【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、光照射によりペプチド結合及び擬ペプチド結合及び有機化合物内の特定の結合を切断する方法及びそのための装置に関するものである。より詳細には、分子振動に共鳴する赤外光が照射された部位におこる振動励起を利用して分子内の特定部位の結合を切断し、さらに光を照射された場所という空間的に制御された条件下で分子の分解、構造の改変、誘導体の生成を行う方法及びその装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】有機化合物の結合の切断による分解は、有毒物質の無毒化のみならず、有機化学分析や酵素等の活性制御、さらに医薬品や生理活性物質の生理活性の付与や消失の制御に応用することができる。しかしながら、紫外線等の照射やガス流やイオン等との衝突、触媒等を用いた方法では有機化合物内の結合を非特異的に切断するため、分解生成物の構造を制御できず、元となる物質の構造を推定すること、分解による高次構造変化を制御すること、分解生成物に分子機能を付与すること等はきわめて困難である。さらに条件によっては無機物にまで分解されうる。一方でいわゆる酵素を用いた方法では酵素の性質により切断される結合が特定されるために、元となる基質の選択性や生成物の分子機能を期待できる。しかし酵素には反応条件に制約が多く、真空中や気相中での反応は期待できず、水溶液中の反応においても特定の場所のみの分解等反応という空間的な制御の要求には困難がともない、さらに分解物の造形には利用できない。しかし赤外線レーザー光を用いたコレステロールエステルの選択的分解装置が特許公報第２８６５６５５号に開示されており、分子振動と共鳴する波長域の光を用いることで空間選択性と結合部位選択性を併せ持った結合切断とそれに伴う有機化合物の構造変化や生物学的活性等の機能制御が可能であることが期待される。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】発明者らは特定の部位においてのみ有機化合物内の結合の切断をもたらす系として、光の照射によるエネルギーを利用して化学反応を惹起し、光を照射された場所に限定された空間内においてのみ結合の切断をもたらし分解物を生成する方法と装置を提供することを課題とした。
【０００４】さらに、照射する光の波長を選択することにより、有機化合物内の特定の結合部位を切断する方法を提供することを課題とした。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、十分なエネルギー密度を備えた光を必要な場所のみに照射する装置を用いて、分子内の特定の部位のみに作用する光の波長を選択し使用する有機化合物内の特定の結合を切断する方法並びに装置である。
【０００６】電磁波である光を有機化合物の分解に用いるには対象となる化合物が光を吸収することが必要である。紫外から可視領域の光の吸収は結合の電子エネルギー準位間の遷移によるものであり、光を吸収する分子構造部分は発色団と呼ばれている。しかし、発色団は比較的普遍的に存在し特異性が低いため、今日では紫外から可視領域の吸収特性から化合物の種類や構造を分析することは一部の色素等以外については行われず、逆に特異性が低いことを活用して例えばたんぱく質溶液の濃度分析など同種化合物の総量を測定する用途などに多く用いられている。
【０００７】同じ電磁波である赤外光の場合は結合の振動励起が起こるエネルギー領域であり、赤外領域における光の吸収は特定の結合の結合角が変化する変角振動や結合距離が変化する伸縮振動という分子振動の励起と関連付けられている。それぞれの結合に由来する振動は基準振動と呼ばれ、ばねと重りの単純なモデルを用いて分子軌道法から求められた結合の強さと結合している原子の換算質量で推定することができる。複数の原子で構成される化合物では、近傍の原子の影響で結合強度が変化することや基準振動の相互作用のためにそれぞれ共鳴振動数が変化する。このため精密な赤外分光分析は有機化合物の構造解析や化合物の種類の同定に用いられている。
【０００８】従ってそれぞれの結合の共鳴振動数が異なることを利用して、特定の結合に共鳴する振動数を持つ波長の光を選択的に照射することで分子内の特定の結合部位にのみエネルギーを与えることができる。
【０００９】十分な強さをもつ赤外領域の単色光の光源と損失の少ない光学系を用いて、分子振動に共鳴する波長の赤外光を選択的に照射することにより課題を解決することができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、この発明の実施形態について図面を参照して説明する。光源装置は分子振動に共鳴する波長の赤外光を発生させることができればその形式はどのようなものでも良く、一例としてこの実施形態では自由電子レーザー装置が用いられている。
【００１１】図１は実施形態の光化学的有機化合物の結合切断装置の概略図である。光源として用いる自由電子レーザー装置から導かれた平行光線である赤外光１は焦点距離３０ｃｍの凹面鏡２により集光され、二次元光学走査装置３に入射し、試料台４上の試料に焦点を結ぶ。二次元光学走査装置３はモーターにより反射鏡の角度を変化させることにより試料台の任意の位置に赤外光を照射することができる。試料台４もモーター駆動により焦点位置の調節及び照射スポット形の選択、そして赤外光照射位置を変えることができる。照射前後の試料の状況は逐次モニターカメラ５により撮影され、テレビジョンモニター６の画面上で確認することができる。さらにモニターカメラ５をＭＣＴ赤外線検出器に換装することにより、試料に到達する赤外光のパワーを測定することができる。
【００１２】自由電子レーザーは磁界の方向が周期的に反転する周期磁場内を電子ビームが蛇行するときに発生する光を増幅するレーザー装置であり、周期磁場の周期、強度及び電子ビームのエネルギーなどのバラメータを変化させることにより、連続的に波長を変化させることができる。赤外領域においても波長選択の自由度が高くエネルギー密度の高い光源として利用することができる。
【００１３】自由電子レーザー装置から得られる赤外光はパルス状であり、高いピークバワーを保ちながらも試料に照射される総エネルギーは小さく抑えることができるため、試料の熱変性などの非特異的な変化を小さくすることできる。今回も用いたレーザー光はパルス幅が１０−１２秒であり、試料に達する赤外光の平均パワーは１０から１４ｍＷ、ピーク時のパワー密度は焦点位置において約５．０ＧＷ／ｃｍ２に達する。光が単色光でなおかつパルス状であれば他の光源装置であっても良い。
【００１４】この実施形態における装置では、反射鏡表面は金コートされており反射による赤外光の損失を小さくしている。さらに凹面鏡２から試料位置までの距離を３０ｃｍとして、長距離の光伝送を避けることにより、大気中の水蒸気や二酸化炭素による赤外光の損失を抑えている。
【００１５】図１に示す装置では可視光で試料の状態及び照射部位の状況をモニターカメラ５により観察することができ、正確に光路と試料の位置関係を調節することを可能にする。
【００１６】
【実施例】本発明はこれらの実施例に限定されるものではないが、上述の装置により、ペプチド結合の切断実験を行った。
【００１７】対象試料として用いたローダミン１１０のベンジロキシカルボニル−Ｌ−アルギニン誘導体は次に示すごとく蛍光色素であるローダミン１１０にＬ−アルギニンがペプチド結合しアミド体を構成しているときは蛍光を発しないが、ペプチド結合が切断されてローダミン１１０が遊離するとフルオレセインと同様の強い緑色の蛍光を発する。この試薬は緑色蛍光がペプチド結合切断すなわちたんぱく質の分解を示すことから、たんぱく質分解酵素の活性を測定する用途に多用されている。今回の実験において赤外光照射後に緑色の蛍光を得ることができれば、蛍光色素の骨格を破壊せずにペプチド結合を切断することができた、すなわち光によっても酵素と同様に有機化合物内の選択的な結合の切断を実施できたことがわかる。
【００１８】
【化１】
【００１９】ローダミン１１０のベンジロキシカルボニル−Ｌ−アルギニン誘導体の赤外吸収スペクトルをＦＴ−ＩＲ法によって測定した結果を図２に示す。今回の実験に用いた６．０６μｍ、６．１６μｍ、６．４５μｍのそれぞれの波長においてほぼ同等の吸光度を示している。アミドＩの吸収帯に帰属する波長６．０６μｍ付近の吸収は分子軌道法から求めたれた結果よりペプチド結合近傍の分子振動に由来することが推定されており、この波長によってペプチド結合を選択的に励起できると考えられる。他の化合物を用いて異なる結合を切断するにはその結合部位を振動励起する異なる波長を選択すればよい。
【００２０】ローダミン１１０のベンジロキシカルボニル−Ｌ−アルギニン誘導体の結晶を赤外透明性の高いＢａＦ２板上に配置し、記述の装置を用いて赤外光を照射した。
【００２１】波長６．０６μｍ照射の結果を図３に示す。図３ａはフルオレセイン観察条件の蛍光顕微鏡画像であり、図３ｂは同一部位の白色可視透過光による画像である。赤外光の平均パワーは１２ｍＷであり、２秒間総計２４ｍＪの照射を行った。照射スポット径は直径約１１８μｍで、図３ａ及びｂの中央部に照射された。照射スポット位置でのピーク時のパワー密度は約５．０ＧＷ／ｃｍ２であった。図３ａにおいて蛍光顕微鏡画像であり中央部に飛散したローダミン１１０に由来する蛍光を確認することができる。周辺部においても散乱光の影響と思われる蛍光がみられる。図３ｂに見られるようにレーザー光照射により結晶の形態は変化しているが、ペプチド結合が切断されたにもかかわらず蛍光を発するローダミン１１０骨格は保たれたまま、赤外光照射部位において蛍光色素であるローダミン１１０が生成されていることがわかった。この結果から波長６．０６μｍの光はたんばく分解酵素様の作用を持っていると考えられた。
【００２２】波長６．１６μｍ照射の結果を図５に示す。図４ａは先と同様の蛍光顕微鏡画像であり、図４ｂは同一部位の白色可視透過光による画像である。赤外光の平均パワーは１３ｍＷであり、２秒間総計２６ｍＪの照射を行った。照射スポット径は直径約１２２μｍで、同様に図の中央部に照射された。照射スポット位置でのピーク時のパワー密度は約５．１ＧＷ／ｃｍ２であった。図４ｂの中央部において形態が変型した結晶が照射痕として認められたが、図４ａにおいて蛍光は弱く、結晶周囲にも蛍光は認められなかった。したがって波長６．１６μｍの光はたんばく分解酵素様の作用は持っておらず、０．１μｍの波長の違いにおいても、その作用は大きく異なると考えられた。
【００２３】波長６．４５μｍ照射の結果を図５に示す。図５ａは先と同様の蛍光顕微鏡画像であり、図５ｂは同一部位の白色可視透過光による画像である。赤外光の平均パワーは１０ｍＷであり、２秒間総計２０ｍＪの照射を行った。照射スポット径は直径約１０７μｍで、同様に図の中央部に照射された。照射スポット位置でのピーク時のパワー密度は約４．６ＧＷ／ｃｍ２であった。図５ｂの中央部においてレーザー照射により砕かれた結晶が認められたが、図５ａにおいては図４ａに見られた蛍光は認められなかった。したがって波長６．４５μｍの光は非特異的な作用は持っているものの、特定の結合のみを切断するというたんばく分解酵素様の作用は持っていないと考えられた。
【００２４】
【発明の効果】この発明においては、有機化合物の分子振動にあわせた選択的励起により、特定の結合を切断し有機化合物の分解、構造改変、誘導体生成ができ、光の照射部位の選択性を用いて光化学反応の空間的な制御ができ、反応も非常に短時間であることや、真空中での反応や選択的蒸散への応用など、酵素などを用いた反応などに比して種々の利点が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施形態の光化学的有機化合物の結合切断装置の概略図である。
【図２】ローダミン１１０のベンジロキシカルボニル−Ｌ−アルギニン誘導体の赤外吸収スペクトルのグラフである。
【図３】波長６．０６μｍ照射部位の顕微鏡写真である。
【図４】波長６．１６μｍ照射部位の顕微鏡写真である。
【図５】波長６．４５μｍ照射部位の顕微鏡写真である。
【符号の説明】
１ 自由電子レーザー装置から導かれた平行光線である赤外光
２ 集光用凹面鏡
３ 二次元光学スキャナ
４ 試料台
５ モニターカメラ装置
６ テレビジョンモニター装置[0001]
BACKGROUND OF THEINVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for cleaving peptide bonds and pseudo-peptide bonds and specific bonds in organic compounds by light irradiation, and an apparatus therefor. More specifically, it breaks bonds at specific sites in the molecule by using vibrational excitation that occurs at the site irradiated with infrared light that resonates with molecular vibrations, and is further spatially controlled at the location irradiated with light. The present invention relates to a method and an apparatus for decomposing a molecule, modifying a structure, and producing a derivative under conditions.
[0002]
2. Description of the Related Art Decomposition by breaking the bond of an organic compound is not only for detoxification of toxic substances, but also for control of the activity of organic chemical analysis, enzymes, etc., and control of imparting or eliminating the physiological activity of pharmaceuticals and biologically active substances. Can be applied. However, irradiation with ultraviolet rays or the like, collision with a gas flow or ions, or a method using a catalyst, etc., non-specifically cuts bonds in an organic compound, so that the structure of a decomposition product cannot be controlled and becomes a source. It is extremely difficult to estimate the structure of a substance, control higher-order structural changes due to decomposition, and impart molecular functions to decomposition products. Further, it can be decomposed into inorganic substances depending on conditions. On the other hand, in a method using a so-called enzyme, a bond to be cleaved is specified by the property of the enzyme, so that selectivity of a base substrate and molecular function of a product can be expected. However, there are many restrictions on the reaction conditions of enzymes, and reactions in a vacuum or gas phase cannot be expected. Even in reactions in aqueous solutions, it is difficult to request spatial control such as decomposition at a specific location only. No, it cannot be used for forming decomposed products. However, an apparatus for selectively decomposing cholesterol ester using infrared laser light is disclosed in Japanese Patent Publication No. 2865655, which has both spatial selectivity and binding site selectivity by using light in a wavelength range that resonates with molecular vibration. It is expected that bond breaking and functional control such as structural change and biological activity of the organic compound accompanying the bond breaking are possible.
[0003]
SUMMARY OF THE INVENTION As a system for breaking bonds in an organic compound only at a specific site, the inventors have induced a chemical reaction using the energy of light irradiation, and have been exposed to light. It is an object of the present invention to provide a method and an apparatus for producing a decomposed product by causing a bond to be broken only in a space limited to a place.
Another object of the present invention is to provide a method for cutting a specific binding site in an organic compound by selecting the wavelength of light to be irradiated.
[0005]
SUMMARY OF THE INVENTION The present invention uses an apparatus for irradiating light having a sufficient energy density only to a required place to select a wavelength of light acting only on a specific site in a molecule. A method and an apparatus for breaking a specific bond in an organic compound to be used.
[0006] In order to use light, which is an electromagnetic wave, for decomposing organic compounds, it is necessary that the target compound absorb the light. The absorption of light in the ultraviolet to visible region is due to the transition between the electron energy levels of the bonds, and the molecular structure that absorbs light is called a chromophore. However, since chromophores are relatively ubiquitous and have low specificity, today it is not possible to analyze the type or structure of a compound from the absorption characteristics in the ultraviolet to visible region, except for some dyes, etc. Utilizing its low specificity, it is often used for measuring the total amount of the same kind of compounds such as, for example, concentration analysis of protein solutions.
In the case of infrared light, which is the same electromagnetic wave, it is an energy region in which vibrational excitation of a bond occurs, and light absorption in the infrared region changes a bending angle vibration in which a bond angle of a specific bond changes and a bond distance changes. It is related to the excitation of molecular vibration called stretching vibration. The vibration resulting from each bond is called a reference vibration, and can be estimated from the bond strength determined by the molecular orbital method and the reduced mass of the bonded atoms using a simple model of a spring and a weight. In a compound composed of a plurality of atoms, the resonance frequency changes due to the change in bond strength due to the influence of nearby atoms and the interaction of normal vibration. For this reason, precise infrared spectroscopy is used for structural analysis of organic compounds and identification of types of compounds.
Therefore, utilizing the fact that the resonance frequency of each bond is different, by selectively irradiating light of a wavelength having a frequency which resonates with a specific bond, the energy can be applied only to a specific bond site in the molecule. Can be given.
To solve the problem by selectively irradiating infrared light having a wavelength that resonates with molecular vibration using a light source of monochromatic light in the infrared region having a sufficient intensity and an optical system with low loss. Can be.
[0010]
Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings. The light source device may be of any type as long as it can generate infrared light having a wavelength that resonates with molecular vibration. For example, in this embodiment, a free electron laser device is used.
FIG. 1 is a schematic view of an apparatus for cutting and binding a photochemical organic compound according to an embodiment.Infrared light 1 which is a parallel light beam guided from a free electron laser device used as a light source is condensed by aconcave mirror 2 having a focal length of 30 cm, enters a two-dimensionaloptical scanning device 3 and focuses on a sample on asample stage 4. tie. The two-dimensionaloptical scanning device 3 can irradiate infrared light to an arbitrary position on the sample table by changing the angle of the reflecting mirror by a motor. Thesample stage 4 can also adjust the focal position, select the irradiation spot type, and change the infrared light irradiation position by driving a motor. The state of the sample before and after the irradiation is sequentially photographed by themonitor camera 5 and can be confirmed on the screen of thetelevision monitor 6. Further, by replacing themonitor camera 5 with an MCT infrared detector, the power of infrared light reaching the sample can be measured.
A free electron laser is a laser device that amplifies light generated when an electron beam meanders in a periodic magnetic field in which the direction of a magnetic field is periodically reversed. , The wavelength can be continuously changed. It can be used as a light source having a high degree of freedom in wavelength selection and a high energy density even in the infrared region.
[0013] The infrared light obtained from the free electron laser device is pulsed, and the total energy applied to the sample can be kept small while maintaining a high peak power. The change can be reduced. The laser beam used this time also has a pulse width of 10−12 seconds, the average power of the infrared light reaching the sample is 10 to 14 mW, and the power density at the peak reaches about 5.0 GW / cm2 at the focal position. Other light source devices may be used as long as the light is monochromatic and pulsed.
In the apparatus of this embodiment, the surface of the reflecting mirror is coated with gold to reduce the loss of infrared light due to reflection. Further, by setting the distance from theconcave mirror 2 to the sample position to be 30 cm and avoiding long-distance light transmission, loss of infrared light due to water vapor and carbon dioxide in the atmosphere is suppressed.
In the apparatus shown in FIG. 1, the state of the sample and the state of the irradiated area can be observed with themonitor camera 5 using visible light, and the positional relationship between the optical path and the sample can be accurately adjusted.
[0016]
EXAMPLES Although the present invention is not limited to these examples, an experiment for cleaving peptide bonds was carried out using the above-mentioned apparatus.
The benzyloxycarbonyl-L-arginine derivative of rhodamine 110 used as a target sample emits fluorescence when L-arginine is peptide-bonded to rhodamine 110, which is a fluorescent dye, to form an amide as shown below. However, when the peptide bond is cleaved to release rhodamine 110, it emits the same strong green fluorescence as fluorescein. This reagent is widely used for measuring the activity of a proteolytic enzyme since green fluorescence indicates peptide bond cleavage, that is, degradation of the protein. In this experiment, if green fluorescence could be obtained after irradiation with infrared light, peptide bonds could be cleaved without destroying the skeleton of the fluorescent dye. It can be seen that the typical bond was successfully broken.
[0018]
Embedded image
FIG. 2 shows the results of measuring the infrared absorption spectrum of the benzyloxycarbonyl-L-arginine derivative of rhodamine 110 by the FT-IR method. It shows almost the same absorbance at each wavelength of 6.06 μm, 6.16 μm and 6.45 μm used in this experiment. It is estimated from the results obtained by the molecular orbital method that the absorption near the wavelength of 6.06 μm attributed to the absorption band of amide I is derived from the molecular vibration near the peptide bond. It is thought that it can be excited. In order to cleave a different bond using another compound, a different wavelength that vibrates the binding site may be selected.
A crystal of a benzyloxycarbonyl-L-arginine derivative of rhodamine 110 was placed on a BaF2 plate having high infrared transparency, and irradiated with infrared light using the apparatus described above.
FIG. 3 shows the result of irradiation at a wavelength of 6.06 μm. FIG. 3A is a fluorescence microscope image under fluorescein observation conditions, and FIG. 3B is an image of the same site with white visible transmitted light. The average power of the infrared light was 12 mW, and irradiation was performed for a total of 24 mJ for 2 seconds. The irradiation spot diameter was about 118 μm and was applied to the center of FIGS. 3A and 3B. The power density at the peak at the irradiation spot position was about 5.0 GW / cm2 . In FIG. 3a, it is a fluorescence microscope image, and fluorescence derived from rhodamine 110 scattered in the center can be confirmed. Fluorescence, which is considered to be affected by scattered light, is also found in the periphery. As can be seen in FIG. 3b, the morphology of the crystal is changed by the irradiation of the laser beam, but the rhodamine 110 skeleton that emits fluorescence despite the cleavage of the peptide bond is maintained at the site irradiated with the infrared light. It was found that rhodamine 110, which is a pigment, was produced. From these results, it was considered that light having a wavelength of 6.06 μm had an action similar to that of a protease.
FIG. 5 shows the result of irradiation at a wavelength of 6.16 μm. FIG. 4a is the same fluorescence microscope image as before, and FIG. 4b is the image of the same site with white visible transmitted light. The average power of the infrared light was 13 mW, and irradiation was performed for a total of 26 mJ for 2 seconds. The irradiation spot diameter was about 122 μm, and was similarly applied to the center of the figure. The power density at the peak at the irradiation spot position was about 5.1 GW / cm2 . In the center of FIG. 4b, a crystal whose shape was changed was observed as an irradiation mark, but in FIG. 4a, the fluorescence was weak, and no fluorescence was observed around the crystal. Therefore, it was considered that light having a wavelength of 6.16 μm did not have a proteolytic enzyme-like effect, and the effect was significantly different even at a difference in wavelength of 0.1 μm.
FIG. 5 shows the result of irradiation at a wavelength of 6.45 μm. FIG. 5a is the same fluorescence microscope image as before, and FIG. 5b is the image of the same site with white visible transmitted light. The average power of the infrared light was 10 mW, and irradiation was performed for a total of 20 mJ for 2 seconds. The irradiation spot diameter was about 107 μm, and was similarly applied to the center of the figure. The power density at the peak at the irradiation spot position was about 4.6 GW / cm2 . Crystals broken by the laser irradiation were observed in the center of FIG. 5B, but the fluorescence shown in FIG. 4A was not observed in FIG. 5A. Therefore, although light having a wavelength of 6.45 μm has a nonspecific action, it is considered that it does not have an action like a protease that cuts only a specific bond.
[0024]
According to the present invention, a specific bond is cleaved by selective excitation in accordance with the molecular vibration of an organic compound, whereby the organic compound can be decomposed, its structure is modified, and its derivative is formed. It is possible to control the photochemical reaction spatially by using it, and the reaction is very short-time. Benefits are obtained.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic view of a photochemical organic compound bond breaking device according to an embodiment.
FIG. 2 is a graph of an infrared absorption spectrum of a benzyloxycarbonyl-L-arginine derivative of rhodamine 110.
FIG. 3 is a photomicrograph of a portion irradiated with a wavelength of 6.06 μm.
FIG. 4 is a micrograph of an irradiation site at a wavelength of 6.16 μm.
FIG. 5 is a micrograph of an irradiation site at a wavelength of 6.45 μm.
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OFSYMBOLS 1 Infrared light which is a parallel ray guided from a freeelectron laser device 2 Condensingconcave mirror 3 2Doptical scanner 4 Sample stand 5Monitor camera device 6 Television monitor device
