【発明の詳細な説明】 遺伝子改変された樹状細胞により媒介される免疫刺激発明の技術分野 本発明は一般に組換えDNA技術に関する。詳細には、本発明は、(i)樹状細胞のインビボでの形質導入、または(ii)少なくとも１つの疾患関連抗原を機能的にコードする発現ベクターによってエクスビボで形質導入された樹状細胞の投与による、動物の免疫系の予防的または治療的刺激のために有用な組成物または方法に関する。発明の背景 疾患に関連する抗原に対する免疫系刺激は、疾患の予防のための認容されたアプローチである。従来の技術は、種々のウイルス病原から作製された死菌ワクチンまたは弱毒化生ワクチンの使用を包含した。組換えDNA技術の出現によって、ウイルス感染と戦うための、より安全なワクチンの新世代（ここで、免疫刺激物は典型的には病原によってコードされる免疫原性タンパク質である）の開発が可能となった。 これらの技術にもかかわらず、多くのウイルス疾患およびガンについては、有効な処置または予防手段はわずかしか開発されていない。近年、いくつかのグループが、遺伝子治療技術の使用による、HIVコード遺伝子産物に対する動物での免疫誘導を報告している。具体的には、HIV env/rev遺伝子をコードするレトロウイルスベクターによってエクスビボで形質導入された自己線維芽細胞を、マウス、非ヒト霊長類、およびヒトに注射して、これらの抗原に対する免疫応答を誘導した。Warnerら、1991；Laubeら、1993；およびZeignerら、1994を参照のこと。 しかし、このようなエクスビボのアプローチは、個別の産物（すなわち形質導入された自己細胞）を各患者ごとに作製しなければならないので、大規模なワクチン接種プログラムのためには実用的ではない。エクスビボのアプローチのこのような欠点および他の欠点を克服するために、疾患特異的免疫原の発現を指向する発現ベクターを保有する遺伝子送達ビヒクルを患者に直接投与する、インビボ技術の開発が企てられている。WO 91/02805、WO 93/10814、WO 93/15207、WO 94/O6921、WO 94/21792、およびWO 95/07994を参照のこと。Irwinら(1994)は、マウス、アカゲザル、およびヒヒへの組換えレトロウイルスの筋肉内注射の後の、特定の免疫原に対する免疫誘導を報告した。疾患関連抗原に対する改良された免疫刺激を可能とする組成物および方法が必要とされている。発明の要旨 本発明の目的は、哺乳動物、特にヒトを包含する動物の免疫予防的または免疫治療的処置のための組成物および方法を提供することにある。本発明の組成物は、ガンのような疾患に対して、あるいは細菌性、寄生虫性、またはウイルス性の感染対して動物を免疫するために、動物に免疫原（すなわち、疾患関連抗原）を送達するために使用され得る。このような免疫は、(i)遺伝子送達ビヒクルによって送達される発現ベクターによってコードされ、次いでインビボで抗原提示細胞(APC)の表面上で発現および提示される免疫原、または(ii)エクスビボでこのような発現ベクターによって形質導入されたAPC（特に、樹状細胞）の表面上に提示される免疫原に対する、細胞性免疫応答の発生の結果である。 本発明の１つの局面は、インビボまたはインビトロであれ、樹状細胞を標的とする遺伝子送達ビヒクルに関する。このような遺伝子送達ビヒクルは、樹状細胞標的エレメントおよび少なくとも１つの疾患関連抗原の発現を指向する発現ベクターを含む。１つの実施態様において、発現ベクターは組換えウイルスによって保有される。組換えウイルスは本発明の実施において有用であり、DNAウイルスおよびRNAウイルスの両方を包含する。好ましい実施態様において、組換えウイルスは、マイナス鎖RNAウイルスまたはプラス鎖RNAウイルスのいずれか由来のものである。組換えウイルスが由来し得るプラス鎖RNAウイルスの例としては、レトロウイルス類（例えば、ニワトリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、メイソン−パイツァーサルウイルス、ヒヒ内因性ウイルス、ネコ内因性レトロウイルス、テナガザル白血病ウイルス、HIV I、HTLV I、およびHTLV III）、特にマウスレトロウイルス類、トガウイルス類、例えば、アルファウイルス類、特にシンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス、ピコルナウイルス類、ならびにコロナウイルス類が挙げられ、レトロウイルス類およびアルファウイルス類由来のものが好ましい。組換えウイルスが由来し得るマイナス鎖RNAウイルスの例としては、ラブドウイルス類（例えば、水疱性口内炎ウイルス）、ミクソウイルス類、パラミクソウイルス類、オルトミクソウイルス類（例えば、インフルエンザウイルス）、およびブニアウイルス類が挙げられる。本発明の実施において有用な組換えウイルスが由来し得る有用なDNAウイルスは、アデノウイルス類およびアデノ随伴ウイルス類を含む。 他の実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは非ウイルス性の遺伝子送達ビヒクルである。すなわち、発現ベクターはウイルスによって保有されていない。この発現ベクターはDNAまたはRNAのいずれかであり、そして線状または環状であり得る。特に好ましい発現ベクターは、真核生物層状(layered)ベクター開始系である。１つの実施態様において、発現ベクターは１つ以上のポリヌクレオチド凝集剤(condensing agent)と複合体を形成する。ポリヌクレオチド凝集剤はポリカチオンを包含する。好ましいポリカチオンとしては、ポリリジン、ポリアルギニン、ヒストン、プロタミン、スペルミジン、およびスペルミンが挙げられ、ポリリジンが特に好ましい。別の実施態様において、発現ベクターは、樹状細胞標的エレメントのみと複合体を形成する。さらに別の実施態様において、発現ベクターは脂質と会合し、好ましくはリポソーム（特にカチオン性脂質で構成されるリポソーム）中にカプセル化されている。 遺伝子送達ビヒクルが樹状細胞を標的とする場合、樹状細胞標的エレメントは、遺伝子送達ビヒクルを樹状細胞に標的する任意の分子であり得る。種々の実施態様は、樹状細胞標的エレメントが、高親和性結合対、樹状細胞表面マーカーに対して反応性の抗体、および樹状細胞表面マーカーに対して反応性の抗体由来の抗原結合ドメインからなる群から選択される実施態様を包含する。好ましい高親和性結合対としては、ビオチン／アビジン、シトスタチン／パパインおよびホスホネート／カルボキシペプチダーゼＡからなる群から選択されるものを含む。好ましい樹状細胞表面マーカー（これに対して抗体（または抗体由来の抗原結合ドメイン）が生じて樹状細胞標的エレメントを生成する）としては、CD11c、CD54、CD58、CD25、CD11a、CD23、CD32、CD40、CD1、CD45、MHCクラスＩ、MHCクラスII、Mac-1、Mac-2、およびMac-3が挙げられる。他の実施態様において、樹状細胞標的エレメントはハイブリッドエンベロープタンパク質であり、ここでエンベロープ部分はウイルスエンベロープタンパク質（例えば、レトロウイルスエンベロープタンパク質）由来であり、そして樹状細胞標的エレメントは、樹状細胞原形質膜上に提示される分子と特異的に相互作用するタンパク質由来である。 本発明の発現ベクターは少なくとも１つの疾患関連抗原の発現を指向する。そのような抗原は好ましくは、ガン、過剰増殖性疾患、細菌感染、寄生虫感染、およびウイルス感染からなる群から選択される疾患に関連する。本明細書中に記載される免疫刺激組成物および方法を用いて処置、抑制、または予防され得るガンとしては、とりわけ、乳ガン、大腸ガン、メラノーマ、肺ガン、脳ガン、および白血病が挙げられる。処置、抑制、または予防され得る細菌感染としては、とりわけ、肺炎、敗血病、結核、およびブドウ球菌感染症(staph infections)が挙げられる。処置され得る寄生虫感染としては、とりわけ、マラリア（Plasmodium属の原虫（P.falciparum、P.malariae、P.ovale、およびP.vivaxを包含する）によって引き起こされる）、睡眠病（トリパノソーマによって引き起こされる）、および眼オンコセルカ症を引き起こす感染が挙げられる。本明細書中に記載される組成物および方法を用いて処置、抑制、または予防され得るウイルス感染としては、とりわけ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、非Ａ非Ｂ肝炎、デルタ型肝炎因子(hepatitis delta agent)、CMV、エプスタイン・バールウイルス、HTLV I、HTLV II、およびHIV Iによって引き起こされる感染が挙げられる。 １つの実施態様において、発現ベクターは１つの疾患関連抗原をコードする。他の実施態様において、発現ベクターは複数の疾患関連抗原（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または10以上の抗原）をコードする。複数の疾患関連抗原が１つの発現ベクターによってコードされる場合、それらの抗原は同じ疾患または異なる疾患に関連し得る。あるいは、他の発現ベクターでコードされる疾患とは異なる疾患に関連する１つ以上の抗原を各々コードする発現ベクターの組み合わせを含む組成物もまた調製され得る。異なる疾患に関連する１つ以上の抗原をコードする組成物がワクチンとして特に有用である。 本発明の本局面のさらに別の実施態様において、発現ベクターはまた免疫調節補因子をコードする。 本発明の好ましい実施態様は、本発明の種々の遺伝子送達ビヒクルおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物に関する。特に好ましい実施態様としては、薬学的組成物が固体形態である実施態様が挙げられる。 本発明の第２の局面は、遺伝的に改変された樹状細胞を産生するためのインビボの方法に関する。そのような方法は、樹状細胞を標的とする遺伝子送達ビヒクルを動物に投与する工程を包含し、ここで遺伝子送達ビヒクルは樹状細胞標的エレメントおよび少なくとも１つの疾患関連抗原の発現を指向する発現ベクターを含む。 関連する局面において、予防方法が提供される。１つの実施態様において、予防は、予防有効量の本発明による遺伝子送達ビヒクルを動物に投与することによって達成される。別の実施態様において、予防は、疾患関連抗原の少なくとも抗原性部分をコードする遺伝子の発現を指向するに十分な遺伝情報をコードする発現ベクターを保有する遺伝子送達ビヒクルによってエクスビボで形質導入された、予防有効量の樹状細胞集団を動物に投与することによって達成される。 本発明のさらに別の関連する局面において、疾患の治療的処置（予防ではなく）のための方法が提供される。１つの実施態様において、治療的処置は、樹状細胞を標的とする治療有効量の遺伝子送達ビヒクルを動物に投与することによって達成される。ここで遺伝子送達ビヒクルは、疾患関連抗原の少なくとも抗原性部分をコードする遺伝子の発現を指向するに十分な遺伝情報をコードする発現ベクターを保有する。別の実施態様において、治療的処置は、疾患関連抗原の少なくとも抗原性部分をコードする遺伝子の発現を指向するに十分な遺伝情報をコードする発現ベクターを保有する遺伝子送達ビヒクルによってエクスビボで形質導入された、治療有効量の樹状細胞集団を動物に投与することによって達成される。 このような動物の予防または処置方法は、遺伝子送達ビヒクル、あるいは、単回または複数回エクスビボで形質導入された樹状細胞集団の、一度の直接注射によって達成され得る。別の実施態様において、この方法は、本発明の遺伝子送達ビヒクル、あるいはエクスビボで形質導入された樹状細胞集団を、ほとんど同時に複数部位へ投与することを包含する。好ましい投与経路は、静脈内経路および皮下経路を包含する。このような方法による予防的処置に好ましい動物は、鳥類、哺乳動物、および魚類を包含する。特に好ましい哺乳動物は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、およびヒツジからなる群から選択される哺乳動物を包含する。 本発明のさらに別の局面は、遺伝的に改変された樹状細胞を生産するエクスビボの方法に関する。１つの実施態様において、このような方法は、樹状細胞から実質的に構成される（すなわち、約50％を超える樹状細胞、より好ましくは約75％を超える樹状細胞、より好ましくはさらに約90％を超える樹状細胞であり、約95％を超える樹状細胞が特に好ましい）細胞の集団を得る工程、および本発明の遺伝子送達ビヒクルの導入によってこの細胞集団を遺伝的に改変する工程を包含する。別の実施態様において、この方法は、樹状細胞を含む細胞の第１集団を得る工程、本発明の遺伝子送達ビヒクルの導入によってこの細胞の第１集団を遺伝的に改変する工程、および樹状細胞から実質的に構成される細胞の第２集団を遺伝的に改変された細胞の第１集団から部分的に単離する工程を包含する。樹状細胞から実質的に構成される細胞集団を単離する好ましい方法としては、アフィニティークロマトグラフィーおよびFACSが挙げられる。図面の簡単な説明 図１は、樹状細胞を同定するために有用ないくつかの細胞表面マーカーを示す。（−）で示されるマーカーは樹状細胞上に存在しないので、ネガティブ選択ストラテジーにおいて使用され得る。（＋）で示されるマーカーは樹状細胞上に存在し、(++)および(+++)は特に有用な樹状細胞マーカーを示す。（＋）、（++）、および（+++）樹状細胞マーカーはまた、本発明の遺伝子送達ビヒクルが標的し得る適切な標的を示す。 図２のフローチャートは、パーコール密度勾配を用いる脾細胞分離ストラテジーを示す。 図３は、CT26.p24に対する樹状細胞治療の効果を示す。Balb/cマウスに総量で２×105の腫瘍細胞を注射した。８日目、15日目、および22日目に図中に示すように動物を処置した。マウスの腫瘍体積を１週間に２回測定した。 図４は、JC.p24に対する樹状細胞治療の効果を示す。Balb/cマウスに総量で３×105の腫瘍細胞を注射した。８日目、15日目、および22日目に図中に示すように動物を処置した。マウスの腫瘍体積を１週間に２回測定した。 図５は、JC.p24に対する樹状細胞免疫の効果を示す。Balb/cマウスを、p24で２回（１週間の間をおいて）形質導入した日臓樹状細胞で免疫し、次に３×105の腫瘍細胞を注射した。マウスの腫瘍体積を１週間に２回測定した。 図６は、BM-DC.p24による単回の免疫の後の、JC.p24に対する樹状細胞免疫の効果を示す。Balb/cマウスを、BM-DC.p24で１回免疫した。１週間後、このマウスに総量で３×105の腫瘍細胞を注射した。マウスの腫瘍体積を１週間に２回測定した。 図７は、JC.p24に対する樹状細胞免疫の効果を示す。Balb/cマウスを、D2SC/1.β-galおよびD2SC/1.p24で１日目および８日目に処置した。次に、このマウスに総量で３×105の腫瘍細胞を15日目に注射した。マウスの腫瘍体積を１週間に２回測定した。 図８は、CT26.p24に対する樹状細胞免疫の効果を示す。Balb/cマウスを、１日目および７日目に図の説明に記載されたワクチンで免疫した。15日目に、この動物に総量で２×105の腫瘍細胞を注射した。マウスの腫瘍体積を１週間に２回測定した。 図９は、樹状細胞に抗原を導入する方法間の比較を示す。これは、レトロウイルスベクターをタンパク質またはペプチドローディングに対して比較する。Balb/cマウスを図の説明に記載されたワクチンで１日目および７日目に免疫した。８日目に、この動物に総量で２×105のCT26.β-gal腫瘍細胞を注射した。マウスの腫瘍体積を１週間に２回測定した。用語の定義 以下の用語を明細書全体を通して使用する。特に指示のない限り、これらの用語は以下のように定義される： 「遺伝子送達ビヒクル」は、１つ以上の問題の遺伝子または配列を宿主細胞中に送達（および好ましい実施態様においては発現）し得る構築物をいう。このようなビヒクルの代表例としては、ウイルスベクター、裸のDNAまたはまたはRNA発現ベクター、カチオン性凝集剤と会合したDNAまたはRNA発現ベクター、リポソーム中にカプセル化されたDNAまたはRNA発現ベクター、およびある種の真核生物細胞(例えば、プロデューサー細胞)）が挙げられる。本発明の好ましい実施態様の範囲内において、遺伝子送達ビヒクルは、標的エレメント（例えば、その遺伝子送達ビヒクルに共有結合するか、その遺伝子送達ビヒクル上で発現するか、またはその遺伝子送達ビヒクルの外側の必須部分として含まれる、高親和性結合対のメンバー）を含む。 「高親和性結合対」は、10-yＭ未満のＫDで互いに結合することができる分子の一組を意味し、ここでｙは８、９、10、11、12、13、14および15からなる群から選択される。本明細書中で使用される「ＫD」は、反応Ａ＋Ｂ＝ＡＢの解離定数を意味し、ここでＡおよびＢはこの高親和性結合対のメンバーである。当該分野において理解されるように、２つの分子の親和性が高まるにつれ、ＫDは減少する。親和性定数は、例えばScatchard分析（Scatchard，Ann．N.Y．Acad．Sci．51:660-672，1949参照）による技術を包含する種々の技術によって容易に決定され得る。適切な親和性結合対の代表例としては、ビオチン／アビジン、シトスタチン／パパイン、およびホスホネート／カルボキシペプチダーゼＡが挙げられる。 「標的エレメント」は、樹状細胞に特異的に結合し得る分子を意味する。本発明の内容においては、標的エレメントおよびその補体の結合の後にその細胞型において生物学的影響が見られる場合、あるいは樹状細胞と結合した標的エレメントと非標的細胞との結合の間に、10倍を超える相違、好ましくは25、50または100倍を超える相違がある場合、標的エレメントは樹状細胞に特異的に結合すると考えられる。一般に、標的エレメントは樹状細胞に、ＫDが（前出のScatchard分析で決定して）10-5Ｍ未満、好ましくは10-6Ｍ未満、より好ましくは10-7Ｍ未満、そして最も好ましくは10-8Ｍ未満で結合することが好ましい。さらに、高親和性結合対を標的のために使用する場合、標的エレメントは、好ましくは、高親和性結合対の親和性定数より少なくとも１log（すなわち10倍）少ない親和性で樹状細胞に結合する。適切な標的エレメントは、好ましくは、非免疫原性であり、タンパク質分解によって分解されず、そして免疫系によって除去されないものである。特に好ましい標的エレメントは、好ましくは、動物中で（清澄化剤(clearing agent)の非存在下で）10分間から１週間の間の半減期を有する。適切な標的エレメントの代表例をより詳細に後述する。 「樹状細胞を標的する」は樹状細胞を標的する方法をいう。そのような方法は以下のように定義される：遺伝子送達ビヒクルは、従来の多数の様式のうちの任意の様式での投与の後に、遺伝子送達ビヒクルがそのエレメントを欠く場合に起こる形質導入と比較して、樹状細胞の形質導入の増加を引き起こすエレメントを有する；あるいは、通常または従来の投与経路と比較して樹状細胞の形質導入が増強されるような特定の様式または特定の経路で、遺伝子送達ビヒクルが投与される。 「清澄化剤」は、循環する結合した標的エレメントに結合および／または架橋する分子を意味する。好ましくは、清澄化剤は、非免疫原性であり、結合した標的エレメントに特異的であり、そして迅速な腎クリアランスを避けるに十分に大きい。さらに、清澄化剤は好ましくはタンパタ質分解で分解されず、そして免疫系によって除去されない。特に好ましい清澄化剤としては、結合した標的エレメントに親和性結合メンバーとは異なる部位で結合するものが挙げられ、そして最も好ましくは、その標的への標的エレメントの結合をブロックするように結合するものである。本発明の内容において数多くの清澄化剤が使用され得、例えば、Marshallら、Brit．J．Cancer 69:502-507、1994に記載のものが挙げられる。 「発現ベクター」は、疾患関連抗原をコードする１つ以上の遺伝子の発現を指向し得る組換え核酸分子(DNAまたはRNA)をいう。発現ベクターは、抗原をコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーター（その発現ベクターが、機能的プロモーターに隣接した位置特異的組み込みのために設計されている場合を除いて）、およびポリアデニル化配列を含まなければならない。特定の実施態様において、発現ベクターはプラスミド構築物の一部である。発現ベクター成分に加えて、プラスミド構築物はまた、以下のうちの１つ以上を含み得る：細菌性複製起点；１つ以上の選択マーカー；プラスミド構築物を一本鎖DNAとして存在させるシグナル（例えば、M13複製起点）；マルチクローニングサイト；および「哺乳動物」複製起点（例えば、SV40またはアデノウイルス複製起点）。他の実施態様において、発現ベクターは組換えウイルスゲノムであり、そして用いられる特定のウイルス系に依存してRNAまたはDNAのいずれかである。あるいは、発現ベクターは、インビトロで転写されるRNAを含み得る。本明細書において用いられる「発現ベクター」はまた、細胞中に導入した後、異なる形態に変換されるベクターをいう。例えば、組換えレトロウイルスを保有するRNAゲノムはDNAに逆転写され、そして細胞のゲノム中に組み込まれる。本発明の目的のためには、RNAおよびDNAの両方の形態が「発現ベクター」である。 「変質細胞成分(altered cellular component」は、通常、細胞を腫瘍形成性にすることに関連するか、あるいは腫瘍形成細胞に関連するが、細胞を腫瘍形成性にするために必要とされるわけではなく必須であるわけでもない、タンパク質および他の細胞構成要素をいう。変質の前、この細胞成分は、正常な細胞増殖および調節に必須であり得、そして例えば、細胞内タンパク質分解、転写調節、細胞周期制御、および細胞−細胞相互作用を調節するタンパク質を含む。変質の後、この細胞成分はもはやその通常の調節機能を果たさず、それゆえ細胞は非制御的増殖を経験し得る。変質細胞成分の代表例としては、ras*、p53*、Rb*、ウィルムス腫瘍遺伝子でコードされる変質タンパク質、ユビキチン*、ムチン*、DCC、APC、およびMCC遺伝子でコードされるタンパク質、ならびにレセプターまたはレセプター様構造、例えばneu、チロイドホルモンレセプター、血小板由来成長因子(PDGF)レセプター、インスリンレセプター、上皮成長因子(EGF)レセプター、およびコロニー刺激因子(CSF)レセプターが挙げられる。これらならびに他の細胞成分はより詳細に後述され、引用参考文献にも説明されている。 「非腫瘍形成性」は、ヌードマウスにおいて細胞形質転換を引き起こさず、または腫瘍形成を誘導しない変質細胞成分をいう。腫瘍形成細胞成分を非腫瘍形成細胞成分と識別する代表的なアッセイをより詳細に後述する。 本発明において使用される「免疫原性」は、適当な条件下で免疫応答を引き起こし得る変質細胞成分のことをいう。この応答は細胞性でなければならず、そして体液性応答を包含し得る。免疫原性を決定するために使用され得る代表的なアッセイをより詳細に後述する。 本発明の数多くの局面および利点は、本発明の実施の説明を提供する以下の詳細な説明を考慮すると、当業者に明らかである。発明の詳細な説明 本発明は、樹状細胞における少なくとも１つの疾患関連抗原の発現および細胞表面提示を、その抗原が関連する疾患に対する予防的または治療的免疫応答を生じさせるために使用し得るという発見に基づく。さらに、遺伝的に改変された樹状細胞によって媒介される免疫系刺激の効率が、遺伝的に改変された線維芽細胞、筋肉、および他の細胞型によって媒介される免疫系刺激の効率より数桁高い大きさであり得るということが発見された。その結果、これらの発見は、所望の予防的または治療的結果を達成するために必要とされる投薬量を低減すること、あるいは免疫応答を増強することのいずれかによる、遺伝子治療媒介免疫刺激への改善されたアプローチを可能とする。 免疫刺激ストラテジーを用いる処置に適した疾患としては、HBV（WO 93/15207参照）、HCV（WO 93/15207参照）、HPV（WO 92/05248、WO 90/10459、EPO 133,123参照）、エプスタインバーウイルス(EPO 173,254；JP 1,128,788；および米国特許第4,939,088号、および同5,173,414号参照）、ネコ白血病ウイルス（WO 93/09070、EPO 377,842、WO 90/08832、およびWO 93/09238参照）、ネコ免疫不全ウイルス（米国特許第5,037,753号、WO 92/15684、WO 90/13573、およびJP 4,126,085)、HTLV IおよびII、ならびにHIV（WO 91/02805参照）によって引き起こされるようなウイルス感染；メラノーマ、子宮頚ガン、直腸ガン、腎臓ガン、乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、白血病のようなガン；および心疾患が挙げられる。 樹状細胞は、免疫応答を開始するように機能する抗原提示細胞の系である（Steinman，R.(1991)、Annu．Rev．Immunol.，9巻:272-296；Research in Immunology，140巻、International Reviews in Immunology、6巻、Advances in Immunology，47巻、およびEpidermal Langerhans Cell、G．Shuler編もまた参照のこと）。樹状細胞は、多くの非リンパ系組織中に見出されるが、求心性リンパ流または血流を介して、リンパ系器官のＴ依存性領域に移動し得る。非リンパ系器官において、樹状細胞はランゲルハンス細胞および間質樹状細胞を包含する。リンパ液および血液において、樹状細胞は、それぞれ、求心性リンパベール細胞(afferent lymph veiled cell)および血液樹状細胞を包含する。樹状細胞は遠心性リンパ液中には見出されない。リンパ系器官において、樹状細胞はリンパ系樹状細胞および相互鉗合（interdigitating）細胞を包含する。本発明の文脈において用いられる場合、特に指示のない限り、これらの細胞型およびその前駆体の各々を「樹状細胞」と呼ぶ。 樹状細胞は、独特の樹状形状を有し、運動性であり、そして細胞表面刺激に特異的なＴ細胞を効率的にクラスター形成および活性化させる。典型的には、ランゲルハンス細胞および間質細胞のような非リンパ系器官中の樹状細胞は、求心性リンパ中および血中でベール細胞（連続的に広がり、そして大きな膜状仮足を退縮する細胞）となり、これはリンパ系組織に移動し、ここで樹状細胞または相互鉗合細胞として単離され得る。 上皮ランゲルハンス細胞の部分的に富化された集団（ここでランゲルハンス細胞は総細胞集団の約60％までを構成し得る）は容易に調製され得る。なぜならα-thy-1（モノクローナル抗体）および補体と付着とを用いて、マウス組織からケラチノサイトを枯渇させ得るからである。ヒトランゲルハンス細胞の富化調製物は、α-thy-1を抗CD-1抗体で置換することによって調製され得る。培養中、１〜３日培養の後までは、マウスランゲルハンス細胞およびヒトランゲルハンス細胞のいずれも活性な抗原提示細胞ではない。この期間の後、血中およびリンパ系の樹状細胞に完全に類似して、これらの細胞は増大し、より多くのMHCクラスIIおよび細胞付着分子を発現し、そしてFcレセプターを失う。ヒトの血液から、90％を超える樹状細胞を含む細胞集団が得られ、ここで富化なしで0.1％未満の白血球が樹状細胞である。このような富化は、Ｔ細胞、単球、およびＢ細胞プラスＮＫ細胞を連続的に枯渇させることによって達成され得、30〜60％の範囲の樹状細胞の初期集団を生じる。次いで、不純物と選択的に反応するモノクローナル抗体（特に、CD45RAへの）を用いるパニングまたはFACSによって、より高い純度が得られる（Freudenthal，P、Steinman、R.M.，Proc．Nat'l．Acad．Sci．(USA)(1990)87：7698-7702）。一般に樹状細胞を富化するために、低い浮遊密度、培養中のプラスチックに非付着性であること（特に１日以上後）、および他の細胞上で見出されるマーカーの非存在についての選択が行われる。そのような方法は、他の細胞型を枯渇させるが、樹状細胞を積極的に選択しない。 樹状細胞は、その細胞膜上に識別可能なパターンのマーカーを発現する。図１は、いくつかの異なる細胞表面マーカーの存在または非存在を示すことによってこのパターンを図示する。樹状細胞をポジティブまたはネガティブに選択するために使用され得る他のマーカーとしては、ICAM-1(CD54)、LFA-3(CD58)、およびCD11bが挙げられる。ヒトまたはマウスの血液から単離されるが皮膚からは単離されない樹状細胞は、CD11aおよびLFA-1を発現する。皮膚においては、樹状細胞の免疫刺激効果は、サイトカイン（特にGM-CSF）によって増強され得る。 樹状細胞は、静止状態のリンパ球からのＴ依存性応答を開始させる。一旦感作すると、Ｔ細胞は他の抗原提示細胞と相互作用する。樹状細胞抗原プロセシング活性が調節される。皮膚またはリンパ系器官から単離された新鮮な細胞（すなわち１日未満の間、培養された細胞）のみが天然のタンパク質を提示する。この期間の後、この細胞は抗原をプロセシングしない。さらに、樹状細胞は活動的に食作用性ではない。 遺伝子治療媒介免疫刺激は種々の方法で達成され得る。例えば、疾患関連抗原またはその改変形態（本明細書中以下、集合的に「抗原」とよぶ）をコードする発現ベクターを樹状細胞に送達して、その抗原に対する免疫応答を開始させ得る。抗原の発現は一過性であり得、またはある時間にわたって安定であり得る。免疫応答が病原性因子（例えば、ウイルス、細菌、もしくは新生物性、またはさもなければ他の疾患性の自己細胞）によって刺激されるべき場合、発現ベクターは好ましくは、抗原の改変形態（天然抗原と比較して病原性が低減されているが、それでもなおそれに対する免疫応答を刺激する）をコードする。 ウイルス感染によって引き起こされる特定の疾患（例えば、HIVによって引き起こされるAIDS）の場合、発現ベクターによってコードされる免疫刺激発現産物は、HLAクラスI-拘束免疫応答またはクラスII-拘束免疫応答のいずれかあるいは両方を誘発する形態である。HIVについては、免疫刺激のための好ましい抗原は、好ましくはgp160、gp120、およびgp41から選択されるエンベロープタンパク質由来であり、これは、病原性を低減するために（特にシンシチウムの可能性を低減するため、疾患増強免疫応答に導くエピトープの発現を避けるため、免疫優性であるが株特異的なエピトープを除去するため、またはいくつかの株特異的エピトープを提示するために）改変されている。この目的のために発現され得る他のHIV遺伝子または遺伝子の組み合わせとしては、gag、pol、rev、vif、nef、prot、gag/pol、gag protなどが挙げられる。これに加えて、他の所望の抗原由来の免疫原性部分が発現され得る。所望の抗原の免疫原性部分は長さが変更されてもよく、好ましくは少なくとも９アミノ酸であり、そしてタンパク質全体を含み得る。当業者が理解するように、このアプローチおよび同様の免疫刺激アプローチは、数多くの疾患の処置に使用され得る。 さらなる実施態様において、発現ベクターは、疾患関連抗原の１つ以上の免疫原性部分をコードする少なくとも１つの目的の遺伝子の発現を導く。本明細書において用いられる場合、目的の遺伝子は免疫刺激を可能にする少なくとも１つの産物をコードする。「疾患関連」抗原は、細胞（または器官）を罹患させることに関連するか、あるいは疾患状態に一般的に関連するが細胞を罹患させるために必要とはされない抗原である。広範な種々の「疾患関連」抗原が公知であり、これらには、通常は腫瘍細胞に関連する免疫原性の非腫瘍形成性変質細胞成分が含まれる（WO 93/10814参照）。細胞性免疫応答に対応する腫瘍関連抗原（例えば、MAGE-1、MAGE-3、MART-1、およびgp100）もまた本明細書中で用いられる「疾患関連抗原」に包含される。「疾患関連」抗原が、種々の真核生物、原核生物、またはウイルス性の病原の全体または一部を包含することもまた理解される。さらに詳細にはWO 93/10814を参照のこと。 上記の産物をコードする核酸分子、ならびに本発明において使用するのに有利である他の核酸分子は、種々の供給源（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクションのような寄託機関）から、あるいはBritish Bio-Technology Limited（Cowley、Oxford England）のような商業的な供給源から容易に入手され得る。あるいは本発明で使用するためのcDNA配列は、その配列を発現するかまたは含む細胞から、例えば、単離されたmRNAからのRT PCRによって得られ得る。本発明で使用するに適した核酸分子はまた、その全体または一部が、例えばApplied Biosystems Inc.のDNA合成機（例えばABI DNA合成機モデル392（Foster City、CA）上で合成され得る。 Ａ．遺伝子送達ビヒクル 遺伝子送達ビヒクル（「GDV」）は、核酸分子、具体的には発現ベクターを真核生物細胞に送達し得る組成物である。遺伝子送達ビヒクルの代表例としては、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス；WO 89/09271参照、およびシンドビスのようなアルファウイルス；WO 95/07994参照）、他の組換えおよび非組換えのウイルス系（例えば、アデノウイルス；WO 93/19191参照）、１以上の凝集剤と会合した核酸分子（WO 93/03709参照）、リポソームと会合した核酸分子（Wangら、PNAS 84：7851、1987）、改変されたバクテリオファージ、または細菌が挙げられる。どのような形態であっても、GDVは標的細胞中で少なくとも１つの疾患関連抗原の発現を指向する発現ベクターを保有する。 １つの実施態様において、GDVは、アストロウイルス（astrovirus）、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、パポーバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、トガウイルス、またはアデノイウルイスのようなウイルス由来の組換えウイルスである。好ましい実施態様において、組換えウイルスベクターは、組換えレトロウイルスベクターである。レトロウイルスGDVは、例えばＢ、ＣおよびＤ型のレトロウイルスを含む広範な種々のレトロウイルス、ならびにスプマウイルス(spumavirus)およびレンチウイルスから容易に構築され得る(RNA Tumor Viruses、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、1985)。このようなレトロウイルスは、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC，Rockville，MD)のような寄託機関またはコレクションから容易に入手し得、または公知の供給源から一般に利用可能な技術を用いて単離され得る。本発明の実施において使用され得る数多くのレトロウイルスGDVは、米国特許第5,219,740号および同第4,777,127号、EP345,242およびWO 91/02805に記載されている。 特に好ましい組換えレトロウイルスは、ニワトリ白血病ウイルス（ATCC番号VR-535およびVR-247）、ウシ白血病ウイルス（VR-1315）、マウス白血病ウイルス(MLV)、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス(Kochら、J．Vir．49:828、1984；およびOliffら、J．Vir．48:542、1983)、マウス肉腫ウイルス(ATCC番号VR-844、45010および45016)、細網内皮症ウイルス(ATCC番号VR-994、VR-770および45011)、ラウス肉腫ウイルス、メイソン−パイツァーサルウイルス、ヒヒ内因性ウイルス、ネコ内因性レトロウイルス(例えば、RD114)、テナガザル白血病ウイルス(GALV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、HTLV I、HTLV III、およびレトロウイルスベクターとして使用されるマウスまたはラットのgL30配列を包含するレトロウイルス由来である。組換えレトロウイルスを生成し得る特に好ましいMLVの株としてはが挙げられる。特に好ましい非マウスレトロウイルスはラウス肉腫ウイルスである。好ましいラウス肉腫ウイルスとしてはが挙げられる。 本明細書で提供される開示および標準的な組換え技術があれば、上記の任意のレトロウイルスが、レトロウイルスGDVを作製または構築するために容易に使用され得る。さらに、レトロウイルスGDVの一部分は、異なるレトロウイルス由来であり得る。例えば、組換えレトロウイルスは、マウス肉腫ウイルス由来のLTR、ラウス肉腫ウイルス由来のtRNA結合部位、MLV由来のパッケージングシグナル、およびニワトリ白血病ウイルス由来の第２鎖合成起点を含み得る。これらの組換えレトロウイルスベクターを使用して、適当なパッケージング細胞株中にこれらの組換えレトロウイルスベクターを導入することによって、形質導入受容性のレトロウイルスベクター粒子を生成し得る（WO 92/05266参照）。さらに、宿主細胞DNAの特定の領域中への組換えレトロウイルスゲノムの位置特異的組み込みを指向する組換えレトロウイルスが生産され得る。このような部位特異的組み込みは、レトロウイルス粒子中に組み込まれたキメラインテグラーゼによって媒介され得る。例えば、WO 96/06727を参照のこと。組換えウイルスベクターは複製欠損組換えウイルスであることが好ましい。 別の実施態様において、GDVはトガウイルス由来である。好ましいトガウイルスとしては、アルファウイルス、特に共有に係るWO 95/07994に記載のアルファウイルスが挙げられる。代表的なアルファウイルスはシンドビスウイルスである。簡単に述べれば、組換えシンドビス発現ベクターは、代表的には、シンドビスウイルス転写を開始し得る５’配列、シンドビス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、改変または不活性化されたウイルス接合領域、シンドビスRNAポリメラーゼ認識配列、少なくとも１つの目的の遺伝子、およびポリアデニル化区域(tract)を含む。他のアルファウイルス由来の対応領域を上記の領域の代わりに使用し得る。 好ましい実施態様において、組換えアルファウイルスベクターは構造タンパク質をコードせず、そして目的の遺伝子はウイルス接合領域の下流に位置する。第２のウイルス接合領域を有するベクターにおいて、目的の遺伝子は第２のウイルス接合領域の下流に位置し得る。このような場合、ベクターはウイルス接合領域と目的の遺伝子との間に位置するポリリンカーをさらに含み得る。 本発明において使用され得る他の組換えトガウイルスベクターとしては、セムリキ森林ウイルス(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、ミッデルブルグウイルス(ATCC VR-370)、ロスリバーウイルス（ATCC VR-373；ATCC VR-1246）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR-1249；ATCC VR-532）由来のベクター、ならびに米国特許第5,091,309号、同第5,217,879号、およびWO 92/10578に記載のベクターが挙げられる。上記の組換えシンドビス発現ベクター、ならびに多くの同様のベクター構築物は、本質的にWO 95/07994に記載されるようにして容易に調製され得る。 別の実施態様において、組換えウイルスベクターは組換えアデノウイルスベクターである。そのような発現ベクターは、本明細書で提供される開示があれば容易に調製および使用され得る（Berkner、Biotechniques 6:616、1988、およびRosenfeldら、Science 252:431、1991、WO 93/07283、WO 93/06223、およびWO 93/07282参照のこと）。 本発明での使用に適した他のウイルスベクターとしては、例えば、由来のベクターが挙げられる。 本発明の別の実施態様において、GDVは、DNAまたはRNA発現ベクターを含む。そのようなGDVの代表例としては、プラスミド、コスミド、および線状の2本鎖および１本鎖ポリヌクレオチドが挙げられる。このようなベクターは、樹状細胞中で疾患関連抗原を発現させるために必要とされる遺伝情報、すなわち、プロモーター、その疾患関連抗原をコードするオープンリーディングフレーム、転写停止シグナル、およびポリアデニル化シグナルを含む。このようなポリヌクレオチド系の１つの利点は、大量の所定の遺伝子送達ビヒクルを容易に生産し得ることである。当該分野で公知の任意の種々の技術のいずれかを用いて、インビトロ転写によって大量のRNAが生産され得る。同様に、大量のDNAが細菌中で容易に培養され得る。 関連の実施態様において、GDVは凝集剤（例えばポリカチオン）と会合したDNAまたはRNA発現ベクターを含む。ポリカチオンは、負に荷電したホスフェート骨格をマスクすることによって発現ベクターを凝集させ、分子をよりコンパクトな形態に折り畳ませる。本発明のこの実施態様において有用なポリカチオンとしては、とりわけ、ポリリジン、ポリアルギニン、ヒストン、プロタミン、スペルミジン、スペルミン、および他の高度に塩基性のタンパク質またはポリペプチドが挙げられる。このようなポリカチオンは修飾されて、標的エレメントを取り込み得、そして／または核酸／ポリカチオン複合体の免疫原性を減少させ得る。例えば、ポリカチオンは１つ以上のポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール）と化学結合し得る。あるいは（またはそれに加えて）、ポリカチオンは１つ以上の多糖類と結合し得る。簡単に述べれば、化学結合は、ポリカチオンとポリアルキレンまたは多糖類との間の共有結合の形成を伴う。そのような結合を作製するための多くの適切な方法が当該分野で公知である。例えば、共有に係るWO 96/21036を参照のこと。 別の実施態様において、GDVはリポソームに会合したDNAまたはRNA発現ベクターである。リポソームは小さい脂質小胞であり、脂質二重層で包囲された水性コンパートメントで構成され、代表的には直径数百オングストロームの球状またはわずかに引き伸ばされた構造である。適当な条件下で、リポソームは細胞の原形質膜と、あるいはリポソームを取り込んだ細胞内のエンドサイトーシス小胞の膜と融合して、その内容物を細胞質中に放出し得る。しかし細胞表面との相互作用の前に、リポソーム膜は、その内容物を例えば血漿中の分解酵素から隔離および保護する比較的非浸透性の障壁として作用する。さらに、リポソームは合成構造なので、所望の特徴を組み込んだ特別に設計されたリポソームを生産し得る（Stryer，L.、Biochemistry、236-240頁、1975（W．H．Freeman、San Francisco、CA）；Szokaら、Biochim．Biophys．Acta 600:1、1980；Bayerら、Biochim．Biohys．Acta．550:464、1979；Rivnayら、Meth．Enzymol．149:119、1987；Wangら、PNAS 84:7851、1987；Plantら、Anal．Biochem．176:420、1989、および米国特許第4,762,915号参照）。リポソームは、本発明の実施に有用なDNA、RNA、プラスミド、および他の発現ベクターを含む種々の核酸分子をカプセル化し得る。 GDV（１つ以上の異なる樹状細胞標的エレメント型に結合したGDVを包含する）は、さらに改変され得る。１つの特に有用な改変は、得られる組成物の免疫原性を低減させる、ポリカチオンおよび遺伝子送達ビヒクルに結合する化合物の使用を包含する。共有に係るWO 96/21036を参照のこと。 Ｂ．目的の遺伝子 上記本発明の実施に有用なGDVは、１つ以上の目的の遺伝子、すなわち処置または予防すべき疾患に関連するかあるいは特徴的である少なくとも１つの抗原をコードする核酸分子を包含するかあるいは含有する。このような抗原としては、変質細胞成分由来のもの、および外来生物または他の病原由来の抗原が挙げられる。他の種々の疾患関連抗原が本発明の遺伝子送達ビヒクル中で使用され得る。例えば、WO 91/02805、WO 96/20414、および米国特許第5,580,859号を参照のこと。 本発明の他の実施態様において、外来生物または他の病原由来の抗原の免疫原性部分の発現を指向する発現ベクターが提供される。これらの抗原もまた本明細書中で「疾患関連抗原」とよばれる。このような抗原の代表例としては、細菌（例えば、E.coli、連鎖球菌、ブドウ球菌、ミコバクテリアなど）、真菌、寄生虫、およびウイルス（例えば、インフルエンザウイルス、HIV、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびＣ型肝炎ウイルス（それぞれ「HAV」、「HBV」および「HAC」）、ヒトパピローマウイルス（「HPV」）、エプスタインバーウイルス（「EBV」）、単純ヘルペスウイルス（「HSV」）、ハンタウイルス、HTLV I、HTLV II、サイトメガロウイルス（「CMV」）、およびネコ白血病ウイルス）由来の抗原が挙げられる。本明細書において使用される「免疫原性部分」は、適当な条件下で免疫応答（すなわち細胞性または体液性）を引き起こし得るそれぞれの抗原の一部分をいう。「部分」は種々のサイズであり得るが、好ましくは少なくとも９アミノ酸長であり、そして抗原全体を含み得る。 本発明の１つの実施態様において、発現ベクターは、少なくとも１つの疾患関連抗原に加えて、免疫調節補因子をコードする遺伝子をコードする。免疫調節補因子とは、すなわち、樹状細胞中で疾患関連抗原に加えて発現した場合に、その抗原に対する免疫応答の質または強度を、補因子が存在しない場合に生じる免疫応答に比べて増強させる因子である。応答の質または強度は、当業者に公知の種々のアッセイによって測定され得、このアッセイとしては、例えば、細胞増殖を測定するインビトロアッセイ（例えば、3Hチミジン取込み）、およびインビトロ細胞障害性アッセイ（例えば、51Cr放出を測定するアッセイ）（Waenerら、AIDS Res．and Human Retroviruses 7:645-655，1991参照）が挙げられる。別の実施態様において、免疫調節補因子は、発現ベクターでコードされる代わりに、遺伝子送達ビヒクルが投与される前に、投与と同時に、あるいは投与後にのいずれかで外部から添加される。 免疫調節因子はインビボおよびエクスビボの両方で活性であり得る。このような免疫調節因子の代表例としては、例えば、サイトカイン、例えば、、およびトランスポータータンパク質またはそのアナログに結合したMHC（Powisら、Nature 354:528、1991）が挙げられる。どの免疫調節因子を使用するかの選択はその因子の治療的効果に基づく。好ましい免疫調節因子としては、α-インターフェロン、γ-インターフェロン、およびIL-2が挙げられる。 疾患関連抗原をコードする核酸分子は、種々の供給源、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC、Rockville、MD)のような受託機関から、あるいはBritish Bio-Technology Limited（Cowley、Oxford、England）のような商業的な供給源から容易に入手され得る。あるいは、このような抗原をコードするcDNAは、対応する遺伝子を発現するかまたは含むことが知られている細胞から生成され得る（米国特許第4,683,202号；同第4,683,195号；および同第4,800,159号参照。PCR Technology：Prlnciples and Applications for DNA Amplification,Erlich（編）、Stockton Press、1989もまた参照のこと）。あるいは、既知配列の遺伝子、または既知アミノ酸配列の抗原をコードする遺伝子が、例えばApplied Biosystems Inc.のDNA合成機（例えばAPBDNA合成機モデル392(Foster City、CA)上で合成され得る。 Ｃ．標的エレメント 上記のように、本発明の１つの局面は、遺伝子送達ビヒクルを樹状細胞にインビボまたはインビトロのいずれかで標的するための組成物および方法を提供する。本発明の内容において、標的エレメントは、樹状細胞の表面上に存在する分子に親和性を有する分子である。広範な種々の標的エレメントが本発明の実施において利用されて、遺伝子送達ビヒクルを樹状細胞に特異的に指向し得る。 本発明の１つの実施態様は、遺伝子送達ビヒクルを樹状細胞に標的するための高親和性結合対の使用に関する。標的エレメントを用いる他の実施態様において、標的エレメントは、多官能性結合剤を介して遺伝子送達ビヒクルに共有結合される。一般的には、共有に係るWO 92/05266を参照のこと。 当業者に明らかなように、樹状細胞を標的し得る他の標的メカニズムもまた本発明の範囲内である。 Ｄ．GDV生産 一旦GDVが設計されると、それは所望の標的エレメントへの結合のためにおよび／または動物への投与のために十分な量で生産されなければならない。GDVが組換えウイルスベクターである場合、それはパッケージング系を利用して生産され得る。種々のウイルスベクターパッケージング系が以下に記載される。これは、親ウイルスの１つ以上の必須機能が欠失され、その結果いくつかの機能（例えば、ゲノム複製）が欠失しているが、パッケージングシグナルおよび１つ以上の核酸分子からの遺伝子産物を発現する能力を保持している。ウイルスベクターパッケージング系の代表的な例は、レトロウイルスベクター、アルファウイルスベクター、およびアデノウイルスベクターのためのものを含む。 このような組換えレトロウイルスベクターが利用される場合、ウイルス粒子を生産するパッケージング細胞株を利用するのが好ましい。ここで、少なくともgag/pol遺伝子の5'末端のコドンが、ベクターとパッケージング細胞中のウイルス構造タンパク質をコードする配列との間の相同的組換えの可能性を最小にするために、遺伝暗号の縮重性質を利用して改変される。パッケージング細胞に存在するベクターとパッケージされる組換えレトロウイルスゲノムとの間の組換え事象の可能性を低減するためのさらなる技術は、共有に係るWO 95/30763およびWO 96/07749において提供される。 上記の組換えレトロウイルスベクターとの使用に適切なパッケージング細胞株は、公知の技術を使用して容易に調製され得（WO 95/30763およびWO 92/05266を参照のこと）、そして組換えベクター粒子の生産のためのプロデューサー細胞株を作製するために利用される得る。 本発明のさらなる実施態様において、アルファウイルスパッケージング細胞株が提供される。詳細には、アルファウイルスパッケージング細胞株は、次のように提供される。ウイルス構造タンパク質（１つ以上の安定に組み込まれた発現ベクターからトランスで与えられる）が、トランスフェクトされた、形質導入された、または細胞内で生産されたベクターRNA転写物を細胞質中でカプシド内に取り込み得、そして感染性のパッケージされたベクター粒子を細胞膜を介して放出し得るため、それによりアルファウイルスベクター産生細胞株が作製される。 上記のアルファウイルスベクター構築物の使用に適切なパッケージング細胞株は容易に調製され得る（WO 95/07994を参照のこと）。 本発明のさらなる実施態様において、アデノウイルスパッケージング細胞株が提供される。アデノウイルスベクターは核複製ウイルスに由来し、そしてそれらが複製欠損であるように構築され得る。１つ以上の核酸分子が、アデノウイルスベクターにより、標的細胞への送達のために保有され得る（Ballayら、EMBO J．4:3861，1985、Thummelら、J．Mol．Appl．Genetics 1:435，1982およびWO 92/05266を参照のこと）。 本発明の別の実施態様において、標的化遺伝子送達ビヒクルは、遺伝子送達を補助するための１つ以上の融合性（fusigenic）タンパク質を含む。融合性タンパク質の代表的な例は、エコトロピックマウスレトロウイルスエンベロープタンパク質、正常なレセプター認識が不可能であるように改変された他のレトロウイルスエンベロープタンパク質、単純ヘルペスウイルス融合性タンパク質gHおよびgL由来の融合性タンパク質、エプスタインバーウイルス融合性タンパク質、風疹ウイルスタンパク質、マラリア原虫融合性タンパク質、および融合特性を有する当該分野で公知の他のタンパク質を含む。 Ｅ．遺伝子送達ビヒクルの精製 一旦GDVが生産されると、それらは、好ましくは、所望の標的エレメントに結合する前に精製される。さらに、標的化GDVを含む組成物は、好ましくは、投与前に再度精製される。精製のために利用される技術は、精製されるGDVのタイプに依存する。例えば、種々の当該分野で公知の技術が存在する。これは、GDVが、エンベロープを有する組換えウイルスベクター、核酸、またはリポソームである場合に使用され得る（精製手順の例についての米国特許第5,447,859号を参照のこと）。 さらに、GDVが核酸である場合、種々の当該分野で公知の技術が存在する。これは、例えば、CsCl-エチジウムブロミド勾配、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、およびポリエチレングリコールでの分沈澱による精製を含む。核酸の精製のさらなる記述は、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第２版(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)に提供される。 GDVがリポソームである場合、当業者に公知の種々の精製方法が利用され得、そしてManninoおよびGould-Fogerite(BioTechniqucs 6:682，1988)により詳細に記載される。簡潔には、リポソームの調製は、代表的には、１以上の精製リン脂質およびコレステロールの溶液を有機溶媒中で混合する工程、および溶媒を乾燥するまで蒸発させる工程を包含する。次いで、GDVを含有する緩衝水溶液は脂質膜に添加され、そして混合物は超音波処理され、十分均一なリポソームの分散液を作製する。特定の実施態様において、透析、ゲルろ過、または超遠心が次いで使用されて、インタクトなリポソームからの取り込まれなかった成分を分離する Ｆ．処方 GDVを含む組成物の精製後、調製物は、好ましくは、薬学的組成物に処方される。このような組成物は、液体または乾燥形態であり得る。好ましい液体組成物は、所望の産物が、薬学的に受容可能なキャリアおよび／または希釈剤中に懸濁され、そして安定化剤および他の賦形剤をさらに含み得る水溶液を含む。あるいは、本発明の組成物は、使用直前に再懸濁することが意図される固体処方物で調製され得る。乾燥処方物は、凍結乾燥またはフリーズドライされたものを含む。 GDVが脂質エンベロープを有するウイルスである場合、好ましい乾燥処方物は以下のいくつかまたはすべてを含む：１つ以上の薬学的に受容可能なキャリアおよび／または希釈剤：サッカライド；高分子量構造添加剤；緩衝成分；水；および１つ以上のアミノ酸。これらの成分のいくつかまたはすべての組み合わせは、凍結および凍結乾燥、または蒸発による乾燥の際に、標的化GDVの活性を保持するように作用する。本発明の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤は、用いる投与量および濃度においてレシピエントに対して非毒性である。注射可能な溶液のためのキャリアまたは希釈剤の代表的な例は、例えば、水、等張生理食塩水（すなわち、リン酸緩衝化生理食塩水またはTris緩衝化生理食塩水、好ましくは生理的pHに緩衝化されている）、マンニトール、デキストロース、グリセロール、およびエタノール、ならびにポリペプチドまたはヒト血清アルブミンのようなタンパク質を含む。 脂質エンベロープを有するウイルス（特に、組換えレトロウイルスおよびアルファウイルス）のために好ましい凍結乾燥組成物は、10mg/mLマンニトール、１mg/mL HSA、20mM Tris(pH7.2)、および150mM NaClを含むものが特に好ましい(WO 95/10601を参照のこと）。このような組成物は、-70℃で少なくとも６ヶ月間安定である。本発明の薬学的組成物はまた、細胞分裂、その結果、投与されたGDVの摂取および取り込みを刺激する因子をさらに含み得る。組換えウイルスを保存するために特に好ましい方法および組成物は、WO 95/10601、WO 95/07994、およびWO 96/21014に記載されている。液体または固体形態において、GDVが組換えウイルスである場合の組成物の調製後、組換えウイルスは、好ましくは投与あたり約10ng〜１mgの物質（同時精製した夾雑物として示される物質の量の約10倍）からなる。好ましくは、組成物は、約0.1〜1.0mLの水溶液の投与量で投与される。これは、１つ以上の追加の薬学的に受容可能な賦形剤、安定化剤、または希釈剤を含んでも含まなくてもよい。 Ｉ．投与 本発明の組成物（エクスビボで改変された樹状細胞または直接投与のためのGDV）は、代表的には、インビボで非経口（例えば、静脈内、皮下、および筋肉内）で、または他の従来の直接的な経路（例えば、頬／舌下、直腸、口腔、鼻腔、局所（例えば、経皮および眼）、膣、肺、動脈内、腹腔内、眼内、または鼻腔内経路）で投与されるか、あるいは特定の組織（例えば、肝臓、骨髄）またはガン治療の場合には腫瘍に直接投与される。非経口ではない（non-parenteral）経路は、WO 96/20732でさらに議論されている。 好ましくは、組成物は動物に所望の経路で投与され、次いでその動物は所望の生物学的応答について試験される。このような試験は、免疫学的スクリーニングアッセイ（例えば、CTLアッセイ、抗体アッセイ）を含み得る。実施される試験は、標的化GDVにより導入される核酸分子により産生される産物および処置または予防される疾患に依存する。このような試験の結果に基づいて、投与される標的化GDVの力価が、投与以上のものが要求される場合、所望の効果をさらに増強するために調節され得る。 本明細書に記載の多くの投与経路または他の当該分野で公知の投与経路による投与は、単に、針、カテーテル、または関連デバイスを使用し、１つの時点または複数の時点で直接投与することにより達成され得る。さらに、所定の時点での遺伝子送達ビヒクル（またはそのためのエクスビボ形質導入細胞）の「投与」は、１つ以上の領域に、または１つ以上の経路により投与することを含む。本発明の特定の実施態様において、１以上の投与量が、示される様式で以下に直接投与される：静脈内、103、104、105、106、107、108、109、1010、または1011cfu以上の投与量；動脈内、103、104、105、106、107、108、109、1010、または1011cfu以上の投与量；筋肉内、103、104、105、106、107、108、109、1010、または1011cfu以上の投与量（1010または1011cfuの投与量が好ましい）；皮内、103、104、105、106、107、108、109、1010、または1011cfu以上の投与量；肺、103、104、105、106、107、108、109、1010、または1011cfu以上の投与量；皮下、103、104、105、106、107、108、109、1010、または1011cfu以上の投与量（108、1010、または1011cfuの投与量が好ましい）；間質、103、104、105、106、107、108、109、1010、または1011cfu以上の投与量（108、109、1010、または1011cfuの投与量が好ましい）；リンパ器官中（例えば、脾臓、扁桃、またはリンパ節）、103、104、105、106、107、108、109、1010、または1011cfu以上の投与量；腫瘍中、103、104、105、106、107、108、109、1010、または1011cfu以上の投与量（108、109、1010、または1011cfuの投与量が好ましい）；腹腔内、103、104、105、106、107、108、109、1010、または1011cfu以上の投与量（108、109、1010、または1011cfuの投与量が好ましい）；および輸入リンパ中、103、104、105、106、107、108、109、1010、または1011cfu以上の投与量。簡便のために、「cfu」はまた、非ウイルス粒子をいう。そのため、１cfuは１非ウイルス粒子に等価である。 投与のための他の経路および方法は、非経口ではない経路（例えば、共有に係るWO 96/20732に開示される）、ならびに複数部位を介した投与（共有に係るWO 96/20731に開示される）を含む。 実施例 以下の実施例は、より完全に本発明を例示することを含む。さらに、これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を提供し、そしてその範囲を制限することを意図しない。以下の実施例に記載の多くの手順、または適切な別の手順のための標準的な方法が、例えば、「Molecular Cloning」、第２版（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press，1987）および「Current Protocols in Molecular Biology」（Ausubelら編、Greene Associates/Wiley Interscience，NY，1990）のような分子生物学の広く再編されたマニュアルにおいて提供される。実施例１遺伝子送達ビヒクルの直接投与後の重要な抗原提示細胞としての樹状細胞の同定 上記のように、少なくとも１つの疾患関連抗原ベクターをコードする発現ベクターを有する組換えレトロウイルスの直接注射が、エクスビボアプローチに好ましい。しかし、所望の疾患関連抗原が形質導入細胞（例えば、線維芽細胞）（これは、次いで患者に投与される）により発現されるエクスビボアプローチに比較して、遺伝子送達ビヒクルの患者への直接投与は、注射部位およびその近傍での細胞の形質導入、ならびに組織（例えば、静脈内または皮下投与後に、遺伝子送達ビヒクルがリンパ組織に輸送され得る）中に存在する形質導入細胞をもたらす。以前は、遺伝子送達ビヒクルの注射により直接送達される発現ベクターによりコードされる疾患関連抗原の提示をどの細胞が担うか未知であった。動物への直接注射により送達される発現ベクターによりコードされる抗原を提示する形質導入細胞の同定を以下に記載する。 動物に直接注射された組換えレトロウイルスにより送達された発現ベクターを追跡するために設計された以前の生物局在性研究では、全器官PCRを使用してプロウイルスDNAが注射部位において検出された（Sajjadiら、1994；Kamantigueら、1995）。さらに、プロウイルスDNAは、しばしば、二次リンパ器官において検出された。結果は、これらの動物がプロウイルスによりコードされる免疫原に対して首尾よい免疫応答を増大した観察に一致した。 本研究において、組換えレトロウイルスを使用して送達された４つの発現ベクター（それぞれが、HIV gp160/120エンベロープ、細菌β-ガラクトシダーゼ、ニワトリオボアルブミン、またはルシフェラーゼのいずれかをコードする）を使用して、直接投与後の抗原提示および免疫誘導に関与する細胞を同定した。４つの細胞集団を試験した。１番目の細胞集団は、PCRで同定した発現ベクターのプロウイルスコピーを含む（グループI）。２番目の細胞のサブセットは、コードされたタンパク質を発現する細胞のサブセットである（グループII）。β-gal組織化学および免疫組織化学アッセイを用いてこれらの細胞を分析した。３番目のサブセット（グループIII）は、免疫系に対して抗原ペプチドを提示し得るグループII細胞のサブ集団からなる。グループIII細胞を、Ｔ細胞アッセイにおける免疫応答を誘導するその能力により同定した。最後に、グループIVは、発現ベクターのプロウイルスコピーを含まず、それゆえその対応の遺伝子由来の抗原タンパク質またはペプチドを発現しないが、それでもなお抗原を提示する異なるグループの細胞からなる。グループIV細胞の例は、初代形質導入細胞またはその断片を取り込む食細胞を含む。このような細胞は、次いで再プロセシングされて、それら自身のMHC分子と関連して抗原ペプチドを提示する。レトロウイルスベクター HIV gp160/120、細菌性βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、およびニワトリオボアルブミンをコードする発現ベクターを有する非複製アンホトロピックマウス組換えレトロウイルスを用いた。レトロウイルスベクター骨格および高力価ウイルス調製物（＞１×107cfu/mL）を、WO 89/09271、WO 92/05266、および共有に係るWO 96/21014に記載のように作製した。pUG-1ベクター（Mooreら、1993）におけるニワトリオボアルブミンのcDNAをコードする1.2kbのBamHI〜BglIIフラグメントを、pSP73（Promega,Madison WI）のBamHI部位にクローニングした。1.2kbのXhoI〜ClaIフラグメントを回収し、そしてN2-HIV gp160/120由来の対応する3.8kbのXhoI〜ClaIフラグメントと置換した。ウイルス調製物のアリコートを、複製コンピテントレトロウイルス（RCR）について試験し、そしてRCRを含まないことを決定した。動物およびベクター免疫 Harlan Sprague-Dawley由来の７〜８週齢の雌BALB/c(H-2d)マウスまたはC57BL/6(H-2b)マウスを、全ての実験に用いた。１、４、および７日目に、マウスに、100μl／注射、全200μl／マウスで、排腹筋または脛側前筋の両方において筋肉内に（i.m.）、または100μlのレトロウイルス調製物で尾のつけねに皮内に注射した。脾臓を採収し、そして適切に照射された脾臓細胞と混合することによって、インビトロでのCTL培養を開始した。免疫組織化学 以下のリンパ球マーカーに対する抗体を、培養上清または精製免疫グロブリンとして用いた：CD4（ラットIgG）；CD8（ラットIgM）；マクロファージ（ラットIgG）；およびB220（ラット（IgM））。CD45（30R11.1、ラットIgG；Pharmingen,San Diego,CA）、ラットIg（ポリクローナル；Jackson ImmunoResearch Labs.,Inc.,West Grove,PA）、およびウサギIg（ポリクローナル；Jackson ImmunoResearch,PA）に対する市販のビオチン化抗体もまた用いた。通常のウサギ血清を、ネガティブコントロールとして用いた。 注射部位の筋肉を注意深く摘出し、OCTに浸し、そして液体窒素で迅速に凍結して、そして使用するまで-70℃で保存した。５〜６μmでクリオスタット切片を切り、風乾し、そしてアセトンで５分間固定した。切片を、先に力価測定したTris緩衝化生理食塩水（pH7.4）に希釈した最適濃度の抗体とともに60分間インキュベートし、Tris緩衝化生理食塩水で洗浄し、ビオチン化抗ラットまたはウサギIgGとともにインキュベートし、そして洗浄し、次いで、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ（Jackson ImmunoResearch,PA）とともにインキュベートした。結合したアルカリホスファターゼを、先の記載の基質Fastviolet（Surh，J.Exp.Med.，第176巻:495-505）で検出した。切片を、Meyerのヘマトキシリンで軽く対比染色し、そしてZeiss Axioscope顕微鏡下で写真撮影した。バックグラウンドを最小にするために、Airfuge超遠心分離機（Beckman Instruments,Inc.,Palo Alto,CA）で148,000×gで、30分間スピンし、そしてペレットを捨てた後、抗体を用いた。浸潤細胞の単離 注射部位を、同時注射したラテックスビーズからの蛍光放射を介して可視化しした後に、外科鋏で摘出し、そして賽の目に切った。得られた筋肉の小片（平均サイズ0.5cm3）を、ときどき振盪しながら、トリプシンで37℃で１時間消化した。消化の終わりに、ウシ胎児血清を添加し、そして残った筋肉片を重力によって分離した。浸潤細胞を培地で洗浄し、そしてルシフェラーゼおよびB3.Zアッセイの後に計測した。パーコール密度勾配による脾臓細胞分画（図２を参照のこと） パーコールストックを、１部の10×リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）に対して９部のパーコールを混合することによって調製した。「1.030」および「1.075」作業パーコール溶液を、それぞれ、75％PBS＋25％パーコールストック溶液および40％PBS＋60％パーコールストック溶液を混合することによって作製した。ナイーブなまたは免疫した動物由来の脾臓細胞を、以下の方法によってＢ＋Ｔ細胞、マクロファージ、および樹状細胞に分画した。脾臓を、ハンクス平衡化塩溶液（HBSS）中のDNAse（Calbiochem,3800ユニット/mL）で、室温で、ときどき揺り動かしながら１時間つぶした後に、ナイロンメッシュで濾過して破片を除去した。得られた細胞をプールし、そして1500rpmで５分間遠心分離した後に、「1.075」パーコール溶液に再懸濁した。プールした脾臓細胞を含む「1.075」パーコール溶液を、「1.030」パーコール溶液に注意深く重層し、そして勾配を、20分間、1200rpmでスピンした。パーコール遠心分離の後、界面の低密度細胞およびペレット中の高密度細胞を別々に回収し、そして徹底的に洗浄した。高密度細胞は、赤血球、Ｔ細胞および形質細胞を除いたほとんどのＢ細胞を含んだ。低密度細胞は、FACSの判定によれば、いくつかのＢ細胞（形質細胞を含む）、樹状細胞、単球、およびマクロファージを含むが、Ｔ細胞は含まなかった。低密度画分中のほとんどのＢ細胞を、完全培地（RPMI1640、10％ウシ胎児血清）と組織培養プレート中で２時間インキュベートした後に、注意深く洗浄することによって除去した。残った付着細胞（樹状細胞、単球、およびマクロファージを含む）を、さらに一晩インキュベートした。成熟マクロファージは、一晩培養した後でもなお付着する唯一の細胞であるので、全ての他の細胞型から分離された。X-gal（５-ブロモ-４-クロロ-３-インドシルb-D-ガラクトピラノシド）染色 培養物を、３％ホルムアルデヒドで５分間、室温で固定した後、PBSで洗浄した。細胞を、１mg/mL X-gal/mL、５mMフェロシアン化カリウム、５mMのフェリシアン化カリウム、および２mM MgCl2の溶液で重層した。プレートを、37℃で一晩インキュベートした後に、LacZ発現した青色細胞の存在について、顕微鏡的に試験した。インビトロでのCTL誘導および細胞障害性アッセイ ５匹のマウスを、HIV gp160/120をコードする発現ベクターを有する組換えレトロウイルスを投与することによって免疫した。Ｂ＋Ｔ細胞、樹状細胞、およびマクロファージの画分を調製した。５匹の免疫していない同腹子を、類似の様式でプロセシングした。細胞画分を、50：１の比で照射した刺激剤と混合し、７日間培養した。51Cr放出アッセイ（Warnerら、(1991),AIDS Res.and Human Retroviruses,第７巻：645-655）を行い、そして溶解の割合を計算した。樹状細胞および単球のエクスビボでの形質導入および養子移入 ナイーブなマウスを屠殺して、低密度画分を上記のように単離し、そしてGM-CSF（25ユニット/mL）およびIL-4（100ユニット/mL）を含む培地に移した。DA/KTおよびDA/β-galプロデューサー細胞株を、0.45ミクロンの孔サイズを有するトランスウェルに播種した。トランスウェル中の樹状細胞およびプロデューサー細胞を、３日間同時培養した。回収した細胞を、徹底的に洗浄した。ナイーブなレシピエントマウスに、これらの形質導入樹状細胞またはHIV gp160/120で安定に形質導入した線維芽細胞を腹腔内に注射した。レシピエントマウスからの脾臓を、７日後に採収した後に、インビトロで再刺激し、そして51Cr放出アッセイをした。B3.Zアッセイ B3.Z細胞は、H-2Kb分子に関してニワトリオボアルブミンを認識するＴ細胞ハイブリドーマである。これは、ヒトIL-2遺伝子の最小プロモーターに融合した細菌LacZ遺伝子を含むプラスミドを含み、それゆえ、抗原刺激に際してLacZを誘導し得る。抗原提示細胞は、オボアルブミン遺伝子でトランスフェクトされた細胞またはオボアルブミン発現ベクターで免疫したマウス由来の分画された脾臓細胞のいずれかである。２×105のB3.Z細胞および１×107の抗原提示細胞を含む個々の培養物を一晩インキュベートし、続いて、B3.Z活性化のレベルを評価するためにX-gal染色した。各画分の抗原提示細胞の数を、オボアルブミン遺伝子でトランスフェクトした既知数の細胞を含む培養物から作製される標準曲線から推定した。結果 形質導入される細胞型を規定し、そして組換えレトロウイルスに基づく遺伝子送達ビヒクルの筋肉への直接投与の後の免疫を誘導するために、注射部位を免疫組織化学によって試験し、インビボでトランスフェクトされた細胞を同定した。マウスを、ニワトリオボアルブミンをコードする発現ベクターを有する組換えレトロウイルスで免疫した。３回の注射の後、マウスを、凍結切片のために屠殺し、そして注射部位を、種々の白血球マーカーおよびオボアルブミンに対する抗体を用いて免疫組織化学により分析した。 多くの浸潤細胞を、注射部位の近くの筋内膜（endomesium）中に見出した。マーカープロフィール分析から、F4/80ポジティブ単球／マクロファージを、注射部位で最も突出した浸潤細胞として同定した。さらに、顕著な数のCD4ポジティブ細胞およびときどきＢ細胞が、注射部位に浸潤した。CD8ポジティブ細胞は見出されなかった。異なるエピトープに対する２つの樹状細胞特的抗体（NLDC-145およびN148）は、注射部位で、顕著な数の樹状細胞を検出し得た。処方緩衝液のみで注射したマウスは、同等のリンパ球浸潤を示し、注射由来の注射針損傷はリンパ球浸潤を引き起こすのに十分であることを示唆した。注射の皮内径路（同等の免疫応答を誘導する）を試験した場合、注射部位は、同一の表現型を有する細胞による同等の浸潤を示した。 免疫組織化学によって、いくつかの浸潤細胞が、オボアルブミンタンパク質を発現することを見出した。抗オボアルブミンおよびF4/80抗体を用いた二重染色は、全てではないがいくつかのオボアルブミンポジティブ細胞がマクロファージマーカー（F4/80）と同時染色されることを示した。発現ベクターによってコードされるタンパク質の注射部位発現を確認するために、浸潤細胞を、ルシフェラーゼまたはオボアルブミンコード遺伝子送達ビヒクルを注射した動物から単離した。初めに、細胞をNBTアッセイによって分析し、それらのほとんどが名実ともにマクロファージ／単球細胞系列であることを確認した。次いで、浸潤細胞は、ルシフェラーゼまたはB3.Zアッセイに供された。ルシフェラーゼアッセイは、ほとんどのルシフェラーゼ活性が、浸潤細胞に集中するが、残りの筋肉には集中しないことを明らかにした。さらに、B3.Zアッセイは、浸潤細胞が、Ｔ細胞に対してオボアルブミン由来のペプチドを提示することを示した。正常ウサギ血清を有する平行切片、またはHIV gp160/120コード遺伝子送達ビヒクルで処置されたマウスの注射部位での抗オボアルブミン抗体を用いる染色は見出されなかった。これらの結果は、注射部位での浸潤細胞のいくつかの画分が、実際に形質導入され、免疫応答を刺激するためにプロセシングされ得る抗原タンパク質を発現することを示す。 これらの実験から、注射針損傷によって生じる炎症は、白血球の浸潤を促進する可能性があり、次いで、白血球は遺伝子送達ビヒクルによってトランスフェクトされる。次いで、これらのトランスフェクトされた白血球を、免疫応答を誘導するために二次リンパ様器官に移植する。これを確認するために、プロウイルスDNA組込みおよびタンパク質発現を、リンパ節および脾臓中の種々の白血球集団において分析した。 全体の器官から単離されたDNAを用いる以前の生物局在性の研究は、いくつかの二次リンパ様器官中のプロウイルスDNAの検出に至った（Sajjadiら、前出；Kamantigueら、前出）。全体の器官のPCRの感受性が制限されているので、PCRアッセイを、分画した脾臓細胞について行った。免疫したマウス由来の脾臓細胞をプールし、そしてＢ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、および樹状細胞の画分に分離した。HIV gp160/120またはβ-galをコードする遺伝子で免疫したマウスにおいて、ネオマイシンに対する耐性を与えるマーカー遺伝子に加えて、両ベクターによってコードされるneoマーカーを、樹状細胞およびマクロファージ細胞の画分において検出した。 プロウイルスDNAの組込みが白血球細胞画分において検出されたので、発現ベクター由来のタンパク質発現もまた、これらのトランスフェクトした細胞画分において分析した。BALB/cマウスに、β-gal発現を指向する遺伝子送達ビヒクルを３回注射した。それらの脾臓をプールし、そして上記のように分画し、続いてX-gal染色した。PCRデータに一致して、分画していない脾臓および樹状細胞の画分はβ-gal染色を示した。形質導入した細胞のほとんどが、クラスターにおいて発見され、このことは、最初のトランスフェタト細胞からクローン的に誘導されることを示唆している。ここに、0.2％の樹状細胞がトランスフェクトされ、これはマウス当たり約2,000の細胞に対応する。さらに、マクロファージ画分およびこれらのマウスの鼠径および膝窩リンパ節由来の細胞は、いくらかのX-gal染色を示したが、数は、樹状細胞画分と比較して非常に減少した。高密度画分は、Ｂ細胞およびＴ細胞を含み、X-gal染色についてネガティブであった。 形質導入された細胞の表現型を、さらに分析した。Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびマクロファージの画分は、CD45R/B220、Thy-1.2、およびF4/80のそれらの代表的なマーカープロフィールによって判断されるように、分画後に同種であることが示された。対照的に、細胞単離後すぐにプラスチックに付着するが、一晩培養後ではプラスチックに付着しない細胞は、いくつかの樹状細胞抗体染色に基づいて樹状細胞を大部分含み、従って慣習的に樹状細胞画分と呼ばれるが、これらの画分はまた、いくつかのCD45R/B220ポジティブＢ細胞（約20％）およびF4/80ポジティブ単球／マクロファージ（約30％）を含み得る。より付着性の成熟マクロファージは、プラスチックに持続的に付着することによって分離されたので、「樹状」細胞画分における単球／マクロファージ細胞は、単球のようであった。従って、「樹状細胞」画分における純種の樹状細胞および単球の形質導入の割合を決定した。さらに、いくつかのF4/80ポジティブ細胞が、注射部位において形質導入されることが明らかなので、これらの細胞が脾臓に通る（traffic）かどうかを決定した。β-gal遺伝子で形質導入したマウス由来の脾臓細胞を分画し、上記のように「樹状細胞」画分を得た。細胞を２色FACSを用いて選別し、CD45R/B220ポジティブ、F4/80ポジティブ、または二重ネガティブ細胞（すなわち、それぞれＢ細胞、単球、または樹状細胞）を回収した。次いで、各集団を、X-gal染色し、そしてβ-gal活性を、単球で0.035％および樹状細胞で0.025％見出したが、Ｂ細胞分画では、見出さなかった。これらの結果は、脾臓由来の脾臓樹状細胞および単球／マクロファージの両方が、形質導入され得、そしてベクターコードタンパク質を発現し得ることを示す。 免疫した動物由来の「樹状細胞」は、免疫系によって認識され、従って抗原ペプチドを提示するので、このような細胞を、インビトロでナイーブな脾臓を初回抗原刺激し得るかどうか測定するために研究した。マウスの１つのグループを免疫し、HIVエンベロープgp160/120を発現させた。これらの脾臓細胞を、３つのグループに分画した：Ｂ＋Ｔ細胞；マクロファージ；および「樹状細胞」の画分。ナイーブな同腹子を、同様にプロセシングした。得られた６の別々の細胞グループを、混合して、脾臓細胞集団を再構成した。照射した刺激剤を加え、インビトロでCTL培養を開始した。HIVエンベロープgp160/120を発現する細胞で免疫したマウス由来の、分画されていない免疫した脾臓および脾臓細胞を、コントロールとして含んだ。免疫したマウス由来の初めの４つの組合せ（Ｂ＋Ｔ細胞画分を含む）が、優れた免疫応答を誘導し得た。興味深いことに、マウスを免疫した「樹状細胞」画分のみが、ナイーブなＢ＋Ｔ細胞集団において免疫応答を誘導し得、「樹状細胞」画分が、インビトロで免疫応答を開始し得る抗原提示細胞を含むことを証明した。樹状細胞は、インビトロでの免疫応答を開始し得る細胞の唯一の集団として以前に同定されているので、この「樹状細胞」集団は、真性の抗原提示樹状細胞を含むはずである。 上記のデータは、インビボで形質導入された樹状細胞およびマクロファージが、インビボおよびインビトロで一次免疫応答を誘導し得ることを示したので、エクスビボで形質導入された細胞が免疫応答を刺激する能力もまた研究した。低密度細胞画分を、ナイーブな脾臓のパーコール勾配分離によって分離し、続いてサイトカインのカクテルで刺激し、細胞分裂を促進させた。増殖性細胞を、トランスウエル培養を用いて、HIV gp160/120をコードする発現ベクターを有する組換えレトロウイルスで形質導入した。形質導入樹状細胞およびマクロファージ細胞のアリコートを、ナイーブな宿主に移入し、続いてインビトロで再刺激し、そしてCTL分析をした。予期されたように、レシピエントマウスは優れたCTL応答を誘導し、これらの細胞の免疫誘導における役割を確認した。 他の細胞型と比較した、形質導入樹状細胞の免疫応答を誘導する相対的効力をエクスビボ方法により評価するために、形質導入樹状細胞を、同一の注射プロトコルにより注射された同じ抗原の匹敵するレベルを発現する形質導入線維芽細胞と比較した。レトロウイルス媒介ルシフェラーゼ発現に基づく樹状細胞の形質導入効率は、同一のプロトコル、その後のタンパク質含量に基づく標準化により約0.1％であった。この形質導入効率に基づいて、養子移入実験におけるレシピエントマウスは、計５×105注射細胞中の平均約５×102形質導入樹状細胞を受けたと算出された。これらのエクスビボ形質導入樹状細胞により誘導された免疫応答レベルは、同じ抗原を発現する３×104〜1×105線維芽細胞を注射するための同じ注射プロトコルを用いて生じた免疫応答レベルに匹敵する。この算出に基づいて、単一の形質導入樹状細胞は、60〜200の形質導入線維芽細胞により生じた免疫応答と等価な免疫応答を誘導する。 上記のデータは、タンパク質発現細胞の相対的に希なことを示す。由来する抗原またはタンパク質を発現する細胞間の抗原提示細胞の頻度を評価するために、以下の手順を使用して、これらの希な抗原提示細胞を、注射部位および種々のリンパ器官で同定した。 C57BL/6マウスに、オボアルブミンコード組換えレトロウイルスを注射した。プールされた脾臓を、Ｂ、Ｔ、マタロファージ、および「樹状細胞」に分画した。これらの潜在的な抗原提示細胞を、抗原刺激の際にLacZタンパク質を発現するCTLハイブリドーマである、B3.Z細胞と一晩インキュベートした。これらの培養物を、X-galで染色して、B3.Z活性化のレベルを評価した。コントロールとして、B3.Z細胞を、以下の試薬とインキュベートした：プレート結合抗Ｔ細胞レセプター抗体；オボアルブミン遺伝子でトランスフェクトした既知数のE7.G細胞；非免疫脾細胞；または分画していない免疫脾細胞。標準曲線を、固定数のE7.G細胞とインキュベートした活性化青色B3.Z細胞の頻度から作製し、そして各脾臓画分における抗原提示細胞の頻度をそれらから評価した。脾臓あたり平均約100の抗原提示細胞を、計107cfuの組換えレトロウイルスを注射したマウスにおいて検出した。これらのマウスからプールされた脾細胞は、インビトロ刺激の１週間後に100：１のエフェクター：標的比で行われたCTLアッセイにおいて40％の溶解を生じた。 実験の別のシリーズにおいて、10匹のC57BL/6マウスに、上記で使用されたような６×107cfuの同じ遺伝子送達ビヒクルを注射した。細胞を注射部位およびリンパ器官から単離した。E7.G細胞の認識から作製した標準曲線に対する比較は、１×105および４×104抗原提示細胞を、それぞれ、鼠径リンパ節および膝窩リンパ節から回収したことを示した。２×104抗原提示細胞を、注射部位から回収した。このデータは、抗原提示細胞が全く希であることを示す。従って、遺伝子治療媒介免疫誘導は、以下に記載の選択細胞型の形質導入を増大することによって改善され得る。 上記に示すように、遺伝子送達ビヒクル媒介形質導入により影響される細胞のヒエラルキーが存在する。発現ベクターを含む細胞を、種々の供給源（器官全体、精製細胞集団、またはインサイチュ形態の組織切片を含む）においてPCRのような技術により検出し得る。発現ベクターを含む細胞(グループI)のうち、一般的に、いくつかのみがタンパク質を発現するが（グループII）、グループI細胞集団およびグループII細胞集団の相対的な大きさは、多くの例において比較し得る。グループII細胞を、組織化学および免疫組織化学を含む種々の技術により検出し得る。異種タンパク質発現の持続時間を調べる場合、発現の損失は上記の研究の経過の間（10日）に生じないが、発現の持続時間は、使用される特定の遺伝子送達ビヒクルに依存して変化するようである。 抗原プロセシングおよび抗原提示は、以下の多くの工程およびパラメーターを含む：抗原タンパク質のペプチドへのプロセシング；ペプチドの小胞体への輸送；ペプチドの適切なMHCクラスI分子への結合；およびペプチド-MHCクラスI複合体が細胞傷害性Ｔ細胞と相互作用し得る微小環境。従って、タンパク質発現細胞のサブ集団のみが、免疫系に対して抗原ペプチドを提示するようである（グループIII）。上記の結果はこの仮説を確認し、そして抗原提示細胞が全く希であることを確かに見出す。 最後に、発現ベクターを含まず、従って抗原を発現し得ないが、それにもかかわらず抗原を提示する細胞の異なるグループ(グループIV)が存在する。これらの細胞の例として、初代形質導入細胞またはそれらのフラグメントを取り込み、そしてそれ自身のMHC分子に関して抗原ペプチドを再プロセシングして提示する（すなわち、交差プライミング(cross-Priming)）、食細胞が挙げられる。 上記の結果は、遺伝子送達ビヒクルの直接投与後の抗原提示が、脾臓樹状細胞およびマクロファージ細胞により媒介されることを証明する。特定の理論に縛られることなく、注射部位で最終的に形質導入された細胞は、針損傷により引き起こされる炎症反応により補充され得るようである。形質導入後、細胞は、リンパ管を介して脾臓に排出され、そして抗原を提示するようである。従って、エクスビボ形質導入された単球/マクロファージおよび樹状細胞は、免疫応答を移入するための優れた供給源である。従って、自己またはハプロタイプ適合の、形質導入樹状細胞または単球/マクロファージは、疾患処置または予防のための免疫治療アプローチにおいて使用され得る。しかし、エクスビボ遺伝子治療に関するロジスティックなおよび他の複雑性により、遺伝子送達ビヒクルの患者への直接投与が好ましい。特に好ましいアプローチにおいて、樹状細胞のインビボ形質導入が行われる。このような形質導入を増強するために、患者は、選択的に白血球の増殖を引き起こすGM-CSFのようなサイトカインをコードする遺伝子送達ビヒクルのプレ注射または同時注射により処置され得る。あるいは、このような免疫調節補因子の組換えバージョンを投与し得る。特に好ましいアプローチにおいて、遺伝子送達ビヒクルを、インビボで樹状細胞に標的する。このような標的化遺伝子送達ビヒクルの代表的な生産の例を、以下の実施例２に記載する。実施例２腫瘍特異的抗原に対して予防的および治療的免疫応答を誘導するためにレトロウイルスベクターで形質導入されたマウス樹状細胞１．腫瘍治療 ヒトパピローマウイルス(HPV)は、いくつかのヒトガン、特に頚領域および肛門性器領域の扁平上皮腫瘍の発生に関与する。いくつかのパピローマウイルス型由来のE7タンパク質は、腫瘍サプレッサー遺伝子Rb産物への結合により頸上皮細胞の腫瘍形成形質転換を媒介する。E7遺伝子は不死化しており、そして初代ラット細胞(Kanda，Tら、J.Virol，62:610-613，1988)および初代ヒト線維芽細胞(Watanabe,Sら、J.Virol，63，965-969，1989)の両方を形質転換し得る。タンパク質の構造と機能との間の関係を解明することを意図するE7の変異分析は、アミノ酸24での単一の点変異が形質転換能力を除去するが、一方トランス活性化活性は維持されることを明らかにし(Edmonds,Cら、J.Virology 63，2650-2656，1989)、そのためこのE7変異体はp24と呼ばれた。理論的には、頸ガンの大部分に存在するE7タンパク質は、インビボ刺激Ｔ細胞応答に対する魅力的な標的である。 マウス細胞株はHPV感染に非許容的であるので、２つの代理HPV領域を、DA/p24プロデューサー株由来のレトロウイルスベクターを形質導入することにより作製した。DA/p24プロデューサー株を、p24遺伝子(Edmonds,Cら、J.Virology 63，2650-2656，1989)をras遺伝子の代わりにレトロウイルス骨格に挿入した以外は、上記の実施例２に記載のように構築した哺乳動物癌腫細胞株であるJC(ATCC番号CRL-2116)および結腸直腸癌腫細胞株であるCT26(Michael Brittain at Baylor College of Medicine)をDA/p24で形質導入して、それぞれ、JC.p24およびCT26.p24を作製した。 形質導入樹状細胞画分を以下のように調製した。天然のマウスを屠殺し、そして脾臓樹状細胞(SP-DC)画分を実施例１に記載のように調製した。骨髄樹状細胞（BM-DC）を、長骨を洗浄し、続いてＢ細胞の補体媒介除去を行うことにより調製した。それらを、GM-CSF(500U/ml)およびIL-4(1000U/ml)を含むRPMI 1640培地に入れた。DA/p24を、膜を横切ってプロデューサー細胞を全く漏らさない、0.45ミクロンの孔サイズを有するトランスウェル（Corning Costar，Cambridge，MA）中に播種した。樹状細胞画分を、低付着組織培養ウェル(Corning Costar，Cambridge，MA)に添加し、そしてDA/p24を含むトランスウェルを樹状細胞画分上に置いた。同時培養の７日後、回収された細胞を、予防のための天然のレシピエントマウスまたは治療実験のための腫瘍保持マウスへの注射の前にPBSで３回洗浄した。親不死化樹状細胞株であるD2SC/1(WO 94/28113)を、β-galまたはp24抗原のいずれかで形質導入した。得られる２つの不死化樹状細胞株D2SC/1.β-galおよびD2SC/1.p24をコントロールとして使用した。 治療実験のために、JC.p24またはCT26.p24腫瘍保持BALB/cマウスのいずれかを、DA/p24プロデューサー細胞株との同時培養により形質導入された同系BM-DCまたはSP-DC樹状細胞を用いて処置した。腫瘍を、１日目に接種し、続いてp24形質導入BM-DCまたはSP-DCで毎週処置した。免疫実験のために、天然のBALB/cマウスを、１日目および７日目にp24形質導入BM-DCまたはSP-DCで２回免疫し、続いて14日目にJC.p24またはCT26.p24で攻撃した。全てのマウスを、週に２回、腫瘍体積を測定した。全ての実験について、平均腫瘍体積を腫瘍接種後の日数に対してプロットした。Ａ．CT26.p24モデル ２×105 CT26.p24細胞を、50匹のBALB/cマウス（各10匹のマウスの５グループ）に注射し、７、14、および21日目にp24形質導入したBMまたは脾臓由来の樹状細胞を用いて処置した。D2SC/1．β-galおよびDS2C/1.p24を、５×106細胞/マウス/治療で注射した。BM-DCおよびSP-DCを、それぞれ、２〜３×106細胞/マウス/治療または４〜10×105細胞/マウス/治療で注射した。BM-DCおよびSP-DCの効率は、0.1〜１％であると評価され、従って２×103〜３×104(BM-DC)または４×102〜１×104(SP-DC)の形質導入樹状細胞/マウス/治療が注射されたと考えられた。 CT26.p24細胞を用いる樹状細胞治療の効果についての結果を図３に示す。p24形質導入SP-DCまたはBM-DCで免疫されたマウスは、コントロールマウスと比較した場合、腫瘍体積において30％未満の減少を示した。Ｂ．JC.p24モデル ３×105 JC.p24細胞を、50匹のBALB/cマウス（各10匹のマウスの５グループ）に注射し、そして７、14、および21日目に形質導入樹状細胞を用いて処置した。D2SC/1.β-galおよびD2SC/1.p24を、５×106細胞/マウス/治療で注射した。BM-DCおよびSP-DCを、それぞれ、２〜３×e6細胞/マウス/治療または４〜10×105細胞/マウス/治療で注射した。トランスウェル同時培養によるBM-DCおよびSP-DCの形質導入効率は、0.1〜１％であると評価され、従って２×103〜３×104(BM-DC)または４×102〜１×104(SP-DC)の形質導入樹状細胞/マウス/免疫が注射された。 JC.p24を用いる樹状細胞治療の効果についての結果を図４に示す。SP-DC免疫マウスは、コントロール動物と比較した場合、腫瘍体積において約60％の減少を示した。BM-DCワクチン接種動物が１回しかBM-DCで注射されなかった事実にかかわらず、いくらかの保護がなお観察された。いくつかの動物は、腫瘍負荷の減少を示した。D2SC/1.β-gal免疫マウスは、非免疫コントロールとD2SC/1.p24免疫動物との間の中間レベルの保護を示した。２．腫瘍予防 Ａ．JC.p24腫瘍 50匹のBALB/cマウスを１日目に２回免疫し、そして7.3×105 JC.p24細胞を、50匹のBALB/cマウス（各10匹のマウスの５グループ）に注射し、そして７、14、および21日目に形質導入樹状細胞を用いて処置した。D2SC/1.β-galおよびD2SC/1.p24を、５×106細胞/マウス/治療で注射した。BM-DCおよびSP-DCを、それぞれ、２〜３×106細胞/マウス/治療または４〜10×105細胞/マウス/治療で注射した。トランスウェル同時培養によるBM-DCおよびSP-DCの形質導入効率は、0.1〜１％であると評価され、従って２×103〜３×104(BM-DC)または４×102〜１×104(SP-DC)の形質導入樹状細胞/マウス/免疫が注射された。 JC.p24を用いる樹状細胞免疫の効果についての結果を図５に示す。BM-DCワクチン接種動物が１回しかBM-DCを注射されなかった事実にかかわらず、いくらかの保護がなお観察された（図６）。いくつかの動物は、腫瘍負荷の減少を示した。D2SC/1.β-gal免疫マウス（図７）は、非免疫コントロールおよびD2SC/1.p24免疫動物との間の中間レベルの保護を示した。Ｂ．CT26.p24モデル 腫瘍が免疫原性である場合、樹状細胞ベースの予防および治療がより効果的であることが、文献(Zitvogelら、Exp J.Med．183:87，1996)において示唆されている。樹状細胞予防または治療は、免疫原性腫瘍の完全な保護または退行を達成し得るが、弱い免疫原性の腫瘍は、部分的な保護または退行しか達成され得ない。JC.p24は弱い免疫原性であり、従って、おそらく免疫治療に対してほとんど感受性がないので、免疫原性CT26.p24を用いる類似の予防実験は、より良好な保護を示した（図８を参照のこと）。３．樹状細胞ローディングの他の方法に対する比較 以下の実験は、レトロウイルス形質導入が、免疫応答の誘導において、樹状細胞のタンパク質またはペプチドローディングと等価であることを示した。β-galを、DA/β-galベクターで形質導入したCT26腫瘍であるCT26.β-galにおける代理腫瘍抗原として使用した。免疫応答を、β-galで形質導入したか、または抗原ペプチドもしくはタンパク質をロードしたかのいずれかの骨髄樹状細胞を用いて誘導した。以下のグループを免疫誘導について比較し、そして結果は、これらのグループの全てから誘導されたCTL応答に匹敵し得ることを示した。この結果は、ペプチドまたはタンパク質の樹状細胞ローディングが免疫応答を誘導するのに最も良好な方法であると考慮されたので重要であった。同様の効力が、最適化された形質導入法の使用により達成された。 １．処置なし ２．BM-DC．β-gal（マウスあたり１×106）形質導入（DA/β-gal同時培養、７日間） ３．タンパク質の一晩のインキュベーション（100μg/ml） ４．２時間のペプチドローディング（20ng/ml)＋hb2m（10μg/ml）(ヒトβ-2ミクログロブリンは、抗原ペプチドの細胞ローディングのための標準的なプロトコルである） 図９は、樹状細胞に抗原を導入する方法間の比較を示す。この図に示すように、腫瘍攻撃についての等価なレベルの保護を、レトロウイルスベクター形質導入樹状細胞および抗原ペプチドまたはタンパク質をロードした樹状細胞を用いて免疫した動物から観察した。樹状細胞にロードするために使用されたβ-galペプチドまたはタンパク質のモル比は非常に過剰（＞100万倍）であったので（一方、レトロウイルスベクター形質導入効率は１％しかないと評価された）、レトロウイルス形質導入がペプチドまたはタンパク質ローディングと等価な保護を達成することを高く奨励した。 以下の表は、樹状細胞による免疫誘導に必要とされるタンパク質発現のレベルは、線維芽細胞のレベルの１％しかないことを示す。詳細には、線維芽細胞免疫動物と等価な正味CTL溶解を、タンパク質発現が1/100である形質導入樹状細胞で免疫したマウスにおいて観察した。この結果は、樹状細胞による抗原提示の優れた効率を証明した。 本発明は、一般的におよび好ましい実施態様に関しての両方で上記されたが、変化および改変が、前出の記載を考慮して当業者には想到されることが理解される。従って、添付の請求の範囲は、請求される本発明の範囲内にある全てのそのような変化をカバーすることが意図される。 さらに、刊行物、特許、特許出願、および本発明の背景を明らかにするために、特に、詳細な説明および実施例に記載されるようなその実施に関してさらなる詳細を提供するために引用された他の資料は、その全体が参考として本明細書中に援用される。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Immunostimulation mediated by genetically modified dendritic cellsTECHNICAL FIELD OF THE INVENTION The present invention relates generally to recombinant DNA technology. In particular, the present invention provides (i)Transduction in vivo, or (ii) functionally co-administering at least one disease-associated antigen.Injection of dendritic cells transduced ex vivo with an expression vectorCompositions or methods useful for prophylactic or therapeutic stimulation of the animal's immune system.Related.Background of the Invention Stimulation of the immune system against disease-related antigens is an accepted approach to disease prevention.It is a approach. Conventional technology is based on killed bacterial vaccines made from various viral pathogens.Or the use of live attenuated vaccines. With the advent of recombinant DNA technology,A new generation of safer vaccines to combat viral infections (where immunostimulantsAre typically immunogenic proteins encoded by pathogens)Noh. Despite these technologies, many viral diseases and cancers haveOnly few effective treatments or preventive measures have been developed. In recent years, some guruHas been used in animals to respond to HIV-encoded gene products by using gene therapy techniques.We report immunity induction. Specifically, retroviruses encoding the HIV env / rev geneAutologous fibroblasts transduced ex vivo with viral vectors wereInjections into humans, non-human primates, and humans to elicit an immune response to these antigensLed. See Warner et al., 1991; Laube et al., 1993; and Zeigner et al., 1994.. However, such an ex-vivo approach requires individual products (ie,Autologous cells) must be generated for each patient.Not practical for a chin vaccination program. This of the ex vivo approachTo overcome these and other drawbacks, direct the expression of disease-specific immunogensAdministering a gene delivery vehicle carrying an expression vector directly to a patient,Technology development is being attempted. WO 91/02805, WO 93/10814, WO 93/15207, WO 94See / O6921, WO 94/21792, and WO 95/07994. Irwin et al. (1994)After intramuscular injection of recombinant retrovirus into mouse, rhesus monkey, and baboon,Immune induction against a particular immunogen was reported. Improved immunity to disease-associated antigensThere is a need for compositions and methods that allow for epidemiological stimulation.Summary of the Invention It is an object of the present invention to provide immunoprophylactic or immunization of mammals, especially animals, including humans.It is to provide compositions and methods for therapeutic treatment. The composition of the present invention, Against diseases such as cancer, or bacterial, parasitic, or viralTo immunize an animal against infection, the animal is given an immunogen (ie, a disease-associated antigen).Can be used to deliver. Such immunity can be achieved by (i) gene delivery vehicles.Encoded by an expression vector that is delivered byImmunogen expressed and presented on the surface of the vesicle (APC), or (ii)APC (especially dendritic cells) transduced by such an expression vectorThe result of the development of a cellular immune response to the presented immunogen. One aspect of the present invention targets dendritic cells, either in vivo or in vitro.Gene delivery vehicle. Such gene delivery vehicles include dendritic cellsExpression vector directing the expression of a target element and at least one disease-associated antigenIncluding In one embodiment, the expression vector is a recombinant virus.Will be retained. Recombinant viruses are useful in the practice of the present invention, and DNA virusesAnd RNA viruses. In a preferred embodiment, the recombinantRuss is derived from either a minus-strand RNA virus or a plus-strand RNA virus.It is. Examples of positive-strand RNA viruses from which the recombinant virus can be derived includeToroviruses (eg, chicken leukemia virus, bovine leukemia virus, mouseLeukemia virus, mink cell focus forming virus, mouse sarcoma virus,Reticuloendotheliosis virus, Rous sarcoma virus, Mason-Petizer monkey virus, Baboon endogenous virus, cat endogenous retrovirus, gibbon ape leukemia virus,HIV I, HTLV I, and HTLV III), especially mouse retroviruses, togavirusViruses, such as alphaviruses, especially Sindbis virus, Semliki ForestIlls and Venezuelan equine encephalitis virus, picornaviruses, andRonaviruses, including retroviruses and alphavirusesAre preferred. As an example of a minus-strand RNA virus from which a recombinant virus can be derivedRhabdoviruses (eg, vesicular stomatitis virus), myxoviruses, Paramyxoviruses, orthomyxoviruses (eg, influenzaIrs), and Bunia viruses. Useful in the practice of the present inventionUseful DNA viruses from which the recombinant virus can be derived include adenoviruses and antigens.Includes deno-associated viruses. In another embodiment, the gene delivery vehicle is a non-viral gene delivery vehicle.Kuru. That is, the expression vector is not carried by the virus. ThisExpression vectors are either DNA or RNA, and are linear or circularobtain. Particularly preferred expression vectors are eukaryotic layered vector initiation systems.is there. In one embodiment, the expression vector contains one or more polynucleotides.Forms a complex with a condensing agent. Polynucleotide flocculant is polycarbonateThione. Preferred polycations include polylysine, polyarginine, Histones, protamine, spermidine, and spermine;Lysine is particularly preferred. In another embodiment, the expression vector is a dendritic cell targetForm a complex with only the element. In yet another embodiment, the expression vectorIs associated with lipids, preferably liposomes (particularly those composed of cationic lipids).Posomes). If the gene delivery vehicle targets dendritic cells, the dendritic cell targeting element, Can be any molecule that targets the gene delivery vehicle to dendritic cells. Various implementationsIn an embodiment, the dendritic cell targeting element is a high affinity binding pair, a dendritic cell surface marker.Antibodies reactive against dendritic cell surface markersEmbodiments selected from the group consisting of antigen binding domains are included. Preferred high parentsBiotin / avidin, cytostatin / papain and phosAnd those selected from the group consisting of phonate / carboxypeptidase A. GoodMaNew dendritic cell surface markers (to which antibodies (or antigen-bindingTo generate dendritic cell targeting elements) include CD11c, CD54, CD58, CD25, CD11a, CD23, CD32, CD40, CD1, CD45, MHC class I, MHC class II, Mac-1, Mac-2, and Mac-3. In another embodiment, a dendritic cellThe target element is a hybrid envelope protein, where the envelopeThe envelope part is a virus envelope protein (for example, a retrovirus envelope).Protein) and the dendritic cell targeting element is a dendritic cellIt is derived from a protein that specifically interacts with molecules displayed on the membrane. The expression vector of the invention directs the expression of at least one disease-associated antigen. SoAntigens such as are preferably cancer, hyperproliferative diseases, bacterial infections, parasitic infections,And viral infections. Described in this specificationThat can be treated, suppressed, or prevented using the immunostimulatory compositions and methods providedAmong them are, among others, breast, colon, melanoma, lung, brain andLeukemia. Bacterial infections that can be treated, suppressed, or prevented include:This includes pneumonia, sepsis, tuberculosis, and staph infections.Can be Parasitic infections that can be treated include, among others, malaria (Plasmodium spp.)Protozoa (including P. falciparum, P. malariae, P. ovale, and P. vivax)), Sleeping sickness (caused by trypanosoma), andAnd infections that cause ocular onchocerciasis. As described hereinAs a viral infection that can be treated, suppressed, or prevented using the compositions and methodsIs a cause of hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, non-A non-B hepatitis, hepatitis delta, among others.Offspring (hepatitis delta agent), CMV, Epstein-Barr virus, HTLV I, HTInfections caused by LV II, and HIV I. In one embodiment, the expression vector encodes one disease associated antigen.In other embodiments, the expression vector comprises a plurality of disease associated antigens (eg, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 or more antigens). Multiple disease relatedIf the antigens are encoded by a single expression vector, they willOr it can be associated with a different disease. Alternatively, a disease encoded by another expression vectorA set of expression vectors each encoding one or more antigens associated with a disease different from the diseaseCompositions containing the combinations can also be prepared. One or more anti-tumors associated with different diseasesCompositions encoding the original are particularly useful as vaccines. In yet another embodiment of this aspect of the invention, the expression vector is also immunomodulatory.Encode a cofactor. Preferred embodiments of the invention are directed to various gene delivery vehicles and pharmaceuticals of the invention.Pharmaceutical compositions comprising a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. Especially preferredSome embodiments include those in which the pharmaceutical composition is in a solid form. A second aspect of the present invention is an in vivo method for producing a genetically modified dendritic cell.Bo method. Such a method is a gene delivery vehicle targeting dendritic cells.Administering the gene delivery vehicle to the animal, wherein the gene delivery vehicle comprises a dendritic cell targeting agent.An expression vector that directs the expression of at least one disease-associated antigen.Including. In a related aspect, a method of prevention is provided. In one embodiment, thePrevention is accomplished by administering to the animal a prophylactically effective amount of a gene delivery vehicle according to the present invention.Is achieved. In another embodiment, the prevention is at least the anti-antigen of the disease associated antigen.A gene encoding sufficient genetic information to direct expression of the gene encoding theTransduced ex vivo with a gene delivery vehicle carrying the current vector, By administering a prophylactically effective amount of the population of dendritic cells to the animal. In yet another related aspect of the invention, therapeutic treatment of disease (but not prophylaxis).) Are provided. In one embodiment, the therapeutic treatment is a dendritic cell.By administering to the animal a therapeutically effective amount of a gene delivery vehicle that targets the vesiclesAchieved. Here, the gene delivery vehicle is at least the antigenic portion of the disease-associated antigen.Expression vector that encodes sufficient genetic information to direct expression of the gene encodingOwns In another embodiment, the therapeutic treatment is to reduce the amount of the disease-associated antigen.Both encode sufficient genetic information to direct expression of the gene encoding the antigenic portionEx vivo transduction with a gene delivery vehicle carrying an expression vectorThis is accomplished by administering to the animal a therapeutically effective amount of the population of dendritic cells. Methods for preventing or treating such animals include gene delivery vehicles, or simplySingle direct injection of single or multiple ex vivo transduced dendritic cell populationsThus, it can be achieved. In another embodiment, the method comprises the gene delivery of the present invention.Vehicle or ex vivo transduced dendritic cell populationTo multiple sites. Preferred routes of administration are intravenous andIncludes subcutaneous route. Preferred animals for prophylactic treatment by such methods include birds, Mammals, and fish. Particularly preferred mammals are humans, cows, cormorantsEncompasses mammals selected from the group consisting of ma, dog, cat, pig, and sheepI do. Yet another aspect of the invention is an ex vivo method for producing a genetically modified dendritic cell.Bo method. In one embodiment, such a method is performed from dendritic cells.Substantially composed (ie, greater than about 50% dendritic cells, more preferably about 75%Greater than about 90% dendritic cells, more preferably still greater than about 90% dendritic cells,Obtaining more than 95% of the dendritic cells).Genetically modifying this cell population by introducing a gene delivery vehicleI do. In another embodiment, the method comprises obtaining a first population of cells comprising dendritic cells.The first population of cells by introducing the gene delivery vehicle of the present invention.Genetically modifying the second population of cells substantially consisting of dendritic cells.Partially isolating from the first population of genetically modified cells. DendriticPreferred methods for isolating a cell population substantially composed of cells include AffinityTea chromatography and FACS.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 shows some cell surface markers useful for identifying dendritic cells. Since the marker shown by (-) is not present on dendritic cells,Can be used in strategies. Markers indicated by (+) are present on dendritic cellsAnd (++) and (+++) indicate particularly useful dendritic cell markers. (+), (++), And (+++) dendritic cell markers are also targeted by the gene delivery vehicles of the present invention.Indicate suitable targets that can be used. The flow chart in FIG. 2 illustrates the spleen cell separation strategy using the Percoll density gradient.Is shown. FIG. 3 shows the effect of dendritic cell therapy on CT26.p24. Balb / c mice in total2 × 10FiveOf tumor cells were injected. Shown in the figure on days 8, 15, and 22Animals were treated as described. The tumor volume of the mice was measured twice a week. FIG. 4 shows the effect of dendritic cell therapy on JC.p24. 3 in Balb / c mice× 10FiveOf tumor cells were injected. As shown in the figure on days 8, 15, and 22The animals were treated. The tumor volume of the mice was measured twice a week. FIG. 5 shows the effect of dendritic cell immunization on JC.p24. Balb / c mouse with p24Immunize twice (at one week intervals) with transduced scleral dendritic cells and thenFiveOf tumor cells were injected. The tumor volume of the mice was measured twice a week. FIG. 6 shows the dendritic cell immunity against JC.p24 after a single immunization with BM-DC.p24.Show the effect. Balb / c mice were immunized once with BM-DC.p24. One week later, this mouse3 × 10 in totalFiveOf tumor cells were injected. Measure tumor volume twice a week in miceSpecified. FIG. 7 shows the effect of dendritic cell immunization on JC.p24. Balb / c mouse, D2SC / 1.beta.-gal and D2SC / 1.p24 were treated on days 1 and 8. Next, this mouse3 × 10 in totalFiveOf tumor cells were injected on day 15. Tumor volume of mice in one weekMeasured twice. FIG. 8 shows the effect of dendritic cell immunization on CT26.p24. Balb / c mice for one dayEyes and days 7 were immunized with the vaccine described in the figure legend. On the fifteenth day,2 × 10 in totalFiveOf tumor cells were injected. Measure tumor volume twice a week in miceSpecified. FIG. 9 shows a comparison between methods of introducing antigen into dendritic cells. This is a retro uiRuss vectors are compared for protein or peptide loading. Balb/ c mice were immunized on days 1 and 7 with the vaccine described in the figure legend. 8On day, a total of 2 × 10FiveOf CT26.β-gal tumor cells were injected. of mouseTumor volume was measured twice a week.Definition of terms The following terms are used throughout the specification. Unless otherwise indicated, theseWords are defined as follows: "Gene delivery vehicle"Represents one or more genes or sequences of interest in a host cell.(And in preferred embodiments, expressed). ThisRepresentative examples of such vehicles include viral vectors, naked DNA or RNACurrent vector, DNA or RNA expression vector associated with cationic flocculant, LiposoA DNA or RNA expression vector encapsulated in a vector and certain eukaryotic cells.Vesicles (eg, producer cells). Of the preferred embodiment of the present inventionWithin the scope, the gene delivery vehicle may include a target element (eg, the geneCovalently linked to the delivery vehicle, expressed on the gene delivery vehicle, orIs included as an integral part of the gene delivery vehicle, of a high affinity binding pair.Members). "High affinity binding pairIs 10-yK less than MDMolecules that can bind to each other inMeans a set of where y is a group consisting of 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, and 15Selected from As used herein, "KDIndicates the dissociation of reaction A + B = ABMeans a number, where A and B are members of this high affinity binding pair. The minuteAs is understood in the field, as the affinity of two molecules increases, KDDecreasesI do. Affinity constants can be determined, for example, by Scatchard analysis (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci.. 51: 660-672, 1949), easily determined by various techniques, includingCan be done. Representative examples of suitable affinity binding pairs include biotin / avidin, cytosStatins / papain, and phosphonate / carboxypeptidase AYou. "Target element"Means a molecule that can specifically bind to dendritic cells. DepartureIn the context of the description, the binding of the target element and its complementIf biological effects are seen in theMore than 10-fold difference between the binding of the target and non-target cells, preferably 25, 50 or 10If there is more than a 0-fold difference, the target element will bind specifically to dendritic cells.Conceivable. Generally, the target element is a dendritic cell, KD((Scatchard minutes mentioned above)10)-FiveLess than M, preferably 10-6Less than M, more preferably 10-7Less than MAnd most preferably 10-8It is preferred that the bond be less than M. Furthermore, high affinityWhen a sexual binding pair is used for targeting, the target element is preferably a high affinitysexDendritic with an affinity at least 1 log (ie 10 times) less than the affinity constant of the binding pairBinds to cells. Suitable targeting elements are preferably non-immunogenic,It is not degraded by proteolysis and is not removed by the immune system.You. Particularly preferred target elements are preferably in animals (clearing) (in the absence of g agent) has a half-life of between 10 minutes and 1 week. Appropriate targetRepresentative examples of the elements will be described later in more detail. "Target dendritic cells"Refers to a method of targeting dendritic cells. Such a method isDefined as follows: gene delivery vehicles are one of many traditional modalities.After administration in a desired manner, occurs when the gene delivery vehicle lacks the element.Elements that cause increased transduction of dendritic cells compared to transductionOr has reduced transduction of dendritic cells compared to the normal or conventional route of administration.The gene delivery vehicle is administered in a particular manner or by a particular route so as to be enhanced.It is. "Clarifying agentMeans binding and / or cross-linking to the circulating bound target elementMeans a molecule. Preferably, the clarifying agent is non-immunogenic andSpecific to the target element and large enough to avoid rapid renal clearance.Good. Further, the clarifying agent is preferably not degraded by proteolysis andNot removed by the system. Particularly preferred fining agents include bound target elements.Binding to a different site than the affinity binding member.Also preferably binds to block the binding of the target element to its targetThings. Numerous fining agents may be used in the context of the present invention, for example,Marshall et al., Brit. J. Cancer 69: 502-507, 1994. "Expression vector"Refers to the expression of one or more genes encoding disease-associated antigens.Refers to a recombinant nucleic acid molecule (DNA or RNA) that is capable of directing. The expression vector encodes the antigenA promoter operably linked to the gene to be expressed (the expression vectorUnless designed for site-specific integration adjacent to the motor), And a polyadenylation sequence. In certain embodimentsThus, the expression vector is part of the plasmid construct. In addition to the expression vector componentsThe plasmid construct may also include one or more of the following:Dot; one or more selectable markers; plasmid construct present as single-stranded DNASignals (eg, M13 origin of replication); multiple cloning sites;Animal "origin of replication (eg, SV40 or adenovirus origin of replication). Other embodimentsThe expression vector is a recombinant viral genome and the specificEither RNA or DNA depending on the viral system. Alternatively, an expression vectorCan include RNA transcribed in vitro. As used herein,An expression vector is also a vector that is transformed into a different form after introduction into a cell.Say. For example, an RNA genome carrying a recombinant retrovirus is reverse transcribed into DNA.And is integrated into the cell's genome. For the purposes of the present invention, RNA and DBoth forms of NA are “expression vectors”. `` Altered cellular components '' usually cause cells to become tumorigenicOr related to tumorigenic cells, but causes the cells to become tumorigenicProteins that are not required or required for sexAnd other cell components. Prior to alteration, this cellular component is responsible for normal cell growth andAnd regulation, and may be essential for intracellular proteolysis, transcriptional regulation,Includes proteins that regulate cell cycle control, and cell-cell interactions. After transformation, This cellular component no longer performs its normal regulatory function and therefore the cell is unregulatedCan experience invasive growth. Ras is a typical example of a degenerated cell component.*, P53*, Rb*,Ubiquitin, an altered protein encoded by the Lumus oncogene*, Mucin*, DCC, APC, and proteins encoded by MCC genes, and receptors orReceptor-like structures such as neu, thyroid hormone receptor, platelet-derived growthFactor (PDGF) receptor, insulin receptor, epidermal growth factor (EGF) receptorAnd colony stimulating factor (CSF) receptors. These and otherCellular components are described in more detail below and in the cited references. "Non-tumorigenic'' Does not cause cell transformation in nude mice,Or a degenerated cell component that does not induce tumorigenesis. Non-tumorigenic tumorigenic cell componentsRepresentative assays for distinguishing between cellular components are described in more detail below. As used in the present invention,ImmunogenicityElicits an immune response under appropriate conditions.It refers to a degenerated cell component that can be rubbed. This response must be cellular andHumoral response. Representative methods that can be used to determine immunogenicityThe essays are described in more detail below. Numerous aspects and advantages of the present invention are set forth in the following detailed description, which provides a description of the practice of the invention.It will be apparent to those skilled in the art in light of the detailed description.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to the expression of at least one disease-associated antigen in dendritic cells and cellsSurface presentation can generate a prophylactic or therapeutic immune response to a disease associated with that antigen.Based on the discovery that it can be used to In addition, genetically modified treesGenetically Modified Fibroblasts Efficiency of Immune System Stimulation Mediated by Dendritic CellsLarge, several orders of magnitude higher than the efficiency of immune system stimulation mediated by muscle, muscle, and other cell typesIt was discovered that it could be bulky. As a result, these findings areReducing the dosage required to achieve a protective or therapeutic result;Or gene therapy-mediated immune stimulation, either by enhancing the immune responseEnables an improved approach. Diseases suitable for treatment with an immunostimulatory strategy include HBV (WO 93/15207).HCV (see WO 93/15207), HPV (WO 92/05248, WO 90/10459, EPO 133,123), Epstein Barr virus (EPO 173,254; JP 1,128,788; and the United States)Patent Nos. 4,939,088 and 5,173,414), feline leukemia virus (WO 93 /09070, EPO 377,842, WO 90/08832, and WO 93/09238), feline immunodeficiencyIls (US Pat. No. 5,037,753, WO 92/15684, WO 90/13573, and JP 4,126,085), caused by HTLV I and II, and HIV (see WO 91/02805)Virus infection such as melanoma, cervical cancer, rectal cancer, kidney cancer, breast cancer, Ovarian cancer, prostate cancer, cancer such as leukemia; and heart disease. Dendritic cells are a line of antigen-presenting cells that function to initiate an immune response (St.einman, R. (1991), Annu. Rev. Immunol., 9: 272-296; Research in Immunology, Volume 140, International Reviews in Immunology, Volume 6, Advances in Immunology, Volume 47, and Epidermal Langerhans Cell, G .; See also Shuler). Dendritic cells are found in many non-lymphoid tissues, but also in afferent lymphatic flow.Or through the bloodstream to T-dependent regions of lymphoid organs. Non-lymphoid organsIn, dendritic cells include Langerhans cells and stromal dendritic cells. RinIn fluid and blood, dendritic cells are afferent lymphoid cells (aff), respectively.erent lymph veiled cells) and blood dendritic cells. Dendritic cells are efferentIt is not found in the buffer solution. In lymphoid organs, dendritic cells areCells and interdigitating cells. In the context of the present inventionWhen used, each of these cell types and their precursors, unless otherwise indicatedAre called "dendritic cells". Dendritic cells have a unique dendritic shape, are motile, and are unique to cell surface stimulation.Efficient clustering and activation of different T cells. Typically, runDendritic cells in non-lymphoid organs such as gelhans cells and stromal cells are afferentVeil cells in lymph and blood (continuously spread and regress large membrane pseudopodia)Cells that contract), which migrate to lymphoid tissues, where dendritic cells orCan be isolated as clamped cells. A partially enriched population of epithelial Langerhans cells (here, Langerhans cells)Vesicles can make up up to about 60% of the total cell population). Because α-thy-1 (monoclonal antibody) and complement and attachmentThis is because latinocytes can be depleted. Enriched preparation of human Langerhans cellsCan be prepared by replacing α-thy-1 with an anti-CD-1 antibody. During culture, 1Until after 3 days of culture, mouse and human Langerhans cellsAre not active antigen presenting cells. After this period, the blood and lymphatic systemCompletely similar to dendritic cells, these cells expand and become more MHC class II andAnd expresses cell adhesion molecules and loses the Fc receptor. 90% from human bloodA cell population comprising more than 0.1 dendritic cells is obtained, wherein less than 0.1% of leukemia without enrichmentThe sphere is a dendritic cell. Such enrichment is due to T cells, monocytes, and B cells plus NIt can be achieved by continuous depletion of K cells, with dendritic cells ranging from 30-60%Produces an initial population of vesicles. Next, a monoclonal antibody that selectively reacts with impurities(Especially CD45RAHigher purity by panning or FACS using(Freudenthal, P, Steinman, R.M., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) (19)90) 87: 7698-7702). Low buoyant density, generally during culture, to enrich dendritic cellsNon-adherent to plastic (especially after more than one day), and on other cellsA selection is made for the absence of the found marker. Such methods areDepletes cell types, but does not actively select dendritic cells. Dendritic cells express a discernable pattern of markers on their cell membrane. FIG.By indicating the presence or absence of several different cell surface markersThis pattern is illustrated. For positive or negative selection of dendritic cellsOther markers that may be used for ICAM-1 (CD54), LFA-3 (CD58), and CD11b. Isolated from human or mouse blood but not from skinNon-dendritic cells express CD11a and LFA-1. In the skin, dendritic cellsThe immunostimulatory effect can be enhanced by cytokines, especially GM-CSF. Dendritic cells initiate a T-dependent response from quiescent lymphocytes. Once sensitizationThe T cells then interact with other antigen presenting cells. Dendritic cell antigen processingActivity is regulated. Fresh cells isolated from skin or lymphoid organsOnly cells cultured for less than one day) present the native protein. This periodAfter a while, the cells do not process the antigen. In addition, dendritic cells actively eatNot active. Gene therapy-mediated immunostimulation can be achieved in various ways. For example, disease-associated antigensOr a modified form thereof (hereinafter collectively referred to as "antigen")An expression vector can be delivered to dendritic cells to mount an immune response against that antigen. Antigen expression can be transient or stable over time. ExemptionIf the epidemic response is due to a virulence factor (eg, viral, bacterial, or neoplastic, orIf not stimulated by other diseased autologous cells).Preferably, a modified form of the antigen (with reduced pathogenicity compared to the native antigen,Yet stimulates an immune response to fear). Certain diseases caused by viral infections (eg, triggered by HIV)Induced AIDS), the immunostimulatory expression product encoded by the expression vectorIs either an HLA class I-restricted immune response or a class II-restricted immune response orIt is a form that induces both. For HIV, the preferred antigen for immunostimulation is,Preferably from an envelope protein selected from gp160, gp120 and gp41This is to reduce pathogenicity (especially reducing the potential for syncytia)In order to avoid the expression of epitopes that lead to a disease enhancing immune response,To remove some but strain-specific epitopes, or some strain-specific epitopesHave been modified (to present loops). Other HIs that can be expressed for this purposeV genes or gene combinations include gag, pol, rev, vif, nef, prot,gag / pol, gag prot and the like. In addition to this, licenses from other desired antigensEpidemiological moieties can be expressed. The immunogenic portion of the desired antigen may vary in length.And preferably at least 9 amino acids, and may include the entire protein. As one skilled in the art will appreciate, this and similar immunostimulation approachesCan be used to treat a number of diseases. In a further embodiment, the expression vector comprises one or more immunizations of a disease associated antigen.Directs the expression of at least one gene of interest that encodes the intrinsic portion. In this specificationWhen used in at least one gene, the gene of interestEncode the product. "Disease-related" antigens affect cells (or organs)To affect cells or to be generally associated with a disease stateAn antigen that is not required. A wide variety of "disease-related" antigens are known andThese include immunogenic non-tumorigenic altered cell components that are usually associated with tumor cells.(See WO 93/10814). Tumor-associated antigens corresponding to the cellular immune response (eg,, MAGE-1, MAGE-3, MART-1, and gp100) are also used herein as "disease".Disease-associated antigens ". "Disease-related" antigens can be found in various eukaryotes, prokaryotes,It is also understood that it encompasses all or part of a viral pathogen. SaSee WO 93/10814 for further details. Nucleic acid molecules encoding the above products, as well as advantageous for use in the present inventionOther nucleic acid molecules are available from various sources (eg, American Type CultureOr a depository institution such as a collection) or British Bio-Technology Limited(Cowley, Oxford England) and can be readily obtained from commercial sources.Alternatively, a cDNA sequence for use in the present invention expresses or comprises that sequenceIt can be obtained from cells, for example, by RT PCR from isolated mRNA. In the present inventionNucleic acid molecules suitable for use also include, in whole or in part, e.g., Applied Biosystems Inc. DNA synthesizer (eg ABI DNA synthesizer model 392 (Foster City, CA)Can be synthesized above. A.Gene delivery vehicle Gene delivery vehicles (“GDVs”) are used to transfer nucleic acid molecules, specifically expression vectors.A composition that can be delivered to a eukaryotic cell. Representative examples of gene delivery vehicles include:Recombinant viral vectors (eg, retroviruses; see WO 89/09271, andAlphaviruses such as Sindbis; see WO 95/07994), other recombinants andNon-recombinant virus system (eg, adenovirus; see WO 93/19191), one or moreNucleic acid associated with a coagulant (see WO 93/03709), nucleic acid associated with liposomesMolecules (Wang et al., PNAS 84: 7851, 1987), modified bacteriophages, andInclude bacteria. Regardless of the form, GDV is at least present in the target cells.Also carry an expression vector that directs the expression of one disease associated antigen. In one embodiment, GDV is astrovirus, coronaVirus, orthomyxovirus, papovavirus, paramyxovirus,Rubovirus, picornavirus, poxvirus, retrovirus, togauRecombinant virus derived from viruses such as irs, or adenoids. In a preferred embodiment, the recombinant viral vector is a recombinant retrovirusIt is a vector. Retroviruses GDV are, for example, B, C and D retroviruses.A wide variety of retroviruses, including ills, and spumaviru (spumavirus) and can easily be constructed from lentiviruses (RNA Tumor Viruses, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985). Such retroviruses areDepositary institutions such as Cantype Culture Collection (ATCC, Rockville, MD)Or readily available from collections or generally available from known sourcesCan be isolated using various techniques. Numerous reto that can be used in the practice of the present inventionGDV is disclosed in U.S. Patent Nos. 5,219,740 and 4,777,127, EP 345,242 andAnd WO 91/02805. A particularly preferred recombinant retrovirus is chicken leukemia virus (ATCC No. VR-535 and VR-247), bovine leukemia virus (VR-1315), mouse leukemia virus (MLV), mink cell focus forming virus (Koch et al., J. Vir. 49: 828, 1984;And Oliff et al. Vir. 48: 542, 1983), mouse sarcoma virus (ATCC number VR-844, 45010 and 45016), Reticuloendotheliosis virus (ATCC numbers VR-994, VR-770 and 45011), Rous sarcoma virus, Mason-Petizer monkey virus, baboon endogenous virus, Cat endogenous retrovirus (e.g., RD114), gibbon ape leukemia virus (GALV), human immunodeficiency virus (HIV), HTLV I, HTLV III, and retroviral vectors.Retrovirus containing mouse or rat gL30 sequence used as a vectorOriginated from As a particularly preferred strain of MLV capable of producing a recombinant retrovirusIsIs mentioned. A particularly preferred non-mouse retrovirus is Rous sarcoma virus.You. Preferred Rous sarcoma viruses includeIs mentioned. Any of the disclosures provided herein and standard recombinant techniques, if any,Retroviruses are easily used to create or construct retroviral GDVCan be done. In addition, parts of the retrovirus GDV are derived from different retrovirusesCan be For example, the recombinant retrovirus is LTR derived from mouse sarcoma virus., Rous sarcoma virus-derived tRNA binding site, MLV-derived packaging signal,And a second strand origin of synthesis from chicken leukemia virus. These recombinationUse retroviral vectors to transfer these into the appropriate packaging cell line.By introducing the recombinant retroviral vector ofTorovirus vector particles can be generated (see WO 92/05266). In addition, hostSite-specific integration of the recombinant retroviral genome into specific regions of vesicle DNADirected recombinant retroviruses can be produced. Such site-specific integrationIs mediated by a chimeric integrase incorporated into the retroviral particle.Can be See, for example, WO 96/06727. Recombinant viral vectors lack replicationPreferably, the virus is a recombinant virus. In another embodiment, the GDV is from a togavirus. Preferred togaoilExamples of the virus include alphaviruses, particularly alphaviruses described in WO 95/07994, which are related to sharing.Viruses. Typical alphavirus is Sindbis virus. Briefly, recombinant Sindbis expression vectors are typically Sindbis5 'sequence capable of initiating viral transcription, encoding a Sindbis nonstructural proteinNucleotide sequence, modified or inactivated viral junction region, Sindbis RNA polymerase recognition sequence, at least one gene of interest, and polyadenylIncludes tracts. Corresponding regions from other alphaviruses are substituted for the above regions.Can be used instead. In a preferred embodiment, the recombinant alphavirus vector has a structural proteinIt does not code for quality and the gene of interest is located downstream of the viral junction region. No.In a vector having two viral junction regions, the gene of interest is the second virusAnd may be located downstream of the junction region. In such cases, the vector isAnd a polylinker located between the target gene and the gene of interest. Other recombinant togavirus vectors that can be used in the present invention include SemLyki Forest Virus (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), Middelburg Virus (ATCCVR-370), Ross River virus (ATCC VR-373; ATCC VR-1246), Venezuelan eumaEncephalitis virus (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR-1249; ATCC VR-532)And U.S. Patent Nos. 5,091,309, 5,217,879, and WO 92 /10578. The recombinant Sindbis expression vector described above,And many similar vector constructs are described essentially in WO 95/07994.Thus, it can be easily prepared. In another embodiment, the recombinant viral vector is a recombinant adenovirus vector.It is a tar. Such expression vectors are compatible with the disclosure provided herein.Easily prepared and used (Berkner, Biotechniques 6: 616, 1988, and Rosenfeld et al., Science 252: 431, 1991, WO 93/07283, WO 93/06223, and WO 93 /.07282). Other viral vectors suitable for use in the present invention include, for example,Derived vectors. In another embodiment of the invention, the GDV comprises a DNA or RNA expression vector.Representative examples of such GDV include plasmids, cosmids, and linear double strandedAnd single-stranded polynucleotides. Such vectors are used in dendritic cells.Genetic information required to express disease-related antigens inThe open reading frame encoding the disease-associated antigen, transcription terminationSignal, and polyadenylation signal. Such polynucleotidesOne advantage of the system is that large quantities of a given gene delivery vehicle can be easily produced.is there. In vitro transcription may be performed using any of a variety of techniques known in the art.Can produce large amounts of RNA. Similarly, large amounts of DNA are easily cultured in bacteria.Can be In a related embodiment, the GDV is DNA associated with an aggregating agent (eg, a polycation).Or an RNA expression vector. Polycations are negatively charged phosphate boneAggregate the expression vector by masking the case, making the molecule more compactFold it into shape. As a polycation useful in this embodiment of the inventionIs, inter alia, polylysine, polyarginine, histone, protamine, spermiGin, spermine, and other highly basic proteins or polypeptidesNo. These polycations are modified to incorporate the target elementAnd / or reduce the immunogenicity of the nucleic acid / polycation complex. exampleFor example, the polycation may include one or more polyalkylene glycols (eg, polyethyleneGlycol). Alternatively (or in addition),The ON can bind to one or more polysaccharides. Simply put, chemical bonds areWith the formation of a covalent bond between the ON and the polyalkylene or polysaccharide. like thatMany suitable methods for making bonds are known in the art. For example, shareSee WO 96/21036 according to. In another embodiment, the GDV is a liposome-associated DNA or RNA expression vectorIt is. Liposomes are small lipid vesicles that contain an aqueous core surrounded by a lipid bilayer.Compartment is typically composed of a few hundred angstromsSlightly stretched structure. Under appropriate conditions, the liposome isMembrane of endocytic vesicles in cells that have taken up liposomesAnd release its contents into the cytoplasm. But interaction with the cell surfaceBefore, the liposome membrane sequesters its contents from, for example, degrading enzymes in plasma.Acts as a relatively impermeable barrier to protect. In addition, liposomes have a synthetic structureThus, specially designed liposomes incorporating desired characteristics can be produced (St.ryer, L., Biochemistry, 236-240, 1975 (WH Freeman, San Francisco, CA); Szoka et al., Biochim. Biophys. Acta 600: 1, 1980; Bayer et al., Biochim. Biohys. Acta. 550: 464, 1979; Rivnay et al., Meth. Enzymol. 149: 119, 1987; Wang et al., PNAS 84: 7851, 1987; Plant et al., Anal. Biochem. 176: 420, 1989, and United StatesPatent No. 4,762,915). Liposomes are useful for practicing the present invention.A variety of nucleic acid molecules can be encapsulated, including rasmids, and other expression vectors. GDV (including GDV bound to one or more different dendritic cell target element types)Can be further modified. One particularly useful modification is the immunogenicity of the resulting composition.Of compounds that bind to polycations and gene delivery vehiclesIs included. See WO 96/21036 for sharing. B.Gene of interest GDV useful in the practice of the invention described above may include one or more genes of interest,Or at least one antigen associated with or characteristic of the disease to be prevented.Includes or contains the encoding nucleic acid molecule. Such antigens include:Antigens derived from altered cell components, and antigens from foreign organisms or other pathogensYou. A variety of other disease-associated antigens can be used in the gene delivery vehicles of the present invention.See, for example, WO 91/02805, WO 96/20414, and U.S. Patent No. 5,580,859.When. In another embodiment of the invention, an immunogen of an antigen from a foreign organism or other pathogenExpression vectors are provided that direct the expression of the sex moiety. These antigens are also described herein.It is called "disease-associated antigen" in the text. Representative examples of such antigens include bacteria(Eg, E. coli, streptococci, staphylococci, mycobacteria, etc.), fungi, parasitesInsects and viruses (eg, influenza virus, HIV, hepatitis A virus)Virus, hepatitis B virus and hepatitis C virus ("HAV", "HBV" andAnd "HAC"), human papillomavirus ("HPV"), Epstein-Barr virusVirus (“EBV”), herpes simplex virus (“HSV”), hantavirus, HTLV I,From HTLV II, cytomegalovirus ("CMV"), and feline leukemia virusAntigens. An "immunogenic moiety" as used herein, is a suitableEach of which can cause an immune response (ie, cellular or humoral) under conditionsRefers to a part of an antigen. The "portions" can be of various sizes, but are preferably lessBoth are 9 amino acids long and can include the entire antigen. In one embodiment of the invention, the expression vector comprises at least one disease-related vector.In addition to the serial antigen, it encodes a gene encoding an immunomodulatory cofactor. Immune regulationA factor means that when expressed in dendritic cells in addition to a disease-associated antigen,The quality or strength of the immune response to the antigen is determined by the immunityIt is a factor that enhances the response. The quality or strength of the response depends on species known to those of skill in the art.Can be measured by various assays, including, for example, cell proliferationIn vitro assays to measure (eg,ThreeH-thymidine incorporation), and in vitroCytotoxicity assays (eg,51Assay to measure Cr release) (Waener et al., AIDS Res. and Human Retroviruses 7: 645-655, 1991). Another implementationIn an embodiment, the immunomodulatory cofactor is a geneticEither before, simultaneously with, or after the child delivery vehicle is administeredIs added from outside. Immunomodulators can be active both in vivo and ex vivo. like thisRepresentative examples of various immunomodulators include, for example, cytokines, for example,, And MHC (PowisNature 354: 528, 1991). Choosing which immunomodulator to useThe choice is based on the therapeutic effect of the factor. Preferred immunomodulators include α-inExamples include terferon, γ-interferon, and IL-2. Nucleic acid molecules encoding disease-associated antigens can be obtained from a variety of sources, such as American Thai.From contractors such as the Culture Collection (ATCC, Rockville, MD)Or a business such as British Bio-Technology Limited (Cowley, Oxford, England)It can be easily obtained from commercial sources. Alternatively, encode such an antigencDNA is produced from cells known to express or contain the corresponding gene.(U.S. Pat. Nos. 4,683,202; 4,683,195; and 4,800,159).No. PCR Technology: Prlnciples and Applications for DNA Amplification, Erlich (ed.), Stockton Press, 1989). Alternatively, a known distributionSequence, or a gene encoding an antigen of known amino acid sequence, such as Applied Biosystems Inc. DNA synthesizer (eg, APB DNA synthesizer model 392 (Foster City, CA). C.Target element As mentioned above, one aspect of the present invention is to incorporate a gene delivery vehicle into dendritic cells.Provide compositions and methods for targeting either in vivo or in vitro. In the context of the present invention, a target element is a molecule present on the surface of a dendritic cell.Is a molecule that has an affinity for A wide variety of target elements are involved in the practice of the present invention.Can be used to specifically direct gene delivery vehicles to dendritic cells. One embodiment of the present invention provides a method for targeting a gene delivery vehicle to dendritic cells.For the use of high affinity binding pairs. In other embodiments using targeting elements, The targeting element is covalently linked to the gene delivery vehicle via a multifunctional binderIt is. See generally WO 92/05266 for sharing. As will be apparent to those skilled in the art, other targeting mechanisms that can target dendritic cells areWithin the scope of the invention. D.GDVproduction Once the GDV has been designed, it is useful for binding to the desired target element.And / or must be produced in sufficient quantities for administration to animals. GDVIf it is a recombinant viral vector, it is produced using a packaging system.Can be Various viral vector packaging systems are described below. this isOne or more essential functions of the parent virus are deleted, resulting in some functions (eg,Genomic replication) is deleted, but the packaging signal and one or moreIt retains the ability to express gene products from nucleic acid molecules. Virus vectorTypical examples of packaging systems are retroviral vectors, alphavirus vectors.And those for adenovirus vectors. When such a recombinant retroviral vector is used, virus particles are used.It is preferable to utilize the packaging cell line that produces. Where at least gaThe codon at the 5 'end of the g / pol gene isTo minimize the possibility of homologous recombination with the sequence encoding the structural proteinFor this reason, it is modified using the degenerate nature of the genetic code. Present in packaging cellsEvents between the vector and the packaged recombinant retroviral genomeAdditional techniques to reduce the likelihood of sharing are described in WO 95/30763 and WO 96/ 07749. Packaging cell lines suitable for use with the above recombinant retroviral vectorsCan be readily prepared using known techniques (WO 95/30763 and WO 92/05266See also) and producer cell lines for the production of recombinant vector particlesCan be utilized to produce In a further embodiment of the present invention, an alphavirus packaging cell lineIs provided. Specifically, the alphavirus packaging cell lines include:Provided to Viral structural proteins (one or more stably integrated expression vectors)Transfected), transfected, transducedVector RNA transcript, or produced in the cell, is encapsidated in the cytoplasm.And release infectious packaged vector particles through the cell membraneAs such, it produces an alphavirus vector producing cell line. Packaging Cell Line Suitable for Use of the Alphavirus Vector Constructs AboveCan be easily prepared (see WO 95/07994). In a further embodiment of the present invention, the adenovirus packaging cell line isProvided. Adenovirus vectors are derived from nuclear replicating viruses andCan be constructed to be replication defective. One or more nucleic acid molecules is an adenovirusVectors can be carried for delivery to target cells (Ballay et al., EMBO J. Am.4: 3861, 1985; Thummel et al. Mol. Appl. Genetics 1: 435, 1982 and WO 92/0See 5266). In another embodiment of the invention, the targeted gene delivery vehicle comprises a gene delivery system.Includes one or more fusigenic proteins to assist. Fusible tongueA typical example of protein is the ecotropic mouse retrovirus envelope protein.Protein, other retroviruses modified so that normal receptor recognition is not possibleLus envelope protein, herpes simplex virus fusion protein gH andgL-derived fusogenic protein, Epstein-Barr virus fusogenic protein, rubellaViral proteins, malaria parasite fusion proteins, and have fusion propertiesIncludes other proteins known in the art. E. FIG.Purification of gene delivery vehicle Once GDV is produced, they preferably bind to the desired target element.Purified before combining. Further, the composition comprising the targeted GDV is preferably administeredBefore being purified again. The technology used for purification depends on the type of GDV being purifiedDepends on. For example, there are various techniques known in the art. This is GDV, An enveloped recombinant viral vector, nucleic acid, or liposome.(See US Pat. No. 5,447,859 for an example of a purification procedure)Thing). In addition, when GDV is a nucleic acid, there are a variety of techniques known in the art. ThisThis includes, for example, CsCl-ethidium bromide gradient, ion exchange chromatographyGel filtration chromatography and precipitation with polyethylene glycol.Including purification. Further descriptions of nucleic acid purification can be found in Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)Provided. When GDV is a liposome, various purification methods known to those skilled in the art may be utilized,And by Mannino and Gould-Fogerite (BioTechniqucs 6: 682, 1988)be written. Briefly, liposome preparations typically involve one or more purified phospholipids.Mixing a solution of cholesterol and cholesterol in an organic solvent, and drying the solventUntil evaporation. Next, the buffered aqueous solution containing GDV isThe mixture is added to the membrane and the mixture is sonicated to give a homogenous dispersion of liposomes.Is prepared. In certain embodiments, dialysis, gel filtration, or ultracentrifugation is thenUsed to separate entrapped components from intact liposomes F.Prescription After purification of the composition comprising GDV, the preparation is preferably formulated into a pharmaceutical compositionYou. Such compositions may be in liquid or dry form. Preferred liquid compositionMeans that the desired product is suspended in a pharmaceutically acceptable carrier and / or diluent.And aqueous solutions that may further include stabilizers and other excipients. ThereThe compositions of the present invention are prepared in a solid formulation intended to be resuspended immediately before use.Can be made. Dry formulations include those that have been lyophilized or freeze-dried. When GDV is a virus with a lipid envelope, a preferred dry formulation isIncluding some or all of the following: one or more pharmaceutically acceptable carriers andAnd / or diluents: saccharides; high molecular weight structural additives; buffer components; water;And one or more amino acids. Some or all combinations of these ingredientsRetains the activity of the targeted GDV during freezing and lyophilization or drying by evaporationActs as follows. The pharmaceutically acceptable carrier or diluent of the present invention may be usedIt is non-toxic to recipients at different dosages and concentrations. Injectable dissolutionRepresentative examples of carriers or diluents for liquids are, for example, water, isotonic saline(Ie phosphate buffered saline or Tris buffered saline, preferablyBuffered to physiological pH), mannitol, dextrose, glycerolAnd ethanol, as well as polypeptides or human serum albuminContains protein. Viruses with lipid envelopes (particularly recombinant retroviruses andThe preferred lyophilized composition for vaccinia) is 10 mg / mL mannitol, 1 mThose containing g / mL HSA, 20 mM Tris (pH 7.2), and 150 mM NaCl are particularly preferred (WO95/10601). Such compositions can be stored at -70 ° C for at least 6 months.It is fixed. The pharmaceutical composition of the present invention may also comprise cell division, and consequently administered GDV.It may further include factors that stimulate the uptake and uptake of. Stores recombinant virusParticularly preferred methods and compositions for doing so are WO 95/10601, WO 95/07994, andAnd WO 96/21014. GDV in recombinant or liquid formAfter preparation of the composition when it is irs, the recombinant virus is preferably administered per dose.Approximately 10 ng to 1 mg of the substance (about 10 times the amount of the substance shown as a co-purified contaminant)Consists of Preferably, the composition is administered in a dosage of about 0.1-1.0 mL of the aqueous solution. This may include one or more additional pharmaceutically acceptable excipients, stabilizers, or diluents.It may or may not contain an agent. I.Administration Compositions of the Invention (Ex Vivo Modified Dendritic Cells or GD for Direct Administration)V) is typically parenteral in vivo (eg, intravenous, subcutaneous, and intramuscular)) Or other conventional direct routes (eg, cheek / sublingual, rectal, buccal, nasal,Topical (eg, transdermal and ocular), vaginal, pulmonary, intraarterial, intraperitoneal, intraocular, or intranasalRoute) or a specific tissue (eg, liver, bone marrow) or cancerIn the case of treatment, it is administered directly to the tumor. Non-parenteral routeAre further discussed in WO 96/20732. Preferably, the composition is administered to the animal by the desired route, and then the animalTested for biological response. Such tests may be used in immunological screeningAssays (eg, CTL assays, antibody assays). Tests performedIs the product produced by the nucleic acid molecule introduced by the targeted GDV and the treatment orDepends on the disease to be prevented. Based on the results of such tests, theIf the GDV titer is more than administered, the desired effect is further enhancedCan be adjusted to By any of the routes of administration described herein or other routes known in the art.Administration may simply be with a needle, catheter, or related device, at one time orCan be achieved by direct administration at multiple time points. In addition, at a given timeThe “administration” of the gene delivery vehicle (or ex vivo transduced cells therefor)Administration to one or more areas or by one or more routes. The present inventionIn certain embodiments of the one or more doses are administered directly below in the manner indicatedIs: intravenous, 10Three,TenFour,TenFive,Ten6,Ten7,Ten8,Ten9,TenTenOr 1011less than cfuUpper dose; intra-arterial, 10Three,TenFour,TenFive,Ten6,Ten7,Ten8,Ten9,TenTenOr 1011cfu or more dose; intramuscular, 10Three,TenFour,TenFive,Ten6,Ten7,Ten8,Ten9,TenTenOr 1011cfu or higher dose (10TenOr 1011cfu dose is preferred); intradermal, 10Three,TenFour,TenFive,Ten6,Ten7,Ten8,Ten9,TenTenOr 1011Dose greater than cfu; lung, 10Three,TenFour,TenFive,Ten6,Ten7,Ten8,Ten9,TenTenOr 1011cfu or higher dose; subcutaneous, 10Three,TenFour,TenFive,Ten6,Ten7,Ten8,Ten9,TenTenOr 1011cfu or higher dose (108,TenTenOr 1011cfuDose is preferred); stroma, 10Three,TenFour,TenFive,Ten6,Ten7,Ten8,Ten9,TenTen,AlsoIs 1011cfu or higher dose (108,Ten9,TenTenOr 1011cfu dose is preferred)In lymphoid organs (eg, spleen, tonsils, or lymph nodes), 10Three,TenFour,TenFive,Ten6,Ten7,Ten8,Ten9,TenTenOr 1011dose over cfu; 10 in tumorThree,TenFour,TenFive,Ten6,Ten7,Ten8,Ten9,TenTenOr 1011cfu or higher dose (108,Ten9,TenTen,Or 1011cfu dose is preferred); intraperitoneal, 10Three,TenFour,TenFive,Ten6,Ten7,Ten8,Ten9,TenTenOr 1011cfu or higher dose (108,Ten9,TenTenOr 1011cfuDose is preferred); and 10Three,TenFour,TenFive,Ten6,Ten7,Ten8,Ten9,TenTenOr 1011Dosage over cfu. For simplicity, "cfu" alsoRuth particles. Thus, one cfu is equivalent to one non-viral particle. Other routes and methods for administration include non-parenteral routes (eg,WO 96/20732), as well as administration via multiple sites (shared WO96/20731). Example The following examples include more fully illustrating the invention. In addition, theseThe examples provide preferred embodiments of the present invention and limit its scope.Not intended. For many procedures described in the examples below, or alternative procedures as appropriateStandard methods are described, for example, in "Molecular Cloning", 2nd edition (Sambrook et al., Col.d Spring Harbor Laboratory Press, 1987) and “Current Protocols in Molecular Biology ”(edited by Ausubel et al., Greene Associates / Wiley Interscience, NY, 1990) in a widely reorganized manual of molecular biology. Example 1After direct administration of the gene delivery vehicleIdentification of dendritic cells as important antigen presenting cells As described above, an expression vector encoding at least one disease-associated antigen vectorDirect injection of recombinant retroviruses withNew However, the desired disease-associated antigen may be transduced cells (eg, fibroblasts) (thisWhich is then administered to the patient) compared to the ex vivo approach expressed byThus, direct administration of a gene delivery vehicle to a patient can be performed at or near the injection site.Cell transduction and tissue delivery (eg, after intravenous or subcutaneous administration)The transduced cells present in the delivery vehicle (which can be transported to lymphoid tissue). Previously, expression vectors were delivered directly by injection of a gene delivery vehicle.It was unknown which cells were responsible for presenting the encoded disease-associated antigen. Direct to animalsTransduction displaying antigen encoded by an expression vector delivered by direct injectionThe identification of the incoming cells is described below. Expression vectors delivered by the recombinant retrovirus injected directly into the animalPrevious biolocalization studies designed to track the use of whole-organ PCRRovirus DNA was detected at the injection site (Sajjadi et al., 1994; Kamantigue et al.), 1995). In addition, proviral DNA is often detected in secondary lymphoid organs.Was issued. The results show that these animals are not immune to the immunogen encoded by the provirus.Was consistent with the observation that increased the successful immune response. In this study, four expression vectors delivered using a recombinant retrovirus were used.(The HIV gp160 / 120 envelope, bacterial β-galactosidase,Encoding either watrioalbumin or luciferase)Then, cells involved in antigen presentation and immunity induction after direct administration were identified. FourThe cell population was tested. The first cell population contains the expression vector that was identified by PCR.Including virus copies (Group I). The second subset of cells is codedIs a subset of cells expressing the expressed protein (Group II). β-gal tissueThese cells were analyzed using chemical and immunohistochemical assays. The third saBuset (Group III) is a group that can present antigenic peptides to the immune system.Consists of a subpopulation of cells. Group III cells were isolated in a T cell assay.Identified by its ability to induce an epidemic response. Finally, Group IV is an expression vectorAntigen-protein from the corresponding geneDifferent groups that do not express proteins or peptides but still present antigenConsists of cells. Examples of Group IV cells include primary transduced cells or fragments thereof.Contains phagocytic cells for uptake. Such cells are then re-processed toPresent antigen peptides in association with their own MHC molecules.Retro virus vector HIV gp160 / 120, bacterial beta-galactosidase, luciferase, and chickenNon-replicating amphotropicoma having an expression vector encoding ryoalbuminA male recombinant retrovirus was used. Retroviral vector backbone and high titerVirus preparation (> 1 × 107cfu / mL) in WO 89/09271, WO 92/05266, andIt was prepared as described in WO 96/21014. pUG-1 vector (Moore et al., 1993)), A 1.2 kb BamHI to BglII fragment encoding chicken ovalbumin cDNAThe fragment was cloned into the BamHI site of pSP73 (Promega, Madison WI).The 1.2 kb XhoI to ClaI fragment was recovered and the corresponding N2-HIV gp160 / 120With a 3.8 kb XhoI to ClaI fragment. Aliquot of virus preparationTested for replication competent retrovirus (RCR) and contained RCRDecided not to.Animal and vector immunity Harlan Sprague-Dawley 7-8 week old female BALB / c (H-2d) Mouse or C57BL/ 6 (H-2b) Mice were used for all experiments. On days 1, 4, and 7, mice receive:100 μl / injection, a total of 200 μl / mouse, muscle in both gastrocnemius or tibialis anteriorIntra (i.m.) or intradermally at the tail fin with 100 μl of the retroviral preparationdid. By harvesting the spleen and mixing with appropriately irradiated spleen cellsIn vitro CTL culture was started.Immunohistochemistry Antibodies to the following lymphocyte markers can be used in culture supernatant or purified immunoglobulinUsed as: CD4 (rat IgG); CD8 (rat IgM); macrophage (ratIgG); and B220 (rat (IgM)). CD45 (30R11.1, rat IgG; Pharmingen, San Diego, CA), rat Ig (polyclonal; Jackson ImmunoResearch Labs.,Inc., West Grove, PA) and rabbit Ig (polyclonal; Jackson ImmunoRese)arch, PA) was also used. Normal rabbit serum,Used as a negative control. Carefully remove muscle at injection site, soak in OCT, and quickly freeze in liquid nitrogenAnd stored at -70 ° C until use. Cryostat sections at 5-6 μmCut, air dried and fixed with acetone for 5 minutes. Sections were taken from the previously titrated TrIncubate for 60 minutes with the optimal concentration of antibody diluted in is buffered saline (pH 7.4)And washed with Tris-buffered saline, biotinylated anti-rat or rabbitIncubate with IgG and wash, then bind streptavidinIncubation with alkaline phosphatase (Jackson ImmunoResearch, PA)I did it. The bound alkaline phosphatase is converted to the substrate Fastviolet (Surh, J. Exp. Med., Vol. 176: 495-505). Sections with Meyer's HematoxyliCounterstained lightly and photographed under a Zeiss Axioscope microscope. backTo minimize grounding, Airfuge ultracentrifuges (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA), spun at 148,000 xg for 30 minutes and discarded the pelletLater, the antibody was used.Isolation of infiltrating cells Injection site is visualized via fluorescence emission from co-injected latex beadsAfter that, they were excised with surgical scissors and diced. Small pieces of muscle obtained (averageSize 0.5cmThree) Was digested with trypsin for 1 hour at 37 ° C with occasional shaking. At the end of the digestion, fetal calf serum is added and the remaining muscle pieces are removed by gravity.separated. Wash the invading cells with media and luciferase and B3.Z assayAfter the measurement.Spleen cell fractionation by Percoll density gradient (see Figure 2) Percoll stock against 1 part 10x phosphate buffered saline (PBS)Prepared by mixing 9 parts Percoll. "1.030" and "1.075"Working Percoll solution was added to 75% PBS + 25% Percoll stock solution andAnd 40% PBS + 60% Percoll stock solution. NaSpleen cells from an eaves or immunized animal are transformed into B + T cells by the following method., Macrophages, and dendritic cells. Spleen with Hanks balanced salt solutionOccasionally shake at room temperature with DNAse (Calbiochem, 3800 units / mL) in (HBSS)After crushing for 1 hour while moving, it was filtered through a nylon mesh to remove debris.. The resulting cells were pooled and centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes to give "1.075"Re-suspended in Percoll solution. “1.075” Parker with pooled spleen cellsSolution is carefully layered over the "1.030" Percoll solution, and the gradient is run for 20 minutes.And spun at 1200 rpm. After Percoll centrifugation, low-density cells andThe high-density cells in the let were collected separately and thoroughly washed. High density cellsMost B cells except erythrocytes, T cells and plasma cells. Low density thinThe vesicles, as determined by FACS, contain several B cells (including plasma cells), dendritic cells,Included monocytes, and macrophages, but not T cells. In the low density fractionMost B cells are harvested in complete medium (RPMI1640, 10% fetal calf serum) in tissue culture media.After a 2 hour incubation in the plate, remove by careful washing.Was. Remaining adherent cells (including dendritic cells, monocytes, and macrophages)Overnight. Mature macrophages remain attached even after overnight culture.Since it was the only cell to attach, it was isolated from all other cell types.X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indosyl bD-galactopyranoside) staining Cultures were fixed with 3% formaldehyde for 5 minutes at room temperature, then washed with PBS.Was. Cells were harvested at 1 mg / mL X-gal / mL, 5 mM potassium ferrocyanide, 5 mM ferricisate.Potassium anide, and 2 mM MgClTwoLayer. Plate at 37 ° C overnightAfter incubation, microscopically test for the presence of blue cells expressing LacZ.Tested.In vitro CTL induction and cytotoxicity assays Five mice were recombined with a recombinant plasmid harboring an expression vector encoding HIV gp160 / 120.Immunization was performed by administering torovirus. B + T cells, dendritic cells, andMacrophage fractions were prepared. Five non-immunized littermates were treated in a similar mannerProcessed. The cell fraction was mixed with the irradiated stimulant at a ratio of 50: 1, andThe culture was continued for a while.51Cr release assay (Warner et al., (1991), AIDS Res. And Human Retroviruses, Volume 7: 645-655), and the percentage of lysis was calculated.Ex vivo transduction and adoptive transfer of dendritic cells and monocytes Naive mice were sacrificed, the low density fraction was isolated as described above, and GM-CThe cells were transferred to a medium containing SF (25 units / mL) and IL-4 (100 units / mL). DA / KTAnd DA / β-gal producer cell lines with a pore size of 0.45 microns.The seeds were seeded in lance wells. Dendritic cells and producer cells in transwellsThe vesicles were co-cultured for 3 days. The collected cells were thoroughly washed. NaiveStabilize these mice with these transduced dendritic cells or HIV gp160 / 120Transduced fibroblasts were injected intraperitoneally. Spleen from the recipient mouseRestimulated in vitro after harvesting 7 days later, and51Do a Cr release assayWas.B3.ZAssay B3.Z cells are H-2KbT cells that recognize chicken ovalbumin for moleculesIt is an hybridoma. This is a cell fused to the minimal promoter of the human IL-2 gene.Contains a plasmid containing the bacterial LacZ gene and therefore induces LacZ upon antigen stimulationI can do it. Antigen presenting cells are cells transfected with the ovalbumin geneOr fractionated spleen cells from mice immunized with ovalbumin expression vectorIs one of 2 × 10FiveB3.Z cells and 1 × 107Individual containing antigen presenting cellsIncubate the culture overnight, and then evaluate the level of B3.Z activationWas stained with X-gal. The number of antigen-presenting cells in each fraction was counted by the ovalbumin gene.Estimated from a standard curve generated from a culture containing a known number of transfected cells.Was.result Gene that defines the cell type to be transduced and is based on the recombinant retrovirusImmunize the injection site to induce immunity after direct administration of the delivery vehicle to the muscle.Tested by histochemistry to identify cells transfected in vivo.Mice were recombinantly harbored with an expression vector encoding chicken ovalbumin.Immunized with Torovirus. After three injections, the mice were sacrificed for frozen sections.And injection site with antibodies to various leukocyte markers and ovalbuminAnd analyzed by immunohistochemistry. Many infiltrating cells were found in the endomesium near the injection site. MaInjection of F4 / 80 positive monocytes / macrophagesThe site was identified as the most prominent infiltrating cell. Plus, a remarkable number of CD4 positivesBu cells and sometimes B cells infiltrated the injection site. CD8 positive cellsI was not issued. Two dendritic cell-specific antibodies against different epitopes (NLDC-145And N148) could detect a significant number of dendritic cells at the injection site. Of prescription bufferInjected mice show comparable lymphocyte infiltration and no needle damage from injectionIt was suggested that it was sufficient to cause the infiltration of the lymphocyte. Injection skin inner diameter path (equivalentInjection site), the injection site should be the same phenotype.Showed equivalent infiltration by vesicles. Some cells infiltrate ovalbumin protein by immunohistochemistryWas found to be expressed. Double staining with anti-ovalbumin and F4 / 80 antibodyIndicates that some, but not all, ovalbumin-positive cells are macrophagesIt was shown to be co-stained with the marker (F4 / 80). Depending on the expression vector,To confirm injection site expression of the loaded protein, infiltrate cells into LuciferaOr ovalbumin-encoding gene delivery vehicle.Was. First, cells were analyzed by the NBT assay, most of themIt was confirmed that the cell line was a macrophage / monocyte cell line. The invading cells thenLuciferase or B3.Z assay. Luciferase assays areMost luciferase activity is concentrated in infiltrating cells, but not in the rest of the muscle.Revealed that there is no. In addition, the B3.Z assay shows that infiltrating cellsOvalbumin was presented. Has normal rabbit serumParallel sections or mice treated with the HIV gp160 / 120-encoding gene delivery vehicle.No staining was found with anti-ovalbumin antibody at the injection site of the mouse. ThisThese results indicate that some fractions of infiltrating cells at the injection site were actually transduced.Expressing antigenic proteins that can be processed to stimulate an immune responseAnd These experiments show that inflammation caused by needle injury promotes leukocyte infiltrationLeukocytes may then be transfected by the gene delivery vehicle.Is These transfected leukocytes then induce an immune responseTransplanted into a secondary lymphoid organ to do so. To confirm this, a provirusDNA integration and protein expression were determined by different leukocyte populations in lymph nodes and spleenWas analyzed. Previous studies of biolocalization using DNA isolated from whole organsLed to the detection of proviral DNA in the secondary lymphoid organs of S. japonica (Sajjadi et al., Supra; Ka).mantigue et al., supra). Due to the limited sensitivity of whole organ PCR,Staining was performed on fractionated spleen cells. Purify spleen cells from immunized miceAnd separates into B cell, T cell, macrophage, and dendritic cell fractionsdid. In mice immunized with the gene encoding HIV gp160 / 120 or β-galIn addition to a marker gene that confers resistance to neomycin,Thus, the encoded neo marker is used for the fractionation of dendritic cells and macrophage cells.Was detected. Since expression of the proviral DNA was detected in the leukocyte cell fraction,Protein expression from these transfected cellsAnd analyzed. BALB / c mice receive a gene delivery vehicle that directs β-gal expressionThree injections were made. The spleens were pooled and fractionated as above, followed by X-Gal staining was performed. Unfractionated spleen and dendritic cell fractions consistent with PCR dataShowed β-gal staining. Most of the transduced cells start in clustersWhich is clonally derived from the first transferato cellsSuggest that. Here, 0.2% of dendritic cells are transfected,Corresponds to approximately 2,000 cells per mouse. Furthermore, the macrophage fraction andCells from the inguinal and popliteal lymph nodes of these mice showed some X-gal stainingHowever, the number was greatly reduced compared to the dendritic cell fraction. The high density fraction is BIncluded cells and T cells and were negative for X-gal staining. The phenotype of the transduced cells was further analyzed. B cells, T cells, andThe clophage fractions are representative of those of CD45R / B220, Thy-1.2, and F4 / 80.Homogeneous after fractionation as judged by marker profileWas done. In contrast, they attach to plastic immediately after cell isolation, but after overnight culture.Cells that do not adhere to the plastic are stained based on some dendritic cell antibody staining.These cells contain most of the dendritic cells and are therefore customarily referred to as dendritic cell fractions.Also showed that some CD45R / B220 positive B cells (about 20%) and F4 / 80 positiveLive monocytes / macrophages (about 30%). More adherent mature macrophaWere separated by persistent adhesion to the plastic, so"Monocyte / macrophage cells in the cell fraction appeared to be monocytes. ThereforeDetermines the percentage of transgenic pure dendritic cells and monocytes in the "dendritic cell" fractiondid. In addition, some F4 / 80 positive cells transduced at the injection siteIt is clear that these cells are trafficking the spleenWere determined. The mouse-derived spleen cells transduced with the β-gal gene were fractionated, andThe "dendritic cell" fraction was thus obtained. Cells are sorted using two-color FACS and CD45R / B220Positive, F4 / 80 positive, or double negative cells (ie,B cells, monocytes, or dendritic cells) were collected. Each population was then stained with X-gal.And β-gal activity was found at 0.035% in monocytes and 0.025% in dendritic cells.In the cell fraction, it was not found. These results show that spleen-derived spleen dendritic cells andAnd both monocytes / macrophages can be transduced, andIt shows that protein can be expressed. "Dendritic cells" from the immunized animal are recognized by the immune system and thusSuch cells can be used to prime naive spleens in vitroA study was performed to determine whether antigen stimulation was possible. Free one group of miceIt was infected and expressed the HIV envelope gp160 / 120. These spleen cells areFractionated into loops: B + T cells; macrophages; and the fraction of "dendritic cells".Naive littermates were similarly processed. 6 separate cell glues obtainedThe mix was mixed to reconstitute the spleen cell population. Add irradiated stimulant and inviteThe CTL culture was started in (b). Immunized with cells expressing the HIV envelope gp160 / 120Unfractionated immunized spleen and spleen cells from mice wereIncluded as The first four combinations from the immunized mice (including the B + T cell fraction)M), but could induce an excellent immune response. Interestingly, the "tree"Only the "dendritic cell" fraction can elicit an immune response in a naＢve B + T cell population,The "dendritic cell" fraction contains antigen presenting cells capable of initiating an immune response in vitro.And proved. Dendritic cells are the only cells capable of initiating an immune response in vitro.As previously identified as a population, this “dendritic cell” populationShould contain dendritic cells. The above data indicates that dendritic cells and macrophages transduced in vivoDemonstrated that it can induce a primary immune response in vivo and in vitro.The ability of ex vivo transduced cells to stimulate an immune response was also studied. Low densityThe cell fraction was separated by percoll gradient separation of the naive spleen,Stimulated with a cocktail of Itokine to promote cell division. Proliferating cellsRecombination with an expression vector encoding HIV gp160 / 120 using swell cultureAnd transduced with a retrovirus. Transduced dendritic cells and macrophage cellsAliquots were transferred to a naive host, followed by restimulation in vitro, andAnd performed CTL analysis. As expected, recipient mice elicit superior CTL responsesAnd confirmed the role of these cells in inducing immunity. The relative potency of inducing the immune response of transduced dendritic cells compared to other cell typesFor evaluation by the ex vivo method, transduced dendritic cells wereTransduced fibroblasts expressing comparable levels of the same antigen injected by ColAnd compared. Transduction of dendritic cells based on retrovirus-mediated luciferase expressionThe efficiency of entry is approximately equal to the same protocol, followed by standardization based on protein content.0.1%. Based on this transduction efficiency,Mouse is 5 × 10FiveAverage about 5 × 10 in injected cellsTwoReceived transduced dendritic cellsIt was calculated. Immune response induced by these ex vivo transduced dendritic cellsThe level is 3 x 10 expressing the same antigenFour~ 1 × 10FiveSame for injecting fibroblastsComparable to the level of immune response generated using the same injection protocol. Based on this calculationThus, a single transduced dendritic cell was isolated from 60-200 transduced fibroblasts.Induces an immune response equivalent to the epidemic response. The above data shows that the protein expressing cells are relatively rare. Derived antiTo assess the frequency of antigen presenting cells between cells expressing the original or protein,These rare antigen-presenting cells are isolated at the injection site and at various sites using the following procedure.Identified in the organ organ. C57BL / 6 mice were injected with ovalbumin-encoding recombinant retrovirus.Pooled spleen was fractionated into B, T, matalophage, and "dendritic cells". These potential antigen presenting cells express LacZ protein upon antigen stimulationIncubated overnight with B3.Z cells, a CTL hybridoma. These culturesArticles were stained with X-gal to assess the level of B3.Z activation. As a control, B3.Z cells were incubated with the following reagents: plate-bound anti-T cell receptorA known number of E7.G cells transfected with the ovalbumin gene;Immune splenocytes; or unfractionated immune splenocytes. The standard curve is analyzed using a fixed number of E7.G cells.Generated from the frequency of activated blue B3.Z cells incubated with and each spleen fractionFrom which the frequency of antigen presenting cells was assessed. On average about 100 anti-spleens per spleenOriginal presentation cells, total 107Detected in mice injected with recombinant retrovirus of cfudid. Splenocytes pooled from these mice were obtained one week after in vitro stimulation.Generated 40% lysis in CTL assays performed at 100: 1 effector: target ratioI did In another series of experiments, 10 C57BL / 6 mice were used as described above.Una 6 × 107The same gene delivery vehicle of cfu was injected. Place cells at the injection site andIsolated from the rat organs. Comparison to a standard curve generated from E7.G cell recognition1 × 10FiveAnd 4 × 10FourAntigen-presenting cells were isolated from inguinal lymph nodes and popliteal phosphorus, respectively.It was shown that it was recovered from Pak node. 2 × 10FourRecover antigen presenting cells from the injection siteWas. This data indicates that antigen presenting cells are quite rare. Therefore, gene therapyTreatment-mediated immunity induction is achieved by increasing the transduction of selected cell types as described below.Can be improved. As shown above, the cells affected by gene delivery vehicle-mediated transductionThere is a hierarchy. Cells containing the expression vector can be transferred to various sources (whole organs)., Purified cell populations, or tissue sections in situ)Can be detected by such techniques. Among cells containing an expression vector (Group I),In some cases, only some express proteins (Group II), but Group I cellsThe relative size of the population and the group II cell population can be compared in many instances.You. Group II cells are examined by various techniques, including histochemistry and immunohistochemistry.I can put it out. When examining the duration of heterologous protein expression, loss of expression isAlthough not occurring during the course of the study (10 days), the duration of expressionIt appears to vary depending on the offspring delivery vehicle. Antigen processing and presentation involves many steps and parameters:Including: processing of antigenic proteins into peptides; transport of peptides to the endoplasmic reticulumBinding of peptides to appropriate MHC class I molecules; and peptide-MHC class I complexesA microenvironment in which the body can interact with cytotoxic T cells. Thus, protein expressing cellsOnly a sub-population appears to present antigenic peptides to the immune system (groupIII). The above results confirm this hypothesis, and antigen presenting cells are quite rareFind out for sure. Finally, it does not contain an expression vector and therefore cannot express the antigen,Nevertheless, there is a different group of cells presenting antigen (Group IV). theseAs an example of a cell, a primary transduced cell or a fragment thereof is taken up andTo reprocess and present the antigenic peptide for its own MHC molecule (That is, cross-priming) and phagocytes are mentioned. The above results indicate that antigen presentation after direct administration of the gene delivery vehicleAnd that it is mediated by macrophage cells. Tied to a particular theoryWithout transfection, the final transduced cells at the injection site are caused by needle damage.It appears that it can be replenished by this inflammatory response. After transduction, the cellsIt is excreted into the spleen via a tube and appears to present antigen. Therefore,Vivo transduced monocytes / macrophages and dendritic cells transfer the immune responseAn excellent source for Therefore, self- or haplotype-matched,Dendritic cells or monocytes / macrophages can be used for immunotherapy to treat or prevent disease.Can be used in therapeutic approaches. However, ex-vivo gene therapyDue to the stickiness and other complications, gene delivery vehicles can be delivered directly to patients.Is preferred. In a particularly preferred approach, in vivo transduction of dendritic cellsIs performed. In order to enhance such transduction, patients can be selectively treated with leukocytes.Gene delivery vehicles encoding cytokines such as GM-CSF that cause proliferationCan be treated by pre-injection or co-injection. Alternatively, such immunomodulationA recombinant version of the cofactor may be administered. In a particularly preferred approach,The gene delivery vehicle is targeted to dendritic cells in vivo. Such targeted genesAn example of a representative production of a delivery vehicle is described in Example 2 below. Example 2Retrograde to induce prophylactic and therapeutic immune responses against tumor-specific antigensMouse dendritic cells transduced with the ils vector1.Tumor treatment Human papillomavirus (HPV) is used in several human cancers, especially in the cervical region and analInvolved in the development of squamous cell tumors of the hilar region. Some papillomavirus typesE7 protein is derived from cervical epithelium by binding to the tumor suppressor gene Rb product.Mediates oncogenic transformation of vesicles. The E7 gene is immortalized, andCells (Kanda, T et al., J. Virol, 62: 610-613, 1988) and primary human fibroblasts (Watanabe, S et al., J. Virol, 63, 965-969, 1989). ProteinMutational analysis of E7, intended to elucidate the relationship between quality structure and function,A single point mutation at acid 24 eliminates transforming ability, while transactivating activity(Edmonds, C et al., J. Virology 63, 2650-2656, 1989)Therefore, this E7 variant was called p24. Theoretically, present in most cervical cancersE7 proteins are attractive targets for in vivo stimulated T cell responses. Since the mouse cell line is not permissive for HPV infection, two surrogate HPV regions were added to DA / p24Produced by transducing a retroviral vector from a producer straindid. The DA / p24 producer strain was transformed with the p24 gene (Edmonds, C et al., J. Virology 63, 26).50-2656, 1989) was inserted into the retroviral backbone instead of the ras gene.JC (ATCC No. C), a mammalian carcinoma cell line constructed as described in Example 2 aboveRL-2116) and CT26, a colorectal carcinoma cell line (Michael Brittain at Baylor Co.)llege of Medicine) was transduced with DA / p24, and JC.p24 and CT26.p24, respectively.Was prepared. The transduced dendritic cell fraction was prepared as follows. Slaughter native miceThe spleen dendritic cell (SP-DC) fraction was prepared as described in Example 1. Bone marrow dendritic cells(BM-DC) was prepared by washing long bones followed by complement-mediated removal of B cells.Made. They were converted to RPMI 1640 medium containing GM-CSF (500 U / ml) and IL-4 (1000 U / ml).Put in. DA / p24, without leaking producer cells across the membrane, 0.45Transwell with micron pore size (Corning Costar, Cambridge, MA). The dendritic cell fraction was transferred to low attachment tissue culture wells (Corning Costar, Cambridge, MA) and place the transwell containing DA / p24 on the dendritic cell fraction.placed. After 7 days of co-cultivation, the recovered cells are transferred to a natural recipient for prevention.3 washes with PBS prior to injection into tomato or tumor-bearing mice for treatment experimentsdid. The parental immortalized dendritic cell line, D2SC / 1 (WO 94/28113),Were transduced. The resulting two immortalized dendritic cell lines D2SC / 1.β-gal andAnd D2SC / 1.p24 were used as controls. For treatment experiments, either JC.p24 or CT26.p24 tumor-bearing BALB / c mice were used.And syngeneic BM-DC transduced by co-culture with the DA / p24 producer cell line.Or treated with SP-DC dendritic cells. Tumors were inoculated on day 1 followed by p24 traitsTreated weekly with introduced BM-DC or SP-DC. Native BALB / c mice for immunization experimentsWere immunized twice on days 1 and 7 with p24-transduced BM-DC or SP-DC, followed by 1On day 4, she was attacked with JC.p24 or CT26.p24. All mice were treated twice a week with tumor cellsThe product was measured. For all experiments, the mean tumor volume wasPlotted.A.CT26.p24model 2 × 10Five CT26.p24 cells were transferred to 50 BALB / c mice (5 groups of 10 mice each)) And dendrites from p24-transduced BM or spleen on days 7, 14, and 21The cells were treated. D2SC / 1. β-gal and DS2C / 1.p24 at 5 × 106Cell / MauInjections / treatment. BM-DC and SP-DC were 2-3 × 106Cells / mouse /Treatment or 4-10 × 10FiveInjected cells / mouse / treatment. BM-DC and SP-DC efficiencyIs estimated to be between 0.1 and 1%, thus 2 × 10Three~ 3 × 10Four(BM-DC) or 4 × 10Two~ 1 × 10Four(SP-DC) transduced dendritic cells / mouse / treatment seemed to be injected. The results on the effect of dendritic cell therapy using CT26.p24 cells are shown in FIG. p24Mice immunized with transduced SP-DC or BM-DC were compared to control mice.Showed less than a 30% reduction in tumor volume.B.JC.p24model 3 × 10Five JC. P24 cells were transferred to 50 BALB / c mice (5 groups of 10 mice each)And treated on days 7, 14, and 21 with transduced dendritic cells.D2SC / 1.β-gal and D2SC / 1.p24 at 5 × 106Injected cells / mouse / treatment. BM-DC and SP-DC were treated with 2-3 × e6 cells / mouse / treatment or 4-10 × 10 6, respectively.FiveFineInjected in vesicles / mouse / treatment. Transwell co-culture for BM-DC and SP-DCThe transduction efficiency was estimated to be between 0.1 and 1% and therefore 2 × 10Three~ 3 × 10Four(BM-DC)Or 4 × 10Two~ 1 × 10Four(SP-DC) transduced dendritic cells / mouse / immune injected. The results on the effect of dendritic cell therapy using JC.p24 are shown in FIG. SP-DC immunityMice show about a 60% reduction in tumor volume when compared to control animals.Indicated. Does the fact that BM-DC vaccinated animals were injected only once with BM-DC?Nevertheless, some protection was still observed. Some animals have reduced tumor burdenshowed that. D2SC / 1.β-gal immunized mice were unimmunized control and D2SC / 1.p24 immunizedIt showed an intermediate level of protection between the animals.2.Tumor prevention A.JC.p24tumor Fifty BALB / c mice were immunized twice on day 1 and 7.3 x 10Five JC.p24 cells, 50 BALB / c mice (5 groups of 10 mice each) were injected and 7,14,And on day 21 they were treated with transduced dendritic cells. D2SC / 1.β-gal and D2SC /1.p24 is 5 × 106Injected cells / mouse / treatment. BM-DC and SP-DC, respectively, 2-3 × 106Cells / mouse / treatment or 4-10 × 10FiveInjected cells / mouse / therapy. The transduction efficiency of BM-DC and SP-DC by transwell co-culture is 0.1 to 1% And therefore 2 × 10Three~ 3 × 10Four(BM-DC) or 4 × 10Two~ 1 × 10Four(Transduced dendritic cells / mouse / immunization of (SP-DC) were injected. The results on the effect of dendritic cell immunization using JC.p24 are shown in FIG. BM-DC WakuDespite the fact that chin-inoculated animals were injected only once with BM-DC, someWas still observed (FIG. 6). Some animals showed reduced tumor burden. D2SC / 1.β-gal immunized mice (FIG. 7) were treated with non-immune control and D2SC / 1.p24It showed an intermediate level of protection between immunized animals.B.CT26.p24model Dendritic cell-based prophylaxis and treatment is more effective if the tumor is immunogenicIt has been suggested in the literature (Zitvogel et al., Exp J. Med. 183: 87, 1996).I have. Dendritic cell prevention or treatment achieves complete protection or regression of immunogenic tumorsBut weakly immunogenic tumors can only achieve partial protection or regression. JC.p24 is weakly immunogenic and, therefore, probably less sensitive to immunotherapy.A similar prophylactic experiment with immunogenic CT26.p24 would give better protection since it was not(See FIG. 8).3.Comparison of Dendritic Cell Loading to Other Methods The following experiments demonstrate that retroviral transduction is notEquivalent to vesicle protein or peptide loading. β-galWas substituted in CT26.β-gal, a CT26 tumor transduced with the DA / β-gal vector.Used as tumor antigen. The immune response was transduced with β-gal orInduction using bone marrow dendritic cells, either peptide or protein loadedLed. The following groups were compared for immunity induction, and the results wereIt was shown that CTL responses derived from all of the loops could be comparable. The result isDendritic cell loading of peptides or proteins is most important for inducing an immune response.Was also considered important because it was considered a good method. Similar potency, but optimizedWas achieved by the use of a transduction method. 1. No treatment 2. BM-DC. β-gal (1 × 106) Transduction (DA / β-gal co-culture,7 days) 3. Overnight protein incubation (100 μg / ml) 4.2 hours peptide loading (20 ng / ml) + hb2m (10 μg / ml) (human β-2Microglobulin is a standard protocol for cellular loading of antigenic peptides.Is col) FIG. 9 shows a comparison between methods of introducing antigen into dendritic cells. As shown in this figureEquivalent level of protection against tumor attack, retroviral vector transductionImmunization using dendritic cells and dendritic cells loaded with antigenic peptides or proteinsObserved from quarantined animals. Β-gal pepti used to load dendritic cellsThe molar ratios of the proteins or proteins were so large (> 1 million times)Retroviral vector transduction efficiency was estimated to be only 1%), retrovirusIls transduction achieves protection equivalent to peptide or protein loadingHighly encouraged. The table below shows the levels of protein expression required for induction of immunity by dendritic cells.Indicates that there is only 1% of the level of fibroblasts. Specifically, fibroblast immunityEquivalent net CTL lysis in animals with transduced dendritic cells with 1/100 protein expressionObserved in immunized mice. This result indicates that antigen presentation by dendritic cells is excellent.Prove efficiency. Although the invention has been described above both in general and with respect to preferred embodiments,It is understood that changes and modifications will occur to those skilled in the art in light of the foregoing description.You. Accordingly, the appended claims are intended to cover all such claims as falling within the scope of the invention as claimed.It is intended to cover such changes. In addition, publications, patents, patent applications, and the present invention may be, Particularly with respect to its implementation as described in the detailed description and examples.Other materials cited to provide details are incorporated herein by reference in their entirety.Invite to
─────────────────────────────────────────────────────フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０８／７７２，０１０(32)優先日 平成８年12月19日(1996．12．19)(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ(72)発明者 リー，バージニア アメリカ合衆国 カリフォルニア 92007, カーディフ，エバーグリーン ドライブ 1374(72)発明者 ジォリー，ダグラス ジェイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 92924, リューカディア，ヒルクレスト ドライブ 277────────────────────────────────────────────────── ───Continuation of front page (31) Priority claim number 08 / 772,010(32) Priority date December 19, 1996 (December 19, 1996)(33) Priority country United States (US)(81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE,DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), CA, JP(72) Inventor Lee, Virginia United States California 92007, Cardiff, Evergreen Drive 1374(72) Inventors Gory and Douglas J. United States California 92924, Leucadia, Hillcrest Drive 277