【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸を含有する材
料から簡便かつ短時間に核酸を単離する方法に関する。
また、前記核酸単離方法を行うための核酸単離用流路、
及び核酸単離用チップに関する。詳細には、核酸を含有
する材料として、たとえば人の疾患の診断に用いる臨床
検体である喀痰、唾液、尿、便、精液、血液、組織、臓
器、その他の体液、またはこれらの体液の分画、微生物
汚染の検査に用いる食品、飲料水、土壌、排水、河川
水、海水、ふき取り液、ふき取り綿などが挙げられる。
本発明は、核酸を検出することで、検体中の特定微生物
の存在を検出する場合や、人の遺伝子診断を行ったりす
る場合において利用可能である。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for isolating a nucleic acid from a nucleic acid-containing material simply and in a short time.
Further, a nucleic acid isolation channel for performing the nucleic acid isolation method,
And a chip for nucleic acid isolation. Specifically, as a material containing a nucleic acid, for example, a clinical sample used for diagnosing a human disease, such as sputum, saliva, urine, stool, semen, blood, tissue, organ, other body fluid, or a fraction of these body fluids. , Food used for inspection of microbial contamination, drinking water, soil, drainage, river water, seawater, wiping solution, wiping cotton, etc.
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be used in the case of detecting the presence of a specific microorganism in a sample by detecting a nucleic acid, or in the case of performing genetic diagnosis of human.
【０００２】[0002]
【従来の技術】遺伝子工学分野の進歩によって、遺伝子
を用いた医療診断や微生物検査が一般的に行われるよう
になった。たとえば医療分野においては、核酸ハイブリ
ダイゼーション法と呼ばれる方法を用いて、感染性微生
物の菌種同定を行う試験方法が実用化されている。この
方法は、まず対象となる微生物の２本鎖の核酸（ＤＮ
Ａ）を、加熱やアルカリ処理によって１本鎖ＤＮＡとす
る。次いで、プローブと呼ばれる既知配列の１本鎖ＤＮ
Ａに放射性同位元素や蛍光物質等で標識したものを前記
１本鎖ＤＮＡと反応させる。この反応はハイブリダイゼ
ーション反応として知られている。対象の微生物由来の
ＤＮＡがオリゴ核酸と相補的である場合、２本鎖ＤＮＡ
が形成される。この２本鎖のＤＮＡを検出することで、
対象の微生物の菌種を同定できる。2. Description of the Related Art Advances in the field of genetic engineering have led to the general practice of medical diagnosis and microbial testing using genes. For example, in the medical field, a test method for identifying a bacterial species of an infectious microorganism using a method called a nucleic acid hybridization method has been put into practical use. This method starts with double-stranded nucleic acid (DN
A) is converted into single-stranded DNA by heating or alkali treatment. Then, a single-stranded DN of known sequence called a probe
A labeled with a radioisotope, a fluorescent substance, or the like is reacted with the single-stranded DNA. This reaction is known as the hybridization reaction. Double-stranded DNA when the DNA derived from the target microorganism is complementary to the oligonucleic acid
Is formed. By detecting this double-stranded DNA,
The species of the target microorganism can be identified.
【０００３】また、ポリメラーゼ・チェイン反応法（Ｐ
ＣＲ法、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０：１３５０−１３５
４、１９８５、日本国特許第２５４６５７６号、第２５
０２０４１号、第２６１３８７７号）をはじめとした様
々な核酸増幅方法の開発は、遺伝子を用いた医療診断や
微生物検査を大きく伸展させた。すなわち、これらの核
酸増幅法によって、核酸を配列特異的に増幅することが
可能なため、たとえば、臨床検体中に存在する可能性の
ある病原体について、その病原体固有の配列の核酸を増
幅する事によって、より高感度に検出することが可能に
なっている。Further, the polymerase chain reaction method (P
CR method, Science, 230: 1350-135
4, 1985, Japanese Patent No. 2546576, No. 25
The development of various nucleic acid amplification methods such as No. 02041 and No. 2613877) has greatly expanded medical diagnostics and microbiological tests using genes. That is, since nucleic acids can be sequence-specifically amplified by these nucleic acid amplification methods, for example, for a pathogen that may be present in a clinical specimen, by amplifying a nucleic acid having a sequence unique to the pathogen. , It is possible to detect with higher sensitivity.
【０００４】ここで、一般的に、核酸を含有する材料に
含まれる核酸を検出するためには、まず、核酸を含有す
る材料中の核酸を単離する必要がある。それは、核酸を
含有する材料中には核酸以外の夾雑物質、たとえばタン
パク質、脂質、糖質などが大量に含まれており、これら
が、該核酸をポリメラーゼ・チェイン反応などで増幅反
応を行ったり、ハイブリダイゼーション反応で検出した
り、核酸の配列解析を行う場合などに悪影響を及ぼすた
めである。たとえば核酸を含有する材料中に増幅反応が
阻害される因子を含むような場合では、実際には、目的
の菌が含まれているにもかかわらず、増幅反応が起きな
いため、最終的に増幅産物が確認できず、菌が含まれて
いないという誤った結果を与える。したがって、あらか
じめ核酸を含有する材料中の夾雑物質を除き、引き続い
て行われる核酸の増幅反応や、ハイブリダイゼーション
などの検出反応に影響を及ぼさないように、核酸を単離
する操作が必要となる。Generally, in order to detect the nucleic acid contained in the nucleic acid-containing material, it is first necessary to isolate the nucleic acid in the nucleic acid-containing material. That is, the material containing nucleic acid contains a large amount of contaminants other than nucleic acid, such as proteins, lipids, sugars, etc., and these perform amplification reaction of the nucleic acid by polymerase chain reaction or the like, This is because it has an adverse effect on detection by a hybridization reaction or analysis of a nucleic acid sequence. For example, in the case where the material containing nucleic acid contains a factor that inhibits the amplification reaction, the amplification reaction does not actually occur even though the target bacterium is contained, so that the amplification The product cannot be confirmed, giving the false result that the fungus is not contained. Therefore, it is necessary to remove impurities in the material containing the nucleic acid in advance and isolate the nucleic acid so as not to affect the subsequent amplification reaction of the nucleic acid or detection reaction such as hybridization.
【０００５】核酸の単離に関しては、従来からクロロホ
ルム／フェノールを用いた手法が用いられてきた。本手
法は、タンパク質分解酵素や界面活性剤の存在下で核酸
を含有する材料を溶解して核酸を遊離した後、フェノー
ル及びクロロホルムを加えて、核酸を水層中に抽出し、
該水層を分離後、エタノールを加えて核酸を沈降させ、
エタノールから分離することにより実施される。また、
ほかの一例は、日本国特許第２６８０４６２号（特開平
２−２８９５９６号公報、Ｊ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２８−３：４９５−５０３、
１９９０）に記載の方法である。この方法は、核酸を含
有する材料を、たとえばグアニジンチオシアン酸塩水溶
液等のカオトロピック性の高い水溶液に暴露して核酸を
遊離したあと、核酸結合性シリカ粒子に該核酸を吸着さ
せ、該シリカ粒子を液相から分離して、核酸を含有する
材料中の夾雑物質を分離した後、該シリカ粒子に結合し
た核酸を溶出することにより実施される。この方法に基
づいた核酸の単離を行う試薬や用具は、いわゆる「キッ
ト」として市販されている。Regarding the isolation of nucleic acids, a method using chloroform / phenol has been conventionally used. This method is to dissolve a nucleic acid-containing material in the presence of a proteolytic enzyme or a surfactant to release the nucleic acid, and then add phenol and chloroform to extract the nucleic acid into an aqueous layer,
After separating the aqueous layer, ethanol is added to precipitate the nucleic acid,
It is carried out by separating it from ethanol. Also,
Another example is Japanese Patent No. 2680462 (JP-A-2-289596, J. Clinical M).
microbiology, 28-3: 495-503,
1990). In this method, a material containing a nucleic acid is exposed to an aqueous solution having a high chaotropic property such as an aqueous solution of guanidine thiocyanate to release the nucleic acid, and then the nucleic acid is adsorbed on a nucleic acid-binding silica particle to form the silica particle. It is carried out by separating from the liquid phase to separate contaminants in the nucleic acid-containing material and then eluting the nucleic acid bound to the silica particles. Reagents and tools for isolating nucleic acids based on this method are commercially available as so-called "kits".
【０００６】一方、医療における臨床検査の現場では、
患者から採取した検体を、臨床の現場において迅速かつ
簡便に検査し、結果を判断してすぐに診療に生かす、い
わゆる「ポイント・オブ・ケアー・テスト」と呼ばれる
診断法が求められている。また、環境や食品の分析にお
いても、迅速かつ簡便に結果を出す検査、いわゆる「ポ
イント・オブ・フィールド・テスト」が求められてい
る。以下、これらの検査を「簡易迅速検査」と記載す
る。これらの検査においては、できるだけ短時間に、手
動で行う操作を減らして簡便に行うことが要求される。
すなわち、核酸の単離と次いで行われる増幅や、更に検
出の工程が１つの「チップ」で完結できるのが望まし
い。このチップは、安価に製造することができ、「使い
捨て」またはそれに準じる使い方ができるように設計さ
れている事が望ましい。しかし、核酸を用いた診断にお
いては、このような簡易迅速検査として実用化されてい
るものはない。On the other hand, in the field of clinical examination in medicine,
There is a demand for a so-called "point-of-care test" diagnostic method in which a sample collected from a patient is tested quickly and simply in a clinical setting, the result is judged and it is immediately utilized for medical treatment. Also, in the analysis of environment and food, a so-called "point-of-field test" that promptly and easily produces results is required. Hereinafter, these inspections will be referred to as “simple and quick inspections”. In these inspections, it is required to reduce the number of manual operations and to simply perform them in the shortest possible time.
That is, it is desirable that the step of isolating the nucleic acid, the subsequent amplification, and the detection can be completed by one “chip”. It is desirable that this chip be manufactured at low cost and designed to be "disposable" or used in a similar manner. However, none of the diagnostics using nucleic acids has been put to practical use as such a simple and rapid test.
【０００７】特許第２６８０４６２号に記載の手法で核
酸を含有する材料から単離した核酸に、遊離、吸着や洗
浄に用いた液体、具体的にはグアニジンチオシアン酸塩
やエタノール等の有機溶媒が残存した場合、これらの因
子が、ポリメラーゼ・チェイン反応やハイブリダイゼー
ション反応を阻害する。これらを解決するために上記方
法では核酸が結合したシリカ粒子の段階で、遠心操作で
充分に洗浄液を分離する方法か、容器の蓋を開放して加
熱することで乾燥して分離する方法を採用するか、また
は、溶出した核酸溶液を、ポリメラーゼ・チェイン反応
やハイブリダイゼーション反応に阻害がかからない程度
まで希釈して使用しなければならない。遠心操作は操作
が複雑であり、簡易迅速検査を妨げる要因である。有機
溶媒で洗浄した後容器の蓋を開放して乾燥する方法は、
空気中に存在している他の微生物や核酸の混入の危険性
が増す。実際に、ポリメラーゼ・チェイン反応を行う場
合、これら周囲からの核酸の混入は、しばしば臨床検査
において偽陽性の結果を与え、問題となる。希釈して阻
害を避ける方法は、増幅法によってもたらされる高感度
に検出できる利点を失うことになる。したがって、特許
第２６８０４６２号に記載の手法は、そのままの手法で
は、簡易迅速検査に適用するのが困難である。[0007] On the nucleic acid isolated from the material containing the nucleic acid by the method described in Japanese Patent No. 2680462, a liquid used for liberation, adsorption or washing, specifically, an organic solvent such as guanidine thiocyanate or ethanol remains. If so, these factors inhibit the polymerase chain reaction and the hybridization reaction. In order to solve these problems, in the above method, at the stage of silica particles to which nucleic acids are bound, a method in which the washing solution is sufficiently separated by centrifugation or a method in which the container lid is opened and heated to dry it is adopted. Alternatively, the eluted nucleic acid solution must be diluted to such an extent that it does not interfere with the polymerase chain reaction or the hybridization reaction. Centrifugal operation is complicated and is a factor that hinders simple and quick inspection. The method of drying after opening the lid of the container after washing with an organic solvent is
The risk of contamination with other microorganisms and nucleic acids present in the air increases. In fact, when carrying out the polymerase chain reaction, contamination of nucleic acids from these surroundings is often problematic, giving false positive results in clinical tests. The method of dilution to avoid inhibition loses the sensitive detection advantages afforded by the amplification method. Therefore, it is difficult to apply the method described in Japanese Patent No. 2680462 to the simple and quick inspection as it is.
【０００８】また、カオトロピックイオンの存在下で核
酸を吸着する物質として、磁場によって液相からの分離
を容易に行うことのできる磁性体粒子をシリカ基材で覆
った微粒子（特開平９−１９２９２号公報）がある。こ
の磁性シリカ粒子を用いた方法では、各工程において、
該磁性シリカ粒子を液体中に分散することが重要で、こ
れを解決するために、物理的な方法、具体的にはボルテ
ックスミキサー等の振動機器で容器を振動させるか、ピ
ペットと呼ばれる器具で、容器内の液体を激しく出し入
れする方法で、分散することが必要である。または、自
動機器において磁石の振動によって洗浄効果を高めるこ
とも行われている（特開平１１−２１５９７８号公
報）。しかしその操作は煩雑なので、チップ上では極め
て難しく、簡易迅速検査に適した機械化を妨げる要因と
なる。Further, as a substance for adsorbing nucleic acids in the presence of chaotropic ions, fine particles in which magnetic particles which can be easily separated from a liquid phase by a magnetic field are covered with a silica substrate (Japanese Patent Laid-Open No. 9-19292). Gazette). In the method using the magnetic silica particles, in each step,
It is important to disperse the magnetic silica particles in a liquid, and in order to solve this, a physical method, specifically, vibrating the container with a vibrating device such as a vortex mixer, or an instrument called a pipette, It is necessary to disperse the liquid in the container by vigorously moving it in and out. Alternatively, the cleaning effect is also enhanced by vibration of a magnet in an automatic device (JP-A-11-215978). However, since the operation is complicated, it is extremely difficult on the chip, and becomes a factor that hinders mechanization suitable for simple and quick inspection.
【０００９】以上のように、現在実用化されている核酸
の自動単離装置は、数多くの試料を大量に処理すること
が求められる場合に有用ではあるが、簡易迅速検査に求
められる、「短時間に簡便に核酸を単離し、更に単一チ
ップ内で次の増幅反応や検出反応を行う」のは難しく、
解決すべき課題が非常に多い。[0009] As described above, the automatic nucleic acid isolator currently in practical use is useful when a large number of samples are required to be processed in a large amount. It is difficult to simply isolate the nucleic acid in time and further carry out the next amplification reaction or detection reaction in a single chip.
There are so many issues to be solved.
【００１０】[0010]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
を解決するためのものであり核酸を含有する材料から、
該核酸を効率よく短時間に簡便に、そして自動機械化可
能な手段にて単離する方法を提供することを課題とす
る。また、チップ内で核酸を単離する自動機器を提供す
ることを課題とする。更には、核酸を単離後、増幅反応
を行い、増幅された核酸を検出することを完了する自動
核酸検出機器を提供する事を課題とする。これらの機器
によって、簡易迅速検査が実現される。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention is for solving the above-mentioned problems, and is made of a material containing a nucleic acid,
It is an object of the present invention to provide a method for isolating the nucleic acid efficiently, in a short time, easily and by means capable of automatic mechanization. Another object is to provide an automatic device for isolating nucleic acid in a chip. Another object of the present invention is to provide an automatic nucleic acid detection device that completes the detection of the amplified nucleic acid by performing an amplification reaction after isolating the nucleic acid. A simple and quick inspection is realized by these devices.
【００１１】[0011]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、核酸が結合した核酸結合性磁性担体
の洗浄、乾燥、及び該磁性担体からの核酸の溶出を流路
中で効率よく行う方法について、鋭意研究を重ねた。そ
の結果、核酸単離用流路として該流路に沿った少なくと
も２箇所で該磁性担体を保持しうる磁場を適用可能であ
る流路を発明し、該流路において該磁性担体を含む懸濁
液を流し、かつ、該磁性担体を磁場による保持と磁場の
解除による分散を行いながら洗浄、乾燥、及び核酸の溶
出を行うことにより、核酸を含有する材料から簡便かつ
短時間に核酸を単離でき、単離された該核酸の増幅反応
も可能であることを見出して、本発明を完成するに至っ
た。また、本発明の核酸単離方法を行うための核酸単離
用流路を含む核酸単離用チップを完成させるに至った。In order to solve the above-mentioned problems, the inventors of the present invention wash, dry, and elute the nucleic acid from the magnetic carrier bound with the nucleic acid in the flow channel. We have earnestly researched how to do it efficiently. As a result, as a flow path for nucleic acid isolation, a flow path capable of applying a magnetic field capable of holding the magnetic carrier at at least two points along the flow path is invented, and a suspension containing the magnetic carrier in the flow path is invented. Isolate nucleic acid from a material containing nucleic acid by flowing a liquid and washing, drying, and elution of nucleic acid while holding the magnetic carrier by a magnetic field and dispersing by releasing the magnetic field. It was found that the amplification reaction of the isolated nucleic acid was possible, and the present invention was completed. Further, a nucleic acid isolation chip including a nucleic acid isolation channel for carrying out the nucleic acid isolation method of the present invention has been completed.
【００１２】すなわち、本発明は、（１）核酸が結合し
た核酸結合性磁性担体から核酸を単離する方法であっ
て、該方法は核酸単離用流路であって、該流路に沿った
少なくとも２箇所で該磁性担体を保持しうる磁場を適用
可能である核酸単離用流路を用意する工程；該流路に核
酸が結合した該磁性担体の懸濁液を流すとともに、該少
なくとも２箇所の１つの箇所で該磁場を適用して該磁性
担体を該懸濁液から分離する工程；該流路に少なくとも
１つの洗浄用溶液を流すとともに、該磁性担体が保持さ
れた箇所での該磁場の適用を解除し、該磁性担体が保持
された箇所より下流の箇所で該磁場を適用することで、
該磁性担体を洗浄しかつ該洗浄用溶液から分離する工
程；該流路に核酸溶出用溶液を流して、該磁性担体から
核酸を溶出する工程；を包含する核酸単離方法に関す
る。That is, the present invention is (1) a method for isolating a nucleic acid from a nucleic acid-binding magnetic carrier to which a nucleic acid is bound, the method comprising a nucleic acid isolation channel, which is provided along the channel. A step of preparing a nucleic acid isolation channel to which a magnetic field capable of holding the magnetic carrier can be applied at at least two places; Applying the magnetic field at one of two locations to separate the magnetic carrier from the suspension; at least one wash solution flowing through the channel and at the location where the magnetic carrier was retained By canceling the application of the magnetic field and applying the magnetic field at a location downstream of the location where the magnetic carrier is held,
And a step of washing the magnetic carrier and separating it from the washing solution; a step of flowing a nucleic acid eluting solution into the channel to elute the nucleic acid from the magnetic carrier.
【００１３】また、本発明は、（２）核酸の単離方法で
あって、該方法は、核酸を含有する材料と核酸遊離用溶
液を混合して、溶液中に該核酸を遊離した混合液を調製
する工程；該混合液に核酸結合性磁性担体及び核酸吸着
用溶液を混合して、核酸が結合した核酸結合性磁性担体
を含有する懸濁液を調製する工程；核酸単離用流路であ
って該流路に沿った少なくとも２箇所で該磁性担体を保
持しうる磁場を適用可能である核酸単離用流路を用意す
る工程；該流路に該懸濁液を流すとともに、該少なくと
も２箇所の１つの箇所で該磁場を適用して該磁性担体を
該懸濁液から分離する工程；該流路に少なくとも１つの
洗浄用溶液を流すとともに、該磁性担体が保持された箇
所での該磁場の適用を解除し、該磁性担体が保持された
箇所より下流の箇所で該磁場を適用して、該磁性担体を
洗浄し、かつ該洗浄用溶液から分離する工程；該流路に
核酸溶出用溶液を流して、該磁性担体から核酸を溶出す
る工程；を包含する核酸単離方法に関する。The present invention also provides (2) a method for isolating a nucleic acid, which comprises mixing a material containing a nucleic acid and a nucleic acid releasing solution to release the nucleic acid in the solution. A step of preparing a nucleic acid-binding magnetic carrier and a solution for adsorbing a nucleic acid to prepare a suspension containing the nucleic acid-binding magnetic carrier to which nucleic acid is bound; And a step of preparing a nucleic acid isolation channel to which a magnetic field capable of holding the magnetic carrier can be applied at at least two points along the channel; Applying the magnetic field at one of at least two locations to separate the magnetic carrier from the suspension; at least one wash solution flowing through the channel and at the location where the magnetic carrier is retained The application of the magnetic field of the And applying the magnetic field to wash the magnetic carrier and separate it from the washing solution; flowing a nucleic acid eluting solution into the channel to elute the nucleic acid from the magnetic carrier. A nucleic acid isolation method.
【００１４】また、本発明は、（３）核酸の単離方法で
あって、該方法は、核酸を含有する材料と核酸遊離用溶
液と核酸結合性磁性担体及び核酸吸着用溶液を混合し
て、核酸が結合した核酸結合性磁性担体を含有する懸濁
液を調製する工程；核酸単離用流路であって該流路に沿
った少なくとも２箇所で該磁性担体を保持しうる磁場を
適用可能である核酸単離用流路を用意する工程；該流路
に該懸濁液を流すとともに、該少なくとも２箇所の１つ
の箇所で該磁場を適用して該磁性担体を該懸濁液から分
離する工程；該流路に少なくとも１つの洗浄用溶液を流
すとともに、該磁性担体が保持された箇所での該磁場の
適用を解除し、該磁性担体が保持された箇所より下流の
箇所で該磁場を適用して、該磁性担体を洗浄し、かつ該
洗浄用溶液から分離する工程；該流路に核酸溶出用溶液
を流して、該磁性担体から核酸を溶出する工程；を包含
する核酸単離方法に関する。The present invention also provides (3) a method for isolating a nucleic acid, which comprises mixing a nucleic acid-containing material, a nucleic acid releasing solution, a nucleic acid-binding magnetic carrier and a nucleic acid adsorbing solution. A step of preparing a suspension containing a nucleic acid-binding magnetic carrier having nucleic acids bound thereto; applying a magnetic field capable of holding the magnetic carrier at at least two points along the flow path for nucleic acid isolation A step of preparing a flow channel for nucleic acid isolation which is possible; flowing the suspension through the flow channel, and applying the magnetic field at one of the at least two locations to remove the magnetic carrier from the suspension. A step of separating; flowing at least one washing solution into the flow path, releasing the application of the magnetic field at the location where the magnetic carrier is held, and performing the treatment at a location downstream of the location where the magnetic carrier is held. A magnetic field is applied to wash the magnetic carrier and separate it from the washing solution. That process; relates to a nucleic acid isolation method including; flowing a nucleic acid eluting solution in the flow path, eluting the nucleic acid from the magnetic carrier.
【００１５】また、本発明は、（４）核酸の単離方法で
あって、該方法は核酸結合性磁性担体、核酸を含有する
材料、及び核酸遊離吸着用溶液を混合して、核酸が結合
した核酸結合性磁性担体を含有する懸濁液を調製する工
程；核酸単離用流路であって該流路に沿った少なくとも
２箇所で該磁性担体を保持しうる磁場を適用可能である
核酸単離用流路を用意する工程；該流路に該懸濁液を流
すとともに、該少なくとも２箇所の１つの箇所で該磁場
を適用して該磁性担体を該懸濁液から分離する工程；該
流路に少なくとも１つの洗浄用溶液を流すとともに、該
磁性担体が保持された箇所での該磁場の適用を解除し、
該磁性担体が保持された箇所より下流の箇所で該磁場を
適用して、該磁性担体を洗浄し、かつ該洗浄用溶液から
分離する工程；該流路に核酸溶出用溶液を流して、該磁
性担体から核酸を溶出する工程；を包含する核酸単離方
法に関する。The present invention also provides (4) a method for isolating nucleic acid, which comprises mixing a nucleic acid-binding magnetic carrier, a material containing nucleic acid, and a solution for free adsorption of nucleic acid to bind the nucleic acid. Of a suspension containing the nucleic acid-binding magnetic carrier described above; a nucleic acid for applying a magnetic field capable of holding the magnetic carrier at at least two points along the flow path for nucleic acid isolation Providing an isolation channel; flowing the suspension through the channel and applying the magnetic field at one of the at least two locations to separate the magnetic carrier from the suspension; Flowing at least one cleaning solution in the channel, and releasing the application of the magnetic field at the location where the magnetic carrier is held,
A step of applying the magnetic field at a location downstream of the location where the magnetic carrier is held to wash the magnetic carrier and separate it from the washing solution; And a step of eluting the nucleic acid from the magnetic carrier.
【００１６】これら（１）〜（４）の発明によって、核
酸の単離を容易に達成することができるようになる。す
なわち、該磁性担体は、磁場を使って集積した場合に強
固に凝集を起こして塊となることが多い。このような凝
集塊に対して、磁場の適用を解除せずに、そのまま洗浄
液による洗浄操作を行った場合、該磁性担体が洗浄液中
に分散しないので、洗浄液が担体の塊の内部にまで及ば
ず、夾雑物質の分離除去が不完全になる。磁場によって
凝集した後、洗浄する場合に該磁場を解除して、下流の
磁場で再び凝集するという（１）〜（４）の発明によっ
て、洗浄時に該磁性担体が洗浄液中に分散されるので、
洗浄液が該磁性担体を効率良く洗浄することが可能にな
る。また、磁場を適用して該磁性単体が凝集した塊は、
凝集させたまま、洗浄等の操作を行うと、より強く凝集
して流路内部での詰まりの原因となる。（１）〜（４）
の発明によって、洗浄時に該磁性担体の凝集塊が分散さ
れるので、詰まりの原因となる可能性が低くなる。The inventions (1) to (4) make it possible to easily achieve isolation of nucleic acid. That is, the magnetic carrier often strongly aggregates into a lump when integrated using a magnetic field. When such agglomerates are subjected to a washing operation with a washing liquid as they are without releasing the application of a magnetic field, the magnetic carrier does not disperse in the washing liquid, so that the washing liquid does not reach the inside of the carrier agglomerates. , Separation and removal of contaminants becomes incomplete. According to the inventions (1) to (4), in which the magnetic field is released in the case of washing after the flocculation by the magnetic field and the flocculation is performed again in the downstream magnetic field, the magnetic carrier is dispersed in the washing liquid at the time of washing.
The cleaning liquid can efficiently clean the magnetic carrier. In addition, a lump in which the magnetic simple substance is aggregated by applying a magnetic field is
If an operation such as washing is performed with the aggregated particles, the particles are aggregated more strongly and cause clogging in the flow channel. (1)-(4)
According to the invention of (1), since the aggregates of the magnetic carrier are dispersed at the time of washing, the possibility of causing clogging is reduced.
【００１７】さらに、（２）〜（４）の発明によって核
酸結合性磁性担体を用いて核酸を含有する材料から該核
酸を抽出して単離する一連の操作が、すべて、核酸単離
用流路内で達成することが可能になり、容易に核酸の単
離を実施することが可能になる。さらに、（３）の発明
である、該遊離液と該吸着液を混合する工程を同一工程
とすることにより、また（４）の発明である、該核酸単
離方法において該遊離液が吸着液を兼ねることにより、
それぞれの発明において核酸単離の工程が少なくなり、
より容易に核酸の単離を実施することが可能になる。Further, according to the inventions of (2) to (4), a series of operations for extracting and isolating the nucleic acid from the material containing the nucleic acid by using the nucleic acid-binding magnetic carrier are all performed for nucleic acid isolation. It can be achieved in the tract and facilitates the isolation of nucleic acids. Furthermore, by making the step of mixing the free liquid and the adsorbent solution, which is the invention of (3), the same step, and in the nucleic acid isolation method of the invention of (4), the free liquid is an adsorbent solution. By also serving as
In each invention, the steps of nucleic acid isolation are reduced,
It becomes possible to perform nucleic acid isolation more easily.
【００１８】また、本発明は、（５）該懸濁液を調製す
る工程を、該核酸単離用流路に連通する流路内で行うこ
とを特徴とする上記（２）〜（４）に記載の核酸単離方
法に関する。（５）の発明によって、核酸結合性磁性担
体を用いて核酸を含有する材料から該核酸を抽出して単
離する一連の操作を核酸単離用流路内で達成する場合に
おいて、該核酸結合性磁性担体に該核酸が結合した状態
の該懸濁液を流路内で効率良く調製することが可能にな
り、容易に核酸の単離を実施することが可能になる。Further, the present invention is characterized in that (5) the step of preparing the suspension is carried out in a channel communicating with the nucleic acid isolation channel. The method for isolating nucleic acid according to 1. According to the invention of (5), when a series of operations for extracting and isolating the nucleic acid from the material containing the nucleic acid by using the nucleic acid-binding magnetic carrier is accomplished in the nucleic acid isolation channel, the nucleic acid binding It becomes possible to efficiently prepare the suspension in a state in which the nucleic acid is bound to the polar magnetic carrier in the flow channel, and to easily isolate the nucleic acid.
【００１９】また、本発明は、（６）該磁性担体を洗浄
し、かつ該洗浄用溶液から分離する工程が更に、該下流
の箇所を加熱して該箇所に保持された該磁性担体を乾燥
する工程、及び該下流の箇所に送風して該箇所に保持さ
れた該磁性担体を乾燥する工程の少なくとも１つの工程
を包含する上記（１）〜（５）に記載の核酸単離方法に
関する。（６）の発明によって、核酸結合性磁性担体を
用いて核酸を含有する材料から該核酸を抽出して単離す
る場合に、該核酸結合性磁性担体中に残存する洗浄液
を、流路内で効率良く除去することが可能になる。これ
は、核酸単離後に次いで行われるハイブリダイゼーショ
ンや増幅反応において、残存する洗浄液に由来する反応
の阻害がなくなるので有用である。In the present invention, the step (6) of washing the magnetic carrier and separating it from the washing solution further comprises heating the downstream portion to dry the magnetic carrier held at the portion. The method for isolating nucleic acid according to the above (1) to (5), which comprises at least one of the steps of: (1) and a step of drying the magnetic carrier retained at the location by blowing air to the location. According to the invention of (6), when a nucleic acid-containing magnetic carrier is used to extract and isolate the nucleic acid from a material containing the nucleic acid, the washing liquid remaining in the nucleic acid-binding magnetic carrier is kept in the channel. It can be removed efficiently. This is useful in the subsequent hybridization or amplification reaction performed after nucleic acid isolation, since the reaction derived from the remaining washing solution is not disturbed.
【００２０】また、本発明は、（７）該磁性担体から核
酸を溶出する工程が、該核酸溶出用溶液を該流路に流す
とともに、該下流の箇所での該磁場の適用を解除して、
該磁性担体から核酸を溶出する工程である、上記（１）
〜（６）に記載の核酸単離方法に関する。（７）の発明
によって、核酸結合性磁性担体に結合している核酸を溶
出する工程においても、該磁性担体が塊とならず溶出液
中に分散されるため溶出効率が高くなり、核酸の単離に
おいて有用である。Further, in the present invention, (7) in the step of eluting the nucleic acid from the magnetic carrier, the solution for eluting the nucleic acid is caused to flow in the channel, and the application of the magnetic field at the downstream portion is canceled. ,
The above step (1) is a step of eluting nucleic acid from the magnetic carrier.
To (6) on the nucleic acid isolation method. According to the invention of (7), even in the step of eluting the nucleic acid bound to the nucleic acid-binding magnetic carrier, the magnetic carrier is not aggregated and dispersed in the eluate, so that the elution efficiency is increased and the nucleic acid is isolated. Useful in separation.
【００２１】また、本発明は、（８）該核酸溶出用溶液
が、核酸増幅反応用の酵素、オリゴ核酸、及び基質を含
有する、上記（１）〜（７）に記載の核酸単離方法に関
する。（８）の発明によって、溶出液で溶出された状態
のまま、引き続いて核酸の増幅反応を行うことが可能に
なる。すなわち、より迅速に核酸を検出することが可能
になる。また、本発明は、（９）該核酸結合性磁性担体
が、磁性シリカ粒子または磁性シリカ誘導体粒子であ
る、上記（１）〜（８）に記載の核酸単離方法に関す
る。[0021] The present invention also provides (8) the method for isolating a nucleic acid according to the above (1) to (7), wherein the nucleic acid elution solution contains an enzyme for nucleic acid amplification reaction, an oligonucleic acid, and a substrate. Regarding According to the invention of (8), it becomes possible to carry out a nucleic acid amplification reaction subsequently while being eluted with an eluent. That is, the nucleic acid can be detected more quickly. The present invention also relates to (9) the method for isolating nucleic acid according to the above (1) to (8), wherein the nucleic acid-binding magnetic carrier is magnetic silica particles or magnetic silica derivative particles.
【００２２】また、本発明は、（１０）該核酸遊離用溶
液及び該核酸吸着用溶液の少なくとも一方がカオトロピ
ックイオンを含有する、上記（２）〜（９）に記載の核
酸単離方法、あるいは、（１１）該核酸遊離吸着用溶液
がカオトロピックイオンを含有する、上記（３）〜
（９）に記載の核酸単離方法に関する。これら（９）〜
（１１）の発明によって、核酸の該核酸結合性磁性担体
への結合、吸着、および遊離がより効率良く行われ、核
酸の単離において有用である。The present invention also provides (10) the method for isolating nucleic acid according to the above (2) to (9), wherein at least one of the nucleic acid releasing solution and the nucleic acid adsorbing solution contains chaotropic ions, or (11) The nucleic acid free adsorption solution contains a chaotropic ion, (3) to
It relates to the method for isolating a nucleic acid according to (9). These (9) ~
According to the invention of (11), the binding, adsorption, and release of the nucleic acid to the nucleic acid-binding magnetic carrier can be carried out more efficiently, which is useful in the isolation of the nucleic acid.
【００２３】また、本発明は、（１２）核酸単離増幅方
法であって、上記（１）〜（１１）に記載の核酸単離方
法により単離された核酸を、核酸増幅反応により増幅す
る、核酸単離増幅方法に関する。また、本発明は、（１
３）該核酸増幅反応を、該核酸単離用流路から連通する
流路内で行うことを特徴とする上記（１２）に記載の核
酸単離増幅方法に関する。また、本発明は（１４）該核
酸増幅反応がポリメラーゼ・チェイン反応である上記
（１２）または（１３）に記載の核酸単離増幅方法に関
する。これら（１２）〜（１４）の発明よって、溶出液
で溶出された状態のまま、核酸の増幅反応を行うことが
できるようになり、より迅速に核酸を検出することが可
能になる。さらに（１３）の発明によって、核酸の増幅
反応が流路内で達成され、より簡便に核酸を検出するこ
とが可能になる。さらに（１４）の発明によって、溶出
液で溶出された状態のまま、核酸のポリメラーゼ・チェ
イン反応を行うことができるようになり、より迅速に核
酸を検出することが可能になる。The present invention also provides (12) a nucleic acid isolation / amplification method, wherein the nucleic acid isolated by the nucleic acid isolation method described in (1) to (11) above is amplified by a nucleic acid amplification reaction. , A method for isolating and amplifying nucleic acid. The present invention also provides (1
3) The method for isolating and amplifying nucleic acid according to the above (12), wherein the nucleic acid amplification reaction is carried out in a channel communicating with the channel for nucleic acid isolation. The present invention also relates to (14) the method for isolating and amplifying nucleic acid according to the above (12) or (13), wherein the nucleic acid amplification reaction is a polymerase chain reaction. According to these inventions (12) to (14), the nucleic acid amplification reaction can be performed in the state of being eluted with the eluent, and the nucleic acid can be detected more quickly. Further, according to the invention of (13), the nucleic acid amplification reaction is achieved in the flow channel, and the nucleic acid can be detected more easily. Further, according to the invention of (14), the polymerase chain reaction of the nucleic acid can be performed in the state of being eluted with the eluent, and the nucleic acid can be detected more quickly.
【００２４】また、本発明は（１５）核酸が結合した核
酸結合性磁性担体から核酸を単離するための流路であっ
て、該流路に沿った少なくとも２箇所で該磁性担体を保
持しうる磁場を適用可能である、核酸単離用流路に関す
る。また、本発明は（１６）核酸が結合した核酸結合性
磁性担体から核酸を単離するためのチップであって、該
チップは、核酸単離用流路を包含し、該流路に沿った少
なくとも２箇所で該磁性担体を保持しうる磁場を適用可
能であることを特徴とする、核酸単離用チップに関す
る。これら（１５）〜（１６）の発明によって、核酸を
単離する流路またはチップを作成することを可能にす
る。すなわち、該磁性担体は、磁場を使って集積した場
合に強固に凝集を起こして塊となることが多い。The present invention also provides (15) a channel for isolating a nucleic acid from a nucleic acid-binding magnetic carrier to which a nucleic acid is bound, the magnetic carrier being held at at least two locations along the channel. Flow field for nucleic acid isolation to which a variable magnetic field can be applied. The present invention also provides (16) a chip for isolating a nucleic acid from a nucleic acid-binding magnetic carrier to which a nucleic acid is bound, the chip including a nucleic acid isolation channel, which is provided along the channel. The present invention relates to a chip for nucleic acid isolation, wherein a magnetic field capable of holding the magnetic carrier can be applied at at least two places. These inventions (15) to (16) make it possible to create a channel or a chip for isolating nucleic acid. That is, the magnetic carrier often strongly aggregates into a lump when integrated using a magnetic field.
【００２５】このような凝集塊に対して、磁場の適用を
解除せずに、そのまま洗浄液による洗浄操作を行った場
合、該磁性担体が洗浄液中に分散しないので、洗浄液が
担体の塊の内部にまで及ばず、夾雑物質の分離除去が不
完全になる。磁場によって凝集した後、洗浄する場合に
磁場を解除するという流路（１５）およびチップ（１
６）の発明によって、洗浄時に該磁性担体が洗浄液中に
分散されるので、洗浄液が該磁性担体を効率良く洗浄す
ることが可能になる。また、このような凝集塊は流路内
部での詰まりの原因となるが、洗浄時に該磁性担体の凝
集塊が分散されるので詰まりの原因となる可能性が低く
なる。When such agglomerates are washed with the washing liquid as they are without releasing the application of the magnetic field, the magnetic carrier does not disperse in the washing liquid. The separation and removal of contaminants will be incomplete. After coagulation by the magnetic field, the channel (15) and the chip (1) that release the magnetic field when washing are used.
According to the invention of 6), since the magnetic carrier is dispersed in the cleaning liquid at the time of cleaning, the cleaning liquid can efficiently clean the magnetic carrier. Further, such aggregates cause clogging inside the flow channel, but since the aggregates of the magnetic carrier are dispersed at the time of washing, the possibility of causing clogging is reduced.
【００２６】また、本発明は（１７）核酸単離用チップ
であって、該チップは、核酸を含有する材料と核酸遊離
用溶液を混合して反応する遊離反応槽；該混合液と核酸
結合性磁性担体と核酸吸着用溶液を更に混合する吸着反
応槽；核酸単離用流路であって、該流路に沿った少なく
とも２箇所で該磁性担体を保持しうる磁場を適用可能で
ある核酸単離用流路；該核酸遊離用溶液を収納する核酸
遊離用溶液収納用リザーバー；該核酸吸着用溶液を収納
する核酸吸着用溶液収納用リザーバー；該核酸遊離用溶
液収納用リザーバーと該遊離反応槽を連通する流路；該
核酸吸着用溶液収納用リザーバーと該吸着反応槽を連通
する流路；該遊離反応漕と該吸着反応漕を連通する流
路；該吸着反応槽と該核酸単離用流路を連通する流路；
洗浄用溶液を収納する少なくとも１つの洗浄用溶液収納
用リザーバー；該遊離反応槽、該吸着反応槽、該核酸遊
離用溶液収納用リザーバーと該遊離反応槽を連通する流
路、該核酸吸着用溶液収納用リザーバーと該吸着反応槽
を連通する流路、該遊離反応漕と該吸着反応漕を連通す
る流路、該吸着反応槽と該核酸単離用流路を連通する流
路、及び該核酸単離用流路からなる群から選ばれる少な
くとも一つと、該洗浄用溶液収納用リザーバーとを連通
する少なくとも１つの洗浄用流路；核酸溶出用溶液を収
納する核酸溶出用溶液収納用リザーバー；及び、該遊離
反応槽、該吸着反応槽、該核酸遊離用溶液収納用リザー
バーと該遊離反応槽を連通する流路、該核酸吸着用溶液
収納用リザーバーと該吸着反応槽を連通する流路、該遊
離反応漕と該吸着反応漕を連通する流路、該吸着反応槽
と該核酸単離用流路を連通する流路、該核酸単離用流
路、及び該洗浄用流路、からなる群から選ばれる一つ
と、該核酸溶出用溶液収納用リザーバーとを連通する流
路；を包含する核酸単離用チップに関する。The present invention also provides (17) a nucleic acid isolation chip, which is a free reaction tank in which a material containing a nucleic acid and a nucleic acid free solution are mixed and reacted; the mixed solution and nucleic acid binding Reaction tank for further mixing a polar magnetic carrier and a solution for adsorbing nucleic acid; a nucleic acid isolation flow channel, to which a magnetic field capable of holding the magnetic carrier can be applied at at least two points along the flow channel Isolation channel; Nucleic acid releasing solution containing reservoir containing the nucleic acid releasing solution; Nucleic acid adsorbing solution containing reservoir containing the nucleic acid adsorbing solution; Nucleic acid releasing solution containing reservoir and the releasing reaction A flow path connecting the tank; a flow path connecting the nucleic acid adsorption solution storage reservoir and the adsorption reaction tank; a flow path connecting the free reaction tank and the adsorption reaction tank; the adsorption reaction tank and the nucleic acid isolation A flow path communicating with the flow path for use;
At least one washing solution storage reservoir for storing a cleaning solution; the liberation reaction tank, the adsorption reaction tank, the nucleic acid liberation solution storage reservoir and a flow path connecting the liberation reaction tank, and the nucleic acid adsorption solution A flow path that connects the storage reservoir and the adsorption reaction tank, a flow path that connects the free reaction tank and the adsorption reaction tank, a flow path that connects the adsorption reaction tank and the nucleic acid isolation flow path, and the nucleic acid At least one washing flow channel communicating with at least one selected from the group consisting of isolation flow channels and the washing solution storage reservoir; a nucleic acid eluting solution storage reservoir containing a nucleic acid eluting solution; and A free passage, the adsorption reaction tank, a flow path for communicating the nucleic acid free solution storage reservoir with the free reaction tank, a flow path for connecting the nucleic acid adsorption solution storage reservoir with the adsorption reaction tank, Free reaction tank and the adsorption One selected from the group consisting of a flow path communicating with a reaction tank, a flow path communicating with the adsorption reaction tank and the nucleic acid isolation flow path, the nucleic acid isolation flow path, and the washing flow path, The present invention relates to a nucleic acid isolation chip including a flow path communicating with the nucleic acid elution solution storage reservoir.
【００２７】また、本発明は（１８）核酸単離用チップ
であって、該チップは、核酸を含有する材料と核酸結合
性磁性担体及び核酸遊離吸着用溶液を混合して反応する
遊離吸着反応槽；核酸単離用流路であって、該流路に沿
った少なくとも２箇所で該磁性担体を保持しうる磁場を
適用可能である核酸単離用流路；該核酸遊離吸着用溶液
を収納する核酸遊離吸着用溶液収納用リザーバー；該核
酸遊離吸着用溶液収納用リザーバーと該遊離吸着反応槽
を連通する流路；該遊離吸着反応槽と該核酸単離用流路
を連通する流路；洗浄用溶液を収納する少なくとも１つ
の洗浄用溶液収納用リザーバー；該遊離吸着反応槽、該
核酸遊離吸着用溶液収納用リザーバーと該遊離吸着反応
槽を連通する流路、該遊離吸着反応槽と該核酸単離用流
路を連通する流路、及び該核酸単離用流路からなる群か
ら選ばれる少なくとも一つと、該洗浄用溶液収納用リザ
ーバーとを連通する少なくとも１つの洗浄用流路；核酸
溶出用溶液を収納する核酸溶出用溶液収納用リザーバ
ー；及び、該遊離吸着反応槽、該核酸遊離吸着用溶液収
納用リザーバーと該遊離吸着反応槽を連通する流路、該
遊離吸着反応槽と該核酸単離用流路を連通する流路、該
核酸単離用流路、及び該洗浄用流路、からなる群から選
ばれる一つと、該核酸溶出用溶液収納用リザーバーとを
連通する流路；を包含する核酸単離用チップに関する。The present invention also provides (18) a nucleic acid isolation chip, wherein the chip is a free adsorption reaction in which a nucleic acid-containing material is mixed with a nucleic acid-binding magnetic carrier and a nucleic acid free adsorption solution to react. Tank: Nucleic acid isolation channel in which a magnetic field capable of holding the magnetic carrier can be applied at least at two points along the channel; Nucleic acid isolation / adsorption solution is stored A reservoir for storing a nucleic acid free adsorption solution; a flow path connecting the nucleic acid free adsorption solution storage reservoir with the free adsorption reaction tank; a flow path connecting the free adsorption reaction tank with the nucleic acid isolation flow path; At least one cleaning solution storage reservoir for storing a cleaning solution; the free adsorption reaction tank, a flow path connecting the nucleic acid free adsorption solution storage reservoir with the free adsorption reaction tank, the free adsorption reaction tank, and the free adsorption reaction tank Flow path that connects the flow paths for nucleic acid isolation And at least one washing flow channel communicating with at least one selected from the group consisting of the nucleic acid isolation flow channel and the washing solution storage reservoir; A reservoir; and the free adsorption reaction tank, a flow path for communicating the nucleic acid free adsorption solution storage reservoir with the free adsorption reaction tank, a flow path for connecting the free adsorption reaction tank with the nucleic acid isolation flow path, The present invention relates to a nucleic acid isolation chip including one selected from the group consisting of the nucleic acid isolation channel and the washing channel, and a channel communicating with the nucleic acid elution solution storage reservoir.
【００２８】また、本発明は（１９）核酸単離用チップ
であって、該チップは更に、空気ポンプに接合可能な少
なくとも１つの空気ポンプ接合口を包含し、該遊離反応
槽、該吸着反応槽、該核酸遊離用溶液収納用リザーバー
と該遊離反応槽を連通する流路、該核酸吸着用溶液収納
用リザーバーと該吸着反応槽を連通する流路、該遊離反
応漕と該吸着反応漕を連通する流路、該吸着反応槽と該
核酸単離用流路を連通する流路、及び該核酸単離用流路
からなる群から選ばれる少なくとも一つと、該空気ポン
プ接合口とを連通する少なくとも１つの流路を包含す
る、上記（１７）の核酸単離用チップに関する。The present invention also provides (19) a nucleic acid isolation chip, which further comprises at least one air pump connection port connectable to an air pump, the free reaction tank and the adsorption reaction. A tank, a flow path connecting the nucleic acid releasing solution storage reservoir with the release reaction tank, a flow path connecting the nucleic acid adsorbing solution storage reservoir with the adsorption reaction tank, the release reaction tank and the adsorption reaction tank At least one selected from the group consisting of a flow path that communicates, a flow path that connects the adsorption reaction tank and the nucleic acid isolation flow path, and the nucleic acid isolation flow path, and the air pump connection port The nucleic acid isolation chip according to (17) above, which comprises at least one channel.
【００２９】また、本発明は（２０）核酸単離用チップ
であって、該チップは更に、空気ポンプに接合可能な少
なくとも１つの空気ポンプ接合口を包含し、該遊離吸着
反応槽、該核酸遊離吸着用溶液収納用リザーバーと該遊
離吸着反応槽を連通する流路、該遊離吸着反応槽と該核
酸単離用流路を連通する流路、及び該核酸単離用流路か
らなる群から選ばれる少なくとも一つと、該空気ポンプ
接合口とを連通する少なくとも１つの流路を包含する、
上記（１８）に記載の核酸単離用チップに関する。The present invention also provides (20) a nucleic acid isolation chip, which further comprises at least one air pump connection port that can be connected to an air pump, the free adsorption reaction tank, and the nucleic acid. From the group consisting of a channel for communicating the free adsorption solution storage reservoir with the free adsorption reaction tank, a channel for communicating the free adsorption reaction tank with the nucleic acid isolation channel, and the nucleic acid isolation channel At least one flow path communicating with at least one selected and the air pump joint port is included.
The present invention relates to the nucleic acid isolation chip according to (18).
【００３０】（１７）〜（２０）の発明によって、核酸
結合性磁性担体を用いて核酸を含有する材料から該核酸
を抽出して単離する一連の操作を流路で達成するチップ
を作成する場合において、該核酸結合性磁性担体を流路
内で効率良く洗浄することが可能になる。その効果によ
って、核酸の単離を容易に達成するチップを作成するこ
とができる。また、（１８）の発明の該核酸単離用チッ
プは、該遊離液が吸着液を兼ねていて、この事により、
工程が少なくなり、反応漕の数を減らすことができ、よ
り容易に核酸の単離を実施することが可能になる。さら
に（１９）、（２０）の発明によって、該核酸結合性磁
性担体中に残存する洗浄液を、空気により排出させ、ま
た乾燥させることが可能になり、流路内で効率良く除去
することが可能になる。これは、核酸単離後に次いで行
われるハイブリダイゼーションや増幅反応において、残
存する洗浄液による反応の阻害がなくなるので有用であ
る。According to the inventions (17) to (20), a chip is prepared which achieves a series of operations for extracting and isolating nucleic acid from a material containing the nucleic acid by using a nucleic acid-binding magnetic carrier in a channel. In this case, the nucleic acid-binding magnetic carrier can be efficiently washed in the channel. Due to the effect, a chip that easily achieves isolation of nucleic acid can be prepared. Further, in the chip for nucleic acid isolation of the invention of (18), the free liquid also serves as an adsorption liquid,
The number of steps is reduced, the number of reaction vessels can be reduced, and nucleic acid can be isolated more easily. Further, according to the inventions of (19) and (20), the washing liquid remaining in the nucleic acid-binding magnetic carrier can be discharged by air and dried, and can be efficiently removed in the flow channel. become. This is useful because in the hybridization or amplification reaction that is subsequently performed after nucleic acid isolation, the remaining washing solution does not inhibit the reaction.
【００３１】また、本発明は（２１）核酸単離用チップ
であって、該チップは更に、空気ポンプに接合可能な少
なくとも１つの空気ポンプ接合口を包含し、該核酸遊離
用溶液収納用リザーバー、該核酸吸着用溶液収納用リザ
ーバー、該洗浄用溶液収納用リザーバー、及び該核酸溶
出用溶液収納用リザーバーからなる群から選ばれる少な
くとも一つと、該空気ポンプ接合口とを連通する少なく
とも１つの流路を包含する、上記（１７）に記載の核酸
単離用チップに関する。The present invention also provides (21) a nucleic acid isolation chip, which further comprises at least one air pump connection port that can be connected to an air pump, and which contains a nucleic acid release solution storage reservoir. , At least one selected from the group consisting of the nucleic acid adsorption solution storage reservoir, the washing solution storage reservoir, and the nucleic acid elution solution storage reservoir, and at least one flow communicating with the air pump joint port. The nucleic acid isolation chip according to (17) above, which comprises a channel.
【００３２】また、本発明は（２２）核酸単離用チップ
であって、該チップは更に、空気ポンプに接合可能な少
なくとも１つの空気ポンプ接合口を包含し、該核酸遊離
吸着用溶液収納用リザーバー、該洗浄用溶液収納用リザ
ーバー、及び該核酸溶出用溶液収納用リザーバーからな
る群から選ばれる少なくとも一つと、該空気ポンプ接合
口とを連通する少なくとも１つの流路を包含する、上記
（１８）に記載の核酸単離用チップに関する。（２
１）、（２２）の発明によって、核酸結合性磁性担体を
用いて核酸を含有する材料から該核酸を抽出して単離す
るチップにおいて、各リザーバー内の溶液を、空気によ
って送液することが容易となる。The present invention also provides (22) a nucleic acid isolation chip, which further comprises at least one air pump connection port that can be connected to an air pump, for storing the nucleic acid free adsorption solution. (18) At least one flow path communicating with at least one selected from the group consisting of a reservoir, a washing solution storage reservoir, and a nucleic acid elution solution storage reservoir, and the air pump joint port. The chip for nucleic acid isolation as described in 1). (2
According to the inventions of 1) and (22), in a chip in which a nucleic acid-containing magnetic carrier is used to extract and isolate a nucleic acid from a material containing the nucleic acid, the solution in each reservoir can be sent by air. It will be easy.
【００３３】また、本発明は（２３）核酸単離用チップ
であって、該チップは更に、該核酸単離用流路の該少な
くとも２箇所のうち少なくとも１箇所を加熱する手段を
備える上記（１６）〜（２２）に記載の核酸単離用チッ
プに関する。（２３）の発明によって、核酸結合性磁性
担体を用いて核酸を含有する材料から該核酸を抽出して
単離するチップにおいて、該核酸結合性磁性担体中に残
存する洗浄液を、加熱によってより効率よく乾燥させる
ことが可能になり、流路内で迅速に除去することが可能
になる。これは、核酸単離後に次いで行われるハイブリ
ダイゼーションや増幅反応において、残存する洗浄液に
よる反応の阻害がなくなるので有用である。The present invention also provides (23) a nucleic acid isolation chip, which further comprises a means for heating at least one of the at least two positions of the nucleic acid isolation channel. 16) to the chip for nucleic acid isolation according to (22). According to the invention of (23), in a chip in which a nucleic acid-binding magnetic carrier is used to extract and isolate the nucleic acid from a material containing the nucleic acid, the washing liquid remaining in the nucleic acid-binding magnetic carrier is more efficiently heated by heating. It becomes possible to dry well, and it becomes possible to remove quickly in the channel. This is useful because in the hybridization or amplification reaction that is subsequently performed after nucleic acid isolation, the remaining washing solution does not inhibit the reaction.
【００３４】以上、本発明によって、核酸を含有する材
料から、該核酸を効率よく短時間に簡便に、そして自動
機械化可能な手段にて単離することが可能となる。ま
た、チップ内で核酸を単離する自動機器を提供すること
が可能となる。これによって、核酸を単離後、増幅反応
を行い、増幅された核酸を検出することを完了する自動
核酸検出機器を提供し、簡易迅速検査が実現されること
が期待される。本発明において使用する核酸を含有する
材料から核酸を遊離する遊離液は、通常の核酸の遊離に
用いる溶液であれば特に限定されない。たとえば、プロ
ナーゼ等の蛋白質分解酵素、リゾチーム等の糖鎖分解酵
素、リパーゼ等の脂質分解酵素、界面活性剤、尿素、グ
アニジンやチオ硫酸等のカオトロピックイオン、ＥＤＴ
Ａ等の金属イオンキレート剤などを単独でもしくは組み
合わせて用いる。As described above, according to the present invention, it becomes possible to isolate a nucleic acid from a material containing the nucleic acid efficiently, in a short time, and easily by a means capable of automatic mechanization. Further, it becomes possible to provide an automatic device for isolating nucleic acid in the chip. This is expected to provide an automatic nucleic acid detection device that completes the detection of the amplified nucleic acid by performing an amplification reaction after isolating the nucleic acid, and is expected to realize a simple and quick test. The release liquid for releasing the nucleic acid from the material containing the nucleic acid used in the present invention is not particularly limited as long as it is a solution used for the usual release of nucleic acid. For example, proteolytic enzymes such as pronase, sugar chain degrading enzymes such as lysozyme, lipolytic enzymes such as lipase, surfactants, chaotropic ions such as urea, guanidine and thiosulfate, EDT.
A metal ion chelating agent such as A is used alone or in combination.
【００３５】本発明において使用する核酸結合性磁性担
体、遊離液、吸着液、洗浄液及び溶出液は、組み合わせ
て使用される。すなわち、遊離液によって液層中に遊離
した核酸が、吸着液中で核酸結合性磁性担体に結合し、
洗浄液中でも結合が維持され、溶出液中で結合した核酸
が溶出するものを組み合わせて用いる。たとえば、核酸
結合性磁性担体としてシリカまたはその誘導体を含む
物、吸着液としてカオトロピック性の高いイオン溶液、
洗浄液としてアルコール溶液、溶出液として水あるいは
ｐＨが６〜９程度の塩濃度が１Ｍ以下の水溶液の組を用
いる。The nucleic acid-binding magnetic carrier, free solution, adsorbent solution, washing solution and eluate used in the present invention are used in combination. That is, the nucleic acid released in the liquid layer by the release liquid binds to the nucleic acid-binding magnetic carrier in the adsorption liquid,
A combination is used in which the binding is maintained even in the washing solution and the bound nucleic acid is eluted in the eluate. For example, a substance containing silica or a derivative thereof as a nucleic acid-binding magnetic carrier, an ion solution having a high chaotropic property as an adsorption liquid,
An alcohol solution is used as the cleaning liquid, water or an aqueous solution having a salt concentration of about 6 to 9 and a salt concentration of 1 M or less is used as the eluent.
【００３６】またあるいは、核酸結合性磁性担体として
陰イオン交換樹脂を含む物、吸着液としてイオン強度の
低い中性〜弱酸性の水溶液、洗浄液としてイオン強度が
吸着液と同じか若干高い水溶液、溶出液としてイオン強
度が吸着液より高い水溶液あるいは塩基性の水溶液の組
を用いる。なお、遊離液と吸着液は同一の組成であって
も良い。また遊離液と吸着液は区別せずに、同時に遊離
と吸着を行っても良い。たとえば、核酸結合性磁性担体
としてシリカまたはその誘導体を含む物、吸着液として
カオトロピック性の高いイオン溶液を用いる場合は、吸
着液が核酸を含有する材料から核酸を遊離する遊離液を
兼ねることができる。Alternatively, a substance containing an anion exchange resin as a nucleic acid-binding magnetic carrier, a neutral to weakly acidic aqueous solution having a low ionic strength as an adsorbing solution, an aqueous solution having the same or slightly higher ionic strength as an adsorbing solution as a washing solution, elution As the liquid, a set of an aqueous solution having a higher ionic strength than the adsorbing liquid or a basic aqueous solution is used. The free liquid and the adsorbed liquid may have the same composition. Further, the free liquid and the adsorbed liquid may be simultaneously distinguished and adsorbed without distinction. For example, when a substance containing silica or its derivative is used as the nucleic acid-binding magnetic carrier and an ionic solution having a high chaotropic property is used as the adsorbent, the adsorbent can also serve as a free liquid for releasing the nucleic acid from the material containing the nucleic acid. .
【００３７】本発明では、核酸が結合している核酸結合
性磁性担体を洗浄液で洗浄後、加温状態で気体（空気や
窒素）を送風することで、蓋を開放することなく、該磁
性担体を乾燥することが除去することができる。この場
合、送風する気体中に他微生物や核酸の混入がないこと
は重要である。このためには、送風する気体をあらかじ
め濾過器を通して使用することや、微生物を分離する工
程を入れることも可能である。In the present invention, the nucleic acid-binding magnetic carrier to which nucleic acid is bound is washed with a washing liquid, and then a gas (air or nitrogen) is blown in a heated state so that the magnetic carrier can be opened without opening the lid. Can be removed by drying. In this case, it is important that the gas to be blown does not contain other microorganisms or nucleic acids. For this purpose, it is possible to use a gas to be blown through a filter in advance or to add a step of separating microorganisms.
【００３８】本発明において、核酸とはＤＮＡ（ｄｅｏ
ｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）またはＲＮＡ
（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を意味し、対象
となる材料に含まれるＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。
本発明の核酸結合性磁性担体として用いられる磁性体と
は、磁性を有するものであれば特に限定されないが、磁
場を与えられることで強い磁性を発生して結合し合い、
磁場がなくなるとその磁性もなくなって分散するものを
用いる。このような性質を示すものとしては、たとえ
ば、スピネル型、プランバイト型のフェライトや、鉄、
ニッケル、コバルト等を主成分とした合金などが挙げら
れる。In the present invention, nucleic acid means DNA (deo
xyribonucleic acid) or RNA
(Ribonucleic acid), and means DNA or RNA contained in the target material.
The magnetic substance used as the nucleic acid-binding magnetic carrier of the present invention is not particularly limited as long as it has magnetism, but generates strong magnetism by being given a magnetic field and binds each other,
When the magnetic field disappears, it loses its magnetism and is dispersed. Examples of materials exhibiting such properties include spinel type and pranbite type ferrites, iron,
Examples thereof include alloys containing nickel, cobalt and the like as main components.
【００３９】本発明のシリカ粒子はＳｉ（シリコン元
素）とＯ（酸素元素）が結合した高分子重合体である。
たとえば、シリカゲル、シリカガラス、酸化ケイ素、ケ
イ酸塩などを示している。またシリカ誘導体として、た
とえば有機化合物を該シリカに化学的に結合させたもの
が上げられる。本発明の核酸結合性磁性担体の一例とし
て用いられる磁性シリカ粒子や、磁性イオン交換樹脂粒
子は、前記した磁性体とシリカやその誘導体あるいはイ
オン交換樹脂を含んでいる粒子から成る。その製造方法
については、特に限定されるものではない。したがっ
て、一般的に市販されているものを用いることができ
る。核酸の吸着効率を上げるため、磁性体粒子がシリカ
やイオン交換樹脂で覆われている構造の磁性担体が良
い。The silica particles of the present invention are high-molecular polymers in which Si (silicon element) and O (oxygen element) are bonded.
For example, silica gel, silica glass, silicon oxide, silicate and the like are shown. Examples of the silica derivative include those obtained by chemically bonding an organic compound to the silica. The magnetic silica particles and magnetic ion exchange resin particles used as an example of the nucleic acid-binding magnetic carrier of the present invention are particles containing the above-mentioned magnetic material and silica or its derivative or an ion exchange resin. The manufacturing method is not particularly limited. Therefore, commercially available products can be used. In order to improve the adsorption efficiency of nucleic acid, a magnetic carrier having a structure in which magnetic particles are covered with silica or an ion exchange resin is preferable.
【００４０】核酸結合性磁性担体を流路またはチップの
集積箇所に集積する磁場は、流路またはチップを操作す
る外部機器から供給される。外部機器には、電磁石ある
いは永久磁石によって磁場が発生する部分を備え、チッ
プ内で行う核酸の単離工程に応じて、該磁性担体の集積
位置に磁場を供給し、また、該磁性担体を流路中に分散
する場合は、該磁場を消すように組み込まれる。本発明
のチップの材質は、金属、ガラス、セラミックス等を用
いることもできるが、加工の容易さからプラスチックで
ある事が望ましい。ただし、核酸の単離工程において、
該核酸が吸着しない材質が望ましい。このような材質と
しては、たとえば、ポリ塩化ビニール樹脂、ポリエチレ
ン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリ塩化ビニリデン樹
脂、ポリウレタン樹脂、ナイロン樹脂、ポリスチレン樹
脂、ＡＢＳ樹脂、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカー
ボネート樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、
メラミン樹脂、エポキシ樹脂等が上げられる。また、チ
ップ上にバルブや、流路内の液体、気体の気密性を保つ
ためにパッキングとして、ゴム等の弾性体を用いても良
い。このような弾性体としては、天然ゴム、ブタジエン
ゴム、スチレンゴム、ブチルゴム、エチレン・プロピレ
ンゴム、ニトリルゴム、アクリルゴム、ウレタンゴム、
シリコンゴム、フッ素ゴム等のゴム類、軟質塩化ビニー
ル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリ
塩化ビニリデン樹脂、ポリウレタン樹脂、フッ素樹脂、
ナイロン樹脂等が上げられる。The magnetic field for accumulating the nucleic acid-binding magnetic carrier at the accumulation location of the channel or chip is supplied from an external device for operating the channel or chip. The external device is provided with a portion where a magnetic field is generated by an electromagnet or a permanent magnet, and supplies the magnetic field to the accumulation position of the magnetic carrier according to the nucleic acid isolation process performed in the chip, and also flows the magnetic carrier. When dispersed in the path, it is incorporated so as to extinguish the magnetic field. As the material of the chip of the present invention, metal, glass, ceramics or the like can be used, but it is preferable that it is plastic because of the ease of processing. However, in the nucleic acid isolation step,
A material that does not adsorb the nucleic acid is desirable. Examples of such materials include polyvinyl chloride resin, polyethylene resin, polypropylene resin, polyvinylidene chloride resin, polyurethane resin, nylon resin, polystyrene resin, ABS resin, acrylic resin, fluororesin, polycarbonate resin, methylpentene resin, Phenolic resin,
Examples include melamine resin and epoxy resin. Further, an elastic body such as rubber may be used as packing on the chip in order to maintain the airtightness of the liquid or gas in the valve or the channel. Examples of such an elastic body include natural rubber, butadiene rubber, styrene rubber, butyl rubber, ethylene / propylene rubber, nitrile rubber, acrylic rubber, urethane rubber,
Rubbers such as silicone rubber and fluororubber, soft vinyl chloride resin, polyethylene resin, polypropylene resin, polyvinylidene chloride resin, polyurethane resin, fluororesin,
Nylon resin etc. can be raised.
【００４１】更に、チップとしての形状を完成するため
の部品、バルブに用いる部品、熱を効率良く伝える為の
部品等は、プラスチックの他、アルミニウム、真鍮、
鉄、銅、ステンレス、チタン合金、マグネシウム合金、
ジュラルミン等の金属であってもよい。チップに熱を加
える場合には、その加熱部分が設定した温度において、
機械的強度を維持できる材質でなければならない。チッ
プ上には、液体や気体の流れる流路と、各溶液が保存さ
れるリザーバー部分、反応を行う部分、核酸結合性磁性
担体を集積する部分から構成されており、チップ外の装
置によって気体及び／または液体のポンプ若しくはアク
チュエータでリザーバー部分の溶液が、流路や反応器部
分に送液されるようになっている。Further, in addition to plastic, aluminum, brass, parts for completing the shape as a chip, parts used for valves, parts for efficiently transmitting heat, etc.
Iron, copper, stainless steel, titanium alloy, magnesium alloy,
It may be a metal such as duralumin. When heat is applied to the chip, at the temperature set by the heating part,
It must be a material that can maintain its mechanical strength. On the chip, there are a flow path for liquid and gas, a reservoir part for storing each solution, a reaction part, and a part for accumulating nucleic acid-binding magnetic carrier. The solution in the reservoir part is sent to the flow path or the reactor part by a liquid pump or actuator.
【００４２】本発明は、これらの特徴を持ち、一連の操
作を閉鎖された流路で、あるいはその流路を含むチップ
内で完結する。更に続けて、流路内で、あるいは流路を
含むチップ内で増幅反応及び検出反応を単一チップ内に
持ち合わせることのできる、核酸単離装置を提供する。The present invention has these characteristics and completes a series of operations in a closed channel or in a chip containing the channel. Further, subsequently, there is provided a nucleic acid isolation device capable of having an amplification reaction and a detection reaction in a single chip in a channel or in a chip including the channel.
【００４３】[0043]
【発明の実施の形態】以下、実施例を挙げて本発明を更
に具体的に説明するが、本発明は、何らこれに限定する
ものではない。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
【００４４】[0044]
【実施例１】ポリプロピレン製マイクロテストチューブ
（エッペンドルフ社、１．５ｍｌ）とシリコンゴム栓で
リザーバー１〜４（１、２、３、４）と遊離吸着反応槽
（５）を、電磁バルブ（ファルマシア社、ＩＭＶ−８）
でバルブ１〜４（６、７、８、９）を、テフロン（登録
商標）チューブ（外径２．５ｍｍ、内径１．５ｍｍ）で
トラップ１〜３（１０、１１、１２）を、テフロン（登
録商標）チューブ（外径１．７ｍｍ、内径０．９ｍｍ）
で各部分をつなぐ流路を作成して、図１に示す核酸単離
用流路を完成した。各部とのつなぎ目は、フェラル（フ
ァルマシア社）を用いた。リザーバー１（１）に、核酸
遊離（吸着）液（２０ｍＭのＥＤＴＡ、１．３％のＴｒ
ｉｔｏｎＸ−１００、５．２５Ｍのグアニジンチオシア
ン酸塩を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ６．
４）９００μｌと磁性シリカ粒子（東洋紡）の懸濁液１
μｌの混合液を添加した。リザーバー２（２）とリザー
バー３（３）に、それぞれ洗浄液（７０％エタノール）
５００μｌを添加した。リザーバー４（４）に溶出液と
して蒸留水１００μｌを添加した。この装置に空気ポン
プで送液する装置（ファルマシア社、Ｐ−６０００）
（１３）、反応槽（５）を加熱する装置（１４）、バル
ブを操作する装置（ファルマシア社、ＬＣＣ−５００）
（１５）、トラップ１〜３（１０、１１、１２）の部分
に磁場を与える装置として、直径８ｍｍ、長さ２５ｍｍ
の円筒型磁石１〜３（１６、１７、１８）をそれぞれ取
り付けた。あらかじめ、空気ポンプ（１３）は、送気時
には１０ｍｌ／分の流速で、最大圧が０．１気圧となる
ように調製し、バルブ１〜４（６〜９）は、すべて閉に
した。Example 1 A polypropylene microtest tube (Eppendorf, 1.5 ml), a silicone rubber stopper, reservoirs 1 to 4 (1, 2, 3, 4), a free adsorption reaction tank (5), and an electromagnetic valve (Pharmacia). Company, IMV-8)
Valve 1 to 4 (6, 7, 8, 9), Teflon (registered trademark) tube (outer diameter 2.5 mm, inner diameter 1.5 mm) to traps 1 to 3 (10, 11, 12) and Teflon ( (Registered trademark) tube (outer diameter 1.7 mm, inner diameter 0.9 mm)
A flow path for connecting the respective parts was created by completing the flow path for nucleic acid isolation shown in FIG. A ferrule (Pharmacia) was used for the joint between each part. Nucleic acid release (adsorption) liquid (20 mM EDTA, 1.3% Tr) is stored in the reservoir 1 (1).
itonX-100, 50 mM Tris-HCl buffer containing 5.25 M guanidine thiocyanate, pH 6.
4) Suspension 1 of 900 μl and magnetic silica particles (Toyobo)
μl of the mixture was added. Wash solution (70% ethanol) is added to reservoir 2 (2) and reservoir 3 (3), respectively.
500 μl was added. 100 μl of distilled water was added as an eluent to the reservoir 4 (4). A device that feeds this device with an air pump (P-6000, Pharmacia)
(13), device (14) for heating reaction tank (5), device for operating valve (LCC-500, Pharmacia)
(15), 8 mm in diameter and 25 mm in length as a device for applying a magnetic field to the parts of traps 1 to 3 (10, 11, 12)
Cylindrical magnets 1 to 3 (16, 17, 18) were attached. In advance, the air pump (13) was adjusted so that the maximum pressure was 0.1 atm at a flow rate of 10 ml / min during air supply, and all the valves 1 to 4 (6 to 9) were closed.
【００４５】反応槽（５）に、菌体の個数として１０7
個の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の
ペレットを入れ、更にこの部分を加熱装置（１４）で９
８℃に加熱した。バルブ１（６）を開にした後、空気ポ
ンプ（１３）からリザーバー１（１）に送気して、遊離
（吸着）液を反応槽（５）に導入した。１０分後、バル
ブ１（６）を閉、バルブ２（７）、バルブ３（８）を開
にして、反応槽（５）の内容物を廃液口（１９）へ廃液
した。トラップ１（Ｍ１）の部分に磁性シリカ粒子を集
積した。廃液後、トラップ１（１０）に設置した磁石１
（１６）を取り除き、リザーバー２（２）に空気ポンプ
（１３）で送気して、トラップ１（１０）に集積した磁
性シリカ粒子を洗浄液で分散し洗浄すると同時に、トラ
ップ２（１１）の部分で再度集積し、洗浄液を廃液口
（１９）に廃液した。廃液後、トラップ２（１１）に設
置した磁石２（１７）を取り除き、バルブ２（７）を閉
にして、リザーバー３（３）に空気ポンプ（１３）で送
気して、トラップ２（１１）に集積した磁性シリカ粒子
を洗浄液で分散し洗浄すると同時に、トラップ３（１
２）の部分で再度蓄積し、洗浄液を廃液口（１９）に廃
液した。廃液後、バルブ３（８）を閉、バルブ４（９）
を開とし、トラップ３（１２）に設置した磁石３（１
８）を取り除き、リザーバー４（４）に空気ポンプ（１
３）で送気して、トラップ３（１２）に蓄積した磁性シ
リカ粒子を、溶出液と共に回収口（２０）から回収し
た。In the reaction tank (5), the number of bacterial cells was 107
Pour Bacillus subtilis pellets, and add 9 parts of this pellet with a heating device (14).
Heated to 8 ° C. After opening the valve 1 (6), air was sent from the air pump (13) to the reservoir 1 (1), and the free (adsorbed) liquid was introduced into the reaction tank (5). After 10 minutes, the valve 1 (6) was closed, the valve 2 (7) and the valve 3 (8) were opened, and the contents of the reaction tank (5) were drained to the drain port (19). Magnetic silica particles were accumulated in the portion of trap 1 (M1). After the waste liquid, the magnet 1 installed in the trap 1 (10)
(16) is removed, and air is sent to the reservoir 2 (2) by an air pump (13) to disperse and wash the magnetic silica particles accumulated in the trap 1 (10) with a washing liquid, and at the same time, a portion of the trap 2 (11). Was collected again, and the cleaning liquid was drained to the drain port (19). After the waste liquid, the magnet 2 (17) installed in the trap 2 (11) is removed, the valve 2 (7) is closed, and the air is pumped to the reservoir 3 (3) by the air pump (13). The magnetic silica particles accumulated in) are dispersed and washed with a washing solution, and at the same time, the trap 3 (1
It was accumulated again in the portion 2), and the cleaning liquid was drained to the drain port (19). After drainage, close valve 3 (8) and valve 4 (9)
Open and open the magnet 3 (1) installed in the trap 3 (12).
8) Remove the air pump (1) to the reservoir 4 (4).
The magnetic silica particles accumulated in the trap 3 (12) by air supply in 3) were collected from the collection port (20) together with the eluate.
【００４６】回収した溶出液の１０μｌをポリメラーゼ
・チェイン反応用マイクロチューブ（Ｓｏｒｅｎｓｏｎ
ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社、Ｍｕｌｔｉ Ｕｌｔｒａ
ＰＣＲ Ｔｕｂｅ）に入れ、２種類の２０ｍＭのオリゴ
核酸（ＤＮＡプローブ）溶液を各０．２５μｌ、基質溶
液（ＴＡＫＡＲＡ社、ｄＮＴＰ ｍｉｘｕｒｅ、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰを各２．５ｍＭ含む
もの）を２μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ溶液（ＴＡＫＡＲ
Ａ社、Ｚ−Ｔａｑ、２．５Ｕ／μｌ）を０．２５μｌ、
緩衝液（３００ｍＭトリス−塩酸、７５ｍＭ硫酸アンモ
ニウム、１７．５ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ８．５）
を５μｌ添加し、更に蒸留水を添加して全量２５μｌに
した。鉱物油（シグマ社）２０μｌを重層して、サーモ
サイクラー（ストラタジーン社、ＲｏｂｏＣｙｃｌｅ
ｒ）で９８℃２０秒と６５℃３０秒で４０サイクルのポ
リメラーゼ・チェイン反応を行った。２種類のオリゴ核
酸（ＤＮＡプローブ）は、枯草菌（菌株：ＡＴＣＣ登録
番号６６３３）の１６ｓ ｒＲＮＡに対する遺伝子の、
塩基配列４５８番目のａから４８１番目のａまでの配列
（配列番号１）と、同遺伝子の塩基配列６５９番目のｔ
から６８１番目のｃまでの相補鎖の配列（配列番号２）
をＳｉｇｍａ社に依頼して化学的に合成した。ポリメラ
ーゼ・チェイン反応が終了した溶液５μｌに、サンプル
処理液（ＴＡＫＡＲＡ社、１０× Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂ
ｕｆｆｅｒ）を０．５μｌ添加し、それを、３％アガロ
ースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ３：１ ａｇａｒｏｓｅをＴ
ＡＥ（トリス／酢酸／ＥＤＴＡ）緩衝液に溶解し固めた
もの）で電気泳動（ＡＤＶＡＮＣＥ社、Ｍｕｐｉｄ）し
た。電気泳動後、アガロースゲルをエチジウムブロマイ
ド水溶液（１μｇ／ｍｌ）に１５分間浸し、泳動された
ＤＮＡを紫外線で検出した。10 μl of the collected eluate was added to a polymerase chain reaction microtube (Sorenson).
BioScience, Multi Ultra
0.25 μl each of two 20 mM oligonucleic acid (DNA probe) solutions and a substrate solution (TAKARA, dNTP mixture, dAT)
2 μl of P, dTTP, dGTP and dCTP each containing 2.5 mM) and a DNA polymerase solution (TAKAR)
A company, Z-Taq, 2.5 U / μl) 0.25 μl,
Buffer solution (300 mM Tris-hydrochloric acid, 75 mM ammonium sulfate, 17.5 mM magnesium chloride, pH 8.5)
5 μl was added, and distilled water was further added to make a total volume of 25 μl. 20 μl of mineral oil (Sigma) was overlaid and thermocycler (Stratagene, RoboCycle) was used.
In r), 40 cycles of polymerase chain reaction were carried out at 98 ° C. for 20 seconds and 65 ° C. for 30 seconds. Two kinds of oligonucleic acid (DNA probe) are the genes for 16s rRNA of Bacillus subtilis (strain: ATCC registration number 6633),
The sequence from the 458th a to the 481st a (SEQ ID NO: 1) and the 659th t of the base sequence of the same gene
Sequence of complementary strand from c to 681st (c) (SEQ ID NO: 2)
Was chemically synthesized by requesting Sigma. Add 5 μl of the solution in which the polymerase chain reaction was completed to the sample treatment solution (TAKARA, 10 × Loading B
0.5 μl of the buffer solution) was added, and it was applied to a 3% agarose gel (NuSieve 3: 1 agarose T).
Electrophoresis (Made by ADVANCE, Mupid) was performed by AE (Tris / acetic acid / EDTA) buffer solution and solidified. After the electrophoresis, the agarose gel was immersed in an ethidium bromide aqueous solution (1 μg / ml) for 15 minutes, and the electrophoresed DNA was detected by ultraviolet rays.
【００４７】その結果、図２に示したように、ＤＮＡ分
子量マーカー（ＢｉｏＶｅｎｔｕｒｅｓ，Ｉｎｃ製、Ｂ
ｉｏＭａｋｅｒTM Ｌｏｗ）（２１、左端はマーカーの
遺伝子の大きさ（単位：塩基対））の３００ｂｐと２０
０ｂｐの間の位置に、本ポリメラーゼ・チェイン反応に
よって増幅されたＤＮＡ（２２）が、塩基配列から予想
される大きさのバンドとして泳動された。したがって本
手法によって、枯草菌のＤＮＡが単離されたことが示さ
れた。As a result, as shown in FIG. 2, a DNA molecular weight marker (manufactured by BioVentures, Inc., B
ioMaker™ Low) (21, left end is marker gene size (unit: base pairs)) 300 bp and 20
At a position between 0 bp, the DNA (22) amplified by the polymerase chain reaction was migrated as a band having a size expected from the nucleotide sequence. Therefore, it was shown that the DNA of Bacillus subtilis was isolated by this method.
【００４８】[0048]
【実施例２】ポリプロピレン製マイクロテストチューブ
（エッペンドルフ社、１．５ｍｌ）とシリコンゴム栓で
リザーバー１〜３（３１、３２、３３）と遊離（吸着）
反応槽（３５）を、サンプルインジェクター（ファルマ
シア社、ＩＭＶ−７、サンプルループ容量５０μｌを用
いてリザーバー４（３４）を、電磁バルブ（ファルマシ
ア社、ＩＭＶ−８）でバルブ１〜４（３６、３７、３
８、３９）を、テフロン（登録商標）チューブ（外径
２．５ｍｍ、内径１．５ｍｍ）でトラップ１〜３（４
０、４１、４２）を作成した。空気ポンプで送液する装
置（ファルマシア社、Ｐ−６０００）（４３）、反応槽
（３５）を加熱する加熱装置１（４４）、バルブを操作
する装置（ファルマシア社、ＬＣＣ−５００）（４
５）、トラップ１〜３（４０、４１、４２）の部分に直
径８ｍｍ、長さ２５ｍｍの円筒型磁石１〜３（４６、４
７、４８）を取り付けた。また、テフロン（登録商標）
チューブ（外径１．７ｍｍ、内径０．９ｍｍ）で各部分
をつなぐ流路を作成した。更に、ポリメラーゼ・チェイ
ン反応を行う為の液体ポンプ（ファルマシア社、Ｐ−５
００）（５０）、トラップ部分を加熱する加熱装置２
（５１）、ポリメラーゼ・チェイン反応を行う部分を２
つの異なる温度に加熱する加熱装置３、４（５２、５
３）を作成した。この２つの温度に加熱された部分を４
０回往復する流路（テフロン（登録商標）チューブ、外
径１．７ｍｍ、内径０．５ｍｍ、１往復が２０ｃｍの長
さ）（５４）を取付け、図３に示した装置を完成した。
流路と各部とのつぎ目は、フェラル（ファルマシア社）
を用いた。Example 2 A polypropylene micro test tube (Eppendorf, 1.5 ml) and a silicone rubber stopper were used to store reservoirs 1 to 3 (31, 32, 33) and release (adsorb).
The reaction tank (35) was a reservoir 4 (34) using a sample injector (Pharmacia, IMV-7, sample loop volume 50 μl), and valves 1 to 4 (36, 37) with electromagnetic valves (Pharmacia, IMV-8). Three
8, 39) with a Teflon (registered trademark) tube (outer diameter 2.5 mm, inner diameter 1.5 mm) to traps 1 to 3 (4).
0, 41, 42) were prepared. Device for sending liquid by air pump (P-6000, Pharmacia) (43), heating device 1 (44) for heating reaction tank (35), device for operating valve (Pharmacia, LCC-500) (4)
5), the traps 1 to 3 (40, 41, 42) are cylindrical magnets 1 to 3 (46, 4) having a diameter of 8 mm and a length of 25 mm.
7, 48). In addition, Teflon (registered trademark)
A channel (outer diameter 1.7 mm, inner diameter 0.9 mm) was used to create a flow path connecting each part. Furthermore, a liquid pump for carrying out the polymerase chain reaction (P-5, Pharmacia)
00) (50), heating device 2 for heating the trap portion
(51), 2 parts for polymerase chain reaction
Heating devices 3, 4 (52, 5) for heating to three different temperatures
3) was created. 4 parts heated to these two temperatures
A flow path (Teflon (registered trademark) tube, outer diameter 1.7 mm, inner diameter 0.5 mm, length of reciprocation of 20 cm) (54) that reciprocates 0 times was attached to complete the device shown in FIG.
The joint between the flow path and each part is a ferrule (Pharmacia)
Was used.
【００４９】リザーバー１（３１）に、遊離（吸着）液
（２０ｍＭのＥＤＴＡ、１．３％のＴｒｉｔｏｎＸ−１
００、５．２５Ｍのグアニジンチオシアン酸塩を含む５
０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ６．４）９００μｌ
に、磁性シリカ粒子（東洋紡）の懸濁液１μｌの混合液
を添加した。リザーバー２（３２）及びリザーバー３
（３３）に洗浄液（７０％エタノール）５００μｌを添
加した。リザーバー４（３４）に溶出液としてポリメラ
ーゼ・チェイン反応を行う溶液（０．１２５ＵのＤＮＡ
ポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ社、Ｚ−Ｔａｑ）、３．５
ｍＭの塩化マグネシウム、各０．２ｍＭの２種類のオリ
ゴ核酸（枯草菌の菌株（ＡＴＣＣ６６３３）の１６ｓ
ｒＲＮＡに対する遺伝子の、塩基配列４５８番目のａか
ら４８１番目のａまでの配列（配列番号１）と、同遺伝
子の塩基配列６５９番目のｔから６８１番目のｃまでの
相補鎖の配列（配列番号２））、基質（ｄＡＴＰ、ｄＴ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、各０．２ｍＭ）を含む溶
液）５０μｌを添加した。あらかじめ、空気ポンプ（４
３）は、送気時には１０ｍｌ／分の流速で、最大圧が
０．１気圧となるように調製し、バルブ１〜４（３６〜
３９）は、すべて閉にした。In the reservoir 1 (31), a free (adsorption) solution (20 mM EDTA, 1.3% Triton X-1) was added.
00, containing 5.25M guanidine thiocyanate 5
900 μl of 0 mM Tris-HCl buffer, pH 6.4)
To this, a mixed solution of 1 μl of a suspension of magnetic silica particles (Toyobo) was added. Reservoir 2 (32) and reservoir 3
To (33), 500 μl of the washing solution (70% ethanol) was added. Solution for carrying out polymerase chain reaction as an eluent in the reservoir 4 (34) (0.125 U of DNA
Polymerase (TAKARA, Z-Taq), 3.5
2 kinds of oligonucleic acid (each Bacillus subtilis strain (ATCC6633) 16s of mM magnesium chloride, 0.2 mM each)
The sequence of the gene for rRNA from a at the base sequence 458th to a at the base 481st (SEQ ID NO: 1) and the sequence of the complementary strand from the base sequence 659th to c at the base 681 of the gene (SEQ ID NO: 2) )), Substrate (dATP, dT)
50 μl of a solution containing TP, dGTP, dCTP, 0.2 mM each) was added. In advance, air pump (4
3) was prepared so that the maximum pressure would be 0.1 atm at a flow rate of 10 ml / min during air supply, and valves 1 to 4 (36 to
39) closed all.
【００５０】反応槽（３５）に、菌体の個数として１０
7個の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）の
ペレットを入れ、更にこの部分を加熱装置１（４４）で
９８℃に加熱した。バルブ１（３６）を開にした後、リ
ザーバー１（３１）に空気ポンプ（４３）で送気して遊
離吸着液を反応槽（３５）に導入した。１０分後、バル
ブ１（３６）を閉、バルブ２（３７）、バルブ３（３
８）を開にして、反応槽の液体を廃液し、同時に磁性シ
リカ粒子をトラップ１（４０）に集積した。廃液口（４
９）から廃液した後、トラップ１（４０）に設置した磁
石１（４６）を取り除き、リザーバー２（３２）に空気
ポンプで送気して、トラップ１（４０）に集積した磁性
シリカ粒子を洗浄液で分散し洗浄すると同時に、トラッ
プ２（４１）の部分で再度集積し、洗浄液を廃液した。
廃液後、トラップ２（４１）に設置した磁石２（４７）
を取り除き、バルブ２（３７）を閉にして、リザーバー
３（３３）に空気ポンプ（４３）で送気して、トラップ
２（４１）に集積した磁性シリカ粒子を洗浄液で分散し
洗浄すると同時に、トラップ３（４２）の部分で再度集
積し、洗浄液を廃液した。空気ポンプ（４３）の流速を
５０ｍｌ／分にして、加熱装置２（５１）で、トラップ
部分を約９０℃に加熱し、トラップ３（４２）に集積し
た磁性シリカ粒子を十分乾燥した。乾燥後、バルブ３
（３８）を閉、バルブ４（３９）を開、トラップ３（４
２）に設置した磁石３（４８）を取り除き、リザーバー
４（３４）に液体ポンプ（５０）を用いて鉱物油（シグ
マ社）を０．１２ｍｌ／分の流速で送液した。In the reaction tank (35), the number of bacterial cells was 10
Seven pellets of Bacillus subtilis were placed, and this portion was further heated to 98 ° C. by a heating device 1 (44). After opening the valve 1 (36), the free adsorbed liquid was introduced into the reaction tank (35) by supplying air to the reservoir 1 (31) with an air pump (43). After 10 minutes, valve 1 (36) was closed, valve 2 (37), valve 3 (3
8) was opened to drain the liquid in the reaction tank, and at the same time, the magnetic silica particles were accumulated in the trap 1 (40). Waste liquid port (4
After draining the liquid from 9), the magnet 1 (46) installed in the trap 1 (40) is removed, air is sent to the reservoir 2 (32) by an air pump, and the magnetic silica particles accumulated in the trap 1 (40) are washed. At the same time as being dispersed and washed with, the trap 2 (41) was accumulated again and the washing liquid was discharged.
After the waste liquid, the magnet 2 (47) installed in the trap 2 (41)
Is removed, the valve 2 (37) is closed, and air is sent to the reservoir 3 (33) by the air pump (43) to disperse and wash the magnetic silica particles accumulated in the trap 2 (41) with a washing solution. The trap 3 (42) was accumulated again and the washing liquid was drained. The flow rate of the air pump (43) was set to 50 ml / min and the trap portion was heated to about 90 ° C. by the heating device 2 (51) to sufficiently dry the magnetic silica particles accumulated in the trap 3 (42). After drying, valve 3
(38) closed, valve 4 (39) opened, trap 3 (4
The magnet 3 (48) installed in 2) was removed, and mineral oil (Sigma) was fed to the reservoir 4 (34) using the liquid pump (50) at a flow rate of 0.12 ml / min.
【００５１】ポリメラーゼ・チェイン反応部分を加熱装
置３（５２）と加熱装置４（５３）でそれぞれ９２℃と
６５℃に加温して、ポリメラーゼ・チェイン反応をＰＣ
Ｒ反応流路（５４）の中で行った。回収口（５５）から
ポリメラーゼ・チェイン反応が終了した溶液を回収し
た。その回収液５μｌを、サンプル処理液（ＴＡＫＡＲ
Ａ社、１０× Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）を０．
５μｌ添加し、それを、３％アガロースゲル（ＮｕＳｉ
ｅｖｅ３：１ ａｇａｒｏｓｅをＴＡＥ（トリス／酢酸
／ＥＤＴＡ）緩衝液に溶解し固めたもの）で電気泳動
（ＡＤＶＡＮＣＥ社、Ｍｕｐｉｄ）した。電気泳動後、
アガロースゲルをエチジウムブロマイド水溶液（１μｇ
／ｍｌ）に１５分間浸し、泳動されたＤＮＡを紫外線で
検出した。その結果、図４に示したように、ＤＮＡ分子
量マーカー（ＢｉｏＶｅｎｔｕｒｅｓ，Ｉｎｃ製、Ｂｉ
ｏＭａｋｅｒTM Ｌｏｗ）（６１、左端はマーカーの遺
伝子の大きさ（単位：塩基対））の３００ｂｐと２００
ｂｐの間の位置に、本ポリメラーゼ・チェイン反応によ
って増幅されたＤＮＡ（６２）が、配列から予想される
大きさのバンドとして泳動された。したがって本手法に
よって、枯草菌由来のＤＮＡが単離され、更に増幅され
たことが示された。The polymerase chain reaction is heated to 92 ° C. and 65 ° C. by the heating device 3 (52) and the heating device 4 (53), respectively, and the polymerase chain reaction is performed on the PC.
It was carried out in the R reaction channel (54). The solution in which the polymerase chain reaction was completed was recovered from the recovery port (55). 5 μl of the recovered liquid was used as a sample treatment liquid (TAKAR
Company A, 10 × Loading Buffer) was set to 0.
5 μl was added, and it was added to 3% agarose gel (NuSi
The eve3: 1 agarose was dissolved in TAE (Tris / acetic acid / EDTA) buffer and solidified) for electrophoresis (ADVANCE, Mupid). After electrophoresis,
Agarose gel is treated with ethidium bromide aqueous solution (1 μg
/ Ml) for 15 minutes, and the electrophoresed DNA was detected by ultraviolet light. As a result, as shown in FIG. 4, a DNA molecular weight marker (BioVentures, Inc., Bi
oMaker™ Low) (61, left end is marker gene size (unit: base pair)) 300 bp and 200
At the position between bp, the DNA (62) amplified by this polymerase chain reaction was run as a band of the size expected from the sequence. Therefore, it was shown that the B. subtilis-derived DNA was isolated and further amplified by this method.
【００５２】[0052]
【実施例３】図５、６、７、８に示した基板１〜４（７
１〜７４）となる部品をポリカーボナイト板で、図９、
１０、１１に示した気密板１〜３（７５〜７７）となる
部品をシリコンゴム板で、図１２に示したバルブ棒（７
８）をステンレス棒で作成した。これらの部品とビス及
びナットを用いて、図１３に示したチップを組み立て
た。チップは外部からの押す力によって、各バルブ（Ｖ
１〜Ｖ１１）の開閉操作が可能となっている。また、ト
ラップ１〜３（Ｍ１〜Ｍ３）へ磁石の設置と除去が可能
になっている。またポンプ部との接合口（Ｐ１〜Ｐ５）
にシリンジポンプ（ファルマシア社、Ｐ−６００）を利
用した空気ポンプが接合され、この空気送気による送液
が可能になっている。更に、湯浴及び加熱空気の送気に
よる遊離（吸着）反応槽（Ｒ５）及びトラップ２、３
（Ｍ２、Ｍ３）の加熱が可能となっている。EXAMPLE 3 Substrates 1 to 4 (7 shown in FIGS. 5, 6, 7 and 8)
1-74) is a polycarbonate sheet, as shown in FIG.
The airtight plates 1 to 3 (75 to 77) shown in FIGS. 10 and 11 are silicon rubber plates, and the valve rod (7
8) was made with a stainless steel rod. The chip shown in FIG. 13 was assembled using these parts, screws and nuts. The tip is pushed by each valve (V
1 to V11) can be opened and closed. Further, it is possible to install and remove magnets in the traps 1 to 3 (M1 to M3). Also, the joint with the pump part (P1 to P5)
An air pump using a syringe pump (P-600, Pharmacia Co., Ltd.) is joined to this to enable liquid feeding by this air feeding. Furthermore, a liberation (adsorption) reaction tank (R5) and traps 2 and 3 by a hot water bath and supply of heated air
Heating of (M2, M3) is possible.
【００５３】リザーバー１（Ｒ１）に、遊離（吸着）液
（２０ｍＭのＥＤＴＡ、１．３％のＴｒｉｔｏｎＸ−１
００、５．２５Ｍのグアニジンチオシアン酸塩を含む５
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ６．４）９００μｌ、
磁性シリカ粒子（東洋紡）の懸濁液１μｌを添加した。
リザーバー２（Ｒ２）に洗浄液（７０％エタノール）５
００μｌ、リザーバー３（Ｒ３）に洗浄液（９９％エタ
ノール）５００μｌを添加した。リザーバー４（Ｒ４）
に蒸留水１００μｌを添加した。遊離（吸着）反応槽
（Ｒ５）に、菌体の個数として１０7個の大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のペレットを入れた。
すべてのバルブ（Ｖ１〜Ｖ１１）を閉にし、トラップ部
分（Ｍ１〜Ｍ３）に磁石を設置した。反応槽（Ｒ５）、
トラップ２（Ｍ２）、トラップ３（Ｍ３）の部分を、そ
れぞれ９８℃に加熱した。バルブ１（Ｖ１）、バルブ３
（Ｖ３）を開、空気の送気を空気ポンプ接合口１（Ｐ
１）から開始し、リザーバー１（Ｒ１）の遊離吸着液を
反応槽（Ｒ５）の部分に導いた。３分後、バルブ５（Ｖ
５）、バルブ７（Ｖ７）を開、バルブ３（Ｖ３）を閉じ
て、反応槽（Ｒ５）の液体を廃液口２（Ｗ２）に廃液し
た。トラップ１（Ｍ１）の部分に磁性シリカ粒子を集積
した。バルブ１（Ｖ１）、バルブ７（Ｖ７）を閉、バル
ブ２（Ｖ２）、バルブ６（Ｖ６）、バルブ１０（Ｖ１
０）を開にし、トラップ１（Ｔ１）部分の磁石を取り除
き、空気の送気を空気ポンプ接合口２（Ｐ２）から開始
し、リザーバー２（Ｒ２）の洗浄液を流して、磁性シリ
カ粒子を分散し洗浄すると同時にトラップ２（Ｍ２）の
部分に再度集積した。In the reservoir 1 (R1), the free (adsorption) liquid (20 mM EDTA, 1.3% Triton X-1) was added.
00, containing 5.25M guanidine thiocyanate 5
0 mM Tris-HCl buffer, pH 6.4) 900 μl,
1 μl of a suspension of magnetic silica particles (Toyobo) was added.
Wash solution (70% ethanol) 5 in reservoir 2 (R2)
A washing solution (99% ethanol) (500 μl) was added to the reservoir (R3) (00 μl). Reservoir 4 (R4)
100 μl of distilled water was added to. In the free (adsorption) reaction tank (R5), 107 Escherichia coli (Es
cherichia coli) was added.
All valves (V1 to V11) were closed and magnets were installed in the trap parts (M1 to M3). Reaction tank (R5),
The portions of trap 2 (M2) and trap 3 (M3) were each heated to 98 ° C. Valve 1 (V1), valve 3
(V3) is opened and air is sent to the air pump joint 1 (P
Starting from 1), the free adsorbed liquid of reservoir 1 (R1) was introduced into the reaction tank (R5). After 3 minutes, valve 5 (V
5), the valve 7 (V7) was opened, the valve 3 (V3) was closed, and the liquid in the reaction tank (R5) was drained to the drain port 2 (W2). Magnetic silica particles were accumulated in the portion of trap 1 (M1). Close valve 1 (V1), valve 7 (V7), valve 2 (V2), valve 6 (V6), valve 10 (V1
0) is opened, the magnet in the trap 1 (T1) part is removed, air supply is started from the air pump joint port 2 (P2), and the cleaning liquid in the reservoir 2 (R2) is flowed to disperse the magnetic silica particles. Then, at the same time as washing, it was again accumulated in the portion of the trap 2 (M2).
【００５４】バルブ５（Ｖ５）を閉、バルブ４（Ｖ４）
を開、トラップ２（Ｍ２）の部分の磁石を取り除いた。
空気の送気を空気ポンプ接合口３（Ｐ３）から開始し、
リザーバー３（Ｒ３）の洗浄液を流して、磁性シリカ粒
子を分散し洗浄すると同時にトラップ３（Ｍ３）の部分
に再度集積した。バルブ６（Ｖ６）を閉じ、バルブ８
（Ｖ８）を開にし、１０分間、空気ポンプ接合口４（Ｐ
４）から５０ｍｌ／分の空気を送気して、磁性シリカ粒
子に残っているエタノールを乾燥した。バルブ８（Ｖ
８）、バルブ１０（Ｖ１０）を閉、バルブ９（Ｖ９）、
バルブ１１（Ｖ１１）を開にし、トラップ３（Ｍ３）部
分の磁石を取り除き、空気の送気を空気ポンプ接合口５
（Ｐ５）から開始し、リザーバー４（Ｒ４）の溶出液を
流して、回収口（Ｗ３）から核酸を回収した。回収した
液体中に大腸菌由来のＤＮＡが精製されていることを、
以下の方法で確認した。Valve 5 (V5) is closed, valve 4 (V4)
Was opened, and the magnet in the portion of the trap 2 (M2) was removed.
Start air supply from the air pump joint port 3 (P3),
The washing liquid in the reservoir 3 (R3) was flowed to disperse and wash the magnetic silica particles, and at the same time, the magnetic silica particles were accumulated again in the trap 3 (M3) portion. Valve 6 (V6) is closed, valve 8
(V8) is opened and the air pump joint 4 (P
Air of 50 ml / min was sent from 4) to dry the ethanol remaining on the magnetic silica particles. Valve 8 (V
8), valve 10 (V10) is closed, valve 9 (V9),
Open the valve 11 (V11), remove the magnet in the trap 3 (M3) part, and supply air to the air pump joint port 5
Starting from (P5), the eluate of the reservoir 4 (R4) was caused to flow, and the nucleic acid was recovered from the recovery port (W3). Confirm that the E. coli-derived DNA is purified in the recovered liquid.
It was confirmed by the following method.
【００５５】回収した溶出液の１０μｌをポリメラーゼ
・チェイン反応用マイクロチューブ（Ｍｕｌｔｉ Ｕｌ
ｔｒａ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、Ｓｏｒｅｎｓｏｎ Ｂｉｏ
Ｓｃｉｅｎｃｅ製）に入れ、２種類の２０ｍＭのオリゴ
核酸（大腸菌のリボゾーム蛋白質 Ｌ２５に対する遺伝
子の、塩基配列４４９番目のｃから４７２番目のｔまで
の配列（配列番号３）と、同遺伝子の塩基配列６２８番
目のａから６５０番目のａまでの相補鎖の配列（配列番
号４））各０．２５μｌ、基質（ｄＮＴＰ ｍｉｘｕｒ
ｅ：ＴＡＫＡＲＡ社製、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰを各２．５ｍＭ含むもの）２μｌ、ＤＮＡ
ポリメラーゼ溶液（Ｚ−Ｔａｑ、２．５Ｕ／μｌ、ＴＡ
ＫＡＲＡ社製）０．２５μｌ、緩衝液（３００ｍＭトリ
ス−塩酸、７５ｍＭ硫酸アンモニウム、１７．５ｍＭ塩
化マグネシウム、ｐＨ９．５）５μｌを添加し、更に蒸
留水を添加して全量を２５μｌにした。鉱物油（シグマ
社製）２０μｌを重層して、サーモサイクラー（Ｒｏｂ
ｏＣｙｃｌｅｒ：ストラタジーン製）で９８℃２０秒と
６５℃３０秒で４０サイクルのポリメラーゼ・チェイン
反応を行った。２種類のオリゴ核酸（ＤＮＡプローブ）
はシグマ社に依頼して化学的に合成した。10 μl of the collected eluate was added to a polymerase chain reaction microtube (Multi Ul).
tra PCR Tube, Sorenson Bio
(Science) and two types of 20 mM oligonucleic acid (the sequence for the Escherichia coli ribosomal protein L25 gene from the nucleotide sequence 449th c to the 472nd t (SEQ ID NO: 3) and the nucleotide sequence 628 of the same gene). 0.25 μl each of the complementary strand sequence from the a-th to the 650-th a (SEQ ID NO: 4), the substrate (dNTP mixur
e: TAKARA, dATP, dTTP, dGT
P and dCTP each containing 2.5 mM) 2 μl, DNA
Polymerase solution (Z-Taq, 2.5 U / μl, TA
0.25 μl of KARA), 5 μl of buffer (300 mM Tris-hydrochloric acid, 75 mM ammonium sulfate, 17.5 mM magnesium chloride, pH 9.5) were added, and distilled water was further added to make the total volume 25 μl. 20 μl of mineral oil (manufactured by Sigma) is overlaid, and the thermocycler (Rob
40 cycles of polymerase chain reaction was carried out at 98 ° C. for 20 seconds and 65 ° C. for 30 seconds using oCycler (Stratagene). Two kinds of oligonucleic acid (DNA probe)
Was commissioned by Sigma and was chemically synthesized.
【００５６】ポリメラーゼ・チェイン反応液５μｌ、サ
ンプル処理液（１０× Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅ
ｒ：ＴＡＫＡＲＡ製）０．５μｌを添加し、それを、３
％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ３：１ ａｇａｒｏ
ｓｅをＴＡＥ（トリス／酢酸／ＥＤＴＡ）緩衝液に溶解
し固めたもの）で電気泳動（Ｍｕｐｉｄ：ＡＤＶＡＮＣ
Ｅ社製）した。電気泳動後、アガロースゲルをエチジウ
ムブロマイド水溶液（１μｇ／ｍｌ）に１５分間浸し、
泳動されたＤＮＡを紫外線で検出した。その結果、図１
４に示したように、マーカーＤＮＡ２００ｂｐとほぼ同
じ位置に、本ポリメラーゼ・チェイン反応によって増幅
されたＤＮＡが、塩基配列から予想される大きさのバン
ドとして泳動された。したがって本手法によって、大腸
菌のＤＮＡが単離された事が示された。5 μl of polymerase chain reaction solution, sample treatment solution (10 × Loading Buffer)
0.5 μl (r: manufactured by TAKARA), and add it to 3
% Agarose gel (NuSieve 3: 1 agaro
Se dissolved in TAE (Tris / acetic acid / EDTA) buffer and solidified) by electrophoresis (Mupid: ADVANC)
Manufactured by Company E). After electrophoresis, soak the agarose gel in ethidium bromide aqueous solution (1 μg / ml) for 15 minutes,
The electrophoresed DNA was detected by ultraviolet light. As a result,
As shown in 4, the DNA amplified by this polymerase chain reaction was electrophoresed at approximately the same position as the marker DNA 200 bp as a band of the size expected from the nucleotide sequence. Therefore, it was shown that E. coli DNA was isolated by this method.
【００５７】[0057]
【比較例１】実施例１で作成した装置において、トラッ
プ２（１１）とトラップ３（１２）部分を省略し、この
部分を流路でつなげた装置を組み立てた。実施例１と同
様にして、リザーバー１（１）に、遊離（吸着）液（２
０ｍＭのＥＤＴＡ、１．３％のＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０、５．２５Ｍのグアニジンチオシアン酸塩を含む５０
ｍＭのトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ６．４）９００μｌに
磁性シリカ粒子（東洋紡）の懸濁液１μｌの混合液を添
加した。リザーバー２（２）とリザーバー３（３）に、
それぞれ洗浄液（７０％エタノール）５００μｌを添加
した。リザーバー４（４）に溶出液として蒸留水１００
μｌを添加した。この装置に空気ポンプで送液する装置
（１３）、遊離（吸着）反応槽（５）を加熱する装置
（１４）、バルブを操作する装置（１５）、トラップ１
（１０）の部分に磁場を与える装置として、直径８ｍ
ｍ、長さ２５ｍｍの円筒型磁石（１６）をそれぞれ取り
付けた。あらかじめ、空気ポンプ（１３）は、送気時に
は１０ｍｌ／分の流速で、最大圧が０．１気圧となるよ
うに調製し、バルブ１〜４（６〜９）は、すべて閉にし
た。[Comparative Example 1] In the apparatus prepared in Example 1, the trap 2 (11) and the trap 3 (12) were omitted, and the apparatus was assembled by connecting these portions with a flow path. In the same manner as in Example 1, the free (adsorption) liquid (2
0 mM EDTA, 1.3% Triton X-10
50 with 0, 5.25 M guanidine thiocyanate
A mixed solution of 1 μl of a suspension of magnetic silica particles (Toyobo) was added to 900 μl of mM Tris-hydrochloric acid buffer, pH 6.4. In reservoir 2 (2) and reservoir 3 (3),
500 μl of washing solution (70% ethanol) was added to each. Distilled water 100 as eluent in the reservoir 4 (4)
μl was added. A device (13) for feeding a liquid to this device by an air pump, a device (14) for heating a free (adsorption) reaction tank (5), a device (15) for operating a valve, and a trap 1.
8m in diameter as a device that gives a magnetic field to the part (10)
A cylindrical magnet (16) having a length of m and a length of 25 mm was attached. In advance, the air pump (13) was adjusted so that the maximum pressure was 0.1 atm at a flow rate of 10 ml / min during air supply, and all the valves 1 to 4 (6 to 9) were closed.
【００５８】反応槽（５）に、菌体の個数として１０7
個の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の
ペレットを入れ、更にこの部分を加熱装置（１４）で９
８℃に加熱した。バルブ１（６）を開にした後、空気ポ
ンプ（１３）からリザーバー１（１）に送気して、遊離
吸着液を反応槽（５）に導入した。１０分後、バルブ１
（６）を閉、バルブ２（７）、バルブ３（８）を開にし
て、反応槽（５）の内容物を廃液口（１９）へ廃液し
た。廃液後、リザーバー２（２）に空気ポンプ（１３）
で送気して、トラップ１（１０）に蓄積した磁性シリカ
粒子を洗浄し、洗浄液を廃液口（１９）に廃液した。廃
液後、バルブ２（７）を閉にして、リザーバー３（３）
に空気ポンプ（１３）で送気して、トラップ１（１０）
に集積した磁性シリカ粒子を洗浄し、洗浄液を廃液口
（１９）に廃液した。廃液後、バルブ３（８）を閉、バ
ルブ４（９）を開とし、トラップ１（１０）に設置した
磁石（１６）を取り除き、リザーバー４（４）に空気ポ
ンプ（１３）で送気して、トラップ１（１０）に集積し
た磁性シリカ粒子を、溶出液と共に回収口（２０）から
回収しようとした。この時、トラップ１（１０）に集積
した磁性シリカ粒子は、分散せずに、塊となって流路を
流れ、バルブとチューブの結合部分をふさいでしまい、
核酸を含む溶出液が回収口から回収できなかった。In the reaction vessel (5), the number of bacterial cells was 107
Pour Bacillus subtilis pellets, and add 9 parts of this pellet with a heating device (14).
Heated to 8 ° C. After opening the valve 1 (6), air was sent from the air pump (13) to the reservoir 1 (1) to introduce the free adsorbed liquid into the reaction tank (5). After 10 minutes, valve 1
(6) was closed, valve 2 (7) and valve 3 (8) were opened, and the contents of the reaction tank (5) were drained to the drain port (19). After draining, the air pump (13) in the reservoir 2 (2)
The magnetic silica particles accumulated in the trap 1 (10) were washed with air to wash the washing liquid, and the washing liquid was drained to the drain port (19). After draining the liquid, close the valve 2 (7) to the reservoir 3 (3).
The air pump (13) supplies air to the trap 1 (10).
The magnetic silica particles accumulated in were washed, and the washing liquid was drained to the drain port (19). After draining, the valve 3 (8) is closed, the valve 4 (9) is opened, the magnet (16) installed in the trap 1 (10) is removed, and the air is pumped to the reservoir 4 (4) by the air pump (13). Then, the magnetic silica particles accumulated in the trap 1 (10) were tried to be collected from the collection port (20) together with the eluate. At this time, the magnetic silica particles accumulated in the trap 1 (10) do not disperse but flow as a lump in the flow path, blocking the connecting portion between the valve and the tube.
The eluate containing nucleic acid could not be recovered from the recovery port.
【００５９】[0059]
【発明の効果】本発明によって、核酸を含有する材料か
らの核酸単離を迅速簡便に行うことができ、核酸を使っ
た簡易迅速検査を達成する。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, nucleic acid can be isolated from a nucleic acid-containing material quickly and simply, and a simple and quick test using nucleic acid is achieved.
【図１】 本発明の核酸単離用流路を用い核酸単離方法
を行う装置の構成を示す概念図。FIG. 1 is a conceptual diagram showing the configuration of an apparatus for performing a nucleic acid isolation method using the nucleic acid isolation channel of the present invention.
【図２】 実施例１の結果を示すアガロースゲル電気泳
動の写真印刷。2 is a photographic print of agarose gel electrophoresis showing the results of Example 1. FIG.
【図３】 本発明の核酸単離用流路を用い核酸単離増幅
方法を行う装置の構成を示す概念図。FIG. 3 is a conceptual diagram showing a configuration of an apparatus for performing a nucleic acid isolation / amplification method using the nucleic acid isolation channel of the present invention.
【図４】 実施例２の結果を示すアガロースゲル電気泳
動の写真印刷。FIG. 4 is a photographic print of agarose gel electrophoresis showing the results of Example 2.
【図５】 本発明の核酸単離用チップを構成する基板１
の平面図及び断面図。FIG. 5: Substrate 1 constituting the nucleic acid isolation chip of the present invention
And FIG.
【図６】 本発明の核酸単離用チップを構成する基板２
の平面図及び断面図。FIG. 6 is a substrate 2 that constitutes the nucleic acid isolation chip of the present invention.
And FIG.
【図７】 本発明の核酸単離用チップを構成する基板３
の平面図及び断面図。FIG. 7: Substrate 3 that constitutes the nucleic acid isolation chip of the present invention
And FIG.
【図８】 本発明の核酸単離用チップを構成する基板４
の平面図及び断面図。FIG. 8: Substrate 4 constituting the nucleic acid isolation chip of the present invention
And FIG.
【図９】 本発明の核酸単離用チップを構成する気密板
１の平面図及び断面図。FIG. 9 is a plan view and a sectional view of an airtight plate 1 which constitutes the nucleic acid isolation chip of the present invention.
【図１０】 本発明の核酸単離用チップを構成する気密
板２の平面図及び断面図。FIG. 10 is a plan view and a sectional view of an airtight plate 2 that constitutes the nucleic acid isolation chip of the present invention.
【図１１】 本発明の核酸単離用チップを構成する気密
板３の平面図及び断面図。FIG. 11 is a plan view and a sectional view of an airtight plate 3 which constitutes the nucleic acid isolation chip of the present invention.
【図１２】 本発明の核酸単離用チップを構成するバル
ブ棒の側面図及び上面図。FIG. 12 is a side view and a top view of a valve rod that constitutes the nucleic acid isolation chip of the present invention.
【図１３】 本発明の核酸単離用チップの平面図及び断
面図。FIG. 13 is a plan view and a cross-sectional view of the nucleic acid isolation chip of the present invention.
【図１４】 実施例３の結果を示すアガロースゲル電気
泳動の写真印刷。FIG. 14: Photographic print of agarose gel electrophoresis showing the results of Example 3.
１：リザーバー１、２：リザーバー２、３：リザーバー３、４：リザーバー４、５：遊離（吸着）反応槽、６：バルブ１、７：バルブ２、８：バルブ３、９：バルブ４、１０：トラップ１、１１：トラップ２、１２：トラップ３、１３：空気ポンプ、１４：加熱装置１、１５：バルブ操作装置、１６：磁石１、１７：磁石２、１８：磁石３、１９：廃液口、２０：回収口２１：ＤＮＡ分子量マーカー２２：増幅されたＤＮＡ断片３１：リザーバー１、３２：リザーバー２、３３：リザーバー３、３４：リザーバー４、３５：遊離（吸着）反応槽、３６：バルブ１、３７：バルブ２、３８：バルブ３、３９：バルブ４、４０：トラップ１、４１：トラップ２、４２：トラップ３、４３：空気ポンプ、４４：加熱装置１、４５：バルブ操作装置、４６：磁石１、４７：磁石２、４８：磁石３、４９：廃液口、５０：液体ポンプ、５１：加熱装置２、５２：加熱装置３、５３：加熱装置４、５４：ＰＣＲ用流路５５：回収口６１：ＤＮＡ分子量マーカー６２：増幅されたＤＮＡ断片７１：基板１７２：基板２７３：基板３７４：基板４７５：密着板１７６：密着板２７７：密着板３７８：バルブ棒Ｖ１：バルブ１Ｖ２：バルブ２Ｖ３：バルブ３Ｖ４：バルブ４Ｖ５：バルブ５Ｖ６：バルブ６Ｖ７：バルブ７Ｖ８：バルブ８Ｖ９：バルブ９Ｖ１０：バルブ１０Ｖ１１：バルブ１１Ｍ１：トラップ１Ｍ２：トラップ２Ｍ３：トラップ３Ｐ１：ポンプ接合口１Ｐ２：ポンプ接合口２Ｐ３：ポンプ接合口３Ｐ４：ポンプ接合口４Ｐ５：ポンプ接合口５Ｒ１：リザーバー１Ｒ２：リザーバー２Ｒ３：リザーバー３Ｒ４：リザーバー４Ｒ５：遊離（吸着）反応槽Ｗ１：排出口１Ｗ２：排出口２Ｗ３：回収口８１：ＤＮＡ分子量マーカー８２：増幅されたＤＮＡ断片1: Reservoir 1,2: Reservoir 2,3: Reservoir 3,4: Reservoir 4,5: Free (adsorption) reaction tank,6: valve 1,7: valve 2,8: valve 3,9: valve 4,10: Trap 1,11: Trap 2,12: Trap 3,13: Air pump,14: heating device 1,15: Valve operating device,16: Magnet 1,17: Magnet 2,18: Magnet 3,19: Waste liquid outlet,20: Collection port21: DNA molecular weight marker22: Amplified DNA fragment31: Reservoir 1,32: Reservoir 2,33: Reservoir 3,34: Reservoir 4,35: Free (adsorption) reaction tank,36: valve 1,37: valve 2,38: valve 3,39: valve 4,40: Trap 1,41: Trap 2,42: Trap 3,43: Air pump,44: heating device 1,45: valve operating device,46: Magnet 1,47: Magnet 2,48: Magnet 3,49: Waste liquid outlet,50: liquid pump,51: heating device 2,52: heating device 3,53: heating device 4,54: PCR flow path55: Collection port61: DNA molecular weight marker62: amplified DNA fragment71: Substrate 172: Substrate 273: substrate 374: Substrate 475: Contact plate 176: Contact plate 277: Contact plate 378: Valve rodV1: Valve 1V2: Valve 2V3: Valve 3V4: Valve 4V5: Valve 5V6: Valve 6V7: Valve 7V8: Valve 8V9: Valve 9V10: Valve 10V11: Valve 11M1: Trap 1M2: Trap 2M3: Trap 3P1: Pump connection 1P2: Pump connection port 2P3: Pump joint 3P4: Pump connection port 4P5: Pump connection port 5R1: Reservoir 1R2: Reservoir 2R3: Reservoir 3R4: Reservoir 4R5: Free (adsorption) reaction tankW1: outlet 1W2: outlet 2W3: Collection port81: DNA molecular weight marker82: amplified DNA fragment
【００００】[0000]
<110> Asahi Kasei Corporation<120> 核酸単離方法、核酸単離用流路、及び核酸単離用
チップ<130> X13-00335<160> 4<210> 1<211> 24<212> DNA<213> Bacillus subtilis<220><223> 枯草菌の菌株（ＡＴＣＣ６６３３）の１６ｓ ｒ
ＲＮＡに対する遺伝子の、塩基配列４５８番目のａから
４８１番目のａまでの配列。<400> 1accttgacgg tacctaacca gaaa 24<210> 2<211> 23<212> DNA<213> Bacillus subtilis<220><223> 枯草菌の菌株（ＡＴＣＣ６６３３）の１６ｓ ｒ
ＲＮＡに対する遺伝子の、塩基配列６５９番目のｔから
６８１番目のｃまでの相補鎖の配列。<400> 2gcatttcacc gctacacgtg gaa 23<210> 3<211> 24<212> DNA<213> Escherichia Coli<220><223> 大腸菌のリボゾーム蛋白質 Ｌ２５に対する遺伝
子の、塩基配列４４９番目のｃから４７２番目のｔまで
の配列。<400> 3ctaacaagtt cccggcaatc atct 24<210> 4<211> 23<212> DNA<213> Escherichia Coli<220><223> 大腸菌のリボゾーム蛋白質 Ｌ２５に対する遺伝
子の、塩基配列６２８番目のａから６５０番目のａまで
の相補鎖の配列。<400> 4tcgatgtgct gcagcttcgg ttt 23<110> Asahi Kasei Corporation <120> Nucleic acid isolation method, nucleic acid isolation channel, and nucleic acid isolation chip <130> X13-00335 <160> 4 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220><223> 16 sr of Bacillus subtilis strain (ATCC6633)
The sequence from the 458th a to the 481st a of the gene for RNA. <400> 1 accttgacgg tacctaacca gaaa 24 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220><223> 16 sr of Bacillus subtilis strain (ATCC6633)
The sequence of the complementary strand from the t at the 659th position to the c at the 681st position of the gene for RNA. <400> 2 gcatttcacc gctacacgtg gaa 23 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Escherichia Coli <220><223> Escherichia coli ribosomal protein L25 gene, the nucleotide sequence from the 449th c to the 472nd c Array up to t. <400> 3 ctaacaagtt cccggcaatc atct 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Escherichia Coli <220><223> Escherichia coli ribosomal protein L25 gene of the nucleotide sequence 628 from a to 650th Sequence of complementary strands up to a. <400> 4 tcgatgtgct gcagcttcgg ttt 23
─────────────────────────────────────────────────────フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/553 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＦ Ｆターム(参考） 2G045 DA12 DA13 DA14 FA27 FB05 HA14 4B024 AA20 BA80 CA02 CA04 CA05 CA09 CA10 CA12 HA11 HA19 HA20 4B029 AA07 AA09 AA21 AA23 BB20 CC13 FA15 HA09 HA10 4C057 BB02 BB05 DD01 MM04 MM08 MM09─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl.7 Identification code FI theme code (reference) G01N 33/553 C12N 15/00 ZNAF F term (reference) 2G045 DA12 DA13 DA14 FA27 FB05 HA14 4B024 AA20 BA80 CA02 CA04 CA05 CA09 CA10 CA12 HA11 HA19 HA20 4B029 AA07 AA09 AA21 AA23 BB20 CC13 FA15 HA09 HA10 4C057 BB02 BB05 DD01 MM04 MM08 MM09
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