【発明の詳細な説明】２つまたはそれ以上の相互作用性（ポリ）ペプチドをコードする核酸配列の新規同定方法 本発明は２つまたはそれ以上の特定の相互作用性ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列の同定方法に関する。さらに本発明は本発明の方法にしたがって核酸配列を同定するために用いることができるキットに関する。 タンパク質−タンパク質相互作用は遺伝子の複製および発現から生物の形態形成まで、すべての生物学的プロセスにおいて重要な役割を演じている（Lewin，B．1994，Genes V．Oxford University Press）。タンパク質−タンパク質相互作用の検出方法は種々の生物学的プロセスの基本機構および治療学の発展を理解するのに有用であることが証明されている。タンパク質−タンパク質相互作用の検出は２つの主要なカテゴリー：（ｉ）物理−化学に基づくアプローチおよび（ii）遺伝学的アプローチ（Phizicky，E.，M．& Fields，S．Microbiological Reviews 59（1995）94-123）に分けられる。通常、物理−化学的方法によるタンパク質−タンパク質相互作用の検出は大量の材料を必要とし、より重要な点は研究するタンパク質の実体（アイデンティティー）が既知でなければならないことである。最近の質量分析法の発達によりこの問題は回避されたが、高性能の装置と熟練性を要するという不都合を伴う（Wang，R．& Chait，B．T.，Current Opinion in Biotech．5（1994）77-84）。対照的に、遺伝的アプローチは純粋な材料および専門の装置を必要とせず、さらに処理量がより高いという利点を有するタンパク質−タンパク質相互作用の簡易かつ強力な同定方法を可能とする。 種々の遺伝学的アプローチがタンパク質−タンパク質相互作用の同定に用いられてきた。現在通用している１つの方法は酵母２−ハイブリッドシステム（Fields，S．& Song，O．K.，Nature（London）340，（1989）245-246）であり、これは既知のタンパク質と相互作用する新規タンパク質を同定できる。 もう１つの一般的な遺伝学的アプローチはファージディスプレイシステム（特許出願WO90/02809）であり、これは、タンパク質を繊維状ファージの表面タンパク質成分に融合させることにより、目的のリガンドとの結合について選択することを可能とする。ファージ表面にディスプレイ（表示）されるタンパク質をコードする遺伝子はファージ内に包含され、遺伝情報がその遺伝子産物とカップリングされる。これにより「ライブラリー」タンパク質のスクリーニングが可能になり、スクリーニングされたタンパク質の実体をファージの核酸配列から推定することができる。この技術はWinterら（特許出願WO92/20791）によって適用拡大され、特異的結合ペアの多量体メンバー（例えば、抗体のVHおよびVL鎖の組み合わせ）のライブラリーを作成し、相補的な特異的結合ペアメンバーに結合できる機能的な特異的結合ペアメンバー（例えば、抗原）が選択された。このライブラリーは、当該多量体メンバーの対応するサブユニット集団をそれぞれコードする２つのサブライブラリーを組み合わせる（例えば、VH鎖のライブラリーをVL鎖のライブラリーと組み合わせる）ことによって構築されるが、原理的には、第１サブライブラリー由来のそれぞれのサブユニットは第２サブライブラリー由来のそれぞれのサブユニットに非特異的に結合することができるものである。この方法により特定の抗原に対する唯一の抗体を同定することができるけれども、特異的結合ペアの２つのパートナーがともに未知である場合、それらを同定する方法は提供できない。 最近、非感染ファージに依存する独特のバージョンのファージティスプレイ法が提唱されている（Duenas，M．& Borrebaeck，C．A．K.，Bio/Technology 12（1994）999-1002；EP 0 614989）。junタンパク質と相互作用する、cDNAライブラリーからのタンパク質を同定できるこのシステムのバージョンが記載されている（Gramatikoffら、Nucleic．Acids Res．22（1994）5761-5762）。また、同じ原理が抗体−抗原システムに作用することも示されている（Krebberら、FEBS Letters 377（1995）227-231）。 前述の遺伝子選択アプローチはすべて強力であるが、これらは遺伝的に異なる単一の集団のみから相互作用する結合性物質を選択することに限定されている（ライブラリーvs．個々）。 しかし、ライブラリーvs．ライブラリーセッティングにおいて結合性物質およびそれらの特異的結合パートナーを同時に同定し、好ましくは少なくとも２つの遺伝的に異なる集団が関与する同定方法が強く望まれる。先行文献は、この技術的問題に対する解決法、すなわち２つ以上の遺伝的に異なる集団（ライブラリーvs．ライブラリー）由来の相互作用性物質およびそれぞれの核酸配列を同定することを記載も示唆もしていない。本発明は、上記の技術的問題を請求の範囲に特徴づけされている態様を提供することによって解決するものである。これらの態様を用いることによって（ポリ）ペプチド−（ポリ）ペプチド相互作用が検出される割合を指数関数的に増加させることができた。本発明は機能的ゲノム分野において種々の適用がみいだされ、これにより未知の機能の種々のタンパク質を他のタンパク質と関連づけることができる。 すなわち、本発明は、核酸配列の集合体であって該核酸配列のそれぞれが該核酸配列集合体中の別のメンバーによってコードされる少なくとも１つのさらなる（ポリ）ペプチドと相互作用できる（ポリ）ペプチドをコードしているものである該核酸配列集合体を同定するための方法であって、工程： (a)（ポリ）ペプチドをコードする種々の核酸配列からなる遺伝的に異なる核酸配列を含む組換えベクター分子の第１ライブラリーを入手し； (b)工程(a)に記載のさらなる（ポリ）ペプチドと相互作用することができる（ポリ）ペプチドをコードする種々の核酸配列からなる遺伝的に異なる核酸配列を含む組換えベクター分子の第２ライブラリーを入手し（ここに当該組換えベクター分子および／または組換え挿入物の製造に用いるベクター分子は工程(a)に用いるベクター分子および／または組換え挿入物とは表現型が区別できる性質を表示し、また工程(a)および(b)に用いるそれぞれのベクター分子および／または組換え挿入物によって表示される少なくとも１つの該性質は、当該第１ライブラリー由来の（ポリ）ペプチドと当該第２ライブラリー由来の（ポリ）ペプチドとがともに相互作用すると、スクリーニング可能なまたは選択可能な性質を発生させる）； (c)要すれば、工程(a)および／または(b)に記載のさらなる（ポリ）ペプチド（群）と相互作用できる、あるいは該相互作用を引き起こすことができる（ポリ）ペプチドをコードする種々の核酸配列からなる遺伝的に異なる核酸配列を含む組換えベクター分子の付加的なライブラリーを入手し（ここに当該組換えベクター分子および／または組換え挿入物の製造に用いるベクター分子は工程(a)および(b)に用いるベクター分子および／または組換え挿入物と表現型が区別できる性質を表示し、また任意に、工程(c)に用いる当該ベクター分子および／または組換え挿入物によって表示される少なくとも１つの該性質は、工程(a)および／または(b)に用いる当該ベクター分子および／または当該組換え挿入物のいずれかによって表示される少なくとも１つの当該性質とともに、当該付加的なライブラリー由来の（ポリ）ペプチドと当該第１ライブラリー由来の（ポリ）ペプチドおよび／または当該第２ライブラリー由来の（ポリ）ペプチドのいずれかとが相互作用するとスクリーニング可能なまたは選択可能な性質を発生させることができる）； (d)工程(a)、(b)および任意に(c)に記載の組換えベクターまたは核酸配列の該ライブラリーのメンバーを適当な宿主細胞中、少なくとも１つの相互作用が確立するように発現させ； (e)該（ポリ）ペプチドの相互作用を表すスクリーニング可能なまたは選択可能な性質の発生について選択し； (f)任意に、さらに選択、スクリーニングおよび／または精製工程を行い；そして (g)該（ポリ）ペプチドをコードする該核酸配列を同定することを特徴とする方法に関する。 これゆえ本明細書中では、用語「表現型が区別できる性質」はベクター分子によってコードされる性質もしくは組換え挿入物によってコードされる性質または両方のタイプの性質のいずれかに関する。ベクターにコードされる性質に関しては、これらは例えば耐性マーカーまたは特定栄養の要求性であり得る。組換え挿入物は相互作用に寄与する核酸部分に加えて当該性質をコードする核酸部分を含むことができることに留意すべきである。 本明細書中において、用語「別のメンバー」は必ずしもそうではないが、構造的に異なる相違物であり得る。 さらに、本発明の本文中において、用語「集合体」は「少なくとも２つ」の意味をもつ。 少なくとも２つの組換え挿入物によって発生される新規な性質は本発明の発明原理を反映している。すなわち、２つ（またはそれ以上）の（ポリ）ペプチドが、例えばホモ２量体またはヘテロ２量体形態で相互作用する場合のみ、スクリーニング可能または選択可能な性質が生成する。２つまたはそれ以上の分子間の相互作用は直接の相互作用であるか、あるいは間接的に媒介されてもよい。直接的相互作用の例は、ライブラリー１由来の核酸配列によってコードされる抗体とライブラリー２由来のcDNAタンパク質との結合、cDNAライブラリー１由来の核酸配列によってコードされるタンパク質とcDNAライブラリー２由来のタンパク質との結合および一方のライブラリー由来の核酸配列によってコードされる抗イディオタイプ抗体と他方のライブラリー由来の核酸配列によってコードされる対応する抗体との結合である。核酸配列は好ましくはDNAであり、最も好ましくは遺伝子またはその一部である。 間接的相互作用の例は２つのライブラリーによってコードされる２つの（ポリ）ペプチドの、リン酸化酵素によって媒介される架橋である。例えばライブラリー１によってコードされる１つの（ポリ）ペプチドが各々のキナーゼによってリン酸化されると、このタンパク質はライブラリー２によってコードされる第２の（ポリ）ペプチドと相互作用できる。このタイプの相互作用のよい例であるリン酸化酵素は追加の（付加的な）ライブラリー（の１つ）由来の核酸によってコードされてもよいし、ならびに／あるいは宿主細胞のゲノムによってコードされていてもよい。通常、２つの（ポリ）ペプチドの相互作用は分子の「架橋」を形成し、この「架橋」は適当な検出方法を用いて検出可能である。この架橋はライブラリー１または好ましくは２によってコードされるポリペプチドの１つと共役し、あるいはこれによってコードされ、結合するタグ分子によって間単に検出できる。 さらに本発明は、核酸配列の集合体であって該核酸配列のそれぞれが該核酸配列集合体中の別のメンバーによってコードされる少なくとも１つのさらなる（ポリ）ペプチドと相互作用できる（ポリ）ペプチドをコードしているものである該核酸配列集合体を同定するための方法であって、工程： (a)適当な宿主細胞中で以下のものを少なくとも１つの相互作用を確立するように発現させる； (aa)（ポリ）ペプチドをコードする種々の核酸配列からなる遺伝的に異なる核酸配列を含む組換えベクター分子の第１ライブラリーに含まれる核酸配列； (ab)工程(aa)に記載のさらなる（ポリ）ペプチドと相互作用することができる(ポリ)ペプチドをコードする種々の核酸配列からなる遺伝的に異なる核酸配列を含む組換えベクター分子の第２ライブラリーに含まれる核酸配列（ここに当該組換えベクター分子および／または組換え挿入物の製造に用いるベクター分子が工程(aa)に用いるベクター分子および／または組換え挿入物とは表現型が区別できる性質を表示し、また工程(aa)および(ab)に用いるそれぞれのベクター分子および／または組換え挿入物によって表示される少なくとも１つの該性質は、当該第１ライブラリー由来の（ポリ）ペプチドと当該第２ライブラリー由来の（ポリ）ペプチドとが相互作用すると、スクリーニング可能なまたは選択可能な性質を発生させる）； (ac)要すれば、工程(aa)および／または(ab)に記載のさらなる（ポリ）ペプチド（群）と相互作用できる、あるいは該相互作用を引き起こすことができる（ポリ）ペプチドをコードする種々の核酸配列からなる遺伝的に異なる核酸配列を含む組換えベクター分子の付加的なライブラリーに含まれる核酸配列（ここに当該組換えベクター分子および／または組換え挿入物の製造に用いるベクター分子が工程(aa)および(ab)に用いるベクター分子および／または組換え挿入物と表現型が区別できる性質を表示し、また任意に、工程(ac)に用いる当該ベクター分子および／または組換え挿入物によって表示される少なくとも１つの該性質は、工程(aa)および／または(ab)に用いる当該ベクター分子および／または当該組換え挿入物のいずれかによって表示される少なくとも１つの当該性質とともに、当該付加的なライブラリー由来の（ポリ）ペプチドと当該第１ライブラリー由来の（ポリ）ペプチドおよび／または当該第２ライブラリー由来の（ポリ）ペプチドのいずれかとが相互作用するとスクリーニング可能または選択可能性質を発生することができる）； (b)該（ポリ）ペプチドの相互作用を示す当該スクリーニング可能なまたは選択可能な性質の発生について選択し； (c)任意に、さらにスクリーニング、選択および／または精製工程を行い；そして (d)該（ポリ）ペプチドをコードする該核酸配列を同定するを特徴とする方法に関する。 本発明の方法の好ましい態様においては、当該スクリーニング可能なまたは選択可能な性質を細胞外に発現させる。 この態様は、上記の性質を細胞外検出する従来からの方法、例えばスクリーニング可能なタグを保持させたカラムクロマトグラフィーなどを例えばプラーク精製法とともに使用しているであろう多くの研究室により簡便に利用され、それにより例えばこのカラムクロマトグラフィー工程によって始めに増産した細胞をさらに精製することができる。 本発明の方法のさらに好ましい態様においては、工程(a)/(aa)（スラッシュの後に特定した工程は上記した本発明方法の第２態様の対応工程を意味する）の組換えベクター分子は表面に当該（ポリ）ペプチドを表示する複製可能遺伝的パッケージ（RGP）を生み出す。本明細書中において用語「複製可能遺伝的パッケージ（RGP）」は適当な宿主細胞に感染後、複製することができるウイルスまたはバクテリオファージのようなものを意味する。例えばバクテリオファージの場合は、核酸配列集団をファージまたはファージミドベクターのどちらかにファージの外殻成分、例えばgene IIIと解読枠内で挿入すればよく、その結果、コードされる結合性物質がファージの表面に表示される。組換えベクター分子として特に好ましいものは組換えファージ、ファージミドまたはウイルスであり、ファージとしては以下のものが最も好ましい： (a)クラスＩファージfd、M13、If、Ike、ZJ/2、Ffのいずれか； (b)クラスIIファージXf、Pf1およびPf3のいずれか； (c)λファージ群、ラムダ、434、P1のいずれか； (d)包膜ファージ群、PRD1のクラスのいずれか；あるいは (e)パラミクソウイルス群、オソミクソウイルス群、バキュロウイルス群、レトロウイルス群、レオウイルス群およびアルファウイルス群のクラスのいずれか。 本発明の方法のさらに好ましい態様においては、上記選択工程(e)/(b)を相互作用性（ポリ）ペプチドを含むポリファージの選択によって行う。ポリファージは１コピーより多くのファージゲノムDNAを含有する。新しく生成するファージ外殼が２またはそれ以上の一本鎖DNA分子を包嚢する場合に、これらは低〜中頻度で天然に存在する。本発明の場合には、生成されるポリファージは少なくとも２つのファージゲノムを含み、これらは（i）両方ともライブラリー１を表すか、または（ii）両方ともライブラリー２を表すか、または（iii）それぞれライブラリー１およびライブラリー２を表すか、または（iv）付加的なライブラリーのいずれかからの少なくとも１つのメンバーと（ｉ）〜（iii）とを組み合わせたものであるか、のいずれかである。当業者に周知のように（例えばLopez，J．およびWebster，R．E.，Virorlogy 127（1983），177-193、Bauer，M．およびSmith，G．P.，Virology 167（1988）166-175、またはGailus，V．ら、Res.Microbiol．145（1994）699-709参照）、ポリファージの生成効率はファージゲノムに適当な突然変異を導入することによって増加させることができる。 本発明の方法のさらに好ましい態様では、スクリーニング可能なまたは選択可能な性質を上記RGPの感染力に結び付ける。 この態様では、例えばバクテリオファージの感染力を操作できる可能性を利用し、感染力を当該（ポリ）ペプチドの相互作用と直接相関させるものである。 本発明の方法の最も好ましい態様では、RGPは工程(a)/(aa)に用いる当該組換えベクターによってコードされ、非感染性とされており、そしてRGPの感染性力は、RGPに感染力を与えるドメインに融合させた工程(b)/(ab)および/または工程(c)/(ac)の（ポリ）ペプチドと工程(a)/(aa)の（ポリ）ペプチドとの相互作用によって回復する。 本発明の方法のさらに最も好ましい態様では、RGPが宿主細胞に結合し、感染するのに必要な表面タンパク質をコードする遺伝子配列の修飾によって当該RGPを非感染性にする。 RGPの感染性に関する本発明の方法のこれらの好ましい態様および最も好ましい態様は、スクリーニングタグの別用途として用いられる。これらの態様では、選択感染の現象に利点をみいだすことができる（Krebbsrら、FEBS Letters 377（1995）227-239）。スクリーニングタグは集合中の他の分子からその分子を物理的に分離することを可能にする一方、選択感染の利用によって相互作用ペアを積極的に選択することを可能にする。この現象は、例えばgeneIIIタンパク質のＣ末端以外のすべてを欠失させることによって非感染性にしたファージに対し感染性を選択的に回復させることができる構築体を利用することに基づくものである。ライブラリー１を表示するためにそのようなファージを利用し、結合性物質を保有する非感染性ファージが得られる。ライブラリー２と共発現させることによって上記のように結合性物質および結合パートナー間の相互作用が確立する。結合性物質−結合パートナーペアを保有するファージは非感染性であるが、上記のスクリーニングタグのかわりに感染性タンパク質を用いると感染性が回復する。本明細書中において用語「感染性タンパク質」はファージと結合した場合に、ファージがその後複製する場である細菌宿主内に侵入することを可能にする物質を意味する。感染性タンパク質の例は繊維状バクテリオファージgeneIIIタンパク質のＮ末端（少なくとも最初の２２０アミノ酸）である。 感染性タンパク質はそれを保有するファージに対し、複製能力を与える。これゆえ、結合性物質/パートナーペアを保有するファージのみが複製する。ライブラリー１および２両者由来の遺伝子を含むハイブリッドファージの精製は、例えば上記の２つの選択マーカーの利用に左右される。このファージ中の遺伝子は当業者に周知の方法論を用いて同定できる。 本発明のさらに好ましい態様は工程(a)/(aa)の組換えベクター分子が細胞、好ましくは細菌の表面に発現される融合タンパク質を生み出す方法に関する。 これらの融合タンパク質は、例えばスクリーニングタグを連結したライブラリー２由来の適当な結合パートナーと相互作用すると、例えば細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳類細胞とすることができる宿主細胞の表面にて検出することができる。融合タンパク質の細菌表面における表示自体は当分野に周知である。すなわち、リポタンパク質（Lpp）、外膜タンパク質A（OmpA）および鞭毛は大腸菌細胞表面に対する抗体およびペプチドを標的化するため用いられている。Fuchsら、Bio/Technology 9（1991）1369-1372、WO93/01287は大腸菌表面に一本鎖抗体をペプチドグリカン関連リポタンパク質との融合タンパク質として提示させた。この抗体は蛍光ラベルした抗原および表示された一本鎖抗体のリンカーペプチドに指向する蛍光ラベルした抗体の結合によって視覚化された。Franciscoら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90（1993）10444-10448およびGeorgiu，G．ら、WO93/10214は一本鎖抗体のＮ末端をOmpAのＣ末端に融合させ、一方OmpAのＮ末端はシグナル配列およびLppの最初の９アミノ酸と融合させることによって、大腸菌表面に抗体を表示させている。蛍光ラベルした抗原のOmpA−抗体融合タンパク質への結合をFACSによって検出した。Klauser（WO 95/17509）はIgAプロテアーゼシステムを淋菌から大腸菌に移し抗体を表示させた。IgAプロテアーゼ前駆体のベータドメインを外膜に組み込むことによって、プロテアーゼドメインの膜を通した輸送を、続いて培地中への自己タンパク質分解放出を導いた。それゆえIgAプロテアーゼのベータドメインに連結している抗体が細菌の表面に提示される。Further,Lu,Z.ら、Bio/Technology 13（1994）366-371はペプチドをチオレドキシンおよび細菌鞭毛と融合させることによって抗IL-8抗体に対するエピトープのペプチド擬似体に対しスクリーニングする、そのペプチドを細菌表面に表示するシステムを記載している。 次いで相互作用性（ポリ）ペプチドをコードする所望の核酸分子のさらなる同定は、当分野に既知の方法、例えば表面にタグを表示している宿主細胞の精製およびさらに抗生物質に基づく（antibioticum-based）選択技術、DNA精製および配列決定によって達成され得る。 本発明の方法の特に好ましい態様では、当該細菌は淋菌または大腸菌であり、当該融合タンパク質は少なくとも鞭毛、lamB、ペプチドグリカン関連リポタンパク質またはOmpAタンパク質の一部および当該（ポリ）ペプチドからなる。 本明細書の上記部分において繰り返し指摘したように、ライブラリー２にコードされる（ポリ）ペプチドに連結されたタグは所望の核酸配列の同定戦略にて用いられる。したがって本発明の方法のさらに好ましい態様では、工程(b)/(ab)または(c)/(ac)の組換えベクター分子によってコードされる（ポリ）ペプチドを少なくとも１つのスクリーニングまたは選択タグに連結する。本明細書中において、用語「スクリーニングまたは選択タグ」は特定の物質が認識し、結合することができる短いアミノ酸配列を意味する。タグは一般に生体分子の精製に用いられ、その例は、Niまたは特異的抗体が結合することができるHis(n)［ここにn=4-6である］ならびに適当な抗体によって認識されるflagおよびmycタグである。これらいずれの場合も、タグはライブラリー２のすべての結合パートナーとのＣ末端融合物としてコードされ得る。本発明では、タグは例えば上記のポリファージの単離に用いることができる。これゆえ、ファージに結合している結合性物質およびその相互作用性結合パートナー間の相互作用はファージ粒子ならびにスクリーニングおよび選択タグ間の連結を確立する。この特徴は相互作用する分子を保有するポリファージを単離するために例えばアフィニティークロマトグラフィーによる工程において利用される。最終工程では、２つの異なる核酸分子、好ましくは遺伝子（結合性物質および結合パートナーをコードする遺伝子）を保有するポリファージをこの２つの遺伝子のうち１つだけを保有するポリファージから、形質導入または個々のゲノムに存在する異なる選択マーカー（例えば抗生物質耐性）に基づく選択によって分離することができる。このようにして、２つの相互作用性分子をコードする遺伝子を同定することができる。 本発明の最も好ましい態様は、このスクリーニングまたは選択タグが工程(b)/(ab)または(c)/(ac)の組換えベクターによってコードされている方法に関する。 本発明のさらに最も好ましい態様は、スクリーニングまたは選択タグがHis(n)、myc、FLAG、malE、チオレドキシン、GST、ストレプトアビジン、ベータ-ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼT7gene10、Strep-ダグおよびカルモジュリンのリストから選択される方法に関する。これらのスクリーニングタグは当分野に周知であり、当業者は完全に利用可能である。 本発明の方法のさらに特に好ましい態様では、当該スクリーニングおよび選択タグが宿主細胞のゲノムによってコードされる。この態様の例は宿主細胞によって発現され、例えばカラムクロマトグラフィーによる精製において別のの架橋として機能できる抗Fcレセプター特異的抗体である。本態様のもう１つの例は宿主細胞によって産生される酵素であって、この酵素によって起こる修飾がスクリーニングまたは選択タグとなるような、工程(b)/(ab)および(a)/(aa)の（ポリ）ペプチドの相互作用を崩壊させない第２ライブラリーの（ポリ）ペプチドのリン酸化のようなタグを生成させる酵素である。 本発明の方法のさらに好ましい態様では、工程(c)/(ac)の追加ライブラリーの核酸配列によってコードされる（ポリ）ペプチドが工程(a)/(aa)および(b)/(ab)の（ポリ）ペプチドの少なくとも１つのリン酸化、グリコシル化、メチル化、脂質化またはファルネシル化によって工程(a)/(aa)および(b)/(ab)の（ポリ）ペプチドの相互作用を引き起こす。 本発明のさらに好ましい態様は工程(d)/(a)の宿主細胞が空間的にアドレス可能であり、工程(g)/(a)に記載の核酸配列が対応する空間的アドレス可能宿主細胞から回収できる方法に関する。 本発明の本文中において、用語「空間的アドレス可能」は第１、第２および任意に追加ライブラリーメンバーの潜在的組み合わせの１つを担持する個々の細胞がその相対的位置によって、例えば親プレート上のそれらの位置によって同定できる状況を意味する。例えばスクリーニングおよび選択を親プレートから誘導された単一のコロニーか、レプリカプレート上の単一のコロニーかどちらかについて行い、そうしてスクリーニング可能または選択可能な性質と親プレート上の宿主細胞中に含まれる情報との間の結びつきを維持することができる。 本発明のさらに好ましい態様は当該スクリーニング可能または選択可能な性質を細胞内において発現させる方法に関する。 特に好ましいのは、スクリーニング可能な性質がベーターガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはhis3およびleuのような栄養マーカーまたはアンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ゼオシン、ネオマイシン、テトラサイクリンまたはストレプトマイシンのような抗生物質に対する耐性を与える耐性遺伝子などのレポーター遺伝子の転写のトランス活性化である方法である。 さらには、上記本明細書中にて言及した酵母2-ハイブリッドシステムもしくは相互作用トラップシステム（Brentら、EP-A0672 131）またはビブリオコレラのtoxRシステムを利用する上記引用システムに類似する原核生物バージョンシステム（Fritz,H.-J．ら、EP-A 0 630 968）を使用できる。さらに当分野に既知のスクリーニングシステムを本発明の方法と組み合わせることは当業者の技術の範囲内にある。 本発明のさらに好ましい方法では、工程(a)/(aa)、(b)/(ab)および(c)/(ac)の組換えベクターは組換え促進部位を含み、工程(e)/(b)では組換えイベントを選択し、ここでは工程(a)/(aa)の（ポリ）ペプチドをコードする核酸配列、工程(b)/(ab)の（ポリ）ペプチドをコードする核酸配列および任意の工程(c)/(ac)の（ポリ）ペプチドをコードする核酸配列はこの同じベクターに含有される。このアプローチでは、ライブラリー１および２を保有するベクター中に適当な組換え部位を組み込む場合には、２つの遺伝子は単一のベクター中にてカップリングさせ、標準サイズのファージ中にパッケージングさせることができる。両方の核酸配列および遺伝子を保有するファージは例えばスクリーニングタグを利用して再び精製することができる。組換えを利用して２つのライブラリー由来の遺伝子をカップリングする場合、部位特異的組換えはあまり効率的でないため、いくつかのハイブリッド後代ファージは非組換えゲノムを含むことがあろう。しかし、ハイブリッドファージは、ライブラリー２を含まない宿主細胞の再感染、続くもう一度のスクリーニングタグによって選択できる。 本発明の方法の特に好ましい態様では、当該組換えイベントは部位特異的組換え機構Cre-lox、attP-attB、Mu ginまたは酵母flpによって媒介される。 本発明の方法の特に好ましい態様では、当該組換え促進部位は制限酵素認識部位であり、当該組換えイベントは工程(a)/(aa)、(b)/(ab)および任意に(c)/(ac)に記載の組換えベクター分子の少なくとも２つの異なる制限酵素を用いる切断および当該ベクターに含まれる核酸配列の連結による組換えによって達成される。 本発明は別の好ましい態様としてPCRによる選択工程(e)/(b)後に当該核酸配列の同定を行い、および好ましくは当該PCR後に当該核酸配列の配列決定を行う方法に関する。当該選択工程(e)/(b)後、PCRは都合よく組換えベクター分子のベクター部分にハイブリダイズするプライマーを用い、豊富な所望の産物を伴って行うことができる。次いでPCR産物の配列決定は常法により行うことができる。 本発明に記載の方法のさらに好ましい態様では、工程(a)/(aa)、(b)/(ab)および/または(c)/(ac)の組換えベクターは選択マーカーをコードする少なくとも１つの遺伝子を含む。 当該選択マーカーをコードする遺伝子は工程(a)/(aa)、(b)/(ab)および/または(c)/(ac)のそれぞれにおいて異なっている、すなわち当該ベクターは異なる選択マーカーをコードする遺伝子を含むのが好ましい。当該選択マーカーは都合よく工程(f)/(c)においてもくろまれるさらなる精製用に用いることができる。例えば、ライブラリー１および２それぞれの２つのメンバーを含むポリファージは、抗生物質に対する二重耐性に基づいて選択することができる。また成功した組換えイベントはライブラリー１および２由来の核酸分子の両方および異なる選択マーカーをコードする遺伝子を保有する新たな組換えベクターを生む。再び、二重耐性選択が所望産物を同定する助けとなろう。 当該方法の特に好ましい態様においては、当該選択マーカーは抗生物質、好ましくはアンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ゼオシン、ネオマイシン、テトラサイクリンまたはストレプトマイシンに対する耐性である。 本発明のさらに好ましい態様は宿主細胞がF'および好ましくは大腸菌XL-1ブルー、K91もしくはその誘導体、TG1、XL1kanまたはTOP10Fである方法に関する。 本発明の特に好ましい態様において、当該RGPはR408、M13k07およびVCSM13、M13de13、fCA55ならびにfKN16またはその誘導体のリストから選択されるヘルパーファージを用いて生産する。 さらに好ましいのは、その方法中で少なくとも１つの当該遺伝的に異なる核酸配列が免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーをコードするような方法である。 当該方法は当該遺伝的に異なる核酸配列が免疫グロブリンの重または軽鎖のレパートリーをコードするものであれば特に好ましい。 本発明の別の好ましい態様においては、当該方法中で当該遺伝的に異なる核酸配列を突然変異法によって生産する。種々の突然変異法は当業者に周知であり、さらに詳細には本明細書中に記載する必要はない。 本発明は別の好ましい態様においては、その方法中で当該遺伝的に異なる核酸配列がcDNAライブラリーから生産されるような方法に関する。 本発明の方法の最後の好ましい態様において、当該核酸配列は遺伝子またはその一部である。 本明細書中に用いている、用語「その一部」は他のライブラリーによってコードされるいくつかの産物と相互作用することができる産物をコードする遺伝子の一部に関する。種々のタンパク質は異なるドメインから構成されることは周知である。当該ドメインの１つだけが、異なる（ポリ）ペプチドと相互作用できる場合がある。本発明によれば、そのようなドメインは当該遺伝子の一部がコードしていることがあり得る。 また本発明は２以上の相互作用性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子の同定を提供している。これは上記の方法の拡大により、遺伝的に異なる別の核酸をコードする別のベクターを用いることによって行うことができる。前記のように、スクリーニングタグまたは感染性タンパク質のどちらかの存在を用い、複合体の構成成分をコードする遺伝子を保有するファージを精製する。次いで再び、ファージ中のこの遺伝子の配列を当業者に周知の方法論によって決定することができる。 加えて、本発明は少なくとも(a)工程(a)/(aa)に記載の組換えベクター分子または相当するベクター分子；(b)工程(b)/(ab)に記載の組換えベクター分子または相当するベクター分子；および任意に(c)工程(c)/(ac)に記載の少なくとも１つのさらなる組換えベクター分子または相当するベクター分子を含むキットに関する。 一般に、組換えベクター分子が上記キットに含まれる場合、これは核酸分子のライブラリーを含む。言い換えれば、本発明のキットは種々の組換えベクター分子の集合体を含む。図および表の説明図１：ポリファージ原理の概説図２：２つのファージミドの共形質導入、ポリファージ形成およびHis-タグによる選択：概説A、B：好ましくは異なる耐性マーカーをもつファージミドのライブラリー；A：gIIIpへの融合物；B：タグ(His)への融合物；共形質導入後、同族ペアを表示する（図の左側）あるいは表示しない（右側）ファージ集合を導くファージ産生、宿主細胞の選択感染後、二重耐性による選択別方法では、プラスミドまたはファージミドに基づくライブラリーBを担持する細胞をファージライブラリーAで感染させる（再必要条件：抑制-耐性構築体）。図３：pBSベクター群：pBS13の機能地図および配列図４：ファージミドの共存在：制限消化の結果二重耐性(Amp/Cm)クローンの制限分析。R1：pIG10.3、Xba/ScaＩ；R2：pBS13、Xba/ScaＩ；R1+R2：R1およびR2をおよそ等しい割合で混合する；M1：マーカーλ：BstEII；M2：マーカーpBR322：MspＩ；１から10：ランダムにピックアップしたクローン：Xba/ScaＩ図５：ファージミドベクターpYING1-C1：機能地図fosペプチド含有。対応するベクターpYING1-C2およびpYING1-C3はfosのかわりにそれぞれp75およびIL16ペプチドを含む。図６：ファージミドベクターpYANG3-A：機能地図junペプチド含有。対応するベクターpYANG3-Ape2、pYANG3-Ape3およびpYANG3-Ape10はjunのかわりにそれぞれp75結合性ペプチドpe2、pe3およびpe10を含む。図７：選択クローンの分析（表２参照)：7.a：選択前および後のクローンの制限消化R：pYANG3-Ape2：XbaＩ;M1：マーカーλ：BstEII；M2：マーカーpBR322：MspＩ；α/1から10：選択前にランダムにピックアップしたクローン：XbaＩ/HindIII；β/1から10：選択後にランダムにピックアップしたクローン：XbaＩ/HindIII；予想サイズ：jun-gIII：745bp；fos：256bp；p75：577bp；IL-16：502bp7.b：選択後のクローンのプライマーOPEP5LおよびOGIII3を用いるPCR反応R1：鋳型としてのpYANG3-A；R2：鋳型としてのpYANG3-Ape2；M：マーカーλ：BstEII；β/1から10：選択後にランダムにピックアップした鋳型としてのクローン図８：ファージミドベクターpING1-C1：機能地図Hisタグペプチド含有。対応するベクターpING3-C1はさらにFLAGエピトープを含み；pING1-C2およびpING3-C2はHisタグのかわりにStrepタグを含み、pING3-C2はさらにFLAGエピトープを含む。図９：ファージミドベクターpONG3-A:機能地図ファージディスプレイライブラリー（gIII融合体）の作成用図10：ファージおよびプラスミドの共形質導入、ポリファージ形成およびSIPによる選択：概説fA：ファージ構築体におけるライブラリーA;B：ライブラリーB、IMPと融合しているライブラリーメンバー；好ましくはファージおよびプラスミド上に異なる耐性マーカー；共形質導入後のファージ生産；同族ペア相互作用の場合における感染性ファージの形成；選択；二重耐性のプレートにまくことによるポリファージ粒子の同定。図11：ファージベクターfhag1A：機能地図α-HAG scFvのファージディスプレイ用図11a：CAT遺伝子モジュール：機能地図および配列図12：ファージベクターfjun1A：機能地図junペプチドのファージディスプレイ用図13：ファージベクターfjun1B：機能地図junペプチドのファージディスプレイ用図14：ファージベクターfpep3-IB：機能地図p75の細胞内ドメインに結合するペプチドpe3のファージディスプレイ用図15：ファージベクターfNGF-1B：機能地図NGFのファージディスプレイ用図16：プラスミドpUC19/IMPhag：機能地図HAGペプチドのgIIIP（IMP）のＮ末端ドメインへの融合物を含む図17：プラスミドpUC18/IMPp75：機能地図p75細胞内ドメインのgIIIP（IMP）のＮ末端ドメインへの融合物を含む；pUC18/IMPfosはp75細胞内ドメインのかわりにfosペプチドを含む。図18：プラスミドpUC18/IMPIL16：機能地図IL16のgIIIP（IMP）のＮ末端ドメインへの融合物を含む図19：選択クローンの分析（表３参照）レーン１：マーカーλ：BstEII；レーン２から20：Xba/HindIIIで消化したポリファージ形質導入体クローン＃１から＃19；f..-lb：消化後のファージベクター断片；pUC18：消化後のプラスミド断片；α-HAG：gIIIcへ融合している抗HAG scFvを含む断片；IMP-p75およびIMP-HAG：それぞれp75へ融合しているIMP、およびIMP-HAGペプチドを含む断片；PeP3-gIIIs：gIIICへ融合しているpep3を含む断片（s：短型）図20：ファージミドの共形質導入、インビボ組換えおよびHisタグによる選択：概説A、B：ファージミドライブラリー；好ましくは異なる耐性マーカーを伴う；A：gIIIpへの融合物；Ｂ：タグ（His）への融合物；lox/loxPのような組換え促進部位(*)を含む両構築体；共形質導入および組換え後のファージ生産；Ni-NTAによる選択；宿主細胞への再感染、二重耐性による選択図21：インビトロ組換えおよびHisタグによる選択：概説A、B：ファージミドのライブラリー；好ましくは異なる耐性マーカーを伴う；A：gIIIpへの融合物；B：タグ（His）への融合物；制限酵素（+/o）に対応する認識部位を含む両構築体；消化および共ライゲーション後の形質導入およびファージ生産；Ni-NTAによる選択；宿主細胞への再感染、二重耐性による選択図22：ファージベクターfjunhag：junペプチドのファージディスプレイ用機能地図図23：空間的インビボSIP：概説上記方法のいずれかに記載の形質導入または共形質導入後、マスタープレートを作成する。これより、個々のクローンから分泌されたファージは個々に分析でき（上）、あるいはレプリカ（フィルター盤を通す分泌ファージの移動物）はその上でタグの存在または感染性の選択を行うことができるように作成できる。マスタープレートにもどることによって、組換えおよび/またはポリファージ生産を必要とせずに選択された同族の相互作用ペアの情報を回収することができる。図24：大腸菌ディスプレイ：概説A、B：ファージミドのライブラリー；好ましくは異なる耐性マーカーを伴う；Ａ：大腸菌表面ディスプレイタンパク質への融合物；B：タグ（His）への融合物；共形質導入後の構築体の発現；表面ディスプレイ；同族相互作用が起こった場合における宿主細胞表面のタグのディスプレイ；選択図25：pTERMsc2H10myc3sCAM：機能地図および配列表１：実験２および３用に構築したファージミド表２：実験２の結果（図７参照）2.a：最初のライブラリーに存在するファージミドの組み合わせ（α）2.b：選択後に存在するファージミドの組み合わせ（β）表３：実験４の結果（図19参照）3.a：個々のクローンに存在するファージ／プラスミドの同定3.b:個々のクローンの感染性についての試験 以下の実施例は本発明を例示する。実施例１：ポリファージ原理の概説（図１） ライブラリー１を構成する結合性物質はペプチドまたはタンパク質であってよく、遺伝的に異なるの第１核酸配列の集団によってコードされる。複製可能遺伝的パッケージの表面にこのコードされる結合性物質を表示させる第１ベクター中へこれらの核酸配列を挿入する。これに続く選択のため、第１ベクターは抗生物質耐性のような選択マーカーをコードする遺伝子も保有するべきである。ライブラリー２を構成する結合パートナーはペプチドまたはタンパク質であってよく、第２ベクターに挿入される遺伝的に異なる第２核酸配列の集団によってコードされ得る。例として、この第２ベクターはプラスミドであってよく、あるいはファージまたはファージミドでもよいが、この場合には複製起点が第１ベクターのものと異なっているべきである。これに続く選択のため、第２ベクターは抗生物質耐性のような選択可能マーカーをコードする遺伝子であって、好ましくは第１ベクターに存在するものと異なるものも保有しているべきである。結合性物質-結合パートナーペア間で形成される複合体の精製を容易にするため、ライブラリー２のメンバーにスクリーニングタグを連結するのが都合よい場合がある。 次いで２つの遺伝的に異なる核酸集団を、コードされるライブラリー１および２が発現できるように宿主細胞集団に導入する。これは（ｉ）２つのベクターを共形質導入する、すなわち実際に図に示されているようにするか、（ii）相補的核酸集団が導入された細胞集団を高い効率で感染させるために用いることができるベクター（例えばバクテリオファージ）へ核酸集団の１つをパッケージングさせること、のいずれかによって達成できる。この結果、その細胞集団において個々の細胞がそれぞれのライブラリーの代表を保有する細胞集団となる。 ２つの核酸集団を発現させると、それぞれがそれぞれのライブラリー由来の分子である分子のペアが生産される。それぞれの場合において結合性物質ライブラリーの１つまたはそれ以上のメンバーをRGPの外殻中にパッケージングさせる。いくつかの細胞においては、RGP表面の結合パートナーおよびライブラリー２から発現される結合パートナー間に相互作用が確立するであろう。したがってそのような相互作用が確立した場合、RGPは結合性物質および結合パートナーの両方を保有する。 次いで本明細書中、前述ようにポリファージおよび種々の選択マーカーを用い、そのような相互作用を表示するRGPをさらに精製することができる。そのような選択後、１つまたは両方の結合パートナーをコードする核酸配列をDNA配列決定のような当分野に既知の方法論によって都合よく同定することができる。実施例２：同じ大腸菌複製起点をもつファージミドの共形質導入、ポリファージ形成およびHisタグによる正しいペア形成相互作用の選択2.1：原理（図２参照） ポリファージ形成により、タンパク質ペアの１つのメンバーに融合させたタグを用いて選択される同族タンパク質ペアの遺伝情報が回収可能となることを示すため、ファージミドベクターにおいて２つの別個の小ライブラリーを構築する。2.2：同じ大腸菌複製起点をもつファージミドの共形質導入試験 ２つの異なるファージミドを含むポリファージ粒子形成に必要な条件は、異なるファージミドベクターが宿主細胞中に共存できることである。 ベクターpBS13はカナマイシン耐性遺伝子のかわりにクロラムフェニコール耐性遺伝子、2H10-gIII融合遺伝子のかわりにβラクタマーゼ遺伝子カセットを含むベクター（Krebberら、1996）の誘導体であり、pto2H10a3sから出発する標準的方法によって組み立てることができる。図３は機能地図およびpBS13配列を含む。pIGHAG1A（実施例4.2.1.f参照）はXbaＩおよびHindIIIによって消化可能である。繊維状ファージｐIIIタンパク質のＣ末端ドメインを融合している抗HAG遺伝子を含むこの1.3kb断片を単離し、前もって消化しておいたファージミドベクターpIG10.3、およびpBS13（XbaＩ-HindIII）と連結し、それぞれベクターpIG10.3-scFv（抗HAG）（ApR）およびpBS13-scFv（抗HAG）（CmR）を構築する。このベクターを用いてコンピテントXL-1ブルー細胞を形質転換し、Amp/Cm/Tetおよびグルコース（20mM）を含むLBプレート上にて選択する。 二重耐性コロニー（Amp/Cm）のクローン由来のファージミドを単離する。制限消化は単一のコロニーから両方のファージミドが共単離されることを示す（図4）。2.3：ライブラリーAおよびBの設計 ライブラリーAはそれぞれ低アフィニティー神経成長因子（NGF）レセプター（実施例４参照）の細胞内ドメインに結合した３つの環状ペプチドおよびjun転写因子由来ロイシンジッパードメインを含み、これらはすべて繊維状ファージ由来ｇIIIのＣ末端にそのＮ末端を介して融合している。 ライブラリーＢはロイシンジッパードメインを介してjunとヘテロニ量体を形成しているfos転写因子のロイシンジッパードメイン、NGFレセプターp75の細胞内ドメイン、およびライブラリーAのメンバーと相互作用しないネガティブコントロールとしてのIL-16の３つのメンバーをコードし、これらすべてはタグとしてのHis6ペプチドとそのＮ末端で融合している（Hochuliら、1988；Lindnerら、1992）。 同族ペア形成はjunおよびfos（CrameriおよびSuter、1993）ならびにp75および選択される環状ペプチド（実施例４参照）間の相互作用から生じる。非同族ペア形成は記載の非同族ペア間ならびにjunまたは環状ペプチドの１つおよびIL-16間に起こるであろう。2.4：個々の構築体のPCR増幅 pOKl（Gramatikoffら、1994）を鋳型として、OFOS-5およびOFOS-3をプライマーとして用い、Ｎ末端がHis6に融合しているFosをPCR増幅した。ここにHis6はOFOS-5プライマー中にコードされる。pOK1を鋳型として、オリゴヌクレオチドOJUN-5およびOJUN-3をプライマーとして用い、junをPCR増幅した：ホットスタート法を用いる。段階的タッチダウンPCRを適用する：92℃、１分間；58-52℃、ΔT=2℃、１分間；72℃、１分間。これをその後26サイクル（92℃、１分間；52℃、１分間；72℃、１分間）続ける。 PCR産物をQIAquickキット（Qiagen）を用いて精製し、ddH2O中に溶出させる。次いで一晩これらをEcoRIおよびEcoRVで消化する。 またpUC18-IMPp75（実施例４参照）を鋳型として、オリゴヌクレオチドOP75-5（ここにHis6がコードされている）およびOP75-3をプライマーとして用いてp75断片をPCR増幅する：上記と同じPCRおよび制限消化条件を適用する。 OIL16-5（ここにHis6がコードされている）およびOIL16-3をプライマーとして用いてcDNAクローンであるpcDNA3-ILHu1（M.Baier,Paul EhrlichInstitute,Germany；Baierら、1995；Bannertら、1996）からIL-16断片を増幅する：上記と同じPCRおよび制限消化条件を適用する。 すべての場合においてこれらの断片は容易に増幅され、消化される。2.5：中間体ベクター中へのクローニング 消化したPCR断片をゲル精製（QIAquickキット、Qiagen）し、TE緩衝液中へ溶出させる。またpIG1ベクター（Geら、1995）のEcoRV/EcoRI断片も単離する。fos、p75およびIL-16消化PCR断片はベクター断片に連結し、この連結ベクターをTG1細胞中へ形質導入する。 pIG1ベクター中の構築体はこの構築体にインフレームで融合しているOmpAシグナル配列を含む。 配列決定によって正しいクローンをスクリーニングし、確認する。これらは次いでXbaI/HindIII消化し、断片を単離する。2.6：発現ベクター中へのクローニング 2.3より単離した断片をXbaI/HindIIIで切断したpBS13中へ挿入した結果、ベクターpYING1-C1(Fos),pYING1-C2(p75)、pYING1-C3（IL-16）となる(図５参照)。EcoRV/EcoRIを用いてjunを含む断片をpIG10.3ベクター中へクローニングした結果、pYANG3-Aとなる（図６参照）。XbaI/HindIIIを用いて抗p75ペプチドpe2、pe3およびpe10（実施例４参照）をpIG10.3中へクローニングした結果、それぞれベクターpYANG3-Ape2、-Ape3、-Ape10（図６参照）となる。2.7：Hisタグを用いる正しいペア形成の選択 pYANG3-A+pYING1-C1またはpYANG3-A+pYING1-C2またはpYANG3-A+pYING1-C3または（pYANG3-Ape2、-Ape3および-Ape10）+pYING1-C1または（pYANG3-Ape2、-Ape3および-Ape10）+pYING1-C2または（pYANG3-Ape2、-Ape3および-Ape10）+pYING1-C3の組み合わせでTG1細胞を形質転換し、これによりすべての可能な組み合わせを作り出し、選択実験においてこれら各々を確実に存在させる。形質転換細胞をアンピシリン/クロラムフェニコール含有LB寒天プレートにまき、二重耐性（ApR/CmR）をもつコロニーを選択する。このコロニーをプレートからかきとり、2xYT培地（Amp/Cm）に植え付け、37℃で３時間振とうする。培養物を30℃で１時間誘導（1mM IPTG）し、37℃で30分間R408（Stratagene）で感染させる。培養物を室温で３時間振とうし、カナマイシンを加え、振とうを室温で一晩継続する。 一晩培養物からファージ粒子を回収し、混合し、PEG沈殿させる。ファージを固定Ni-NTA（Ni-NTA HisSorb Strips、Qiagen）上で直接選択する。溶出したファージを用いてTG1細胞を感染させ、これをアンピシリン/クロラムフェニコール含有LB寒天プレートにまき、二重耐性（ApR/CmR）をもつコロニーを選択する。 選択されたコロニーのファージミドを単離し、制限消化によって分析し（図7.a参照）、PCRスクリーニング用の鋳型として用いる。プライマーOPEP5Lを用いてpYANG3-Ape2、-Ape3および-Ape10構築体を特異的に増幅する（図7.b参照）。OPEP5L ５'-GACTACAAAGATGTCGACTG 正しいペア形成の構築体が特異的に豊富であった（表２）。実施例３：大腸菌ゲノムDNAライブラリーの相互作用スクリーニング（ポリファージ/タグシステム）3.1：原理（図２参照） 実施例２の２つのモデルライブラリーを用いるかわりに、大腸菌のゲノムDNAライブラリーを調製し、自身に対してスクリーニングし、相互作用する大腸菌ペプチドまたはタンパク質を同定する。3.2：ゲノムDNA用表示および発現ベクターの構築 オリゴヌクレオチドカセットまたはPCRによってHisタグ、Strepタグ（SchmidtおよびSkerra、1994）またはｇIIIのＣ末端ドメイン（gIIIc）いずれかの前に挿入された平滑末端制限部位SmaIを有する発現ベクターを構築する。 自己相補的オリゴヌクレオチドOHIS5＆OHIS3およびOSTREP5＆OSTREP3を用いてそれぞれHisタグおよびStrepタグをコードするカセットを作成する： これらのカセットをリン酸化し、アニーリングしてEcoRIおよびHindIII部位を再構築する。これらのカセットを同じ制限酵素で切断したpIG1およびpIG3ベクター（Geら、1995）中へ挿入する。得られたベクターはそれぞれpING1-A1、pING3-A1（pIG1およびpIG3ベクター中のHisタグ用）、pING1-A2およびpING3-A2（Strepタグ用）である。正しいベクターをXmaI部位（SmaIのアイソシゾマー）の存在に対してスクリーニングし、配列決定によってこれらの構築体を確認する。これらのベクターのXbaI/HindIII断片をpBS13ベクター中へ挿入し、同じ酵素で線状化した結果、それぞれベクターpING1-Cl、pING3-Cl、およびpING1-C2、pING3-C2となる（図８参照）。 pIG10.3ベクターをPCR増幅するに当たり、プライマーOGIII5およびベクター中のgeneIIIの3'にアニーリングするOGIII3を用いてSmaI部位を含むgIIIc断片を作成する： ホットスタート：92℃、１分間；46℃、１分間；72℃、1.5分間でPCRを３回行う。続いて、92℃、１分間；50℃、１分間；72℃、1.5分間を30回行う。PCR産物を精製（QIAquick）し、EcoRIおよびHindIIIで消化する。この断片をゲル精製（QIAquick）し、pIG10.3中へ連結する。得られたベクターpONG3-A（図８参照）の配列は制限分析および配列決定によって確認する。3.2：Hisタグを用いる大腸菌ゲノムDNA由来の相互作用性ペアの選択 大腸菌株XL-１ブルー（Stratagene）のゲノムDNAをブラッド＆セルカルチャーDNAマキシキット（Qiagen）を用いて単離し、TE緩衝液（pH8.0）中に溶出させる。このDNA 200μgをとり、超音波破砕（50回、270mA、0.5秒／ストローク）する。断片化DNA（平均サイズ：最大0.7kB）をT4 DNAポリメラーゼでの充填反応（ギャップをうめる）反応によって平滑末端化する。 ベクターpING1-C1およびpONG3-AをEcoRVおよびSmaＩで消化し、これらのベクター断片をゲル精製（Qiagen）する。次いでこれらのベクター断片を16℃で一晩、平滑末端ゲノムDNAと連結する。得られた連結混合物でTG1細胞を形質転換する。 pING1-C1およびpONG3-A形質転換体をプレートからかきとり、それぞれCm/グルコースまたはAmp/グルコースを含有する2xYT培地に植え付ける。pING1-C1培養物をヘルパーファージ（VCSM13またはM13k07）で感染させ、ファージ粒子を単離する。これらのファージ粒子を用いてpONG3-Aを含む対数期細胞を感染させる。得られた培養物を大きなAmp/Cm/グルコースプレート上にまく。 コロニーを上記プレート表面からかきとり、Amp/Cmを含有する2xYT培地に移す。37℃で30分間振とうした後、この培養物を30分間誘導（1mM IPTG）し、室温で一晩振とうする。 ファージ粒子を一晩培養物から採取し、PEG沈殿させる。これらを固定Ni-NTA（NI-NTA HisSorb Strips、Qiagen）上で選択する。溶出ファージを用いて対数期TG1細胞を感染させる。選択されたタンパク質ペアを対応するDNA配列の決定によって特性化する。実施例４：ポリファージ、およびSIPを用いる正しいペア形成相互作用の選択4.1：原理（図10参照） この実験の目的は、SIP（選択感染ファージ：Krebberら、1995；この実験セクションに用いている用語「IMP」は繊維状ファージのgeneIIIタンパク質のＮ末端ドメインを含む「感染性媒介粒子」を意味する）選択システムを用いて２つのライブラリーの組み合わせから正しい相互作用性ペアが単離同定でき、ポリファージ粒子の形成および選択によって相互作用性パートナー両方についての情報を回収できることを示すことである。対応するライブラリーのメンバーと相互作用性するペアを形成するライブラリーメンバーは、対応するライブラリーのメンバーと相互作用しないライブラリーメンバーと「混ざる（doped）」ことがあり、ポジティブSIP選択を与えるべきでない。4.2：ベクター構築4.2.1：fhag1A（図11参照）a.ファージベクターf17/9-hag（Krebberら、1995）をEcoRVおよびXmnIで消化する。抗HAG Ab遺伝子を含む1.1Kb断片をアガロースゲル電気泳動によって単離し、Qiagenゲル抽出キットを用いて精製する。この断片を前もって消化しておいたpIG10.3ベクター（EcoRV-XmnI）に連結する。連結したDNAをDH5α中へ形質導入し、ポジティブクローンを制限分析で確認する。この組換えクローンをpIGhag1Aと称する。上記および以下に記載のすべてのクローニングは標準的手法（Sambrookら、1989）にしたがう。b.ベクターf17/9-hag（Krebberら、1995）をEcoRVおよびStuIで消化する。7.9kbの断片を単離し、自己連結させてベクターfhag2を形成させる。c.鋳型pACYC（CardosoおよびSchwarz、1992）を用いるアセンブリーPCR（GeおよびRudolph、1997）によって組み立てたクロラムフェニコール耐性遺伝子（CAT）（図11aはCAT遺伝子の機能地図および配列を示す）をプライマー：を用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅する。d.標準的手法（Sambrookら、1989）に引き続いてPCRを行う。増幅産物はBspEIおよびBsu36Iで消化した後、前もって消化しておいたfhag2ベクター（BspEI-Bsu36I；7.2kb断片）に連結し、fhag2Cを形成させる。e.ベクターfhag2CをEcoRIで消化し、クレノー断片で充填することによって末端を平滑化する。平滑化ベクターを自己連結させ、ベクターfhag2CdelEcoRIを形成させる。f.pIGHAG1AをXbaIおよびHindIIIで消化する。繊維状ファージｐIIIタンパク質のＣ末端ドメインに融合した抗HAG遺伝子を含む1.3kb断片を単離し、前もって消化しておいたfhag2CdelEcoRIファージベクター（XbaI-HindIII；6.4kb）と連結し、ベクターfhag1Aを作成する。4.2.2：fjun1A（図12参照）a.プライマー：を用いるオリゴヌクレオチドサイトダイレクト突然変異（Sambrookら、1989）によってpIG10.3のEcoRV部位をSalI部位に変換する。突然変異pIG10.3をpIG10.3SalIと称する。b.pOK1（Grammatikoffら、1994）由来junロイシンジッパードメインをプライマー：を用いるPCRによって増幅する。b.標準的手法（Sambrookら、1989）に引き続いてPCRを行う。増幅産物はSalIおよびEcoRIで消化した後、前もって消化しておいたpIG10.3SalIベクター（SalI-EcoRI）に連結し、ベクターjun-pIG10.3SalIを形成する。d.ベクターjun-pIG10.3SalIをXbaIおよびEcoRIで消化する。0.14kb断片を前もって消化しておいたベクターfhag1A（XbaI-EcoRI；7kb）に連結し、ベクターfjun1Aを形成する。4.2.3：fjun1B（図13参照）a.繊維状ファージｐIII（短ｇIII）のアミノ末端ドメインからＣ末端ドメインを分離する長いリンカーを含むＣ末端ドメインをコードするDNAをプライマー：を用い、pOK1（Grammatikoffら、1994）を鋳型として用いて増幅する。b.標準的手法（Sambrookら、1989）に引き続いてPCRを行う。増幅産物はEcoRIおよびHindIIIで消化した後、前もって消化しておいたfhag1Aベクター（EcoRI-HindIII）に連結し、ベクターfjun1Bを形成する。4.2.4：fpep2-1b）fpep3-1B、fpep10-1b（図14参照）a.これらの構築物は、SIP実験におけるp75の細胞内ドメインである、NGF低アフィニティーレセプターに対してスクリーニングされたペプチドライブラリーから得られる。b.6-16アミノ酸の長さ変異体をもつ環状ペプチドのペプチドライブラリーカセットをオリゴ：［ここにＭはcysをコードするコドンを除く19トリヌクレオチドコドンの混合から調製する。長さの変異は、標準カップリング手法を用いる６トリヌクレオチド位置のカップリング、それに続く10カップリングサイクルにおけるDNA合成の間のキャッピング工程を省略し、そしてトリヌクレオチド混合物を希釈して50％のカップリング収率を段階的に達成することにより行われる。 上記オリゴをアニーリングし、DNAポリメラーゼＩのクレノー断片で充填し、標準的方法（Sambrookら、1989）を用いて二本鎖DNAカセットを形成する。このカセットをSalI-EcoRIで消化し、Qiaex DNAゲル抽出キットで精製し、前もって消化しておいたfjun1Bベクター（Sal I-EcoR I）に連結し、ペプチドライブラリーを形成する。連結ペプチドライブラリーをpUC18/IMP-p75（以下参照）を宿すコンピテントDH5α細胞中に形質導入し、ルリアブロス（LB）（30μg/mlクロラムフェニコール+l00μg/mlアンピシリン）プレート上にまき、環境温度で一晩インキュベートする。c.AmpR CmRロニーをLBとともにかきとり、この懸濁液1mlをLB（30μg/mlクロラムフェニコール+100μg/mlアンピシリン＋1mM IPTG）25mlに植え付ける。この培養物を一晩室温でインキュベートする。d.この上清を遠心（10,000RPM、10分間、4℃）によって細胞から分離する。30％PEG/3M NaCl 5mlをこの上清に加え、100回混合する。氷上で１時間後ファージ沈殿物を遠心（10,000RPM、10分間、4℃）によって集める。ペレットをTBS緩衝液1ml中へ再懸濁する。この懸濁物を0.45ミクロンフィルター（Sartorius）を用いてろ過する。e.ファージ上清10μlを用いて対数期K91細胞（またはいずれかの雄性大腸菌細胞（Ｆ線毛含有））100μｌを感染させ、LB（30μg/mlクロラムフェニコール）プレート上にまき、環境温度で一晩インキュベートする。f.クロラムフェニコール耐性形質導入体をとり、一晩培養物を調製して、配列決定用DNAを単離する。配列決定によりペプチドpe2、pe3およびpe10を含むfpep2-1b、fpep3-1B、fpep10-1bを同定する。4.2.5：fNGF1B（図15参照）a.神経成長因子（NGFI）遺伝子をコードするDNAをプライマー： を用い、pXM NGF（Ibanezら、1992）を鋳型として増幅する。b.標準的手法（Sambrookら、1989）に引き続いてPCRを行う。増幅産物はSal IおよびEcoRIで消化した後、前もって消化しておいたfjun1Bベクター (Sal I-EcoR I）に連結し、ベクターfNGF1Bを形成する。4.2.6：pUC19/IMP-HAG（図16参照）a.ベクターf17/9-hag（Krebberら、1995）をEcoIおよびHindIIIで消化する。 HAGペプチドとIMPの融合遺伝子を含む1.4kb断片を単離し、前もって消化し ておいたpUC19（EcoR I-Hind III）中へクローニングし、ベクターpUC19/IMP- HAGを形成する。4.2.7：pUC18/IMP-p75（図17参照）a.C末端の142アミノ酸を含むp75の細胞内ドメインをプライマー を用い、p75のcDNAクローン（Chaoら、1986）を鋳型として増幅する。b.標準的手法（Sambrookら、1989）に引き続いてPCRを行う。増幅産物はBsiW IおよびHind IIIで消化した後、前もって消化しておいたpUC19ベクター（BsiW I-Hind III）に連結し、ベクターpUC19/IMP-p75を形成する。c.ベクターpUC19/IMP-p75をXbal IおよびHind IIIで消化する。この1kb断片を単離し、前もって消化しておいたpUC18ベクター（Xbal I-Hind III）中へクローニングし、ベクターpUC18/IMP-p75を形成する。4.2.8：pUC18/IMP-IL16（図18参照）a.IL16遺伝子をプライマー を用い、クローンpcDNA3-ILHu1（M.Baier、Paul Ehrlich Institute） Germany；Baierら、1995；Bannertら、1996）を鋳型として増幅する。b.標準的手法（Sambrookら、1989）に引き続いてPCRを行う。増幅産物は Bsu36 ＩおよびHind IIIで消化した後、前もって消化しておいたpUC18/IMP-p75ベクター（Bsu36I-Hind III）中へ連結し、ベクターpUC18/IMP-IL16を形成する。4.3：共形質導入およびポリファージを用いるインビボSIP4.3.１：２ライブラリーの組み合わせ（ライブラリー１をｇIIIに融合させ、一方ライブラリー２をIMPに融合させる）a.fjun1B、fjun1A、fpep3-1B、fhag1A、fNGF1Bの各10ngをpUC18/IMP-p75、pUC18/IMP-HAG、pUC18/IMP-IL16の各500ngと共にエレクトロポレーションによってDH5α細胞中へ共形質導入する。この細胞をルリアブロス（LB）（30μg/mlクロラムフェニコール+100μg/mlアンピシリン）プレート上にまき、環境温度で一晩インキュベートする。 AmprCmrコロニーをLBからかきとり、懸濁物1mlをLB（30μg/mlクロラムフェニコール+100μg/mlアンピシリン＋1mM IPTG）25mlに植え付けた後、室温で一晩インキュベートする。4.3.2：インビボSIP。細胞からの上清を遠心（10,000RPM、10分間、4℃）によって分離する。30％PEG/3M NaCl 5mlをこの上清に加え、100回混合する。氷上に１時間後、ファージ沈殿物を遠心（10,000RPM、10分間、4℃）によって集める。このペレットをTBS緩衝液1ml中に再懸濁し、この懸濁物を0.45ミクロンフィルター（Sartorius）を通してろ過する。 ファージ上清200μlを用いて、対数期K91細胞（または雄性大腸菌細胞（F線毛含有）のいずれか）1.8mlを感染させ、この細胞をLB（30μg/mlクロラムフェニコール+100μg/mlアンピシリン）プレート上にまき、環境温度で一晩インキュベートする。4.3.3:感染性ポリファージのDNAパターンおよび感染性の試験。20の独立したAmprCmrコロニーをそれぞれLB（30μg/mlクロラムフェニコール+100pg/mlアンピシリン）5ml中に植え付け、環境温度で一晩インキュベートする。Qiagen Miniprep DNA kitを用いてそれぞれのクローンからプラスミドおよびRF DNAを単離する。製造元によって供給され、指示されるように制限酵素Xba IおよびHindIIIを適当な緩衝液といっしよに用いる制限分析によってクローンを分析する。この制限消化は0.8％TBEアガロースゲル中、100Vの一定電圧で1.5時間行う。制限パターンはバンドの相対的な強さと共に（ファージベクター（fjun1B、fjun1A、fpep3-1B、fNGF1B,．fhag1A）はプラスミドベクターより非常に少ないコピー数しかないから）、相互作用性ペアの正確な同定を可能にする。ペアfhag1A+pUC19/IMP-HAGに対し、Xba I-Hind III消化により6.5kb、3.3kb、1.3kbおよび0.7kb断片が生成し、一方ペアfpep3-1B+pUC18/IMP-p75に対しては同消化によって6.3kb、2.8kb、1kbおよび0.7kb断片が生成する。問題はfjun1Bまたはfjun1AのpUC18/IMP-p75との潜在的非同族ペアの組み合わせを区別することであるが、これらがfpep3-1B+pUC18/IMP-p75と類似のパターンを与えるからである。さらにこれを解決するためには、同一のパターンを含むクローンをBamH I-Hind IIIで再消化することができる。fjun1Aまたはfjun1BはpUC18/IMP-p75との組み合わせにおいてただ４つのみの断片-4.1kbおよび2.9kb、2.6kb、1.2kb断片-を生成するが、一方同族ペアfpep3-1B+pUC18/IMP-p75は５断片-3.5kb、2.9kb、2.6kb、1.2kb、0.5kbを生成するであろう。さらに同族相互作用性ペアが選択されたことを証明するために、クローンの選択的感染性ファージ粒子形成能力を試験する。同族ペアをもつクローンだけが感染性ファージを形成できる。個々のクローンの一晩培養物からの上清を0.45ミクロンフィルター（Sartorius）でろ過する。ファージ上清10μlを対数期K91細胞（または雄性大腸菌細胞（F線毛含有）のいずれか）100μlと37℃で10分間混合する。この懸濁物をLB（30pg/mlクロラムフェニコール）プレート上にまき、37℃で一晩インキュベートする。この結果を表3.bに示す。 要約すると（図19参照）、上記実施例から得られた結果は分析した19クローン中、8/19が同族ペアfpep3-1B+pUC18/IMP-p75をもって、選択的感染性ファージを生産し；1/19はfhag1A+pUC19/IMP-HAG組み合わせをもち、選択的感染性ファージを生産することを示している。実施例５：組換えおよびタグ系を用いたスクリーニングによる多ライブラリーの単一ファージミドベクターへの組み込み5.1：原理（図20参照） パートナーの１つに融合したタグによって選択される同族タンパク質ペアに対する遺伝情報の回収を可能にするために、lox組換え促進部位を含むファージミドベクター中に２つの別個のライブラリーを構築し、それをインビボ組換えにおけるcre組換え酵素の働きによって１つのファージミド上に組換えする。5.2：ベクター構築 loxPおよびloxP511部位（Hoessら、1986）両方を縦一列にベクターpING1-C1中のCo1E1複製起点およびβラクタマーゼが両端に隣接する領域に挿入するが、ベクターpONG3-AにおいてloxP部位はXba Iの上流に、loxP511はHind III部位の下流にクローニングする。これゆえクローニングされたゲノムDNAの両端にはloxPおよびloxP511部位が隣接する。5.3：ライブラリー構築および組換え ライブラリーは実施例３に記載のとおりに調製する。二重耐性クローン中のファージミドを、誘導可能なファージミド中にコードされている（Tsurushitaら、1996）か、あるいはP1ファージの感染によって転位されてる（Rosner、1972；Waterhouseら、1993）cre組換え酵素によって組換える。ファージは組換えクローンからヘルパーファージ感染によって調製し、これを用いて新たな大腸菌細胞（cre-）を感染させる。5.4：選択 ファージ粒子をCmrクローンから調製し、実施例２および３に記載のとおりにHisタグ選択に付す。mycタグ領域（ライブラリー1）およびHisタグ領域（ライブラリー2）に特異的なプライマーを用いて配列決定することにより、両方のライブラリーのメンバーを現に含むそれぞれのファージミド中にコードされる配列を決定することができる。実施例６：別個に構築されたライブラリーを１つのファージベクターにインビトロ組換えすることによるSIPに基づくライブラリーvs．ライブラリースクリーニング6.1：原理（図21参照） インビボのSIP相互作用によって選択される同族タンパク質ペアに対する遺伝情報の回収を可能にするために、ファージおよびプラスミドベクター中の２つの別個のライブラリーを構築し、インビトロ組換えにおける共連結によって組換えする。6.2：ライブラリーAおよびBの構築 ライブラリーAは２つのメンバー、すなわちヘマグルチニンから誘導されるペプチドに対する単鎖Fv抗体（fαhag）およびjun転写因子（fjun）から誘導されるロイシンジッパードメインをコードし、両者ともＮ末端を介して繊維状ファージ由来ｇIIIのＣ末端ドメインに融合し、Flagエピトープが後に続くompAシグナル配列の後に続く。 ライブラリーBはpUC類プラスミドベクター上の３つのメンバー、すなわち上記αhag抗体が結合しているヘマグルチニンペプチド（pUC19-IMPhag）、ロイシンジッパードメインを介してjunとヘテロダイマーを形成するfos転写因子のロイシンジッパードメイン（pUC18-IMPfos）および、ライブラリーAメンバーと相互作用しないネガティブコントロールとしての低アフィニティー神経成長因子の細胞内ドメイン（pUC18-IMPp75）をコードしており、これらすべてはファージgIIIタンパク質の感染性媒介Ｎ末端ドメインに融合し、gIIIシグナル配列に後続する。 ライブラリーA挿入部位の下流にgIIIのＮ末端ドメイン（N1-N2）を含み、この後にライブラリーBメンバーのインフレーム挿入を可能とするクローニング部位BsiW IおよびHind IIIが続くfdファージベクター中へライブラリーAのメンバーをクローニングする。ライブラリーA構築物fαhagはf17/9-hag fdファージベクター（Krebberら、1995）と同一であり、fjun構築の基礎となる。junロイシンジッパーをgIIIのＣ末端部分の290から326のアミノ酸といっしよに実施例４にて構築する構築体fjun1B（gIIIのアミノ酸290から493に融合しているjunロイシンジッパーを含む）からPCR増幅（プライマーFR620およびFR621、それぞれEcoR IおよびSfi I部位含有）する。得られたPCR断片をEcoRV/SfiIで消化したf17/9-hagベクター中へgIIIC末端ドメインのアミノ酸327から493とインフレームで一定方向に連結し、結果としてベクターfjunhag（図22参照）とする。 ライブラリーB構築体pUC19IMPhagおよびpUC18-IMPp75の作成は実施例４に記載されている。pUC18-IMPfosを構築するためにgIIIのＮ末端部分のアミノ酸219から272をfosロイシンジッパーといっしょにpOK1ファージミドベクター（Grammatikoffら、1994）からPCR増幅（プライマーFR618およびFR619、それぞれBsiW IおよびHind III部位を含む）する。得られたPCR断片をBsiW I/Hind IIIで消化したpUC18-IMPp75中に一定方向に連結し、pUCl8-IMPfos（図17参照）を作成する。プライマー6.3：ライブラリーAおよびBの調製および組換えならびにSIPによる相互作用性タンパク質ペアの選択 αhag抗体のhagペプチドとの非共有結合的な同族相互作用（Krebberら、1995）ならびにfosおよびjunロイシンジッパードメインの非共有結合的同族相互作用（Grammatikoffら、1994）は感染性SIPファージを生み出す。これゆえ、モデルライブラリーAおよびBのメンバーの６つの可能な組み合わせ（fαhag-hag、fαhag-fos、fαhag-p75、fjun-fos、fjun-hag、fjun-p75）から２つの組み合わせ（同族ペアは太字）だけがインビボSIPによって選択されるはずである。すべての可能な順列におけるライブラリーメンバーの組換えのため、ライブラリーAをBsiW I/Hind IIIで消化することによって線状化し、上記の構築体BプールからBsiW I/Hind IIIで集団切断することによって調製されるライブラリーBメンバーをランダムに包含するように調製する。集団切断ライブラリーB断片をライブラリーAベクター中へ共連結した後、サンプルをコンピテント大腸菌細胞中へ形質導入し、これをクロラムフェニコール含有LBアガープレート上にまき、37℃で一晩培養する。組換えライブラリーのサイズは形質転換体の連続希釈物をプレートにまくことによって測定でき、それは個々のライブラリーAおよびBの複雑性と比較することができる。総組換えライブラリーをLB培地のプレートからかきとり、1mM IPTGを補充した適当な量のクロラムフェニコール選択LB培地に植え付ける。SIPファージを生産させるため30℃で一晩振とうを続けながら培養した後、細菌を遠心によってペレットにし、氷上で１時間20％PEG/2.5M NaCl 0.25容量を加えることによって上清中に存在するファージを沈殿させる。このファージを30分間、10,000Xgにて、4℃で遠心することによってペレットとする。このペレットを適当な容量の１×TBS緩衝液中に再懸濁し、0.45μＭフィルターを通してろ過する。このろ液を連続希釈してF+大腸菌細胞を感染させるのに用いる。標準方法によって得られた形質導入体コロニーから二本鎖の、複製形態ファージDNAを調製し、制限消化および配列決定によってライブラリーAおよびBメンバーの存在および同一性について分析する。さらに感染性SIPファージの存在について形質導入体コロニーの上清を分析し、組換えライブラリーAおよびBから選択される特定ペアのタンパク質-タンパク質相互作用がSIPファージ感染性の原因であることを確認する。 一方、モデルライブラリーA（２メンバー）およびB（３メンバー）を用いてすべての可能な組み合わせ（上記）を個々に構築し、６つの組み合わせそれぞれの等量（50ng）をコンピテント大腸菌細胞中へ共形質導入し、引き続いて上記工程を行うことができる。共形質導入後の個々の構築体の分配およびモデルライブラリーから得られる形質導入体の分配を上記のように分析することができる。同族タンパク質ペアを共コードするファージ構築体の選択回収により、適当な組換えイベント後の結合パートナーのSIPに基づく選択が実現可能であることを示す。実施例７：「空間的」インビボSIP7.1：原理（図23参照） 相互作用ペプチドまたはタンパク質のメンバーについての情報のカップリングは選択可能またはスクリーニング可能な性質をディスプレイする粒子（この実施例においてSIP実験用ファージ）および個々のライブラリーメンバーに対する遺伝情報を含むパッケージ（この実施例において大腸菌細胞が分泌するスクリーニングされるファージ粒子）間の空間的関係、すなわちマスタープレート上における試験されるファージおよび対応する大腸菌宿主の位置間の相関を有することによって達成される。7.2：２ライブラリーの混合（ライブラリーAはgIIIと融合し、一方ライブラリーBはIMPと融合する） fjun1B、fjun1A、fpep3-1B、fhag1A、fNGF1Bのそれぞれ10ngをpUC18/IMP-p75、pUC19/IMP-HAG、pUC18/IMP-IL16のそれぞれ500ngと共にDH5α細胞中ヘエレクトロポレーションによって共形質導入する。形質転換体をLB（30μg/mlクロラムフェニコール+100μg/mlアンピシリン）プレート上にまき、環境温度で一晩インキュベートする。7.3：SIPによる共形質転換体のスクリーニング 共形質転換体のマスタープレートから、それぞれの共形質転換体をラベルし、LB（30pg/mlクロラムフェニコール+100μg/mlアンピシリン）5ml中に分離して植え付け、環境温度で一晩インキュベートする。 Qiagen Miniprep DNAキットを用いてそれぞれのクローンからプラスミドおよびRF DNAを単離する。製造元によって供給され、指示されたように制限酵素Xba IおよびHind IIIを適当な緩衝液と共に用いて制限分析することによって、クローンを分析する。この制限消化は0.8％TBEアガロースゲル中、100Vの一定電圧にて１-２時間行う。制限パターンは特定クローンの識別を可能にする。 個々のクローンの一晩培養物からの上清を0.45ミクロンフィルター（Sartorius）を通してろ過する。ファージ上清10μlを対数期K91細胞（または雄性大腸菌細胞（F線毛含有））100μlと37℃で10分間混合する。この懸濁物をLB（30μg/mlクロラムフェニコール）プレート上にまき、37℃で一晩インキュベートする。 ポシティブ共形質転換体（すなわち正しい相互作用ペアを含む）は対応する正しい制限パターンを有し、２次またはそれ以降の感染できない感染性ファージを生産することができる。ポリファージ粒子はそのような感染が可能であり、また相互作用ペアの遺伝情報を含むので、これらの制限消化パターンによって容易に同定することができる。実施例８：大腸菌表示8.1：原理（図24参照） ２つのライブラリーを細胞表面に存在するライブラリーAの発現メンバー（例えば抗体、ペプチドまたはcDNAライブラリー）と共に大腸菌細胞中へ導入する。相互作用ペアが形成される場合、ライブラリーBのメンバー（例えば抗体、ペプチドまたはcDNAライブラリー）もまたその同族パートナーとの複合体において細胞表面に輸送され、これゆえタグのような選択可能またはスクリーニング可能な性質を表示する。選択される細胞は相互作用パートナー両方についての情報を含む。8.2：ライブラリーAの調製 チオレドキシンペプチドライブラリーはpFLITRXベクター中、大腸菌鞭毛への融合物として本質的に記載（Luら、1995）のように調製する。8.3：ライブラリーBの調製 FLAGエピトープを含む環状、変動可能長のペプチドライブラリー（Hoppら、に調製し、カナマイシン耐性遺伝子のかわりにクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むpto2H10a3sベクター（Krebberら、1996）の修正バージョンである、pTERMベクター中にクローニングする。このpTERMベクターはpto2H10a3sから出発する標準方法によって組み立てることができる。この環状ペプチドライブラリーは標準方法（Sambrookら、1989）によりヘルパーファージ（M13K07またはVCSM13）で感染させることによって包含させる。8.4：ライブラリーAおよびBの混合 ライブラリーAを含む大腸菌細胞をLB（100μg/mlアンピシリン）50mlに植え付け、環境温度でOD600が0.4に達するまでインキュベートする。ライブラリーBを含むファージで10多感染（MOI）によりこの細胞を感染させる。30分の感染後、細胞を遠心（5000RPM、10分間、4℃）によって集め、LB 1ml中に再懸濁する。この懸濁物をM9培地（+1mMMgCl2、0.5％グルコース、0.2％カザアミノ酸、100μg/mlアンピシリン、30μg/mlクロラムフェニコールを補充）プレート上にまく。8.5：相互作用ペアの選択 AmprCmrコロニーをM9培地（+1mM MgCl2、0.5％グルコース、0.2％カザアミノ酸、100μg/mlアンピシリン、30μg/mlクロラムフェニコールを補充）からひっかきとり、この懸濁物をM9培地（+1mM MgCl2、0.5％グルコース、0.2％カザアミノ酸、100μg/mlアンピシリン、30μg/mlクロラムフェニコールを補充）25mlに植え付け、37℃で飽和するまでインキュベートする。選択は本質的に記載（Luら、1995）のように行い、修正は選択に用いる抗体をM1抗FLAG抗体（Kodak）とすることである。 個々の豊富なAmprCmrコロニーを単離し、対応する相互作用ペプチドおよび環状ペプチドの配列をDNA配列決定によって決定する。そのコードされるペプチドおよび環状ペプチド同族ペアを形成することを確認するために、それぞれのコロニーを上記選択方法に基づく豊富さについて試験し、これにより１回の選択においてAmprCmrコロニーはM1抗FLAG抗体に結合する。文献：Baierら，1995,Nature 378,563Bannertら，1996,Nature 381,30CardosoおよびSchwarz,J.Appl.Bacteriol.72(1992)289-293CrameriおよびSuter,1993,Gene 137,69-75Geら，1995,Antibody Engineering,2nded.,229-266GeおよびRudolph,Bio Techniques 22(1997)28-29Gramatikoffら,Nucleic Acids Res.22(1994)5761-5762Hochuliら,1988,Bio/Technology6,1321-1325Hoessら,1986,Nucleic Acids Res.14,2287-2300Hoppら,1988,Bio/Technology6,1204-1210Ibanezら,1992,Cell 69,329-341Krebberら,1995,FEBS Letter 377,227-231Krebberら,1996,Gene 178,71-74Linderら,1992,Methods:A companion to Methods Enzymol.4,41-56Luら,1995,Bio/Technology 13,366-372Rosner,1972,Virology 48,679-689Sambrookら,1989,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2nded.SchmidtおよびSkerra,1994,J.Chromatogr.A 676,337-345Tsurushitaら,1996,Gene 172,59-63Waterhouseら,Nucleic Acids Res.21,2265-2266表１：実験２および３用に構築されたファージミド 表２：実験２の結果（Figure７参照）表２ａ：最初のライブラリーに存在するファージミドの組み合わせ（α）表２ｂ：選択後に存在するファージミドの組み合わせ（β） 表３：実験４の結果（Figure１９参照） 表３ａ：個々のクローンに存在するファージ／プラスミドの同定表３ｂ：個々のクローンの感染性についての試験DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTIONNovel nucleic acid sequences encoding two or more interacting (poly) peptidesIdentification method The present invention relates to two or more specific interacting peptides or proteins.It relates to a method for identifying an encoding nucleic acid sequence. Further, the present invention provides a method according to the present invention.And a kit that can be used to identify a nucleic acid sequence. Protein-protein interaction is the morphological form of an organism from gene replication and expression.Till the end of life, it plays an important role in all biological processes (Lewin, B. 1994, Genes V. Oxford University Press). Protein-protein interactionDetection methods understand the basic mechanisms of various biological processes and the development of therapeuticsHas proven to be useful. Detection of protein-protein interactionSources fall into two major categories: (i) physico-chemical based approaches and (ii)) Genetic approach (Phizicky, E. , M .; & Fields, S.M. Microbiological Reviews 59 (1995) 94-123). Usually, proteins by physical-chemical methodsDetection of quality-protein interactions requires large amounts of material, and more importantly, research.That the identity of the protein must be known.You. Although recent advances in mass spectrometry have avoided this problem, sophisticated instruments and matureWith the inconvenience of requiring kneading (Wang, R .; & Chait, B.S. T. , Current Opinion in Biotech. 5 (1994) 77-84). Genetic approaches, in contrast, are pure material andTanks with the advantages of higher throughput without the need for specialized equipmentIt enables a simple and powerful method for identifying protein-protein interactions. Various genetic approaches have been used to identify protein-protein interactionsI have been. One method currently in use is the yeast two-hybrid system (Fields, S. & Song, O. K. , Nature (London) 340, (1989) 245-246).Can identify new proteins that interact with known proteins. Another common genetic approach is the phage display system (particularlyApplication WO90 / 02809), which converts proteins into surface proteins of filamentous phage.Fusion to the protein component to select for binding to the ligand of interest.And enable. Coat proteins displayed on the phage surface.The gene to be encoded is contained within the phage, and the genetic information is coupled to the gene product.Is This allows screening of “library” proteins.The identity of the screened protein from the nucleic acid sequence of the phagebe able to. This technology has been extended by Winter et al. (Patent application WO92 / 20791).Multimeric members of a specific binding pair (eg, a combination of VH and VL chains of an antibody)A library that can bind to complementary specific binding pair membersEffective specific binding pair members (eg, antigens) were selected. This libraryIndicates that each encodes the corresponding subunit population of the multimeric member.Combine two sub-libraries (for example, a library of VH chains), But in principle, the first subEach subunit from the library is that from the second sublibrary.It can bind nonspecifically to each subunit. This wayAlthough only one antibody to a more specific antigen can be identified,If the two partners of a combined pair are both unknown, a method to identify them is provided.I can't offer it. Recently, a unique version of the phage display method that relies on uninfected phageHas been proposed (Duenas, M .; & Borrebaeck, C.A. A. K. , Bio / Technology 12 (1994) 999-1002; EP 0 614989). cDNA library interacting with jun proteinVersion of this system has been described that can identify proteins from L.(Gramatikoff et al., Nucleic. Acids Res. 22 (1994) 5761-5762). Also the same fieldHave also been shown to act on the antibody-antigen system (Krebber et al., FEBS Lett.ers 377 (1995) 227-231). All of the aforementioned gene selection approaches are powerful, but they are genetically differentLimited to selecting interacting binding substances from only a single population (Library vs. individual). However, the library vs. In the library setting,And their specific binding partners are simultaneously identified, preferably at least twoIdentification methods involving genetically distinct populations are highly desirable. The prior literature describes this technologyA solution to a genetic problem, ie, two or more genetically distinct populations (librariesvs. Library) to identify interacting substances and their respective nucleic acid sequencesIt does not mention or suggest this. The present invention addresses the above technical problems with the appended claims.The problem is solved by providing the aspects that are claimed. These states(Poly) peptide- (poly) peptide interaction is detected by usingExponentially increased the rate at which they were added. The present invention relates to the field of functional genomeIn this way, various applications have been found, and various proteins with unknown functions have been identified.Proteins. That is, the present invention provides a collection of nucleic acid sequences, each of whichAt least one additional member encoded by another member in the acid sequence assemblyIt encodes a (poly) peptide that can interact with the (poly) peptideA method for identifying the nucleic acid sequence assembly, comprising the steps of: (a) Genetically distinct nuclei consisting of various nucleic acid sequences encoding (poly) peptidesObtaining a first library of recombinant vector molecules comprising an acid sequence; (b) capable of interacting with a further (poly) peptide according to step (a) (Genetically different nucleic acid sequences consisting of various nucleic acid sequences encoding poly) peptidesTo obtain a second library of recombinant vector molecules containing the recombinant vector-Vector molecules used for the production of molecules and / or recombinant inserts are used in step (a)Phenotypically distinguishable from certain vector molecules and / or recombinant insertsAnd the respective vector molecules and / or sets used in steps (a) and (b)The at least one property displayed by the replacement insert is the first library-Derived (poly) peptide and the (poly) peptide derived from the second libraryWhen interacting together they generate a screenable or selectable property); (c) If necessary, the further (poly) paper described in steps (a) and / or (b)Can interact with or cause the peptide (s)Genetically different nucleic acid sequences consisting of different nucleic acid sequences encoding (poly) peptidesTo obtain an additional library of recombinant vector molecules containingThe vector molecule and / or the vector molecule used to produce the recombinant insert is) And (b) used to distinguish phenotypes from vector molecules and / or recombinant inserts.The vector molecule and / or the vector molecule used in step (c).Or at least one such property exhibited by the recombinant insert,And / or the recombinant insert used in (b).The additional label with at least one of the properties indicated by theA (poly) peptide from the library and a (poly) peptide from the first libraryAnd / or any of the (poly) peptides from the second library.Generate screenable or selectable properties when interactingCan be done); (d) the recombinant vector or nucleic acid sequence of steps (a), (b) and optionally (c)Establishing at least one interaction between library members in a suitable host cellExpressed so that (e) screenable or selectable representing the interaction of the (poly) peptideSelecting for the occurrence of a functional property; (f) optionally, performing further selection, screening and / or purification steps;And (g) identifying the nucleic acid sequence encoding the (poly) peptideTo a method characterized by the following. Therefore, in this specification, the term "phenotypically distinguishable property" refers to a vector molecule.Properties encoded by the recombinant insert or properties encoded by the recombinant insert orFor either type of property. Regarding properties encoded in vectorsThese may be, for example, resistance markers or auxotrophy requirements. RecombinationThe input contains a nucleic acid moiety that encodes the property in addition to the nucleic acid moiety that contributes to the interaction.It should be noted that As used herein, the term "another member", although not necessarily, has the structureDifferences can be quite different. Further, in the text of the present invention, the term “aggregate” means “at least two”.Has a taste. The novel properties generated by at least two recombinant insertsIt reflects the principle. That is, two (or more) (poly) peptidesFor example, only when interacting in homo- or hetero-dimer form.A tunable or selectable property is created. Phase between two or more moleculesThe interaction may be a direct interaction or may be mediated indirectly. directAn example of an interaction is the interaction between the antibody encoded by the nucleic acid sequence from Library 1 and the antibody.Binding to cDNA protein from library 2, nucleic acid sequence from cDNA library 1Between the protein encoded by the sequence and the protein from cDNA library 2Binding and anti-idio encoded by nucleic acid sequences from one libraryType antibodies and the corresponding ones encoded by nucleic acid sequences from the other libraryBinding to an antibody. The nucleic acid sequence is preferably DNA, most preferably a geneOr part of it. Examples of indirect interactions are two (poly) encoded by two libraries.2.) Cross-linking of the peptide mediated by a kinase. Library(Poly) peptide encoded by -1 is released by each kinaseWhen oxidized, this protein becomes the second protein encoded by library 2.Can interact with (poly) peptides. Phosphorus is a good example of this type of interactionOxidase is encoded by nucleic acids from one of the additional (additional) libraries.And / or encoded by the genome of the host cellMay be. Usually, the interaction of two (poly) peptides forms a "crosslink" of the moleculeHowever, this "crosslink" can be detected using an appropriate detection method. This bridge is liveConjugated to one of the polypeptides encoded by rally 1 or preferably 2Or it can be easily detected by the tag molecule encoded and bound by it.You. Further, the present invention provides a collection of nucleic acid sequences, wherein each of the nucleic acid sequences is a nucleic acid sequence.At least one additional (port) coded by another member in the sequence aggregateLi) encoding a (poly) peptide capable of interacting with the peptide;A method for identifying a set of nucleic acid sequences, comprising: (a) In a suitable host cell, establish at least one interaction with:To be expressed; (aa) a genetically distinct nucleus consisting of various nucleic acid sequences encoding (poly) peptides;A nucleic acid sequence contained in a first library of recombinant vector molecules comprising an acid sequence; (ab) able to interact with further (poly) peptides according to step (aa)Genetically different nucleic acid sequences consisting of various nucleic acid sequences encoding (poly) peptidesNucleic acid sequences contained in a second library of recombinant vector molecules comprisingThe vector molecule used to produce the recombinant vector molecule and / or the recombinant insert is engineered.Phenotypically distinguishable from the vector molecule and / or recombinant insert used in step (aa)And the respective vector molecules used in steps (aa) and (ab).And / or at least one of the properties displayed by the recombinant insert may be(Poly) peptide from one library and (Poly) from the second libraryWhen interacting with a peptide, it emits a screenable or selectable property.Live); (ac) optionally, further (poly) peptides as described in steps (aa) and / or (ab)Can interact with or cause the interaction (group)G) contains genetically distinct nucleic acid sequences consisting of various nucleic acid sequences encoding the peptide.Nucleic acid sequences contained in an additional library of recombinant vector moleculesThe vector molecule used to produce the recombinant vector molecule and / or the recombinant insert isVector molecules and / or recombinant inserts and phenotypes used in steps (aa) and (ab)Indicate the properties that can be distinguished from each other, and optionally, the vector molecule and the vector molecule used in step (ac).And / or at least one of the properties displayed by the recombinant insert may bethe vector molecule and / or the recombinant insert used in (aa) and / or (ab)At least one such property indicated by any of the inputsTogether with the (poly) peptide from the additional library and the first liveRally and / or (poly) peptides from the second library.I) Screenable or selectable when interacting with any of the peptidesProperties can occur); (b) the screenable or selection showing the interaction of the (poly) peptide.Selecting for the occurrence of an optional property; (c) optionally, performing further screening, selection and / or purification steps;And (d) identifying the nucleic acid sequence encoding the (poly) peptideA method characterized by the following. In a preferred embodiment of the method of the present invention, the screenable or selectiveSelective properties are expressed extracellularly. This embodiment uses conventional methods for extracellular detection of the above properties, such as screeniniColumn chromatography with a tag that can beConveniently used by many laboratories that may be using it with the recipe,For example, cells that initially produced increased by this column chromatography processCan be further purified. In a further preferred embodiment of the method of the present invention, step (a) / (aa) (slashThe steps specified later mean the corresponding steps of the above-described second embodiment of the method of the present invention)The recombinant vector molecule is a replicable genetic package displaying the (poly) peptide on its surface.Create a cage (RGP). As used herein, the term "replicable genetic package"(RGP) is a virus or a virus that can replicate after infecting a suitable host cell.It means something like bacteriophage. For example, for bacteriophageCan be used to transfer a population of nucleic acid sequences into phage or phagemid vectors.Can be inserted in the open reading frame with the outer shell component of, for example, gene III, so that the codingThe binding substance to be displayed is displayed on the surface of the phage. Especially as a recombinant vector moleculePreferred are recombinant phages, phagemids or viruses;The most preferred are: (a) any of class I phage fd, M13, If, Ike, ZJ / 2, Ff; (b) any of class II phage Xf, Pf1 and Pf3; (c) λ phage group, lambda, 434, any of P1; (d) an enveloped phage group, one of the classes of PRD1; or (e) Paramyxovirus group, Osomyovirus group, Baculovirus group, LetoOne of the rovirus, reovirus, and alphavirus classes. In a further preferred embodiment of the method of the present invention, the selection steps (e) / (b)This is done by selecting polyphages containing the active (poly) peptide. PolyphageContains more than one copy of phage genomic DNA. Newly generated phageThese are low to moderate in frequency when the shell encases two or more single-stranded DNA molecules.Naturally present in degrees. In the case of the present invention, the polyphage produced is at leastContains two phage genomes, which (i) both represent library 1, Or (ii) both represent library 2, or (iii)Representing library 1 and library 2 or (iv) additional librariesCombining at least one member from any of the above with (i) to (iii)Or one of: As is well known to those skilled in the art (eg, Lopez, J. et al. And Webster, R. E. , Virorlogy 127 (1983), 177-193, Bauer, M .; And Smith, G. P. , Virology 167 (1988) 166-175, or Gailus, V. et al. Res. Microbiol. 145 (1994) 699-709), and polyphage production efficiency depends on the phage genome.It can be increased by introducing appropriate mutations. In a further preferred embodiment of the method of the present invention, a screenable or selectableThe ability to work is linked to the infectivity of the RGP. In this embodiment, for example, take advantage of the possibility of manipulating the infectivity of bacteriophagesAnd directly correlate the infectivity with the interaction of the (poly) peptide. In a most preferred embodiment of the method of the present invention, the RGP is the recombinant used in step (a) / (aa).Vector, is non-infectious, and is infectiousIs the step (b) / (ab) and / or step fused to a domain that imparts infectivity to RGP(c) / (ac) (poly) peptide and step (a) / (aa) (poly) peptideRecovers by interaction with tide. In a further most preferred embodiment of the method of the present invention, the RGP binds to the host cell andModification of the gene encoding the surface protein necessary forMake it non-infectious. These preferred and most preferred embodiments of the method of the invention with respect to the infectivity of RGPThe embodiment is used as another application of the screening tag. In these embodiments,Advantages can be found in the phenomenon of selective infection (Krebbsr et al., FEBS Letters 377(1995) 227-239). Screening tags identify that molecule from other molecules in the assembly., While using selective infection to make interacting pairs possible.Enables you to make aggressive choices. This phenomenon, for example,Sensitive to phage rendered non-infectious by deleting everything but the C-terminusBased on the use of constructs that can selectively restoreYou. Utilizing such a phage to display library 1, a binding agentIs obtained. To co-express with library 2Thus, the interaction between the binding substance and the binding partner is established as described above.Phage bearing the binding agent-binding partner pair are non-infectious,Infectivity is restored by using an infectious protein instead of a screening tag. As used herein, the term "infectious protein" when bound to phage,Substances that allow the phage to enter the bacterial host, where it subsequently replicatesMeans An example of an infectious protein is the filamentous bacteriophage gene III proteinN-terminus of the protein (at least the first 220 amino acids). Infectious proteins confer replication capacity on the phage carrying them. thisTherefore, only the phage carrying the binding agent / partner pair will replicate. livePurification of hybrid phage containing genes from both rally 1 and 2It depends on the use of the above two selection markers. The gene in this phage isIt can be identified using methodology well known to those skilled in the art. In a further preferred embodiment of the present invention, the recombinant vector molecule of step (a) / (aa) is a cell,More preferably, it relates to a method for producing a fusion protein expressed on the surface of a bacterium. These fusion proteins are, for example, libraries linked with a screening tag.Interacts with a suitable binding partner derived from bacteria, yeast, insect cells, etc.Can be detected on the surface of host cells, which can be cells or mammalian cells.You. The representation of the fusion protein on the bacterial surface itself is well known in the art. SandLipoprotein (Lpp), outer membrane protein A (OmpA) and flagella are E. coli cellsIt has been used to target antibodies and peptides to the surface. Fuchs et al., Bio / Technology 9 (1991) 1369-1372 and WO93 / 01287 disclose a single-chain antibody on the surface of E. coli.It was displayed as a fusion protein with the peptide glycan-related lipoprotein. thisAntibodies are directed to the fluorescently labeled antigen and linker peptide of the indicated single-chain antibody.Visualized by binding of the corresponding fluorescently labeled antibody. Francisco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 10444-10448 and Georgiu, G .; Et al., WO93 / 10214 fuses the N-terminus of the single-chain antibody to the C-terminus of OmpA, while the N-terminus of OmpAFusion with the first 9 amino acids of Lpp and the LppThe antibody is displayed. Binding of fluorescently labeled antigen to OmpA-antibody fusion proteinWas detected by FACS. Klauser (WO 95/17509) uses the IgA protease systemWere transferred from Neisseria gonorrhoeae to E. coli and the antibodies were displayed. IgA protease precursor betaBy incorporating the domain into the outer membrane, the protease domain can be transported across the membrane.Transport followed by autoproteolytic release into the medium. Therefore the IgA proteinAntibodies linked to the beta domain of thease are displayed on the bacterial surface. Further, Lu, Z. Et al., Bio / Technology 13 (1994) 366-371 disclose thioredoxin and peptides.Of an epitope for an anti-IL-8 antibody by fusing it with bacterial flagellaScreening system for a peptide mimetic.Is described. The desired nucleic acid molecule encoding the interacting (poly) peptide is then further homologated.Can be determined by methods known in the art, such as purification and purification of host cells displaying a tag on the surface.And even antibiotic-based selection techniques, DNA purification andThis can be achieved by sequencing. In a particularly preferred embodiment of the method of the present invention, said bacterium is Neisseria gonorrhoeae or E. coli,The fusion protein is at least flagella, lamB, peptidoglycan-related lipoprotein.Or a portion of the OmpA protein and the (poly) peptide. As pointed out repeatedly in the above part of this specification, library 2The tag linked to the (poly) peptide to be used can be used in a strategy for identifying a desired nucleic acid sequence.Can be. Therefore, in a further preferred embodiment of the method of the invention, steps (b) / (ab)Or the (poly) peptide encoded by the (c) / (ac) recombinant vector moleculeLink to at least one screening or selection tag. In this specification, The term “screening or selection tag” means that a specific substance recognizes and bindsMeans a short amino acid sequence. Tags are commonly used for biomolecule purification.Examples are Nis or His (n) to which specific antibodies can bind [where n = 4-6And the flag and myc tags recognized by the appropriate antibody. ThisIn each of these cases, the tag is a C-terminal with all binding partners in library 2.It can be coded as an end fusion. In the present invention, the tag is, for example, the polyphage described above.Can be used for isolation. Therefore, binding substances and phage bindingInteractions between phage particles and screensEstablish a connection between the learning and selection tags. This feature preserves interacting molecules.To isolate polyphages containing, for example, affinity chromatographyUsed in the process by In the final step, two different nucleic acid molecules, preferablyOr genes (genes encoding binding substances and binding partners)Polyphages were converted from polyphages carrying only one of these two genes.Different selectable markers present in the transduction or individual genomes (eg, antibiotic resistance)Gender). In this way, two mutualThe gene encoding the acting molecule can be identified. In a most preferred embodiment of the present invention, the screening or selection tag comprises the step (b) /It relates to the method encoded by the recombinant vector (ab) or (c) / (ac). In a further most preferred embodiment of the present invention, the screening or selection tag is His (n), Myc, FLAG, malE, thioredoxin, GST, streptavidin, beta-Galactosidase, alkaline phosphatase T7gene10, Strep-Dag and mosquitoA method selected from a list of lumodulin. These screenersAre well known in the art and are fully available to those skilled in the art. In a further particularly preferred embodiment of the method of the invention, said screening and selectionThe tag is encoded by the host cell genome. An example of this embodiment depends on the host cell.Expressed by another cross-link in purification by column chromatography, for example.Anti-Fc receptor-specific antibody that can function as Another example of this embodiment is a hostAn enzyme that is produced by a cell and that the modification caused by this enzyme(Poly) paper of steps (b) / (ab) and (a) / (aa), such asPhosphates of (poly) peptides of the second library that do not disrupt peptide interactionsIt is an enzyme that generates a tag such as an enzyme. In a further preferred embodiment of the method of the invention, the additional library of step (c) / (ac) isStep (a) / (aa) and (b) / (ab) the (poly) peptide encoded by the nucleic acid sequencePhosphorylation, glycosylation, methylation, lipidation of at least one (poly) peptide of(A) / (aa) and (b) / (ab)Causes the interaction of the tide. In a further preferred embodiment of the present invention, the host cells of step (d) / (a) are spatially addressable.The nucleic acid sequence described in step (g) / (a) corresponds to the spatially addressable host cell.A method that can be recovered from cells. In the context of the present invention, the term "spatial addressable" refers to first, second and optionalIndividual cells carrying one of the potential combinations of additional library membersAre identified by their relative position, for example by their position on the parent plateIt means a situation that can be done. For example, screening and selection are derived from the parent plate.Single colony or a single colony on a replica plateAnd screened or selectable properties and accommodations on the parent plateThe link between the information contained in the main cells can be maintained. A further preferred aspect of the present invention is the screenable or selectable property.Is expressed in a cell. Particularly preferred are beta-galactosidase whose screenable properties are:Nutrition markers such as alkaline phosphatase or his3 and leu or enPicilin, chloramphenicol, kanamycin, zeocin, neomycin, teConfer resistance to antibiotics such as tracycline or streptomycinTransactivation of reporter gene transcription such as resistance gene. Furthermore, the yeast two-hybrid system mentioned in the present specification orInteraction trap system (Brent et al., EP-A0672 131) or Vibrio cholera tA prokaryotic version system similar to the above cited system using the oxR system(Fritz, H. -J. EP-A 0 630 968) can be used. In addition, switches known in the artCombining a cleaning system with the method of the present invention is within the skill of the artisan.Is within. In a further preferred method of the present invention, the steps (a) / (aa), (b) / (ab) and (c) / (ac)The recombination vector contains a recombination promoting site, and in steps (e) / (b), a recombination event is selected.Here, a nucleic acid sequence encoding the (poly) peptide of step (a) / (aa), step (b)) / (ab) the nucleic acid sequence encoding the (poly) peptide and (c) / (ac)The nucleic acid sequence encoding the poly) peptide is contained in this same vector. ThisIn the approach, the appropriate recombination sites were placed in the vectors carrying libraries 1 and 2.When integrating a position, the two genes are coupled in a single vector., Can be packaged in standard size phage. Both nucleic acid sequencesThe phage carrying the sequence and the gene can be re-usedIt can be purified. Utilizing recombination to capture genes from two librariesWhen coupled, site-specific recombination is not very efficientHybrid progeny phage may contain a non-recombinant genome. But highBridphage was used to re-infect host cells without Library 2, followed by anotherDepending on the degree of screening tag can be selected. In a particularly preferred embodiment of the method of the invention, said recombination event is site-specific recombination.It is mediated by Cre-lox, attP-attB, Mugin or yeast flp. In a particularly preferred embodiment of the method of the present invention, the recombination promoting site is a restriction enzyme recognition site.And the recombination events are steps (a) / (aa), (b) / (ab) and optionally (c) / (ac)Cleavage of at least two different restriction enzymes of the recombinant vector molecule described inAnd by recombination by ligation of nucleic acid sequences contained in the vector. As another preferred embodiment of the present invention, the nucleic acid sequence after the selection step (e) / (b) by PCRIdentification of the nucleic acid sequence, and preferably sequencing of the nucleic acid sequence after the PCR.About the law. After the selection step (e) / (b), PCR is conveniently performed on the vector of the recombinant vector molecule.With primers that hybridize to theI can. Subsequently, sequencing of the PCR product can be performed by a conventional method. In a further preferred embodiment of the method according to the invention, steps (a) / (aa), (b) / (ab) andAnd / or (c) / (ac) recombinant vector comprises at least oneContains two genes. The gene encoding the selectable marker can be obtained in steps (a) / (aa), (b) / (ab) and / orAre different in each of (c) / (ac), i.e. the vectorIt preferably comprises a gene encoding a selectable marker. The selection marker is convenientIt can be used for further purification which is also envisaged in step (f) / (c). An exampleFor example, a polyphage containing two members of each of libraries 1 and 2, Based on double resistance to antibiotics. Also successful pairThe recombination events are both nucleic acid molecules from libraries 1 and 2 and different selectionsThis creates a new recombinant vector carrying the gene encoding the marker. Again, twoHeavy tolerance selection will help identify the desired product. In a particularly preferred embodiment of the method, the selectable marker is an antibiotic, preferablyOr ampicillin, chloramphenicol, kanamycin, zeocin, neomaResistance to isin, tetracycline or streptomycin. In a further preferred embodiment of the present invention, the host cell is F 'and preferably E. coli XL-1 blue., K91 or a derivative thereof, TG1, XL1kan or TOP10F. In a particularly preferred embodiment of the invention, the RGP is R408, M13k07 and VCSM13, MHell selected from the list of 13de13, fCA55 and fKN16 or derivatives thereofProduced using perphage. Even more preferred is at least one said genetically distinct nucleic acid in the methodIn such a way that the sequence encodes a member of the immunoglobulin superfamilyis there. The method is characterized in that the genetically distinct nucleic acid sequence is a heavy or light immunoglobulin chain.Particular preference is given to those encoding a partry. In another preferred embodiment of the invention, the genetically distinct nucleic acid in the methodThe sequence is produced by a mutation method. Various mutation methods are well known to those skilled in the art,Further details need not be described herein. In another preferred embodiment, the present invention provides a method for producing a genetically distinct nucleic acid, comprising the steps of:A method wherein the sequence is produced from a cDNA library. In a final preferred embodiment of the method of the invention, the nucleic acid sequence is a gene or its gene.Part of. As used herein, the term "part thereof" is used by other libraries.Gene encoding a product that can interact with several productsAbout some. It is well known that various proteins are composed of different domains.is there. Where only one of the domains can interact with a different (poly) peptideThere is a case. According to the present invention, such domains are encoded by a portion of the gene.Could be. The invention also relates to a gene encoding two or more interacting peptides or proteins.Provides identification of offspring. This is another genetically differentThis can be done by using another vector encoding a nucleic acid. The aboveAs such, using the presence of either a screening tag or an infectious protein,Phage carrying the genes encoding the components of the complex are purified. Then reAnd the sequence of this gene in the phage can be determined by methodology well known to those skilled in the art.Can be. In addition, the present invention(a) the recombinant vector molecule or the corresponding vector molecule according to step (a) / (aa);(b) a recombinant vector molecule according to step (b) / (ab) or a corresponding vector molecule;And optionally(c) at least one additional recombinant vector molecule according to step (c) / (ac) orCorresponding vector moleculeA kit comprising Generally, when a recombinant vector molecule is included in the kit, it willIncludes library. In other words, the kit of the present invention can be used for various recombinant vector components.Contains a collection of children.Description of figures and tablesFigure 1: Overview of polyphage principleFigure 2: Cotransduction of two phagemids, polyphage formation and by His-tagChoice: An OverviewA, B: libraries of phagemids, preferably with different resistance markers;A: fusion to gIIIp; B: fusion to tag (His); display cognate pair after co-transductionPhage production leading to phage assembly (left) or not displayed (right)After selective infection of host cells, selection by double resistanceAlternatively, carrying a library B based on a plasmid or phagemidInfect cells with phage library A (requirement: suppression-resistant construct).Figure 3: pBS vector group: functional map and sequence of pBS13Figure 4: Co-presence of phagemid: results of restriction digestionRestriction analysis of double resistant (Amp / Cm) clones. R1: pIG10. 3, Xba / ScaI; R2: pBS13, Xba / ScaI; R1 + R2: mixing R1 and R2 in approximately equal proportions; M1: marker λ: BstEII; M2: marker pBR322: MspI; 1 to 10: randomly picked upClone: Xba / ScaIFigure 5: Phagemid vector pYING1-C1: Functional mapContains fos peptide. The corresponding vectors pYING1-C2 and pYING1-C3 replace fosIncludes p75 and IL16 peptides, respectively.Figure 6: Phagemid vector pYANG3-A: functional mapContains jun peptide. The corresponding vectors pYANG3-Ape2, pYANG3-Ape3 and pYANG3-Ape10 contains the p75 binding peptides pe2, pe3 and pe10, respectively, instead of jun.Figure 7: Analysis of selected clones (see Table 2):7. a: Restriction digestion of clones before and after selectionR: pYANG3-Ape2: XbaI; M1: marker λ: BstEII; M2: marker pBR322: MspI; α / 1 to 10: clones randomly picked before selection: XbaI / HindIII; β / 1 to 10: clones randomly picked after selection: XbaI / HindIII; expected size: jun-gIII: 745 bp; fos: 256 bp; p75: 577 bp; IL-16: 502 bp7. b: PCR reaction using primers OPEP5L and OGIII3 of the clone after selectionR1: pYANG3-A as template; R2: pYANG3-Ape2 as template; M: marker λ:BstEII; β / 1 to 10: Claw as a template randomly picked after selectionInFigure 8: Phagemid vector pING1-C1: Functional mapContains His tag peptide. The corresponding vector pING3-C1 also contains the FLAG epitopeOnly; pING1-C2 and pING3-C2 contain a Strep tag instead of a His tag,pING3-C2 further contains a FLAG epitope.Figure 9: Phagemid vector pONG3-A: functional mapFor construction of phage display library (gIII fusion)Figure 10: For phage and plasmid co-transduction, polyphage formation and SIPChoices: OverviewfA: Library A in phage construct; B: Library B, fused with IMPLibrary members; preferably differently resistant on phage and plasmidSex markers; phage production after co-transduction; sensitivity in the case of cognate pair interactionsFormation of infectious phages; selection; polyphages by plating on double resistant platesParticle identification.Figure 11: Phage vector fhag1A: Functional mapFor phage display of α-HAG scFvFigure 11a: CAT gene module: functional map and sequenceFigure 12: Phage vector fjun1A: Functional mapFor phage display of jun peptidesFigure 13: Phage vector fjun1B: Functional mapFor phage display of jun peptidesFigure 14: Phage vector fpep3-IB: Functional mapFor phage display of peptide pe3 binding to the intracellular domain of p75Figure 15: Phage vector fNGF-1B: Function mapFor phage display of NGFFigure 16: Plasmid pUC19 / IMPhag: functional mapIncludes fusion of HAG peptide to N-terminal domain of gIIIP (IMP)Figure 17: Plasmid pUC18 / IMPp75: Functional mapincluding a fusion of the p75 intracellular domain to the N-terminal domain of gIIIP (IMP);pUC18 / IMPfos contains the fos peptide instead of the p75 intracellular domain.Figure 18: Plasmid pUC18 / IMPIL16: Functional mapIncludes fusion of IL16 to N-terminal domain of gIIIP (IMP)Figure 19: Analysis of selected clones (see Table 3)Lane 1: marker λ: BstEII; lanes 2 to 20: Xba / HindIII digested polyPhage transductant clones # 1 to # 19; f ..-lb: Phage vector after digestionFragment; pUC18: plasmid fragment after digestion; α-HAG: anti-HAG sc fused to gIIIcFv-containing fragments; IMP-p75 and IMP-HAG: IMP fused to p75, respectively, andFragment containing IMP-HAG peptide; PeP3-gIIIs: Fragment containing pep3 fused to gIIIC(S: short)Figure 20: Phagemid co-transduction, in vivo recombination and selection with His tag:OverviewA, B: phagemid library; preferably with different resistance markers; A: gFusion to IIIp; B: fusion to tag (His); recombination facilitator such as lox / loxPRank (*); Phage production after co-transduction and recombination; by Ni-NTASelection; reinfection of host cells, selection by double resistanceFigure 21: In vitro recombination and selection by His tag: an overviewA, B: library of phagemids; preferably with different resistance markers;A: fusion to gIIIp; B: fusion to tag (His); corresponding to restriction enzyme (+ / o)Both constructs containing recognition sites; transduction and digestion and digestion and co-ligationProduction; selection by Ni-NTA; reinfection of host cells, selection by double resistanceFigure 22: Phage vector fjunhag: Functional site for phage display of jun peptidesFigureFigure 23: Spatial in vivo SIP: an overviewAfter transduction or co-transduction according to any of the above methods, the master plate iscreate. Thus, phage secreted from individual clones can be analyzed individually.(Top) or replica (movement of secreted phage through filter disc)The above can be made to allow for the selection of the presence or infectivity of the tag. troutReturn to the target plate for recombination and / or polyphage production.The information of the selected cognate interaction pair can be recovered without need.Figure 24: E. coli display: overviewA, B: library of phagemids; preferably with different resistance markers;A: fusion to E. coli surface display protein; B: fusion to tag (His)Expression of the construct after co-transduction; surface display; where cognate interactions occurDisplay of host cell surface tags in the context of selectionFigure 25: pTERMsc2H10myc3sCAM: functional map and sequenceTable 1: Phagemids constructed for experiments 2 and 3Table 2: Results of Experiment 2 (see FIG. 7)2.a: Combination of phagemids present in the first library (α)2.b: Combination of phagemids present after selection (β)Table 3: Results of Experiment 4 (see FIG. 19)3.a: Identification of phage / plasmid present in individual clones3.b: Testing individual clones for infectivity The following examples illustrate the invention.Example 1: Overview of the principle of polyphage (FIG. 1) The binding substance constituting library 1 may be a peptide or a protein.And is encoded by a population of genetically distinct first nucleic acid sequences. Replicable inheritanceIn a first vector that displays this coded binding substance on the surface of a static packageInsert these nucleic acid sequences into For subsequent selections, the first vector is an antibioticGenes encoding selectable markers, such as quality resistance, should also be carried. liveThe binding partner making up Rally 2 may be a peptide or a protein,Encoded by a population of genetically distinct second nucleic acid sequences inserted into the second vector.Can be By way of example, this second vector may be a plasmid orOr a phagemid, in which case the origin of replication is that of the first vector.Should be different from For subsequent selection, the second vector is an antibioticA gene encoding a selectable marker such as resistance, preferably a firstShould also have something different than what exists in the industry. Binding substanceLibrary to facilitate purification of the complex formed between the partner pairsIt may be convenient to link the screening tag to the two members. The two genetically distinct nucleic acid populations are then combined with the encoded library 1 and2 is introduced into a host cell population so that it can be expressed. This is (i) two vectorsCo-transduce, ie, as shown in the figure, or (ii)It can be used to infect a cell population into which a nucleic acid population has been introduced with high efficiency.Packaging one of the nucleic acid populations into a vector (eg, a bacteriophage).To achieve this. As a result, individualEach cell becomes a cell population that carries a representative of the respective library. When two populations of nucleic acids are expressed, each is derived from the respective library.A pair of child molecules is produced. In each case the binding substance libraryOne or more members of Lee are packaged in the outer shell of the RGP.In some cells, RGP surface binding partners and library 2An interaction will be established between the binding partners expressed from them. Therefore theWhen such an interaction is established, RGP can be used as both a binding substance and a binding partner.Hold. The polyphages and various selectable markers were then used as described herein above.RGPs displaying such interactions can be further purified. Like thatAfter successful selection, the nucleic acid sequence encoding one or both binding partners is DNA sequenced.Can be conveniently identified by methodology known in the art, such asExample 2: Co-transduction of phagemid with same E. coli origin of replication, polyphageThe right pairing interaction by pairing and His tags2.1: Principle (see Fig. 2) Tags fused to one member of a protein pair by polyphage formationIndicates that the genetic information of a cognate protein pair selected using ssh can be recoveredTo do this, two separate small libraries are constructed in a phagemid vector.2.2: Co-transduction test of phagemids having the same origin of replication in E. coli The conditions required for polyphage particle formation containing two different phagemids are different.Phagemid vectors can coexist in host cells. Vector pBS13 is chloramphenicol resistant instead of kanamycin resistant geneΒ-lactamase gene cassette in place of the sex gene and 2H10-gIII fusion geneA derivative of the vector (Krebber et al., 1996), starting from pto2H10a3sCan be assembled by a standard method. Figure 3 contains a functional map and the pBS13 sequence.No. pIGHAG1A (see Example 4.2.1.f) is digestible by XbaI and HindIII.is there. Anti-HAG fragment fusing the C-terminal domain of filamentous phage pIII proteinThis 1.3 kb fragment containing the gene was isolated and the previously digested phagemid vectorLigated with pIG10.3 and pBS13 (XbaI-HindIII)pIG10.3-scFv (anti-HAG) (ApR) And pBS13-scFv (anti-HAG) (CmRBuild).Using this vector, competent XL-1 blue cells can be transformed and used for Amp / Cm / TetOn LB plates containing glucose and glucose (20 mM). Phagemids from clones of double resistant colonies (Amp / Cm) are isolated. RestrictionDigestion shows that both phagemids were co-isolated from a single colony (Fig.Four).2.3: Design of libraries A and B Library A has low affinity nerve growth factor (NGF) receptor (Three cyclic peptides bound to the intracellular domain of Example 4) and jun transcriptionContains factor-derived leucine zipper domains, all derived from filamentous phageIt is fused to the C-terminus of gIII via its N-terminus. Library B forms heterodimer with jun via leucine zipper domainCells forming leucine zipper domain of fos transcription factor, NGF receptor p75Negative domain that does not interact with the internal domain and library A membersCodes three members of IL-16 as trolls, all of which are tagsHis6Fused to the peptide at its N-terminus (Hochuli et al., 1988; Lindner et al.,1992). Cognate pairing was performed by jun and fos (Crameri and Suter, 1993) and p75 andAnd selected cyclic peptides (see Example 4). Non-kind familyA formation is between the described non-cognate pairs and one of the jun or cyclic peptides and IL-16Will happen in between.2.4: PCR amplification of individual constructs Using pOKl (Gramatikoff et al., 1994) as a template, OFOS-5 and OFOS-3 as primersAnd the N-terminal is His6Was amplified by PCR. Here his6Is OFEncoded in the OS-5 primer. Using pOK1 as a template, oligonucleotide OJUNJun was PCR amplified using -5 and OJUN-3 as primers:Use the hot start method. Apply step-by-step touchdown PCR: 92 ° C, 1 minute58-52 ° C, ΔT = 2 ° C, 1 minute; 72 ° C, 1 minute. This is followed by 26 cycles (92 ° C,1 minute; 52 ° C., 1 minute; 72 ° C., 1 minute). The PCR product was purified using the QIAquick kit (Qiagen) and ddHTwoElute in O.They are then digested overnight with EcoRI and EcoRV. Using pUC18-IMPp75 (see Example 4) as a template, oligonucleotide OP75-5(His here6Is encoded) and p75 using OP75-3 as a primerPCR amplify the fragment:Apply the same PCR and restriction digest conditions as above. OIL16-5 (His here6Is coded) and OIL16-3 as primerPcDNA3-ILHu1 (M. Baier, Paul EhrlichInstitute, Germany; Baier et al., 1995; Bannert et al., 1996) to amplify an IL-16 fragment.RU:Apply the same PCR and restriction digest conditions as above. In all cases, these fragments are easily amplified and digested.2.5: Cloning into intermediate vector The digested PCR fragment is gel purified (QIAquick kit, Qiagen) and dissolved in TE buffer.Let out. The EcoRV / EcoRI fragment of the pIG1 vector (Ge et al., 1995) is also isolated. fos, P75 and the IL-16 digested PCR fragment were ligated into the vector fragment and the ligated vectorTransduce into cells. The construct in the pIG1 vector contains the OmpA sigma fused to this construct in frame.Contains null sequence. The correct clone is screened and confirmed by sequencing. These areThen digest with XbaI / HindIII and isolate the fragment.2.6: Cloning into expression vector As a result of inserting the fragment isolated from 2.3 into pBS13 cut with XbaI / HindIII,PYING1-C1 (Fos), pYING1-C2 (p75), and pYING1-C3 (IL-16) (see FIG. 5).Using EcoRV / EcoRI, the fragment containing the jun was cloned into the pIG10.3 vector.The result is pYANG3-A (see FIG. 6). Anti-p75 peptide pe2, pe using XbaI / HindIIIAs a result of cloning 3 and pe10 (see Example 4) into pIG10.3,The results are pYANG3-Ape2, -Ape3, and -Ape10 (see FIG. 6).2.7: Selecting the Right Pairing Using His Tags pYANG3-A + pYING1-C1 or pYANG3-A + pYING1-C2 or pYANG3-A + pYING1-C3 orIs (pYANG3-Ape2, -Ape3 and -Ape10) + pYING1-C1 or (pYANG3-Ape2, -Ape3And -Ape10) + pYING1-C2 or (pYANG3-Ape2, -Ape3 and -Ape10) + pYING1-Transform TG1 cells with the C3 combination, which allows all possible combinationsTo ensure that each of these is present in the selection experiments. Transformed cellsSpread on LB agar plates containing ampicillin / chloramphenicol, double resistant (ApR/CmR) Is selected. This colony was scraped off the plate and 2xYTInoculate the medium (Amp / Cm) and shake at 37 ° C for 3 hours. Incubate the culture at 30 ° C for 1 hour(1 mM IPTG) and infect with R408 (Stratagene) at 37 ° C. for 30 minutes. Room for cultureShake at room temperature for 3 hours, add kanamycin and continue shaking at room temperature overnight. The phage particles are collected from the overnight culture, mixed and PEG precipitated. PhageSelect directly on immobilized Ni-NTA (Ni-NTA HisSorb Strips, Qiagen). ElutedAnd infect TG1 cells with ampicillin / chloramphenicol.Spread on LB agar plate containing, double resistant (ApR/CmR) Is selected. Phagemids of selected colonies were isolated and analyzed by restriction digestion (Figure 7.a)), and used as a template for PCR screening. Using primer OPEP5LThe pYANG3-Ape2, -Ape3 and -Ape10 constructs are specifically amplified (see FIG. 7.b). OPEP5L 5'-GACTACAAAGATGTCGACTG Correctly paired constructs were specifically abundant (Table 2).Example 3: Interaction screening of E. coli genomic DNA library (PolyphaPage / tag system)3.1: Principle (see Fig. 2) Instead of using the two model libraries of Example 2, genomic DNA of E. coliPrepare libraries, screen against themselves, and interact with E. coliIdentify the peptide or protein.3.2: Construction of display and expression vector for genomic DNA His tag, Strep tag (SchmidtAnd Skerra, 1994) or the g-terminal C-terminal domain (gIIIc).An expression vector having the inserted blunt-end restriction site SmaI is constructed. Using self-complementary oligonucleotides OHIS5 & OHIS3 and OSTREP5 & OSTREP3Create cassettes that code for the His and Strep tags respectively: These cassettes are phosphorylated and annealed to create EcoRI and HindIII sites.Rebuild. PIG1 and pIG3 vectors obtained by cutting these cassettes with the same restriction enzymes-(Ge et al., 1995). The resulting vectors were pING1-A1, pING3-A1 (for His tag in pIG1 and pIG3 vectors), pING1-A2 andpING3-A2 (for Strep tag). Insert the correct vector in the XmaI site (isolated SmaI).Zomer) and screen these constructs by sequencing.Confirm. Insert XbaI / HindIII fragments of these vectors into pBS13 vector,As a result of linearization with the same enzymes, vectors pING1-Cl, pING3-Cl, and pING respectively1-C2 and pING3-C2 (see FIG. 8). For PCR amplification of the pIG10.3 vector, the primer OGIII5 and theA gIIIc fragment containing a SmaI site was created using OGIII3, which anneals to the 3 'Accomplish: Hot start: 92 ° C, 1 minute; 46 ° C, 1 minute; 72 ° C, 1.5 minutes, 3 times of PCRU. Subsequently, 30 times of 92 ° C, 1 minute; 50 ° C, 1 minute; 72 ° C, 1.5 minutes are performed. PCR productsIs purified (QIAquick) and digested with EcoRI and HindIII. This fragment was gel purified (QIAquick) and ligate into pIG10.3. Of the resulting vector pONG3-A (see FIG. 8)The sequence is confirmed by restriction analysis and sequencing.3.2: Selection of interacting pairs derived from Escherichia coli genomic DNA using His tags Blood & cell culture of genomic DNA of E. coli strain XL-1 blue (Stratagene)Isolate using DNA maxi kit (Qiagen) and elute in TE buffer (pH 8.0). Take 200 μg of this DNA and sonicate (50 times, 270 mA, 0.5 sec / stroke). Fragmented DNA (average size: 0.7 kB maximum) was filled with T4 DNA polymerase (GThe end is blunted by the reaction. The vectors pING1-C1 and pONG3-A were digested with EcoRV and SmaI and these vectors were digested.Gel fragment (Qiagen). These vector fragments are then incubated at 16 ° C overnight.Ligated with blunt-ended genomic DNA. Transform TG1 cells with the resulting ligation mixture. PING1-C1 and pONG3-A transformants were scraped off the plate, and the Cm / gluInoculate in 2xYT medium containing course or Amp / glucose. pING1-C1 cultureInfected with helper phage (VCSM13 or M13k07) to isolate phage particlesYou. These phage particles are used to infect log phase cells containing pONG3-A. ProfitPlate the resulting culture on a large Amp / Cm / glucose plate. Remove colonies from the plate surface and transfer to 2xYT medium containing Amp / Cm. After shaking at 37 ° C for 30 minutes, the culture was induced for 30 minutes (1 mM IPTG) and allowed to stand at room temperature.Shake overnight. Phage particles are harvested from the overnight culture and PEG precipitated. Fix these Ni-NTA(NI-NTA HisSorb Strips, Qiagen). Logarithm using eluted phageInfect stage TG1 cells. Use the selected protein pair to determine the corresponding DNA sequenceTherefore, it is characterized.Example 4: Selection of the correct pairing interaction using polyphages and SIP4.1: Principle (see Fig. 10) The purpose of this experiment was to use SIP (selective infectious phage: Krebber et al., 1995;The term "IMP" used in the application refers to the N-terminus of the gene III proteinUsing a selection system (meaning "infectious mediator particles")The correct interacting pairs can be isolated and identified from the library combinations,Information about both interacting partners is collected by diparticle formation and selection.It is to show that it can be collected. Interact with corresponding library membersThe library members that form a pair to be paired are members of the corresponding library.Can be “doped” with library members that do not interact withYou should not give alternative SIP options.4.2: Vector construction4.2.1: fhag1A (see Figure 11)a. Digest the phage vector f17 / 9-hag (Krebber et al., 1995) with EcoRV and XmnIYou. A 1.1 Kb fragment containing the anti-HAG Ab gene was isolated by agarose gel electrophoresis.And purified using Qiagen gel extraction kit. I've digested this fragment beforeLigation to pIG10.3 vector (EcoRV-XmnI). Transduce ligated DNA into DH5αAnd positive clones are confirmed by restriction analysis. This recombinant clone is called pIGhag1ACalled. All cloning described above and below are performed using standard techniques (Sambrook et al., 1989).b. Digest vector f17 / 9-hag (Krebber et al., 1995) with EcoRV and StuI.The 7.9 kb fragment is isolated and self-ligated to form the vector fhag2.c. Assembly PCR using template pACYC (Cardoso and Schwarz, 1992) (Ge andChloramphenicol resistance gene (CAT) assembled by Dr. and Rudolph, 1997)(FIG. 11a shows a functional map and sequence of the CAT gene)Amplification by polymerase chain reaction (PCR) usingd. PCR is performed following standard procedures (Sambrook et al., 1989). The amplification product is BspEIAfter digestion with Bsu36I and Bsu36I, the previously digested fhag2 vector (BspEI-Bsu36II; 7.2 kb fragment) to form fhag2C.e. Digest vector fhag2C with EcoRI and fill inIs smoothed. Self-ligate blunted vector to form vector fhag2CdelEcoRILet it.f. Digest pIGHAG1A with XbaI and HindIII. Filamentous phage pIII proteinIsolate and digest a 1.3 kb fragment containing the anti-HAG gene fused to the C-terminal domainLigated with the fhag2CdelEcoRI phage vector (XbaI-HindIII; 6.4 kb)To create the vector fhag1A.4.2.2: fjun1A (see Figure 12)a. Primers:Oligonucleotide site-directed mutations (Sambrook et al., 1989)Thus, the EcoRV site of pIG10.3 is converted to a SalI site.Mutant pIG10.3 is called pIG10.3SalI.b. Primer of the jun leucine zipper domain from pOK1 (Grammatikoff et al., 1994)ー ：Amplify by PCR usingb. PCR is performed following standard procedures (Sambrook et al., 1989). The amplification product is SalIAfter digestion with EcoRI and pIG10.3SalI vector (SalI-EcoRI) to form the vector jun-pIG10.3SalI.d. Digest the vector jun-pIG10.3SalI with XbaI and EcoRI. 0.14kb fragment in advanceLigated to the vector fhag1A (XbaI-EcoRI; 7 kb) digested withForm A.4.2.3: fjun1B (see Figure 13)a. From the amino-terminal domain to the C-terminal domain of filamentous phage pIII (short gIII)Primer DNA encoding C-terminal domain with long linker to separate:And amplify using pOK1 (Grammatikoff et al., 1994) as a template.b. PCR is performed following standard procedures (Sambrook et al., 1989). The amplification product is EcoRIAfter digestion with HindIII and fhag1A vector (EcoRI-HindIII) to form the vector fjun1B.4.2.4: fpep2-1b) fpep3-1B, fpep10-1b (see Fig. 14)a.These constructs are NGF low af, the intracellular domain of p75 in SIP experiments.From a peptide library screened for affinity receptorscan get.b.Peptide library cassette for cyclic peptides with 6-16 amino acid length variantsOligo:[Where M is a mixture of 19 trinucleotide codons excluding the codon encoding cysPrepared from The length variation was determined using a 6-trinucleotide using standard coupling techniques.Of the DNA position, followed by DNA synthesis in 10 coupling cycles.Omit the capping step between and dilute the trinucleotide mixture to 50%By achieving the coupling yield stepwise. Annealing the oligo, filling with Klenow fragment of DNA polymerase I,Double-stranded DNA cassettes are formed using standard methods (Sambrook et al., 1989). thisDigest the cassette with SalI-EcoRI, purify with Qiaex DNA gel extraction kit, andLigated to digested fjun1B vector (Sal I-EcoR I), peptide libraryTo form Linked peptide library to pUC18 / IMP-p75 (see below)Transfected into competent DH5α cells harboring Luria broth (LB) (30 μg / mlChloramphenicol + 100 μg / ml ampicillin)Incubate overnight.c.AmpR CmRRonny was scraped with LB, and 1 ml of this suspension was added to LB (30 μg / mlInoculate 25 ml of mufenicol + 100 μg / ml ampicillin + 1 mM IPTG). This cultureThe nutrients are incubated overnight at room temperature.d. Separate the supernatant from the cells by centrifugation (10,000 RPM, 10 minutes, 4 ° C). 30%Add 5 ml of PEG / 3M NaCl to this supernatant and mix 100 times. Phage precipitation after 1 hour on iceCollect the deposits by centrifugation (10,000 RPM, 10 minutes, 4 ° C). Pellets in TBS buffer 1Resuspend in ml. Use a 0.45 micron filter (Sartorius) for this suspensionAnd filter.e. Log phase K91 cells (or any male E. coli cells) using 10 μl of phage supernatantInfect 100 μl of LB (30 μg / ml chloramphenicol)Spread on rate and incubate overnight at ambient temperature.f. Take chloramphenicol resistance transductants, prepare overnight cultures, and sequenceIsolate the working DNA. Contains peptides pe2, pe3 and pe10 by sequencingfpep2-1b, fpep3-1B, fpep10-Identify 1b.4.2.5: fNGF1B (see Fig. 15)a. Primers with DNA encoding the nerve growth factor (NGFI) gene: Using pXM NGF (Ibanez et al., 1992) as a template.b. PCR is performed following standard procedures (Sambrook et al., 1989). Amplification product is Sal Pre-digested fjun1B vector after digestion with I and EcoRI (Sal I-EcoR I) to form the vector fNGF1B.4.2.6: pUC19 / IMP-HAG (See Fig. 16)a. Digest vector f17 / 9-hag (Krebber et al., 1995) with EcoI and HindIII. The 1.4 kb fragment containing the HAG peptide-IMP fusion gene was isolated and digested beforehand. Cloned into pUC19 (EcoR I-Hind III) and stored in the vector pUC19 / IMP- Form HAG.4.2.7: pUC18 / IMP-p75 (See Fig. 17)a. Primer of p75 intracellular domain containing C-terminal 142 amino acids Using p75 cDNA clone (Chao et al., 1986) as a template.b. PCR is performed following standard procedures (Sambrook et al., 1989). Amplification product is BsiW IPUC19 vector (BsiW I-Hind III) to form the vector pUC19 / IMP-p75.c. Digest vector pUC19 / IMP-p75 with Xbal I and Hind III. This 1 kb fragment is simplyRelease and clone into the previously digested pUC18 vector (Xbal I-Hind III).To form the vector pUC18 / IMP-p75.4.2.8: pUC18 / IMP-IL16 (see Fig. 18)a.IL16 gene primer Using clone pcDNA3-ILHu1 (M.Baier, Paul Ehrlich Institute) Germany; Baier et al., 1995; Bannert et al., 1996) as a template.b. PCR is performed following standard procedures (Sambrook et al., 1989). Amplification products Bsu36 PUC18 / IMP-p75 vector previously digested after digestion with I and Hind III(Bsu36I-HindIII) to form the vector pUC18 / IMP-IL16.4.3: In vivo SIP using co-transduction and polyphages4.3.1: Two library combinations (library 1 fused to gIII,Library 2 fused to IMP)a.fjun1B, fjun1A, fpep3-10 ng of each of 1B, fhag1A and fNGF1B was added to pUC18 / IMP-p75, pUC18/ IMP-HAG, DH5 by electroporation with 500 ng each of pUC18 / IMP-IL16Co-transduce into α cells. The cells were treated with Luria Broth (LB) (30 μg / ml chloram(Phenicol + 100 μg / ml ampicillin) plate and incubate overnight at ambient temperatureCubate. AmprCmrThe colonies are scraped from the LB, and 1 ml of the suspension is LB (30 μg / ml chloramphenic acid).(+100 μg / ml ampicillin + 1 mM IPTG) and inoculate at room temperature overnight.Incubate.4.3.2: In vivo SIP. Centrifuge the supernatant from the cells (10,000 RPM, 10 minutes, 4 ° C).And separate. Add 5 ml of 30% PEG / 3M NaCl to the supernatant and mix 100 times. One on iceAfter time, the phage precipitate is collected by centrifugation (10,000 RPM, 10 minutes, 4 ° C.). ThisResuspend the pellet in 1 ml of TBS buffer and filter the suspension with a 0.45 micron filter.(Sartorius). Using 200 μl of phage supernatant, log phase K91 cells (or male E. coli cells (F fimbriae)1.8 ml), and inoculate the cells with LB (30 μg / ml chloramphenic acid).Cole + 100 μg / ml ampicillin) on a plate and incubate overnight at ambient temperature.To4.3.3: Infectious polyphage DNA pattern and infectivity testing. 20 independent AmpsrCmrEach colony was LB (30 μg / ml chloramphenicol + 100 pg / ml ampicillin).Phosphorus) inoculate in 5 ml and incubate at ambient temperature overnight. Qiagen Miniprep The plasmid and RF DNA are isolated from each clone using a DNA kit.Appropriate restriction enzymes Xba I and Hind III as supplied and specified by the manufacturerThe clones are analyzed by restriction analysis using the appropriate buffer. This limitThe conversion is performed in a 0.8% TBE agarose gel at a constant voltage of 100 V for 1.5 hours.The restriction pattern was determined by the relative strength of the band (phage vectors (fjun1B, fjun1B1A, fpep3-1B, fNGF1B,. fhag1A) has much less copy-Allows accurate identification of interacting pairs. Pair fhag1A + pFor UC19 / IMP-HAG, 6.5 kb, 3.3 kb, 1.3 kb and 0.7 kb by Xba I-Hind III digestion.A kb fragment is generated, while the pair fpep3-For 1B + pUC18 / IMP-p75 6.3 kb, 2.8 kb, 1 kb and 0.7 kb fragments are produced. The problem is pUC1 of fjun1B or fjun1A8 / IMP-p75 to distinguish potential non-homologous pair combinationsIs fpep3-This is because it gives a pattern similar to 1B + pUC18 / IMP-p75. And thisTo resolve, re-digest clones containing the same pattern with BamH I-Hind IIIcan do. fjun1A or fjun1B in combination with pUC18 / IMP-p75Produces only four fragments-4.1 kb and 2.9 kb, 2.6 kb, 1.2 kb fragments-Familiar pair fpep3-1B + pUC18 / IMP-p75 has 5 fragments-3.5kb, 2.9kb, 2.6kb, 1.2kb, 0.5kbkb. Prove further that a cognate interacting pair has been selectedTo this end, the clones are tested for their ability to form selectively infectious phage particles. Family pairOnly those clones can form infectious phage. Overnight culture of individual clonesThe supernatant from is filtered through a 0.45 micron filter (Sartorius). Phage supernatant 1100 μl of 0 μl log phase K91 cells (or any of male E. coli cells (containing F fimbriae))And at 37 ° C for 10 minutes. This suspension is treated with LB (30 pg / ml chloramphenicol)Spread on rate and incubate at 37 ° C overnight. The results are shown in Table 3.b. In summary (see FIG. 19), the results obtained from the above example were analyzed for 19 clones.Medium, 8/19 is a family pair fpep3-Selective infectious phage with 1B + pUC18 / IMP-p75Produced; 1/19 had fhag1A + pUC19 / IMP-HAG combination and selectively infectious phageTo produce.Example 5: Multilibrary screening by recombination and screening using the tag systemIntegration into a single phagemid vector5.1: Principle (see Fig. 20) A pair of cognate proteins selected by a tag fused to one of the partnersPhage containing a lox recombination promoting site in order toTwo separate libraries were constructed in a vector, which was used for in vivo recombination.Recombination on one phagemid by the action of cre recombinase.5.2: Vector construction Both loxP and loxP511 sites (Hoess et al., 1986) are tandemly aligned in the vector pING1-C1Of the Co1E1 origin of replication and β-lactamaseThe loxP site is upstream of XbaI and loxP511 is below the HindIII site in pONG3-A.Clone into the stream. Therefore, both ends of the cloned genomic DNA are loxPAnd the loxP511 sites are adjacent.5.3: Library construction and recombination The library is prepared as described in Example 3. In the double resistant clonePhagemid is encoded in an inducible phagemid (Tsurushita et al.1996) or has been transposed by infection with P1 phage (Rosner, 1972; Wa)terhouse et al., 1993). Phage is recombinant clawPrepared from helper phage infection and used to produce new E. coli cells (cre-Infect).5.4: Selection Phage particles to CmrPrepared from clones and prepared as described in Examples 2 and 3Add to is tag selection. myc tag area (library 1) and His tag area (liveBy sequencing with primers specific for rally 2), bothThe sequence encoded in each phagemid that actually contains members of the libraryCan be determined.Example 6: Separately constructed libraries were injected into one phage vectorA library based on SIP by recombination vs. Libraries ScreeniniNing6.1: Principle (see Fig. 21) Inheritance for cognate protein pairs selected by SIP interactions in vivoTo allow for the recovery of information, two phage and plasmid vectorsBuild separate libraries and recombine by co-ligation in in vitro recombinationI do.6.2: Construction of libraries A and B Library A contains two members, a hemagglutinin-derived pen.Derived from single-chain Fv antibody against peptide (fαhag) and jun transcription factor (fjun)Encoding a leucine zipper domain, both of which are fibrous fur via the N-terminusOmpA signal fused to the C-terminal domain of di-derived gIII followed by a Flag epitopeFollowing the file array. Library B has three members on the pUCs plasmid vector,Hemagglutinin peptide (pUC19-IMPhag) bound to αhag antibody, leucineLeuci, a fos transcription factor that forms a heterodimer with jun through a zipper domainInteraction with zipper domain (pUC18-IMPfos) and library A membersLow Affinity Nerve Growth Factor Cells as Unused Negative ControlsEncoding the internal domain (pUC18-IMPp75), all of whichIt is fused to the infectious mediating N-terminal domain of the protein and follows the gIII signal sequence. Downstream of the library A insertion site contains the N-terminal domain of gIII (N1-N2)Cloning site B that allows for in-frame insertion of library B members laterLibrary A member into fd phage vector followed by siW I and Hind IIICloning. Library A construct fαhag is the f17 / 9-hag fd phage vector(Krebber et al., 1995), which is the basis for fjun construction. jun leucinejiPar was constructed in Example 4 with 290 to 326 amino acids in the C-terminal portion of gIIIConstruct fjun1B (jun leucine fusion fused to amino acids 290-493 of gIII)PCR amplification (primers FR620 and FR621, EcoRI andAnd Sfi I site). The obtained PCR fragment was digested with EcoRV / SfiI and the f17 / 9-hagDirection in frame with amino acids 327 to 493 of the gIII C-terminal domainTo the vector fjunhag (see FIG. 22). The construction of library B constructs pUC19IMPhag and pUC18-IMPp75 is described in Example 4.Have been. Amino acid 219 in the N-terminal part of gIII to construct pUC18-IMPfos272 with fos leucine zipper together with pOK1 phagemid vector (Grammatikoff et al., 1994) from PCR amplification (primers FR618 and FR619, BsiW I andAnd a Hind III site). The resulting PCR fragment was digested with BsiW I / Hind IIILigation into pUC18-IMPp75 in one direction creates pUC18-IMPfos (see FIG. 17).Primer6.3: Preparation and recombination of libraries A and B and interaction with SIPChoosing a protein pair Non-covalent cognate interaction of the αhag antibody with the hag peptide (Krebber et al., 1995) And non-covalent homologous interactions of the fos and jun leucine zipper domains(Grammatikoff et al., 1994) produce infectious SIP phage. Hence the modelSix possible combinations of members of libraries A and B (fαhag-hag, fαhag-fos, fαhag-p75, fjun-fos, fjun-hag, fjun-p75)Only the cognate pairs (bold) should be selected by in vivo SIP. AllFor recombination of library members in possible permutations, library ABsiW from construct B pool was linearized by digestion with W I / Hind IIILibrary B members prepared by mass cutting with I / Hind IIIPrepared to be included in random. Population cut library B fragment into library AAfter co-ligation into the vector, the sample is transduced into competent E. coli cells.This was spread on an LB agar plate containing chloramphenicol and cultured at 37 ° C overnight.I do. Recombination library size depends on plating serial dilutions of transformantsOf the individual libraries A and BCan be compared with complexity. Total recombinant library from LB medium plateScrape and inoculate an appropriate volume of chloramphenicol selective LB medium supplemented with 1 mM IPTG.Get it. Incubate overnight at 30 ° C with shaking to produce SIP phage.After that, the bacteria are pelleted by centrifugation and 20% PEG / 2.5M NaCl 0.25 for 1 hour on ice.Phage present in the supernatant are precipitated by adding a volume. This furThe pellet is centrifuged at 10,000 × g for 30 minutes at 4 ° C. to pellet. thisResuspend the pellet in the appropriate volume of 1 × TBS buffer and pass through a 0.45 μM filter.And filter. Dilute this filtrate serially+Used to infect E. coli cells.Double-stranded, replicative phage from transductant colonies obtained by standard methodsPrepare DNA and library A and B members by restriction digestion and sequencingAre analyzed for presence and identity. Furthermore, the presence of infectious SIP phageAnalyze the supernatant of the transductant colonies and select from recombinant libraries A and BSpecific pairs of protein-protein interactions are responsible for SIP phage infectivityTo verify that. On the other hand, using model libraries A (2 members) and B (3 members)All possible combinations (above) were built individually and each of the six combinationsAn equal amount (50 ng) was co-transduced into competent E. coli cells, followed by the steps described above.It can be performed. Partitioning of individual constructs after co-transduction and model librariesThe distribution of transductants obtained from lee can be analyzed as described above. FamilySelective recovery of phage constructs that co-encode protein pairs allows for appropriate recombinationShows that SIP based selection of binding partners after the event is feasible.Example 7: "Spatial" in vivo SIP7.1: Principle (see Fig. 23) Coupling information about interacting peptide or protein membersAre particles displaying selectable or screenable properties (this implementationPhage for SIP experiments in examples) and the remnants for individual library membersA package containing bioinformation (screening secreted by E. coli cells in this example)Spatial relationship between the phage particles)Having a correlation between the location of the phage to be tested and the corresponding E. coli hostIs achieved.7.2: Mixing two libraries (library A fused with gIII while libraryB fuses with IMP) fjun1B, fjun1A, fpep3-1B, fhag1A, 10ng each of fNGF1B was pUC18 / IMP-p75, PUC19 / IMP-HAG, pUC18 / IMP-IL16 together with 500ng each in DH5α cellsCo-transduce by troporation. Transformants were transformed with LB (30 μg / ml chloram(Phenicol + 100 μg / ml ampicillin) plate and incubate overnight at ambient temperatureCubate.7.3: Screening of co-transformants by SIP Label each co-transformant from the co-transformant master plate,Separate and plant in 5 ml of LB (30 pg / ml chloramphenicol + 100 μg / ml ampicillin)And incubate overnight at ambient temperature. Plasmid and plasmid from each clone using Qiagen Miniprep DNA KitAnd RF DNA. Restriction enzyme Xba as supplied and supplied by the manufacturerCloning was performed by restriction analysis using I and Hind III with appropriate buffers.Analyzes This restriction digestion is performed at a constant voltage of 100 V in 0.8% TBE agarose gel.For 1-2 hours. Restriction patterns allow the identification of particular clones. Supernatants from overnight cultures of individual clones were filtered with a 0.45 micron filter (Sartorius). Transfer 10 μl of phage supernatant to log phase K91 cells (or male E. coliMix with 100 μl of cells (containing F fimbriae) for 10 minutes at 37 ° C. This suspension was treated with LB (30 μg / ml chloramphenicol) plate and incubate at 37 ° C overnight. Positive co-transformants (ie, containing the correct interacting pair) have the corresponding positiveInfectious phage that have a new restriction pattern and cannot be infectedCan be produced. Polyphage particles are capable of such infections, andIncludes the genetic information of the interacting pairs, so these restriction digestion patterns facilitateCan be identified.Example 8: E. coli display8.1: Principle (see Fig. 24) Two libraries are expressed on the cell surface.(For example, an antibody, peptide or cDNA library) into E. coli cells.If an interacting pair is formed, library B members (eg, antibodies, peptides)Or cDNA libraries) are also detailed in complexes with their cognate partners.Transported to the cell surface and therefore selectable or screenable like a tagDisplay properties. The cells selected contain information about both interaction partners.No.8.2: Preparation of library A The thioredoxin peptide library is used to transfer E. coli flagella into the pFLITRX vector.Prepared essentially as described for the fusion (Lu et al., 1995).8.3: Preparation of library B Cyclic, variable length peptide libraries containing FLAG epitopes (Hopp et al.,Chloramphenicol resistance gene instead of the kanamycin resistance genePTERM, a modified version of the pto2H10a3s vector (Krebber et al., 1996) containingClone into vector. This pTERM vector starts from pto2H10a3sCan be assembled by standard methods. This cyclic peptide library isWith helper phage (M13K07 or VCSM13) by the sub-method (Sambrook et al., 1989).Include by infection.8.4: Mixing libraries A and B Inoculate E. coli cells containing library A into 50 ml of LB (100 μg / ml ampicillin)And incubate at ambient temperature until OD600 reaches 0.4. Library BThe cells are infected with the multiplicity of infection (MOI) with the containing phage. After 30 minutes of infection,The cells are collected by centrifugation (5000 RPM, 10 minutes, 4 ° C.) and resuspended in 1 ml of LB. ThisSuspension of M9 medium (+1 mM gClTwo, 0.5% glucose, 0.2% kaza amino acid, 100 μg /supplemented with 30 μg / ml chloramphenicol, supplemented with 30 ml of ampicillin)sow.8.5: Selection of interaction pairs AmprCmrColonies were transferred to M9 medium (+1 mM MgClTwo, 0.5% glucose, 0.2% casaminoSupplement with acid, 100 μg / ml ampicillin, 30 μg / ml chloramphenicol)Scrape off the suspension and use M9 medium (+1 mM MgClTwo, 0.5% glucose, 0.2% kamiamiNoic acid, supplement 100 μg / ml ampicillin, 30 μg / ml chloramphenicol) to 25 mlInoculate and incubate at 37 ° C. until saturation. The choice is essentially described (Lu et al., 1995), and the modification was performed using the antibody used for selection as M1 anti-FLAG antibody (Kodak).Is Rukoto. Individual Rich AmprCmrIsolate colonies and corresponding interacting peptides and ringsThe sequence of the dendritic peptide is determined by DNA sequencing. The encoded peptideAnd each peptide to confirm that they form a homologous pair of cyclic peptides.Knees are tested for abundance based on the above selection method, which allows for a single selectionAmprCmrColonies bind to M1 anti-FLAG antibody.Literature:Baier et al., 1995, Nature 378,563.Bannert et al., 1996, Nature 381, 30.Cardoso and Schwarz, J. Appl. Bacteriol. 72 (1992) 289-293.Crameri and Suter, 1993, Gene 137, 69-75Ge et al., 1995, Antibody Engineering, 2nded., 229-266Ge and Rudolph, Bio Techniques 22 (1997) 28-29Gramatikoff et al., Nucleic Acids Res. 22 (1994) 5761-5762.Hochuli et al., 1988, Bio / Technology 6, 1321-1325.Hoess et al., 1986, Nucleic Acids Res. 14, 2287-2300Hopp et al., 1988, Bio / Technology 6, 1204-1210.Ibanez et al., 1992, Cell 69, 329-341.Krebber et al., 1995, FEBS Letter 377, 227-231Krebber et al., 1996, Gene 178, 71-74.Linder et al., 1992, Methods: A companion to Methods Enzymol. 4, 41-56.Lu et al., 1995, Bio / Technology 13,366-372Rosner, 1972, Virology 48,679-689Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nded.Schmidt and Skerra, 1994, J. Chromatogr.A 676,337-345Tsurushita et al., 1996, Gene 172, 59-63.Waterhouse et al., Nucleic Acids Res. 21, 2265-2266Table 1: Phagemids constructed for experiments 2 and 3 Table 2: Results of Experiment 2 (see Figure 7)Table 2a: Combinations of phagemids present in the first library (α)Table 2b: Combinations of phagemids present after selection (β) Table 3: Results of Experiment 4 (see Figure 19) Table 3a: Identification of phage / plasmid present in individual clonesTable 3b: Testing of individual clones for infectivity