【発明の詳細な説明】発明の名称 ＴＳＨレセプター自己抗体を検出するためのレセプター結合アッセイ 本発明は甲状腺の自己免疫病、特にグレーブス病において生じるＴＳＨレセプター自己抗体を測定するための競争的レセプター結合アッセイ（競合レセプター結合アッセイ）に関する。 甲状腺が関与する多くの病気は甲状腺の分子構造に対する自己抗体が形成され、そして病気と関連して自己抗原として作用し始める自己免疫病であることが知られている。甲状腺の自己抗原として知られる最も重要なものはチログロブリン（Ｔｇ）、チロイドパオキシダーゼ（ＴＰＯ）そして特にＴＳＨレセプター（ＴＳＨｒ）である。（フルマニアック ジェイ(Furmaniak J.)等、Autoimmunity １９９０， ７巻６３−８０頁を参照）。 ＴＳＨレセプターは甲状腺膜に局在し、脳下垂体腺によって分泌されるホルモンのＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン又はチロトロピン）がこれに結合し従って実際の甲状腺ホルモン特にチロキシンの分泌の引き金となるレセプターである。ＴＳＨレセプターは、大きなアミノ末端細胞外ドメインを有している、Ｇ−プロテイン結合糖蛋白質レセプターからなるレセプターファミリーに属し、このファミリーにＬＨ／ＣＧ及びＦＳＨレセプターも属している。ＴＳＨレセプターの化学構造すなわち、それをコードしているＤＮＡ及びそこから誘導されるレセプター自体のアミノ酸配列は１９８９年の終りに明らかにされた（リバート エフ等，Biochem．Biophys．Res．Commun．165: 1250-1255; ナガヤマ ワイ等． Biochem．Biophys．Res．Commun．165:1184-1190;を参照、又 EP-A-0433509及びWO-A-91/09121; 及び WO-A-91/09137;WO-A-91/10735及び WO-A-91/03483も参照; 更にユージ ナガヤマ 及びバシル ラボポート：Molecular Endocrinology，６巻Ｎｏ．２、１４５−１５６頁及びそこに引用された文献も参照）。 刺激性自己抗体は、グレーブス病としてしられる甲状腺自己免疫病に於て、ある役割を果たすことが一般に知られており、その自己抗体はＴＳＨレセプターに対して形成されそしてそれと相互作用をするので、甲状腺が刺激され甲状腺亢進症として現われる。従ってＴＳＨレセプターに対する自己抗体の測定はグレーブス病の診断のためにかなりの臨床的な重要性を有している。 実験動物又は特別な細胞培養基が役割を果たすような、そしてまた現在となっては特には歴史的な興味しかない検定方法は別として（シム ドライゲル等(Schumm-Draeger)、Akt．Endokr．Stoffw．10(1989)，９０−１０２頁）、今日まで本質的に２つの基本的な方法に従ってＴＳＨレセプター自己抗体を測定することが可能である（モルゲンターラー(Morgenthaler) エヌ ジー等 Exp Clin Endocrinol Diabetes 104（1996）増補版(Suppl)４ ５６〜５９頁）。細胞刺激試験に於て、文献中ではしばしば省略記号ＴＳＩ（ＴＳＩ＝甲状腺刺激性イムノグロブリン）と呼ばれる刺激性ＴＳＨレセプター自己抗体の存在は次のような事実となってその正体が現われる。即ち、細胞膜中に天然又は組替えＴＳＨレセプターを有し、そして自己抗体を含有している試料と接触する適当な細胞の特定機能特にｃＡＭＰの形成（環状アデノシンモノフォスフェート）がその刺激によって引き金を引かれた如く現われるか又は強化されるということである。バイオアッセイとも呼ばれるこれらの試験に於て、刺激効果は選択的に測定されるが、測定は極めて複雑で従って通常の臨床診断には非常に適しているものとは言えない。 別の方法として、自己抗体は競争的なレセプター結合アッセイ、特にラジオレセプターアッセイ、例えばベー．アール．アー．ハー．エム．エス．ディアグノスティカゲーエムベーハー．(B.R.A.H.M.S．Diagnostica GmbH)からのＴＲＡＫ−アッセイRの使用によって測定することも出来る。この慣用方法によるＴＳＨレセプター自己抗体の測定の為には、測定されるべき血清試料に由来する自己抗体は、液相において、洗剤で可溶化されたブタＴＳＨレセプターの結合場所に対して放射性の標識が付けられたウシＨコンペティター（競争物質）と競争させられる（サウスゲート(Southgate) ケー等Clin．Endocrinol． （オックスフォード）２０，５３９−５４１（１９８４）； マツバ ティ等， J．Biochem.１１８，２６５−２７０頁（１９９５）； ＥＰ ７１９ ８５８ Ａ２； ベー．アール．アー．ハー．エム．エス．ディアグノスティカゲーエムベーハー．(B.R.A.H.M.S．Diagnostica GmbH)からのＴＲＡＫ−アッセイRについての製品情報を参照）。レセプター調製物に対し結合した標識化されたＴＳＨを測定するために、培養が完了したのちにＴＳＨレセプターは沈殿試薬を用い、その後の遠心段階を用いて液相から分離される。レセプターに結合した標識化ＴＳＨは沈殿物中の結合した放射活性を測定することによって測定される。測定は標識化ＴＳＨと測定されるべき自己抗体の間のＴＳＨレセプターの共通した結合場所に対する競争に基づいているから、実際にＴＳＨと競争する自己抗体の全部のみがこの方法で測定される。ＴＳＨ結合を阻害することができるそのような競争性の自己抗体は文献でＴＢＩＩ（ＴＢＩＩ＝チロトロピン結合阻害性イムノグロブリン）とも呼ばれ、それらの活性の程度もいわゆるＴＢＩＩ活性％として述べられる。 異なる組成の異質な自己抗体群が甲状腺の自己免疫病で形成されることが以前から知られている。刺激性自己抗体とＴＳＨと競争性の自己抗体とは部分的にしか一致しない。即ち、ＴＳＨと競争しない刺激性の自己抗体が存在し、又刺激効果を有しないＴＳＨと競争性の自己抗体が存在する。更に刺激効果も有さずＴＳＨとも競争しない自己抗体も存在する（例えばラドゲート(Ludgate)エム等Mol.Cell.Endocrinol.73(1990),R13-R18;フィレッティ(Filetti) エム等，J．Clin．Endocrinol．Metab．72，１０９６−１１０１頁1991; モルゲンサーラー(Morgen thaler) エヌ．ジー等， Exp Clin Endocrinol Diabetes 104(1996)Suppl４，５６−５９頁及びその中に援用された文献を参照）。この結果、ラジオレセプターアッセイによっても自己抗体はグレーブス病にかかっている患者の約８０〜９０％しか検出することができない（例えば「免疫学に於ける推論診断」［Rational Diagnostics in Endocrinology］， Thieme Verlag，４９頁パラグラフ：TSH Rezeptorautoantikorper（ＴＳＨ−ＲＡＫ）［ＴＳＨレセプター自己抗体（ＴＳＨ−ＲＡＢ）］；又は ロパーズ エー等，Cell．Immunol．161，２６２−２６９頁(1995)；オオモリ エム等，Biochem．Biophys．Res．Commun．174，No.1(1991)，３３９−４０３頁； エンドウ ティ等，Biochem．Biophys．Res．Commun．181，No.3(1991)，１０３５−１０４１頁； グプタ エム．ケー，Clin．Biochem．２５， １９３−１９９頁(1992)を参照）。グレーブス病で生じる自己抗体の一部を検出することが出来ないのは、今日まで競争的なラジオレセプターアッセイの測定原理のためであるから、グレーブス病にかかっている患者の臨床的な様子と、競争するＴＢＩＩ自己抗体の測定の結果との間の不一致が明らかであるかどうか、刺激性のＴＳＩ自己抗体を測定するための補充的なバイオアッセイ測定を実施することがかなりの複雑さにも拘らずすでに提案されている（デルウォール エム等，Exp.Clin.Endocrinol.100(1992)，７５−７９頁）。 記載されたように臨床的な価値が限られていることとは別に、ＴＳＨレセプター自己抗体の検出の為の今日まで知られている競争的なラジオレセプターアッセイは、ＴＳＨレセプター調製物の結合能力がレセプターの変化又はそれによって結合される生物分子の変化に対し、一般的に非常に感受性があるという事実の為に、実用性に於ける基本的な欠点を有している。例えばホルモン類又は自己抗体類等のペプチド性又は蛋白質性の生物分子の、レセプター類への結合は通常非常に複雑であり、レセプターと生物分子間の特異的な結合の形成はレセプターがなにも役割を果たさない多くのイムノアッセイの基礎となっている通常の抗原／抗体結合対の場合よりも、構造的な変化、特にレセプターの構造に於ける変化に対し、ずっと感受性が高い。ＴＳＨレセプターを固定する試み及び／又は標識する試みは、常に構造的な変化につながり、このことは非常にレセプターの機能を損なう。この結果、抗体／抗原結合を用いるイムノアッセイ、特に固定された結合パートナーが用いられ、そして測定の最後に固相に対するトレーサー結合の濃度が直接測定されるか又は酵素、酵素の基質又は化学発光トレーサーなどのかさばった分子が標識に使用されるイムノアッセイに於て利用出来る多くの基礎的なアッセイ型は、ＴＳＨレセプター自己抗体の測定のためにレセプター結合アッセイを実施するためには今日まで実際的には使用出来なかった。固相へのトレーサーの結合の測定は一連の測定に対する殆どの自動検定ユニットの基礎を形成するから、今日までそのような自動ユニット上でＴＳＨレセプター自己抗体の測定をするための既知の検定法を実施することは可能ではなかった。 ＤＥ ４３ ２８ ０７０ Ｃ１特許は被覆されたチューブの技術に従って操作されるレセプター結合アッセイ法の一つの型を記載しており、ここでは標識又は固定された機能するレセプター調襞物を製造することの困難性が実際のレセプター結合反応のいわばシャドウ（影）を表わす競争反応系の固相成分に結合されることによって克服される。しかしながらこの方法の開示された原理は複雑すぎることが証明されており、従って通常の臨床診断に検定法を提供することは実現しそうはない。この特許の一般的なレセプター結合アッセイの問題についての一般的な記載及び特にＴＳＨレセプター自己抗体の測定についての問題に関する一般的な記載は参照によって本明細書に取り込まれることをここに明示する。 更にＥＰ−Ｂ−０ ４８８ １７０は、細胞のないレセプター結合試験を開示しており、ここではアミノ末端レセプター蛋白質及びキャリア蛋白質特にイムノグロブリンの重い鎖の一定断片（Ｆｃ）からなる組替え融合レセプターが使用され、この融合レセプター類は高血清又はモノクローナル抗体によって固相に結合される。議論されるレセプター類は高分子量Ｇ−蛋白質結合糖蛋白質レセプターからなるクラスには属しない。更に、イムノグロブリンのＦｃ断片であるキャリア蛋白質を結合させることによる固定化は、その固定化の助けによって自己抗体が測定されるべきレセプター結合アッセイには非常に適してはいない。なぜならば自己抗体それら自身がイムノグロブリン類に属し、固定系に結合し得るからである。 更に、ＤＥ ４１ ２０ ４１２ Ｃ１は、固定された特異的自己抗体、適当な臓器抽出物の形態の粗製自己抗原、特にＴＰＯ、及び標識された更に別の抗体から構成されるサンドイッチの、試料中に存在する自己抗原に対する自己抗体による攪乱が測定の為に使用される自己抗体の測定法を開示している。攪乱の意味は、試料中に存在する自己抗体が、原則として各個々の免疫結合と、又は完成したサンドイッチの構造に関与する両方の免疫結合と相互作用できるということである。記載されたレセプターの感受性と要求される選択性を有している自己抗体が不足しているために、今日までこの原理を自己抗原がレセプターであり、標識された結合パートナーが標識されたホルモン例えばＴＳＨである場合に対し、応用することができなかった。 ＴＳＨレセプターの分子構造が明らかにされた後に、ヒト組替えＴＳＨレセプター、そのようなレセプターの（シグナルペプチドなしの３９８個のアミノ酸からなる）Ｎ−末端細胞外断片、及びより短いレセプターペプチド部分配列のコンジュゲート類に対するモノクローナル及びポリクローナル自己抗体が、ＴＳＨ結合及び抗体結合の責任を担っているＴＳＨレセプターのエピトープを明らかにする目的で、数多くの研究グループによって製造された。（例えばエヌ．ジー．モルゲンサーラー(Morgenthaler)等，Exp Clin Endocrinol Diabetes 104(1996)Suppl４ 56-59頁; シーサラマイアー ジー．エス．等，Endocrinology 134，No.2，549-554頁(1994); デサイ アール．ケー．等， J．Clin．Endocrinol．Metab．77:658-663，1993; ダラス ジェイ．エス．等， Endocrinology 134，No.3，1437-1445頁(1994);ジョンストン エー．ピー．等，Mol．Cell．Endocrinol．105(1994)，R1-R9; シーサラマイアー ジー．エス．等， Endocrinology136，No.7，2817-2824頁(1995); ニコルソン エル．ビー．等， J．Mol．Endocrinol．(1996)16，159-170頁; ロパース エー．等， Cell．Immunol．161，262-269頁(1995); オオモリ エム．等， Biochem．Biophys．Res．Commun．174，No.1(1991)，399-403頁;エンド ティ等，Biochem．Biophys．Res．Commun．181，No.3(1991)，1035-1041頁; コスタグリオラ エス．等， Endocrinology 128，No.3，1555-1562頁，1991; マリオン エス．等， Endocrinology 130，No.2，967-975頁(1992); ジェイ．サンダース等， J．Endocrinol．Invest．19(Suppl６),1996及び更にこれらの刊行物に引用されている文献を参照）。ＴＳＨレセプター又は組替えによって造られたその部分配列に対する種々の自己抗体の結合挙動について、そして特にＴＳＨレセプターの種々の形態又は断片に対するＴＳＨの結合の乱れを生じる種々の抗体の能力に関して、種々の抗体が試験された。種々のポリクローナル又はモノクローナル抗体が異なる動物を免疫化することにより及び／又は異なる発現系からの組替え物質を使用することによって造られて以来、そして組替えで造られた異なる起源からのＴＳＨレセプター又はそのペプチド断片が、しばしば結合試験に使用されたあとでも、そして更にレセプターペプチドのグリコシル化及び／又は正しい折り曲げ(folding)が多くの抗体の結合に決定的に必要でありそうであることがわかって以来、天然のＴＳＨレセプターのエピトープ構造及びポリクローナル自己抗体の固体群中に生じる自己抗体のエピトープ特異的な結合挙動は未だ完全に説明されてはいない。 例えばダラス ジェイ．エス．等，Endocrinology 134，No.3，1437-1445頁(1994)による刊行物中で、バクロウィルス／昆虫細胞発現系の助けにより造られたそして、Ｎ−末端シグナルペプチドのないヒトＴＳＨレセプターの細胞外ドメインのアミノ酸を有している部分的な組替えＴＳＨレセプターが、ウサギを免疫化するのに使用され、そして約２０個のアミノ酸を各々有している合成ペプチドを使用してアフィニティクロマトグラフィーによって生じるイムノグロフリンフラクションから、特異的な抗体フラクションが得られる。次に上記の特異的な抗体フラクションは、なかでも市販レセプター結合アッセイ中での可溶化されたブタＴＳＨレセプターに対するＴＳＨの結合を封鎖する適正について調べられる。この抗体は刺激活性を示さなかった。 シーサラマイアー ジー．エス．等，Endocrinology 136，No.7，2817-2824頁(1995)による刊行物は、上記の刊行物のものと同じ部分的な組替えＴＳＨレセプターが、マウスを免疫するのにどの様に使用されたか、そして標準技術に従ってＴＳＨレセプターの個々のエピトープに対するモノクローナル抗体を造るのにどの様に使用されたかを記載している。同様の手順がニコルソン エル．ビー．等，J．Mol．Endocrinol．(1996)16，159−170頁に記載されている。 上に記載されたように造られたシーサラマイアー ジー．エス．等，Endocrinology 134，No.2，549-554頁(1994)に従う部分的な組替えＴＳＨレセプターは、その後折り曲げられて放射性標識化ＴＳＨを結合する適性について試験された。この目的の為に、これは放射性標識化ＴＳＨと液相で反応させられる。次に、生じる複合体をできるだけ定量的に反応混合物から分離するために、完全なＴＳＨレセプター配列の３５７−３７２のアミノ酸を含有し、そして折り曲げられてない部分的な組替えＴＳＨレセプターに対しＴＳＨの結合を阻害しないことが示されているペプチド断片のコンジュゲートでウサギを免疫化することによって造られた抗体が、沈殿系の一部として加えられる（デサイ アール．ケー．等，J．Clin．Endocrinol．Metab．77:658-663，1993）。次に加えられた抗体又はそれを含有している複合体及び結合されている放射性標識化ＴＳＨは任意の抗体と非特異的に結合するプロテインＡの助けにより沈殿させられる。試験条件下でプロテインＡのレセプター結合抗体に対する結合は、同時にＴＳＨ結合を損なうことがないように見える。 組替えＴＳＨレセプター又はその部分に対する抗体を使用して得られた知識は、イムノプレシピテーションアッセイの形態に於て第３のそれ自体は知られている原理を使用することによってＴＳＨレセプター自己抗体を測定するという提案に導かれ、そこでは35Ｓ−標識化メチオニンを組込むことによって標識される組替えＴＳＨレセプターの細胞外の部分の調製物が沈殿の為の試薬として使用される。そのような検定はＴＳＩにもＴＢＩＩにも選択性を有していない（エヌ．ジー．モルゲンサーラー等，Exp Clin Endocrinol Diabetes 104(1996)Suppl４ ５６−５９頁）。しかしながらインヴィトロの翻訳による標識化されたレセプターを調製することは極めて複雑で費用がかかり、35Ｓによって放出される放射線のための通常の臨床的な測定に適した測定装置は存在しない。従ってこの方法は通常の臨床診断の為の測定方法としては適していない。 本発明の目的は、先行技術のそのような競争的レセプター結合アッセイの記載された欠点を有しないＴＳＨレセプター自己抗体を測定するための競争的レセプター結合アッセイを提供することである。 特に本発明の目的は、慣用の固相上での測定する検定方法の反応体から形成されたＴＳＨレセプター複合体を固定することが可能であり、そして適したトレーサーがないということに関する既存法の制限を克服することが可能であるので、そのようなレセプター結合アッセイの為の自動的方法を用いることが可能である、ＴＳＨレセプター自己抗体を測定するための改良された競争的レセプター結合アッセイを提供することである。 特に本発明の更に別の目的は、先行技術の検定法と比較してより大きな臨床価値が得られるような方法で、ＴＳＨレセプター自己抗体の検出の為の改良された競争的レセプター結合アッセイを設計することである。 本発明の更に別な目的は、そのような改良されたレセプター結合アッセイを通常の臨床診断に於て実施するための試薬キットを提供することである。 上記の目的は請求項１のプレキャラクタライジングクローズ（前段）に従って、請求項１のキャラクタライジングクローズ（後段）に記載された特徴を有している、少なくとも一部はラジオレセプターアッセイによって達成される。（原文脱文あり） 本発明に従う改良されたレセプター結合アッセイの有利な具体例はサブクレーム中に記載されており、特に本明細書の記載中の次の説明と組合せて記載される。 対応した試薬キットを提供する目的は、各場合に於て請求項１５に従う成分（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の少なくとも一つを含有している本発明に従う方法を実施するための試薬キットによって達成される。 本発明のレセプター結合アッセイの為の種々の可能な具体例をカバーするために、下にイントロダクションによって説明される一般的な表現のモードが、請求項１において、そのようなレセプター結合アッセイの既知の特徴を記載するためにも、そして本発明に従うレセプター結合アッセイが先行技術のものとは異なる特徴についても、用いられる。 イントロダクション部分で説明されるように、全てがラジオレセプターアッセイとして設計されている既知の競争的レセプター結合アッセイは次の検定成分を含有している。 可溶化されたＴＳＨレセプター（ｉ）、特に可溶化された天然の動物（ブタ）ＴＳＨレセプターであって動物の甲状腺膜から得られるもの。 更に既知のラジオレセプターアッセイは放射標識されたウシＴＳＨ（ｉｉ）を含有し、これは、使用されるＴＳＨレセプター上の共通の結合場所について血清試料（ＴＢＩＩ）からのＴＳＨレセプター自己抗体と競争する。この競争は今日まで最も重要性を有するものであり、又存在する自己抗体の大部分、即ち８０〜９０％の測定を可能にもするものであるので、先行技術の標識化されたＴＳＨは、請求項１で使用される「プライマリーコンペティター」という定義によってカバーされる。しかしながらこの定義は又他の形態の「プライマリーコンペティターズ」を含むものであり、この場合の使用は本発明によって初めて許されるものである。即ちより詳しく下に記載するＴＳＨレセプターに対する標識化された選択的抗体も、ＴＢＩＩに対する競争者として、又必要ならば他の自己抗体フラクションに対する競争者として使用出来る。更にＴＢＩＩとの競争のため、固相に結合したＴＳＨも「プライマリーコンペティター」の定義を満たすことが出来るべきである。 初めにも説明したように、ＴＳＨレセプターとこれと結合している反応混合物の成分即ち標識化されたＴＳＨと自己抗体との複合体は沈殿試薬によって反応混合物から沈殿され、そして遠心分離により反応混合物から分離される。請求項１のプレキャラクタライジングクローズ（プレアンブル）の意味に於て、沈殿試薬は（ｉｉｉ）に従う試薬としてみなされるべきである。本発明に従う競争的レセプター結合アッセイの場合に於ては、そのような試薬（ｉｉｉ）は固相に結合している反応体に対応し、そして固相上で固定されている主として特異的ＴＳＨレセプター抗体であるが、「鏡像」具体例に従うとこれは又固相に結合したＴＳＨでも有り得る。 本発明に対し必須の発見は、ＴＢＩＩ自己抗体及び標識化されたＴＳＨに対するＴＳＨレセプターの結合能力が有為に損なわれることなしに、ＴＳＨレセプターの適当な部分配列に対し特異的となされている固定された選択的抗体の助けによって、任意の種類の可溶化されたＴＳＨレセプター調製物からの天然のＴＳＨレセプター（即ち折り曲げ／グリコシル化が、天然のＴＳＨレセプターに少なくとも本質的に対応している、ヒト、動物又は組替えＴＳＨレセプター）の固定も可能であるという発見である。従ってこの発見は、固相への結合が測定できるという形態に於て、例えばプライマリーコンペティター放射標識化ＴＳＨの、結合され標識化されたコンペティターの量が測定できる方法でＴＳＨレセプター自己抗体の測定の為のレセプター結合アッセイを実施するための前提条件を造りだす。しかし驚くべきことに、選択的ＴＳＨレセプター抗体の助けによって固相上にＴＳＨレセプターを固定することにより、ＴＳＨレセプター自己抗体の測定の為の競争的レセプター結合アッセイの臨床的価値をかなり改良することが可能であることが更にみいだされた。下により詳細に説明されるように、実際固相に結合される特異的抗体の適当な選択によって、この検定系は試料からの自己抗体が競争することができる少なくとも更に１つの結合場所を含有している。 固相に結合された抗体が、「プライマリーコンペティター」による競争によって測定されるＴＢＩＩとは別の、試料中の自己抗体と競争する「セカンダリーコンペティター」として作用するように選択されるならば、臨床的な価値の増加が達成される。実際、生じる測定系は、患者の試料からの異質ポリクローナル自己抗体でのサンドイッチの異なる結合場所でダブルディスターバンス（２箇所の攪乱）が存在している。ＤＥ ４１ ２０ ４１２の図３に図解される検定系と類似のものとみなすことが出来るものである。このようなディスターバンス（攪乱）はトレーサーが固相に結合することを防止するのに十分であり、測定範囲は広げられ感度が増加する。２つの抗体と粗製抗原を使用するそのような変形が米国特許５，５０１，９５５にも記載されている。 本発明の方法に従って、例えば、（シグナルペプチドを含んでいる）完全なＴＳＨレセプターのアミノ酸配列の２０〜３９のアミノ酸を有する合成ペプチドに対し造られた特異的な抗体を使用することによって、臨床の症状に基づいてグレーブス病患者に分類される全ての患者は、慣用のラジオレセプターアッセイでは８０％しか陽性として測定されなかったにも拘らず、自己抗体陽性として全ての患者が測定された。グレーブス病の間に発生するＴＢＩＩ以外の自己抗体と競争する「第２の競争者（セカンダリーコンペティター）」を使用することによって、グレーブス病の診断の為のレセプター結合アッセイの臨床価値をかなり改良することが可能である。 「セカンダリーコンペティター」は好ましくは細胞刺激試験中で刺激性と測定され、そしてＴＳＨとの競争性がないために慣用のラジオレセプターアッセイによっては検出されない自己抗体（ＴＳＩ）と競争することが好ましい。しかしながら「セカンダリーコンペティター」が競争する自己抗体は実際には刺激効果を有する必要が無く、従ってグレーブス病の臨床症候群を強める必要は無い。「セカンダリーコンペティター」と競争する自己抗体は、封鎖効果を有している自己抗体サブポピュレーションに属することも出来、又は実際の病理学的過程に対し重要でないもので有り得る。そのような自己抗体サブポピュレーションがグレーブス病にかかっている患者の血清中で常に又はしばしば存在する限り、このレセプターアッセイの臨床的価値は、ＴＢＩＩ自己抗体のみを検出する慣用のラジオレセプターアッセイのものよりも大きいものである。 従って好ましい「セカンダリーコンペティター」を形成する適当な選択的抗体は、ＴＳＨ結合に参加しないがグレーブス病中で自己抗体が形成されるＴＳＨレセプターの断片に対する抗体である。アフィニティクロマトグラフィによって精製されたポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として製造された抗体を使用する今日までの研究は、選択的な抗体として特に適した結合領域であるＴＳＨレセプターの幾つかの断片を生じている。しかしながら今日までの文献データーの解釈に於て、殆どの選択的抗体が組み替えによって造られたＴＳＨレセプターペプチド又は合成ペプチド断片に対し造られたものであって、従っておそらく配列を有する性質のものであるということが注意されるべきである。自然界に於て記載される抗体の主要な部分が細胞刺激試験において無効であることが更に証明されている。このことは血清からの自己抗体との競争にもかかわらず、合成によってつくられた抗体を測定されるべき自己抗体と同一視することができないことを示している。更に天然のＴＳＨレセプターの折り曲げ及びそのグリコシル化の為に、ネイティブなＴＳＨレセプター調製物に対する合成的に造られた抗体の結合挙動は、合成ペプチド又は組替えによって造られたＴＳＨレセプター断片の結合挙動とは異なり得る。しかし本発明の教える知識をもってすれば、特定の場合に於て比較的単純な通常の試験で本発明に従う方法のために特別な特異的抗体の適合性を決定し、そしてそれらの「セカンダリーコンペティター」として作用する能力を測定することが可能である。 下に記載される試験は、完全なＴＳＨレセプターの２０〜３９のアミノ酸の範囲からのペプチドに結合することがしられている固定された特異的な抗体、及び慣用のトレーサーとして標識化標識化されたウシＴＳＨ「プライマリーコンペティター」を使用して実施された。使用された抗体は慣用のハイブリドーマー技術によって対応する合成ペプチドからのコンジュゲートの助けで免疫化された後に選択及び製造されたモノクローナル抗体であった。文献には同様にＴＳＨレセプターの細胞外ドメインのアミノ末端の同じ領域又は重複する領域に同様に結合する種々のポリクローナル又はモノクローナル特異的抗体が記載されている。（ダラス ジェイ．エス．等 Endocrinology 134，No.3，1437-1445頁(1994); シーサラマイヤー ジー．エス．等， Endocrinology 136，No.7，2817-2824(1995); ニコールソン エル．ビー．等， J．Mol．Endocrinol．(1996)16，259-270頁; オオモリ エム．等， J．Endocrinol．(1992)135，479-484頁; エンド ティ．等， Biochem．Biophys．Res．Commun．177，145-150頁(1991);ヒロオカ ワイ．等，Med．Sci．Res．1992，20，639-640頁参照）。上記刊行物中に記載される製造技術と抗体の型は原則として試験中で、特に使用された抗体を置き換えるのに適しているが、ＴＳＨレセプターの近い配列に対する抗体が非常に異なる抗体型に属し得ることが知られていることも注意されるべきである。 実施例中で使用される抗体の代替物として、そしてヒトＴＳＨレセプターの２０〜３９のアミノ酸に対する抗体の代替物として、２８７〜３０１、３６１〜３８０又は７３９〜７５８の領域に対し造られた抗体も適している。しかし以下に記載される試験に基づいて、特別の場合に特別の性質がチェックされるべきである。 慣用のラジオレセプターアッセイの最初の検定法（アッセイ）デザインが放射性標識されたＴＳＨとより大きな程度違ったもので、そして放射標識化ＴＳＨの変わりに別の標識化された選択的抗体が使用されるならば、「プライマリーコンペティター」と「セカンダリーコンペティター」の間の上記の区別は明確さがより少なくなるか又はその意味を完全に失うものと成り得る。これは本発明に従うレセプター結合アッセイの検定原理に関するなにものをも変化させず、そしてそのような検定も本発明によって保護されるという事実に関するなにものをも変化させないものである。 測定溶液中に形成されるＴＳＨレセプター複合体の固定を、本発明に従う方法は複合体に直接結合されるトレーサーで又は固定後導入されるトレーサーで可能とするという事実の為、そして更に放射性同位体以外のトレーサーを有する試薬が使用できるから、ＴＳＨレセプター自己抗体アッセイの実際の操作は過去に可能であったものよりもずっとより良く臨床的な実施の要件に適合化できる。培養計画も変化されることができ、そして次の実施例中で記載される培養計画は最早必須ではないようである。 プラスチック表面、ミクロ粒子、磁気粒子、フィルター、ポリマーゲル物質及び他の既知の固相基質を固相として使用できる。標識化された自己抗体を使用することが出来ること及び固定されたＴＳＨを使用することができること（固定されたＴＳＨに対する結合の為のＴＳＨレセプターの能力についてはリードマンピー．ジェイ．等J．Clin．Endocrinol．Metab．69，134-141頁1989を参照）は、かなりこの検定法の使用範囲を増加し、特に適当な直接又は間接のトレーサーの自由な選択に関して使用範囲を増加させるであろう。本発明の方法によって、ＴＳＨレセプター自己抗体アッセイを自動化することも可能である。従って検定法デザインは既知の自動システム上で実施することが出来るように適合化できる（例えばボーリンガーマンハイムからのエレクシス システム又はチバ コーニングからのＡＣＳ１８０システムを参照）。そのような自動化されたシステム中で、ピペット操作は試料の自動的取扱の過程で実施され、標識化されたＴＳＨとの又は自由に標識化された抗体（例えばルテニウム錯体標識化又はアクリジニウムエステル標識化）とのプレミックスとして、ＴＳＨレセプターに対する適当な特異的抗体で被覆されているか、又はＴＳＨで被覆された磁気粒子を次に混合することができ、そして最後に基本的に任意の適当なＴＳＨレセプター物質を加えることが出来る。培養後慣用の固相−液相分離が可能であり、そして信号を測定することができ、必要ならば適当な試薬を加えることによってシグナルの引き金を引いた後にこれを行うことができる。実施例に従って述べられたピペット操作の順序は変化し得る。 本発明に従う方法は二つの図面を参照しながら、特定の具体例に基づいてより詳細に以下に説明される。 図１は、以下の実施例で記載される本発明に従う方法の具体例について、常法で得られた標準曲線を示している。そして 図２は、グレーブス病にかかっている患者群の測定の場合における本発明に従う方法によって得られた測定結果と慣用のラジオレセプターアッセイ（ベー．アール．アー．ハー．エム．エス．ディアグノスティカ ゲーエムベーハーからのＴＲＡＫ−アッセイR）によって得られた測定結果の比較を示している。 実験の記載 材料 以下に記載される実験において、種々の市販物質が使用され、特にベー．アール．アー．ハー．エム．エス．ディアグノスティカ ゲーエムベーハー製ＴＲＡＫ−アッセイRの成分、固定の為に造られた抗体を精製するためのファーマシア製ＮＡＰ２５デサリネーションカラム、固相基質物質としてピアース製カルボリンク材料及びフルカ製過ヨウ素酸ナトリウムが使用された。 １．ＴＳＨレセプターに対するモノクローナル抗体の製造 先行技術の方法によって（上を参照）、ｈＴＳＨレセプターの選ばれたペプチド類に対する種々のモノクローナル抗体が造られた。一つのペプチドに対するモノクローナル抗体であって完全なヒトＴＳＨレセプターの２０〜３９のアミノ酸（アミノ酸配列 ＧＧＭＧＣＳＳＰＢＣＥＣＨＱＥＥＤＦＲＶ）を含有するモノクローナル抗体が、更に試験をするために用いられた。 ２．固相に結合されたモノクローナル抗体の製造。 ＰＢＳ（リン酸塩緩衝化された塩溶液；50mM リン酸ナトリウム，100mM ＮａＣｌ，ｐＨ7.5）で１：１０に希釈されている、そして上記のモノクローナル抗体を含有している腹水溶液２０ミリリットル中に２５０ミリグラムの過ヨウ素酸塩を溶解し、培養を室温で３０分実施した。反応溶液をＮＡＰ２５脱塩カラム（ファルマシア）上で製造業者の方法によって脱塩した。脱塩された蛋白質をＰＢＳ中で洗浄されたカルボリンク(Carbolink)材料(10ミリリットル)と混合した。 一定の振温をしながら４℃で一夜培養後、上にモノクローナル抗体が結合している生じるゲル０．５ミリリットルをプラスチックカラム(0.5X4cm)中に満たし、そして２５ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ２．５（洗浄容量2ml）で洗浄した。このカラムをＰＢＳ（2ml）で平衡化し、そして次に更に試験をするために使用した。 ３．上記カラムの助けによりＴＲＡＫ−アッセイR（ベー．アール．アー．ハー．エム．エス．ディアグノスティカ ゲーエムベーハー）の成分を使用してラジオレセプターアッセイを実施した。 ラジオレセプターアッセイ（標準曲線の準備、患者試料の測定）をＴＲＡＫ−アッセイRを実施するための方法に従って実施した。次のピペット操作計画が用いられた。 ５０μlの試料をピペットで取った。 ５０μlの可溶化されたウシＴＳＨレセプターを次にピペットで加えた。 室温で１５分間培養を実施した。 １００μlのトレーサー（放射性ヨウ素で標識したＴＳＨ）をピペットで加えた。 得られた反応バッチを上記のようにモノクローナル抗体を負荷させた固相（カルボリンク材料を有するカラム）に移した。 反応バッチを室温で１時間培養する。 カラムを２mlのＰＢＳで洗浄する。 固相に結合した放射能をガンマーカウンター中で測定し、これは固相を含有しているカラムを直接使用することにより又は結合した蛋白質を１mlの２５mMクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ２．５で溶離した後のいずれかに行われる。 患者の血清の測定の結果を評価するための標準曲線をつくるために対応する手順を使用し、２０００Ｕ ＴＳＨ／mlを含有する標準と共に市販のＴＲＡＫ−アッセイRからの標準が使用された。 結果 標準を使用して標準曲線（図１）が得られ、これは慣用のＴＲＡＫ−アッセイRのものに対応しており、即ち標識されないＴＳＨの添加量の濃度の増加と共に結合した放射能の減少が得られる。 グレーブス病にかかっている患者の血清試料を市販のＴＲＡＫ−アッセイRで本発明の方法に従って測定すると次の結果が得られた。 ４５人の健康な対照の人、及び３９人のグレーブス病にかかった患者からの血清を本発明の方法によって慣用のＴＲＡＫ−アッセイRで測定した。測定の結果は表１にまとめられている。 最初の治療前又は治療的な手段の開始後６週間以内の試料から生じるグレーブス病にかかった患者の血清。対照群（ｎ−４５）の自己抗体のない血清の測定についての平均値はＴＲＡＫ−アッセイRについては４．１±６．４（２ｓ）Ｕ／ｍｌであり本発明の方法では４．８±８．８（２ｓ）Ｕ／ｍｌである。 両方の試験中で９５．５％の比肩し得る特異性を維持するためにカットオフ（陰性の試料の値と陽性の試料の値の間の境界）を慣用方法については１１Ｕ／ｍｌに、そして本発明に従う方法については１４Ｕ／ｍｌに指定した。これらのカットオフ値を使用してグレーブス病にかかった患者の７９．５％（３９人中３１人）がすでに確立されているＴＲＡＫ−アッセイRラジオレセプター方法中では陽性と評価された。 本発明に従う方法による患者の同じグループの測定では驚くべきことに、グレーブス病にかかっている患者の１００％（３９人中３９人）が自己抗体陽性と測定された。慣用のＴＲＡＫ−アッセイRで陰性（試料ナンバー２、３、１２、２９、３０、３４、３９）と測定された試料は、明らかに本発明に従う方法では陽性と評価された。 その上、本発明に従う方法の更に別の利点は試料の主要部分がかなりより強い測定シグナルを有することが見出された。得られた結果は説明のために図２中にグラフで示される。 固相に結合した特定の抗体と、ＴＳＨレセプター複合体に結合された放射標識されたＴＳＨを有するＴＳＨレセプター複合体との間の相互作用を試料中に存在する自己抗体によって乱すことが、本発明の方法では追加的に可能であるため、グレーブス病を診断する検定の臨床価値が増加するのみならず、両方の試験で陽性と同定された患者の場合に於ても、本発明の方法によって生じた実質的により強い、従ってより信頼性のある測定信号が生じる。グレーブス病の特徴として生じるＴＳＨレセプター自己抗体の測定の臨床的な価値は、従ってはっきりと高められる。Description: Title of the Invention Receptor Binding Assay for Detecting TSH Receptor Autoantibodies The present invention relates to a competitive receptor binding assay for measuring TSH receptor autoantibodies that occur in thyroid autoimmune diseases, especially Graves' disease. (Competitive receptor binding assay). Many diseases involving the thyroid gland are known to be autoimmune diseases in which autoantibodies to the thyroid molecular structure are formed and begin to act as autoantigens in association with the disease. The most important known thyroid autoantigens are thyroglobulin (Tg), thyroid peroxidase (TPO) and especially the TSH receptor (TSHr). (See Furmaniak J. et al., Autoimmunity 1990, 7, 63-80). The TSH receptor is a receptor localized to the thyroid membrane to which the hormone TSH (thyroid stimulating hormone or thyrotropin) secreted by the pituitary gland binds and thus triggers the secretion of actual thyroid hormones, especially thyroxine. TSH receptors belong to the receptor family consisting of G-protein coupled glycoprotein receptors, which have large amino-terminal extracellular domains, to which LH / CG and FSH receptors also belong. The chemical structure of the TSH receptor, ie, the DNA encoding it and the amino acid sequence of the receptor itself derived therefrom, were elucidated at the end of 1989 (Revert F et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165). Nagayama W. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165: 1184-1190; and EP-A-0433509 and WO-A-9 1/09121; and WO-A-91 / 09137. See also WO-A-91 / 10735 and WO-A-91 / 03483; see also Eugene Nagayama and Basil Laboport: Molecular Endocrinology, Vol. 6, No. 2, pages 145-156 and references cited therein). Stimulatory autoantibodies are generally known to play a role in thyroid autoimmune disease, known as Graves' disease, since the autoantibodies are formed against and interact with the TSH receptor, The thyroid gland is stimulated and manifests as hyperthyroidism. Therefore, the measurement of autoantibodies to the TSH receptor has considerable clinical importance for the diagnosis of Graves' disease. Apart from assay methods in which laboratory animals or special cell culture media play a role, and which are now only of particular historical interest (Schum-Draeger, Akt. Endokr. Stoffw. 10 (1989), pp. 90-102), to date, it is possible to measure TSH receptor autoantibodies according to essentially two basic methods (Morgenthaler Energy et al. Exp Clin End ocrinol Diabetes). 104 (1996) Suppl 456-59). In the cell stimulation test, the existence of a stimulatory TSH receptor autoantibody often referred to in the literature as an abbreviation TSI (TSI = thyroid stimulating immunoglobulin) is revealed by the following facts. That is, the specific function of appropriate cells that have a native or recombinant TSH receptor in the cell membrane and come into contact with a sample containing autoantibodies, particularly the formation of cAMP (cyclic adenosine monophosphate), is triggered by its stimulation. Appear or be enhanced as they were. In these tests, also called bioassays, the stimulatory effect is measured selectively, but the measurement is very complicated and therefore not very suitable for routine clinical diagnosis. Alternatively, autoantibodies may be used in competitive receptor binding assays, particularly radioreceptor assays, e.g. R. Ah. Her. M. S. Diagnostika Gamem Beher. TRAK-assay from (BRAHMS. Diagnostica GmbH)R Can also be measured by using For the measurement of TSH receptor autoantibodies by this conventional method, the autoantibodies derived from the serum sample to be measured are radioactively labeled in the liquid phase against the binding site of the porcine TSH receptor solubilized with detergent. (Southgate K et al., Clin. Endocrinol. (Oxford) 20, 539-541 (1984); Matsubati et al., J. Biochem. 118, 265). EP 719 858 A2; TRAK-assay from B.R.A.H.A.H.M.S.Diagnosticage GmbH (BRAHMS.Diagnostica GmbH).R About product information). To determine the labeled TSH bound to the receptor preparation, after the culture is complete, the TSH receptor is separated from the liquid phase using a precipitation reagent and a subsequent centrifugation step. Labeled TSH bound to the receptor is measured by measuring the bound radioactivity in the precipitate. Since the measurement is based on competition between the labeled TSH and the autoantibody to be measured for a common binding site of the TSH receptor, only all autoantibodies that actually compete with TSH are measured in this way. Such competitive autoantibodies capable of inhibiting TSH binding are also referred to in the literature as TBII (TBII = thyrotropin binding inhibiting immunoglobulin) and their degree of activity is also described as so-called% TBII activity. It has long been known that a heterogeneous group of autoantibodies of different composition is formed in thyroid autoimmune diseases. Stimulatory autoantibodies and TSH and competitive autoantibodies only partially match. That is, there are stimulating autoantibodies that do not compete with TSH, and there are TSH and autoantibodies that have no stimulating effect. Furthermore, there are autoantibodies that have no stimulating effect and do not compete with TSH (for example, Ludgate M et al., Mol. Cell. Endocrinol. 73 (1990), R13-R18; Filetti M et al., J. Am. See, Clin. Endocrinol.Metab.72, 1096-1101, 1991; Morgenthaler N.G., et al., Exp Clin Endocrinol Diabetes 104 (1996) Suppl4, pages 56-59 and references incorporated therein. ). As a result, autoantibodies can only be detected in about 80-90% of patients with Graves' disease by radioreceptor assay (eg, "Rational Diagnostics in Endocrinology", Thieme). Verlag, p. 49, paragraph: TSH Rezeptor autoantikorper (TSH-RAK) [TSH receptor autoantibody (TSH-RAB)]; or Roppaz A et al., Cell. Immunol. 161, 262-269 (1995); Biophys. Res. Commun. 174, No. 1 (1991), pp. 339-403; Endo et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 181, No. 3 (1991), 1035-1041; , Clin. Biochem. 25, 193-199 (1992)). The inability to detect some of the autoantibodies arising from Graves 'disease is due to the measurement principle of the competitive radioreceptor assay to date, so the clinical appearance of patients with Graves' disease, Whether discrepancies between the results of competing TBII autoantibody measurements are evident, and despite the considerable complexity of performing supplemental bioassay measurements to measure stimulatory TSI autoantibodies. Has already been proposed (Delwall M et al., Exp. Clin. Endocrinol. 100 (1992), pp. 75-79). Apart from its limited clinical value as described, a competitive radioreceptor assay known to date for the detection of TSH receptor autoantibodies has the binding capacity of a TSH receptor preparation. It has a fundamental drawback in practicality due to the fact that it is generally very sensitive to changes in the receptor or the biomolecules bound thereby. The binding of peptide or proteinaceous biomolecules, such as hormones or autoantibodies, to receptors is usually very complex, and the formation of specific bonds between the receptor and the biomolecule is a matter of the receptor. It is much more susceptible to structural changes, especially in the structure of the receptor, than the normal antigen / antibody binding pair that underlies many non-functional immunoassays. Attempts to immobilize and / or label the TSH receptor always lead to structural changes, which greatly impair the function of the receptor. As a result, immunoassays using antibody / antigen binding, in particular immobilized binding partners are used, and at the end of the measurement the concentration of the tracer binding to the solid phase is determined directly or as an enzyme, an enzyme substrate or a chemiluminescent tracer. Many basic assay types available in immunoassays where bulky molecules are used for labeling are practically used to date to perform receptor binding assays for the measurement of TSH receptor autoantibodies. I could not do it. Since the determination of tracer binding to the solid phase forms the basis of most automated assay units for a series of assays, to date there are known assays for measuring TSH receptor autoantibodies on such automated units. It was not possible to do so. The DE 43 28 070 C1 patent describes one type of receptor binding assay that operates according to the coated tubing technique, where the difficulty in producing labeled or immobilized functional receptor folds is described. Sex is overcome by being bound to the solid phase components of a competitive reaction system that represents the so-called shadow of the actual receptor binding reaction. However, the disclosed principles of this method have proven to be too complex, and it is unlikely to provide an assay for routine clinical diagnosis. It is expressly stated here that the general description of the general receptor binding assay problem of this patent and especially the problem of measuring TSH receptor autoantibodies is incorporated herein by reference. Further, EP-B-0 488 170 discloses a cell-free receptor binding test in which a recombinant fusion receptor consisting of an amino-terminal receptor protein and a constant fragment (Fc) of the heavy chain of a carrier protein, particularly an immunoglobulin, is used. The fusion receptors are bound to a solid phase by high serum or monoclonal antibodies. The receptors discussed do not belong to the class consisting of high molecular weight G-protein coupled glycoprotein receptors. Furthermore, immobilization by binding a carrier protein, which is an Fc fragment of immunoglobulin, is not very suitable for receptor binding assays where autoantibodies are to be measured with the aid of the immobilization. This is because autoantibodies themselves belong to immunoglobulins and can bind to the immobilization system. Furthermore, DE 41 20 412 C1 is present in a sample of a sandwich composed of immobilized specific autoantibodies, crude autoantigens in the form of suitable organ extracts, especially TPO, and further labeled antibodies. Disclosed is a method of measuring autoantibodies wherein perturbation by autoantibodies to existing autoantigens is used for the measurement. The meaning of perturbation is that the autoantibodies present in the sample can in principle interact with each individual immune binding, or with both immune bindings involved in the structure of the finished sandwich. Due to the lack of autoantibodies that have the sensitivity and the required selectivity of the described receptors, this principle up to now has been based on the principle that the autoantigen is the receptor and the labeled binding partner is a labeled hormone, e.g. It could not be applied to the case of TSH. After the molecular structure of the TSH receptor has been elucidated, the conjugation of human recombinant TSH receptor, the N-terminal extracellular fragment (comprising 398 amino acids without the signal peptide) of such a receptor, and a shorter receptor peptide subsequence Monoclonal and polyclonal autoantibodies to the gates have been produced by a number of research groups with the aim of revealing the epitope of the TSH receptor responsible for TSH binding and antibody binding. (Eg, NG Morgenhaler et al., Exp Clin Endocrinol Diabetes 104 (1996) Suppl 4 pp. 56-59; Seesalamaier GS et al., Endocrinology 134, No. 2, pages 549-554 (1994) J. Clin Endocrinol. Me tab. 77: 658-663, 1993; Dallas J. S. et al., Endocrinology 134, No. 3, 1437-1445 (1994); P. et al., Mol. Cell. Endocrino l. 105 (1994), R1-R9, Seesalamaier G. S. et al., Endocrinology 136, No. 7, pages 2817-2824 (1995); J. Mol. Endo crinol. (1996) 16, pp. 159-170; Ropers A. et al., Cell. Immunol. 161, 262-269 (1995); Omori M. et al., Biochem. Biophys. Commun. 174, No. 1 (1991), pp. 399-403; Endy et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 181, No. 3 (1991), pp. 1035-1041; , No. 3, 15 Marion S. et al., Endocrinology 130, No. 2, pages 967-975 (1992); J. Sanders et al., J. Endocrinol. Invest. 19 (Suppl6), 1996 and further publications thereof. See the references cited in Regarding the binding behavior of various autoantibodies to the TSH receptor or its recombinantly produced subsequences, and in particular the ability of various antibodies to disrupt TSH binding to various forms or fragments of the TSH receptor, various antibodies Was tested. TSH receptor or peptide thereof since different polyclonal or monoclonal antibodies have been made by immunizing different animals and / or by using recombinant material from different expression systems and from different sources recombinantly made Since fragments have often been used in binding studies, and since it has been found that glycosylation and / or correct folding of the receptor peptide is likely to be critical for the binding of many antibodies, The epitope structure of the native TSH receptor and the epitope-specific binding behavior of the autoantibodies that occur in the solid population of polyclonal autoantibodies have not yet been fully described. For example, Dallas Jay. S. Et al., Endocrinology 134, No. 3, pages 1437-1445 (1994), in a cell of the human TSH receptor made with the aid of a baculovirus / insect cell expression system and without the N-terminal signal peptide. A partially recombinant TSH receptor having ectodomain amino acids is used to immunize rabbits and is generated by affinity chromatography using synthetic peptides each having about 20 amino acids. From the immunoglobulin fraction, a specific antibody fraction is obtained. The specific antibody fractions described above are then tested for suitability to block TSH binding to solubilized porcine TSH receptor, among others, in a commercial receptor binding assay. This antibody did not show stimulatory activity. Sea Sala Myer G. S. Et al., Endocrinology 136, No. 7, pages 2817-2824 (1995) describe how the same partially recombinant TSH receptor used in the above publication was used to immunize mice. It then describes how it was used to generate monoclonal antibodies against individual epitopes of the TSH receptor according to standard techniques. A similar procedure is performed by Nicholson El. Bee. J. et al. Mol. Endocrinol. (1996) 16, 159-170. Seesala Myer G. made as described above. S. Et al., Endocrinology 134, No. 2, pp. 549-554 (1994), were then tested for their ability to fold and bind radiolabeled TSH. For this purpose, it is reacted in the liquid phase with radiolabelled TSH. Next, in order to separate the resulting complex from the reaction mixture as quantitatively as possible, the binding of TSH to the unfolded partial recombinant TSH receptor containing amino acids 357-372 of the complete TSH receptor sequence. Antibodies made by immunizing rabbits with a conjugate of a peptide fragment that has been shown not to inhibit PEG are added as part of the precipitation system (Desial K. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 77: 658-663, 1993). The added antibody or complex containing it and the bound radiolabeled TSH are then precipitated with the aid of protein A, which binds nonspecifically to any antibody. Under the test conditions, the binding of Protein A to the receptor binding antibody does not appear to impair TSH binding at the same time. The knowledge gained using antibodies to the recombinant TSH receptor or portions thereof may be used to measure TSH receptor autoantibodies by using a third, per se known principle in the form of an immunoprecipitation assay. Led to a proposal to do35 A preparation of the extracellular portion of the recombinant TSH receptor, which is labeled by incorporating S-labeled methionine, is used as a reagent for precipitation. Such an assay has no selectivity for TSI or TBII (NG Morgensaller et al., Exp Clin Endocrinol Diabetes 104 (1996) Suppl 456-59). However, preparing labeled receptors by in vitro translation is extremely complex and expensive,35 There is no measurement device suitable for routine clinical measurement for radiation emitted by S. Therefore, this method is not suitable as a measurement method for ordinary clinical diagnosis. It is an object of the present invention to provide a competitive receptor binding assay for measuring TSH receptor autoantibodies that does not have the described disadvantages of such competitive receptor binding assays of the prior art. In particular, it is an object of the present invention to be able to immobilize the TSH receptor complex formed from the reactants of the assay method to be measured on a conventional solid phase, and to address the existing methods relating to the lack of a suitable tracer. Provided is an improved competitive receptor binding assay for measuring TSH receptor autoantibodies, which is capable of overcoming limitations so that automated methods for such receptor binding assays can be used. It is to be. In particular, yet another object of the present invention is to design an improved competitive receptor binding assay for the detection of TSH receptor autoantibodies in a manner that provides greater clinical value as compared to prior art assays. It is to be. Yet another object of the present invention is to provide a reagent kit for performing such an improved receptor binding assay in routine clinical diagnosis. The above object is achieved according to the pre-characterizing close (first part) of claim 1 and has the features described in the characterizing close (second part) of claim 1, at least in part achieved by a radioreceptor assay. Advantageous embodiments of the improved receptor binding assay according to the present invention are described in the sub-claims, and in particular in combination with the following description herein. The purpose of providing a corresponding reagent kit is to provide a reagent for carrying out the method according to the invention, which in each case contains at least one of the components (i), (ii) and (iii) according to claim 15. Achieved by the kit. To cover the various possible embodiments for the receptor binding assay of the present invention, the general mode of expression described below by the introduction is referred to in claim 1 as the known mode of such receptor binding assay. The features are used to describe the features, and also for the features that the receptor binding assay according to the invention differs from those of the prior art. As described in the introduction, known competitive receptor binding assays, all designed as radioreceptor assays, contain the following assay components. Solubilized TSH receptor (i), especially solubilized natural animal (porcine) TSH receptor obtained from the thyroid membrane of the animal. Further known radioreceptor assays contain radiolabeled bovine TSH (ii), which competes with TSH receptor autoantibodies from serum samples (TBII) for a common binding site on the TSH receptor used. Since this competition is of the greatest importance to date and also allows for the measurement of the majority of autoantibodies, ie, 80-90%, the prior art labeled TSH is It is covered by the definition of “primary competitor” as used in claim 1. However, this definition also includes other forms of "primary competitors", the use of which is for the first time permitted by the present invention. Thus, labeled selective antibodies to the TSH receptor, described in more detail below, can also be used as competitors for TBII and, if necessary, for other autoantibody fractions. Furthermore, due to competition with TBII, TSH bound to the solid phase should also be able to meet the definition of "primary competitor". As described earlier, the TSH receptor and the components of the reaction mixture bound thereto, i.e., the complex of labeled TSH and autoantibody, are precipitated from the reaction mixture by a precipitating reagent and centrifuged to remove the reaction mixture. Separated from In the meaning of the precharacterizing close (preamble) of claim 1, the precipitating reagent is to be regarded as a reagent according to (iii). In the case of a competitive receptor binding assay according to the present invention, such reagent (iii) corresponds to the reactant bound to the solid phase and is primarily a specific TSH receptor immobilized on the solid phase. Although an antibody, according to the "mirror image" embodiment, it can also be TSH attached to a solid phase. An essential finding for the present invention is that immobilization made specific for the appropriate subsequence of the TSH receptor without significantly impairing the binding ability of the TSH receptor to TBII autoantibodies and labeled TSH. Human TSH receptor from any type of solubilized TSH receptor preparation (i.e., wherein the folding / glycosylation corresponds at least essentially to the natural TSH receptor, (Animal or recombinant TSH receptor) is also possible. Therefore, this finding was made for the determination of TSH receptor autoantibodies in a form in which binding to the solid phase could be measured, for example, in a manner in which the amount of bound and labeled competitor of primary competitor radiolabeled TSH could be measured. Create prerequisites for performing the receptor binding assay. Surprisingly, however, immobilizing the TSH receptor on a solid phase with the aid of a selective TSH receptor antibody significantly improves the clinical value of a competitive receptor binding assay for the measurement of TSH receptor autoantibodies. It was further found that it was possible. As will be explained in more detail below, by appropriate selection of the specific antibody actually bound to the solid phase, the assay system contains at least one further binding site where autoantibodies from the sample can compete. ing. If the antibody bound to the solid phase is selected to act as a “secondary competitor” that competes with autoantibodies in the sample, separate from TBII as measured by competition with the “primary competitor”, clinically Value increase is achieved. In fact, the resulting assay system has a double disturbance (two perturbations) at different binding sites of the sandwich with the heterogeneous polyclonal autoantibodies from the patient sample. It can be regarded as analogous to the test system illustrated in FIG. 3 of DE 41 20 412. Such disturbance is sufficient to prevent the tracer from binding to the solid phase, extending the measurement range and increasing sensitivity. Such a variant using two antibodies and a crude antigen is also described in US Pat. No. 5,501,955. According to the method of the present invention, for example, by using a specific antibody raised against a synthetic peptide having 20 to 39 amino acids of the amino acid sequence of the complete TSH receptor (including the signal peptide), All patients classified as Graves' disease patients based on their symptoms were measured as autoantibody positive, even though only 80% were measured positive by conventional radioreceptor assays. Significantly improving the clinical value of receptor binding assays for the diagnosis of Graves 'disease by using a "second competitor" that competes with non-TBII autoantibodies that develop during Graves' disease Is possible. "Secondary competitors" preferably compete with autoantibodies (TSIs) that are measured as irritants in cell stimulation tests and are not detected by conventional radioreceptor assays due to lack of competition with TSH. However, autoantibodies competed by "secondary competitors" do not actually need to have a stimulatory effect and thus do not have to enhance the clinical syndrome of Graves' disease. Autoantibodies that compete with the "secondary competitor" can also belong to autoantibody subpopulations that have a blocking effect, or can be insignificant to the actual pathological process. As long as such autoantibody subpopulations are always or often present in the sera of patients with Graves' disease, the clinical value of this receptor assay is that of a conventional radioreceptor assay that detects only TBII autoantibodies. Is larger than Accordingly, suitable selective antibodies which form preferred "secondary competitors" are antibodies to fragments of the TSH receptor that do not participate in TSH binding but form autoantibodies in Graves' disease. Studies to date using polyclonal antibodies purified by affinity chromatography or antibodies produced as monoclonal antibodies have yielded several fragments of the TSH receptor that are binding regions that are particularly suitable as selective antibodies. However, in interpreting the literature data to date, most selective antibodies have been raised against recombinantly produced TSH receptor peptides or synthetic peptide fragments, and thus are likely to have sequence properties. It should be noted that It has further been demonstrated that a major portion of the antibodies described in nature are ineffective in cell stimulation tests. This indicates that, despite competition with autoantibodies from serum, antibodies produced by synthesis cannot be identified with the autoantibodies to be measured. Furthermore, due to the folding of the native TSH receptor and its glycosylation, the binding behavior of the synthetically produced antibody to the native TSH receptor preparation is different from that of a synthetic peptide or a recombinantly produced TSH receptor fragment. Can be different. However, given the teachings of the present invention, in certain cases relatively simple routine tests will determine the suitability of specific specific antibodies for the method according to the present invention, and their "secondary competitors" It is possible to measure the ability to act as The test described below is an immobilized specific antibody that is capable of binding to peptides from the 20-39 amino acid range of the complete TSH receptor, and is labeled as a conventional tracer. Performed using a bovine TSH "Primary Competitive". The antibodies used were monoclonal antibodies selected and produced after immunization with the aid of conjugates from the corresponding synthetic peptides by conventional hybridoma technology. The literature also describes various polyclonal or monoclonal specific antibodies that also bind to the same or overlapping regions at the amino terminus of the extracellular domain of the TSH receptor. (Dallas J. S. et al. Endocrinology 134, No. 3, pp. 1437-1445 (1994); Seesaramayer G. S. et al., Endocrinology 136, No. 7, 2817-2824 (1995); B. et al., J. Mol. Endocrinol. (1996) 16, 259-270; Omori M. et al., J. Endocrinol. (1992) 135, 479-484; Commun.177, pp.145-150 (1991); Hirookai et al., Med.Sci.Res.1992, 20, 639-640). Although the production techniques and antibody types described in the above publications are in principle under test and are particularly suitable for replacing the antibodies used, antibodies to close sequences of the TSH receptor belong to very different antibody types. It should also be noted that it is known to gain. As an alternative to the antibodies used in the examples, and as an alternative to the antibodies to amino acids 20-39 of the human TSH receptor, they were made against regions 287-301, 361-380 or 739-758. Antibodies are also suitable. However, based on the tests described below, special properties should be checked in special cases. The initial assay design of conventional radioreceptor assays differs to a greater extent from radiolabeled TSH, and another labeled selective antibody is used in place of radiolabeled TSH. If so, the above distinction between "primary competitor" and "secondary competitor" can be less clear or lose its meaning entirely. This does not change anything about the assay principle of the receptor binding assay according to the present invention, nor does it change anything regarding the fact that such assays are also protected by the present invention. Due to the fact that the method according to the invention allows the immobilization of the TSH receptor complex formed in the measuring solution with a tracer directly attached to the complex or with a tracer introduced after the immobilization, and furthermore with the radioisotope Since reagents with other tracers can be used, the actual operation of the TSH receptor autoantibody assay can be much better adapted to the requirements of clinical practice than was previously possible. The culture schedule can also be varied, and it appears that the culture schedule described in the following examples is no longer essential. Plastic surfaces, microparticles, magnetic particles, filters, polymer gel materials, and other known solid substrates can be used as the solid phase. The ability to use labeled autoantibodies and the ability to use immobilized TSH (for the ability of the TSH receptor for binding to immobilized TSH, see Reedmumpy J. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 69, 134-141, 1989) would significantly increase the range of use of this assay, especially with respect to the free choice of suitable direct or indirect tracers. By the method of the present invention, it is also possible to automate a TSH receptor autoantibody assay. Thus, the assay design can be adapted to be performed on known automated systems (see, for example, the Elexis system from Boehringer Mannheim or the ACS180 system from Ciba Corning). In such an automated system, pipetting is performed during the automatic handling of the sample and can be performed with labeled TSH or with free labeled antibodies (eg ruthenium complex labeling or acridinium ester). Labeling), magnetic particles coated with a suitable specific antibody to the TSH receptor or coated with TSH can then be mixed, and finally essentially any suitable TSH receptor substances can be added. After cultivation, conventional solid-liquid phase separation is possible, and the signal can be measured, if necessary after the signal is triggered by adding appropriate reagents. The order of pipetting described according to the embodiments may vary. The method according to the invention will be explained in more detail below on the basis of a specific embodiment, with reference to two figures. FIG. 1 shows a standard curve obtained in a routine manner for an embodiment of the method according to the invention described in the following examples. And FIG. 2 shows the measurement results obtained by the method according to the invention in the case of the measurement of a group of patients with Graves' disease and a conventional radioreceptor assay (B.R.A.H.H.M.S. Diagnostics). TRAK-assay from GAMBEHAR 3) shows a comparison of the measurement results obtained by the above method. Description of the Experiment Materials In the experiments described below, various commercial materials were used, in particular R. Ah. Her. M. S. Diagnostica GM K-Assay TRA K-AssayR NAP25 desalination column manufactured by Pharmacia for purifying the antibody prepared for immobilization, Carbolink material manufactured by Pierce and sodium periodate manufactured by Fluka were used as solid phase substrate materials. 1. Production of Monoclonal Antibodies to the TSH Receptor Various monoclonal antibodies to selected peptides of the hTSH receptor were produced by prior art methods (see above). A monoclonal antibody to one peptide, containing 20 to 39 amino acids of the fully human TSH receptor (amino acid sequence GGMGCSSPBCECHQEEDFRV), was used for further testing. 2. Production of monoclonal antibodies bound to a solid phase. In 20 ml of ascites solution diluted 1:10 with PBS (phosphate buffered saline; 50 mM sodium phosphate, 100 mM NaCl, pH 7.5) and containing the monoclonal antibody described above. Was dissolved in 250 mg of periodate, and the culture was carried out at room temperature for 30 minutes. The reaction solution was desalted on a NAP25 desalting column (Pharmacia) according to the manufacturer's method. The desalted protein was mixed with the washed Carbolink material (10 ml) in PBS. After overnight incubation at 4 ° C. with constant shaking, 0.5 ml of the resulting gel with the monoclonal antibody bound thereon is filled into a plastic column (0.5 × 4 cm) and 25 mM sodium citrate buffer pH 2. Washed with 5 (2 ml wash volume). The column was equilibrated with PBS (2 ml) and then used for further testing. 3. TRAK-assay with the help of the above columnR Radioreceptor assays were performed using the components of (B.R.A.H.H.M.S.D.A.G.N. Radioreceptor assay (preparation of standard curve, measurement of patient sample) using TRAK-assayR Was carried out in accordance with the method for carrying out. The following pipetting scheme was used. A 50 μl sample was pipetted. 50 μl of solubilized bovine TSH receptor was then pipetted. Culture was performed at room temperature for 15 minutes. 100 μl of tracer (TSH labeled with radioactive iodine) was added by pipette. The resulting reaction batch was transferred to a solid phase (column with carbolink material) loaded with a monoclonal antibody as described above. The reaction batch is incubated at room temperature for 1 hour. Wash the column with 2 ml of PBS. The radioactivity bound to the solid phase was measured in a gamma counter, either by directly using the column containing the solid phase or by eluting the bound protein with 1 ml of 25 mM sodium citrate buffer pH 2.5. Will be done either later. A commercially available TRAK-assay with a standard containing 2000 U TSH / ml, using the corresponding procedure to generate a standard curve to evaluate the results of the measurement of patient serumR Standards from were used. Results A standard curve (FIG. 1) was obtained using the standard, which was a conventional TRAK-assay.R That is, a decrease in bound radioactivity is obtained with increasing concentration of unlabeled TSH. Commercially available TRAK-assay using serum samples from patients with Graves' diseaseR The following results were obtained when measured according to the method of the present invention. Serum from 45 healthy control persons and 39 patients with Graves' disease were subjected to conventional TRAK-assay by the method of the present invention.R Was measured. The results of the measurements are summarized in Table 1. Serum from a patient with Graves' disease arising from a sample before the first treatment or within 6 weeks after the start of the therapeutic measures. The mean for the measurement of serum without autoantibodies in the control group (n-45) is the TRAK-assayR Is 4.1 ± 6.4 (2 s) U / ml, and in the method of the present invention, 4.8 ± 8.8 (2 s) U / ml. Cut-off (boundary between negative and positive sample values) to 115.5 U / ml for conventional methods to maintain 95.5% comparable specificity in both tests; And for the method according to the invention, 14 U / ml was specified. Using these cut-off values, 79.5% (31/39) of patients with Graves' disease have already established TRAK-assaysR Scored positive in the radioreceptor method. In a measurement of the same group of patients according to the method according to the invention, surprisingly, 100% (39/39) of patients with Graves' disease were determined to be autoantibody positive. Conventional TRAK-assayR Samples that were determined to be negative (Sample Nos. 2, 3, 12, 29, 30, 34, 39) were clearly scored positive by the method according to the invention. Furthermore, it has been found that a further advantage of the method according to the invention is that the main part of the sample has a significantly stronger measured signal. The results obtained are shown graphically in FIG. 2 for illustration. Disrupting the interaction between a particular antibody bound to a solid phase and a TSH receptor complex having a radiolabeled TSH bound to the TSH receptor complex by autoantibodies present in the sample is described by the present invention. The method of the present invention, which is additionally possible, not only increases the clinical value of assays for diagnosing Graves' disease, but also results in the method of the present invention in patients identified as positive in both tests. A substantially stronger and thus more reliable measurement signal results. The clinical value of measuring TSH receptor autoantibodies that occur as a feature of Graves' disease is therefore clearly enhanced.
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１１月１７日（１９９８．１１．１７）【補正内容】 請求の範囲（PCTチャプターIIの補正） １．反応混合物中の試料を、同時に又は順次、 （i）可溶化された天然の人又は動物又は組替えＴＳＨレセプター調製物の形のＴＳＨレセプター、 （ii）試料中にあることが予測されるＴＳＨレセプター自己抗体の少なくとも一部に対するプライマリーコンペティター、及び (iii)ＴＳＨレセプターとＴＳＨレセプターに結合されている反応混合物の成分との複合体を液相から分離するための試薬、と反応させ、そして その生物試料中で測定されるべきＴＳＨレセプター自己抗体の存在及び／又は量が、該液相から分離された該ＴＳＨレセプター複合体中のコンペティターの量に基づいて、又は該液相中の結合していない該プライマリーコンペティターの残りの量に基づいて決定され、但し、上記目的の為に該コンペティターは標識化された形態で使用されるか又は固液分離後に標識化されるものである、生物試料中のＴＳＨレセプター自己抗体の測定の為の競争的レセプター結合アッセイ方法に於て、 該反応が更に、該ＴＳＨレセプターの部分的なペプチド配列に対し特異的である少なくとも一つのモノクローナル又はポリクローナル抗体の存在下で実施されること、そしてこの特異的な抗体がＴＳＨレセプターとプライマリーコンペティターの複合体を固定するに際し、ＴＳＨ結合阻害能のある自己抗体（ＴＢＩＩ自己抗体）に対しまた標識化ＴＳＨに対しＴＳＨレセプターの結合能を有意に損なうことなく固定するための、固定剤として及び／又は試料中で存在することが予測されるＴＳＨレセプター自己抗体の更に別の部分に対するセカンダリーコンペティターとして使用されること、及び、上記のプライマリー及びセカンダリーコンペティターが、標識されているか又は選択的に標識されることができるものであること、を特徴とする競争的レセプター結合アッセイ方法。 ２．該少なくとも一つの特異的な抗体が、固相に結合した形で使用され、そしてプライマリーコンペティターが標識されたＴＳＨ又は標識された別のＴＳＨレセプター抗体であることによって特徴づけられ、該固相に対し結合されている特異的な抗体が、プライマリーコンペティターの結合によって影響を受けないでＴＳＨレセプターに結合することを特徴とする請求項１に記載のレセプター結合アッセイ法。 ３．同時に、該固相に結合された抗体が、プライマリーコンペティターのＴＳＨレセプターへの結合を妨げない、試料からのＴＳＨレセプター自己抗体と、プライマリーコンペティターによって認識されないエピトープについて競争するセカンダリーコンペティターであることを特徴とする請求項２に記載のレセプター結合アッセイ方法。 ４．該標識された更に別のＴＳＨレセプター抗体が、ＴＳＨレセプターのエピトープについてＴＳＨと競争することを特徴とする請求項２に記載のレセプター結合アッセイ方法。 ５．該固相に結合した抗体が、グレーブス病に特徴的に存在するが、ＴＳＨとは競争しない試料からのＴＳＨレセプター自己抗体と、セカンダリーコンペティターとして競争する、請求項３に記載のレセプター結合アッセイ方法。 ６．該セカンダリーコンペティターと競争するＴＳＨレセプター自己抗体が、刺激性の自己抗体（ＴＳＩ）に属することを特徴とする請求項５に記載のレセプター結合アッセイ方法。 ７．該少なくとも一つの抗体が、液相中でセカンダリーコンペティターとして標識された形態で使用され、そして該固相に結合したＴＳＨがＴＳＨレセプターとＴＳＨレセプターに結合した反応混合物の成分の複合体を分離するための分離剤としてそしてまたプライマリーコンペティターとして使用される請求項１に記載のレセプター結合アッセイ方法。 ８．該少なくとも一つの更に別の抗体が、組替え部分ＴＳＨレセプターを用いて、特にＴＳＨレセプターの膜にアンカーをした領域の細胞外ループ又は細胞外ドメインを用いて、適当な動物に対し、それ自体は知られている免疫化を行うこと、そして免疫化に使用した該部分ＴＳＨレセプターの固定部分ペプチドの使用によるアフィニティークロマトグラフィにより、生じる抗体を分画することによって造られたものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１に記載のレセプター結合アッセイ方法。 ９．該少なくとも一つの更に別の抗体が、組替え部分ＴＳＨレセプター、特にＴＳＨレセプターの組替え細胞外部分、又はそのより短い部分ペプチドを用いた、適当な動物に対するそれ自体知られている免疫化、骨髄球による抗体生産スプレノサイトのそれ自体知られている融合、そして個々の抗体生産ハイブリッド細胞のそれ自体は知られている選択、そしてその培養によって造られたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１に記載のレセプター結合アッセイ方法。 １０．該少なくとも一つの更に別の抗体が、完全なＴＳＨレセプターのアミノ酸配列のアミノ酸２０〜３９、３２〜５４、２８７〜３０１、３６１〜３８１又は７３９〜７５８を有するペプチドから選択される部分ＴＳＨレセプターペプチドに対し形成された請求項８又は９いずれか１に記載のレセプター結合アッセイ方法。 １１．粒子、試験管又はプラスチック又はガラスのミクロタイタープレートの形態、又は磁性重合体粒子、ポリマーゲル、又はフィルターの形態の基体が固相として使用され、該少なくとも一つの抗体又はＴＳＨがそのような基体に対し直接又は間接的に結合した形態で使用される、請求項１〜１０のいずれか１に記載のレセプター結合アッセイ方法。 １２．プライマリー又はセカンダリーコンペティターを標識するために、放射性同位体、酵素及び酵素基質又は化学発光又は蛍光標識系の成分から選択され、それ自体は知られているトレーサーが使用されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１に記載のレセプター結合アッセイ方法。 １３．特異的結合系の成分に結合しているプライマリー又はセカンダリーコンペティターが使用され、そして形成されるＴＳＨレセプター複合体が、検出可能なトレーサー又は固相に結合している、該特異的結合系の第２の成分を有している反応体との反応によって、標識又は固定されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１に記載のレセプター結合アッセイ方法。 １４．測定されるべきＴＳＨレセプター自己抗体が、人の血清中に存在することがグレーブス病の特徴とされるレセプター刺激性自己抗体であることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１に記載のレセプター結合アッセイ方法。 １５． 下記と別の試薬キットの慣用成分に加えて、 （i）可溶化されたＴＳＨレセプター調製物、 （ii）標識されたＴＳＨ又は標識された特異的ＴＳＨレセプター抗体、及び (iii)特異的ＴＳＨレセプター抗体又はＴＳＨが結合している固相基体、を含有していることを特徴としている請求項１〜１４のいずれか１に記載の競争的レセプター結合アッセイ法を実施するための試薬キット。モノクローナル抗体が異なる動物を免疫化することにより及び／又は異なる発現系からの組替え物質を使用することによって造られて以来、そして組替えで造られた異なる起源からのＴＳＨレセプター又はそのペプチド断片が、しばしば結合試験に使用されたあとでも、そして更にレセプターペプチドのグリコシル化及び／又は正しい折り曲げ(folding)が多くの抗体の結合に決定的に必要でありそうであることがわかって以来、天然のＴＳＨレセプターのエピトープ構造及びポリクローナル自己抗体の固体群中に生じる自己抗体のエピトープ特異的な結合挙動は未だ完全に説明されてはいない。 例えばダラス ジェイ．エス．等，Endocrinology 134，No.3，1437-1445頁(1994)による刊行物中で、バクロウィルス／昆虫細胞発現系の助けにより造られたそして、Ｎ−末端シグナルペプチドのないヒトＴＳＨレセプターの細胞外ドメインのアミノ酸を有している部分的な組替えＴＳＨレセプターが、ウサギを免疫化するのに使用され、そして約２０個のアミノ酸を各々有している合成ペプチドを使用してアフィニティクロマトグラフィーによって生じるイムノグロフリンフラクションから、特異的な抗体フラクションが得られる。次に上記の特異的な抗体フラクションは、なかでも市販レセプター結合アッセイ中での可溶化されたブタＴＳＨレセプターに対するＴＳＨの結合を封鎖する適正について調べられる。この抗体は刺激活性を示さなかった。 シーサラマイアー ジー．エス．等，Endocrinology 136，No.7，2817-2824頁(1995)による刊行物は、上記の刊行物のものと同じ部分的な組替えＴＳＨレセプターが、マウスを免疫するのにどの様に使用されたか、そして標準技術に従ってＴＳＨレセプターの個々のエピトープに対するモノクローナル抗体を造るのにどの様に使用されたかを記載している。同様の手順がニコルソン エル．ビー．等，J．Mol．Endocrinol．(1996)16，159-170頁に記載されている。 上に記載されたように造られたシーサラマイアー ジー．エス．等，Endocrinology 134，No.2，549-554頁(1994)に従う部分的な組替えＴＳＨレセプターは、その後折り曲げられて放射性標識化ＴＳＨを結合する適性について試験された。この目的の為に、これは放射性標識化ＴＳＨと液相で反応させられる。次に、生じる複合体をできるだけ定量的に反応混合物から分離するために、完全なＴＳＨレセプター配列の３５７−３７２のアミノ酸を含有し、そして折り曲げられてない部分的な組替えＴＳＨレセプターに対しＴＳＨの結合を阻害しないことが示されているペプチド断片のコンジュゲートでウサギを免疫化することによって造られた抗体が、沈殿系の一部として加えられる（デサイ アール．ケー．等，J．Clin．Endocrinol．Metab．77:658-663，1993）。次に加えられた抗体又はそれを含有している複合体及び結合されている放射性標識化ＴＳＨは任意の抗体と非特異的に結合するプロテインＡの助けにより沈殿させられる。試験条件下でプロテインＡのレセプター結合抗体に対する結合は、同時にＴＳＨ結合を損なうことがないように見える。 組替えＴＳＨレセプター又はその部分に対する抗体を使用して得られた知識は、イムノプレシピテーションアッセイの形態に於て第３のそれ自体は知られている原理を使用することによってＴＳＨレセプター自己抗体を測定するという提案に導かれ、そこでは35Ｓ−標識化メチオニンを組込むことによって標識される組替えＴＳＨレセプターの細胞外の部分の調製物が沈殿の為の試薬として使用される。そのような検定はＴＳＩにもＴＢＩＩにも選択性を有していない（エヌ．ジー．モルゲンサーラー等， Exp Clin Endocrinol Diabetes 104(1996)Suppl ４ ５６−５９頁）。しかしながらインヴィトロの翻訳による標識化されたレセプターを調製することは極めて複雑で費用がかかり、35Ｓによって放出される放射線のための通常の臨床的な測定に適した測定装置は存在しない。従ってこの方法は通常の臨床診断の為の測定方法としては適していない。 本発明の目的は、先行技術のそのような競争的レセプター結合アッセイの記載された欠点を有しないＴＳＨレセプター自己抗体を測定するための競争的レセプター結合アッセイを提供することである。 特に本発明の目的は、慣用の固相上での測定する検定方法の反応体から形成されたＴＳＨレセプター複合体を固定することが可能であり、そして適したトレーサーがないということに関する既存法の制限を克服することが可能であるので、そのようなレセプター結合アッセイの為の自動的方法を用いることが可能である、ＴＳＨレセプター自己抗体を測定するための改良された競争的レセプター結合アッセイを提供することである。 特に本発明の更に別の目的は、先行技術の検定法と比較してより大きな臨床価値が得られるような方法で、ＴＳＨレセプター自己抗体の検出の為の改良された競争的レセプター結合アッセイを設計することである。 本発明の更に別な目的は、そのような改良されたレセプター結合アッセイを通常の臨床診断に於て実施するための試薬キットを提供することである。 上記の目的は請求項１のプレキャラクタライジングクローズ（前段）に従って、請求項１中のキャラクタライジングクローズ（後段）に記載された特徴を有している、少なくとも一部はラジオレセプターアッセイによって達成される。 本発明に従う改良されたレセプター結合アッセイの有利な具体例はサブクレーム中に記載されており、特に本明細書の記載中の次の説明と組合せて記載される。 対応した試薬キットを提供する目的は、各場合に於て請求項１５に従う成分（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の少なくとも一つを含有している本発明に従う方法を実施するための試薬キットによって達成される。 本発明のレセプター結合アッセイの為の種々の可能な具体例をカバーするために、下にイントロダクションによって説明される一般的な表現のモードが、請求項１において、そのようなレセプター結合アッセイの既知の特徴を記載するためにも、そして本発明に従うレセプター結合アッセイが先行技術のものとは異なる特徴についても、用いられる。 イントロダクション部分で説明されるように、全てがラジオレセプターアッセイとして設計されている既知の競争的レセプター結合アッセイは次の検定成分を含有している。 可溶化されたＴＳＨレセプター（ｉ）、特に可溶化された天然の動物（ブタ）ＴＳＨレセプターであって動物の甲状腺膜から得られるもの。 更に既知のラジオレセプターアッセイは放射標識されたウシＴＳＨ（ｉｉ）を含有し、これは、使用されるＴＳＨレセプター上の共通の結合場所について血清試料（ＴＢＩＩ）からのＴＳＨレセプター自己抗体と競争する。この競争は今日まで最も重要性を有するものであり、又存在する自己抗体の大部分、即ち８０〜９０％の測定を可能にもするものであるので、先行技術の標識化されたＴＳＨは、請求項１で使用される「プライマリーコンペティター」という定義によってカバーされる。しかしながらこの定義は又他の形態の「プライマリーコンペティターズ」を含むものであり、この場合の使用は本発明によって初めて許されるものである。即ちより詳しく下に記載するＴＳＨレセプターに対する標識化された選択的抗体も、ＴＢＩＩに対する競争者として、又必要ならば他の自己抗体フラクションに対する競争者として使用出来る。更にＴＢＩＩとの競争のため、固相に結合したＴＳＨも「プライマリーコンペティター」の定義を満たすことが出来るべきである。 初めにも説明したように、ＴＳＨレセプターとこれと結合している反応混合物の成分即ち標識化されたＴＳＨと自己抗体との複合体は沈殿試薬によって反応混合物から沈殿され、そして遠心分離により反応混合物から分離される。請求項１のプレキャラクタライジングクローズ（プレアンブル）の意味に於て、沈殿試薬は（ｉｉｉ）に従う試薬としてみなされるべきである。本発明に従う競争的レセプター結合アッセイの場合に於ては、そのような試薬（ｉｉｉ）は固相に結合している反応体に対応し、そして固相上で固定されている主として特異的ＴＳＨレセプター抗体であるが、「鏡像」具体例に従うとこれは又固相に結合したＴＳＨでも有り得る。 本発明に対し必須の発見は、ＴＢＩＩ自己抗体及び標識化されたＴＳＨに対するＴＳＨレセプターの結合能力が有為に損なわれることなしに、ＴＳＨレセプターの適当な部分配列に対し特異的となされている固定された選択的抗体の助けによって、任意の種類の可溶化されたＴＳＨレセプター調製物からの天然のＴＳＨレセプター（即ち折り曲げ／グリコシル化が、天然のＴＳＨレセプターに少なくとも本質的に対応している、ヒト動物又は組替えＴＳＨレセプター）の固定も達成することが可能であるという発見である。従ってこの発見は、固相への結合が測定できるという形態に於て、例えばプライマリーコンペティター放射標識化ＴＳＨの、結合され標識化されたコンペティターの量が測定できる方法でＴＳＨレセプター自己抗体の測定の為のレセプター結合アッセイを実施するための前提条件を造りだす。しかし驚くべきことに、・・・ 上記刊行物中に記載される製造技術と抗体の型は原則として試験中で、特に使用された抗体を置き換えるのに適しているが、ＴＳＨレセプターの近い配列に対する抗体が非常に異なる抗体型に属し得ることが知られていることも注意されるべきである。 実施例中で使用される抗体の代替物として、そしてヒトＴＳＨレセプターの２０〜３９のアミノ酸に対する抗体の代替物として、３２〜５４、２８７〜３０１、３６１〜３８１又は７３９〜７５８の領域に対し造られた抗体も適している。しかし以下に記載される試験に基づいて、特別の場合に特別の性質がチェックされるべきである。 慣用のラジオレセプターアッセイの最初の検定法（アッセイ）デザインが放射性標識されたＴＳＨとより大きな程度違ったもので、そして放射標識化ＴＳＨの変わりに別の標識化された選択的抗体が使用されるならば、「プライマリーコンペティター」と「セカンダリーコンペティター」の間の上記の区別は明確さがより少なくなるか又はその意味を完全に失うものと成り得る。これは本発明に従うレセプター結合アッセイの検定原理に関するなにものをも変化させず、そしてそのような検定も本発明によって保護されるという事実に関するなにものをも変化させないものである。 測定溶液中に形成されるＴＳＨレセプター複合体の固定を、本発明に従う方法は複合体に直接結合されるトレーサーで又は固定後導入されるトレーサーで可能とするという事実の為、そして更に放射性同位体以外のトレーサーを有する試薬が使用できるから、ＴＳＨレセプター自己抗体アッセイの実際の操作は過去に可能であったものよりもずっとより良く臨床的な実施の要件に適合化できる。培養計画も変化されることができ、そして次の実施例中で記載される培養計画は最早必須ではないようである。・・・そして 図２は、グレーブス病にかかっている患者群の測定の場合における本発明に従う方法によって得られた測定結果と慣用のラジオレセプターアッセイ（ベー．アール．アー．ハー．エム．エス．ディアグノスティカ ゲーエムベーハーからのＴＲＡＫ−アッセイR）によって得られた測定結果の比較を示している。 実験の記載 材料 以下に記載される実験において、種々の市販物質が使用され、特にベー．アール．アー．ハー．エム．エス．ディアグノスティカ ゲーエムベーハー製ＴＲＡＫ−アッセイRの成分、固定の為に造られた抗体を精製するためのファーマシア製ＮＡＰ２５デサリネーションカラム、固相基質物質としてピアース製カルボリンクR材料及びフルカ製過ヨウ素酸ナトリウムが使用された。 １．ＴＳＨレセプターに対するモノクローナル抗体の製造 先行技術の方法によって（上を参照）、ｈＴＳＨレセプターの選ばれたペプチド類に対する種々のモノクローナル抗体が造られた。一つのペプチドに対するモノクローナル抗体であって完全なヒトＴＳＨレセプターの２０〜３９のアミノ酸（アミノ酸配列 ＧＧＭＧＣＳＳＰＢＣＥＣＨＱＥＥＤＦＲＶ）を含有するモノクローナル抗体が、更に試験をするために用いられた。 ２．固相に結合されたモノクローナル抗体の製造。 ＰＢＳ（リン酸塩緩衝化された塩溶液；50mM リン酸ナトリウム，100mM ＮａＣｌ，ｐＨ7.5）で１：１０に希釈されている、そして上記のモノクローナル抗体を含有している腹水溶液２０ミリリットル中に２５０ミリグラムの過ヨウ素酸塩を溶解し、培養を室温で３０分実施した。反応溶液をＮＡＰ２５脱塩カラム（ファルマシア）上で製造業者の方法によって脱塩した。脱塩された蛋白質をＰＢＳ中で洗浄されたカルボリンク(Carbo1inkR)材料(10ミリリットル)と混合した。 一定の振温をしながら４℃で一夜培養後、上にモノクローナル抗体が結合している生じるゲル０．５ミリリットルをプラスチックカラム(0.5X4cm)中に満たし、そして２５ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ２．５（洗浄容量2ml）で洗浄した。このカラムをＰＢＳ（2ml）で平衡化し、そして次に更に試験をするために使用した。 ３．上記カラムの助けによりＴＲＡＫ−アッセイR（ベー．アール．アー．ハー．エム．エス．ディアグノスティカ ゲーエムベーハー）の成分を使用してラジオレセプターアッセイを実施した。 ラジオレセプターアッセイ（標準曲線の準備、患者試料の測定）をＴＲＡＫ−アッセイRを実施するための方法に従って実施した。次のピペット操作計画が用いられた。 ５０μlの試料をピペットで取った。 ５０μlの可溶化されたウシＴＳＨレセプターを次にピペットで加えた。 室温で１５分間培養を実施した。 １００μlのトレーサー（放射性ヨウ素で標識したＴＳＨ）をピペットで加えた。 得られた反応バッチを上記のようにモノクローナル抗体を負荷させた固相（カルボリンクR材料を有するカラム）に移した。 反応バッチを室温で１時間培養する。[Procedure for Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Date of Submission] November 17, 1998 (November 17, 1998) [Details of Amendment] Claims (Amendments to PCT Chapter II) The samples in the reaction mixture can be analyzed simultaneously or sequentially, (i) TSH receptor in the form of a solubilized natural human or animal or recombinant TSH receptor preparation, (ii) TSH receptor self predicted to be in the sample. A primary competitor for at least a portion of the antibody, and (iii) a reagent for separating a complex of the TSH receptor and a component of the reaction mixture bound to the TSH receptor from a liquid phase; and The presence and / or amount of TSH receptor autoantibodies to be determined at the time of is determined based on the amount of competitor in the TSH receptor complex separated from the liquid phase, or the unbound primary in the liquid phase. Determined based on the remaining amount of competitor, provided that the competitor is in labeled form for the above purpose. In a competitive receptor binding assay method for measuring TSH receptor autoantibodies in a biological sample, which is used or is labeled after solid-liquid separation, the reaction further comprises a portion of the TSH receptor. Carried out in the presence of at least one monoclonal or polyclonal antibody specific for the specific peptide sequence, and its ability to inhibit TSH binding in immobilizing the complex of TSH receptor and primary competitor. TSH which is expected to be present as a fixative and / or in a sample for immobilizing the TSH receptor on labeled autoantibodies (TBII autoantibodies) and labeled TSH without significantly impairing the binding ability Used as a secondary competitor for yet another part of the receptor autoantibody And that the primary and secondary competitors are labeled or capable of being selectively labeled. 2. The at least one specific antibody is used in a form bound to a solid phase, and is characterized in that the primary competitor is labeled TSH or another labeled TSH receptor antibody. 2. The receptor binding assay of claim 1, wherein the specific antibody bound binds to the TSH receptor unaffected by the binding of the primary competitor. 3. At the same time, the antibody bound to the solid phase is a secondary competitor that does not interfere with the binding of the primary competitor to the TSH receptor and competes with TSH receptor autoantibodies from the sample for epitopes not recognized by the primary competitor. The receptor binding assay method according to claim 2, wherein 4. 3. The method of claim 2, wherein the further labeled TSH receptor antibody competes with TSH for epitopes of the TSH receptor. 5. 4. The receptor binding assay method according to claim 3, wherein the antibody bound to the solid phase competes as a secondary competitor with a TSH receptor autoantibody from a sample that is characteristic of Graves' disease but does not compete with TSH. 6. The receptor binding assay method according to claim 5, wherein the TSH receptor autoantibody that competes with the secondary competitor belongs to a stimulatory autoantibody (TSI). 7. The at least one antibody is used in a liquid phase in a labeled form as a secondary competitor, and the TSH bound to the solid phase separates a complex of a TSH receptor and a component of a reaction mixture bound to the TSH receptor. 2. The method of claim 1 wherein said method is used as a separating agent and also as a primary competitor. 8. The at least one further antibody may be known per se to a suitable animal using a recombinant partial TSH receptor, particularly using the extracellular loop or extracellular domain of the region anchored to the membrane of the TSH receptor. Or by fractionating the resulting antibody by affinity chromatography using an immobilized partial peptide of said partial TSH receptor used for immunization. Item 8. The receptor binding assay method according to any one of Items 1 to 7. 9. The at least one further antibody is a immunization, known per se, of a myelocyte against a suitable animal using a recombinant partial TSH receptor, in particular a recombinant extracellular part of the TSH receptor, or a shorter partial peptide thereof. 2. A fusion known per se of antibody-producing splenocytes, and a monoclonal antibody produced by its own selection and culture of individual antibody-producing hybrid cells. 8. The receptor binding assay method according to any one of items 7 to 7. 10. The at least one further antibody is a partial TSH receptor peptide selected from peptides having amino acids 20-39, 32-54, 287-301, 361-381 or 739-758 of the complete TSH receptor amino acid sequence. 10. The receptor binding assay method according to claim 8, wherein the receptor binding assay method is formed. 11. Substrates in the form of particles, test tubes or microtiter plates of plastic or glass, or in the form of magnetic polymer particles, polymer gels or filters are used as the solid phase and the at least one antibody or TSH is applied to such a substrate. The receptor binding assay method according to any one of claims 1 to 10, which is used in a form directly or indirectly bound to the receptor. 12. Claims characterized in that a tracer selected from radioisotopes, enzymes and enzyme substrates or components of a chemiluminescent or fluorescent labeling system and known per se is used for labeling the primary or secondary competitor. The receptor binding assay method according to any one of items 1 to 11. 13. A primary or secondary competitor binding to a component of the specific binding system is used, and the TSH receptor complex formed is bound to a detectable tracer or solid phase. The receptor binding assay method according to any one of claims 1 to 11, wherein the label is fixed or immobilized by a reaction with a reactant having the component (1). 14． 14. The TSH receptor autoantibody to be measured is a receptor-stimulating autoantibody which is present in human serum as a feature of Graves' disease. Receptor binding assay method. 15. (I) a solubilized TSH receptor preparation, (ii) a labeled TSH or a labeled specific TSH receptor antibody, and (iii) a specific TSH receptor The reagent kit for performing a competitive receptor binding assay according to any one of claims 1 to 14, comprising a solid substrate to which an antibody or TSH is bound. Since monoclonal antibodies have been produced by immunizing different animals and / or by using recombinant materials from different expression systems, and since recombinantly produced TSH receptors or peptide fragments thereof from different sources, often Even after being used in binding studies, and since it has been found that glycosylation and / or correct folding of the receptor peptide is likely to be critically required for the binding of many antibodies, the native TSH receptor And the epitope-specific binding behavior of autoantibodies that occur in the solid population of polyclonal autoantibodies has not yet been fully elucidated. For example, Dallas Jay. S. Et al., Endocrinology 134, No. 3, pages 1437-1445 (1994), in a cell of the human TSH receptor made with the aid of a baculovirus / insect cell expression system and without the N-terminal signal peptide. A partially recombinant TSH receptor having ectodomain amino acids is used to immunize rabbits and is generated by affinity chromatography using synthetic peptides each having about 20 amino acids. From the immunoglobulin fraction, a specific antibody fraction is obtained. The specific antibody fractions described above are then tested for suitability to block TSH binding to solubilized porcine TSH receptor, among others, in a commercial receptor binding assay. This antibody did not show stimulatory activity. Sea Sala Myer G. S. Et al., Endocrinology 136, No. 7, pages 2817-2824 (1995) describe how the same partially recombinant TSH receptor used in the above publication was used to immunize mice. It then describes how it was used to generate monoclonal antibodies against individual epitopes of the TSH receptor according to standard techniques. A similar procedure is performed by Nicholson El. Bee. J. et al. Mol. Endocrinol. (1996) 16, 159-170. Seesala Myer G. made as described above. S. Et al., Endocrinology 134, No. 2, pp. 549-554 (1994), were then tested for their ability to fold and bind radiolabeled TSH. For this purpose, it is reacted in the liquid phase with radiolabelled TSH. Next, in order to separate the resulting complex from the reaction mixture as quantitatively as possible, the binding of TSH to the unfolded partial recombinant TSH receptor containing amino acids 357-372 of the complete TSH receptor sequence. Antibodies made by immunizing rabbits with a conjugate of a peptide fragment that has been shown not to inhibit PEG are added as part of the precipitation system (Desial K. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 77: 658-663, 1993). The added antibody or complex containing it and the bound radiolabeled TSH are then precipitated with the aid of protein A, which binds nonspecifically to any antibody. Under the test conditions, the binding of Protein A to the receptor binding antibody does not appear to impair TSH binding at the same time. The knowledge gained using antibodies to the recombinant TSH receptor or portions thereof may be used to measure TSH receptor autoantibodies by using a third, per se known principle in the form of an immunoprecipitation assay. In which preparations of the extracellular portion of the recombinant TSH receptor, which is labeled by incorporating35 S-labeled methionine, are used as reagents for precipitation. Such an assay has no selectivity for either TSI or TBII (NG Morgensaller et al., Exp Clin Endocrinol Diabetes 104 (1996) Suppl 456-59). However preparing a labeled receptor by vitro translation takes very complex and expensive,35 S normal measurement device suitable for clinical measurements for radiation emitted by the absence. Therefore, this method is not suitable as a measurement method for ordinary clinical diagnosis. It is an object of the present invention to provide a competitive receptor binding assay for measuring TSH receptor autoantibodies that does not have the described disadvantages of such competitive receptor binding assays of the prior art. In particular, it is an object of the present invention to be able to immobilize the TSH receptor complex formed from the reactants of the assay method to be measured on a conventional solid phase, and to address the existing methods relating to the lack of a suitable tracer. Provided is an improved competitive receptor binding assay for measuring TSH receptor autoantibodies, which is capable of overcoming limitations so that automated methods for such receptor binding assays can be used. It is to be. In particular, yet another object of the present invention is to design an improved competitive receptor binding assay for the detection of TSH receptor autoantibodies in a manner that provides greater clinical value as compared to prior art assays. It is to be. Yet another object of the present invention is to provide a reagent kit for performing such an improved receptor binding assay in routine clinical diagnosis. According pre characterizing closing the aforementioned object according to claim 1 (front), and has the features set forth in the characterizing closedin claim 1 (below) is accomplished at least in part by radioreceptor assay . Advantageous embodiments of the improved receptor binding assay according to the present invention are described in the sub-claims and are particularly described in conjunction with the following description herein. The purpose of providing a corresponding reagent kit is to provide a reagent for carrying out the method according to the invention, which in each case contains at least one of the components (i), (ii) and (iii) according to claim 15. Achieved by the kit. To cover the various possible embodiments for the receptor binding assay of the present invention, the general mode of expression described below by the introduction is referred to in claim 1 as the known mode of such receptor binding assay. The features are used to describe the features, and also for the features that the receptor binding assay according to the invention differs from those of the prior art. As described in the introduction, known competitive receptor binding assays, all designed as radioreceptor assays, contain the following assay components. Solubilized TSH receptor (i), especially solubilized natural animal (porcine) TSH receptor obtained from the thyroid membrane of the animal. Further known radioreceptor assays contain radiolabeled bovine TSH (ii), which competes with TSH receptor autoantibodies from serum samples (TBII) for a common binding site on the TSH receptor used. Since this competition is of the greatest importance to date and also allows for the measurement of the majority of autoantibodies, ie, 80-90%, the prior art labeled TSH is It is covered by the definition of “primary competitor” as used in claim 1. However, this definition also includes other forms of "primary competitors", the use of which is for the first time permitted by the present invention. Thus, labeled selective antibodies to the TSH receptor, described in more detail below, can also be used as competitors for TBII and, if necessary, for other autoantibody fractions. Furthermore, due to competition with TBII, TSH bound to the solid phase should also be able to meet the definition of "primary competitor". As described earlier, the TSH receptor and the components of the reaction mixture bound thereto, i.e., the complex of labeled TSH and autoantibody, are precipitated from the reaction mixture by a precipitating reagent and centrifuged to remove the reaction mixture. Separated from In the meaning of the precharacterizing close (preamble) of claim 1, the precipitating reagent is to be regarded as a reagent according to (iii). In the case of a competitive receptor binding assay according to the present invention, such reagent (iii) corresponds to the reactant bound to the solid phase and is primarily a specific TSH receptor immobilized on the solid phase. Although an antibody, according to the "mirror image" embodiment, it can also be TSH attached to a solid phase. An essential finding for the present invention is that immobilization made specific for the appropriate subsequence of the TSH receptor without significantly impairing the binding ability of the TSH receptor to TBII autoantibodies and labeled TSH. Human TSH receptor from any type of solubilized TSH receptor preparation (i.e., wherein the folding / glycosylation corresponds at least essentially to the natural TSH receptor, fixation of the animal or recombinant TSH receptor) also is the discoverythat itis possible toreachformed. Thus, the finding is that the determination of TSH receptor autoantibodies in a manner in which binding to the solid phase can be measured, for example, in a manner in which the amount of bound and labeled competitor, eg, primary competitor radiolabeled TSH, can be measured. Prerequisites for performing a receptor binding assay for Surprisingly, however, ... the production techniques and antibody types described in the above publications are in principle under test and are particularly suitable for replacing the antibodies used, but for the close sequence of the TSH receptor. It should also be noted that it is known that antibodies can belong to very different antibody types. As an alternative to antibodies used in the examples, and as an alternative to antibodies against 2 0-39 amino acids of the human TSHreceptor, 32-54, 287-30 1, of 361 to 381 or 739 to 758 Antibodies directed against the region are also suitable. However, based on the tests described below, special properties should be checked in special cases. The initial assay design of conventional radioreceptor assays differs to a greater extent from radiolabeled TSH, and another labeled selective antibody is used in place of radiolabeled TSH. If so, the above distinction between "primary competitor" and "secondary competitor" can be less clear or lose its meaning entirely. This does not change anything about the assay principle of the receptor binding assay according to the present invention, nor does it change anything regarding the fact that such assays are also protected by the present invention. Due to the fact that the method according to the invention allows the immobilization of the TSH receptor complex formed in the measuring solution with a tracer directly attached to the complex or with a tracer introduced after the immobilization, and furthermore with the radioisotope Since reagents with other tracers can be used, the actual operation of the TSH receptor autoantibody assay can be much better adapted to the requirements of clinical practice than was previously possible. The culture schedule can also be varied, and it appears that the culture schedule described in the following examples is no longer essential. ... and Fig. 2 shows the measurement results obtained by the method according to the invention in the case of the measurement of a group of patients with Graves' disease and a conventional radioreceptor assay (B.R.H.H.M.S. FIG. 4 shows a comparison of the measurement results obtained by TRAK-assayR ) from Diagnostica GmbH. Description of the Experiment Materials In the experiments described below, various commercial materials were used, in particular R. Ah. Her. M. S. Deer grayed Diagnostics Tikka GmbH made TRA K-assayR component, Pharmacia Ltd. NAP25 Desalination column for purifying the produced antibodies for fixed, Pierce made carboxymethyl link over Ltd.R materials and Fluka as solid substrate material Sodium iodate was used. 1. Production of Monoclonal Antibodies to the TSH Receptor Various monoclonal antibodies to selected peptides of the hTSH receptor were produced by prior art methods (see above). A monoclonal antibody to one peptide, containing 20 to 39 amino acids of the fully human TSH receptor (amino acid sequence GGMGCSSPBCECHQEEDFRV), was used for further testing. 2. Production of monoclonal antibodies bound to a solid phase. In 20 ml of ascites solution diluted 1:10 with PBS (phosphate buffered saline; 50 mM sodium phosphate, 100 mM NaCl, pH 7.5) and containing the monoclonal antibody described above. Was dissolved in 250 mg of periodate, and the culture was carried out at room temperature for 30 minutes. The reaction solution was desalted on a NAP25 desalting column (Pharmacia) according to the manufacturer's method. The desalted protein was mixed with the washed-carbonitrile link in P BS (Carbo1inkR) material (10 mL). After overnight incubation at 4 ° C. with constant shaking, 0.5 ml of the resulting gel with the monoclonal antibody bound thereon is filled into a plastic column (0.5 × 4 cm) and 25 mM sodium citrate buffer pH 2. Washed with 5 (2 ml wash volume). The column was equilibrated with PBS (2 ml) and then used for further testing. 3. A radioreceptor assay was performed using the components of TRAK-AssayR (B.R.A.H.H.M.D.A.G.N. (Preparation of the standard curve, measurement of the patient sample) radio receptor assay was performed according to the method for implementing TRAK- assayR a. The following pipetting scheme was used. A 50 μl sample was pipetted. 50 μl of solubilized bovine TSH receptor was then pipetted. Culture was performed at room temperature for 15 minutes. 100 μl of tracer (TSH labeled with radioactive iodine) was added by pipette. The resulting reaction batch was transferred to a (column with carboxymethyl linkR materials) solid phase obtained by loading a monoclonal antibody as described above. The reaction batch is incubated at room temperature for 1 hour.
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