kapcsolnak.they switch.
-----·«*,··-----·«*,··
ELSŐBBSÉGI PÉLDÁNY ”* ::::20θ7-3.οPRIORITY COPY ”* :::: 20θ7-3.ο
KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNYPUBLICATION COPY
Szolgálati találmányService invention
Új kombinatorikus fehérjemarker molekulakönyvtárak, eljárás azok előállítására és alkalmazásáraNew combinatorial protein marker molecular libraries, method for their production and application
ComGenex Rt., BudapestComGenex Ltd., Budapest
Feltalálók:Inventors:
dr. Darvas Ferenc, vegyészmérnök, Budapest dr. Ürge László, vegyész, Budapest Bucsai Ágota, vegyészmérnök, Budapest dr. Béres Mariann, vegyész, Budapest dr. Dormán György, vegyészmérnök, Budapest dr. Krajcsi Péter, vegyész, Budapest dr. Nagy Tamás, vegyészmérnök, Budapest Szalay Dániel, villamos üzemmérnök, Budapest dr. Kálmán Ferenc, vegyészmérnök, BudapestDr. Ferenc Darvas, chemical engineer, Budapest Dr. László Ürge, chemist, Budapest Ágota Bucsai, chemical engineer, Budapest Dr. Mariann Béres, chemist, Budapest Dr. György Dormán, chemical engineer, Budapest Dr. Péter Krajcsi, chemist, Budapest Dr. Tamás Nagy, chemical engineer, Budapest Dániel Szalay, electrical plant engineer, Budapest Dr. Ferenc Kálmán, chemical engineer, Budapest
5%, 5%, 23%, 16%, 35%,5%, 5%, 23%, 16%, 35%,
4%, 6%, 3%, 3%.4%, 6%, 3%, 3%.
A bejelentés napja: 2002.07.10.Date of announcement: 2002.07.10.
A találmány tárgya új kombinatorikus fehérjemarker molekulakönyvtárak, eljárás azok előállítására és alkalmazására.The invention relates to novel combinatorial protein marker molecular libraries, a method for their production and use.
Ismert, hogy a humán genom feltérképezése eredményeként több ezer új fehérje vár azonosításra. A fehérjék potenciális gyógyszertargetként való azonosítása az elkövetkező évek legfontosabb gyógyszerkutatási kihívása. Számos módszert dolgoztak ki, amelyek a genom által azonosított új fehérjék betegség állapottal való kapcsolatát állapítják meg, ilyen például az összehasonlító 2D elektroforézis (A. Görg, Proteomics, 2000, July 3), illetve az izotópos jelölés tömegspektrometriával kombinált módszerei. (S.P. Gygi et al, Proteomics, 2000, July 31).It is known that thousands of new proteins are waiting to be identified as a result of the mapping of the human genome. The identification of proteins as potential drug targets is the most important challenge in drug discovery in the coming years. Several methods have been developed to determine the relationship of new proteins identified by the genome with disease states, such as comparative 2D electrophoresis (A. Görg, Proteomics, 2000, July 3) and isotopic labeling combined with mass spectrometry methods. (S.P. Gygi et al, Proteomics, 2000, July 31).
A fenti módszerek számos esetben nem vezetnek eredményre, például kis koncentrációban jelenlévő fehérjék esetén, valamint a nagyszámú fehérje együttes elválasztása, detektálása és felbontóképessége és azonosítása is nehezen megoldható. Új technológiai megoldásokra továbbá a legfontosabb igényt az jelenti, hogy nem elegendő a betegségállapottal kapcsolatba hozható fehérjét azonosítani, hanem annak funkcióját befolyásolni képes kis molekulák felfedezése a gyógyszerkutatás valódi célja.The above methods do not lead to results in many cases, for example in the case of proteins present in low concentrations, and the separation, detection, resolution and identification of a large number of proteins is also difficult to solve. Furthermore, the most important need for new technological solutions is that it is not enough to identify a protein that can be associated with a disease state, but the discovery of small molecules that can influence its function is the real goal of drug research.
Kismolekulák kötődése egy adott fehérjéhez egyben annak gyógyszer célponttá (targettá) válását (drugability: gyógyszerelhetőség) is validálja azáltal, hogy kismolekula egyáltalán képes kötődni hozzá, továbbá kiegészítő expressziós vizsgálatokkal azt is bizonyítani lehet, a kötődés útján a betegségállapot befolyásolható-e, ami a fehérje funkcióját is igazolja (G. Dormán, et al. Current Drug Discovery, 2001, 1, 21-24). Ismert és ismeretlen ligandumok segítségével ismert ill. még azonosításra váró fehérjék affinitás alapú tanulmányozására és jellemzésére számos lehetőség nyílik a mellékelt mátrix alapján:The binding of small molecules to a given protein also validates its drugability by showing that the small molecule is able to bind to it at all, and by means of additional expression studies it can also be proven whether the disease state can be influenced by the binding, which also confirms the function of the protein (G. Dormán, et al. Current Drug Discovery, 2001, 1, 21-24). With the help of known and unknown ligands, there are many possibilities for affinity-based study and characterization of known and yet to be identified proteins based on the attached matrix:
Fehérje Ismert célferhérje Lehetséges célfehérjeProtein Known target protein Possible target protein
Ismert gyógyszerKnown drug
Ligandum/ SzubsztrátLigand/Substrate
Gyógyszer jelöltDrug candidate
A kombinatorikus kémia kifejlődésével, ahol az építőköveket azok minden lehetséges kombinációjában csatlakoztatjuk egy központi szerkezeti elemhez, lehetőség nyílt nagy számú új kismolekula, illetve a korábban ismert hatásos gyógyszermolekulák nagyszámú analógjainak előállítására.With the development of combinatorial chemistry, where building blocks are connected in all possible combinations to a central structural element, it has become possible to produce a large number of new small molecules and a large number of analogues of previously known effective drug molecules.
E felismerés eredményeképpen új, illetve már ismert fehérjék hatékony azonosítása, osztályokba sorolása nagyszámú kismolekulával való affinitás alapú kölcsönhatáson keresztül az előbbi mátrix szerint tömegszerűen vált lehetségessé és ezt bioanalitika és bioinformatika robbanásszerű fejlődése is támogatta.As a result of this realization, the efficient identification and classification of new and already known proteins through affinity-based interactions with a large number of small molecules according to the aforementioned matrix became possible on a mass scale, and this was also supported by the explosive development of bioanalytics and bioinformatics.
Mivel az affinitás alapú módszerek elsősorban az újonnan felfedezett gének által kódolt fehérjék azonosítását, illetve funkcionális validálását többnyire szintetikusan előállított szerves kismolekulák alkalmazásával végzik el; ezt az új megközelítést kémiai genomikának, illetve proteomikának nevezték el.Since affinity-based methods primarily identify and functionally validate proteins encoded by newly discovered genes, mostly using synthetically produced small organic molecules, this new approach has been called chemical genomics or proteomics.
Egyébként az affinitás alapú módszerek fehérjék izolálására és azonosítására már korábban alkalmazást nyertek.Incidentally, affinity-based methods for the isolation and identification of proteins have already been used previously.
Az affinitás kromatográfiában kismolekulák cellulózhoz, illetve különböző polimerekhez kikötve un. affinitás oszlopokat eredményeznek, amelyeken a fehérje keveréket keresztül áramoltatva azok a kismolekulákhoz való kötődési erősségüktől függően különböző sebességgel, elkülönülve távoztak az oszlopról.In affinity chromatography, small molecules are bound to cellulose or various polymers, resulting in so-called affinity columns, through which the protein mixture is passed, and they leave the column separately at different speeds, depending on their binding strength to the small molecules.
A másik affinitás alapú módszernél az affinitás jelzésnél egy reaktív marker csoport által specifikus kémiai vagy fotokémiai reakció játszódik le, melynek eredményeként egy stabil kovalens kötés épül ki a fehérje és a ligandum között, aminek a legnagyobb előnye az, hogy az addukt stabil marad a fehérje denaturálását követően is és ezzel a ligandum és a ligandumhoz kapcsolódó jelhordozó (un. riporter csoportok) a fehérjéhez (annak kötőhelyéhez) kapcsolt állapotban maradnak.In the other affinity-based method, affinity labeling involves a specific chemical or photochemical reaction by a reactive marker group, resulting in the formation of a stable covalent bond between the protein and the ligand. The biggest advantage of this is that the adduct remains stable even after denaturation of the protein, and thus the ligand and the signal carrier (so-called reporter groups) attached to the ligand remain attached to the protein (its binding site).
Valójában az affinitás jelzési technika lényegi eleme ez, és amennyiben a ligandum tartalmaz egy un. riporter csoportot, egy címkét (jelzést) juttat célba a kovalens addukt képződése révén. Az un. ’’riporter” szerkezeti egység vagy csoport lehet fluoreszcens, radioaktív, biotin, spin vagy más jelző egység. (A ’’riporter” csoport elnevezés arra utal, hogy ezen keresztül nyerhetünk információt konformációról, kötődésről, stb.).In fact, this is the essential element of the affinity signaling technique, and if the ligand contains a so-called reporter group, it delivers a label (signal) to the target through the formation of a covalent adduct. The so-called “reporter” structural unit or group can be fluorescent, radioactive, biotin, spin or other signaling unit. (The name “reporter” group refers to the fact that through it we can obtain information about conformation, binding, etc.).
A kémiailag aktiválható csoportok (pl. aziridin, epoxid) esetén a ligandum vagy szubsztrát - még mielőtt kötési helyzetbe kerülne - gyakran elreagál nem-specifikus módon a nukleofilekkel.In the case of chemically activatable groups (e.g. aziridine, epoxide), the ligand or substrate - before reaching a binding position - often reacts non-specifically with nucleophiles.
A fotokémiailag aktiválható csoportok (fotofórok: pl. benzofenon, aromás azidok) elterjedése annak köszönhető, hogy távolról irányítható, ’tiszta reagensek’ és számos előnyös tulajdonsággal rendelkeznek a pusztán kémiailag reaktív csoportokkal szemben, így, „sötétben” stabilak és a biológiai nem-kovalens kötési helyzetben, csak a tanulmányozó beavatkozása (fénybesugárzás) hatására, jól időzíthető módon történik meg a kovalens kötést eredményező fotokémiai reakció. (Dormán Gy., Fénnyel aktiválható biológiailag hatékony vegyületek, Kémia Újabb Eredményei, 89. Kötet, Akadémiai Kiadó, 2001). Fontos feltétel, hogy a fehérjét kevéssé károsító hullámhosszú (>350 nm) fényirradiáció alkalmas legyen a gerjesztésre.The spread of photochemically activatable groups (photophores: e.g. benzophenone, aromatic azides) is due to the fact that they are remotely controllable, ‘pure reagents’ and have several advantageous properties compared to purely chemically reactive groups, such as being stable “in the dark” and in the biological non-covalent binding situation, the photochemical reaction resulting in the covalent bond occurs in a well-timed manner only under the intervention of the researcher (light irradiation). (Gy. Dormán, Light-Activable Biologically Effective Compounds, New Results of Chemistry, Volume 89, Akadémiai Kiadó, 2001). An important condition is that light irradiation with a wavelength (>350 nm) that is not damaging to the protein is suitable for excitation.
Normál esetben a kombinatorikus könyvtárak tervezésekor mind a kémiailag ill. mind a fotokémiailag aktiválható csoportok alkalmazását általában kerülik, éppen azon tulajdonságok miatt, hogy biológiai kötési helyzetben könnyen reagálnak a fehérjével.Normally, when designing combinatorial libraries, the use of both chemically and photochemically activatable groups is generally avoided, precisely because of their properties that they readily react with the protein in a biological binding situation.
Találmányunk azon a felismerésen alapul, hogy a kemogenomikai alkalmazásban a kombinatorikus könyvtárakat, ha megfelelő módon kémiai vagy fotokémiai affinitás jelző csoportokkal látjuk el, lehetőség nyílik nagy tömegű biológiai affinitás alapú információ gyors megszerzésére, kötési profilok meghatározására, célfehérjék gyors osztályba sorolására, kedvező esetben közvetlen azonosítására, nagyáteresztőképességíí biológiai szűrőrendszerekben való felhasználásra.Our invention is based on the recognition that in chemogenomic applications, combinatorial libraries, if appropriately equipped with chemical or photochemical affinity signaling groups, provide the opportunity to rapidly obtain large amounts of biological affinity-based information, determine binding profiles, rapidly classify target proteins, and, in favorable cases, directly identify them, and use them in high-throughput biological screening systems.
Meglepő módon a kombinatorikus marker könyvtárak előállítása során azt találtuk, hogy igen előnyös, ha a kémiailag ill. fotokémiailag reaktív marker csoportokat (pl. fotofórt) és a riporter csoportokat egy un. marker egységben csatlakoztatjuk a könyvtárhoz, egyetlen, párhuzamos, robotizálható lépésben az előre különböző diverzitású pontokban kiépített funkciós csoportokon keresztül. A funkciós csoport lehet közvetlenül a molekuláris hordozón vagy előnyösen egy un. kapcsoló oldallánc (pányva) végcsoportjaként helyezkedhet el.Surprisingly, during the preparation of combinatorial marker libraries, we found that it is very advantageous to connect the chemically or photochemically reactive marker groups (e.g. photophores) and the reporter groups in a so-called marker unit to the library, in a single, parallel, robotic step via functional groups built in advance at points of different diversity. The functional group can be located directly on the molecular carrier or preferably as the end group of a so-called linker side chain (lanyard).
Riporter CsoportReporter Group
Marker csoport (Fotofór)Marker group (Photophore)
A fentiek alapján a találmány tárgya kombinatorikus fehérjemarker molekula könyvtárak, amelyek egy közös molekuláris váz körül különböző térirányú pozíciókban egy oldalláncon keresztül kapcsolt módon kémiai vagy fotokémiai úton aktiválható csoportokat - riporter csoportokkal együtt vagy anélkül - tartalmaznak.Based on the above, the subject of the invention is combinatorial protein marker molecule libraries, which contain groups that can be activated chemically or photochemically - with or without reporter groups - in different spatial positions around a common molecular skeleton, linked via a side chain.
A találmány továbbá kombinatorikus marker egység könyvtár, amely kémiailag vagy fotokémiailag reaktív marker csoportokat, riporter csoportokat és különböző típusú oldalláncokat egy közös molekuláris-, előnyösen lizin-alapú, vázon variábilisén tartalmaz.The invention further provides a combinatorial marker unit library comprising chemically or photochemically reactive marker groups, reporter groups and different types of side chains variably on a common molecular, preferably lysine-based, backbone.
A találmány szerinti könyvtár marker-csopÓitokként benzofenon-, nitro-fenilazidcsoportokat, riporter-csoportként biotin-, fluoreszcens-csoportokat, valamint oldalláncként telített szénláncot, ill. polietilén-glikol egységeket tartalmaz.The library according to the invention contains benzophenone and nitrophenylazide groups as marker groups, biotin and fluorescent groups as reporter groups, and saturated carbon chains and polyethylene glycol units as side chains.
A találmány továbbá kombinatorikus kémiai pányvázási eljárás, amely abban áll, hogy szerkezeti diverzitás, illetve fehérje-kötődési hatékonyság szempontjából optimális pozícióban helyezzük el az egy végcsoporttal, előnyösen amino csoporttal rendelkező oldalláncot, amelyhez, kívánt esetben marker egységet kapcsolunk.The invention further provides a combinatorial chemical tethering method, which consists in placing the side chain with one end group, preferably an amino group, in an optimal position in terms of structural diversity and protein binding efficiency, to which a marker unit is optionally attached.
A találmány a fentieken túlmenően pányvázott kombinatorikus könyvtárak alkalmazása nem-kovalens módon affinitás alapú biopolimer, előnyösen fehérje és kismolekula, így ligand, szubsztrát és mások kölcsönhatás-vizsgálatára közvetlen vagy szilárd hordozóhoz kötött formában, előnyösen affinitás kromatográfia vagy kémiai mikroarrayk, mikrochipek felhasználásával.The invention further relates to the use of tethered combinatorial libraries in a non-covalent manner for affinity-based interaction studies between biopolymers, preferably proteins, and small molecules, such as ligands, substrates, and others, in direct or solid support-bound form, preferably using affinity chromatography or chemical microarrays, microchips.
A találmány szerinti szilárd hordozóhoz kötött pányvázott vegyületek alkalmazhatók makromolekulák, előnyösen fehérje és kismolekula kölcsönhatásvizsgálatára, olyan módon, hogy más technikával kialakított mikrochipekhez vagy mikroarraykhez rögzített molekulák vizsgálatára kidolgozott protein, DNS vagy bármilyen leolvasó chipek használatára kialakított protokollokban, eljárásokban használjuk.The tethered compounds bound to a solid support according to the invention can be used to study the interaction of macromolecules, preferably proteins, and small molecules, in a way that they are used in protocols and methods designed for the use of protein, DNA or any reader chips developed for the study of molecules attached to microchips or microarrays formed by other techniques.
A találmány ezen kívül robotizált parallel derivatizálási eljárás, amely abban áll, hogy az oldalláncot vagy közvetlenül a marker egységet a molekulakönyvtár intermedierjeihez kapcsoljuk.The invention also provides a robotic parallel derivatization process, which consists of attaching the side chain or directly the marker unit to the intermediates of the molecular library.
A találmány továbbá HT biológiai teszt alkalmazása, amely szövetkeverékből nagyszámú minta párhuzamos affinitás jelzését teszi lehetővé, beleértve a kovalensen kötött fehérjék detektálását, elkülönítését.The invention further provides the use of an HT biological test, which enables parallel affinity labeling of a large number of samples from a tissue mixture, including the detection and separation of covalently bound proteins.
A találmány továbbá HT analitikai módszer alkalmazása, amely alkalmas a kovalensen kötött fehérjék tömegspektrometrtiás módszerekkel való szekvenálására és ismert szekvencia adatbázisokkal való összehasonlításra.The invention further provides an application of the HT analytical method, which is suitable for sequencing covalently bound proteins by mass spectrometry methods and for comparison with known sequence databases.
Találmányunk alapján olyan egyszerű marker egységek kombinatorikus könyvtára alakítható ki, amely alkalmas megfelelően előkészített kismolekula kombinatorikus könyvtárakhoz, párhuzamos, robotizált módon tömegszerűen kapcsolódni. A marker egység könyvtára valójában különböző típusú kapcsoló oldallánc, (foto)reaktív csoport, különböző riporter csoport lehetséges összes kombinációja.Based on our invention, a combinatorial library of simple marker units can be created that is suitable for mass-linking to appropriately prepared small molecule combinatorial libraries in a parallel, robotic manner. The marker unit library is actually all possible combinations of different types of linking side chains, (photo)reactive groups, and different reporter groups.
Előnyösen ez egy lizin-alapú elágazó rendszert alkot, ahol a marker, és riporter csoportokat, valamint az oldallánc minőségét lehet variálni.Preferably, this forms a lysine-based branching system where the marker and reporter groups, as well as the quality of the side chain, can be varied.
Riporter csoportReporter group
Marker Csoport (Fotofór)Marker Group (Photophore)
OldalláncSide chain
A találmány szerinti marker könyvtárak kombinatorikus affinitás ligandumok tervezésére is alkalmasak. Megállapítottuk, hogy az alábbiakat kell biokémiai szempontból figyelembe venni az affinitás ligandumok tervezésénél:The marker libraries of the invention are also suitable for the design of combinatorial affinity ligands. We have determined that the following should be considered from a biochemical perspective when designing affinity ligands:
1. Az affinitás alapú próbavegyületek kötődése várhatóan ugyanazon a helyen következzen be, mint az azt nem tartalmazó módosítás nélküli vegyületek esetén, és biológiai aktivitásuknak legalább egy nagyságrendben kell lennie azzal;1. Affinity-based test compounds should be expected to bind at the same site as unmodified compounds that do not contain it, and their biological activity should be at least of the same order of magnitude;
2. A kovalens kötés kialakítása és az azzal járó irreverzibilis aktiválás vagy inaktiválás legyen arányos a riporter csoport által közvetített jel intenzitásával azaz a kötőfehérjén kívül minimális legyen a nem-specifikus jelzés.2. The formation of the covalent bond and the associated irreversible activation or inactivation should be proportional to the intensity of the signal mediated by the reporter group, i.e., non-specific signaling outside the binding protein should be minimal.
3. Fotokémiai aktiválás esetén a fény gerjesztési hullámhossz ne károsítsa a fehérjét azaz ne legyen kisebb, mint 320 nm, valamint ezen a hullámhosszon a emax (moláris extinkciós tényező) értéke magas legyen.3. In the case of photochemical activation, the light excitation wavelength should not damage the protein, i.e. it should not be less than 320 nm, and the aemax (molar extinction coefficient) value at this wavelength should be high.
4. A kovalens addukt stabil legyen a kémiai és enzimatikus fehérje fragmentálás körülményei között. Ez az alkalmazott kémiai vagy fotokémiai reaktív csoportok sajátos mechanizmusában rejlik.4. The covalent adduct should be stable under the conditions of chemical and enzymatic protein fragmentation. This lies in the specific mechanism of the chemical or photochemical reactive groups used.
5. A fehérje kovalens módosítása legyen lehetőség szerint valamilyen mértékben pontill. régió szelektív, ami egy vagy két szomszédos aminosav jelzésével egyetlen módosított vagy jelzett fehérje fragmenset szolgáltat, és ez a fehérje azonosítását megkönnyíti, az MS alapú szekvencia azonosítása ill. a szekvencia adatbázisokkal való összehasonlítása által.5. The covalent modification of the protein should be, if possible, to some extent point or region selective, which provides a single modified or labeled protein fragment by labeling one or two adjacent amino acids, and this facilitates the identification of the protein, by MS-based sequence identification or by comparing the sequence with databases.
A találmány szerinti affinitás jelzés során a célfehérjét tartalmazó szövetpreparátumot inkubáljuk rövid ideig a ligandummal. Kémiailag aktiválható csoportok esetén a keresztkötés közvetlenül kialakul, míg fotoreaktív csoportok esetén, ha ezt sötétben végezzük az így kialakuló nem-kovalens kötést a fényérzékeny csoportnak megfelelő hullámhosszú lámpával megvilágítva játszódik le az adott csoprtra jellemző fotokémiai reakció és irreverzibilis kötés épül ki a receptor és a ligandum között. Ez a kötés a riporter csoport által detektálható többféleképpen:In the affinity labeling according to the invention, the tissue preparation containing the target protein is incubated with the ligand for a short period of time. In the case of chemically activatable groups, the cross-linking is formed directly, while in the case of photoreactive groups, if this is done in the dark, the non-covalent bond thus formed is illuminated with a lamp of a wavelength corresponding to the photosensitive group, the photochemical reaction characteristic of the given group takes place and an irreversible bond is formed between the receptor and the ligand. This bond can be detected by the reporter group in several ways:
Mivel a ligandummal együtt a megfelelő riporter csoport is beépül a fehérjébe, (a kötőhely régiójába), így az aktivitást nem mutató polipeptidektől könnyen megkülönböztethetjük a ligandum kötő fehérjét/fehérjéket.Since the corresponding reporter group is incorporated into the protein (in the binding site region) along with the ligand, we can easily distinguish the ligand-binding protein(s) from the polypeptides that do not show activity.
Biológiai jellegű riporter csoportok a detektáláson kívül alkalmasak elválasztásra is pl. biotin egységet tartalmazó fehérje - ligandum adduktot avidin affinitás oszlopon könnyen elkülöníthetők. Az elkülönített fehérjéket enzimatikus ill. kémiai módszerekkel kisebb szakaszokra bonthatjuk, amelyeket vagy tömegspektrometriás vagy klasszikus szekvencia analízisnek vetjük alá. Amennyiben a kötőhelyet tartalmazó fehérje fragmens ismert, akkor jelzés nélkül közvetlenül az MS fragmentációs mintázatból (fingerprint) lehet meghatározni a kötőhely pontos helyét elhelyezkedését.In addition to detection, biological reporter groups are also suitable for separation, e.g. protein-ligand adducts containing a biotin unit can be easily separated on an avidin affinity column. The separated proteins can be broken down into smaller fragments by enzymatic or chemical methods, which are then subjected to either mass spectrometric or classical sequence analysis. If the protein fragment containing the binding site is known, then the exact location of the binding site can be determined directly from the MS fragmentation pattern (fingerprint) without labeling.
A találmány szerinti kémiailag vagy fotokémiailag reaktívvá alakított ligandumokkal való affinitás alapú kölcsönhatási kísérlet 5 szinten nyújt infomációt:The affinity-based interaction experiment with chemically or photochemically reactive ligands according to the invention provides information at 5 levels:
• Azonosít egy fehérje- ligandum kölcsönhatást egy adott lizátumban, szövetpreparátumban, ahol a ligandummal interakcióba lépő fehérje lehet ismert vagy ismeretlen funkciójú, de szekvenciája azonosítható a humán génállomány DNS szekvencia adatbázisai által, • Azonosítani lehet a fehérjén belül a kötőhelyet tartalmazó régiót, • Azonosítani lehet a fehérjén belül a kötőhely aminosav sorrendjét, több nézetből is, ami alapján a kötőhely minimum aktív fragmense meghatározható, • Irreverzibilis aktiválás ill. inaktiválás által azonosítani lehet kedvező esetben a fehérje funkcióját, szerepét a sejtek közötti ill. sejten belüli kémiai kommunikációban, • Adott fehérje kifejeződési (expressziós) szintjének megállapítására alkalmas betegség állapotban ill. egészséges állapotban, • nem funkcionális, transzport folyamatok jellemzése pl. efflux pumpák (MDR).• Identifies a protein-ligand interaction in a given lysate or tissue preparation, where the protein interacting with the ligand may have a known or unknown function, but its sequence can be identified by the DNA sequence databases of the human genome, • The region containing the binding site within the protein can be identified, • The amino acid sequence of the binding site within the protein can be identified from several perspectives, based on which the minimum active fragment of the binding site can be determined, • In favorable cases, the function of the protein, its role in chemical communication between cells or within cells can be identified by irreversible activation or inactivation, • Suitable for determining the expression level of a given protein in a disease state or in a healthy state, • Characterization of non-functional, transport processes, e.g. efflux pumps (MDR).
A találmány szerinti megoldásban a reaktív marker csoportokat/ egységeket kapcsoljuk a várhatóan biológiailag aktív vegyülethez. Mint ismert, az affinitás jelző analogonok egy csoportjában (un. exo-típusú pányvázott ligandumok esetében; elnevezést lásd: Baker: Design of Active Site Directed Irreversible Enzyme Inhibitors, 1967, John Wiley & Sons, Inc.:New York.) a fényérzékeny csoport egy oldalláncon át kapcsolódik a ligandumhoz, ez a módszer a receptor elkülönítésénél előnyös. Míg olyan esetekben, amikor a reaktív csoport a farmakofór része mimikáivá annak szerkezeti egységeit, a receptor kötőhely pontos feltérképezése (“mapping”) válik lehetségessé (endo-típus). Az exo-típusú affinitás próbavegyület esetében a reaktív csoportot távol a farmakofórtól szférikusán flexibilis helyen kell bevezetni, hogy ne változtassa meg a vegyület konformációját.In the present invention, reactive marker groups/units are linked to the expected biologically active compound. As is known, in one group of affinity signaling analogs (so-called exo-type tethered ligands; see Baker: Design of Active Site Directed Irreversible Enzyme Inhibitors, 1967, John Wiley & Sons, Inc.:New York.), the photosensitive group is linked to the ligand via a side chain, which is advantageous for receptor isolation. Whereas in cases where the reactive group mimics the structural units of the pharmacophore, precise mapping of the receptor binding site becomes possible (endo-type). In the case of exo-type affinity probes, the reactive group must be introduced in a spherically flexible location away from the pharmacophore so as not to change the conformation of the compound.
A találmány szerinti reaktív marker próbavegyületek szintézisénél az alábbiakat kell figyelembe vennünk:The following should be considered when synthesizing the reactive marker probe compounds of the invention:
1. A marker könyvtár elemek szintézise során (pl. a marker egység kapcsolása a pányvázott könyvtárhoz) a kémiailag reaktív csoport, ill. fotofór nem szenvedhet bomlást, így előnyösen egy stabil prekurzorát alakítjuk ki vagy építjük be a molekulába és a reakciósor utolsó lépésében alakítjuk át fotoreaktív csoporttá (lineáris megközelítés);1. During the synthesis of marker library elements (e.g. coupling of the marker unit to the tethered library), the chemically reactive group or photophore must not undergo decomposition, so a stable precursor is preferably formed or incorporated into the molecule and converted into a photoreactive group in the last step of the reaction sequence (linear approach);
2. A reaktív csoportot vagy prekurzorát legegyszerűbben közvetlenül a természetes ligandum egy meglevő funkciós csoportjához kapcsolhatjuk (endo-típus), ill. egy egyszerű csoport közvetlen hozzátoldásával alakíthatjuk ki a fotoreaktív csoportot (szemi-szintetikus megközelítés, pl. aromás gyűrű direkt benzoilezésével nyerhetünk helyettesített benzofenont).2. The reactive group or its precursor can be most simply attached directly to an existing functional group of the natural ligand (endo-type), or the photoreactive group can be formed by direct addition of a simple group (semi-synthetic approach, e.g. direct benzoylation of an aromatic ring to obtain a substituted benzophenone).
3. Megfelelő funkciós csoport hiányában előnyösen egy nukleofil csoportot vezetünk be a molekulába oldalláncon keresztül ’’pányva” vagy anélkül és ehhez kapcsoljuk utolsó lépésben a fotofort tartalmazó szintont vagy heterobifunkcionális reagenssel (konvergens megközelítés).3. In the absence of a suitable functional group, a nucleophilic group is preferably introduced into the molecule via a side chain, with or without a tether, and in the final step, the photophore-containing synthon or heterobifunctional reagent is coupled to it (convergent approach).
Találmányunk esetében ez utóbbi megoldás, mind szintetikus, párhuzamosítási, mind pedig tervezési okokból a legelőnyösebbnek tűnik.In the case of our invention, the latter solution seems to be the most advantageous, both for synthetic, parallelization, and design reasons.
Sztérikusan nagyméretű reaktív marker egységek (pl. benzofenon fotofór) még ilyen helyzetben is komoly befolyással lehetnek a molekula egészének konformációjára és a biológiai aktivitására. Ekkor célszerűen a molekula szabadon változtatható szerkezeti egységéhez egy kis teret elfoglaló oldallánc (“pányva”, tether) kapcsolható, ami egy funkcionálásra alkalmas végcsoportot tartalmaz. Erre a ’’pányvára” lehet azután ’’rákötni” a reaktív vagy fotoreaktív csoportot előnyösen a riporter csoporttal együtt, amely így egy külön marker egységet alkot. Az előbb vázolt ’’pányvázott” ligandum módszer további nyilvánvaló előnye, hogy az oldalláncon át szilárdfázisú hordozóhoz is köthető a bioaktív ligandum és a kötőfehérje előtisztítására nyílik lehetőség a későbbiekben affinitás kromatográfia segítségével.Even in such a situation, sterically large reactive marker units (e.g. benzophenone photophore) can have a serious influence on the conformation and biological activity of the entire molecule. In this case, it is advisable to attach a small space-occupying side chain (“tether”) to the freely variable structural unit of the molecule, which contains an end group suitable for functioning. The reactive or photoreactive group can then be “tied” to this “tether”, preferably together with the reporter group, which thus forms a separate marker unit. Another obvious advantage of the “tethered” ligand method outlined above is that the bioactive ligand can also be bound to a solid-phase support via the side chain, and the binding protein can be pre-purified later using affinity chromatography.
A találmány szerinti affinitás alapú marker könyvtárak készítésénél figyelembe kell venni az alábbiakat:The following should be considered when creating affinity-based marker libraries according to the invention:
Fotoaffinitás és más affinitás alapú biokonjugációs technikák szükségessé teszik a gondos tervezést, modellezést annak érdekében, hogy a biológiai aktivitás fenn maradjon. A pányvázott kismolekula könyvtárak esetén a szintézis tervezés során a legfontosabb feladat olyan funkciós csoportok kiépítése a molekuláris váz különböző diverzitású pontjain, amihez közvetlenül vagy egy további oldalláncon keresztül a marker egységet kapcsolni lehet a szintézis lehetőleg utolsó lépésében. A szintézis tervezésnél tehát olyan bifunkcionális vagy maszkírozott kémiai reagenseket (építőelemeket) kell standard reagens készletbe bevenni, amely ilyen vegyületeket eredményez. így az előállítás párhuzamosítható és robotizálható.Photoaffinity and other affinity-based bioconjugation techniques require careful design and modeling to maintain biological activity. In the case of tethered small molecule libraries, the most important task during synthesis design is to build functional groups at points of different diversity of the molecular skeleton, to which the marker unit can be attached directly or via an additional side chain, preferably in the last step of the synthesis. Therefore, in synthesis design, bifunctional or masked chemical reagents (building blocks) must be included in a standard reagent kit that results in such compounds. Thus, the production can be parallelized and roboticized.
A biológiai aktivitás változatlanul tartása érdekében a pányva elhelyezésének megállapítása 3 módon lehetséges akkor, ha ismert fehérjén kívánunk tesztelni analóg molekulákat:In order to keep the biological activity unchanged, there are 3 ways to determine the placement of the tether when testing analog molecules on a known protein:
Az irodalomban ismert hasonló affinitás próbavegyületek vagy affinitás kromatográfiás tapasztalatokból kiindulva vagy QSAR adatok ill. 3D dokkolási eredmények alapján, amennyiben fehérje 3D szerkezete ismert.Similar affinity probe compounds known in the literature or based on affinity chromatography experiences or QSAR data or 3D docking results, if the 3D structure of the protein is known.
Nagyobb valószínűséggel talál elérhető funkciós csoportot a gerjesztett fotofór, ha flexibilis alkil oldallánchoz kapcsolódik (un. ’’pányvához”, lásd később).The excited photophore is more likely to find an accessible functional group if it is attached to a flexible alkyl side chain (so-called ‘‘tether’’, see later).
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott kapcsoló oldallánc szerepét az alábbiakban elemezzük:The role of the linking side chain used in the process of the invention is analyzed below:
A kapcsoló oldallánc (’’pányva”) flexibilitása komolyan befolyásolja az affinitás jelzés sikerét. Választása függ a kitűzött céltól és a feltételezett célfehérje sajátosságaitól. A rigid vagy flexibilis linker választása általában két egymás ellen ható tényező kompromisszumát jelenti. Flexibilis és hosszabb oldallánc növeli a szabadsági fokot és nagyobb esélyt ad kovalens kötés kialakítására, bár a jelzés helye így távolabb kerülhet a kötőhelytől, valamint a többszörös támadási ponttal is számolhatunk. Túl rövid ’’pányva” esetén a ligandum konformációjától függően a fotoreaktív csoport esetleg mélyen beágyazódik a ligandum funkciós csoportjai közé és nem képes hatékony jelzésre, valamint intramolekuláris reakció is elképzelhető. Merev ’’pányva” várhatóan pont szelektíven jelöl egyetlen aminosavat, bár a hatékonyság várhatóan alacsonyabb, hiszen a reagáló fehérje részek elérési valószínűsége a flexibilitással arányos.The flexibility of the linker side chain (‘‘tether’’) seriously influences the success of affinity labeling. Its choice depends on the intended purpose and the specificities of the putative target protein. The choice of a rigid or flexible linker usually represents a compromise between two opposing factors. A flexible and longer side chain increases the degree of freedom and gives a greater chance of forming a covalent bond, although the labeling site may thus be further away from the binding site, and multiple points of attack can also be expected. In the case of a too short ‘‘tether’’, depending on the conformation of the ligand, the photoreactive group may be deeply embedded between the functional groups of the ligand and is unable to effectively label, and intramolecular reactions are also possible. A rigid ‘‘tether’’ is expected to selectively label a single amino acid, although the efficiency is expected to be lower, since the probability of reaching the reacting protein parts is proportional to the flexibility.
Összegezve; a ’’pányva” flexibilitása és hossza a kitűzött céltól nagymértékben függ. Új ismeretlen receptor fehérje azonosításánál, (mint pl. a természetes anyagok esetén) egy hosszabb, flexibilis oldallánc a megfelelőbb. Más esetekben, amikor a receptor térbeli feltérképezése az elsődleges cél, egy merev, ismert méretű oldallánc adhat valódi információt. Ezutóbbi esetben célszerű a fotoreaktív csoportot a bioaktív ligandum több különböző helyzetében is kipróbálni, azaz több különböző ’’nézetből” is vizsgálni a kovalens kötés létesítésének regiospeficitását és eredményességét.In summary; the flexibility and length of the “tether” depends largely on the intended purpose. In the identification of a new unknown receptor protein, (e.g. in the case of natural products), a longer, flexible side chain is more appropriate. In other cases, when the spatial mapping of the receptor is the primary goal, a rigid, known-size side chain can provide real information. In the latter case, it is advisable to test the photoreactive group in several different positions of the bioactive ligand, i.e. to examine the regiospecificity and effectiveness of the establishment of the covalent bond from several different “views”.
A flexibilis kapcsoló oldallánc hidrofilicitásával vagy hidrofóbicitásával a hozzákapcsolódó fotoreaktív csoport különböző fehérje régiók felé irányítható. Membránba ágyazódott fehérjeszakaszok jelzésére a hidrofób jellegű ’’pányvát” célszerű választani (kivéve ion-csatorna esetét), míg a receptor intercelluláris szakaszain hidrofil oldallánc alkalmazása előnyös. Ez utóbbi az affinitás ligandum általános vízoldhatóságát is növeli.The hydrophilicity or hydrophobicity of the flexible linker side chain can direct the attached photoreactive group towards different protein regions. For labeling protein segments embedded in membranes, a hydrophobic ‘‘tether’’ is advisable (except in the case of ion channels), while the use of hydrophilic side chains is advantageous for the intracellular regions of the receptor. The latter also increases the overall water solubility of the affinity ligand.
A találmány szerinti megoldás legfőbb előnye, hogy a pányvázott kombinatorikus könyvtár jó termeléssel állítható elő. Fontos körülmény az is, hogy robotizálható körülmények között, azaz a ligandum/ könyvtár fiinkcionalizálás ill. ’’pányvázás” a ligandum/ könyvtár ismert és hatékony szintézis sorának minimális módosításával megvalósítható.The main advantage of the solution according to the invention is that the tethered combinatorial library can be produced in good yield. Another important circumstance is that it can be performed under robotic conditions, i.e. the ligand/library functionalization or “tethering” can be performed with minimal modification of the known and efficient synthesis sequence of the ligand/library.
A találmány egy előnyös változatában a marker csoportokat kombinatorikus megközelítéssel (marker könyvtárak) hozzuk létre. így; ismeretlen fehérje ill. kismolekula család esetén, ahol nincs a fentieknek megfelelő információnk a kombinatorikus megközelítést alkalmazhatjuk, aminek eredményeként a pányvát a molekuláris váz különböző pontján helyezzük el a diverzitást (szerkezeti különbséget) hordozó helyzetekben.In a preferred embodiment of the invention, the marker groups are created using a combinatorial approach (marker libraries). Thus; in the case of an unknown protein or small molecule family, where we do not have the information corresponding to the above, we can use the combinatorial approach, as a result of which the tether is placed at different points of the molecular skeleton in positions carrying diversity (structural difference).
Új kombinatorikus könyvtárakhoz kapcsolt kémiai vagy fotomarker egységekkel meghatározhatjuk a vegyületek gyógyszerelhetőségét (“drugability”) valamint egy lépésben lehet azonosítani egy fehérje targetet valamint a hozzákötődő biológiailag aktív ligandumot/ szubsztrátot.With chemical or photomarker units linked to new combinatorial libraries, we can determine the drugability of compounds and identify a protein target and the biologically active ligand/substrate that binds to it in one step.
A találmány szerinti kombinatorikus kémiai könyvtárak tipikusan 3 vagy 4 variálható pontot tartalmaznak, amelyek általában a tér különböző irányába mutatnak.Combinatorial chemical libraries of the invention typically contain 3 or 4 variable points, which generally point in different directions in space.
A könyvtárak egy megfelelő kisebb reprezentatív csoportjában a variálható pontokon elhelyezhetünk a reaktív marker csoportokat, oly módon, hogy az minimális mértékben befolyásolja csak a módosítatlan vegyület várható biológiai aktivitását.In a suitably small representative group of libraries, reactive marker groups can be placed at variable points in such a way that it minimally affects the expected biological activity of the unmodified compound.
A találmány előnyeit az alábbiakban foglaljuk össze:The advantages of the invention are summarized below:
A kombinatorikus könyvtárak nagy kapacitású, párhuzamos derivatizálása kovalens kötést eredményező származékokká (előnyösen fotoreaktív csoportokkal), valamint affinitás jelzési kísérletet és detektálást nagy áteresztőképességűvé téve számítógépes adatfeldolgozással kiegészítve egy gyors fehérje profilírozási módszerként alkalmazható, ami lehetőséget ad a megjelölt fehérjék detektálására és elválasztására, továbbá azok szerkezet alapú, szekvenciális vagy funkcionális jellemzésére, osztályba sorolására.High-throughput, parallel derivatization of combinatorial libraries into covalently linked derivatives (preferably with photoreactive groups), coupled with high-throughput affinity labeling and detection coupled with computational data processing, can be used as a rapid protein profiling method, enabling the detection and separation of labeled proteins, as well as their structure-based, sequential, or functional characterization and classification.
A módszer kifejleszthető riporter csoport nélkül is egységes előnyösen rekombináns fehérjék alkalmazása esetén tömegspektrometria (MS) alkalmazásával, egy un. fotofór MS ujjlenyomatok (fingerprintek) keresése által. Ez esetben olyan (foto)kémiailag aktiválható csoport alkalmazása szükséges, amely jellegzetes MS fragmens mintát ad.The method can be developed without a reporter group, preferably using recombinant proteins, by using mass spectrometry (MS), by searching for a so-called photophore MS fingerprint. In this case, it is necessary to use a (photo)chemically activatable group that gives a characteristic MS fragment pattern.
A találmányt az alábbi példákon mutatjuk be, anélkül, hogy találmányunk oltalmi körét csak ezekre korlátoznánk:The invention is illustrated by the following examples, without limiting the scope of our invention to these:
Példák:Examples:
1.példaExample 1
Benzofenon-biotin és benzofenon-danzil fotomarker-egység szintéziseSynthesis of benzophenone-biotin and benzophenone-dansyl photomarker units
Reakcióséma:Reaction scheme:
Fotorrarker egységPhotorarker unit
A./ Alapanyag előállítása:A./ Raw material production:
5-aminovaleriánsav dietilészter hidroklorid:5-aminovaleric acid diethyl ester hydrochloride:
ohe
117.15117.15
S1798S1798
EtOH / HCIEtOH / HCl
CIHCIH
181.66 g (42,7 mmól) 5-aminovaleriánsavat oldunk kb. 40 ml sósavas etanolban, és szobahőfokon kevertetjük 2-3 órán keresztül. VRK: CHCI3 : MeOH = 4:1, Rf.: 0.3. Ha a kiindulási anyag elfogyott, a reakcióelegyet rotán bepároljuk, a kapott olajos terméket sósavas éterrel kristályosítjuk, szűrjük, éterrel mossuk. Termelés: 85-95%.181.66 g (42.7 mmol) of 5-aminovaleric acid are dissolved in ca. 40 ml of hydrochloric ethanol and stirred at room temperature for 2-3 hours. TRC: CHCl3 : MeOH = 4:1, Rf.: 0.3. When the starting material is consumed, the reaction mixture is evaporated under reduced pressure, the resulting oily product is crystallized with hydrochloric ether, filtered, washed with ether. Yield: 85-95%.
Cbz-Boc-lizin:Cbz-Boc-lysine:
g (17.8 mmól) kiindulási diciklohexilaminsót 2 ekv. cc. H2SO4 és kb. 40 g jég elegyével kevertetjük jeges vizes hűtés mellett 1.5-2 órán keresztül. VRK: CHCI3 : MeOH = 4:1, Rf.: 0.7, a termék és a kiindulási anyag Rp-je megegyezik, jódozva látszik a különbség. A reakcióelegyet etilacetáttal 3-szór extraháljuk, a szerves fázist szárítjuk, bepároljuk. Termelés: gyakorlatilag 100 % ( Mivel az olajos termékről nehéz maradék nélkül az etilacetátot eltávolítani, mindig túlsúlyt mérünk.)g (17.8 mmol) of the starting dicyclohexylamine salt is stirred with a mixture of 2 eq. cc. H2SO4 and ca. 40 g of ice under ice-water cooling for 1.5-2 hours. TRC: CHCI3 : MeOH = 4:1, Rf.: 0.7, the Rp of the product and the starting material are the same, the difference is visible when iodinated. The reaction mixture is extracted 3 times with ethyl acetate, the organic phase is dried and evaporated. Yield: practically 100 % (Since it is difficult to remove ethyl acetate from the oily product without residue, an excess is always measured.)
1. Lépés: Cbz-Boc-lizin kapcsolása 5-aminovaleriánsav dietilészter hidrokloriddalStep 1: Coupling of Cbz-Boc-lysine with 5-aminovaleric acid diethyl ester hydrochloride
6.25 g (16.4 mmól) Cbz-Boc-lizint oldunk 50 ml diklóretánban (HPLC minőségű), hozzáadunk 1,05 ekv. CDI-t és fél órát kevertetjük szobahőmérsékleten (CaCL cső), majd hozzáadunk 2 ekv. trietilamint és 1 ekv. 5-aminovaleriánsav dietilészter hidrokloridot. A reakcióelegyet 12 órán keresztül kevertetjük szobahőmérsékleten. VRK: CHCI3 : MeOH = 4:1, Rf: 0.8. Feldolgozás: extrakció 1-szer 1%-os citromsav vizes oldatával, egyszer 5%-os NaHCCL oldattal és egyszer desztillált vízzel. A szerves fázist szárítjuk, bepároljuk. Termelés: 53-75 %.6.25 g (16.4 mmol) of Cbz-Boc-lysine are dissolved in 50 ml of dichloroethane (HPLC grade), 1.05 eq. of CDI is added and stirred for half an hour at room temperature (CaCL tube), then 2 eq. of triethylamine and 1 eq. of 5-aminovaleric acid diethyl ester hydrochloride are added. The reaction mixture is stirred for 12 hours at room temperature. TLC: CHCl3 : MeOH = 4:1, Rf: 0.8. Workup: extraction 1 time with 1% aqueous citric acid solution, once with 5% NaHCCL solution and once with distilled water. The organic phase is dried and evaporated. Yield: 53-75 %.
2. Lépés: Cbz védőcsoport eltávolításaStep 2: Removal of the Cbz protecting group
4.9 g kiindulási anyagot (1. lépés termékét) oldunk 100 ml etilacetát : etanol 1:1 arányú elegyében, hozzáadunk 4 ekv. ammónium-formiátot és 10 tömeg %-nyi (kiindulási anyagra számolva) palládium csontszenet. A reakcióelegyet 4 órán keresztül refluxoltatjuk. Ha a kiindulási anyag elfogyott, hűtés után a reakcióelegyet celiten átszűrjük, a szűrőréteget diklórmetánnal mossuk, és az összegyűjtött szerves fázisokat bepároljuk. A bepárolt nyersterméket diklórmetánban feloldjuk és egyszer desztillált vízzel kirázzuk, a szerves fázist szárítjuk, bepároljuk.4.9 g of starting material (product of step 1) are dissolved in 100 ml of ethyl acetate:ethanol 1:1, 4 eq. ammonium formate and 10 wt. % (based on starting material) palladium on carbon are added. The reaction mixture is refluxed for 4 hours. When the starting material is consumed, after cooling, the reaction mixture is filtered through celite, the filter pad is washed with dichloromethane, and the collected organic phases are evaporated. The evaporated crude product is dissolved in dichloromethane and extracted with distilled water once, the organic phase is dried and evaporated.
VRK: diklóretán : etanol = 5:1, Rf: 0.2. Termelés: 60-90 %.TLC: dichloroethane:ethanol = 5:1, Rf: 0.2. Yield: 60-90%.
3. Lépés: kapcsolás benzoil-benzoesavvalStep 3: coupling with benzoylbenzoic acid
373.50373.50
S1799S1799
226.23226.23
CDI, DMFCDI, DMF
S0362S0362
162.15162.15
A kiindulási anyagra (második lépés terméke) számított 1 ekv. 4-benzoil-benzoesavat, (ebben az esetben 1.99 g, 8.8 mmól) oldunk 20 ml DMF-ben (jó minőségű, szilikán átszűrt) és hozzáadunk 1.05 ekv. CDI-t. 1 óra keverés után hozzáadunk 3.3 g (8.8 mmól) kiindulási anyagot (második lépés termékét) majd a reakcióelegyet 20 órán keresztül kevertetjük. Feldolgozás: a reakcióelegyet bepároljuk, a kapott nyersterméket diklórmetánban feloldjuk és extraháljuk 1-szer 1%-os citromsav vizes oldatával, egyszer 5%-os NaHCCh oldattal és egyszer deszt.vízzel. A szerves fázist szárítjuk, bepároljuk. VRK: CHC13 : MeOH = 4:1, Rf.: 0.8.1 eq. of 4-benzoylbenzoic acid (in this case 1.99 g, 8.8 mmol) calculated on the starting material (product of the second step) is dissolved in 20 ml of DMF (good quality, filtered through silica) and 1.05 eq. of CDI is added. After 1 hour of stirring, 3.3 g (8.8 mmol) of starting material (product of the second step) is added and the reaction mixture is stirred for 20 hours. Workup: the reaction mixture is evaporated, the resulting crude product is dissolved in dichloromethane and extracted once with 1% aqueous citric acid solution, once with 5% NaHCCl solution and once with distilled water. The organic phase is dried and evaporated. TLC: CHC13 : MeOH = 4:1, Rf .: 0.8.
Termelés: 76 %.Production: 76%.
4. Lépés: Boc védőcsoport eltávolításaStep 4: Removal of the Boc protecting group
g (6.9 mmól) kiindulási anyagot 60 ml 30% trifluorecetsav diklórmetános oldatában kevertetünk szobahőmérsékleten, míg a kiindulási anyag elfogy. VRK: diklóretán : etanol = 5:1, Rf 0.2. Feldolgozás: a reakcióelegyet bepároljuk, desztvízben feloldjuk és kétszer éterrel extraháljuk. Ezután a vizes fázis pH-ját 5%-os K2CO3 oldattal 11-12-re állítjuk majd háromszor kloroformmal extraháljuk. A szerves fázist szárítjuk, bepároljuk. Termelés: 85%.g (6.9 mmol) of starting material was stirred in 60 ml of 30% trifluoroacetic acid in dichloromethane at room temperature until the starting material was consumed. TRC: dichloroethane : ethanol = 5:1, Rf 0.2. Workup: the reaction mixture was concentrated, dissolved in distilled water and extracted twice with ether. Then the pH of the aqueous phase was adjusted to 11-12 with 5% K2CO3 solution and extracted three times with chloroform. The organic phase was dried and concentrated. Yield: 85%.
Megjegyzés: ha a termékből nem folytatjuk a következő lépést, akkor még az első bepárlás után kapott trifluoracetát só formában eltartható bomlás nélkül, s a következő lépés előtt közvetlenül felszabadítható a szabad amin.Note: if the product is not continued to the next step, it can be stored in the form of the trifluoroacetate salt obtained after the first evaporation without decomposition, and the free amine can be released directly before the next step.
5. a. Lépés: kapcsolás biotinnal5. Step a: coupling with biotin
A kiindulási anyagra (előző lépés terméke) számított 0.8 ekv., jelen esetben 1.11 g biotint oldunk 30 ml DMF-ben 80 °C-on majd hozzáadunk 0.8 ekv. (kiindulási anyagra) CDI-t. A reakció elegy et a pezsgés befejeztéig 80 °C-on tartjuk (kb. 10 perc), majd hagyjuk lehűlni s összesen 2 órán keresztül kevertetjük. Ezután hozzáadjuk a kiindulási anyag 30 ml DMF-es oldatát, és a reakcióeleyget további 20 órán keresztül kevertetjük. Feldolgozás: a reakcióelegyet bepároljuk, a maradékot diklórmetánban felszuszpendáljuk, szűrjük, 1-szer diklórmetánnal mossuk, majd 1%-os citromsavval, 5%-os NaHCCb oldattal s végül 2-szer desztvízzel. VRK: CHCI3 : MeOH = 4:1, Rf.: 0.6. Termelés: 50 %.0.8 eq., in this case 1.11 g of biotin, calculated on the starting material (product of the previous step), is dissolved in 30 ml of DMF at 80 °C and then 0.8 eq. (based on starting material) of CDI is added. The reaction mixture is kept at 80 °C until the effervescence stops (approx. 10 minutes), then allowed to cool and stirred for a total of 2 hours. Then 30 ml of DMF solution of the starting material is added and the reaction mixture is stirred for a further 20 hours. Work-up: the reaction mixture is evaporated, the residue is suspended in dichloromethane, filtered, washed once with dichloromethane, then with 1% citric acid, 5% NaHCCb solution and finally twice with distilled water. TLC: CHCl3 : MeOH = 4:1, Rf.: 0.6. Yield: 50%.
5. b. Lépés: kapcsolás danzilkloriddal5. Step b: coupling with dansyl chloride
1.5 g (3.1 mmól) kiindulási anyagot oldunk 20 ml diklóretánban, majd hozzáadunk 2 ekv. trietilamint és 1 ekv. danzilkloridot. A reakció elegy et szobahőmérsékleten kevertetjük több órán keresztül. Ha a kiindulási anyag elfogyott, a reakcióelegyet egyszer 1%-os citromsavval, majd kétszer deszt.vízzel extraháljuk, a szerves fázist szárítjuk, bepároljuk. A terméket n-hexánnal kristályosítjuk. VRK: hexán : etilacetát = 10:1, Rf.: 0.3.1.5 g (3.1 mmol) of starting material is dissolved in 20 ml of dichloroethane, then 2 eq. of triethylamine and 1 eq. of dansyl chloride are added. The reaction mixture is stirred at room temperature for several hours. When the starting material is consumed, the reaction mixture is extracted once with 1% citric acid and then twice with distilled water, the organic phase is dried and evaporated. The product is crystallized from n-hexane. TLC: hexane : ethyl acetate = 10:1, Rf.: 0.3.
Termelés: 80 %.Production: 80%.
6.a. és 6.b. Lépés: hidrolízis6.a. and 6.b. Step: hydrolysis
A következő recept egyaránt jó mind a biotinos mind a danzilos anyagra:The following recipe is equally good for both biotin and dansyl:
Fotomarker egység g kiindulási anyagot 10-15 ml etanolban oldunk és hozzáadunk 2 ekv. IN NaOH oldatot. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten kevertetjük amíg a kiindulási anyag elfogy. VRK: a danzillal szubsztituált származéknál DKE : EtOH = 5:1, a biotinnal szubsztituált származék esetében: CHCI3 : MeOH = 4:1. Feldolgozás: a reakcióelegyről az etanolt rotán lepároljuk, majd 5%os sósavval megsavanyítjuk. A kivált kristályokat szűrjük, vízzel mossuk.Photomarker unit g starting material is dissolved in 10-15 ml ethanol and 2 eq. IN NaOH solution is added. The reaction mixture is stirred at room temperature until the starting material is consumed. VRK: for the dansyl-substituted derivative DKE : EtOH = 5:1, for the biotin-substituted derivative: CHCI3 : MeOH = 4:1. Workup: the ethanol is evaporated from the reaction mixture on a rotary evaporator, then acidified with 5% hydrochloric acid. The precipitated crystals are filtered and washed with water.
Termelés: 90 %.Production: 90%.
. példaexample
Aminok kapcsolása a benzofenon-biotin egységhezCoupling of amines to the benzophenone-biotin unit
Az un. benzofenon-biotin fotomarker egységet 80 °C-on DMF ben oldjuk (0.2 mmólt 2-3 ml-ben) majd hozzáadunk 1 ekv. CDI-t és egy órán keresztül kevertetjük, közben a reakcióelegyet hagyjuk kihűlni. Ezután hozzáadunk 1 ekv. primer vagy szekunder amin reagenst, és 20 órán keresztül szobahőfokon kevertetjük. Ezután a reakcióelegyet bepároljuk, a maradékot felvesszük kloroformban amit 1%-os citromsavval, 5%-os NaHCCh oldattal majd desztvízzel extrahálunk. A szerves fázist szárítjuk, bepároljuk. További tisztítást preparatív HPLC-vel végzünk.The so-called benzophenone-biotin photomarker unit is dissolved in DMF at 80 °C (0.2 mmol in 2-3 ml) then 1 eq. CDI is added and stirred for one hour, while the reaction mixture is allowed to cool. Then 1 eq. primary or secondary amine reagent is added and stirred for 20 hours at room temperature. Then the reaction mixture is evaporated, the residue is taken up in chloroform which is extracted with 1% citric acid, 5% NaHCCl solution and then distilled water. The organic phase is dried and evaporated. Further purification is carried out by preparative HPLC.
.példa.example
Aminok kapcsolása a benzofenon-danzil egységhezCoupling of amines to the benzophenone-danzyl unit
Az un. benzofenon-danzil fotomarker egységet diklóretánban oldjuk (0.2 mmólt 2-3 miben) majd hozzáadunk 1 ekv. CDI-t és egy órán keresztül kevertetjük. Ezután hozzáadunk 1 ekv. primer vagy szekunder amin reagenst, és 20 órán keresztül szobahőfokon kevertetjük. Ezután a reakcióelegyet diklórmetánnal rázótölcsérbe mossuk és 1%-os citromsavval, 5%-os NaHCCh oldattal majd deszt.vízzel extraháljuk. A szerves fázist szárítjuk, bepároljuk. További tisztítást preparatív HPLC-vel végzünk.The so-called benzophenone-danzyl photomarker unit is dissolved in dichloroethane (0.2 mmol in 2-3 ml) then 1 eq. CDI is added and stirred for one hour. Then 1 eq. primary or secondary amine reagent is added and stirred for 20 hours at room temperature. Then the reaction mixture is washed with dichloromethane in a separatory funnel and extracted with 1% citric acid, 5% NaHCCl solution and distilled water. The organic phase is dried and evaporated. Further purification is carried out by preparative HPLC.
.példa.example
Tetherálási receptekTethering recipes
1. Aminok kapcsolása 6-Boc-aminokapronsavval1. Coupling of amines with 6-Boc-aminocaproic acid
+ R2 R1+ R2 R1
CDICDI
OHE
I R2 mmol 231 mg 6-boc-aminokapronsavat 5 ml diklóretánban (Romil SPS tisztaságú) oldunk majd hozzáadunk 1.05 mmol 170,1 mg 1,1-karbonil-diimidazolt. A pezsgés befejeződése után (kb.0.5-1 h) hozzáadunk 1.05 eqv. amint. A reakció előrehaladását vékonyréteg kromatográfiásan dikóretán : etanol 5:1 elegyben követjük majd jódban előhívjuk. Ha a reakció lement a reakcióelegyet extraháljuk 3%-os HC1 oldattal, 5%-os NaiCOs oldattal, majd vízzel. Az anyag tisztaságát vékonyréteg kromatográfiával ellenőrizzük. Szükség esetén az extrakciót megismételjük. A szerves fázist bepároljuk majd továbbvisszük a következő lépésre.I R2 mmol 231 mg 6-boc-aminocaproic acid is dissolved in 5 ml dichloroethane (Romil SPS purity) and then 1.05 mmol 170.1 mg 1,1-carbonyldiimidazole is added. After the effervescence has ceased (ca. 0.5-1 h) 1.05 eqv. amine is added. The progress of the reaction is monitored by thin layer chromatography in a 5:1 mixture of dichloroethane:ethanol and then developed in iodine. If the reaction has subsided, the reaction mixture is extracted with 3% HCl solution, 5% NaiCOs solution and then water. The purity of the substance is checked by thin layer chromatography. If necessary, the extraction is repeated. The organic phase is evaporated and then carried forward to the next step.
2. Védőcsoport hasítás2. Protecting group cleavage
TFATFA
OHE
I R2I R2
Az előző lépésben kapott Boc védett aminosavamidot 2 ml diklórmetánban oldjuk. Jeges vízben hűtjük és a diklórmetánnal azonos mennyiségű trifluorecetsavat csepegtetünk bele. A reakció előrehaladását vékonyréteg kromatográfiásan diklóretán-etanol 5:1 elegyben követjük Ha a kiindulási anyag elfogyott (kb. 1 h) a reakcióelegyet rotadeszten bepároljuk, vízben felvesszük, éterrel extraháljuk a kiindulási anyag esetleges maradékát, a vizes fázist 20%-os nátrium-karbonát oldattal lúgosítjuk majd diklórmetánnal kiextraháljuk a terméket. A szerves fázist magnézium szulfáton szárítjuk majd rotadeszten bepároljuk.The Boc-protected amino acid amide obtained in the previous step is dissolved in 2 ml of dichloromethane. It is cooled in ice water and an equal amount of trifluoroacetic acid is added dropwise to it. The progress of the reaction is monitored by thin layer chromatography in a 5:1 mixture of dichloroethane and ethanol. When the starting material is consumed (about 1 h), the reaction mixture is concentrated on a rotary evaporator, taken up in water, any remaining starting material is extracted with ether, the aqueous phase is basified with 20% sodium carbonate solution and the product is extracted with dichloromethane. The organic phase is dried over magnesium sulfate and concentrated on a rotary evaporator.
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU0202212AHUP0202212A2 (en) | 2002-07-10 | 2002-07-10 | Novel protein marker combinatorial libraries, process for their preparation and their use |
| PCT/HU2003/000056WO2004008151A2 (en) | 2002-07-10 | 2003-07-09 | New combinatorial peptide libraries containing markers and methods for their preparation and utilization |
| AU2003251072AAU2003251072A1 (en) | 2002-07-10 | 2003-07-09 | New combinatorial peptide libraries containing markers and methods for their preparation and utilization |
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU0202212AHUP0202212A2 (en) | 2002-07-10 | 2002-07-10 | Novel protein marker combinatorial libraries, process for their preparation and their use |
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU0202212D0 HU0202212D0 (en) | 2002-09-28 |
| HUP0202212A2true HUP0202212A2 (en) | 2004-04-28 |
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0202212AHUP0202212A2 (en) | 2002-07-10 | 2002-07-10 | Novel protein marker combinatorial libraries, process for their preparation and their use |
| Country | Link |
|---|---|
| AU (1) | AU2003251072A1 (en) |
| HU (1) | HUP0202212A2 (en) |
| WO (1) | WO2004008151A2 (en) |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2004206856B9 (en)* | 2003-01-16 | 2006-11-02 | Caprotec Bioanalytics Gmbh | Capture compounds, collections thereof and methods for analyzing the proteome and complex compositions |
| CN116354898B (en)* | 2023-03-14 | 2025-08-29 | 兰州大学 | A trifunctional probe based on photocrosslinking groups and its preparation method and application |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HU9201687D0 (en)* | 1992-05-21 | 1992-08-28 | Arpad Furka | Preparation of sets from peptid mixtures with polycomponents and their use for the identification of biologically active peptides |
| CA2143848C (en)* | 1992-10-01 | 2007-09-11 | W. Clark Still | Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags |
| AR020101A1 (en)* | 1998-07-01 | 2002-04-10 | Cancerforskingsfonden Af 1989 | A PEPTIDE ANTAGONIST OF THE HUMAN UROQUINASE RECEPTOR, PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING HIM, ITS USE FOR THE MANUFACTURE OF A MEDICINAL PRODUCT AND METHODOPARA TO SELECT AN ADEQUATE PEPTIDE ANTAGONIST. |
| SE0200968D0 (en)* | 2002-03-26 | 2002-03-26 | Lars Baltzer | Novel polypeptide scaffolds and use thereof |
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2004008151A2 (en) | 2004-01-22 |
| HU0202212D0 (en) | 2002-09-28 |
| WO2004008151A3 (en) | 2004-07-29 |
| AU2003251072A1 (en) | 2004-02-02 |
| AU2003251072A8 (en) | 2004-02-02 |
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20200124613A1 (en) | Single molecule peptide sequencing | |
| ES2389510T3 (en) | Mass markers | |
| EP1588173B1 (en) | Affinity fishing for ligands and proteins receptors | |
| CZ217698A3 (en) | Reaction process monitoring | |
| US12379381B2 (en) | Single molecule peptide sequencing | |
| CA3117476A1 (en) | Solid-phase n-terminal peptide capture and release | |
| CA2187792A1 (en) | Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags | |
| US6503759B1 (en) | Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags | |
| WO2002099078A2 (en) | Functional proteomic profiling | |
| JP2011039067A (en) | Manufacturing method of mass coded combinatorial library | |
| CN119790193A (en) | Determining protein information by recoding amino acid polymers into DNA polymers | |
| EP3384041B1 (en) | Method for identification of protease substrates | |
| EP1119529B1 (en) | Chemical constructs | |
| US20040235054A1 (en) | Novel encoding method for "one-bead one-compound" combinatorial libraries | |
| HUP0202212A2 (en) | Novel protein marker combinatorial libraries, process for their preparation and their use | |
| CA2449942A1 (en) | Characterising polypeptides | |
| JP2004513120A (en) | Tagged compounds and methods of use in AIDA libraries | |
| WO2000020112A2 (en) | Chemical constructs and their uses | |
| US20060134697A1 (en) | Method of preparing coded compound libraries | |
| US20050101763A1 (en) | Synthesis of photolabile 2-(2-nitrophenyl)propyloxycarbonyl protected amino acids | |
| US20100099831A1 (en) | Solid phase immobilized trifunctional linker | |
| KR101632062B1 (en) | Thiol derivatives of biotin and method for analysing substrate specificity of serine/threonine kinase | |
| WO2001025171A1 (en) | Chemical constructs | |
| JP4679870B2 (en) | Kinase activity detection method | |
| US20070141724A1 (en) | Solid phase immobilized trifunctional linker |