【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】この出願の発明は、細胞骨格
系の調節にバイオタイマーとして重要な役割を果たして
いる細胞内シグナル伝達物質Ｒhoの活性を制御するＧＤ
I（ＧＤＰ dissociation inhibitor）−αをコードする
遺伝子がノックアウト（機能破壊）されているＲho Ｇ
ＤI−α遺伝子欠損動物に関するものである。この動物
は、腎糸球体、腎尿細管および精巣上皮細胞等に病変を
有し、突発性ネフローゼおよび男性不妊症等の疾患モデ
ル動物として有用である。TECHNICAL FIELD The invention of this application relates to a GD that controls the activity of an intracellular signal transducer Rho that plays an important role as a biotimer in the regulation of the cytoskeletal system.
Rho G in which the gene encoding I (GDP dissociation inhibitor) -α has been knocked out (disrupted in function)
It relates to a DI-α gene-deficient animal. This animal has lesions in renal glomeruli, renal tubules, testicular epithelial cells, and the like, and is useful as a disease model animal such as idiopathic nephrosis and male infertility.
【０００２】[0002]
【従来の技術】細胞内シグナル伝達物質の一つであるＲ
hoタンパク質ファミリーには、少なくとの９種類のタン
パク質メンバーが知られており、これらはアクチン細胞
骨格の調節にバイオタイマーとして重要な役割を果たし
ている。また、このＲhoタンパク質は、遺伝子発現や細
胞周期の進行、あるいは細胞外物質の取り込みや放出等
にも関与していることが知られている。2. Description of the Related Art R, one of intracellular signal transducers,
At least nine protein members are known in the ho protein family, which play an important role as a biotimer in the regulation of the actin cytoskeleton. It is known that the Rho protein is involved in gene expression, progression of the cell cycle, uptake and release of extracellular substances, and the like.
【０００３】このＲhoはＧタンパク質の一種であり、２
つの状態（ＧＴＰ結合活性期およびＧＤＰ結合不活性
期）を繰り返す。そしてこの２つの状態の繰り返しは３
種類の制御因子、すなわちＧＤＰ／ＧＴＰ exchange pr
otein（ＧＥＰ）、ＧＴＰase activating protein（Ｇ
ＡＰ）およびＧＤＰ dissociation inhibitor（ＧＤ
Ｉ）によって調節されている。[0003] Rho is a kind of G protein.
The two states (GTP binding active phase and GDP binding inactive phase) are repeated. And the repetition of these two states is 3
Kinds of regulators, ie GDP / GTP exchange pr
otein (GEP), GTPase activating protein (G
AP) and GDP dissociation inhibitor (GD
I).
【０００４】これらの制御因子のうち、ＧＤＩは全ての
Ｒhoタンパク質メンバーに対する制御因子であり、その
主たる機能は、ＧＤＰ結合期のＲhoに選択的に結合し、
このＧＤＰ結合期Ｒhoを細胞質内にとどめ、それがＧＴ
Ｐ結合期へと移行することを防止することにある（例え
ば、Trends. Biochem. Sci. 20: 227-231,1995; Genes
to cells.1:615-632,1996）。[0004] Among these regulators, GDI is a regulator for all Rho protein members, and its main function is to selectively bind to Rho in the GDP binding phase.
This GDP binding phase Rho remains in the cytoplasm,
To prevent the transition to the P-binding phase (for example, Trends. Biochem. Sci. 20: 227-231, 1995; Genes).
to cells. 1: 615-632, 1996).
【０００５】これまでに、Ｒho ＧＤIの様々なイソフォ
ーム（例えば、Ｒho ＧＤI−α、Ｒho ＧＤI−β、Ｒho
ＧＤI−３など）が分子クローニングされ、それらが各
種成体組織で発現し、Ｒhoタンパク質メンバーの各々と
様々に複合体を形成することが明らかにされている。そ
してこのようは発現組織と結合対象の多様性は、各々の
Ｒho ＧＤIが特定のＲhoタンパク質メンバーと何時どの
ように結合するかをコントロールする何らかのメカニズ
ムの存在を示唆するが、そようなメカニズムの詳細は明
らかにされていない。[0005] To date, various isoforms of Rho GDI (eg, Rho GDI-α, Rho GDI-β, Rho GDI
GDI-3) have been molecularly cloned and shown to be expressed in various adult tissues and form various complexes with each of the Rho protein members. And the diversity of expression tissues and binding targets suggests that there is some mechanism to control when and how each Rho GDI binds to a particular Rho protein member, but details of such mechanisms Was not disclosed.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】Ｒho ＧＤIのイソフォ
ームうち、Ｒho ＧＤI−αは牛脳の細胞質画分から最初
に単離され、ラット組織において広範に発現し、Ｒhoメ
ンバーのうちＲhoＡ、ＲhoＢ、Ｒac１、Ｒac２およびＣ
ｄｃ４２と結合することが知られている。また、培養細
胞へのＲho ＧＤI−αタンパク質の微量注入やその遺伝
子のトランスフェクション等によって、細胞骨格の形成
や、細胞形態、細胞運動性、細胞内物質の放出等に対す
るＲho ＧＤI−αの機能が解明されつつある。Among the isoforms of Rho GDI, Rho GDI-α was first isolated from the cytoplasmic fraction of bovine brain, widely expressed in rat tissues, and among the Rho members, RhoA, RhoB, and Rac1. , Rac2 and C
It is known to bind to dc42. In addition, the function of Rho GDI-α with respect to the formation of cytoskeleton, cell morphology, cell motility, release of intracellular substances, etc., by microinjection of Rho GDI-α protein into cultured cells or transfection of its gene, etc. It is being elucidated.
【０００７】しかしながら、このＲho ＧＤI−αの欠損
が動物個体においてどのように作用するかという問題は
全く検討されていない。なお、Ｒho ＧＤI−β遺伝子に
ついてはそのノックアウトマウスが既に作成されている
が、その免疫反応はほとんど正常であることが報告され
ている（Mol.Immunol.34:481-491,1997）。これに対し
て、Ｒho ＧＤI−α遺伝子は、Ｒho ＧＤI−βに比べて
その発現組織が広範であることから、そのノックアウト
は何らかの形質変化を生じさせるものと期待される。そ
して、このような動物個体の形質変化は、Ｒho ＧＤIの
Ｒhoタンパク質に対する制御メカニズムを解明するため
の手がかりを提供するとともに、その形質変化（例え
ば、特定臓器の病変等）はヒト疾患モデルを提供するも
のと期待される。However, the problem of how this Rho GDI-α deficiency acts in animal individuals has not been studied at all. Although knockout mice have already been prepared for the Rho GDI-β gene, it has been reported that the immune response is almost normal (Mol. Immunol. 34: 481-491, 1997). On the other hand, since the Rho GDI-α gene expresses a wider range of tissues than Rho GDI-β, its knockout is expected to cause some trait change. Such a change in the trait of an animal individual provides a clue for elucidating the control mechanism of Rho GDI for the Rho protein, and the change in the trait (eg, lesion of a specific organ) provides a human disease model. Expected.
【０００８】この出願の発明は、以上のとおりの事情に
鑑みてなされたものであり、ＲhoＧＤI−α遺伝子をノ
ックアウトした動物個体を提供することを課題としてい
る。The invention of this application has been made in view of the circumstances described above, and has as its object to provide an animal individual in which the RhoGDI-α gene has been knocked out.
【０００９】[0009]
【課題を解決するための手段】この出願は、前記の課題
を解決する発明として、染色体ＤＮＡのＲho ＧＤＩ−
α遺伝子がその変異配列に相同組換えされた動物胚幹細
胞を初期胚に導入し、この初期胚を雌動物体内で個体へ
と発生させ、産出させたキメラ動物の子孫動物であっ
て、生殖細胞および体細胞染色体ＤＮＡのＲho ＧＤI−
α遺伝子が変異配列に置換されていることを特徴とする
Ｒho ＧＤI−α遺伝子欠損動物を提供する。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is directed to an invention for solving the above-mentioned problems.
An α-gene homologously recombined with the mutant sequence is introduced into an embryonic embryonic stem cell into an early embryo, and this early embryo is developed into an individual in a female animal, and is a progeny animal of a chimeric animal produced, comprising a germ cell And Rho GDI- of somatic chromosomal DNA
An Rho GDI-α gene-deficient animal characterized in that the α gene has been replaced by a mutant sequence.
【００１０】また、この発明においては、動物がマウス
であることを好ましい態様としてもいる。In a preferred embodiment of the present invention, the animal is a mouse.
【００１１】[0011]
【発明の実施の形態】この発明のＲho ＧＤI−α遺伝子
欠損動物は、公知のジーンターゲッティング法により、
例えば以下のとおりに作成することができる。先ず、Ｒ
ho ＧＤI−α遺伝子のコード領域（エクソン配列）にネ
オマイシン耐性遺伝子を挿入して、Ｒho ＧＤI−α遺伝
子の一部配列に対する変異配列（ターゲッティングベク
ター）を作成する。このターゲッティングベクターを哺
乳動物の胚幹細胞（ＥＳ細胞）に導入し、染色体ＤＮＡ
のＲho ＧＤI−α遺伝子の一部配列がターゲッティング
ベクターに相同組換えされたＥＳ細胞を選択する。この
遺伝子相同組換え細胞の選択は、Ｇ４１８を細胞培地に
添加してネオマイシン耐性遺伝子を持たない非組換え細
胞を除去することによって行うことができる。選択され
た遺伝子組換え細胞のＲho ＧＤI−α遺伝子は、そのコ
ード配列中にネオマイシン耐性遺伝子が挿入された変異
配列であり、Ｒho ＧＤI−αを産生することができな
い。なお、ターゲッティングベクターがランダム位置に
挿入された組換え細胞は、例えば、実施例に例示したよ
うなサザンブロット解析またはＰＣＲ解析等の方法によ
り除去することができる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The Rho GDI-α gene-deficient animal of the present invention can be prepared by a known gene targeting method.
For example, it can be created as follows. First, R
A neomycin resistance gene is inserted into the coding region (exon sequence) of the ho GDI-α gene to prepare a mutant sequence (targeting vector) for a partial sequence of the Rho GDI-α gene. This targeting vector is introduced into mammalian embryonic stem cells (ES cells) and chromosomal DNA
ES cells in which the partial sequence of the Rho GDI-α gene has been homologously recombined with the targeting vector. The selection of the homologous recombinant cells can be performed by adding G418 to the cell culture medium to remove non-recombinant cells not having the neomycin resistance gene. The Rho GDI-α gene of the selected transgenic cell is a mutant sequence having a neomycin resistance gene inserted into its coding sequence, and cannot produce Rho GDI-α. The recombinant cells into which the targeting vector has been inserted at random positions can be removed by, for example, Southern blot analysis or PCR analysis as exemplified in the Examples.
【００１２】次いで、この遺伝子組換えされたＥＳ細胞
を哺乳動物の初期胚（胚盤胞）に注入し、この初期胚を
雌動物の体内で個体へと発生させ、キメラ動物を産出さ
させる。そして、このキメラ動物と野生型動物とを交配
して子孫動物を産出させ、これらの子孫動物の中から、
対立遺伝子の両方に変異型Ｒho ＧＤI−α遺伝子を有す
る動物個体を選別することによって、Ｒho ＧＤI−α産
生能を持たない遺伝子欠損動物を作成することができ
る。Next, the genetically modified ES cells are injected into an early embryo (blastocyst) of a mammal, and the early embryo is developed into an individual in a female animal to produce a chimeric animal. Then, the chimeric animal and the wild-type animal are bred to produce progeny animals, and among these progeny animals,
By selecting an animal individual having a mutant Rho GDI-α gene in both alleles, a gene-deficient animal having no Rho GDI-α production ability can be prepared.
【００１３】動物種としては、ＥＳ細胞株が樹立されて
いるマウス、ラット等の動物を例示することができる
が、ＥＳ細胞の操作が容易で、しかも個体発生から産
出、成長の期間が短期間であるマウスを用いるのが好ま
しい。Examples of the animal species include animals such as mice and rats in which an ES cell line has been established. The manipulation of ES cells is easy, and the period of production and growth from ontogeny is short. It is preferable to use a mouse that is
【００１４】[0014]
【実施例】以下、実施例を示してこの発明のＲho ＧＤI
−α遺伝子欠損動物についてさらに詳細かつ具体的に説
明するが、この発明は以下の例に限定されるものではな
い。なお、以下の実施例における試料の調製等は以下の
方法により行った。 方法１：ＤＮＡの抽出 ＥＳ細胞のＤＮＡは、以下のとおりに抽出した。すなわ
ち、ＥＳ細胞を500μlの溶解バッファー（100 mM Tris-
Cl,pH 8.0, 5 mM EDTA, 0.2% SDS, 200 mM Nacl, 0.1 m
g/mlのproteinase K含有）中で５５℃一晩溶解した。Ｄ
ＮＡはフェノールおよびフェノール／クロロフォルム
（１：１）で抽出し、500μｌのイソプロパノールに沈
殿させた。ＤＮＡペレットは70%エタノールで洗い、乾
燥させた後、10 mM Tris-Cl(pH 8.0)および1 mM EDTA溶
液（100μｌ）に再浮遊させ、このＤＮＡサンプルの約
２μｇをサザンブロット分析に使用した。The present invention will now be described by way of examples with reference to the Rho GDI of the present invention.
The -α gene-deficient animal will be described in more detail and specifically, but the present invention is not limited to the following examples. The preparation of samples in the following examples was performed by the following method. Method 1: DNA extraction ES cell DNA was extracted as follows. That is, ES cells were mixed with 500 μl of lysis buffer (100 mM Tris-
Cl, pH 8.0, 5 mM EDTA, 0.2% SDS, 200 mM Nacl, 0.1 m
g / ml of proteinase K) at 55 ° C overnight. D
NA was extracted with phenol and phenol / chloroform (1: 1) and precipitated in 500 μl of isopropanol. The DNA pellet was washed with 70% ethanol, dried, resuspended in 10 mM Tris-Cl (pH 8.0) and 1 mM EDTA solution (100 μl), and about 2 μg of this DNA sample was used for Southern blot analysis.
【００１５】また、マウス尾部ＤＮＡの抽出は、１ cm
の尾部先端を、溶解バッファー（50mM Tris-Cl,pH 8.0,
100 mM EDTA, 0.5% SDS, 0.5 mg/mlのproteinase K含
有）中で溶解させることを除き、ＥＳ細胞のＤＮＡ抽出
と同一の方法により行った。 方法２：サザンブロット分析 プローブは、Multiprime DNA labeling kit（Amersham
社製）を用い、そのプロトコールに従って、[α-32Ｐ]
−ｄＣＴＰにより放射標識した。ブロットしたメンブレ
ンは、0.1％ＳＤＳ含有の２×ＳＳＣで簡単に洗った
後、十分な量のQuickHyb hybridization solution（Str
atagene社製）中で少なくとも１５分間６５℃でプレハ
イブリダイズした。放射標識したプローブは100℃で２
分間変性させ、プレハイブリダイゼーション溶液に添加
し、６５℃で２時間インキュベートした。ハイブリダイ
ズさせたメンブレンは0.1％ＳＤＳ含有の２×ＳＳＣに
より室温で５分間洗浄した後、同一バッファーで６５℃
３０分間洗浄し、Biomax MS film（Kodak社製）に−８
０℃で一晩露出させた。 方法３：ＰＣＲ分析 前記方法１で抽出したＤＮＡサンプル１μｇを、５０μ
ｌのＰＣＲ溶液［10 mM Tris-Cl,pH 8.3, 50 mM KCl,
1.5 mM MgCl2, 0.2 mMの各dNTP, 0.5μM の各プライマ
ー,および1.25 unitのTaKaRa Taq Polymerase（宝酒造
社製）］に混合し、この溶液をミネラルオイル１滴で被
覆した。ＰＣＲサイクルの後、反応溶液１０μｌを２％
アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで
染色し、写真撮影した。ＰＣＲプライマーおよび反応条
件は以下のとおりである。Further, extraction of mouse tail DNA was performed by 1 cm
The tail tip of the lysis buffer (50 mM Tris-Cl, pH 8.0,
The extraction was performed in the same manner as in the DNA extraction of ES cells, except that the DNA was dissolved in 100 mM EDTA, 0.5% SDS, and 0.5 mg / ml proteinase K). Method 2: Southern blot analysis Probes were obtained using Multiprime DNA labeling kit (Amersham
Used Company Ltd.), in accordance with the protocol,[alpha-32 P]
-Radiolabeled with dCTP. The blotted membrane was briefly washed with 2 × SSC containing 0.1% SDS, and then a sufficient amount of QuickHyb hybridization solution (Str
atagene) at 65 ° C. for at least 15 minutes. Radiolabeled probe 2 at 100 ° C
Denatured for 1 minute, added to the prehybridization solution and incubated at 65 ° C. for 2 hours. The hybridized membrane was washed with 2 × SSC containing 0.1% SDS at room temperature for 5 minutes, and then washed with the same buffer at 65 ° C.
After washing for 30 minutes, -8 was added to Biomax MS film (Kodak).
Exposure overnight at 0 ° C. Method 3: PCR analysis 1 μg of the DNA sample extracted by the above method 1 was used for 50 μl
l of PCR solution [10 mM Tris-Cl, pH 8.3, 50 mM KCl,
1.5 mM MgCl2 , 0.2 mM of each dNTP, 0.5 μM of each primer, and 1.25 units of TaKaRa Taq Polymerase (manufactured by Takara Shuzo)], and the solution was coated with one drop of mineral oil. After the PCR cycle, add 10 μl of the reaction solution to 2%
Electrophoresed on agarose gel, stained with ethidium bromide and photographed. PCR primers and reaction conditions are as follows.
【００１６】 野生型Ｒho ＧＤI−α断片（239-bp）のＰＣＲ：反応条件：９４℃３０秒間；（９４℃３０秒間、６０℃
１分間、７２℃２分間）×３０サイクル；７２℃５分間 変異型Ｒho ＧＤI−α断片（370-bp）のＰＣＲ：反応条件：９４℃３０秒間；（９４℃３０秒間、５５℃
１分間、７２℃２分間）×３０サイクル；７２℃５分間 方法４：組織サンプルの調製と分画 ８週齢から１６週齢のマウスの各組織を細片化し、２−
３mlのホモジェナイズバッファー（20 mM Tris-Cl,pH7.
5, 2 mM EDTA, 0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 10μg/ml o
f PMSF含有）中でホモジェナイズした。ホモジェネート
の半分を保存し、残りを1,000g×10分間で遠心分離し、
非破壊組織および核を沈殿させた。粗メンブレン画分を
含むペレットをホモジェナイズバッファーに再浮遊さ
せ、その上清を細胞質ゾル画分とした。 方法５：ウエスタンブロット分析 タンパク質濃度は、Bio-Rad protein assay（Bio-Rad l
aboratory社製）を用いたBradford法により決定した。
タンパク質サンプルはlaemmli's sammple buffer（Natu
re.227:680-685, 1970）に溶解し、５分間加温し、等量
のタンパク質を１２％ポリアクリルアミドゲルを用いた
ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。タンパク質は半乾燥バッフ
ァーとともに0.8 mA/cm2で９０分間、ニトロセルロース
膜Hybound-C super（Amersham International社製）に
転写した。メンブレンはＴＢＳ（50 mM Tris-Cl,pH 7.
5, 200 mM NaCl）、５％ＢＳＡ（Sigma社製）および0.1
% Tween 20含有のブロッキングバッファーで室温１時間
インキュベートし、次いで、ブロッキングバッファーで
希釈した１次抗体と共に４℃一晩インキュベートした。
シートを0.05% Tween 20含有のＴＢＳで３回（各１０分
間）洗浄した後、ブロッキングバッファーで希釈したho
rseradish peroxidase標識ヤギ抗ウサギＩｇＧまたは抗
マウスＩｇＧと共に室温で１時間インキュベートした。
洗浄の後、シートはＥＣＬシステム（Amersham社製）で
処理し、Hyperfilm-ECL film上に暴露された。抗Ｒho
ＧＤI抗体、抗Ｌｙ ＧＤI抗体、抗ＲhoＡ抗体および抗
アクチン抗体は、Santa Cruz Biotechnology社より購入
した。抗Ｒac１抗体はTransductionLaｂoratory社より
購入した。 方法６：形態分析 組織学的分析のための腎臓はCarnoy溶液で固定し、睾丸
はBouin溶液で固定し、脱水化し、パラフィンに包埋し
た。腎臓は１μm厚、睾丸は５μm厚で切片化し、ヘマト
キシリン−エオシン、Periodic acid Schiff（ＰＡＳ）
およびメセナミン銀で染色した。PCR of wild-type Rho GDI-α fragment (239-bp):Reaction conditions: 94 ° C for 30 seconds; (94 ° C for 30 seconds, 60 ° C
1 minute, 72 ° C 2 minutesInterval) × 30 cycles; PCR at 72 ° C. for 5 minutes of mutant Rho GDI-α fragment (370-bp):Reaction conditions: 94 ° C for 30 seconds; (94 ° C for 30 seconds, 55 ° C
1 minute, 72 ° C 2 minutesInterval) × 30 cycles; 72 ° C. for 5 minutes Method 4: Preparation and Fractionation of Tissue Samples
3 ml of homogenizing buffer (20 mM Tris-Cl, pH7.
5, 2 mM EDTA, 0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 10 μg / ml o
f containing PMSF). Homogenate
, And centrifuge the remaining at 1,000 g for 10 minutes.
Non-destructive tissue and nuclei were precipitated. Crude membrane fraction
Resuspend the pellet in the homogenization buffer.
The supernatant was used as a cytosolic fraction. Method 5: Western blot analysis The protein concentration was determined using the Bio-Rad protein assay (Bio-Radl
aboratory) (Bradford method).
For protein samples, use laemmli's sammple buffer (Natu
re.227: 680-685, 1970), warm for 5 minutes, and equal volume
Of protein was used on 12% polyacrylamide gel
It was subjected to SDS-PAGE. Protein is semi-dry buff
Nitrocellulose at 0.8 mA / cm2 for 90 minutes
Membrane Hybound-C super (Amersham International)
Transcribed. The membrane is made of TBS (50 mM Tris-Cl, pH 7.
5, 200 mM NaCl), 5% BSA (Sigma) and 0.1%
1 hour at room temperature with blocking buffer containing% Tween 20
Incubate, then in blocking buffer
Incubated overnight at 4 ° C. with diluted primary antibody.
Sheets were washed three times with TBS containing 0.05% Tween 20 (10 min each)
Interval) After washing, ho diluted with blocking buffer
rseradish peroxidase labeled goat anti-rabbit IgG or anti
Incubated with mouse IgG for 1 hour at room temperature.
After washing, the sheet is treated with the ECL system (Amersham).
Treated and exposed on Hyperfilm-ECL film. Anti-Rho
GDI antibody, anti-Ly GDI antibody, anti-RhoA antibody and anti-RhoA antibody
Actin antibody purchased from Santa Cruz Biotechnology
did. Anti-Rac1 antibody from Transduction Laboratory
Purchased. Method 6: Morphological analysis Kidneys for histological analysis were fixed with Carnoy's solution and testes
Are fixed in Bouin solution, dehydrated and embedded in paraffin
Was. Kidneys are 1 μm thick, testes are 5 μm thick and sectioned.
Xylin-eosin, Periodic acid Schiff (PAS)
And stained with mesenamin silver.
【００１７】電子顕微鏡サンプルとしては、マウスを２
％パラホルマリンおよび2.5％グルタルアルデヒド含有
の0.1Ｍリン酸バッファー（pH 7.3）で２０分間潅流固
定し、切断した後、各組織を同溶液中に４℃２時間浸し
た。サンプルは同バッファーで１時間洗浄し、１％の四
酸化オスミウムで４℃２時間固定した。洗浄後、サンプ
ルはエタノール系列で脱水化し、ＬＵＶＥＡＫ-812（Na
calai Tesque社製）に包埋した。超薄切片（60-80nm）
を調製し、ＴＥＭ-1200ＥＸ電子顕微鏡（ＪＥＯＬ社
製）で検査した。 方法７：血液および尿分析 マウスを自由な摂食、摂水条件化で飼育し、２４時間の
尿を採取した。また、血液サンプルは１２週齢のマウス
から採取した。血清および尿タンパク質は、Bradford法
により測定した。血清および尿のクレアチニン、血清の
全コレステロールおよび血尿窒素は、測定キット（和光
純薬社製）により数値化した。また、クレアチニン-ク
レアランアス（Ｃcr）は、以下の式により算出した：Ｃ
cr＝ＵｘＶ／Ｐ（Ｐ＝血漿クレアチニンレベルmg/ml、
Ｕ＝尿クレアチニンレベルmg/ml、Ｖ＝２４時間の尿ml/
day）。 方法８：In Vitro受精 各遺伝型の雌マウスを８週齢で過排卵させた。過排卵
は、妊娠した雌ウマの血清（ＰＭＳ：帝国臓器社製）５
IUを腹内腔注射し、次いで４８時間後にヒト絨毛性ゴナ
ドトロピン（ｈＣＧ：帝国臓器社製）５IUを注射するこ
とにより行った。卵子を卵管から採取し、精子とともに
一晩インキュベートし、偽妊娠マウスの卵管に移植し
た。As an electron microscope sample, two mice were used.
After perfusion fixation with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.3) containing 2.5% glutaraldehyde and 2.5% paraformalin for 20 minutes, and after cutting, each tissue was immersed in the same solution at 4 ° C for 2 hours. The sample was washed with the same buffer for 1 hour and fixed with 1% osmium tetroxide at 4 ° C. for 2 hours. After washing, the sample was dehydrated in an ethanol series, and LVEAK-812 (Na
calai Tesque). Ultra-thin section (60-80nm)
Was prepared and inspected with a TEM-1200EX electron microscope (manufactured by JEOL). Method 7: Analysis of blood and urine Mice were bred under free feeding and drinking conditions, and urine was collected for 24 hours. Blood samples were collected from 12-week-old mice. Serum and urine proteins were measured by the Bradford method. Serum and urine creatinine, serum total cholesterol and blood urinary nitrogen were quantified using a measurement kit (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). In addition, creatinine-creatalanus (Ccr) was calculated by the following formula: C
cr = UxV / P (P = plasma creatinine level mg / ml,
U = urine creatinine level mg / ml, V = 24 hour urine ml /
day). Method 8: In Vitro Fertilization Female mice of each genotype were superovulated at 8 weeks of age. Superovulation was performed using serum from pregnant mares (PMS: Teikoku Organs) 5
IU was injected intraperitoneally, and 48 hours later, 5 IU of human chorionic gonadotropin (hCG: Teikoku Organs) was injected. Oocytes were collected from the fallopian tubes, incubated overnight with sperm, and implanted into the fallopian tubes of pseudopregnant mice.
【００１８】次に、Ｒho ＧＤI−α遺伝子欠損マウスの
実施例を示す。 実施例１：Ｒho ＧＤI−α遺伝子欠損マウスの作成 (1)マウスＲho ＧＤI−α遺伝子のクローニング ウシＲho ＧＤI−αｃＤＮＡ（Oncogene. 5:1321-1328,
1990）から調製したプローブを用いて、マウスｃＤＮＡ
ライブラリー（Stratagene社製）をスクリーニングし、
ポジティブな８クローンをpBluescript IIベクターにサ
ブクローニングした。その結果、マウスＲho ＧＤI−α
遺伝子の全長オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
を含む1780-bpのｃＤＮＡ断片を得、これを用いて129SV
Jマウスゲノムライブラリー（Stratagene社製）から、
マウスＲho ＧＤI−α遺伝子のオーバーラッピングクロ
ーンを単離し、そのｃＤＮＡ配列に従ってマッピングし
た。 (2)Ｒho ＧＤI−α遺伝子ターゲッティングベクターの
構築（図１参照） ＭＣ１プロモーターの支配下にネオマイシン耐性遺伝子
とジフテリア毒Ａ遺伝子を有するpBluescript neo/DT-A
ベクターのSmaI部位に、Ｒho ＧＤI−αエクソン１の上
流から５’側のHpaI−SphI断片（4.5-kb）を挿入し、次
いで、エクソン３の下流から３’側のXbaI断片（3.2-k
b）をベクターのEcoRV部位に挿入することによって、Ｒ
ho ＧＤI−α遺伝子の全エクソンをカバーする領域がネ
オマイシン耐性遺伝子カセットによって置換されたター
ゲッティングベクターを構築した。 (3)遺伝子組換えＥＳ細胞の選択 前記(2)のターゲッティングベクターをNotIで開列して
直鎖状とし、エレクトロポーレーション法によって129/
SvＣＣＥ ＥＳ細胞（A practical approach. IRL pres
s, London.71-112, 1987）に導入した。具体的には、タ
ーゲッティングベクター50μｇとＣＣＥ ＥＳ細胞５×1
07個をＰＢＳ(-)に浮遊させ、Electro Cell Manipulato
r（ＢＴＸ社製）を用いて、270Ｖおよび500μＦで処理
した。ＥＳ細胞をＧ418耐性ＳＴＯフィーダー細胞上に
蒔き、10％ＦＣＳ含有のＤＭＥＭ培地で培養し、４８時
間後にＧ418耐性のＥＳ細胞を選別した。Next, an example of a mouse deficient in the Rho GDI-α gene will be described. Example 1: Preparation of mouse lacking Rho GDI-α gene (1) Cloning of mouse Rho GDI-α gene Bovine Rho GDI-α cDNA (Oncogene. 5: 1321-1328,
1990) using the probe prepared from mouse cDNA
Screening library (Stratagene),
Eight positive clones were subcloned into the pBluescript II vector. As a result, mouse Rho GDI-α
Gene full-length open reading frame (ORF)
1780-bp cDNA fragment containing 129SV
From the J mouse genome library (Stratagene),
An overlapping clone of the mouse Rho GDI-α gene was isolated and mapped according to its cDNA sequence. (2) Construction of Rho GDI-α gene targeting vector (see FIG. 1) pBluescript neo / DT-A having a neomycin resistance gene and a diphtheria toxin A gene under the control of MC1 promoter
An HpaI-SphI fragment (4.5-kb) 5 ′ from the upstream of Rho GDI-α exon 1 was inserted into the SmaI site of the vector, and an XbaI fragment (3.2-k) 3 ′ from the downstream of exon 3 was inserted.
By inserting b) into the EcoRV site of the vector, R
A targeting vector was constructed in which the region covering all exons of the ho GDI-α gene was replaced by a neomycin resistance gene cassette. (3) Selection of genetically modified ES cells The targeting vector of the above (2) was opened with NotI to form a linear form, and 129/9
SvCCE ES cells (A practical approach. IRL pres
s, London. 71-112, 1987). Specifically, 50 μg of the targeting vector and 5 × 1 of CCE ES cells
07 cells were suspended in PBS (-), and Electro Cell Manipulato
r (manufactured by BTX) at 270 V and 500 μF. ES cells were seeded on G418-resistant STO feeder cells, cultured in DMEM medium containing 10% FCS, and 48 hours later, G418-resistant ES cells were selected.
【００１９】選別の日７〜１０日後に、Ｇ418耐性クロ
ーンをサザンブロット分析した。すなわち、ＥＳ細胞の
ゲノムＤＮＡをPstＩで完全分解し、0.7％アガロースゲ
ル上で電気泳動してHybond-N+メンブレン（Amersham社
製）に移し、プローブＡ（図１参照）をハイブリダイズ
させて5.6-kb断片を同定したた。また、また、ＥＳ細胞
ＤＮＡのSphＩ断片はプローブＢを用いて同様に分析し
た。これらの分析によって、Ｒho ＧＤI−α遺伝子の一
部配列がターゲッティングベクターに相同組換えされた
２クローン（Ｒho ＧＤI−αヘテロ接合（＋／−）を得
た。 (4)遺伝子欠損マウスの作出 前記(3)で得た遺伝子組換えＥＳ細胞（10-20個）をＣ57
ＢＬ/6マウスの胚盤胞に注入し、この胚盤胞を偽妊娠さ
せたＭＣＨマウスに移植し、キメラマウスを産出させ
た。このキメラマウス（雄）をＢＤＦ１マウス（雌）と
交配させて初代（Ｆ１）マウスを産出させ、その尾部Ｄ
ＮＡのサザンブロット分析（後記(5)と同様の方法）か
ら２倍体染色体の一方にＲho ＧＤI−α変異配列が確認
されたＦ１マウス（雄、雌）を選別し、これらを交配さ
せて第２代（Ｆ２）マウスを得た。 (5)遺伝型の分析 Ｆ２マウスの尾部から定法に従ってＤＮＡを抽出し、サ
ザンブロット分析を行った。また、抽出ＤＮＡを鋳型と
するＰＣＲ分析も行った。Seven to ten days after selection, G418 resistant clones were analyzed by Southern blot. That is, genomic DNA of ES cells was completely digested with PstI, electrophoresed on a 0.7% agarose gel, transferred to a Hybond-N+ membrane (manufactured by Amersham), and probe A (see FIG. 1) was hybridized to 5.6. A -kb fragment was identified. In addition, the SphI fragment of the ES cell DNA was similarly analyzed using probe B. As a result of these analyses, two clones (Rho GDI-α heterozygous (+/-) in which a partial sequence of the Rho GDI-α gene was homologously recombined with the targeting vector were obtained. (4) Production of Gene-Deficient Mice The recombinant ES cells (10-20 cells) obtained in (3) were
The blastocysts were injected into BL / 6 mice, and the blastocysts were transplanted into pseudopregnant MCH mice to produce chimeric mice. This chimeric mouse (male) is bred with a BDF1 mouse (female) to produce a primary (F1) mouse, and its tail D
F1 mice (male, female) in which a Rho GDI-α mutant sequence was confirmed in one of the diploid chromosomes from Southern blot analysis of NA (the same method as described in (5) below) were selected, and these were crossed to obtain a mouse. Two generation (F2) mice were obtained. (5) Analysis of genotype DNA was extracted from the tail of F2 mice according to a standard method, and Southern blot analysis was performed. In addition, PCR analysis was performed using the extracted DNA as a template.
【００２０】結果は図２（サザンブロット分析）および
図３（ＰＣＲ分析）に示したとおりであり、得られたＦ
２マウスのホモ接合型（-/-）：ヘテロ接合型（+/-）：
野生型（+/+）の比率は予想通り１：２：１であった。
以下、この発明のＲho ＧＤI−α遺伝子欠損マウスを
「Ｒho ＧＤI−α（-/-）マウスと記載することがあ
る。The results are shown in FIG. 2 (Southern blot analysis) and FIG. 3 (PCR analysis).
2 mice homozygous (-/-): heterozygous (+/-):
The ratio of wild type (+ / +) was 1: 2: 1 as expected.
Hereinafter, the Rho GDI-α gene-deficient mouse of the present invention may be referred to as “Rho GDI-α (− / −) mouse”.
【００２１】なお、いずれのＦ２マウスも正常に発生
し、産出された。 実施例２：Ｒho ＧＤI−α（-/-）マウスの特性の確認 (1)Ｒho ＧＤI−αタンパク質の発現 Ｆ２マウスの全脾臓溶解物を定法に従って調製し、抗Ｒ
ho ＧＤI−α抗体および抗Ｒho ＧＤI−β抗体を用いた
ウエスタンブロット分析を行った。結果は図４に示した
とおりであり、Ｒho ＧＤI−αは、野生型Ｆ２マウスお
よびヘテロ接合型Ｆ２マウスでは検出されたが、この発
明のＲho ＧＤI−α（-/-）マウスであるホモ接合型Ｆ
２マウスでは検出されなかった。一方、Ｒho ＧＤI−β
は全ての遺伝型マウスにおいて検出された。In addition, all F2 mice developed normally and were produced. Example 2: Confirmation of characteristics of Rho GDI-α (-/-) mouse (1) Expression of Rho GDI-α protein Whole spleen lysate of F2 mouse was prepared according to a conventional method, and anti-R
Western blot analysis was performed using ho GDI-α antibody and anti-Rho GDI-β antibody. The results are as shown in FIG. 4. Rho GDI-α was detected in wild-type and heterozygous F2 mice, but was homozygous for Rho GDI-α (-/-) mice of the present invention. Type F
It was not detected in 2 mice. On the other hand, Rho GDI-β
Was detected in all genotype mice.
【００２２】以上の結果から、この発明のＲho ＧＤI−
α（-/-）マウスはＲho ＧＤI−αタンパク質の産生能
を持たないことが確認された。 (2)ネフローゼ症候群様腎傷害 この発明のＲho ＧＤI−α（-/-）マウスは、見かけ上
の大きさ、成長、発達および行動はほとんど正常であっ
た。しかしながら、Ｒho ＧＤI−α（-/-）マウスは加
齢とともに衰弱し、生後約３０週で死亡した。From the above results, it can be seen that the Rho GDI-
It was confirmed that α (− / −) mice do not have the ability to produce Rho GDI-α protein. (2) Nephrotic syndrome-like kidney injury The Rho GDI-α (-/-) mice of the present invention had almost normal apparent size, growth, development and behavior. However, Rho GDI-α (-/-) mice became weaker with age and died about 30 weeks after birth.
【００２３】生後３ヶ月の時点で腎臓を摘出し、解剖学
的および組織学的な異常を検査した。Ｒho ＧＤI−α
（-/-）マウスの腎臓は、大きさや重量は野生型マウス
と差はなかったが、その表面は荒く、ざらついていた。
また、２分割したところ、ＲhoＧＤI−α（-/-）マウス
の腎臓には、多くの小型細胞が皮質および髄質に観察さ
れた。At three months of age, kidneys were removed and examined for anatomical and histological abnormalities. Rho GDI-α
The kidneys of the (-/-) mice were not different in size and weight from the wild-type mice, but their surfaces were rough and rough.
In addition, when the cells were divided into two, many small cells were observed in the cortex and medulla of the kidney of the RhoGDI-α (-/-) mouse.
【００２４】組織学的な検査の結果、Ｒho ＧＤI−α
（-/-）マウスの腎臓は、腎尿細管の基部および末端部
の両方に様々な程度ののう胞状拡張を示した（図５Ａ、
Ｂ）。腎尿細管の末端部ほど大きく変性していた。腎尿
細管の上皮細胞はその細胞質に密着して希薄になってお
り、変性した上皮細胞はしばしばその基底膜から剥離し
（図５Ｃ）、管腔内に放出されていた。細胞片を除い
て、拡張した末端細管はしばしば無細胞性の無構造硝子
円柱を含んでいた（図５Ｃ矢印）。As a result of histological examination, Rho GDI-α
(-/-) Mouse kidneys showed varying degrees of cystic dilation both at the base and end of the renal tubule (FIG. 5A,
B). Degeneration was larger at the end of the renal tubule. Epithelial cells of the renal tubules were intimately attached to their cytoplasm and dilute, and degenerated epithelial cells often detached from their basement membrane (FIG. 5C) and were released into the lumen. With the exception of cell debris, the expanded terminal tubules often contained acellular, non-structural hyaline casts (Figure 5C arrows).
【００２５】また、腎糸球体の異常も観察された。すな
わち、糸球体の局所的な萎縮が様々な部位で観察され
た。症状の重い腎臓では、糸球体のほとんどはメサンギ
ウム領域において萎縮と硝子変性を示し（図５Ｅ）、こ
れら糸球体の幾つかは糸球体硬化症を示した。さらに、
半月体形成と、炎症細胞の間質への浸潤も検出された
（図５Ｆ）。In addition, abnormal glomeruli of the kidney were also observed. That is, local atrophy of glomeruli was observed at various sites. In symptomatic kidneys, most of the glomeruli showed atrophy and vitreous degeneration in the mesangial area (FIG. 5E), and some of these glomeruli showed glomerulosclerosis. further,
Crescent formation and infiltration into the stroma of inflammatory cells were also detected (FIG. 5F).
【００２６】一方、３週齢のＲho ＧＤI−α（-/-）マ
ウスの腎臓では組織学的な異常は観察されず、７週齢マ
ウスの腎臓でも、遠位尿細管および集合管における少量
の硝子円柱の形成は観察されたが、腎尿細管の拡張や糸
球体の萎縮は観察されなかった。次に、尿細管および糸
球体の機能的異常を解明するため、尿および血清を化学
的に分析した。結果は表１に示したとおりである。すな
わち、若い成体のＲhoＧＤI−α（-/-）マウスにおいて
は、血清クレアチニンのレベルは1.5倍であり、また糸
球体機能の指標であるクレアチニン−クリアランスは低
下していた。さらに、組織学的な異常が検出されていな
い３週齢のＲho ＧＤI−α（-/-）マウスにおいてさ
え、タンパク尿が検出された。これらの結果は、糸球体
の萎縮が一次性ネフローゼ症候群を引き起こし、これら
の形態的および機能的な障害がＲhoＧＤI−α（-/-）マ
ウスの加齢とともに徐々に進行していることを示唆す
る。On the other hand, no histological abnormalities were observed in the kidneys of 3-week-old Rho GDI-α (-/-) mice, and even in the kidneys of 7-week-old mice, small amounts of distal tubules and collecting ducts were observed. The formation of a vitreous cast was observed, but no dilation of renal tubules or atrophy of glomeruli was observed. Next, urine and serum were chemically analyzed to elucidate the functional abnormalities of the tubules and glomeruli. The results are as shown in Table 1. That is, in young adult RhoGDI-α (-/-) mice, the serum creatinine level was 1.5-fold and creatinine-clearance, which is an indicator of glomerular function, was reduced. Furthermore, proteinuria was detected even in 3-week-old Rho GDI-α (-/-) mice in which no histological abnormality was detected. These results suggest that glomerular atrophy causes primary nephrotic syndrome and that these morphological and functional disorders are progressively evolving with RhoGDI-α (-/-) mouse aging .
【００２７】[0027]
【表１】[Table 1]
【００２８】(3)腎尿細管上皮細胞における基底陥入の
破壊 Ｒho ＧＤI−α欠損変異の効果の詳細を検討するため、
Ｒho ＧＤI−α（-/-）マウスの腎臓を電子顕微鏡で検
査した。野生型マウスの腎臓の基底細管にはBasal Laby
rinthが観察される（図６Ａ）のに対し、Ｒho ＧＤI−
α（-/-）マウスの腎臓では、主に基底部に空胞状の変
性がみられた（図６Ｂ）。このように、Ｒho ＧＤI−α
（-/-）マウス腎臓の基部および末端細管の上皮細胞に
おいては細胞の空胞化が特徴的であり、これが腎の上皮
をその基底膜から引き離す原因となっている。一方、Ｒ
ho ＧＤI−α（-/-）マウスの腎臓の末端細管において
は、様々な表現型を示した。すなわち、あまり影響を受
けていない細管では上皮細胞はほとんど正常であるが、
拡張した細管では、各断片化やミトコンドリア数の減少
等の変性過程が観られた（図６Ｃ、Ｄ）。(3) Disruption of basal invagination in renal tubular epithelial cells To examine the details of the effect of the Rho GDI-α deficient mutation,
The kidneys of Rho GDI-α (-/-) mice were examined by electron microscopy. Basal Laby is used in the basal tubule of the kidney of wild-type mice.
rinth is observed (FIG. 6A), whereas Rho GDI-
In the kidney of α (− / −) mice, vacuolar degeneration was observed mainly at the basal part (FIG. 6B). Thus, Rho GDI-α
Vascularization of the cells is characteristic of the basal and terminal tubule epithelial cells of the (-/-) mouse kidney, causing the renal epithelium to detach from its basement membrane. On the other hand, R
ho GDI-α (-/-) mice showed various phenotypes in the terminal tubule of the kidney. In other words, the epithelial cells are almost normal in the less affected tubules,
In the expanded tubule, denaturation processes such as fragmentation and reduction of mitochondrial number were observed (FIGS. 6C and 6D).
【００２９】Ｒho ＧＤI−α（-/-）マウス腎臓の萎縮
糸球体も検査した。メサンギウム領域は、電子密集マト
リックスによって占められておおり、毛管ループ構造は
破壊され、メサンギウム細胞と内皮細胞の数は減少して
おり、局所的な糸球体の萎縮に一致していた（図６Ｅ、
Ｆ）。これらの糸球体のタコ足細胞は過度に障害を受け
ており、細胞の脱落成分以外は観察されなかった（図６
Ｆ）。これらの糸球体の変化がネフローゼ症候群を引き
起こすものと考えられる。 (4)繁殖異常 Ｒho ＧＤI−α（-/-）マウスの雌雄を交配してもほと
んど子孫は産まれない。その原因を調べるため、様々な
遺伝型を交配させた。結果は表２に示したとおりであ
り、Ｒho ＧＤI−α（-/-）マウスの雄は、野生型マウ
ス雌と交配した場合には不妊であり、Ｒho ＧＤI−αマ
ウス（-/-）の雌も野生型マウス雄との交配ではほとん
ど繁殖能はなかった。一方、ヘテロ接合型ではそのよう
な繁殖異常はなかった。The atrophied glomeruli of the Rho GDI-α (-/-) mouse kidney were also examined. The mesangial area was occupied by an electron-dense matrix, the capillary loop structure was disrupted, the number of mesangial cells and endothelial cells was reduced, consistent with localized glomerular atrophy (FIG. 6E,
F). These glomerular octopus podocytes were excessively damaged, with no observed components other than the shed components of the cells (FIG. 6).
F). These glomerular changes are thought to cause nephrotic syndrome. (4) Reproductive abnormalities Even when the male and female of Rho GDI-α (-/-) mice are crossed, little offspring are born. To investigate the cause, we crossed various genotypes. The results are as shown in Table 2. Males of Rho GDI-α (-/-) mice were infertile when bred with wild-type female mice, whereas males of Rho GDI-α mice (-/-) Females also had little fertility when mated with wild-type mice. On the other hand, there was no such reproductive abnormality in the heterozygous type.
【００３０】[0030]
【表２】[Table 2]
【００３１】そこで、Ｒho ＧＤI−α（-/-）マウスの
繁殖異常を調べるため、in vitro繁殖を行った。結果
は、表３に示したとおりであり、（-/-）マウスは、雌
雄とも繁殖能を消失していることが確認された。Therefore, in order to examine the reproductive abnormalities of the Rho GDI-α (-/-) mice, they were bred in vitro. The results are as shown in Table 3, and it was confirmed that (-/-) mice had lost their reproductive ability in both sexes.
【００３２】[0032]
【表３】[Table 3]
【００３３】７〜２０週齢の雄のＲho ＧＤI−α（-/
-）マウスを解剖した結果、精巣異常と、様々な程度の
精巣萎縮が認められた。組織学的には、２０週齢のヘテ
ロ接合型マウス（+/-）の輸精管は正常である（図７
Ａ、Ｂ、Ｃ）のに対し、Ｒho ＧＤI−α（-/-）マウス
では、ほとんどの輸精管は発生初期段階から空胞を含ん
でおり、その直径も徐々に減少していた（図７Ｄ、
Ｅ）。また、これらの輸精管は伸長した精子細胞を含ん
でいたが、成熟精子はほとんど観察されなかった（図７
Ｅ、Ｆ）。Rho GDI-α (-//) males 7 to 20 weeks old
-) Dissection of the mice revealed testicular abnormalities and varying degrees of testicular atrophy. Histologically, the vas deferens of heterozygous mice (+/-) at the age of 20 weeks are normal (FIG. 7).
In contrast, in Rho GDI-α (-/-) mice, most vas deferens contained vacuoles from the early stages of development and their diameters gradually decreased (Fig. 7D, C).
E). In addition, these vas deferens contained elongated sperm cells, but almost no mature spermatozoa were observed (FIG. 7).
E, F).
【００３４】[0034]
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願に
よって、Ｒho ＧＤI−α遺伝子欠損動物が提供られる。
このこの動物は、腎糸球体、腎尿細管および精巣上皮細
胞等に病変を有し、突発性ネフローゼおよび男性不妊症
等の疾患モデル動物として有用である。As described in detail above, the present application provides an animal deficient in the Rho GDI-α gene.
This animal has lesions in renal glomeruli, renal tubules, testicular epithelial cells and the like, and is useful as a disease model animal such as idiopathic nephrosis and male infertility.
【図１】実施例１に用いたターゲッティングベクターの
構成を示した模式図である。FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of a targeting vector used in Example 1.
【図２】実施例１におけるＦ２マウス尾部ＤＮＡのサザ
ンブロット分析の結果である。FIG. 2 shows the results of Southern blot analysis of F2 mouse tail DNA in Example 1.
【図３】実施例１におけるＦ２マウス尾部ＤＮＡのＰＣ
Ｒ分析の結果である。FIG. 3 shows a PC of F2 mouse tail DNA in Example 1.
It is a result of R analysis.
【図４】実施例１におけるイムノブロット分析の結果で
ある。FIG. 4 shows the results of immunoblot analysis in Example 1.
【図５】Ｒho ＧＤI−α遺伝子欠損マウス腎臓の組織学
的異常を示す図面に代わる写真図である。FIG. 5 is a photograph instead of a drawing showing histological abnormalities of Rho GDI-α gene deficient mouse kidney.
【図６】Ｒho ＧＤI−α遺伝子欠損マウスの腎破壊の程
度を示す図面に代わる電子顕微鏡写真図である。FIG. 6 is an electron micrograph instead of a drawing showing the degree of renal destruction in Rho GDI-α gene deficient mice.
【図７】Ｒho ＧＤI−α遺伝子欠損マウス精巣の組織学
的分析結果を示す図面に代わる顕微鏡写真である。FIG. 7 is a micrograph instead of a drawing, showing the results of histological analysis of Rho GDI-α gene deficient mouse testis.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA02 DA02 DA06 EA04 GA25 4B063 QA01 QQ02 QQ12 QQ13 4B065 AA26X AA91X AA91Y AB01 CA24 CA46 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page F term (reference) 4B024 AA11 BA80 CA02 DA02 DA06 EA04 GA25 4B063 QA01 QQ02 QQ12 QQ13 4B065 AA26X AA91X AA91Y AB01 CA24 CA46
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11090272AJP2000279054A (en) | 1999-03-30 | 1999-03-30 | RhoGDI gene deficient animal |
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|---|---|---|---|
| JP11090272AJP2000279054A (en) | 1999-03-30 | 1999-03-30 | RhoGDI gene deficient animal |
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| JP2000279054Atrue JP2000279054A (en) | 2000-10-10 |
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| JP (1) | JP2000279054A (en) |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105784656A (en)* | 2016-03-16 | 2016-07-20 | 大连理工大学 | Biological probe for detecting activity of RhoGDIalpha (Rho GDP dissociation inhibitor alpha) protein in living cell |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105784656A (en)* | 2016-03-16 | 2016-07-20 | 大连理工大学 | Biological probe for detecting activity of RhoGDIalpha (Rho GDP dissociation inhibitor alpha) protein in living cell |
| CN105784656B (en)* | 2016-03-16 | 2019-01-01 | 大连理工大学 | The bioprobe of RhoGDI α protein active in a kind of detection living cells |
| Publication | Publication Date | Title |
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| US5850002A (en) | Animal models for loss and gain of Hox11 function | |
| JP5088786B2 (en) | Mutant TRPV3 gene-introduced transgenic mouse or transgenic rat |
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