JP2005504552A - ターゲティングベクターの調製方法およびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、遺伝子ターゲティングまたは相同組換えのためのターゲティングベクター用のターゲティング構築物の調製方法の提供に関する。本発明はまた、ターゲティングベクターならびに所定の改変を有するベクターを含む細胞、植物、および動物（酵母を含む）を提供する。本発明は、さらに、ターゲティングベクターによって改変された植物および動物を提供する。本発明において使用した遺伝子ターゲティング法は、トランスポゾンおよび半自動化ノックアウトベクター産生に従う欠失の高処理産生を提供する組換え媒介手順に基づく。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子ターゲティングまたは相同組換えのためのターゲティングベクター用のターゲティング構築物の調製方法の提供に関する。本発明はまた、ターゲティングベクターならびに所定の改変を有するベクターを含む細胞、植物、および動物（酵母を含む）を提供する。本発明は、さらに、ターゲティングベクターによって改変された植物および動物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
細胞および生物への異種ＤＮＡの組み込みは、所望の遺伝子および／またはポリペプチドを発現することができる形質転換された細胞および生物の生産に潜在的に有用である。しかし、この系に関連する多数の問題が存在する。主な問題は、哺乳動物細胞などの多細胞生物由来の細胞ゲノムへの異種遺伝子のランダムな組み込みパターンにある。これにより、しばしば、異なる形質転換された細胞の間でこのような異種遺伝子の発現レベルが広範に変化する。さらに、ゲノムへの異種ＤＮＡのランダムな組み込みにより、細胞または生物の変異、分化、および／または生存度に必要な内因性遺伝子が破壊され得る。ランダムな組み込みに関連する問題を解決するための１つのアプローチは、遺伝子ターゲティングの使用を含む。本方法は、細胞または生物のゲノム中に存在するＤＮＡ配列と新規に組み込まれたＤＮＡ配列との間の相同組換え事象の選択を含む。これにより、細胞または生物のゲノムを体系的に変化させる手段が得られる。
【０００３】
相同組換え事象が行われた哺乳動物および植物細胞などの細胞の検出および単離で遭遇する重要な問題は、このような細胞が非相同組換えを媒介する傾向がより高いことにある。
【０００４】
相同組換えの相対的な非効率は、インビトロで容易に産生されず、上記の選択およびスクリーニングプロトコールが不可能でないにしても非実用的であり得る細胞を使用して作用させた場合、さらにより問題がある。例えば、インビトロでのクローン産生が困難または不可能な多数の幹細胞型を含む非常に多様な細胞型が存在する。相同組換え自体の相対頻度を改良することができる場合、専門的な単離技術の影響を受けない種々の細胞をターゲティングすることができる。
【０００５】
したがって、日常的且つ効率的に相同組換えを行うことができ、特定の選択およびスクリーニングプロトコールの必要性を予め回避するのに非常に十分な頻度で構築することができる遺伝子ターゲティング系が非常に必要である。
【０００６】
相同組換えは、異種配列の移入に有用なだけでなく、この技術を使用して遺伝子内の配列を消滅、除去、または不活化することもできる。
【０００７】
「遺伝子ノックアウト」は、細胞または生物における遺伝子のターゲティングされた不活化をいう。この技術は、相同組換えによる染色体上の野生型遺伝子（標的遺伝子）のターゲティングベクター上の不活化遺伝子への置換に依存する。遺伝子ノックアウト実験で遭遇する一般的な問題は、遺伝子置換（相同組換え）よりもむしろ動物細胞におけるホールベクターのランダムな挿入（非相同組換え）頻度の高さである。ランダムな挿入事象を対抗選択するためにポジティブ／ネガティブ選択手順が伝統的に使用されている。一般に、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を、ネガティブ選択マーカーとして使用する。この系が日常的に使用されているが、この系に関連する多数の欠点が存在する。第１に、構築されたポジティブ／ネガティブ選択ベクターは、非常に不安定な場合がある。第２に、多クローニングステップは、数週間、時には数ヶ月を要するノックアウトベクターの構築に関与する。第３に、本明細書中に記載の方法自体によって、既存の技術で現在利用不可能なターゲティングベクターのアセンブリのための半自動アプローチが得られる。
【０００８】
したがって、遺伝子ターゲティングベクターの開発系および日常的且つ効率的に相同組換えを行うことができ、特定の選択およびスクリーニングプロトコールの必要性を予め回避するのに非常に十分な頻度で構築することができる遺伝子ターゲティング系がさらに必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、安定な遺伝子ターゲティングベクターを迅速且つ有効に構築することができる方法、および細胞または生物のゲノムの任意の所定の標的領域を改変し、このような改変細胞を選択および富化することができるベクターを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の態様では、ターゲティングベクター用のターゲティング構築物を調製する方法であって、前記ターゲティングベクターが標的ＤＮＡ配列を改変することができ、前記方法が、
前記標的ＤＮＡ配列のコピーをインビトロで得るステップと、
トランスポゾン配列およびＤＮＡ組換え配列を含むＤＮＡ配列を標的ＤＮＡ配列コピーの一方の部位に挿入するステップと、
トランスポゾン配列およびＤＮＡ組換え配列を含む別のＤＮＡ配列を標的ＤＮＡ配列コピーの他方の部位に挿入するステップと、
前記組換え配列間で組換え事象を誘導して、前記標的ＤＮＡ配列コピーの一部を欠失させるステップとを含む方法を提供する。
【００１１】
本明細書中に記載の方法は、相同組換えを行うことができる細胞ゲノム中の標的ＤＮＡ配列を改変するためにターゲティングベクターに挿入することができるターゲティング構築物を提供する。このトランスポゾン媒介手段は、標的ＤＮＡ配列および細胞での欠失の作製に特に有用である。
【００１２】
本発明の別の態様では、標的ＤＮＡ配列のコピーと、
それぞれ組換え配列を含む少なくとも２つのトランスポゾン単位とを含み、
前記組換え配列間の組換えの際に標的ＤＮＡコピーの一部が欠失するように前記標的ＤＮＡコピー内に前記トランスポゾン単位を挿入して位置付ける、標的ＤＮＡ配列の欠失の作成用のプレターゲティング構築物を提供する。
【００１３】
このプレターゲティング構築物は、ターゲティング構築物の前駆体であり、組換えの誘導前に存在する。この構築物は、トランスポゾン媒介遺伝子欠失プロセスの基礎を形成し、プロセスの不可欠な構成要素である。トランスポゾン単位の使用により、相同組換え時の標的ＤＮＡおよび／または標的ＤＮＡコピー由来のＤＮＡの欠失を可能にし、促進する。
【００１４】
本発明の別の態様では、本明細書中に記載の方法によって調製されたターゲティング構築物を提供する。ターゲティング構築物は、組換え配列間の組換えに起因し、標的ＤＮＡのコピーの一部を欠き、標的ＤＮＡに相同なＤＮＡ配列または本質的に相同なＤＮＡ配列をさらに含む。この形態では、ターゲティング構築物は、相同組換えによる標的ＤＮＡ配列の改変で使用するためのそのクローニングベクターからの除去およびターゲティングベクターへの挿入に理想的である。ターゲティング構築物を、元のクローニングベクターから単離し、標的ベクターに再挿入してクローニングすることができる。
【００１５】
本発明の別の態様では、相同組換えを行うことができる標的細胞ゲノム中に含まれる標的ＤＮＡ配列を改変するためのダブルポジティブ（ＤＰ）ベクターを提供する。ベクターは、標的ＤＮＡ配列の第１の領域の一部に実質的に相同な少なくとも１つの配列の一部を含む第１のＤＮＡ配列を含む。ベクターはまた、標的ＤＮＡ配列の第２の領域の別の部分に実質的に相同な少なくとも１つの配列部分を含む第２のＤＮＡ配列を含む。好ましくは、第１のＤＮＡ配列と第２のＤＮＡ配列との間に第３の配列を位置付け、発現した場合にベクターを使用した標的細胞で機能的なポジティブ選択マーカーをコードする。
【００１６】
第３のＤＮＡ配列内で、部位特異的リコンビナーゼの存在下で高効率ＤＮＡ組換えを補助する別のＤＮＡ配列を提供する。適切な配列は、ＣｒｅまたはＦＬＰなどの部位特異的リコンビナーゼの影響下にあるｌｏｘＰ配列またはＦＲＴ配列である。
【００１７】
部位特異的リコンビナーゼの存在下での高効率ＤＮＡ組換えを補助し、標的細胞で機能的な配列でもある第４のＤＮＡ配列を、第１のＤＮＡ配列の５’および／または第２のＤＮＡ配列の３’に位置付け、標的ＤＮＡ配列での相同組換えを実質的に行うことができない。この配列はまた、ＣｒｅまたはＦＬＰなどの部位特異的リコンビナーゼの影響下での別のｌｏｘＰ部位またはＦＲＴであり得る。
【００１８】
好ましくは、プライマーとして作用するさらなるＤＮＡ配列は、ベクターの５’または３’のいずれかに添加することができるか、第１のＤＮＡ配列または第２のＤＮＡ配列のそれぞれ５’または３’である。
【００１９】
２つの相同部分およびポジティブ選択マーカーを含む上記のＤＰベクターを、標的ＤＮＡ配列を改変するために本発明の方法で使用することができる。この方法では、細胞を、上記のベクターで最初にトランスフェクトする。この形質転換中に、ＤＰベクターは、細胞ゲノム内に最も頻繁にランダムに組み込まれる。この場合、第１、第２、第３、および第４のＤＮＡ配列を含む実質的に全てのＤＰベクターを、ゲノムに挿入する。しかし、いくつかのＤＰベクターは、相同組換えを介してゲノムに組み込む。ＤＰベクターの第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列の相同部分と細胞の内因性標的ＤＮＡの対応する相同部分との間で相同組換えがおこる場合、部位特異的リコンビナーゼの存在下での高効率ＤＮＡ組換えを補助する配列を含む第４のＤＮＡ配列はゲノムに組み込まれない。これは、内因性標的ＤＮＡ配列の相同領域外に配列が存在するからである。
【００２０】
結果として、少なくとも２つの細胞集団が形成される。第４のＤＮＡ配列中に含まれる部位特異的リコンビナーゼの存在下での高効率ＤＮＡ組換えを補助する配列によって選択することができるベクターのランダム組換えが起こった細胞集団が存在する。これは、線状ＤＮＡの末端での組み込みによってランダム事象が起こるためである。相同組換えによって遺伝子ターゲティングされた他の細胞集団を、ベクターの第３のＤＮＡ配列中に含まれるポジティブ選択マーカーによってポジティブ選択する。第４のＤＮＡ配列が存在する場合、好ましくはｌｏｘＰ配列によって隣接したベクター部分の失活によって、Ｃｒｅなどのリコンビナーゼの活性化によってポジティブ選択マーカーを失活させることができる。この細胞集団は、ポジティブ選択マーカーを含まないので、ポジティブ選択を生き残せない。このポジティブ選択法の正味の効果は、改変された標的ＤＮＡ配列を含む形質転換された細胞が実質的に豊富であり、それにより相同組換えが行えることである。
【００２１】
上記のＤＰベクターにおいて、ポジティブ選択マーカーを含む第３のＤＮＡ配列を、第１のＤＮＡ配列とポリペプチドの一部をコードするＤＮＡ配列に対応する第２のＤＮＡ配列との間（例えば、真核生物のエクソン内）または遺伝子発現に必要な調節領域内に位置付ける場合、相同組換えにより、このような標的ＤＮＡ配列を含む遺伝子が非機能的であるように改変された細胞を選択可能である。
【００２２】
しかし、ＤＰベクターの第３のＤＮＡ配列中に含まれたポジティブ選択マーカーがゲノム非翻訳領域内（例えば、真核生物遺伝子中のイントロン内）に位置付けられる場合、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、挿入、および／または欠失によって、標的遺伝子の機能的特徴を消失することなく周辺の標的配列（例えば、エクソンおよび／または調節領域）を改変することができる。
【００２３】
本発明はまた、細胞ゲノム中に含まれる標的ＤＮＡ配列の少なくとも１つの所定の改変を含む形質転換された細胞を含む。
【００２４】
さらに、本発明は、生物のゲノム中の標的ＤＮＡ配列の所定の改変を有する細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物および植物などの生物を含む。
【００２５】
本発明の種々の他の態様は、以下の詳細な説明、添付の図面、および特許請求の範囲から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の第１の態様は、ターゲティングベクター用のターゲティング構築物を調製する方法であって、前記ターゲティングベクターが標的ＤＮＡ配列を改変することができ、前記方法が、
前記標的ＤＮＡ配列のコピーをインビトロで得るステップと、
トランスポゾン配列およびＤＮＡ組換え配列を含むＤＮＡ配列を標的ＤＮＡ配列コピーの一方の部位に挿入するステップと、
トランスポゾン配列およびＤＮＡ組換え配列を含む別のＤＮＡ配列を標的ＤＮＡ配列コピーの他方の部位に挿入するステップと、
前記組換え配列間で組換え事象を誘導して、前記標的ＤＮＡ配列コピーの一部を欠失させるステップとを含む方法を提供する。
【００２７】
本明細書中に記載の方法は、相同組換えを行うことができる細胞ゲノム中の標的ＤＮＡ配列を改変するためのターゲティングベクターに挿入することができるターゲティング構築物を提供する。このトランスポゾン媒介手順は、標的ＤＮＡ配列および細胞中の欠失作製に特に有用である。
【００２８】
組換え事象は、標的ＤＮＡのコピーを、標的ＤＮＡの相同または実質的に相同な部分を含むが、ターゲティング構築物から欠失した標的ＤＮＡの一部を有するターゲティング構築物に変換する。それぞれ組換え配列を含む本質的に２つのトランスポゾンを、標的遺伝子のコピーの異なる位置に挿入することができる。２つのトランスポゾン上の組換え配列間の組換えにより、トランスポゾン間の配列を欠失させることができる。細胞中のポジティブ選択のために動物欠失部位に選択マーカーが残されることが好ましい。これは、クローン化遺伝子中の高処理欠失作製を促進させる所与の遺伝子中の種々の欠失が望ましい場合に特に好ましい。
【００２９】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、用語「comprise」ならびに「comprising」および「comprises」などのこの用語の変形形態は、他の添加物、成分、整数、またはステップを排除することを意図しない。
【００３０】
本明細書中で使用される、「標的ＤＮＡ配列」は、本発明のターゲティングベクターによる改変のためにターゲティングされる細胞ゲノム内の所定の領域である。標的ＤＮＡ配列は、遺伝子の全ての構造成分（すなわち、真核生物の場合にイントロンおよびエクソンを含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列）、エンハンサー配列およびプロモーターなどの調節配列、目的のゲノム内の他の領域を含む。標的ＤＮＡ配列はまた、ベクターによってターゲティングされた場合に宿主ゲノムの機能に対して効果がない配列であり得る。各標的ＤＮＡ配列は、本発明のターゲティングベクターのデザインに使用される相同配列部分を含む。
【００３１】
本明細書中で使用される、用語「標的ＤＮＡ配列のコピー」は、標的ＤＮＡの相同なコピー、実質的に相同なコピー、または改変コピーを含む。標的ＤＮＡの相同コピーは標的と同一であり、標的ＤＮＡの一部の明白な欠失を所望する場合に特に有用である。「実質的に相同な」コピーは、ほぼ同一であるがストリンジェントな条件下でハイブリッド形成するＤＮＡ配列である。「改変」コピーは、「実質的に相同」であるが、ターゲティングベクター、最終的には細胞ゲノムへの挿入を所望する変化または改変を含む配列である。これらのＤＮＡ配列は、ターゲティングベクターで使用するための改変ＤＮＡ配列になる。改変されたＤＮＡでは、組換え時にこれらの改変された配列がターゲティング構築物に残存するように組換え配列部位の外側が改変されていることが好ましい。
【００３２】
標的ＤＮＡ配列のコピーを、任意の供給源から得ることができ、一般に、市販のライブラリーから得る。一般に、標的ＤＮＡ配列は、公知の配列または公知の遺伝子である。しかし、本発明は、公知の配列に制限されない。ＤＮＡの一部を改変について識別することができ、抽出、天然または合成法（本発明の範囲内である）のいずれかによってこの部分のコピーを得ることができる。本発明の目的のために、所望の配列の操作および欠失のためにインビトロで配列を使用する。標的ＤＮＡを含む構築物を安定にすることができ、且つトランスポゾンおよび組換え配列を含む挿入されたＤＮＡ配列を得るための任意のベクターまたはクローニングベクターにクローン化することができる。好ましくは、構築物は、市販の供給源から入手した任意の利用可能な構築物である。しかし、ベクターｐＮＥＢ１９３が有用であることが見出された。その他には、一般にｐＵＣベースのベクター、コスミドベース、ＰＡＣ／ＢＡＣベースまたはＹＡＣベースのベクターが含まれる。
【００３３】
ターゲティングベクターへの挿入のために、ターゲティング構築物をこのようにして構築する。本明細書中に記載の方法により、インビトロでの標的ＤＮＡ配列のコピーの一部を有効に除去し、標的動物遺伝子が望ましく欠失することができる。この都合の良い手順により、標的細胞中の欠失の作製のための手順が著しく簡単になる。正確な相同組換えを確実にするためにターゲティングベクター中にプロモーター配列、選択マーカー、および相同標的配列を含むＤＮＡインサートの正確な置換を必要とする遺伝子構築物を作成する必要性が著しく減少する。
【００３４】
ターゲティング構築物には、トランスポゾン配列およびＤＮＡ組換え配列を含む少なくとも２つの個別の挿入されたＤＮＡ配列が含まれる。しかし、多数の挿入されたＤＮＡ配列を使用して、組換え事象を誘導し、標的ＤＮＡ配列のコピーの一部を欠失することができる。
【００３５】
トランスポゾン配列は、ＤＮＡ分子上の新規の部位に挿入することができる個別のＤＮＡセグメント（転位とよばれるプロセス）である。このようなエレメントは、真核生物および原核生物の両方に存在する。細菌では、多数の異なるトランスポゾンを含むこのようなエレメントのいくつかのクラスが存在し、そのいくつかは詳細に研究されており、挿入変異誘発の目的でこれを使用して真核生物遺伝子および細菌遺伝子に挿入されている。トランスポゾンはまた、クローニングのためのポータブルマーカーおよび配列決定のためのプライマー結合部位の挿入のためのツールとして使用されている。
【００３６】
転位の機構および様式は、トランスポゾンによって異なる。一般に、トランスポゾンは、トランスポゾンをコードするトランスポザーゼによるトランスポゾン末端の認識、その後のトランスポゾン末端と標的部位との間の組換え事象を含む。ほとんどのトランスポザーゼ遺伝子は、シスで機能し、トランスポザーゼ遺伝子を含む同一のＤＮＡ分子上でのトランスポゾンの転位を触媒する。しばしば、補助タンパク質（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）およびＤＮＡ補因子はインビボ転位で必要であり、いくつかのトランスポゾンは同一のトランスポゾンのこれらを含むＤＮＡ分子への転位を防止する転位免疫を付与する。
【００３７】
２成分（種々のトランスポゾンの末端に隣接する抗生物質耐性マーカーを含むミニトランスポゾンまたはミニｍｕトランスポゾンおよびドナートランスポゾンのレシピエントＤＮＡ分子への転位を触媒する精製トランスポザーゼ）のみを必要とする多数のインビトロトランスポゾン系が開発されている。このような系では、一般に、トランスポザーゼのみで十分であり、補助タンパク質およびＤＮＡ補因子は必要ない。さらに、転位免疫は存在せず、１つを超えるトランスポゾンを同一のＤＮＡ分子に挿入することができる。
【００３８】
適切なミニトランスポゾンを、Ｍｕ１−Ｃａｍ、Ｍｕ２−Ｎｅｏ、Ｍｕ２−Ｈｙｇ ＥＧＦＰ、およびＭｕ２−β−ｇｅｏからなる群から選択することができる。
【００３９】
挿入されたＤＮＡ配列は、組換え配列をさらに含む。本明細書中に記載の組換え配列は、標的ＤＮＡ配列または組換え配列に隣接する任意の配列のコピーの一部の欠失プロセスで重要である。これらの配列は、部位特異的リコンビナーゼの存在下での高効率の組換えを補助する。
【００４０】
適切な配列は、ＣｒｅまたはＦＬＰなどそれぞれのリコンビナーゼの影響下にあるｌｏｘＰ配列または逆向き反復塩基配列（ＦＲＴ）を含む。リコンビナーゼの他のインテグラーゼファミリーメンバー（Ｇｌｎ、Ｈｉｎ、レソルバーゼ）もまた、本説明に含まれる。他の酵素媒介組換えまたは高効率組換え事象は、この系を潜在的に媒介することができる。
【００４１】
Ｃｒｅ−ＬｏｘＰリコンビナーゼ系が最も好ましい。しかし、ＦＬＰ−ＦＲＴ系もまた使用することができる。ＬｏｘＰは、リコンビナーゼ（Ｃｒｅ）によって媒介される別のＬｏｘＰ配列で組換える３４ｂｐのＤＮＡである。組換え事象によりＤＮＡが環状化され、ＬｏｘＰ部位間のＤＮＡ配列が欠失される。この系の１つの重要な特徴は、同一方向でのＬｏｘＰ配列間の組換えにより配列間のＤＮＡが欠失してＬｏｘＰの１つのコピーを遊離させることである。この系は原核生物および高等生物の両方で機能するので、本明細書中に記載の方法は、酵母を含む全ての細胞型に有用である。
【００４２】
挿入されたＤＮＡ配列の組換え配列は、組換えることができなければならない限り適合しなければならない。したがって、例えば、一方のＤＮＡ配列の組換え配列がＬｏｘＰ配列である場合、他のＤＮＡ配列はＬｏｘＰ配列を含まなければならないので、隣接する配列の除去または欠失が促進される。
【００４３】
好ましいことであるが、トランスポゾン配列は、選択マーカーおよびプロモーター配列が得られる他のＤＮＡ配列を含んでもよい。これらのＤＮＡ配列は、コピーされた標的ＤＮＡ配列への首尾のよいトランスポゾン挿入を識別するための手段を提供する。任意の選択マーカーを、トランスポゾン配列と組み合わせて使用することができる。
【００４４】
適切なマーカーには、クロラムフェニコール耐性マーカー、テトラサイクリン耐性マーカー、ネオマイシン耐性マーカー、またはβ−ｇｅｏマーカーなどの抗生物質耐性マーカーまたは酵素ベースのマーカーが含まれる。
【００４５】
確実にトランスポゾンが同一の方向で存在し、それにより確実に組換え配列も同一の方向で存在するように標的ＤＮＡ配列のコピーに挿入するＤＮＡ配列を挿入することができる。
【００４６】
欠失のためにターゲティングされた配列に隣接するトランスポゾンまたはさらなる選択マーカーおよびプロモーターと相対的な任意の空間的順序で挿入されたＤＮＡ配列内の組換え配列の位置付けを行うことができる。標的ＤＮＡ配列のコピーの一部欠失時に新規のマーカー配列が活性化されるように組換え配列を有利に位置付けることができる。
【００４７】
理論に制限されないが、１つの挿入されたＤＮＡ配列は、Ｃａｍ^rなどの第１の選択マーカーを駆動するプロモーター配列に隣接するトランスポゾン配列を含むことができ、プロモーター配列と選択マーカーとの間に組換え配列を挿入する。別の挿入されたＤＮＡ配列は、Ｔｅｔ^rなどの活性選択マーカーおよびβ−ｇｅｏなどの非活性選択マーカーに隣接するトランスポゾン配列を含むことができ、組換え配列を、活性選択マーカーと非活性選択マーカーとの間に挿入する。組換え配列間の組換え事象の活性により第１の選択マーカーおよび活性選択マーカーが欠失し、首尾のよい組換えをさらに識別するための非活性マーカーが活性化される。
【００４８】
転位プロセスおよびトランスポゾンをコードするトランスポザーゼによるＤＮＡ配列中のトランスポゾン末端の認識によって挿入されたＤＮＡ配列を標的ＤＮＡのコピーに挿入することができる。理想的には、標的ＤＮＡのコピーを確実に連続組み込みするために各ＤＮＡ配列を個別に挿入する。選択マーカーにより首尾のよい組み込みを識別することができる。しかし、挿入されたＤＮＡ配列を同時に挿入することができる。理想的ではないが、この方法を使用して、適合する組換え配列を標的ＤＮＡのコピーに組み込み、組み込み配列の欠失を意図するＤＮＡの一部に隣接（flank）させることができる。
【００４９】
トランスポゾンの組み込みはランダムである。ＰＣＲスクリーニングまたは制限消化マッピングの使用によって、トランスポゾンの部位および方向を決定することができる。
【００５０】
好ましくは細胞へのＣｒｅの組み込みによって、組換え配列間の組換え事象を誘導することができる。
【００５１】
好ましくは調節された手段によってｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子を発現することができる。Ｔｅｔ−ｏｎ系またはエクダイシン（ｅｃｄｙｓｉｎｅ）誘導系を使用して、ｃｒｅ発現を誘導することができる。これらの系は、染色体への２つのプラスミドの組み込みが必要である。トランスジェニック実験およびノックアウト実験では、染色体に組み込まれたプラスミドＤＮＡにより、所望でない副作用を引き起こし得る。この問題を克服するために、ＬｏｘＰ部位に隣接するＤＮＡセグメントを除去するために、Ｃｒｅリコンビナーゼの一過性発現が最も望ましい。リコンビナーゼの一過性発現での使用にアデノウイルスベクターが好ましい。複製欠損であり、複製機能を必要とする特定の細胞株でのみ増幅することができるので、これらのベクターは稀に染色体に組み込まれて正常な細胞株で複製されない。さらに、トランスフェクション効率は、プラスミド発現ベクターよりもさらに高い（アデノウイルスについては、プラスミド発現ベクターについての約２０％と比較して約１００％）。Ｃｒｅ遺伝子の一過性発現のためのアデノウイルスベクターが最も好ましい。ＣｒｅリコンビナーゼＡ×ＣＡＮＣｒｅ（ＲＩＫＥＮ、Ｊａｐａｎ）を発現するアデノウイルスが好ましい。抗Ｃｒｅ抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して、ウェスタンブロッティングによってＣｒｅリコンビナーゼの発現を確認することができる。
【００５２】
ＦＬＰ−ＦＲＴ系などの他の組換え配列またはリコンビナーゼのインテグラーゼファミリーの他のメンバーを使用する場合、類似の様式で対応するリコンビナーゼを誘導することができる。
【００５３】
本発明の別の態様では、標的ＤＮＡ配列のコピーと、
それぞれ組換え配列を含む少なくとも２つのトランスポゾン単位と
を含み、前記組換え配列間の組換えの際に標的ＤＮＡコピーの一部が欠失するように前記標的ＤＮＡコピー内に前記トランスポゾン単位を挿入して位置付ける、標的ＤＮＡ配列の欠失の作成用のプレターゲティング構築物を提供する。
【００５４】
このプレターゲティング構築物は、ターゲティング構築物の前駆体であり、組換えの誘導前に存在する。この構築物は、トランスポゾン媒介遺伝子欠失プロセスの基礎を形成し、プロセスの不可欠な構成要素である。トランスポゾン単位の使用により、相同組換え時の標的ＤＮＡおよび／または標的ＤＮＡコピー由来のＤＮＡの欠失を可能にし、促進する。
【００５５】
好ましい実施形態では、トランスポゾン単位は、ミニｍｕトランスポゾン単位である。ミニｍｕトランスポゾン単位は、選択マーカーおよび望ましくは選択マーカーの発現のプロモーターをさらに含む。トランスポゾン単位は、組換え時に異なる選択マーカーまたは遺伝子を組換え体およびターゲティング構築物の選択を促進するように活性化されるように異なることが好ましい。
【００５６】
前述のように選択マーカーを選択する。
【００５７】
本発明の別の態様では、本明細書中に記載の方法によって調製されたターゲティング構築物を提供する。ターゲティング構築物は、組換え配列間の組換えに起因し、標的ＤＮＡのコピーの一部を欠き、標的ＤＮＡに相同または本質的に相同なＤＮＡ配列をさらに含む。この形態では、ターゲティング構築物は、相同組換えによる標的ＤＮＡ配列の改変で使用するためのそのクローニングベクターからの除去およびターゲティングベクターへの挿入に理想的である。ターゲティング構築物を、元のクローニングベクターから単離し、ターゲティングベクターに再挿入してクローニングすることができる。
【００５８】
ターゲティング構築物の好ましい形態は、組換え事象後に形成された活性な選択マーカーを含み、活性な選択マーカーは、個別に挿入されたＤＮＡ配列に由来するプロモーターと選択マーカーとの組み合わせに起因する。好ましくは、活性な選択マーカーは、標的ＤＮＡに相同なＤＮＡ配列または実質的に相同なＤＮＡ配列に隣接する。この選択マーカーは、ターゲティング構築物が配置されるターゲティングベクターで使用されたクローニングベクターおよび細胞の両方でのポジティブ選択に役立つ。
【００５９】
このトランスポゾン媒介手順を、欠失を作製し、遺伝子がクローン化されてすぐベクター構築が迅速化されるようにデザインした。クローン化遺伝子上のトランスポゾン挿入がランダムであり、且つミニＭｕトランスポゾンに配列優先度が存在しないので、各欠失のためにさらなるクローニングを行うことなく任意の所望の位置で欠失を作製することができる。これにより、ノックアウトベクターの半自動産生に潜在的に影響を受ける高処理欠失作製を促進する。
【００６０】
好ましいターゲティングベクターは、本明細書中に記載のＤＰ（ダブルポジティブ）ベクターである。
【００６１】
本発明の別の態様では、細胞ゲノム中に含まれる標的ＤＮＡ配列を改変するためのダブルポジティブ（ＤＰ）ベクターであって、前記ＤＰベクターは、
前記標的ＤＮＡ配列の第１の領域と相同組換えすることができる第１の相同ベクターＤＮＡ配列と、
前記細胞中で特徴的なポジティブ選択を付与することができるポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列と、
部位特異的リコンビナーゼの存在下で高効率のＤＮＡ組換えを補助し、前記ポジティブ選択マーカー中に含まれる第３の配列と、
前記標的ＤＮＡ配列の第２の領域と相同組換えを行うことができる第２の相同ベクターＤＮＡ配列と、
前記第３の配列との部位特異的組換えを指示するが、前記標的ＤＮＡ配列との相同組換えを実質的に行うことができない第４の配列とを含み、
前記ＤＰベクター中の前記配列の空間的順序は、前記第１の相同ベクターＤＮＡ配列、前記第３の配列を含む前記ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列、前記第２の相同ベクターＤＮＡ配列および前記第４の配列であり、
前記ベクターが、前記第１の相同ベクターＤＮＡ配列の前記標的配列の前記第１の領域との相同組換えおよび前記第２の相同ベクターＤＮＡ配列の前記標的配列の前記第２の領域との相同組換えによって前記標的ＤＮＡ配列を改変することができるＤＰベクターを提供する。
【００６２】
本発明のダブルポジティブ選択（「ＤＰ」）法およびベクターまたはターゲティングベクターを使用して、相同組換えを行うことができる細胞ゲノム中の標的ＤＮＡ配列を改変する。
【００６３】
本発明のＤＰベクターの略図を、図３および図４に示す。別のＤＰベクターを、図４に示す。ＤＰベクターは、少なくとも４つのＤNＡ配列を含む。第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列は、それぞれ、ターゲティングＤＮＡの第１の領域および第２の領域中の対応する相同部分に実質的に相同な部分を含む。ゲノムの適切な領域へのＤＰベクターのターゲティングを保証するためにＤＰベクターおよび標的ＤＮＡのこれらの部分の間に実質的な相同性が必要である。
【００６４】
本明細書中で使用される、用語「相同な」または「実質的に相同な」ＤＮＡ配列は、基準ＤＮＡ配列と同一またはほぼ同一であるＤＮＡ配列である。２つの配列が相同であるという表示は、これらの配列が最もストリンジェントなハイブリッド形成条件下でさえも互いにハイブリッド形成し、好ましくは配列多型を示さない（すなわち、制限エンドヌクレアーゼによって異なる切断部位を含まない）ことである。
【００６５】
本明細書中で使用される、用語「実質的に相同な」は、基準ＤＮＡ配列を少なくとも約９７〜９９％同一、および好ましくは基準ＤＮＡ配列と少なくとも約９９．５％〜９９．９％同一、ある用途では、基準ＤＮＡ配列と１００％同一であるＤＮＡをいう。２つの配列が実質的に相同であるという表示は、これらの配列が最もストリンジェントな条件下で依然として互いにハイブリッド形成し、（少なくとも約９７％〜９９％の配列が同一である特定の長さの配列が統計的に予想される数と比較して）ＲＦＬＰまたは配列多型を示すことは稀であることである。
【００６６】
遺伝子ターゲティングによれば、動物細胞ゲノムを選択的に操作する能力が主に進歩する。この技術を使用して、部位特異的様式および正確なで特定のＤＮＡ配列をターゲティングおよび改変することができる。調節領域、コード領域、および遺伝子間のＤＮＡ領域を含む異なるＤＮＡ配列型を改変のためにターゲティングすることができる。調節配列の例としては、プロモーター領域、エンハンサー領域、ターミネーター領域、およびイントロンが含まれる。これらの調節領域の改変により、遺伝子発現のタイミングおよびレベルを変化させることができる。コード領域を、例えば、抗原もしくは抗体の特異性、酵素活性、食品のタンパク質組成、タンパク質の不活化に対する感受性、タンパク質の分泌、細胞内のタンパク質の配列を変化、増強、または消滅させるように改変することができる。イントロンおよびエクソンならびに遺伝子内領域は、改変に適切な標的である。この技術はまた、リコンビナーゼと組み合わせて使用した場合、染色体を操作することが可能であり（Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｓｏｌｉｓ Ｒ．，Ｌｉｕ Ｐ．，Ｂｒａｄｌｅｙ Ａ，１９９５，「マウスの染色体操作」，Ｎａｔｕｒｅ，３７８，７２０〜４）、それにより巨大な染色体間または染色体内再配列を行うことができる。
【００６７】
ＤＮＡ配列の改変には、先行する挿入、欠失、置換、または任意の組換えを含むいくつかの型が存在し得る。修飾の特例は、遺伝子産物の発現を破壊するヌクレオチド配列の部位特異的な組み込みによる遺伝子の不活化である。ターゲティングによる遺伝子の「ノックアウト」のためのこのような技術を使用して、遺伝子産物の機能的発現を破壊するためのアンチセンスＲＮＡの使用に関連する問題を回避する。例えば、本発明を使用した標的遺伝子の破壊への１つのアプローチは、ターゲティングＤＮＡと標的ＤＮＡとの間の相同組換えにより、標的遺伝子のコード領域に選択マーカーが挿入されるようにターゲティングＤＮＡに選択マーカーを挿入することである。
【００６８】
ポジティブ選択マーカーをコードするＤＮＡ配列もまたＤＰに含まれる。本明細書の説明で使用される好ましいポジティブ選択マーカーには、薬物耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性など）、蛍光もしくは生体発光マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）など）、または挿入ＤＮＡを保有する細胞とこのようなＤＮＡを欠く細胞とを区別するために使用することができる任意の他のマーカーが含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
ポジティブ選択マーカーをコードするＤＮＡ配列を、第１のＤＮＡ配列と第２のＤＮＡ配列との間に位置付けることが好ましい。ターゲティング構築物中のマーカー遺伝子の好ましい位置は、遺伝子ターゲティングの目的に依存する。例えば、標的遺伝子発現の破壊が目的である場合、選択マーカーを標的ＤＮＡ中のコード配列に対応するターゲティングＤＮＡにクローン化することができる。あるいは、アミノ酸が置換されたタンパク質などの標的遺伝子由来の変化した産物を発現することを目的とする場合、クローニング配列を、置換をコードするように改変することができ、選択マーカーを、コード領域の外側（例えば、イントロン付近）に位置付けることができる。
【００７０】
選択マーカーが発現のためにそのプロモーターに依存し、マーカー遺伝子がターゲティングされた生物に比べて非常に異なる生物由来である場合（例えば、哺乳動物細胞のターゲティングで使用した原核生物マーカー遺伝子）、元のプロモーターをレシピエント細胞で機能することが公知の転写機構と置換することが好ましい。多数の転写開始領域（例えば、メタロチオネインプロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、およびサイトメガロウイルスプロモーターを含む）をこのような目的に利用可能である。広範に使用されている例は、ＳＶ４０初期プロモーターの調節下で細菌ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を有し、Ｇ４１８（ネオマイシンに関連する抗生物質）への哺乳動物細胞耐性を付与するｐＳＶ２−ｎｅｏプラスミドである。
【００７１】
ＤＰベクター中のマーカーの特徴は、ポジティブマーカーのコード配列内に部位特異的リコンビナーゼの存在下での高効率組換えを補助する第３の配列が存在することである。適切な配列は、ＣｒｅまたはＦＬＰなどそれぞれのリコンビナーゼの影響下にあるｌｏｘＰ配列または逆向き反復塩基配列（ＦＲＴ）を含む。リコンビナーゼの他のインテグラーゼファミリーメンバー（Ｇｌｎ、Ｈｉｎ、レソルバーゼ）もまた、本説明に含まれる。他の酵素媒介組換えまたは高効率組換え事象は、この系を潜在的に媒介することができる。
【００７２】
ｌｏｘＰ配列は、欠失されるべき配列に隣接する３４塩基対のＤＮＡである。Ｃｒｅタンパク質に関与しないで組換えすることは不可能である。
【００７３】
ＦＲＴ配列は、ＦＬＰの標的であり、リコンビナーゼＦＬＰの存在下で欠失することができるＤＮＡ配列にも隣接している。
【００７４】
細胞内でプロモーター配列が活性化された場合にポジティブ選択マーカー遺伝子の発現を妨害することなく、部位特異的リコンビナーゼの存在下で高効率ＤＮＡ組換えを補助する第３の配列を挿入することができることが好ましい。この配列を、選択マーカー遺伝子のプロモーターとコード領域との間に挿入することが好ましい。しかし、β−ガラクトシダーゼコード配列が破壊される青色／白色選択ストラテジーなどの別のストラテジーを考察することができる。
【００７５】
このような選択マーカーをコードするＤＮＡ配列によって発現された表現型がＤＮＡ配列を発現する細胞に特異的なポジティブ選択を付与することができる場合、ポジティブマーカーは形質転換された細胞中で「機能的」である。したがって、「ポジティブ選択」は、組み込まれたポジティブ選択マーカーを含まない細胞を死滅させるか選択する適切な薬剤を含むＤＰベクターでトランスフェクトした細胞を移入するステップを含む。
【００７６】
本明細書中で使用される他のポジティブ選択マーカーには、膜結合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が含まれる。このようなポリペプチドは、当業者に周知であり、分泌配列、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。ポジティブ選択マーカーとして発現する場合、このようなポリペプチドは標的細胞膜に会合する。次いで、細胞外ドメインに特異的な蛍光標識抗体を、膜結合ポリペプチドを発現する細胞を選択するための蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）で使用することができる。ネガティブ選択前後にＦＡＣＳ選択を行うことができる。
【００７７】
ＤＰベクター中の第４の配列は、部位特異的リコンビナーゼの存在下での高効率ＤＮＡ組換えを補助し、第３の配列内の部位特異的組換えを指示するが、標的ＤＮＡ配列での相同組換えを実質的に行うことができない。好ましくは、第３の配列がｌｏｘＰ配列である場合、第４の配列もｌｏｘＰ配列であり、それにより隣接する配列の除去が促進される。同様に、第３の配列がＦＲＴ配列である場合、第４の配列もＦＲＴ配列であり、それにより隣接する配列の除去が促進される。各リコンビナーゼは、ＣｒｅおよびＦＬＰである。同一の効果を得ることができる他のリコンビナーゼは、本発明の範囲内である。
【００７８】
本発明の重要な特徴は、部位特異的リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ）の影響下で、ｌｏｘＰ部位間で組換えが起こってポジティブ選択マーカーの機能が喪失することである。したがって、相同組換えが起こる細胞は、そのゲノムがＣｒｅ（またはＦＬＰなどの別のリコンビナーゼ）の誘導形態を発現するように変化されなければならない。
【００７９】
さらに好ましい実施形態では、第４のＤＮＡ配列は、ＰＣＲプライマー部位またはポジティブ選択マーカー内で使用される部位に対して別の組換え部位として作用することができる別の短いＤＮＡ領域を含む。第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列のいずれかの末端にこれを付加することができる。
【００８０】
しかし、ポジティブ選択マーカーを、独立して発現する（例えば、標的ＤＮＡのイントロン中に含まれる場合）ように構築するか、標的ＤＮＡ配列中の調節配列の調節下に相同組換えがおかれるように構築することができる。
【００８１】
しかし、ＤＰベクター内の種々のＤＮＡ配列の位置付けは、各ＤＮＡ配列をＤＰベクターの一本鎖上に転写的におよび翻訳的に整列させることを必要としない。したがって、例えば、第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列は、標的ＤＮＡ配列中の領域１および領域２の５’→３’方向と一致する５’→３’方向を有してもよい。そのようにして整列させた場合、ＤＰベクターは、「置換ＤＰベクター」である。相同組換えの際、置換ＤＰベクターは、標的ＤＮＡの相同部分の間のゲノムＤＮＡ配列をＤＰベクターの第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列の相同部分の間のＤＮＡ配列と置換する。本発明の実施には配列置換ベクターが好ましい。あるいは、ＤＮＡ配列１の相同部分が標的ＤＮＡ配列の領域１の相同部分の５’→３’に対応する一方で、ＤＰベクター中のＤＮＡ配列２の相同部分が標的ＤＮＡ配列の第２の領域の第２の領域の相同部分について３’→５’方向であるようにＤＰベクター中の第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列の相同部分を互いに逆にすることができる。この逆方向により、「挿入ＤＰベクター」が得られる。挿入ＤＰベクターが標的ＤＮＡ配列に相同に挿入された場合、標的ＤＮＡ中の相同部分を置換することなくＤＰベクター全体が標的ＤＮＡ配列に挿入される。このようにして得られた改変標的ＤＮＡは、ＤＰベクター中に含まれる標的ＤＮＡの少なくとも相同部分の重複を必ず含む。
【００８２】
同様に、ポジティブ選択マーカー、第３、および第４のＤＮＡ配列を、相互且つ標的ＤＮＡ配列の転写方向と比較して転写を逆にすることができる。しかし、これは、第３のＤＮＡ配列中のポジティブ選択マーカーが適切な調節配列によって独立して調節される場合のみである。例えば、無プロモーターポジティブ選択マーカーをその発現が内因性調節領域の調節下に置かれるように第３の配列として使用した場合、このようなベクターは、内因性調節領域の転写方向および配列を有する適切なアラインメント（５’→３’および適切なリーディングフレーム）で存在するようにポジティブ選択マーカーを位置付けることが必要である。
【００８３】
ＤＰ選択は、第４のＤＮＡ配列が標的ＤＮＡ配列での相同組換えを実質的に行うことができないことが必要である。
【００８４】
本発明のさらに別の態様では、ベクターに含まれる別の選択マーカーが存在する。好ましくは、ｌｏｘＰおよびＦＲＴの上記のリコンビナーゼの影響下にある部位特異的組換え配列にさらなるマーカーが隣接する。このようなＤＰベクター中に含まれる選択マーカーは、同一または異なる選択マーカーのいずれかであり得る。これらのマーカーが異なり、このようなマーカーを含む細胞を選択するために２つの異なる薬剤の使用が必要な場合は、このよう選択は、選択マーカーに適切な薬剤を使用して連続的にまたは同時に行うことができる。ＤＰベクターの５’末端および３’末端での２つの選択マーカーの位置付けにより、ランダムに組み込まれたＤＰベクターを有する標的細胞の選択が増強される。これは、ランダム組み込みによりＤＰベクターが再整列されて、ランダム組み込み前に選択マーカーの全部または一部が切り出される場合があるためである。これが起こった場合、ＤＰベクターをランダムに組み込んだ細胞を選択することができない。しかし、ＤＰベクター上の第２の選択マーカーの存在により、ランダム組換えにより２つの選択マーカーのうちの少なくとも１つが挿入される可能性が実質的に増大する。
【００８５】
好ましくは、本発明は、ＤＰ選択プロセス中にＣｒｅが非機能的である細胞を排除するために使用することができるｌｏｘＰ部位に隣接する別の選択マーカーを含む。このマーカーは、上記の任意のマーカー（好ましくは、単純ヘルペスチミジンキナーゼまたは蛍光タンパク質など）であり得る。しばらくすると誘導性Ｃｒｅが活性化され、ほとんどの細胞で相同組換えが起こる。これは、細胞型によって異なる。Ｃｒｅの誘導からしばらくして選択マーカーの選択が開始され、Ｃｒｅが有効に機能しない細胞を排除するように作用する。
【００８６】
この態様のさらに好ましい実施形態では、マーカーの一方がプロモーターレスマーカー（promoter-less marker）であり、他方のマーカーがプロモーターの影響下にある少なくとも２つの選択マーカーを有するＤＰベクターを提供する。適切なプロモーターレスマーカーは、ハイグロマイシン耐性マーカー（Ｈｙｇ^r）である。
【００８７】
ランダムに組み込まれた事象全ての細胞が第１の選択マーカーに感受性を示すようになり、それにより第２ラウンドの選択で死滅するように１００％またはほぼ１００％の細胞がＣｒｅリコンビナーゼの発現に依存する系では、１００％有効な細胞は存在し得ない。さもなければ、選択手順により、ランダム組み込みを保有するバックグラウンドが得られる。したがって、ランダム組み込みの発生を減少させるために、本発明でＤＰベクター形態（少なくとも２つのポジティブ選択マーカーを含むベクター）を提供する（図４）。
【００８８】
このベクターは、別のＬｏｘＰ部位およびプロモーターレス選択マーカー耐性遺伝子が第１の選択マーカー遺伝子の後に存在すること以外は上記のＤＰベクターと同一である。第１のマーカー遺伝子が、プロモーターとプロモーターレス遺伝子との間で「stuffer配列」として作用するので、プロモーターレスマーカー遺伝子は発現しない。このベクターを使用して、第１のマーカー耐性を選択する細胞をトランスフェクトする。標的化された事象後、アデノウイルス−Ｃｒｅを使用したＣｒｅリコンビナーゼの発現により、第１の選択マーカー遺伝子が欠失し、プロモーターレス遺伝子が発現し、細胞または異なる耐性が付与される。２つの外側ＬｏｘＰ部位が存在するランダムな組み込み事象では、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現によりプロモーターまたはプロモーターレス遺伝子（あるいはそれらの両方）が欠失する。したがって、プロモーターレスの第２の選択を使用すると、標的化された事象に起因する細胞のみが生存する。ＬｏｘＰ組換えが行われずにプロモーターレス遺伝子が発現するので、Ｃｒｅリコンビナーゼの不十分な発現はここでは問題とならない。この改変は、標的化されていない細胞レベルが非常に低いより優れた遺伝子ターゲティングベクターを示す。
【００８９】
ＤＰベクターの第４の配列と標的ＤＮＡとの間の実質的な非相同性により、第４のＤＮＡ配列の連結点または連結点付近での配列相同性が不連続になる。したがって、細胞の相同組換え機構によってゲノムにベクターが組み込まれた場合、第４のＤＮＡ配列は、標的ＤＮＡに導入されない。これは、本発明のＤＰ法の基礎を形成する相同組換えおよびリコンビナーゼの活性化の間の、この第４のＤＮＡ配列の非組み込みである。
【００９０】
本明細書中で使用される、「改変ＤＮＡ配列」は、ゲノムのターゲティング領域へのＤＰベクターの相同挿入後の標的ＤＮＡ配列中の１つまたは複数のヌクレオチドの置換、挿入、および／または欠失をコードする第１、第２、および／またはポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列中に含まれるＤＮＡ配列である。ＤＰベクターがポジティブ選択マーカーをコードするＤＮＡ配列の挿入のみを含む場合、ＤＮＡ配列を「第１の改変ＤＮＡ配列」という場合がある。選択マーカーをコードするＤＮＡ配列に加えて、ＤＰベクターも１つまたは複数のヌクレオチドのさらなる置換、挿入、および／または欠失をコードする場合、このようなさらなる改変をコードする部分を、「第２の改変ＤＮＡ配列」という場合がある。第２の改変ＤＮＡ配列は第１および／または第２のＤＮＡ配列全体を含み得るか、いくつかの場合、第１および／または第２のＤＮＡ配列の全体未満を含み得る。後者の場合は、例えば、内因性調節配列の調節下に異種遺伝子が置かれるようにデザインされたＤＰベクターに、異種遺伝子が組み込まれる。このような場合、例えば、第１のＤＮＡ配列の相同部分は、ターゲティング内因性調節配列の全てまたは一部を含むことができ、改変ＤＮＡ配列は異種ＤＮＡ配列をコードする第１のＤＮＡ配列部分（およびいくつかの場合、同様に第２のＤＮＡ配列の一部）を含む。ＤＰベクターのターゲティングを完了するために第２のＤＮＡ配列中の適切な相同部分を含む。他方では、第１および／または第２のＤＮＡ配列全体は、例えば、これらのＤＮＡ配列のいずれかまたは両方がターゲティングＤＮＡ配列中の遺伝的欠損の修正をコードする場合に、第２の改変ＤＮＡ配列を含み得る。
【００９１】
さらに好ましい実施形態では、本発明は、トランスポゾン媒介法によって調製されたターゲティング構築物を含み、前記方法が、
前記標的ＤＮＡ配列のコピーをインビトロで得るステップと、
トランスポゾン配列およびＤＮＡ組換え配列を含むＤＮＡ配列を標的ＤＮＡ配列コピーの一方の部位に挿入するステップと、
トランスポゾン配列およびＤＮＡ組換え配列を含む別のＤＮＡ配列を標的ＤＮＡ配列コピーの他方の部位に挿入するステップと、
前記組換え配列間で組換え事象を誘導して、前記標的ＤＮＡ配列コピーの一部を欠失させるテップとを含む、ＤＰベクターを提供する。
【００９２】
組換えステップ後、ターゲティング構築物を回収し、ＤＰベクターへの挿入を単離することが好ましい。クローニングベクターから構築物を単離する任意の方法によって回収することができる。制限消化物は、ＤＰベクターへの挿入を促進する様式で構築物を切断することが望ましい。
【００９３】
なおさらに好ましい実施形態では、ターゲティング構築物は、
標的ＤＮＡ配列の第１の領域と相同組換えすることができる第１の相同ベクターＤＮＡ配列と、
前記細胞中で特徴的なポジティブ選択を付与することができるポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列と、
部位特異的リコンビナーゼの存在下で高効率ＤＮＡ組換えを補助し、前記ポジティブ選択マーカー中に含まれる第３の配列と、
前記標的ＤＮＡ配列の第２の領域と相同組換えを行うことができる第２の相同ベクターＤＮＡ配列と、
前記第３の配列との部位特異的組換えを指示するが、前記標的ＤＮＡ配列との相同組換えを実質的に行うことができない第４の配列とを含み、
前記ベクターが、前記第１の相同ベクターＤＮＡ配列の前記標的配列の前記第１の領域との相同組換えおよび前記第２の相同ベクターＤＮＡ配列の前記標的配列の前記第２の領域との相同組換えによって前記標的ＤＮＡ配列を改変することができる。
【００９４】
本明細書中で使用される、「改変された標的ＤＮＡ配列」は、ＤＰベクターによって改変されているターゲティング細胞ゲノム中のＤＮＡ配列をいう。改変されたＤＮＡ配列は、このような形質転換された標的細胞が由来する細胞と比較して第１の形質転換された標的細胞中の１つまたは複数のヌクレオチドの置換、挿入、および／または欠失を含む。いくつかの場合、改変された標的ＤＮＡ配列を、「第１の」および／または「第２の改変された標的ＤＮＡ配列」をいう。これらは、第１または第２の改変配列を含むＤＰベクターが標的ＤＮＡ配列に相同的に組み込まれた場合に形質転換された標的細胞で見出されるＤＮＡ配列に対応する。
【００９５】
「第１の形質転換された標的細胞」という場合がある「形質転換された標的細胞」は、ＤＰベクターが標的細胞ゲノムに相同的に組み込まれた標的細胞をいう。他方では、「形質転換された細胞」は、ＤＰがゲノムに非相同的にランダムに挿入された細胞をいう。「形質転換された標的細胞」は、一般に、改変された標的ＤＮＡ配列内にポジティブ選択マーカーを含む。ゲノム改変の目的が特定の遺伝子の発現を破壊することである場合、一般に、ターゲティング内因性遺伝子の転写および／または翻訳を有効に妨害するエクソン内にポジティブ選択マーカーを含んでいた。しかし、ゲノム改変の目的が外因性遺伝子を挿入して内因性遺伝子の欠失を修正することである場合、第１の形質転換された標的細胞中の改変された標的ＤＮＡ配列は、正常な（すなわち、非欠損）内因性遺伝子中で見出される配列に対応する外因性ＤＮＡ配列または内因性ＤＮＡ配列をさらに含む。
【００９６】
「第２の形質転換された標的細胞」は、その後ゲノムが所定の方法で改変される第１の形質転換された標的細胞をいう。例えば、第１の形質転換された標的細胞のゲノム中に含まれるポジティブ選択マーカーを、相同組換えによって切り出して、第２の形質転換された標的細胞を産生することができる。このような所定のゲノム操作の詳細を、以後により詳細に記載する。
【００９７】
本明細書中で使用される、「異種ＤＮＡ」は、標的ＤＮＡ配列を含む配列と異なるＤＮＡ配列をいう。異種ＤＮＡは、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、挿入、および／または欠失によって標的ＤＮＡと異なる。したがって、内因性遺伝子配列を、同一生物のゲノムの異なる調節領域へのその挿入をターゲティングするためにＤＰベクターに組み込むことができる。このようにして得た改変ＤＮＡ配列は、異種ＤＮＡ配列である。異種ＤＮＡ配列はまた、遺伝子欠損を修正または移入するか内因性遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を変化させるように改変された内因性配列を含む。さらに、異種ＤＮＡ配列は、内因性配列（例えば、異なる種由来の配列）に関連しない外因性ＤＮＡ配列を含む。このような「外因性ＤＮＡ配列」は、外因性ポリペプチドまたは外因性調節配列をコードする配列を含む。例えば、（例えば、哺乳動物分泌細胞中の）組織特異的発現のためのマウスまたはウシＥＳ細胞に移入することができる外因性ＤＮＡ配列には、ｔ−ＰＡ、第ＶＩＩＩ因子、および血清アルブミンなどのヒト血液因子が含まれる。ポジティブ選択マーカーをコードするＤＮＡ配列は、異種ＤＮＡ配列のさらなる例である。
【００９８】
本発明のさらに別の態様では、細胞ゲノム中の標的ＤＮＡ配列が改変された形質転換された細胞を富化する方法であって、
（ａ）ＤＰ選択ベクターで相同組換えを媒介することができる細胞をトランスフェクトするステップであって、前記ベクターが、
前記標的ＤＮＡ配列の第１の領域と相同組換えすることができる第１の相同ベクターＤＮＡ配列と、
前記細胞中で特徴的なポジティブ選択を付与することができるポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列と、
部位特異的リコンビナーゼの存在下でＤＮＡ組換えを補助し、前記ポジティブ選択マーカー中に含まれる第３の配列と、
前記標的ＤＮＡ配列の第２の領域と相同組換えを行うことができる第２の相同ベクターＤＮＡ配列と、
前記第３の配列との部位特異的組換えを指示するが、前記標的ＤＮＡ配列との相同組換えを実質的に行うことができない第４の配列とを含み、
前記ＤＰベクター中の前記配列の空間的順序は、前記第１の相同ベクターＤＮＡ配列、前記第３の配列を含む前記ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列、前記第２の相同ベクターＤＮＡ配列および前記第４の配列であり、
前記ベクターが、前記第１の相同ベクターＤＮＡ配列の前記標的配列の前記第１の領域との相同組換えおよび前記第２の相同ベクターＤＮＡ配列の前記標的配列の前記第２の領域との相同組換えによって前記標的ＤＮＡ配列を改変することができるステップと、
（ｂ）リコンビナーゼの存在下でポジティブ選択マーカーを含む形質転換された細胞の連続的または同時選択による相同組換えによって、前記ＤＰ選択ベクターが前記標的ＤＮＡ配列に組み込まれた形質転換された細胞を選択するステップと、
（ｃ）前記選択ステップで生存した形質転換された細胞のＤＮＡを分析して改変された細胞を識別するステップとを含む方法を提供する。
【００９９】
所望の相同組換え事象の選択は、標的化された事象とランダム事象との区別に基づく。標的化された事象では、標的ＤＮＡ配列ならびに第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列と組換えられて、ベクターのいずれかの末端でｌｏｘＰ部位またはＦＲＴ部位が排除される。したがって、Ｃｒｅ（またはＦＬＰなどの別のリコンビナーゼ）の存在下で、組換え事象が起こらず、ポジティブ選択マーカーは、インタクト且つ機能的なままである。したがって、マーカーＤＮＡを発現する細胞のポジティブ選択の維持により細胞が生存する。
【０１００】
あるいは、ランダムな事象では、ベクターの１つまたは両方の末端は、（一般に）インタクトなままであり、２つまたは３つの機能的ｌｏｘＰ部位またはＦＲＴが細胞ゲノムに組み込まれる。細胞内での誘導性Ｃｒｅ（またはＦＬＰなどの別のリコンビナーゼ）の活性化により、ポジティブ選択マーカーが非機能的になる。したがって、ポジティブ選択条件下での細胞の維持により、選択プロセスからこのような細胞が死滅または排除される。
【０１０１】
いくつかの環境下で、組換え事象が有効でなく、非相同組換え事象に対する排除率が比較的効率的ではない割合となる。これらの場合、プライマー配列は、ＰＣＲ反応によって検出される比較的稀な事象の検出が可能なように機能する。したがって、ＤＰ選択プロセスの終了時に、Ｃｒｅ下で細胞が維持されつづけて、プライマー配列および第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用したＰＣＲ反応によって検出可能な、継続しているが頻繁でない組換え率が得られる。
【０１０２】
ＤＰ法でＤＰベクターを使用して、ポジティブ選択マーカーを含む形質転換された標的細胞を選択する。このようなポジティブ選択手順により、相同組換えが起こった形質転換された標的細胞が実質的に富化する。本明細書中で使用される、「実質的富化」は、非相同な形質転換体に対する相同な形質転換体の比率と比較して少なくとも２倍の形質転換された標的細胞の富化、好ましくは、１０倍の富化、より好ましくは１０００倍の富化、最も好ましくは１０，０００倍の富化（すなわち、形質転換された細胞に対する形質転換された標的細胞の比）をいう。いくつかの場合、ランダム組み込みに対する相同組換えの頻度は、１０００個、いくつかの場合１０，０００個の形質転換された細胞のうちの１つである。ＤＰベクターおよび本発明の方法によって得られた実質的な富化により、約１％、より好ましくは約２０％、最も好ましくは約９５％の得られた細胞集団が、ＤＰベクターが相同的に組み込まれた形質転換された標的細胞を含む細胞集団がしばしば得られる。このような実質的に富化された形質転換された標的細胞集団を、その後の遺伝子操作、細胞培養実験、またはトランスジェニック動物もしくは植物などのトランスジェニック生物の産生に使用することができる。
【０１０３】
好ましい実施形態では、ＤＰ選択ベクターは、本明細書中に記載のトランスポゾン媒介法によって調製されたターゲティング構築物を含む。
【０１０４】
本発明のさらに別の態様では、本明細書中に記載の方法によって調製された形質転換された細胞を提供する。
【０１０５】
細胞は、ＤＰベクターを受けることができ、且つ標的ＤＮＡで改変された任意の原核細胞または真核細胞であり得る。
【０１０６】
本発明のなおさらなる態様では、相同組換えを媒介することができる細胞をＤＰ選択ベクターでトランスフェクトするステップと、前記ベクターが、
前記標的ＤＮＡ配列の第１の領域と相同組換えすることができる第１の相同ベクターＤＮＡ配列と、
前記細胞中で特徴的なポジティブ選択を付与することができるポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列と、
部位特異的リコンビナーゼの存在下でＤＮＡ組換えを補助し、前記ポジティブ選択マーカー中に含まれる第３の配列と、
前記標的ＤＮＡ配列の第２の領域と相同組換えを行うことができる第２の相同ベクターＤＮＡ配列と、
前記第３の配列との部位特異的組換えを指示するが、前記標的ＤＮＡ配列との相同組換えを実質的に行うことができない第４の配列とを含み、
前記ＤＰベクター中の前記配列の空間的順序は、前記第１の相同ベクターＤＮＡ配列、前記第３の配列を含む前記ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列、前記第２の相同ベクターＤＮＡ配列および前記第４の配列であり、
前記ベクターが、前記第１の相同ベクターＤＮＡ配列の前記標的配列の前記第１の領域との相同組換えおよび前記第２の相同ベクターＤＮＡ配列の前記標的配列の前記第２の領域との相同組換えによって前記標的ＤＮＡ配列を改変することができることとを含む、細胞ゲノムの改変を誘導する方法を提供する。
【０１０７】
好ましい実施形態では、ＤＰ選択ベクターは、本明細書中に記載のトランスポゾン媒介法によって調製されたターゲティング構築物を含む。
【０１０８】
改変は、遺伝子の欠失または遺伝子配列の置換を含んでもよい。改変は、標的ＤＮＡ配列の所定の改変であってもよい。
【０１０９】
多くの場合、破壊または改変されるべき遺伝子のエクソン中のポジティブ選択マーカーの位置付けによって遺伝子を破壊することが望ましい。例えば、特定の原癌遺伝子を、この方法によって改変してトランスジェニック動物を産生することができる。選択的に不活化された原癌遺伝子を含むこのようなトランスジェニック動物は、このような遺伝子の腫瘍形成およびいくつかの場合は正常な発達への遺伝的寄与の分析に有用である。
【０１１０】
遺伝子不活化の別の潜在的使用は、細胞表面上のタンパク性受容体の破壊である。例えば、推定ウイルス受容体発現を適切なＤＰベクターを使用して破壊した細胞株および生物を、ウイルスを使用してアッセイして、実際に受容体がウイルス感染に関与することを確認することができる。さらに、適切なＤＰベクターを使用して、特定の遺伝子欠失についてのトランスジェニック動物モデルを産生することができる。例えば、多数の遺伝子欠損は、特定の遺伝子の機能的遺伝子産物を発現することができないこと（例えば、αおよびβサラセミア、血友病、ゴーシェ病）およびα−１−抗トリプシン、ＡＤＡ、ＰＮＰ、フェニルケトン尿症、家族性高コレステロール血症、および網膜芽細胞種の発症に影響を与える欠損によって特徴付けられている。このような病態に関連する対立遺伝子の一方または両方が破壊されているか特定の遺伝子欠損をコードする改変を含むトランスジェニック動物を、治療モデルとして使用することができる。出生時に生存可能な動物について、実験的治療を提供することができる。しかし、遺伝子欠損が生存に影響を与える場合、トランスジェニック動物の適切な世代（例えば、Ｆ０、Ｆ１）を使用して、遺伝子治療のためのインビボ技術を研究することができる。
【０１１１】
相同組み込みによる遺伝子Ｘの破壊のための上記手段の改変形態は、発現に必要な１つまたは複数の調節配列が欠損したポジティブ選択マーカーの使用を含む。ポジティブ選択マーカーをコードする構造遺伝子セグメントから５’側に遺伝子Ｘの一部であるが全部ではない調節配列（例えば、Ｘ遺伝子のプロモーターの一部をコードする相同配列）がＤＰベクターに含まれるようにＤＰベクターを構築する。この構築の結果として、遺伝子Ｘのプロモーター領域に相同に組み込まれたような時間までに、ポジティブ選択マーカーは標的細胞で機能的ではない。このように組み込まれた場合、遺伝子Ｘは破壊され、このような細胞を標的遺伝子プロモーターの調節下で発現するポジティブ選択マーカーによって選択することができる。このようなアプローチの使用における唯一の制限は、ターゲティング遺伝子が使用した細胞型で活発に発現する必要があることである。そうでなければ、細胞に対して特徴的なポジティブ選択を付与するようにポジティブ選択マーカーは発現されない。
【０１１２】
多数の例では、例えば、いくつかの遺伝子治療への適用のために内因性遺伝子の破壊は望ましくない。このような状況では、ＤＰベクターのポジティブ選択マーカーを、非翻訳配列（例えば、標的ＤＮＡのイントロンまたは５’もしくは３’非翻訳領域）内に位置付けることができる。ポジティブ選択マーカーを、第１の配列と第２の配列との間に位置付ける。第４のＤＮＡ配列を、相同領域の外側に位置付ける。ＤＰベクターが相同組換えによって標的ＤＮＡに組み込まれる場合、ポジティブ選択マーカーは、ターゲティング遺伝子のイントロンに存在する。ターゲティング遺伝子と独立して発現および翻訳することができるように、選択マーカー配列を構築する。したがって、独立した機能プロモーター、翻訳開始配列、翻訳終止配列、およびいくつかの場合、ＤＰベクターでトランスフェクトした細胞型でそれぞれ機能的なポリアデニル化配列および／または１つまたは複数のエンハンサー配列を含む。この様式では、相同組換えによってＤＰベクターを組み込んだ細胞を、内因性遺伝子を破壊することなくポジティブ選択マーカーによって選択することができる。勿論、同一の調節配列を使用して、エクソン内に位置付けた場合にポジティブ選択マーカーの発現を調節することができる。勿論、当業者に公知の他の調節配列を使用することができる。それぞれの場合、調節配列が適切に整列され、必要に応じて、発現すべき特定のＤＮＡ配列を有する適切な読み取り枠に位置付ける。異なる起源由来の調節配列（例えば、エンハンサーおよびプロモーター）を、調整された遺伝子発現を得るために組み合わせることができる。
【０１１３】
勿論、本発明のＤＰベクターおよび方法によって得ることができる細胞ゲノム中の標的ＤＮＡ配列の多数の他の改変例が存在する。例えば、原癌遺伝子の発現を調節する内因性調節配列を、生物の特異的細胞型中の特定の遺伝子を積極的に発現するプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの調節配列（すなわち、組織特異的調節配列）と置換することができる。この様式では、特定の細胞型（例えば、トランスジェニック動物）における原癌遺伝子の発現を、原癌遺伝子が正常に発現しない細胞型における原癌遺伝子発現の効果が決定されるように調節することができる。あるいは、ウイルス癌遺伝子の組織特異的発現を引き起こすために、公知のウイルス癌遺伝子を標的ゲノムの特異的部位に挿入することができる。
【０１１４】
示すように、本発明のＤＰ選択法およびベクターを使用して、相同組換えを行うことができる標的細胞ゲノム中の標的ＤＮＡ配列を改変する。したがって、相同組換えを行うことができる任意の細胞型を使用して本発明を実施することができる。このような標的細胞の例には、ヒト、ウシ種、ヒツジ種、マウス種、サル種などの哺乳動物を含む脊椎動物および糸状菌などの他の真核生物、ならびに植物などの高等多細胞生物由来の細胞が含まれる。相同組換えを行うことができるグラム陽性およびグラム陰性細菌などの下等生物を使用して本発明を実施することもできる。しかし、一般に有意な非相同組換え（すなわち、ランダム組換え）が証明されていないので、このような下等生物は好ましくない。したがって、非相同形質転換体を選択する必要はほとんどないか全くない。
【０１１５】
最終目的が非ヒトトランスジェニック動物の産生である場合、胚幹細胞（ＥＳ細胞）および神経幹細胞は好ましい標的細胞である。ＥＳ細胞を、インビトロで培養した前移植胚から得ることができる。ＤＰベクターを、エレクトロポレーションもしくは微量注入または他の形質転換法（好ましくはエレクトロポレーション）によってＥＳ細胞に有効に移入することができる。その後に、このような形質転換ＥＳ細胞を、非ヒト動物の胚盤胞と組み合わせることができる。その後、ＥＳ細胞は、胚にコロニー化し、キメラ動物が得られる生殖細胞系に寄与することができる。本発明では、ＤＰベクターを、ＥＳ細胞ゲノムの特定の部分にターゲティングし、その後これを使用して標準的な技術によってキメラトランスジェニック動物を作製することができる。
【０１１６】
最終目的がヒトなどの生物の遺伝子欠損を修正するための遺伝子治療である場合、特定の疾患の原因およびどのようにして発症するかによって細胞型を決定する。例えば、造血幹細胞は、このような幹細胞から分化する細胞型（例えば、赤血球および白血球）における遺伝子欠損の修正に好ましい細胞である。したがって、鎌状赤血球貧血およびβサラセミアなどの赤血球のグロビン鎖合成における遺伝子欠損を、罹患患者から単離した造血幹細胞と共に本発明のＤＰベクターおよび方法の使用によって修正することができる。例えば、標的ＤＮＡが造血幹細胞中に含まれる鎌状細胞β−グロビン遺伝子であり、ＤＰベクターをこの遺伝子にターゲティングする場合、分化時に正常なβ−グロビンが発現する形質転換された造血幹細胞を得ることができる。欠損の修正後、造血幹細胞を患者の骨髄または全身循環に戻して正常なヘモグロビンを含む赤血球の亜集団を形成することができる。あるいは、照射および／または化学療法ならびにその後の改変された造血幹細胞の再移入およびそれによる欠失の調整によって患者の造血幹細胞を破壊することができる。
【０１１７】
幹細胞の他の型を使用して、このような幹細胞由来の細胞に関連する特定の遺伝子欠損を修正することができる。このような他の幹細胞には、上皮細胞、肝細胞、肺細胞、筋細胞、内皮細胞、間葉細胞、神経細胞、および骨幹細胞が含まれる。
【０１１８】
あるいは、遺伝子欠損自体は修正されず、欠損遺伝子の遺伝子産物が補足される方法での細胞ゲノムの改変によって、一定の病態を治療することができる。例えば、通常全身循環中に存在する因子に影響を与える障害を治療するためのヒト遺伝子治療のための標的として内皮細胞が好ましい。モデル研究では、イヌおよびブタの内皮細胞の使用により、初代培養物が形成され、培養においてＤＮＡで形質転換可能であり、宿主生物への動脈移植片の再移植の際に導入遺伝子を発現することができることが示された。内皮細胞が移植片の不可分の一部を形成するので、このような形質転換された細胞を使用して、循環系で分泌されるべきタンパク質を産生し、それにより循環因子に影響を与える遺伝病の治療における治療薬として使用することができる。このような疾患の例には、インスリン欠乏性糖尿病、α−１−抗トリプシン欠乏症、および血友病が含まれる。上皮細胞により、第ＶＩＩＩ因子欠乏血友病治療で特定の利点が得られる。これらの細胞は、フォン・ウィレブランド因子（ｖＷＦ）を天然に産生し、活性第ＶＩＩＩ因子の産生がｖＷＦの自立的合成に依存することが示された。
【０１１９】
免疫および／または循環系の他の疾患は、ヒト遺伝子治療の候補である。標的組織（骨髄）は現代技術によって容易に利用しやすく、インビトロでの幹細胞の培養において有利である。酵素アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）およびプリンヌクレオチドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）の変異に起因する免疫不全症は特に興味深い。遺伝子がクローン化されるだけでなく、ＤＰ遺伝子治療によって修正された細胞は変異対応物よりも選択的利点を有するようである。したがって、レシピエント患者における骨髄の除去は必要ない。
【０１２０】
ＤＰ選択アプローチは、以下の特徴を有する遺伝病に適用可能である。第１にＤＮＡ配列および好ましくはクローン化した正常遺伝子を利用可能なはずであること。第２に、適切な組織関連幹細胞または他の適切な細胞を利用可能なはずであること。
【０１２１】
示すように、欠損の修正のための隣接セグメントと共に遺伝子欠損部位付近のイントロンなどの非翻訳領域におけるポジティブ選択マーカーの位置付けによって特定の細胞株における遺伝子欠損を修正することができる。このアプローチでは、ポジティブ選択マーカーはそれ自体の調節下に置かれており、ターゲティング遺伝子の発現を実質的に妨害することなくマーカー自体を発現することができる。ヒト遺伝子治療では、特定の遺伝子欠損の修正に必要なＤＮＡ配列のみを移入することが望ましい。これに関して、相同組換えによる遺伝子欠損の修正後に残存するポジティブ選択マーカーを除去することが望ましいが、必ずしも必要ではない。
【０１２２】
本発明のＤＰベクターおよび方法を、植物細胞および最終的には植物全体のゲノムの操作に提供することもできる。広範な種々のトランスジェニック植物が報告されており、草本性双子葉植物、木本性双子葉植物、および単子葉植物が含まれる。このようなトランスジェニック植物および形質転換植物細胞を産生するための多数の異なる遺伝子導入技術が開発されている。１つの技術は、遺伝子導入系としてアグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用した（Ｒｏｇｅｒｓら、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１８、６２７〜６４０）。密接に関連する形質転換は、細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを使用する。これらの各系では、植物ゲノムに挿入されるＤＮＡ配列を定義するより広い領域を含むＴｉまたはＲｉ植物形質転換ベクターを構築することができる。以前にこれらの系を使用して、植物ゲノムに外因性ＤＮＡをランダムに組み込まれている。本発明では、適切なＤＰベクターを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換ベクターによって植物細胞に導入されたＤＮＡ配列を定義するより広い配列の間に植物形質転換ベクターを挿入することができる。
【０１２３】
好ましくは、本発明のＤＰベクターを、プロトプラストへの導入遺伝子の移入に以前に使用されている方法と類似の方法によって植物プロトプラストに直接導入する。あるいは、ＤＰベクターは、植物プロトプラストと融合することができるか核内微量注入によって植物プロトプラストに直接挿入されるリポソーム内に含まれる。微量注入は、好ましいプロトプラストトランスフェクション法である。ＤＰベクターを、分裂花房に微量注入することができる。最後に、導入遺伝子の挿入で使用された方法と類似のＤＰベクターでコートされた高速微粒子によって、組織移植片をトランスフェクトすることができる。このような形質転換移植片を使用して、例えば、種々の作物を連続的に再生することができる。
【０１２４】
上記の任意の方法によって一旦ＤＰベクターが植物細胞に挿入されると、相同組換えによりＤＰベクターが植物ゲノム中の適切な部位にターゲティングされる。トランスフェクションに使用した方法に依存して、形質転換プロトプラストまたは植物細胞の組織培養物に対してポジティブ−ネガティブ選択を行う。いくつかの場合、組織培養に影響を受ける細胞を、Ｆ₀またはその後の世代のいずれか由来の形質転換植物から切り出すことができる。
【０１２５】
本発明のＤＰベクターおよび方法を使用して、所定の方法で植物ゲノムを正確に改変する。したがって、例えば、除草剤、殺虫剤、および耐病性を、例えば、組織特異的耐性（例えば、葉および樹皮における昆虫耐性）を得るために特定の植物種に予想通りに操作することができる。あるいは、植物内の種々の成分の発現レベルを、種子中の脂肪酸および／または油含有量、植物内のデンプン含有量、および食品中の望ましくない風味に寄与する成分の消滅を変化させるための適切な調節因子の置換によって改変することができる。あるいは、異種遺伝子を植物の所定の調節下で植物に移入して、ゴムの製造で使用されるワックスおよび炭化水素を含む種々の炭水化物を産生することができる。
【０１２６】
例えば、リジンおよびトリプトファンが欠損していることが公知のコムギおよびトウモロコシ中の種々の貯蔵タンパク質のアミノ酸組成を改変することもできる。ＤＰベクターを、リジンおよび／またはトリプトファンをコードするためのこのような貯蔵タンパク質内の特定のコドンを変化させ、それによりこの作物の栄養価を増大させるように容易にデザインすることができる。
【０１２７】
種々の細胞および生物における特定のタンパク質発現を調節する種々のポジティブおよびネガティブ調節因子の発現レベルを改変することも可能である。したがって、このようなネガティブ調節因子の調節下で特定のタンパク質発現を増大するための適切なプロモーターの使用によって、ネガティブ調節因子の発現レベルを減少させることができる。あるいは、ポジティブ調節タンパク質の発現レベルを、調節されたタンパク質の発現を増大するために増加させるか、細胞または生物中の調節されたタンパク質量を減少させるために減少させることができる。
【０１２８】
本発明のＤＰベクターの基本エレメントは既に記載している。しかし、ＤＰベクターを含む各ＤＮＡ配列の選択は、使用した細胞型、改変すべき標的ＤＮＡ配列、および所望の改変型に依存する。
【０１２９】
好ましくは、ＤＰベクターは、線状二本鎖ＤＮＡ配列である。しかし、環状の閉じたＤＰベクターを使用することもできる。標的ＤＮＡ配列への相同組み込み頻度が増大するので、線状ベクターが好ましい（Ｔｈｏｍａｓら、１９８６、Ｃｅｌｌ、４４、４９）。
【０１３０】
一般に、ＤＰベクターは、全長が２．５ｋｂ（２５００塩基対）と１００ｋｂとの間である。サイズの下限は、２つの基準によって設定される。これらのうちの第１の基準は、ＤＰベクターおよび標的遺伝子座の第１の配列と第２の配列の間の相同性に必要な最小の長さである。この最小の長さは、約５００ｂｐ（ＤＮＡ配列１＋ＤＮＡ配列２）である。第２の基準は、第３の機能遺伝子の必要性である。最後に、ターゲティング組換え部位にさらなる短い部位が必要である（例えば、ＬｏｘＰ部位は３４ｂｐ長である）。実用的な理由のために、この下限は、各配列で約１０００ｂｐである。これは、公知のポジティブおよびネガティブ選択マーカーをコードする最も小さなＤＮＡ配列が約１．０〜１．５ｋｂ長であるからである。
【０１３１】
ＤＰベクターの長さの上限を、ＤＮＡフラグメントの操作に使用される技術の状態によって決定される。細菌プラスミドとしてこれらのフラグメントを増殖させる場合、実用的な長さの上限は約２５ｋｂであり、コスミドとして増幅させる場合、上限は約５０ｋｂであり、ＹＡＣ（酵母人工染色体）として増殖させる場合、上限は約２０００ｋｂである（例えば、ＣＥＰＨ Ｂ ＹＡＣはこのサイズであり得る）。
【０１３２】
ＤＰベクターの第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列は、標的ＤＮＡ配列の第１の領域および第２の領域中に含まれる配列部分に実質的に相同なＤＮＡ配列の一部である。ベクターと標的配列との間の相同性の程度は、２配列間の相同組合え頻度に影響を与える。１００％配列相同相同性が最も好ましいが、より低い配列相同性を使用して、本発明を実施することができる。したがって、約８０％の低さの配列相同性を使用することができる。配列相同性の実用的な下限を、さらなる減少によってゲノムへのＤＰベクターの相同組み込みが媒介されない場合の相同性として機能的に定義することができる。わずか２５ｂｐの１００％相同性が哺乳動物における相同組換えに必要であるにもかかわらず（Ａｙａｒｅｓら、１９８６、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８３、５１９９〜５２０３）、より長い領域が好ましい（例えば、各相同部分について５００ｂｐ、より好ましくは５０００ｂｐ、および最も好ましくは２５０００ｂｐ）。これらの数は、第１および第２の配列のそれぞれの長さの限度を定義する。好ましくは、非相同性の増大が遺伝子ターゲティングの頻度の減少が対応するので、ＤＰベクターの相同部分は標的ＤＮＡ配列と１００％相同である。ＤＰベクターの相同部分と標的ＤＮＡの適切な領域の間に相同性が存在しない場合、非相同性は相同部分全体に拡大しないが、相同部分の個別の領域に拡大することが好ましい。第４の配列に隣接するＤＰベクターの相同部分は標的ＤＮＡ中の対応領域と１００％相同であることも好ましい。これは、ＤＰベクター中の相同配列と非相同配列との間の最大不連続を確保することである。
【０１３３】
第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列の相同部分の組み合わせ中のＤＮＡ配列の絶対量が増加する場合、相同組換え頻度の増大が認められた。
【０１３４】
前述のように、第４のＤＮＡは、第４のＤＮＡ配列と標的ＤＮＡとの間の相同組換えの防止に十分な標的ＤＮＡ配列に対する非相同性を有するはずである。選択したネガティブ選択マーカーが標的ＤＮＡ配列に対する任意の実質的相同性を有する可能性が低いので、一般にこれは問題ではない。任意の事象では、第４のＤＮＡ配列と標的ＤＮＡ配列との間の配列相同性は、約５０％未満、最も好ましくは約３０％未満のはずである。
【０１３５】
第４のＤＮＡ配列と標的ＤＮＡ配列との間の十分な配列非相同性についての予備アッセイは、標準的なハイブリッド形成技術を使用する。例えば、特定のネガティブ選択マーカーを、放射性同位体または他の検出可能なマーカーで適切に標識し、標的細胞のゲノムＤＮＡのサザンブロット分析におけるプローブとして使用することができる。約５５℃でハイブリッド形成した場合の３×ＳＳＣなどの中程度のストリンジェンシー条件下でシグナルがほとんど検出されないか全く検出されない場合、第４の配列は、この細胞型での相同組換えのためにデザインしたＤＰベクターで機能的なはずである。しかし、シグナルが検出されたとしても、特定の第４の配列をこのゲノムをターゲティングするＤＰベクターで使用することができないことを必ず示す必要はない。これは、配列が標的ＤＮＡ配列と隣接していないゲノム領域とハイブリッド形成することができるためである。
【０１３６】
高ストリンジェンシーハイブリッド形成を使用して、ある種由来の遺伝子を異なる種における関連遺伝子にターゲティングすることができるかどうかを確認することも可能である。例えば、予備的な遺伝子治療実験は、ヒトゲノム配列をマウス細胞中の対応する関連ゲノム配列に置換することが必要であり得る。約６８℃での０．１×ＳＳＣなどの高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件を使用して、このような条件下でのハイブリッド形成シグナルをこのような配列のＤＰベクターの第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列中の相同部分として作用する能力と相関させることができる。このような実験を、公知の相同性が異なる種々のゲノム配列を使用して日常的に行うことができる。したがって、ハイブリッド形成の基準を、このような配列が組換え頻度を許容可能にする能力と相関させることができる。
【０１３７】
別の態様では、標的ＤＮＡ配列が改変されたゲノムを有するトランスジェニック植物または動物を産生する方法であって、前記方法が、
胚幹細胞集団をＤＰベクターで形質転換するステップと、
前記ＤＰベクターを含む細胞の選択および改変の存在について選択を生き抜いた細胞由来のＤＮＡの分析によってゲノムを有する細胞を識別するステップと、
細胞を胚に挿入するステップと、
前記胚から植物または動物を増殖させるステップと、
前記ＤＰベクターが、
前記標的ＤＮＡ配列の第１の領域と相同組換えすることができる第１の相同ベクターＤＮＡ配列と、
前記細胞中で特徴的なポジティブ選択を付与することができるポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列と、
部位特異的リコンビナーゼの存在下でＤＮＡ組換えを補助し、前記ポジティブ選択マーカー中に含まれる第３の配列と、
前記標的ＤＮＡ配列の第２の領域と相同組換えを行うことができる第２の相同ベクターＤＮＡ配列と、
前記第３の配列との部位特異的組換えを指示するが、前記標的ＤＮＡ配列との相同組換えを実質的に行うことができない第４の配列とを含み、
前記ＤＰベクター中の前記配列の空間的順序は、前記第１の相同ベクターＤＮＡ配列、前記第３の配列を含む前記ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列、前記第２の相同ベクターＤＮＡ配列および前記第４の配列であり、
前記ベクターが、前記第１の相同ベクターＤＮＡ配列の前記標的配列の前記第１の領域との相同組換えおよび前記第２の相同ベクターＤＮＡ配列の前記標的配列の前記第２の領域との相同組換えによって前記標的ＤＮＡ配列を改変することができる方法を提供する。
【０１３８】
好ましくは、ＤＰベクターは、本明細書中に記載のトランスポゾン媒介法によって調製されたターゲティング構築物を含む。
【０１３９】
胚幹細胞は、任意の動物または植物に由来し、当業者に利用可能な任意の方法によって単離および調製することができる。
【０１４０】
ＤＰベクターは、上記のものが好ましい。
【０１４１】
本発明のなおさらなる態様では、本明細書中に記載の方法によって調製されたトランスジェニック動物または植物を提供する。
【０１４２】
添付の実施例および図面を参照して本発明をより完全に記載する。しかし、以下の記載は、例示のみを目的とし、記載の本発明の一般性を制限すると決して解釈されないと理解すべきである。
【実施例１】
【０１４３】
［欠失を作製するためのトランスポゾン媒介手順の開発］
クローン化遺伝子中の欠失の作製のために、以前に開発された手順を使用して２つのミニＭｕトランスポゾンを構築することができる（Ｈａａｐａら、１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２７，２７７７〜２７８４）。適切なトランスポゾンの構築および欠失作製のためのその使用を、図１に示す。ここでは、例示のみを目的としてβ−ｇｅｏマーカーを使用し、他のマーカーも等しく適切である。ミニＭｕトランスポゾンの使用も例示するが、他のトランスポゾンも等しく有用であり得る。
【０１４４】
ミニＭｕトランスポゾン１を、以下のように構築することができる。原核生物／真核生物二重プロモーター（Ｐ／Ｐ）は、５’末端にトランスポゾン末端および３’末端にＬｏｘＰ配列が組み込まれたｐＥＧＦＰ−Ｎ１などのＣｌｏｎｔｅｃｈベクターから増幅させることができる。クロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃａｍ^r）を、３’末端にトランスポゾン末端が組み込まれたｐＡＣＹＣ１８４などのベクターから増幅させることができる。前者のＰＣＲ産物の５’側に後者をライゲーションすることができ、ｐＵＣ１９のポリリンカーにクローン化した構築物を含む。このトランスポゾンでは、細菌プロモーターは、Ｃａｍ^r遺伝子の発現を駆動する。
【０１４５】
ミニＭｕトランスポゾン２を、以下のように構築することができる。テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｅｔ^r）を、５’末端にトランスポゾン末端および３’末端にＬｏｘＰ配列を組み込んだｐＢＲ３２２などのプラスミドから増幅することができる。プロモーターレスβ−ｇｅｏ遺伝子を、３’末端にトランスポゾン末端を組み込んだｐβＡｃｌβｇｅｏなどのベクターから増幅することができる。前のＰＣＲ産物の５’に後者をライゲーションすることができ、ｐＵＣ１９のポリリンカーにクローン化した構築物を含む。このトランスポゾンでは、Ｔｅｔ^r遺伝子を大腸菌で発現することができるが、β−ｇｅｏ遺伝子はこの形態で発現されない。
【０１４６】
この技術の一般的適用図を、図２に示す。標的遺伝子を、ｐＮＥＢ１９３にクローン化し、２つのトランスポゾンを、所望の位置で正しい方向に挿入することができる。ミニＭｕトランスポゾン１を、インビトロ転位によってクローン化遺伝子に挿入し、転位混合物を大腸菌細胞に形質転換し、Ｃａｍ^rについて選択することができる。トランスポゾン挿入を、物理的にマッピングし、第１の所望の欠失点でのトランスポゾン挿入を選択することができる（これは、図１に示す方向であることが必要である）。次いで、ミニＭｕトランスポゾン２をクローンに挿入し、大腸菌中のＴｅｔ^rについて選択することができる。トランスポゾン挿入をマッピングし、第２の所望の欠失点でのトランスポゾン挿入を選択することができる（これは、図１に示す方向であることが必要である）。
【０１４７】
選択されたクローンを、ｃｒｅリコンビナーゼを発現する大腸菌ＥＡＫ１３３株に形質転換することができる。これにより、２つのＬｏｘＰ部位の間に、Ｃａｍ^r遺伝子およびＴｅｔ^r遺伝子ならびに２つのトランスポゾン間の標的動物遺伝子の一部が消滅した欠失が作製される。ミニＭｕトランスポゾン１上のプロモーターがβ−ｇｅｏ遺伝子の発現を駆動するので、これらの細胞をＫａｎ^rおよびＸ−Ｇａｌの存在下での青色によって選択することができる。Ｃａｍ^rおよびＴｅｔ^rの喪失ならびに制限消化またはＰＣＲによって欠失事象を確認することができる。
【０１４８】
遺伝子構築物をベクターから切り出し、実施例２のようにＤＰベクターの２つのポリリンカー間にクローン化し、ｎｅｏ^rカセットを置換することができる。ＤＰベクター上の切断物に適合するので、ｐＮＥＢ１９３の８ｂｐ切断物（cutter）をこの目的のために使用することができる。このクローニングステップを、ベクター間の遺伝子インサートを移動させるためのλバクテリオファージの組換え部位（att）の適用によって容易にすることができ、この組換えはクロナーゼ酵素混合物によって触媒される。このベクター変換系を使用して、ｐＮＥＢ１９３を、標的動物遺伝子をクローン化するためのドナーベクターに変化させることができる。同様に、ＤＰベクターを、ドナーベクターの欠失作製後の遺伝子のサブクローニングのための目的（destination）ベクターに変換することができる。
【０１４９】
インビトロトランスポゾン系を最初に使用することができるが、細菌の交雑によって転位が行われるインビボ系も開発することができる。このような系は、以下の成分が必要である。１）ベクター上のプラスミド導入起点（ｏｒｉＴ）、２）ｏｒｉＴを含むプラスミドの抱合的（conjugational）導入を駆動するためのミニトランスポゾン、トランスポザーゼ、および導入機能を提供する大腸菌株。標的遺伝子を含むベクターを、レシピエント株と交雑することができるこの株に最初に形質転換し、トランスポゾンによって保有される抗生物質耐性マーカーを選択することができる。Ｔｎ５挿入によって細菌遺伝子を変異誘発するためにこのような系を開発した（Ｚｈａｎｇら、１９９３、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｌｅｔｔ．，１０８、３０３〜３１０）。２つの改変によってこれを本発明の目的に適合することができる。第１に、トランスで作用する変異トランスポザーゼを作製する必要がない。第２に、転位免疫現象を排除するために２つの異なるトランスポゾンが必要であり得る。
【実施例２】
【０１５０】
［ＤＰベクター系を使用した改変］
記載の様式および組み合わせで適用した場合に当業者に利用可能な任意の方法によって、一般的なＤＰノックアウトベクターの構築方法を実施することができる。同様に、この誘導リコンビナーゼが安定に発現する細胞株の同時作製を使用した誘導性Ｃｒｅ（またはＦＬＰ）系の構築を当業者は利用することができる（この手順の詳細な説明は、一般に、Ｂｕｊａｒｄによってｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｍｂｈ．ｕｎｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／Ｂｕｊａｒｄ／Ｈｏｍｅｐａｇｅ．ｈｔｍｌで提供されている）。
【０１５１】
所望の相同組換え事象の選択は、標的化された事象とランダム事象との間の区別に基づく。標的化された事象では、標的ＤＮＡ配列およびＤＮＡ配列１および２を使用して組換えが起こり（図３Ａ：ＮＢ、三角はｌｏｘＰ部位を示す）、ベクターのいずれかの末端でｌｏｘＰ部位が排除される。したがって、マーカーＤＮＡを発現する細胞のポジティブ選択の維持により、細胞が生き残る。リコンビナーゼ（Ｃｒｅ）の誘導およびそれによる第２のポジティブ選択事象は、標的化された事象に影響を与えない。あるいは、ランダム事象では（図３Ｂ）、ベクターの１つまたは両方の末端は、（一般に）インタクトなままであり、２つまたは３つの機能的ｌｏｘＰが細胞ゲノムに組み込まれる。細胞内の誘導性リコンビナーゼ（Ｃｒｅ）の活性化により、非機能的マーカーが得られ（この場合、プロモーターは欠失されている）、それによりポジティブ選択条件で維持された細胞が死滅するか、選択プロセスから排除される。
【０１５２】
いくつかの環境では、組換え事象が不十分であり、非相同組換え事象における排除率が比較的低くなる。プライマー配列は、これらの場合、ＰＣＲ反応で検出可能な比較的稀な事象の検出が可能なように機能する。したがって、ＤＰ選択プロセスの終了時に、細胞は、Ｃｒｅ下で維持され続けて、継続的であるが不定期の組換え発生率が得られ、これを、図３ＡのｌｏｘＰ部位の外側の極端に（ｅｘｒｅｍｅ）左および右の領域中のプライマー配列ならびに第１または第２のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用したＰＣＲ反応によって検出することができる。
【実施例３】
【０１５３】
［ＤＰベクターの構築および標的遺伝子の挿入］
ダブルポジティブ選択（ＤＰ）を、図３に示す。通常、ベクター全体が非相同挿入（ランダム組み込み）で染色体に組み込まれるとという事実は、このＤＰベクターの基礎を形成する。ここでは、例示のみを目的としてｎｅｏ^rマーカーを使用するが、β−ｇｅｏ、ハイグロマイシン耐性、ゼオマイシン耐性、ＨＰＲＴ遺伝子、およびＧＦＰを含む他のマーカーも等しく適切である。また、ＦＬＰ／ＦＲＴなどの他の組換え系を使用して、Ｃｒｅ／ＬｏｘＰと置換することができる。
【０１５４】
標的遺伝子を含む最終構築物は、以下の順序で含まれ得る。プライマー結合配列−ＬｏｘＰ部位−標的遺伝子の短腕−ｎｅｏ^r遺伝子を駆動するためのプロモーター−別のＬｏｘＰ部位−ｎｅｏ^r遺伝子−標的遺伝子の長腕−第３のＬｏｘＰ部位−別のプライマー結合部位（図３Ｄ）。このベクターでは、ＬｏｘＰコピーによってｎｅｏ^r遺伝子をそのプロモーターから分離することができる。ＬｏｘＰコピーによるプロモーターおよび遺伝子の分離は遺伝子の転写に影響を与えないことが公知である。トランスフェクション後、ターゲティングおよびランダム挿入の両方を行った細胞は、ネオマイシン耐性を示す（第１のポジティブ選択）。しかし、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現後（ｐＴｅｔ−ｏｎ系−Ｃｌｏｎｔｅｃｈの調節下）、遺伝子ターゲティングを行った細胞（図３Ｂ）は、依然としてネオマイシン耐性を示す（第２のポジティブ選択）。対照的に、ランダム挿入を行った細胞（図３Ｃ）は、プロモーターもしくは構造ｎｅｏ^r遺伝子のいずれかまたは両方が消滅した任意の２つのＬｏｘＰ部位間の欠失のためにネオマイシンに感受性を示すようになる。
【０１５５】
一般的使用のためのＤＰベクターを、ポリリンカー中に３つの８ｂｐ切断物の１つの部位を保有するｐＵＣ１９誘導体であるｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）から構築することができる。以下の手順によってＤＰベクターの構築を行う（図３Ｄ）。Ｎｏｔ１部位が移入されたアニーリングオリゴヌクレオチドを使用して、ポリリンカーの左側のＥｃｏＲ１部位とＫｐｎ１部位との間にＬｏｘＰ配列をクローン化することができる。Ｆｓｅ１部位が移入されたアニーリングオリゴヌクレオチドを使用して、ポリリンカーの右側のＰｓｔ１部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に別のＬｏｘＰ配列をクローン化することができる。８ｂｐ切断物Ｎｏｔ１およびＦｓｅ１の制限部位は、動物細胞に対するトランスフェクション前のベクターの線状化を促進する。次いで、ＰＣＲによってｐＣＩ−ｎｏｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からｎｅｏ^r遺伝子（プロモーターなし）を増幅するし、ポリリンカーの中央のＢａｍＨ１部位とＰａｃ１部位との間にクローン化することができる。最後に、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターを、ｐＣＩ−ｎｅｏから増幅し（３’末端にＬｏｘＰ部位を組み込む）、ｎｅｏ^r遺伝子に対して５’でクローン化することができる。ＰＧＫまたはβ−アクチンを含む潜在的に有用な他のプロモーターが存在するか、特異的細胞株中で発現する細胞特異的プロモーター（例えば、雄生殖細胞中のプロタミンプロモーター）の組織を使用することができる。各ステップでは、オリゴヌクレオチド中に適切な制限部位を組み込むことができる。
【０１５６】
このようにして構築した新規のＤＰベクターでは、２つのポリリンカーは、ｎｅｏ^rカセットによって分離されるｐＮＥＢ１９３ポリリンカーに由来し得る。第１のポリリンカーは、８ｂｐ切断物Ａｓｃ１を用いたＫｐｎ１からＢａｍＨ１までの領域を対象として、第２のポリリンカーは、８ｂｐ切断物（Ｐａｃ１およびＰｍｅ１）を使用したＰａｃ１とＰｍｅ１との間の領域を対象とする。これら２つのポリリンカーを使用して、標的遺伝子のそれぞれ短腕および長腕をクローン化することができる。
【０１５７】
本研究で開発された両方の系における動物細胞での第２のポジティブ選択のために（非相同事象におけるネオマイシン耐性を除去するため）、Ｃｒｅ発現のタイミングが重要である。この調節されたＣｒｅ発現を２つの手段によって行うことができる。トランスジェニック実験およびノックアウト実験では、染色体に組み込まれたプラスミドＤＮＡにより、望ましくない副作用を生じ得る。この問題を克服するために、Ｃｒｅリコンビナーゼの一過性発現を使用して、ＬｏｘＰ部位に隣接するＤＮＡセグメントを除去した。Ｃｒｅを発現するアデノウイルスベクターの使用が特に興味深い（Ｋａｎｅｇａｅら、１９９５；Ｋａａｒｔｉｎｅｎ ＆ Ｎａｇｙ、２００１）。これらのベクターは、稀に染色体に組み込まれ、複製欠損であり、複製機能が提供された特定の細胞株でのみ増殖されるので、正常な細胞株では複製されない。さらに、トランスフェクション効率は、プラスミド発現ベクターよりもさらに高い（プラスミド発現ベクターについての約２０％と比較してアデノウイルスについてはほぼ１００％）。ＮＢ、任意の方法（タンパク質またはｃＤＮＡのトランスフェクション、タンパク質またはｃＤＮＡの微量注入を含む）を使用して、Ｃｒｅを発現することができる。
【実施例４】
【０１５８】
［２つのポジティブ選択マーカーを使用したダブルポジティブ選択ベクターの構築］
このベクターは、Ｎｅｏ^r遺伝子の後に別のＬｏｘＰ部位およびプロモーターレスハイグロマイシン耐性（Ｈｙｇ^r）遺伝子が存在すること以外は図３Ａ中のＤＰベクターと同一である。ベクターを使用して、ラット細胞をトランスフェクトし、ネオマイシン耐性について選択する。ターゲティング後、アデノウイルス−Ｃｒｅを使用したＣｒｅリコンビナーゼの発現により、Ｎｅｏ^r遺伝子が欠失し、Ｈｙｇ^r遺伝子が発現し、細胞にハイグロマイシン耐性が付与される。ＬｏｘＰ部位の外側に２つが存在するランダム組み込み事象では、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現により、プロモーターまたはＨｙｇ^r遺伝子（または両方）が欠失し、細胞にハイグロマイシン感受性が付与される。図３ＤのＮｅｏ^r遺伝子の後にＰａｃ１部位にＬｏｘＰ−Ｈｙｇ^rフラグメントを挿入することにより、このようなＤＰベクターを構築する。ベクターを、図４に示す。
【実施例５】
【０１５９】
［欠失を作製するためのトランスポゾン媒介手順の開発］
ａ）オリゴヌクレオチドプライマー
種々のトランスポゾンを構築するためのＤＮＡセグメントを増幅するためのＰＣＲ反応用のオリゴヌクレオチドプライマーを以下に示す。
【０１６０】
【化１】

【化２】

【化３】

【０１６１】
ｂ）ＰＣＲ
ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＰＣＲを行った。２００μＭの各ｄＮＴＰ、２０ｐｍｏｌの各プライマー、１．２５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含むＭｇＣｌ₂含有１×ＰＣＲ緩衝液（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含む５０μｌの反応混合物中で、テンプレートＤＮＡ（１０〜１００ｎｇ）を増幅させた。以下の条件下で３０サイクル反応を行った。変性、９４℃で３０秒；プライマーアニーリング、５５℃で３０秒；プライマー伸長、７２℃で１５０秒。最初のサイクルでの変性ステップを１５０秒に延長し、最後のサイクルでプライマー伸長ステップを５７０秒に延長した。
【０１６２】
ｃ）ＤＮＡクローニング
プライマーの５’末端での制限部位の組み込みによって移入された制限部位を有するＰＣＲ産物のクローニング効率が比較的低いので（Ｊｕｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８、６１５６，１９９０）、ＰＣＲ産物を平滑末端ライゲーションによってベクターに最初にクローン化した（Ｚｈａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４２、３９０〜３９５、１９９８）。これを行うために、Ｏｂｅｒｍａｉｅｒ−Ｋｕｓｓｅｒら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６９、１００７〜１０１５、１９９０）に記載のようにＰＣＲ産物をＫｌｅｌｏｗフラグメントで処理して、３’末端の人為的に重合したデオキシアデニル酸を除去した。次いで、産物を、ゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲル精製し、平滑末端制限酵素で消化したプラスミドベクターにクローン化した（Ｚｈａｎｇら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２９７，３４〜３８，１９９２）。インサートを配列決定し、必要と見なされる場合、適合する制限酵素を使用した消化およびライゲーションによって適切なベクターにサブクローン化した。
【０１６３】
ｄ）インビトロ転位
ＢｇＩＩＩでの消化およびゲル精製によって、細菌ベクターからトランスポゾンを放出させた。インビトロトランスポゾン反応物（２０μｌ）は、２０ｎｇミニＭｕトランスポゾン（ＢｇＩＩＩフラグメント）、４００ｎｇ標的プラスミドＤＮＡ、および０．２２μｇのＭｕＡトランスポゾンを含む１×転位緩衝液（ＦｉｎｎＺｙｍｅ）を含んでいた。３７℃で１時間反応を行い、その後７５℃１０分間インキュベートしてトランスポゾンを失活させた。反応混合物を使用して、大腸菌ＤＨ５αを形質転換するか、大腸菌ＤＨ１０βにエレクトロポレーションを行って、適切な抗生物質耐性マーカーを選択した。
【０１６４】
１．ミニＭｕトランスポゾン１の構築
原核生物／真核生物二重プロモーター（Ｐ／Ｐ）を、５’末端にＭｕトランスポゾン末端、および３’末端にＬｏｘＰ配列を組み込んだ、プライマーＭｕ１−１およびＭｕ１−２を使用したＣｌｏｎｔｅｃｈベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ１からＰＣＲによって増幅した。５’末端および３’末端のＳｍａＩ部位にＫｐｎＩ部位およびＢｇＩＩＩ部位を移入した。この産物を、ｐＵＣ９のＳｍａＩ部位にクローン化してｐＣＯ６を形成させた。３’末端にＭｕトランスポゾン末端を組み込んだプライマーＭｕ１−３およびＭｕ１−４を使用したＰＣＲによってｐＡＣＹＣ１８４からクロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃａｍ^r）を増幅させた。５’末端にＨｉｎｃＩＩ部位を移入し、３’末端にＢｇＩＩＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を移入した。この産物を、ｐＵＣ７のＨｉｎＩＩ部位の間にクローン化してｐＣＯ７を形成させた。ＨｉｎｃＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの消化によってＣａｍ^rインサートをｐＣＯＰ７から放出させ、ｐＵＣ１９のＨｉｎｃＩＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間にクローン化してｐＣＯ９を形成させた。ＫｐｎＩおよびＳｍａＩでの消化によってＰ／ＰインサートをｐＣＯ６から放出させ、ｐＣＯ９のＫｐｎＩ部位とＨｉｎｃＩＩ部位との間にクローン化した。これによりＬｏｘＰ配列によって分離された二重プロモーターＰ／ＰおよびＣａｍ^rを含み、遺伝子構築物全体がトランスポゾン末端に隣接したミニＭｕトランスポゾン１の構築が完了する。このトランスポゾンを保有するベクターを、ｐＣＯ１０と命名する（図５）。ＢｇＩＩＩでの消化により、ベクターからトランスポゾンが放出される。
【０１６５】
２．ミニＭｕトランスポゾン１の試験
ミニＭｕトランスポゾン１（Ｍｕ１−Ｃａｍ）を、クロラムフェニコール耐性について選択した標的ＤＮＡ分子としてｐＵＣ７を使用したインビトロでの転位能力を試験した。５０個のクロラムフェニコール耐性コロニーをアンピシリンプレート上にパッチした場合、１３個（２６％）がアンピシリンに感受性を示すことが見出され、トランスポゾンが挿入されてＡｍｐ^r遺伝子を不活化したことを示す。ｐＵＣ７のＡｍｐ^r遺伝子の比率（３０％）を考慮すると、このプラスミドに対するＭｕ１の挿入はランダムであった。これを、制限消化によってさらに確認した。３つのＡｍｐ^rコロニーおよび３つのＡｍｐ^sコロニーを選択し、プラスミドＤＮＡを単離した。ＤＮＡを、ｐＵＣ７において１回およびトランスポゾンにおいて２回切断するＳｓｐＩで消化した。異なるパターンが認められ（図６）、ｐＵＣ７に対するトランスポゾン挿入のランダムな性質ことが示唆される。図６では、レーン１〜３はＡｍｐ^r遺伝子に挿入されたトランスポゾンを含むｐＵＣ７であり、レーン４〜６は、Ａｍｐ^r遺伝子の外側に挿入されたトランスポゾンを有するｐＵＣ７である。
【０１６６】
３．ミニＭｕトランスポゾン２の構築
Ｍｉｎｉ−Ｍｕトランスポゾン２の３つの異なる異形を構築した。５’末端は、３つの異形の全てにおいて同一であり、トランスポゾン末端および細菌テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｅｔ^r）であった。これを、以下のように構築した。５’側にＫｐｎＩ−ＢｇＩＩＩ−トランスポゾン末端および３’末端にＸｈｏＩ部位を組み込んだプライマーＭｕ２−１およびＭｕ２−２を使用したＰＣＲによってＴｅｔ^r遺伝子をｐＢＲ３２２から増幅させた。この産物を、ｐＮＥＢ１９３のＨｉｃＩＩ部位にクローン化して、ｐＣＯ１９を形成させた。Ｍｉｎｉ−Ｍｕトランスポゾン２の３つの異形の完成を以下に示した。
【０１６７】
ａ）Ｍｕ２−Ｎｅｏ。このトランスポゾンは、Ｔｅｔ^r遺伝子の下流にネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ^r）を有する。５’にＸｈｏＩ−ＬｏｘＰおよび３’末端にトランスポゾン末端−ＢｇＩＩＩ−ＸｂａＩを組み込んだプライマーＭｕ２−Ｎｅｏ−１およびＭｕ２−Ｎｏｅ−２を使用してｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からＮｅｏ^r遺伝子を増幅させた。インサートのＸｈｏＩ部位がベクターのＫｐｎＩ部位に向かうような方法でｐＮＥＢ１９３のＨｉｎｃＩＩ部位にこの産物をクローン化して、ｐＣＯ１８を形成させた。ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩを使用してｐＣＯ１９のインサートを切り出し、ｐＣＯ１８のＫｐｎＩ部位とＸｈｏＩ部位との間にクローン化した。トランスポゾンＭｕ２−Ｎｅｏを保有するベクターを、ｐＣＯ２０と命名した（図７）。
【０１６８】
ｂ）Ｍｕ２−ＨｙｇＥＧＦＰ。このトランスポゾンは、Ｔｅｔ^r遺伝子の下流にハイグロマイシン耐性−ＥＧＦＰ融合遺伝子（ＨｙｇＥＧＦＰ）を有する。５’末端にＸｈｏＩ−ＬｏｘＰおよび３’末端にＢｇＩＩＩ部位を組み込んだプライマーＭｕ２−ＨｙｇＥＧＦＰ−１およびＭｕ２−ＨｙｇＥＧＦＰ−２を使用して、ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子のコード領域をｐＨｙｇＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅させた。この産物をｐＮＥＢ１９３のＨｉｎｃＩＩ部位にクローン化してｐＣＯ１５を形成させた。５’末端にＢａｍＨＩおよび３’末端にトランスポゾン末端−ＢｇＩＩＩ−ＸｂａＩを組み込んだプライマーＭｕ２−ポリＡ−１およびＭｕ２−ポリＡ−２を使用して、同一のプラスミドからＳＶ４０ポリＡシグナルを含む配列を増幅させた。この産物をｐＮＥＢ１９３のＨｉｎｃＩＩ部位にもクローン化して、ｐＣＯ１６を形成させた。ポリＡインサートを、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで切り出し、ｐＣＯ１５のＢｇＩＩＩ部位とＸｂａＩ部位との間にクローン化して、ｐＣＯ２１を形成させた。ポリＡを含むＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子をＸｈｏＩおよびＸｂａＩで切断し、ｐＣＯ１９のＸｈｏＩ部位とＸｂａＩ部位との間にクローン化した。トランスポゾンＭｕ２−ＨｙｇＥＧＦＰを保有するこのベクターを、ｐＣＯ２５と命名した（図８）。
【０１６９】
ｃ）Ｍｕ−２−β−ｇｅｏ。このトランスポゾンは、Ｔｅｔ^r遺伝子の下流にβ−ガラクトシダーゼ−ネオマイシン耐性融合遺伝子（β−ｇｅｏ）を有する。β−ｇｅｏ遺伝子のコード領域は約４ｋｂであり、本発明者らのＰＣＲ条件下で効率的に増幅することができず、遺伝子は２つのフラグメントとして増幅され、その後互いに連結し、遺伝子の中央でＳａｃＩ部位を活用した。５’末端にＸｈｏＩ−ＬｏｘＰおよび天然のＳａｃＩ部位の後の３’末端にＢｇＩＩＩ−ＸｂａＩ部位を組み込んだプライマーＭｕ２−ｇｅｏ−１およびＧｅｏＳａｃＢｇＩＸｂａを使用して、遺伝子の５’側の半分をｐＨβＡｃＩβｇｅｏ（Ｅ．Ｓｔａｎｌｅｙ、私信）から増幅させた。この産物を、平滑末端ライゲーションによってｐＮＥＢ１９３のＨｉｃＩＩ部位にクローン化し（ｐＣＯ２２が形成される）、その後ＰａｃＩおよびＰｍｅＩを使用してｐＣＯ４（このベクターはＳａｃＩ部位を含まない、以下を参照のこと）を形成させた（ｐＣＯ４０が形成される）。５’末端に天然のＳａｃＩ部位を含み、３’末端にＢｇＩＩＩ部位を組み込んだプライマーＳａｃＧｅｏおよびＭｕ２−ｇｅｏ−２を使用して、β−ｇｅｏ遺伝子の３’側の半分を増幅させた。この産物を、ｐＵＣ７のＨｉｃＩＩ部位（ｉｓｔｅ）にクローン化してｐＣＯ１３を形成させた。次いで、ｐＣＯ１６由来ポリＡシグナルを含むＢａｍＨＩ−ＢｇＩＩＩフラグメントをｐＣＯ１３のＢｇＩＩＩ部位にクローン化して、ｐＣＯ４１を形成させた。ＳａｃＩおよびＢｇＩＩＩでの消化によりｇｅｏ２：：ポリＡ部分が放出し、ｐＣＯ４０のＳａｃＩ部位とＢｇＩＩＩ部位との間にクローン化して、ｐＣＯ４２を形成させた。これにより、ポリＡシグナルおよびその後にトランスポゾン末端を有する完全なβ−ｇｅｏ遺伝子が得られた。この構築物を、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩで切り出し、ｐＣＯ１９のＸｈｏＩ部位とＸｂａＩ部位との間にクローン化した。トランスポゾンＭｕ２−β−ｇｅｏを保有するこのベクターを、ｐＣＯ４３と命名した（図９）。
【実施例６】
【０１７０】
［ラットＨＰＲＴ遺伝子のトランスポゾン変異誘発］
ラットＨＰＲＴ遺伝子のエクソン３およびエクソン４〜９の一部を含む２４ｋｂｋのＸｈｏＩフラグメント（図１０を参照のこと）を、ＰＡＣクローンからｐＮＥＢ１９３のＳａＩＩ部位にクローン化して、ｐＣＯ２８を形成させた。このクローンを、クロラムフェニコール耐性選択を用いたミニＭｕトランスポゾン１による転位のための標的として使用した。外側を指示する３’末端を有するミニＭｕトランスポゾン１の末端に存在するオリゴヌクレオチドＭｕ１ＣａｍＥｎｄＯｕｔｗａｒｄを、ＰＣＲ用の４つの各プライマーと組み合わせた。これらは、ＨＰＲＴｅｘｏｎ４Ｆ、ＨＰＲＴｅｘｏｎ５Ｆ、ＨＰＲＴｅｘｏｎ６Ｆ、ＨＰＲＴｅｘｏｎ７−９Ｆであった。４９個のＣａｍ^rコロニーをスクリーニングした場合、１〜３個のコロニーから各ＰＣＲ反応用の１ｋｂ以内のＰＣＲ産物が得られた（すなわち、２〜６％）。２７ｋｂのプラスミド（ベクターを含む）の一方向での任意の１ｋｂ領域中でのトランスポゾンの推定される挿入能力は２％である。スクリーニングした同数のコロニーを考慮すると、得られた比率は許容される。各ＰＣＲ用の１つのこのようなコロニーを選択した。これらは、隣接した位置を図１０の三角で示し、Ｃａｍ^r遺伝子の転写方向を矢印で示したトランスポゾン挿入を示した。これらは、トランスポゾンインサートの所望の方向を有し、ミニ−Ｍｕ２−Ｎｅｏのこれらへの転位を同様に行うことができる。
【実施例７】
【０１７１】
［ＤＰベクターの構築および標的遺伝子の挿入］
ａ）オリゴヌクレオチド
【化４】

【化５】

【０１７２】
ｂ）ＰＣＲおよびクローニング
以下を追加して実施例５と同一の方法を実施した。２つのオリゴヌクレオチドがアニーリングおよびクローン化された場合、５０ｐｍｏｌの各プライマーを最終体積１０μｌに混合し、加熱ブロックにて９５℃で５分間インキュベートした。次いで、加熱ブロックを切り、加熱ブロック中でサンプルを室温に緩やかに冷却した。適合末端を含まない２つの酵素でベクターを消化し、オリゴヌクレオチドをアニーリングし、ベクターにクローン化した。
【０１７３】
１．ＤＰベクターの構築
一方はＣＭＶプロモーターを含み、他方はＰＧＫプロモーターを有し、両方がＮｅｏ^r発現を駆動するＤＰベクターの２つの異形を構築した。オリゴ１およびオリゴ２をアニーリングし、ｐＮＥＢ１９３のＥｃｏＲＩ部位とＫｐｎＩ部位との間にクローン化して、ｐＣＯ３を形成させた。これにＮｏｔＩ部位およびＬｏｘＰ配列を移入し、同時にＥｃｏＲＩ部位を破壊した。次いで、オリゴ３およびオリゴ４をアニーリングし、ｐＣＯ３のＰｓｔＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間にクローン化してｐＣＯ４を形成させた。これにＬｏｘＰ配列およびＦｓｅＩ部位を移入し、同時にＨｉｎｄＩＩＩ部位を破壊した。プライマーＯｌｉｇｏＮｅｏ１およびＯｌｉｇｏＮｅｏ２を用いてｐＣＩ−ｎｅｏからネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ^r）を増幅させ、ｐＵＣ７のＨｉｃＩＩ部位の間にクローン化してｐＣＯ２を形成させた。次いで、ＢａｍＨＩおよびＰａｃＩを使用してＮｅｏ^r遺伝子を放出させ、ｐＣＯ４のＢａｍＨＩ部位とＰａｃＩ部位との間にクローン化してｐＣＯ５を形成させた。プライマーＯｌｉｇｏＣＭＶＰｒｏｍ１およびＯｌｉｇｏＣＭＶＰｒｏｍ２を使用してｐＣＩ−ｎｅｏからＣＭＶプロモーターを増幅させ、ｐＵＣ７のＨｉｃＩＩ部位の間にクローニングしてｐＣＯ１を形成させた。同様に、プライマーＯｌｉｇｏＰＧＫＰｒｏｍ１およびＯｌｉｇｏＰＧＫＰｒｏｍ２を使用してｐＫＯＳｃｒａｍｂｌｅｒＮＴＫＹ−１９０６からＰＧＫプロモーターを増幅させ、ｐＵＣ７のＨｉｎｃＩＩ部位の間にクローン化してｐＣＯ１２を形成させた。これら２つのプロモーターは、ＢａｍＨＩおよいｂＢｇＩＩＩを使用して各ベクターから放出され、ｐＣＯ５のＢａｍＨＩ部位にクローン化してそれぞれＤＰベクターの２つの異形を形成させた。ＣＭＶプロモーターを有するＤＰベクターをｐＣＯ８と命名し、ＰＧＫプロモーターを有するものをｐＣＯ１４と命名した（図１１）。
【０１７４】
２．大腸菌でのＤＰベクターの試験
２つのＤＰベクター（ｐＣＯ８およびｐＣＯ１４）を、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する大腸菌株に形質転換した。プラスミドＤＮＡを抽出し、Ｎｏｔ１消化によって線状化した。図１２では、レーン１およびレーン２はｐＣＯ８であり、レーン３およびレーン４はｐＣＯ１４である。プラスミドのサイズ（２．７ｋｂ）で判断したところ、ネオマイシン耐性遺伝子およびプロモーターの両方が欠失していた。これは、これらのベクターのＬｏｘＰ部位に隣接する配列をリコンビナーゼによって有効に除去することができることを示す。
【実施例８】
【０１７５】
［２つのポジティブ選択マーカーを使用したダブルポジティブ選択ベクターの構築］
ａ）オリゴヌクレオチドプライマー
【化６】

【０１７６】
ｂ）ＰＣＲおよびクローニング
実施例５および６と同一の方法を行った。
【０１７７】
１．ＤＰベクターの構築（図１３）
５’末端にＰｖｕＩ部位およびＬｏｘＰ配列、３’末端にＰａｃＩ部位を組み込んだプライマーＰｖｕＩＬｏｘＨｙｇおよびＨｙｇＰａｃＩを使用してｐＰＧＫＨｙｇからハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇ^r）を増幅させた。産物を、ｐＮＥＢ１９３のＨｉｎｃＩＩ部位にクローン化してｐＣＯ１７を形成させた。ＰａｃＩでの完全な消化およびその後のＰｖｕＩでの部分的消化（遺伝子上に内部ＰｖｕＩ部位が存在するため）によってＨｙｇ^r遺伝子が放出され、ＤＰベクターの両異形（ｐＣＯ８およびｐＣＯ１４）のＰａｃＩ部位にクローン化してｐＣＯ２６（ＣＭＶプロモーター）およびｐＣＯ２７（ＰＧＫプロモーター）を形成させた。
【実施例９】
【０１７８】
［ＨＰＲＴ遺伝子のためのノックアウトベクターの構築］
ａ）オリゴヌクレオチドプライマー
【化７】

【０１７９】
ＤＰベクターを立証するために、ノックアウトされるべき標的としてラットＨＰＲＴ遺伝子を選択した。短腕は、プライマーＨＰＲＴｅｘｏｎ７−９ＦおよびＨＰＲＴｅｘｏｎ７−９Ｆを使用してＰＡＣクローンから増幅したＰＣＲ産物であった。この産物を、ｐＵＣ７のＨｉｎｃＩＩ部位の間にクローン化してｐＣＯ３０を形成させた。ＢａｍＨＩを使用してインサートを放出させ、２つのＤＰベクターｐＣＯ１４およびｐＣＯ２７のＢａｍＨＩ部位にクローン化してそれぞれｐＣＯ３３およびｐＣＯ３４を形成させた。伝統的なポジティブ／ネガティブ選択ベクターを使用してターゲティング効率を比較するために、ｐＫＯ ＳｃｒａｍｂｌｅｒＮＴＫＹ−１９０６のＢａｍＨＩ部位に短腕をクローン化してｐＣＯ３２も形成させた。選択された長腕は、イントロン１からエクソン３までの８．８ｋｂのＸｈｏＩフラグメントであった。ＰＡＣクローンからｐＣＯ３３（ｐＣＯ３８が形成される）およびｐＣＯ３４（ｐＣＯ３９が形成される）のＳａＩＩ部位ならびにｐＣＯ３２（ｐＣＯ４４が形成される）のＸｈｏＩ部位にこれをクローン化した。３つのターゲティング構築物は、概略的に例示した図１４である（図は一定の比率で記載していない）。
【実施例１０】
【０１８０】
［ｌｏｘＰに隣接した（ｆｌｏｘｅｄ）β−ｇｅｏを用いたベクターの構築］
ａ）プライマー
【化８】

【０１８１】
哺乳動物細胞中のＬｏｘＰ組換え効率を試験するために、ＬｏｘＰ部位に隣接するβ−ｇｅｏを含むベクターを構築した。ラット細胞ゲノムにベクターを組み込み、Ｃｒｅリコンビナーゼを一過性に発現するアデノウイルスベクターを感染させる。Ｘ−Ｇａｌ染色で決定したβ−ｇｅｏ遺伝子を喪失した細胞の比率は、Ｃｒｅ媒介ＬｏｘＰの組換え効率を示す。
【０１８２】
１．ターゲティングベクターの構築
実施例５に記載のミニ−Ｍｕ２−β−ｇｅｏの構築に関して、β−ｇｅｏ遺伝子を２つのフラグメントとして増幅させ、その後互いに連結させて遺伝子の中央でＳａｃＩ部位を活用した。５’末端にＫｐｎＩおよび天然のＳａｃＩ部位の後の３’末端にＢｇＩＩＩ−ＸｂａＩ部位を組み込んだプライマーＫｐｎ−ｇｅｏ−１およびＧｅｏＳａｃＢｇＩＸｂａを使用して、遺伝子の５’側の半分を増幅させた。この産物を、平滑末端ライゲーションによってｐＮＥＢ１９３のＨｉｎｃＩＩ部位にクローン化し（ｐＣＯ４５が形成される）、その後ＫｐｎＩおよびＸｂａＩを使用してｐｐＣＯ４（このベクターはポリリンカーに隣接するＬｏｘＰを有する）を形成させた（ｐＣＯ４６が形成される）。プロモーターの各末端にＫｐｎＩ部位を組み込んだプライマーＫｐｎ−ＰＧＫ−１およびＭｕＥｎｄＥｃｏＳｗａＰＧＫ−２を使用して、ＰＧＫプロモーターを増幅させた。この産物を、平滑末端ライゲーションによってｐＮＥＢ１９３のＨｉｎｃＩＩ部位に産物をクローン化してｐＣＯ４７を形成させた。ＫｐｎＩを使用してインサートを放出させ、ｐＣＯ４６のＫｐｎＩ部位にクローン化してｐＣＯ４８を形成させた。５’末端にＢａｍＨＩ部位および３’末端にＫｐｎＩ−ＢｇＩＩＩ部位を組み込んだプライマーＭｕ２−ＰｏｌｙＡ−１およびＰｏｌｙＡ−Ｒを使用して、ｐＨｙｇＥＧＦＰからポリＡシグナルを含む配列を増幅させた。この産物を、ｐＮＥＢ１９３のＨｉｎｃＩＩ部位にクローン化してｐＣＯ４９を形成させた。ＢａｍＨＩおよびＢｇＩＩＩを使用してポリＡインサートを切り出し、ｐＣＯ１３のＢｇＩＩＩ部位にクローン化してｐＣＯ５０を形成させた。ＳａｃＩおよびＢｇＩＩＩでの消化によりｐＣＯ５０からｇｅｏ２：：ポリＡ部分が放出させ、ｐＣＯ４８のＳａｃＩ部位とＢｇＩＩＩ部位との間にクローン化して、ｐＣＯ５１を形成させた（図１５）。
【実施例１１】
【０１８３】
［ＨＰＲＴノックアウトを立証するためのサザンストラテジーのデザイン］
ａ）プライマー
【化９】

【化１０】

【０１８４】
上記の３つのＨＰＲＴターゲティングベクターの構造に基づいて、ＨＰＲＴ遺伝子のノックアウトを立証するためのサザンハイブリッド形成ストラテジーをデザインした。このストラテジーを、以下に示す（図１６、図は、一定に比率で記載しておらず、長腕および短腕のアラインメントを強調している）。
【０１８５】
プライマーＨＰＲＴＳｏｕｔｈｅｒｎ１およびＨＰＲＴＳｏｕｔｈｅｒｎ２を使用してＨＰＲＴ遺伝子の４０４ｂｐフラグメント（その位置を、左側の黒い四角によって示す）を増幅させ、ｐＣＵ７のＢａｍＨＩ部位の間にクローン化してｐＣＯ５１を形成させた。プローブとして使用した場合、これは、野生型ゲノムＤＮＡ由来の３ｋｂのＳｐｈＩフラグメントとハイブリッド形成する。ハイブリッド形成されたフラグメントのサイズは、ＰＤ−Ｎｅｏ、ＰＤ−Ｎｅｏ−Ｈｙｇ、およびｐＫＯを使用して作製したノックアウトについて、それぞれ２．４ｋｂ、３．８ｋｂ、および２ｋｂである。
【０１８６】
プライマーＳｏｕｔｈｅｒｎ３およびＨＰＲＴＳｏｕｔｈｅｒｎ４を使用してＨＰＲＴ遺伝子の４１４ｂｐフラグメント（その位置を、右側の黒い四角によって示す）を増幅させ、ｐＣＵ７のＢａｍＨＩ部位の間にクローン化してｐＣＯ５２を形成させた。プローブとして使用した場合、これは、野生型ゲノムＤＮＡ由来の５．５ｋｂのＰｓｔＩフラグメントとハイブリッド形成する。ハイブリッド形成されたフラグメントのサイズは、ＰＤ−Ｎｅｏ、ＰＤ−Ｎｅｏ−Ｈｙｇ、およびｐＫＯを使用して作製したノックアウトについて、それぞれ２．７ｋｂ、２．７ｋｂ、および２．５ｋｂである。
【０１８７】
最後に、本明細書中で概説した本発明の精神を逸脱することなく種々の他の改変形態および／または変形形態を得ることができると理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】ミニＭｕトランスポゾンの構築物および欠失作製でのその使用を示す図である。ＬｏｘＰ部位（白抜きの三角）によってクロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃａｍ^r）から分離された二重（細菌および真核生物）プロモーター（Ｐ／Ｐ）を含み、全構造がトランスポゾン末端に隣接するミニｍｕトランスポゾン−１を構築することができる。このトランスポゾンでは、細菌プロモーターおよび真核生物プロモーターの両方がＣａｍ^r遺伝子の発現を駆動することができる。テトラサイクリン耐性遺伝子（細菌プロモーターを含むＴｅｔ^r）−ＬｏｘＰ配列−プロモーターレスβ−ｇｅｏ遺伝子を含み、全構造がトランスポゾン末端に隣接するミニｍｕトランスポゾン−２を構築することができる。
ミニＭｕトランスポゾンの構造および欠失におけるその使用。Ｐ／Ｐ、原核生物／真核生物二重プロモーター；三角、ＬｏｘＰ配列；Ｃａｍ^r、プロモーターを含まないクロラムフェニコール耐性遺伝子；Ｔｅｔ^r、その天然の細菌プロモーターを含むテトラサイクリン耐性遺伝子；β−ｇｅｏ、プロモーターを含まないネオマイシン耐性−ＬａｃＺ融合遺伝子；太線、クローン化された標的遺伝子；細線、ベクター骨格。
【図２】クローン化動物遺伝子における欠失作製手順を示すフローチャートである。
【図３】ＤＰベクターの原理を示す図である。Ａ．ダブルポジティブベクターのデザイン。三角は、リコンビナーゼ（Ｃｒｅ）によって活性化されたＬｏｘＰ組換え部位を示す。Ｂ．Ｃｒｅリコンビナーゼの発現後、遺伝子ターゲティングを行った細胞は、依然としてネオマイシン耐性を示す（第２のポジティブ選択）。Ｃ．ランダム挿入を行った細胞は、プロモーターもしくは構造ｎｅｏ^r遺伝子のいずれかまたはその両方を喪失する任意の２つのＬｏｘＰ部位の間の欠失によりネオマシンに感受性を示すようになる。Ｄ．ＤＰベクター系の構築で採用することができるアプローチの例。
【図４】２つのポジティブ選択マーカーを含む別のＤＰベクターを示す図である。三角は、ｌｏｘＰ部位を示す。
【図５】ミニｍｕトランスポゾン１を保有するベクターｐＣＯ１０の構築を示す図である。
【図６】ミニｍｕトランスポゾン１の試験を示す図である。
【図７】トランスポゾンＭｕ２−Ｎｅｏを保有するベクターｐＣＯ２０の構築を示す図である。
【図８】トランスポゾンＭｕ２−ＨｙｇＥＧＦＰを保有するベクターｐＣＯ２５の構築を示す図である。
【図９】トランスポゾンＭｕ２−β−ｇｅｏを保有するベクターｐＣＯ４３の構築を示す図である。
【図１０】クローン化フラグメント上にラットＨＰＲＴ遺伝子のエクソン３およびエクソン４〜９の一部ならびにミニｍｕトランスポゾン１を含む２４ｋｂのＸｈｏＩフラグメントを示す図である。
【図１１】Ｎｅｏ^r発現を駆動するプロモーターを含むＤＰベクターを示す図である。
【図１２】ＤＰベクターの試験を示す図である。
【図１３】２つのポジティブ選択マーカーを含むＤＰベクターを示す図である。
【図１４】ラットＨＰＲＴ遺伝子のノックアウトベクター用のこれらのターゲティング構築物を示す図である。
【図１５】ｌｏｘＰに隣接した（ｆｌｏｘｅｄ）β−ｇｅｏを有するベクターの構築を示す図である。
【図１６】ＨＰＲＴノックアウトを評価するためのサザンストラテジーデザインを示す図である。

Claims (56)

1. ターゲティングベクター用のターゲティング構築物を調製する方法であって、前記ターゲティングベクターが標的ＤＮＡ配列を改変することができ、前記方法が、
   前記標的ＤＮＡ配列のコピーをインビトロで得るステップと、
   トランスポゾン配列およびＤＮＡ組換え配列を含むＤＮＡ配列を標的ＤＮＡ配列コピーの一方の部位に挿入するステップと、
   トランスポゾン配列およびＤＮＡ組換え配列を含む別のＤＮＡ配列を標的ＤＮＡ配列コピーの他方の部位に挿入するステップと、
   前記組換え配列間で組換え事象を誘導して、前記標的ＤＮＡ配列コピーの一部を欠失させるステップとを含む方法。
2. 前記挿入されたＤＮＡ配列がミニトランスポゾンを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記トランスポゾンが、Ｍｕ１−Ｃａｍ、Ｍｕ２−Ｎｅｏ、Ｍｕ２−Ｈｙｇ ＥＧＦＰ、およびＭｕ２−β−ｇｅｏを含んでなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
4. 前記組換え配列が、リコンビナーゼの影響下でｌｏｘＰおよび逆方向反復塩基配列（ＦＲＴ）を含んでなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記リコンビナーゼが、Ｃｒｅ、ＦＬＰ、またはリコンビナーゼのインテグラーゼファミリーを含んでなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
6. 前記リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーが、Ｇｌｎ、Ｈｉｎ、またはレソルバーゼを含んでなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
7. 前記組換え事象が、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰリコンビナーゼ系によって媒介される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記トランスポゾン配列が、選択可能なマーカーおよびプロモーター配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記選択可能なマーカーが、抗生物質耐性マーカーまたは酵素ベースのマーカーから選択される、請求項８に記載の方法。
10. 前記抗生物質耐性マーカーが、クロラムフェニコール耐性マーカー、テトラサイクリン耐性マーカー、またはネオマイシン耐性マーカーを含んでなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
11. 前記酵素ベースのマーカーが、β−ｇｅｏマーカーである、請求項９に記載の方法。
12. 前記トランスポゾンを含む前記ＤＮＡ配列を標的ＤＮＡに連続的に挿入する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記組換え事象の誘導が、Ｔｅｔ−ｏｎ系またはエクダイシン誘導系による、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 標的ＤＮＡ配列のコピーと、
    それぞれ組換え配列を含む少なくとも２つのトランスポゾン単位とを含み、
    前記組換え配列間の組換えの際に標的ＤＮＡコピーの一部が欠失するように前記標的ＤＮＡコピー内に前記トランスポゾン単位を挿入して位置付ける、標的ＤＮＡ配列の欠失の作成用のプレターゲティング構築物。
15. 前記トランスポゾン単位がミニｍｕトランスポゾン単位である、請求項１４に記載のプレターゲティング構築物。
16. 前記トランスポゾン単位が、Ｍｕ１−Ｃａｍ、Ｍｕ２−Ｎｅｏ、Ｍｕ２−Ｈｙｇ ＥＧＦＰ、およびＭｕ２−β−ｇｅｏを含んでなる群から選択される、請求項１４または１５に記載のプレターゲティング構築物。
17. 前記組換え配列が、リコンビナーゼの影響下にあるｌｏｘ−Ｐおよび逆方向反復塩基配列（ＦＲＴ）を含んでなる群から選択される、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のプレターゲティング構築物。
18. 前記リコンビナーゼが、Ｃｒｅ、ＦＬＰ、またはＧｌｎ、Ｈｉｎ、もしくはレソルバーゼを含むリコンビナーゼのインテグラーゼファミリーを含んでなる群から選択される、請求項１７に記載のプレターゲティング構築物。
19. 前記インテグラーゼファミリーが、Ｇｌｎ、Ｈｉｎ、またはレソルバーゼを含んでなる群から選択される、請求項１８に記載のプレターゲティング構築物。
20. 前記組換え事象が、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰリコンビナーゼ系によって媒介される、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載のプレターゲティング構築物。
21. 前記トランスポゾン単位が選択マーカーを含む、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載のプレターゲティング構築物。
22. 前記選択マーカーが、抗生物質耐性マーカーまたは酵素ベースのマーカーから選択される、請求項２１に記載のプレターゲティング構築物。
23. 前記マーカーが、クロラムフェニコール耐性マーカー、テトラサイクリン耐性マーカー、ネオマイシン耐性マーカー、またはβ−ｇｅｏマーカーを含んでなる群から選択される、請求項２２に記載のプレターゲティング構築物。
24. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法によって調製されたターゲティング構築物。
25. 細胞ゲノム中に含まれる標的ＤＮＡ配列を改変するためのダブルポジティブ（ＤＰ）ベクターであって、前記ＤＰベクターは、
    前記標的ＤＮＡ配列の第１の領域と相同組換えすることができる第１の相同ベクターＤＮＡ配列と、
    前記細胞中で特徴的なポジティブ選択を付与することができるポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列と、
    部位特異的リコンビナーゼの存在下で高効率ＤＮＡ組換えを補助する、前記ポジティブ選択マーカー中に含まれる第３の配列と、
    前記標的ＤＮＡ配列の第２の領域と相同組換えを行うことができる第２の相同ベクターＤＮＡ配列と、
    前記第３の配列との部位特異的組換えを指示するが、前記標的ＤＮＡ配列との相同組換えを実質的に行うことができない第４の配列とを含み、
    前記ＤＰベクター中の前記配列の空間的順序は、前記第１の相同ベクターＤＮＡ配列、前記第３の配列を含む前記ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列、前記第２の相同ベクターＤＮＡ配列および前記第４の配列であり、
    前記ベクターが、前記第１の相同ベクターＤＮＡ配列の、前記標的配列の前記第１の領域との相同組換えと、前記第２の相同ベクターＤＮＡ配列の、前記標的配列の前記第２の領域との相同組換えとによって前記標的ＤＮＡ配列を改変することができる、ＤＰベクター。
26. 前記第１のＤＮＡ相同ベクターＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ相同ベクターＤＮＡ配列が、前記標的ＤＮＡの第１の領域および第２の領域中の対応する部分に実質的に相同なＤＮＡの一部を含む、請求項２５に記載のＤＰベクター。
27. 前記第１の相同ベクターＤＮＡ配列および第２の相同ベクターＤＮＡ配列が、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で前記標的ＤＮＡの第１の領域および第２の領域とハイブリッド形成する、請求項２５または２６に記載のＤＰベクター。
28. 前記第１の相同ベクターＤＮＡ配列および第２の相同ベクターＤＮＡ配列が、配列多型を示さない、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載のＤＰベクター。
29. 前記ポジティブ選択マーカーが、薬物耐性遺伝子マーカー、蛍光マーカー、または生体発光マーカーを含んでなる群から選択される、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載のＤＰベクター。
30. 前記ポジティブ選択マーカーを、第１のＤＮＡ配列と第２のＤＮＡ配列との間に位置付ける、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載のＤＰベクター。
31. 前記第３の配列が、リコンビナーゼの影響下にあるｌｏｘＰまたは逆方向反復塩基配列（ＦＲＴ）を含んでなる群から選択される、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載のＤＰベクター。
32. 前記リコンビナーゼが、Ｃｒｅ、ＦＬＰ、またはＧｌｎ、Ｈｉｎ、もしくはレソルバーゼを含むリコンビナーゼのインテグラーゼファミリーを含んでなる群から選択される、請求項３１に記載のＤＰベクター。
33. 前記インテグラーゼファミリーが、Ｇｌｎ、Ｈｉｎ、またはレソルバーゼを含んでなる群から選択される、請求項３２に記載のＤＰベクター。
34. プロモーター配列が細胞内で活性化された場合に、ポジティブ選択マーカー遺伝子の発現を妨害することなく、前記第３の配列が挿入される、請求項２５〜３３のいずれか１項に記載のＤＰベクター。
35. 前記第３の配列が、選択マーカー遺伝子のプロモーターとコード領域との間に挿入される、請求項３４に記載のＤＰベクター。
36. 第４の配列が組換え配列である、請求項２５〜３５のいずれか１項に記載のＤＰベクター。
37. 前記組換え配列が、第３の配列がそれぞれｌｏｘＰまたはＦＲＴである場合に、ｌｏｘＰまたはＦＲＴから選択される、請求項３６に記載のＤＰベクター。
38. 前記第４の配列が、ＰＣＲプライマー部位または別の組換え部位としてさらなるＤＮＡ領域を含む、請求項３６または３７に記載のＤＰベクター。
39. 前記ポジティブ選択マーカーと同一であるか異なるさらなる選択マーカーをさらに含む、請求項２５〜３８のいずれか１項に記載のＤＰベクター。
40. 前記さらなる選択マーカーが、リコンビナーゼの影響下にある部位特異的組換え配列に隣接する、請求項３９に記載のＤＰベクター。
41. 前記組換え配列がｌｏｘＰまたはＦＲＴである、請求項４０に記載のＤＰベクター。
42. 少なくとも２つの選択可能なマーカーを含み、前記マーカーの一方がプロモーターレスマーカーであり、他方のマーカーがプロモーターの影響下にある、請求項３９に記載のＤＰベクター。
43. 前記プロモーターレスマーカーがハイグロマイシン耐性マーカー（Ｈｙｇ^r）である、請求項４２に記載のＤＰベクター。
44. 請求項２４に記載のターゲティング構築物を含むＤＰベクター。
45. 細胞ゲノム中の標的ＤＮＡ配列に改変を含む、形質転換された細胞を富化する方法であって、前記細胞が、
    （ａ）ＤＰ選択ベクターで相同組換えを媒介することができる細胞をトランスフェクトするステップであって、前記ベクターが、
    標的ＤＮＡ配列の第１の領域と相同組換えすることができる第１の相同ベクターＤＮＡ配列と、
    前記細胞中で特徴的なポジティブ選択を付与することができるポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列と、
    部位特異的リコンビナーゼの存在下でＤＮＡ組換えを補助する、前記ポジティブ選択マーカー中に含まれる第３の配列と、
    前記標的ＤＮＡ配列の第２の領域と相同組換えを行うことができる第２の相同ベクターＤＮＡ配列と、
    前記第３の配列との部位特異的組換えを指示するが、前記標的ＤＮＡ配列との相同組換えを実質的に行うことができない第４の配列とを含み、
    前記ＤＰベクター中の前記配列の空間的順序は、前記第１の相同ベクターＤＮＡ配列、前記第３の配列を含む前記ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列、前記第２の相同ベクターＤＮＡ配列および前記第４の配列であり、
    前記ベクターが、前記第１の相同ベクターＤＮＡ配列の、前記標的配列の前記第１の領域との相同組換えと、前記第２の相同ベクターＤＮＡ配列の、前記標的配列の前記第２の領域との相同組換えによって、前記標的ＤＮＡ配列を改変することができることと、
    （ｂ）リコンビナーゼの存在下でポジティブ選択マーカーを含む形質転換された細胞の連続的または同時選択による相同組換えによって、前記ＤＰ選択ベクターが前記標的ＤＮＡ配列に組み込まれた形質転換された細胞を選択するステップと、
    （ｃ）前記選択ステップで生存した形質転換された細胞のＤＮＡを分析して改変を含む細胞を識別するステップとを含む、方法。
46. 前記形質転換された細胞の選択が、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰリコンビナーゼ系によって媒介される、請求項４５に記載の方法。
47. 請求項４５または４６に記載の方法によって調製された形質転換された細胞。
48. 相同組換えを媒介することができる細胞をＤＰ選択ベクターでトランスフェクトするステップと、前記ベクターが、
    前記標的ＤＮＡ配列の第１の領域と相同組換えすることができる第１の相同ベクターＤＮＡ配列と、
    前記細胞中で特徴的なポジティブ選択を付与することができるポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列と、
    部位特異的リコンビナーゼの存在下でＤＮＡ組換えを補助する、前記ポジティブ選択マーカー中に含まれる第３の配列と、
    前記標的ＤＮＡ配列の第２の領域と相同組換えを行うことができる第２の相同ベクターＤＮＡ配列と、
    前記第３の配列との部位特異的組換えを指示するが、前記標的ＤＮＡ配列との相同組換えを実質的に行うことができない第４の配列とを含み、
    前記ＤＰベクター中の前記配列の空間的順序は、前記第１の相同ベクターＤＮＡ配列、前記第３の配列を含む前記ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列、前記第２の相同ベクターＤＮＡ配列および前記第４の配列であり、
    前記ベクターが、前記第１の相同ベクターＤＮＡ配列の、前記標的配列の前記第１の領域との相同組換えと、前記第２の相同ベクターＤＮＡ配列の、前記標的配列の前記第２の領域との相同組換えとによって前記標的ＤＮＡ配列を改変することができることとを含む、細胞ゲノムの改変を誘導する方法。
49. 前記ポジティブ選択マーカーが、破壊または改変される遺伝子のエクソンに位置付けられている、請求項４８に記載の方法。
50. 前記細胞が、哺乳動物を含む脊椎動物、糸状菌、および植物由来の細胞を含んでなる群から選択される、請求項４８または４９に記載の方法。
51. 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項５０に記載の方法。
52. 前記細胞が、胚細胞、神経細胞、上皮細胞、肝細胞、肺細胞、筋細胞、内皮細胞、間葉細胞、または骨幹細胞を含んでなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
53. 前記ＤＰベクターをエレクトロポレーションまたは微量注入によってトランスフェクトする、請求項４８〜５２のいずれか１項に記載の方法。
54. 標的ＤＮＡ配列に改変を含むゲノムを有するトランスジェニック植物または動物の産生方法であって、前記方法は、
    胚幹細胞集団をＤＰベクターで形質転換するステップと、
    前期ＤＰベクターを含む細胞の選択および改変の存在についての選択を生存した細胞由来のＤＮＡの分析によって前記ゲノムを有する細胞を識別するステップと、
    前記細胞を胚に挿入するステップと、
    前記胚から植物または動物を増殖させるステップとを含み、前記ＤＰベクターが、
    前記標的ＤＮＡ配列の第１の領域と相同組換えすることができる第１の相同ベクターＤＮＡ配列と、
    前記細胞中で特徴的なポジティブ選択を付与することができるポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列と、
    部位特異的リコンビナーゼの存在下でＤＮＡ組換えを補助し、前記ポジティブ選択マーカー中に含まれる第３の配列と、
    前記標的ＤＮＡ配列の第２の領域と相同組換えを行うことができる第２の相同ベクターＤＮＡ配列と、
    前記第３の配列との部位特異的組換えを指示するが、前記標的ＤＮＡ配列との相同組換えを実質的に行うことができない第４の配列とを含み、
    前記ＤＰベクター中の前記配列の空間的順序は、前記第１の相同ベクターＤＮＡ配列、前記第３の配列を含む前記ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列、前記第２の相同ベクターＤＮＡ配列および前記第４の配列であり、
    前記ベクターが、前記第１の相同ベクターＤＮＡ配列の、前記標的配列の前記第１の領域との相同組換えと、前記第２の相同ベクターＤＮＡ配列の、前記標的配列の前記第２の領域との相同組換えとによって前記標的ＤＮＡ配列を改変することができることとを含む、方法。
55. 請求項５４に記載の方法によって調製された動物。
56. 請求項５４に記載の方法によって調製された植物。

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