DESCRIZIONEDESCRIPTION
del brevetto per invenzione industriale dal titolo:of the patent for industrial invention entitled:
"MEMBRANA PER NANOCAPSULA, NANOCAPSULA COMPRENDENTE LA STESSA E SUO USO""MEMBRANE FOR NANOCAPSULE, NANOCAPSULE INCLUDING THE SAME AND ITS USE"
La presente invenzione à ̈ relativa ad una membrana per nanocapsula e ad una nanocapsula comprendente la stessa per la veicolazione di farmaci lipofili.The present invention relates to a membrane for nanocapsule and to a nanocapsule comprising the same for the delivery of lipophilic drugs.
Il successo di una terapia à ̈ legato alla correttezza della diagnosi e della scelta del farmaco. L'entità delle risposte ad un farmaco à ̈ funzione della sua concentrazione sul sito d'azione: un dosaggio troppo basso produrrà risposte inadeguate, mentre con uno troppo alto l'entità degli effetti indesiderati potrà essere tale da vanificare l'effetto della terapia. Solo tra questi due limiti (che definiscono la finestra terapeutica) l'intervento farmacologico à ̈ corretto. Il rapporto tra la concentrazione che dà luogo ad effetti tossici e la concentrazione efficace à ̈ definito indice terapeutico: più alto à ̈ l'indice terapeutico, più maneggevole à ̈ il farmaco.The success of a therapy is linked to the correctness of the diagnosis and the choice of the drug. The entity of the responses to a drug is a function of its concentration on the site of action: too low a dosage will produce inadequate responses, while with too high a dosage the extent of the undesirable effects may be such as to nullify the effect of the therapy. Only between these two limits (which define the therapeutic window) is pharmacological intervention correct. The relationship between the concentration that gives rise to toxic effects and the effective concentration is defined as the therapeutic index: the higher the therapeutic index, the more manageable the drug is.
A tal fine negli anni sono state studiate numerose soluzioni che permettano la veicolazione del farmaco al sito bersaglio mantenendo la sua concentrazione entro i limiti dell'efficacia e allo stesso tempo cercando di ridurre al minimo gli effetti collaterali eventualmente associati all'utilizzo del farmaco stesso.To this end, numerous solutions have been studied over the years that allow the drug to be conveyed to the target site while maintaining its concentration within the limits of efficacy and at the same time trying to minimize any side effects associated with the use of the drug itself.
Un esempio di farmaco che trova numerose applicazioni terapeutiche ma presenta anche elevati effetti collaterali à ̈ 1'Amfotericina B.An example of a drug that has numerous therapeutic applications but also has high side effects is Amphotericin B.
L'Amfotericina B ha un'azione fungicida molto rapida contro la Candida albicane e per molti anni à ̈ stato il farmaco di prima scelta per il trattamento di gravi infezioni sistemiche provocate da Candida albicans e da altri funghi. L'Amfotericina B à ̈ anche utilizzata come farmaco alternativo per il trattamento sintomatico della cistite, della pielonefrite , dell'osteomielite, dell'artrite settica e dell'endocardite provocate dalla Candida.Amphotericin B has a very rapid fungicidal action against Candida albicane and for many years it has been the drug of choice for the treatment of severe systemic infections caused by Candida albicans and other fungi. Amphotericin B is also used as an alternative drug for the symptomatic treatment of cystitis, pyelonephritis, osteomyelitis, septic arthritis and endocarditis caused by Candida.
L'uso clinico di Amfotericina B à ̈ ostacolato dalla nefrotossicità dose-limitante e da altri effetti collaterali correlati all'infusione come febbre, brividi, cefalea, nausea e vomito. Si pensa inoltre che 1'Amfotericina B possa legare il colesterolo, un importante componente delle membrane cellulari dei mammiferi, portando ad un aumento di permeabilità della membrana e a conseguenti danni cellulari.Clinical use of Amphotericin B is hampered by dose-limiting nephrotoxicity and other infusion-related side effects such as fever, chills, headache, nausea and vomiting. It is also thought that Amphotericin B can bind cholesterol, an important component of mammalian cell membranes, leading to an increase in membrane permeability and consequent cell damage.
La sua formulazione clinica convenzionale à ̈ costituita da una sospensione micellare di Amfotericina B con un sale biliare, il sodio desossicolato, il cui nome commerciale à ̈ Fungizone. A causa del suo scarso assorbimento orale, 1'Amfotericina B à ̈ somministrata principalmente per via endovenosa o via inalatoria. Il farmaco à ̈ scarsamente solubile in acqua e presenta un'alta percentuale di legame con le proteine piasmatiche con un'emivita di circa 10 - 24 ore. Il farmaco raggiunge concentrazioni elevate negli organi solidi (fegato, milza, reni e polmoni) mentre nell'occhio raggiunge concentrazioni più elevate nell'umor acqueo piuttosto che in quello vitreo. L'Amfotericina B non attraversa efficacemente la barriera ematoencefalica anche in presenza di infiammazione e la sua concentrazione nel tessuto cerebrale e nel liquido cerebrospinale à ̈ bassa.Its conventional clinical formulation consists of a micellar suspension of Amphotericin B with a bile salt, sodium deoxycholate, whose trade name is Fungizone. Due to its poor oral absorption, Amphotericin B is mainly administered intravenously or by inhalation. The drug is poorly soluble in water and has a high percentage of binding with piasmatic proteins with a half-life of about 10 - 24 hours. The drug reaches high concentrations in solid organs (liver, spleen, kidneys and lungs) while in the eye it reaches higher concentrations in the aqueous humor than in the vitreous humor. Amphotericin B does not cross the blood brain barrier effectively even in the presence of inflammation and its concentration in brain tissue and cerebrospinal fluid is low.
Ad oggi sono state sviluppate diverse formulazioni lipidiche di Amfotericina nel tentativo di ridurre gli effetti tossici sistemici del farmaco soprattutto a carico dei reni. Questi includono una dispersione colloidale di Amfotericina B (ABCD, Amfotericina B Colloidal Dispersion) , un complesso lipidico di AmB (ABLC Amfotericin B Lipid Complex) e Amfotericina B liposomale (L-AmB o AmBisome) .To date, several lipid formulations of Amphotericin have been developed in an attempt to reduce the systemic toxic effects of the drug, especially on the kidneys. These include a colloidal dispersion of Amphotericin B (ABCD, Amphotericin B Colloidal Dispersion), a lipid complex of AmB (ABLC Amphotericin B Lipid Complex) and liposomal Amphotericin B (L-AmB or AmBisome).
Tuttavia, le formulazioni lipidiche attualmente in uso in ambito clinico, come l'AmBisome, l'Amphocil o l'Abelcet pur essendo meno tossiche richiedono somministrazioni ad alte dosi di Amfotericina B, un processo di sintesi altamente complesso, e conseguentemente, costi di preparazione elevati. In particolare, l'AmBisome porta ad una minore tossicità renale ma può dare epatotossicità ad alte dosi.However, lipid formulations currently in use in the clinical setting, such as AmBisome, Amphocil or Abelcet, despite being less toxic, require high doses of Amphotericin B, a highly complex synthesis process, and consequently, preparation costs. elevated. In particular, AmBisome leads to lower renal toxicity but can cause hepatotoxicity at high doses.
Pertanto, à ̈ sentita nell'arte la necessità di sviluppare formulazioni alternative per la veicolazione di farmaci come 1'Amfotericina B volte a migliorarne la tossicità , l'efficacia terapeutica ed il profilo farmacocinetico .Therefore, the need is felt in the art to develop alternative formulations for the delivery of drugs such as Amphotericin B aimed at improving their toxicity, therapeutic efficacy and pharmacokinetic profile.
Scopo della presente invenzione à ̈ pertanto quello di fornire una formulazione farmaceutica per la veicolazione di farmaci che ne aumenti l'efficacia terapeutica riducendone gli effetti collaterali.The aim of the present invention is therefore to provide a pharmaceutical formulation for the delivery of drugs which increases their therapeutic efficacy by reducing their side effects.
Tale scopo à ̈ raggiunto dalla presente invenzione, in quanto relativa ad una membrana per nanocapsula secondo la rivendicazione 1 ad una nanocapsula secondo la rivendicazione 8 al suo uso secondo la rivendicazione 16 ed ad una composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 18 .This object is achieved by the present invention, as it relates to a membrane for nanocapsule according to claim 1 to a nanocapsule according to claim 8 to its use according to claim 16 and to a pharmaceutical composition according to claim 18.
DefinizioniDefinitions
A meno che non sia specificato esplicitamente il contrario, i seguenti termini presentano il significato indicato qui sotto.Unless otherwise explicitly specified, the following terms have the meanings given below.
Nel presente testo per "nanocapsula" si intende una particella formata da aggregati atomici o molecolari con un diametro compreso indicativamente fra i 2 e i 500 nm, di forma sostanzialmente sferica composta da una membrana o involucro e da una cavità , all'interno della quale si possono collocare le sostanze desiderate, come ad esempio farmaci in forma liquida, solida o come dispersione molecolare.In the present text, "nanocapsule" means a particle formed by atomic or molecular aggregates with a diameter between approximately 2 and 500 nm, of a substantially spherical shape composed of a membrane or envelope and a cavity, inside which they can place the desired substances, such as drugs in liquid, solid form or as a molecular dispersion.
Nel presente testo per "alchile" si intende una catena alifatica satura (vale a dire un gruppo alifatico privo di doppi o tripli legami carbonio -carbonio) lineare o ramificata. Esempi non limitativi di alchili sono: npropil, t-butil, esil e octileIn the present text, "alkyl" means a saturated aliphatic chain (ie an aliphatic group devoid of double or triple carbon-carbon bonds) linear or branched. Non-limiting examples of alkyls are: npropyl, t-butyl, hexyl and octyl
Nel presente testo, per "alchile sostituito" si intende un gruppo alchilico legato ad almeno un sostituente, il quale à ̈ vantaggiosamente scelto nel gruppo consistente di: alogeno, idrossi, alcossi Ci-C4, aromatico, nitro, ciano, alchilcarbossi Ci-C4, alcanoil Ci-C4.In the present text, by "substituted alkyl" is meant an alkyl group bonded to at least one substituent, which is advantageously selected from the group consisting of: halogen, hydroxy, alkoxy C-C4, aromatic, nitro, cyano, alkylcarboxy C-C4 , C1-C4 alkanoyl.
Nel presente testo per "concentrazione molare", "concentrazione M", "molarità ", "M" si intende il rapporto tra il numero di moli di un composto ed il volume, in particolare i litri, di un solvente, in particolare acqua, senza che ciò implichi che il composto sia disciolto nel solvente .In this text, "molar concentration", "concentration M", "molarity", "M" means the ratio between the number of moles of a compound and the volume, in particular liters, of a solvent, in particular water, without this implying that the compound is dissolved in the solvent.
Nel presente testo per "concentrazione normale", "concentrazione N", "normalità ", "N" si intende il rapporto tra il numero di equivalenti di un soluto ed il volume, in particolare i litri, di un solvente, in particolare acqua, senza che ciò implichi che il composto sia disciolto nel solvente .In this text, "normal concentration", "concentration N", "normality", "N" means the ratio between the number of equivalents of a solute and the volume, in particular liters, of a solvent, in particular water, without this implying that the compound is dissolved in the solvent.
Breve descrizione delle FigureBrief description of the Figures
Per una migliore comprensione della presente innovazione, essa verrà nel seguito descritta anche con riferimento alle figure allegate, che illustrano quanto segue :For a better understanding of the present invention, it will be described hereinafter also with reference to the attached figures, which illustrate the following:
la Figura 1 illustra la retta di taratura di amfotericina in metanolo utilizzata per determinare la quantità di farmaco presente nelle nanocapsule;Figure 1 illustrates the amphotericin in methanol calibration line used to determine the amount of drug present in the nanocapsules;
- la Figura 2 illustra la retta di taratura in acqua acida a pH = 5,5 per lo studio della cinetica di rilascio in vitro a questo pH;- Figure 2 illustrates the calibration line in acid water at pH = 5.5 for the study of the release kinetics in vitro at this pH;
- la Figura 3 illustra la retta di taratura in acqua acida a pH = 7,4 per lo studio della cinetica di rilascio in vitro a questo pH;- Figure 3 illustrates the calibration line in acidic water at pH = 7.4 for the study of the release kinetics in vitro at this pH;
la Figura 4 illustra la retta di rilascio dell' Amfotericina B dalle nanocapsule dell'invenzione a pH 5,5;Figure 4 illustrates the release line of Amphotericin B from the nanocapsules of the invention at pH 5.5;
la Figura 5 illustra la retta di rilascio dell'Amfotericìna B dalle nanocapsule dell'invenzione a pH 7,4;Figure 5 illustrates the release line of Amphotericin B from the nanocapsules of the invention at pH 7.4;
la Figura 6 illustra il confronto del rilascio dell'Amfotericina B dalle nanocapsule dell'invenzione a pH 5,5 e 7,4.Figure 6 illustrates the comparison of the release of Amphotericin B from the nanocapsules of the invention at pH 5.5 and 7.4.
Descrizione dettagliata dell'invenzioneDetailed description of the invention
Secondo un primo aspetto dell'invenzione viene fornita una membrana per nanocapsula per incapsulare un agente terapeutico. Tale membrana comprende molecole anfifiliche costituite da una testa idrofila ed una coda lipofila.According to a first aspect of the invention, a nanocapsule membrane is provided for encapsulating a therapeutic agent. This membrane comprises amphiphilic molecules consisting of a hydrophilic head and a lipophilic tail.
In particolare, la testa idrofila à ̈ selezionata nel gruppo costituito da ciclodestrine naturali e loro derivati, più in particolare beta-ciclodestrina, gammaciclodestrina e 6-desossi-6-mercapto-beta-ciclodestrina.In particular, the hydrophilic head is selected from the group consisting of natural cyclodextrins and their derivatives, more particularly beta-cyclodextrin, gammacyclodextrin and 6-deoxy-6-mercapto-beta-cyclodextrin.
La coda lipofila à ̈ selezionata nel gruppo costituito un residuo alchilcarbonilico lineare o ramificato comprendente almeno 8 atomi di carbonio, da una catena polimerica poliestere, da una catena polimerica polianidride e da una catena polimerica dell'acriloilmorfolina .The lipophilic tail is selected from the group consisting of a linear or branched alkylcarbonyl residue comprising at least 8 carbon atoms, a polyester polymer chain, a polyanhydride polymer chain and an acryloylmorpholine polymer chain.
In particolare, la coda lipofila può essere un residuo alchilcarbonilico lineare o ramificato comprendente da 10 a 22 atomi di carbonio, più in particolare un residuo dodecilcarbonilico .In particular, the lipophilic tail can be a linear or branched alkylcarbonyl residue comprising from 10 to 22 carbon atoms, more particularly a dodecylcarbonyl residue.
Alternativamente la coda lipofila può essere una catena polimerica lipofila selezionata nel gruppo costituito da poli (4-acriloilmorf olina) , polilattati o poliglicolattati .Alternatively, the lipophilic tail can be a lipophilic polymer chain selected from the group consisting of poly (4-acryloylmorph oline), polylactates or polyglycolactates.
Le teste ciclodestriniche sono legate alle code lipofile attraverso i residui ossidrilici o eventuali loro derivati delle ciclodestrine, come ad esempio un derivato tiolico, mediante un legame covalente.The cyclodextrin heads are linked to the lipophilic tails through the hydroxyl residues or their possible derivatives of the cyclodextrins, such as for example a thiol derivative, by means of a covalent bond.
In una prima forma di realizzazione dell'invenzione la membrana comprende molecole anfifiliche in cui la testa idrofila à ̈ 6-desossi-6 mercapto-beta-ciclodestrina (β-CD-SH) e la coda lipofila à ̈ poli(4-acriloilmorf olina) (PACM).In a first embodiment of the invention the membrane comprises amphiphilic molecules in which the hydrophilic head is 6-deoxy-6 mercapto-beta-cyclodextrin (β-CD-SH) and the lipophilic tail is poly (4-acryloylmorph oline ) (PACM).
In una seconda forma di realizzazione dell'invenzione la membrana comprende molecole anfifiliche in cui la testa idrofila à ̈ gamma-ciclodestrina e la coda lipofila à ̈ un residuo dodecilcarbonilico .In a second embodiment of the invention the membrane comprises amphiphilic molecules in which the hydrophilic head is gamma-cyclodextrin and the lipophilic tail is a dodecylcarbonyl residue.
Secondo un secondo aspetto dell'invenzione viene fornita una nanocapsula comprendente una membrana come sopra descritta. In particolare, la membrana delimita al suo interno una cavità nella quale può essere incapsulato un agente terapeutico, preferibilmente un farmaco lipofilo.According to a second aspect of the invention, a nanocapsule is provided comprising a membrane as described above. In particular, the membrane delimits inside it a cavity in which a therapeutic agent, preferably a lipophilic drug, can be encapsulated.
Tale agente terapeutico in particolare à ̈ Amfotericina B.This therapeutic agent in particular is Amphotericin B.
L'agente terapeutico può essere disciolto in un solvente opportuno, preferibilmente selezionato nel gruppo costituito da trigliceridi , mono-digliceridi , esteri, siliconi, perfluorocarburi o loro miscele più preferibilmente trigliceridi o loro miscele.The therapeutic agent can be dissolved in a suitable solvent, preferably selected from the group consisting of triglycerides, mono-diglycerides, esters, silicones, perfluorocarbons or their mixtures, more preferably triglycerides or their mixtures.
Secondo una forma di realizzazione dell'invenzione la nanocapsula comprende una membrana in cui la testa idrofila à ̈ una gamma ciclodestrina, la coda lipofila à ̈ un residuo dodecilcarbonilico e l'agente terapeutico à ̈ Amfotericina B disciolta in una miscela di trigliceridi dell'acido caprilico e dell'acido caprico.According to an embodiment of the invention, the nanocapsule comprises a membrane in which the hydrophilic head is a gamma cyclodextrin, the lipophilic tail is a dodecylcarbonyl residue and the therapeutic agent is Amphotericin B dissolved in a mixture of acid triglycerides caprylic and capric acid.
Secondo una ulteriore forma di realizzazione dell'invenzione la nanocapsula comprende una membrana in cui la testa idrofila à ̈ 6-desossi-6-mercapto-betaciclodestrina, la coda lipofila à ̈ poli(4-acriloilmorf olina) e l'agente terapeutico à ̈ Amfotericina B disciolta in una miscela di trigliceridi dell'acido caprilico e dell'acido caprico .According to a further embodiment of the invention, the nanocapsule comprises a membrane in which the hydrophilic head is 6-deoxy-6-mercapto-betacyclodextrin, the lipophilic tail is poly (4-acryloylmorph oline) and the therapeutic agent is ̈ Amphotericin B dissolved in a mixture of caprylic acid and capric acid triglycerides.
Le nanocapsule dell'invenzione contenenti amfotericina B possono essere utilizzate nel trattamento di una patologia associata ad infezioni fungine sistemiche in particolare selezionata nel gruppo costituito da infezioni fungine in pazienti neutropenici , meningite da Criptococco in pazienti infettati da HIV, infezioni da Aspergillus spp., Candida spp. e Cryptococcus spp. refrattarie al trattamento con Amfotericina B deossicolato, leishmaniosi viscerale .The nanocapsules of the invention containing amphotericin B can be used in the treatment of a pathology associated with systemic fungal infections in particular selected in the group consisting of fungal infections in neutropenic patients, Cryptococcal meningitis in HIV infected patients, Aspergillus spp. Infections, Candida spp. and Cryptococcus spp. refractory to treatment with amphotericin B deoxycholate, visceral leishmaniasis.
Secondo un ulteriore aspetto dell'invenzione viene fornita una composizione farmaceutica comprendente nano capsule come sopra descritte ed un eccipiente farmacologicamente accettabile.According to a further aspect of the invention, a pharmaceutical composition is provided comprising nano capsules as described above and a pharmacologically acceptable excipient.
Ulteriori caratteristiche della presente invenzione risulteranno dalla descrizione che segue di alcuni esempi meramente illustrativi e non limitativi. Le seguenti abbreviazioni sono usate nel seguito negli esempi sotto riportati: h (ora), g (grammi), mg (milligrammi), mmol (millimole) , mL (millilitro), MHz (megahertz) , Hz (hertz), p.fus. (punto di fusione), Rf (Ratio frontis) , UV (ultravioletto) , NMR (Risonanza Magnetica Nucleare) , MS (Spettroscopia di Massa) , Me (metile) , Mei (ioduro di metile), KOH (idrossido di potassio), HC1 (acido cloridico) , DMSO (dimetilsolf ossido) , CH2C12(cloruro di metilene) , Na2S04(solfato di sodio) , CDC13(cloroformio deuteriato) , Et3N (trietilammina) , THF (tetraidrofurano) , DME (dimetiletere) , Et20 (dietiletere) , NH4C1 (cloruro di ammonio) , NaCl (cloruro di sodio), K2C03(carbonato di potassio) , CH3CN (Acetonitrile), NBS (N-bromosuccinimmide) , H20 (acqua), EtOAc (acetato di etile).Further characteristics of the present invention will emerge from the following description of some merely illustrative and non-limiting examples. The following abbreviations are used below in the examples below: h (hour), g (grams), mg (milligrams), mmol (millimole), mL (milliliter), MHz (megahertz), Hz (hertz), p.fus . (melting point), Rf (Ratio frontis), UV (ultraviolet), NMR (Nuclear Magnetic Resonance), MS (Mass Spectroscopy), Me (methyl), Mei (methyl iodide), KOH (potassium hydroxide), HC1 (hydrochloric acid), DMSO (dimethylsulf oxide), CH2C12 (methylene chloride), Na2S04 (sodium sulfate), CDC13 (deuterium chloroform), Et3N (triethylamine), THF (tetrahydrofuran), DME (dimethyl ether), Et20 (diethylether) ), NH4C1 (ammonium chloride), NaCl (sodium chloride), K2C03 (potassium carbonate), CH3CN (Acetonitrile), NBS (N-bromosuccinimide), H20 (water), EtOAc (ethyl acetate).
EsempiExamples
Esempio 1Example 1
Preparazione di molecole anfifiliche in cui la testa idrofila à ̈ 6-desossi-6-mercapto-beta-ciclodestrina (β-CD-SH)_ e_ la_ coda_ lipofila_ à ̈_ poli (4-acriloilmorfolina) (PACM)(LED132)Preparation of amphiphilic molecules in which the hydrophilic head is 6-deoxy-6-mercapto-beta-cyclodextrin (β-CD-SH) _ and_ the lipophilic tail_ à ̈_ poly (4-acryloylmorpholine) (PACM) (LED132)
La 6-desossi-6-mercapto-P-ciclodestrina (β-CD-SH) à ̈ preparata ed utilizzata come agente di trasferimento di catena nella polimerizzazione radicale della 4-acriloilmorfolina (Sigma, Aldrich, distillata prima dell'uso, bp 158°C at 50 mmHg). Il rapporto peso/peso β-CD/PACM à ̈ 32,7 ed il numero molecolare medio ed il peso molecolare medio sono rispettivamente 7860 e 13500.6-deoxy-6-mercapto-P-cyclodextrin (β-CD-SH) is prepared and used as a chain transfer agent in the radical polymerization of 4-acryloylmorpholine (Sigma, Aldrich, distilled before use, bp 158 ° C at 50 mmHg). The weight / weight ratio β-CD / PACM is ̈ 32.7 and the average molecular number and the average molecular weight are respectively 7860 and 13500.
Esempio 2Example 2
Attività emolitica e citotossicità della molecola anfifilica dell'esempio 1Hemolytic activity and cytotoxicity of the amphiphilic molecule of Example 1
La determinazione dell'attività emolitica del polimero à ̈ stata eseguita tramite metodo spettrofotometrico.The determination of the hemolytic activity of the polymer was performed by means of a spectrophotometric method.
2 mi di sangue sono stati diluiti con 8 mi di tampone fosfato a pH 7,4.2 ml of blood was diluted with 8 ml of phosphate buffer at pH 7.4.
In una serie di provette sono state introdotte quantità crescenti di LED132, da 1 a 15 mg, solubilizzate in 500 Î1⁄4Î di tampone fosfato con l'aggiunta di 1 mi di sangue precedentemente diluito.In a series of test tubes, increasing quantities of LED132 were introduced, from 1 to 15 mg, solubilized in 500 µl of phosphate buffer with the addition of 1 ml of previously diluted blood.
Le provette vengono lasciate per 90 minuti a 37 °C sotto incubazione. Al termine dei 90 minuti si centrifuga a 2000 rpm per 5 minuti.The tubes are left for 90 minutes at 37 ° C under incubation. At the end of the 90 minutes it is centrifuged at 2000 rpm for 5 minutes.
Vengono prelevati 500 Î1⁄4Î di surnatante e diluiti con 2,5 mi di tampone fosfato a pH 7,4.500 Î1⁄4ε of supernatant are taken and diluted with 2.5 ml of phosphate buffer at pH 7.4.
Questi vengono sottoposti ad analisi UV-vis a 543 nm e viene calcolata la percentuale di emolisi.These are subjected to UV-vis analysis at 543 nm and the percentage of hemolysis is calculated.
La percentuale di emolisi à ̈ calcolata dall'assorbanza dovuta alla presenza di emoglobina nel surnatante.The percentage of hemolysis is calculated from the absorbance due to the presence of hemoglobin in the supernatant.
Come bianco viene utilizzato sangue diluito in tampone fosfato mentre come riferimento del 100 % di emolisi viene utilizzato sangue con tampone fosfato e un eccesso di cloruro d'ammonio.Blood diluted in phosphate buffer is used as a blank, while blood with phosphate buffer and an excess of ammonium chloride is used as a reference for 100% hemolysis.
La molecola non ha mostrato attività emolitica. Si à ̈ riscontrata un'assenza di emolisi e nessuna modificazione morfologica dei globuli rossi. Da questi risultati si evidenzia che la molecola à ̈ biocompatibile.The molecule showed no haemolytic activity. There was an absence of hemolysis and no morphological changes in the red blood cells. These results show that the molecule is biocompatible.
Esempio 3Example 3
Preparazione_ della_ nanocapsula_ incapsulante Amfotericina B ottenuta con la molecola anfifilica dell'esempio 1Preparation of the encapsulating nanocapsule Amphotericin B obtained with the amphiphilic molecule of Example 1
Si prepara una fase organica solubilizzando in etanolo assoluto 2 mi 1<1>Amfotericina (principio attivo circa 2 mg) a cui si addiziona il Miglyol 220 microlitri (olio) (Myritol 318) e LED132 (30-35 mg). La fase acquosa à ̈ una soluzione acquosa di 1 % Tween 80.An organic phase is prepared by solubilizing in absolute ethanol 2 ml 1 <1> Amphotericin (active principle about 2 mg) to which is added Miglyol 220 microliters (oil) (Myritol 318) and LED132 (30-35 mg). The aqueous phase is an aqueous solution of 1% Tween 80.
La solubilizzazione dei vari componenti viene facilitata dall'agitazione continua per 30 minuti.The solubilization of the various components is facilitated by continuous stirring for 30 minutes.
Una volta solubilizzate le due fasi si fa gocciolare, sotto agitazione, la fase organica nella fase acquosa.Once the two phases have been solubilized, the organic phase is made to drop, under stirring, into the aqueous phase.
Si nota subito un rapido intorbidimento dovuto alla formazione delle nanocapsule.Rapid clouding is immediately noticeable due to the formation of the nanocapsules.
La preparazione viene lasciata sotto continua agitazione per 24 ore lontano da fonti luminose (per via della fotosensibilità dell'Amfotericina) per l'evaporazione dell'etanolo.The preparation is left under continuous stirring for 24 hours away from light sources (due to the photosensitivity of the Amphotericin) for the evaporation of the ethanol.
Per proteggerla in modo adeguato, il beker utilizzato à ̈ stato completamente rivestito con carta stagnola per proteggere la preparazione dalle radiazioni luminose.To protect it adequately, the beaker used was completely lined with aluminum foil to protect the preparation from light radiation.
Nelle nanocapsule 1<1>Amfotericina si troverà disciolta in miglyol che costituisce un nucleo interno delimitato da una membrana di LEDI32.In the nanocapsules 1 <1> Amphotericin will be found dissolved in miglyol which constitutes an inner core delimited by a membrane of LEDI32.
Al termine delle 24 ore si sospende l'agitazione. La formulazione à ̈ centrifugata a 1000 rpm per 2 minuti per separare 1'Amfotericina rimasta libera da quella incapsulata.At the end of 24 hours, stirring is suspended. The formulation is centrifuged at 1000 rpm for 2 minutes to separate the free Amphotericin from the encapsulated one.
Dopo la centrifugazione si preleva il surnatante (la sospensione di nanocapsule) e si procede alla caratterizzazione .After centrifugation, the supernatant (the suspension of nanocapsules) is taken and characterization is carried out.
Esempio 4Example 4
Preparazione di molecole anfifiliche in cui la testa idrofila à ̈ gamma-ciclodestrina (γ-CD) e la coda lipofila à ̈ dodecilfosfato (NC12C)Preparation of amphiphilic molecules in which the hydrophilic head is gamma-cyclodextrin (γ-CD) and the lipophilic tail is dodecylphosphate (NC12C)
In un pallone vengono miscelati l'alcool (ES, C12) e il diimidazoilchetone in rapporto molare 1:1.5 usando come solvente diclorometano privo di alcool. La miscela à ̈ lasciata sotto agitazione per due ore.In a flask, the alcohol (ES, C12) and the diimidazoylketone are mixed in a molar ratio of 1: 1.5 using alcohol-free dichloromethane as a solvent. The mixture is left under stirring for two hours.
Si trasferisce in un imbuto separatore. Si eseguono tre lavaggi con acqua distillata. La fase organica à ̈ trasferita in una beuta, anidrificata con solfato di sodio anidro. Quindi si filtra e si concentra la fase organica mediante Rotavapor ottenendo l'imidazoil derivato dell'alcool (Prodotto 1). Contemporaneamente la gamma ciclodestrina viene essiccata in stufa fino a peso costante, si prepara il bagno di silicone a 80 C. In un pallone si pesa la gamma ciclodestrina, essiccata, il Prodotto 1 in rapporto molare 1:3, e piridina anidrificata in quantità da anidrificare la gamma ciclodestrina. Si riscalda a ricadere per 3 ore, quindi si filtra e si concentra al Rotavapor. Si addiziona etere di etilico e si lascia riposare per una notte. Quindi si filtra e si recupera 1'alchilcarbonato sul filtro stesso che viene lavato con etanolo.It moves into a separating funnel. Three washes are performed with distilled water. The organic phase is transferred to a flask, anhydrified with anhydrous sodium sulphate. The organic phase is then filtered and concentrated by Rotavapor obtaining the imidazoyl derivative of the alcohol (Product 1). At the same time the gamma cyclodextrin is dried in an oven to constant weight, the silicone bath is prepared at 80 C. In a flask, the gamma cyclodextrin is weighed, dried, Product 1 in a molar ratio 1: 3, and anhydrified pyridine in quantities from dry the gamma cyclodextrin. It is heated under reflux for 3 hours, then filtered and concentrated in the Rotavapor. Ethyl ether is added and left to stand overnight. The alkyl carbonate is then filtered and recovered on the filter itself which is washed with ethanol.
Esempio 5Example 5
Saggio_ emolitico_ della_ molecola_ anfifilica dell'esempio 4Hemolytic_ assay of the amphiphilic molecule of Example 4
La determinazione dell'attività emolitica à ̈ stata eseguita tramite metodo spettrofotometrico.The determination of the haemolytic activity was performed by a spectrophotometric method.
Ad una serie di provette contenenti 1 mi di sangue sono state addizionate quantità crescenti di NC12C, da 2,5 a 20 mg.Increasing amounts of NC12C, from 2.5 to 20 mg, were added to a series of tubes containing 1 ml of blood.
Le provette vengono lasciate ad incubare a 37 °C per 90 minuti. Al termine dei 90 minuti si centrifuga a 3000 rpm per 10 minuti.The tubes are left to incubate at 37 ° C for 90 minutes. At the end of the 90 minutes it is centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes.
Si prelevano 250 Î1⁄4Î di surnatante e si diluiscono con 2,5 mi di tampone fosfato a pH 7,4.250 Î1⁄4ε of supernatant are taken and diluted with 2.5 ml of phosphate buffer at pH 7.4.
Si analizzano i campioni allo spettrofotometro a 543 nm e viene calcolata la percentuale di emolisi.The samples are analyzed on a spectrophotometer at 543 nm and the percentage of hemolysis is calculated.
Come bianco viene utilizzato sangue diluito in tampone fosfato mentre come riferimento del 100 % di emolisi viene utilizzato sangue con tampone fosfato e un eccesso di cloruro d'ammonio.Blood diluted in phosphate buffer is used as a blank, while blood with phosphate buffer and an excess of ammonium chloride is used as a reference for 100% hemolysis.
La molecola non ha mostrato attività emolitica. Si à ̈ riscontrata un'assenza di emolisi e nessuna modificazione morfologica dei globuli rossi. Da questi risultati si evidenzia che la molecola à ̈ biocompatibile.The molecule showed no haemolytic activity. There was an absence of hemolysis and no morphological changes in the red blood cells. These results show that the molecule is biocompatible.
Esempio 6Example 6
Preparazione_ delle_ nanocapsule_ incapsulanti Amfotericina B ottenuta con la molecola anfifilica dell'esempio 4Preparation of the encapsulating nanocapsules Amphotericin B obtained with the amphiphilic molecule of Example 4
Le nanocapsule di NC12C sono preparate seguendo la procedura illustrata nell'esempio 3.The NC12C nanocapsules are prepared following the procedure illustrated in Example 3.
Esempio 7Example 7
Saggio emolitico sulle nanocapsule degli esempi 3 e 6 La determinazione dell'attività emolitica à ̈ stata eseguita tramite metodo spettrofotometrico.Haemolytic assay on the nanocapsules of examples 3 and 6 The determination of the haemolytic activity was carried out by means of a spectrophotometric method.
2 mi di sangue umano sono stati diluiti con 8 mi di tampone fosfato a pH 7,4.2 ml of human blood was diluted with 8 ml of phosphate buffer at pH 7.4.
In una serie di provette sono state introdotte quantità crescenti di nanocapsule ottenute mediante le procedure degli esempi 3 e 6, da 1 a 15,mg, solubilizzate in 500 Î1⁄4Î di tampone fosfato con l'aggiunta di 1 mi di sangue precedentemente diluito.In a series of test tubes increasing quantities of nanocapsules obtained by the procedures of Examples 3 and 6, from 1 to 15 mg, solubilized in 500 µl of phosphate buffer with the addition of 1 ml of previously diluted blood, were introduced.
Le provette vengono lasciate per 90 minuti a 37 °C sotto incubazione. Al termine dei 90 minuti si centrifuga a 2000 rpm per 5 minuti.The tubes are left for 90 minutes at 37 ° C under incubation. At the end of the 90 minutes it is centrifuged at 2000 rpm for 5 minutes.
Vengono prelevati 500 Î1⁄4Î di surnatante e diluiti con 2,5 mi di tampone fosfato a pH 7,4.500 Î1⁄4ε of supernatant are taken and diluted with 2.5 ml of phosphate buffer at pH 7.4.
Questi vengono sottoposti ad analisi UV-vis a 543 nm e viene calcolata la percentuale di emolisi.These are subjected to UV-vis analysis at 543 nm and the percentage of hemolysis is calculated.
La percentuale di emolisi à ̈ calcolata dall'assorbanza dovuta alla presenza di emoglobina nel surnatante.The percentage of hemolysis is calculated from the absorbance due to the presence of hemoglobin in the supernatant.
Come bianco viene utilizzato sangue diluito in tampone fosfato mentre come riferimento del 100 % di emolisi viene utilizzato sangue con tampone fosfato e un eccesso di cloruro d'ammonio.Blood diluted in phosphate buffer is used as a blank, while blood with phosphate buffer and an excess of ammonium chloride is used as a reference for 100% hemolysis.
Entrambe le formulazioni non hanno mostrato attività emolitica .Both formulations showed no haemolytic activity.
In tutte e due i casi si à ̈ riscontrata un'assenza di emolisi e nessuna modificazione morfologica dei globuli rossi. Da questi risultati si evidenzia che le formulazioni sono biocompatibili.In both cases there was an absence of haemolysis and no morphological modification of the red blood cells. These results show that the formulations are biocompatible.
Esempio 8Example 8
Determinazione quantitativa del efficienza di incapsulazione di Amfotericina B mediante analisi spettrofotometrica sulle nanocapsule degli esempi 3 e 6Quantitative determination of the encapsulation efficiency of Amphotericin B by spectrophotometric analysis on the nanocapsules of Examples 3 and 6
Sono state eseguite diverse curve di calibrazione per poter determinare la cinetica di rilascio del principio attivo dalle nanocapsule ottenute come illustrato negli esempi 3 e 6 a diversi valori di pH.Various calibration curves were performed in order to determine the release kinetics of the active ingredient from the nanocapsules obtained as illustrated in Examples 3 and 6 at different pH values.
Retta di taratura dell'AmfotericinaAmphotericin calibration line
Sono state preparate tre diverse rette di taratura : • Amfotericina in metanoloThree different calibration lines were prepared: â € ¢ Amphotericin in methanol
• Amfotericina in acqua filtrata a pH 5,5â € ¢ Amphotericin in filtered water at pH 5.5
• Amfotericina in tampone fosfato a pH 7,4â € ¢ Amphotericin in phosphate buffer at pH 7.4
La retta di taratura à ̈ stata costruita tramite analisi UV-Vis utilizzando uno spettrofotometro Beckman Coulter DU<®>730.The calibration line was constructed by UV-Vis analysis using a Beckman Coulter DU <®> 730 spectrophotometer.
Lo spettro à ̈ dovuto alla presenza di una porzione cromofora all'interno della struttura dell'Amfotericina (i 7 doppi legami coniugati).The spectrum is due to the presence of a chromophore portion within the Amphotericin structure (the 7 conjugated double bonds).
In tutti e tre i casi à ̈ stata preparata una soluzione madre a concentrazione nota di Amfotericina esattamente pesata e solubilizzata in DMSO.In all three cases a stock solution with a known concentration of Amphotericin was prepared exactly weighed and solubilized in DMSO.
Da queste vengono preparate 6 soluzioni standard con opportune diluizioni di Amfotericina B rispettivamente in metanolo, acqua filtrata pH 5,5 e tampone fosfato a pH 7,4.From these, 6 standard solutions are prepared with suitable dilutions of Amphotericin B respectively in methanol, filtered water pH 5.5 and phosphate buffer at pH 7.4.
Una volta preparati gli standard questi vengono analizzati allo spettrofotometro tramite analisi con scansione (per visionare l'intero spettro) .Once the standards have been prepared, they are analyzed on the spectrophotometer by scanning analysis (to view the entire spectrum).
É stata costruita la retta di taratura Assorbanza (A) in funzione della concentrazione (ppm) .The Absorbance (A) calibration line as a function of the concentration (ppm) has been constructed.
Retta di taratura in metanoloCalibration line in methanol
É stata preparata una soluzione madre in DMSO con una concentrazione di 50 ppm.A stock solution in DMSO with a concentration of 50 ppm was prepared.
Da questa sono stati preparati gli standard effettuando le seguenti diluizioni:From this the standards were prepared by making the following dilutions:
• 500 Î1⁄4Î di madre sono stati portati a 5 mi con metanolo : 5 ppmâ € ¢ 500 Î1⁄4Î of mother were raised to 5 ml with methanol: 5 ppm
• 375 Î1⁄4Î di madre sono stati portati a 5 mi con metanolo: 3,75 ppmâ € ¢ 375 Î1⁄4Î of mother were raised to 5 ml with methanol: 3.75 ppm
• 250 Î1⁄4Î di madre sono stati portati a 5 mi con metanolo : 2,5 ppmâ € ¢ 250 Î1⁄4Î of mother were raised to 5 ml with methanol: 2.5 ppm
250 Î1⁄4Î di madre sono stati portati a 10 mi con metanolo : 1,25 ppm250 Î1⁄4γ of mother was made up to 10 ml with methanol: 1.25 ppm
100 Î1⁄4Î di madre sono stati portati a 10 mi con metanolo : 0,50 ppm100 Î1⁄4γ of mother were brought to 10 ml with methanol: 0.50 ppm
50 Î1⁄4Î di madre sono stati portati a 10 mi con metanolo : 0,25 ppm50 µ1⁄4µ of mother was made up to 10 ml with methanol: 0.25 ppm
I sei standard sono stati analizzati allo spettrofotometro e ne à ̈ stata misurata l'Assorbanza a 406 nm .The six standards were analyzed on the spectrophotometer and their Absorbance was measured at 406 nm.
È stata costruita la retta di taratura Assorbanza in funzione della concentrazione espressa in ppm.The Absorbance calibration line has been constructed as a function of the concentration expressed in ppm.
Nella tabella di seguito riportata sono indicati i valori di Assorbanza e le rispettive concentrazioni espresse in ppm utilizzate per il calcolo della retta di taratura in metanolo (riportata in Figura 1).The table below shows the Absorbance values and the respective concentrations expressed in ppm used for the calculation of the calibration line in methanol (shown in Figure 1).
ppm Assorbanzappm Absorbance
0,00 0,0000.00 0.000
0,25 0,0480.25 0.048
0,50 0,0870.50 0.087
1,25 0,1911.25 0.191
2,50 0,3772.50 0.377
3,75 0,5523.75 0.552
5,00 0,7345.00 0.734
L'analisi à ̈ stata condotta allo spettrofotometro tenendo come riferimento il picco a 406 nm.The analysis was carried out with the spectrophotometer taking as reference the peak at 406 nm.
Gli standard sono stati preparati ad una concentrazione tale da avere valori di assorbanza inferiori a 1 (prima di effettuare le diluizioni à ̈ stata misurata 1'assorbanza della madre). Dal grafico illustrato in Figura 1 si può osservare una buona linearità con un coefficiente di determinazione (R2) pari a 1.The standards were prepared at a concentration such as to have absorbance values lower than 1 (the absorbance of the mother was measured before making the dilutions). From the graph illustrated in Figure 1 it is possible to observe a good linearity with a coefficient of determination (R2) equal to 1.
Retta di taratura in acqua acida pH 5,5Calibration line in acidic water pH 5.5
L'acqua acida à ̈ stata preparata portando a pH 5,5100 mi di Acqua filtrata MilliQ con acido cloridrico 0,1 M. É stata preparata una soluzione madre in DMSO con una concentrazione di 76 ppm.The acidic water was prepared by bringing to pH 5.5100 ml of MilliQ filtered water with 0.1 M hydrochloric acid. A stock solution in DMSO with a concentration of 76 ppm was prepared.
Da questa sono stati preparati gli standard effettuando le seguenti diluizioni:From this the standards were prepared by making the following dilutions:
• 7,9 mi di soluzione madre sono stati portati a 10 mi con acqua acida: 60 ppmâ € ¢ 7.9 ml of stock solution was made up to 10 ml with acidic water: 60 ppm
• 2,5 mi di soluzione madre sono stati portati a 5 mi con acqua acida: 38 ppmâ € ¢ 2.5 ml of stock solution was made up to 5 ml with acidic water: 38 ppm
• 1 mi di soluzione madre sono stati portati a 5 mi con acqua acida: 15,2 ppmâ € ¢ 1 ml of stock solution was made up to 5 ml with acidic water: 15.2 ppm
• 1 mi di soluzione madre sono stati portati a 10 mi con acqua acida: 7,6 ppmâ € ¢ 1 ml of stock solution was made up to 10 ml with acidic water: 7.6 ppm
I quattro standard sono stati analizzati allo spettrofotometro e ne à ̈ stata misurata l'Assorbanza a 395 nm.The four standards were analyzed on the spectrophotometer and their absorbance was measured at 395 nm.
É stata costruita la retta di taratura Assorbanza in funzione della concentrazione espressa in ppm.The Absorbance calibration line has been constructed as a function of the concentration expressed in ppm.
Nella tabella di seguito riportata sono indicati i valori di Assorbanza e le rispettive concentrazioni espresse in ppm utilizzate per il calcolo della retta di taratura in acqua acida pH 5,5.The table below shows the Absorbance values and the respective concentrations expressed in ppm used for the calculation of the calibration line in acidic water pH 5.5.
AssorbanzaAbsorbance
0,00 0,0000.00 0.000
7,60 0,1287.60 0.128
15,20 0,23415.20 0.234
38,00 0,58238.00 0.582
60,00 0,90560.00 0.905
La retta à ̈ stata preparata tramite analisi allo spettrofotometro prendendo come riferimento il picco a 395 nm. La retta di taratura ottenuta à ̈ riportata in Figura 2.The straight line was prepared by spectrophotometer analysis taking the peak at 395 nm as reference. The calibration line obtained is shown in Figure 2.
Retta di taratura in tampone fosfato pH 7,4Calibration line in phosphate buffer pH 7.4
Il tampone fosfato à ̈ stato preparato secondo Farmacopea.The phosphate buffer was prepared according to Pharmacopoeia.
250 mi di potassio fosfato monobasico 0,2 M vengono aggiunti a 393,4 mi di NaOH 0,1 M. Nel nostro caso sono stati preparati 100 mi apportando le necessarie diluizioni.250 ml of 0.2 M monobasic potassium phosphate are added to 393.4 ml of 0.1 M NaOH. In our case 100 ml have been prepared by making the necessary dilutions.
É stata preparata una soluzione madre in DMSO con una concentrazione di 300 ppm.A stock solution in DMSO was prepared with a concentration of 300 ppm.
Da questa sono stati preparati gli standard effettuando le seguenti diluizioni:From this the standards were prepared by making the following dilutions:
• 1 mi di madre sono stati portati a 10 mi con tampone fosfato pH 7,4: 30 ppmâ € ¢ 1 ml of mother was raised to 10 ml with phosphate buffer pH 7.4: 30 ppm
• 500 Î1⁄4Î di madre sono stati portati a 10 mi con tampone fosfato pH 7,4: 15 ppmâ € ¢ 500 Î1⁄4Î of mother were brought to 10 ml with phosphate buffer pH 7.4: 15 ppm
• 250 Î1⁄4Î di madre sono stati portati a 10 mi con tampone fosfato pH 7,4: 7,5 ppmâ € ¢ 250 Î1⁄4Î of mother were brought to 10 ml with phosphate buffer pH 7.4: 7.5 ppm
• 100 Î1⁄4Î di madre sono stati portati a 10 mi con tampone fosfato pH 7,4: 3 ppmâ € ¢ 100 Î1⁄4Î of mother were brought to 10 ml with phosphate buffer pH 7.4: 3 ppm
I quattro standard sono stati analizzati allo spettrofotometro e ne à ̈ stata misurata l'Assorbanza a 409 nm.The four standards were analyzed on the spectrophotometer and their Absorbance was measured at 409 nm.
É stata costruita la retta di taratura Assorbanza in funzione della concentrazione espressa in ppm.The Absorbance calibration line has been constructed as a function of the concentration expressed in ppm.
Nella tabella di seguito riportata sono indicati i valori di Assorbanza e le rispettive concentrazioni espresse in ppm utilizzate per il calcolo della retta di taratura in tampone fosfato pH 7,4.The table below shows the Absorbance values and the respective concentrations expressed in ppm used for the calculation of the calibration line in phosphate buffer pH 7.4.
ppm Assorbanzappm Absorbance
0 00 0
30 0.76930 0.769
15 0 .37915 0 .379
7.5 0 .1857.5 0 .185
3 0 .083 0 .08
La retta à ̈ stata preparata tramite analisi allo spettrofotometro prendendo come riferimento il picco a 409 nm. La retta di taratura ottenuta à ̈ riportata in Figura 3.The straight line was prepared by spectrophotometer analysis taking as reference the peak at 409 nm. The calibration line obtained is shown in Figure 3.
Determinazione dell'efficienza di ineapsulazione La determinazione della quantità di Amfotericina incapsulata à ̈ stata effettuata tramite analisi UV-visibile.Determination of the ineapsulation efficiency The determination of the quantity of encapsulated amphotericin was carried out by UV-visible analysis.
1 mi delle nanocapsule preparate secondo quanto illustrato negli esempi 3 e 6 viene diluito 1:10 V/V con metanolo (per aprire le nanocapsule).1 ml of the nanocapsules prepared as illustrated in Examples 3 and 6 is diluted 1:10 V / V with methanol (to open the nanocapsules).
La soluzione preparata viene agitata al vortex per 5 minuti al riparo da fonti luminose vista la fotosensibilità dell'Amfotericina. Dopo la diluizione la preparazione appare limpida.The prepared solution is vortexed for 5 minutes away from light sources due to the photosensitivity of Amphotericin. After dilution the preparation appears clear.
Viene infine eseguita analisi spettrofotometrica UV-visibile con metanolo come bianco e si va a determinare la percentuale di incorporazione del farmaco.Finally, UV-visible spectrophotometric analysis is performed with methanol as blank and the percentage of incorporation of the drug is determined.
Qualora il valore di assorbanza risulti maggiore di 1 verrà effettuata un'ulteriore diluizione.If the absorbance value is greater than 1, a further dilution will be carried out.
L'efficienza di incapsulazione dell'Amfotericina nelle nanocapsule à ̈ stata calcolata con la formula seguente:The encapsulation efficiency of Amphotericin in the nanocapsules was calculated with the following formula:
Quantità di farmaco nelle nanocapsuleAmount of drug in the nanocapsules
Efficienza di incapsulazione= _ X 100Encapsulation efficiency = _ X 100
Quantità totale di farmaco usata per la preparazione L'analisi viene eseguita in metanolo sfruttando la retta di taratura precedentemente preparata.Total quantity of drug used for preparation The analysis is performed in methanol using the calibration line previously prepared.
Con la retta osservando il valore di assorbanza del campione à ̈ facile ricavare la concentrazione di Amfotericina presente tenendo conto delle diluizioni effettuate .With the straight line observing the absorbance value of the sample it is easy to obtain the concentration of Amphotericin present taking into account the dilutions made.
Efficienza di incapsulazioneEncapsulation efficiency
Efficienza di incapsulazione Nanocapsule 49,00%Nanocapsule encapsulation efficiency 49.00%
Esempio 9Example 9
Determinazione dimensionale delle nanocapsule ottenute secondo gli esempi 3 e 6Dimensional determination of the nanocapsules obtained according to examples 3 and 6
La misura delle dimensioni delle nanocapsule à ̈ stata eseguita con lo strumento 90 Plus Instrument (Brookhaven) .The measurement of the dimensions of the nanocapsules was performed with the 90 Plus Instrument (Brookhaven).
Questo strumento utilizza la tecnica del Dynamic Light Scattering (DSL).This tool uses the Dynamic Light Scattering (DSL) technique.
Il DSL Ã ̈ una tecnica non invasiva chiamata anche PCS (Photon Correlation Spectroscopy) o QELS (Quasi-Elastic Light Scattering) e viene impiegata per la misura della dimensione delle molecole. Consente di misurare, ad esempio, il diametro di proteine, polimeri, liposomi.DSL is a non-invasive technique also called PCS (Photon Correlation Spectroscopy) or QELS (Quasi-Elastic Light Scattering) and is used to measure the size of molecules. It allows to measure, for example, the diameter of proteins, polymers, liposomes.
Inoltre consente di ottenere una distribuzione dimensionale (nel caso fossero presenti più popolazioni di molecole) e la determinazione di possibili aggregati presenti nella preparazione.It also allows to obtain a dimensional distribution (in the event that there are more populations of molecules) and the determination of possible aggregates present in the preparation.
Il campione viene illuminato da un raggio laser e viene misurato la variazione di intensità della luce diffusa dalle particelle in funzione del tempo.The sample is illuminated by a laser beam and the variation in intensity of the light scattered by the particles as a function of time is measured.
Le variazioni di intensità sono dovute al movimento Browniano delle particelle.The variations in intensity are due to the Brownian movement of the particles.
A parità di viscosità e temperatura, le particelle piccole si muoveranno velocemente (creando variazioni rapide dell'intensità di scattering) mentre le particelle più grandi saranno più lente.At the same viscosity and temperature, small particles will move fast (creating rapid variations in scattering intensity) while larger particles will be slower.
Grazie ad un autocorrelatore la velocità delle variazioni di intensità viene misurata e il coefficiente di diffusione à ̈ calcolato dalla funzione di correlazione.Thanks to an autocorrelator the speed of the intensity variations is measured and the diffusion coefficient is calculated by the correlation function.
Infine l'equazione di Stokes-Einstein converte il coefficiente di diffusione in diametro.Finally, the Stokes-Einstein equation converts the diffusion coefficient into diameter.
kTkT
D =D =
6πη R6Ï € Î · R
Equazione di Stokes Einstein correla il coefficiente di diffusione (D) con il raggio idrodinamico (R). Gli altri parametri sono K (costante di Boltzmann), T (temperatura), e η ( viscosità ).Stokes equation Einstein correlates the diffusion coefficient (D) with the hydrodynamic radius (R). The other parameters are K (Boltzmann constant), T (temperature), and Î · (viscosity).
Raddoppiando il raggio idrodinamico si ottiene il valore del diametro.Doubling the hydrodynamic radius gives the diameter value.
Caratterizzazione nanocapsule non contenenti farmaco Diametro Errore Indice di (nm) standard Polidispersione Nanocapsule 348 6,8 0,07Characterization of non-drug containing nanocapsules Diameter Error Index of standard (nm) Polydispersion Nanocapsules 348 6.8 0.07
Il basso valore dell'indice di polidispersione indica una distribuzione omogenea della popolazione di nanoparticelleThe low value of the polydispersion index indicates a homogeneous distribution of the population of nanoparticles
Caratterizzazione nanocapsule con Amfotericina DimensioniCharacterization of nanocapsules with Amphotericin Dimensions
Diametro Errore Indice di ( nm ) standard Polidispersione Nanocapsule 392 6,9 0,07Diameter Error Index of standard (nm) Polydispersion Nanocapsules 392 6.9 0.07
La presenza di Amfotericina all'interno delle nanocapsule produce un aumento delle dimensioni medie delle nanocapsule indicando la presenza del farmaco all'interno del sistema, mentre non varia l'indice di polidispersione.The presence of Amphotericin inside the nanocapsules produces an increase in the average size of the nanocapsules, indicating the presence of the drug inside the system, while the polydispersion index does not change.
Esempio 10Example 10
Determinazione della carica superficiale (misura del Potenziale Zeta)Determination of the surface charge (measurement of the Zeta Potential)
Il Potenziale Zeta à ̈ stato misurato utilizzando lo strumento Potenziale Z Plus Instrument (Brookhaven).The Zeta Potential was measured using the Potential Z Plus Instrument (Brookhaven).
Una molecola superficialmente carica produce un movimento di ioni intorno a se stessa provocando un aumento della concentrazione di controioni (ioni di carica opposta alla molecola in esame) intorno alla superficie.A superficially charged molecule produces a movement of ions around itself causing an increase in the concentration of counterions (ions of opposite charge to the molecule under examination) around the surface.
Lo strato liquido intorno alla molecola à ̈ diviso in due zone: una zona più interna detta strato di Stern dove gli ioni sono fortemente legati e una seconda zona più esterna detta strato diffuso dove le interazioni sono molto più deboli.The liquid layer around the molecule is divided into two areas: an innermost area called the Stern layer where the ions are strongly bound and a second more external area called the diffuse layer where the interactions are much weaker.
Lo strato Stern più lo strato diffuso vanno a formare un doppio strato elettrico intorno alla molecola.The Stern layer plus the diffuse layer form an electrical double layer around the molecule.
All'interno dello strato diffuso à ̈ presente un limite teorico nel quale il movimento delle molecole à ̈ accompagnato dal movimento degli ioni (questo confine à ̈ detto slipping piane). Fuori da questo confine gli ioni non seguono il movimento della molecola.Inside the diffuse layer there is a theoretical limit in which the movement of the molecules is accompanied by the movement of the ions (this boundary is called slipping planes). Outside this boundary, the ions do not follow the movement of the molecule.
Il potenziale in questa zona corrisponde al Potenziale zeta.The potential in this zone corresponds to the Zeta potential.
Un valore elevato del Potenziale Zeta à ̈ indice di elevata stabilità e ci dice che prevalgono le forze repulsive; viceversa valori molto bassi sono indice di poca stabilità e indicano una tendenza da parte delle molecole ad aggregarsi .A high value of the Zeta Potential indicates high stability and tells us that repulsive forces prevail; conversely, very low values indicate a lack of stability and indicate a tendency on the part of the molecules to aggregate.
Valori medi di Potenziale ZAverage values of Potential Z
Conduttanza Potenziale Z Errore (pS ) (mV) standard Nanocapsule 231 -15,5 1,7 biancheConductance Potential Z Error (pS) (mV) standard Nanocapsules 231 -15.5 1.7 white
Nanocapsule con AmfotericinaNanocapsules with Amphotericin
Conduttanza Potenziale Z Errore (pS ) (mV) standard Nanocapsule 210 -14,16 1,7 La carica negativa indica la presenza dei residui ciclodestrinici all'esterno della nanocapsula.Conductance Potential Z Standard error (pS) (mV) Nanocapsule 210 -14.16 1.7 Negative charge indicates the presence of cyclodextrin residues outside the nanocapsule.
Esempio 11Example 11
Determinazione della stabilità nel tempoDetermination of stability over time
Una volta preparate, le nanocapsule sono state controllate nel tempo monitorando determinati parametri come il pH, le dimensioni, la % di incapsulazione , il Potenziale Zeta, e durante ogni controllo sono state visualizzate al microscopio.Once prepared, the nanocapsules were checked over time by monitoring certain parameters such as pH, size,% encapsulation, Zeta potential, and during each check they were viewed under a microscope.
Inoltre sono state effettuate prove di stabilità in plasma e in tampone fosfato.In addition, stability tests were carried out in plasma and in phosphate buffer.
1 mi di nanocapsule viene diluito, in matraccio da 10 mi, con tampone fosfato a pH 7,4 viene lasciato incubare per 3 e per 6 ore.1 ml of nanocapsule is diluted, in a 10 ml flask, with phosphate buffer at pH 7.4 and left to incubate for 3 and 6 hours.
Al termine dei due intervalli le nanocapsule vengono visionate al microscopio ottico e vengono caratterizzate misurando le dimensioni e la carica superficiale.At the end of the two intervals, the nanocapsules are viewed under an optical microscope and are characterized by measuring the size and surface charge.
Per la prova in plasma, invece, Ã ̈ stato precedentemente diluito il plasma in tampone fosfato a pH 7,4 (diluizione 1 : 5 V/V).For the plasma test, on the other hand, the plasma was previously diluted in phosphate buffer at pH 7.4 (dilution 1: 5 V / V).
La variazione delle dimensioni delle nanocapsule nel tempo a temperatura ambiente à ̈ di seguito riportata. I risultati ottenuti sono la media di più valori corrispondenti a diverse analisi.The variation in the size of the nanocapsules over time at room temperature is shown below. The results obtained are the average of several values corresponding to different analyzes.
La stabilità à ̈ stata valutata nei 60 giorni successivi alla preparazione.Stability was assessed in the 60 days following preparation.
Dopo 1 Dopo 7 Dopo 14 Dopo 21 Dopo 60 giorno giorni giorni giorni giorni Nanocapsule 392 395 401 405 420 Esempio 12After 1 After 7 After 14 After 21 After 60 day days days days days Nanocapsules 392 395 401 405 420 Example 12
Studio della cinetica di rilascio in vitroIn vitro release kinetics study
Per determinare la cinetica di rilascio delle nanocapsule à ̈ stato utilizzato il metodo delle celle rotanti .The rotating cell method was used to determine the release kinetics of the nanocapsules.
Questo sistema à ̈ costituito da un sistema multicompartimentale formato da due dischi di plexiglass ciascuno formato da pozzetti circolari.This system consists of a multi-compartment system made up of two plexiglass disks each made up of circular wells.
Tra i pozzetti viene inserita una membrana da dialisi; la membrana utilizzata à ̈ stata una membrana da dialisi in cellulosa modificata con un cut-off di 12000-14000 Dalton.A dialysis membrane is inserted between the wells; the membrane used was a modified cellulose dialysis membrane with a cut-off of 12000-14000 Dalton.
I due dischi vengono fatti combaciare e aderire attraverso una chiusura a vite.The two discs are made to match and adhere through a screw closure.
Nei pozzetti dei due dischi vengono introdotti la fase donatrice e la fase ricevente e le 2 due fasi sono appunto separate dalla membrana.The donor phase and the receiving phase are introduced into the wells of the two discs and the 2 two phases are precisely separated by the membrane.
La membrana prima di essere utilizzata viene lasciata per 5 minuti in acqua bollente; questo viene fatto per eliminare il conservante così da attivarla.Before being used, the membrane is left for 5 minutes in boiling water; this is done to eliminate the preservative so as to activate it.
Successivamente la membrana viene tagliata e posta tra i due pozzetti in modo che la parte interna della membrana sia a contatto con la fase donatrice.Subsequently the membrane is cut and placed between the two wells so that the inner part of the membrane is in contact with the donor phase.
Infine vengono riempiti i pozzetti con le due fasi. Ad ogni prelievo si raccoglie la fase ricevente e si sostituisce con 1 mi di fase ricevente frasca.Finally the wells are filled with the two phases. At each sampling, the receiving phase is collected and replaced with 1 ml of branch receiving phase.
L'esperimento à ̈ stato eseguito per 48 ore.The experiment ran for 48 hours.
Tutti i prelievi vengono tenuti al riparo dalla luce per via della fotosensibilità dell'Amfotericina. I vari prelievi vengono analizzati, insieme alla fase donatrice (per determinare 1'Amfotericina non rilasciata), allo spettrometro UV-visibile e viene costruita la curva di rilascio.All samples are kept away from light due to the photosensitivity of Amphotericin. The various samples are analyzed, together with the donor phase (to determine the amphotericin not released), with the UV-visible spectrometer and the release curve is constructed.
Determinazione rilascio Amfotericina a pH 5,5 La fase donatrice utilizzata à ̈ costituita da 1 mi di nanocapsule di amfotericina mentre la fase ricevente à ̈ costituita da 1 mi di acqua filtrata portata a pH 5,5.Amphotericin release determination at pH 5.5 The donor phase used is made up of 1 ml of amphotericin nanocapsules while the receiving phase is made up of 1 ml of filtered water brought to pH 5.5.
Questa à ̈ stata preparata portando a pH 5,5 100 mi di acqua filtrata con acido cloridrico 0,1 M. Ad ogni intervallo di prelievo viene prelevata la fase ricevente e viene sostituita con 1 mi di acqua acida.This was prepared by bringing 100 ml of water filtered with 0.1 M hydrochloric acid to pH 5.5. At each sampling interval the receiving phase is removed and replaced with 1 ml of acidic water.
Tutti i prelievi e la fase donatrice vengono analizzati allo spettrofotometro e i loro valori di assorbanza vengono convertiti in concentrazione grazie alla retta di taratura dell'Amfotericina in acqua acida precedentemente preparata.All samples and the donor phase are analyzed on the spectrophotometer and their absorbance values are converted into concentration thanks to the calibration line of Amphotericin in acid water previously prepared.
In questo modo si va a costruire la curva percentuale di rilascio in funzione del tempo dei singoli prelievi.In this way, the release percentage curve is constructed as a function of the time of the individual withdrawals.
La percentuale di rilascio à ̈ data dal rapporto tra 1'Amfotericina rilasciata nei vari intervalli e 1 'Amfotericina totale moltiplicato per 100.The release percentage is given by the ratio between the Amphotericin released in the various intervals and the total Amphotericin multiplied by 100.
Determinazione rilascio Amfotericina a pH 7,4 La fase donatrice utilizzata à ̈ costituita da 1 mi di nanocapsule di Amfotericina mentre la fase ricevente à ̈ costituita da 1 mi di tampone fosfato a pH 7,4. Questo à ̈ stato preparato secondo Farmacopea.Amphotericin release determination at pH 7.4 The donor phase used is made up of 1 ml of Amphotericin nanocapsules while the receiving phase is made up of 1 ml of phosphate buffer at pH 7.4. This was prepared according to Pharmacopoeia.
250 mi di potassio fosfato monobasico 0,2 M vengono aggiunti a 393,4 mi di NaOH 0,1 M.250 ml of 0.2 M monobasic potassium phosphate are added to 393.4 ml of 0.1 M NaOH.
Sono stati preparati 50 mi effettuando le opportune diluizioni .50 ml were prepared by making the appropriate dilutions.
Ad ogni intervallo di prelievo viene prelevata la fase ricevente e viene sostituita con 1 mi di tampone fosfato.At each withdrawal interval, the receiving phase is removed and replaced with 1 ml of phosphate buffer.
Tutti i prelievi e la fase donatrice vengono analizzati allo spettrofotometro e i loro valori di assorbanza vengono convertiti in concentrazione grazie alla retta di taratura dell' Amfotericina in tampone fosfato precedentemente preparata.All samples and the donor phase are analyzed on the spectrophotometer and their absorbance values are converted into concentration thanks to the calibration line of Amphotericin in phosphate buffer previously prepared.
In questo modo si costruisce la curva percentuale di rilascio in funzione del tempo.In this way, the percentage release curve as a function of time is constructed.
Come si può notare dalle Figure 4-6, la cinetica di rilascio in vivo dell'Amfotericina B risulta prolungata nel tempo senza nessun tipo di rilascio immediato confermando l'incorporazione dell'Amfotericina nel compartimento centrale delle nanocapsule.As can be seen from Figures 4-6, the in vivo release kinetics of Amphotericin B are prolonged over time without any type of immediate release, confirming the incorporation of Amphotericin in the central compartment of the nanocapsules.
Esempio 13Example 13
Efficacia in vitro dell 'Amfotericina formulata in nanocapsule secondo gli esempi 3 e 6In vitro efficacy of Amphotericin formulated in nanocapsules according to examples 3 and 6
Ceppi di CandidaStrains of Candida
Il ceppo ATCC 10231 di Candida albicans (acquistato presso 1'American Type Colture Collection) à ̈ stato utilizzato come ceppo di riferimento nell'ambito dei saggi di suscettibilità all'amfotericina B. Inoltre, un totale di sette ceppi isolati clinici di Candida spp. sono stati utilizzati: tre ceppi di Candida. albicane (due da emocoltura ed uno da tampone vaginale, denominati rispettivamente 424084, 402766 e 403553, gentilmente forniti dalla Professoressa Pianella Savoia, del Dipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche dell'Ospedale San Luigi Gonzaga di Orbassano), uno di Candida glabrata, uno di Candida krusei, uno di Candida parapsilosis ed uno di Candida tropicalis (rispettivamente identificati dalle sigle UCSC3, UCSC16, UCSC8 e UCSC9, forniti dal Professor Sanguinetti, dell'Università Cattolica del Sacro Cuore di Roma). Tutte le specie ed i ceppi sopra elencati sono stati coltivati su terreno semisolido Saboureaud dextrose agar (OXOID, Solaar House, 19 Merces Row, Cambridge, CB5 8BZ, UK) ad una temperatura di 37°C e sono stati conservati ad una temperatura di -80°C mediante l'utilizzo di una soluzione crio-preservante con glicerolo (ad una concentrazione finale del 50%), in grado di prevenire il danno cellulare dovuto al congelamento.Candida albicans strain ATCC 10231 (purchased from the American Type Cultures Collection) was used as a reference strain in amphotericin B susceptibility assays. In addition, a total of seven clinical isolates of Candida spp. were used: three strains of Candida. albicane (two from blood culture and one from vaginal swab, respectively named 424084, 402766 and 403553, kindly provided by Professor Pianella Savoia, of the Department of Clinical and Biological Sciences of the San Luigi Gonzaga Hospital in Orbassano), one of Candida glabrata, one of Candida krusei, one of Candida parapsilosis and one of Candida tropicalis (respectively identified by the initials UCSC3, UCSC16, UCSC8 and UCSC9, provided by Professor Sanguinetti, of the Catholic University of the Sacred Heart of Rome). All the species and strains listed above were grown on Saboureaud dextrose agar semi-solid medium (OXOID, Solaar House, 19 Merces Row, Cambridge, CB5 8BZ, UK) at a temperature of 37 ° C and were stored at a temperature of - 80 ° C by using a cryo-preservative solution with glycerol (at a final concentration of 50%), capable of preventing cell damage due to freezing.
Saggio di suscettibilità delle Candide all'amfotericinaSusceptibility test of Candide to amphotericin
Il saggio à ̈ stato effettuato eseguendo il protocollo validato dal National Committee for Clinical and Laboratory Standards. In breve, sono state preparate diluizioni di Amfotericina B veicolata con nanocapsule di LED132 e NC12C ed Amfotericina B libera, in RPMI 1640 con L-glutamina tamponato a pH 7,4 (PAA, 4061 Pasching, Austria) ad una concentrazione di 2,5Î1⁄4Îœ di Amfotericina B; da questa concentrazione, in piastra da 96 pozzetti con fondo a "U", sono state effettuate diluizioni scalari 1:2, in un volume finale di ΙΟΟÎ1⁄4Ι, fino a giungere ad una concentrazione finale di 0,0012Î1⁄4Îœ.The assay was performed by running the protocol validated by the National Committee for Clinical and Laboratory Standards. Briefly, dilutions of Amphotericin B carried with nanocapsules of LED132 and NC12C and free Amphotericin B were prepared, in RPMI 1640 with buffered L-glutamine at pH 7.4 (PAA, 4061 Pasching, Austria) at a concentration of 2.5Î1 ⁄4Îœ of Amphotericin B; from this concentration, 1: 2 scalar dilutions were carried out in a 96-well plate with "U" bottom, in a final volume of Î ™ ΟΟÎ1⁄4Î ™, until reaching a final concentration of 0.0012Î1⁄4Îœ .
L'inoculo à ̈ stato preparato in RPMI, al fine di dispensare in ogni pozzetto 5x104 CFU/ml; un ugual volume di inoculo (ΙΟΟÎ1⁄4Ι) à ̈ stato aggiunto ad ogni pozzetto contenente 1'Amfotericina libera o veicolata.The inoculum was prepared in RPMI, in order to dispense in each well 5x104 CFU / ml; an equal volume of inoculum (Î ™ ΟΟÎ1⁄4Î ™) was added to each well containing the free or conveyed Amphotericin.
Al fine di discriminare l'effettiva efficacia dell'Amfotericina libera e veicolata, sono stati effettuati esperimenti di controllo trattando le Candide con diluizioni seriali di nanocapsule LED132 e NC12C vuote (ovvero, prive del contenuto di amfotericina).In order to discriminate the effective efficacy of free and conveyed Amphotericin, control experiments were performed by treating Candide with serial dilutions of empty LED132 and NC12C nanocapsules (ie, devoid of amphotericin content).
Le piastre sono state dunque incubate a 35°C per 24, 48 e 72 ore.The plates were then incubated at 35 ° C for 24, 48 and 72 hours.
A questi tempi à ̈ stata valutata la Minima Concentrazione Inibitoria (MIC), definita come la minima concentrazione di farmaco alla quale non à ̈ visualizzabile la crescita fungina, e la Minima Concentrazione Fungicida 50 (MFC50), ovvero la concentrazione di farmaco in grado di uccidere il 50% delle Candide. Al fine di rilevare questo ultimo parametro, campioni di Candide dai pozzetti trattati con differenti concentrazioni sono stati prelevati, opportunamente diluiti e piastrati su Saboureaud Dextrose Agar, al fine di quantificare le CFU/ml contenute nei pozzetti trattati, e costruire delle curve dose-risposta. Tale operazione à ̈ stata effettuata 24, 48 e 72 ore posttrattamento.At these times, the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) was evaluated, defined as the minimum drug concentration at which fungal growth is not visible, and the Minimum Fungicide Concentration 50 (MFC50), i.e. the concentration of drug capable of kill 50% of Candide. In order to detect this last parameter, Candide samples from the wells treated with different concentrations were taken, suitably diluted and plated on Saboureaud Dextrose Agar, in order to quantify the CFU / ml contained in the treated wells, and build dose-response curves. . This operation was carried out 24, 48 and 72 hours post-treatment.
In un secondo gruppo di esperimenti, l'efficacia in vitro dell'Amfotericina B formulata in nanocapsule à ̈ stata confrontata con quella dell'AmBisome (Gilead), una formulazione liposomale di Amfotericina B comunemente utilizzata in ambito clinico; in questo caso le due formulazioni sono state ricostituite nello stesso momento, ed i saggi di suscettibilità sono stati effettuati subito dopo.In a second group of experiments, the in vitro efficacy of Amphotericin B formulated in nanocapsules was compared with that of AmBisome (Gilead), a liposomal formulation of Amphotericin B commonly used in the clinical setting; in this case the two formulations were reconstituted at the same time, and the susceptibility tests were carried out immediately afterwards.
L'efficacia in vitro dell'Amfotericina B incapsulata e dell'AmBisome (conservati entrambi a 4°C) à ̈ stata inoltre valutata dopo tre mesi dalla ricostituzione di entrambi, al fine di saggiare la stabilità delle formulazioni.The in vitro efficacy of encapsulated Amphotericin B and AmBisome (both stored at 4 ° C) was also evaluated three months after the reconstitution of both, in order to test the stability of the formulations.
Saggio di suscettibilità del biofilm di C. albicans Il saggio di suscettibilità su biofilm à ̈ stato effettuato seguendo il protocollo descritto da Ramage e colleghi (Ramage et al., 2001); in breve, una provetta contenente 20ml di YPD brodo (1% p/v di estratto di lievito, 2% p/v di peptone, 2% p/v di destrosio) à ̈ stata inoculata con un'ansata di cellule da piastra di Saboureaud Dextrose Agar, ed incubata per tutta la notte a 30°C in agitazione (180 rpm).Susceptibility test of C. albicans biofilm The susceptibility test on biofilm was carried out following the protocol described by Ramage and colleagues (Ramage et al., 2001); in short, a tube containing 20ml of YPD broth (1% w / v yeast extract, 2% w / v peptone, 2% w / v dextrose) was inoculated with a loop of cells from a Saboureaud Dextrose Agar, and incubated overnight at 30 ° C under shaking (180 rpm).
Il giorno successivo, le cellule sono state lavate mediante centrifugazione in PBS sterile, e risospese in RPMI 1640 supplementato con L-glutamina e tamponato a pH 7,4.The next day, the cells were washed by centrifugation in sterile PBS, and resuspended in RPMI 1640 supplemented with L-glutamine and buffered at pH 7.4.
I biofilm di C. albicans (ceppo ATCC 10231) sono stati preparati su piastre da 96 pozzetti con fondo piatto (Orange Scientific) inoculando ΙΟΟÎ1⁄4Ι di una sospensione di 106 cellule/ml in ogni pozzetto. I pozzetti della dodicesima colonna devono rimanere vuoti, andando a costituire un valore di background durante la seguente quantificazione del biofilm.Biofilms of C. albicans (strain ATCC 10231) were prepared on 96-well flat bottom plates (Orange Scientific) by inoculating Î ™ ΟΟÎ1⁄4Î ™ of a suspension of 106 cells / mL into each well. The wells of the twelfth column must remain empty, constituting a background value during the following quantification of the biofilm.
La piastra à ̈ stata dunque chiusa con l'apposito coperchio, sigillata con parafilm ed incubata a 37°C per 48 ore.The plate was then closed with the appropriate lid, sealed with parafilm and incubated at 37 ° C for 48 hours.
Dopo la formazione del biofilm, il terreno à ̈ stato aspirato e le cellule planctoniche o non aderenti sono state rimosse mediante due lavaggi con PBS IX (ΙΟΟÎ1⁄4Ι per pozzetto) .After biofilm formation, the medium was aspirated and planktonic or non-adherent cells were removed by two washes with PBS IX (Î ™ ΟΟÎ1⁄4Î ™ per well).
I biofilm sono stati dunque trattati secondo il seguente protocollo: in primo luogo, sono state preparate diluizioni di Amfotericina B veicolata con nanocapsule LED 132 e NC12C, AmBisome ed Amfotericina B tal quale, in RPMI 1640 ad una concentrazione di 8Î1⁄4Îœ di Amfotericina B; in piastra da 96 pozzetti con fondo a "U", sono state effettuate diluizioni scalari 1:2, in un volume finale di ΙΟΟÎ1⁄4Ι, fino a giungere ad una concentrazione finale di 0,0078Î1⁄4Îœ.The biofilms were therefore treated according to the following protocol: firstly, dilutions of Amphotericin B were prepared with LED 132 and NC12C nanocapsules, AmBisome and Amphotericin B as it is, in RPMI 1640 at a concentration of 8Î1⁄4Îœ of Amphotericin B ; in a 96-well plate with a "U" bottom, 1: 2 scalar dilutions were carried out in a final volume of Î ™ ΟΟÎ1⁄4Î ™, until reaching a final concentration of 0.0078Î1⁄4Îœ.
Il PBS utilizzato per lavare i pozzetti contenenti i biofilm à ̈ stato rimosso ed i composti così diluiti sono stati aggiunti.The PBS used to wash the wells containing the biofilms was removed and the diluted compounds were added.
La piastra à ̈ stata nuovamente sigillata con parafilm ed incubata a 37°C per 48 ore.The plate was re-sealed with parafilm and incubated at 37 ° C for 48 hours.
L'effetto dei composti sul biofilm di C. albicane à ̈ stato valutato mediante un saggio metabolico basato sull'uso dei sali di tetrazolio (XTT sodium salt bioreagent, X4626, SIGMA-ALDRICH).The effect of the compounds on the C. albicane biofilm was evaluated by a metabolic assay based on the use of tetrazolium salts (XTT sodium salt bioreagent, X4626, SIGMA-ALDRICH).
- Attività inibitoria dell'Amfotericina B incapsulata nei confronti di diverse specie di Candida- Inhibitory activity of encapsulated Amphotericin B against various Candida species
I risultati ottenuti durante la fase di sperimentazione in vitro hanno dimostrato che 1'Amfotericina B veicolata con nanocapsule di dodecilcarbonato (NC12C-Amf) (Tabella 1 e 2) o LED132 (Tabella 3 e 4) ha un'efficacia in vitro molto maggiore rispetto al principio attivo tal quale (Amf), nei confronti di tutti i ceppi e le specie in esame; inoltre, l'effetto inibitorio esercitato dall 'Amfotericina B formulata in nanocapsule, al contrario dell'Amfotericina B tal quale, risulta essere costante nell'arco di 72 ore. Le nanocapsule di dodecilcarbonato prive del contenuto di Amfotericina B (NC12C) non mostrano effetto inibitorio nei confronti della crescita fungina.The results obtained during the in vitro experimentation phase have shown that Amphotericin B delivered with dodecylcarbonate nanocapsules (NC12C-Amf) (Tables 1 and 2) or LED132 (Tables 3 and 4) has a much greater in vitro efficacy than to the active principle as it is (Amf), against all strains and species under examination; moreover, the inhibitory effect exerted by Amphotericin B formulated in nanocapsules, unlike Amphotericin B as it is, is constant over 72 hours. The dodecylcarbonate nanocapsules devoid of the Amphotericin B (NC12C) content show no inhibitory effect against fungal growth.
I medesimi risultati sono stati ottenuti confrontando l'efficacia in vitro dell'Amfotericina B veicolata con nanocapsule di dodecilcarbonato(NC12C-Amf) con l'AmBisome (Tabella 5 e 6); deve essere sottolineato infine che l'efficacia in vitro dell'Amfotericina B formulata con nanocapsule, anche dopo tre mesi dalla data di preparazione delle medesime, risulta invariata, mantenendo un'efficacia in vitro superiore di circa 10 volte rispetto a quella dell'AmBisome e dell'Amfotericina B tal quale.The same results were obtained by comparing the in vitro efficacy of Amphotericin B delivered with dodecylcarbonate nanocapsules (NC12C-Amf) with the AmBisome (Table 5 and 6); Finally, it must be emphasized that the in vitro efficacy of Amphotericin B formulated with nanocapsules, even after three months from the date of preparation of the same, is unchanged, maintaining an in vitro efficacy approximately 10 times higher than that of AmBisome and of Amphotericin B as it is.
Tabella 1: minime concentrazioni Inibitorie (MIC) ottenute sa vitro dell 'Amf otericina B tal guale (Amf), formulata con nanocaps (NC12C-Amf) o nanocapsula vuota (NC12C) .Table 1: Minimum Inhibitory Concentrations (MIC) obtained in vitro of Amphotericin B tal guale (Amf), formulated with nanocaps (NC12C-Amf) or empty nanocapsule (NC12C).
24h 48h24h 48h
Amf NC12C-Amf NC12C Amf NC12C-Amf NC12C C. Albicans 0,3 0,02 >1 0,6 0,02 >1 ATCC ceppo 10231Amf NC12C-Amf NC12C Amf NC12C-Amf NC12C C. Albicans 0.3 0.02> 1 0.6 0.02> 1 ATCC strain 10231
C. Albicans 0,3 0,02 >1 0,6 0,04 >1 Ceppo 402766C. Albicans 0.3 0.02> 1 0.6 0.04> 1 Strain 402766
C. Albicans 0,15 0,02 >1 0,3 0, 02 >1 Ceppo 424084C. Albicans 0.15 0.02> 1 0.3 0.02> 1 Strain 424084
C. Albicans 0,15 0,02 >1 0,6 0,02 >1 Ceppo 403553C. Albicans 0.15 0.02> 1 0.6 0.02> 1 Strain 403553
C. glabrata 0,15 0,02 >1 C. tropicalis 0,15 0,08 >1 0,3 0,04 >1 C. parapsilosis 0,3 0,15 >1 1,25 0,15 >1 C. krusei 0,08 0,02 >1 0,08 0,02 >1 C. glabrata (ceppo resistente) 2 1 >2 2 1 >4 Tabella 2: Minime concentrazioni fungicide 50 (MFC50) ottenute sa vitro dell' Amfotericina B tal quale (Amf ), formulata con nanocaps (NC12C-Amf) o nanocapsula vuota (NC12C) .C. glabrata 0.15 0.02> 1 C. tropicalis 0.15 0.08> 1 0.3 0.04> 1 C. parapsilosis 0.3 0.15> 1 1.25 0.15> 1 C . krusei 0.08 0.02> 1 0.08 0.02> 1 C. glabrata (resistant strain) 2 1> 2 2 1> 4 Table 2: Minimum fungicidal concentrations 50 (MFC50) obtained in vitro of Amphotericin B as it is (Amf), formulated with nanocaps (NC12C-Amf) or empty nanocapsule (NC12C).
24h 48h24h 48h
Amf NC12C-Amf NC12C Amf NC12C-Amf NC12C . Albicans 0,3026 0,01553 >1 0,2948 0,02298 >1 TCC ceppo 10231Amf NC12C-Amf NC12C Amf NC12C-Amf NC12C. Albicans 0.3026 0.01553> 1 0.2948 0.02298> 1 TCC strain 10231
. Albicans 0,02543 0,009819 >1 0,1178 0,01754 >1 eppo 402766. Albicans 0.02543 0.009819> 1 0.1178 0.01754> 1 eppo 402766
. Albicans 0,03003 0,004482 >1 0,0921 0 ,001016 >1 eppo 424084. Albicans 0.03003 0.004482> 1 0.0921 0, 001016> 1 eppo 424084
. Albicans 0,1166 0,01486 >1 0,1551 0,005157 >1 eppo 403553. Albicans 0.1166 0.01486> 1 0.1551 0.005157> 1 eppo 403553
. glabrata >1 0,0913 0 ,01544 >1 . tropicalis 0,08965 0,01637 >1 0,1114 0,01501 >1 . parapsilosis 0,1601 0,1006 >1 0,314 0,06954 >1 . krusei 0,00996 0,02011 >1 0,0673 0,008306 >1 . glabrata (ceppo resistente) 1,2 0,4357 1,401 1,131 0 ,4784 0,943 Tabella 3: Minime concentrazioni inibitorie (MIC) ottenute saggian dell 'Amfotericina B tal quale (Ami), formulata con nanocapsule LED LED132. glabrata> 1 0.0913 0, 01544> 1. tropicalis 0.08965 0.01637> 1 0.1114 0.01501> 1. parapsilosis 0.1601 0.1006> 1 0.314 0.06954> 1. krusei 0.00996 0.02011> 1 0.0673 0.008306> 1. glabrata (resistant strain) 1,2 0,4357 1,401 1,131 0, 4784 0,943 Table 3: Minimum inhibitory concentrations (MIC) obtained by sagging of Amphotericin B as it is (Ami), formulated with LED nanocapsules LED132
24h 4 8h24h 4 8h
Amf LED132-Amf LED132 Amf LED132 -Amf LEDI 32 lbicans 0,3 0,02 >1 0,6 0,04 >1 o 402766Amf LED132-Amf LED132 Amf LED132 -Amf LEDI 32 lbicans 0.3 0.02> 1 0.6 0.04> 1 or 402766
lbicans 0,15 0,02 >1 0,3 0,02 >1 o 424084lbicans 0.15 0.02> 1 0.3 0.02> 1 or 424084
lbicans 0,15 0,02 >1 0,3 0,02 >1 o 403553lbicans 0.15 0.02> 1 0.3 0.02> 1 or 403553
Tabella 4: Minime concentrazioni fungicide 50 (MFC50) ottenute sa vitro dell'Amfotericina B tal quale (Ami), formulata con nanocapsul vuote LED132Table 4: Minimum fungicidal concentrations 50 (MFC50) obtained in vitro of Amphotericin B as it is (Ami), formulated with empty nanocapsul LED132
24h 4 8h24h 4 8h
Amf LED132-Amf LED132 Amf LED132 -Amf LED132 icans 0,02543 0,0052 >1 0,1178 0, 0089 >1 402766Amf LED132-Amf LED132 Amf LED132 -Amf LED132 icans 0,02543 0,0052> 1 0,1178 0, 0089> 1 402766
icans 0,03003 0,0066 >1 0,09214 0, 0049 >1 424084icans 0.03003 0.0066> 1 0.09214 0.0049> 1 424084
icans 0,1166 0,01 >1 0,1551 0, 0066 >1 403553icans 0.1166 0.01> 1 0.1551 0.0066> 1 403553
Tabella 5: Minime concentrazioni Inibitorie (MIC) ottenute sa vitro dell 'Amfotericina B tal quale (Amf), formulata con nanocapsu (NC12C-Amf) o nanocapsula vuota (NC12C), valutata subito dopo (t0) preparazione della formulazioneTable 5: Minimum inhibitory concentrations (MIC) obtained in vitro of Amphotericin B as it is (Amf), formulated with nanocapsu (NC12C-Amf) or empty nanocapsule (NC12C), evaluated immediately after (t0) preparation of the formulation
24h 48h 72h Amf NC12C-Amf NC12C Amf NC12C-Amf NC12C Amf 0,3 0,02 >1 0,6 0,04 >1 1,2 0 1,2 0,02 >1 1,2 0,04 >1 1,2 0 Tabella 6: Minime Concentrazioni Fungicide 50 (MFC50) ottenut in vitro dell'Amfotericina B tal quale (Amf), formulata con carbonato (NC12C-Amf ) o nanocapsula vuota (NC12C) , valutata subit dopo (t3) la preparazione della formulazione.24h 48h 72h Amf NC12C-Amf NC12C Amf NC12C-Amf NC12C Amf 0.3 0.02> 1 0.6 0.04> 1 1.2 0 1.2 0.02> 1 1.2 0.04> 1 1,2 0 Table 6: Minimum Concentrations Fungicide 50 (MFC50) obtained in vitro of Amphotericin B as it is (Amf), formulated with carbonate (NC12C-Amf) or empty nanocapsule (NC12C), evaluated immediately after (t3) preparation of the formulation.
24h 48h 72h Amf NC12C-Amf NC12C Amf NC12C-Amf NC12C Amf 0,303 001553 >1 0,295 0, 02298 >1 0,101 0 0,668 0,01284 >1 0,781 0, 01367 >1 0,999 0 - Attività inibitoria dell'Amfotericina B incapsulata nei confronti del biofilm di Candida albicans24h 48h 72h Amf NC12C-Amf NC12C Amf NC12C-Amf NC12C Amf 0.303 001553> 1 0.295 0, 02298> 1 0.101 0 0.668 0.01284> 1 0.781 0, 01367> 1 0.999 0 - Inhibitory activity of encapsulated Amphotericin B of Candida albicans biofilm
Data la rilevanza clinica dei biofilm di Candida, l'efficacia dell'Amfotericina B veicolata con nanocapsule di dodecilcarbonato à ̈ stata valutata anche nei confronti di cellule sessili (notoriamente più resistenti delle planctoniche) , in termini di Minima Concentrazione Inibitoria Sessile in grado di limitare del 50% la crescita del biofilm (SMIC50) , utilizzando un ceppo commerciale di Candida albicans (ATCC 10231); i valori ottenuti dimostrano, anche in questo caso, che l'efficacia dell 'Amfotericina B formulata in nanocapsule à ̈ superiore di 10 volte rispetto al farmaco tal quale e paragonabile a quella dell'AmBisome :Given the clinical relevance of Candida biofilms, the efficacy of Amphotericin B delivered with dodecylcarbonate nanocapsules has also been evaluated against sessile cells (notoriously more resistant than planktonic), in terms of Minimum Inhibitory Sexile Concentration capable of limiting biofilm growth by 50% (SMIC50), using a commercial strain of Candida albicans (ATCC 10231); the values obtained show, also in this case, that the effectiveness of Amphotericin B formulated in nanocapsules is 10 times higher than the drug as it is and comparable to that of AmBisome:
SMIC50 Amfotericina: 0,3129 Î1⁄4Îœ SMIC50 Amfotericina veicolata con nanocapsula di dodecilcarbonato: 0,05338 Î1⁄4Îœ SMIC50 Nanocapsule "vuote": >8 Î1⁄4ÎœSMIC50 Amphotericin: 0.3129 Î1⁄4Îœ SMIC50 Carried amphotericin with dodecylcarbonate nanocapsule: 0.05338 Î1⁄4Îœ SMIC50 "Empty" nanocapsules:> 8 Î1⁄4Îœ
SMIC50 AmBisome: 0,02037 Î1⁄4ÎœSMIC50 AmBisome: 0.02037 Î1⁄4Îœ
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| IT000884AITTO20110884A1 (en) | 2011-10-04 | 2011-10-04 | MEMBRANE FOR NANOCAPSULA, NANOCAPSULA INCLUDING THE SAME AND ITS USE |
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| IT000884AITTO20110884A1 (en) | 2011-10-04 | 2011-10-04 | MEMBRANE FOR NANOCAPSULA, NANOCAPSULA INCLUDING THE SAME AND ITS USE |
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| ITTO20110884A1true ITTO20110884A1 (en) | 2013-04-05 |
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| IT000884AITTO20110884A1 (en) | 2011-10-04 | 2011-10-04 | MEMBRANE FOR NANOCAPSULA, NANOCAPSULA INCLUDING THE SAME AND ITS USE |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5718905A (en)* | 1992-06-16 | 1998-02-17 | Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.) | Preparation and use of novel cyclodextrin-based dispersible colloidal systems in the form of nanospheres |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5718905A (en)* | 1992-06-16 | 1998-02-17 | Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.) | Preparation and use of novel cyclodextrin-based dispersible colloidal systems in the form of nanospheres |
| Title |
|---|
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| CAVALLI R ET AL: "Enhanced antiviral activity of Acyclovir loaded into beta-cyclodextrin-poly(4-acryloylmorpholine) conjugate nanoparticles", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 137, no. 2, 20 July 2009 (2009-07-20), pages 116 - 122, XP026154881, ISSN: 0168-3659, [retrieved on 20090408], DOI: 10.1016/J.JCONREL.2009.04.004* |
| ROBERTA CAVALLI ET AL: "Nanoparticles derived from amphiphilic [gamma]-cyclodextrins", JOURNAL OF INCLUSION PHENOMENA AND MACROCYCLIC CHEMISTRY, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, DO, vol. 57, no. 1-4, 19 January 2007 (2007-01-19), pages 657 - 661, XP019502959, ISSN: 1573-1111, DOI: 10.1007/S10847-006-9269-9* |
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