【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明はポリメラーゼ連鎖反
応法（以後、ＰＣＲ法と略記する）を応用して核酸配列
を増幅する方法に関する。より詳細には対象２本鎖に対
して特異性の低い非特異性プライマーを一対設定し、若
干の塩基配列の差があっても非特異的プライマーと対象
２本差核酸の増幅反応が進行するようなＰＣＲ条件下で
ＰＣＲ増幅反応を行う核酸配列を増幅する方法に関す
る。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for amplifying a nucleic acid sequence by applying a polymerase chain reaction method (hereinafter abbreviated as PCR method). More specifically, a pair of non-specific primers having low specificity for the target double strand is set, and the amplification reaction between the non-specific primer and the target double-difference nucleic acid proceeds even if there is a slight base sequence difference. The present invention relates to a method for amplifying a nucleic acid sequence that carries out a PCR amplification reaction under such PCR conditions.
【０００２】[0002]
【従来の技術】ごく微量の核酸のコピーを繰り返すこと
によって必要とする目的核酸を簡単に、且つ多量に増幅
させる技術であるＰＣＲ法は、増幅した核酸を用いて遺
伝子判定や核酸変異の判定に応用されており、そのＰＣ
Ｒ法は特公平４−６７９５７に開示されている。その手
法は、目的とする核酸領域をはさんで該目的核酸の核酸
配列の鎖を相補する特異的なプライマーを結合させ、核
酸ポリメラーゼ酵素の働きで核酸を増幅させるものであ
る。2. Description of the Related Art The PCR method, which is a technique for amplifying a desired nucleic acid easily and in large quantities by repeating a very small amount of a copy of a nucleic acid, is used for gene determination or nucleic acid mutation determination using the amplified nucleic acid. Has been applied and its PC
The R method is disclosed in Japanese Examined Patent Publication No. 4-67957. The technique is to bind a specific primer that complements the strand of the nucleic acid sequence of the target nucleic acid across the target nucleic acid region and amplify the nucleic acid by the action of the nucleic acid polymerase enzyme.
【０００３】目的核酸あるいはＰＣＲ法で増幅された核
酸増幅物に温度をかけていくと、それらは各々１本鎖核
酸に解離する。この急激に解離する温度をＴｍ（Ｍｅｌ
ｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値と呼ぶが、Ｔｍ
値と該Ｔｍ値を観察した２本鎖核酸溶解曲線（Ｍｅｌｔ
Ｃｕｒｖｅ）、あるいは該曲線を微分して得られた２
本鎖解離曲線（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｕｒｖ
ｅ）等の解離パターンから核酸の変異を判別する方法が
発明者によって出願されている（特願２００１−１３５
５５６）。When a target nucleic acid or a nucleic acid amplification product amplified by the PCR method is heated, they are dissociated into single-stranded nucleic acids. The temperature at which this abrupt dissociation occurs is Tm (Mel
TingTemperature) value,
Value and the Tm value of the double-stranded nucleic acid dissolution curve (Melt
Curve) or 2 obtained by differentiating the curve
Strand dissociation curve (Dissociation Curv
A method for discriminating a nucleic acid mutation from a dissociation pattern such as e) has been filed by the inventor (Japanese Patent Application No. 2001-135).
556).
【０００４】通常のＰＣＲではプライマーの鋳型核酸に
対する特異性を高め、全核酸中の特定の一部分のみを認
識し、１つのＰＣＲ産物のみ増幅することを目的とす
る。このため非特異的なプライマーの反応を抑制する手
段がとられていた。その基本的な手法は、ａ）プライマーに鋳型核酸に特異的な塩基配列を設定す
る方法、ｂ）プライマーの全長を長くする方法、ｃ）プライマーの溶解温度を高く設定し、アニーリング
温度を高くする方法、などである。In ordinary PCR, the purpose is to increase the specificity of the primer for the template nucleic acid, recognize only a specific part of the total nucleic acid, and amplify only one PCR product. Therefore, measures have been taken to suppress the reaction of nonspecific primers. The basic methods are: a) a method of setting a base sequence specific to the template nucleic acid in the primer, b) a method of lengthening the entire length of the primer, c) a high melting temperature of the primer, and a high annealing temperature. Method, etc.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】核酸あるいは核酸増幅
物の解離パターンから遺伝子判定や核酸変異を検出する
場合には複数のプライマーセットを用いてＰＣＲ法など
で核酸増幅を行い、数種の解離パターンを得て判定する
ことが必要であった。本発明は、一対の非特異プライマ
ーを用いてＰＣＲ法を応用して核酸増幅を行うことによ
って複数のプライマーセットを用いたＰＣＲと同等の効
果を見出し、本発明を完成するに至った。When a gene determination or nucleic acid mutation is detected from the dissociation pattern of a nucleic acid or a nucleic acid amplification product, nucleic acid amplification is performed by a PCR method using a plurality of primer sets, and several types of dissociation patterns are obtained. It was necessary to obtain and judge. The present invention has found the same effect as PCR using a plurality of primer sets by applying nucleic acid amplification by applying a PCR method using a pair of non-specific primers, and completed the present invention.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】対象２本鎖核酸に対して
特異性の低い非特異プライマーセットを一対設定し、若
干の塩基配列の差があっても非特異的なプライマー／対
象２本鎖核酸の反応が進行するようなＰＣＲ条件下でＰ
ＣＲ増幅反応を行う。この結果、プライマーの塩基配列
に相同性のある対象２本鎖核酸の複数部分が同時に増幅
されるため、結果的に複数のＰＣＲ産物が生成されるこ
とになる。この状態で加熱しＰＣＲ産物の解離パターン
を描くと、これら複数のＰＣＲ産物由来の複数の解離パ
ターンの合成波形が得られる。[Means for Solving the Problems] A pair of non-specific primer sets having low specificity for a target double-stranded nucleic acid is set, and a non-specific primer / target double-strand having a slight difference in base sequence is set. P under PCR conditions that allow the reaction of nucleic acids to proceed
Perform CR amplification reaction. As a result, a plurality of portions of the target double-stranded nucleic acid having homology to the base sequence of the primer are simultaneously amplified, resulting in the generation of a plurality of PCR products. When heating is performed in this state and the dissociation pattern of the PCR product is drawn, a synthetic waveform of the plurality of dissociation patterns derived from the plurality of PCR products is obtained.
【０００７】個々のＰＣＲ産物の描く解離パターンが、
由来する塩基配列の状態から複数種類ある場合、ＰＣＲ
産物が多種類得られれば得られるほど一回の解析で多く
の核酸変異情報が得られることになる。例えば３箇所に
反応し、３本のＰＣＲ産物（これをＰＣＲ、、と
する）を生成するプライマーセット及びＰＣＲ条件で核
酸増幅を行った場合、ＰＣＲで２種類の解離パター
ン、ＰＣＲで３種類の解離パターン、ＰＣＲで２種
類の解離パターンが得られる場合、これらの合成波形と
して２ｘ３ｘ２＝１２、計１２種類の解離パターンが得
られ、１２種類の核酸変異が判別できることになる。こ
れは３対のプライマーを同時に反応させたＭｕｌｔｉｐ
ｌｅｘ ＰＣＲと同等の効果が得られるが、本発明の場
合は１対のプライマーしか用いていないため、コストも
低下する利点がある。The dissociation pattern drawn by each PCR product is
If there are multiple types of the derived nucleotide sequence, PCR
The more kinds of products are obtained, the more information on nucleic acid mutations can be obtained in one analysis. For example, when nucleic acid amplification is performed under a primer set and PCR conditions that generate three PCR products (which are referred to as PCR,) by reacting at three sites, two types of dissociation patterns by PCR and three types by PCR When two types of dissociation patterns are obtained by the dissociation pattern and PCR, a total of 12 types of dissociation patterns, 2 × 3 × 2 = 12, are obtained as a synthetic waveform of these, and 12 types of nucleic acid mutations can be discriminated. This is a Multip in which 3 pairs of primers were reacted simultaneously.
Although an effect equivalent to that of lex PCR can be obtained, in the case of the present invention, there is an advantage that cost is reduced because only one pair of primers is used.
【０００８】また、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲの場
合、プライマー相互の干渉が起こるため同時に反応させ
られるプライマーの数には制限があるが、本発明の場合
はこのような制限はなく、最終的に生成されるＰＣＲ産
物数のコントロールは、プライマーの塩基配列にゲノム
ＤＮＡに出現する塩基配列の頻度をあわせることにより
実現可能である。例えば、全長５００万ｂｐの中でＧＣ
ＧＴＡという塩基配列が１０万回に１回の頻度で出現す
る場合、プライマーにこれを認識する配列を挿入する
と、計算上ＰＣＲ産物は５０個生成されることになる。
このプライマーに挿入する特異塩基配列が長ければＰＣ
Ｒ産物の数は減少し、逆に短ければＰＣＲ産物の数は増
加する。In addition, in the case of Multiplex PCR, there is a limit to the number of primers that can be reacted simultaneously due to interference between the primers, but in the present invention, there is no such limitation, and the PCR to be finally generated is The control of the number of products can be realized by matching the frequency of the base sequence appearing in the genomic DNA with the base sequence of the primer. For example, in the total length of 5 million bp, GC
When the nucleotide sequence of GTA appears once in 100,000 times, inserting a sequence recognizing this into the primer results in the calculation of 50 PCR products.
If the specific base sequence inserted into this primer is long, PC
The number of R products decreases, and conversely, the number of PCR products increases when the number is short.
【０００９】また、本法を特定部分に焦点をあわせるこ
とも可能である。例えばリボゾーマルＲＮＡをコードす
る遺伝子に着目した場合、この遺伝子内に出現頻度の高
い塩基配列をプライマーの一部に挿入すると、リボゾー
マルＲＮＡとこれに近い関係の遺伝子からＰＣＲ産物が
複数得られる。従ってこの解離パターンはリボゾーマル
ＲＮＡに関連した核酸変異を反映することになる。It is also possible to focus the method on specific parts. For example, in the case of paying attention to a gene encoding ribosomal RNA, if a base sequence having a high frequency of appearance is inserted into a part of the primer in this gene, a plurality of PCR products can be obtained from the ribosomal RNA and a gene having a relationship close thereto. Therefore, this dissociation pattern will reflect nucleic acid mutations associated with ribosomal RNA.
【００１０】通常のＰＣＲでは特異性を高めることによ
り目的遺伝子の解析を行うが、本発明はこれと異なり、
非特異性を高めることにより目的遺伝子と同時にこれと
類似する複数の遺伝子もＰＣＲ産物として生成し、１つ
のＰＣＲ産物の解析（解離パターンの解析）では成し得
なかった多彩な遺伝子情報を一対の非特異プライマーを
用いたＰＣＲで簡易に得ることができる。In the ordinary PCR, the target gene is analyzed by increasing the specificity, but the present invention is different from this.
By increasing non-specificity, multiple genes similar to the target gene are generated as PCR products at the same time, and a variety of gene information that could not be obtained by analysis of one PCR product (dissociation pattern analysis) It can be easily obtained by PCR using non-specific primers.
【００１１】[0011]
【発明の実施の形態】通常のＰＣＲではプライマーの鋳
型核酸に対する特異性を高め、全ＤＮＡ中の特定の一部
分のみを認識し、１つのＰＣＲ産物のみ増幅することを
目的とするが、本発明ではプライマーの鋳型核酸に対す
る非特異性を高め、通常のプライマーに見られる特異的
な塩基配列部分を３’末端側に限り、５’末端側にはど
のような塩基であっても結合できるように多様性、Ａｍ
ｂｉｇｕｉｔｙ Ｃｏｒｄで表記される塩基配列の非特
異プライマーを用いて全核酸中の特定の一部分のみなら
ず、これと類似する複数部分を認識し、増幅することを
目的とする。このため、非特異的なプライマーの反応を
進行させるための基本的な手法として、ａ）プライマーに鋳型核酸に特異的な塩基配列の割合を
低く設定する、ｂ）プライマーの全長を比較的短くする、ｃ）プライマーの溶解温度を低く設定しアニーリング温
度を低くする、などの方法をとる。次にこの原理を、図面を用いて説明
する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION In general PCR, the purpose is to increase the specificity of a primer for a template nucleic acid, recognize only a specific part of the total DNA, and amplify only one PCR product. Increase the non-specificity of the primer to the template nucleic acid, and vary the specific base sequence part found in ordinary primers so that only the 3'end side can bind to any base at the 5'end side. Sex, Am
The purpose of the present invention is to recognize and amplify not only a specific part of all nucleic acids but also a plurality of parts similar thereto by using a non-specific primer having a nucleotide sequence represented by bigness Cord. Therefore, as a basic method for proceeding the reaction of a non-specific primer, a) set a low ratio of the base sequence specific to the template nucleic acid to the primer, and b) make the total length of the primer relatively short. , C) Set the melting temperature of the primer low and the annealing temperature low. Next, this principle will be described with reference to the drawings.
【００１２】図１は目的核酸に部分が非特異的な一対
のセンスプライマーとアンチプライマーセットして添加
してＰＣＲを行うと、本来プライマーの基本となった
部分以外に、この塩基配列と相似性のある全核酸中の他
の部分（およびの部分）にもプライマーと非特異的
な反応が起こり、複数のＰＣＲ増幅産物が生成される。[0012] Fig. 1 shows that when a pair of sense primer and anti-primer set of which part is non-specific to the target nucleic acid is added and PCR is carried out, there is a similarity with the base sequence other than the part which was originally the base of the primer. The non-specific reaction with the primer also occurs in the other part (and part thereof) of a certain total nucleic acid to generate a plurality of PCR amplification products.
【００１３】ＰＣＲ増幅産物を加熱し、１本鎖に解離す
る溶解曲線の変化から該増幅産物中の核酸塩基配列の変
異を検出する場合に、図１で得られたＰＣＲ増幅産物を
加熱して１本鎖核酸に解離する溶解曲線（あるいは解離
曲線）を観察すると図２に示す様に、通常の特異プライ
マーを用いてＰＣＲを行った場合と異なり、非特異プラ
イマーの場合には部分、部分および部分の様に複
数の解離曲線が得られ核酸変異の検出あるいは識別の効
率が高まる。When the PCR amplification product is heated and the mutation of the nucleobase sequence in the amplification product is detected from the change in the dissolution curve that dissociates into single strands, the PCR amplification product obtained in FIG. 1 is heated. When the dissolution curve (or dissociation curve) for dissociating into single-stranded nucleic acid is observed, as shown in FIG. 2, unlike in the case where PCR is carried out using a normal specific primer, in the case of a non-specific primer, the partial, partial and A plurality of dissociation curves are obtained as in the case of the portion, and the efficiency of detection or discrimination of nucleic acid mutations is increased.
【００１４】即ち、、およびの各部分で各々２つ
の解離パターンが得られ、これらの組み合わせとして、
２×２×２＝８、で８種類の核酸変異検出あるいは識別
が可能となって特異プライマーを用いた場合と比較し
て、非特異プライマーを用いた場合には一対のプライマ
ーでありながら数倍の情報が得られる。更に、複数対の
非特異プライマーを用いれば、より多くの解離パターン
が得られ核酸変異の検出あるいは識別の効率が高まる。That is, two dissociation patterns are obtained in each of the parts and, and as a combination of these,
With 2 × 2 × 2 = 8, 8 types of nucleic acid mutations can be detected or discriminated, and compared with the case of using a specific primer, when using a non-specific primer, it is a pair of primers but several times Information is obtained. Furthermore, when a plurality of pairs of non-specific primers are used, more dissociation patterns are obtained and the efficiency of nucleic acid mutation detection or discrimination is increased.
【００１５】上記の通り、一対の非特異プライマーで３
個のＰＣＲ増幅産物が得られ各々２個の解離曲線波形が
得られる場合、理論的には組み合わせて８個の解離曲線
波形が形成される。プライマーを２種類用いると１６個
の解離曲線波形が形成されることから複数個の非特異プ
ライマーを用いることによって、より効率が高まる。As described above, 3 pairs of non-specific primers are used.
When one PCR amplification product is obtained and two dissociation curve waveforms are obtained, respectively, theoretically, eight dissociation curve waveforms are combined. Since 16 dissociation curve waveforms are formed when two types of primers are used, the efficiency is further increased by using a plurality of non-specific primers.
【００１６】ＰＣＲプロトコールは基本的に、ａ）ディネーチャー（９８℃／２秒など、２本鎖核酸を
１本鎖核酸に解離・変性させる）、ｂ）アニーリング（５５℃／１０秒など、解離した１本
鎖核酸とプライマーとの反応を起こさせる）、ｃ）エクステンション（７２℃／１０秒など、プライマ
ーからポリメラーゼ酵素で相補的な核酸を合成する）、過程からなっているが、本発明では非特異性を高めるた
めに通常のＰＣＲでは用いない４９℃以下の温度でアニ
ーリングを行うことが特徴である。The PCR protocol is basically a) denaturation (98 ° C./2 sec, etc. to dissociate and denature double-stranded nucleic acid into single-stranded nucleic acid), b) annealing (55 ° C./10 sec, dissociation, etc.) The reaction of the single-stranded nucleic acid with the primer), c) extension (synthesizing a complementary nucleic acid from the primer with a polymerase enzyme at 72 ° C./10 seconds, etc.), The feature is that annealing is performed at a temperature of 49 ° C. or lower, which is not used in ordinary PCR, in order to enhance non-specificity.
【００１７】通常のＰＣＲでは特異性を高めるために可
能な限り明確、かつ他部分との差異が特徴づけられる塩
基配列のプライマーを用いる。しかし、本発明の核酸増
幅法ではプライマーに非特異性を高めるため、通常のプ
ライマーに見られる特異的な塩基配列部分を３’末端側
に限り、５’末端側にはどの様な塩基であっても結合で
きるように多様性とＡｍｂｉｇｕｉｔｙ Ｃｏｄｅで表
記される塩基配列を持つプライマーを使用することによ
って達成された。これは、プライマーは３’末端側から
ＤＮＡに結合を始める性質があるためで、５’末端側は
目的核酸のみならず相似性のある核酸をも同時に増幅が
可能となる。In general PCR, a primer having a nucleotide sequence which is as clear as possible and characterized by a difference from other portions is used in order to enhance specificity. However, in the nucleic acid amplification method of the present invention, in order to increase the non-specificity to the primer, the specific base sequence portion found in a normal primer is limited to the 3'-terminal side and what kind of base is present at the 5'-terminal side. It was achieved by using a primer having diversity and a nucleotide sequence represented by Ambiguity Code so that it can bind to each other. This is because the primer has the property of starting to bind to DNA from the 3'end side, and it is possible to simultaneously amplify not only the target nucleic acid but also similar nucleic acids at the 5'end side.
【００１８】ＰＣＲバッファーは塩濃度、特にマグネシ
ウム濃度が重要で、一般的に高濃度でポリメラーゼ酵素
の活性が高められる。しかし、通常のＰＣＲでは至適マ
グネシウム濃度（１．５〜３．０ｍＭ）を超えると非特
異的反応を促進するのでマグネシウム濃度は３．０ｍＭ
以下に設定されているが、本発明では通常のＰＣＲでは
用いない４．０ｍＭ以上のマグネシウム濃度のバッファ
ーでＰＣＲを行うことを特徴とする。The salt concentration of the PCR buffer, particularly the magnesium concentration is important, and generally the activity of the polymerase enzyme is enhanced at a high concentration. However, in normal PCR, when the optimal magnesium concentration (1.5 to 3.0 mM) is exceeded, nonspecific reaction is promoted, so the magnesium concentration is 3.0 mM.
Although set as follows, the present invention is characterized in that PCR is performed in a buffer having a magnesium concentration of 4.0 mM or more, which is not used in ordinary PCR.
【００１９】また、ＰＣＲのプライマー濃度は、通常域
（１ｍＭ以下）を超えるとプライマー同士の相互干渉や
鋳型核酸に対する非特異的反応が起きやすくなる。しか
し、本発明では非特異性を高めるために通常のＰＣＲで
は用いない１ｍＭ以上のプライマー濃度でＰＣＲを行う
ことによって目的が達せられる。When the PCR primer concentration exceeds the normal range (1 mM or less), mutual interference between the primers and nonspecific reaction with the template nucleic acid are likely to occur. However, in the present invention, the purpose can be achieved by performing PCR with a primer concentration of 1 mM or more which is not used in ordinary PCR in order to enhance non-specificity.
【００２０】[0020]
【実施例】次に、ヒト、マウス、ラットの遺伝子の核酸
変異検出および識別を行った結果に関し、本発明の方法
（非特異ＰＣＲ法）を通常の方法（特異ＰＣＲ法）との
比較で示す。検体からの核酸抽出はＡＧＰＣ法などの常
法に従って行い、リアルタイムＰＣＲを表１の処方で行
った。EXAMPLES Next, regarding the results of nucleic acid mutation detection and discrimination of human, mouse and rat genes, the method of the present invention (non-specific PCR method) will be shown in comparison with the ordinary method (specific PCR method). . Nucleic acid extraction from the sample was performed according to a conventional method such as the AGPC method, and real-time PCR was performed according to the formulation shown in Table 1.
【００２１】[0021]
【００２２】表１において、検体核酸溶液と滅菌蒸留水
の量との間にはｘμｌ＋ｙμｌ＝２５．５μｌの関係に
なる様に調整した。また、プライマーは、特異ＰＣＲ法
の場合には、プライマー１：５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３’（塩基配列番号１）；プライマー２：５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’（塩基配列番号２）；なるＧ３ＰＤＨ特異プライマーを使用した。また、非特異ＰＣＲ法の場合には、プライマー１：５’−ＮＮＶＨＤＢＳＳＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３’（塩基配列番号３）；プライマー２：５’−ＮＮＶＨＤＢＳＳＧＴＴＧＣＴＧＡＴ−３’（塩基配列番号４）；なる５’末端側にＡｍｂｉｇｕｉｔｙ Ｃｏｒｄで表記
された非特異塩基配列を有する構造のＧ３ＰＤＨ非特異
プライマーを使用した。ここにＡｍｂｉｇｕｉｔｙ Ｃ
ｏｒｄは表２に示す通りである。In Table 1, adjustment was made so that the relationship between the sample nucleic acid solution and the amount of sterile distilled water was x μl + y μl = 25.5 μl. In the case of the specific PCR method, the primers are: Primer 1: 5′-ACCACAGTCCATGCCATCATC-3 ′ (base sequence number 1); Primer 2: 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 ′ (base sequence number 2); Primers were used. In the case of the non-specific PCR method, primer 1: 5'-NNVHDBSSTGCCATCAC-3 '(base sequence number 3); Primer 2: 5'-NNVHDBSSGTTGCTGAT-3' (base sequence number 4); The G3PDH non-specific primer having a structure having a non-specific base sequence represented by Ambiguity Cord was used. Ambiguity C here
ord is as shown in Table 2.
【００２３】[0023]
【００２４】ＰＣＲサイクルは、ＡＢＩ社のＧｅｎｅ
Ａｍｐ５７００を使用して特異ＰＣＲの場合には９８℃
／２秒＋５５℃／１０秒＋７２℃／１０秒のサイクルで
４０サイクル、非特異ＰＣＲの場合には９８℃／２秒＋
３０℃／４０秒＋７２℃／１０秒のサイクルで４０サイ
クル実施した。The PCR cycle is based on Gene of ABI
98 ° C in case of specific PCR using Amp5700
/ 2 seconds + 55 ° C / 10 seconds + 72 ° C / 10 seconds 40 cycles, 98 ° C / 2 seconds + for non-specific PCR
40 cycles were carried out at a cycle of 30 ° C./40 seconds + 72 ° C./10 seconds.
【００２５】縦軸に蛍光強度、横軸に温度を取って示し
た特異ＰＣＲで得られたＰＣＲ増幅産物の解離曲線を図
３に、非特異ＰＣＲの解離曲線を図４に示す。図３では
ヒト、マウス、ラットの曲線が重なり核酸変異検出ある
いは識別ができない。しかし、非特異ＰＣＲの図４では
解離曲線が３種類に分かれ、ヒト、マウス、ラットの核
酸変異検出あるいは識別が可能となる。FIG. 3 shows the dissociation curve of the PCR amplification product obtained by the specific PCR in which the vertical axis shows the fluorescence intensity and the horizontal axis shows the temperature, and the dissociation curve of the non-specific PCR is shown in FIG. In FIG. 3, the curves of human, mouse, and rat overlap, and nucleic acid mutations cannot be detected or identified. However, in FIG. 4 of the non-specific PCR, the dissociation curves are divided into three types, and it becomes possible to detect or discriminate human, mouse, and rat nucleic acid mutations.
【００２６】図５は、条件Ａ、条件Ｂ、条件Ｃの順で非
特異性を高めたプライマーを用いて核酸増幅を行った増
幅産物のアガロースゲル電気泳動写真であるが、非特異
性が高まるにつれてＰＣＲバンドの数の増加が確認され
る。このことからも本来の目的遺伝子であるＧ３ＰＤＨ
のみならず、これと相似性のある核酸塩基配列も増幅さ
れている事が判る。FIG. 5 is an agarose gel electrophoresis photograph of an amplification product obtained by subjecting a nucleic acid to amplification using a primer having higher nonspecificity in the order of condition A, condition B, and condition C. The nonspecificity increases. As a result, an increase in the number of PCR bands is confirmed. From this, G3PDH which is the original target gene
Not only that, the nucleic acid base sequence that is similar to this is also amplified.
【００２７】[0027]
【発明の効果】本発明のＰＣＲを応用した核酸増幅法
は、対象２本鎖核酸に対して特異的プライマーを一対使
用してＰＣＲを行う従来の核酸増幅法に比較して、非特
異的プライマーを一対または複数対使用しているので特
異的な目的塩基配列と非特異的な類似塩基配列を同時に
増幅させることができる。その結果、一度のＰＣＲで複
数のＰＣＲ産物を得ることができる。INDUSTRIAL APPLICABILITY The nucleic acid amplification method to which the PCR of the present invention is applied has a non-specific primer as compared with the conventional nucleic acid amplification method in which PCR is performed using a pair of specific primers for the target double-stranded nucleic acid. Since one pair or a plurality of pairs are used, a specific target base sequence and a non-specific similar base sequence can be simultaneously amplified. As a result, multiple PCR products can be obtained by one PCR.
【００２８】目的核酸あるいはＰＣＲ産物を加熱すると
２本鎖核酸が１本鎖核酸に解離する時の解離パターンか
ら核酸変異を検出することができるが、本発明の核酸増
幅法の場合には複数のＰＣＲ産物から複数の解離パター
ンを一度のＰＣＲで可能となる。また、一対のプライマ
ーから複数のＰＣＲ産物が得られるので特異プライマー
を複数対使用した場合に起こるプライマー同士の相互干
渉を回避し、ＰＣＲ効率の低下を防ぐことができるので
コストを低下させる利点がある。When the target nucleic acid or the PCR product is heated, the nucleic acid mutation can be detected from the dissociation pattern when the double-stranded nucleic acid dissociates into the single-stranded nucleic acid. In the nucleic acid amplification method of the present invention, a plurality of nucleic acid mutations can be detected. Multiple dissociation patterns from PCR products are possible in a single PCR. In addition, since a plurality of PCR products can be obtained from a pair of primers, mutual interference between the primers that occurs when a plurality of pairs of specific primers are used can be avoided, and a decrease in PCR efficiency can be prevented, which is advantageous in reducing costs. .
【００２９】[0029]
【配列表】 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ＜１１０＞株式会社アドジーン＜１２０＞ＰＣＲ法を応用した非特異核酸増幅法＜１３０＞ＡＤＧ０２０３２２＜１４１＞２００２−３−２２＜１６０＞４＜２１０＞１＜２１１＞２０＜２１２＞ＤＮＡ＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＜４００＞１ａｃｃａｃａｇｔｃｃａ ｔｇｃｃａｔｃａｃ ２０＜２１０＞２＜２１１＞２０＜２１２＞ＤＮＡ＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＜４００＞２ｔｃｃａｃｃａｃｃｃ ｔｇｔｔｇｃｔｇｔａ ２０＜２１０＞３＜２１１＞１７＜２１２＞ＤＮＡ＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＜４００＞３ｎｎｖｈｄｂｓｓｔｇ ｃｃａｔｃａｃ １７＜２１０＞４＜２１１＞１７＜２１２＞ＤＮＡ＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＜４００＞４ｎｎｖｈｄｂｓｓｇｔ ｔｇｃｔｇｔａ １７[Sequence list] SEQUENCE LISTING<110> Adgene Co., Ltd.<120> Nonspecific nucleic acid amplification method applying PCR method<130> ADG020322<141> 2002-3-22<160> 4<210> 1<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<400> 1accacagtcca tgcccatcac 20<210> 2<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<400> 2tccaccacccc tgtttgctgta 20<210> 3<211> 17<212> DNA<213> Artificial Sequence<400> 3nnvhdbsstg cccatcac 17<210> 4<211> 17<212> DNA<213> Artificial Sequence<400> 4nnvhdbssgt tgctgta 17
【図１】目的核酸に対するプライマーの配置状態の概念
図である。FIG. 1 is a conceptual diagram showing the arrangement of primers for a target nucleic acid.
【図２】非特異プライマーを使用した核酸増幅産物の解
離曲線の概念図である。FIG. 2 is a conceptual diagram of a dissociation curve of a nucleic acid amplification product using a non-specific primer.
【図３】特異ＰＣＲ法増幅産物の解離曲線である。FIG. 3 is a dissociation curve of an amplification product of a specific PCR method.
【図４】非特異ＰＣＲ増幅産物の解離曲線である。FIG. 4 is a dissociation curve of a non-specific PCR amplification product.
【図５】非特異ＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真である。FIG. 5 is an electrophoretic photograph of a non-specific PCR amplification product.
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