CAMPO TECNICOTECHNICAL FIELD
Questa invenzione concerne in generale le composizioni e le tecniche per la cura del cheratocono e più in particolare una nuova composizione adatta ad essere impiegata in un trattamento di cross-linking corneale.This invention relates in general to compositions and techniques for the treatment of keratoconus and more particularly to a new composition suitable for use in a corneal cross-linking treatment.
BACKGROUNDBACKGROUND
Il cross-linking corneale (C3) con riboflavina (vitamina B2), brevemente indicato con la dicitura riboflavina-C3, è una tecnica innovativa per il trattamento di pazienti affetti da cheratocono e da ectasia corneale e consiste nella somministrazione combinata di riboflavina ed irradiazione con raggi ultravioletti (UVA) per rafforzare il tessuto corneale [1] [2].Corneal cross-linking (C3) with riboflavin (vitamin B2), briefly referred to as riboflavin-C3, is an innovative technique for the treatment of patients with keratoconus and corneal ectasia and consists in the combined administration of riboflavin and irradiation with ultraviolet rays (UVA) to strengthen the corneal tissue [1] [2].
Il trattamento risulta tecnicamente semplice; la riboflavina viene instillata nell’ occhio ed una quantità attentamente dosata di raggi UVA viene applicata alla cornea per una durata di cinque minuti, la procedura viene quindi ripetuta per 6 volte in successione nella stessa seduta fino ad una esposizione totale di 30 minuti.The treatment is technically simple; riboflavin is instilled into the eye and a carefully dosed amount of UVA rays is applied to the cornea for a duration of five minutes, the procedure is then repeated 6 times in succession in the same session up to a total exposure of 30 minutes.
Il parametro clinico più importante che deve essere preso in esame per stabilire l’indicazione al trattamento di crosslinking è lo spessore corneale, che deve risultare non inferiore a 400 micron.The most important clinical parameter that must be taken into consideration to establish the indication for crosslinking treatment is the corneal thickness, which must be no less than 400 microns.
Lo scopo ultimo di questi trattamenti conservativi del cheratocono è di posticipare o possibilmente eliminare la necessità del trapianto di cornea, e di migliorare la performance visiva del paziente migliorandone la qualità della vita [6][7].The ultimate goal of these conservative keratoconus treatments is to postpone or possibly eliminate the need for corneal transplantation, and to improve the patient's visual performance by improving their quality of life [6] [7].
La tecnica di cross-linking è stata applicata ai casi di cheratocono, patologia caratterizzata da un progressivo sfiancamento della cornea per una anomala lassità del parenchima corneale dovuta ad una minore coesione delle lamelle di collagene di cui è costituito. Mediante l’utilizzo di luce UVA e di riboflavina vengono creati nuovi legami tra le molecole di collagene corneali adiacenti in modo che la cornea acquisisce maggiore spessore e rigidità [3]. La cornea presenta numerosi strati di fibre di collagene nello spessore del parenchima; l’esistenza di legami trasversali o cosiddetti “crosslinks” che saldano i vari strati di collagene tra loro contribuisce in maniera determinante al grado di resistenza corneale. Lo scopo del trattamento di crosslinking corneale è quello di aumentare il grado di rigidità del tessuto corneale mediante la formazione di un maggior numero di questi legami trasversali.The cross-linking technique has been applied to cases of keratoconus, a pathology characterized by a progressive exhaustion of the cornea due to an anomalous laxity of the corneal parenchyma due to a lower cohesion of the collagen lamellae of which it is made up. Through the use of UVA light and riboflavin, new bonds are created between the adjacent corneal collagen molecules so that the cornea acquires greater thickness and rigidity [3]. The cornea has numerous layers of collagen fibers in the thickness of the parenchyma; the existence of transverse bonds or so-called "crosslinks" that weld the various layers of collagen together contributes significantly to the degree of corneal resistance. The aim of corneal crosslinking treatment is to increase the degree of stiffness of the corneal tissue by forming more of these transverse bonds.
L’applicazione della riboflavina sulla cornea disepitelizzata con penetrazione di circa 200 µm e l’irradiazione delle molecole di riboflavina mediante UVA determinano la perdita dell’equilibrio chimico delle molecole di riboflavina con la conseguente produzione di radicali liberi. La molecola di riboflavina diventa instabile e si stabilizza legandosi con due fibrille di collagene. Una serie di ponti biochimici si creano tra le fibrille di collagene (vale a dire, cross-linking) in modo da produrre un rafforzamento generale della cornea [3].The application of riboflavin on the de-epithelialized cornea with a penetration of about 200 µm and the irradiation of the riboflavin molecules by UVA lead to the loss of the chemical balance of the riboflavin molecules with the consequent production of free radicals. The riboflavin molecule becomes unstable and stabilizes by binding with two collagen fibrils. A series of biochemical bridges are created between the collagen fibrils (ie, cross-linking) in order to produce a general strengthening of the cornea [3].
Dal punto di vista tecnico, la procedura attualmente viene generalmente eseguita dopo aver rimosso lo strato più superficiale della cornea (epitelio corneale).From a technical standpoint, the procedure is currently usually performed after removing the most superficial layer of the cornea (corneal epithelium).
Tale modalità di trattamento di cross-linking (C3-R) del cheratocono e delle ectasie corneali prevede la preventiva rimozione dell’epitelio corneale per favorire la penetrazione della soluzione standard di riboflavina-destrano 0,1% (ad esempio quella commercializzata dalla SOOFT ITALIA S.r.l. con il marchio RICROLIN™) nello stroma sottostante e la procedura è stata standardizzata sulla base di tale presupposto.This method of cross-linking (C3-R) treatment of keratoconus and corneal ectasias provides for the preventive removal of the corneal epithelium to favor the penetration of the standard solution of riboflavin-dextran 0.1% (for example the one marketed by SOOFT ITALIA S.r.l. with the RICROLIN ™ brand) in the underlying stroma and the procedure was standardized on the basis of this assumption.
Secondo i sostenitori di questa tecnica, la rimozione dello strato epiteliale sarebbe necessaria per garantire il miglior assorbimento della soluzione di riboflavina all’ interno dello stroma corneale e quindi la massima efficacia della terapia.According to the supporters of this technique, the removal of the epithelial layer would be necessary to ensure the best absorption of the riboflavin solution within the corneal stroma and therefore the maximum effectiveness of the therapy.
La rimozione dell’epitelio corneale tuttavia può arrecare irritazione e bruciore oculare il giorno dopo il trattamento e in quelli immediatamente successivi ed un transitorio offuscamento della vista; questi sintomi sono previsti e persistono fino alla ricostituzione dell’ epitelio corneale e vengono abitualmente trattati utilizzando colliri antinfiammatori non steroidei (FANS), colliri a base di sostituti lacrimali e antidolorifici, e l’applicazione di una lente a contatto terapeutica sulla cornea per i primi giorni [4-7].However, the removal of the corneal epithelium can cause irritation and ocular burning the day after treatment and in those immediately following and a transient blurring of vision; these symptoms are expected and persist until the corneal epithelium is reconstituted and are routinely treated using non-steroidal anti-inflammatory eye drops (NSAIDs), tear substitute eye drops and pain relievers, and the application of a therapeutic contact lens to the cornea for the first days [4-7].
Alcuni sostengono che sarebbe possibile effettuare il trattamento C3-R applicando la metodica standard senza preliminare rimozione dell’epitelio corneale, sostenendone l’efficacia e la sicurezza sulla base di dati clinici sull'osservazione. Secondo quest'altra modalità, si dovrebbe eseguire il trattamento senza effettuare la preliminare disepitelizzazione della cornea.Some argue that it would be possible to carry out the C3-R treatment by applying the standard method without preliminary removal of the corneal epithelium, supporting its efficacy and safety on the basis of clinical observation data. According to this other modality, the treatment should be carried out without carrying out preliminary de-epithelialization of the cornea.
Lo scopo è quello di evitare ai pazienti i disagi conseguenti alla rimozione dell'epitelio, propri della prima metodica, di poterla svolgere in regime ambulatoriale e soprattutto di evitare il rischio di una infezione postchirurgica propria di una metodica che prevede la rimozione dell’epitelio con conseguente esposizione degli strati sottoepiteliali.The aim is to avoid patients the inconvenience resulting from the removal of the epithelium, typical of the first method, to be able to carry it out on an outpatient basis and above all to avoid the risk of a post-surgical infection typical of a method that involves the removal of the epithelium with consequent exposure of the subepithelial layers.
I sostenitori di questa modalità di trattamento raccomandano l’applicazione della riboflavina sull’occhio per un lasso di tempo maggiore per permettere il miglior assorbimento nello stroma prima dell’ applicazione dei raggi UVA [8].Supporters of this treatment modality recommend the application of riboflavin on the eye for a longer period of time to allow the best absorption in the stroma before the application of UVA rays [8].
Per quanto concerne la rimozione o meno dell’epitelio nel trattamento con cross-linking del cheratocono e delle ectasie corneali in generale esistono in letteratura opinioni contrastanti.As regards the removal or not of the epithelium in the cross-linking treatment of keratoconus and corneal ectasias in general, there are conflicting opinions in the literature.
Inizialmente, il trattamento C3-R è stato studiato ed attuato dopo rimozione dell’epitelio corneale per favorire la penetrazione della riboflavina nello stroma. Non sono però noti studi che abbiano determinato con certezza se e quanta riboflavina penetri effettivamente nello stroma corneale [9] rimuovendo o meno l’epitelio.Initially, the C3-R treatment was studied and implemented after removal of the corneal epithelium to facilitate the penetration of riboflavin into the stroma. However, there are no known studies that have determined with certainty whether and how much riboflavin actually penetrates the corneal stroma [9] by removing the epithelium or not.
L'esecuzione del cross-linking senza preventiva disepitelizzazione è criticata da numerosi autori, i quali sostengono che in questo modo la riboflavina non passerebbe per via trans-epiteliale e che non è stato sinora dimostrato se e quanta soluzione standard di riboflavina-destrano 0,1% penetri realmente nello stroma corneale senza rimozione dell’epitelio e se il trattamento mediante raggi UV-A per via trans-epiteliale risulti ugualmente efficace quanto quello effettuato dopo rimozione dell’epitelio.The execution of cross-linking without prior de-epithelialization is criticized by numerous authors, who argue that in this way the riboflavin would not pass through the transepithelial route and that it has not been demonstrated so far whether and how much standard solution of riboflavin-dextran 0, 1% actually penetrates the corneal stroma without removal of the epithelium and if the treatment with UV-A rays by transepithelial route is equally effective as that carried out after removal of the epithelium.
Nel tentativo di fornire sostanze utili nella cura del cheratocono con tecnica cross-linking senza dover rimuovere l'epitelio corneale, in [17] è stato suggerito dal Dott. Spörl l'uso del benzalconio cloruro per aumentare la permeabilità dell'epitelio e dal Dott. Pinelli l'uso di tensioattivi mescolati a riboflavina.In an attempt to provide substances useful in the treatment of keratoconus with cross-linking technique without having to remove the corneal epithelium, in [17] it was suggested by Dr. Spörl the use of benzalkonium chloride to increase the permeability of the epithelium and by Dr. Pinelli the use of surfactants mixed with riboflavin.
Nella domanda di brevetto italiana MI2007A002162 [16] è divulgata una composizione per il trattamento del cheratocono con tecnica di crosslinking trans-epiteliale contenente riboflavina e benzalconio cloruro.In the Italian patent application MI2007A002162 [16] a composition for the treatment of keratoconus with a trans-epithelial crosslinking technique containing riboflavin and benzalkonium chloride is disclosed.
Sperimentazioni condotte dai richiedenti su cornee umane, i cui risultati sono illustrati più avanti, portano a concludere che la seconda tecnica, eseguita con la soluzione standard o con la composizione proposta dal Dott. Pinelli [16], non risolverebbe i problemi dovuti alla rimozione dell'epitelio corneale in quanto esso verrebbe distrutto, lasciando esposti gli strati sottostanti con il rischio d’insorgenza di infezione e di alterazione dei meccanismi riparativi.Experiments conducted by the applicants on human corneas, the results of which are illustrated below, lead to the conclusion that the second technique, performed with the standard solution or with the composition proposed by Dr. Pinelli [16], would not solve the problems due to the removal of the corneal epithelium as it would be destroyed, leaving the underlying layers exposed with the risk of onset of infection and alteration of repair mechanisms.
Sarebbe desiderabile una composizione a base di riboflavina per il cross-linking della cornea, che sia in grado di attraversare in tempi brevi e certi l'epitelio corneale e che non procuri danni all’epitelio corneale, responsabili di fastidiosi sintomi post-operatori.A riboflavin-based composition for corneal cross-linking would be desirable, which is able to cross the corneal epithelium in a short and certain time and which does not cause damage to the corneal epithelium, responsible for annoying post-operative symptoms.
SOMMARIOSUMMARY
I richiedenti hanno effettuato studi approfonditi tesi a determinare in che misura la riboflavina penetri da sola o mescolata con altri prodotti ("carriers") attraverso cornee umane con e senza preliminare rimozione dell’epitelio, nonché l’efficacia e la sicurezza del successivo trattamento con raggi UV-A.The applicants carried out in-depth studies aimed at determining to what extent riboflavin penetrates alone or mixed with other products ("carriers") through human corneas with and without preliminary epithelial removal, as well as the effectiveness and safety of subsequent treatment with UV-A rays.
Sono state identificate sostanze, scelte nell'insieme composto da amminoacidi essenziali e semi-essenziali, coenzima Q, vitamina E, L-prolina, glicina, lisina cloridrato, L-leucina, L-arginina e composti adatti a stimolare la produzione di metallo proteinasi MMP9, che possono essere impiegate efficacemente come carrier in composizioni idonee alla somministrazione di riboflavina, in particolare con la soluzione standard di riboflavina-destrano, attraverso l'epitelio corneale. Le composizioni così ottenute, commercializzabili ad esempio in forma di collirio o di gel o applicate su lenti a contatto terapeutiche, possono essere usate per il trattamento del cheratocono con tecnica di cross-linking trans-epiteliale preservando l'epitelio corneale.Substances have been identified, chosen from the ensemble composed of essential and semi-essential amino acids, coenzyme Q, vitamin E, L-proline, glycine, lysine hydrochloride, L-leucine, L-arginine and compounds suitable for stimulating the production of metallo proteinase MMP9, which can be used effectively as a carrier in compositions suitable for the administration of riboflavin, in particular with the standard solution of riboflavin-dextran, through the corneal epithelium. The compositions thus obtained, marketable for example in the form of eye drops or gel or applied to therapeutic contact lenses, can be used for the treatment of keratoconus with a transepithelial cross-linking technique while preserving the corneal epithelium.
Le composizioni possono eventualmente contenere degli eccipienti, quali ad esempio l'acido acetico, oppure le sostanze indicate possono essere trattate con acido acetico o un altro eccipiente prima di essere mescolate con riboflavina.The compositions can optionally contain excipients, such as for example acetic acid, or the indicated substances can be treated with acetic acid or another excipient before being mixed with riboflavin.
Questa invenzione propone inoltre l'uso di almeno una sostanza scelta nell'insieme costituito da amminoacidi essenziali e semi-essenziali, coenzima Q, vitamina E, L-prolina, glicina, lisina cloridrato, L-leucina, L-arginina e composti adatti a stimolare la produzione di metallo proteinasi MMP9, per la preparazione di una composizione contenente riboflavina per il trattamento del cheratocono con tecnica di cross-linking trans-epiteliale o per proteggere strutture interne del globo oculare da raggi UV-A e una relativa composizione contenente riboflavina, e come carrier in una composizione idonea alla somministrazione di riboflavina attraverso l'epitelio corneale.This invention also proposes the use of at least one substance selected from the set consisting of essential and semi-essential amino acids, coenzyme Q, vitamin E, L-proline, glycine, lysine hydrochloride, L-leucine, L-arginine and compounds suitable for stimulate the production of metallo proteinase MMP9, for the preparation of a composition containing riboflavin for the treatment of keratoconus with a transepithelial cross-linking technique or to protect internal structures of the eyeball from UV-A rays and a relative composition containing riboflavin, and as a carrier in a composition suitable for administration of riboflavin through the corneal epithelium.
Questa invenzione propone anche un metodo di preparazione di una tale composizione consistente nell'aggiungere ad una soluzione di riboflavina almeno uno dei carrier trovati.This invention also proposes a method for preparing such a composition consisting in adding at least one of the carriers found to a riboflavin solution.
Ognuna delle sostanze proposte come carrier può essere aggiunta da sola o in combinazione con altri carrier proposti ad una soluzione a base di riboflavina in concentrazioni scelte negli intervalli indicati nella seguente descrizione di forme di realizzazione esemplificative.Each of the substances proposed as carriers can be added alone or in combination with other proposed carriers to a riboflavin-based solution in selected concentrations in the ranges indicated in the following description of exemplary embodiments.
L'invenzione è definita nelle annesse rivendicazioni.The invention is defined in the attached claims.
BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNIBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
La FIG. 1 mostra una scala di valutazione visiva,fluorimetrica, colorimetrica adottata per la dimostrazione del passaggio di riboflavina 0,1 % attraverso la cornea dopo applicazione per via transepiteliale.FIG. 1 shows a visual, fluorimetric, colorimetric rating scale adopted for demonstrating the passage of 0.1% riboflavin through the cornea after transepithelial application.
La FIG. 2a è un'immagine fluoroscopica di una sezione di cornea su cui è stata applicata in modo trans-epiteliale la quarta composizione di test per 15 minuti.FIG. 2a is a fluoroscopic image of a corneal section on which the fourth test composition was transepithelially applied for 15 minutes.
La FIG. 2b è un'immagine fluoroscopica di una sezione di cornea su cui è stata applicata in modo trans-epiteliale la quarta composizione di test per 30 minuti.FIG. 2b is a fluoroscopic image of a corneal section on which the fourth test composition was transepithelially applied for 30 minutes.
La FIG. 2c è un'immagine fluoroscopica di una sezione di cornea trattata con cross-linking trans-epiteliale usando la quarta nuova composizione, in cui si nota la fluorescenza per l’avvenuto passaggio della quarta composizione e la notevole rigidità del tessuto dopo il trattamento.FIG. 2c is a fluoroscopic image of a section of cornea treated with trans-epithelial cross-linking using the fourth new composition, which shows the fluorescence due to the passage of the fourth composition and the considerable rigidity of the tissue after treatment.
La FIG. 3a mostra il grado di flessione di una cornea trattata con crosslinking trans-epiteliale usando la soluzione standard.FIG. 3a shows the degree of flexion of a cornea treated with trans-epithelial crosslinking using the standard solution.
La FIG. 3b mostra il grado di flessione di una cornea trattata con crosslinking trans-epiteliale usando la quarta nuova composizione di test.FIG. 3b shows the degree of flexion of a cornea treated with trans-epithelial crosslinking using the fourth new test composition.
La FIG. 4 è una microscopia a scansione che mostra come si presentano le lamelle di una sezione di cornea affetta da cheratocono.FIG. 4 is a scanning microscopy showing what the lamellae of a section of cornea affected by keratoconus look like.
La FIG. 5 è una microscopia a scansione che riproduce con un maggior ingrandimento una parte della cornea di FIG. 4.FIG. 5 is a scanning microscopy which reproduces a part of the cornea of FIG. 4.
La FIG. 6 è una microscopia a scansione che illustra come si presentano le lamelle di una sezione di cornea affetta da cheratocono dopo il cross-linking trans-epiteliale effettuato utilizzando la quarta nuova composizione di test.FIG. 6 is a scanning microscopy showing how the lamellae of a section of cornea affected by keratoconus look after transepithelial cross-linking performed using the fourth new test composition.
La FIG. 7 è una microscopia a scansione che mostra la morfologia dei microvilli e degli strati superficiali dell’epitelio in una cornea normale.FIG. 7 is a scanning microscopy showing the morphology of the microvilli and the superficial layers of the epithelium in a normal cornea.
La FIG. 8 è una microscopia a scansione di una cornea trattata con UV-A a dosaggio standard dopo aver applicato per via trans-epiteliale la soluzione standard di riboflavina-destrano 0,1%.FIG. 8 is a scanning microscopy of a standard dose UV-A treated cornea after transepithelial application of the standard 0.1% riboflavin-dextran solution.
La FIG. 9 è una microscopia a scansione di una cornea trattata con UV-A a dosaggio standard dopo aver applicato per via trans-epiteliale la quarta nuova composizione di test.FIG. 9 is a scanning microscopy of a standard dose UV-A treated cornea after transepithelial application of the fourth new test composition.
La FIG. 10 è una microscopia a scansione di una cornea trattata con UV-A a dosaggio standard dopo aver applicato per via trans-epiteliale una soluzione fisiologica.FIG. 10 is a scanning microscopy of a standard dose UV-A treated cornea after transepithelial application of a physiological solution.
DESCRIZIONE DI FORME DI REALIZZAZIONE ESEMPLIFICATIVEDESCRIPTION OF EXAMPLE EMBODIMENTS
I test sono stati effettuati su cornee umane di donatori, provenienti dall’Azienda Ospedaliera Napoli 1 Banca Occhi Regione Campania Ospedale dei Pellegrini dopo consenso come previsto nel protocollo di espianto e con richiesta al Comitato Etico come da num. di prot.0009304/2009.The tests were carried out on human corneas of donors from the Naples 1 Eye Bank Campania Region Hospital of the Pilgrims after consent as provided for in the explantation protocol and with a request to the Ethics Committee as per number of protocol 0009304/2009.
È stato verificato l'attraversamento delle composizioni attraverso cornee umane integre, cioè senza preventiva rimozione dell’epitelio, aventi spessore compreso tra 500 e 600 micron, sia della soluzione standard di riboflavina-destrano, sia della composizione a base di riboflavina-destrano benzalconio cloruro suggerita in [16] e [17], che di nuove composizioni di test ottenute miscelando la riboflavina con almeno una sostanza scelta nell'insieme comprendente vitamina E, coenzima Q (o vitamina Q), prolina (L-prolina), glicina, lisina cloridrato, leucina (L-leucina), a varie concentrazioni.The crossing of the compositions through intact human corneas, i.e. without prior removal of the epithelium, having a thickness between 500 and 600 microns, has been verified, both of the standard solution of riboflavin-dextran, and of the composition based on riboflavin-dextran benzalkonium chloride suggested in [16] and [17], that of new test compositions obtained by mixing riboflavin with at least one substance selected from the whole comprising vitamin E, coenzyme Q (or vitamin Q), proline (L-proline), glycine, lysine hydrochloride, leucine (L-leucine), in various concentrations.
Le concentrazioni delle sostanze utilizzate per realizzare nuove composizioni di test sono comprese nei seguenti intervalli:The concentrations of the substances used to make new test compositions are included in the following ranges:
vitamina E: concentrazione da 0,0001 mg % ml a 2000 mg % ml. Secondo una forma di realizzazione alternativa, la concentrazione varia da 0,01 mg % ml a 1500 mg % ml. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da 10 mg % ml a 1000 mg % ml. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione è di circa 500 mg % ml;vitamin E: concentration from 0.0001 mg% ml to 2000 mg% ml. According to an alternative embodiment, the concentration ranges from 0.01 mg% ml to 1500 mg% ml. According to yet another embodiment, the concentration ranges from 10 mg% ml to 1000 mg% ml. According to yet another embodiment, the concentration is about 500 mg% ml;
vitamina Q: concentrazione da 0,0001 mg % ml a 2000 mg % ml. Secondo una forma di realizzazione alternativa, la concentrazione varia da 0,01 mg % ml a 1500 mg % ml. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da 1 mg % ml a 1000 mg % ml. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione è di circa 100 mg % ml;vitamin Q: concentration from 0.0001 mg% ml to 2000 mg% ml. According to an alternative embodiment, the concentration ranges from 0.01 mg% ml to 1500 mg% ml. According to yet another embodiment, the concentration ranges from 1 mg% ml to 1000 mg% ml. According to yet another embodiment, the concentration is about 100 mg% ml;
L-prolina: concentrazione da 0,0001 mg % ml a 2000 mg % ml. Secondo una forma di realizzazione alternativa, la concentrazione varia da 0,001 mg % ml a 100 mg % ml. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da 0,005 mg % ml a 10 mg % ml. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da circa 0,01 mg % ml a 1 mg % ml. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione è di circa 0,1 mg % ml;L-proline: concentration from 0.0001 mg% ml to 2000 mg% ml. According to an alternative embodiment, the concentration ranges from 0.001 mg% ml to 100 mg% ml. According to yet another embodiment, the concentration ranges from 0.005 mg% ml to 10 mg% ml. According to yet another embodiment, the concentration ranges from about 0.01 mg% ml to 1 mg% ml. According to yet another embodiment, the concentration is about 0.1 mg% ml;
glicina: concentrazione da 0,0001 mg % ml a 2000 mg % ml. Secondo una forma di realizzazione alternativa, la concentrazione varia da 0,001 mg % ml a 100 mg % ml. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da 0,005 mg % ml a 10 mg % ml. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da circa 0,01 mg % ml a 1 mg % ml. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione è di circa 0,1 mg % ml;glycine: concentration from 0.0001 mg% ml to 2000 mg% ml. According to an alternative embodiment, the concentration ranges from 0.001 mg% ml to 100 mg% ml. According to yet another embodiment, the concentration ranges from 0.005 mg% ml to 10 mg% ml. According to yet another embodiment, the concentration ranges from about 0.01 mg% ml to 1 mg% ml. According to yet another embodiment, the concentration is about 0.1 mg% ml;
lisina cloridrato: concentrazione da 0,0001 mg % ml a 2000 mg % ml. Secondo una forma di realizzazione alternativa, la concentrazione varia da 0,001 mg % ml a 100 mg % ml. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da 0,005 mg % ml a 10 mg % ml. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da circa 0,01 mg % ml a 1 mg % ml. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione è di circa 0,05 mg % ml;lysine hydrochloride: concentration from 0.0001 mg% ml to 2000 mg% ml. According to an alternative embodiment, the concentration ranges from 0.001 mg% ml to 100 mg% ml. According to yet another embodiment, the concentration ranges from 0.005 mg% ml to 10 mg% ml. According to yet another embodiment, the concentration ranges from about 0.01 mg% ml to 1 mg% ml. According to yet another embodiment, the concentration is about 0.05 mg% ml;
L-leucina: concentrazione da 0,0001 mg % ml a 2000 mg % ml. Secondo una forma di realizzazione alternativa, la concentrazione varia da 0,001 mg % ml a 100 mg % ml. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da 0,005 mg % ml a 10 mg % ml. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da circa 0,01 mg % ml a 1 mg % ml. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione è di circa 0,08 mg % ml.L-leucine: concentration from 0.0001 mg% ml to 2000 mg% ml. According to an alternative embodiment, the concentration ranges from 0.001 mg% ml to 100 mg% ml. According to yet another embodiment, the concentration ranges from 0.005 mg% ml to 10 mg% ml. According to yet another embodiment, the concentration ranges from about 0.01 mg% ml to 1 mg% ml. According to yet another embodiment, the concentration is about 0.08 mg% ml.
Nuove composizioni adatte per la cura del cheratocono mediante crosslinking trans-epiteliale sono state ottenute mescolando una o più delle sostanze summenzionate in concentrazioni comprese negli intervalli indicati con una soluzione di riboflavina, per esempio con una soluzione di riboflavina-destrano in una concentrazione scelta nell'intervallo da 0,0001% a 0,5%. Secondo una forma di realizzazione alternativa, la concentrazione di riboflavina-destrano varia da 0,001% a 0,4%. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da 0,005% a 0,3%. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da circa 0,01% a 0,2%. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione è di circa 0,1%.New compositions suitable for the treatment of keratoconus by trans-epithelial crosslinking have been obtained by mixing one or more of the aforementioned substances in concentrations included in the indicated ranges with a solution of riboflavin, for example with a solution of riboflavin-dextran in a concentration selected in the range from 0.0001% to 0.5%. According to an alternative embodiment, the riboflavin-dextran concentration ranges from 0.001% to 0.4%. According to yet another embodiment, the concentration ranges from 0.005% to 0.3%. According to yet another embodiment, the concentration ranges from about 0.01% to 0.2%. According to yet another embodiment, the concentration is about 0.1%.
I risultati dei test hanno dimostrato che ciascuna delle sostanze dell'insieme trovato è adatta a favorire la penetrazione della riboflavina, ed in particolare della soluzione standard di riboflavina-destrano, attraverso l'epitelio corneale e a proteggere l'epitelio dai raggi UV-A.The results of the tests have shown that each of the substances of the set found is suitable for favoring the penetration of riboflavin, and in particular of the standard solution of riboflavin-dextran, through the corneal epithelium and to protect the epithelium from UV-A rays.
Le cornee prese in esame provengono dallo smaltimento della Banca degli occhi in quanto non utilizzabili, mantenute in adatte soluzioni di conservazione, e prima della sperimentazione rivalutate mediante microscopio ottico ed esame delle cellule endoteliali.The corneas examined come from the disposal of the Eye Bank as they cannot be used, kept in suitable storage solutions, and before the experimentation they were re-evaluated by means of an optical microscope and examination of the endothelial cells.
Sono state utilizzate soltanto cornee con buona trasparenza, con spessore compreso tra 500 e 600 micron e con mosaico endoteliale presente, secondo quanto consigliato in [10-15].Only corneas with good transparency, with thickness between 500 and 600 microns and with endothelial mosaic present, were used, as recommended in [10-15].
Le cornee sono state posizionate in modo da chiudere un contenitore cilindrico contenente una quantità predefinita di soluzione di sodio ialuronato xanthan gum 0,4 ml ed è stata applicato sulla superficie corneale un anelletto metallico a tenuta avente lo stesso diametro del contenitore cilindrico. Quindi le composizioni da testare sono state mescolate con una sostanza fluorescente e le miscele così ottenute sono state applicate sulle cornee. Misurando il grado di fluorescenza della soluzione all'interno del contenitore al trascorrere del tempo, si è potuto verificare in che quantità le nuove composizioni attraversano la cornea e in quanto tempo ciò accade.The corneas were positioned so as to close a cylindrical container containing a predefined quantity of 0.4 ml sodium hyaluronate xanthan gum solution and a metal seal ring having the same diameter as the cylindrical container was applied to the corneal surface. Then the compositions to be tested were mixed with a fluorescent substance and the mixtures thus obtained were applied to the corneas. By measuring the degree of fluorescence of the solution inside the container over time, it was possible to verify how much the new compositions cross the cornea and how long this happens.
L'efficacia delle sostanze indicate come carrier in composizioni per la somministrazione di riboflavina per via trans-epiteliale e delle composizioni che si possono ottenere mescolando riboflavina ad almeno una delle sostanze indicate viene descritta attraverso i seguenti esempi di test, a scopo meramente illustrativo e non limitativo.The efficacy of the substances indicated as carriers in compositions for the administration of riboflavin by transepithelial route and of the compositions that can be obtained by mixing riboflavin with at least one of the substances indicated is described through the following test examples, for illustrative purposes only and not limiting.
Per brevità, si riportano solo i risultati di test ottenuti trattando le cornee con le seguenti composizioni :For the sake of brevity, only the test results obtained by treating corneas with the following compositions are reported:
1) Soluzione standard di riboflavina-destrano 0,1%;1) Standard solution of riboflavin-dextran 0.1%;
2) Soluzione standard di riboflavina-destrano 0,1% benzalconio cloruro 0,01%, conformemente a quanto proposto in [16];2) Standard solution of riboflavin-dextran 0.1% benzalkonium chloride 0.01%, as proposed in [16];
3) Prima nuova composizione di test di riboflavina–destrano 0,1% vitamina E TPGS (D-alfa-tocoferil polietilenglicol 1000 succinato) alla concentrazione di 500 mg % ml;3) First new test composition of riboflavin – dextran 0.1% vitamin E TPGS (D-alpha-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate) at a concentration of 500 mg% ml;
4) Seconda nuova composizione di test di riboflavina-destrano 0,1% Vitamina Q 100 mg % ml;4) Second new test composition of riboflavin-dextran 0.1% Vitamin Q 100 mg% ml;
5) Terza nuova composizione di test di riboflavina-destrano 0,1% L-prolina 0,1 mg % glicina 0,1 mg %, lisina cloridrato 0,05 mg %, L-leucina 0,08 mg %;5) Third new test composition of riboflavin-dextran 0.1% L-proline 0.1 mg% glycine 0.1 mg%, lysine hydrochloride 0.05 mg%, L-leucine 0.08 mg%;
6) Quarta nuova composizione di test di riboflavina-destrano 0,1% vitamina E TPGS (D-alfa-tocoferil polietilenglicol 1000 succinato) 500mg % ml Vitamina Q 100 mg % ml L-prolina 0,1 mg % glicina 0,1 mg % lisina cloridrato 0,05 mg % L-leucina 0,08 mg %.6) Fourth new test composition of riboflavin-dextran 0.1% vitamin E TPGS (D-alpha-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate) 500mg% ml Vitamin Q 100 mg% ml L-proline 0.1 mg% glycine 0.1 mg % lysine hydrochloride 0.05 mg% L-leucine 0.08 mg%.
Ciascuna delle sei composizioni menzionate è stata applicata sulla superficie delle cornee selezionate e sistemate come già descritto ed è stata valutata rispettivamente a distanza di 15 minuti e 30 minuti l'imbibizione dello stroma corneale e la presenza della sostanza fluorescente nella soluzione di sodio ialuronato xanthan gum 0,4 ml situata all’interno del contenitore al di sotto della cornea trattata.Each of the six compositions mentioned was applied on the surface of the selected corneas and arranged as already described and the imbibition of the corneal stroma and the presence of the fluorescent substance in the sodium hyaluronate xanthan gum solution were evaluated respectively after 15 minutes and 30 minutes. 0.4 ml located inside the container below the treated cornea.
La valutazione della penetrazione di riboflavina nello stroma corneale è stata effettuata mediante sezione della cornea e successiva valutazione al microscopio a fluorescenza.The evaluation of riboflavin penetration into the corneal stroma was performed by sectioning the cornea and subsequent evaluation under a fluorescence microscope.
La presenza di riboflavina all’interno della soluzione di sodio ialuronato xanthan gum 0,4 ml, a dimostrazione dell’avvenuto passaggio attraverso la cornea, è stata valutata sia qualitativamente mediante l’adozione di una scala visiva e fluoroscopica del tipo illustrato in FIG. 1, sia quantitativamente mediante l’impiego di una scala colorimetrica.The presence of riboflavin within the 0.4 ml sodium hyaluronate xanthan gum solution, demonstrating the passage through the cornea, was assessed both qualitatively by adopting a visual and fluoroscopic scale of the type illustrated in FIG. 1, both quantitatively through the use of a colorimetric scale.
Il significato dei due numeri accanto ciascun campione di colore rappresenta rispettivamente il numero di parti di soluzione standard di riboflavina che dà luogo alla colorazione illustrata e il numero di parti di soluzione di xanthan gum e sodio ialuronato.The meaning of the two numbers next to each color sample represents the number of parts of riboflavin standard solution resulting in the illustrated staining and the number of parts of xanthan gum and sodium hyaluronate solution, respectively.
La scala di riferimento è stata predisposta effettuando diluizioni di riboflavina-destrano 0,1% con xanthan gum sodio ialuronato nelle seguenti proporzioni (unità/µl): 50/0, 40/10, 30/20, 20/30, 10/40, 0/50. E’ stata così predisposta una scala visiva ed una scala fluorometrica corrispondente ai valori di unità/µl definiti ed è stato attribuito un punteggio da 10 a 0 per ciascun rapporto di diluizione. Tale scala colorimetrica prevede un valore minimo di percentuale del giallo pari al 20% in assenza di riboflavina, corrispondente allo spettro colorimetrico della sostanza scelta quale diluente.The reference scale was prepared by making dilutions of riboflavin-dextran 0.1% with xanthan gum sodium hyaluronate in the following proportions (units / µl): 50/0, 40/10, 30/20, 20/30, 10/40 , 0/50. A visual scale and a fluorometric scale corresponding to the defined unit / µl values were thus prepared and a score from 10 to 0 was assigned for each dilution ratio. This colorimetric scale provides for a minimum yellow percentage value equal to 20% in the absence of riboflavin, corresponding to the color spectrum of the substance chosen as diluent.
La valutazione mediante scala visiva è stata effettuata in condizioni di illuminazione standard per confronto diretto dei reperti ottenuti dalla sperimentazione con i campioni predefiniti e mediante tecnica fotografica digitalizzata. La valutazione fluorimetrica è stata eseguita utilizzando un microscopio a fluorescenza corredato di fotocamera digitale in camera oscura. L’attribuzione del punteggio relativo alla valutazione con scala visiva e fluorimetrica era effettuata da un terzo esaminatore, operando una media dei valori ottenuti con le due metodiche.The evaluation by visual scale was carried out under standard lighting conditions by direct comparison of the findings obtained from the experimentation with the predefined samples and by means of a digitized photographic technique. The fluorimetric evaluation was performed using a fluorescence microscope equipped with a digital camera in a dark room. The attribution of the score related to the assessment with visual and fluorimetric scale was carried out by a third examiner, averaging the values obtained with the two methods.
La valutazione colorimetrica è stata effettuata mediante l’inserimento del materiale presente al termine dell’esperimento all’interno del contenitore (e quindi al di sotto della cornea) in una bustina trasparente e successiva analisi computerizzata con scannerizzazione ad alta definizione delle diluizioni predefinite e valutazione delle percentuali di giallo utilizzando un programma software Photoshop™ 7.0 e un selettore monocromatico. E’ stato così possibile rapportare la percentuale del colore giallo, prevalente e caratterizzante, rilevato con tale metodica sui reperti della sperimentazione ad un preciso range di concentrazione in unità/µl della riboflavina 0,1 % come riportato nella FIG. 1.The colorimetric evaluation was carried out by inserting the material present at the end of the experiment inside the container (and therefore below the cornea) in a transparent sachet and subsequent computerized analysis with high-definition scanning of the predefined dilutions and evaluation percentages of yellow using a Photoshop ™ 7.0 software program and a monochrome selector. It was thus possible to relate the percentage of the predominant and characterizing yellow color detected with this method on the experimental findings to a precise range of concentration in units / µl of 0.1% riboflavin as shown in FIG. 1.
La FIG. 2a è un'immagine fluoroscopica di una sezione di cornea trattata con cross-linking trans-epiteliale dopo aver applicato la quarta nuova composizione per 15 minuti, la FIG. 2b è un'immagine fluoroscopica di una sezione di cornea trattata con cross-linking trans-epiteliale dopo aver applicato la quarta nuova composizione per 30 minuti, e la FIG. 2c è un'immagine fluoroscopica di una sezione di cornea trattata con cross-linking trans-epiteliale con la quarta nuova composizione. In quest'ultima figura si nota come la riboflavina sia penetrata in tutta la cornea e la rigidità del tessuto dopo il trattamento di cross-linking.FIG. 2a is a fluoroscopic image of a cornea section treated with trans-epithelial cross-linking after applying the fourth new composition for 15 minutes, FIG. 2b is a fluoroscopic image of a cornea section treated with trans-epithelial cross-linking after applying the fourth new composition for 30 minutes, and FIG. 2c is a fluoroscopic image of a cornea section treated with trans-epithelial cross-linking with the fourth new composition. In the latter figure it is noted how riboflavin has penetrated the entire cornea and the stiffness of the tissue after the cross-linking treatment.
I test effettuati hanno dimostrato che:The tests carried out have shown that:
a) dopo 15 minuti dall'applicazione della soluzione standard di riboflavinadestrano 0,1% per via trans-epiteliale si verifica parziale imbibizione dello stroma corneale e non risulta rilevabile la presenza della soluzione fluorescente nella sostanza posta all’interno del contenitore, con spettro colorimetrico sovrapponibile alla soluzione di sodio ialuronato xanthan gum 0,4 ml (punteggio 0 come da FIG. 1 e percentuale di giallo non superiore al 20%);a) after 15 minutes from the application of the standard solution of riboflavinadextran 0.1% via the transepithelial route, partial imbibition of the corneal stroma occurs and the presence of the fluorescent solution in the substance placed inside the container is not detectable, with colorimetric spectrum superimposable to the solution of sodium hyaluronate xanthan gum 0.4 ml (score 0 as per FIG. 1 and percentage of yellow not exceeding 20%);
b) dopo 30 minuti dall'applicazione della soluzione standard di riboflavinadestrano 0,1% per via trans-epiteliale lo stroma corneale appare completamente imbibito di soluzione fluorescente; si osserva la presenza di fluorescenza all’interno della soluzione di sodio ialuronato xanthan gum 0,4 ml presente nel contenitore con punteggio 2-3 della FIG. 1 e percentuale di giallo rilevato con la sopraindicata tecnica computerizzata in un range 75%-80%;b) after 30 minutes from the application of the standard solution of riboflavin dextran 0.1% via the transepithelial route, the corneal stroma appears completely imbued with the fluorescent solution; the presence of fluorescence is observed inside the 0.4 ml sodium hyaluronate xanthan gum solution present in the container with score 2-3 of FIG. 1 and percentage of yellow detected with the aforementioned computerized technique in a range of 75% -80%;
c) dopo 15 minuti dall'applicazione per via trans-epiteliale della prima nuova composizione di test di riboflavina-destrano 0,1% vitamina E TPGS (D-alfa-tocoferil polietilenglicol 1000 succinato) alla concentrazione di 500 mg % ml, l’imbibizione della cornea è completa e la soluzione fluorescente risulta presente all’interno del contenitore (punteggio 2-3 della FIG. 1, con percentuale di giallo del 72-76%);c) 15 minutes after transepithelial application of the first new test composition of riboflavin-dextran 0.1% vitamin E TPGS (D-alpha-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate) at a concentration of 500 mg% ml, the imbibition of the cornea is complete and the fluorescent solution is present inside the container (score 2-3 of FIG. 1, with a yellow percentage of 72-76%);
d) dopo 30 minuti dall'applicazione della prima nuova composizione di test, oltre alla completa imbibizione di tutti gli strati della cornea, si osserva un'elevata concentrazione del prodotto all’interno del contenitore, a testimonianza della buona permeabilità del tessuto corneale al prodotto stesso posto a contatto con la superficie epiteliale (punteggio 3-4 della FIG. 1, con percentuale di giallo del 79-84%);d) after 30 minutes from the application of the first new test composition, in addition to the complete imbibition of all layers of the cornea, a high concentration of the product is observed inside the container, reflecting the good permeability of the corneal tissue to the product same place in contact with the epithelial surface (score 3-4 of FIG. 1, with a yellow percentage of 79-84%);
e) la composizione proposta in [16] e le nuove composizioni di test seconda e terza, rispettivamente contenenti: benzalconio cloruro 0,01%; Vitamina Q 100 mg % ml; L-prolina 0,1 mg %, glicina 0,1 mg %, lisina cloridrato 0,05 mg % ed L-leucina 0,08 mg %, hanno fatto rilevare con le medesime metodiche una migliore penetrazione della riboflavina sia in termini quantitativi che di rapidità, rispetto ai risultati ottenuti utilizzando la sola soluzione standard (riboflavina-destrano 0,1%) (punteggio della FIG. 1 di 3-4 a 15 minuti e 4-6 a 30 minuti, con percentuale di giallo del 70-79% a 15 minuti e del 78-86% a 30 minuti);e) the composition proposed in [16] and the new second and third test compositions, respectively containing: 0.01% benzalkonium chloride; Vitamin Q 100 mg% ml; L-proline 0.1 mg%, glycine 0.1 mg%, lysine hydrochloride 0.05 mg% and L-leucine 0.08 mg%, showed with the same methods a better penetration of riboflavin both in quantitative and of rapidity, compared to the results obtained using the standard solution alone (riboflavin-dextran 0.1%) (score in FIG. 1 of 3-4 at 15 minutes and 4-6 at 30 minutes, with a yellow percentage of 70-79 % at 15 minutes and 78-86% at 30 minutes);
f) la quarta nuova composizione di test ha determinato risultati ancora migliori rispetto a tutte le altre composizioni sperimentate, soprattutto per quanto riguarda le diverse concentrazioni di colorante rilevate fluoroscopicamente ed l'analisi computerizzata di sostanza fluorescente all’interno del contenitore dopo 15 e dopo 30 minuti di applicazione del prodotto sulla superficie epiteliale (punteggio 5-6 della FIG. 1 a 15 minuti, con percentuale di giallo dell’88-91%; punteggio di 6-7 a 30 minuti, con percentuale di giallo superiore al 90%); la maggiore concentrazione di sostanza fluorescente nel materiale posto al di sotto della cornea ottenuta dopo applicazione trans-epiteliale della quarta nuova composizione di test risulta particolarmente evidente al test eseguito a distanza di 15 minuti, soprattutto se confrontata con i risultati ottenuti con la soluzione standard, che non risulta rilevabile nel materiale posto all’interno del contenitore dopo questo lasso di tempo.f) the fourth new test composition determined even better results than all the other tested compositions, especially as regards the different concentrations of dye detected fluoroscopically and the computerized analysis of the fluorescent substance inside the container after 15 and after 30 minutes of application of the product on the epithelial surface (score 5-6 of FIG. 1 at 15 minutes, with a yellow percentage of 88-91%; score of 6-7 at 30 minutes, with a yellow percentage greater than 90%) ; the higher concentration of fluorescent substance in the material placed under the cornea obtained after trans-epithelial application of the fourth new test composition is particularly evident in the test performed after 15 minutes, especially when compared with the results obtained with the standard solution, which is not detectable in the material placed inside the container after this period of time.
I risultati illustrati mostrano che almeno le seguenti sostanze:The results shown show that at least the following substances:
- vitamina E- Vitamin E
R1=CH3o H R2=CH3o H R3=CH3; a scopo esemplificativo si cita in particolare la vitamina E TPGS (D-alfa-tocoferil polietilenglicol 1000 succinato);R1 = CH3o H R2 = CH3o H R3 = CH3; by way of example, vitamin E TPGS (D-alpha-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate) is mentioned in particular;
- Coenzima Q- Coenzyme Q
rma rma
semichinonica,semichinonic,
nella forma ridotta, in the reduced form,
qualunque sia il numero di unità isopreniche del coenzima Q; a scopo esemplificativo, si cita in particolare il coenzima Q10;whatever the number of isoprene units of coenzyme Q; by way of example, the coenzyme Q10 is mentioned in particular;
- L-prolina- L-proline
--
- lisina- lysine
oppure lisina cloridrato;or lysine hydrochloride;
- L-leucina- L-leucine
singolarmente o in combinazione tra loro, eventualmente in combinazione con eccipienti come ad esempio l'acido acetico, e in concentrazioni scelte nei range indicati in precedenza favoriscono la penetrazione della riboflavina attraverso l'epitelio corneale in tempi minori rispetto alla soluzione standard di riboflavina-destrano e in quantità sufficienti per il successivo trattamento di cross-linking.individually or in combination with each other, possibly in combination with excipients such as acetic acid, and in concentrations chosen in the ranges indicated above, they favor the penetration of riboflavin through the corneal epithelium in shorter times than the standard riboflavin-dextran solution and in sufficient quantities for the subsequent cross-linking treatment.
La combinazione di tutti i composti menzionati con la riboflavina ha mostrato effetti complessivamente migliori per quanto concerne le concentrazioni di prodotto che attraversa i tessuti corneali e per la rapidità con cui avviene tale passaggio.The combination of all the compounds mentioned with riboflavin has shown overall better effects as regards the concentrations of product that crosses the corneal tissues and for the speed with which this passage occurs.
I Richiedenti hanno verificato in vitro l'efficacia del trattamento di cross-linking per via trans-epiteliale su cornee umane mediante applicazione della quarta nuova composizione di test ed irradiazione UV-A 3mW/cm<2>, secondo i protocolli standard.The Applicants have verified in vitro the efficacy of the transepithelial cross-linking treatment on human corneas by applying the fourth new test composition and UV-A 3mW / cm <2> irradiation, according to standard protocols.
Le cornee sono state preparate come nel precedente esperimento, fissandole su apposito supporto e applicando la soluzione standard di riboflavina-destrano 0,1% e la quarta nuova composizione di test sulla superficie epiteliale di rispettive cornee (quindi somministrate per via transepiteliale) per trenta minuti. Successivamente è stato effettuato il trattamento UV-A standard per trenta minuti suddivisi in “step” di 5 minuti, preceduti da riapplicazione di ciascuna composizione sulla superficie della cornea.The corneas were prepared as in the previous experiment, fixing them on a special support and applying the standard solution of riboflavin-dextran 0.1% and the fourth new test composition on the epithelial surface of the respective corneas (then administered transepithelially) for thirty minutes. . The standard UV-A treatment was then carried out for thirty minutes divided into 5-minute “steps”, preceded by the reapplication of each composition on the surface of the cornea.
Al termine dell’esperimento, è stato valutato il grado di rigidità del lembo corneale nel modo seguente: ciascuna cornea è stata agganciata all’estremità per una lunghezza di 2mm con una pinza corneale mantenuta lungo una linea orizzontale ed è stata effettuata misurazione gonioscopica dell’angolo formato dall’estremità opposta del lembo corneale rispetto alla stessa linea orizzontale.At the end of the experiment, the degree of stiffness of the corneal flap was assessed as follows: each cornea was hooked to the end for a length of 2mm with a corneal forceps held along a horizontal line and gonioscopic measurement of the angle formed by the opposite end of the corneal flap with respect to the same horizontal line.
La FIG. 3a mostra una cornea dopo trattamento di cross-linking transepiteliale effettuato usando la soluzione standard di riboflavina-destrano 0,1%, che si flette verso il basso di circa 40° e la FIG. 3b mostra un'altra cornea dopo il trattamento di cross-linking effettuato usando la quarta nuova composizione di test e senza aver preventivamente rimosso l'epitelio corneale. Dal confronto è evidente che il trattamento di cross-linking transepiteliale effettuato con la quarta nuova composizione di test ha irrigidito la cornea, come desiderato, che si flette verso il basso di soli 25°.FIG. 3a shows a cornea after transepithelial cross-linking treatment performed using the standard 0.1% riboflavin-dextran solution, flexing downward by approximately 40 ° and FIG. 3b shows another cornea after cross-linking treatment performed using the fourth new test composition and without having previously removed the corneal epithelium. From the comparison it is evident that the transepithelial cross-linking treatment performed with the fourth new test composition stiffened the cornea, as desired, which flexes downwards by only 25 °.
Ad ulteriore conferma dell’efficacia del trattamento di “cross-linking” per via trans-epiteliale mediante pretrattamento con la quarta nuova composizione di test, è stata realizzata tale metodica in vitro su lembi corneali umani, provenienti da pazienti affetti da cheratocono, sottoposti a cheratoplastica perforante; in questi casi la cornea espiantata al ricevente il trapianto corneale, anziché smaltirla, è stata utilizzata in laboratorio usando l’accorgimento di evitare il tempo chirurgico relativo alla diatermia per consentire in tal modo la conservazione ed il rispetto dei piani degli strati corneali (trapianto a tutto spessore). I lembi corneali sono stati fissati su un apposito supporto. Sulla prima cornea è stata applicata la soluzione standard di riboflavina-destrano 0,1% e sulla seconda la quarta nuova composizione di test, deponendole sulla superficie corneale senza rimozione dell’epitelio per trenta minuti.As further confirmation of the efficacy of the transepithelial "cross-linking" treatment by pretreatment with the fourth new test composition, this method was carried out in vitro on human corneal flaps, coming from patients affected by keratoconus, subjected to perforating keratoplasty; in these cases the cornea explanted from the corneal transplant recipient, instead of disposing of it, was used in the laboratory using the precaution of avoiding the surgical time related to diathermy to allow in this way the conservation and respect of the planes of the corneal layers (transplant to full thickness). The corneal flaps were fixed on a special support. The standard 0.1% riboflavin-dextran solution was applied to the first cornea and the fourth new test composition was applied to the second, depositing them on the corneal surface without removing the epithelium for thirty minutes.
Successivamente è stato effettuato solo sulla cornea trattata con la quarta nuova composizione di test il trattamento UV-A standard a 340 nm con potenza di 3mW/cm<2>per trenta minuti suddivisi in “step” di 5 minuti, preceduti dalla riapplicazione del composto sulla superficie della cornea. L’altro lembo con cheratocono, fissato su apposito supporto, è stato trattato solo mediante deposizione sulla cornea di soluzione standard di riboflavinadestrano 0.1%, senza successiva irradiazione con UV-A.Subsequently, the standard UV-A treatment at 340 nm with a power of 3mW / cm <2> was carried out only on the cornea treated with the fourth new test composition for thirty minutes divided into 5-minute "steps", preceded by the reapplication of the compound. on the surface of the cornea. The other flap with keratoconus, fixed on a special support, was treated only by depositing on the cornea a 0.1% standard solution of riboflavin dextran, without subsequent irradiation with UV-A.
Al termine dell’esperimento, è stata effettuata valutazione del parenchima corneale mediante microscopia elettronica a scansione.At the end of the experiment, evaluation of the corneal parenchyma was carried out by scanning electron microscopy.
La FIG. 4 mostra come si presentano ad una microscopia a scansione le lamelle di una sezione di cornea con cheratocono non trattata. La FIG. 5 è un ingrandimento di una parte della FIG. 4. Queste due figure mostrano una lassità delle lamelle nel lembo corneale, proveniente da un paziente affetto da cheratocono, sottoposto soltanto a contatto con soluzione standard a base di riboflavina-destrano 0,1% senza irradiazione.FIG. 4 shows how the lamellae of a section of cornea with untreated keratoconus look like a scanning microscopy. FIG. 5 is an enlargement of a portion of FIG. 4. These two figures show a laxity of the lamellae in the corneal flap, coming from a patient suffering from keratoconus, subjected only to contact with standard solution based on riboflavin-dextran 0.1% without irradiation.
La FIG. 6 è una microscopia a scansione che mostra come si presentano le lamelle di una sezione di cornea con cheratocono dopo trattamento di cross-linking trans-epiteliale con la quarta nuova composizione di test. Il lembo cheratoconico, trattato con la quarta nuova soluzione per via transepiteliale ed irradiazione UV-A secondo il protocollo standard per complessivi trenta minuti, ha presentato lamelle corneali fortemente stipate e compatte, a testimonianza dell’avvenuta formazione di nuovi legami biochimici di cross-linking.FIG. 6 is a scanning microscopy showing how the lamellae of a cornea section with keratoconus look after trans-epithelial cross-linking treatment with the fourth new test composition. The keratoconus flap, treated with the fourth new solution by transepithelial route and UV-A irradiation according to the standard protocol for a total of thirty minutes, presented strongly crammed and compact corneal lamellae, reflecting the formation of new biochemical cross-linking bonds. .
Risultati analoghi a quelli mostrati per la quarta nuova composizione di test sono stati ottenuti anche con le nuove composizioni di test prima, seconda e terza.Results similar to those shown for the fourth new test composition were also obtained with the new first, second and third test compositions.
I risultati ottenuti con le nuove composizioni di test superano anche i rilievi mossi da alcuni autori in merito ad un'ipotizzata riduzione degli effetti della procedura di cross-linking quando venga attuata per via trans-epiteliale, a causa di un possibile effetto di schermo dell’epitelio sui raggi UV-A. L’ipotesi di una riduzione dell’efficacia del trattamento di cross-linking trans-epiteliale risulta smentita dai reperti istologici riscontrati, se alla riboflavina si aggiunge almeno una delle sostanze qui proposte come "carrier" e si irradia seguendo il protocollo abituale.The results obtained with the new test compositions also surpass the findings made by some authors regarding a hypothesized reduction of the effects of the cross-linking procedure when it is carried out transepithelially, due to a possible screening effect of the epithelium on UV-A rays. The hypothesis of a reduction in the effectiveness of the trans-epithelial cross-linking treatment is denied by the histological findings found, if at least one of the substances proposed here as "carrier" is added to the riboflavin and irradiated following the usual protocol.
E’ stato inoltre effettuato uno studio comparativo degli effetti del trattamento di cross-linking per via trans-epiteliale sulla integrità morfologica o meno degli strati epiteliali della cornea e dei microvilli presenti sulla superficie delle cellule epiteliali, utilizzando un microscopio elettronico a scansione (7500x). Ciò è stato fatto al fine di valutare la tollerabilità del trattamento di cross-linking eseguito con la quarta nuova composizione di test per via trans-epiteliale sull’epitelio corneale rispetto alla soluzione standard di riboflavina-destrano 0,1% e alla composizione di soluzione standard benzalconio cloruro 0,01% del tipo proposto in [16].A comparative study of the effects of the trans-epithelial cross-linking treatment on the morphological integrity or otherwise of the epithelial layers of the cornea and of the microvilli present on the surface of the epithelial cells was also carried out, using a scanning electron microscope (7500x). . This was done in order to evaluate the tolerability of the cross-linking treatment performed with the fourth new test composition via transepithelial route on the corneal epithelium compared to the standard 0.1% riboflavin-dextran solution and the solution composition. 0.01% benzalkonium chloride standard of the type proposed in [16].
Questo test è stato effettuato perché le cellule epiteliali sono le prime strutture organiche ad essere irradiate dal fascio di UV-A e potrebbero riportare lesioni in seguito all’assorbimento di tali radiazioni. Nessuna delle pubblicazioni note in letteratura appare considerare tale aspetto, né sono noti dati in proposito.This test was carried out because epithelial cells are the first organic structures to be irradiated by the UV-A beam and could be injured following the absorption of such radiation. None of the known publications in the literature appears to consider this aspect, nor are data known in this regard.
Gli indici attualmente ritenuti più attendibili di vitalità delle cellule epiteliali sono l’esame citologico con tecnica ad impressione ed, in particolare, l’esame al microscopio elettronico dei microvilli dello strato delle cellule epiteliali superficiali della cornea. La presenza di estroflessioni della membrana (microvilli) degli elementi cellulari superficiali integri, contenenti una elevata concentrazione di mucine transmembrana ed un ricco glicocalice, consente di legare in modo ottimale la mucina libera che costituisce lo strato profondo del film lacrimale precorneale. La patologica perdita dei microvilli determina al contrario una difficoltosa aderenza dello strato di lacrime alla superficie oculare e fenomeni di sofferenza epiteliale indotta proprio dalla disfunzione del film lacrimale precorneale e dai conseguenti fenomeni infiammatori.The currently considered most reliable indices of epithelial cell vitality are cytological examination with impression technique and, in particular, electron microscopic examination of the microvilli of the superficial epithelial cell layer of the cornea. The presence of membrane protrusions (microvilli) of the intact superficial cellular elements, containing a high concentration of transmembrane mucins and a rich glycocalyx, allows the free mucin that constitutes the deep layer of the precorneal tear film to be optimally bound. On the contrary, the pathological loss of microvilli determines a difficult adhesion of the layer of tears to the ocular surface and phenomena of epithelial suffering induced by the dysfunction of the precorneal tear film and the consequent inflammatory phenomena.
E’ stata effettuata la valutazione della morfologia dei microvilli con esame al microscopio elettronico a scansione dopo trattamento transepiteliale in vitro con UV-A secondo i dosaggi standard. Sono state prese in esame cornee umane di spessore compreso tra 500 e 600 micron, dopo incubazione per trenta minuti con una comune soluzione salina bilanciata (BSS), con la soluzione standard di riboflavina-destrano 0,1%, con la composizione di soluzione standard benzalconio cloruro 0,01% e con la quarta nuova composizione di test.The morphology of the microvilli was evaluated with scanning electron microscope examination after in vitro transepithelial treatment with UV-A according to standard dosages. Human corneas of thickness between 500 and 600 microns were examined, after incubation for thirty minutes with a common balanced saline solution (BSS), with the standard solution of riboflavin-dextran 0.1%, with the composition of standard solution benzalkonium chloride 0.01% and with the fourth new test composition.
Preliminarmente, è stato condotto anche lo studio della morfologia dei microvilli e degli strati superficiali dell’epitelio corneale di cornee non sottoposte ad alcun trattamento per evidenziare come debbano mostrarsi le cellule epiteliali ed i loro microvilli quando non sottoposte ad alcun procedimento fotochimico.Preliminarily, the study of the morphology of the microvilli and the superficial layers of the corneal epithelium of corneas not subjected to any treatment was also carried out to highlight how the epithelial cells and their microvilli must show themselves when not subjected to any photochemical procedure.
La FIG. 7 è una microscopia a scansione che mostra la morfologia dei microvilli e degli strati superficiali dell’epitelio in una cornea normale, e la FIG. 8 mostra una microscopia a scansione di una cornea trattate con UV-A dopo aver applicato la soluzione standard riboflavina-destrano 0,1% seguendo il protocollo standard. Dal confronto con la FIG. 7, è evidente la completa e totale perdita di tutti gli strati epiteliali e l’esposizione della membrana di Bowman.FIG. 7 is a scanning microscopy showing the morphology of the microvilli and the superficial layers of the epithelium in a normal cornea, and FIG. 8 shows a scanning microscopy of a cornea treated with UV-A after applying the standard 0.1% riboflavin-dextran solution following the standard protocol. From the comparison with FIG. 7, the complete and total loss of all epithelial layers and the exposure of Bowman's membrane is evident.
Una situazione analoga è stata verificata anche in quelle cornee trattate con la composizione costituita dalla soluzione standard benzalconio cloruro 0,01% del tipo suggerito in [16].A similar situation was also verified in those corneas treated with the composition consisting of the standard 0.01% benzalkonium chloride solution of the type suggested in [16].
La FIG. 9 è una microscopia a scansione di una cornea trattata con UV-A a dosaggio standard dopo trattamento con la quarta nuova composizione di test. Dal confronto con le FIGG. 7 e 8 si nota la conservazione degli strati epiteliali, dei nuclei cellulari e delle giunzioni intercellulari (gap-junction). Si rileva inoltre una significativa riduzione della densità dei microvilli, quelli restanti conservano però l'integrità morfologica, e nessuna compromissione dell’integrità della membrana cellulare citoplasmatica profonda. Risultati analoghi sono stati ottenuti con le nuove composizioni di test prima, seconda e terza.FIG. 9 is a scanning microscopy of a standard dose UV-A treated cornea after treatment with the fourth new test composition. From the comparison with FIGS. 7 and 8 we note the conservation of the epithelial layers, cell nuclei and intercellular junctions (gap-junction). There is also a significant reduction in the density of microvilli, the remaining ones, however, retain their morphological integrity, and no impairment of the integrity of the deep cytoplasmic cell membrane. Similar results were obtained with the new first, second and third test compositions.
La FIG. 10 è una microscopia a scansione di una cornea trattata con UV-A a dosaggio standard utilizzando, a scopo di confronto, solo una soluzione fisiologica. Si evidenzia uno scompaginamento degli strati epiteliali, la perdita in molte cellule del nucleo citoplasmatico e quasi totale perdita sia delle gap-junction sia dei microvilli.FIG. 10 is a scanning microscopy of a standard dose UV-A treated cornea using saline only for comparison purposes. There is a disruption of the epithelial layers, the loss in many cells of the cytoplasmic nucleus and almost total loss of both the gap junctions and the microvilli.
I risultati ottenuti possono essere così sintetizzati:The results obtained can be summarized as follows:
1) le cornee trattate con UV-A previa incubazione con la soluzione standard di riboflavina-destrano 0,1% o con la composizione contenente la soluzione standard benzalconio cloruro 0,01% seguendo il protocollo standard, hanno subito la totale perdita di tutti gli strati epiteliali e la conseguente esposizione della membrana di Bowman (FIG. 8). In pratica, usando solo la soluzione standard eventualmente addizionata di benzalconio cloruro, l'epitelio viene distrutto dalla radiazione UV-A. Ciò induce a ritenere che il cross-linking effettuato senza rimuovere l'epitelio usando la soluzione standard oppure la composizione riboflavina-destrano benzalconio cloruro non risparmierebbe ai pazienti i fastidiosi sintomi post-operatori causati dalla tecnica che invece prevede la rimozione chirurgica dell'epitelio;1) corneas treated with UV-A after incubation with the standard solution of riboflavin-dextran 0.1% or with the composition containing the standard solution benzalkonium chloride 0.01% following the standard protocol, have suffered the total loss of all epithelial layers and the consequent exposure of Bowman's membrane (FIG. 8). In practice, using only the standard solution possibly added with benzalkonium chloride, the epithelium is destroyed by UV-A radiation. This leads us to believe that cross-linking carried out without removing the epithelium using the standard solution or the composition of riboflavin-dextran benzalkonium chloride would not spare patients the annoying post-operative symptoms caused by the technique which instead involves the surgical removal of the epithelium;
2) le cornee trattate con UVA a dosaggio standard dopo incubazione con composizioni comprendenti la riboflavina-destrano e almeno un "carrier" tra quelli indicati in precedenza, ed in particolare la quarta nuova composizione di test, hanno evidenziato la conservazione degli strati epiteliali, dei nuclei cellulari e delle giunzioni intercellulari (gap-junction). È stata rilevata una significativa riduzione della densità dei microvilli, ma quelli restanti però mostrano integrità morfologica. Non si è verificata alcuna compromissione dell’integrità della membrana cellulare citoplasmatica profonda delle cornee;2) corneas treated with standard dosage UVA after incubation with compositions comprising riboflavin-dextran and at least one "carrier" among those indicated above, and in particular the fourth new test composition, showed the preservation of the epithelial layers, of the cell nuclei and intercellular junctions (gap-junction). A significant reduction in the density of microvilli was detected, but the remaining ones show morphological integrity. There was no impairment of the integrity of the deep cytoplasmic cell membrane of the corneas;
3) le cornee trattate con UVA a dosaggio standard dopo incubazione con il solo composto di soluzione fisiologica (BSS) hanno evidenziato uno scompaginamento degli strati epiteliali, perdita in molte cellule del nucleo citoplasmatico e quasi totale perdita sia delle gap-junction sia dei microvilli.3) corneas treated with standard dosage UVA after incubation with the compound of physiological solution (BSS) alone showed a disruption of the epithelial layers, loss in many cells of the cytoplasmic nucleus and almost total loss of both the gap junctions and the microvilli.
Sono state effettuate microscopie a scansione anche sulle cornee trattate con le nuove composizioni di test prima, seconda e terza, ma non sono state riportate perché esse appaiono sostanzialmente come quelle trattate usando la quarta nuova composizione di test.Scanning microscopies have also been performed on corneas treated with the new first, second and third test compositions, but have not been reported because they appear substantially like those treated using the fourth new test composition.
Questi risultati inducono a ritenere che almeno la vitamina E, la vitamina Q o coenzima Q, gli amminoacidi testati quali la L-prolina, la glicina, la lisina cloridrato e la L-leucina, aiutino a proteggere l'epitelio corneale e a favorire l'attraversamento dell'epitelio corneale da parte della riboflavina. Tra le nuove composizioni proposte, la quarta composizione ha mostrato le migliori performance sia in termini di tempo di attraversamento che di conservazione dell'epitelio corneale.These results suggest that at least vitamin E, vitamin Q or coenzyme Q, the tested amino acids such as L-proline, glycine, lysine hydrochloride and L-leucine, help protect the corneal epithelium and promote crossing of the corneal epithelium by riboflavin. Among the new compositions proposed, the fourth composition showed the best performances both in terms of crossing time and conservation of the corneal epithelium.
Le ragioni del perché le sostanze proposte consentano di ottenere questi straordinari risultati non sono attualmente completamente definite. Senza alcuna intenzione di limitare l'invenzione ad una teoria, i Richiedenti ipotizzano che la limitata capacità lesiva sull’epitelio rilevata dopo pretrattamento con la quarta nuova composizione di test potrebbe essere dovuta all'azione citoprotettiva esercitata dalla vitamina E, ad esempio la vitamina E-TPGS, e/o alla presenza nella soluzione di almeno un amminoacido essenziale o semi-essenziale. La vitamina E agirebbe sul glutadione ossidasi e sulla peroxide dismutasi, che sono gli enzimi coinvolti nella azione riparativa dell’epitelio, mentre gli amminoacidi essenziali o semi-essenziali ("conditionally essential") avrebbero una funzione citoriparativa e probabilmente favorirebbero anche l’effetto di cross-linking. Inoltre è possibile che la maggiore imbibizione del tessuto da parte della quarta nuova composizione determini non solo un aumento dell’effetto di cross-linking, ma anche una migliore protezione degli strati epiteliali corneali dagli effetti nocivi della radiazione UV-A.The reasons why the proposed substances allow these extraordinary results to be achieved are currently not fully defined. Without any intention of limiting the invention to a theory, the Applicants hypothesize that the limited damage capacity on the epithelium detected after pretreatment with the fourth new test composition could be due to the cytoprotective action exerted by vitamin E, for example vitamin E -TPGS, and / or the presence in the solution of at least one essential or semi-essential amino acid. Vitamin E would act on glutadione oxidase and peroxide dismutase, which are the enzymes involved in the reparative action of the epithelium, while essential or semi-essential amino acids ("conditionally essential") would have a cyto-repair function and would probably also favor the effect of cross-linking. Furthermore, it is possible that the greater imbibition of the tissue by the fourth new composition determines not only an increase in the cross-linking effect, but also a better protection of the corneal epithelial layers from the harmful effects of UV-A radiation.
Con le nuove composizioni a base di riboflavina-destrano ed almeno un "carrier" scelto tra quelli qui proposti, è possibile effettuare il trattamento di cross-linking, ad esempio per la cura del cheratocono, senza preventiva rimozione dell’epitelio corneale. L'assenza di disepitelizzazione evita:With the new compositions based on riboflavin-dextran and at least one "carrier" chosen from those proposed here, it is possible to carry out the cross-linking treatment, for example for the treatment of keratoconus, without prior removal of the corneal epithelium. The absence of de-epithelialization avoids:
1) i disturbi dovuti ad irritazione che tipicamente si verificano nei primi giorni dopo il trattamento di cross-linking con protocollo standard;1) disturbances due to irritation that typically occur in the first days after cross-linking treatment with standard protocol;
2) la necessità di applicare una lente a contatto terapeutica in tale periodo e, soprattutto,2) the need to apply a therapeutic contact lens during this period and, above all,
3) l’insorgenza dei rischi di infezioni corneali post-chirurgiche dovuti alla rimozione dell’epitelio.3) the onset of risks of post-surgical corneal infections due to the removal of the epithelium.
Si evitano inoltre manovre chirurgiche sulla cornea, per cui diventa possibile effettuare il trattamento in regime ambulatoriale, senza necessità di sala operatoria e di microscopio operatorio.Furthermore, surgical maneuvers on the cornea are avoided, making it possible to carry out the treatment on an outpatient basis, without the need for an operating room and operating microscope.
Le nuove composizioni potrebbero essere somministrate anche sotto forma di collirio o di gel o applicate su lenti a contatto terapeutiche prima dell’esposizione ai raggi solari, soprattutto nel periodo estivo, in modo da potenziare l’effetto cross-linking naturale dovuto ad irraggiamento con luce solare.The new compositions could also be administered in the form of eye drops or gel or applied on therapeutic contact lenses before exposure to sunlight, especially in the summer, in order to enhance the natural cross-linking effect due to irradiation with light. solar.
Le nuove composizioni potrebbero inoltre esercitare un effetto protettivo dai raggi UV-A sulle strutture interne del globo oculare e quindi essere utilizzate ad esempio per la protezione della macula e/o per la prevenzione della cataratta in soggetti a rischio esposti per molte ore alla luce solare.The new compositions could also exert a protective effect from UV-A rays on the internal structures of the eyeball and therefore be used for example for the protection of the macula and / or for the prevention of cataracts in subjects at risk exposed for many hours to sunlight. .
Al solo scopo di conservare più a lungo le nuove composizioni in contenitori non monodose, è possibile aggiungere del benzalconio cloruro, in concentrazione da 0,0001% a 0,02%, preferibilmente in concentrazione pari allo 0,01%. Qualora le nuove composizioni dovessero essere prodotte e vendute in contenitori monodose, non è indispensabile che contengano benzalconio cloruro.For the sole purpose of keeping the new compositions in non-single-dose containers longer, it is possible to add benzalkonium chloride, in a concentration from 0.0001% to 0.02%, preferably in a concentration equal to 0.01%. If the new compositions are to be produced and sold in single-dose containers, it is not essential that they contain benzalkonium chloride.
Le composizioni possono essere inoltre addizionate di conservanti, antimicrobici, antimicotici, eccipienti (a titolo di esempio si cita l'acido acetico) e in generale di tutte quelle sostanze utilizzate in campo oftalmico per rendere stabili e sterili nel tempo soluzioni oftalmiche e/o per favorirne l'assunzione.The compositions can also be added with preservatives, antimicrobials, antifungals, excipients (by way of example, acetic acid is mentioned) and in general with all those substances used in the ophthalmic field to make ophthalmic solutions and / or for favor their intake.
Come detto in precedenza, i Richiedenti ipotizzano che le buone performance delle composizioni ottenute aggiungendo alla riboflavina almeno una sostanza scelta tra vitamina Q, L-prolina, glicina, lisina cloridrato, L-leucina siano in parte dovute al fatto che queste ultime sono amminoacidi essenziali o semi-essenziali ("conditionally essential"), che svolgerebbero una funzione citoriparativa attraverso un incremento delle metallo proteinasi MMP9.As previously mentioned, the Applicants hypothesize that the good performances of the compositions obtained by adding to the riboflavin at least one substance chosen from among vitamin Q, L-proline, glycine, lysine hydrochloride, L-leucine are partly due to the fact that the latter are essential amino acids or semi-essential ("conditionally essential"), which would perform a cytoreparative function through an increase in the metallo proteinase MMP9.
Ciò induce a ritenere che sia possibile ottenere risultati analoghi a quelli delle nuove composizioni di test prima, seconda, terza e quarta aggiungendo, ad una soluzione di riboflavina, per esempio ad una soluzione di riboflavina-destrano, almeno una sostanza idonea ad aumentare la metallo proteinasi MMP9 verosimilmente in una concentrazione compresa tra 0,00001% e 0,5%.This suggests that it is possible to obtain results similar to those of the new first, second, third and fourth test compositions by adding, to a solution of riboflavin, for example to a solution of riboflavin-dextran, at least one substance suitable for increasing the metal. MMP9 proteinase likely in a concentration between 0.00001% and 0.5%.
Si ritiene inoltre che sia possibile ottenere risultati analoghi a quelli delle nuove composizioni di test prima, seconda, terza e quarta aggiungendo, ad una soluzione di riboflavina, per esempio ad una soluzione di riboflavinadestrano, almeno un amminoacido essenziale o semi-essenziale.It is also believed that it is possible to obtain results similar to those of the new first, second, third and fourth test compositions by adding, to a solution of riboflavin, for example to a solution of riboflavin dextran, at least one essential or semi-essential amino acid.
Tra tutte le sostanze potenzialmente utili, la più promettente sembra essere la L-arginina. Essa può essere mescolata con una soluzione a base di riboflavina, per esempio la soluzione standard di riboflavina-destrano, ed eventualmente in aggiunta ad una o più delle sostanze indicate in precedenza per ottenere le nuove composizioni.Of all the potentially useful substances, the most promising appears to be L-arginine. It can be mixed with a riboflavin-based solution, for example the standard riboflavin-dextran solution, and optionally in addition to one or more of the substances indicated above to obtain the new compositions.
Anche se non sono stati ancora tutti testati, appare ragionevole ritenere che tutti gli amminoacidi essenziali possano essere validamente utilizzati per facilitare l'attraversamento della riboflavina attraverso l'epitelio corneale e proteggere quest'ultimo dalla radiazione UV-A. In particolare, appare ragionevole ritenere che la L-arginina possa dimostrarsi un "carrier" valido quanto le altre sostanze proposte in precedenza perché appare ragionevole presumere che la L-arginina, che è un amminoacido precursore dell'ossido di azoto, possa fornire ossido di azoto (NO) a livello periferico. L'uso dell'ossido di azoto (NO) per curare pazienti affetti da cheratocono mediante applicazione sull'epitelio di una sostanza nella quale sia disciolto è attualmente ostacolato dalla sua scarsa solubilità.Even if not all have been tested yet, it seems reasonable to believe that all essential amino acids can be validly used to facilitate the passage of riboflavin through the corneal epithelium and protect it from UV-A radiation. In particular, it seems reasonable to believe that L-arginine can prove to be a "carrier" as valid as the other substances proposed above because it seems reasonable to assume that L-arginine, which is an amino acid precursor of nitric oxide, can provide oxide of nitrogen (NO) at the peripheral level. The use of nitric oxide (NO) to treat patients with keratoconus by applying a substance in which it is dissolved to the epithelium is currently hampered by its poor solubility.
Resta da verificare se la L-arginina e gli altri amminoacidi essenziali siano in grado o meno di proteggere i microvilli dell'epitelio dai raggi UV-A usati nel cross-linking. Se gli altri amminoacidi essenziali o semi-essenziali e in particolare la L-arginina dovessero risultare utili per realizzare soluzioni che permettano il cross-linking trans-epiteliale preservando l'epitelio corneale, cosa che al momento ai Richiedenti appare ragionevole, verosimilmente essi dovranno essere presente in una concentrazione compresa tra 0,00001% e 0,5% in aggiunta ad una soluzione di riboflavina, ad esempio una soluzione di riboflavina-destrano.It remains to be seen whether L-arginine and other essential amino acids are able or not to protect the microvilli of the epithelium from UV-A rays used in cross-linking. If the other essential or semi-essential amino acids and in particular L-arginine were to be useful for creating solutions that allow trans-epithelial cross-linking while preserving the corneal epithelium, which at the moment seems reasonable to the Applicants, they will probably have to be present in a concentration between 0.00001% and 0.5% in addition to a riboflavin solution, for example a riboflavin-dextran solution.
Secondo una forma di realizzazione alternativa, la concentrazione di L-arginina o di altro amminoacido essenziale varia da 0,001% a 0,4%. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da 0,005% a 0,3%. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da circa 0,01% a 0,2%. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione di L-arginina o di altro amminoacido essenziale è di circa 0,1%.According to an alternative embodiment, the concentration of L-arginine or other essential amino acid ranges from 0.001% to 0.4%. According to yet another embodiment, the concentration ranges from 0.005% to 0.3%. According to yet another embodiment, the concentration ranges from about 0.01% to 0.2%. According to yet another embodiment, the concentration of L-arginine or other essential amino acid is about 0.1%.
Opzionalmente, si potrebbe aggiungere la L-arginina e/o qualsiasi altro amminoacido essenziale ad una qualsiasi delle nuove composizioni proposte.Optionally, L-arginine and / or any other essential amino acid could be added to any of the new proposed compositions.
BIBLIOGRAFIABIBLIOGRAPHY
1 Seiler T, Spoerl E, Huhle M, Kamouna A. Conservative therapy of keratoconus by enhancement of collagen cross-links. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 1996;37:S1017.1 Seiler T, Spoerl E, Huhle M, Kamouna A. Conservative therapy of keratoconus by enhancement of collagen cross-links. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 1996; 37: S1017.
2 Seiler T, Quurke AW. Iatrogenic keratectasia after LASIK in a case of forme fruste keratoconus. J Cat Refract Surg. 1998;24:1007-1009.2 Seiler T, Quurke AW. Iatrogenic keratectasia after LASIK in a case of forme fruste keratoconus. J Cat Refract Surg. 1998; 24: 1007-1009.
3 Spoerl E, Huhle M, Seiler T. "Induction of cross-links in corneal tissue", Exp Eye Res. 1998;66:97-103.3 Spoerl E, Huhle M, Seiler T. "Induction of cross-links in corneal tissue", Exp Eye Res. 1998; 66: 97-103.
4 Mazzotta C, Traversi C, Baiocchi S, Sergio P, Caporossi T, Caporossi A.” Conservative treatment of keratoconus by riboflavin-uva-induced crosslinking of corneal collagen: qualitative investigation. Eur J Ophthalmol.4 Mazzotta C, Traversi C, Baiocchi S, Sergio P, Caporossi T, Caporossi A. " Conservative treatment of keratoconus by riboflavin-uva-induced crosslinking of corneal collagen: qualitative investigation. Eur J Ophthalmol.
2006;16:530-5.2006; 16: 530-5.
5 Caporossi A, Baiocchi S, Mazzotta C, Traversi C, Caporossi T. “Parasurgical therapy for keratoconus by riboflavin-ultraviolet type A rays induced cross-linking of corneal collagen: preliminary refractive results in an Italian study.” J Cataract Refract Surg. 2006;32:837-45.5 Caporossi A, Baiocchi S, Mazzotta C, Traversi C, Caporossi T. "Parasurgical therapy for keratoconus by riboflavin-ultraviolet type A rays induced cross-linking of corneal collagen: preliminary refractive results in an Italian study." J Cataract Refract Surg. 2006; 32: 837-45.
6 Spoerl E, Seiler T. Techniques for stiffening the cornea. J Refract Surg.6 Spoerl E, Seiler T. Techniques for stiffening the cornea. J Refract Surg.
1999;15:711-713.1999; 15: 711-713.
7 Hagele G, Boxer Wachler BS. “Corneal Collagen Crosslinking with Riboflavin (C3-R) for corneal stabilization”. Presented at the International Congress of Corneal Cross Linking (CCL). December 9-10, 2005. Zurich, Switzerland.7 Hagele G, Boxer Wachler BS. “Corneal Collagen Crosslinking with Riboflavin (C3-R) for corneal stabilization”. Presented at the International Congress of Corneal Cross Linking (CCL). December 9-10, 2005. Zurich, Switzerland.
8 Pinelli, R.” C3-Riboflavin for the treatment of keratoconus.” J Cataract & Refractive Surgery Today Europe. 2006;1:49-50.8 Pinelli, R. " C3-Riboflavin for the treatment of keratoconus. " J Cataract & Refractive Surgery Today Europe. 2006; 1: 49-50.
9 Pinelli R. “Eyeword”,2007;5:34-40.9 Pinelli R. “Eyeword”, 2007; 5: 34-40.
10 Linda J Müller, Elisabeth Pels, Gijs F J M Vrensen:” The specific architecture of the anterior stroma accounts for maintenance of corneal curvature”. Br J Ophthalmol 2001;85:437-443 (April).10 Linda J Müller, Elisabeth Pels, Gijs F J M Vrensen: ”The specific architecture of the anterior stroma accounts for maintenance of corneal curvature”. Br J Ophthalmol 2001; 85: 437-443 (April).
11 Mau T. Tran1, Robert N. Lausch2 and John E. Oakes:” Substance P Differentially Stimulates IL-8 Synthesis in Human Corneal Epithelial Cells”. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2000;41:3871-3877.11 Mau T. Tran1, Robert N. Lausch2 and John E. Oakes: "Substance P Differentially Stimulates IL-8 Synthesis in Human Corneal Epithelial Cells". Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2000; 41: 3871-3877.
12 L.J. Muller, L Pels and GF Vrensen:” Novel aspects of the ultrastructural organization of human corneal keratocytes”. Investigative Ophthalmology & Visual Science, Vol 36, 2557-2567.12 L.J. Muller, L Pels and GF Vrensen: "Novel aspects of the ultrastructural organization of human corneal keratocytes". Investigative Ophthalmology & Visual Science, Vol 36, 2557-2567.
13 G Perrella, P Brusini, R Spelat, P Hossain, A Hopkinson, H S Dua: ”Expression of haematopoietic stem cell markers, CD133 and CD34 on human corneal keratocytes”. British Journal of Ophthalmology 2007;91:94-99.13 G Perrella, P Brusini, R Spelat, P Hossain, A Hopkinson, H S Dua: "Expression of haematopoietic stem cell markers, CD133 and CD34 on human corneal keratocytes". British Journal of Ophthalmology 2007; 91: 94-99.
14 Tadashi Senoo, and Nancy C. Joyce:” Cell Cycle Kinetics in Corneal Endothelium from Old and Young Donors”. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2000;41:660-667.14 Tadashi Senoo, and Nancy C. Joyce: "Cell Cycle Kinetics in Corneal Endothelium from Old and Young Donors". Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2000; 41: 660-667.
15 L.J. Muller, L Pels and GF Vrensen: "Ultrastructural organization of human corneal nerves”. Investigative Ophthalmology & Visual Science, Vol 37, 476-488.15 L.J. Muller, L Pels and GF Vrensen: "Ultrastructural organization of human corneal nerves." Investigative Ophthalmology & Visual Science, Vol 37, 476-488.
16 Domanda di brevetto italiano MI2007A002162, 14 nov. 2007, R. Pinelli, "Collirio per il trattamento del cheratocono con tecnica cross-linking trans-epiteliale".16 Italian patent application MI2007A002162, 14 nov. 2007, R. Pinelli, "Eye drops for the treatment of keratoconus with transepithelial cross-linking technique".
17 R. Pinelli, A. J. Kannellopoulos, B. S. B. Wachler, E. Spoerl, A. Ertan, S. L. Trokel, "C3-Riboflavine treatments: Where did we come from? Where are we now?", Cataract & Refractive Surgery Today Europe, Summer 2007.17 R. Pinelli, A. J. Kannellopoulos, B. S. B. Wachler, E. Spoerl, A. Ertan, S. L. Trokel, "C3-Riboflavine treatments: Where did we come from? Where are we now?", Cataract & Refractive Surgery Today Europe, Summer 2007 .
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT000052AITVA20090052A1 (en) | 2009-07-27 | 2009-07-27 | COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF KERATOCONUS WITH TRANS-EPITHELIAL CROSS-LINKING TECHNIQUE OR TO PROTECT INTERNAL STRUCTURES OF THE OCULAR GLOBE FROM UV-A RAYS |
| PT107378739TPT2459186E (en) | 2009-07-27 | 2010-07-23 | Ophthalmic solution for protecting internal structures of the eyeball against uv-a rays or for the treatment of keratoconus with a trans-epithelial cross-linking technique |
| ES10737873.9TES2441227T3 (en) | 2009-07-27 | 2010-07-23 | Ophthalmic solution for the protection of the internal structures of the eyeball against UV-A rays or for the treatment of keratoconus with a transepithelial cross-linking technique |
| AU2010277668AAU2010277668A1 (en) | 2009-07-27 | 2010-07-23 | Ophthalmic solution for protecting internal structures of the eyeball against UV-A rays or for the treatment of keratoconus with a trans-epithelial cross-linking technique |
| CN2010800328001ACN102470120A (en) | 2009-07-27 | 2010-07-23 | Ophthalmic solution for protecting the inner structure of the eyeball against ultraviolet light or for treating keratoconus with transepithelial cross-linking |
| EP10737873.9AEP2459186B1 (en) | 2009-07-27 | 2010-07-23 | Ophthalmic solution for protecting internal structures of the eyeball against uv-a rays or for the treatment of keratoconus with a trans-epithelial cross-linking technique |
| PCT/EP2010/060752WO2011012557A1 (en) | 2009-07-27 | 2010-07-23 | Ophthalmic solution for protecting internal structures of the eyeball against uv-a rays or for the treatment of keratoconus with a trans-epithelial cross-linking technique |
| RU2012106178/15ARU2540481C2 (en) | 2009-07-27 | 2010-07-23 | Ophthalmic solution for uv-a rays protection of internal structures of eyeball or for treating keratoconus by transepithelial crosslinking |
| CA2805511ACA2805511C (en) | 2009-07-27 | 2010-07-23 | Ophthalmic solution for protecting internal structures of the eyeball against uv-a rays or for the treatment of keratoconus with a trans-epithelial cross-linking technique |
| KR1020127004681AKR20120038520A (en) | 2009-07-27 | 2010-07-23 | Opthalmic solution for protecting internal structures of the eyeball against uv-a rays or for the treatment of keratoconus with a trans-epithelial cross-linking technique |
| US13/387,668US9192594B2 (en) | 2009-07-27 | 2010-07-23 | Ophthalmic solution for protecting internal structures of the eyeball against UV-A rays or for the treatment of keratoconus with a trans-epithelial cross-linking technique |
| JP2012522123AJP2013500302A (en) | 2009-07-27 | 2010-07-23 | Ophthalmic solution for protecting internal structure of eyeball against UV-A rays or treating keratoconus by transepithelial crosslinking |
| BR112012001998ABR112012001998B8 (en) | 2009-07-27 | 2010-07-23 | ophthalmic solution, use of a compound, and, method for preparing an ophthalmic solution |
| ZA2012/01122AZA201201122B (en) | 2009-07-27 | 2012-02-15 | Opthalmic solution for protecting internal structures of the eyeball against uv-a rays or for the treatment of keratoconus with a trans-epithelial cross-linking technique |
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT000052AITVA20090052A1 (en) | 2009-07-27 | 2009-07-27 | COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF KERATOCONUS WITH TRANS-EPITHELIAL CROSS-LINKING TECHNIQUE OR TO PROTECT INTERNAL STRUCTURES OF THE OCULAR GLOBE FROM UV-A RAYS |
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ITVA20090052A1true ITVA20090052A1 (en) | 2011-01-28 |
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT000052AITVA20090052A1 (en) | 2009-07-27 | 2009-07-27 | COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF KERATOCONUS WITH TRANS-EPITHELIAL CROSS-LINKING TECHNIQUE OR TO PROTECT INTERNAL STRUCTURES OF THE OCULAR GLOBE FROM UV-A RAYS |
| Country | Link |
|---|---|
| IT (1) | ITVA20090052A1 (en) |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5156852A (en)* | 1989-04-20 | 1992-10-20 | La Haye Laboratories, Inc. | Composition and method for combating macular degeneration |
| WO2001091772A2 (en)* | 2000-06-01 | 2001-12-06 | Theralife, Inc. | Compositions for treating eye discomfort containing herbals and/or nutritional supplements and/or minerals and/or vitamins |
| WO2002017879A1 (en)* | 2000-08-29 | 2002-03-07 | Chopra Raj K | Palatable oral coenzyme q liquid |
| JP2005247777A (en)* | 2004-03-05 | 2005-09-15 | Taisho Pharmaceut Co Ltd | Ophthalmic agent |
| WO2009001396A1 (en)* | 2007-06-26 | 2008-12-31 | Sooft Italia Spa | Disposable sterile ocular solution for corneal cross- linking of cheratocone, and process for production thereof |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5156852A (en)* | 1989-04-20 | 1992-10-20 | La Haye Laboratories, Inc. | Composition and method for combating macular degeneration |
| WO2001091772A2 (en)* | 2000-06-01 | 2001-12-06 | Theralife, Inc. | Compositions for treating eye discomfort containing herbals and/or nutritional supplements and/or minerals and/or vitamins |
| WO2002017879A1 (en)* | 2000-08-29 | 2002-03-07 | Chopra Raj K | Palatable oral coenzyme q liquid |
| JP2005247777A (en)* | 2004-03-05 | 2005-09-15 | Taisho Pharmaceut Co Ltd | Ophthalmic agent |
| WO2009001396A1 (en)* | 2007-06-26 | 2008-12-31 | Sooft Italia Spa | Disposable sterile ocular solution for corneal cross- linking of cheratocone, and process for production thereof |
| Title |
|---|
| AHLROT-WESTERLUND B ET AL: "Remarkable success of antioxidant treatment (selenomethionine and vitamin E) to a 34-year old patient with posterior subcapsular cataract, keratoconus, severe atopic eczema and asthma.", ACTA OPHTHALMOLOGICA APR 1988, vol. 66, no. 2, April 1988 (1988-04-01), pages 237 - 238, XP008117503, ISSN: 0001-639X* |
| GABY A R: "Nutritional therapies for ocular disorders: Part three", ALTERNATIVE MEDICINE REVIEW 200809 US, vol. 13, no. 3, September 2008 (2008-09-01), pages 191 - 204, XP008117502, ISSN: 1089-5159* |
| WOLLENSAK G ET AL: "Riboflavin/ultraviolet-A-induced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus", AMERICAN JOURNAL OF OPHTHALMOLOGY, OPHTHALMIC PUBL, CHICAGO, IL, US, vol. 135, no. 5, 1 May 2003 (2003-05-01), pages 620 - 627, XP002496965, ISSN: 0002-9394* |
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2805511C (en) | Ophthalmic solution for protecting internal structures of the eyeball against uv-a rays or for the treatment of keratoconus with a trans-epithelial cross-linking technique | |
| AU2009286285B2 (en) | Use of enhancers, possibly associated to riboflavin, as well as corresponding ophthalmic compositions for corneal cross-linking in the treatment of the keratoconus or of other corneal ectasic disorders | |
| Skeie et al. | Mitophagy: an emerging target in ocular pathology | |
| JP2009501727A (en) | Treatment of conditions associated with the presence of macromolecular assemblies, especially ophthalmic disorders | |
| RU2706704C2 (en) | Intraocular delivery of biologically active molecules using iontophoresis | |
| Olchawa et al. | Photosensitized oxidative stress to ARPE-19 cells decreases protein receptors that mediate photoreceptor outer segment phagocytosis | |
| Yu et al. | Mefloquine damage vestibular hair cells in organotypic cultures | |
| Shen et al. | TMEM97 ablation aggravates oxidant-induced retinal degeneration | |
| Rumyantseva et al. | Ameliorative effects of SkQ1 eye drops on cataractogenesis in senescence-accelerated OXYS rats | |
| JP2021138710A (en) | How to treat eye diseases | |
| Wu et al. | Neuroprotective effects of apigenin on retinal ganglion cells in ischemia/reperfusion: modulating mitochondrial dynamics in in vivo and in vitro models | |
| ITVA20090052A1 (en) | COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF KERATOCONUS WITH TRANS-EPITHELIAL CROSS-LINKING TECHNIQUE OR TO PROTECT INTERNAL STRUCTURES OF THE OCULAR GLOBE FROM UV-A RAYS | |
| ITVA20100044A1 (en) | OPHTHALMIC SOLUTION TO PROTECT INTERNAL STRUCTURES OF THE OCULAR GLOBE FROM UV-A RAYS OR FOR THE TREATMENT OF KERATOCONO WITH TRANS-EPITHELIAL CROSS-LINKING TECHNIQUE | |
| JP6964864B2 (en) | Cataract induction methods, cataract model organisms, cataract preventive and therapeutic agent screening methods, and cataract inducers | |
| Bashir et al. | Acacia senegal Inhibits Diabetic Nephropathy Ultrastructure Alteration and Renal Biomarkers Changes in Rats. | |
| Komolkriengkrai et al. | The effectiveness of edible bird's nest in lowering VEGF, CD31, and PDGFR-β levels in diabetic retinopathy in rats with type 1 diabetes | |
| Olchawa et al. | The Inhibitory Effect of Blue Light on Phagocytic Activity by ARPE‐19 Cells | |
| CA2731871C (en) | Use of enhancers, possibly associated to riboflavin, as well as corresponding ophthalmic compositions for corneal cross-linking in the treatment of the keratoconus or of other corneal ectasic disorders | |
| Bashir et al. | Acacia senegal Inhibe la Alteración de la Ultraestructura de la Nefropatía Diabética y los Cambios en los Biomarcadores Renales en Rata | |
| Zhang et al. | Harmonizing NAD+ metabolism with CeMOF nanozyme to orchestrate intraocular pressure modulation for glaucoma treatment | |
| US10736934B2 (en) | Proteasome modulation for treatment of corneal disorders | |
| Tan | Organelle Trafficking in Health and Disease of the Retinal Pigment Epithelium | |
| CN115721656A (en) | Pharmaceutical composition containing rebamipide or salt thereof, preparation method thereof and application thereof in preparing ophthalmic preparation |