【発明の詳細な説明】Ｄ−ペプチドの発生：方法および組成物序論背景 薬理学的活性を有する小さい分子、例えば、種々のアクセプター分子のアゴニストまたはアンタゴニスト、例えば、細胞表面のレセプター、酵素または抗体を生産しかつ同定することが必要であることの認識が増大しつつある。薬剤として有用である小さい分子についての探索は、このような分子を収集物を発生させ、生理的活性をもつ分子について収集物をスクリーニングし、そしてスクリーニング工程において陽性の結果を提供する分子の構造を同定することを必要とする。組合せライブラリーのアプローチを使用して、小さい分子の収集物を発生させることができる。しかしながら、先行技術はＤ−抗体およびＤ−ペプチドを使用して潜在的薬理学的活性について小さい分子のこのような組合せライブラリーをスクリーニングする意義、および鏡像の転換を使用して有用なＤ−ペプチドおよびＤ−抗体をつくる能力を認識しなかった。 必須の20アミノ酸のうちの19は、「キラリティー」、すなわち、ハンデッドネスを有する。唯一のアキラルの必須アミノ酸はグリシンである。キラル化合物を記載するために、接頭語ＤおよびＬを使用してそのキラル中心の回りの分子の立体配置を言及する。アミノ酸のキラル中心はアルファ炭素であり、そしてアミノ酸がＤ立体配置またはＬ立体配置を有するかどうかはエミル・フィッシャーが確立した立体異性体のコンペンションに依存する。キラルアミノ酸は立体異性体として存在することができ、これらは互いに鏡像である同一の化学構造物である。双方の立体異性体はしばしば鏡像異性体の対と呼ばれ、そして１つの立体異性体は鏡像異性体であり、これは他の立体異性体／鏡像異性体の重ならない鏡像である。 天然に存在するキラルアミノ酸のすべてはＬ立体配置で存在し、一般にＬ−アミノ酸と呼ばれる。Ｌ−立体配置の各キラルアミノ酸の立体異性体はＤ−アミノ酸と呼ばれる。Ｄ−アミノ酸はグリセルアルデヒドの２つの立体異性体、Ｌ−グリセルアルデヒドおよびＤ−グリセルアルデヒドのうちのＤ−立体異性体に相当する立体配置を有するものである。Ｄ−グリセルアルデヒドと同一の立体化学的立体配置を有するすべてのＤ−アミノ酸、Ｄ−ポリペプチドまたはＤ−ペプチドの立体異性体はＤと表示され、そしてＬ−グリセルアルデヒドと同一の立体配置を有するものはＬ−と表示される。 ポリペプチドのリボソームの翻訳における酵素反応はＬ−アミノ酸について立体特異的であるので、すべてのＤ−アミノ酸から成るペプチドは一般に天然に存在しない。したがって、特定の酵素的手段によるか、またはリボソーム上の生合成によるよりむしろ他の翻訳後の修飾により導入された制限された数のＤ−アミノ酸を含有する、ある種の抗体および細菌の細胞壁のタンパク質を除外して、すべての天然に存在するタンパク質およびポリペプチドはＬ−アミノ酸から成る。 Ｄ−アミノ酸は、また、ラセマーゼによる翻訳後の修飾の結果として、そして長いin vivo寿命をもつタンパク質の自発的ラセミ化の結果として、人間において天然に存在する。HelfmanおよびBada，PNAS，72：2891-2894(1975)を参照のこと。ラセミ化は天然に存在するプロセスであり、天然に存在するＬ−アミノ酸をＬ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸の双方のラセミ混合物に経時的に変換する。 いくつかの承認されたペプチド様薬剤の構造物の制限された部分はわずかのＤ−アミノ酸を含む。このような産物は広く知られている抗生物質のバリノマイシン、グラミシジンＡ、グラミシジンＳ、およびまたバソプレシン類似体のデソムプレシン(RPR)、ルプロン（Abbott）、シナレル（Syntex）、サンドスタチン（Sandoz）、SK&-110679（Smithkline Beecham）、およびデカペプチル（Ipsen-Beuafor/Akzo）を包含する。このような構造物は小さく、そしてＤ−アミノ酸のみから構成されていない。 現在、Ｄ−ペプチドは、この分野においてよく知られている技術を使用して、化学的合成により作られる。例えば、Ｄ−ペプチドは、適当な保護基の使用を含む固相合成法において、Ｄ−アミノ酸の段階的付加を使用して合成することができる。Ｌ−ペプチドについて普通に使用されている固相ペプチド合成技術は、下記の文献に記載されている：Meinhofer，Hormonal Proteins and Peptides，vol.2，(New York 1983)；Kent，et al.，Ann.Rev.Biochem．57：957(1988)；およびBodanszky et al.，Peptide Synthesis，(2d ed. 1976)、これらのすべての参考文献は引用することによって本明細書の一部とされる。Ｄ−ペプチドの固相合成において使用のためのＤ−アミノ酸は、多数の商業的源から得ることができる。 Ｄ−ペプチドおよび混合Ｌ−およびＤ−アミノ酸を含有するペプチドはこの分野において知られている。また、もっぱらＤ−アミノ酸を含有するペプチド（Ｄ−ペプチド）は合成された。Zawadzke et al.，J.Am.Chem.Soc.，114：4002-4003(1992)：Milton et al.，Science 256：1445-1448(1992)を参照のこと。この分野において知られているリガンドの類似体は小さい有機分子、Ｌ−ペプチド、および修飾されたＬ−ペプチドである。しかしながら、レセプターまたはリガンドまたは基質に特異的に結合するＤ−抗体は文献に記載されてきていず、そしてこのようなＤ−抗体およびリガンドおよびレセプターの類似体であるＤ−ペプチドならびにそれらの同定および生産の方法が要求されている。発明の要約 したがって、本発明の目的は、ホルモンおよび神経ペプチドを包含するが、これらに限定されない、生物学的に活性なペプチドおよびタンパク質の類似体に関する方法および組成物を提供することであり、ここで類似体はＤ−アミノ酸からもっぱらまたは本質的に構成されており、そして生物学的に機能的である。 本発明の１つの面は、天然のまたは人工的Ｌ−ペプチドまたはＬ−タンパク質の標的、例えば、身体における生物学的レセプターと相互作用するＤ−アミノ酸から完全に構成されたＤ−ペプチドおよびＤ−タンパク質を発生させることに関する。 Ｄ−アミノ酸から構成された抗体様実在物（Ｄ−抗体、またはリガンドまたはレセプターの類似体であるＤ−ペプチド）および操作された誘導体の形態を含んでなる新規な組成物、および必要な生物学的および製剤学的機能を達成するような方法において、それらの新規な抗体様実在物を生産する方法が提供される。この一般的方法は、Ｄ−ペプチド（すなわち、Ｄ−抗体またはそれらのフラグメントを包含する、Ｄ−アミノ酸から完全にまたは大部分構成されたポリペプチドまたはタンパク質）の分子認識表面（例えば、ファン・デル・ワールスおよび静電的表面）がＬ−アミノ酸から構成された天然の生物学的リガンドの分子認識表面を模擬すると同時に、Ｄ−ペプチドの有利な性質を保持するような方法において、前記分子認識表面を産生することを可能とする。このようなＤ−ペプチドは好都合には消化管中のタンパク質分解に対して耐性であり、血清および組織のプロテアーゼに対して耐性であり、そして比較的免疫学的に不活性である。本発明のＤ−抗体またはそれらの抗原結合ループを包含する、それらのフラグメント、またはそれらの再設計された成分は、消化管中において、また身体を通してタンパク質分解に対して耐性である。本発明のＤ−抗体および他のＤ−ポリペプチドを含んでなる組成物が考えられる。特性がもはや抗体様でない比較的小さい構造物が天然の生物学的リガンドの類似体として本質的に機能するように、抗原結合ループの結合特異性を保存するＬ−抗体のＤ−ペプチド類似体は可能である。この分野において知られており、かつ特定の抗原に対して抗体を発生させる標準的モノクローナル抗体法の別法であるFAbフラグメントのファージ発生を包含する、免疫学的アプローチを洗練する別のスクリーニング法が提供される。 通常のＬ−抗体の使用を越えた追加の利点は、抗体を著しく修飾することができることであり、例えば、Ｄ−類似体中のFAbフラグメントのみの保持、または基本的抗原の認識の保持を含み、そして結合ループはもとの抗原におけるのと同一の向きにスカホールド（ここでは、Ｄ−アミノ酸の）上に配置される。設計は抗体認識領域を直接修飾する必要がなく、生ずるＤ−抗体またはＤ−ポリペプチドは形態が抗体とかなり異なる。しかしながら、Ｄ−ポリペプチドは通常タンパク質分解に対して耐性であり、かつ対応するＬ−ポリペプチドよりも免疫原性が非常に低い。 好ましい態様において、エピトープ、ドメインまたは全タンパク質のＬ−アミノ酸配列が以前に実験的またはコンピューター手段により同定されている場合、このようなエピトープ、ドメインまたは全タンパク質のＬ−アミノ酸配列に相当するＤ−アミノ酸配列に対してモノクローナル抗体を発生させる。タンパク質リガンド上の結合部位は、前述のエピトープ、ドメイン、またはタンパク質からなる構造物として典型的な重要性をもつ１例であろう。エピトープ、ドメイン、またはタンパク質に対して発生したモノクローナル抗体の配列を次いで決定し、そして全抗体または抗原結合部位またはその一部分を含む全抗体の一部分をモノクローナル抗体における配列または配列の一部分に相当するＤ−アミノ酸配列として合成する。Ｄ−アミノ酸から完全に構成された生ずる抗体またはそのサブフラグメントは、前述のエピトープ、ドメイン、または全タンパク質のもとの天然の生物学的Ｌ−形態と一般に相互作用する。ヒト化抗体と異なり、減少した大きさのペプチド鎖を含む、本発明のＤ−ポリペプチドの高度の修飾は、ヒト化を維持するために典型的に要求される設計なしに、可能であり、そして生ずるＤ−ポリペプチドは、ホルモンおよび神経ペプチドおよび天然の抗体のようなタンパク質の薬理学的に機能的な類似体よりも、in vivoにおいてより長く生き残ることができる。 他の面において、本発明は前述の方法を含んでなり、この方法において、モノクローナル抗体に相当するＤ−ペプチドの合成は、モノクローナル抗体の結合部位および前記結合部位のＬ−アミノ酸配列の決定、およびＬ−アミノ酸配列またはモノクローナル抗体の結合部位の配列の合成を含む、すなわち、Ｄ−ペプチドがモノクローナル抗体の結合部位のＬ−アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸を有する以外、Ｄ−ペプチドは結合部位のＬ−アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する。 なお他の面において、本発明は、Ｌ−アミノ酸から成るＬ−抗体のＬ−アミノ酸配列に相当するＤ−アミノ酸配列から構成されたポリペプチドまたはペプチドを含んでなる合成されたＤ−抗体を提供する。本発明のＤ−抗体は、Ｄ−アミノ酸またはアミノ酸類似体の対応する鏡像異性体から完全にまたは本質的に構成されている。また、本発明のＤ−抗体は１またはそれ以上のアキラルグリシンアミノ酸残基を含有することができる。 本発明のＤ−抗体は、レセプター、酵素上の基質結合部位、レセプター抗体が結合するとき、リガンドの結合を妨害するレセプターのエピトープ、レセプターのリガンド結合部位、酵素上のコファクター結合部位およびタンパク質上の糖結合部位を含むことができる。他の態様において、Ｄ−抗体は、レセプターのリガンド、酵素結合部位の基質、レセプターのペプチドホルモン、レセプターの非ペプチドホルモン、レセプターの神経伝達物質、酵素上のコファクター結合部位のコファクター、およびタンパク質上の糖結合部位の糖を含むことができる。 なお他の面として、スクリーニングおよび分子活性の方法、および生物学的操作法または化学的合成法、例えば、質量または組合せのスクリーニング法を包含するかどうかにかかわらず、この方法において認識表面を産生することに等しい方法は、また、本発明の範囲内に入る。後述するように、モノクローナル抗体の生産およびFAbフラグメントのファージ発生の既知の方法を使用して、Ｄ−ペプチドの抗原に応答して発生するＬ−抗体を生産することができる。詳細な説明 一般に、リガンドまたはレセプターに結合するＤ−ペプチドを発生させる方法は、リガンドまたはレセプターのＤ−バージョンをつくり、Ｌ−ペプチドから作られたライブラリーを前記リガンドまたはレセプターのＤ−バージョンでプロービングまたはスクリーニングし、「hits」、すなわち、前記リガンドまたはレセプターのＤ−バージョンに結合するＬ−ペプチドを検出し、次いでＬ−ペプチドのＤ−バージョンを合成することを包含する。Ｌ−ペプチドのＤ−バージョンは、リガンドまたはレセプターのＬ−バージョンに結合することができる。このようなＬ−ペプチドのＤ−バージョンは、本明細書においてＤ−ペプチドまたはＤ−抗体としばしば呼ばれる。これらの工程は順次に実施するか、または次の工程に進行する前に反復する（例えば、スクリーニング工程）ことができる。さらに、工程のあるもののみの完結は活性分子、例えば、治療薬の設計を促進することは明らかであろう。 通常、第１工程はタンパク質の標的（または非ペプチドのリガンド）、例えば、レセプター、または新規なＤ−ペプチドのリガンドをそれに対して設計しようとする酵素を選択することである。典型的には、このようなリガンドのＤ−ペプチドはアンタゴニストとして通常の機能を阻害するか、またはある場合においてアゴニストとして通常の機能の活性化を阻害するであろう。標的のタンパク質またはタンパク質の成分（例えば、リガンド結合部位）は、それらをＤ−アミノ酸（Ｄ−ポリペプチド）から作ることによって、それらの鏡像体で合成される。生ずる分子はＤ−ポリペプチド、Ｄ−レセプター、Ｄ−酵素、またはＤ−ホルモンと呼ぶことができ、それらの一部分は配列が通常のＬ−レセプター、Ｌ−酵素またはＬ−ホルモンに相当する。通常、このような分子のＤ−バージョンおよびＬ−バージョンのアミノ酸配列は、それらが互いの鏡像である以外、同一である。用語Ｄ−レセプターは、アゴニスト、アンタゴニスト、または任意の他の新規なリガンドをそれらに対して望む、Ｄ−レセプター、Ｄ−酵素、Ｄ−ホルモンまたは任意の他のＤ−タンパク質、またはこのようなタンパク質の一部分であるかどうかにかかわらず、すべてのタンパク質の標的を呼ぶために使用されるであろう。１つの典型的な態様として、まず天然のレセプターのリガンド結合ドメインのアミノ酸配列を見ることによって、Ｄ−レセプターのリガンド結合ドメインを作り、次いでＬ−アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸を使用して同一の配列を再合成することができる。特に認識表面がタンパク質のアミノ酸配列において100アミノ酸より小さい距離で離れているとき、リガンドの少なくとも２つの表面と接触する分子認識表面をもつリガンド結合部位は好ましい。 通常、第２工程は、Ｄ−レセプターまたはＤ−ポリペプチドでプロービングすることによって、Ｌ−ペプチドのライブラリーを組合せスクリーニングを実施することである。時には、標的が既知である場合、第１工程を使用しないことが望ましいであろう。組合せスクリーニングにより、ペプチドの多様な組をつくることができ、次いでこれらのペプチドをＤ−ペプチドに変換することができる。また、抗体の免疫学的生産または抗体の組換え生産を使用して、対応するＤ−ペプチドに変換することができるＬ−ペプチドの多様な組をつくることができる。合成ペプチドのライブラリーを前もって組合せ的に製造し、次いでＤ−レセプターに対してスクリーニングすることができる。合成ペプチドのライブラリーの１つの利点は、天然に存在しないアミノ酸、例えば、天然に存在するアミノ酸と同一の電荷をもつが、電荷がペプチドの主鎖から位置する距離が異なるアミノ酸を使用するとき、それらがより大きい化学的多様性を提供することである。距離の変更は陰性または陽性の電荷の１，２または３原子のエクステンダーを使用して達成することができ、好ましくは炭素原子を使用する。この分野において知られているように、組換えペプチドのライブラリーを同様によく使用することができる。 好ましい組合せライブラリーの１つのタイプは、ファージ表示Ｄ−ペプチドのアプローチである。典型的には、まずこの分野において知られている方法を使用して通常のＬ−ペプチドをもつバクテリオファージ表示を調製する。また、Ｌ−ペプチドの生成にプラスミドを用いる他の組換えライブラリーを使用することができる。ここで、タンパク質を発現するDNAのヌクレオチドセグメントのランダム突然変異または部分的ランダム突然変異または組合せ選択により、多数の異なるペプチドまたはタンパク質の組合せ提示を間接的に実行する。好ましくは、組換えライブラリー、例えば、ファージ表示ライブラリーにおいて、DNAの短い区画は、Ｌ−ペプチドの一部分またはすべてとなる突然変異した領域をコードする。好ましくは、突然変異した領域はランダムに突然変異せず、そして３〜10または５〜８アミノ酸の突然変異した領域についてすべての可能なアミノ酸配列を含有しない。その代わり、突然変異は選択的であり、通常、前もって決定したアミノ酸の位置において、保存的突然変異、例えば、異なる極性のアミノ酸について交換する極性アミノ酸、異なる陰性に帯電したアミノ酸について陰性に帯電したアミノ酸および異なる疎水性アミノ酸について疎水性アミノ酸を導入する。このような突然変異した領域は合成ペプチドのライブラリーとともに使用され、好ましくは、Ｄ−抗体のファージ表示とともに使用される。 バクテリオファージのライブラリーは安価であり、操作が容易である。バクテリオファージ表示または「ファージ表示」は広く使用される。Ｎ−末端においてランダムアミノ酸を表示するコートタンパク質のキメラの特質を記載するために、それは本来「融合ファージ」技術として開発された(S.F.ParmleyおよびG.P.Smith，Gene，73：305-318，1988、引用することによって本明細書の一部とされる）。最も早いファージ表示ライブラリーは、いっそう一般的なスクリーニングの目的のための技術として開発された、1990年において多数の研究所において出現し、そして典型的にはfdまたはM13フィラメント状バクテリオファージの遺伝子IIIの中にDNAの合成片をクローニングすることによって実施された(J.K.ScottおよびG.P.Smith，Science 249：386-390，1990；J.L.Devlin，L.C.Panganiban，P.E.Devlin，Science 249：404-406，1990；S.E.Cwiria，E.A.Peters，R.W.Barrett，W.J.Dower，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 87：6378-6382，1990)。これらの場合において、また、ちょうど組合せ的に発生したペプチドのセグメントではなく、タンパク質を安定化するか、またはその表示を促進するために他の源からのタンパク質ドメイン上の領域を表示することができる。このような領域の遺伝子または遺伝子のセグメントをバクテリオファージのDNAの中に挿入し、そしてバクテリオファージのタンパク質の表面に変動する配列含量をもつドメインとして発現させる。バクテリオファージのプラークのポリメラーゼ連鎖反応の増幅、引き続く DNAの配列決定により、標的レセプターに結合するペプチドの配列を発生した遺伝子を同定する。 組合せスクリーニングの他の利点は、スクリーニングのそれ以上のサイクルによりスクリーニングをますます洗練させることである。好ましくは、スクリーニングの追加のサイクルは、より強い結合、すなわち、より低い見掛けのKdについて選択するためにより高いストリンジェンシイの条件を提供する。より高いストリンジェンシイの条件は、温度の増加、イオン強度の低下または増加、カオトロフィック剤およびその他の増加、またはそれらの組み合わせにより達成することができる。例えば、アフィニティー精製されたファージの集団で細胞を感染させ、これにより、アフィニティーによる次の選択において、もとの選択の100万までのコピーを使用し、バクテリオファージを回収し、増幅できるようにすることができる。このような典型的な場合において、この方法はほぼ１mlの体積の管において少なくとも108の異なるペプチドに対するアクセスを可能とする。 通常、第３工程において、Ｌ−ペプチドを検出し、次いで検出または同定の手段を使用してＬ−ペプチドが表示する配列に関して配列決定または同定する。検出または同定の手段の多数は組合せライブラリーについてこの分野において知られている。組合せペプチドのライブラリーの使用において、それぞれ、結合するペプチドまたは濃縮されたペプチドを、例えば、エドマン分解法によりアミノ酸を配列決定するか、または他の手段により同定することができる。例えば、組合せがコントロールされた方法において発生したグリッド上の位置によるか、または放射性標識化標的を包含する化学的標識化標識、ユニーク結合核酸標識、質量分析により測定された最終の質量(PCT/US95／03355明細書を参照のこと、これは引用することによって本明細書の一部とされる)、より小さいサブプールまたはサブミクスチュアーの反復再合成およびスクリーニング（Zuckermann et al.，J．of Medicinal Chem.，37(17)：2678-2685(1994)を参照のこと)(引用することによって本明細書の一部とされる)によるか、またはこれらの任意の組合わせまたは他の既知の技術により、「hits」を同定することができる。バクテリオファージ表示の使用において、通常、問題のペプチドをコードするDNA配列の増幅および検査により、配列を推定する。 通常、第４工程において、Ｌ−ペプチドまたはＬ−タンパク質の配列を記録し、次いでＬ−アミノ酸よりむしろＤ−アミノ酸を使用して、同一のアミノ酸配列を使用してＤ−ペプチドまたはＤ−タンパク質を作る。これらのＤ−ペプチドまたはＤ−タンパク質は選択した組合わせペプチドの鏡像に相当する。ここで、このような分子は、スクリーンのために作られたＤ−レセプターに相当するアミノ酸配列を有するもとのＬ−標的レセプターと相互作用することができる。再び、このようなレセプターは、本発明の目的のために、固有のレセプター、酵素、ホルモン、およびそれらのに対してＤ−ペプチドのリガンドの製造しようとする他のタンパク質を包含する。 本発明の重要な面は、ファージの中にクローニングして、標的に対する結合部位（認識ループ）を精製するばかりでなく、かつまたフレーム、特に抗原結合部位を有するFabフラグメントを精製することによって、Ｌ−抗体またはその部分、例えば、Fabフラグメントを表示することである。特に、独占的ではないが、ファージ上に表示されたペプチドおよびタンパク質のすべては、もとのＤ−抗体に対して発生したモノクローナル抗体の抗原結合ループを少なくとも含有し、そしてこれはもとのＬ−型の抗原、例えば、身体における天然のレセプターと相互作用する認識を有する。前述したように、本発明は、これらのループが精製の目的でファージ表示により修飾できることを包含し、また、抗原結合部位の配列の精製がファージにおいて発生するように、ある程度の設計を実施できることを包含する。ファージ表示により考えられる修飾は、フレームの広範な修飾、認識ループを担持するための非抗体フレームによる置換（他のタンパク質の折りたたみ）、および可能ならばシスチンの交差結合の挿入を含むフレームの除去を包含する大きさの高度の減少を包含する。ファージ表示による抗体成分の修飾および選択は、Ｄ−抗体を除外して、この分野において知られており、そして「半合成抗体のライブラリー」の使用として知られている（C.Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci．USA，89：4457，1992）。これらの修飾および最終産物について有益な効果をもってこれらの修飾を実施する能力は、Ｄ−ペプチドまたはＤ−タンパク質に必要な認識表面を割り当てる、本明細書において記載する本発明に関して、特別な、前例のない意義を有することに注意することが重要である。前述したように、Ｄ−抗体またはそれらのフラグメントはタンパク質分解に対して結果であり、免疫原性が低い、ヒト化の有効な形態であろう。したがって、抗体は、著しく修飾されたときでさえ、Ｄ−型においてヒト化を保持する。これはファージ表示により発生し、Ｄ−アミノ酸から作られた任意の形態を包含する。この天然のヒト化は、半合成抗体のライブラリーのファージ表示の通常の適用における著しい修飾と異なる。それゆえ、本発明によれば、活性が保持されるように選択して、含まれかつスクリーニングされた突然変異で、Fabフレームの大きさを漸進的に減少させることができる。単一のジャンプにおける大きさの減少はフレームとの重要な相互作用をかなり喪失させ、結合ループを変形させることがある。FabフラグメントMcPC603からの抗原認識ループＨ２のコンピューターシミュレーション研究(V.P.Collura，P.J.GreanyおよびB.Robson，Protein Engineering，７：2211-223，1992)において、抗原の認識ループとFabフラグメントの残部との間に重要な相互作用が存在することが認められた。また、抗原認識ループはそれら自体は、重鎖上において３つでありかつ軽鎖上において３つであり、結合のために提示させかつ精製することができ、支持する分子のスカホールドを使用しないでＤ−ペプチドとして、個々に合成するか、または、例えば、オリゴグリシンのスペーサーを使用して結合することができる。また、それらはFabフラグメントまたは抗体成分以外のスカホールド上で提示であることができ、ここで活性ループは３つの選択された抗体認識ループにより置換される。典型的には、これらは結合研究において標的またはその類似体に対して最も強く結合するとして同定されるループであるが、研究を実施した大部分の抗体におけるように、重鎖の３つのループであることが期待され、これらは抗原とのいっそう広範な相互作用を有する。同様に、重鎖の２つのより大きいループは、第３のより小さいループなしに、場合に応じて選択することができる。タンパク質のスカホールドを探求するとき、後方（後ろ向き）の配列の方向に１またはそれ以上のループを使用することを包含する操作を必要とすることがある。すべての前述の例において、最初に提案した構造物は典型的にはファージ表示により精製される。 必要に応じて、これらの試薬を、合理的設計により、類似体の構造−活性の関係を探査するか、またはレセプターが既知の構造を有する場合、レセプターの構造をモデル化することによって、薬剤として精製することが必要であることがあり、そして必要に応じて設計および精製の目的で、既知の天然のまたは発見または設計したＬ−ペプチドのリガンドの逆反転形態との比較および、また、必要に応じて、レセプター配列との比較を包含することができる。経口送達および利用能を増大しかつ薬物速度論的性質を改良するために、それ以上の精製を必要とすることがある。基の付加、例えば、いずれかの末端における追加のアミノ酸残基のエクステンションを包含する、それ以上の化学的修飾を必要とすることがある。また、提示媒質、例えば、リポソーム系を使用することを必要とすることがある。ターゲッティングおよび細胞エントリーのためのペプチドのエクステンションは、例えば、Ｌ−アミノ酸に基づく抗体、および好ましくは長い半減期のＬ−ホルモンを包含することができる。Ｄ−アミノ酸から作ることができ、かつＤ−型でなお活性であることができるペプチドおよびタンパク質のエクステンションおよび付加は、マガイニン、セクロピンおよび他の溶解ペプチド、ウイルス細胞エントリーペプチド、ウイルス由来のエンドソームエスケープペプチド、例えば、IgG3のペプチド、または血液脳関門を横切ることができる牛乳タンパク質起源を包含する。 １つの態様において、Ｄ−アミノ酸から完全にまたは本質的に構成された抗体は、Ｌ−アミノ酸から作られた対応するＬ−抗体がＤ−アミノ酸から作られたペプチドまたはタンパク質と効果的に同一の方法において、Ｌ−アミノ酸から作られたペプチドおよびタンパク質と相互作用する。必要な薬理学的標的のＬ−ペプチドまたはＬ−タンパク質の配列とそうでなければ同一であるＤ−ペプチドまたはＤ−タンパク質に対するモノクローナル抗体を調製し、次いでモノクローナル抗体に相当するＤ−抗体を作ることによって、物質は仮想のかがみの平面を通して２回反射され、内因性または天然の薬理学的標的の分子認識類似体としてＤ−抗体の結合部位を残す。 薬理学的標的は任意の天然の内因性または他の生物学的または非天然のリガンドまたはレセプター、例えば、ホルモン、神経ペプチド、ウイルス粒子、他の生物学的に活性なペプチド、または酵素であることができる。標的のＬ−ポリペプチドまたはＬ−タンパク質は、レセプターまたは他のタンパク質標的の結合部位、またはレセプターまたは他の標的のサブドメインまたはドメイン、またはレセプターまたは他の標的の全体または一部分の中またはその付近においてエピトープまたはエピトープの組を表示することができる。Ｌ−ポリペプチドまたはＬ−タンパク質のアミノ酸配列を使用して対応するＤ−アミノ酸配列を発生させ、このＤ−アミノ酸配列は鏡像異性体の形態においてのみ異なりかつＤ−アミノ酸を含んでなる標的アミノ酸のＬ−ペプチドまたはＬ−タンパク質の配列と同一の配列である。アミノ酸が合成されたＤ−ペプチド抗原の抗原性または免疫原性を変更せず、かつ生ずるＤ−抗体の特異性を変更しないかぎり、すべてのアミノ酸をＬ型からＤ型に変換する必要がない。リガンドまたはレセプターの類似体であるＤ−抗体およびＤ−ペプチドの製造 本発明は、下記の工程からなるリガンドまたはレセプターの類似体であるＤ−抗体またはＤ−ペプチドを同定する方法を提供する：リガンドまたはレセプターを選択する；レセプターのリガンドまたはリガンド結合部位を含んでなるＬ−アミノ酸配列を決定する；レセプターのリガンドまたはリガンド結合部位を含んでなるＬ−ペプチドまたはＬ−ポリペプチドに相当するＤ−ペプチドを合成する；前記Ｄ−ペプチドに対するモノクローナル抗体を製造する：モノクローナル抗体のＬ−アミノ酸配列に相当するＤ−アミノ酸配列を含んでなるＤ−抗体を合成する；そして、レセプターのリガンドまたはリガンド結合部位に対する特異的結合について前記Ｄ−抗体をアッセイする。Ｌ−ペプチドまたはＬ−ポリペプチドに相当するＤ−ペプチドまたはＤ−ポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸がそれらの対応するＤ−立体異性体で置換されている以外、Ｌ−ペプチドまたはＬ−ポリペプチドと同一のカルボキシ末端からアミノ末端までのアミノ酸配列を有する。 分子が立体化学的立体配置を有しかつその分子の鏡像異性体を製造できるかぎり、この方法を任意のリガンドまたはレセプターについて使用することができる。したがって、リガンドは非ペプチド、天然に存在しないリガンド、およびＤ−およびＬ−アミノ酸の混合物を含んでなるペプチドであることができる。一般に、リガンドまたはレセプターの任意のエピトープをＤ−アミノ酸を使用して合成し、そして担体分子に取付けて、それを免疫原性とすることができる。このような場合において、Ｄ−エピトープはハプテンと見なすことができる。ほぼ35残基を越えるＤ−タンパク質は、このような担体分子を使用しないと、常には免疫原性ではない。なぜなら、それはＴ−細胞のレセプターに対して主要な組織適合性抗原上に提示されるとき切断される可能性が少ないからである。Ｄ−エピトープに対して発生した抗体から作られたＤ−ペプチドまたはタンパク質は、例えば、レセプターのタンパク質の二量体化またはオリゴマー化を一般的に誘発することによって、レセプターの活性化を含むことができる。 鏡像の類似体を望む非ペプチドのリガンドまたはレセプターの場合において、非ペプチドのリガンドまたはレセプターの鏡像異性体を合成し、そしてそれに特異的に結合する抗体を発生させるために使用するように、この方法を変更する。次いで、抗体またはその一部分のＬ−アミノ酸配列、例えば、Fabフラグメントを決定し、そしてＬ−アミノ酸配列から、対応するＤ−抗体を合成する。 また、この方法をアキラルのリガンドまたはレセプターまたは分子に適用することができる。アキラルのリガンドまたはレセプターまたは分子について、この方法は下記の工程を含む：アキラルのリガンド、レセプターまたは他の分子を使用してＬ−抗体を発生させる；Ｌ−抗体またはその一部分、例えば、Fabフラグメントのアミノ酸配列を決定する；対応するＤ−抗体を合成する；そして、アキラルのリガンド、レセプターまたは他の分子に対する特異的結合についてＤ−抗体をアッセイする。 Ｄ−抗体の結合を望むキラルまたはアキラルの、天然のまたは天然に存在しない、リガンドまたはレセプターまたは他の分子の選択は、文献中のこのような分子についての情報ならびに、存在する場合、このような分子のアミノ酸配列に関する情報を使用して達成される。Ｌ−ポリペプチドまたは天然に存在するタンパク質のリガンド結合部位の選択は、既知のリガンド結合部位、レセプターまたはリガンドのアミノ酸配列に関して文献を参照することによって達成される。このような分子がまだ配列決定されていないペプチドである場合、当業者はよく知られているペプチド配列決定法を使用してペプチドを配列決定することができる。 ペプチドのリガンド、レセプターまたは他の分子のＬ−アミノ酸配列に相当するＤ−ポリペプチドの抗原の合成は化学的合成を使用して達成される。好ましくはＬ−ペプチドの合成について開発された既知の固相の段階的メリフィールド型ペプチド合成技術を使用するが、この場合において段階的合成においてＤ−アミノ酸または保護されたＤ−アミノ酸を使用して、Ｄ−ポリペプチドの抗原を合成する。Ｄ−ポリペプチドの抗原を合成する他の方法、例えば、段階的合成により製造されたモノマーの共有結合が考えられる。本発明のＤ−ポリペプチドの抗原および他のＤ−ポリペプチドまたはＤ−抗体を合成する手段はこの分野において知られており、そして本発明はなお開発すべきＤ−ポリペプチドの合成法を使用して実施することができる。 一般に、Ｄ−ペプチドの固相合成は下記の工程からなる：Ｄ−アミノ酸の未保護のカルボキシルまたはアミノ基を通して不活性の固体状支持体に保護されたＤ−アミノ酸を取付ける；第１Ｄ−アミノ酸のアミノまたはカルボキシル基上の保護基を選択的に除去する；保護された適当なアミノまたはカルボキシル基を有する次のＤ−アミノ酸を導入し、そして第２Ｄ−アミノ酸と固体状支持体に既に取付けられた第１Ｄ−アミノ酸との間のアミド結合の形成を可能とする条件下に第２Ｄ−アミノ酸を反応させる。次いで、第２Ｄ−アミノ酸のアミノまたはカルボキシル基の保護基を選択的に除去する。合成されたＤ−ペプチドへのＤ−アミノ酸の各連続的付加のために、この手順を反復する。Ｄ−ペプチドが完全に合成された後、Ｄ−ペプチド上に保護基が残留する場合、それらを形成し、そして化学的に合成されたＤ−ペプチドを固体状支持体から切断する。大きいＤ−ペプチドを作るために、化学的に合成されたＤ−ペプチドをこの分野において知られている方法を使用して化学的に結合することができる。 いったんＤ−ポリペプチドの抗原が合成されると、それを使用して抗体を生産する。生産すべき抗体はモノクローナル抗体またはファージ発生されたFabフラグメントであることができ、双方の方法はこの分野において知られている。前述したように、Ｄ−ペプチドまたはタンパク質を免疫原性とするために、担体分子を必要とすることがある。特にＴ−細胞に対して主要な組織適合性複合抗原としてＤ−分子を提示するために、Ｄ−分子を切断することができないからである。ペプチドのエピトープに結合するために化学的基で既にプライムされたキットとして、このような分子は商業的に入手可能である。典型的に入手可能なタンパク質はキーホールリンペットヘモシアニンおよびウシ血清アルブミンである。Ｄ−ポリペプチドまたはＤ−ペプチドに対するモノクローナル抗体の製造は、所望の抗原に対して特異的なモノクローナル抗体の製造について標準的方法を使用して達成される。ファージ発生ペプチドは下記の文献に記載されている： PCT／US91／04384(Dower et al.，1991年６月19日提出）；PCT／US91／02989(Dower et al.，1991年５月１日提出)；PCT／US92／08879（Schatz et al.，1992年10月15日提出）；PCT／US94／05796（Aldwin et al.，1994年５月23日提出）；米国特許第5,491,074号(Aldwin et al.，1994年５月24日提出)；およびPCT／FR／00127(Sodoyer et al.，1995年２月２日提出)；それらのすべては引用することによって本明細書の一部とされる。モノクローナル抗体またはファージ発生Fabフラグメントは、Ｄ−ポリペプチドの抗原に対する特異的結合についてこの分野において知られている方法を使用してスクリーニングされる。選択された抗体または抗体の一部分、例えば、修飾されたFabフラグメントまたは一本鎖Fvまたはジサルファイド結合Fvフラグメントを次いで単離し、配列決定する。Fvフラグメントは抗原の結合のために必要な抗体の最小の機能的部分である。Reiter et al.，Protein Engineering，7(5)：697-704(199)。次いで、結合部位を表示する抗体またはタンパク質、Fabフラグメント、一本鎖Fvフラグメントまたはジサルファイド結合FvフラグメントのＬ−アミノ酸配列を使用して、本発明のＤ−抗体の対応するＤ−アミノ酸配列を決定する。全体のＬ−抗体またはその一部分、例えば、Fabフラグメント、一本鎖Fvフラグメントおよびジサルファイド結合Fvフラグメントに相当するＤ−アミノ酸配列を含む、本発明のＤ−抗体を、前述したように、合成する。 抗体のファージ表示を使用する場合、抗体または表示された抗体の部分を、それらの結合認識ループまたは支持する抗体の折りたたみにおいてファージ表示により精製することができる；このような抗原は「半合成」と呼ばれる（C.F.Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 89-4457，1992）。通常、抗体またはFabフラグメントのフレームに対する修飾は、最も典型的にはヒト化が喪失されるので、臨床的使用において利点を与えない。しかしながら、前述したように、本発明の主要な意義は、Ｄ−抗体のプロテアーゼ耐性特性および免疫原性の減少が、フレームに対する修飾が一般に制限でないような程度の組込みのヒト化を意味することである。結局、本発明は、ファージ表示の実施において、通常ヒト化の喪失を危険にさらすようなフレームに対する修飾、例えば、前述したようなフレームの大きさの減少、およびファージ表示における抗体のフレームの大きさの漸進的減少を許す。これは、スクリーニングを各大きさの減少段階において実施して活性を保持するように、漸進的により小さいフレーム上においてファージ表示によりランダム化アミノ酸でクローニングされたFabヘッドを通すことによる濃縮を伴う段階的減少を包含する。対照的に、単一工程における大き過ぎる大きさの減少は、ループとフレームとの間の相互作用の変化が大き過ぎるために、全体の活性を喪失する危険がある。 本発明は、生物学的に機能的な形態の製造を可能とすることによって、Ｄ−タンパク質の適用範囲を大きく拡張する。出発点としてタンパク質を発現する遺伝子の配列、またはその一部分を取ることによって、本発明は、また、ヒトゲノムの中の情報を製剤学的産物により直接的に変換する手段を提供する。 本発明のＤ−抗体は、完全な抗原のＤ−類似体ならびに抗体の部分のＤ−類似体の双方を含み、治療用組成物において、アゴニストまたはアンタゴニストまたは触媒として使用することができる。また、特異的抗原、例えば、ウイルスまたは細菌の抗原を発現する標的を特異的に結合するために、Ｄ−抗体を使用することができる。Ｄ−抗体であるばかりでなく、かつまたＬ−抗体のFabフラグメントまたは他の部分のＤ−ペプチドの類似体であるＤ−抗体は、対応するＬ−抗体を越えたいくつかの利点を有する。第１に、生物学的系およびタンパク質および酵素はＬ−ポリペプチドまたはＬ−アミノ酸に対して一般に特異的であるので、本発明のＤ−抗体は消化管中でかつ身体を通してタンパク質分解に対して耐性である。第２に、Ｄ−ペプチドは対応するＬ−ペプチドよりも一般に免疫原性が低いので、本発明のＤ−抗体はヒト宿主において免疫応答を引き起こす可能性がより少なく、これは治療用組成物について重要な特性である（暫定的米国特許出願第60／005,508号、1995年10月10日提出および暫定的米国特許出願第60／014,433号、これらは引用することによって本明細書の一部とされる）。リガンドまたはレセプターの類似体であるＤ−ペプチド 本発明のＤ−抗体は本質的にＤ−ペプチドであり、これらのＤ−ペプチドはペプチドまたは非ペプチド、天然のまたは天然に存在しない、キラルまたはアキラルの分子に結合することができるリガンドまたはレセプターの類似体であるＤ−ペプチドである。 Ｄ−抗体はレセプターまたはリガンドまたは任意のキラルまたはアキラルの、天然のまたは天然に存在しない分子に結合するように設計することができる。リガンドに特異的に結合することができるＤ−抗体を望むとき、それは本明細書に記載する方法に従い、それからアミノ酸配列を得る鋳型（リガンドがポリペプチドである場合）として、またはモノクローナルであるか、またはファージ発生であるかどうかにかかわらず、Ｌ−抗体を発生させる抗原として、リガンドを使用して生産される。リガンドは天然に存在するポリペプチドまたはペプチド、非ペプチド、例えば、ホルモン、天然に存在しないペプチドまたは非ペプチド、およびキラルまたはアキラルの化合物を包含する。レセプターに特異的に結合するＤ−抗体を望むとき、それは本明細書に記載する方法に従い生産される。１つの態様において、レセプターまたはその一部分をもとのポリペプチドとして使用し、このポリペプチドからＬ−アミノ酸配列を決定することができ、そして対応するＤ−ポリペプチドの抗原を合成する。組合せライブラリーの使用は、この分野においてよく知られている。PCT／IB95／00560（Hodges et al.，1995年６月13日提出）およびPCT／US95／03355(Benkovic et al.，1995年３月23日提出)(それらの双方は引用することによって本明細書の一部とされる)を参照のこと。 リガンドは一般にリガンド結合対の１員、すなわち、リガンドおよびレセプターを包含する。リガンドの一部分またはリガンドの表面は、レセプターの一部分またはレセプターの表面に特異的に結合する。最も頻繁に、リガンドは生物学的作用を発揮することができ、すなわち、生物学的リガンドであることができる。一般に、リガンドの全体の構造または分子量はレセプターより小さいが、これは必要な条件ではない。リガンドはしばしばＬ−ペプチドまたはＬ−ポリペプチドであるが、他の非ペプチド分子、例えば、ステロイド、コファクター、神経伝達物質、神経伝達物質の類似体、非ペプチドのホルモン、非ペプチドのホルモンの類似体、およびヌクレオチド、ヌクレオシドおよび糖および非ペプチド分子の修飾された形態はリガンドとして考えられる。また、天然に存在しないリガンドおよびアキラルのリガンドが考えられる。通常、リガンドはＤ−ポリペプチドまたはＤ−アミノ酸を包含しないであろう。通常、レセプターに対するリガンドのアフィニティー（関係する温度、イオン強度、およびpH、例えば、ヒトの生理的条件における見掛けのKd）は１mMより低く、好ましくは１pM〜100μＭまたは100μＭより低く、より好ましくは10pM〜１μＭまたは１μＭより低く、最も好ましくは100pM〜10nMまたは100nMより低い。Ｄ−リガンドはＤ−立体配置をもつ、通常非ペプチドのリガンドを呼ぶ。 レセプターは一般にリガンド結合対の１員を呼ぶ。レセプターは必ずしも特定の生物学的機能をもつ生物学的レセプターであると考えない。事実、レセプターは、通常リガンドに非共有結合的に結合する分子認識表面をもつリガンド結合対の１員を呼ぶ。レセプターはこのような表面をもつ少なくとも１つのリガンド結合部位を有するであろう。一般に、リガンド結合部位は溶媒アクセス可能、好ましくは水アクセス可能であろう。リガンド結合部位はしばしばペプチド結合により一緒に結合されたＬ−アミノ酸から構成されており、例えば、ペプチドのホルモンの生物学的レセプターであろう。他の例において、レセプターは有機分子、例えば、クラウンエーテル、または核酸、例えば、DNAであることができる。 Ｄ−抗体は、それらが全体のＤ−抗体において有するコンフォメーション（それゆえ、また、対応するＬ−ペプチドがモノクローナルＬ−抗体において典型的には有するであろうコンフォメーションに対する鏡像を有するであろう）にフラグメントまたは別のフラグメントを維持するような修飾を含む、Ｄ−アミノ酸配列を包含する抗体またはそれらのフラグメントを呼ぶ。フラグメントは典型的には抗原との直接的相互作用に関係する抗体の結合認識ループであり、抗体の重鎖上に３つのこのようなループが存在し、そして軽鎖上に３つのこのようなループが存在する。例えば、Fab McPC603からの抗原−組合わせループのコンフォメーション（V.P.Colura，P.G.GreanyおよびB.Robson，Protein Engineering，７：221-223，1994）はFab抗体フラグメントとの相互作用に決定的に依存することが記載された。修飾は種々のタイプであることができる。一般に、Ｄ−抗体のアミノ酸配列はＤ−アミノ酸から完全に作られているであろう。ある場合において、Ｄ−抗体のアミノ酸配列の中にＬ−アミノ酸を含めることが好ましいであろう。特に、本明細書における本発明の方法を読んだ後、Ｄ−抗体の分子認識表面は、完全でないにしても、主としてＤ−アミノ酸から構成されているが、Ｄ−抗体の他の領域は、存在する場合、完全でないにしても、主としてＬ−アミノ酸、例えば、モノクローナル抗体の非変動領域から構成されることができることが明らかであろう。さらに、Ｄ−抗体は一本鎖Fab、またはそれらの任意のサブフラグメントまたは類似体（ここで重鎖および軽鎖は柔軟なリンカーを介して端対端で結合されている）、およびミニ物体（ここで重鎖および軽鎖は、好ましくはジサルファイドまたは同様な結合により、２つの残基様システインを各鎖において１つで導入することによって結合されている）を包含することができる。Reiter et al.，上掲、を参照のこと。好ましくは、リガンド結合部位は少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは96％〜100％または100％のＤ−アミノ酸から作られるであろう；ここで百分率はＤ−アミノ酸の数／配列中のアミノ酸の合計の数×100として計算される。 Ｄ−アミノ酸配列は、レセプターまたはリガンドに似るＤ−抗体を作る方法において、タンパク質（またはペプチド）のリガンドまたはレセプター作るために使用される。タンパク質のリガンドに対する類似体を望むとき、タンパク質のリガンドのＤ−アミノ酸配列を使用してＤ−抗体を作る。タンパク質のレセプターに対する類似体を望むとき、タンパク質のレセプターのＤ−アミノ酸配列を使用してＤ−抗体を作る。このようなＤ−アミノ酸のリガンドおよびレセプターはＤ−ポリペプチドの抗原と考えることができる。通常、タンパク質のレセプターまたはリガンドのＤ−アミノ酸配列はＤ−アミノ酸から完全に構成されたるが、すべてのＤ−アミノ酸のタンパク質のリガンドまたはレセプターに比較してKdを２桁以上、より好ましくは１桁だけ悪く変更しない、タンパク質の領域において、Ｌ−アミノ酸の置換は許容される。 Ｄ−抗原はＤ−立体配置をもつ抗原を呼ぶ。 Ｌ−抗体はＬ−アミノ酸から作られた抗体を呼び、天然に見出されるもの、哺乳動物の免疫化により作られたもの、ファージにより、およびトランケートまたは修飾された抗体、ミニ物体（一本鎖抗体またはそれらの免疫反応性フラグメントを包含するが、これらに限定されない）の製造について他のこの分野において知られている方法により作られたものを包含する。検出法 本発明は、また、検出法を提供する。本発明の抗体およびペプチドはペプチド耐性分子を提供するので、本発明のこのような化合物は分析物の検出に特に適する。一般に、分析物を検出する方法は、分析物をＤ−抗体と接触させ、そして分析物およびＤ−抗体の複合体を検出することからなる。検出法における多数の変法は本発明の抗体を使用して達成可能である。本発明の抗体を例えば、ELISAアッセイにおいて使用することができ、そして未結合Ｄ−抗体から複合体を分離する追加の工程を含む分離法を適用することができる。検出可能なシグナルの生成速度を変化させる相補的アッセイを、この分野において知られているように、使用する場合、洗浄工程は不必要である。このようなアッセイは必要なアッセイ成分を含有するキットを使用して実施することができる。 本発明の抗体および１またはそれ以上の所望の分析物の精製のためのアフィニティー選択を使用して、無数の分析物を検出することができる。主として、分析物はこの出願の提出時にこの分野において知られている方法および後に発見される方法により、それに対する抗体を発生させることができるものであろう。一般に、分析物はレセプターのリガンド、酵素上の結合部位の基質、ペプチドのホルモン、非ペプチドのホルモン、神経伝達物質、コファクター、または糖である。 本発明の抗体は、望む場合、共有結合または非共有結合手段により標識化して検出を促進させることができる。このような標識は、検出可能なシグナルを発生することができる酵素、蛍光化合物（FITCを包含する）、放射性原子（Ｃ14およびＩ125を包含する）、ビオチン、およびアビジンを包含する。好ましくは、標識はリガンド結合部位またはＣ−またはＮ−末端を含まない抗体の領域に取付けられる。また、標識は細胞を殺すか、または細胞の増殖を阻害するトキシンを包含することができる。 本発明の抗体は、酵素的または電気的検出法または２つの組合わせにより、バイオセンサーとして使用することができる。リガンドに結合する他の生物学的分子、特に抗体についてこの分野において教示されているように、本発明の抗体を使用して、リガンド特異的電極を発生させることができる。組成物 本発明は、また、医薬組成物および生物学的状態を調節する方法を包含する。例えば、有効量のＤ−抗体をレセプターと接触させ、こうしてレセプターに対する結合からリガンドをブロックすることによって、レセプターに対するリガンドのリガンドの結合を阻害するために、本発明の抗体を使用することができる。通常、この量は１μｇ〜100mg、より好ましくは10μｇ〜10mgまたは0.01mgより多く、最も好ましくは0.1mg〜10mgであろう。 医薬組成物は、生理的に適当な担体と、本発明の化合物とを含んでなる。このような担体は、この分野において知られているように、緩衝剤およびコーティングを包含する。 この明細書に記載したすべての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物および特許出願が特別にかつ個々に引用することによって本明細書の一部とされると示されている場合と同一程度に、引用することによって本明細書の一部とされる。 本発明を完全に記載したが、当業者にとって明らかなように、本発明の精神または範囲から逸脱しないで多数の変化および変更が可能である。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTIOND-peptide generation: methods and compositionsIntroductionbackground Small molecules with pharmacological activity, such as the agonists of various acceptor moleculesOr antagonists, such as cell surface receptors, enzymes or antibodies.There is growing recognition that there is a need to produce and identify. As a drugThe search for small molecules that are useful will generate a collection of such molecules,Screen the collection for biologically active molecules and screeninIt is necessary to identify the structure of the molecule that provides a positive result in the process.Generate a collection of small molecules using a combinatorial library approachbe able to. However, the prior art uses D-antibodies and D-peptides.Such combinatorial libraries of small molecules for potential pharmacological activityUseful D-peptides using the significance of cleaning, and mirror image conversion andDid not recognize the ability to make D-antibodies. 19 of the 20 essential amino acids are "chirality",Have The only achiral essential amino acid is glycine. Chiral compoundsFor purposes of description, the prefixes D and L are used to indicate the position of a molecule around its chiral center.Mention body placement. The chiral center of the amino acid is the alpha carbon, andEmil Fisher confirms whether an acid has the D or L configuration.Depends on erect stereoisomer competition. Chiral amino acids are stereoisomersAnd these are mirror images of each otherThe same chemical structure. Both stereoisomers are often called enantiomer pairsAnd one stereoisomer is an enantiomer, which is the other stereoisomer / enantiomer.It is a mirror image of non-overlapping sexual bodies. All of the naturally occurring chiral amino acids exist in the L configuration, and are generallyCalled amino acids. The stereoisomer of each chiral amino acid in the L-configuration is D-aminoCalled acid. D-amino acids are the two stereoisomers of glyceraldehyde, L-gCorresponds to D-stereoisomer of lyseraldehyde and D-glyceraldehydeIt has a three-dimensional configuration. Stereochemical identical to D-glyceraldehydeAll D-amino acids, D-polypeptides or D-peptides having a configurationIs designated D, and has the same configuration as L-glyceraldehydeAre denoted as L-. The enzymatic reaction in the translation of the ribosome of a polypeptide is established for L-amino acids.Being body specific, peptides consisting of all D-amino acids are generally naturally occurring.Does not exist. Therefore, by specific enzymatic means or on the ribosomeLimited number of D-aminos introduced by other post-translational modifications rather than by synthesisExcluding certain antibodies and bacterial cell wall proteins that containAll naturally occurring proteins and polypeptides consist of L-amino acids. D-amino acids can also be produced as a result of post-translational modification by racemase, andAs a result of the spontaneous racemization of proteins with long in vivo longevity,Naturally occurring. See Helfman and Bada, PNAS, 72: 2891-2894 (1975).When. Racemization is a naturally-occurring process that removes naturally occurring L-amino acids.Converts over time to a racemic mixture of both L-amino acids and D-amino acids. Restricted parts of the structure of some approved peptidomimetic drugsContains few D-amino acids. Such products are made of widely known antibiotics.Valinomycin, gramicidin A, gramicidin S, and also vasopressinsAnalogous Desompressin (RPR), Lupron (Abbott), Cinarel (Syntex), SunDostatin (Sandoz), SK & -110679 (Smithkline Beecham), and decapepti(Ipsen-Beuafor / Akzo). Such structures are small and D-It is not composed solely of amino acids. Currently, D-peptides are synthesized using techniques well known in the art.Made by chemical synthesis. For example, D-peptides include the use of appropriate protecting groups.In the solid phase synthesis method, the synthesis can be performed using stepwise addition of D-amino acids.Wear. Solid phase peptide synthesis techniques commonly used for L-peptides are described below.In Meinhofer, Hormonal Proteins and Peptides, vol..2, (New York 1983); Kent, et al., Ann. Rev. Biochem. 57: 957 (1988);And Bodanszky et al., Peptide Synthesis, (2d ed. 1976), all of these references.The literature is hereby incorporated by reference. Solid phase synthesis of D-peptideD-amino acids for use in synthesis can be obtained from a number of commercial sources. D-peptides and peptides containing mixed L- and D-amino acids areKnown in the field. In addition, a peptide containing only D-amino acids (D-Peptide) was synthesized. Zawadzke et al., J. Am. Chem. Soc., 114: 4002-400.3 (1992): Milton et al., Science 256: 1445-1448 (1992). This minuteAnalogs of ligands known in the field include small organic molecules, L-peptides andAnd modified L-peptides. However, the receptor or ligandAlternatively, D-antibodies that specifically bind to a substrate have not been described in the literature andD-antibodies and ligands such as-Peptides and analogues of their receptors and their identification and productionLaw is required.Summary of the Invention Thus, the object of the present invention encompasses hormones and neuropeptides,Not limited to analogs of biologically active peptides and proteinsWherein the analog is derived from a D-amino acid.It is exclusively or essentially composed, and is biologically functional. One aspect of the invention relates to natural or artificial L-peptides or L-proteins.D-amino acids that interact with biological receptors in the bodyGenerating fully composed D-peptides and D-proteins fromI do. An antibody-like entity composed of D-amino acids (D-antibody, or ligand orD-peptide, which is an analog of the receptor) and engineered derivativesA novel composition consisting of, and to achieve the required biological and pharmaceutical functionsIn a novel method, a method is provided for producing these novel antibody-like entities. ThisThe general method of D-peptides (ie, D-antibodies or their fragments)Polypeptides composed entirely or mostly of D-amino acids, includingOr protein) or molecular recognition surfaces (eg, van der Waals and electrostaticRecognition surface of natural biological ligands composed of L-amino acidsAnd at the same time retain the advantageous properties of the D-peptide, Making it possible to produce said molecular recognition surface. Such D-peptides are preferred.It is advantageously resistant to proteolysis in the gastrointestinal tract,Resistant to thease and relatively immunologicalInactive to Comprising the D-antibodies of the invention or their antigen binding loops,These fragments, or their redesigned components,And is resistant to proteolysis throughout the body. The D-antibody of the present invention andAnd other D-polypeptides. Characteristics are no longer antibody-likeRelatively small structures are inherently analogs of natural biological ligands.L-antibody D-peptide that preserves the binding specificity of the antigen binding loop to workAnalogs are possible. Known in the art and for specific antigensAn alternative to the standard monoclonal antibody method for generating antibodiesAlternative screening methods to refine immunological approaches, including phage developmentIs provided. An additional advantage over the use of conventional L-antibodies is that antibodies can be significantly modified.For example, retention of only the FAb fragment in the D-analog, orIncluding retention of recognition of the underlying antigen, and the binding loop is the same as in the original antigen.It is placed on the scaffold (here for the D-amino acid) in one orientation. The design isIt is not necessary to directly modify the antibody recognition region, and the resulting D-antibody or D-polypeptideThe morphology is quite different from that of the antibody. However, D-polypeptides are usuallyAnd is more immunogenic than the corresponding L-polypeptide.Very low. In a preferred embodiment, the L-amid of the epitope, domain or whole proteinIf the acid sequence has previously been identified experimentally or by computer means,Corresponds to the L-amino acid sequence of such an epitope, domain or whole proteinA monoclonal antibody is generated against the D-amino acid sequence. ProteinThe binding site on Gand may be from the aforementioned epitopes, domains, or proteins.This would be an example of a typical structure. Epitopes, domains, orOr the sequence of the monoclonal antibody raised against the protein is then determined andTo obtain a whole antibody or a part of the whole antibody containing the antigen binding site or a part thereof.A D-amino acid sequence corresponding to a sequence or a portion of a sequence in a ronal antibody;And combine them. The resulting antibody or its subfragments composed entirely of D-amino acidsFragment is the native epitope of the aforementioned epitope, domain, or whole protein.Interacts generally with biological L-forms. Unlike humanized antibodies, reduced sizeHigh degree of modification of the D-polypeptides of the invention, including the peptide chains ofIs possible, and the resulting D-polyPeptides are proteins such as hormones and neuropeptides and natural antibodiesSurvive longer in vivo than pharmacologically functional analogs ofit can. In another aspect, the invention comprises a method as described above, wherein the method comprises the steps of:The synthesis of the D-peptide corresponding to the clonal antibody depends on the binding site of the monoclonal antibody.Position and the L-amino acid sequence of said binding site, and the L-amino acid sequence orInvolves synthesis of the sequence of the binding site of the monoclonal antibody, ie, the D-peptideHas a D-amino acid in place of the L-amino acid at the binding site of the monoclonal antibodyExcept that the D-peptide has the same amino acid sequence as the L-amino acid sequence at the binding site.I do. In yet another aspect, the invention relates to L-amino acids of L-antibodies comprising L-amino acids.Polypeptide or peptide composed of D-amino acid sequence corresponding to acid sequenceA synthesized D-antibody comprising: The D-antibody of the present invention comprises D-aminoConsists entirely or essentially of the corresponding enantiomer of an acid or amino acid analogHave been. MaAlso, the D-antibodies of the present invention comprise one or more achiral glycine amino acid residues.Can have. The D-antibody of the present invention comprises a receptor, a substrate binding site on an enzyme, and a receptor antibody.Receptor epitope, receptor that interferes with ligand binding when boundBinding sites on proteins, cofactor binding sites on enzymes and glycosylation on proteinsA joining site can be included. In another embodiment, the D-antibody is a receptor ligase.Peptide, enzyme binding site substrate, receptor peptide hormone,Peptide hormones, receptor neurotransmitters, cofactor binding sites on enzymesIt can include cofactors and sugars at the sugar binding site on the protein. Still other aspects include screening and molecular activity methods, and biological manipulation.Includes modalities or chemical synthesis methods, such as mass or combination screening methodsWhether or not to produce a recognition surface in this wayThe method also falls within the scope of the present invention. As described below, monoclonal antibodiesUsing known methods of production and phage generation of FAb fragments, D-peptideL-antibodies generated in response to the antigen of the tide can be produced.Detailed description In general, a method for generating a D-peptide that binds to a ligand or receptorProduces a D-version of the ligand or receptor and is made from the L-peptide.The library obtained is probed with a D-version of the ligand or receptor.Bing or screening and "hits", ie, the ligand or receptor.Detecting the L-peptide binding to the D-version of theSynthesizing a D-version of D- of L-peptideThe version can bind to the L-version of the ligand or receptor.Wear. Such D-versions of L-peptides are referred to herein as D-peptides.Often called tide or D-antibodies. These steps can be performed sequentially orOr repeat before proceeding to the next step (eg, a screening step).Wear. In addition, the completion of only one step requires the design of an active molecule, eg, a therapeutic.It will be clear that it will. Usually, the first step is to target the protein (or a non-peptide ligand), for example,, Receptors, or novel D-peptide ligands against itIs to select the enzyme to be used. Typically, the D-peptide of such ligandsTides may inhibit normal function as antagonists, or in some casesAs an agonist it will inhibit the activation of normal functions. Target proteinOr components of the protein (eg, ligand binding sites)(D-polypeptides) by being synthesized in their enantiomers. RawThe shear molecule is a D-polypeptide, D-receptor, D-enzyme, or D-hormoneA part of which has the normal sequence of L-receptor, L-enzyme, etc.Or L-hormone. Usually, the D-version and L-The amino acid sequences of the versions are identical, except that they are mirror images of one another.The term D-receptor refers to an agonist, antagonist or any other novelD-receptors, D-enzymes, D-hormones orIs any other D-protein or part of such a proteinWill be used to address the targets of all proteins, whether or not. In one exemplary embodiment, first the ligand binding domain of the natural receptorBy looking at the amino acid sequence,Create a ligand binding domain, then use D-amino acids instead of L-amino acidsTo resynthesize the same sequence. In particular, the recognition surface isWhen the amino acid sequence is separated by less than 100 amino acids,Ligand binding sites with a molecular recognition surface that contacts at least two surfaces are preferred. Usually, the second step is to probe with D-receptors or D-polypeptides.To perform a combinatorial screening of the library of L-peptides.Is Rukoto. Sometimes it is desirable not to use the first step if the target is knownWould be better. Creating multiple sets of peptides by combination screeningAnd these peptides can then be converted to D-peptides. MaIn addition, the immunological production of antibodies or the recombinant production ofVarious sets of L-peptides can be created that can be converted to tides. CombinationA library of synthetic peptides is prepared in combination in advance and then the D-receptorCan be screened against. One of the synthetic peptide librariesThe advantage is that non-naturally occurring amino acids, e.g., are identical to naturally occurring amino acidsAmino acids with different charges, but at different distances from the main chain of the peptide.When used, they provide greater chemical diversity. Change in distanceCan be reached using 1, 2 or 3 atom extenders of negative or positive charge.And preferably using carbon atoms. Known in this fieldAs well, a library of recombinant peptides can be used as well. One type of preferred combinatorial library is a library of phage displayed D-peptides.Approach. Typically, first use methods known in the artAnd a bacterium having a normal L-peptidePrepare an phage display. In addition, a plasmid is used for the production of L-peptide.Can be used. Where to express the proteinRandom or partial random mutations in nucleotide segments of DNADifferent or combinatorial selections can provide a combination of many different peptides or proteins.Perform indirectly. Preferably, a recombinant library, such as a phage tableIn the indicated library, a short section of DNA contains a portion or all of the L-peptide.Encodes a mutated region of interest. Preferably, the mutated region is a runDoes not mutate to a dam, and to a mutated region of 3-10 or 5-8 amino acidsDoes not contain all possible amino acid sequences. Instead, mutations are optionalConservative mutations, usually at predetermined amino acid positions,For example, exchange polar amino acids for amino acids of different polarities,For charged amino acids and negatively charged amino acids and different hydrophobic amino acidsThen introduce hydrophobic amino acids. Such a mutated region is a synthetic peptideAnd preferably with phage display of D-antibodies.Used for Bacteriophage libraries are inexpensive and easy to manipulate. BakteLyophage display or "phage display" is widely used. At the N-terminusTo describe the properties of coat protein chimeras displaying random amino acids, It was originally developed as a "fusion phage" technology (S.F.Parmley and G.P.Smith, Gene, 73: 305-318, 1988, which is incorporated herein by reference.). The fastest phage display library is the most common screeningAppeared in numerous laboratories in 1990, developed as a technology for purposeAnd typically fd or M13Cloning a synthetic piece of DNA into the filamentous bacteriophage gene III.(J.K.Scott and G.P.Smith, Science 249: 386-39).0,1990; J.L.Devlin, L.C.Panganiban, P.E.Devlin, Science 249: 404-406,1990; S.E.Cwiria, E.A.Peters, R.W.Barrett, W.J.Dower, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87: 6378-6382, 1990). In these cases, also just combinatorialStabilize the protein, not the segment of the peptide generated inDisplay regions on protein domains from other sources to facilitate their displaybe able to. The gene or gene segment in such a region isInserted into the phage DNA and on the surface of bacteriophage proteinsExpressed as a domain with variable sequence content. Bacteriophage plasticAmplification of the polymerase chain reaction, followed by DNA sequencing,The gene that generated the sequence of the peptide that binds to the scepter is identified. Another advantage of combinatorial screening is that it can be used in further cycles of screening.More refinement of screening. Preferably, screeniniAn additional cycle of aging results in a stronger bond, i.e., a lower apparent Kd.Provide higher stringency conditions for selection. Higher strikeThe conditions of the linguistic conditions include increasing the temperature, decreasing or increasing the ionic strength,Achieved by fixing agents and other increases, or a combination thereofCan be. For example, cells can be infected with a population of affinity-purified phages.This allows the next choice by affinity to be up to one million of the original choice.To be able to recover and amplify bacteriophage usingCan be. In such a typical case, the method can be applied to tubes of approximately 1 ml volume.At least 108Access to different peptides. Usually, in the third step, the L-peptide is detected and then detected or identified.The steps are used to sequence or identify the sequence represented by the L-peptide. InspectionMany means of identification or identification are known in the art for combinatorial libraries.Have been. In the use of a library of combinatorial peptides, each bindPeptides or enriched peptides are converted to amino acids by Edman degradation, for example.Can be sequenced or identified by other means. For example, unionThe position on the grid occurred in a controlled manner, orAre chemically labeled labels, including radiolabeled targets, unique binding nucleic acid labels, massFinal mass determined by analysis (see PCT / US95 / 03355, which is(Incorporated herein by reference), a smaller subpool orIterative resynthesis and screening of submixtures (Zuckermann et al., J.. of Medicinal Chem., 37 (17): 2678-2685 (1994))Or any combination of these).Alternatively, "hits" can be identified by other known techniques. BacteriophaIn the use of image display, amplification and amplification of the DNA sequence encoding the peptide in question are usuallyAnd test to estimate the sequence. Usually, in the fourth step, the sequence of the L-peptide or L-protein is recorded.The same amino acid sequence using D-amino acids rather than L-amino acidsIs used to make D-peptide or D-protein. These D-peptidesOr the D-protein corresponds to the mirror image of the selected combination peptide. WhereAre amino acids corresponding to D-receptors made for screensIt can interact with the original L-target receptor having an acid sequence. again,Such receptors are, for the purposes of the present invention, unique receptors, enzymes,Lumon, and others seeking to produce D-peptide ligands for themOf proteins. An important aspect of the present invention is the ability to clone intoNot only purify the position (recognition loop), but also the frame, especially the antigen binding siteL-antibody or a portion thereof by purifying a Fab fragment havingFor example, to display Fab fragments. In particular, although not exclusive,All of the peptides and proteins displayed on the phage are the original D-antibodies.Contains at least the antigen-binding loop of a monoclonal antibody raised againstThus, it interacts with the original L-type antigen, for example with the natural receptor in the body.Have a working awareness. As described above, the present invention provides that these loopsAnd that it can be modified by phage display.Includes that some design can be performed so that purification occurs in phageInclude. Possible modifications by phage display include extensive frame modifications, recognitionWith non-antibody frame to carry loops (folding of other proteins)), And possibly removal of the frame containing the insertion of the cystine cross-linkIncludes a decrease in altitude of a certain magnitude. Modification and selection of antibody components by phage displayAlternatives are known in the art, excluding D-antibodies, and "semi-synthetic antibodiesKnown as "body libraries" (C. Barbas et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 89: 4457, 1992). Useful for these modifications and end productsThe ability to effect these modifications with effect is due to the ability of the D-peptide or D-proteinRegarding the invention described herein, assigning the required recognition surface to quality,Special, precedentIt is important to note that it has no significance. As mentioned above, D-antiThe body or fragments thereof are the result for proteolysis and are immunogenicWould be an effective form of humanization. Therefore, the antibody was significantly modifiedEven so, it retains humanization in the D-form. This is caused by phage displayAnd any form made from D-amino acids. This natural humanization is semi-Significant modifications and differences in the normal application of phage display of a library of synthetic antibodiesYou. Therefore, according to the present invention, the activity is selected to be retained, included andScreened mutations progressively reduce Fab frame sizebe able to. Size reduction in a single jump is important interaction with the frameIt can cause significant loss of action and deform the coupling loop. Fab fragment MComputer simulation study of antigen recognition loop H2 from cPC603 (V.P.C.ollura, P.J. Greeny and B. Robson, Protein Engineering, 7: 2211-223, 199In 2), an important interaction between the antigen recognition loop and the rest of the Fab fragmentWas found to be present. Also, the antigen recognition loops themselves are on the heavy chainAnd three on the light chain, presented for binding andD-peptides that can be purified and do not use a supporting molecule scaffoldCan be synthesized individually or, for example, using an oligoglycine spacer.Can be combined using They may also be Fab fragments or antibody componentsCan be presented on scaffolds other than, where the active loop has three choicesBy the antibody recognition loop. Typically, these are used in binding studies.Loop that is identified as the most tightly bound to the target or its analog.But three loops in the heavy chain, as in most antibodies studiedAre expected to beHas a broader interaction. Similarly, the two larger loops of the heavy chainWithout the three smaller loops, a choice can be made on a case-by-case basis. proteinWhen exploring a scaffold, one or more in the direction of the rearward (backward) arrayAn operation that involves using the above loop may be required. AllIn the previous example, the first proposed construct was typically purified by phage display.Is done. If necessary, these reagents can be used in rational design toProbe the receptor or, if the receptor has a known structure,By modeling the structure, it may be necessary to purify it as a drug.And, if necessary, for the purpose of design and purification.Compares the designed L-peptide with the inverted form of the ligand and, if necessary,Optionally, a comparison with the receptor sequence can be included. Oral delivery and useRequires further purification to increase potency and improve pharmacokinetic propertiesSometimes. Addition of groups, e.g. additional amino acid residues at either endMay require further chemical modification, including the extension of. It may also be necessary to use a presentation medium, for example, a liposome system.You. Peptide extensions for targeting and cell entryFor example, antibodies based on L-amino acids, and preferably L-amino acids with a long half-life,Hormones can be included. Can be made from D-amino acids, andPeptide and protein extensions that can still be active in formAnd addition of magainin, cecropin and other lytic peptides, viral cellsEntry peptides, endosomal escape peptides derived from viruses, such asCan cross the IgG3 peptide, or the blood-brain barrierIncludes possible milk protein sources. In one embodiment, an antibody composed entirely or essentially of D-amino acidsIndicates that the corresponding L-antibody made from L-amino acids is a peptide made from D-amino acids.Made from L-amino acids in an effectively identical manner to peptides or proteinsInteracts with selected peptides and proteins. L-Pep for required pharmacological targetA D-peptide or sequence that is otherwise identical to the sequence of thePrepares a monoclonal antibody against the D-protein and thenBy creating a D-antibody that corresponds to the antibody, the substance passes through the virtualReflected twice, and as a molecular recognition analog of the endogenous or natural pharmacological target.Leave the antibody binding site. The pharmacological target can be any natural endogenous or other biological or non-natural ligandOr receptors, such as hormones, neuropeptides, virions,It can be a physically active peptide or an enzyme. Target L-polypepTide or L-protein is a binding site for receptors or other protein targetsOr a subdomain or domain of a receptor or other target or receptorEpitoe in or near all or part of a putter or other targetGroups or sets of epitopes can be displayed. L-polypeptide or L-Generating the corresponding D-amino acid sequence using the amino acid sequence of the protein,The D-amino acid sequence of D differs only in enantiomeric form andA sequence identical to the sequence of the L-peptide or L-protein of the target amino acid comprisingColumn. Amino acids alter the antigenicity or immunogenicity of the synthesized D-peptide antigenAll amino acids are changed unless otherwise changed and unless the specificity of the resulting D-antibody is altered.There is no need to convert from L-type to D-type.D-antibodies and D-peptides that are analogs of ligands or receptorsManufacture of tide The present invention provides a ligand or receptor analog D-Methods for identifying antibodies or D-peptides are provided: ligands or receptorsA LA comprising the ligand of the receptor or the ligand binding site.Determine the amino acid sequence; including the ligand or ligand binding site of the receptorSynthesizing a L-peptide or a D-peptide corresponding to the L-polypeptide;Producing a Monoclonal Antibody Against the D-Peptide: Monoclonal AntibodyA D-antibody comprising a D-amino acid sequence corresponding to the L-amino acid sequence ofAnd specific binding to the ligand or ligand binding site of the receptorAssay the D-antibody. L-peptide or L-polypeptideThe corresponding D-peptides or D-polypeptides are those whose L-amino acids have their correspondingL-peptide or L-polypeptide except that it is substituted with a D-stereoisomerAnd has the same amino acid sequence from the carboxy terminus to the amino terminus. As long as the molecule has a stereochemical configuration and can produce enantiomers of the moleculeThis method can be used for any ligand or receptor.. Thus, ligands are non-peptide, non-naturally occurring ligands, and D-And a mixture of L-amino acids. In generalSynthesizing any epitope of a ligand or receptor using D-amino acidsAnd attached to a carrier molecule to render it immunogenic. like thisIn some cases, the D-epitope can be considered a hapten. Almost 35 residuesD-proteins, which do not use such carrier molecules, are always immunogenic.Not sex. Because it is a major histocompatibility for T-cell receptorsPresent on antigenThis is because there is little possibility of being cut when it is performed. Raised against D-epitopeD-peptides or proteins made from the identified antibodies, for example,By generally inducing protein dimerization or oligomerization,Activation of the scepter can be included. In the case of a non-peptide ligand or receptor for which a mirror image analog is desired,Synthesize enantiomers of non-peptide ligands or receptors and characterize themThis method is modified to be used to generate antibodies that bind differentially.Then, the L-amino acid sequence of the antibody or a portion thereof, e.g., a Fab fragmentAnd the corresponding D-antibody is synthesized from the L-amino acid sequence. Also apply this method to achiral ligands or receptors or moleculesbe able to. For achiral ligands or receptors or molecules,The method comprises the steps of: using an achiral ligand, receptor or other molecule.To produce L-antibodies; L-antibodies or portions thereof, eg, Fab flagsDetermining the amino acid sequence of the fragment; synthesizing the corresponding D-antibody;D-antibodies for specific binding to Lal ligands, receptors or other moleculesAssay the body. D-A chiral or achiral, natural or non-naturally occurring non-conjugated antibody is desired.The choice of ligands or receptors or other molecules depends on suchInformation about the offspring and, if present, the amino acid sequence of such molecules.Achieved by using information. L-polypeptides or naturally occurring proteinsThe choice of the ligand binding site of the protein can be based on known ligand binding sites, receptors orThis is accomplished by referring to the literature for the amino acid sequence of the ligand. thisSuch a molecule is a peptide that has not yet been sequenced.In this case, the skilled artisan will use well-known peptide sequencing methods to deliver the peptide.Columns can be determined. Corresponds to the L-amino acid sequence of a peptide ligand, receptor or other moleculeThe synthesis of the antigen of the D-polypeptide is accomplished using chemical synthesis. PreferablyIs a stepwise Merrifield form of a known solid phase developed for the synthesis of L-peptidesPeptide synthesis technology is used, but in this case the D-aminoSynthesizing antigens for D-polypeptides using amino acids or protected D-amino acidsI do. Other methods of synthesizing D-polypeptide antigens, for example, by step-wise synthesisCovalent bonding of the produced monomers is conceivable. Antigen of D-polypeptide of the present inventionAnd other means for synthesizing D-polypeptides or D-antibodies are known in the art.The present invention uses a method for synthesizing a D-polypeptide which is known and still to be developed.Can be implemented. In general, solid phase synthesis of D-peptide consists of the following steps: Unprotected D-amino acidProtected on an inert solid support through a protected carboxyl or amino groupAttaching an amino acid; protection on the amino or carboxyl group of the first D-amino acid.Selectively remove protecting groups; have appropriate protected amino or carboxyl groupsThe next D-amino acid is introduced and already taken up on the solid support with the second D-amino acid.Under conditions that allow the formation of an amide bond with the attached first D-amino acid.React 2D-amino acids. The amino or carbohydrate of the second D-amino acid is thenThe protecting group of the xyl group is selectively removed. D-amino to synthesized D-peptideThis procedure is repeated for each successive addition of acid. D-peptide is completely synthesizedIf any protecting groups remain on the D-peptide after removal, they are formed andThe specifically synthesized D-peptide is cleaved from the solid support. largeTo make D-peptides, chemically synthesized D-peptides are used in the art.Can be chemically coupled using methods known in the art. Once the D-polypeptide antigen is synthesized, it is used to produce antibodiesI do. The antibodies to be produced can be monoclonal antibodies or phage-generated Fab fragments.And both methods are known in the art. AboveAs described above, to make a D-peptide or protein immunogenic, a carrier moleculeMay be required. In particular, a major histocompatibility complex antigen for T-cellsThis is because the D-molecule cannot be cleaved to present the D-molecule.Kits already primed with chemical groups to bind to peptide epitopesThus, such molecules are commercially available. Typical available proteinsQuality is keyhole limpet hemocyanin and bovine serum albumin. D-The production of monoclonal antibodies against polypeptides or D-peptidesUsing standard methods for the production of monoclonal antibodies specific for the antigenAchieved. Phage-generating peptides are described in the following literature: PCT / US91/04384 (Dower et al., Submitted June 19, 1991); PCT / US91 / 02989 (Dower et a.l., submitted May 1, 1991); PCT / US92 / 08879 (Schatz et al., October 15, 1992)PCT / US94 / 05796 (Aldwin et al., Filed May 23, 1994); US PatentNo. 5,491,074 (Aldwin et al., Filed May 24, 1994); and PCT / FR / 00127 (Sodoyer et al., filed February 2, 1995); all of which are incorporated by reference.Part of this specification. Monoclonal antibody or phage-generated Fab fragmentHas been described in the art for specific binding of D-polypeptides to antigens.Screened using known methods. The selected antibody orIs a portion of an antibody, e.g., a modified Fab fragment or a single-chain Fv orThe sulfide-binding Fv fragment is then isolated and sequenced. Fv fragmentThe smallest functional part of an antibody required for antigen binding. Reiter et al., Protein Engineering, 7 (5): 697-704 (199). Then, the binding site is displayedBody or protein, Fab fragment, single chain Fv fragment or disulfUsing the L-amino acid sequence of the F-fragment binding Fv fragment, the D-antibody of the inventionThe corresponding D-amino acid sequence is determined. Whole L-antibody or a part thereof, eg,For example, Fab fragments, single-chain Fv fragments and disulfide-bound FvA D-antibody of the present invention comprising a D-amino acid sequence corresponding toTo synthesize. When using phage display of antibodies, the antibody or portions of the displayed antibody can bePhage display in these binding recognition loops or folding of supporting antibodiesSuch antigens can be further purified; such antigens are called "semisynthetic" (C.F. BarbAs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89-4457, 1992). Usually an antibody or FabModifications to the frame of the fragment most typically result in loss of humanizationAnd does not provide any advantage in clinical use. However, as mentioned earlier,The main significance of Ming is that the decreased protease resistance properties and immunogenicity of the D-antibodyImplies humanization of the integration to the extent that modifications to the frame are generally not limitingIs Rukoto. Ultimately, the present invention relates to the practice of phage display,Modifications to the frame at risk of loss, e.g.,Reduction in the size of the antibody and the size of the antibody frame in phage displayAllow a sharp reduction. This is done by performing screening at each size reduction stage.Progressively smaller to retain activityCloning with randomized amino acids by phage display on the frameIncludes a gradual reduction with enrichment by passing through a modified Fab head. In contrastToo large a reduction in size in a single step is the interaction between the loop and the frame.There is a risk of losing overall activity due to too large a change in action. The present invention provides for the production of D-Greatly expand the scope of protein. Genetics that express proteins as a starting pointBy taking the offspring sequence, or a portion thereof, the present invention alsoProvide a means to directly translate the information in the pharma- ceutical product. The D-antibodies of the present invention include D-analogs of the complete antigen as well as D-analogs of portions of the antibody.The therapeutic composition, including both the body and the agonist or antagonist orCan be used as a catalyst. Also, specific antigens, such as viruses orUses D-antibodies to specifically bind targets expressing bacterial antigens.Can be. Fab fragment not only of D-antibody but also of L-antibodyD-antibodies, which are analogs of D-peptides in the other or other portions, are the corresponding L-antibodies.Has several advantages over: First, biological systems and proteins andSince enzymes are generally specific for L-polypeptides or L-amino acids,The D-antibodies of the invention are resistant to proteolysis in the gastrointestinal tract and throughout the body.is there. Second, D-peptides are generally less immunogenic than the corresponding L-peptides.Thus, the D-antibodies of the present invention are likely to elicit an immune response in a human host.This is an important property for therapeutic compositions (provisional US patent application Ser.No. 60 / 005,508, filed Oct. 10, 1995 and provisional US patent application Ser. No. 60 / 014,433.Nos., Which are hereby incorporated by reference).D-peptides that are analogs of ligands or receptors The D-antibodies of the present invention are essentially D-peptides, and these D-peptides arePeptides or non-peptides, natural or non-natural, chiral or AkiraD-, an analog of a ligand or receptor capable of binding toIs a peptide. D-antibodies are receptors or ligands or any chiral or achiral,It can be designed to bind to natural or non-naturally occurring molecules. ReIf one desires a D-antibody that can specifically bind to gand, it is described herein.According to the method described, a template from which the amino acid sequence is obtained (the ligand is a polypeptide)Or monoclonal or in phage developmentUse ligands as antigens to generate L-antibodies, whether or not they are presentProduced. The ligand may be a naturally occurring polypeptide or peptide,Peptides, such as hormones, non-naturally occurring peptides or non-peptides, andAnd chiral or achiral compounds. D that specifically binds to the receptor-When an antibody is desired, it is produced according to the methods described herein. One formIn one embodiment, using the receptor or a portion thereof as the original polypeptide,From this polypeptide the L-amino acid sequence can be determined and the correspondingThe antigen of the D-polypeptide is synthesized. The use of combinatorial libraries isWell-known in PCT / IB95 / 00560 (Hodges et al., June 13, 1995)(Submitted) and PCT / US95 / 03355 (Benkovic et al., Submitted March 23, 1995) (theseBoth of which are incorporated herein by reference). A ligand is generally a member of a ligand binding pair, ie, a ligand and a receptor.-. Ligand part or ligand tableThe surface specifically binds to a portion of the receptor or the surface of the receptor. Most frequentTraditionally, ligands can exert a biological effect, i.e.,Can be In general, the overall structure or molecular weight of a ligandThis is not a necessary condition. Ligands are often L-peptiOr L-polypeptide but other non-peptide molecules, such as steroids, Cofactors, neurotransmitters, neurotransmitter analogs, non-peptide hormonesAnalogs of non-peptide hormones, and nucleotides, nucleosides and sugarsAnd modified forms of non-peptide molecules are considered as ligands. Also, heavenNon-existent ligands and achiral ligands are possible. Usually LiganWill not include D-polypeptides or D-amino acids. Usually the receptionAffinity of ligand for ligand (relevant temperature, ionic strength, and pHFor example, the apparent Kd) in human physiological conditions is lower than 1 mM, preferably1 pM to 100 μM or lower than 100 μM, more preferably 10 pM to 1 μM or 1 μMM, most preferably between 100 pM and 10 nM or below 100 nM. D-ligandUsually refers to non-peptide ligands having a D-configuration. Receptors generally refer to members of a ligand binding pair. Receptor is not always specificIs not considered a biological receptor with the biological function of In fact, the receptorIs a ligand binding pair with a molecular recognition surface that normally binds non-covalently to the ligandCall one member. The receptor has at least one ligand binding with such a surface.Will have a joint site. Generally, the ligand binding site is solvent accessible andOr water accessible. Ligand binding sites often rely on peptide bindingIt is composed of L-amino acids linked together, for example,A biological receptor for Mont. otherIn some examples, the receptor is an organic molecule, such as a crown ether, or a nucleic acid.For example, it can be DNA. The D-antibodies are in the conformation they have in the whole D-antibody (theTherefore, also, the corresponding L-peptide is typical for monoclonal L-antibodies.Will have a mirror image of the conformation that it will have.A D-amino acid sequence, including modifications to maintain the fragment or another fragment.Refers to antibodies or fragments thereof that encompass the sequence. Fragments are typicallyIs the binding recognition loop of the antibody involved in direct interaction with the antigen, the heavy chain of the antibodyThere are three such loops on and three such loops on the light chainExists. For example, the conformation of the antigen-combination loop from Fab McPC603(V.P.Colura, P.G.Greany and B.Robson, Protein Engineering, 7: 221-223, 1994) may depend critically on interactions with Fab antibody fragments.Described. Modifications can be of various types. Generally, the D-antibodyThe noic acid sequence may be made entirely from D-amino acids. In some cases,It may be preferable to include an L-amino acid in the amino acid sequence of the D-antibody.In particular, after reading the method of the invention herein, the molecular recognition surface of the D-antibodyAlthough not entirely composed of D-amino acids,Other regions, if present, are primarily, if not completely, L-amino acids, eg,It is clear that it can be composed of non-variable regions of monoclonal antibodiesWill. Further, the D-antibody may be a single-chain Fab, or any subfragment thereof.Or analog (where the heavy and light chains are linked end-to-end via flexible linkers)And a mini-object (where the heavy and light chains are preferablyTwo residues-like cysteines are added to each chain by fide or similar linkageIn which they are joined together by a single bond).See Reiter et al., Supra. Preferably, there are few ligand binding sitesAt least 90%, more preferably at least 95%, most preferably 96% to 100% or 1Will be made from 00% D-amino acids; where the percentage is the number of D-amino acids /Calculated as the total number of amino acids in the sequence x 100. D-amino acid sequences can be used to create D-antibodies that resemble receptors or ligands.In order to make ligands or receptors for proteins (or peptides)used. When you want an analog to a protein ligand,The D-antibody is made using the Gand's D-amino acid sequence. Protein receptorUse the D-amino acid sequence of the protein receptorTo make a D-antibody. The ligands and receptors for such D-amino acids are D-amino acids.-Can be considered an antigen of a polypeptide; Usually, the protein receptorAlternatively, the D-amino acid sequence of the ligand is completely composed of D-amino acids.Kd is 2 compared to all D-amino acid protein ligands or receptors.In the region of the protein, which does not change worse by more than an order of magnitude, more preferably by an order of magnitude,Substitution of L-amino acids is allowed. D-antigen refers to an antigen having the D-configuration. L-antibody refers to an antibody made from L-amino acids, which is found in nature,Made by immunization of dairy animals, by phage, and truncated orAre modified antibodies, minibodies (single-chain antibodies or their immunoreactive fragments)Production, including, but not limited to,Includes those made by known methods.Detection method The present invention also provides a detection method. The antibodies and peptides of the present invention are peptidesSuch compounds of the invention are particularly suitable for analyte detection because they provide a resistance molecule.You. In general, methods for detecting an analyte involve contacting the analyte with a D-antibody and analyzingDetecting the complex of the precipitate and the D-antibody. Numerous variations in detection methodsThe method can be achieved using the antibodies of the present invention. The antibody of the present invention can beTo separate conjugates from unbound D-antibodies.Separation methods involving additional steps can be applied. Generating a detectable signalComplementary speed varying assays are used, as is known in the art.If used, a washing step is unnecessary. Such assays require the required assay components.Can be performed using a kit containing the components. Affinity for purification of antibodies of the invention and one or more desired analytesCounting analytes can be detected using tee selection. Primarily, analysisThings were discovered at the time of filing this application by methods known in the art and laterBy such methods, antibodies to it may be generated. GeneralIn addition, analytes include ligands for receptors, substrates for binding sites on enzymes,Mon, a non-peptide hormone, neurotransmitter, cofactor, or sugar. The antibodies of the present invention may be labeled, if desired, by covalent or non-covalent means.Detection can be facilitated. Such a label generates a detectable signalEnzymes, fluorescent compounds (including FITC), radioactive atoms (C14 andAnd I125), biotin, and avidin. Preferably, the markerIs attached to the region of the antibody that does not contain the ligand binding site or the C- or N-terminusCan be Labeling also kills cells or inhibits cell growthA toxin can be included. The antibodies of the present invention can be conjugated by enzymatic or electrical detection or by a combination of the two.Can be used as an ion sensor. Other biological components that bind to the ligandAs taught in the art for antibodies, particularly antibodies,Can be used to generate a ligand-specific electrode.Composition The invention also includes pharmaceutical compositions and methods of modulating a biological condition.For example, an effective amount of a D-antibody is contacted with a receptor, andBy blocking the ligand from binding toThe antibodies of the present invention can be used to inhibit the binding of a ligand. ThroughUsually, this amount will be from 1 μg to 100 mg, more preferably from 10 μg to 10 mg or more than 0.01 mg.And most preferably from 0.1 mg to 10 mg. Pharmaceutical compositions comprise a physiologically suitable carrier and a compound of the present invention. thisSuch carriers are known in the art as buffers and coatings.Embrace. All publications and patent applications mentioned in this specification are subject to their respective publications andAnd patent applications are hereby specifically and individually incorporated by reference.Is incorporated herein by reference to the same extent as if indicated.. Having completely described the invention, it will be apparent to those skilled in the art that the spirit of the invention isMany variations and modifications are possible without departing from the scope.
─────────────────────────────────────────────────────フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl.7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12P 21/08 G01N 33/53 G01N 33/53 C12N 15/00 C (81) Designated countries EP (AT, BE) , CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), AU, CA, JP, US