DESCRIZIONEDESCRIPTION
Annessa a domanda di brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE avente per titoloAttached to a patent application for INDUSTRIAL INVENTION having the title
?Nuovo biomateriale per la rigenerazione del tessuto osseo costituito dal polifenolo naturale oleuropeina, plasma autologo del paziente e vitamina C??New biomaterial for the regeneration of bone tissue consisting of the natural polyphenol oleuropein, autologous plasma of the patient and vitamin C?
CAMPO DELL?INVENZIONEFIELD OF THE INVENTION
La presente invenzione ha per oggetto un processo per la preparazione di un biopolimero. Inoltre, l?invenzione si riferisce al biopolimero ottenuto con il processo e all?uso del biopolimero per la rigenerazione o la riparazione di un tessuto osseo.The present invention relates to a process for the preparation of a biopolymer. Furthermore, the invention relates to the biopolymer obtained with the process and to the use of the biopolymer for the regeneration or repair of bone tissue.
STATO DELL?ARTESTATE OF ART
La necessit? di utilizzare innesti per riparare i difetti ossei causati da traumi o neoplasie dell?osso sono costantemente aumentati negli ultimi anni. Oggi le procedure di trapianto di osso autologo e allogenico sono considerate il gold standard poich? stimolano l?osteoconduzione e l?osteogenesi. Tuttavia, il trapianto autologo richiede una seconda operazione che potrebbe causare morbilit? nel sito donatore, mentre il trapianto allogenico pu? potenzialmente causare la trasmissione di malattie o l?attivazione della risposta immunitaria. Tutte queste motivazioni limitano il loro utilizzo nella ricostruzione del tessuto osseo. Per superare queste limitazioni, sono state sviluppate diverse strategie nell?ingegneria dei tessuti ossei. Attualmente, nella rigenerazione di tessuti di vario tipo, l'utilizzo di impalcature (scaffolds) e nanocompositi risulta essere la tecnica maggiormente impiegata per ottenere tessuti tridimensionali sufficientemente organizzati.The necessity? of using grafts to repair bone defects caused by trauma or bone malignancy have steadily increased in recent years. Today, autologous and allogeneic bone transplant procedures are considered the gold standard because stimulate osteoconduction and osteogenesis. However, autologous transplantation requires a second operation which could cause morbidity. in the donor site, while the allogeneic transplant can? potentially cause disease transmission or activation of the immune response. All these reasons limit their use in the reconstruction of bone tissue. To overcome these limitations, several strategies in bone tissue engineering have been developed. Currently, in the regeneration of tissues of various types, the use of scaffolds (scaffolds) and nanocomposites is the most widely used technique to obtain sufficiently organized three-dimensional tissues.
La reticolazione o formazione di legami crociati (cross-linking) ? il processo mediante il quale le catene polimeriche vanno incontro ad una reazione che crea dei legami fra diverse catene (o eventualmente tra due punti diversi della stessa catena), a livello di gruppi funzionali reattivi. Il cross-linking dei biopolimeri, come le proteine, avviene in natura e questo processo potrebbe essere utilizzato anche per la produzione di materiali biomedicali come gli scaffolds. Gli agenti reticolanti comunemente utilizzati in questo metodo sono le aldeidi e le dialdeidi, come la formaldeide, la glutaraldeide o gli enzimi come la transglutaminasi. ? noto che le aldeidi si legano molto bene alle catene laterali delle proteine (al gruppo amminico della lisina o al gruppo SH della cisteina). Studi sulla reazione della glutaraldeide con le proteine mostra che questa dialdeide funge da crosslinker generando legami covalenti tra i gruppi amminici delle lisine (Peters and Richards, 1977).Cross-linking or cross-linking? the process by which the polymer chains undergo a reaction which creates bonds between different chains (or possibly between two different points of the same chain), at the level of reactive functional groups. Cross-linking of biopolymers, such as proteins, occurs in nature and this process could also be used for the production of biomedical materials such as scaffolds. The crosslinking agents commonly used in this method are aldehydes and dialdehydes, such as formaldehyde, glutaraldehyde, or enzymes such as transglutaminase. ? It is known that aldehydes bind very well to the side chains of proteins (to the amino group of lysine or to the SH group of cysteine). Studies on the reaction of glutaraldehyde with proteins show that this dialdehyde acts as a crosslinker by generating covalent bonds between the amino groups of lysines (Peters and Richards, 1977).
Tuttavia, la natura tossica degli agenti reticolanti come la formaldeide e la glutaraldeide limita il loro utilizzo in prodotti biomedicali. Quindi c?? una forte ricerca di agenti reticolanti naturali, preferenzialmente di natura vegetale che possano essere delle valide alternative agli agenti reticolanti di sintesi. I candidati ideali devono avere delle propriet? in termini di capacit? di legame e processabilit? che siano dello stesso ordine di grandezza o migliore degli agenti reticolanti comunemente utilizzate oggi.However, the toxic nature of cross-linking agents such as formaldehyde and glutaraldehyde limits their use in biomedical products. So c?? a strong search for natural crosslinking agents, preferably of a vegetable nature which can be valid alternatives to synthetic crosslinking agents. The ideal candidates must have properties? in terms of capacity? binding and processability? that are of the same order of magnitude or better than the crosslinking agents commonly used today.
SOMMARIO DELL?INVENZIONESUMMARY OF THE INVENTION
Un primo aspetto della presente invenzione riguarda un processo per la preparazione di un biopolimero. Il processo prevede una fase di preparazione di una soluzione comprendente acido ascorbico, almeno un composto fenolico ed un solvente acquoso, l?aggiunta di una matrice proteica, preferibilmente plasma sanguigno, ed il mantenimento della soluzione ottenuta ad una temperatura compresa tra 25 e 45?C, per un tempo compreso tra 15 e 30 ore.A first aspect of the present invention relates to a process for the preparation of a biopolymer. The process involves a step of preparing a solution comprising ascorbic acid, at least one phenolic compound and an aqueous solvent, the addition of a protein matrix, preferably blood plasma, and maintaining the solution obtained at a temperature between 25 and 45? C, for a time between 15 and 30 hours.
Un secondo aspetto della presente invenzione riguarda un biopolimero ottenuto con il processo sopra descritto.A second aspect of the present invention relates to a biopolymer obtained with the process described above.
Un terzo aspetto della presente invenzione si riferisce ad un sostituto osseo comprendente il o consistente nel biopolimero della presente invenzione.A third aspect of the present invention relates to a bone substitute comprising or consisting of the biopolymer of the present invention.
Un quarto aspetto della presente invenzione riguarda l?uso del biopolimero sopra descritto per la rigenerazione o la riparazione di un tessuto osseo o per il trattamento o la prevenzione di un disturbo associato ad un rapporto squilibrato tra formazione e riassorbimento osseo in un essere umano o animale.A fourth aspect of the present invention relates to the use of the biopolymer described above for the regeneration or repair of bone tissue or for the treatment or prevention of a disorder associated with an unbalanced relationship between bone formation and bone resorption in a human or animal .
Un quinto aspetto della presente invenzione si riferisce ad una composizione comprendente acido ascorbico o un suo sale o un suo derivato, una matrice proteica, preferibilmente plasma sanguigno, ed almeno un composto fenolico. Preferibilmente, il composto fenolico ? oleuropeina od oleuropeina aglicone. Preferibilmente, l?acido ascorbico ? l?acido L-ascorbico.A fifth aspect of the present invention relates to a composition comprising ascorbic acid or a salt thereof or a derivative thereof, a protein matrix, preferably blood plasma, and at least one phenolic compound. Preferably, the phenolic compound ? oleuropein or oleuropein aglycone. Preferably, the ascorbic acid? L-ascorbic acid.
Un ulteriore aspetto della presente invenzione si riferisce ad un metodo per favorire la rigenerazione o la riparazione di un tessuto osseo o per il trattamento di un disturbo associato ad un rapporto squilibrato tra formazione e riassorbimento osseo in un essere umano o animale.A further aspect of the present invention relates to a method for promoting the regeneration or repair of bone tissue or for treating a disorder associated with an unbalanced relationship between bone formation and bone resorption in a human or animal.
Detto metodo prevede almeno una fase di applicazione, ad un individuo che ne necessita, del biopolimero della presente invenzione.Said method provides for at least one application step, to an individual who needs it, of the biopolymer of the present invention.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGUREBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
A seguire la presente invenzione ? descritta dettagliatamente ed esemplificata con riferimento alle annesse figure, in cui:To follow the present invention ? described in detail and exemplified with reference to the annexed figures, in which:
La Figura 1 mostra un esempio di utilizzo del biopolimero della presente invenzione per la rigenerazione del tessuto osseo, in particolare, il riempimento dell?alveolo post-estrattivo;Figure 1 shows an example of use of the biopolymer of the present invention for the regeneration of bone tissue, in particular, the filling of the post-extraction socket;
La Figura 2 mostra il test di citotossicit? del biopolimero su fibroblasti murini L-929 (A) e cellule staminali mesenchimali derivate da polpa dentale umana (DPSCs) (B). Sono stati valutati il cambio di morfologia cellulare e la citotossicit? a 24, 48 e 96 ore.Figure 2 shows the cytotoxicity test? of the biopolymer on murine L-929 fibroblasts (A) and human dental pulp-derived mesenchymal stem cells (DPSCs) (B). Were the change in cell morphology and cytotoxicity evaluated? at 24, 48 and 96 hours.
DEFINIZIONIDEFINITIONS
Nel contesto della presente invenzione con il termine ?biopolimero? si intende un polimero di origine naturale o vegetale che pu? essere impiegato in campo biomedico.In the context of the present invention with the term ?biopolymer? does it mean a polymer of natural or vegetable origin that can? be employed in the biomedical field.
Nel contesto della presente invenzione con il temine ?plasma sanguigno? si intende un componente del sangue che comprende proteine, nutrienti, prodotti del metabolismo, ormoni ed elettroliti inorganici, privo di cellule. Nel contesto della presente invenzione con il temine ?autologo? si intende un tessuto prelevato dallo stesso individuo a cui verr? rinfuso o reimpiantato.In the context of the present invention with the term ?blood plasma? means a blood component that includes proteins, nutrients, products of metabolism, hormones and inorganic electrolytes, devoid of cells. In the context of the present invention with the term ?autologous? does it mean a tissue taken from the same individual to whom it will come? bulk or replanted.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONEDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Un primo aspetto della presente invenzione riguarda un processo per la preparazione di un biopolimero.A first aspect of the present invention relates to a process for the preparation of a biopolymer.
Detto processo comprende le fasi di:This process includes the phases of:
(1) preparare una soluzione (soluzione I) comprendente acido ascorbico o un suo sale o derivato, preferibilmente acido L-ascorbico, almeno un composto fenolico, ed un solvente acquoso;(1) preparing a solution (solution I) comprising ascorbic acid or a salt or derivative thereof, preferably L-ascorbic acid, at least one phenolic compound, and an aqueous solvent;
(2) preparare una soluzione (soluzione II) aggiungendo alla soluzione I una matrice proteica, preferibilmente plasma sanguigno; e(2) preparing a solution (solution II) by adding to solution I a protein matrix, preferably blood plasma; And
(3) incubare la soluzione II ad una temperatura compresa tra 25 e 45?C, preferibilmente tra 30 e 42?C per un tempo compreso tra 15 e 30 ore, preferibilmente tra 20 e 28 ore, ottenendo il biopolimero.(3) incubating solution II at a temperature ranging from 25 to 45°C, preferably from 30 to 42°C for a time ranging from 15 to 30 hours, preferably from 20 to 28 hours, obtaining the biopolymer.
In una forma di realizzazione, la soluzione I ? riscaldata ad una temperatura compresa tra 35 e 60?C, preferibilmente tra 40 e 55?C, per un tempo compreso tra 30 minuti e 2 ore, preferibilmente tra 45 e 90 minuti al fine di solubilizzare i componenti.In one embodiment, solution I ? heated to a temperature comprised between 35 and 60°C, preferably between 40 and 55°C, for a time comprised between 30 minutes and 2 hours, preferably between 45 and 90 minutes in order to solubilize the components.
In una forma di realizzazione, l?almeno un composto fenolico ? un secoiridoide ed ? preferibilmente scelto tra: oleuropeina, oleuropeina aglicone, dimetiloleuropeina, tirosolo, idrossitirosolo, ligustroside, salidroside, nuzhenide e loro combinazioni. Preferibilmente, l?almeno un composto fenolico ? scelto tra oleuropeina e oleuropeina aglicone, pi? preferibilmente oleuropeina.In one embodiment, the at least one phenolic compound is a secoiridoid and ? preferably selected from: oleuropein, oleuropein aglycone, dimethyloleuropein, tyrosol, hydroxytyrosol, ligustroside, salidroside, nuzhenide and combinations thereof. Preferably, the at least one phenolic compound is chosen between oleuropein and oleuropein aglycone, pi? preferably oleuropein.
In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione la soluzione I comprende un enzima glucosidasico, preferibilmente una ?-glucosidasi. L?enzima viene aggiunto alla soluzione I quando si utilizza ad esempio oleuropeina in modo da attivare tale composto mediante una reazione di deglicosilazione e la formazione di oleuropeina aglicone, l?agente reticolante responsabile della formazione del biopolimero mediante reazione con la matrice proteica del passaggio 2).In a preferred embodiment of the invention, solution I comprises a glucosidase enzyme, preferably a ?-glucosidase. The enzyme is added to solution I when using, for example, oleuropein in order to activate this compound by means of a glycosylation reaction and the formation of oleuropein aglycone, the crosslinking agent responsible for the formation of the biopolymer by reaction with the protein matrix of step 2 ).
Nel caso in cui si aggiunga un enzima glucosidasico, dopo l?aggiunta, la soluzione I viene lasciata in agitazione per un tempo compreso tra 2 e 12 ore, preferibilmente tra 3 e 6 ore ad una temperatura compresa tra 30 e 40?C fino a completa deglicosilazione.In case a glucosidase enzyme is added, after the addition, the solution I is left under stirring for a time ranging from 2 to 12 hours, preferably between 3 and 6 hours at a temperature ranging from 30 to 40°C up to complete deglycosylation.
Secondo un aspetto preferito dell?invenzione la soluzione I comprende: acido ascorbico, un composto fenolico, preferibilmente oleuropeina, in un rapporto 1:1, ed un solvente acquoso. Preferibilmente, la soluzione I comprende acido ascorbico in quantit? compresa tra 40 e 60 mg/ml, pi? preferibilmente tra 45 e 55 mg/ml. Preferibilmente, la soluzione I comprende oleuropeina, in una quantit? compresa tra 40 e 60 mg/ml, pi? preferibilmente tra 45 e 55 mg/ml.According to a preferred aspect of the invention solution I comprises: ascorbic acid, a phenolic compound, preferably oleuropein, in a 1:1 ratio, and an aqueous solvent. Preferably, solution I comprises ascorbic acid in an amount between 40 and 60 mg/ml, plus? preferably between 45 and 55 mg/ml. Preferably, solution I comprises oleuropein, in an amount between 40 and 60 mg/ml, plus? preferably between 45 and 55 mg/ml.
Preferibilmente, l?enzima glucosidasico ? aggiunto in una quantit? compresa tra 5 a 30 Unit? (U), preferibilmente tra 10 e 25 U, pi? preferibilmente tra 15 e 23 U.Preferably, the glucosidase enzyme ? added in a quantity? between 5 and 30 units? (U), preferably between 10 and 25 U, plus? preferably between 15 and 23 U.
Secondo un aspetto preferito dell?invenzione, il plasma viene impiegato per formare la soluzione II in un rapporto soluzione I:plasma compreso tra 1:2 ed 1:6, preferibilmente compreso tra 1:3 e 1:5.According to a preferred aspect of the invention, the plasma is used to form solution II in a solution I:plasma ratio ranging from 1:2 to 1:6, preferably ranging from 1:3 to 1:5.
Un secondo aspetto della presente invenzione riguarda un polimero, preferibilmente di un biopolimero, ottenuto con il processo sopra descritto.A second aspect of the present invention relates to a polymer, preferably a biopolymer, obtained with the process described above.
In una forma di realizzazione, il biopolimero ottenuto ? sottoforma di una pasta modellabile, preferibilmente di colore giallastro.In one embodiment, the obtained biopolymer is in the form of a mouldable paste, preferably yellowish in colour.
La Richiedente ha trovato che il biopolimero ottenuto, se applicato a tessuti ossei danneggiati, ? in grado di facilitarne il riparo. Le opportunit? di applicazione sono quelle di rigenerazione del tessuto osseo di diversi distretti corporei. Innanzitutto, il biopolimero ? utilizzabile nel campo dentale dove risolve il problema clinico legato alla perdita ossea dell?alveolo post-estrattivo.The Applicant has found that the biopolymer obtained, if applied to damaged bone tissues, capable of facilitating its recovery. The opportunities? of application are those of regeneration of the bone tissue of different parts of the body. First, the biopolymer ? usable in the dental field where it solves the clinical problem linked to bone loss of the post-extraction socket.
Senza volersi legare ad alcuna teoria, il biopolimero ottenuto mostra capacit? osteoinduttive; infatti, l?acido ascorbico ? essenziale per la normale formazione del tessuto osseo grazie al suo effetto positivo sulla crescita e differenziamento degli osteoblasti e sull?espressione della fosfatasi alcalina ossea. Questo enzima prodotto dagli osteoblasti ha un ruolo chiave nel processo di mineralizzazione ossea. A livello molecolare ? stato visto che alte concentrazioni di acido ascorbico aumentano i livelli di espressione di collagene tipo X che accelera il processo di mineralizzazione delle fratture. Nella membrana plasmatica degli osteoblasti ? presente un canale sodio-dipendente per l?acido ascorbico che stimola la produzione di collagene tipo I.Without wanting to be tied to any theory, the biopolymer obtained shows the ability osteoinductive; in fact, the? ascorbic acid? essential for the normal formation of bone tissue thanks to its positive effect on the growth and differentiation of osteoblasts and on the expression of bone alkaline phosphatase. This enzyme produced by osteoblasts has a key role in the bone mineralization process. At the molecular level? It has been seen that high concentrations of ascorbic acid increase the expression levels of type X collagen which accelerates the mineralization process of fractures. In the plasma membrane of osteoblasts ? There is a sodium-dependent channel for ascorbic acid which stimulates the production of type I collagen.
Inoltre, il plasma viene isolato dal sangue dello stesso paziente (autologo), e pu? essere utilizzato senza potenziali rischi di reazioni immunitarie avverse o infezioni. Infine, l?oleuropeina in seguito alla deglicosilazione ad opera dell?enzima ?-glucosidasi diviene oleuropeina aglicone (la forma attiva dell?oleuropeina). L?oleuropeina aglicone reagisce con le proteine del plasma formando una struttura reticolata che determina la formazione del biopolimero.Furthermore, the plasma is isolated from the patient's own blood (autologous), and can be used without potential risk of adverse immune reactions or infections. Finally, following deglycosylation by the ?-glucosidase enzyme, oleuropein becomes oleuropein aglycone (the active form of oleuropein). The oleuropein aglycone reacts with plasma proteins forming a cross-linked structure which determines the formation of the biopolymer.
Un terzo aspetto della presente invenzione si riferisce ad un sostituto osseo comprendente il o consistente nel biopolimero dell?invenzione. In altre parole, il biopolimero della presente invenzione pu? essere impiegato come sostituto osseo in caso di difetti ossei per favorire la rigenerazione ossea.A third aspect of the present invention relates to a bone substitute comprising or consisting of the biopolymer of the invention. In other words, the biopolymer of the present invention can be used as a bone substitute in case of bone defects to promote bone regeneration.
Un quarto aspetto della presente invenzione si riferisce all?uso del biopolimero sopra descritto per la rigenerazione o la riparazione di un tessuto osseo o per il trattamento o la prevenzione di un disturbo associato ad un rapporto squilibrato tra formazione e riassorbimento osseo in un essere umano o animale.A fourth aspect of the present invention relates to the use of the biopolymer described above for the regeneration or repair of bone tissue or for the treatment or prevention of a disorder associated with an unbalanced relationship between bone formation and bone resorption in a human being or animal.
In una forma di realizzazione, il disturbo ? selezionato dal gruppo costituito da: osteoporosi di tipo I o II, osteoporosi secondaria, malattia di Paget, perdita ossea o osteolisi osservata in prossimit? di una protesi, malattie ossee metastatiche, ipercalcemia indotta da cancro, mieloma multiplo, malattie parodontali e osteoartrite.In one embodiment, the disturbance is selected from the group consisting of: osteoporosis type I or II, secondary osteoporosis, Paget's disease, bone loss or osteolysis observed in the vicinity of the of a prosthesis, metastatic bone disease, cancer-induced hypercalcemia, multiple myeloma, periodontal disease, and osteoarthritis.
Preferibilmente, il biopolimero ? applicabile tramite una siringa e/o tramite l?utilizzo di una spatola. Infatti, il biopolimero che ha la consistenza di una pasta modellabile, ? facilmente applicabile localmente in un difetto osseo, quale per esempio una frattura. Il biopolimero, applicato tramite una siringa, ? in grado di riempire difetti ossei e pu? essere modellato adattandosi alla forma dell?osso. Inoltre, come sopra descritto, il biopolimero pu? essere impiegato per la preparazione di un sostituto osseo. Infatti, grazie alla sua malleabilit?, il biopolimero pu? essere modellato e/o inserito in uno stampo per ottenere un sostituto osseo che pu? essere impiantato nel sito di un difetto osseo di varia grandezza.Preferably, the biopolymer ? applicable using a syringe and/or using a spatula. In fact, the biopolymer which has the consistency of a modeling paste, is easily applicable locally in a bone defect, such as a fracture. The biopolymer, applied via a syringe,? able to fill bone defects and pu? be molded to fit the shape of the bone. Furthermore, as described above, the biopolymer can be used for the preparation of a bone substitute. In fact, thanks to its malleability, the biopolymer can be modeled and / or inserted into a mold to obtain a bone substitute that can? be implanted at the site of a bone defect of varying size.
Un quinto aspetto della presente invenzione riguarda una composizione comprendente acido ascorbico o un suo sale o un suo derivato, una matrice proteica ed almeno un composto fenolico. Preferibilmente, detta composizione ? adatta per la preparazione del biopolimero sopra descritto. In una forma di realizzazione dell?invenzione, il sale dell?acido ascorbico ? scelto tra ascorbato di calcio, ascorbato di magnesio, ascorbato di potassio, ascorbato di sodio e loro miscele.A fifth aspect of the present invention relates to a composition comprising ascorbic acid or a salt or derivative thereof, a protein matrix and at least one phenolic compound. Preferably, said composition? suitable for the preparation of the biopolymer described above. In one embodiment of the invention, the salt of ascorbic acid is selected from calcium ascorbate, magnesium ascorbate, potassium ascorbate, sodium ascorbate and mixtures thereof.
In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, il derivato dell?acido ascorbico ? scelto tra una forma ossidata, preferibilmente acido deidroascorbico, un estere, preferibilmente ascorbil palmitato o magnesio ascorbil fosfato, e loro miscele.In a preferred embodiment of the invention, the ascorbic acid derivative is selected from an oxidized form, preferably dehydroascorbic acid, an ester, preferably ascorbyl palmitate or magnesium ascorbyl phosphate, and mixtures thereof.
In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, l?acido ascorbico ? l?acido L-ascorbico.In a preferred embodiment of the invention, the ascorbic acid is L-ascorbic acid.
In una forma di realizzazione, la composizione comprende acido ascorbico in una concentrazione compresa tra 5 a 20 mg/ml, preferibilmente tra 8 e 18 mg/ml, pi? preferibilmente tra 10 e 16 mg/ml.In one embodiment, the composition comprises ascorbic acid in a concentration of 5 to 20 mg/ml, preferably 8 to 18 mg/ml, plus? preferably between 10 and 16 mg/ml.
In una forma di realizzazione, il substrato proteico ? il plasma sanguigno, preferibilmente ottenuto da un individuo con le metodiche note al tecnico esperto, preferibilmente tramite prelievo di sangue venoso e la sua miscelazione con almeno un agente anticoagulante. Preferibilmente, il plasma prelevato ? autologo, ovvero ? prelevato da un individuo a cui verr? applicato il biopolimero o il sostituto osseo della presente invenzione. Per esempio, sangue periferico viene prelevato da un individuo e posto in una provetta contente almeno un anticoagulante. La provetta viene quindi centrifugata, preferibilmente ad una velocit? compresa tra 2000 e 4000 g per un tempo compreso tra 5 e 15 minuti. In alternativa, il plasma pu? essere separato tramite centrifugazione in gradiente di densit?, per esempio utilizzando Ficoll-Paque?.In one embodiment, the protein substrate is blood plasma, preferably obtained from an individual with methods known to an expert technician, preferably by taking venous blood and mixing it with at least one anticoagulant agent. Preferably, the plasma taken ? autologous, or ? taken from an individual to whom it will come? applied the biopolymer or bone substitute of the present invention. For example, peripheral blood is drawn from an individual and placed in a tube containing at least one anticoagulant. The tube is then centrifuged, preferably at a speed between 2000 and 4000 g for a time between 5 and 15 minutes. Alternatively, plasma can be separated by density gradient centrifugation, for example using Ficoll-Paque?.
In una forma di realizzazione, la composizione comprende plasma sanguigno in una concentrazione compresa tra il 10 e il 70% volume/volume (v/v), preferibilmente tra il 20 e il 65% v/v, pi? preferibilmente tra il 30 ed il 60% v/v.In one embodiment, the composition comprises blood plasma in a concentration of between 10 and 70% vol/vol (v/v), preferably between 20 and 65% v/v, plus? preferably between 30 and 60% v/v.
In una forma di realizzazione, l?almeno un composto fenolico ? un secoiridoide ed ? preferibilmente scelto tra: oleuropeina, oleuropeina aglicone, dimetiloleuropeina, tirosolo, idrossitirosolo, ligustroside, salidroside, nuzhenide e loro combinazioni. Preferibilmente, l?almeno un composto fenolico ? scelto tra oleuropeina e dimetiloleuropeina, pi? preferibilmente oleuropeina.In one embodiment, the at least one phenolic compound is a secoiridoid and ? preferably selected from: oleuropein, oleuropein aglycone, dimethyloleuropein, tyrosol, hydroxytyrosol, ligustroside, salidroside, nuzhenide and combinations thereof. Preferably, the at least one phenolic compound is chosen between oleuropein and dimethyloleuropein, pi? preferably oleuropein.
In una forma di realizzazione, l?almeno un composto fenolico, ha una purezza superiore al 60%, preferibilmente al 70%, pi? preferibilmente all?80%. Preferibilmente, il composto fenolico ? di origine naturale, pi? preferibilmente di origine vegetale, per esempio estratto o preparato da una pianta appartenente alla famiglia delle Oleaceae. In una forma di realizzazione, la pianta appartiene al genere Olea, preferibilmente della specie O. europaea.In one embodiment, the at least one phenolic compound has a purity greater than 60%, preferably 70%, more than 70%. preferably 80%. Preferably, the phenolic compound ? of natural origin, more preferably of vegetable origin, for example extracted or prepared from a plant belonging to the Oleaceae family. In one embodiment, the plant belongs to the genus Olea, preferably of the species O. europaea.
In una forma di realizzazione, la composizione comprende l?almeno un composto fenolico in una concentrazione compresa tra 5 a 20 mg/ml, preferibilmente tra 8 e 18 mg/ml, pi? preferibilmente tra 10 e 16 mg/ml. Preferibilmente, la composizione comprende ulteriormente un enzima glucosidasico, pi? preferibilmente una ?-glucosidasi.In one embodiment, the composition comprises the at least one phenolic compound in a concentration ranging from 5 to 20 mg/ml, preferably from 8 to 18 mg/ml, plus? preferably between 10 and 16 mg/ml. Preferably, the composition further comprises a glucosidase enzyme, plus? preferably a ?-glucosidase.
In una forma di realizzazione, la composizione comprende un enzima glucosidasico in una concentrazione compresa tra 10 a 35 Unit?/ml (U/ml), preferibilmente tra 15 e 30 U/ml, pi? preferibilmente tra 20 e 30 U/ml.In one embodiment, the composition comprises a glucosidase enzyme in a concentration of 10 to 35 Units/ml (U/ml), preferably 15 to 30 U/ml, plus? preferably between 20 and 30 U/ml.
In una forma di realizzazione, la composizione comprende un solvente acquoso, per esempio acqua, preferibilmente acqua sterile. Preferibilmente, la composizione comprende almeno un solvente acquoso in una concentrazione compresa tra 10 e 35% v/v, preferibilmente tra 15 e 30% v/v.In one embodiment, the composition comprises an aqueous solvent, for example water, preferably sterile water. Preferably, the composition comprises at least one aqueous solvent in a concentration of between 10 and 35% v/v, preferably between 15 and 30% v/v.
In una forma di realizzazione, la composizione consiste in acido ascorbico o un suo sale o un suo derivato, plasma sanguigno, un composto fenolico ed un solvente acquoso, come sopra definiti.In one embodiment, the composition consists of ascorbic acid or a salt or derivative thereof, blood plasma, a phenolic compound and an aqueous solvent, as defined above.
Alternativamente, la composizione consiste in acido ascorbico o un suo sale o un suo derivato, un enzima glucosidasico, plasma sanguigno, un composto fenolico ed un solvente acquoso, come sopra definiti.Alternatively, the composition consists of ascorbic acid or a salt or derivative thereof, a glucosidase enzyme, blood plasma, a phenolic compound and an aqueous solvent, as defined above.
Un ulteriore aspetto della presente invenzione si riferisce ad un metodo per favorire la rigenerazione o la riparazione di un tessuto osseo o per il trattamento di un disturbo associato ad un rapporto squilibrato tra formazione e riassorbimento osseo in un essere umano o animale.A further aspect of the present invention relates to a method for promoting the regeneration or repair of bone tissue or for treating a disorder associated with an unbalanced relationship between bone formation and bone resorption in a human or animal.
Detto metodo prevede almeno una fase di applicazione sul/nel tessuto osseo interessato dal disturbo, di un individuo che ne necessita, del biopolimero dell?invenzione.Said method provides for at least one step of application of the biopolymer of the invention on/in the bone tissue affected by the disorder, of an individual who needs it.
Preferibilmente, il biopolimero ? applicato direttamente sul/nel tessuto osseo interessato dal disturbo.Preferably, the biopolymer ? applied directly to/in the affected bone tissue.
Alternativamente, il metodo prevede una fase di preparazione di un sostituto osseo utilizzando il biopolimero della presente invenzione. Il sostituto osseo pre-formato ? applicato al sito del difetto osseo.Alternatively, the method provides a step of preparing a bone substitute using the biopolymer of the present invention. The pre-formed bone substitute ? applied to the site of the bone defect.
In una forma di realizzazione, il disturbo ? selezionato dal gruppo costituito da: osteoporosi di tipo I o II, osteoporosi secondaria, malattia di Paget, perdita ossea o osteolisi osservata in prossimit? di una protesi, malattie ossee metastatiche, ipercalcemia indotta da cancro, mieloma multiplo, malattie parodontali e osteoartrite.In one embodiment, the disturbance is selected from the group consisting of: osteoporosis type I or II, secondary osteoporosis, Paget's disease, bone loss or osteolysis observed in the vicinity of the of a prosthesis, metastatic bone disease, cancer-induced hypercalcemia, multiple myeloma, periodontal disease, and osteoarthritis.
ESEMPIOEXAMPLE
Il biopolimero ? stato ottenuto mediante utilizzo di: oleuropeina, plasma (autologo), acido ascorbico, ?-glucosidasi e acqua sterile per soluzioni iniettabili. Le quantit? dei singoli componenti necessari per la produzione del biopolimero sono le seguenti (per ogni 0,8 ml di soluzione):The biopolymer? was obtained through the use of: oleuropein, plasma (autologous), ascorbic acid, ?-glucosidase and sterile water for injections. The quantities? of the individual components necessary for the production of the biopolymer are the following (for each 0.8 ml of solution):
1. 10 mg di oleuropeina;1. 10 mg of oleuropein;
2. 0,6 ml di plasma autologo;2. 0.6 ml of autologous plasma;
3. 10 mg di acido Ascorbico;3. 10 mg of Ascorbic acid;
4. 3,52 mg di ?-glucosidasi [? 6,4 U/mg]; e4. 3.52 mg of ?-glucosidase [? 6.4 U/mg]; And
5. 0,2 ml di acqua per soluzioni iniettabili (sterile).5. 0.2 ml of water for injections (sterile).
L?oleuropeina che viene utilizzata come agente reticolante nella presente invenzione ha una purezza ? 80%.The oleuropein which is used as a crosslinking agent in the present invention has a purity of ? 80%.
Il processo di produzione del biopolimero prevede le seguenti fasi:The biopolymer production process involves the following stages:
a) Preparare una soluzione I dissolvendo 10 mg di acido ascorbico e 10 mg di oleuropeina (? 80%) in 0,2 ml di acqua sterile per soluzione iniettabili. Risospendere e porre la soluzione a 50 ?C per 1 ora in modo da ottenere lo scioglimento completo della stessa;a) Prepare a solution I by dissolving 10 mg of ascorbic acid and 10 mg of oleuropein (? 80%) in 0.2 ml of sterile water for solution for injection. Resuspend and place the solution at 50 ?C for 1 hour in order to obtain its complete dissolution;
b) Preparare una soluzione II, aggiungendo 3,52 mg di ?-glucosidasi [? 6,4 U/mg] alla soluzione I. Risospendere e porre la soluzione II a 37 ?C in agitazione costante per 4 ore (?143 rpm) in modo da ottenere la deglicosilazione completa dell?oleuropeina;b) Prepare solution II by adding 3.52 mg of ?-glucosidase [? 6.4 U/mg] to solution I. Resuspend and place solution II at 37 ?C under constant stirring for 4 hours (?143 rpm) in order to obtain complete deglycosylation of oleuropein;
c) Preparare una soluzione III, aggiungendo alla soluzione II 0,6 ml di plasma autologo;c) Prepare solution III by adding 0.6 ml of autologous plasma to solution II;
d) Trasferire la soluzione III in siringhe da insulina e porre le siringhe a 37 ?C per 24h:d) Transfer solution III into insulin syringes and place the syringes at 37 ?C for 24h:
e) Dopo 24h di incubazione della soluzione III ottenuta dal punto (d) si ottiene un biopolimero di colore giallastro pronto all?utilizzo (Figura 1).e) After 24h of incubation of solution III obtained from point (d) a yellowish biopolymer is obtained which is ready to use (Figure 1).
Test di citotossicit?Cytotoxicity test?
La citotossicit? del biopolimero ? stata valutata su linee cellulari di fibroblasti murini L929 e cellule staminali mesenchimali isolate da polpa dentale umana (DPSCs). I test di citotossicit? sono stati effettuati per contatto diretto del biopolimero con i fibroblasti di topo L929 e con le cellule DPSCs. Dopo 24 ore in coltura, ? stato ottenuto un singolo strato di cellule L929 e di DPSCs, e il biopolimero ? stato posto in contatto diretto con le cellule. Le cellule L929, attualmente le cellule utilizzate per i test di biocompatibilit? secondo la ISO 10993-5, hanno una buona correlazione con i test in vivo e sono le cellule presenti nei processi di riparazione delle ferite. Sono stati valutati diversi parametri tra cui: il cambio di morfologia delle cellule, la mortalit? e perdita di aderenza delle cellule. I test di citotossicit? mostrano che il biopolimero della presente invenzione non ? citotossico a contatto diretto con le cellule a tempi di 24, 48 e 96 ore (Figura 2 A e B).Cytotoxicity? of the biopolymer ? was evaluated on murine fibroblast cell lines L929 and human dental pulp mesenchymal stem cells (DPSCs). Cytotoxicity tests? were performed by direct contact of the biopolymer with L929 mouse fibroblasts and with DPSCs cells. After 24 hours in culture, ? was obtained a single layer of L929 cells and DPSCs, and the biopolymer ? been placed in direct contact with the cells. L929 cells, currently the cells used for biocompatibility tests? according to ISO 10993-5, they have a good correlation with in vivo tests and are the cells present in wound repair processes. Were evaluated various parameters including: the change of morphology of the cells, the mortality? and loss of cell adhesion. Cytotoxicity tests? show that the biopolymer of the present invention is not cytotoxic in direct contact with cells at times of 24, 48 and 96 hours (Figure 2A and B).
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