【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、ハイブリダイゼー
ションによる核酸の検出に関し、詳しくは、ハイブリダ
イゼーションによる核酸の検出法、並びに同方法に用い
る核酸及び核酸固定化基材に関する。The present invention relates to the detection of nucleic acids by hybridization, and more particularly, to a method for detecting nucleic acids by hybridization, and a nucleic acid and a nucleic acid-immobilized substrate used in the method.
【０００２】[0002]
【従来の技術】臨床検査、食品検査、法医学検査等の分
野において、検体中に存在する核酸、抗体、抗原等生物
学的に活性な物質を検出する方法として、目的物質に応
じて核酸プローブ法、酵素免疫測定法等が用いられてい
る。2. Description of the Related Art In the fields of clinical tests, food tests, forensic tests, etc., as a method for detecting a biologically active substance such as nucleic acids, antibodies, antigens, etc. present in a sample, a nucleic acid probe method according to a target substance is used. , Enzyme immunoassay and the like.
【０００３】核酸を検出する方法としては、病原微生物
等の菌種同定、法医学におけるDNA鑑定等がある。これ
らの方法では、通常、以下のように検出が行われる。標
的となる核酸と相補的な配列を有する核酸を酵素等で直
接、またはハプテン等を介して間接的に標識する。この
標識核酸と標的となる核酸をハイブリダイズさせる。ハ
イブリダイズしなかった標的核酸を除くかまたは標識部
分を不活性化した後に、標識部分を検出することにより
標的核酸の存在及び量を確認する。[0003] Methods for detecting nucleic acids include identification of bacterial species such as pathogenic microorganisms and DNA identification in forensic medicine. In these methods, detection is usually performed as follows. A nucleic acid having a sequence complementary to a target nucleic acid is labeled directly with an enzyme or the like or indirectly via a hapten or the like. The labeled nucleic acid is hybridized with the target nucleic acid. After removing the non-hybridized target nucleic acid or inactivating the labeled portion, the presence and amount of the target nucleic acid are confirmed by detecting the labeled portion.
【０００４】従来の核酸検出法においては、チューブ、
マイクロタイタープレート、メンブレンフィルター、ビ
ーズ等の固相表面に核酸を固定化することが非常に重要
である。そのため、核酸を固定化する種々の方法が公表
されている。[0004] In the conventional nucleic acid detection method, a tube,
It is very important to immobilize nucleic acids on a solid phase surface such as a microtiter plate, a membrane filter, or beads. Therefore, various methods for immobilizing nucleic acids have been published.
【０００５】例えば、 ５'末端にチオール基を有する核酸とチオール基を含
むビーズ状基材との間のジスルフィド結合による固定
（P. J. R. Day, P. S. Flora, J. E. Fox, M. R.Walke
r, Biochem. J., 278, 735-740(1991)）等のような修飾
基を導入した核酸を基材に化学結合させる方法、 核酸を、UV照射あるいは加熱処理によりニトロセル
ロース、ポリ-L-リジンまたはナイロンメンブレン等上
に吸着固定（J. Sambrok, E. F. Fritsch and T. Mania
tis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laborat
ory Press, SecondEdition, page 2.109-2.113 and pag
e 9.34-9.46、特表平１０−５０３８４１号）したり、
マイクロプレート上に物理吸着させ固定（G. C. N. Par
ry and A. D.B. Malcolm, Biochem. Soc. Trans., 17,
230-231(1989)）したりする等の物理吸着で固定する方
法、 基材上に結合させたヌクレオチドを用い、基材上で
ＤＮＡを合成する方法（ＷＯ９７／１０３６５）、 等が知られている。[0005] For example, immobilization by a disulfide bond between a nucleic acid having a thiol group at the 5 'end and a bead-like substrate containing a thiol group (PJR Day, PS Flora, JE Fox, MRWalke)
r, Biochem. J., 278, 735-740 (1991)), etc., a method of chemically bonding a nucleic acid having a modified group introduced thereto to a substrate, nitrocellulose, poly-L by UV irradiation or heat treatment. -Adsorption and fixation on lysine or nylon membrane (J. Sambrok, EF Fritsch and T. Mania
tis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laborat
ory Press, SecondEdition, page 2.109-2.113 and pag
e 9.34-9.46, Tokiohei 10-503841)
Physical adsorption on microplate and fixation (GCN Par
ry and ADB Malcolm, Biochem. Soc. Trans., 17,
230-231 (1989)), a method of immobilization by physical adsorption such as rubbing, and a method of synthesizing DNA on a substrate using nucleotides bound on the substrate (WO97 / 10365). I have.
【０００６】しかしながら、の方法においては、極め
て特殊な機械と試薬が必要となり、また、の方法にお
いては、ハイブリダイゼーションを行った場合、特に操
作過程で基材から核酸が剥がれ落ち、結果として検出感
度が下がる、再現性が得られない等の欠点がある。さら
に、この方法では、長い核酸は固定化できるが、オリゴ
マー等の約５０mer以下の短い核酸になると効率良く固
定化できないという欠点がある。[0006] However, in the above method, very special machines and reagents are required, and in the above method, when performing the hybridization, the nucleic acid is peeled off from the base material particularly during the operation process, and as a result, the detection sensitivity is reduced. However, there are drawbacks such as lowering of reproducibility and inability to obtain reproducibility. Furthermore, this method has the disadvantage that long nucleic acids can be immobilized, but short nucleic acids such as oligomers of about 50 mer or less cannot be immobilized efficiently.
【０００７】また、の方法においては、基材上でＤＮ
Ａを合成するために極めて特殊な機械と試薬が必要とな
り、さらに、合成できる核酸も２５mer程度までに限ら
れるという欠点がある。[0007] In the method of (1), DN
In order to synthesize A, a very special machine and reagent are required, and further, the nucleic acid that can be synthesized is limited to about 25 mer.
【０００８】[0008]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、基材上に核
酸を簡便に効率よく、かつ、簡易に固定化する方法、及
び同方法を用いてハイブリダイゼーションによる核酸の
検出を高感度で行う方法、及びこの方法に用いる核酸及
び核酸固定化基材を提供することを課題とする。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a method for simply and efficiently immobilizing a nucleic acid on a substrate, and a method for detecting a nucleic acid by hybridization with high sensitivity using the method. It is an object to provide a method, and a nucleic acid and a nucleic acid-immobilized substrate used in the method.
【０００９】[0009]
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するた
め、検討を行った結果、核酸の３'又は５'末端の一方又
は両方に、不飽和結合を有する化合物を含むポリマーが
結合した核酸が、短くても強固に固定化できること、さ
らにこのようにして核酸を基材に固定化したものを用い
ると、ハイブリダイゼーションによる核酸の検出感度を
向上できることを見出し、本発明の完成に至った。As a result of investigations to solve the above problems, it has been found that a nucleic acid in which a polymer containing a compound having an unsaturated bond is bonded to one or both of the 3 ′ and 5 ′ ends of the nucleic acid. It has been found that even if the nucleic acid is short, it can be firmly immobilized, and that the use of the immobilized nucleic acid on the substrate in this way can improve the sensitivity of nucleic acid detection by hybridization, thus completing the present invention.
【００１０】すなわち本発明は、以下の通りである。 （１）固定化核酸を用いた核酸同士のハイブリダイゼー
ションに用いられる固定化される核酸であって、核酸の
３'又は５'末端の一方又は両方に、不飽和結合を有する
化合物を含むポリマーが結合した核酸。 （２）前記ポリマーの平均重合度が３以上１００以下で
ある（１）記載の核酸。 （３）前記ポリマーを構成するモノマーがヌクレオチド
である（２）記載の核酸。 （４）核酸固定化用基材と、この基材上に固定化された
（１）〜（３）のいずれか１項に記載の核酸とを有する
核酸固定化基材。 （５）核酸固定化用基材と（１）〜（３）のいずれか１
項に記載の核酸を接触させ、接触部に電磁波を照射する
ことを含む核酸固定化基材の製造法。 （６）固定化核酸を用いたハイブリダイゼーションによ
る核酸の検出法において、（４）記載の核酸固定化基材
を用いることを特徴とする核酸の検出法。That is, the present invention is as follows. (1) A nucleic acid to be immobilized used for hybridization between nucleic acids using the immobilized nucleic acid, wherein a polymer containing a compound having an unsaturated bond at one or both of the 3 ′ and 5 ′ ends of the nucleic acid is used. Bound nucleic acid. (2) The nucleic acid according to (1), wherein the average degree of polymerization of the polymer is 3 or more and 100 or less. (3) The nucleic acid according to (2), wherein the monomer constituting the polymer is a nucleotide. (4) A nucleic acid-immobilized substrate comprising a nucleic acid-immobilized substrate and the nucleic acid according to any one of (1) to (3) immobilized on the substrate. (5) Nucleic acid immobilization substrate and any one of (1) to (3)
A method for producing a nucleic acid-immobilized substrate, which comprises contacting the nucleic acid according to item 1 with an electromagnetic wave to the contact portion. (6) A method for detecting a nucleic acid by hybridization using an immobilized nucleic acid, comprising using the nucleic acid-immobilized substrate according to (4).
【００１１】[0011]
【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態を詳
細に説明する。Embodiments of the present invention will be described below in detail.
【００１２】＜１＞核酸 本発明の核酸は、その３'又は５'末端の一方又は両方
に、不飽和結合を有する化合物を含むポリマーが結合し
た核酸である。すなわち、本発明の核酸は、ポリマー部
分と、ハイブリダイゼーションに関与する領域（以下、
便宜上「特異的領域」ともいう。）を含む部分とからな
る。本発明の核酸の特異的領域を含む部分は、３'又は
５'末端の一方又は両方にポリマーが結合していること
以外は、通常の固定化（固相化）核酸を用いた核酸同士
のハイブリダイゼーションに用いられる固定化核酸と特
に変わることは無く、ハイブリダイゼーションが可能な
核酸であれば特に制限されず、例えば、天然又は合成の
ＤＮＡ（オリゴヌクレオチドを含む）若しくはＲＮＡ
（オリゴヌクレオチドを含む）が挙げられる。また、上
記核酸は１本鎖であっても、２本鎖であっても構わな
い。また、特異的領域の長さは、ハイブリダイゼーショ
ンが可能な長さであれば特に制限されないが、通常５〜
１００００００塩基、好ましくは１０〜２０００塩基程
度である。<1> Nucleic acid The nucleic acid of the present invention is a nucleic acid having a polymer containing a compound having an unsaturated bond bound to one or both of its 3 ′ and 5 ′ ends. That is, the nucleic acid of the present invention comprises a polymer portion and a region involved in hybridization (hereinafter, referred to as a region).
For convenience, it is also referred to as “specific region”. ). The portion containing the specific region of the nucleic acid of the present invention is a nucleic acid between nucleic acids using a normal immobilized (immobilized) nucleic acid, except that a polymer is bonded to one or both of the 3 ′ and 5 ′ ends. There is no particular difference from the immobilized nucleic acid used for hybridization, and the nucleic acid is not particularly limited as long as it is a nucleic acid that can be hybridized. For example, natural or synthetic DNA (including oligonucleotide) or RNA
(Including oligonucleotides). The nucleic acid may be single-stranded or double-stranded. The length of the specific region is not particularly limited as long as hybridization is possible, but is usually 5 to 5.
1,000,000 bases, preferably about 10 to 2000 bases.
【００１３】上記のような核酸の特異的領域を含む部分
の３'又は５'末端、又は両末端にポリマーを結合する方
法としては、公知の方法を用いることができる。具体的
には、例えば、市販されている核酸合成器を用いて、上
記核酸の特異的領域を含む部分の３'又は５'末端、ある
いは両末端に、ポリマーを構成する化合物として、チミ
ン、ウラシル等の核酸塩基を有するヌクレオチドが少な
くとも３塩基以上重合するように、一体として合成する
方法等が挙げられる。A known method can be used to bind a polymer to the 3 ′ or 5 ′ end or both ends of a portion containing a specific region of a nucleic acid as described above. Specifically, for example, using a commercially available nucleic acid synthesizer, thymine, uracil as a compound constituting a polymer at the 3 ′ or 5 ′ end of the portion containing the specific region of the nucleic acid, or at both ends. And the like, so that a nucleotide having a nucleobase is polymerized at least three bases or more.
【００１４】不飽和結合を有する化合物を含むポリマー
とは、ポリマーを構成するモノマーの少なくとも一つが
不飽和結合を有する化合物を含むポリマーを意味する。
不飽和結合を有する化合物は、核酸が核酸固定化用基材
に固定化されるのに十分に含まれていればよいが、ポリ
マーを構成するモノマーの全てが不飽和結合を有する化
合物を含むことが好ましい。なお、「不飽和結合を有す
る化合物を含む」とは、不飽和結合を含む化合物の残基
からなる又は該残基を含むことを意味する。The polymer containing a compound having an unsaturated bond means a polymer containing a compound in which at least one of the monomers constituting the polymer has an unsaturated bond.
The compound having an unsaturated bond only needs to be contained enough for the nucleic acid to be immobilized on the nucleic acid-immobilizing substrate, but it is necessary that all of the monomers constituting the polymer include a compound having an unsaturated bond. Is preferred. In addition, "including a compound having an unsaturated bond" means consisting of or including a residue of a compound having an unsaturated bond.
【００１５】ポリマーの長さとしては、その平均重合度
が３〜１００が好ましく、５〜５０がより好ましく、１
０〜４０が特に好ましい。The polymer has an average degree of polymerization of preferably 3 to 100, more preferably 5 to 50, and more preferably 1 to 50.
0 to 40 are particularly preferred.
【００１６】この平均重合度が２以下であると、十分な
量の核酸を担体上に固定できないことがあり、また、重
合度が１０１以上であると核酸製造工程で著しく収率が
低下することがある。When the average degree of polymerization is 2 or less, a sufficient amount of nucleic acid may not be immobilized on the carrier, and when the degree of polymerization is 101 or more, the yield is significantly reduced in the nucleic acid production process. There is.
【００１７】ポリマーとしては、具体的には、アデニ
ン、アデニン誘導体、シトシン、シトシン誘導体、グア
ニン、グアニン誘導体、チミン、チミン誘導体、ウラシ
ル、ウラシル誘導体を塩基として有するヌクレオチド、
アクリル酸又はメタクリル酸のエステル系モノマー、ス
チレン系モノマー、ポリオレフィン系モノマー、ビニル
系モノマー、ニトリル系モノマー、エチレングリコール
ジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレー
ト、テトラエチレングリコールジアクリレート、トリメ
チロールプロパントリアクリレート、テトラメチロール
プロパンテトラアクリレート、ジペンタエリスリトール
ペンタアクリレート等から選ばれるモノマーが含まれる
ポリマーが挙げられ、ポリマー中の上記モノマーの種類
は同一又は異なってもよい。好ましいモノマーはヌクレ
オチドである。Specific examples of the polymer include adenine, adenine derivatives, cytosine, cytosine derivatives, guanine, guanine derivatives, thymine, thymine derivatives, uracil, nucleotides having uracil derivatives as bases,
Acrylic or methacrylic acid ester monomers, styrene monomers, polyolefin monomers, vinyl monomers, nitrile monomers, ethylene glycol diacrylate, ethylene glycol dimethacrylate, tetraethylene glycol diacrylate, trimethylolpropane triacrylate, tetramethylol Examples include a polymer containing a monomer selected from propane tetraacrylate, dipentaerythritol pentaacrylate, and the like, and the types of the monomers in the polymer may be the same or different. Preferred monomers are nucleotides.
【００１８】前記ポリマー中に、同ポリマーを構成する
モノマーに核酸塩基を有するヌクレオチドを用いる場
合、この核酸塩基と異なる塩基を有するヌクレオチドを
挿入しておくと、固定化核酸とハイブリダイズさせる試
料核酸とのクロスハイブリダイゼーションを抑制するこ
とができる。例えば、ポリマーとしてポリＴ又はポリＵ
を用いた場合、試料核酸中にポリＡ ＲＮＡが含まれて
いると、特異的領域の配列と無関係にハイブリダイズし
てしまう可能性がある。このような場合であっても、ポ
リＴ又はポリＵ中に他の塩基を有するヌクレオチド又は
任意の塩基と塩基対を形成しない化合物を挿入しておく
と、クロスハイブリダイゼーションが抑制される。この
ような化合物としては、例えば、アデニン誘導体、シト
シン誘導体、チミン誘導体、グアニン誘導体、ウラシル
誘導体等を有するヌクレオチド、プリン環及びピリミジ
ン環を有しないデオキシリボ核酸及びリボ核酸、グルコ
ース、ガラクトース、マルトース、アルキル基含有化合
物、アルコキシル基含有化合物、アミノ基含有化合物、
イミノ基含有化合物、水酸基含有化合物、ハロゲン含有
化合物、スルホン酸含有化合物、カルボン酸含有化合
物、ホスホン酸含有化合物等の、ポリヌクレオチドに挿
入可能な公知の化合物を挙げることができる。また、挿
入されるヌクレオチド又は化合物の長さは、通常には１
〜７０分子程度である。挿入されるヌクレオチド又は化
合物は連続していなくてもよい。In the case where a nucleotide having a nucleobase as a monomer constituting the polymer is used in the polymer, if a nucleotide having a base different from the nucleobase is inserted, a sample nucleic acid to be hybridized with the immobilized nucleic acid can be obtained. Cross-hybridization can be suppressed. For example, poly T or poly U as a polymer
When poly (A) RNA is contained in the sample nucleic acid, hybridization may occur regardless of the sequence of the specific region. Even in such a case, if a nucleotide having another base or a compound that does not form a base pair with any base is inserted into poly T or poly U, cross hybridization is suppressed. Such compounds include, for example, adenine derivatives, cytosine derivatives, thymine derivatives, nucleotides having guanine derivatives, uracil derivatives, etc., deoxyribonucleic acids and ribonucleic acids having no purine and pyrimidine rings, glucose, galactose, maltose, alkyl groups Containing compounds, alkoxyl group containing compounds, amino group containing compounds,
Known compounds that can be inserted into a polynucleotide, such as an imino group-containing compound, a hydroxyl group-containing compound, a halogen-containing compound, a sulfonic acid-containing compound, a carboxylic acid-containing compound, and a phosphonic acid-containing compound, can be exemplified. The length of the nucleotide or compound to be inserted is usually 1
It is about 70 molecules. The inserted nucleotides or compounds need not be contiguous.
【００１９】＜２＞核酸固定化用基材 本発明の核酸固定化用基材に用いる基材は、物理的吸着
又は化学結合によって核酸を固定化することができ、通
常のハイブリダイゼーションの条件に耐えうるものであ
れば特に制限されない。具体的には、核酸の固定及びハ
イブリダイゼーション等に用いる溶剤に不溶であり、か
つ常温若しくはその付近の温度範囲内（例えば０〜１０
０℃）で固体又はゲル状であるものが挙げられる。尚、
基材が溶剤に不溶性であるとは、基材に後述のようにし
てカルボジイミド基等の核酸に結合性を有する基を有す
る担体が担持され、次いで核酸が固定化され、その後、
例えば、ＤＮＡチップ等として使用される際の各過程で
用いられる水性溶剤、有機溶剤等の各種溶剤に実質的に
不溶性であることをいう。<2> Substrate for Immobilizing Nucleic Acid The substrate used for the substrate for immobilizing nucleic acids of the present invention can immobilize nucleic acids by physical adsorption or chemical bonding, and can be used under ordinary hybridization conditions. There is no particular limitation as long as it can withstand. Specifically, it is insoluble in a solvent used for immobilization and hybridization of nucleic acids, and at a room temperature or in a temperature range around the room temperature (for example, 0 to 10).
(0 ° C.). still,
When the base material is insoluble in the solvent, a carrier having a group having a binding property to a nucleic acid such as a carbodiimide group is carried on the base material as described below, and then the nucleic acid is immobilized.
For example, it is substantially insoluble in various solvents such as an aqueous solvent and an organic solvent used in each process when used as a DNA chip or the like.
【００２０】このような基材の材質として、具体的に
は、プラスチック、無機高分子、金属、天然高分子、セ
ラミック等が挙げられる。Specific examples of the material of such a substrate include plastics, inorganic polymers, metals, natural polymers, and ceramics.
【００２１】上記プラスチックとして具体的には、ポリ
エチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロ
ピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、
ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化
ビニリデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミド及びアク
リル樹脂等が挙げられる。Specific examples of the plastic include polyethylene, polystyrene, polycarbonate, polypropylene, polyamide, phenol resin, epoxy resin,
Polycarbodiimide resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene fluoride, polyfluorinated ethylene, polyimide, acrylic resin and the like can be mentioned.
【００２２】また、無機高分子として具体的には、ガラ
ス、水晶、カーボン、シリカゲル及びグラファイト等が
挙げられる。Further, specific examples of the inorganic polymer include glass, quartz, carbon, silica gel and graphite.
【００２３】また、金属として具体的には、金、白金、
銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石、パラマグネット等が
挙げられる。Further, specifically, as the metal, gold, platinum,
Silver, copper, iron, aluminum, magnets, paramagnets, and the like.
【００２４】また、天然高分子としては、ポリアミノ
酸、セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸及びそ
れらの誘導体が挙げられる。Examples of natural polymers include polyamino acids, cellulose, chitin, chitosan, alginic acid, and derivatives thereof.
【００２５】また、セラミックとして具体的には、アパ
タイト、アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素及
び炭化ホウ素等が挙げられる。Specific examples of the ceramic include apatite, alumina, silica, silicon carbide, silicon nitride, and boron carbide.
【００２６】上記基材の形状としては、例えば、フィル
ム、平板、粒子、成形品（ビーズ、ストリップ、マルチ
ウェルプレートのウェルまたはストリップ、チューブ、
メッシュ、連続発泡フォーム、膜、紙、針、ファイバ
ー、プレート、スライド及び細胞培養容器等）、ラテッ
クス等を挙げることができる。また、それらの大きさに
ついては、特に制限は無い。Examples of the shape of the substrate include films, flat plates, particles, molded articles (beads, strips, wells or strips of multiwell plates, tubes,
Mesh, open-cell foam, membrane, paper, needle, fiber, plate, slide, cell culture vessel, etc.), latex and the like. There is no particular limitation on their size.
【００２７】上記基材に核酸を固定化するに当たって、
基材に核酸を直接固定化してもよく、担体を基材に担持
させて、担体を介して核酸を基材に固定化してもよい。
担体としては、担体自体が核酸に結合性を有してもよ
く、核酸に結合性を有するリガンドを介して核酸を固定
化できるものであってよい。ここで、「担持」とは、担
体に核酸を固定化する際や核酸固定化基材をＤＮＡチッ
プ等として使用する際等に用いられる水溶性溶剤、有機
溶剤等の各種溶剤中で、基材から上記担体が実質的に脱
離しないことを意味する。In immobilizing the nucleic acid on the substrate,
The nucleic acid may be directly immobilized on the substrate, or the carrier may be supported on the substrate, and the nucleic acid may be immobilized on the substrate via the carrier.
As the carrier, the carrier itself may have a binding property to the nucleic acid, or a carrier capable of immobilizing the nucleic acid via a ligand having the binding property to the nucleic acid may be used. Here, the term "support" refers to a method in which a nucleic acid is immobilized on a carrier, or a nucleic acid-immobilized substrate is used as a DNA chip or the like. Means that the above-mentioned carrier is not substantially eliminated.
【００２８】本発明に用いられる上記担体は、上記基材
上に担持される限り、単に物理的な接着性を利用して担
持されていてもよく、また、化学的に共有結合等を介し
て担持されていてもよい。また、上記担体は、必要に応
じ、基材上の全面において担持されても、また、その一
部において担持されてもよい。The carrier used in the present invention may be supported simply by using physical adhesiveness as long as it is supported on the substrate, or may be chemically bonded via a covalent bond or the like. It may be carried. In addition, the carrier may be supported on the entire surface of the substrate, or may be supported on a part thereof, as necessary.
【００２９】担体としては、有機低分子、プラスチッ
ク、無機高分子、金属、天然高分子、セラミック等が挙
げられる。Examples of the carrier include low organic molecules, plastics, inorganic polymers, metals, natural polymers, ceramics and the like.
【００３０】上記有機低分子として具体的には、カルボ
ジイミド基含有化合物、イソシアネート基含有化合物、
窒素イペリット基含有化合物、アルデヒド基含有化合
物、アミノ基含有化合物等が挙げられる。Specific examples of the organic low-molecular compound include a carbodiimide group-containing compound, an isocyanate group-containing compound,
Examples include a compound containing a nitrogen ipetrite group, a compound containing an aldehyde group, and a compound containing an amino group.
【００３１】また、プラスチックとして具体的には、ポ
リエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプ
ロピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹
脂、ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフ
ッ化ビニリデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミド及び
アクリル樹脂等が挙げられる。Specific examples of the plastic include polyethylene, polystyrene, polycarbonate, polypropylene, polyamide, phenol resin, epoxy resin, polycarbodiimide resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene fluoride, polyfluoroethylene, polyimide and acrylic resin. No.
【００３２】また、無機高分子として具体的には、ガラ
ス、水晶、カーボン、シリカゲル及びグラファイト等が
挙げられる。Further, specific examples of the inorganic polymer include glass, quartz, carbon, silica gel, graphite and the like.
【００３３】また、金属として具体的には、金、白金、
銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石、パラマグネット等が
挙げられる。Specific examples of the metal include gold, platinum,
Silver, copper, iron, aluminum, magnets, paramagnets, and the like.
【００３４】また、天然高分子としては、ポリアミノ
酸、セルロース、キチン、キトサン及びそれらの誘導体
が挙げられる。Examples of natural polymers include polyamino acids, cellulose, chitin, chitosan and derivatives thereof.
【００３５】また、セラミックとして具体的には、アパ
タイト、アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素及
び炭化ホウ素等が挙げられる。Specific examples of the ceramic include apatite, alumina, silica, silicon carbide, silicon nitride, and boron carbide.
【００３６】このような担体は、上記基材に対して高い
接着性を有するものであり、この接着性を利用して基材
に担持されるものである。尚、前記担体が基材上に物理
的な接着性を利用して担持される際の代表的な形態は皮
膜である。Such a carrier has high adhesiveness to the above-mentioned substrate, and is carried on the substrate by utilizing this adhesiveness. In addition, a typical form when the carrier is carried on a base material using physical adhesiveness is a film.
【００３７】前記基材上に前記担体を皮膜で担持させる
方法としては、スプレー、浸漬、ブラッシング、スタン
プ、蒸着、フィルムコータを用いたコーティング等の公
知の方法を用いることができる。As a method of supporting the carrier with a film on the base material, known methods such as spraying, dipping, brushing, stamping, vapor deposition, and coating using a film coater can be used.
【００３８】例えば、ガラス基材の表面全体にカルボジ
イミド基（樹脂）を導入する方法については、まず、３
−アミノプロピルトリエトキシシラン等のアミノ置換オ
ルガノアルコキシシランを適当な溶媒に溶解して得られ
た溶液に７０〜８０℃程度の温度条件下でガラス基材を
概ね２〜３時間程度浸漬した後、これを取り出して水洗
し、さらに、１００〜１２０℃程度で約４〜５時間加熱
乾燥する。乾燥後、適当な溶媒中に浸し、カルボジイミ
ド樹脂を加え３０〜１７０℃程度の温度条件下で１２時
間程度攪拌し、洗浄すればよい。また、上記３−アミノ
プロピルトリエトキシシランのアミノ基と窒素イペリッ
ト基の核酸結合基以外の官能基を適当な溶媒を用いて反
応させ、ガラス基材の表面に窒素イペリット基を導入す
ることもできる。For example, a method for introducing a carbodiimide group (resin) over the entire surface of a glass substrate is as follows.
After immersing the glass substrate in a solution obtained by dissolving an amino-substituted organoalkoxysilane such as -aminopropyltriethoxysilane in an appropriate solvent at a temperature of about 70 to 80 ° C for about 2 to 3 hours, This is taken out, washed with water, and further dried by heating at about 100 to 120 ° C. for about 4 to 5 hours. After drying, it may be immersed in an appropriate solvent, added with a carbodiimide resin, stirred for about 12 hours at a temperature of about 30 to 170 ° C., and washed. Further, the amino group of the 3-aminopropyltriethoxysilane and a functional group other than the nucleic acid binding group of the nitrogen ipetrite group may be reacted with an appropriate solvent to introduce the nitrogen ipetrite group on the surface of the glass substrate. .
【００３９】また、ガラス基材にアミノ基以外場合や、
基材がガラス以外の材料からなる場合においても、上記
基材の説明で挙げた各種材料表面に種々の官能基を導入
することは、従来より一般的に行われていることであ
り、その方法も公知であるので、このような公知の方法
を用いて基材表面への官能基の導入を行うことができ
る。In the case where the glass substrate is other than an amino group,
Even when the substrate is made of a material other than glass, it is a general practice to introduce various functional groups on the surfaces of the various materials mentioned in the description of the substrate, which has been conventionally performed. Is also known, and the functional group can be introduced into the surface of the base material using such a known method.
【００４０】さらに、上記で挙げた基材のプラスチック
基材の中には、基材表面に既に上記のような官能基を有
するものも有り、この場合には基材表面に官能基を導入
することなしに、これをそのまま担体の製造に用いるこ
とも可能である。また、このようなプラスチック基材で
あってもさらに官能基を導入して上記担体の製造に用い
ることも可能である。Further, some of the above-mentioned plastic base materials which have the above-mentioned functional group on the surface of the base material, and in this case, the functional group is introduced into the surface of the base material. Without this, it can be used as it is for the production of the carrier. Further, even with such a plastic substrate, it is also possible to introduce a functional group and use it in the production of the carrier.
【００４１】また、上記担体または基材、あるいは担体
及び基材の材料に公知の光重合開始剤を混合することも
できる。光重合開始剤を混合することによって、紫外線
等の電磁波の照射による核酸の固定化の際の反応性が向
上し得る。Further, a known photopolymerization initiator can be mixed with the above-mentioned carrier or substrate, or the material of the carrier and the substrate. By mixing the photopolymerization initiator, the reactivity at the time of immobilizing nucleic acids by irradiation of electromagnetic waves such as ultraviolet rays can be improved.
【００４２】＜３＞核酸固定化基材 上記核酸を核酸固定化用基材上に固定化すると、本発明
の核酸固定化基材が得られる。核酸を固定化するに際
し、基材上に核酸を点状に固定化することが好ましい。
点状に固定化されるとは、基材の大きさに対して、核酸
固定部位が複数個所設けられる程度に充分小さいことを
いう。前記点の形状は、特に制限されず、核酸固定化基
材の使用形態、用途等により適宜選択されうる。<3> Nucleic acid-immobilized substrate The nucleic acid-immobilized substrate of the present invention is obtained by immobilizing the nucleic acid on a nucleic acid-immobilizing substrate. In immobilizing the nucleic acid, it is preferable to immobilize the nucleic acid on the substrate in a dot-like manner.
“Immobilized in a dot shape” means that it is sufficiently small that a plurality of nucleic acid immobilization sites are provided with respect to the size of the substrate. The shape of the dot is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the use form, application, and the like of the nucleic acid-immobilized substrate.
【００４３】本発明の核酸固定化基材に固定化される核
酸としては、上記＜１＞で挙げた核酸が特に制限無く挙
げられる。The nucleic acid to be immobilized on the nucleic acid-immobilized substrate of the present invention includes, without particular limitation, the nucleic acids described in <1> above.
【００４４】また、上記本発明の核酸固定化基材におい
て点状に固定化されている核酸は同一であっても異なっ
てもよく、異なる核酸を用いる場合の各核酸の配置等に
ついては、得られる核酸固定化基材の使用形態、用途等
により適宜選択されうる。また、固定化される核酸は混
合物であってもよい。The nucleic acids immobilized in the form of dots on the nucleic acid-immobilized base material of the present invention may be the same or different. It can be appropriately selected depending on the use form, application, and the like of the nucleic acid-immobilized substrate to be used. Further, the nucleic acid to be immobilized may be a mixture.
【００４５】このような核酸を上記担体に点状に固定化
するには、担体上に、適当な条件下で、微量の核酸を所
望の大きさの点状に供給することで、担体と核酸を接触
させ固定化すればよい。In order to immobilize such a nucleic acid in the form of dots on the above-mentioned carrier, a small amount of nucleic acid is supplied on the carrier under appropriate conditions in the form of a dot having a desired size. May be brought into contact and immobilized.
【００４６】具体的には、例えば、両者の接触反応にお
いて固定化される核酸の活性が維持されるように、通
常、核酸は水またはバッファー中に含まれる形で供給さ
れる。また、両者の接触中又は接触後に電磁波を照射す
ることによって固定化することもできる。また、上記水
またはバッファー中に公知の光重合開始剤を混合するこ
ともできる。Specifically, for example, the nucleic acid is usually supplied in a form contained in water or a buffer so that the activity of the nucleic acid immobilized in the contact reaction between the two is maintained. The immobilization can also be performed by irradiating electromagnetic waves during or after the contact between the two. Further, a known photopolymerization initiator can be mixed in the water or the buffer.
【００４７】この固定に用いる電磁波としては、２２０
ｎｍ〜３８０ｎｍの波長の紫外線が好ましく、その照射
量は、１０〜５０００ｍＪ/cm2が好ましく、１００〜２
０００ｍＪ/cm2がさらに好ましい。さらに、照射する紫
外線のスペクトルの形状は、１００ｎｍ以下の半値幅を
持ったものが好ましいが化合物（不飽和結合を有する化
合物を含むポリマー）の吸収スペクトルの形状によって
適宜選択することができる。The electromagnetic wave used for this fixing is 220
Ultraviolet light having a wavelength of from nm to 380 nm is preferable, and the irradiation amount is preferably from 10 to 5000 mJ / cm2 , and
000 mJ / cm2 is more preferable. Furthermore, the shape of the spectrum of the ultraviolet light to be irradiated preferably has a half width of 100 nm or less, but can be appropriately selected depending on the shape of the absorption spectrum of the compound (a polymer including a compound having an unsaturated bond).
【００４８】核酸とカルボジイミド樹脂、窒素イペリッ
ト、ポリアミノ酸、ニトロセルロール等の公知の化合物
を化学的に結合又は物理的に結合した状態で、これら混
合物と担体を接触させ固定させてもよく、また、このと
きの固定は前記電磁波を照射して行ってもよい。In a state where nucleic acids and known compounds such as carbodiimide resin, nitrogen ipetrite, polyamino acid, and nitrocellulose are chemically or physically bonded, the mixture may be contacted with a carrier to be immobilized. The fixing at this time may be performed by irradiating the electromagnetic wave.
【００４９】本発明において微量の核酸を、通常は、核
酸を含有する水またはバッファーを、基材または基材上
の担体に点状に供給する手段として、ディスペンサを用
いる方法、ピンを用いる方法、バブルジェットを用いる
方法等が挙げられるが、本発明がこれらに限定されるも
のではない。また、このように溶液を微量に供給する装
置は、一般に市販されており、本発明においてもこれら
を用いることが可能である。In the present invention, a method using a dispenser, a method using a pin, and the like as a means for supplying a trace amount of nucleic acid, usually water or a buffer containing nucleic acid, to a substrate or a carrier on the substrate in a dot-like manner, Examples include a method using a bubble jet, but the present invention is not limited thereto. Further, such a device for supplying a small amount of a solution is generally commercially available, and these can be used in the present invention.
【００５０】本発明の核酸固定化用基材は、これを用い
て分析等を行う際に、上記固定化核酸以外の核酸等を接
触させる機会が多いが、基材または基材上の担体に担持
された未反応核酸固定部分に上記固定化核酸以外の核酸
等が非特異的に結合することを防ぐため、上記のように
して点状に核酸を基材または基材上の担体に固定化した
後に、過剰量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイ
ン、サケ精子ＤＮＡ等を基材または基材上の担体に接触
させ、未反応核酸固定部分をブロックしておくことが好
ましい。The nucleic acid-immobilized substrate of the present invention often has a chance to be brought into contact with a nucleic acid other than the above-mentioned immobilized nucleic acid when performing an analysis or the like using the substrate. In order to prevent non-specific binding of nucleic acids other than the above-mentioned immobilized nucleic acids to the carried unreacted nucleic acid-immobilized portion, the nucleic acids are immobilized on the substrate or the carrier on the substrate in the form of dots as described above. After that, it is preferable to contact an excessive amount of bovine serum albumin (BSA), casein, salmon sperm DNA or the like with the substrate or the carrier on the substrate to block the unreacted nucleic acid immobilized portion.
【００５１】このようにして得られる本発明の核酸固定
化基材は、前記核酸が担体に非常に強固に担持されたも
のであり、ハイブリダイゼーション等で広く使用されて
いる洗浄方法（界面活性剤を用いた洗浄方法）によって
も脱離することがなく、これを用いて分析等を行った場
合、再現性および定量性に優れた分析が可能となる。ま
た、本発明の核酸固定化基材は、核酸が、鎖の数や長さ
に制限されずに固定され得るので、同一基材上で種々の
核酸を同時に取り扱うことができる。The thus obtained nucleic acid-immobilized substrate of the present invention is a substrate in which the nucleic acid is very firmly supported on a carrier, and the washing method (surfactant) widely used for hybridization and the like is used. Even if the analysis or the like is carried out using this, analysis with excellent reproducibility and quantification can be performed. In addition, the nucleic acid-immobilized substrate of the present invention can immobilize nucleic acids without limitation on the number and length of chains, so that various nucleic acids can be handled simultaneously on the same substrate.
【００５２】これらのことから、本発明の核酸固定化基
材は、多数の核酸を用いてハイブリダイゼーション法に
より塩基配列を決定する技術、ＳＢＨ（Sequencing By
Hybridization）法、ＳＨＯＭ（Sequencing by Hybridi
zation with Oligonucleotide Matrix）法等に用いられ
るＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）等に優れた性
能を持って適用可能であるといえる。From these facts, the nucleic acid-immobilized substrate of the present invention can be obtained by a technique of determining the base sequence by hybridization using a large number of nucleic acids, called SBH (Sequencing By).
Hybridization) method, SHOM (Sequencing by Hybridi)
It can be said that it can be applied to a DNA chip (DNA microarray) used for the zation with Oligonucleotide Matrix method or the like with excellent performance.
【００５３】また、本発明の核酸固定化基材は、ハイブ
リダイゼーションによる核酸の回収にも好適に用いるこ
とができる。The nucleic acid-immobilized substrate of the present invention can also be suitably used for recovering nucleic acids by hybridization.
【００５４】[0054]
【実施例】以下、実施例により本発明を説明する。The present invention will be described below with reference to examples.
【００５５】[0055]
【製造例】 カルボジイミド化スライドガラスの作製 （１）アミノ化スライドガラスの作成 蒸留水１８０ｍｌに１０％（ｖ/ｖ）３−アミノプロピ
ルトリエトキシシラン/エタノール溶液２０ｍｌを加え
攪拌した。そこに６Ｎ ＨＣｌを加え、ｐＨ３〜４に調
整した後、スライドガラスを１５枚浸漬し、７５℃にて
２時間加熱処理した。加熱終了後、スライドガラスを溶
液から引き上げ、蒸留水でよく洗い流した後、１１５℃
にて４時間加熱処理して、アミノ化スライドガラスを得
た。[Production Example] Preparation of carbodiimidated slide glass (1) Preparation of aminated slide glass 20 ml of a 10% (v / v) 3-aminopropyltriethoxysilane / ethanol solution was added to 180 ml of distilled water and stirred. After 6N HCl was added thereto to adjust the pH to 3-4, 15 slide glasses were immersed and heat-treated at 75 ° C. for 2 hours. After the heating, the slide glass is taken out of the solution, washed well with distilled water, and then heated to 115 ° C.
For 4 hours to obtain an aminated slide glass.
【００５６】（２）カルボジイミド樹脂の作製 ヘキサメチレンジイソシアナート（アルドリッチ社製）
１１７．９ｇにイソシアン酸シクロヘキシル（東京化成
社製）１２．５ｇ及び３−メチル−１−フェニル−２−
ホスホレン−１−オキシド（アルドリッチ社製）１．３
ｇを加えた。次いで、窒素を流速０．５ｍｌ/分で加え
ながら、１８５℃にて９６時間攪拌した。冷却後、カル
ボジイミド樹脂を粉末として得た。得られた樹脂の平均
重合度は１０であり、数平均分子量は２４００であっ
た。(2) Preparation of carbodiimide resin Hexamethylene diisocyanate (Aldrich)
To 117.9 g, 12.5 g of cyclohexyl isocyanate (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) and 3-methyl-1-phenyl-2-
Phosphorene-1-oxide (manufactured by Aldrich) 1.3
g was added. Then, the mixture was stirred at 185 ° C. for 96 hours while adding nitrogen at a flow rate of 0.5 ml / min. After cooling, the carbodiimide resin was obtained as a powder. The average degree of polymerization of the obtained resin was 10, and the number average molecular weight was 2,400.
【００５７】（３）カルボジイミド化スライドガラスの
作製 前記（２）で作製したカルボジイミド樹脂の１０％クロ
ロホルム溶液を作製し、これに（１）で作製したアミノ
化スライドガラスを１５枚浸漬し、直ちに引き上げた。
次いで、クロロホルム２００ｍｌによる１０分間の洗浄
を２回行った後、４０℃で２時間乾燥して、カルボジイ
ミド化スライドガラスを得た。(3) Preparation of carbodiimidated slide glass A 10% chloroform solution of the carbodiimide resin prepared in (2) was prepared, and 15 aminated slide glasses prepared in (1) were immersed in the solution and immediately pulled up. Was.
Next, washing was performed twice with 200 ml of chloroform for 10 minutes, and then dried at 40 ° C. for 2 hours to obtain a carbodiimidated slide glass.
【００５８】[0058]
【実施例１】（１）末端に重合した塩基を有する核酸の
固定 配列番号１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
（３１mer）を、１００ｎｇ/μｌになるように２Ｍ Ｎ
ａＣｌに溶解し、ＤＮＡ溶液とした。スポッタ（ＳＰＢ
ＩＯ：日立ソフトウェアエンジニアリング（株）社製）
を用い、上記製造例で得たカルボジイミド化スライドガ
ラスの所定の位置に、前記ＤＮＡ溶液を５００箇所にス
ポットした。これを乾燥機に入れ、３７℃にて１５分間
乾燥した。次いで、３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）
を含む緩衝液Ａ（０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍト
リス塩酸（ｐＨ７．５）、０．０５％トライトンＸ−１
００）に浸し、３７℃にて１５分間乾燥した。次に、こ
のスライドガラスをＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、
ｐＨ７．２/１ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄後、３７℃にて
１５分間乾燥した。Example 1 (1) Immobilization of a nucleic acid having a base polymerized at the end An oligonucleotide (31 mer) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 was prepared by adding 2 M N to a concentration of 100 ng / μl.
It was dissolved in aCl to obtain a DNA solution. Spotter (SPB
IO: Hitachi Software Engineering Co., Ltd.)
The DNA solution was spotted at predetermined positions on the carbodiimidated slide glass obtained in the above production example at 500 positions. This was put into a dryer and dried at 37 ° C. for 15 minutes. Then, 3% BSA (bovine serum albumin)
A containing 0.2 M sodium chloride, 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5), 0.05% Triton X-1
00) and dried at 37 ° C. for 15 minutes. Next, the slide glass was placed in a TE buffer (10 mM Tris-HCl,
After washing with (pH 7.2 / 1 mM EDTA), it was dried at 37 ° C. for 15 minutes.
【００５９】一方、コントロールとして、後述のプロー
ブと全く相補性を示さないオリゴマー（配列番号３）も
同様に、カルボジイミド化スライドガラスに固定化し
た。On the other hand, as a control, an oligomer (SEQ ID NO: 3) showing no complementarity with a probe described later was similarly immobilized on a carbodiimidated slide glass.
【００６０】（２）ハイブリダイゼーション 上記のスライドガラスのＤＮＡを固定化した部分に、ハ
イブリダイゼーション溶液［３×ＳＳＣ（ＳＳＣ：１．
５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍクエン酸ナトリウム）、１
０％デキストラン、１pmolビオチン化プローブ］３０μ
ｌをのせ、４２℃のウォーターバスで１晩加熱した。
尚、プローブ核酸には、シゲラ（Shigella）属細菌由来
のシガ様毒素（Shiga-like toxin）タイプ２遺伝子を、
ビオチン標識したプローブを用いてＰＣＲにより増幅
し、得られた増幅産物（約１．２ｋｂ）を用いた。(2) Hybridization The hybridization solution [3 × SSC (SSC: 1.
5M NaCl, 0.15M sodium citrate), 1
0% dextran, 1 pmol biotinylated probe] 30 μ
and heated in a 42 ° C. water bath overnight.
The probe nucleic acid includes a Shiga-like toxin type 2 gene derived from a bacterium belonging to the genus Shigella,
Amplification was performed by PCR using a biotin-labeled probe, and the obtained amplification product (about 1.2 kb) was used.
【００６１】（３）ポストハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーションの後、スライドガラスからハイ
ブリダイゼーション溶液を軽く吸い取り、以下の条件で
ポストハイブリダイゼーション洗浄を行い、非特異的に
吸着したプローブを除去した。(3) Post-hybridization After hybridization, the hybridization solution was lightly sucked from the slide glass, and post-hybridization washing was performed under the following conditions to remove non-specifically adsorbed probes.
【００６２】［ポストハイブリダイゼーション洗浄液及
びその条件］ （i）２×ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ；室温、５分間、２回 （ii）０．２×ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ；４０℃、５分
間、２回 （iii）２×ＳＳＣ；室温、５分間、１回[Post-Hybridization Wash Solution and Conditions] (i) 2 × SSC, 1% SDS; room temperature, 5 minutes, twice (ii) 0.2 × SSC, 1% SDS; 40 ° C., 5 minutes, 2 Times (iii) 2 × SSC; once at room temperature for 5 minutes
【００６３】（４）ハイブリダイゼーションの検出 ３％ＢＳＡを含む緩衝液Ａ５００ｍｌに、上記ポストハ
イブリダイゼーション洗浄後のスライドガラスを浸漬
し、室温で３０分間ブロッキングを行った。次に、スト
レプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲート
溶液（３％ＢＳＡを含む下記組成の緩衝液Ａで原液（ベ
ーリンガーマイハイム社製）を２０００倍に希釈したも
の。）４５ｍｌに浸し、室温で３０分間反応させた。次
に、スライドガラスを緩衝液Ａ ５０ｍｌに浸し、室温
で５分間放置した。これを２回繰り返し、ビオチンと結
合しなかったコンジュゲートを除去した。次にスライド
ガラスを下記組成の緩衝液Ｂ３０ｍｌで１回洗浄した。
最後に基質溶液（緩衝液Ｂ２０ｍｌ、ＢＣＩＰ（５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート）溶
液１８μｌ、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）溶
液３６μｌ）に浸し、室温で３時間放置し、発色反応を
行った。その結果を表１に示す。(4) Detection of Hybridization The slide glass after the post-hybridization washing was immersed in 500 ml of buffer A containing 3% BSA, and blocking was performed at room temperature for 30 minutes. Next, it is immersed in 45 ml of a streptavidin alkaline phosphatase conjugate solution (a stock solution (manufactured by Boehringer Meiheim Co., Ltd.) diluted 2000 times with a buffer solution A containing 3% BSA) and reacted at room temperature for 30 minutes. Was. Next, the slide glass was immersed in 50 ml of buffer A and left at room temperature for 5 minutes. This was repeated twice to remove the conjugate that did not bind to biotin. Next, the slide glass was washed once with 30 ml of buffer B having the following composition.
Finally, the substrate was immersed in a substrate solution (20 ml of buffer B, 18 μl of BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate) solution, 36 μl of NBT (nitro blue tetrazolium) solution), and allowed to stand at room temperature for 3 hours. Was done. Table 1 shows the results.
【００６４】［緩衝液Ａの組成］ ０．２M NaCl ０．１M トリス塩酸（pH７．５） ０．０５％ トライトンX-100 ［緩衝液Ｂの組成］ ０．１M NaCl ０．１M トリス塩酸（pH９．５）[Composition of Buffer A] 0.2 M NaCl 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5) 0.05% Triton X-100 [Composition of Buffer B] 0.1 M NaCl 0.1 M Tris-HCl (pH 9) .5)
【００６５】[0065]
【比較例１】実施例１の（１）〜（４）において、配列
番号１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（３
１mer）の代わりに配列番号２に示す塩基配列を有する
オリゴヌクレオチド（２１mer）を用いた以外は、実施
例１と同様にしてハイブリダイゼーション及び発色反応
を行った。その結果を表１に示す。Comparative Example 1 In Example 1, (1) to (4), the oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (3
Hybridization and color development were carried out in the same manner as in Example 1 except that an oligonucleotide (21mer) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 was used instead of 1mer). Table 1 shows the results.
【００６６】[0066]
【表１】◎：大部分のシグナルが非常に高感度かつ非常に明瞭に
あらわれた。 ○：大部分のシグナルが高感度かつ明瞭にあらわれた。[Table 1] A: Most of the signals were very sensitive and very clear. ：: Most of the signals were clearly and highly sensitive.
【００６７】表１の結果から、本発明の核酸の検出方法
によれば、核酸の検出が非常に高感度かつ非常に明瞭な
シグナルとしてあらわれることがわかる。From the results shown in Table 1, it can be seen that according to the method for detecting a nucleic acid of the present invention, the detection of a nucleic acid appears as a very sensitive and very clear signal.
【００６８】一方、コントロールとして上記プローブと
全く相補性を示さないオリゴマーも同様に固定化した。
その場合は、実施例１及び比較例１のいずれににおいて
も、シグナルは、全く現れなかった。On the other hand, as a control, an oligomer showing no complementarity with the probe was immobilized in the same manner.
In that case, no signal appeared in any of Example 1 and Comparative Example 1.
【００６９】[0069]
【実施例２】（１）末端に重合した塩基を有する核酸の
固定 配列番号４〜配列番号１２に示す塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチド（１８〜２８mer）を、１００ｎｇ/μｌ
になるように２Ｍ ＮａＣｌに溶解しＤＮＡ溶液とし
た。スポッター（GT MASS：日本レーザー電子（株）社
製）を用い、上記製造例で得たカルボジイミド化スライ
ドガラスの所定の位置に、前記ＤＮＡ溶液を２点ずつス
ポットした。次いで、UV STRACTLINKERTMを用いてＵＶ
照射（波長：２５４ｎｍ、６００ｍＪ/ｃｍ2）を行なっ
た。次いで、３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む
緩衝液Ａ（０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス塩
酸（ｐＨ７．５）、０．０５％トライトンＸ−１００）
に浸し、３７℃にて１５分間乾燥した。次に、このスラ
イドガラスをＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
７．２）/１ｍＭ EDTA）で洗浄後、３７℃にて１５分間
乾燥した。Example 2 (1) Immobilization of Nucleic Acid Having Base Polymerized at the Terminal 100 g / μl of an oligonucleotide (18 to 28 mer) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 to SEQ ID NO: 12
Was dissolved in 2M NaCl to obtain a DNA solution. Using a spotter (GT MASS: manufactured by Nippon Laser Electronics Co., Ltd.), the DNA solution was spotted at two points at predetermined positions on the carbodiimidated slide glass obtained in the above production example. Then, using UV STRACTLINKER™ ,
Irradiation (wavelength: 254 nm, 600 mJ / cm2 ) was performed. Next, buffer A (0.2 M sodium chloride, 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5), 0.05% Triton X-100) containing 3% BSA (bovine serum albumin)
And dried at 37 ° C. for 15 minutes. Next, this slide glass was placed in a TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH
After washing with (7.2) / 1 mM EDTA), it was dried at 37 ° C. for 15 minutes.
【００７０】（２）ハイブリダイゼーション 上記のスライドガラスのＤＮＡを固定した部分に、ハイ
ブリダイゼーション溶液[３×ＳＳＣ（ＳＳＣ：１．５
Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍクエン酸ナトリウム）、１０
％デキストラン、１pmolＣｙ５標識プローブ]３０μｌ
をのせ、４２℃のウォーターバスで１晩加熱した。尚、
プローブ核酸には、RNAポリメラーゼβサブユニット(rp
oB)遺伝子を、Ｃｙ５標識したプローブを用いてＰＣＲ
により増幅し、得られた増幅産物（約１１０ｂ）を用い
た。(2) Hybridization A hybridization solution [3 × SSC (SSC: 1.5
M NaCl, 0.15 M sodium citrate), 10
% Dextran, 1 pmol Cy5 labeled probe] 30 μl
And heated in a 42 ° C. water bath overnight. still,
Probe nucleic acids include RNA polymerase β subunit (rp
oB) PCR of gene using Cy5 labeled probe
And the obtained amplification product (about 110b) was used.
【００７１】（３）ポストハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーションの後、スライドガラスからハイ
ブリダイゼーション溶液を軽く吸い取り、以下の条件で
ポストハイブリダイゼーション洗浄を行ない、非特異的
に吸着したプローブを除去した。(3) Post-hybridization After hybridization, the hybridization solution was lightly sucked from the slide glass, and post-hybridization washing was performed under the following conditions to remove non-specifically adsorbed probes.
【００７２】[ポストハイブリダイゼーション洗浄条件
及びその条件] （ｉ）２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；室温５分間、２回 （ii）０．３×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；４０℃、５分
間、２回 （iii）２×ＳＳＣ；室温、５分間[Post-hybridization washing conditions and conditions] (i) 2 × SSC, 0.1% SDS; twice for 5 minutes at room temperature (ii) 0.3 × SSC, 0.1% SDS; 40 ° C. 5 minutes, 2 times (iii) 2 × SSC; room temperature, 5 minutes
【００７３】（４）ハイブリダイゼーションの検出 得られたスライドガラスをSCAN ARREY（ＧＳＩ（株）社
製）を用いて測定した。その結果を表２に示す。表２中
の配列４〜配列１２はそれぞれ配列番号４〜１２に示す
塩基配列であり、その特徴は以下の通りである。配列
４：末端にＴ塩基を付加した相補鎖、配列５〜配列７：
末端にＴ塩基を付加したネガティブコントロール、配列
８：末端にＴ塩基を付加していない相補鎖、配列９〜配
列１１：末端にＴ塩基を付加していないネガティブコン
トロール、配列１２：ポジティブコントロール（末端に
Ｔ塩基を付加した、配列４における相補鎖と異なる相補
鎖）。(4) Detection of Hybridization The obtained slide glass was measured using SCAN ARREY (manufactured by GSI). Table 2 shows the results. Sequences 4 to 12 in Table 2 are the base sequences shown in SEQ ID NOs: 4 to 12, respectively, and the features are as follows. Sequence 4: complementary strand with a T base added to the end, Sequences 5 to 7:
Negative control with a T base added at the end, Sequence 8: Complementary strand without a T base at the end, Sequences 9 to 11: Negative control without a T base at the end, Sequence 12: Positive control (Terminal , A complementary strand different from the complementary strand in Sequence 4).
【００７４】[0074]
【表２】表２ ─────────────────── 配列 シグナル検出 ─────────────────── 配列１２ ◎ 配列４ ◎ 配列５ × 配列６ × 配列７ × 配列８ ○ 配列９ × 配列１０ × 配列１１ × ─────────────────── ◎：非常に強いシグナルが観測された。 ○：シグナルが観測された。 ×：シグナルが観測されなかった。[Table 2] Table 2 配 列 Sequence signal detection 配 列 Sequence 12 ◎ Sequence 4 ◎ Sequence 5 × Sequence 6 × Sequence 7 × Sequence 8 ○ Sequence 9 × Sequence 10 × Sequence 11 × ◎ ：: Very strong signal Observed. ：: Signal was observed. ×: No signal was observed.
【００７５】以上の結果から、本発明の核酸の検出方法
によれば、核酸の検出が非常に高感度でかつ非常に明瞭
なシグナルとして現れることが分かる。From the above results, it can be seen that according to the method for detecting a nucleic acid of the present invention, the detection of the nucleic acid appears as a very sensitive and very clear signal.
【００７６】[0076]
【実施例３】（１）末端に重合した塩基を有する核酸の
固定 ＥＣＨ変性グリセロールトリアクリレート（長瀬産業
（株））をＤＭＦ中でメチルトリメトキシホスホニウム
アイオダイド（Aldrich（株）社製）で処理して、ＥＣ
Ｈ変性グリセロールトリアクリレートの水酸基をよう素
化した。次いで、得られた化合物と配列番号１３〜配列
番号１７に示す塩基配列を有する5'末端がＮＨ2基で修
飾されたオリゴヌクレオチド（１８mer）を、弱アルカ
リ溶液中で加熱反応させた。得られたオリゴヌクレオチ
ドにＥＣＨ変性グリセロールトリアクリレートが導入さ
れたことをＨＰＬＣを用いて確認した。Example 3 (1) Immobilization of a nucleic acid having a polymerized base at the end ECH-modified glycerol triacrylate (Nagase Sangyo Co., Ltd.) was treated with methyltrimethoxyphosphonium iodide (Aldrich Co., Ltd.) in DMF. And EC
Hydroxyl groups of the H-modified glycerol triacrylate were iodinated. Next, the obtained compound and an oligonucleotide (18mer) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 to SEQ ID NO: 17 and modified at the 5 ′ end with an NH2 group were heated and reacted in a weak alkaline solution. HPLC was used to confirm that ECH-modified glycerol triacrylate was introduced into the obtained oligonucleotide.
【００７７】ＥＣＨ変性グリセロールトリアクリレート
導入オリゴヌクレオチドを、１００ｎｇ/μｌになるよ
うに２Ｍ ＮａＣｌ/ＤＭＳＯに溶解しＤＮＡ溶液とし
た。スポッター（GT MASS：日本レーザー電子（株）社
製）を用い、上記製造例で得たカルボジイミド化スライ
ドガラスの所定の位置に、前記ＤＮＡ溶液を２点ずつス
ポットした。次いで、UV STRACTLINKERTMを用いてＵＶ
照射（波長：２５４ｎｍ、１２００ｍＪ/ｃｍ2）を行な
った。次いで、３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含
む緩衝液Ａ（０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス
塩酸（ｐＨ７．５）、０．０５％トライトンＸ−１０
０）に浸し、３７℃にて１５分間乾燥した。次に、この
スライドガラスをＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ７．２）/１ｍＭ EDTA）で洗浄後、３７℃にて１５分
間乾燥した。The ECH-modified glycerol triacrylate-introduced oligonucleotide was dissolved in 2 M NaCl / DMSO at a concentration of 100 ng / μl to prepare a DNA solution. Using a spotter (GT MASS: manufactured by Nippon Laser Electronics Co., Ltd.), the DNA solution was spotted at two points at predetermined positions on the carbodiimidated slide glass obtained in the above production example. Then, using UV STRACTLINKER™ ,
Irradiation (wavelength: 254 nm, 1200 mJ / cm2 ) was performed. Next, buffer A (0.2 M sodium chloride, 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5)) containing 3% BSA (bovine serum albumin), 0.05% Triton X-10
0) and dried at 37 ° C. for 15 minutes. Next, the slide glass was placed in a TE buffer (10 mM Tris-HCl (p
H7.2) / 1 mM EDTA) and then dried at 37 ° C. for 15 minutes.
【００７８】（２）ハイブリダイゼーション 上記のスライドガラスのＤＮＡを固定した部分に、ハイ
ブリダイゼーション溶液[３×ＳＳＣ（ＳＳＣ：１．５
Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍクエン酸ナトリウム）、１０
％デキストラン、１pmolＣｙ５標識プローブ]３０μｌ
をのせ、４２℃のウォーターバスで１晩加熱した。尚、
プローブ核酸には、RNAポリメラーゼβサブユニット(rp
oB)遺伝子を、Ｃｙ５標識したプローブを用いてＰＣＲ
により増幅し、得られた増幅産物（約１１０ｂ）を用い
た。(2) Hybridization A hybridization solution [3 × SSC (SSC: 1.5
M NaCl, 0.15 M sodium citrate), 10
% Dextran, 1 pmol Cy5 labeled probe] 30 μl
And heated in a 42 ° C. water bath overnight. still,
Probe nucleic acids include RNA polymerase β subunit (rp
oB) PCR of gene using Cy5 labeled probe
And the obtained amplification product (about 110b) was used.
【００７９】（３）ポストハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーションの後、スライドガラスからハイ
ブリダイゼーション溶液を軽く吸い取り、以下の条件で
ポストハイブリダイゼーション洗浄を行ない、非特異的
に吸着したプローブを除去した。(3) Post-hybridization After hybridization, the hybridization solution was lightly sucked from the slide glass, and post-hybridization washing was performed under the following conditions to remove non-specifically adsorbed probes.
【００８０】[ポストハイブリダイゼーション洗浄条件
及びその条件] （ｉ）２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；室温５分間、２回 （ii）０．３×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；４０℃、５分
間、２回 （iii）２×ＳＳＣ；室温、５分間[Post-Hybridization Washing Conditions and Conditions] (i) 2 × SSC, 0.1% SDS; twice for 5 minutes at room temperature (ii) 0.3 × SSC, 0.1% SDS; 40 ° C. 5 minutes, 2 times (iii) 2 × SSC; room temperature, 5 minutes
【００８１】（４）ハイブリダイゼーションの検出 得られたスライドガラスをSCAN ARREY（ＧＳＩ（株）社
製）を用いて測定した。その結果、実施例２と同様に、
配列番号１３及び１７のみに非常に強いシグナルを観測
できた。なお、配列番号１３〜１７に示す塩基配列の特
徴は以下の通りである。配列番号１３：相補鎖、配列番
号１４〜１６：ネガティブコントロール、配列番号１
７：ポジティブコントロール（配列番号１３の相補鎖と
異なる相補鎖）。(4) Detection of Hybridization The obtained slide glass was measured using SCAN ARREY (manufactured by GSI). As a result, similar to Example 2,
Very strong signals could be observed only in SEQ ID NOs: 13 and 17. The characteristics of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 13 to 17 are as follows. SEQ ID NO: 13: complementary strand, SEQ ID NOs: 14 to 16: negative control, SEQ ID NO: 1
7: Positive control (complementary strand different from the complementary strand of SEQ ID NO: 13).
【００８２】本発明の核酸の検出方法によれば、核酸の
検出が非常に高感度でかつ非常に明瞭なシグナルとして
現れることが分かる。According to the method for detecting a nucleic acid of the present invention, it can be seen that the detection of a nucleic acid appears as a very sensitive and very clear signal.
【００８３】[0083]
【発明の効果】本発明により、安定に基材または基材上
の担体上に固定化できる核酸が提供される。任意の核酸
の末端にポリマーを付加することにより、基材または基
材上の担体上に固定できる任意の核酸の量を増やすこと
ができるため、検出感度を向上できる。According to the present invention, there is provided a nucleic acid which can be stably immobilized on a substrate or a carrier on the substrate. By adding a polymer to the end of any nucleic acid, the amount of any nucleic acid that can be immobilized on the substrate or the carrier on the substrate can be increased, and thus the detection sensitivity can be improved.
【００８４】また、ポリマーと基材または基材上の担体
が選択的に反応するため、ハイブリダイゼーションに必
要な任意の核酸中の塩基を基材または基材上の担体との
固定に用いることなく核酸検出を行うことができる。こ
れにより、塩基配列の違いをより選択的に検出できる核
酸検出法を提供できる。Further, since the polymer and the substrate or the carrier on the substrate selectively react, the base in any nucleic acid required for hybridization is not used for fixing to the substrate or the carrier on the substrate. Nucleic acid detection can be performed. This can provide a nucleic acid detection method capable of more selectively detecting a difference in base sequence.
【００８５】さらに、核酸が強固に基材または基材上の
担体に結合できるため、核酸固定化基材は、再現性、定
量性に優れたＤＮＡチップ等としての用途に有効な核酸
固定化基材となり得る。Further, since the nucleic acid can be firmly bound to the substrate or the carrier on the substrate, the nucleic acid-immobilized substrate is a nucleic acid-immobilizing group effective for use as a DNA chip or the like having excellent reproducibility and quantification. It can be a material.
【００８６】[0086]
【配列表】 <110> 日清紡績株式会社(Nisshinbo Industries, Inc.) <120> 固定化核酸及び核酸の検出法 <130> P-8222 <150> JP 2000-21843 <151> 2000-01-26 <160> 17 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 1 tttttttttt gttacccaca taccacgaat c 31 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 2 gttacccaca taccacgaat c 21 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 3 tttttttttt ttcttctcag tgcgcaaatt 30 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 4 tttttttttt aattcatggt ccagaaca 28 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 5 tttttttttt aattcatgga ccagaaca 28 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 6 tttttttttt aattcatggg ccagaaca 28 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 7 tttttttttt aattcatggc ccagaaca 28 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 8 aattcatggt ccagaaca 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 9 aattcatgga ccagaaca 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 10 aattcatggg ccagaaca 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 11 aattcatggc ccagaaca 18 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 12 tttttttttt agctgagcca attcatgg 28 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 13 aattcatggt ccagaaca 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 14 aattcatgga ccagaaca 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 15 aattcatggg ccagaaca 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 16 aattcatggc ccagaaca 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 17 agctgagcca attcatgg 18[Sequence List] <110> Nisshinbo Industries, Inc. <120> Immobilized nucleic acid and nucleic acid detection method <130> P-8222 <150> JP 2000-21843 <151> 2000-01-26 <160> 17 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 1 tttttttttt gttacccaca taccacgaat c 31 <210> 2 <211> 21 <212 > DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 2 gttacccaca taccacgaat c 21 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223 > Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 3 tttttttttt ttcttctcag tgcgcaaatt 30 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 4 tttttttttt aattcatggt ccagaaca 28 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 5 tttttttttt aattcatgga ccagaaca 28 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Seq uence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 6 tttttttttt aattcatggg ccagaaca 28 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 7 tttttttttt aattcatggc ccagaaca 28 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 8 aattcatggt ccagaaca 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 9 aattcatgga ccagaaca 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 10 aattcatggg ccagaaca 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 11 aattcatggc ccagaaca 18 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 12 tttttttttt agctgagcca attca tgg 28 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 13 aattcatggt ccagaaca 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 14 aattcatgga ccagaaca 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 15 aattcatggg ccagaaca 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 16 aattcatggc ccagaaca 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 17 agctgagcca attcatgg 18
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/543 ５２５ Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ 37/00 １０２ ＺＮＡＡ (72)発明者 守屋 彰悟 千葉県千葉市緑区大野台１−２−３ 日清 紡績株式会社研究開発センター内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 HA14 HA19 4B029 AA07 AA23 BB20 CC03 FA15 4B063 QA01 QQ16 QQ17 QQ19 QQ42 QQ52 QR08 QR33 QR35 QR42 QR56 QS25 QS34 QS39 QX02──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl.7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) G01N 33/543 525 G01N 37/00 102 33/566 C12N 15/00 F 37/00 102 ZNAA (72) Invention Person Shogo Moriya 1-2-3 Onodai, Midori-ku, Chiba-shi, Chiba F-term in the R & D Center of Nisshinbo Industries Co., Ltd. 4B024 AA11 CA01 HA14 HA19 4B029 AA07 AA23 BB20 CC03 FA15 4B063 QA01 QQ16 QQ17 QQ19 QQ42 QQ52 QR08 QR33 QR35 QR42 QR56 QS25 QS34 QS39 QX02
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