JP2005027519A - Simple method for detecting human cytochrome p4502a6 genetic polymorphism and reagent for detection - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method with which drug metabolic enzyme genetic polymorphism can definitely be detected by simple operation with good reproducibility and to provide a reagent therefor. <P>SOLUTION: The method for detecting the genetic polymorphism in exon 3 of a human cytochrome P4502A6 gene is characterized as using an oligonucleotide containing a sequence substantially complementary to any one of specific base sequences. The genetic polymorphism in the exon 3 of the human cytochrome P4502A6 gene is preferably detected by amplifying a sample containing the gene and/or its fragment. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

Translated fromJapanese

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中に存在する薬物代謝酵素遺伝子多型の中で特にヒトチトクロームＰ４５０２Ａ６の遺伝子多型を検出する方法および試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本発明において、遺伝子多型とは野生型とは異なる塩基配列を有することをいう。遺伝子の塩基多型は薬物代謝において副作用および治療失敗の発生において個体間変動の原因として重要な役割を果たし、体質として知られる基礎代謝等の個人差の原因としても知られている。その上、これらは多数の疾患の遺伝マーカーとしての働きもする。それゆえ、これら突然変異の解明は臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類が臨床研究における精神医学患者および自発志願者にとって特に推奨される（ＧｒａｍおよびＢｒｓｅｎ， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ． Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ， Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ， １９９０， 第８７〜９６頁； Ｂａｌａｎｔら、 Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． 第３６巻、第５５１〜５５４頁、（１９８９））。また、原因となる変異型遺伝子の同定に続くそれぞれの遺伝子型の検出用の核酸配列分析法が所望される。
【０００３】
従来の核酸配列分析技術としては、例えば核酸配列決定法（シークエンシング法）がある。核酸配列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定することができるが、鋳型核酸の調製、ＤＮＡポリメラーゼ反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸配列の解析等を行うため多大な労力と時間が必要である。また近年の自動シークエンサーを用いることで省力化は行うことができるが、高価な装置が必要であるという問題がある。
一方、遺伝子の点突然変異により引き起こされる遺伝病が種々知られており、それらの中には、遺伝子のどの部位がどのように点突然変異することにより遺伝病が引き起こされるかわかっているものも少なくない。
【０００４】
このような予想される点突然変異を検出する方法として、従来より、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（特許文献１，２参照）などの遺伝子増幅法を利用した遺伝子の点突然変異の検出方法が知られている。この方法では、遺伝子増幅法に用いる一対のオリゴヌクレオチドのうちの一方のオリゴヌクレオチドとして、野生型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な野生型用オリゴヌクレオチドと、変異型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な変異型用オリゴヌクレオチドとを用いる。変異型のオリゴヌクレオチドは、その３’末端が予想される点突然変異を起こしたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドになっている。このような野生型及び変異型用オリゴヌクレオチドをそれぞれ別個に用いて試料遺伝子を遺伝子増幅法に供する。
【０００５】
試料遺伝子が野生型であれば、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には核酸の増幅が起きるが、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には、オリゴヌクレオチドの３’末端が試料遺伝子の対応ヌクレオチドと相補的ではない（ミスマッチ）ので伸長反応が起きず、核酸の増幅は起きない。一方、試料遺伝子が変異型であれば、逆に、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には増幅が起きず、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きる。従って、各オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きるか否かを調べることにより、試料遺伝子が野生型か変異型かを判別することができ、それによって試料遺伝子中の点突然変異を同定することができる。この時増幅がおきたか否かを調べる方法として、増幅産物をアガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイド等の核酸特異的結合蛍光試薬を用いて染色の後、ＵＶ照射して増幅核酸の有無を検出できる。またほかの様式として、ナイロン膜上に増幅核酸を固定し、標識プローブを用いて検出するサザンブロット法、個体担体上に固定した補足プローブで捕捉した後検出プローブを作用させて検出するサンドイッチハイブリダイゼーション法、あるいは制限酵素の特異性を利用することによってＰＣＲ等の方法によって増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素で切断し、その断片長から変異の有無を検出するＲＦＬＰ法などが開発されてきた。さらに、近年では、ポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性を利用し、ハイブリした各遺伝子多型に相補的な標識オリゴヌクレオチドから標識をポリメラーゼ反応に応じて遊離させることによって検出する方法も開発されてきている。
【０００６】
【特許文献１】
特公平４−６７９６０号公報
【特許文献２】
特公平４−６７９５７号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記のような方法により増幅核酸を検出し、容易に多型を同定が行えるように思われるが、実際には、操作は煩雑であり、検出値を数値化することが困難である為に野生型シグナルと多型シグナルの比をとると言った解析が困難となり、正確な多型を同定するには多大な作業が必要であった。
【０００８】
たとえば電気泳動法によれば野生型及び多型型を別々に検出する必要がありまた泳動像から核酸量を正確に数値化することは困難である。またサザンブロット法やサンドイッチハイブリダイゼーション法ではプローブとのハイブリダイゼーション反応が必要であり、その条件を厳密に整える必要がある。更には過剰なプローブを除去する工程が必要であり、操作は非常に煩雑である。ＲＦＬＰ法では制限酵素処理を行う必要があり、処理時間によって結果が異なる課題がある。また薬物代謝酵素遺伝子多型を検出するためには数カ所の変異箇所を調べることが必要である。このため、上記方法においては数多くの工程を数カ所に対して個々に行わねばならず、検出作業には多大な労力が必要であった。
【０００９】
またさらには、ヒトチトクロームＰ４５０ ２Ａ６を含む遺伝子と相同性の高い領域が存在するため２Ａ６を特異的に増幅しかつ多型を検出可能であるオリゴヌクレオチドは、知られておらず、ヒトチトクロームＰ４５０ ２Ａ６遺伝子多型の検出においては特に多大な労力が必要なものであった。
本発明の目的は、上記のような課題を解決して、明確にかつ再現性よく薬物代謝酵素遺伝子多型を検出することができる方法及びそのための試薬を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、上記の従来法に対して、特定の塩基多型部位を含む核酸配列に、野生型検出用オリゴヌクレオチド及びまたは１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを同時に又は別々に反応させた後、２本鎖特異的該オリゴヌクレオチドの量を測定することで、煩雑な検出操作を必要とせずまた容易に数値化したデータが得られ、したがって明確な多型同定が可能となる方法を見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）配列表の配列番号１から１２で示される塩基配列の何れか１つに対して実質的に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とするヒトチトクロームＰ４５０ ２Ａ６遺伝子のエクソン３中の遺伝子多型を検出する方法。
【００１１】
（２）ヒトチトクロームＰ４５０２Ａ６遺伝子およびまたはその断片を含む試料を増幅させることによって、ヒトチトクロームＰ４５０ ２Ａ６遺伝子のエクソン３中の遺伝子多型を検出する（１）に記載の遺伝子多型を検出する方法。
【００１２】
（３）取得された増幅産物と核酸特異標識との相互作用により、検出することを特徴とする（２）記載の遺伝子多型を検出する方法。
【００１３】
（４）配列表の配列番号１から１２で示される塩基配列に対して実質的に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とするヒトチトクロームＰ４５０ ２Ａ６遺伝子のエクソン３中の遺伝子多型を検出する検出試薬。
【００１４】
（５） 配列表の配列番号１から１２で示される塩基配列の何れか１つに対して実質的に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用い、ヒトチトクロームＰ４５０２Ａ６遺伝子およびまたはその断片を含む試料を増幅させることによって、ヒトチトクロームＰ４５０ ２Ａ６遺伝子のエクソン３中の遺伝子多型を検出する試薬。
【００１５】
（６） 取得された増幅産物と核酸特異標識との相互作用により、検出することを特徴とする請求項５記載の遺伝子多型を検出する試薬。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。試料中に含まれる薬物代謝酵素の遺伝子多型部位を含む染色体又はその断片は、目的の遺伝子の情報を担う遺伝子多型部位を含む標的核酸であれば、特に制限されない。該標的核酸の例としては、Ａｌｕ配列、蛋白質をコードする遺伝子のエキソンやイントロン、プロモーターなどが例示できる。
【００１７】
本発明において、核酸配列を単に核酸ということがある。変異型核酸とは、野生型核酸のうち少なくとも１つ、好ましくは１つのヌクレオチドが点突然変異して他のヌクレオチドに置換されているものや、野生型核酸の一部に挿入、欠失配列等を含む核酸のことであり、どの部位のヌクレオチドが変異しているかが解明されているものである。このような遺伝子多型により薬物代謝酵素の代謝活性が異なっていることが解明されてきており、本発明の方法は試料中の核酸がこのような予想される変異を有しているか否かを検査し、被験者の有する薬物代謝酵素遺伝子のタイプを検出する方法である。
【００１８】
本発明は、ヒトチトクロームＰ４５０ ２Ａ６遺伝子のエクソン３中の遺伝子多型を検出する方法において、配列表の配列番号１から１２で示される塩基配列の何れか１つに対して実質的に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする。
なお、これらの配列は２Ａ６の変異部位に相当し、２Ａ６＊３（変異型）の配列に相当している。
【００１９】
ここで、実質的に相補的とは、完全に相補鎖として一致する必要はなく、一般の核酸増幅条件でハイブリダイゼーションが起こる程度に相補的であればよく、３箇所、好ましくは２箇所、さらに好ましくは１箇所までのミスマッチは許容範囲である。
【００２０】
本発明で用いるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１から１２で示される塩基配列の何れか１つに対して実質的に相補的な配列を含み、さらにこれに加えた配列を有していても良いが、実質的に相補的な配列より短く欠けているものしか有しない場合には、検出の再現性が乏しくなるため好ましくない。
本発明におけるオリゴヌクレオチドの好ましい長さとしては、１３〜３５塩基、さらに好ましい下限は１６塩基、さらに好ましい上限は３０塩基である。これらの範囲を超えると、再現性が低下したりすることがある。
【００２１】
本発明においては、配列表の配列番号１から１２で示される塩基配列の何れか１つに対して実質的に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子多型を検出する方法であれば、上述や以下に記述する従来の方法等その方法の如何によるものではないが、ヒトチトクロームＰ４５０２Ａ６遺伝子およびまたはその断片を含む試料を増幅させることによって、ヒトチトクロームＰ４５０ ２Ａ６遺伝子のエクソン３中の遺伝子多型を検出する方法であることが好ましい。
以下、ヒトチトクロームＰ４５０２Ａ６遺伝子およびまたはその断片を含む試料を増幅させる方法を中心に本発明を説明する。
【００２２】
本発明において、野生型オリゴヌクレオチドと変異型オリゴヌクレオチドを作用させる反応とは一般的に、一本鎖に変性した標的核酸にオリゴヌクレオチド、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）とＤＮＡポリメラーゼを作用させることで、標的核酸を鋳型とするオリゴヌクレオチド伸長反応が起こり核酸配列の相補鎖が合成される反応を含む。
【００２３】
本発明において、野生型用オリゴヌクレオチドとは、通常の表現型を有している遺伝子多型部位を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであって、変異型用オリゴヌクレオチドとは、野生型とは異なる配列を有している遺伝子多型部位を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００２４】
本発明に用いられる上記オリゴヌクレオチドの好ましい形態は、３‘末端の１〜３番目のヌクレオチドが野生型あるいは変異型配列のヌクレオチドと相補的に対応するように設計され、さらに必要に応じ３’末端から３〜５番目に人為的なミスマッチ塩基を導入されたものであってもよい。またさらに好ましくは３’末端かの１〜２番目のヌクレオチドが野生型あるいは変異型配列のヌクレオチドと相補的に対応するように設計され、さらに必要に応じ３’末端から３〜５番目に人為的なミスマッチ塩基を導入されたものである。
【００２５】
このように設計した場合野生型用オリゴヌクレオチド／野生型核酸及び変異型用オリゴヌクレオチド／変異型核酸の組合せにおいて、各オリゴヌクレオチドは為伸長反応は起こる。一方、野生型用オリゴヌクレオチド／変異型核酸及び変異型用オリゴヌクレオチド／野生型核酸の組合せにおいてはオリゴヌクレオチドの３‘末端近辺の塩基がミスマッチとなるため伸長反応が起こらない、さらにもう１塩基の人為的ミスマッチを導入した場合はさらに伸長反応が起こりにくくなる。
【００２６】
本発明におけるオリゴヌクレオチドの長さとしては、１３〜３５塩基が好ましく、さらに好ましい下限は１６塩基であり、さらに好ましい上限は３０塩基である。上記ミスマッチ部位は、該オリゴヌクレオチド中に少なくとも１つ存在する。また、その位置は、３’末端の３番目から５’末端までのいずれかであれば、特に限定されないが、好ましくは、３’末端の３番目に近い位置、より好ましくは、３’末端から３番目が好ましい。人為的なミスマッチの数の上限はハイブリダイゼーションする限りにおいて特に制限はないが、実質的な相補部分において、３箇所以内、さらには２箇所以内、特には１箇所であることが好ましい。また、実質的な相補部分以外、例えば５’末端側等に他の機能を持たせるため、完全には相補的でない配列を導入することもできる。
【００２７】
３番目に人為的ミスマッチを用いた場合、伸長反応を期待しない核酸配列を鋳型とした時には、塩基多型部位と併せて２塩基のミスマッチとなり、伸長反応が強く阻害される。
本発明においては、上記野生型用オリゴヌクレオチドと１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを、試料に別々、又は同時に作用させる。
【００２８】
本発明において、オリゴヌクレオチドの伸長方法は、基本的には、従来の方法を用いて行うことができる。通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼと共に、野生型用オリゴヌクレオチドと、１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを同時又はそれぞれ別個に用いて作用させることで、標的核酸を鋳型としてオリゴヌクレオチドが伸長する。
【００２９】
該伸長反応は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載の方法に従って行うことができる。本発明において、特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片の増幅方法も、基本的には、従来の方法を用いて行うことができ、通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼ及びリバースプライマーと共に、野生型用オリゴヌクレオチドと、１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチド（フォーワードプライマーに相当）を同時又はそれぞれ別個に用いて作用させることで、標的核酸を鋳型としてファワードオリゴヌクレオチドとリバースオリゴヌクレオチドの間で増幅される。
【００３０】
核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｎａｔｕｒｅ 第３５０巻、第９１頁（１９９１））、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ 第２０巻、第１６９１頁（１９９２））、ＲＣＡ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． 第３１巻、第３２７０頁（１９９３））Ｉｎｖａｄｅｒ法などが挙げられ、これらを参照することができる。
【００３１】
ＬＣＲ法は、標的核酸に２種類のオリゴヌクレオチド、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）とリガーゼを作用させ標的核酸上で２種類のオリゴヌクレオチドを結合させる反応を繰り返すことによって標的核酸を増幅させる方法である。
ＳＤＡは、その配列に制限酵素サイトを有する鋳型と相補的に結合するオリゴヌクレオチドを用い、伸長反応と制限酵素処理を繰り返すことによって核酸を増幅させる方法である。
ＲＣＡは、環状の標的核酸に対し相補的なオリゴヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼを作用させることによって、新たに生成したオリゴヌクレオチドが、鋳型から離されながら、連続的に標的核酸を増幅させる方法である。
【００３２】
ｉｎｖａｄｅｒ法は、ＤＮＡターゲットフラグメントに対して相補的配列を持つインベーダーオリゴと５’のフラップ構造を持ち、ＳＮＰを検出するための相補的オリゴ（シグナルプローブ）を使用する。まずターゲットＤＮＡに対してインベーダーオリゴとシグナルプローブをハイブリダイズさせる。この時、インベーダーオリゴとプローブは１塩基がオーバーラップする構造（ｉｎｖａｓｉｖｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を持つ。この部分にＣｌｅａｖａｓｅが作用し、ＳＮＰ部位のシグナルプローブの塩基とターゲットの塩基が相補的（ＳＮＰなし）の場合にはシグナルプローブの５’フリップが切断される。切断された５’フリップはＦＲＥＴ Ｐｒｏｂｅ （Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｂｅ）にハイブリダイズします。ＦＲＥＴ プローブ上には蛍光色素とクエンチャー（Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が近接しており、蛍光が抑制されているが、５’フリップＤＮＡが結合することによりＣｌｅａｖａｓｅによって蛍光色素の部分が切断され、蛍光シグナルが検出可能である。
【００３３】
なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチド及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各オリゴヌクレオチドと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各オリゴヌクレオチドを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２^ｎ倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。
【００３４】
上記のような核酸増幅法を利用した方法では、野生型核酸を増幅できる野生型用オリゴヌクレオチドと、変異型核酸を増幅できる変異型用オリゴヌクレオチドをそれぞれ別個又は同時に用いて遺伝子増幅法を行う。
【００３５】
野生型用オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸を伸長または増幅反応を行った場合、試料核酸が野生型であれば反応が起きるが、変異型では反応が起きない。逆に、変異型用オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸を伸長または増幅反応を行った場合、試料核酸が変異型であれば反応が起きるが、野生型であれば反応は起こらない。従って、一つの試料を二つに分け、一方は野生型用オリゴヌクレオチドを用いて反応を行い、他方は変異型用オリゴヌクレオチドを用いて反応を行い、反応が起ったか否かを調べることにより、試料核酸が野生型であるか変異型であるかを明確に知ることができる。特に、ヒトを始め、高等生物は、１種類の遺伝子について、父親由来の遺伝子と母親由来の遺伝子をそれぞれ１つずつ有しているが、この方法によれば、試料遺伝子が野生型のホモか、変異型のホモか、あるいは、両方のヘテロかを区別することもできる。すなわち、ヘテロの場合には、野生型遺伝子と変異型遺伝子が共に存在するから野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合も変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合も反応が起きる。
【００３６】
また、オリゴヌクレオチドが反応したか否かを検出する方法とは、特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片を含む核酸試料に、一定量の野生型用オリゴヌクレオチドと及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチド（フォーワードプライマーに相当）を同時にまたはそれぞれ別々に用いて反応を行った後、２本鎖核酸特異的結合物質と反応させることによって前記増幅反応により生じたオリゴヌクレオチド量を検出できる。
【００３７】
上記検出方法としては、標識したオリゴヌクレオチドを用いることも可能である。
例えば、該検出は、該各オリゴヌクレオチドを、予め酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などによって標識しておき、伸長又は増幅反応後に、反応したオリゴヌクレオチドの標識を検出することによって、遺伝子多型の検出を行うことができる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、ＦＩＴＣ，６−ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＴＡＭＲＡ，テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが挙げられる。
【００３８】
ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。
放射性物質としては、^３２Ｐ、^３５Ｓなどが挙げられる。
発光団としては、ルテニウムなどが挙げられる。
該標識は、オリゴヌクレオチドの伸長反応に影響を与えることがなければオリゴヌクレオチドのどの位置に結合させてもよい。好ましくは、５’ 部位である。野生型用オリゴヌクレオチドと変異型用オリゴヌクレオチドに異なる標識を用いた場合には、１つの反応槽で検出ができる。
【００３９】
キット
本発明の遺伝子多型検出試薬は、配列表の配列番号１から１２で示される塩基配列に対して実質的に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とするヒトチトクロームＰ４５０ ２Ａ６遺伝子のエクソン３中の遺伝子多型を検出する検出試薬である。
キットとしては野生型用オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチド、リバースオリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む薬物代謝酵素遺伝子多型検出用試薬キットを含むものであることが好ましい。
また、該各オリゴヌクレオチドは、予め上述したような酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などによって標識されていてもよい。
【００４０】
【実施例】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４１】
実施例１ ＣＹＰ２Ａ６＊３遺伝子多型の検出
（１）ＣＹＰ２Ａ６＊３遺伝子を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１〜４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ１〜４と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、（株）サワディー、Ｐｒｏｌｉｇｏ ＫＫ、アマシャムファルマシア バイオテク（株）等）に依頼した。
オリゴ１、３が野生型検出用のオリゴヌクレオチドであり、オリゴ２、４は２Ａ６＊３用のオリゴヌクレオチドである。なお、オリゴ１から４は必要により標識して使用されても良い。
なお、オリゴ２は配列番号７に対して実質的に相補的な配列を含み、オリゴ４は配列番号３に対して実質的に相補的な配列を含む。
【００４２】
（２）ＰＣＲ法によるＣＹＰ２Ａ６＊３遺伝子多型の解析
▲１▼ ＰＣＲ法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりＣＹＰ２Ａ６＊３遺伝子多型を解析した。
試薬
以下の試薬を含む２５μｌ溶液を調製した。
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１または２ ５ ｐｍｏｌ
オリゴ３または４ ５ ｐｍｏｌ
×１０緩衝液 ２．５ μｌ
２ｍＭ ｄＮＴＰ ２．５ μｌ
２５ ｍＭ ＭｇＣｌ_２ １．５ μｌ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ １．３ Ｕ
抽出ＤＮＡ溶液 １００ ｎｇ
【００４３】
オリゴ１：ａｃｃｔｃｃｃｃａｇ ｇｃｇｔｇｇｔａ
オリゴ２：ｇａｔｃｇａｃｔａｇ ｇｃｇｔｇｇｔａ
オリゴ３：ｃｃｇｃａｇｇｇｔｇ ｇｃｇａｔｇｇａｇ
オリゴ４：ｃｔｃａｇｇｇｔｇｇ ｃｇａｔｇｇｃａ
【００４４】
増幅条件
９５℃・５分
９５℃・３０秒、６５℃・３０秒、７２℃、３０秒（３５サイクル）
７２℃・２分。
【００４５】
▲２▼ 核酸特異的結合物質による検出
▲１▼の増幅反応液３μｌを１００００倍に希釈されたＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ製）の溶液１００μｌに加えて、室温にて攪拌後に暗室中で蛍光プレートリーダー（大日本製薬社）で蛍光強度量を測定した。所要時間は約５分であった。
得られた蛍光強度から、以下の計算式を用いて試料の蛍光強度量を算出した。
［式１］ ＦＬ（試料の蛍光強度）＝ＦＬｂ−ＦＬｓ
ＦＬｂ：Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ （試料が未添加）の蛍光強度
ＦＬｓ：各試料の蛍光強度
【００４６】
【表１】

【００４７】
比の算出方法：各オリゴを組合せた試薬によって同一サンプルから得られた
検出シグナルを除した値
上記のように、オリゴヌクレオチドを用いて、塩基多型特異的増幅反応を行い、増幅反応物質を核酸特異的結合物質を用いて測定することで、容易にかつ迅速に遺伝子型を明確に判定することができた。
【発明の効果】
上述したように、本発明により、試料核酸中の遺伝子多型を明確にまた簡便に検出できる方法が提供される。本発明の方法では、これまでの方法のように煩雑な操作を必要としないので、迅速で容易に再現性の良い結果が得られた。
【配列表】

[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method and a reagent for detecting a gene polymorphism of human cytochrome P4502A6 among polymorphisms of a drug metabolizing enzyme gene present in a sample.
[0002]
[Prior art]
In the present invention, gene polymorphism means having a nucleotide sequence different from that of the wild type. The nucleotide polymorphism of a gene plays an important role as a cause of inter-individual variation in the occurrence of side effects and treatment failures in drug metabolism, and is also known as a cause of individual differences such as basic metabolism known as constitution. In addition, they also serve as genetic markers for a number of diseases. Therefore, elucidation of these mutations is clinically important, and routine phenotyping is particularly recommended for psychiatric patients and volunteers in clinical studies (Gram and Brsen, European Consensus Conference on Pharmacogenetics. Commission of the European Communities, Luxemburg, 1990, pp. 87-96; Balant et al., Eur. J. Clin. Pharmacol., 36, 551-554, (1989)). In addition, a nucleic acid sequence analysis method for detecting each genotype following identification of the causative mutant gene is desired.
[0003]
As a conventional nucleic acid sequence analysis technique, for example, there is a nucleic acid sequencing method (sequencing method). Nucleic acid sequencing can detect and identify nucleotide polymorphisms contained in nucleic acid sequences, but requires a great deal of effort to prepare template nucleic acids, DNA polymerase reaction, polyacrylamide gel electrophoresis, analysis of nucleic acid sequences, etc. And time is needed. Further, labor can be saved by using a recent automatic sequencer, but there is a problem that an expensive apparatus is required.
On the other hand, there are various known genetic diseases caused by point mutations in genes, and some of them know which part of the gene and how point mutations cause genetic diseases. Not a few.
[0004]
As a method for detecting such a predicted point mutation, a method for detecting a point mutation of a gene using a gene amplification method such as a PCR (polymerase chain reaction) method (see Patent Documents 1 and 2) has been conventionally used. Are known. In this method, as one of the pair of oligonucleotides used in the gene amplification method, a wild-type oligonucleotide that is completely complementary to the end region of the wild-type gene amplification region and the mutant-type gene amplification A mutant oligonucleotide that is completely complementary to the end region of the region is used. Mutant oligonucleotides have nucleotides complementary to the predicted point mutation at the 3 'end. Such wild-type and mutant-type oligonucleotides are separately used to subject the sample gene to the gene amplification method.
[0005]
If the sample gene is wild-type, nucleic acid amplification occurs when a wild-type oligonucleotide is used, but if a mutant-type oligonucleotide is used, the 3 ′ end of the oligonucleotide corresponds to the sample gene. Since it is not complementary to the nucleotide (mismatch), no extension reaction occurs, and no nucleic acid amplification occurs. On the other hand, if the sample gene is a mutant type, conversely, amplification does not occur when the wild-type oligonucleotide is used, and amplification occurs when the mutant-type oligonucleotide is used. Therefore, by examining whether amplification occurs when using each oligonucleotide, it is possible to determine whether the sample gene is a wild type or a mutant type, thereby identifying a point mutation in the sample gene. Can do. As a method to check whether amplification has occurred at this time, the amplified product is subjected to agarose gel electrophoresis, stained with a nucleic acid-specific binding fluorescent reagent such as ethidium bromide, and then irradiated with UV to detect the presence of amplified nucleic acid. it can. Other methods include Southern blotting, in which amplified nucleic acid is immobilized on a nylon membrane and detected using a labeled probe, sandwich hybridization in which detection probe is acted on after capturing with a supplementary probe immobilized on an individual carrier. An RFLP method has been developed in which a DNA fragment amplified by a method such as PCR or a method such as PCR by utilizing the specificity of a restriction enzyme is cleaved with a restriction enzyme and the presence or absence of mutation is detected from the fragment length. Furthermore, in recent years, a method has been developed in which a 5 ′ exonuclease activity of a polymerase is used to detect a label by releasing it from a labeled oligonucleotide complementary to each hybridized gene polymorphism in accordance with the polymerase reaction. .
[0006]
[Patent Document 1]
Japanese Examined Patent Publication No. 4-67960
[Patent Document 2]
Japanese Patent Publication No. 4-67957
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
Although it seems that the amplified nucleic acid can be detected by the method as described above and the polymorphism can be easily identified, the operation is complicated and it is difficult to quantify the detected value. The analysis of taking the ratio of type signal to polymorphic signal became difficult, and a great deal of work was required to identify the correct polymorphism.
[0008]
For example, according to the electrophoresis method, it is necessary to separately detect the wild type and the polymorphic type, and it is difficult to accurately quantify the amount of nucleic acid from the electrophoretic image. Further, Southern blotting and sandwich hybridization require a hybridization reaction with a probe, and the conditions must be strictly adjusted. Furthermore, a process for removing excess probes is required, and the operation is very complicated. In the RFLP method, it is necessary to perform a restriction enzyme treatment, and there is a problem that the result varies depending on the treatment time. In addition, in order to detect a drug-metabolizing enzyme gene polymorphism, it is necessary to examine several mutation sites. For this reason, in the above method, many steps must be performed individually for several places, and the detection work requires a great deal of labor.
[0009]
Furthermore, since a region having high homology with a gene containing human cytochrome P450 2A6 exists, an oligonucleotide that specifically amplifies 2A6 and can detect a polymorphism is not known, and human cytochrome P450 2A6 is not known. In detection of gene polymorphism, a particularly large amount of labor is required.
An object of the present invention is to solve the above-described problems and provide a method and a reagent therefor capable of detecting a drug-metabolizing enzyme gene polymorphism clearly and reproducibly.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
In view of the above circumstances, the present inventors, as a result of intensive studies, in comparison with the above-described conventional method, a nucleic acid sequence containing a specific nucleotide polymorphism site is used as a wild type detection oligonucleotide and / or one or two kinds of oligonucleotides. After reacting the oligonucleotides for mutation at the same time or separately, measuring the amount of the double-strand-specific oligonucleotide can easily obtain numerical data without requiring a complicated detection operation, Therefore, a method that enables clear polymorphism identification has been found and the present invention has been completed.
That is, the present invention has the following configuration.
(1) Exon 3 of human cytochrome P450 2A6 gene characterized by using an oligonucleotide containing a sequence substantially complementary to any one of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 in the sequence listing A method for detecting polymorphisms in a gene.
[0011]
(2) The method for detecting a gene polymorphism according to (1), wherein a gene polymorphism in exon 3 of the human cytochrome P450 2A6 gene is detected by amplifying a sample containing the human cytochrome P450 2A6 gene and / or a fragment thereof.
[0012]
(3) The method for detecting a genetic polymorphism according to (2), wherein the detection is performed by interaction between the obtained amplification product and a nucleic acid-specific label.
[0013]
(4) A gene polymorphism in exon 3 of human cytochrome P450 2A6 gene, characterized in that an oligonucleotide containing a sequence substantially complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 in the sequence listing is used Detection reagent to detect.
[0014]
(5) A sample containing a human cytochrome P4502A6 gene and / or a fragment thereof using an oligonucleotide primer containing a sequence substantially complementary to any one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 in the sequence listing A reagent for detecting a gene polymorphism in exon 3 of the human cytochrome P450 2A6 gene by amplifying.
[0015]
(6) The reagent for detecting a genetic polymorphism according to claim 5, wherein the reagent is detected by the interaction between the obtained amplification product and a nucleic acid-specific label.
[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail. The chromosome or fragment thereof containing the gene polymorphic site of the drug metabolizing enzyme contained in the sample is not particularly limited as long as it is a target nucleic acid containing the gene polymorphic site that bears information on the target gene. Examples of the target nucleic acid include Alu sequences, exons of genes encoding proteins, introns, promoters, and the like.
[0017]
In the present invention, the nucleic acid sequence may be simply referred to as a nucleic acid. Mutant nucleic acids are those in which at least one of wild-type nucleic acids, preferably one nucleotide is point-mutated and replaced with other nucleotides, or inserted or deleted sequences in a part of wild-type nucleic acid, etc. It has been elucidated which part of the nucleotide is mutated. It has been elucidated that the metabolic activity of drug-metabolizing enzymes differs depending on such gene polymorphisms, and the method of the present invention determines whether or not the nucleic acid in a sample has such an expected mutation. This is a method for testing and detecting the type of drug metabolizing enzyme gene possessed by a subject.
[0018]
The present invention is a method for detecting a gene polymorphism in exon 3 of a human cytochrome P450 2A6 gene, and is substantially complementary to any one of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 12 in the sequence listing. An oligonucleotide containing the sequence is used.
These sequences correspond to the 2A6 mutation site and to the 2A6 * 3 (mutant) sequence.
[0019]
Here, “substantially complementary” does not need to match completely as complementary strands, and may be complementary to such an extent that hybridization occurs under general nucleic acid amplification conditions. Preferably up to one mismatch is acceptable.
[0020]
The oligonucleotide used in the present invention comprises a sequence substantially complementary to any one of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 in the sequence listing, and further has a sequence added thereto. However, it is not preferable to have only a portion that is shorter than a substantially complementary sequence and lacks the reproducibility of detection.
The preferred length of the oligonucleotide in the present invention is 13 to 35 bases, the more preferred lower limit is 16 bases, and the more preferred upper limit is 30 bases. If these ranges are exceeded, reproducibility may be reduced.
[0021]
In the present invention, any method can be used for detecting a gene polymorphism using an oligonucleotide containing a sequence substantially complementary to any one of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 12 in the sequence listing. Although not depending on the method, such as the conventional method described above and below, the gene in the exon 3 of the human cytochrome P450 2A6 gene is amplified by amplifying a sample containing the human cytochrome P4502A6 gene and / or a fragment thereof. A method for detecting the mold is preferred.
Hereinafter, the present invention will be described focusing on a method for amplifying a sample containing the human cytochrome P4502A6 gene and / or a fragment thereof.
[0022]
In the present invention, the reaction of reacting a wild-type oligonucleotide and a mutant-type oligonucleotide generally comprises an oligonucleotide, four types of deoxynucleoside triphosphates (dNTP) and a DNA polymerase on a target nucleic acid denatured into a single strand. This includes a reaction in which an oligonucleotide extension reaction using the target nucleic acid as a template occurs to synthesize a complementary strand of the nucleic acid sequence.
[0023]
In the present invention, the wild-type oligonucleotide is an oligonucleotide having a sequence complementary to a chromosome containing a gene polymorphic site having a normal phenotype or a fragment thereof, Is an oligonucleotide having a sequence complementary to a chromosome or a fragment thereof containing a gene polymorphic site having a sequence different from the wild type.
[0024]
The preferred form of the oligonucleotide used in the present invention is designed so that the first to third nucleotides at the 3 ′ end correspond complementarily to the nucleotides of the wild type or mutant sequence, and if necessary, the 3 ′ end. 3 to 5 from which an artificial mismatch base is introduced. More preferably, the 1st to 2nd nucleotides at the 3 ′ end are designed to correspond to the nucleotides of the wild-type or mutant sequence in a complementary manner, and if necessary, the 3rd to 5th positions from the 3 ′ end are artificially artificial. A mismatch base is introduced.
[0025]
In such a design, in the combination of the wild type oligonucleotide / wild type nucleic acid and the mutant type oligonucleotide / mutant nucleic acid, each oligonucleotide undergoes an extension reaction. On the other hand, in the combination of wild-type oligonucleotide / mutant nucleic acid and mutant oligonucleotide / wild-type nucleic acid, the base near the 3 ′ end of the oligonucleotide is mismatched, so that no extension reaction occurs. When an artificial mismatch is introduced, the extension reaction is further less likely to occur.
[0026]
The length of the oligonucleotide in the present invention is preferably 13 to 35 bases, more preferably the lower limit is 16 bases, and the more preferable upper limit is 30 bases. There is at least one mismatch site in the oligonucleotide. Further, the position is not particularly limited as long as it is from the 3rd to the 5 'end of the 3' end, but is preferably a position close to the 3rd end of the 3 'end, more preferably from the 3' end. The third is preferred. The upper limit of the number of artificial mismatches is not particularly limited as long as hybridization is performed, but it is preferably 3 or less, more preferably 2 or less, particularly 1 in the substantial complementary portion. In addition, in order to have other functions other than the substantially complementary portion, for example, at the 5 ′ end side, a sequence that is not completely complementary can be introduced.
[0027]
Third, when an artificial mismatch is used, when a nucleic acid sequence that does not expect an extension reaction is used as a template, a mismatch of two bases is combined with the nucleotide polymorphism site, and the extension reaction is strongly inhibited.
In the present invention, the wild-type oligonucleotide and one or two kinds of mutant-type oligonucleotides are allowed to act on a sample separately or simultaneously.
[0028]
In the present invention, the oligonucleotide extension method can basically be performed using a conventional method. Usually, a chromosome containing a specific nucleotide polymorphism site denatured into a single strand or a fragment thereof, together with four types of deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) and a DNA polymerase, a wild-type oligonucleotide and one or two The oligonucleotides are extended using the target nucleic acid as a template by acting the oligonucleotides for mutations of the species simultaneously or separately.
[0029]
The extension reaction can be performed according to the method described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et al., 1989). In the present invention, a method for amplifying a chromosome or fragment containing a specific nucleotide polymorphism site can also be basically performed using a conventional method, and usually a specific nucleotide polymorphism denatured into a single strand. In addition to 4 types of deoxynucleoside triphosphate (dNTP), DNA polymerase and reverse primer, a wild type oligonucleotide and one or two types of mutant oligonucleotides (forward primer) By using the target nucleic acid as a template, and amplification is performed between the forward oligonucleotide and the reverse oligonucleotide.
[0030]
Examples of nucleic acid amplification methods include PCR, NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification method; Nature Vol. 350, page 91 (1991)), LCR (International Publication No. 89/12696, JP-A-2-2934), SDA (Strand Displacement Amplification: Nucleic acid research Vol. 20, p. 1691 (1992)), RCA (International Publication No. 90/1069), TMA (Transcribion medium amplification method, Vol. 31, J. Cl. 3270 (1993)) Invader method and the like are mentioned, and these are referred to. Door can be.
[0031]
The LCR method is a method of amplifying a target nucleic acid by reacting two kinds of oligonucleotides, deoxynucleoside triphosphate (dNTP) and ligase to the target nucleic acid to bind the two kinds of oligonucleotides on the target nucleic acid. is there.
SDA is a method of amplifying a nucleic acid by repeating an extension reaction and a restriction enzyme treatment using an oligonucleotide that binds complementarily to a template having a restriction enzyme site in its sequence.
RCA is a method of amplifying a target nucleic acid continuously while a newly generated oligonucleotide is separated from a template by acting an oligonucleotide complementary to the circular target nucleic acid and a DNA polymerase.
[0032]
The invader method uses an invader oligo having a complementary sequence to a DNA target fragment and a 5 ′ flap structure and a complementary oligo (signal probe) for detecting SNPs. First, an invader oligo and a signal probe are hybridized to the target DNA. At this time, the invader oligo and the probe have a structure in which one base overlaps (inverse structure). Cleavease acts on this part, and when the base of the signal probe at the SNP site and the base of the target are complementary (no SNP), the 5 'flip of the signal probe is cleaved. The cut 5 'flip hybridizes to the FRET Probe (Fluorescence resonance energy transfer probe). A fluorescent dye and a quencher are close to each other on the FRET probe, and the fluorescence is suppressed. However, when the 5 ′ flip DNA is bound, the fluorescent dye part is cleaved by Cleavease, and the fluorescent signal is detected. Is possible.
[0033]
In particular, the PCR method repeats a cycle consisting of three steps of denaturation, annealing, and extension in the presence of a sample nucleic acid, four types of deoxynucleoside triphosphates, a pair of oligonucleotides, and a heat-resistant DNA polymerase, and thereby the above paired pair. In this method, the region of the sample nucleic acid sandwiched between the oligonucleotides is exponentially amplified. That is, the sample nucleic acid is denatured in the denaturation step, each oligonucleotide is hybridized with a region on the complementary single-stranded sample nucleic acid in the subsequent annealing step, and each oligonucleotide is the starting point in the subsequent extension step. As described above, a DNA strand complementary to each single-stranded sample nucleic acid serving as a template is extended by the action of DNA polymerase to form double-stranded DNA. By this one cycle, one double-stranded DNA is amplified into two double-stranded DNAs. Therefore, if this cycle is repeated n times, the region of the sample DNA sandwiched between the pair of oligonucleotides in theory is 2ⁿAmplified twice. Since the amplified DNA region exists in a large amount, it can be easily detected by a method such as electrophoresis. Therefore, if a gene amplification method is used, it is possible to detect even a very small amount of sample nucleic acid that could not be detected in the past (one molecule is acceptable), which is a very widely used technique recently. .
[0034]
In the method using the nucleic acid amplification method as described above, the gene amplification method is performed using a wild-type oligonucleotide capable of amplifying a wild-type nucleic acid and a mutant-type oligonucleotide capable of amplifying a mutant nucleic acid, separately or simultaneously.
[0035]
When a sample nucleic acid is extended or amplified using a wild-type oligonucleotide, the reaction occurs if the sample nucleic acid is a wild type, but no reaction occurs in a mutant type. Conversely, when the sample nucleic acid is extended or amplified using the mutant oligonucleotide, the reaction occurs if the sample nucleic acid is a mutant type, but does not occur if the sample nucleic acid is a wild type. Therefore, one sample is divided into two parts, one is reacted using the wild type oligonucleotide and the other is reacted using the mutant type oligonucleotide to determine whether the reaction has occurred. It is possible to clearly know whether the sample nucleic acid is a wild type or a mutant type. In particular, humans and other higher organisms have one gene each derived from the father and one from the mother for each type of gene. According to this method, the sample gene is a wild-type homologue. It is also possible to distinguish between mutant homozygous or both heterozygous. That is, in the case of heterogeneity, both the wild type gene and the mutant gene exist, so that the reaction occurs both when the wild type oligonucleotide is used and when the mutant type oligonucleotide is used.
[0036]
In addition, the method for detecting whether or not an oligonucleotide has reacted is that a nucleic acid sample containing a chromosome or fragment containing a specific nucleotide polymorphism site is added to a certain amount of wild-type oligonucleotide and one or two kinds of oligonucleotides. Mutation-type oligonucleotides (corresponding to forward primers) are reacted simultaneously or separately and then reacted with a double-stranded nucleic acid-specific binding substance to detect the amount of oligonucleotide produced by the amplification reaction. it can.
[0037]
As the detection method, a labeled oligonucleotide can also be used.
For example, the detection is performed by labeling each oligonucleotide in advance with an enzyme, biotin, fluorescent substance, hapten, antigen, antibody, radioactive substance, luminophore, etc., and then reacting with the labeled oligonucleotide after extension or amplification reaction. By detecting, gene polymorphism can be detected. Examples of the enzyme include alkaline phosphatase and peroxidase. Examples of the fluorescent material include FITC, 6-FAM, HEX, TET, TAMRA, Texas Red, Cy3, and Cy5.
[0038]
Examples of haptens include biotin and digoxigenin.
As radioactive material,³²P,³⁵S etc. are mentioned.
Examples of the luminophore include ruthenium.
The label may be bound to any position of the oligonucleotide as long as it does not affect the extension reaction of the oligonucleotide. A 5 'site is preferred. When different labels are used for the wild-type oligonucleotide and the mutant-type oligonucleotide, detection can be performed in one reaction vessel.
[0039]
kit
The gene polymorphism detection reagent of the present invention uses an oligonucleotide containing a sequence substantially complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 in the sequence listing, which is a human cytochrome P450 2A6 gene. It is a detection reagent for detecting a gene polymorphism in exon 3.
Reagents for detecting drug-metabolizing enzyme gene polymorphisms, including wild-type oligonucleotides and one or two mutant oligonucleotides, reverse oligonucleotides, DNA polymerases, and four deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) The kit is preferably included.
Each oligonucleotide may be labeled in advance with an enzyme, biotin, fluorescent substance, hapten, antigen, antibody, radioactive substance, luminophore or the like as described above.
[0040]
【Example】
Hereinafter, based on an Example, this invention is demonstrated more concretely. However, the present invention is not limited to the following examples.
[0041]
Example 1 Detection of CYP2A6 * 3 gene polymorphism
(1)CYP2A6 * 3Synthesis of oligonucleotides to detect genes
Using a DNA synthesizer type 392 manufactured by PerkinElmer, oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 (hereinafter referred to as oligos 1 to 4) were synthesized by the phosphoramidite method. The synthesis was carried out according to the manual, and the deprotection of various oligonucleotides was carried out with ammonia water at 55 ° C. overnight. Oligonucleotide purification was carried out on a Perkin Elmer OPC column. Alternatively, it was commissioned to a DNA synthesis consignment company (Japan Bioservice Co., Ltd., Sawaddy Co., Ltd., Proligo KK, Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd., etc.).
Oligo 1 and 3 are oligonucleotides for wild type detection, and oligos 2 and 4 are oligonucleotides for 2A6 * 3. Oligos 1 to 4 may be labeled and used as necessary.
Oligo 2 includes a sequence substantially complementary to SEQ ID NO: 7, and oligo 4 includes a sequence substantially complementary to SEQ ID NO: 3.
[0042]
(2)PCRBy lawCYP2A6 * 3Analysis of genetic polymorphism
(1) Amplification reaction by PCR
A DNA solution extracted from human leukocytes by the phenol / chloroform method was used as a sample, the following reagents were added, and the CYP2A6 * 3 gene polymorphism was analyzed under the following conditions.
reagent
A 25 μl solution containing the following reagents was prepared:
Taq DNA polymerase reaction solution
Oligo 1 or 2 5 pmol
Oligo 3 or 4 5 pmol
× 10 buffer 2.5 μl
2 mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgCl₂                                  1.5 μl
Taq DNA polymerase 1.3 U
Extracted DNA solution 100 ng
[0043]
Oligo 1: acctccccag gcgtggta
Oligo 2: gacgacttag gcgtgggta
Oligo 3: ccgcagggtg gcgataggag
Oligo 4: ctcagggtgg cgatggca
[0044]
Amplification conditions
95 ° C for 5 minutes
95 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds (35 cycles)
72 ° C for 2 minutes.
[0045]
(2) Detection by nucleic acid specific binding substance
Add 3 μl of the amplification reaction solution of (1) to 100 μl of 10000 times diluted SilverGreen I (manufactured by Molecular Probe), stir at room temperature, and then adjust the fluorescence intensity in a dark room with a fluorescence plate reader (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.). It was measured. The time required was about 5 minutes.
From the obtained fluorescence intensity, the amount of fluorescence intensity of the sample was calculated using the following calculation formula.
[Formula 1] FL (fluorescence intensity of sample) = FLb−FLs
FLb: Fluorescent intensity of Negative Control (no sample added)
FLs: fluorescence intensity of each sample
[0046]
[Table 1]

[0047]
Ratio calculation method: Obtained from the same sample by reagents combining each oligo
Value excluding detection signal
As described above, a nucleotide polymorphism-specific amplification reaction is performed using an oligonucleotide, and the amplification reaction substance is measured using a nucleic acid-specific binding substance, so that the genotype can be clearly and easily determined. I was able to.
【The invention's effect】
As described above, the present invention provides a method that can clearly and easily detect a gene polymorphism in a sample nucleic acid. Since the method of the present invention does not require a complicated operation as in the conventional methods, results with good reproducibility were obtained quickly and easily.
[Sequence Listing]

Claims (6)

Translated fromJapanese

配列表の配列番号１から１２で示される塩基配列の何れか１つに対して実質的に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とするヒトチトクロームＰ４５０ ２Ａ６遺伝子のエクソン３中の遺伝子多型を検出する方法。A gene in exon 3 of the human cytochrome P450 2A6 gene, characterized by using an oligonucleotide comprising a sequence substantially complementary to any one of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 in the sequence listing How to detect polymorphism.ヒトチトクロームＰ４５０２Ａ６遺伝子およびまたはその断片を含む試料を増幅させることによって、ヒトチトクロームＰ４５０ ２Ａ６遺伝子のエクソン３中の遺伝子多型を検出する請求項１に記載の遺伝子多型を検出する方法。The method for detecting a gene polymorphism according to claim 1, wherein the gene polymorphism in exon 3 of the human cytochrome P450 2A6 gene is detected by amplifying a sample containing the human cytochrome P450 2A6 gene and / or a fragment thereof.取得された増幅産物と核酸特異標識との相互作用により、検出することを特徴とする請求項２記載の遺伝子多型を検出する方法。The method for detecting a gene polymorphism according to claim 2, wherein the detection is performed by interaction between the obtained amplification product and a nucleic acid-specific label.配列表の配列番号１から１２で示される塩基配列に対して実質的に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とするヒトチトクロームＰ４５０ ２Ａ６遺伝子のエクソン３中の遺伝子多型を検出する検出試薬。A gene polymorphism in exon 3 of a human cytochrome P450 2A6 gene is detected, characterized by using an oligonucleotide containing a sequence substantially complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 12 in the sequence listing Detection reagent.配列表の配列番号１から１２で示される塩基配列の何れか１つに対して実質的に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用い、ヒトチトクロームＰ４５０２Ａ６遺伝子およびまたはその断片を含む試料を増幅させることによって、ヒトチトクロームＰ４５０ ２Ａ６遺伝子のエクソン３中の遺伝子多型を検出する試薬。A sample containing a human cytochrome P4502A6 gene and / or a fragment thereof is amplified using an oligonucleotide primer containing a sequence substantially complementary to any one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 in the Sequence Listing A reagent for detecting a gene polymorphism in exon 3 of the human cytochrome P450 2A6 gene.取得された増幅産物と核酸特異標識との相互作用により、検出することを特徴とする請求項５記載の遺伝子多型を検出する試薬。The reagent for detecting a gene polymorphism according to claim 5, wherein the reagent is detected by the interaction between the obtained amplification product and a nucleic acid-specific label.