Le maintien du contrôle des réponses immunitaires à médiation cellulaire et humorales est une dimension importante de l'activité d'un système immunitaire sain. La régulation anormale des réactions immunitaires induites par les lymphocytes T et les lymphocytes B a été associée à un large éventail de maladies humaines, car l'augmentation inappropriée d'une réponse immunitaire contre divers autoantigènes (de l’anglais « self antigens ») et antigènes étrangers joue un rôle causal dans des pathologies telles que les troubles auto-immuns, l'asthme, les réactions allergiques, maladie du greffon contre l'hôte (GvHD, de l’anglais « graft versus host disease »), le rejet d’un greffon de transplantation et une variété d'autres troubles immunologiques incluant le cancer.Maintaining control of cell-mediated and humoral immune responses is an important dimension of healthy immune system activity. Abnormal regulation of T-cell and B-cell-mediated immune responses has been associated with a wide range of human diseases, as inappropriate augmentation of an immune response against various self antigens and foreign antigens plays a causal role in conditions such as autoimmune disorders, asthma, allergic reactions, graft-versus-host disease (GvHD), transplant rejection, and a variety of other immunological disorders including cancer.
Ces maladies sont médiées par les lymphocytes T et B qui font preuve d’une réactivité contre les autoantigènes et ceux dérivés de sources non menaçantes, telles que les allergènes ou les allogreffes de transplantation. Les lymphocytes T régulateurs (Tregs) ont évolué pour inhiber l'activité des cellules immunitaires qui réagissent de manière croisée avec les protéines du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) « du soi » (de l’anglais « self ») et d'autres antigènes bénins. Les populations de Tregs les mieux connues sont les Tregs CD4+, CD25+, FoxP3+ et les Tregs CD17+.These diseases are mediated by T and B lymphocytes that exhibit reactivity against autoantigens and those derived from nonthreatening sources, such as allergens or transplant allografts. Regulatory T cells (Tregs) have evolved to inhibit the activity of immune cells that cross-react with self major histocompatibility complex (MHC) proteins and other benign antigens. The best-known Treg populations are CD4+, CD25+, FoxP3+, and CD17+ Tregs.
Les sous-types 1 et 2 du récepteur du facteur de nécrose tumorale (TNFR, de l’anglais « Tumor Necrosis Factor Receptor ») ont été identifiés spécifiquement sur la surface des Tregs. L'activation du TNFR1 par le TNF-alpha soluble amplifie la cascade de signalisation par la caspase conduisant à l'apoptose des Treg. D'autre part, l'activation du TNFR2 par le TNF-alpha principalement lié à la membrane induit une signalisation par la voie de signalisation à protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK, de l’anglais « Mitogen Activated Protein Kinase »), qui orchestre la transcription médiée par TRAF2/3 et NF-κB des gènes qui favorisent la prolifération cellulaire et échappent à l'apoptose.Tumor necrosis factor receptor (TNFR) subtypes 1 and 2 have been identified specifically on the surface of Tregs. Activation of TNFR1 by soluble TNF-alpha amplifies the caspase signaling cascade leading to Treg apoptosis. On the other hand, activation of TNFR2 by predominantly membrane-bound TNF-alpha induces signaling through the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway, which orchestrates TRAF2/3- and NF-κB-mediated transcription of genes that promote cell proliferation and escape apoptosis.
L'importance du rôle du TNFR2 dans la prolifération et la fonction des Treg a été démontrée dans diverses études. Les souris déficientes en TNFR2 ont montré des nombres réduits de Tregs thymiques et périphériques (2013_Chen X, et al. PMID: 23277487), et les Tregs TNFR2 -/- n'ont pas été capables de contrôler la réponse inflammatoire in vivo (2008_Van Mierlo GJ, et al. PMID: 18292492). Chez l'humain, il a été démontré que les Treg expriment un niveau plus élevé de TNFR2 que les lymphocytes effecteurs T (2013_Okubo Y, et al. PMID: 24193319 & 2002_ Annunziato F, et al. PMID: 12163566) et les Tregs TNFR2+ ont manifesté la suppression la plus puissante de la prolifération et de la production de cytokines des lymphocytes répondeurs T cocultivés (en anglais « co-cultured T-responder cells ») (2010_Chen X, et al. PMID: 20127680). De plus, il a été démontré que TNFR2 joue un rôle dans la carcinogenèse et la croissance tumorale en médiant les réponses TNF dans les cellules immunosuppressives, permettant l'évasion immunitaire et le développement tumoral (Sheng Y., et al. doi: 10.3389/fimmu.2018.01170).The importance of TNFR2 in Treg proliferation and function has been demonstrated in various studies. TNFR2-deficient mice showed reduced numbers of thymic and peripheral Tregs (2013_Chen X, et al. PMID: 23277487), and TNFR2 -/- Tregs were unable to control the inflammatory response in vivo (2008_Van Mierlo GJ, et al. PMID: 18292492). In humans, Tregs have been shown to express higher levels of TNFR2 than effector T cells (2013_Okubo Y, et al. PMID: 24193319 & 2002_Annunziato F, et al. PMID: 12163566) and TNFR2+ Tregs exhibited the most potent suppression of proliferation and cytokine production of co-cultured T-responder cells (2010_Chen X, et al. PMID: 20127680). Furthermore, TNFR2 has been shown to play a role in carcinogenesis and tumor growth by mediating TNF responses in immunosuppressive cells, enabling immune evasion and tumor development (Sheng Y., et al. doi: 10.3389/fimmu.2018.01170).
De plus, dans les maladies auto-immunes affectant le système nerveux central (SNC), en particulier la sclérose en plaques (SEP), des lymphocytes pathogènes sont générés en périphérie pour infiltrer le SNC et provoquer des inflammations locales et une démyélinisation. La démyélinisation est l'endommagement de la couche protectrice (gaine de myéline) qui entoure les fibres nerveuses dans le cerveau. Protéger contre la démyélinisation ou l'inverser sont des stratégies explorées pour lutter contre la SEP. De manière intéressante, plusieurs études ont rapporté l'implication du TNFR2 dans la neuroprotection. Par exemple, dans un modèle murin de démyélinisation induit par la cuprizone, il a été démontré que le TNFR2 est essentiel à la régénération des oligodendrocytes, les cellules principalement responsables du maintien et de la génération de la gaine de myéline qui entoure les axones, alors que la signalisation du TNF via TNFR1 favorisait la démyélinisation des nerfs (2001_HA Arnett, et al. PMID: 11600888).Moreover, in autoimmune diseases affecting the central nervous system (CNS), particularly multiple sclerosis (MS), pathogenic lymphocytes are generated peripherally to infiltrate the CNS and cause local inflammation and demyelination. Demyelination is the damage of the protective layer (myelin sheath) that surrounds nerve fibers in the brain. Protecting against or reversing demyelination are strategies explored to combat MS. Interestingly, several studies have reported the involvement of TNFR2 in neuroprotection. For example, in a mouse model of cuprizone-induced demyelination, TNFR2 was shown to be essential for the regeneration of oligodendrocytes, the cells primarily responsible for maintaining and generating the myelin sheath that surrounds axons, whereas TNF signaling via TNFR1 promoted nerve demyelination (2001_HA Arnett, et al. PMID: 11600888).
En raison de son rôle dans la direction de la survie et de la croissance des cellules, le TNFR2 représente une cible attrayante pour le traitement de maladies telles que les maladies auto-immunes, la GvHD, le rejet d'allogreffe, les réactions allergiques, l’asthme et le cancer.Due to its role in directing cell survival and growth, TNFR2 represents an attractive target for the treatment of diseases such as autoimmune diseases, GvHD, allograft rejection, allergic reactions, asthma, and cancer.
AFFIMER®, développé par Avacta Life Sciences Limited, est une petite molécule protéique stable d’ingénierie basée sur une protéine stéfine A (en anglais « stefin A »), qui est une protéine in vivo. AFFIMER® comprend deux courtes séquences peptidiques ayant une séquence aléatoire et une séquence N-terminale, et est capable de se lier à un matériau cible avec une affinité et une spécificité élevées d'une manière similaire à un anticorps monoclonal. AFFIMER® montre une affinité et une spécificité de liaison remarquablement améliorées par rapport à la bibliothèque de peptides libres, et a une très petite taille et une stabilité élevée par rapport aux anticorps, et fait donc l'objet d'une grande attention en tant que plateforme pharmaceutique alternative de prochaine génération pour remplacer les anticorps (Brevets US n° 9447170, 8853131, etc.).AFFIMER®, developed by Avacta Life Sciences Limited, is a stable engineered small molecule protein based on stefin A protein, which is an in vivo protein. AFFIMER® comprises two short peptide sequences having a random sequence and an N-terminal sequence, and is capable of binding to a target material with high affinity and specificity in a manner similar to a monoclonal antibody. AFFIMER® shows remarkably improved binding affinity and specificity compared with the free peptide library, and has a very small size and high stability compared with antibodies, and thus has received great attention as a next-generation alternative pharmaceutical platform to replace antibodies (US Patent Nos. 9,447,170, 8,853,131, etc.).
La présente invention concerne des polypeptides qui se lient spécifiquement au TNFR2 par ingénierie de la protéine naturelle stéfine A, aboutissant au développement de polypeptides AFFIMER® capables de se lier au TNFR2 avec d’excellentes affinité et spécificité.The present invention relates to polypeptides that specifically bind to TNFR2 by engineering the natural protein stefin A, resulting in the development of AFFIMER® polypeptides capable of binding to TNFR2 with excellent affinity and specificity.
Dans un aspect, il est proposé un polypeptide d’ingénierie qui se lie spécifiquement au TNFR2 avec une Kd de 1×10-6M ou moins, le polypeptide d’ingénierie étant une variante d'une protéine Stéfine A.In one aspect, there is provided an engineered polypeptide that specifically binds to TNFR2 with a Kd of 1×10-6 M or less, the engineered polypeptide being a variant of a Stefin A protein.
Dans un autre aspect, il est proposé une protéine de fusion comprenant un dimère, un trimère ou un tétramère des polypeptides d’ingénierie de l'invention, comprenant optionnellement un ou plusieurs lieurs.In another aspect, there is provided a fusion protein comprising a dimer, trimer or tetramer of the engineered polypeptides of the invention, optionally comprising one or more linkers.
Dans un autre aspect, il est proposé une protéine de fusion comprenant un ou plus des polypeptides d’ingénierie de l'invention liés à un groupement thérapeutique ou diagnostique.In another aspect, there is provided a fusion protein comprising one or more of the engineered polypeptides of the invention linked to a therapeutic or diagnostic moiety.
Dans un autre aspect, il est fourni un polynucléotide ou un ensemble de polynucléotides codant pour le polypeptide d’ingénierie ou la protéine de fusion de l'invention.In another aspect, there is provided a polynucleotide or set of polynucleotides encoding the engineered polypeptide or fusion protein of the invention.
Dans un aspect, il est proposé un véhicule de distribution comprenant le polynucléotide de l'invention.In one aspect, there is provided a delivery vehicle comprising the polynucleotide of the invention.
Dans un autre aspect, il est proposé un plasmide ou un minicercle comprenant le polynucléotide de l'invention.In another aspect, there is provided a plasmid or minicircle comprising the polynucleotide of the invention.
Dans un autre aspect, il est proposé un ARN messager (ARNm) comprenant un cadre de lecture ouvert codant pour le polypeptide d’ingénierie de l'invention.In another aspect, there is provided a messenger RNA (mRNA) comprising an open reading frame encoding the engineered polypeptide of the invention.
Dans un aspect, il est proposé une nanoparticule lipidique, optionnellement une nanoparticule lipidique cationique, comprenant l'ARNm de l'invention.In one aspect, there is provided a lipid nanoparticle, optionally a cationic lipid nanoparticle, comprising the mRNA of the invention.
Dans un autre aspect il est proposé une composition pharmaceutique comprenant le polypeptide d’ingénierie, la protéine de fusion ou le véhicule de distribution selon l'invention, et optionnellement un excipient pharmaceutiquement acceptable.In another aspect there is provided a pharmaceutical composition comprising the engineered polypeptide, fusion protein or delivery vehicle according to the invention, and optionally a pharmaceutically acceptable excipient.
Dans un aspect, il est proposé un conjugué comprenant le polypeptide d’ingénierie ou la protéine de fusion selon l'invention liée à un groupement pharmacologiquement actif.In one aspect, there is provided a conjugate comprising the engineered polypeptide or fusion protein of the invention linked to a pharmacologically active moiety.
Dans un autre aspect, il est fourni un procédé comprenant l'administration à un sujet de la composition pharmaceutique de l'invention.In another aspect, there is provided a method comprising administering to a subject the pharmaceutical composition of the invention.
Dans un aspect il est proposé un polypeptide d’ingénierie, une protéine de fusion ou un véhicule de distribution de l'invention pour utilisation en tant que médicament.In one aspect there is provided an engineered polypeptide, fusion protein or delivery vehicle of the invention for use as a medicament.
Dans un autre aspect, il est proposé un polypeptide d’ingénierie qui entre en concurrence pour la liaison au TNFR2 avec un polypeptide d’ingénierie selon l'invention.In another aspect, there is provided an engineered polypeptide that competes for binding to TNFR2 with an engineered polypeptide according to the invention.
Dans un autre aspect, il est proposé un polypeptide d’ingénierie qui se lie au même épitope sur TNFR2 que celui d'un polypeptide d’ingénierie selon l'invention.In another aspect, there is provided an engineered polypeptide that binds to the same epitope on TNFR2 as an engineered polypeptide according to the invention.
AFFIMER®AFFIMER®
Les polypeptides de stéfine englobent un sous-groupe de protéines dans la superfamille de la cystatine, une famille qui englobe des protéines qui contiennent de multiples séquences de type cystatine. Le sous-groupe Stéfine (en anglais « Stefin ») de la famille des cystatines inclut des protéines à domaine unique relativement petites (environ 100 acides aminés). Elles ne subissent aucune modification post-traductionnelle connue et sont dépourvues de liaisons disulfure, ce qui suggère qu'elles seront capables de se replier de manière identique dans une large gamme d'environnements extracellulaires et intracellulaires. La Stéfine A elle-même est une protéine monomérique, à chaîne unique et à domaine unique de 98 acides aminés. La structure de Stéfine A a été déterminée, facilitant la mutation rationnelle de la Stéfine A en le polypeptide AFFIMER®. La seule activité biologique connue des cystatines est l'inhibition de l'activité des cathepsines, ce qui a permis de tester de manière exhaustive l'activité biologique résiduelle des protéines d’ingénierie.Stefin polypeptides comprise a subgroup of proteins within the cystatin superfamily, a family that encompasses proteins that contain multiple cystatin-like sequences. The Stefin subgroup of the cystatin family includes relatively small (approximately 100 amino acids), single-domain proteins. They undergo no known post-translational modifications and lack disulfide bonds, suggesting that they will be able to fold identically in a wide range of extracellular and intracellular environments. Stefin A itself is a monomeric, single-chain, single-domain protein of 98 amino acids. The structure of Stefin A has been determined, facilitating the rational mutation of Stefin A into the AFFIMER® polypeptide. The only known biological activity of cystatins is inhibition of cathepsin activity, which allowed exhaustive testing of the residual biological activity of the engineered proteins.
Un « polypeptide AFFIMER® » (également appelé ici une « protéine AFFIMER® ») fait référence à une petite protéine très stable qui est une variante d’ingénierie d'un polypeptide de Stéfine. Les protéines AFFIMER® présentent deux boucles peptidiques et une séquence N-terminale qui peuvent toutes être randomisées pour se lier aux protéines cibles souhaitées avec une affinité et une spécificité élevées, d’une manière similaire aux anticorps monoclonaux. La stabilisation des deux peptides par l'échafaudage protéique de la Stéfine A limite les conformations possibles que les peptides peuvent prendre, augmentant l'affinité et la spécificité de liaison par rapport aux bibliothèques de peptides libres. Ces protéines de liaison non anticorps d’ingénierie sont conçues pour imiter les caractéristiques de reconnaissance moléculaire des anticorps monoclonaux dans différentes applications. Des variations d'autres parties de la séquence polypeptidique de Stéfine A peuvent être effectuées, de telles variations améliorant les propriétés de ces réactifs d'affinité, permettant par exemple une augmentation de la stabilité, de les rendre robustes sur une plage de températures et de pH, etc. Dans certains modes de réalisation, un polypeptide AFFIMER® inclut une séquence dérivée de Stéfine A, partageant une identité substantielle avec une séquence de type sauvage de Stéfine A, telle que la Stéfine A humaine. Il apparaîtra à une personne du métier que des modifications peuvent être apportées à la séquence d'échafaudage sans s'écarter de la divulgation. En particulier, un polypeptide AFFIMER® peut avoir une séquence d'acides aminés qui est au moins à 25%, 35%, 45%, 55% ou 60% d'identité avec les séquences correspondantes à la Stéfine A humaine, par exemple au moins 70%, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 92 %, au moins 94 %, au moins 95 % identiques, par ex. lorsque les variations de séquence n'affectent pas négativement la capacité de l'échafaudage à se lier à la cible souhaitée (telle que TFNR2), et par ex. qui ne restaurent pas ou ne génèrent pas de fonctions biologiques telles que celles qui sont possédées par la Stéfine A de type sauvage mais qui sont abolies dans les modifications mutationnelles décrites ici.An “AFFIMER® polypeptide” (also referred to herein as an “AFFIMER® protein”) refers to a small, highly stable protein that is an engineered variant of a Stefin polypeptide. AFFIMER® proteins feature two peptide loops and an N-terminal sequence that can all be randomized to bind to desired target proteins with high affinity and specificity, in a manner similar to monoclonal antibodies. The stabilization of the two peptides by the Stefin A protein scaffold limits the possible conformations that the peptides can assume, increasing binding affinity and specificity compared to free peptide libraries. These engineered non-antibody binding proteins are designed to mimic the molecular recognition characteristics of monoclonal antibodies in a variety of applications. Variations of other portions of the Stefin A polypeptide sequence may be made, such variations improving the properties of these affinity reagents, such as increasing stability, making them robust over a range of temperatures and pH, etc. In some embodiments, an AFFIMER® polypeptide includes a sequence derived from Stefin A, sharing substantial identity with a wild-type Stefin A sequence, such as human Stefin A. It will be apparent to one skilled in the art that modifications may be made to the scaffold sequence without departing from the disclosure. In particular, an AFFIMER® polypeptide may have an amino acid sequence that is at least 25%, 35%, 45%, 55% or 60% identical to the sequences corresponding to human Stefin A, e.g. at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 92%, at least 94%, at least 95% identical, e.g. where the sequence variations do not adversely affect the ability of the scaffold to bind to the desired target (such as TFNR2), and e.g. which do not restore or generate biological functions such as those possessed by wild-type Stefin A but which are abolished in the mutational changes described herein.
Un « agent AFFIMER® » fait référence à un polypeptide qui inclut une séquence polypeptidique AFFIMER® et toute(s) autre(s) modification(s) (par ex. conjugaison, modifications post-traductionnelles, etc.) de manière à représenter une protéine thérapeutiquement active destinée à être délivrée à un individu.An “AFFIMER® agent” refers to a polypeptide that includes an AFFIMER® polypeptide sequence and any other modification(s) (e.g., conjugation, post-translational modifications, etc.) so as to represent a therapeutically active protein for delivery to an individual.
Un « conjugué lié à AFFIMER® » fait référence à un agent AFFIMER® ayant au moins un groupement qui lui est conjugué par l’intermédiaire d’une conjugaison chimique autre que par la formation d'une liaison peptidique contiguë via le C-terminus ou N-terminus de la partie polypeptidique de l’agent AFFIMER® contenant la séquence polypeptidique d’AFFIMER®. Un conjugué lié à AFFIMER® peut être un « conjugué AFFIMER®-médicament », qui fait référence à un agent AFFIMER® incluant au moins un groupement pharmacologiquement actif conjugué à celui-ci. Un conjugué lié à AFFIMER® peut également être un « conjugué AFFIMER®-étiquette », qui fait référence à un agent AFFIMER® incluant au moins un groupement détectable (par ex. une étiquette détectable) conjugué à celui-ci.An “AFFIMER®-linked conjugate” refers to an AFFIMER® agent having at least one moiety conjugated thereto via chemical conjugation other than by formation of a contiguous peptide bond via the C-terminus or N-terminus of the polypeptide portion of the AFFIMER® agent containing the AFFIMER® polypeptide sequence. An AFFIMER®-linked conjugate may be an “AFFIMER®-drug conjugate,” which refers to an AFFIMER® agent including at least one pharmacologically active moiety conjugated thereto. An AFFIMER®-linked conjugate may also be an “AFFIMER®-label conjugate,” which refers to an AFFIMER® agent including at least one detectable moiety (e.g., a detectable label) conjugated thereto.
Un « polynucléotide AFFIMER® codé » fait référence à une construction d'acide nucléique qui, lorsqu'elle est introduite dans et exprimée par des cellules, produit un agent AFFIMER® envisagé.An “AFFIMER®-encoded polynucleotide” refers to a nucleic acid construct that, when introduced into and expressed by cells, produces an intended AFFIMER® agent.
TNFR2TNFR2
Le récepteur 2 du facteur de nécrose tumorale (« TNFR2 », de l’anglais « Tumour necrosis factor receptor 2 »), ainsi que le récepteur 1 du facteur de nécrose tumorale (TNFR1), est un récepteur lié à la membrane de Type 1 qui se lie au facteur de nécrose tumorale alpha (« TNFα »). TNFR2, également connu sous le nom de p75, TNF Receptor Superfamily Member 1B ou CD120b, est codé chez l’humain sous le nom de TNFRSF1B qui exprime une protéine de 48 kDa de 461 acides aminés de longueur (UniProt P20333). Chez la souris, la protéine TNFR2 a une longueur de 474 acides aminés et une masse de 50 kDa.Tumor necrosis factor receptor 2 (“TNFR2”), also known as tumor necrosis factor receptor 1 (TNFR1), is a Type 1 membrane-bound receptor that binds to tumor necrosis factor alpha (“TNFα”). TNFR2, also known as p75, TNF Receptor Superfamily Member 1B or CD120b, is encoded in humans as TNFRSF1B which expresses a 48 kDa protein of 461 amino acids in length (UniProt P20333). In mice, the TNFR2 protein is 474 amino acids in length and has a mass of 50 kDa.
Un « agent TFNR2 AFFIMER® » fait référence à un agent AFFIMER® qui comprend au moins un polypeptide AFFIMER® qui se lie au TFNR2, en particulier le TFNR2 humain et optionnellement le TNFR2 de cynomolgus, avec une constante de dissociation (Kd) d'au moins 10-6M. Dans certains modes de réalisation, l'agent TFNR2 AFFIMER® lie le TFNR2 à un Kd de 1×10−7M ou moins, un Kd de 1×10−8M ou moins, un Kd de 1×10−9M ou moins, ou un Kd de 1×10−10M ou moins. Il doit être compris que les termes « polypeptide TFNR2 AFFIMER® », « protéine TFNR2 AFFIMER® » et « variante d’ingénierie de polypeptide de Stéfine A de liaison au TFNR2 » sont utilisés ici de manière interchangeable. Ainsi, un « polypeptide TFNR2 AFFIMER® » est un polypeptide d’ingénierie qui se lie spécifiquement au TFNR2 avec un Kd de 1 x 10-6M ou moins, dans lequel le polypeptide d’ingénierie est une variante d'une protéine Stéfine A.A “TFNR2 AFFIMER® agent” refers to an AFFIMER® agent that comprises at least one AFFIMER® polypeptide that binds to TFNR2, particularly human TFNR2 and optionally cynomolgus TNFR2, with a dissociation constant (Kd) of at least 10-6 M. In some embodiments, the TFNR2 AFFIMER® agent binds TFNR2 at a Kd of 1×10−7M or less, a Kd of 1×10−8M or less, a Kd of 1×10−9M or less, or a Kd of 1×10−10M or less. It is to be understood that the terms “TFNR2 AFFIMER® polypeptide,” “TFNR2 AFFIMER® protein,” and “engineered variant of TFNR2-binding Stefin A polypeptide” are used interchangeably herein. Thus, a “TFNR2 AFFIMER® polypeptide” is an engineered polypeptide that specifically binds to TFNR2 with a Kd of 1 x 10-6 M or less, wherein the engineered polypeptide is a variant of a Stefin A protein.
PolypeptidesPolypeptides
Les polypeptides (qui incluent les peptides et les protéines) sont des polymères d'acides aminés de n'importe quelle longueur. Le polymère peut être linéaire ou ramifié, il peut comprendre des acides aminés modifiés, et il peut être interrompu par des acides non aminés. Les termes englobent également un polymère d'acides aminés qui a été modifié naturellement ou par intervention ; par exemple, par formation de liaisons disulfure, glycosylation, lipidation, acétylation, phosphorylation, ou toute autre manipulation ou modification, telle qu’une conjugaison avec un composant de marquage. Sont également inclus dans la définition, par exemple, des polypeptides contenant au moins un analogue d'un acide aminé (y compris, par exemple, des acides aminés non naturels), ainsi que d'autres modifications connues dans le métier.Polypeptides (which include peptides and proteins) are polymers of amino acids of any length. The polymer may be linear or branched, may include modified amino acids, and may be interrupted by non-amino acids. The terms also encompass an amino acid polymer that has been modified naturally or by intervention; for example, by disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation, or other manipulation or modification, such as conjugation with a labeling component. Also included within the definition are, for example, polypeptides containing at least one analogue of an amino acid (including, for example, non-naturally occurring amino acids), as well as other modifications known in the art.
Les acides aminés (également appelés ici résidus d'acides aminés) participent à une ou plus liaisons peptidiques d'un polypeptide. De manière générale, les abréviations utilisées ici pour désigner les acides aminés sont basées sur les recommandations de la Commission IUPAC-IUB sur la Nomenclature Biochimique (voir Biochemistry (1972) 11:1726-1732). Par exemple, Met, Ile, Leu, Ala et Gly représentent des "résidus" de méthionine, isoleucine, leucine, alanine et glycine, respectivement. Par résidu, on entend un radical dérivé de l'acide α-aminé correspondant en éliminant la partie OH du groupe carboxyle et la partie H du groupe α-amino. Le terme "chaîne latérale d'acide aminé" est la partie d'un acide aminé à l'exclusion de la partie -CH(NH2)COOH, tel que défini par K. D. Kopple, "Peptides and Amino Acids", W. A. Benjamin Inc., New York et Amsterdam, 1966, pages 2 et 33.Amino acids (also referred to herein as amino acid residues) participate in one or more peptide bonds of a polypeptide. In general, the abbreviations used herein to designate amino acids are based on the recommendations of the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (see Biochemistry (1972) 11:1726-1732). For example, Met, Ile, Leu, Ala, and Gly represent "residues" of methionine, isoleucine, leucine, alanine, and glycine, respectively. A residue is defined as a radical derived from the corresponding α-amino acid by removing the OH portion of the carboxyl group and the H portion of the α-amino group. The term "amino acid side chain" is that portion of an amino acid excluding the -CH(NH2)COOH portion, as defined by K. D. Kopple, "Peptides and Amino Acids", W. A. Benjamin Inc., New York and Amsterdam, 1966, pages 2 and 33.
Pour la plupart, les acides aminés utilisés dans l'application de cette divulgation sont les acides aminés d’occurrence naturelle trouvés dans les protéines, ou les produits anaboliques ou cataboliques d’occurrence naturelle de tels acides aminés qui contiennent des groupes amino et carboxyle. Des chaînes latérales d'acides aminés particulièrement appropriées incluent des chaînes latérales sélectionnées parmi celles des acides aminés suivants : glycine, alanine, valine, cystéine, leucine, isoleucine, sérine, thréonine, méthionine, acide glutamique, acide aspartique, glutamine, asparagine, lysine, arginine, proline, histidine, phénylalanine, tyrosine et tryptophane, et les acides aminés et analogues d'acides aminés qui ont été identifiés comme constituants des parois cellulaires bactériennes peptidylglycanes.For the most part, the amino acids used in the application of this disclosure are the naturally occurring amino acids found in proteins, or the naturally occurring anabolic or catabolic products of such amino acids that contain amino and carboxyl groups. Particularly suitable amino acid side chains include side chains selected from those of the following amino acids: glycine, alanine, valine, cysteine, leucine, isoleucine, serine, threonine, methionine, glutamic acid, aspartic acid, glutamine, asparagine, lysine, arginine, proline, histidine, phenylalanine, tyrosine and tryptophan, and amino acids and amino acid analogs that have been identified as constituents of bacterial cell wall peptidylglycans.
Les résidus d'acides aminés ayant des "chaînes latérales basiques" incluent Arg, Lys et His. Les résidus d'acides aminés ayant des "chaînes latérales acides" incluent Glu et Asp. Les résidus d'acides aminés ayant des "chaînes latérales polaires neutres" incluent Ser, Thr, Asn, Gln, Cys et Tyr. Les résidus d'acides aminés ayant des "chaînes latérales non polaires neutres" incluent Gly, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Pro, Trp et Phe. Les résidus d'acides aminés ayant des "chaînes latérales aliphatiques non polaires" incluent Gly, Ala, Val, Ile et Leu. Les résidus d'acides aminés ayant des "chaînes latérales hydrophobes" incluent Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr et Trp. Les résidus d'acides aminés ayant de "petites chaînes latérales hydrophobes" incluent Ala et Val. Les résidus d'acides aminés ayant des "chaînes latérales aromatiques" incluent Tyr, Trp et Phe.Amino acid residues having "basic side chains" include Arg, Lys, and His. Amino acid residues having "acidic side chains" include Glu and Asp. Amino acid residues having "neutral polar side chains" include Ser, Thr, Asn, Gln, Cys, and Tyr. Amino acid residues having "neutral nonpolar side chains" include Gly, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Pro, Trp, and Phe. Amino acid residues having "nonpolar aliphatic side chains" include Gly, Ala, Val, Ile, and Leu. Amino acid residues having "hydrophobic side chains" include Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, and Trp. Amino acid residues having "small hydrophobic side chains" include Ala and Val. Amino acid residues with "aromatic side chains" include Tyr, Trp, and Phe.
Les résidus d'acides aminés comprennent en outre des analogues, des dérivés et des congénères de tout acide aminé spécifique auquel il est ici fait référence, tel par exemple, le polypeptide AFFIMER® sujet (en particulier s'il est généré par synthèse chimique) peut inclure un analogue d'acide aminé tel que, par exemple, la cyanoalanine, la canavanine, l’acide djenkolique, la norleucine, la 3-phosphosérine, l’homosérine, la dihydroxy-phénylalanine, le 5-hydroxytryptophane, la 1-méthylhistidine, la 3-méthylhistidine, l’acide diaminiopimélique, l’ornithine ou l’acide diaminobutyrique. D'autres métabolites ou précurseurs d'acides aminés d’occurrence naturelle ayant des chaînes latérales qui conviennent ici seront reconnus par les personnes du métier et sont inclus dans la portée de la présente divulgation.Amino acid residues further include analogs, derivatives, and congeners of any specific amino acid referred to herein, such as, for example, the subject AFFIMER® polypeptide (particularly if generated by chemical synthesis) may include an amino acid analog such as, for example, cyanoalanine, canavanine, djenkolic acid, norleucine, 3-phosphoserine, homoserine, dihydroxyphenylalanine, 5-hydroxytryptophan, 1-methylhistidine, 3-methylhistidine, diaminiopimelic acid, ornithine, or diaminobutyric acid. Other naturally occurring amino acid metabolites or precursors having side chains suitable herein will be recognized by those skilled in the art and are included within the scope of this disclosure.
Sont également inclus les stéréoisomères (D) et (L) de ces acides aminés lorsque la structure de l'acide aminé admet des formes stéréoisomères. La configuration des acides aminés et des résidus d'acides aminés dans ce document est désignée par les symboles appropriés (D), (L) ou (DL), de plus lorsque la configuration n'est pas désignée, l'acide aminé ou le résidu peut avoir la configuration (D), (L) ou (DL). On notera que la structure de certains des composés de cette divulgation comprend des atomes de carbone asymétriques. Il doit être compris en conséquence que les isomères résultant d'une telle asymétrie sont inclus dans la portée de cette divulgation. De tels isomères peuvent être obtenus sous une forme sensiblement pure par des techniques classiques de séparation et par synthèse stériquement contrôlée. Aux fins de la présente demande, sauf indication contraire expresse, un acide aminé nommé doit être interprété comme comprenant à la fois les stéréoisomères (D) ou (L).Also included are the (D) and (L) stereoisomers of these amino acids where the structure of the amino acid admits of stereoisomeric forms. The configuration of amino acids and amino acid residues herein is designated by the appropriate symbols (D), (L) or (DL), further where the configuration is not designated, the amino acid or residue may have the (D), (L) or (DL) configuration. It will be noted that the structure of some of the compounds of this disclosure includes asymmetric carbon atoms. It is to be understood accordingly that isomers resulting from such asymmetry are included within the scope of this disclosure. Such isomers can be obtained in substantially pure form by conventional separation techniques and by sterically controlled synthesis. For the purposes of this application, unless expressly indicated otherwise, a named amino acid is to be construed as including both the (D) and (L) stereoisomers.
Les termes "identique" ou pourcentage "d'identité" dans le contexte de deux ou plus acides nucléiques ou polypeptides, font référence à deux ou plus séquences ou sous-séquences qui sont les mêmes ou ont un pourcentage spécifié de nucléotides ou de résidus d'acides aminés qui sont les mêmes, lorsqu'ils sont comparés et alignés (en introduisant des intervalles, si nécessaire) pour une correspondance maximale, sans tenir compte des substitutions conservatrices d'acides aminés dans le cadre de l'identité de séquence. Le pourcentage d'identité peut être mesuré en utilisant un logiciel ou des algorithmes de comparaison de séquences ou par inspection visuelle. Divers algorithmes et logiciels qui peuvent être utilisés pour obtenir des alignements de séquences d'acides aminés ou de nucléotides sont bien connus dans le métier. Ceux-ci incluent, mais sans s'y limiter, BLAST, ALIGN, Megaalign, BestFit, GCG Wisconsin Package et des variantes de ceux-ci. Dans certains modes de réalisation, deux acides nucléiques ou polypeptides de l'invention sont sensiblement identiques, ce qui signifie qu'ils ont au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, et dans certains modes de réalisation au moins 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % d'identité avec des résidus d'acides aminés ou de nucléotides, lorsqu'ils sont comparés et alignés pour une correspondance maximale, tels que mesurés en utilisant un algorithme de comparaison de séquences ou par inspection visuelle. Dans certains modes de réalisation, une identité existe sur une région des séquences d'acides aminés qui est d'au moins environ 10 résidus, d'au moins environ 20 résidus, d'au moins environ 40-60 résidus, d'au moins environ 60-80 résidus de long ou toute valeur entière entre ceux-ci. Dans certains modes de réalisation, une identité existe sur une région plus longue que 60-80 résidus, comme au moins environ 80-100 résidus, et dans certains modes de réalisation, les séquences sont sensiblement identiques sur toute la longueur des séquences comparées, comme la région codante d'une protéine cible ou d'un anticorps. Dans certains modes de réalisation, une identité existe sur une région des séquences nucléotidiques qui est d'au moins environ 10 bases, d'au moins environ 20 bases, d'au moins environ 40-60 bases, d'au moins environ 60-80 bases de long ou toute valeur entière entre ceux-ci. Dans certains modes de réalisation, une identité existe sur une région plus longue que 60-80 bases, comme au moins environ 80-1000 bases ou plus, et dans certains modes de réalisation, les séquences sont sensiblement identiques sur toute la longueur des séquences comparées, comme une séquence nucléotidique codant pour une protéine d’intérêt.The terms "identical" or percent "identity" in the context of two or more nucleic acids or polypeptides, refer to two or more sequences or subsequences that are the same or have a specified percentage of nucleotides or amino acid residues that are the same, when compared and aligned (introducing gaps, if necessary) for maximum match, without regard to conservative amino acid substitutions as part of the sequence identity. Percent identity can be measured using sequence comparison software or algorithms or by visual inspection. Various algorithms and software that can be used to obtain amino acid or nucleotide sequence alignments are well known in the art. These include, but are not limited to, BLAST, ALIGN, Megaalign, BestFit, GCG Wisconsin Package and variations thereof. In some embodiments, two nucleic acids or polypeptides of the invention are substantially identical, meaning that they have at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, and in some embodiments at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identity to amino acid or nucleotide residues, when compared and aligned for maximum match, as measured using a sequence comparison algorithm or by visual inspection. In some embodiments, identity exists over a region of the amino acid sequences that is at least about 10 residues, at least about 20 residues, at least about 40-60 residues, at least about 60-80 residues long, or any integer value therebetween. In some embodiments, identity exists over a region longer than 60-80 residues, such as at least about 80-100 residues, and in some embodiments, the sequences are substantially identical throughout the length of the sequences being compared, such as the coding region of a target protein or an antibody. In some embodiments, identity exists over a region of the nucleotide sequences that is at least about 10 bases, at least about 20 bases, at least about 40-60 bases, at least about 60-80 bases long, or any integer therebetween. In some embodiments, identity exists over a region longer than 60-80 bases, such as at least about 80-1000 bases or more, and in some embodiments, the sequences are substantially identical throughout the length of the sequences being compared, such as a nucleotide sequence encoding a protein of interest.
Lors du calcul du pourcentage d'identité, tous les résidus définis comme « Xaa » ou « X » dans une séquence de référence sont inclus dans le calcul du pourcentage d'identité, c'est-à-dire que tout acide aminé à cette position dans une séquence de comparaison correspond à la séquence de référence.When calculating percent identity, all residues defined as "Xaa" or "X" in a reference sequence are included in the percent identity calculation, i.e., any amino acid at that position in a comparison sequence matches the reference sequence.
Une substitution conservatrice d'acide aminé est une substitution dans laquelle un résidu d'acide aminé est remplacé par un autre résidu d'acide aminé ayant une chaîne latérale similaire. Des familles de résidus d'acides aminés ayant des chaînes latérales similaires ont généralement été définies dans l'art, y compris des chaînes latérales basiques (par ex. lysine, arginine, histidine), des chaînes latérales acides (par ex. acide aspartique, acide glutamique), des chaînes latérales polaires non chargées (par ex. glycine, asparagine, glutamine, sérine, thréonine, tyrosine, cystéine), chaînes latérales non polaires (p. ex., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phénylalanine, méthionine, tryptophane), chaînes latérales à ramification bêta (p. ex., thréonine, valine, isoleucine) et des chaînes latérales aromatiques (par ex. tyrosine, phénylalanine, tryptophane, histidine). Par exemple, la substitution d'une phénylalanine à une tyrosine est une substitution conservatrice. Généralement, les substitutions conservatrices dans les séquences des polypeptides, des protéines solubles et/ou des anticorps de la divulgation n'abrogent pas la liaison du polypeptide, de la protéine soluble ou de l'anticorps contenant la séquence d'acides aminés au site de liaison cible. Les procédés d'identification de substitutions conservatrices d'acides aminés qui n'éliminent pas la liaison sont bien connus dans le métier.A conservative amino acid substitution is a substitution in which one amino acid residue is replaced by another amino acid residue having a similar side chain. Families of amino acid residues having similar side chains have generally been defined in the art, including basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine), acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), nonpolar side chains (e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), beta-branched side chains (e.g., threonine, valine, isoleucine), and aromatic side chains (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine). For example, the substitution of a phenylalanine for a tyrosine is a conservative substitution. Generally, conservative substitutions in the sequences of the polypeptides, soluble proteins and/or antibodies of the disclosure do not abrogate binding of the polypeptide, soluble protein or antibody containing the amino acid sequence to the target binding site. Methods for identifying conservative amino acid substitutions that do not eliminate binding are well known in the art.
Un polypeptide, une protéine soluble, un anticorps, un polynucléotide, un vecteur, une cellule ou une composition "isolé(e)" est un polypeptide, une protéine soluble, un anticorps, un polynucléotide, un vecteur, une cellule ou une composition qui se présente sous une forme non trouvée dans la nature. Les polypeptides, protéines solubles, anticorps, polynucléotides, vecteurs, cellules ou compositions isolé(e)s incluent ceux ou celles qui ont été purifiés à un degré tel qu'ils ne sont plus sous une forme dans laquelle ils se trouvent dans la nature. Dans certains modes de réalisation, un polypeptide, une protéine soluble, un anticorps, un polynucléotide, un vecteur, une cellule ou une composition qui est isolé(e) est sensiblement pur(e).An "isolated" polypeptide, soluble protein, antibody, polynucleotide, vector, cell, or composition is a polypeptide, soluble protein, antibody, polynucleotide, vector, cell, or composition that is in a form not found in nature. Isolated polypeptides, soluble proteins, antibodies, polynucleotides, vectors, cells, or compositions include those that have been purified to a degree that they are no longer in a form in which they are found in nature. In some embodiments, a polypeptide, soluble protein, antibody, polynucleotide, vector, cell, or composition that is isolated is substantially pure.
Un matériel est considéré comme sensiblement pur s'il est pur à au moins 50 % (par ex. exempt de contaminants), au moins 60 %, au moins 70 %, au moins 80 %, au moins 90 % pur, au moins pur à 95 %, au moins pur à 98 %, ou au moins pur à 99 %.A material is considered substantially pure if it is at least 50% pure (e.g. free of contaminants), at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90% pure, at least 95% pure, at least 98% pure, or at least 99% pure.
Un polypeptide de fusion (par ex. une protéine de fusion) est un polypeptide hybride exprimé par une molécule d'acide nucléique comprenant au moins deux cadres de lecture ouverts (par ex. à partir de deux molécules individuelles, par ex. deux gènes individuels).A fusion polypeptide (e.g., a fusion protein) is a hybrid polypeptide expressed by a nucleic acid molecule comprising at least two open reading frames (e.g., from two individual molecules, e.g., two individual genes).
Un lieur (également appelé région lieuse) peut être inséré entre un premier polypeptide (par ex. des copies d'un polypeptide TFNR2 AFFIMER®) et un second polypeptide (par ex. un autre polypeptide AFFIMER®, un domaine Fc, un domaine de liaison de ligand, etc.). Dans certains modes de réalisation, un lieur est un lieur peptidique. Les lieurs ne doivent pas affecter négativement l'expression, la sécrétion ou la bioactivité des polypeptides. Dans certains modes de réalisation, les lieurs ne sont pas antigéniques et ne suscitent pas de réponse immunitaire.A linker (also referred to as a linker region) may be inserted between a first polypeptide (e.g., copies of a TFNR2 AFFIMER® polypeptide) and a second polypeptide (e.g., another AFFIMER® polypeptide, an Fc domain, a ligand binding domain, etc.). In some embodiments, a linker is a peptide linker. The linkers must not adversely affect the expression, secretion, or bioactivity of the polypeptides. In some embodiments, the linkers are non-antigenic and do not elicit an immune response.
Un domaine transmembranaire (également appelé domaine TM) est une séquence qui peut être ajoutée à un polypeptide AFFIMER®, tel que par l'ajout d'une séquence polynucléotidique codant pour le domaine TM à la séquence polynucléotidique codant pour le polypeptide AFFIMER®, afin de s'assurer que l'AFFIMER® est retenu à la surface de la cellule qui l'exprime. Divers domaines TM sont disponibles et facilement utilisables avec le polypeptide AFFIMER®.A transmembrane domain (also referred to as a TM domain) is a sequence that can be added to an AFFIMER® polypeptide, such as by adding a polynucleotide sequence encoding the TM domain to the polynucleotide sequence encoding the AFFIMER® polypeptide, to ensure that the AFFIMER® is retained on the surface of the cell expressing it. A variety of TM domains are available and readily usable with the AFFIMER® polypeptide.
Une « fusion AFFIMER®-anticorps » est une protéine de fusion qui comprend une portion de polypeptide AFFIMER® et une région variable d'un anticorps. Les fusions AFFIMER®-anticorps peuvent inclure des anticorps complets ayant, par exemple, au moins une séquence polypeptidique AFFIMER® attachée au C-terminus ou N-terminus d'au moins une de ses chaînes VH et/ou VL, par ex. au moins une chaîne de l'anticorps assemblé est une protéine de fusion avec un polypeptide AFFIMER®. Les fusions AFFIMER®-anticorps peuvent également comprendre au moins une séquence polypeptidique AFFIMER® en tant que partie d'une protéine de fusion avec un site de liaison à antigène ou une région variable d'un fragment d'anticorps.An “AFFIMER®-antibody fusion” is a fusion protein that comprises a portion of an AFFIMER® polypeptide and a variable region of an antibody. AFFIMER®-antibody fusions may include full-length antibodies having, for example, at least one AFFIMER® polypeptide sequence attached to the C-terminus or N-terminus of at least one of its VH and/or VL chains, e.g. at least one chain of the assembled antibody is a fusion protein with an AFFIMER® polypeptide. AFFIMER®-antibody fusions may also comprise at least one AFFIMER® polypeptide sequence as part of a fusion protein with an antigen binding site or a variable region of an antibody fragment.
Un anticorps est une molécule d'immunoglobuline qui reconnaît et se lie spécifiquement à une cible, telle qu'une protéine, un polypeptide, un peptide, un glucide, un polynucléotide, un lipide ou une combinaison de l'un quelconque de tels éléments, par l’intermédiaire d’au moins un site de liaison à antigène, dans laquelle le site de liaison à antigène se situe généralement au sein de la région variable de la molécule d'immunoglobuline. Tel qu'il est utilisé ici, le terme « anticorps » englobe les anticorps polyclonaux intacts (entiers), les anticorps monoclonaux intacts, les fragments d'anticorps (tels que les fragments Fab, Fab', F(ab')2 et Fv), les anticorps Fv simple chaîne (scFv, de l’anglais « single chain Fv », soit « fragments variables simple chaîne ») à condition que ces fragments aient été formatés pour inclure un Fc ou autre domaine de liaison FcγRIII, les anticorps multispécifiques, les anticorps bispécifiques, les anticorps monospécifiques, les anticorps monovalents, les anticorps chimériques, les anticorps humanisés, les anticorps humains, les protéines de fusion comprenant un site de liaison à l’antigène d'un anticorps (formaté pour inclure un Fc ou autre domaine de liaison FcγRIII), les mimétiques d'anticorps, et toute autre molécule d'immunoglobuline modifiée comprenant un site de liaison à antigène pour autant que les anticorps présentent l'activité biologique souhaitée.An antibody is an immunoglobulin molecule that specifically recognizes and binds to a target, such as a protein, polypeptide, peptide, carbohydrate, polynucleotide, lipid, or combination of any of the above, through at least one antigen-binding site, wherein the antigen-binding site is typically within the variable region of the immunoglobulin molecule. As used herein, the term “antibody” includes intact (whole) polyclonal antibodies, intact monoclonal antibodies, antibody fragments (such as Fab, Fab', F(ab')2, and Fv fragments), single chain Fv (scFv) antibodies provided that such fragments have been formatted to include an Fc or other FcγRIII binding domain, multispecific antibodies, bispecific antibodies, monospecific antibodies, monovalent antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, fusion proteins comprising an antigen binding site of an antibody (formatted to include an Fc or other FcγRIII binding domain), antibody mimetics, and any other modified immunoglobulin molecule comprising an antigen binding site provided that the antibodies exhibit the desired biological activity.
L'anticorps peut appartenir à l'une des cinq grandes classes d'immunoglobulines : IgA, IgD, IgE, IgG et IgM, ou leurs sous-classes (isotypes) (par ex. IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 et IgA2), sur la base de l'identité de leurs domaines constants de chaîne lourde appelés alpha, delta, epsilon, gamma et mu. Dans certains modes de réalisation, la Fc est de non liaison (de l’anglais « null binding », c’est-à-dire ne se lie pas) à FcyR2b. Dans certains modes de réalisation, l'anticorps n'est pas un Fc d’IgG1.The antibody may belong to one of five major classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, or their subclasses (isotypes) (e.g., IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2), based on the identity of their heavy chain constant domains called alpha, delta, epsilon, gamma, and mu. In some embodiments, the Fc is null binding to FcyR2b. In some embodiments, the antibody is not an IgG1 Fc.
Une région variable d'un anticorps peut être une région variable d'une chaîne légère d'anticorps ou une région variable d'une chaîne lourde d'anticorps, soit seule, soit en combinaison. Généralement, la région variable des chaînes lourdes et légères inclut quatre régions de charpente (FR, de l’anglais « framework regions ») et trois régions déterminant la complémentarité (CDR, de l’anglais « complementarity determining regions »), également appelées régions hypervariables. Les CDR de chaque chaîne sont maintenues ensemble à proximité étroite par les régions de charpente et, avec les CDR de l'autre chaîne, contribuent à la formation des sites de liaison à antigène de l'anticorps. Il existe au moins deux techniques pour déterminer les CDR : (1) une approche basée sur la variabilité des séquences inter-espèces (par ex. Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, National Institutes of Health, Bethesda Md.), et (2) une approche basée sur des études cristallographiques de complexes antigène-anticorps (Al Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948). De plus, des combinaisons de ces deux approches sont parfois utilisées dans l'art pour déterminer les CDR.A variable region of an antibody may be a variable region of an antibody light chain or a variable region of an antibody heavy chain, either alone or in combination. Typically, the variable region of both heavy and light chains includes four framework regions (FRs) and three complementarity determining regions (CDRs), also called hypervariable regions. The CDRs of each chain are held together in close proximity by the framework regions and, together with the CDRs of the other chain, contribute to the formation of the antibody's antigen-binding sites. There are at least two techniques for determining CDRs: (1) an approach based on interspecies sequence variability (e.g., Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, National Institutes of Health, Bethesda Md.), and (2) an approach based on crystallographic studies of antigen-antibody complexes (Al Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948). In addition, combinations of these two approaches are sometimes used in the art to determine CDRs.
Un anticorps humanisé est une forme d'anticorps non humain (par ex. murin) qui est : des chaînes d'immunoglobulines spécifiques, des immunoglobulines chimériques ou des fragments de celles-ci qui contiennent des séquences non humaines minimales. En règle générale, les anticorps humanisés sont des immunoglobulines humaines dans lesquelles des résidus des CDR sont remplacés par des résidus des CDR d'une espèce non humaine (par ex. souris, rat, lapin ou hamster) qui ont la spécificité, l'affinité et/ou la capacité de liaison souhaitée(s). Dans certains cas, les résidus de la région de charpente Fv d'une immunoglobuline humaine sont remplacés par les résidus correspondants dans un anticorps provenant d'une espèce non humaine. L'anticorps humanisé peut être en outre modifié par la substitution de résidus supplémentaires soit dans la région de charpente Fv et/ou parmi les résidus non humains remplacés pour affiner et optimiser la spécificité, l'affinité et/ou la capacité de liaison de l'anticorps. L'anticorps humanisé peut comprendre des domaines variables contenant la totalité ou sensiblement la totalité des CDR qui correspondent à l'immunoglobuline non humaine tandis que la totalité ou sensiblement la totalité des régions de charpente sont celles d'une séquence d'immunoglobuline humaine. Dans certains modes de réalisation, les domaines variables comprennent les régions de charpente d'une séquence d'immunoglobuline humaine. Dans certains modes de réalisation, les domaines variables comprennent les régions de charpente d'une séquence consensus d'immunoglobuline humaine. L'anticorps humanisé peut également comprendre au moins une partie d'une région ou d’un domaine constant d'immunoglobuline (Fc), typiquement celui d'une immunoglobuline humaine. Un anticorps humanisé est généralement considéré comme distinct d'un anticorps chimérique.A humanized antibody is a form of non-human (e.g., murine) antibody that is: specific immunoglobulin chains, chimeric immunoglobulins, or fragments thereof that contain minimal non-human sequences. Typically, humanized antibodies are human immunoglobulins in which CDR residues are replaced with CDR residues from a non-human species (e.g., mouse, rat, rabbit, or hamster) that have the desired specificity, affinity, and/or binding capacity. In some cases, residues in the Fv framework region of a human immunoglobulin are replaced with corresponding residues in an antibody from a non-human species. The humanized antibody may be further modified by substituting additional residues either in the Fv framework region and/or among the replaced non-human residues to refine and optimize the specificity, affinity, and/or binding capacity of the antibody. The humanized antibody may include variable domains containing all or substantially all of the CDRs that correspond to the non-human immunoglobulin while all or substantially all of the framework regions are those of a human immunoglobulin sequence. In some embodiments, the variable domains include the framework regions of a human immunoglobulin sequence. In some embodiments, the variable domains include the framework regions of a human immunoglobulin consensus sequence. The humanized antibody may also include at least a portion of an immunoglobulin constant (Fc) region or domain, typically that of a human immunoglobulin. A humanized antibody is generally considered distinct from a chimeric antibody.
Un épitope (également appelé ici déterminant antigénique) est la partie d'un antigène capable d'être reconnue et spécifiquement liée par un anticorps particulier, un polypeptide AFFIMER® particulier ou un autre domaine de liaison particulier. Lorsque l'antigène est un polypeptide, les épitopes peuvent être formés à la fois à partir d'acides aminés contigus et d'acides aminés non contigus juxtaposés par repliement tertiaire d'une protéine. Les épitopes formés à partir d'acides aminés contigus (également appelés épitopes linéaires) sont typiquement conservés lors de la dénaturation des protéines, tandis que les épitopes formés par repliement tertiaire (également appelés épitopes conformationnels) sont typiquement perdus lors de la dénaturation des protéines. Un épitope comprend typiquement au moins 3, et plus généralement, au moins 5, 6, 7 ou 8-10 acides aminés dans une conformation spatiale unique.An epitope (also referred to herein as an antigenic determinant) is that portion of an antigen capable of being recognized and specifically bound by a particular antibody, a particular AFFIMER® polypeptide, or other particular binding domain. When the antigen is a polypeptide, epitopes may be formed from both contiguous amino acids and non-contiguous amino acids juxtaposed by tertiary folding of a protein. Epitopes formed from contiguous amino acids (also referred to as linear epitopes) are typically retained upon protein denaturation, while epitopes formed by tertiary folding (also referred to as conformational epitopes) are typically lost upon protein denaturation. An epitope typically comprises at least 3, and more typically, at least 5, 6, 7, or 8-10 amino acids in a unique spatial conformation.
"Se lie spécifiquement à" ou est "spécifique de" fait référence à des interactions mesurables et reproductibles telles qu’une liaison entre une cible (par ex. TFNR2) et un polypeptide AFFIMER®, anticorps ou autre partenaire de liaison, qui permettent de déterminer la présence de la cible dans la présence d'une population hétérogène de molécules incluant des molécules biologiques. Par exemple, un polypeptide AFFIMER® qui se lie spécifiquement au TFNR2 est un polypeptide AFFIMER® qui se lie au TFNR2 avec une plus grande affinité, avidité (si formaté multimérique), plus facilement et/ou avec une plus grande durée qu'il ne se lie à d'autres cibles.“Binds specifically to” or is “specific for” refers to measurable and reproducible interactions such as binding between a target (e.g., TFNR2) and an AFFIMER® polypeptide, antibody, or other binding partner, that allow the presence of the target to be determined in the presence of a heterogeneous population of molecules including biological molecules. For example, an AFFIMER® polypeptide that binds specifically to TFNR2 is an AFFIMER® polypeptide that binds to TFNR2 with greater affinity, avidity (if formatted multimeric), more readily, and/or with greater duration than it binds to other targets.
« Conjugué », « conjugaison » et leurs variantes grammaticales font référence à la jonction ou la liaison ensemble de deux composés ou plus aboutissant à la formation d'un autre composé, par n'importe quel procédé de jonction ou de liaison connu dans l'art. Elles peuvent également faire référence à un composé qui est généré par la jonction ou la liaison de deux composés ou plus. Par exemple, un polypeptide TFNR2 AFFIMER® lié directement ou indirectement à au moins un groupement chimique ou polypeptide est un exemple de conjugué. De tels conjugués incluent les protéines de fusion, celles produites par des conjugués chimiques et celles produites par n'importe quel autre procédé."Conjugate", "conjugation" and their grammatical variations refer to the joining or linking together of two or more compounds resulting in the formation of another compound, by any joining or linking process known in the art. They may also refer to a compound that is generated by the joining or linking of two or more compounds. For example, a TFNR2 AFFIMER® polypeptide linked directly or indirectly to at least one chemical moiety or polypeptide is an example of a conjugate. Such conjugates include fusion proteins, those produced by chemical conjugates, and those produced by any other process.
PolynucléotidesPolynucleotides
Un polynucléotide (également appelé ici acide nucléique ou molécule d'acide nucléique) est un polymère de nucléotides de n'importe quelle longueur et peut comprendre de l'ADN, de l'ARN (par ex. de l'ARN messager (ARNm)) ou une combinaison d'ADN et d'ARN. Les nucléotides peuvent être des désoxyribonucléotides, des ribonucléotides, des nucléotides ou bases modifiés, et/ou leurs analogues, ou tout substrat qui peut être incorporé dans un polymère par ADN ou ARN polymérase.A polynucleotide (also referred to herein as a nucleic acid or nucleic acid molecule) is a polymer of nucleotides of any length and may include DNA, RNA (e.g., messenger RNA (mRNA)), or a combination of DNA and RNA. The nucleotides may be deoxyribonucleotides, ribonucleotides, modified nucleotides or bases, and/or their analogues, or any substrate that can be incorporated into a polymer by DNA or RNA polymerase.
Un polynucléotide codant pour un polypeptide fait référence à l'ordre ou à la séquence de nucléotides le long d'un brin de désoxyribonucléotides d'acide désoxyribonucléique. L'ordre de ces désoxyribonucléotides détermine l'ordre des acides aminés le long de la chaîne polypeptidique (par ex. protéique). Ainsi, une séquence d'acide nucléique code pour la séquence d'acides aminés.A polynucleotide encoding a polypeptide refers to the order or sequence of nucleotides along a strand of deoxyribonucleotides of deoxyribonucleic acid. The order of these deoxyribonucleotides determines the order of amino acids along the polypeptide (e.g. protein) chain. Thus, a nucleic acid sequence encodes the sequence of amino acids.
Lorsqu'elle est utilisée en référence à des séquences nucléotidiques, une "séquence" peut comprendre de l'ADN et/ou de l'ARN (par ex. de l'ARN messager) et peut être à simple et/ou double brin.When used in reference to nucleotide sequences, a "sequence" may include DNA and/or RNA (e.g., messenger RNA) and may be single- and/or double-stranded.
Les séquences d'acides nucléiques peuvent être modifiées, par ex. mutées, par rapport aux séquences d'acides nucléiques d’occurrence naturelle, par exemple.Nucleic acid sequences may be altered, e.g. mutated, compared to naturally occurring nucleic acid sequences, for example.
La séquence d'acide nucléique peut avoir n'importe quelle longueur, par exemple de 2 à 000.000 nucléotides ou plus (ou toute valeur entière au-dessus ou entre) un acide nucléique, par exemple une longueur d'environ 100 à environ 10.000, ou d'environ 200 nucléotides à environ 500 nucléotides.The nucleic acid sequence may be of any length, for example from 2 to 000,000 nucleotides or more (or any integer value above or between) a nucleic acid, for example from about 100 to about 10,000, or from about 200 nucleotides to about 500 nucleotides.
La transfection est le processus d'introduction d'un acide nucléique exogène dans une cellule eucaryote. La transfection peut être réalisée par divers moyens connus dans l'art, y compris la coprécipitation phosphate de calcium-ADN, la transfection médiée par DEAE-dextrane, la transfection médiée par polybrène, l'électroporation, la micro-injection, la fusion de liposome, la lipofection, la fusion de protoplastes, l'infection rétrovirale et la technologie biolistique (biolistique).Transfection is the process of introducing an exogenous nucleic acid into a eukaryotic cell. Transfection can be accomplished by various means known in the art, including calcium phosphate-DNA coprecipitation, DEAE-dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection, electroporation, microinjection, liposome fusion, lipofection, protoplast fusion, retroviral infection, and biolistic technology (biolistics).
Un vecteur est une construction qui est capable de délivrer, et généralement d'exprimer, au moins un gène ou une séquence d'intérêt dans une cellule hôte. Des exemples de vecteurs incluent, mais sans s'y limiter, des vecteurs viraux, des vecteurs d'expression d'ADN ou d'ARN nu, des vecteurs plasmidiques, cosmidiques ou phagiques, des vecteurs d'expression d'ADN ou d'ARN associés à des agents de condensation cationiques et des vecteurs d'expression d'ADN ou d'ARN encapsulés dans des liposomes. Un vecteur peut, dans certains modes de réalisation, être un acide nucléique isolé qui peut être utilisé pour délivrer une composition à l'intérieur de la cellule. Il est connu dans l'art un certain nombre de vecteurs comprenant, mais sans s'y limiter, les polynucléotides linéaires, les polynucléotides associés à des composés ioniques ou amphiphiles, les plasmides et les virus. Ainsi, un vecteur peut être un plasmide ou un virus, à réplication autonome. Le terme doit également être interprété comme incluant la facilitation du transfert d'acide nucléique dans des cellules des composés non plasmidiques et non viraux, par exemple, des composés de polylysine, des liposomes, et similaires. Des exemples non limitatifs de vecteurs viraux incluent, mais sans s'y limiter, des vecteurs adénoviraux, des vecteurs viraux adéno-associés et des vecteurs rétroviraux.A vector is a construct that is capable of delivering, and typically expressing, at least one gene or sequence of interest into a host cell. Examples of vectors include, but are not limited to, viral vectors, naked DNA or RNA expression vectors, plasmid, cosmid or phage vectors, DNA or RNA expression vectors associated with cationic condensing agents, and DNA or RNA expression vectors encapsulated in liposomes. A vector may, in some embodiments, be an isolated nucleic acid that can be used to deliver a composition into the cell. A number of vectors are known in the art, including, but not limited to, linear polynucleotides, polynucleotides associated with ionic or amphiphilic compounds, plasmids, and viruses. Thus, a vector may be a plasmid or a virus, replicating autonomously. The term should also be interpreted to include facilitating the transfer of nucleic acid into cells of non-plasmid and non-viral compounds, e.g., polylysine compounds, liposomes, and the like. Non-limiting examples of viral vectors include, but are not limited to, adenoviral vectors, adeno-associated viral vectors, and retroviral vectors.
Un vecteur d'expression est un vecteur comprenant un polynucléotide recombinant comprenant une séquence de contrôle de l'expression et une séquence de nucléotides à exprimer liés de manière opérationnelle. Le vecteur d'expression comprend suffisamment d'éléments agissant en cis (éléments agissant en cis) utilisés pour l'expression ; d'autres éléments d'expression peuvent être fournis par la cellule hôte ou le système d'expression in vitro. Les vecteurs d'expression incluent, par exemple, les cosmides, les plasmides (par ex. nus ou contenus dans des liposomes) et les virus (par ex. les lentivirus, les rétrovirus, les adénovirus et les virus adéno-associés).An expression vector is a vector comprising a recombinant polynucleotide comprising an expression control sequence and a nucleotide sequence to be expressed operably linked. The expression vector comprises sufficient cis-acting elements (cis-acting elements) used for expression; other expression elements may be provided by the host cell or the in vitro expression system. Expression vectors include, for example, cosmids, plasmids (e.g. naked or contained in liposomes) and viruses (e.g. lentiviruses, retroviruses, adenoviruses and adeno-associated viruses).
« Lié de manière opérationnelle » fait référence à un couplage fonctionnel entre la séquence régulatrice et une séquence d'acide nucléique hétérologue entraînant l'expression de cette dernière. Par exemple, si le promoteur affecte la transcription ou l'expression de la séquence codante, le promoteur est lié de manière opérationnelle à une séquence codante. Typiquement, les séquençages d'ADN liés de manière opérationnelle sont contigus et peuvent joindre deux régions codant pour une protéine dans le même cadre de lecture.“Operably linked” refers to a functional coupling between the regulatory sequence and a heterologous nucleic acid sequence that drives expression of the latter. For example, if the promoter affects transcription or expression of the coding sequence, the promoter is operably linked to a coding sequence. Typically, operably linked DNA sequences are contiguous and can join two protein-coding regions in the same reading frame.
Un promoteur est une séquence d'ADN reconnue par la machinerie de synthèse nécessaire à la machinerie de synthèse de la transcription spécifique à la cellule d'une séquence polynucléotidique ou introduite.A promoter is a DNA sequence recognized by the synthesis machinery required for the synthesis machinery of cell-specific transcription of a polynucleotide or introduced sequence.
« Expression inductible » fait référence à l'expression dans certaines conditions, telles que l'activation (ou l'inactivation) d'une voie de signalisation intracellulaire ou la mise en contact des cellules hébergeant la construction de l'expression avec une petite molécule qui régule l'expression (ou le degré d'expression) d'un gène lié de manière opérationnelle à un promoteur inductible sensible à la concentration de la petite molécule. Ceci contraste avec l'expression constitutive, qui fait référence à l'expression dans des conditions physiologiques (non limitées par certaines conditions).“Inducible expression” refers to expression under certain conditions, such as activation (or inactivation) of an intracellular signaling pathway or contacting the cells harboring the expression construct with a small molecule that regulates the expression (or level of expression) of a gene operably linked to an inducible promoter that is sensitive to the concentration of the small molecule. This is in contrast to constitutive expression, which refers to expression under physiological conditions (not limited by certain conditions).
« Electroporation » fait référence à l'utilisation d'une impulsion de champ électrique transmembranaire pour induire des voies microscopiques (pores) dans une biomembrane ; leur présence permet aux biomolécules telles que les plasmides ou autres oligonucléotides de passer d'un côté à l'autre de la membrane cellulaire."Electroporation" refers to the use of a transmembrane electric field pulse to induce microscopic pathways (pores) in a biomembrane; their presence allows biomolecules such as plasmids or other oligonucleotides to pass from one side of the cell membrane to the other.
TraitementsTreatments
« Traitement » fait référence à biomembrane la fois (1) les mesures thérapeutiques qui guérissent, ralentissent, atténuent les symptômes et/ou arrêtent la progression d'une affection ou d’un trouble pathologique diagnostiqué(e) et (2) les mesures prophylactiques ou préventives qui empêchent ou ralentissent le développement d'une affection ou d’un trouble pathologique ciblé(e). Ainsi, ceux qui ont besoin d'un traitement incluent ceux qui ont déjà le trouble ; ceux qui sont susceptibles d'avoir le trouble ; et ceux chez qui le trouble doit être prévenu.“Treatment” refers to biomembrane both (1) therapeutic measures that cure, slow, alleviate symptoms, and/or stop the progression of a diagnosed disease or disorder and (2) prophylactic or preventive measures that prevent or slow the development of a targeted disease or disorder. Thus, those in need of treatment include those who already have the disorder; those who are likely to have the disorder; and those in whom the disorder is to be prevented.
« Sujet », « individu » et « patient », utilisés ici de manière interchangeable, font référence à tout animal (par ex. un mammifère), y compris, mais sans s'y limiter, les humains, primates non humains, canidés, félins et rongeurs.“Subject,” “individual,” and “patient,” used interchangeably herein, refer to any animal (e.g., a mammal), including, but not limited to, humans, non-human primates, canines, felines, and rodents.
« Réponse prolongée » fait référence à l'effet prolongé sur la réduction de l'inflammation après l'arrêt d'un traitement. Dans certains modes de réalisation, la réponse prolongée a une durée qui est au moins la même que la durée du traitement, au moins 1,5x, 2,0x, 2,5x ou 3,0x l’étendue de la durée du traitement.“Sustained response” refers to the sustained effect on reducing inflammation after stopping a treatment. In some embodiments, the sustained response has a duration that is at least the same as the duration of the treatment, at least 1.5x, 2.0x, 2.5x or 3.0x the extent of the duration of the treatment.
Une « réponse complète » ou « RC » fait référence à la disparition de toutes les lésions cibles ; « réponse partielle » ou « RP » fait référence à une diminution d'au moins 30 % de la somme des diamètres les plus longs (SLD, de l’anglais « sum of the longest diameters ») des lésions cibles, en prenant comme référence la SLD de base ; et « maladie stable » ou « SD » ne fait référence ni à un rétrécissement suffisant des lésions cibles pour se qualifier pour la RP, ni à une augmentation suffisante pour se qualifier pour la PD, en prenant comme référence la plus petite SLD depuis que le traitement a débuté.A “complete response” or “CR” refers to the disappearance of all target lesions; “partial response” or “PR” refers to a decrease of at least 30% in the sum of the longest diameters (SLD) of target lesions, taking the baseline SLD as a reference; and “stable disease” or “SD” refers to neither sufficient shrinkage of target lesions to qualify for PR nor sufficient increase to qualify for PD, taking the smallest SLD since treatment initiation as a reference.
La « survie sans progression » (PFS, de l’anglais « Progression free survival ») fait référence à la durée pendant et après le traitement pendant laquelle la maladie que l’on traite (par ex. une maladie inflammatoire ou auto-immune) ne s'aggrave pas. La survie sans progression peut inclure la durée pendant laquelle les patients ont présenté une réponse complète ou une réponse partielle, ainsi que la durée pendant laquelle les patients ont présenté une maladie stable.Progression-free survival (PFS) refers to the length of time during and after treatment that the disease being treated (e.g., an inflammatory or autoimmune disease) does not get worse. Progression-free survival can include the length of time that patients have had a complete response or partial response, as well as the length of time that patients have had stable disease.
Le "taux de réponse global" (ORR, de l’anglais « Overall response rate ») fait référence à la somme du taux de réponse complète (RC) et du taux de réponse partielle (RP).The "overall response rate" (ORR) refers to the sum of the complete response (CR) rate and the partial response (PR) rate.
La « survie globale » fait référence au pourcentage d'individus dans un groupe qui sont susceptibles d'être en vie après une période de temps donnée."Overall survival" refers to the percentage of individuals in a group who are likely to be alive after a given period of time.
"Agoniste" et "agoniste" font référence à des agents qui sont capables de/d’, directement ou indirectement, induire, activer, promouvoir, augmenter ou amplifier sensiblement l'activité biologique d'une cible ou d'une voie cible. "Agoniste" est utilisé ici pour inclure tout agent qui induit, active, favorise, augmente ou amplifie partiellement ou totalement l'activité d'une protéine ou d'une autre cible d'intérêt.“Agonist” and “agonist” refer to agents that are capable of, directly or indirectly, inducing, activating, promoting, increasing or substantially amplifying the biological activity of a target or target pathway. “Agonist” is used herein to include any agent that partially or completely induces, activates, promotes, increases or amplifies the activity of a protein or other target of interest.
"Antagoniste" et "antagoniste" font référence à ou décrivent un agent qui est capable, directement ou indirectement, partiellement ou totalement de bloquer, d'inhiber, de réduire ou de neutraliser une activité biologique d'une cible et/ou d'une voie. Le terme « antagoniste » est utilisé ici pour inclure tout agent qui bloque partiellement ou totalement, inhibe, réduit ou neutralise l'activité d'une protéine ou d'une autre cible d'intérêt.“Antagonist” and “antagonist” refer to or describe an agent that is capable, directly or indirectly, partially or completely, of blocking, inhibiting, reducing or neutralizing a biological activity of a target and/or pathway. The term “antagonist” is used herein to include any agent that partially or completely blocks, inhibits, reduces or neutralizes the activity of a protein or other target of interest.
"Modulation" et "moduler" font référence à un changement ou une altération d'une activité biologique. La modulation comprend, mais sans s'y limiter, la stimulation d'une activité ou l'inhibition d'une activité. La modulation peut être une augmentation de l'activité ou une diminution de l'activité, une modification des caractéristiques de liaison, ou tout autre changement des propriétés biologiques, fonctionnelles ou immunologiques associées à l'activité d'une protéine, d'une voie, d'un système ou d'autres cibles biologiques d'intérêt.“Modulation” and “modulate” refer to a change or alteration of a biological activity. Modulation includes, but is not limited to, stimulation of an activity or inhibition of an activity. Modulation may be an increase in activity or a decrease in activity, a change in binding characteristics, or any other change in biological, functional, or immunological properties associated with the activity of a protein, pathway, system, or other biological target of interest.
Une réponse immunitaire comprend les réponses de chacun du système immunitaire inné et du système immunitaire adaptatif. Elle inclut à la fois les réponses immunitaires à médiation cellulaire et/ou humorales. Elle inclut à la fois les réponses des lymphocytes T et des lymphocytes B, ainsi que les réponses d'autres cellules du système immunitaire telles que les lymphocytes tueurs naturels (NK), les monocytes, les macrophages, etc.An immune response includes responses from both the innate immune system and the adaptive immune system. It includes both cell-mediated and/or humoral immune responses. It includes both T-cell and B-cell responses, as well as responses from other cells of the immune system such as natural killer (NK) cells, monocytes, macrophages, etc.
« Pharmaceutiquement acceptable » fait référence à une substance approuvée ou approuvable par un organisme de réglementation du gouvernement fédéral ou d'un gouvernement d'Etat ou répertoriée dans la pharmacopée américaine ou une autre pharmacopée généralement reconnue pour une utilisation chez les animaux, dont les humains.“Pharmaceutically acceptable” means a substance that is approved or approvable by a federal or state government regulatory agency or is listed in the United States Pharmacopeia or other generally recognized pharmacopoeia for use in animals, including humans.
« Excipient pharmaceutiquement acceptable » est un excipient, support ou adjuvant qui peut être administré à un sujet, avec au moins un agent de la présente divulgation, et qui ne détruit pas l'activité pharmacologique de celui-ci et qui est non toxique lorsqu'il est administré à des doses suffisantes pour délivrer un effet thérapeutique. En général, les personnes du métier et la FDA (de l’anglais « Food & Drug Administration », soit « Agence fédérale américaine des produits alimentaires et médicamenteux ») des Etats-Unis considèrent qu'un excipient, support ou adjuvant pharmaceutiquement acceptable est un ingrédient inactif de toute formulation."Pharmaceutically acceptable excipient" is an excipient, carrier or adjuvant that can be administered to a subject, together with at least one agent of the present disclosure, and that does not destroy the pharmacological activity thereof and is nontoxic when administered in doses sufficient to provide a therapeutic effect. In general, those skilled in the art and the United States Food and Drug Administration (FDA) consider a pharmaceutically acceptable excipient, carrier or adjuvant to be an inactive ingredient in any formulation.
Une « quantité efficace » (également appelée ici « quantité thérapeutiquement efficace » est une quantité d'un agent, tel qu'un agent TFNR2 AFFIMER®, efficace pour traiter une maladie ou un trouble chez un sujet tel qu'un mammifère. Dans le cas d'une maladie inflammatoire ou auto-immune, la quantité thérapeutiquement efficace d'un agent TFNR2 AFFIMER® a un effet thérapeutique et peut ainsi réduire l'inflammation ; soulager dans une certaine mesure au moins un des symptômes associés à la maladie inflammatoire ou auto-immune ; réduire la morbidité et la mortalité ; améliorer la qualité de vie ; ou une combinaison de ces effets.An “effective amount” (also referred to herein as a “therapeutically effective amount”) is an amount of an agent, such as a TFNR2 AFFIMER® agent, effective to treat a disease or disorder in a subject such as a mammal. In the case of an inflammatory or autoimmune disease, the therapeutically effective amount of a TFNR2 AFFIMER® agent has a therapeutic effect and may thereby reduce inflammation; alleviate to some extent at least one of the symptoms associated with the inflammatory or autoimmune disease; reduce morbidity and mortality; improve quality of life; or a combination of these effects.
DiversMiscellaneous
Il est entendu que partout où des modes de réalisation sont décrits ici avec le terme "comprenant", des modes de réalisation autrement analogues décrits avec les termes "consistant en" et/ou "consistant essentiellement en" sont également proposés. Il est également entendu que partout où des modes de réalisation sont décrits ici avec le langage "consistant essentiellement en", des modes de réalisation autrement analogues décrits avec les termes "consistant en" sont également proposés.It is understood that wherever embodiments are described herein with the term "comprising," otherwise analogous embodiments described with the terms "consisting of" and/or "consisting essentially of" are also provided. It is further understood that wherever embodiments are described herein with the language "consisting essentially of," otherwise analogous embodiments described with the terms "consisting of" are also provided.
Telle qu'utilisée ici, la référence à « environ » ou « approximativement » une valeur ou un paramètre inclut (et décrit) des modes de réalisation qui concernent cette valeur ou ce paramètre. Par exemple, la description faisant référence à "environ X" inclut la description de "X".As used herein, reference to "about" or "approximately" a value or parameter includes (and describes) embodiments that relate to that value or parameter. For example, the description referring to "about X" includes the description of "X".
Le terme "et/ou" tel qu'il est utilisé dans une phrase telle que "A et/ou B" ici est destiné à inclure à la fois A et B ; A ou B ; A (seul) ; et B (seul). De même, le terme "et/ou" tel qu'utilisé dans une phrase telle que "A, B et/ou C" est destiné à englober chacun des modes de réalisation suivants : A, B et C ; A, B ou C ; A ou C ; A ou B ; B ou C ; A et C ; A et B ; B et C ; A (seul) ; B (seul) ; et C (seul).The term "and/or" as used in a phrase such as "A and/or B" herein is intended to include both A and B; A or B; A (alone); and B (alone). Similarly, the term "and/or" as used in a phrase such as "A, B, and/or C" is intended to encompass each of the following embodiments: A, B, and C; A, B, or C; A or C; A or B; B or C; A and C; A and B; B and C; A (alone); B (alone); and C (alone).
L'expression « au moins un » peut être utilisée de manière interchangeable avec « un ou plus ». Il convient de comprendre que "un" n'est pas limité à un mais signifie plutôt "au moins un".The phrase "at least one" can be used interchangeably with "one or more." It should be understood that "one" is not limited to one but rather means "at least one."
Polypeptide TFNR2 AFFIMER®Polypeptide TFNR2 AFFIMER®
Un polypeptide AFFIMER® est un échafaudage basé sur un polypeptide de Stéfine A, ce qui signifie qu'il a une séquence qui est dérivée d'un polypeptide de Stéfine A, par exemple, un polypeptide de Stéfine A de mammifère, par exemple, un polypeptide de Stéfine A humain. Certains aspects de la demande concernent des polypeptides AFFIMER® qui se lient au TFNR2 (également appelés « polypeptides TFNR2 AFFIMER® ») dans lesquels au moins une des boucles accessibles à solvant de la protéine Stéfine A de type sauvage ayant la capacité de se lier au TFNR2, de préférence sélectivement, et de préférence avec un Kd de 10-6M ou moins.An AFFIMER® polypeptide is a scaffold based on a Stefin A polypeptide, meaning that it has a sequence that is derived from a Stefin A polypeptide, e.g., a mammalian Stefin A polypeptide, e.g., a human Stefin A polypeptide. Certain aspects of the application relate to AFFIMER® polypeptides that bind to TFNR2 (also referred to as “TFNR2 AFFIMER® polypeptides”) wherein at least one of the solvent accessible loops of the wild-type Stefin A protein has the ability to bind to TFNR2, preferably selectively, and preferably with a Kd of 10-6 M or less.
Dans certains modes de réalisation, un polypeptide TFNR2 AFFIMER® est dérivé du polypeptide de Stéfine A humain de type sauvage ayant une séquence squelette et dans laquelle l'une ou les deux parmi la boucle 2 [désignée (Xaa)n] et la boucle 4 [désignée (Xaa)m] sont remplacées par des séquences de boucles alternatives (Xaa)n et (Xaa)m, pour avoir la formule générale (I)In some embodiments, a TFNR2 AFFIMER® polypeptide is derived from wild-type human Stefin A polypeptide having a backbone sequence and wherein one or both of loop 2 [designated (Xaa)n] and loop 4 [designated (Xaa)m] are replaced with alternative loop sequences (Xaa)n and (Xaa)m, to have the general formula (I)
FR1-(Xaa)n-FR2-(Xaa)m-FR3 (I)FR1-(Xaa)n-FR2-(Xaa)m-FR3 (I)
oùOr
FR1 est une séquence polypeptidique représentée par MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TGETYGKLEA VQYKTQVX (SEQ ID NO: 1) ou une séquence polypeptidique ayant au moins 70 % (par ex. au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 % ou 100 %) d'identité avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, où X est n'importe quel nombre d'acides aminés sélectionnés indépendamment, plus convenablement trois ou moins acides aminés sélectionnés indépendamment, ou plus convenablement X est V ; et/ouFR1 is a polypeptide sequence represented by MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TGETYGKLEA VQYKTQVX (SEQ ID NO: 1) or a polypeptide sequence having at least 70% (e.g. at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% or 100%) identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, wherein X is any number of independently selected amino acids, more suitably three or less independently selected amino acids, or more suitably X is V; and/or
FR2 est une séquence polypeptidique comprenant la séquence d'acides aminés de GTNYYIKVRA GDNKYMHLKV FKSL (SEQ ID NO : 2) ou une séquence polypeptidique ayant au moins 70 % (par ex. au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 % ou 100 %) d'identité avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 2 ;FR2 is a polypeptide sequence comprising the amino acid sequence of GTNYYIKVRA GDNKYMHLKV FKSL (SEQ ID NO: 2) or a polypeptide sequence having at least 70% (e.g. at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% or 100%) identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
FR3 est une séquence polypeptidique comprenant la séquence d'acides aminés de EDLVLTGYQV DKNKDDELTG F (SEQ ID NO : 3) ou une séquence polypeptidique ayant au moins 70 % (par ex. au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 % ou 100 %) d'identité avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 3 ; etFR3 is a polypeptide sequence comprising the amino acid sequence of EDLVLTGYQV DKNKDDELTG F (SEQ ID NO: 3) or a polypeptide sequence having at least 70% (e.g. at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% or 100%) identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and
Xaa, individuellement pour chaque occurrence, est un résidu d'acide aminé ; etXaa, individually for each occurrence, is an amino acid residue; and
n et m sont chacun, indépendamment, un nombre entier de 3 à 20.n and m are each, independently, an integer from 3 to 20.
Dans certains modes de réalisation, FR1 est une séquence polypeptidique ayant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % d'homologie avec SEQ ID NO : 1. Dans certains modes de réalisation, FR1 est une séquence polypeptidique ayant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % d'identité avec SEQ ID NO : 1 ; dans certains modes de réalisation, FR2 est une séquence polypeptidique ayant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou même 98 % d'homologie avec SEQ ID NO : 2. Dans certains modes de réalisation, FR2 est une séquence polypeptidique ayant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % d'identité avec SEQ ID NO : 2 ; dans certains modes de réalisation, FR3 est une séquence polypeptidique ayant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou même 98 % d'homologie avec SEQ ID NO : 3. Dans certains modes de réalisation, FR3 est une séquence polypeptidique ayant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % d'identité avec SEQ ID NO: 3.In some embodiments, FR1 is a polypeptide sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%, or even 98% homology to SEQ ID NO: 1. In some embodiments, FR1 is a polypeptide sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%, or even 98% identity to SEQ ID NO: 1; in some embodiments, FR2 is a polypeptide sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%, or even 98% homology to SEQ ID NO: 2. In some embodiments, FR2 is a polypeptide sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%, or even 98% identity to SEQ ID NO: 2; in some embodiments, FR3 is a polypeptide sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%, or even 98% homology to SEQ ID NO: 3. In some embodiments, FR3 is a polypeptide sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%, or even 98% identity to SEQ ID NO: 3.
Dans certains modes de réalisation, le polypeptide TNFR2 AFFIMER® a une séquence d'acides aminés représentée dans la Formule générale (II) :In some embodiments, the TNFR2 AFFIMER® polypeptide has an amino acid sequence represented in General Formula (II):
MIP-Xaa1-GLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVV-(Xaa)n-Xaa2-TNYYIKVRAGDNKYMHLKVF-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa)m-Xaa6-D-Xaa7-VLTGYQVDKNKDDELTGF (SEQ ID NO: 4)(SEQ ID NO: 4)
oùOr
Xaa, individuellement pour chaque occurrence, est un résidu d'acide aminé, etXaa, individually for each occurrence, is an amino acid residue, and
n et m sont chacun, indépendamment, un nombre entier de 3 à 20.n and m are each, independently, an integer from 3 to 20.
Dans certains modes de réalisation, le polypeptide TNFR2 AFFIMER® comprend une séquence d'acides aminés ayant au moins 90 % (par ex. au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, au moins 99 %, ou 100 %) d’identité avec la séquence d'acides aminés de :In some embodiments, the TNFR2 AFFIMER® polypeptide comprises an amino acid sequence having at least 90% (e.g., at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) identity to the amino acid sequence of:
MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVD-(Xaa)n-GTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSL-(Xaa)m-EDLVLTGYQVDKNKDDELTGF (SEQ ID NO: 5), oùMIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVD-(Xaa)n-GTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSL-(Xaa)m-EDLVLTGYQVDKNKDDELTGF (SEQ ID NO: 5), where
Xaa, individuellement pour chaque occurrence, est un résidu d'acide aminé, etXaa, individually for each occurrence, is an amino acid residue, and
n et m sont chacun, indépendamment, un nombre entier de 3 à 20.n and m are each, independently, an integer from 3 to 20.
Dans certains modes de réalisation, Xaa1 est Gly, Ala, Val, Arg, Lys, Asp ou Glu, plus préférablement Gly, Ala, Arg ou Lys, et plus encore plus préférablement Gly ou Arg ; Xaa2 est Gly, Ala, Val, Ser ou Thr, plus préférablement Gly ou Ser ; Xaa3 est Arg, Lys, Asn, Gln, Ser, Thr, plus préférablement Arg, Lys, Asn ou Gln, et encore plus préférablement Lys ou Asn ; Xaa4 est Gly, Ala, Val, Ser ou Thr, plus préférablement Gly ou Ser ; Xaa5 est Ala, Val, Ile, Leu, Gly ou Pro, plus préférablement Ile, Leu ou Pro, et encore plus préférablement Leu ou Pro ; Xaa6 est Gly, Ala, Val, Asp ou Glu, plus préférablement Ala, Val, Asp ou Glu, et encore plus préférablement Ala ou Glu ; et Xaa7 est Ala, Val, Ile, Leu, Arg ou Lys, plus préférablement Ile, Leu ou Arg, et encore plus préférablement Leu ou Arg.In some embodiments, Xaa1 is Gly, Ala, Val, Arg, Lys, Asp or Glu, more preferably Gly, Ala, Arg or Lys, and even more preferably Gly or Arg; Xaa2 is Gly, Ala, Val, Ser or Thr, more preferably Gly or Ser; Xaa3 is Arg, Lys, Asn, Gln, Ser, Thr, more preferably Arg, Lys, Asn or Gln, and even more preferably Lys or Asn; Xaa4 is Gly, Ala, Val, Ser or Thr, more preferably Gly or Ser; Xaa5 is Ala, Val, Ile, Leu, Gly or Pro, more preferably Ile, Leu or Pro, and even more preferably Leu or Pro; Xaa6 is Gly, Ala, Val, Asp or Glu, more preferably Ala, Val, Asp or Glu, and even more preferably Ala or Glu; and Xaa7 is Ala, Val, Ile, Leu, Arg or Lys, more preferably Ile, Leu or Arg, and even more preferably Leu or Arg.
Dans certains modes de réalisation, n est de 3 à 15, 3 à 12, 3 à 9, 3 à 7, 5 à 7, 5 à 9, 5 à 12, 5 à 15, 7 à 12 ou 7 à 9.In some embodiments, n is 3 to 15, 3 to 12, 3 to 9, 3 to 7, 5 to 7, 5 to 9, 5 to 12, 5 to 15, 7 to 12, or 7 to 9.
Dans certains modes de réalisation, m est de 3 à 15, 3 à 12, 3 à 9, 3 à 7, 5 à 7, 5 à 9, 5 à 12, 5 à 15, 7 à 12 ou 7 à 9.In some embodiments, m is 3 to 15, 3 to 12, 3 to 9, 3 to 7, 5 to 7, 5 to 9, 5 to 12, 5 to 15, 7 to 12, or 7 to 9.
Dans certains modes de réalisation, Xaa, indépendamment pour chaque occurrence, est un acide aminé qui peut être ajouté à un polypeptide par expression recombinante dans une cellule procaryote ou eucaryote, et encore plus préférablement l'un des 20 acides aminés d’occurrence naturelle.In some embodiments, Xaa, independently for each occurrence, is an amino acid that can be added to a polypeptide by recombinant expression in a prokaryotic or eukaryotic cell, and even more preferably one of the 20 naturally occurring amino acids.
Dans certains modes de réalisation des séquences et formules ci-dessus, (Xaa)n est une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 6 à 102, ou est une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % d'homologie avec une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 6 à 102. Dans certains modes de réalisation, (Xaa)n est une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % d'identité avec une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 6 à 102.In some embodiments of the above sequences and formulas, (Xaa)n is an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 6 to 102, or is an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95% or even 98% homology to a sequence selected from SEQ ID NOs: 6 to 102. In some embodiments, (Xaa)n is an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95% or even 98% identity to a sequence selected from SEQ ID NOs: 6 to 102.
Dans certains modes de réalisation des séquences et formules ci-dessus, (Xaa)m est une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 103 à 199, ou est une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % d'homologie avec une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 103 à 199. Dans certains modes de réalisation, (Xaa)m est une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % d'identité avec une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 103 à 199.In some embodiments of the above sequences and formulas, (Xaa)m is an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 103 to 199, or is an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95% or even 98% homology to a sequence selected from SEQ ID NOs: 103 to 199. In some embodiments, (Xaa)m is an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95% or even 98% identity to a sequence selected from SEQ ID NOs: 103 to 199.
Dans certains modes de réalisation, le polypeptide TNFR2 AFFIMER® a une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 200 à 296, où la séquence exclut optionnellement un ou plus des vingt-et-un résidus carboxy terminaux. Dans certains modes de réalisation, le polypeptide TNFR2 AFFIMER®® a une séquence d'acides aminés ayant au moins 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % d'identité avec une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 200 à 296, où la séquence exclut optionnellement un ou plus des vingt-et-un résidus carboxy terminaux.In some embodiments, the TNFR2 AFFIMER® polypeptide has an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 200 to 296, wherein the sequence optionally excludes one or more of the twenty-one carboxy terminal residues. In some embodiments, the TNFR2 AFFIMER® polypeptide has an amino acid sequence having at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or even 98% identity to a sequence selected from SEQ ID NO: 200 to 296, wherein the sequence optionally excludes one or more of the twenty-one carboxy terminal residues.
Tableau 1. Séquences polypeptidiques du TNFR2 AFFIMER®. Les 21 acides aminés C-terminaux sont des séquences supplémentaires ajoutées à des fins de clonage et d’essais : Lieur 3xAla, étiquette à dix acides aminés Myc, lieur 2xAla et étiquette 6xHis, qui sont tous facultatifs et non nécessaires pour la présente invention.
Dans certains modes de réalisation, le polypeptide TNFR2 AFFIMER® a une séquence d'acides aminés qui est codée par un acide nucléique ayant une séquence codante au moins à 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % identique à une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 297 à 393, en excluant optionnellement les nucléotides codant pour les vingt-et-un acides aminés carboxy-terminaux. Dans certains modes de réalisation, le polypeptide TNFR2 AFFIMER® a une séquence d'acides aminés qui est codée par un acide nucléique qui ayant une séquence codante qui s’hybride à une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 297 à 393 en excluant optionnellement les nucléotides codant pour les vingt-et-un acides aminés carboxy-terminaux dans des conditions strictes (tel qu’en présence de chlorure de sodium/citrate de sodium (SSC) 6X à 45 °C suivi d'un lavage dans du SSC 0,2X à 65 °C.In some embodiments, the TNFR2 AFFIMER® polypeptide has an amino acid sequence that is encoded by a nucleic acid having a coding sequence that is at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or even 98% identical to a sequence selected from SEQ ID NO: 297 to 393, optionally excluding the nucleotides encoding the twenty-one carboxy-terminal amino acids. In some embodiments, the TNFR2 AFFIMER® polypeptide has an amino acid sequence that is encoded by a nucleic acid that has a coding sequence that hybridizes to a sequence selected from SEQ ID NO: 297 to 393 optionally excluding nucleotides encoding the twenty-one carboxy-terminal amino acids under stringent conditions (such as in the presence of 6X sodium chloride/sodium citrate (SSC) at 45°C followed by washing in 0.2X SSC at 65°C.
Tableau 2 : Séquences d'acides nucléiques de la présente invention. Les 5' 63 nucléotides codant pour les 21 acides aminés C-terminaux sont des séquences supplémentaires ajoutées à des fins de clonage et d’essai : Lieur 3xAla, étiquette à dix acides aminés Myc, lieur 2xAla et étiquette 6xHis, qui sont tous facultatifs et non nécessaires pour la présente invention.
En outre, des modifications mineures peuvent également inclure de petit(e)s délétions ou ajouts - au-delà des inserts de boucle 2 et de boucle 4 décrits ci-dessus - aux séquences dérivées de la Stéfine A ou de Stéfine A décrites ici, telles que l'ajout ou la délétion de jusqu'à 10 acides aminés par rapport à la Stéfine A ou au polypeptide AFFIMER® dérivé de la Stéfine A.Additionally, minor modifications may also include small deletions or additions - beyond the loop 2 and loop 4 inserts described above - to the Stefin A or Stefin A-derived sequences described herein, such as the addition or deletion of up to 10 amino acids relative to the Stefin A or Stefin A-derived AFFIMER® polypeptide.
Dans certains modes de réalisation, l'agent AFFIMER® est un agent TNFR2 AFFIMER® comprenant une partie polypeptidique AFFIMER® qui se lie au TNFR2 humain en tant que monomère avec une constante de dissociation (KD) d'environ 1 uM ou moins, d'environ 100 nM ou moins, d'environ 40 nM ou moins, d’environ 20 nM ou moins, d’environ 10 nM ou moins, d’environ 1 nM ou moins, ou d’environ 0,1 nM ou moins.In some embodiments, the AFFIMER® agent is a TNFR2 AFFIMER® agent comprising an AFFIMER® polypeptide portion that binds to human TNFR2 as a monomer with a dissociation constant (KD) of about 1 uM or less, about 100 nM or less, about 40 nM or less, about 20 nM or less, about 10 nM or less, about 1 nM or less, or about 0.1 nM or less.
Dans certains modes de réalisation, l'agent AFFIMER® est un agent TNFR2 AFFIMER® comprenant une partie polypeptidique AFFIMER® qui se lie au TNFR2 humain en tant que monomère avec une constante de taux de décalage (Koff, de l’anglais « off-rate constant »), telle que mesurée par l’essai BIACORE™, d'environ 10-3s-1(par ex. unité en 1/seconde) ou plus lent ; d'environ 10-4s-1ou moins ou même d'environ 10-5s-1ou moins.In some embodiments, the AFFIMER® agent is a TNFR2 AFFIMER® agent comprising an AFFIMER® polypeptide portion that binds to human TNFR2 as a monomer with an off-rate constant (Koff), as measured by the BIACORE™ assay, of about 10-3 s-1 (e.g., units in 1/second) or slower; about 10-4 s-1 or less; or even about 10-5 s-1 or less.
Dans certains modes de réalisation, l'agent AFFIMER® est un agent TNFR2 AFFIMER® comprenant une partie polypeptidique AFFIMER® qui se lie au TNFR2 humain en tant que monomère avec une constante d'association (Kon), telle que mesurée par l’essai BIACORE™, d'au moins environ 103 M-1s-1 ou plus rapide ; d’au moins environ 104 M-1s-1 ou plus rapide ; d’au moins environ 105 M-1s-1 ou plus rapide ; ou même d’au moins environ 106 M-1s-1 ou plus rapide.In some embodiments, the AFFIMER® agent is a TNFR2 AFFIMER® agent comprising an AFFIMER® polypeptide portion that binds to human TNFR2 as a monomer with an association constant (Kon), as measured by the BIACORE™ assay, of at least about 103 M-1s-1 or faster; at least about 104 M-1s-1 or faster; at least about 105 M-1s-1 or faster; or even at least about 106 M-1s-1 or faster.
Dans certains modes de réalisation, l'agent AFFIMER® est un agent TNFR2 AFFIMER® comprenant une partie polypeptidique AFFIMER® qui se lie au TNFR2 humain en tant que monomère avec une CI50 dans un essai de liaison en concurrence avec le TNFR2 humain de 1 uM ou moins, d'environ 100 nM ou moins, d'environ 40 nM ou moins, d’environ 20 nM ou moins, d’environ 10 nM ou moins, d’environ 1 nM ou moins, ou d’environ 0,1 nM ou moins.In some embodiments, the AFFIMER® agent is a TNFR2 AFFIMER® agent comprising an AFFIMER® polypeptide portion that binds to human TNFR2 as a monomer with an IC50 in a competitive binding assay with human TNFR2 of 1 uM or less, about 100 nM or less, about 40 nM or less, about 20 nM or less, about 10 nM or less, about 1 nM or less, or about 0.1 nM or less.
Dans certains modes de réalisation, l'agent AFFIMER® a une température de fusion (Tm, par ex. la température à laquelle les états replié et déplié sont également peuplés) de 65°C ou plus, et de préférence d'au moins 70°C, 75°C, 80°C. °C ou même 85°C ou plus. La température de fusion est un indicateur particulièrement utile de la stabilité des protéines. Les proportions relatives de protéines repliées et non repliées peuvent être déterminées par de nombreuses techniques connues de la personne du métier, y compris la calorimétrie différentielle à balayage, la spectroscopie par différence aux UV, la fluorescence, le dichroïsme circulaire (CD de l’anglais « circular dichroism ») et la RMN (Pace et al. (1997) "Measuring the conformational stability of a protein" in Protein structure: A practical approach 2: 299-321).In some embodiments, the AFFIMER® agent has a melting temperature (Tm, e.g., the temperature at which the folded and unfolded states are equally populated) of 65°C or greater, and preferably at least 70°C, 75°C, 80°C, or even 85°C or greater. The melting temperature is a particularly useful indicator of protein stability. The relative proportions of folded and unfolded proteins can be determined by many techniques known to those skilled in the art, including differential scanning calorimetry, UV difference spectroscopy, fluorescence, circular dichroism (CD), and NMR (Pace et al. (1997) "Measuring the conformational stability of a protein" in Protein structure: A practical approach 2: 299-321).
Protéines de Fusion - GénéralFusion Proteins - General
Dans certains modes de réalisation, les polypeptides AFFIMER® peuvent en outre comprendre une insertion, substitution et/ou délétion supplémentaire qui module l'activité biologique du polypeptide AFFIMER®. Par exemple, les additions, substitutions et/ou délétions peuvent moduler au moins une propriété ou activité des polypeptides AFFIMER® modifiés. Par exemple, les additions, substitutions ou délétions peuvent moduler l'affinité pour le polypeptide AFFIMER®, par ex. pour la liaison à, et l'inhibition du, TNFR2, moduler la demi-vie circulante, moduler la demi-vie thérapeutique, moduler la stabilité du polypeptide AFFIMER®, moduler le clivage par les protéases, moduler la dose, moduler la libération ou la biodisponibilité, faciliter la purification, diminuer la désamidation, améliorer la durée de péremption, ou améliorer ou altérer une voie d'administration particulière. Similairement, les polypeptides AFFIMER® peuvent comprendre des séquences de clivage de protéase, des groupes réactifs, des domaines de liaison d'anticorps (y compris, mais sans s'y limiter, FLAG ou poly-His) ou d'autres séquences basées sur l'affinité (y compris, mais sans s'y limiter, FLAG, poly-His, GST, etc.) ou des molécules liées (y compris, mais sans s'y limiter, la biotine) qui améliorent la détection, la purification ou d'autres caractéristiques du polypeptide.In some embodiments, the AFFIMER® polypeptides may further comprise an additional insertion, substitution, and/or deletion that modulates the biological activity of the AFFIMER® polypeptide. For example, the additions, substitutions, and/or deletions may modulate at least one property or activity of the modified AFFIMER® polypeptides. For example, the additions, substitutions, or deletions may modulate affinity for the AFFIMER® polypeptide, e.g., for binding to, and inhibition of, TNFR2, modulate circulating half-life, modulate therapeutic half-life, modulate stability of the AFFIMER® polypeptide, modulate protease cleavage, modulate dose, modulate release or bioavailability, facilitate purification, decrease deamidation, improve shelf life, or improve or alter a particular route of administration. Similarly, AFFIMER® polypeptides may include protease cleavage sequences, reactive groups, antibody binding domains (including, but not limited to, FLAG or poly-His) or other affinity-based sequences (including, but not limited to, FLAG, poly-His, GST, etc.) or linked molecules (including, but not limited to, biotin) that enhance the detection, purification or other characteristics of the polypeptide.
Dans certains cas, ces séquences supplémentaires sont ajoutées à une extrémité et/ou à l'autre du polypeptide AFFIMER® sous la forme d'une protéine de fusion. En conséquence, dans certains aspects de la divulgation, l'agent AFFIMER® est une protéine de fusion ayant au moins une séquence polypeptidique AFFIMER® et au moins une séquence polypeptidique hétérologue ("domaine de fusion" ici). Un domaine de fusion peut être sélectionné de manière à conférer une propriété souhaitée, telle que la sécrétion depuis une cellule ou la rétention à la surface de la cellule (par ex. pour un polynucléotide AFFIMER® codé), servir de substrat ou d'autre séquence de reconnaissance pour les modifications post-traductionnelles, créer des structures multimériques s'agrégeant par des interactions protéine-protéine, altérer (souvent pour étendre) la demi-vie sérique, ou altérer la localisation de tissus ou l'exclusion de tissus et autres propriétés ADME (de l’anglais « Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion », soit en français « Absorption, Distribution, Métabolisme, and Excrétion ») - simplement à titre d'exemples.In some cases, these additional sequences are added to one end and/or the other of the AFFIMER® polypeptide in the form of a fusion protein. Accordingly, in some aspects of the disclosure, the AFFIMER® agent is a fusion protein having at least one AFFIMER® polypeptide sequence and at least one heterologous polypeptide sequence ("fusion domain" herein). A fusion domain may be selected to confer a desired property, such as secretion from a cell or retention on the cell surface (e.g., for an encoded AFFIMER® polynucleotide), serve as a substrate or other recognition sequence for post-translational modifications, create multimeric structures that aggregate through protein-protein interactions, alter (often to extend) serum half-life, or alter tissue localization or tissue exclusion and other ADME (Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion) properties - by way of example only.
Par exemple, certains domaines de fusion sont particulièrement utiles pour l'isolement et/ou la purification des protéines de fusion, tel que par chromatographie d'affinité. Des exemples bien connus de tels domaines de fusion qui facilitent l'expression ou la purification comprennent, à simple titre illustratif, des étiquettes d'affinité telles que la polyhistidine (par ex. une étiquette His6), l'étiquette Strep II, l'étiquette de peptide de liaison à la streptavidine (SBP, de l’anglais « streptavidin-binding peptide »), le peptide de liaison à la calmoduline (CBP, de l’anglais « calmodulin-binding peptide »), la glutathion S-transférase (GST de l’anglais « glutathione S-transferase »), la protéine de liaison au maltose (MBP, de l’anglais « maltose-binding protein »), l’étiquette S, l’étiquette HA, l’étiquette c-Myc, la thiorédoxine, la protéine A et la protéine G.For example, certain fusion domains are particularly useful for the isolation and/or purification of fusion proteins, such as by affinity chromatography. Well-known examples of such fusion domains that facilitate expression or purification include, by way of illustration only, affinity tags such as polyhistidine (e.g., a His6 tag), Strep II tag, streptavidin-binding peptide (SBP) tag, calmodulin-binding peptide (CBP), glutathione S-transferase (GST), maltose-binding protein (MBP), S-tag, HA-tag, c-Myc-tag, thioredoxin, protein A, and protein G.
Pour que l'agent AFFIMER® soit sécrété, il contiendra généralement une séquence signal qui dirige le transport de la protéine vers la lumière du réticulum endoplasmique et finalement pour être sécrétée (ou retenue sur la surface cellulaire si un domaine transmembranaire ou autre signal de rétention sur la surface cellulaire). Les séquences signal (également appelées peptides signaux ou séquences leader) sont situées à l'extrémité N-terminale des polypeptides naissants. Elles ciblent le polypeptide vers le réticulum endoplasmique et les protéines sont triées vers leurs destinations, par exemple vers l'espace interne d'un organite, vers une membrane interne, vers la membrane externe de la cellule, ou vers l'extérieur de la cellule par sécrétion. De nombreuses séquences signal sont clivées de la protéine par une peptidase signal après le transport des protéines jusqu’au réticulum endoplasmique. Le clivage de la séquence signal du polypeptide survient habituellement à un site spécifique dans la séquence d'acides aminés et dépend des résidus d'acides aminés dans la séquence signal.In order for the AFFIMER® agent to be secreted, it will typically contain a signal sequence that directs the protein to be transported to the lumen of the endoplasmic reticulum and ultimately to be secreted (or retained on the cell surface if a transmembrane domain or other retention signal on the cell surface). Signal sequences (also called signal peptides or leader sequences) are located at the N-terminus of nascent polypeptides. They target the polypeptide to the endoplasmic reticulum and the proteins are sorted to their destinations, such as to the internal space of an organelle, to an inner membrane, to the outer membrane of the cell, or to the outside of the cell by secretion. Many signal sequences are cleaved from the protein by a signal peptidase after the proteins have been transported to the endoplasmic reticulum. Cleavage of the signal sequence from the polypeptide usually occurs at a specific site in the amino acid sequence and is dependent on the amino acid residues in the signal sequence.
Dans certains modes de réalisation, le peptide signal a une longueur d'environ 5 à environ 40 acides aminés (tel qu’environ 5 à environ 7, environ 7 à environ 10, environ 10 à environ 15, environ 15 à environ 20, environ 20 à environ 25, ou environ 25 à environ 30, environ 30 à environ 35, ou environ 35 à environ 40 acides aminés de longueur).In some embodiments, the signal peptide is about 5 to about 40 amino acids in length (such as about 5 to about 7, about 7 to about 10, about 10 to about 15, about 15 to about 20, about 20 to about 25, or about 25 to about 30, about 30 to about 35, or about 35 to about 40 amino acids in length).
Dans certains modes de réalisation, le peptide signal est un peptide signal natif d'une protéine humaine. Dans d'autres modes de réalisation, le peptide signal est un peptide signal non natif. Par exemple, dans certains modes de réalisation, le peptide signal non natif est un peptide signal natif mutant provenant de la protéine humaine sécrétée native correspondante, et peut inclure au moins une (tel que 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou plus) substitution, insertions et/ou délétions.In some embodiments, the signal peptide is a native signal peptide of a human protein. In other embodiments, the signal peptide is a non-native signal peptide. For example, in some embodiments, the non-native signal peptide is a mutant native signal peptide from the corresponding native secreted human protein, and may include at least one (such as 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 or more) substitutions, insertions, and/or deletions.
Dans certains modes de réalisation, le peptide signal est un peptide signal ou un mutant de celui-ci d'une famille de protéines non IgSF, tel qu'un peptide signal d'une immunoglobuline (telle qu'une IgG chaîne lourde ou une IgG-kappa chaîne légère), une cytokine (telle que l'interleukine-2 (IL-2), ou CD33), une protéine d'albumine sérique (par ex. HSA ou albumine), une séquence signal de préprotéine azurocidine humaine, une luciférase, un trypsinogène (par ex. chymotrypsinogène ou trypsinogène) ou un autre peptide signal capable de sécréter efficacement un protéine d'une cellule. Des exemples de peptides signal incluent, mais sans s'y limiter :In some embodiments, the signal peptide is a signal peptide or mutant thereof from a non-IgSF protein family, such as a signal peptide from an immunoglobulin (such as an IgG heavy chain or an IgG-kappa light chain), a cytokine (such as interleukin-2 (IL-2), or CD33), a serum albumin protein (e.g., HSA or albumin), a human azurocidin preprotein signal sequence, a luciferase, a trypsinogen (e.g., chymotrypsinogen or trypsinogen), or another signal peptide capable of efficiently secreting a protein from a cell. Examples of signal peptides include, but are not limited to:
Tableau 3. Séquences peptidiques signal
De nombreux lieurs naturels présentaient des structures α-hélicoïdales. La structure en hélice α était rigide et stable, avec des liaisons hydrogène intrasegment et un squelette étroitement compacté. Par conséquent, les lieurs α-hélicoïdaux raides peuvent agir comme espaceurs rigides entre domaines protéiques. George et al. (2002) “An analysis of protein domain linkers: their classification and role in protein folding” Protein Eng. 15(11):871-9. En général, les lieurs rigides présentent des structures relativement raides en adoptant des structures α-hélicoïdales ou en contenant de multiples résidus Pro. Dans de nombreuses circonstances, ils séparent les domaines fonctionnels plus efficacement que les lieurs flexibles. La longueur des lieurs peut être facilement ajustée en modifiant le nombre de copies pour obtenir une distance optimale entre les domaines. En conséquence, des lieurs rigides sont choisis lorsque la séparation spatiale des domaines est essentielle pour préserver la stabilité ou la bioactivité des protéines de fusion. A cet égard, des lieurs formant une hélice alpha avec la séquence de (EAAAK)n (SEQ ID NO: 421) ont été appliqués à la construction de nombreuses protéines de fusion recombinantes. Un autre type de lieurs rigides a une séquence riche en Pro, (XP)n, X désignant n'importe quel acide aminé, de préférence Ala, Lys ou Glu.Many natural linkers exhibited α-helical structures. The α-helical structure was rigid and stable, with intrasegment hydrogen bonds and a tightly packed backbone. Therefore, stiff α-helical linkers can act as rigid spacers between protein domains. George et al. (2002) “An analysis of protein domain linkers: their classification and role in protein folding” Protein Eng. 15(11):871-9. In general, stiff linkers exhibit relatively stiff structures by adopting α-helical structures or by containing multiple Pro residues. In many circumstances, they separate functional domains more efficiently than flexible linkers. The length of the linkers can be easily adjusted by changing the copy number to achieve an optimal distance between domains. Accordingly, stiff linkers are chosen when spatial separation of domains is essential to preserve the stability or bioactivity of fusion proteins. In this regard, alpha-helix linkers with the sequence of (EAAAK)n (SEQ ID NO: 421) have been applied to the construction of many recombinant fusion proteins. Another type of rigid linkers has a Pro-rich sequence, (XP)n, with X denoting any amino acid, preferably Ala, Lys or Glu.
A des fins purement d’illustration, des exemples de lieurs comprennent GRA, poly(Gly), poly(Ala) et ceux fournis dans le Tableau 4.For illustration purposes only, examples of linkers include GRA, poly(Gly), poly(Ala) and those provided in Table 4.
Tableau 4. Séquences de lieurs.
Le polypeptide AFFIMER® peut en outre comprendre, par exemple être fusionné à, un domaine transmembranaire (domaine TM). De tels domaines TM garantissent que le polypeptide AFFIMER® reste à la surface de la cellule exprimant l'AFFIMER®. Ces domaines TM sont facilement disponibles et incluent les CD3, CD8, CD28, PDGFR TMD et autres.The AFFIMER® polypeptide may further comprise, for example be fused to, a transmembrane domain (TM domain). Such TM domains ensure that the AFFIMER® polypeptide remains on the surface of the cell expressing the AFFIMER®. Such TM domains are readily available and include CD3, CD8, CD28, PDGFR TMD and others.
D'autres modifications, encore, qui peuvent être apportées à la séquence polypeptidique AFFIMER® ou à un groupement polypeptidique flanquant fourni en tant que partie d'une protéine de fusion sont au moins une séquence qui est un site de modification post-traductionnelle par une enzyme. Celles-ci peuvent inclure, mais sans s'y limiter, une glycosylation, une acétylation, une acylation, une modification lipidique, une palmitoylation, une addition de palmitate, une phosphorylation, une modification de la liaison glycolipidique, etc.Still further modifications that may be made to the AFFIMER® polypeptide sequence or a flanking polypeptide moiety provided as part of a fusion protein are at least one sequence that is a site of post-translational modification by an enzyme. These may include, but are not limited to, glycosylation, acetylation, acylation, lipid modification, palmitoylation, palmitate addition, phosphorylation, glycolipid linkage modification, etc.
Protéines de fusion multispécifiquesMultispecific fusion proteins
Dans certains modes de réalisation, un agent AFFIMER® est un polypeptide multispécifique incluant, par exemple, un premier polypeptide TNFR2 AFFIMER® et au moins un domaine de liaison supplémentaire. Le domaine de liaison supplémentaire peut être une séquence polypeptidique sélectionnée parmi, pour illustrer, un second polypeptide AFFIMER® (qui peut être identique ou différent du premier polypeptide AFFIMER®), un anticorps ou un fragment de celui-ci ou un autre polypeptide de liaison à antigène, une partie de liaison à ligand, d'un récepteur (tel qu'un polypeptide piège de récepteur, de l’anglais « receptor trap polypeptide »), un ligand de liaison à récepteur (tel qu'une cytokine, un facteur de croissance ou similaire), un récepteur de lymphocyte T d’ingénierie, une enzyme ou un fragment catalytique de celle-ci.In some embodiments, an AFFIMER® agent is a multispecific polypeptide including, for example, a first AFFIMER® TNFR2 polypeptide and at least one additional binding domain. The additional binding domain may be a polypeptide sequence selected from, for example, a second AFFIMER® polypeptide (which may be the same as or different from the first AFFIMER® polypeptide), an antibody or fragment thereof or another antigen-binding polypeptide, a ligand-binding portion of a receptor (such as a receptor trap polypeptide), a receptor-binding ligand (such as a cytokine, growth factor, or the like), an engineered T cell receptor, an enzyme or catalytic fragment thereof.
Dans certains modes de réalisation, un agent AFFIMER® inclut au moins une séquence polypeptidique AFFIMER® supplémentaire qui est également dirigée contre le TNFR2. Le(s) polypeptide(s) TNFR2 AFFIMER® supplémentaire(s) peu(ven)t être identique(s) ou différent(s) (ou un mélange de ceux-ci) du premier polypeptide TNFR2 AFFIMER® afin de créer une protéine de fusion AFFIMER® multispécifique. Les agents AFFIMER® peuvent se lier aux mêmes sites ou à des sites chevauchants sur TNFR2 ou peuvent se lier à deux sites différents de sorte que l'agent TNFR2 AFFIMER® peut se lier simultanément à deux sites sur la même protéine TNFR2 (biparatopique) ou à plus de deux sites (multiparatopique).In some embodiments, an AFFIMER® agent includes at least one additional AFFIMER® polypeptide sequence that is also directed against TNFR2. The additional AFFIMER® TNFR2 polypeptide(s) may be the same or different (or a mixture thereof) from the first AFFIMER® TNFR2 polypeptide to create a multispecific AFFIMER® fusion protein. The AFFIMER® agents may bind to the same or overlapping sites on TNFR2 or may bind to two different sites such that the AFFIMER® TNFR2 agent may bind simultaneously to two sites on the same TNFR2 protein (biparatopic) or to more than two sites (multiparatopic).
Dans certains modes de réalisation, un agent AFFIMER® inclut au moins un site de liaison à antigène provenant d'un anticorps. L'agent AFFIMER® résultant peut être une chaîne unique comprenant à la fois le polypeptide TNFR2 AFFIMER® et le site de liaison à antigène (comme dans le cas d'un scFv) ou peut être un complexe protéique multimérique comme dans un anticorps assemblé avec des chaînes lourdes et/ou légères auxquelles la séquence de l'anticorps anti-TNFR2 a également été fusionnée.In some embodiments, an AFFIMER® agent includes at least one antigen binding site from an antibody. The resulting AFFIMER® agent may be a single chain comprising both the AFFIMER® TNFR2 polypeptide and the antigen binding site (as in the case of a scFv) or may be a multimeric protein complex such as in an assembled antibody with heavy and/or light chains to which the anti-TNFR2 antibody sequence has also been fused.
Dans certains modes de réalisation, par rapport à un agent AFFIMER® multispécifique comprenant une immunoglobuline de pleine longueur, la fusion de la séquence polypeptidique AFFIMER® à l'anticorps préservera la fonction Fc de la région Fc de l'immunoglobuline. Par exemple, l'agent AFFIMER® peut être capable de se lier, via sa partie Fc, au récepteur Fc des cellules positives au récepteur Fc. Dans certains autres modes de réalisation, l'agent AFFIMER® peut activer la cellule positive au récepteur Fc en se liant à la cellule positive au récepteur Fc, initiant ou augmentant ainsi l'expression de cytokines et/ou d'antigènes costimulateurs. De plus, l'agent AFFIMER® peut transférer au moins un second signal d'activation nécessaire à l'activation physiologique de la lymphocyte T à la lymphocyte T via les antigènes costimulateurs et/ou les cytokines.In some embodiments, relative to a multispecific AFFIMER® agent comprising a full-length immunoglobulin, fusion of the AFFIMER® polypeptide sequence to the antibody will preserve the Fc function of the Fc region of the immunoglobulin. For example, the AFFIMER® agent may be capable of binding, via its Fc portion, to the Fc receptor of Fc receptor-positive cells. In some other embodiments, the AFFIMER® agent may activate the Fc receptor-positive cell by binding to the Fc receptor-positive cell, thereby initiating or increasing the expression of costimulatory cytokines and/or antigens. Additionally, the AFFIMER® agent may transfer at least one second activation signal necessary for physiological activation of the T cell to the T cell via the costimulatory antigens and/or cytokines.
Dans certains modes de réalisation, résultant de la liaison de sa partie Fc à d'autres cellules qui expriment les récepteurs Fc présents à la surface des cellules effectrices du système immunitaire, telles que les cellules immunitaires, hépatocytes et cellules endothéliales, l'agent AFFIMER® peut posséder une fonction de cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC, de l’anglais « antibody-dependent cellular cytotoxicity »), un mécanisme de défense immunitaire à médiation cellulaire par lequel une cellule effectrice du système immunitaire lyse activement une cellule cible, dont l'antigène de surface membranaire a été lié par un anticorps, et par conséquent, déclenche la mort des cellules tumorales via ADCC. Dans certains autres modes de réalisation, l'agent AFFIMER® est capable de démontrer une fonction ADCC.In some embodiments, resulting from the binding of its Fc portion to other cells that express Fc receptors present on the surface of immune system effector cells, such as immune cells, hepatocytes and endothelial cells, the AFFIMER® agent can possess antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) function, a cell-mediated immune defense mechanism by which an immune system effector cell actively lyses a target cell, whose membrane surface antigen has been bound by an antibody, and thereby triggers tumor cell death via ADCC. In some other embodiments, the AFFIMER® agent is capable of demonstrating ADCC function.
Comme décrit ci-dessus, outre la cytotoxicité médiée par Fc, la partie Fc peut contribuer au maintien des niveaux sériques de l’agent AFFIMER®, critiques pour sa stabilité et sa persistance dans l'organisme. Par exemple, lorsque la partie Fc se lie aux récepteurs Fc sur les cellules endothéliales et sur les phagocytes, l'agent AFFIMER® peut être internalisé et recyclé dans la circulation sanguine, amplifiant sa demi-vie dans le corps.As described above, in addition to Fc-mediated cytotoxicity, the Fc moiety may contribute to maintaining serum levels of the AFFIMER® agent, which are critical for its stability and persistence in the body. For example, when the Fc moiety binds to Fc receptors on endothelial cells and phagocytes, the AFFIMER® agent can be internalized and recycled into the bloodstream, amplifying its half-life in the body.
Des exemples de cibles des polypeptides AFFIMER® supplémentaires incluent, mais sans s'y limiter, une autre protéine de point de contrôle immunitaire et un récepteur costimulateur immunitaire (en particulier si le(s) AFFIMER® supplémentaire(s) peuvent agoniser le récepteur costimulateur), un récepteur, une cytokine, un facteur de croissance ou un antigène associé à une tumeur, purement à titre illustratif. Dans certains modes de réalisation, la partie d’immunoglobuline peut être un anticorps monoclonal dirigé contre au moins une cible auto-immune (par ex. TNFR2 ou IL6-R). Dans certains modes de réalisation, le polypeptide TNFR2 AFFIMER® fait partie d'un agent AFFIMER® qui comprend un ou plus domaines de liaison qui se lient à une protéine régulée positivement dans des affections auto-immunes (par ex. TNFR2 ou IL6-R).Examples of targets of the additional AFFIMER® polypeptides include, but are not limited to, another immune checkpoint protein and an immune costimulatory receptor (particularly if the additional AFFIMER®(s) can agonize the costimulatory receptor), a receptor, a cytokine, a growth factor, or a tumor-associated antigen, by way of illustration only. In some embodiments, the immunoglobulin portion may be a monoclonal antibody directed against at least one autoimmune target (e.g., TNFR2 or IL6-R). In some embodiments, the AFFIMER® TNFR2 polypeptide is part of an AFFIMER® agent that includes one or more binding domains that bind to a protein upregulated in autoimmune conditions (e.g., TNFR2 or IL6-R).
Voir William BA et al. J. Clin. Med. 2019; 8(8): 1261 pour passer en revue les formats d'agents TNFR2 AFFIMER® englobés par la présente divulgation.See William BA et al. J. Clin. Med. 2019;8(8):1261 for a review of the TNFR2 AFFIMER® agent formats encompassed by this disclosure.
Dans certains modes de réalisation, un agent TNFR2 AFFIMER® multispécifique peut en outre comprendre un groupement d'extension de demi-vie, tel que l'un quelconque de ceux décrits ici. Par exemple, un agent TNFR2 AFFIMER® peut comprendre au moins un polypeptide TNFR2 AFFIMER® lié par un lieur peptidique à un domaine de liaison spécifique d'au moins un domaine de liaison (par ex. CD3ε chaîne ou CD16) de cellule immunitaire (par ex. lymphocyte T et/ou lymphocyte NK) lié en outre à un groupement d'extension de demi-vie, tel qu'un domaine fragment cristallisable (Fc) (par ex. un Fc de non liaison à Fc-gammaR), de l'albumine sérique humaine (HSA) ou un polypeptide HSA AFFIMER®. Dans certains modes de réalisation, le groupement d'extension de demi-vie est un domaine fragment cristallisable (Fc). Dans certains modes de réalisation, le groupement d'extension de demi-vie est une albumine sérique humaine (HSA). Dans certains modes de réalisation, le groupement d'extension de demi-vie est un polypeptide HSA AFFIMER®.In some embodiments, a multispecific TNFR2 AFFIMER® agent may further comprise a half-life extending moiety, such as any of those described herein. For example, a TNFR2 AFFIMER® agent may comprise at least one TNFR2 AFFIMER® polypeptide linked by a peptide linker to a specific binding domain of at least one binding domain (e.g., CD3ε chain or CD16) of an immune cell (e.g., T cell and/or NK cell) further linked to a half-life extending moiety, such as a fragment crystallizable (Fc) domain (e.g., a non-Fc-gammaR binding Fc), human serum albumin (HSA), or an AFFIMER® HSA polypeptide. In some embodiments, the half-life extending moiety is a fragment crystallizable (Fc) domain. In some embodiments, the half-life extending moiety is a human serum albumin (HSA). In some embodiments, the half-life extending moiety is an AFFIMER® HSA polypeptide.
Ingénierie des propriétés PK et ADMEPK and ADME property engineering
Dans certains modes de réalisation, l'agent AFFIMER® peut ne pas avoir une demi-vie et/ou un profil PK optimal pour la voie d'administration, telle qu'un dosage thérapeutique parentéral. Une "demi-vie" est la quantité de temps qu'il faut pour qu'une substance, telle qu'un agent AFFIMER® de la présente invention, perde la moitié de son activité ou de sa concentration pharmacologique ou physiologique. La demi-vie biologique peut être affectée par l'élimination, l'excrétion, la dégradation (par ex. enzymatique) de la substance, ou l'absorption et la concentration dans certains organes ou tissus du corps. Dans certains modes de réalisation, la demi-vie biologique peut être appréciée en déterminant le temps pris pour que la concentration plasmatique de la substance atteigne la moitié de son niveau d’état d'équilibre ("demi-vie plasmatique"). Pour remédier à cette lacune, une variété de stratégies générales pour prolonger la demi-vie a été utilisée dans le cas d'autres protéines thérapeutiques, y compris l'incorporation de groupements d’extension de demi-vie en tant que parties de l'agent AFFIMER®.In some embodiments, the AFFIMER® agent may not have an optimal half-life and/or PK profile for the route of administration, such as parenteral therapeutic dosing. A "half-life" is the amount of time it takes for a substance, such as an AFFIMER® agent of the present invention, to lose half of its pharmacological or physiological activity or concentration. The biological half-life may be affected by elimination, excretion, degradation (e.g., enzymatic) of the substance, or absorption and concentration in certain organs or tissues of the body. In some embodiments, the biological half-life can be assessed by determining the time taken for the plasma concentration of the substance to reach half of its steady-state level ("plasma half-life"). To address this shortcoming, a variety of general strategies to extend half-life have been used in the case of other therapeutic proteins, including the incorporation of half-life extending moieties as parts of the AFFIMER® agent.
Le terme « groupement prolongeant la demi-vie » fait référence à un groupement, un domaine ou une molécule pharmaceutiquement acceptable lié(e) de manière covalente (chimiquement conjugué ou fusionné) à un polypeptide AFFIMER® pour former un agent AFFIMER® décrit ici, optionnellement via un amino acide non codé naturellement, directement ou via un lieur, qui empêche ou atténue la dégradation protéolytique in vivo ou autre modification diminuant l'activité du polypeptide AFFIMER®, augmente la demi-vie, et/ou améliore ou altère d'autres propriétés pharmacocinétiques ou biophysiques, y compris, mais non limité à, l’augmentation du taux d'absorption, la réduction de la toxicité, l’amélioration de la solubilité, la réduction de l'agrégation des protéines, l’augmentation de l'activité biologique et/ou la sélectivité des cibles du polypeptide AFFIMER® modifié, l’augmentation de la fabricabilité et/ou la réduction de l'immunogénicité du polypeptide AFFIMER® modifié, par rapport à un comparateur tel qu'une forme non conjuguée du polypeptide AFFIMER® modifié. Le terme « groupement prolongeant la demi-vie » comprend des groupements prolongeant la demi-vie, non protéiques, telles qu'un polymère soluble dans l'eau tel que le polyéthylène glycol (PEG) ou le PEG discret, l'hydroxyéthylamidon (HEA), un lipide, un groupe acyle ramifié ou non ramifié, un groupe acyle en C8-C30 ramifié ou non ramifié, un groupe alkyle ramifié ou non ramifié, et un groupe alkyle en C8-C30 ramifié ou non ramifié ; et des groupements prolongeant la demi-vie protéiques, telles que l'albumine sérique, la transferrine, les adnectines (par ex. les adnectines se liant à l'albumine ou prolongeant la pharmacocinétique (PKE, de l’anglais « pharmacokinetics extending »), le domaine Fc, et un polypeptide non structuré, tel que les polypeptides XTEN et PAS (par ex. les séquences polypeptidiques conformationnelles désordonnées composées des acides aminés Pro, Ala et/ou Ser), et un fragment de l'un quelconque de tels éléments.The term “half-life extending moiety” refers to a pharmaceutically acceptable moiety, domain or molecule covalently linked (chemically conjugated or fused) to an AFFIMER® polypeptide to form an AFFIMER® agent described herein, optionally via a non-naturally encoded amino acid, directly or via a linker, that prevents or attenuates in vivo proteolytic degradation or other modification that decreases the activity of the AFFIMER® polypeptide, increases the half-life, and/or improves or alters other pharmacokinetic or biophysical properties, including, but not limited to, increasing the rate of absorption, reducing toxicity, improving solubility, reducing protein aggregation, increasing the biological activity and/or target selectivity of the modified AFFIMER® polypeptide, increasing manufacturability and/or reducing the immunogenicity of the modified AFFIMER® polypeptide, relative to a comparator such as an unconjugated form of the modified AFFIMER® polypeptide. The term “half-life extending moiety” includes non-proteinaceous half-life extending moieties, such as a water-soluble polymer such as polyethylene glycol (PEG) or discrete PEG, hydroxyethyl starch (HEA), a lipid, a branched or unbranched acyl group, a branched or unbranched C8-C30 acyl group, a branched or unbranched alkyl group, and a branched or unbranched C8-C30 alkyl group; and protein half-life extending moieties, such as serum albumin, transferrin, adnectins (e.g., albumin-binding or pharmacokinetics extending (PKE) adnectins), the Fc domain, and an unstructured polypeptide, such as XTEN and PAS polypeptides (e.g., conformationally disordered polypeptide sequences composed of the amino acids Pro, Ala and/or Ser), and a fragment of any of such elements.
Dans certains modes de réalisation, le groupement d’extension de demi-vie étend la demi-vie de l'agent AFFIMER® résultant circulant dans le sérum sanguin de mammifère par rapport à la demi-vie de la protéine qui n'est pas conjuguée ainsi au groupement (par ex. par rapport au polypeptide AFFIMER® seul). Dans certains modes de réalisation, la demi-vie est étendue de plus ou de plus d'environ 1,2 fois, 1,5 fois, 2,0 fois, 3,0 fois, 4,0 fois, 5,0 fois ou 6,0 fois. Dans certains modes de réalisation, la demi-vie est étendue de plus de 6 heures, de plus de 12 heures, de plus de 24 heures, de plus de 48 heures, de plus de 72 heures, de plus de 96 heures ou de plus d'1 semaine après administration in vivo par rapport à la protéine sans le groupement d’extension de demi-vie.In some embodiments, the half-life extending moiety extends the half-life of the resulting AFFIMER® agent circulating in mammalian blood serum relative to the half-life of the protein that is not thereby conjugated to the moiety (e.g., relative to the AFFIMER® polypeptide alone). In some embodiments, the half-life is extended by more than or equal to about 1.2-fold, 1.5-fold, 2.0-fold, 3.0-fold, 4.0-fold, 5.0-fold, or 6.0-fold. In some embodiments, the half-life is extended by more than 6 hours, more than 12 hours, more than 24 hours, more than 48 hours, more than 72 hours, more than 96 hours, or more than 1 week following in vivo administration relative to the protein without the half-life extending moiety.
Comme moyens à titre d’exemples additionnelles, les groupements prolongeant la demi-vie pouvant être utilisés dans la génération d'agents AFFIMER® de la divulgation incluent :As additional exemplary means, half-life extending moieties that may be used in the generation of AFFIMER® agents of the disclosure include:
• La fusion génétique de la séquence pharmacologique AFFIMER® à une protéine ou un domaine protéique à demi-vie naturellement longue (par ex. fusion Fc, fusion transferrine [Tf] ou fusion albumine. Voir, par exemple, Beck et al. (2011) “Therapeutic Fc-fusion proteins and peptides as successful alternatives to antibodies. MAbs. 3:1–2 ; Czajkowsky et al. (2012) “Fc-fusion proteins: new developments and future perspectives. EMBO Mol Med. 4:1015–28 ; Huang et al. (2009) “Receptor-Fc fusion therapeutics, traps, and Mimetibody technology” Curr Opin Biotechnol. 2009;20:692–9 ; Keefe et al. (2013) “Transferrin fusion protein therapies: acetylcholine receptor-transferrin fusion protein as a model. Dans: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley ; p. 345–56 ; Weimer et al. (2013) “Recombinant albumin fusion proteins. Dans: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley ; 2013. p. 297–323 ; Walker et al. (2013) “Albumin-binding fusion proteins in the development of novel long-acting therapeutics. Dans: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 325–43.• Genetic fusion of the AFFIMER® pharmacological sequence to a protein or protein domain with a naturally long half-life (e.g., Fc fusion, transferrin [Tf] fusion, or albumin fusion. See, for example, Beck et al. (2011) “Therapeutic Fc-fusion proteins and peptides as successful alternatives to antibodies. MAbs. 3:1–2; Czajkowsky et al. (2012) “Fc-fusion proteins: new developments and future perspectives. EMBO Mol Med. 4:1015–28; Huang et al. (2009) “Receptor-Fc fusion therapeutics, traps, and Mimetibody technology” Curr Opin Biotechnol. 2009;20:692–9; Keefe et al. (2013) “Transferrin fusion protein therapies: acetylcholine receptor-transferrin fusion protein as a model. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; p. 345–56; Weimer et al. (2013) “Recombinant albumin fusion proteins. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 297–323; Walker et al. (2013) “Albumin-binding fusion proteins in the development of novel long-acting therapeutics. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 325–43.
• La fusion génétique de la séquence pharmacologique AFFIMER® à un polypeptide inerte, par ex. XTEN (également connu sous le nom de PEG recombinant ou ''rPEG''), un polymère d'homoaminoacides (HAP ; HAPylation), un polymère proline-alanine-sérine (PAS ; PASylation), ou un peptide de type élastine (ELP ; ELPylation). Voir, par exemple, Schellenberger et al. (2009) “A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat Biotechnol. 2009;27:1186–90 ; Schlapschy et al. Fusion of a recombinant antibody fragment with a homo-amino-acid polymer: effects on biophysical properties and prolonged plasma half-life. Protein Eng Des Sel. 2007;20:273–84; Schlapschy (2013) PASylation: a biological alternative to PEGylation for extending the plasma halflife of pharmaceutically active proteins. Protein Eng Des Sel. 26:489–501. Floss et al. (2012) “Elastin-like polypeptides revolutionize recombinant protein expression and their biomedical application. Trends Biotechnol. 28:37–45. Floss et al. “ELP-fusion technology for biopharmaceuticals. Dans: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: application and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 372–98.• Genetic fusion of the AFFIMER® pharmacological sequence to an inert polypeptide, e.g. XTEN (also known as recombinant PEG or ''rPEG''), a homoamino acid polymer (HAP; HAPylation), a proline-alanine-serine polymer (PAS; PASylation), or an elastin-like peptide (ELP; ELPylation). See, for example, Schellenberger et al. (2009) “A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat Biotechnol. 2009;27:1186–90; Schlapschy et al. Fusion of a recombinant antibody fragment with a homo-amino-acid polymer: effects on biophysical properties and prolonged plasma half-life. Protein Eng Des Sel. 2007;20:273–84; Schlapschy (2013) PASylation: a biological alternative to PEGylation for extending the plasma halflife of pharmaceutically active proteins. Protein Eng Des Salt. 26:489–501. Floss et al. (2012) “Elastin-like polypeptides revolutionize recombinant protein expression and their biomedical application. Trends Biotechnology. 28:37–45. Floss et al. “ELP-fusion technology for biopharmaceuticals. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: application and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 372–98.
• L’augmentation du rayon hydrodynamique par conjugaison chimique du peptide ou de la protéine pharmacologiquement actif pour répéter des groupements chimiques, par ex. au PEG (PEGylation) ou à l'acide hyaluronique. Voir, par exemple, Caliceti et al. (2003) “Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates” Adv Drug Delivery Rev. 55:1261–77; Jevsevar et al. (2010) PEGylation of therapeutic proteins. Biotechnol J 5:113–28; Kontermann (2009) “Strategies to extend plasma half-lives of recombinant antibodies” BioDrugs. 23:93–109 ; Kang et al. (2009) “Emerging PEGylated drugs” Expert Opin Emerg Drugs. 14:363–80 ; et Mero et al. (2013) “Conjugation of hyaluronan to proteins” Carb Polymers. 92:2163–70.• Increasing the hydrodynamic radius by chemical conjugation of the pharmacologically active peptide or protein to repeating chemical groups, e.g. to PEG (PEGylation) or hyaluronic acid. See, for example, Caliceti et al. (2003) “Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates” Adv Drug Delivery Rev. 55:1261–77; Jevsevar et al. (2010) PEGylation of therapeutic proteins. Biotechnol J 5:113–28; Kontermann (2009) “Strategies to extend plasma half-lives of recombinant antibodies” BioDrugs. 23:93–109; Kang et al. (2009) “Emerging PEGylated drugs” Expert Opin Emerg Drugs. 14:363–80; and Mero et al. (2013) “Conjugation of hyaluronan to proteins” Carb Polymers. 92:2163–70.
• L’augmentation significative de la charge négative de fusion du peptide ou de la protéine pharmacologiquement actif par polysialylation ; ou, alternativement, (b) la fusion d'un peptide fortement sialylé chargé négativement (par ex. le peptide carboxy-terminal [CTP ; de la gonadotrophine chorionique (GC) chaîne b]), connu pour prolonger la demi-vie de protéines naturelles telles que la GC humaine, sous-unité b, au candidat-médicament biologique. Voir, par exemple, Gregoriadis et al. (2005) “Improving the therapeutic efficacy of peptides and proteins: a role for polysialic acids” Int J Pharm. 2005 ; 300:125–30 ; Duijkers et al. “Single dose pharmacokinetics and effects on follicular growth and serum hormones of a long-acting recombinant FSH preparation (FSHCTP) in healthy pituitary-suppressed females” (2002) Hum Reprod. 17:1987–93 ; et Fares et al. “Design of a longacting follitropin agonist by fusing the C-terminal sequence of the chorionic gonadotropin beta subunit to the follitropin beta subunit” (1992) Proc Natl Acad Sci USA. 89:4304–8. 35; and Fares “Half-life extension through O-glycosylation.• Significantly increasing the negative fusion charge of the pharmacologically active peptide or protein by polysialylation; or, alternatively, (b) fusion of a negatively charged, highly sialylated peptide (e.g., carboxy-terminal peptide [CTP; of human chorionic gonadotropin (GC) b-chain]), known to prolong the half-life of natural proteins such as human GC, b-subunit, to the biologic drug candidate. See, for example, Gregoriadis et al. (2005) “Improving the therapeutic efficacy of peptides and proteins: a role for polysialic acids” Int J Pharm. 2005; 300:125–30; Duijkers et al. “Single dose pharmacokinetics and effects on follicular growth and serum hormones of a long-acting recombinant FSH preparation (FSHCTP) in healthy pituitary-suppressed females” (2002) Hum Reprod. 17:1987–93; and Fares et al. “Design of a long-acting follitropin agonist by fusing the C-terminal sequence of the chorionic gonadotropin beta subunit to the follitropin beta subunit” (1992) Proc Natl Acad Sci USA. 89:4304–8. 35; and Fares “Half-life extension through O-glycosylation.
• La liaison non covalente, via la fixation d'un peptide ou d’un domaine de liaison à protéine à la protéine bioactive, à des protéines normalement à longue demi-vie telles que la HSA, l'IgG humaine, la transferrine ou la fibronectine. Voir, par exemple, Andersen et al. (2011) “Extending half-life by indirect targeting of the neonatal Fc receptor (FcRn) using a minimal albumin binding domain” J Biol Chem. 286:5234–41 ; O’Connor-Semmes et al. (2014) “GSK2374697, a novel albumin-binding domain antibody (albudAb), extends systemic exposure of extendin-4: first study in humans—PK/PD and safety” Clin Pharmacol Ther. 2014;96:704–12. Sockolosky et al. (2014) “Fusion of a short peptide that binds immunoglobulin G to a recombinant protein substantially increases its plasma half-life in mice” PLoS One. 2014;9:e102566.• Noncovalent binding, via attachment of a peptide or protein-binding domain to the bioactive protein, to proteins with normally long half-lives such as HSA, human IgG, transferrin, or fibronectin. See, for example, Andersen et al. (2011) “Extending half-life by indirect targeting of the neonatal Fc receptor (FcRn) using a minimal albumin binding domain” J Biol Chem. 286:5234–41; O’Connor-Semmes et al. (2014) “GSK2374697, a novel albumin-binding domain antibody (albudAb), extends systemic exposure of extendin-4: first study in humans—PK/PD and safety” Clin Pharmacol Ther. 2014;96:704–12. Sockolosky et al. (2014) “Fusion of a short peptide that binds immunoglobulin G to a recombinant protein substantially increases its plasma half-life in mice” PLoS One. 2014;9:e102566.
Les fusions génétiques classiques avec des protéines sériques à longue durée de vie offrent un procédé alternatif d'extension de la demi-vie distinct de la conjugaison chimique au PEG ou aux lipides. Deux protéines majeures ont traditionnellement été utilisées comme partenaires de fusion : les domaines Fc d'anticorps et l'albumine sérique humaine (HSA, de l’anglais « human serum albumin »). Les fusions Fc impliquent la fusion de peptides, de protéines ou d'exodomaines récepteurs à la partie Fc d'un anticorps. Les fusions Fc et albumine atteignent des demi-vies prolongées non seulement en augmentant la taille du médicament peptidique, mais toutes deux tirent également parti du mécanisme de recyclage naturel du corps : le récepteur néonatal Fc, FcRn. La liaison dépendante du pH de ces protéines au FcRn empêche la dégradation de la protéine de fusion dans l'endosome. Les fusions basées sur ces protéines peuvent avoir des demi-vies de l'ordre de 3 à 16 jours, bien plus longues que les peptides PEGylés ou lipidés typiques. La fusion aux domaines Fc d'anticorps peut améliorer la solubilité et la stabilité du médicament peptidique ou protéique. Un exemple de fusion peptidique Fc est le dulaglutide, un agoniste du récepteur GLP-1 actuellement en phase avancée d'essais cliniques. L'albumine sérique humaine, la même protéine exploitée par les peptides gras acylés, est l'autre partenaire de fusion populaire. L'albiglutide est un agoniste des récepteurs GLP-1 basé sur cette plateforme. Une différence majeure entre Fc et albumine est la nature dimère de Fc par rapport à la structure monomère d’HSA conduisant à la présentation d'un peptide fusionné sous forme de dimère ou de monomère selon le choix du partenaire de fusion. La nature dimérique d'une fusion AFFIMER®-Fc peut produire un effet d'avidité si les cibles AFFIMER® sont suffisamment rapprochées ou sont elles-mêmes des dimères. Ceci peut être souhaitable ou non en fonction de la cible.Classical gene fusions with long-lived serum proteins offer an alternative method of half-life extension distinct from chemical conjugation to PEG or lipids. Two major proteins have traditionally been used as fusion partners: antibody Fc domains and human serum albumin (HSA). Fc fusions involve the fusion of receptor peptides, proteins, or exodomains to the Fc portion of an antibody. Fc and albumin fusions achieve extended half-lives not only by increasing the size of the peptide drug, but both also take advantage of the body's natural recycling mechanism: the neonatal Fc receptor, FcRn. The pH-dependent binding of these proteins to FcRn prevents degradation of the fusion protein in the endosome. Fusions based on these proteins can have half-lives in the range of 3 to 16 days, much longer than typical PEGylated or lipidated peptides. Fusion to antibody Fc domains can improve the solubility and stability of the peptide or protein drug. An example of a Fc peptide fusion is dulaglutide, a GLP-1 receptor agonist currently in late-stage clinical trials. Human serum albumin, the same protein exploited by acylated fatty peptides, is the other popular fusion partner. Albiglutide is a GLP-1 receptor agonist based on this platform. A major difference between Fc and albumin is the dimeric nature of Fc compared to the monomeric structure of HSA leading to the presentation of a fused peptide as a dimer or monomer depending on the choice of fusion partner. The dimeric nature of an AFFIMER®-Fc fusion can produce an avidity effect if the AFFIMER® targets are close enough together or are themselves dimers. This may or may not be desirable depending on the target.
Fusions FcFc Mergers
Dans certains modes de réalisation, le polypeptide AFFIMER® peut faire partie d'une protéine de fusion avec un domaine Fc d'immunoglobuline ("domaine Fc"), ou un fragment ou une variante de celui-ci, tel qu'une région Fc fonctionnelle. Dans certains modes de réalisation, la région Fc est une région Fc de non liaison à Fc-gammaR. Dans ce contexte, une fusion Fc ("fusion-Fc"), telle qu'un agent TNFR2 AFFIMER® créé en tant que protéine de fusion de Fc-AFFIMER®, est un polypeptide comprenant au moins une séquence TNFR2 AFFIMER® liée de manière covalente par l’intermédiaire d’un squelette peptidique (directement ou indirectement) à une région Fc d'une immunoglobuline. Une fusion-Fc peut comprendre, par exemple, la région Fc d'un anticorps (qui facilite les fonctions effectrices et la pharmacocinétique) et une séquence TNFR2 AFFIMER® en tant que partie du même polypeptide. Une région Fc d'immunoglobuline peut également être liée indirectement à au moins un polypeptide TNFR2 AFFIMER®. Divers lieurs sont connus dans l'art et peuvent optionnellement être utilisés pour lier un Fc à un polypeptide incluant une séquence TNFR2 AFFIMER® pour générer une fusion-Fc. Dans certains modes de réalisation, les fusions-Fc peuvent être dimérisées pour former des homodimères fusion-Fc, ou en utilisant des domaines Fc non identiques, pour former des hétérodimères fusion-Fc.In some embodiments, the AFFIMER® polypeptide may be part of a fusion protein with an immunoglobulin Fc domain ("Fc domain"), or a fragment or variant thereof, such as a functional Fc region. In some embodiments, the Fc region is a non-Fc-gammaR binding Fc region. In this context, an Fc fusion ("Fc-fusion"), such as an AFFIMER® TNFR2 agent created as an Fc-AFFIMER® fusion protein, is a polypeptide comprising at least one AFFIMER® TNFR2 sequence covalently linked via a peptide backbone (directly or indirectly) to an Fc region of an immunoglobulin. An Fc-fusion may comprise, for example, the Fc region of an antibody (which facilitates effector functions and pharmacokinetics) and an AFFIMER® TNFR2 sequence as part of the same polypeptide. An immunoglobulin Fc region may also be indirectly linked to at least one TNFR2 AFFIMER® polypeptide. Various linkers are known in the art and may optionally be used to link an Fc to a polypeptide including a TNFR2 AFFIMER® sequence to generate an Fc-fusion. In some embodiments, the Fc-fusions may be dimerized to form Fc-fusion homodimers, or using non-identical Fc domains, to form Fc-fusion heterodimers.
Dans certains modes de réalisation, un homodimère fusion-Fc comprend un dimère d'un agent TNFR2 AFFIMER® qui comprend un polypeptide TNFR2 AFFIMER® lié à un domaine Fc lié à un autre polypeptide TNFR2 AFFIMER® (polypeptide TNFR2 AFFIMER®-domaine Fc-polypeptide TNFR2 AFFIMER®).In some embodiments, a fusion-Fc homodimer comprises a dimer of a TNFR2 AFFIMER® agent that comprises a TNFR2 AFFIMER® polypeptide linked to an Fc domain linked to another TNFR2 AFFIMER® polypeptide (TNFR2 AFFIMER® polypeptide-Fc domain-TNFR2 AFFIMER® polypeptide).
Il existe plusieurs raisons de choisir la région Fc d'anticorps humains pour une utilisation dans la génération d'agents TNFR2 AFFIMER® en tant que protéines de fusion TNFR2 AFFIMER®. La principale raison est de produire une protéine stable, suffisamment grande pour démontrer un profil pharmacocinétique similaire à ceux des anticorps, et de tirer parti des propriétés conférées par la région Fc ; ceci inclut la voie de récupération du récepteur FcRn néonatal impliquant le recyclage médié par FcRn de la protéine de fusion à la surface cellulaire après l’endocytose, évitant la dégradation lysosomale et résultant en une relibération dans la circulation sanguine, contribuant ainsi à une demi-vie sérique étendue. Un autre avantage évident est la liaison du domaine Fc à la Protéine A, ce qui peut simplifier le traitement en aval pendant la production de l'agent AFFIMER® et permettre la génération d'une préparation hautement pure de l'agent AFFIMER®.There are several reasons to choose the Fc region of human antibodies for use in the generation of TNFR2 AFFIMER® agents as TNFR2 AFFIMER® fusion proteins. The primary reason is to produce a stable protein, large enough to demonstrate a pharmacokinetic profile similar to those of antibodies, and to take advantage of the properties conferred by the Fc region; this includes the neonatal FcRn receptor retrieval pathway involving FcRn-mediated recycling of the fusion protein to the cell surface after endocytosis, avoiding lysosomal degradation and resulting in re-release into the bloodstream, thus contributing to an extended serum half-life. Another obvious advantage is the linkage of the Fc domain to Protein A, which can simplify downstream processing during AFFIMER® agent production and allow the generation of a highly pure preparation of AFFIMER® agent.
En général, un domaine Fc comprendra la région constante d'un anticorps à l'exclusion du premier domaine d'immunoglobuline à région constante. Ainsi, le domaine Fc fait référence aux deux derniers domaines d'immunoglobuline à région constante de l'IgA, IgD et IgG, et aux trois derniers domaines d'immunoglobuline à région constante de l'IgE et IgM, et à la charnière N-terminale flexible de ces domaines. Pour les IgA et IgM, Fc peut inclure la chaîne J. Pour les IgG, Fc comprend les domaines d'immunoglobuline Cγ2 et Cγ3 et la charnière entre Cγ1 et Cγ2. Bien que les frontières du domaine Fc puissent varier, la région Fc de l'IgG humaine chaîne lourde est généralement définie comme comprenant les résidus C226 ou P230 jusqu'à son extrémité carboxyle, la numérotation étant conforme à l'index EU tel qu'énoncé dans Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NIH, Bethesda, Md. (1991)). Fc peut faire référence à cette région isolément, ou à cette région dans le contexte d'un anticorps entier, d'un fragment d'anticorps ou d'une protéine de fusion de Fc. Des polymorphismes ont été observés à un certain nombre de positions Fc différentes et sont également inclus en tant que domaines Fc tels qu'utilisés ici.In general, an Fc domain will comprise the constant region of an antibody excluding the first constant region immunoglobulin domain. Thus, the Fc domain refers to the last two constant region immunoglobulin domains of IgA, IgD, and IgG, and the last three constant region immunoglobulin domains of IgE and IgM, and the flexible N-terminal hinge of these domains. For IgA and IgM, Fc may include the J chain. For IgG, Fc comprises the Cγ2 and Cγ3 immunoglobulin domains and the hinge between Cγ1 and Cγ2. Although the boundaries of the Fc domain may vary, the Fc region of human IgG heavy chain is generally defined as consisting of residues C226 or P230 to its carboxyl terminus, with numbering according to the EU index as set forth in Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NIH, Bethesda, Md. (1991)). Fc may refer to this region in isolation, or to this region in the context of a whole antibody, an antibody fragment, or an Fc fusion protein. Polymorphisms have been observed at a number of different Fc positions and are also included as Fc domains as used herein.
Dans certains modes de réalisation, le Fc Tel qu'utilisé ici, une « région Fc fonctionnelle » fait référence à un domaine Fc ou un fragment de celui-ci qui conserve la capacité de se lier au FcRn. Une région Fc fonctionnelle se lie au FcRn mais ne possède pas de fonction effectrice. La capacité de la région Fc ou d'un fragment de celle-ci à se lier au FcRn peut être déterminée par des essais de liaison standard connus dans l'art. Des exemples de "fonctions effectrices" incluent la liaison de C1q ; la cytotoxicité dépendante du complément (CDC) ; la liaison au récepteur Fc ; la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) ; la phagocytose ; la régulation à la baisse des récepteurs de surface cellulaire (par ex. récepteur des lymphocytes B ; BCR, de l’anglais « B cell receptor »), etc. De telles fonctions effectrices peuvent être appréciées en utilisant divers essais connus dans l'art pour évaluer de telles fonctions effectrices d'anticorps.In some embodiments, the Fc As used herein, a “functional Fc region” refers to an Fc domain or fragment thereof that retains the ability to bind to FcRn. A functional Fc region binds to FcRn but does not possess an effector function. The ability of the Fc region or fragment thereof to bind to FcRn can be determined by standard binding assays known in the art. Examples of “effector functions” include C1q binding; complement-dependent cytotoxicity (CDC); Fc receptor binding; antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC); phagocytosis; downregulation of cell surface receptors (e.g., B cell receptor; BCR), etc. Such effector functions can be assessed using various assays known in the art for evaluating such antibody effector functions.
Dans un exemple de mode de réalisation, le domaine Fc est dérivé d'une sous-classe d'IgG1, cependant, d'autres sous-classes (par ex. IgG2, IgG3 et IgG4) peuvent également être utilisées. Un exemple de séquence d'un domaine Fc d'immunoglobuline IgG1 humaine pouvant être utilisé est : DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO : 442)In an exemplary embodiment, the Fc domain is derived from a subclass of IgG1, however, other subclasses (e.g., IgG2, IgG3, and IgG4) may also be used. An exemplary sequence of a human IgG1 immunoglobulin Fc domain that may be used is: DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 442)
Dans certains modes de réalisation, la région Fc utilisée dans la protéine de fusion peut comprendre la région charnière d'une molécule Fc. Un exemple de région charnière comprend les résidus de charnière centrale couvrant les positions 1 à 16 (par ex. DKTHTCPPCPAPELLG ((SEQ ID NO : 484)) de l'exemple de séquence de domaine Fc d'immunoglobuline humaine IgG1 fourni ci-dessus. Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion contenant AFFIMER® peut adopter une structure multimérique (par ex. un dimère) en raison, en partie, des résidus de cystéine aux positions 6 et 9 au sein de la région charnière de l'exemple de séquence de domaine Fc d'immunoglobuline humaine IgG1 proposé ci-dessus. Dans d'autres modes de réalisation, la région charnière telle qu'utilisée ici peut comporter en outre des résidus dérivés des régions CH1 et CH2 qui flanquent la séquence charnière centrale de l'exemple de séquence de domaine Fc d'immunoglobuline IgG1 humaine fournie ci-dessus. Dans encore d'autres modes de réalisation, la séquence charnière peut comprendre ou consister en GSTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO : 443) ou EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO : 444).In some embodiments, the Fc region used in the fusion protein may comprise the hinge region of an Fc molecule. An exemplary hinge region includes the central hinge residues spanning positions 1-16 (e.g., DKTHTCPPCPAPELLG ((SEQ ID NO: 484)) of the exemplary human immunoglobulin IgG1 Fc domain sequence provided above. In some embodiments, the AFFIMER®-containing fusion protein may adopt a multimeric structure (e.g., a dimer) due, in part, to the cysteine residues at positions 6 and 9 within the hinge region of the exemplary human immunoglobulin IgG1 Fc domain sequence provided above. In other embodiments, the hinge region as used herein may further include residues derived from the CH1 and CH2 regions that flank the central hinge sequence of the exemplary human immunoglobulin IgG1 Fc domain sequence provided above. In still other embodiments, the hinge sequence may comprise or consist of GSTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 443) or EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 444).
Dans certains modes de réalisation, la séquence charnière peut inclure au moins une substitution qui confère des propriétés pharmacocinétiques, biophysiques et/ou biologiques souhaitables. Des exemples de séquences charnières incluent :
In some embodiments, the hinge sequence may include at least one substitution that confers desirable pharmacokinetic, biophysical and/or biological properties. Examples of hinge sequences include:
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO: 445) ;
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO: 445);
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO: 446) ;
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO: 446);
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 447);
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 447);
EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 448) ;
EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 448);
DKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO: 449); et
DKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO: 449); And
DKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 450).DKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 450).
Dans certains modes de réalisation, le résidu P en position 18 de l'exemple de séquence de domaine Fc d'immunoglobuline IgG1 humaine fourni ci-dessus peut être remplacé par S pour retirer la fonction effectrice de Fc ; ce remplacement est exemplifié dans des charnières ayant les séquencesIn some embodiments, the P residue at position 18 of the exemplary human IgG1 immunoglobulin Fc domain sequence provided above may be replaced with S to remove the Fc effector function; this replacement is exemplified in hinges having the sequences
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO : 451), EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO : 452), et DKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO : 453).EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 451), EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 452), and DKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 453).
Dans un autre mode de réalisation, les résidus DK aux positions 1-2 de l'exemple de séquence de domaine Fc d'immunoglobuline humaine IgG1 proposé ci-dessus peuvent être remplacés par GS pour éliminer un site de clip (de l’anglais « clip site ») potentiel ; ce remplacement est exposé à titre d’exemple dans la séquence EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO : 448). Dans un autre mode de réalisation, le C en position 103 de la région constante de la chaîne lourde de l'IgG1 humaine (par ex. les domaines CH1-CH3) peut être remplacé par S pour empêcher la formation incorrecte d’une liaison cystéine en l'absence d’une chaîne légère ; ce remplacement est illustré à titre d’exemple par EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO : 446), EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO : 451), et EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO : 452).In another embodiment, the DK residues at positions 1-2 of the exemplary human immunoglobulin IgG1 Fc domain sequence provided above may be replaced with GS to eliminate a potential clip site; this replacement is exemplified in the sequence EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 448). In another embodiment, the C at position 103 of the human IgG1 heavy chain constant region (e.g., CH1-CH3 domains) may be replaced with S to prevent improper formation of a cysteine bond in the absence of a light chain; This replacement is illustrated by way of example by EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO: 446), EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 451), and EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 452).
Dans certains modes de réalisation, le Fc est un Fc de mammifère tel qu'un Fc humain, comprenant des domaines Fc dérivés d'IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. La région Fc peut posséder au moins environ 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % d'identité de séquence avec une région Fc native et/ou avec une région Fc d'un polypeptide parent. Dans certains modes de réalisation, la région Fc peut avoir au moins environ 90 % d'identité de séquence avec une région Fc native et/ou avec une région Fc d'un polypeptide parent.In some embodiments, the Fc is a mammalian Fc such as a human Fc, comprising Fc domains derived from IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4. The Fc region may have at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity to a native Fc region and/or to an Fc region of a parent polypeptide. In some embodiments, the Fc region may have at least about 90% sequence identity to a native Fc region and/or to an Fc region of a parent polypeptide.
Dans certains modes de réalisation, le domaine Fc comprend une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 454-467 ou une séquence Fc parmi les exemples fournis par les SEQ ID NO : 454-467. Il doit être compris que la lysine C-terminale d'un domaine Fc est un composant optionnel d'une protéine de fusion comprenant un domaine Fc. Dans certains modes de réalisation, le domaine Fc comprend une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 454-467, à ceci près que la lysine C-terminale de celle-ci est omise. Dans certains modes de réalisation, le domaine Fc comprend la séquence d'acides aminés sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 454-467. Dans certains modes de réalisation, le domaine Fc comprend la séquence d'acides aminés sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 454-467 à ceci près que la lysine C-terminale de celle-ci est omise.In some embodiments, the Fc domain comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 454-467 or an Fc sequence exemplified by SEQ ID NO: 454-467. It is to be understood that the C-terminal lysine of an Fc domain is an optional component of a fusion protein comprising an Fc domain. In some embodiments, the Fc domain comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 454-467, except that the C-terminal lysine thereof is omitted. In some embodiments, the Fc domain comprises the amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 454-467. In some embodiments, the Fc domain comprises the amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 454-467 except that the C-terminal lysine thereof is omitted.
Tableau 5. Séquences du domaine Fc.
[Sous-type A]
[Sous-type A/F]
[Contient cinq mutations ponctuelles pour altérer la fonction ADCC, sous-type F]
[Contient cinq mutations ponctuelles pour altérer la fonction ADCC et C225S (numérotation Edlemen) ; sous-type F]
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[Sous-type A]
[hIgG1a_190 sans "K" sur terminaison C ; Sous-type A]
[Sous-type A]
[Sous-type A]
[Sous-type A]
[Sous-type A]
[Subtype A]
[Subtype A/F]
[Contains five point mutations to impair ADCC function, subtype F]
[Contains five point mutations to impair ADCC function and C225S (Edlemen numbering); subtype F]
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSS IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[Subtype A]
[hIgG1a_190 without "K" on C terminus; Subtype A]
[Subtype A]
[Subtype A]
[Subtype A]
[Subtype A]
La « cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps » ou « ADCC » (en anglais « Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity ») fait référence à une forme de cytotoxicité dans laquelle les Ig sécrétées liées aux récepteurs Fc (FcR) présents sur certaines cellules cytotoxiques (par ex. les lymphocytes NK (de l’anglais « Natural Killer », soit tueuses naturelles), les neutrophiles et les macrophages) permet à ces cellules effectrices cytotoxiques de se lier spécifiquement à une cellule cible porteuse d'antigènes et de tuer ensuite la cellule cible avec des cytotoxines.Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) refers to a form of cytotoxicity in which secreted Ig bound to Fc receptors (FcRs) on certain cytotoxic cells (e.g., natural killer (NK) cells, neutrophils, and macrophages) allows these cytotoxic effector cells to specifically bind to an antigen-bearing target cell and subsequently kill the target cell with cytotoxins.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion comprend une séquence de domaine Fc pour laquelle l'agent AFFIMER® résultant n'a pas (ou qu’un niveau réduit) d'ADCC et/ou l'activation du complément ou la fonctionnalité effectrice. Par exemple, le domaine Fc peut comprendre une région constante naturellement désactivée d'isotype IgG2 ou IgG4 ou une région constante IgG1 mutée. Des exemples de modifications appropriées sont décrits dans EP0307434. Un exemple comprend les substitutions de résidus d'alanine aux positions 235 et 237 (numérotation selon l'index UE).In some embodiments, the fusion protein comprises an Fc domain sequence for which the resulting AFFIMER® agent has no (or reduced) ADCC and/or complement activation or effector functionality. For example, the Fc domain may comprise a naturally deactivated constant region of IgG2 or IgG4 isotype or a mutated IgG1 constant region. Examples of suitable modifications are described in EP0307434. An example includes substitutions of alanine residues at positions 235 and 237 (EU index numbering).
Dans d'autres modes de réalisation, la protéine de fusion comprend une séquence de domaine Fc pour laquelle l'agent AFFIMER® résultant conservera une partie ou la totalité de la fonctionnalité Fc, par exemple sera capable d'une ou des deux activités ADCC et CDC, comme par exemple si la protéine de fusion comprend le domaine Fc de l'IgG1 ou IgG3 humaine. Les niveaux de fonction effectrice peuvent varier selon des techniques connues, par exemple par des mutations dans le domaine CH2, par exemple où le domaine IgG1 CH2 a au moins une mutation en des positions sélectionnées parmi 239 et 332 et 330, par exemple les mutations étant sélectionnées parmi S239D et I332E et A330L de telle sorte que l'anticorps ait une fonction effectrice amplifiée, et/ou par exemple en altérant le profil de glycosylation de la protéine de liaison à antigène de la divulgation de sorte qu'il y ait une réduction de la fucosylation de la région Fc.In other embodiments, the fusion protein comprises an Fc domain sequence for which the resulting AFFIMER® agent will retain some or all of the Fc functionality, e.g. will be capable of one or both of ADCC and CDC activities, such as for example if the fusion protein comprises the Fc domain of human IgG1 or IgG3. The levels of effector function may be varied according to known techniques, e.g. by mutations in the CH2 domain, e.g. where the IgG1 CH2 domain has at least one mutation at positions selected from 239 and 332 and 330, e.g. the mutations being selected from S239D and I332E and A330L such that the antibody has enhanced effector function, and/or e.g. by altering the glycosylation profile of the antigen binding protein of the disclosure such that there is reduced fucosylation of the Fc region.
Fusions d'albumineAlbumin fusions
Dans certains modes de réalisation, l'agent AFFIMER® est une protéine de fusion comprenant, en plus d'au moins une séquence AFFIMER®, une séquence d'albumine ou un fragment d'albumine. Dans d'autres modes de réalisation, l'agent AFFIMER® est conjugué à la séquence d'albumine ou à un fragment d'albumine par l’intermédiaire d’une liaison chimique autre qu'une incorporation dans la séquence polypeptidique incluant le polypeptide AFFIMER®. Dans certains modes de réalisation, l'albumine, une variante de l'albumine ou un fragment d'albumine est de l’albumine sérique humaine (HSA), une variante de l’albumine sérique humaine ou un fragment d’albumine sérique humaine. Des protéines sériques d'albumine comparables à l'HSA se trouvent, par ex. chez les singes cynomolgus, les vaches, chiens, lapins et rats. Parmi les espèces non humaines, l'albumine sérique bovine (BSA, de l’anglais « bovine serum albumin ») est structurellement la plus similaire à l’HSA. Voir, par ex., Kosa et al., (2007) J Pharm Sci. 96(11):3117-24. La présente divulgation envisage l'utilisation d'albumine provenant d'espèces non humaines, dont, mais sans s'y limiter, une séquence d'albumine dérivée de l’albumine sérique cyno ou de l’albumine sérique bovine.In some embodiments, the AFFIMER® agent is a fusion protein comprising, in addition to at least one AFFIMER® sequence, an albumin sequence or albumin fragment. In other embodiments, the AFFIMER® agent is conjugated to the albumin sequence or albumin fragment via a chemical bond other than incorporation into the polypeptide sequence including the AFFIMER® polypeptide. In some embodiments, the albumin, albumin variant, or albumin fragment is human serum albumin (HSA), a human serum albumin variant, or a human serum albumin fragment. Serum albumin proteins comparable to HSA are found, e.g., in cynomolgus monkeys, cows, dogs, rabbits, and rats. Among non-human species, bovine serum albumin (BSA) is structurally most similar to HSA. See, e.g., Kosa et al., (2007) J Pharm Sci. 96(11):3117-24. The present disclosure contemplates the use of albumin from non-human species, including, but not limited to, an albumin sequence derived from cyno serum albumin or bovine serum albumin.
L’HSA mature, un polypeptide de 585 acides aminés (env. 67 kDa) ayant une demi-vie sérique d'environ 20 jours, est principalement responsable du maintien de la pression artérielle osmotique colloïdale, du pH sanguin, et du transport et de la distribution de nombreux ligands endogènes et exogènes. La protéine a trois domaines structurellement homologues (domaines I, II et III), est presque entièrement de conformation alpha-hélicoïdale et est hautement stabilisée par 17 ponts disulfure. Dans certains modes de réalisation, l'agent AFFIMER® peut être une protéine de fusion d'albumine comprenant au moins une séquence polypeptidique AFFIMER® et la séquence pour l'albumine sérique humaine mature (SEQ ID NO : 468) ou une variante ou un fragment de celle-ci qui maintient les propriétés PK et/ou de biodistribution de l'albumine mature dans la mesure souhaitée dans la protéine de fusion.Mature HSA, a 585 amino acid (approx. 67 kDa) polypeptide with a serum half-life of approximately 20 days, is primarily responsible for maintaining colloidal osmotic blood pressure, blood pH, and the transport and distribution of numerous endogenous and exogenous ligands. The protein has three structurally homologous domains (domains I, II, and III), is almost entirely alpha-helical in conformation, and is highly stabilized by 17 disulfide bridges. In some embodiments, the AFFIMER® agent may be an albumin fusion protein comprising at least one AFFIMER® polypeptide sequence and the sequence for mature human serum albumin (SEQ ID NO: 468) or a variant or fragment thereof that maintains the PK and/or biodistribution properties of mature albumin to the extent desired in the fusion protein.
La séquence d'albumine peut être séparée de la séquence polypeptidique AFFIMER® ou d'autres séquences flanquantes dans l'agent AFFIMER® par utilisation de séquences de lieurs comme décrit ci-dessus.The albumin sequence can be separated from the AFFIMER® polypeptide sequence or other flanking sequences in the AFFIMER® agent by use of linker sequences as described above.
Sauf indication contraire, la référence ici à « l'albumine » ou à « l'albumine mature » est prévue pour se référer à l'HSA. Cependant, il est à noter que la HSA pleine longueur a un peptide signal de 18 acides aminés (MKWVTFISLLFLFSSAYS (SEQ ID NO : 483) suivi d'un prodomaine de 6 acides aminés (RGVFRR) (SEQ ID NO : 469) ; ce peptide de 24 résidus d'acides aminés peut être appelé préprodomaine. Les protéines de fusion AFFIMER®-HSA peuvent être exprimées et sécrétées en utilisant le préprodomaine HSA dans la séquence codante des protéines recombinantes. En variante, la protéine de fusion AFFIMER®-HSA peut être exprimée et sécrétée par inclusion d'autres séquences signal de sécrétion, telles que décrites ci-dessus.Unless otherwise indicated, reference herein to “albumin” or “mature albumin” is intended to refer to HSA. However, it is noted that full-length HSA has an 18 amino acid signal peptide (MKWVTFISLLFLFSSAYS (SEQ ID NO: 483) followed by a 6 amino acid prodomain (RGVFRR) (SEQ ID NO: 469); this 24 amino acid residue peptide may be referred to as the preprodomain. The AFFIMER®-HSA fusion proteins may be expressed and secreted by utilizing the HSA preprodomain in the coding sequence of the recombinant proteins. Alternatively, the AFFIMER®-HSA fusion protein may be expressed and secreted by including other secretory signal sequences, as described above.
Dans des modes de réalisation alternatifs, plutôt que fournis en tant que partie d'une protéine de fusion avec le polypeptide AFFIMER®, le polypeptide d'albumine sérique peut être couplé de manière covalente au polypeptide contenant AFFIMER® par l’intermédiaire d’une liaison autre qu'une liaison amide de squelette, tel que réticulé par l’intermédiaire d’une conjugaison chimique entre des chaînes latérales d'acides aminés sur chacun parmi le polypeptide d'albumine et le polypeptide contenant AFFIMER®.In alternative embodiments, rather than being provided as part of a fusion protein with the AFFIMER® polypeptide, the serum albumin polypeptide may be covalently coupled to the AFFIMER®-containing polypeptide via a linkage other than a backbone amide linkage, such as cross-linked via chemical conjugation between amino acid side chains on each of the albumin polypeptide and the AFFIMER®-containing polypeptide.
Dans certains modes de réalisation, un procédé de modification chimique qui peut être appliqué dans la génération des agents AFFIMER® sujets pour augmenter la demi-vie des protéines est la lipidation, qui implique la liaison covalente d'acides gras aux chaînes latérales peptidiques. Conçue à l'origine et développée en tant que procédé pour étendre la demi-vie de l'insuline, la lipidation partage le même mécanisme de base d’extension de la demi-vie que la PEGylation, à savoir l'augmentation du rayon hydrodynamique pour réduire la filtration rénale. Cependant, le groupement lipidique est lui-même relativement petit et l'effet est médié indirectement par la liaison non covalente du groupement lipidique à de l'albumine circulante. Une conséquence de la lipidation est qu'elle réduit la solubilité dans l'eau du peptide, mais l'ingénierie du lieur entre le peptide et l'acide gras peut moduler cela, par exemple en utilisant du glutamate ou des mini PEG au sein du lieur. L'ingénierie des lieurs et la variation du groupement lipidique peuvent affecter l'auto-agrégation, ce qui peut contribuer à augmenter la demi-vie en ralentissant la biodistribution, indépendamment de l'albumine. Voir, par exemple, Jonassen et al. (2012) Pharm Res. 29(8):2104-14.In some embodiments, one chemical modification method that can be applied in the generation of the subject AFFIMER® agents to increase protein half-life is lipidation, which involves the covalent attachment of fatty acids to peptide side chains. Originally conceived and developed as a method to extend the half-life of insulin, lipidation shares the same basic mechanism of half-life extension as PEGylation, namely increasing the hydrodynamic radius to reduce renal filtration. However, the lipid moiety itself is relatively small and the effect is mediated indirectly by non-covalent attachment of the lipid moiety to circulating albumin. A consequence of lipidation is that it reduces the water solubility of the peptide, but engineering of the linker between the peptide and the fatty acid can modulate this, for example by using glutamate or mini PEGs within the linker. Linker engineering and lipid moiety variation can affect self-aggregation, which may contribute to increased half-life by slowing biodistribution, independent of albumin. See, for example, Jonassen et al. (2012) Pharm Res. 29(8):2104–14.
D'autres exemples de groupements de liaison à l'albumine à utiliser dans la génération de certains agents AFFIMER® incluent les adnectines de liaison à l'albumine (PKE2) (voir WO2011140086 "Serum Albumin Binding Molecules", WO2015143199 "Serum albumin-binding Fibronectin Type III Domains" et WO2017053617 "Fast-off rate serum albumin binding fibronectin type iii domains"), le domaine de liaison à l'albumine 3 (ABD3, de l’anglais « albumin binding domain 3 ») de la protéine G de la souche G148 de Streptocoque, et l'anticorps du domaine de liaison à l'albumine GSK2374697 (« AlbudAb ») ou la portion de nanocorps de liaison à l'albumine de l'ATN-103 (Ozoralizumab).Other examples of albumin-binding moieties for use in the generation of certain AFFIMER® agents include albumin-binding adnectins (PKE2) (see WO2011140086 "Serum Albumin Binding Molecules", WO2015143199 "Serum albumin-binding Fibronectin Type III Domains" and WO2017053617 "Fast-off rate serum albumin binding fibronectin type iii domains"), albumin binding domain 3 (ABD3) of Streptococcus G148 strain G protein, and the albumin-binding domain antibody GSK2374697 ("AlbudAb") or the albumin-binding nanobody portion of ATN-103 (Ozoralizumab).
AFFIMER® XTAFFIMER® XT
Dans certains modes de réalisation, la molécule qui se lie à une protéine sérique telle que l’HSA comprend un polypeptide HSA AFFIMER®. Des exemples de tels polypeptides HSA AFFIMER® peuvent être trouvés dans WO2022/023540. Un polypeptide HSA AFFIMER® proposé ici, dans certains modes de réalisation, est lié à une autre molécule et étend la demi-vie de cette molécule (par ex. un polypeptide thérapeutique). Il a été démontré que ces polypeptides HSA AFFIMER® dans des études pharmacocinétiques (PK, de l’anglais « PharmacoKinetic ») in vivo prolongent, de manière contrôlée, la demi-vie sérique de tout autre polypeptide AFFIMER® thérapeutique auquel il est conjugué en une seule fusion génétique, par ex. qui peut être faite dans E. Coli. Les polypeptides AFFIMER® XT™ peuvent également être utilisés pour prolonger la demi-vie d'autres agents thérapeutiques peptidiques ou protéiques, tels que le TNFR2 AFFIMER® de la présente invention.In some embodiments, the molecule that binds to a serum protein such as HSA comprises an AFFIMER® HSA polypeptide. Examples of such AFFIMER® HSA polypeptides can be found in WO2022/023540. An AFFIMER® HSA polypeptide provided herein, in some embodiments, is linked to another molecule and extends the half-life of that molecule (e.g., a therapeutic polypeptide). These AFFIMER® HSA polypeptides have been shown in in vivo pharmacokinetic (PK) studies to controllably extend the serum half-life of any other therapeutic AFFIMER® polypeptide to which it is conjugated in a single genetic fusion, e.g., which may be made in E. Coli. AFFIMER® XT™ polypeptides may also be used to extend the half-life of other peptide or protein therapeutic agents, such as the TNFR2 AFFIMER® of the present invention.
Dans certains modes de réalisation, un polypeptide HSA AFFIMER® prolonge la demi-vie sérique du polypeptide TNFR2 AFFIMER® in vivo. Par exemple, un polypeptide HSA AFFIMER® peut étendre la demi-vie du polypeptide TNFR2 AFFIMER® d'au moins 2 fois, par rapport à la demi-vie de la molécule non liée à un polypeptide HSA AFFIMER®. Dans certains modes de réalisation, un polypeptide HSA AFFIMER® prolonge la demi-vie du polypeptide TNFR2 AFFIMER® d'au moins 3 fois, au moins 4 fois, au moins 5 fois, au moins 6 fois, au moins 7 fois, au moins 8 fois, au moins 9 fois, au moins 10 fois, au moins 20 fois, ou au moins 30 fois, par rapport à la demi-vie du polypeptide TNFR2 AFFIMER® non lié à un polypeptide HSA AFFIMER®. Dans certains modes de réalisation, un polypeptide HSA AFFIMER® prolonge la demi-vie du polypeptide TNFR2 AFFIMER® de 2 fois à 5 fois, 2 fois à 10 fois, 3 fois à 5 fois, 3 fois à 10 fois. 15 fois à 5 fois, 4 fois à 10 fois, ou 5 fois à 10 fois, par rapport à la demi-vie du polypeptide TNFR2 AFFIMER® non lié à un polypeptide HSA AFFIMER®. Dans certains modes de réalisation, un polypeptide HSA AFFIMER® prolonge la demi-vie du polypeptide TNFR2 AFFIMER® d'au moins 6 heures, d'au moins 12 heures, d'au moins 24 heures, d'au moins 48 heures, d'au moins 72 heures, d'au moins 96 heures, par exemple au moins 1 semaine après administration in vivo, par rapport à la demi-vie de la molécule non liée à un polypeptide HSA AFFIMER®.In some embodiments, an AFFIMER® HSA polypeptide prolongs the serum half-life of the AFFIMER® TNFR2 polypeptide in vivo. For example, an AFFIMER® HSA polypeptide can extend the half-life of the AFFIMER® TNFR2 polypeptide by at least 2-fold, relative to the half-life of the molecule unbound to an AFFIMER® HSA polypeptide. In some embodiments, an AFFIMER® HSA polypeptide prolongs the half-life of the AFFIMER® TNFR2 polypeptide by at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 6-fold, at least 7-fold, at least 8-fold, at least 9-fold, at least 10-fold, at least 20-fold, or at least 30-fold, relative to the half-life of the AFFIMER® TNFR2 polypeptide unbound to an AFFIMER® HSA polypeptide. In some embodiments, an AFFIMER® HSA polypeptide extends the half-life of the AFFIMER® TNFR2 polypeptide by 2-fold to 5-fold, 2-fold to 10-fold, 3-fold to 5-fold, 3-fold to 10-fold, 15-fold to 5-fold, 4-fold to 10-fold, or 5-fold to 10-fold, relative to the half-life of the AFFIMER® TNFR2 polypeptide unbound to an AFFIMER® HSA polypeptide. In some embodiments, an AFFIMER® HSA polypeptide extends the half-life of the AFFIMER® TNFR2 polypeptide by at least 6 hours, at least 12 hours, at least 24 hours, at least 48 hours, at least 72 hours, at least 96 hours, e.g., at least 1 week after in vivo administration, relative to the half-life of the molecule unbound to an AFFIMER® HSA polypeptide.
Un polypeptide HSA AFFIMER® comprend un polypeptide AFFIMER® dans lequel au moins une des boucles accessibles à solvant provient de la protéine Stéfine A de type sauvage ayant des séquences d'acides aminés pour permettre à un polypeptide AFFIMER® de se lier à l'HSA, sélectivement, et dans certains modes de réalisation, avec un Kd de 10-6M ou moins.An AFFIMER® HSA polypeptide comprises an AFFIMER® polypeptide wherein at least one of the solvent accessible loops is derived from wild-type Stefin A protein having amino acid sequences to enable an AFFIMER® polypeptide to bind to HSA, selectively, and in some embodiments, with a Kd of 10-6 M or less.
Dans certains modes de réalisation, le polypeptide HSA AFFIMER® est dérivé de la protéine Stéfine A humaine de type sauvage ayant une séquence squelette et dans laquelle l'une ou les deux parmi la boucle 2 (désignée (Xaa)n) et la boucle 4 (désignée (Xaa)m) sont remplacées par des séquences de boucles alternatives (Xaa)n et (Xaa)m, pour avoir la Formule générale (I) :In some embodiments, the HSA AFFIMER® polypeptide is derived from wild-type human Stefin A protein having a backbone sequence and wherein one or both of loop 2 (designated (Xaa)n) and loop 4 (designated (Xaa)m) are replaced with alternative loop sequences (Xaa)n and (Xaa)m, to have the general Formula (I):
FR1-(Xaa)n-FR2-(Xaa)m-FR3 (I),FR1-(Xaa)n-FR2-(Xaa)m-FR3 (I),
où FR1 est une séquence d’acides aminés ayant au moins 70 % (par ex. au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 % ou 100 %) d'identité avec MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TNETYGKLEA VQYKTQVLA (SEQ ID NO : 470) ; FR2 est une séquence d’acides aminés ayant au moins 70 % (par ex. au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 % ou 100 %) d'identité avec GTNYYIKVRA GDNKYMHLKV FKSL (SEQ ID NO : 2) ; FR3 est une séquence d’acides aminés ayant au moins 70 % (par ex. au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 % ou 100 %) d'identité avec EDLVLTGYQV DKNKDDELTG F (SEQ ID NO : 3) ; Xaa, individuellement pour chaque occurrence, est un acide aminé ; et n est un nombre entier de 3 à 20, et m est un nombre entier de 3 à 20. Des variantes supplémentaires de cette structure générale peuvent être trouvées dans WO2022/023540.where FR1 is an amino acid sequence having at least 70% (e.g. at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% or 100%) identity with MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TNETYGKLEA VQYKTQVLA (SEQ ID NO: 470); FR2 is an amino acid sequence having at least 70% (e.g. at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% or 100%) identity with GTNYYIKVRA GDNKYMHLKV FKSL (SEQ ID NO: 2); FR3 is an amino acid sequence having at least 70% (e.g. at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% or 100%) identity to EDLVLTGYQV DKNKDDELTG F (SEQ ID NO: 3); Xaa, individually for each occurrence, is an amino acid; and n is an integer from 3 to 20, and m is an integer from 3 to 20. Additional variations of this general structure can be found in WO2022/023540.
Dans tous les modes de réalisation, chaque acide aminé de (Xaa)n peut être identique ou sélectionné parmi n'importe quel acide aminé. Il en va de même pour (Xaa)m.In all embodiments, each amino acid of (Xaa)n may be the same or selected from any amino acid. The same is true for (Xaa)m.
Dans certains modes de réalisation, le polypeptide TNFR2 AFFIMER® comprend un polypeptide HSA AFFIMER® comprenant une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi l'une quelconque des SEQ ID NO : 471-477 (Table 6). Dans certains modes de réalisation, le polypeptide TNFR2 AFFIMER® a une demi-vie sérique étendue et comprend une séquence d'acides aminés qui est au moins à 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % identique à une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 471-477 (Table 6). Des séquences de polypeptides HSA AFFIMER® supplémentaires à utiliser avec la présente invention peuvent être trouvées dans WO2022/023540.In some embodiments, the TNFR2 AFFIMER® polypeptide comprises an HSA AFFIMER® polypeptide comprising an amino acid sequence selected from any of SEQ ID NOs: 471-477 (Table 6). In some embodiments, the TNFR2 AFFIMER® polypeptide has an extended serum half-life and comprises an amino acid sequence that is at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or even 98% identical to a sequence selected from SEQ ID NOs: 471-477 (Table 6). Additional HSA AFFIMER® polypeptide sequences for use with the present invention can be found in WO2022/023540.
Tableau 6. Exemples de séquences polypeptidiques HSA AFFIMER®
ConjuguésConjugated
Les agents AFFIMER® sujets peuvent également inclure au moins un groupement fonctionnel destiné à conférer une détectabilité ou une activité pharmacologique supplémentaire à l'agent AFFIMER®. Les groupements fonctionnels pour la détection sont ceux qui peuvent être employés pour détecter l'association de l'agent AFFIMER® avec une cellule ou un tissu in vivo. Les groupements fonctionnels ayant une activité pharmacologique sont les agents qui sont destinés à être délivrés au tissu exprimant la cible de l'agent AFFIMER® (TNFR2 dans le cas des agents TNFR2 AFFIMER® de la présente divulgation) et, ce faisant, ont une conséquence pharmacologique pour les tissus ou cellules ciblé(e)s.The subject AFFIMER® agents may also include at least one functional group intended to provide additional detectability or pharmacological activity to the AFFIMER® agent. Functional groups for detection are those that can be used to detect the association of the AFFIMER® agent with a cell or tissue in vivo. Functional groups having pharmacological activity are those agents that are intended to be delivered to the tissue expressing the target of the AFFIMER® agent (TNFR2 in the case of the TNFR2 AFFIMER® agents of the present disclosure) and, in doing so, have a pharmacological consequence for the targeted tissues or cells.
La présente divulgation propose des agents AFFIMER® incluant des conjugués de substances ayant une grande variété de groupes, de substituants ou de groupements fonctionnels, ces Groupements Fonctionnels (en anglais « Functional Moieties ») incluant, mais sans s'y limiter, un marqueur ; un colorant ; une molécule d'immunoadhésion ; un radionucléide ; un composé cytotoxique ; un médicament ; un marqueur d'affinité ; un marqueur de photoaffinité ; un composé réactif ; une résine ; une seconde protéine ou un second polypeptide ou analogue de polypeptide ; un anticorps ou fragment d'anticorps ; un chélateur métallique ; un cofacteur ; un acide gras ; un glucide ; un polynucléotide ; un ADN ; un ARN ; un polynucléotide antisens ; un saccharide ; un dendrimère soluble dans l'eau ; une cyclodextrine ; un acide ribonucléique inhibiteur ; un biomatériau ; une nanoparticule ; une sonde radicalaire (en anglais « spin label ») ; un fluorophore, un groupement contenant un métal ; un groupement radioactif ; un nouveau groupe fonctionnel ; un groupe qui interagit de manière covalente ou non covalente avec d'autres molécules ; un groupement photocagé ; un groupement excitable par rayonnement actinique ; un groupement photoisomérisable ; la biotine ; un dérivé de la biotine ; un analogue de la biotine ; un groupement incorporant un atome lourd ; un groupe chimiquement clivable ; un groupe photoclivable ; une chaîne latérale allongée ; un sucre lié à un carbone ; un agent redox-actif ; un aminothioacide ; un groupement toxique ; un groupement isotopiquement marqué ; une sonde biophysique ; un groupe phosphorescent ; un groupe chimioluminescent ; un groupe dense en électrons ; un groupe magnétique ; un groupe intercalant ; un chromophore ; un agent de transfert d'énergie ; un agent biologiquement actif ; un marqueur détectable ; une petite molécule ; un point quantique ; un nanotransmetteur ; un radionucléotide ; un émetteur radio ; un agent de capture de neutrons ; ou toute combinaison de ce qui précède, ou tout autre composé ou substance souhaitable.The present disclosure provides AFFIMER® agents including conjugates of substances having a wide variety of groups, substituents or functional moieties, such Functional Moieties including, but not limited to, a label; a dye; an immunoadhesion molecule; a radionuclide; a cytotoxic compound; a drug; an affinity tag; a photoaffinity tag; a reactive compound; a resin; a second protein or polypeptide or polypeptide analog; an antibody or antibody fragment; a metal chelator; a cofactor; a fatty acid; a carbohydrate; a polynucleotide; a DNA; an RNA; an antisense polynucleotide; a saccharide; a water-soluble dendrimer; a cyclodextrin; an inhibitory ribonucleic acid; a biomaterial; a nanoparticle; a spin label; a fluorophore, a metal-containing group; a radioactive group; a novel functional group; a group that interacts covalently or non-covalently with other molecules; a photocaged group; a group excitable by actinic radiation; a photoisomerizable group; biotin; a biotin derivative; a biotin analogue; a group incorporating a heavy atom; a chemically cleavable group; a photocleavable group; an elongated side chain; a sugar linked to a carbon; a redox-active agent; an aminothioacid; a toxic group; an isotopically labeled group; a biophysical probe; a phosphorescent group; a chemiluminescent group; an electron-dense group; a magnetic group; an intercalating group; a chromophore; an energy transfer agent; a biologically active agent; a detectable label; a small molecule; a quantum dot; a nanotransmitter; a radionucleotide; a radio emitter; a neutron capture agent; or any combination of the foregoing, or any other desirable compound or substance.
Marqueurs et groupements détectablesDetectable markers and groups
Lorsque le groupement est un marqueur détectable, il peut s'agir d'un marqueur fluorescent, d'un marqueur radioactif, d'un marqueur enzymatique ou de tout autre marqueur connu de la personne du métier. Dans certains modes de réalisation, le groupement fonctionnel est un marqueur détectable qui peut être inclus en tant que partie d'un conjugué pour former certains agents AFFIMER® adaptés à l'imagerie médicale. Par « imagerie médicale », on entend toute technique permettant de visualiser une région interne du corps humain ou animal, à des fins de diagnostic, de recherche ou de traitement thérapeutique. Par exemple, l'agent AFFIMER® peut être détecté (et quantifié) par radioscintigraphie, imagerie par résonance magnétique (IRM), tomodensitométrie (en l’anglais « computed tomography », ou CT scan), imagerie nucléaire, émission de positrons comprenant un agent de contraste de tomographie métallique (PET, de l’anglais « Positron Emission Tomography »), imagerie optique (telle que l'imagerie par fluorescence comprenant l'imagerie par fluorescence dans le proche infrarouge (NIRF, de l’anglais « near-infrared fluorescence »), imagerie par bioluminescence ou des combinaisons de celles-ci. Le Groupement Fonctionnel (en anglais « Functional Moiety ») est optionnellement un agent de contraste pour l'imagerie par rayons X. Les agents utiles pour amplifier ces techniques sont les matériaux qui permettent une visualisation d'un locus, organe ou site de maladie particulier dans le corps, et/ou qui mènent à une certaine amélioration de la qualité des images générées par les techniques d'imagerie, offrant une interprétation améliorée ou plus facile de ces images. De tels agents sont appelés ici agents de contraste, dont l'utilisation facilite la différenciation des différentes parties de l'image, en augmentant le "contraste" entre ces différentes régions de l'image. Le terme « agents de contraste » englobe ainsi les agents qui servent à amplifier la qualité d'une image qui peut néanmoins être générée en l'absence d'un tel agent (comme c'est le cas, par exemple, en IRM), ainsi que les agents qui sont préalables à la génération d'une image (comme c'est le cas, par exemple, en imagerie nucléaire).When the moiety is a detectable label, it may be a fluorescent label, a radioactive label, an enzymatic label or any other label known to those skilled in the art. In some embodiments, the functional group is a detectable label that may be included as part of a conjugate to form certain AFFIMER® agents suitable for medical imaging. By "medical imaging" is meant any technique for visualizing an internal region of the human or animal body, for diagnostic, research or therapeutic treatment purposes. For example, the AFFIMER® agent may be detected (and quantified) by X-ray scanning, magnetic resonance imaging (MRI), computed tomography (CT) scan, nuclear imaging, positron emission tomography (PET) contrast agent, optical imaging (such as fluorescence imaging including near-infrared fluorescence (NIRF) imaging), bioluminescence imaging, or combinations thereof. The Functional Moiety is optionally a contrast agent for X-ray imaging. Agents useful for enhancing these techniques are materials that allow visualization of a particular locus, organ, or disease site in the body, and/or that lead to some improvement in the quality of images generated by the imaging techniques, providing improved or easier interpretation of those images. Such agents are herein referred to as contrast agents, the use of which facilitates the differentiation of different parts of the image, by increasing the "contrast" between these different regions of the image. The term "contrast agents" thus encompasses agents which serve to amplify the quality of an image which can nevertheless be generated in the absence of such an agent (as is the case, for example, in MRI), as well as agents which are prior to the generation of an image (as is the case, for example, in nuclear imaging).
Dans certains modes de réalisation, le marqueur détectable comprend un groupement chélate pour chélater un métal, par ex. un chélateur pour un radiométal ou un ion paramagnétique. Dans certains modes de réalisation, le marqueur détectable est un chélateur pour un radionucléide utile pour des procédures de radiothérapie ou d'imagerie. Les radionucléides utiles dans la présente divulgation incluent les émetteurs gamma, émetteurs de positrons, émetteurs d'électrons Auger, émetteurs de rayons X et émetteurs de fluorescence, avec les émetteurs bêta ou alpha à usage thérapeutique. Voici des exemples de radionucléides utiles comme toxines en radiothérapie : 43K, 47Sc, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 64Cu, 67Ga, 67Cu, 68Ga, 71Ge, 75Br, 76Br, 77Br, 77As, 81Rb, 90Y, 97Ru, 99mTc, 100Pd, 101Rh, 103Pb, 105Rh, 109Pd, 111Ag, 111In, 113In, 119Sb 121Sn, 123I, 125I, 127Cs, 128Ba, 129Cs, 131I, 131Cs, 143Pr, 153Sm, 161Tb, 166Ho, 169Eu, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 191Os, 193Pt, 194Ir, 197Hg, 199Au, 203Pb, 211At, 212Pb, 212Bi et 213Bi. Les conditions dans lesquelles un chélateur coordonnera un métal sont décrites, par exemple, par Gansow et al., Brevet US NOS: 4,831,175, 4,454,106 et 4,472,509. Des exemples de chélateurs comprennent, simplement à titre d'illustration, l'acide 1,4,7-triazacyclononane-N,N',N"-triacétique (NOTA) l’acide 1,4,7,10-tétraazacyclododécane-N,N',N",N'"-tétraacétique (DOTA) l’acide 1,4,8,11-tétraazacyclotétradécane-N,N',N",N'"-tétraacétique (TETA).In some embodiments, the detectable label comprises a chelate moiety for chelating a metal, e.g., a chelator for a radiometal or a paramagnetic ion. In some embodiments, the detectable label is a chelator for a radionuclide useful for radiation therapy or imaging procedures. Radionuclides useful in the present disclosure include gamma emitters, positron emitters, Auger electron emitters, X-ray emitters, and fluorescence emitters, with beta or alpha emitters for therapeutic use. Examples of radionuclides useful as toxins in radiotherapy include: 43K, 47Sc, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 64Cu, 67Ga, 67Cu, 68Ga, 71Ge, 75Br, 76Br, 77Br, 77As, 81Rb, 90Y, 97Ru, 99mTc, 100Pd, 101Rh, 103Pb, 105Rh, 109Pd, 111Ag, 111In, 113In, 119Sb 121Sn, 123I, 125I, 127Cs, 128Ba, 129Cs, 131I, 131Cs, 143Pr, 153Sm, 161Tb, 166Ho, 169Eu, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 191Os, 193Pt, 194Ir, 197Hg, 199Au, 203Pb, 211At, 212Pb, 212Bi and 213Bi. The conditions under which a chelator will coordinate a metal are described, for example, by Gansow et al., US Patent Nos.: 4,831,175, 4,454,106 and 4,472,509. Examples of chelators include, by way of illustration only, 1,4,7-triazacyclononane-N,N',N"-triacetic acid (NOTA), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N",N'"-tetraacetic acid (DOTA), 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-N,N',N",N'"-tetraacetic acid (TETA).
D'autres isotopes détectables qui peuvent être incorporés directement dans les résidus d'acides aminés du polypeptide AFFIMER® ou qui autrement ne nécessitent pas de chélateur, incluent 3H, 14C, 32P, 35S et 36Cl.Other detectable isotopes that can be incorporated directly into the amino acid residues of the AFFIMER® polypeptide or that otherwise do not require a chelator, include 3H, 14C, 32P, 35S and 36Cl.
Des ions paramagnétiques, utiles pour les procédures de diagnostic, peuvent également être administrés. Des exemples d'ions paramagnétiques incluent le chrome (III), le manganèse (II), le fer (III), le fer (II), le cobalt (II), le nickel (II), le cuivre (II), le néodyme (III), le samarium (III), l’ytterbium (III), le gadolinium (III), le vanadium (II), le terbium (III), le dysprosium (III), l’holmium (III), l’erbium (III), ou des combinaisons de ces ions paramagnétiques.Paramagnetic ions, useful for diagnostic procedures, may also be administered. Examples of paramagnetic ions include chromium(III), manganese(II), iron(III), iron(II), cobalt(II), nickel(II), copper(II), neodymium(III), samarium(III), ytterbium(III), gadolinium(III), vanadium(II), terbium(III), dysprosium(III), holmium(III), erbium(III), or combinations of these paramagnetic ions.
Des exemples de marqueurs fluorescents incluent, mais sans s'y limiter, les colorants organiques (par ex. la cyanine, la fluorescéine, la rhodamine, les Alexa Fluors, les Dylight fluors, les ATTO Dyes, les BODIPY Dyes, etc.), les fluorophores biologiques (par ex. la protéine fluorescente verte (GFP, de l’anglais « Green Fluorescent Protein »), l’R-Phycoérythrine, etc.), et les points quantiques.Examples of fluorescent labels include, but are not limited to, organic dyes (e.g., cyanine, fluorescein, rhodamine, Alexa Fluors, Dylight fluors, ATTO Dyes, BODIPY Dyes, etc.), biological fluorophores (e.g., green fluorescent protein (GFP), R-Phycoerythrin, etc.), and quantum dots.
Les composés fluorescents non limitatifs qui peuvent être utilisés dans la présente divulgation incluent, Cy5, Cy5.5 (également connu sous le nom de Cy5++), Cy2, l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC, de l’anglais « fluorescein isothiocyanate »), l'isothiocyanate de tétraméthylrhodamine (TRITC, de l’anglais « tetramethylrhodamine isothiocyanate »), la phycoérythrine, Cy7, la fluorescéine (FAM), Cy3, Cy3.5 (également connu sous le nom de Cy3++), Texas Red, LightCycler-Red 640, LightCycler Red 705, la tétraméthylrhodamine (TMR), la rhodamine, un dérivé de rhodamine (ROX), l’hexachlorofluorescéine (HEX), la rhodamine 6G (R6G), le dérivé de rhodamine JA133, les Alexa Fluorescent Dyes (tels que Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 555, et Alexa Fluor 647), le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), l’iodure de propidium, l’AMCA, le Spectrum Green, le Spectrum Orange, le Spectrum Aqua, la Lissamine et complexes de métaux de transition fluorescents, tels que l'europium. Les composés fluorescents qui peuvent être utilisés incluent également des protéines fluorescentes, telles que la GFP (protéine fluorescente verte), la GFP amplifiée (EGFP, de l’anglais « enhanced GFP »), la protéine fluorescente bleue et ses dérivés (BFP, de l’anglais « blue fluorescent protein », EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1), la protéine fluorescente cyan et ses dérivés (CFP, de l’anglais « cyan fluorescent protein », ECFP, Cerulean, CyPet) et la protéine fluorescente jaune et ses dérivés (YFP, de l’anglais « yellow fluorescent protein », Citrine, Venus, YPet). WO2008142571, WO2009056282, WO9922026.Non-limiting fluorescent compounds that may be used in the present disclosure include, Cy5, Cy5.5 (also known as Cy5++), Cy2, fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), phycoerythrin, Cy7, fluorescein (FAM), Cy3, Cy3.5 (also known as Cy3++), Texas Red, LightCycler-Red 640, LightCycler Red 705, tetramethylrhodamine (TMR), rhodamine, rhodamine derivative (ROX), hexachlorofluorescein (HEX), rhodamine 6G (R6G), rhodamine derivative JA133, Alexa Fluorescent Dyes (such as Alexa Fluorescent Dyes), and the like. Fluorine 488, Alexa Fluorine 546, Alexa Fluorine 633, Alexa Fluorine 555, and Alexa Fluorine 647), 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), propidium iodide, AMCA, Spectrum Green, Spectrum Orange, Spectrum Aqua, Lissamine, and fluorescent transition metal complexes, such as europium. Fluorescent compounds that can be used also include fluorescent proteins, such as GFP (green fluorescent protein), enhanced GFP (EGFP), blue fluorescent protein and derivatives (BFP, EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1), cyan fluorescent protein and derivatives (CFP, ECFP, Cerulean, CyPet), and yellow fluorescent protein and derivatives (YFP, Citrine, Venus, YPet). WO2008142571, WO2009056282, WO9922026.
Des exemples de marqueurs enzymatiques incluent, mais sans s'y limiter, la peroxydase de raifort (HRP, de l’anglais « horseradish peroxidase »), la phosphatase alcaline (AP, de l’anglais « alkaline phosphatase »), la glucose oxydase et la ß-galactosidase.Examples of enzyme markers include, but are not limited to, horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (AP), glucose oxidase, and ß-galactosidase.
Un autre marqueur bien connu est la biotine. Les marqueurs à biotine sont généralement composés du groupe biotinyle, d'un bras espaceur et d'un groupe réactif qui est responsable de la fixation aux groupes fonctionnels cibles sur les protéines. La biotine peut être utile pour attacher la protéine marquée à d'autres groupements qui comprennent un groupement avidine.Another well-known label is biotin. Biotin labels are usually composed of the biotinyl group, a spacer arm, and a reactive group that is responsible for attachment to target functional groups on proteins. Biotin can be useful for attaching the labeled protein to other moieties that include an avidin group.
Conjugués polypeptides AFFIMER®-médicamentsAFFIMER® polypeptide-drug conjugates
Dans certains modes de réalisation, l'agent AFFIMER® comprend au moins un agent thérapeutique, par ex. pour former un conjugué polypeptide-médicament AFFIMER®. Tel qu'utilisé ici, le terme « agent thérapeutique » fait référence à une substance qui peut être utilisée dans la guérison, l'atténuation, le traitement ou la prévention d'une maladie chez un humain ou autre animal. De tels agents thérapeutiques incluent des substances reconnues dans la Pharmacopée officielle des États-Unis (de l’anglais « official United States Pharmacopeia »), la Pharmacopée Homéopathique officielle des États-Unis (de l’anglais « official Homeopathic Pharmacopeia of the United States »), le Formulaire National officiel (de l’anglais « official National Formulary »), ou toute addition de ceux-ci, et incluent, mais sans s'y limiter, les petites molécules, les nucléotides, les oligopeptides, les polypeptides, etc. Les agents thérapeutiques qui peuvent être attachés aux polypeptides contenant AFFIMER® incluent, mais sans s'y limiter, le/les agents cytotoxiques, anti-métabolites, agents alkylants, antibiotiques, facteur de croissance, cytokines, agents anti-angiogéniques, agents anti-mitotiques, toxines, agents apoptotiques ou similaires, tels que les agents alkylants d'ADN, inhibiteurs de la topoisomérase, inhibiteurs des microtubules (par ex. DM1, DM4, MMAF et MMAE), agents induisant le stress du réticulum endoplasmique, composés du platine, antimétabolites, vincalcaloïdes, taxanes, épothilones, inhibiteurs d'enzymes, antagonistes des récepteurs, anticorps thérapeutiques, inhibiteurs de la tyrosine kinase, radiosensibilisants et combinaisons thérapeutiques chimiothérapeutiques, tels qu’en illustration.In some embodiments, the AFFIMER® agent comprises at least one therapeutic agent, e.g., to form an AFFIMER® polypeptide-drug conjugate. As used herein, the term “therapeutic agent” refers to a substance that can be used in the cure, mitigation, treatment, or prevention of disease in a human or other animal. Such therapeutic agents include substances recognized in the Official United States Pharmacopeia, the Official Homeopathic Pharmacopeia of the United States, the Official National Formulary, or any combination thereof, and include, but are not limited to, small molecules, nucleotides, oligopeptides, polypeptides, and the like. Therapeutic agents that may be attached to AFFIMER®-containing polypeptides include, but are not limited to, cytotoxic agent(s), anti-metabolites, alkylating agents, antibiotics, growth factors, cytokines, anti-angiogenic agents, anti-mitotic agents, toxins, apoptotic agents or the like, such as DNA alkylating agents, topoisomerase inhibitors, microtubule inhibitors (e.g., DM1, DM4, MMAF and MMAE), endoplasmic reticulum stress inducing agents, platinum compounds, antimetabolites, vincalcaloids, taxanes, epothilones, enzyme inhibitors, receptor antagonists, therapeutic antibodies, tyrosine kinase inhibitors, radiosensitizers and chemotherapeutic combination therapies, as illustrated.
N'importe quel procédé connu dans l'art pour la conjugaison à des anticorps et autres protéines peut être utilisé pour générer les conjugués de la présente divulgation, y compris les procédés décrits par Hunter, et al., (1962) Nature 144:945 ; David et al., (1974) Biochemistry 13:1014 ; Pain, et al., (1981) J. Immunol. Meth. 40:219; et Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407. Les procédés de conjugaison de peptides, de polypeptides et de groupements organiques et inorganiques à des anticorps et à d'autres protéines sont conventionnels et très bien connus dans l'art et facilement adaptés à la génération de ces versions des agents AFFIMER® sujets.Any method known in the art for conjugation to antibodies and other proteins can be used to generate the conjugates of the present disclosure, including the methods described by Hunter, et al., (1962) Nature 144:945; David et al., (1974) Biochemistry 13:1014; Pain, et al., (1981) J. Immunol. Meth. 40:219; and Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407. Methods for conjugating peptides, polypeptides, and organic and inorganic moieties to antibodies and other proteins are conventional and very well known in the art and readily adapted to the generation of these versions of the subject AFFIMER® agents.
Lorsque le groupement conjugué est un peptide ou un polypeptide, ce groupement peut être chimiquement réticulé au polypeptide contenant l'AFFIMER® ou peut être inclus en tant que partie d'une protéine de fusion avec le polypeptide contenant l'AFFIMER®. Et un exemple illustratif serait une protéine de fusion toxine diphtérique-AFFIMER®. Dans le cas d'entités non peptidiques, l'ajout au polypeptide contenant AFFIMER® se fera généralement par voie de conjugaison chimique au polypeptide contenant AFFIMER® - tel que via un groupe fonctionnel sur une chaîne latérale d'acide aminé ou le groupe carboxyle au niveau du groupe C-terminal ou amino à l'extrémité N-terminale du polypeptide. Dans certains modes de réalisation, qu'il s'agisse d'une protéine de fusion ou d'un groupement chimiquement réticulé, le groupement conjugué comprendra au moins un site qui est sensible à une condition environnementale (telle que le pH) qui permet au groupement conjugué d'être libéré du polypeptide contenant l'AFFIMER®, comme dans un tissu malade (ou un tissu à protéger si le groupement conjugué fonctionne pour protéger un tissu sain).Where the conjugated moiety is a peptide or polypeptide, such moiety may be chemically cross-linked to the AFFIMER®-containing polypeptide or may be included as part of a fusion protein with the AFFIMER®-containing polypeptide. And an illustrative example would be a diphtheria toxin-AFFIMER® fusion protein. In the case of non-peptide entities, addition to the AFFIMER®-containing polypeptide will generally be by way of chemical conjugation to the AFFIMER®-containing polypeptide - such as via a functional group on an amino acid side chain or the carboxyl group at the C-terminal or amino group at the N-terminus of the polypeptide. In some embodiments, whether a fusion protein or a chemically cross-linked moiety, the conjugated moiety will include at least one site that is responsive to an environmental condition (such as pH) that allows the conjugated moiety to be released from the AFFIMER®-containing polypeptide, such as in diseased tissue (or tissue to be protected if the conjugated moiety functions to protect healthy tissue).
EspaceursSpacers
Dans certains modes de réalisation, un conjugué polypeptide-médicament AFFIMER® comprend un espaceur ou une liaison (L1) entre le groupement d'extension de demi-vie et la séquence de reconnaissance de substrat (SRS, de l’anglais « substrate recognition sequence ») clivable par l'enzyme, par ex. présente dans un microenvironnement inflammatoire.In some embodiments, an AFFIMER® polypeptide-drug conjugate comprises a spacer or linkage (L1) between the half-life extension moiety and the substrate recognition sequence (SRS) cleavable by the enzyme, e.g., present in an inflammatory microenvironment.
L'espaceur peut être n'importe quelle molécule, par ex. un ou plus nucléotides, acides aminés, groupes fonctionnels chimiques. Dans certains modes de réalisation, l'espaceur est un lieur peptidique (par ex. deux acides aminés ou plus). Les espaceurs ne doivent pas affecter négativement l'expression, la sécrétion ou la bioactivité des polypeptides. Dans certains modes de réalisation, les espaceurs ne sont pas antigéniques et ne suscitent pas de réponse immunitaire. Une réponse immunitaire comprend une réponse du système immunitaire inné et/ou du système immunitaire adaptatif. Ainsi, une réponse immunitaire peut être une réponse à médiation cellulaire et/ou une réponse immunitaire humorale. La réponse immunitaire peut être, par exemple, une réponse à lymphocytes T, une réponse à lymphocytes B, une réponse à lymphocytes tueurs naturels (NK), une réponse à monocytes et/ou une réponse à macrophages. D'autres réponses cellulaires sont envisagées ici. Dans certains modes de réalisation, les lieurs ne codent pas pour des protéines.The spacer may be any molecule, e.g., one or more nucleotides, amino acids, chemical functional groups. In some embodiments, the spacer is a peptide linker (e.g., two or more amino acids). The spacers should not adversely affect the expression, secretion, or bioactivity of the polypeptides. In some embodiments, the spacers are non-antigenic and do not elicit an immune response. An immune response includes a response from the innate immune system and/or the adaptive immune system. Thus, an immune response may be a cell-mediated response and/or a humoral immune response. The immune response may be, for example, a T cell response, a B cell response, a natural killer (NK) cell response, a monocyte response, and/or a macrophage response. Other cellular responses are contemplated herein. In some embodiments, the linkers do not encode proteins.
Dans certains modes de réalisation, L1 est un hydrocarbure (chaîne droite ou cyclique) tel que le 6-maléimidocaproyle, le maléimidopropanoyle et le maléimidom éthyl cyclohexane-l-carboxylate, ou L1 est le N-succinimidyl 4-(2-pyridylthio) pentanoate, le N-succinimidyl 4- (N- maléimidométhyl) cyclohexane-1 carboxylate, le N-succinimidyl (4-iodo-acétyl) aminobenzoate.In some embodiments, L1 is a hydrocarbon (straight chain or cyclic) such as 6-maleimidocaproyl, maleimidopropanoyl and maleimidom ethyl cyclohexane-1-carboxylate, or L1 is N-succinimidyl 4-(2-pyridylthio) pentanoate, N-succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1 carboxylate, N-succinimidyl (4-iodo-acetyl) aminobenzoate.
Dans certains modes de réalisation, L1 est un polyéther tel qu'un poly(éthylène glycol) ou un autre lieur hydrophile. Par exemple, lorsque le CBM (de l’anglais « carbohydrate-binding module », soit module de liaison aux glucides) comprend un thiol (tel qu'un résidu de cystéine), L1 peut être un polyéthylèneglycol) couplé au groupe thiol par l'intermédiaire d'un groupement maléimide.In some embodiments, L1 is a polyether such as a poly(ethylene glycol) or other hydrophilic linker. For example, when the CBM (carbohydrate-binding module) comprises a thiol (such as a cysteine residue), L1 may be a polyethylene glycol) coupled to the thiol group through a maleimide moiety.
Des exemples non limitatifs de lieurs à utiliser conformément à la présente divulgation sont décrits dans la publication internationale n° WO 2019/236567, publiée le 12 décembre 2019.Non-limiting examples of linkers for use in accordance with the present disclosure are described in International Publication No. WO 2019/236567, published on December 12, 2019.
Polynucléotide AFFIMER® codé pour administration in vivoAFFIMER® polynucleotide encoded for in vivo administration
Une approche alternative à la délivrance d'agents thérapeutiques AFFIMER®, tels qu'un agent TNF2 AFFIMER®, serait de laisser la production du polypeptide thérapeutique au corps lui-même. Une multitude d'études cliniques a illustré l'utilité du transfert de gène in vivo dans les cellules en utilisant une variété de systèmes de délivrance différents. Le transfert de gène in vivo cherche à administrer aux patients le polynucléotide AFFIMER® codé, plutôt que l'agent AFFIMER®. Cela permet au corps du patient de produire l'agent thérapeutique AFFIMER® d'intérêt pendant une durée prolongée, et de le sécréter soit de manière systémique soit locale, selon le site de production. Le polynucléotide AFFIMER® codé à base de gènes peut présenter une alternative économique en termes de temps et financiers aux production, purification et administration conventionnelles de la version polypeptidique de l'agent AFFIMER®. Un certain nombre de plateformes d'expression d'anticorps, auxquelles la livraison du polynucléotide codé AFFIMER® peut être adaptée, a été suivi in vivo, y compris les vecteurs viraux, l'ADN nu et l'ARN.An alternative approach to the delivery of AFFIMER® therapeutic agents, such as an AFFIMER® TNF2 agent, would be to have the body itself produce the therapeutic polypeptide. A multitude of clinical studies have illustrated the utility of in vivo gene transfer into cells using a variety of different delivery systems. In vivo gene transfer seeks to deliver the encoded AFFIMER® polynucleotide, rather than the AFFIMER® agent, to patients. This allows the patient's body to produce the AFFIMER® therapeutic agent of interest for an extended period of time, and to secrete it either systemically or locally, depending on the site of production. The gene-encoded AFFIMER® polynucleotide may present a time- and cost-effective alternative to conventional production, purification, and administration of the polypeptide version of the AFFIMER® agent. A number of antibody expression platforms, to which delivery of the AFFIMER®-encoded polynucleotide can be adapted, have been monitored in vivo, including viral vectors, naked DNA and RNA.
Le succès de la thérapie génique a été entraîné en grande partie par les améliorations apportées aux vecteurs de transfert de gènes non viraux et viraux. Un éventail de procédés non viraux physiques et chimiques a été utilisé pour transférer de l'ADN et de l'ARNm à des cellules de mammifères et un nombre substantiel de ceux-ci a été développé en tant que technologies de stade clinique pour la thérapie génique, à la fois ex vivo et in vivo, et est facilement adapté à la délivrance du polynucléotide TNFR2 AFFIMER® codé de la présente divulgation.The success of gene therapy has been driven in large part by improvements in nonviral and viral gene transfer vectors. A variety of nonviral physical and chemical methods have been used to transfer DNA and mRNA to mammalian cells and a substantial number of these have been developed as clinical stage technologies for gene therapy, both ex vivo and in vivo, and are readily adapted to deliver the encoded TNFR2 AFFIMER® polynucleotide of the present disclosure.
Une approche efficace de transfert de gène AFFIMER® codé aboutit à une expression qui doit être à un niveau approprié à l'application spécifique. Les promoteurs sont un élément majeur agissant en cis au sein de la conception du génome du vecteur qui peut dicter la force globale de l'expression ainsi que la spécificité cellulaire. De même, la polyadénylation d'une transcription AFFIMER® codé transcrite peut également être importante pour l'exportation nucléaire, la traduction et la stabilité de l'ARNm. Par conséquent, dans certains modes de réalisation, le polynucléotide AFFIMER® codé comprendra un promoteur et/ou une séquence signal de polyadénylation, ainsi que d'autres éléments régulateurs bien connus dans l'art, tels que des amplificateurs (de l’anglais « enhancers »), des séquences introniques, des agents régulateurs post-transcriptionnels et similaires.An efficient approach to encoded AFFIMER® gene transfer results in expression that must be at a level appropriate to the specific application. Promoters are a major cis-acting element within the design of the vector genome that can dictate the overall strength of expression as well as cellular specificity. Similarly, polyadenylation of an encoded AFFIMER® transcript can also be important for nuclear export, translation, and mRNA stability. Therefore, in some embodiments, the encoded AFFIMER® polynucleotide will include a promoter and/or a polyadenylation signal sequence, as well as other regulatory elements well known in the art, such as enhancers, intronic sequences, post-transcriptional regulatory agents, and the like.
Vecteurs virauxViral vectors
Des exemples de système de thérapie génique virale qui sont facilement adaptés pour utilisation dans la présente invention incluent les plasmides, les adénovirus, les virus adéno-associés (AAV), les rétrovirus, les lentivirus, les virus herpès simplex, le virus de la vaccine, le poxvirus, les réovirus, les virus de la rougeole, le virus de la forêt de Semliki, etc. Les vecteurs viraux préférés sont basés sur des virus eucaryotes non cytopathiques dans lesquels des gènes non essentiels ont été remplacés par la construction d'acide nucléique portant les séquences d'acide nucléique codant pour les épitopes et les séquences de ciblage d'intérêt.Examples of viral gene therapy systems that are readily adapted for use in the present invention include plasmids, adenoviruses, adeno-associated viruses (AAVs), retroviruses, lentiviruses, herpes simplex viruses, vaccinia virus, poxvirus, reoviruses, measles viruses, Semliki Forest virus, etc. Preferred viral vectors are based on non-cytopathic eukaryotic viruses in which non-essential genes have been replaced by the nucleic acid construct carrying the nucleic acid sequences encoding the epitopes and targeting sequences of interest.
Pour illustrer davantage, les polynucléotides AFFIMER® codés peuvent être délivrés in vivo en utilisant des adénovirus et des virus adéno-associés (AAV), qui sont des virus à ADN double brin qui ont déjà été approuvés pour une utilisation humaine en thérapie génique. Les polypeptides TNFR2 AFFIMER® peuvent être codés et délivrés in vivo en utilisant des vecteurs rétroviraux, tels que des gammarétrovirus ou des lentivirus. Dans certains modes de réalisation, le vecteur viral est pseudotypé avec une enveloppe choisie parmi l'une des enveloppes de virus amphotrope, polytrope, xénotrope, 10A1, GALV, VSV-G, du virus endogène du babouin, RD114, des rhabdovirus, alphavirus, des virus de la rougeole ou de la grippe.To further illustrate, the encoded AFFIMER® polynucleotides may be delivered in vivo using adenoviruses and adeno-associated viruses (AAVs), which are double-stranded DNA viruses that have already been approved for human use in gene therapy. The AFFIMER® TNFR2 polypeptides may be encoded and delivered in vivo using retroviral vectors, such as gammaretroviruses or lentiviruses. In some embodiments, the viral vector is pseudotyped with an envelope selected from one of the envelopes of amphotropic, polytropic, xenotropic, 10A1, GALV, VSV-G, endogenous baboon virus, RD114, rhabdoviruses, alphaviruses, measles or influenza viruses.
Vecteurs non virauxNon-viral vectors
Des exemples d'acides nucléiques ou de polynucléotides pour les agents TNFR2 AFFIMER® codés de la présente divulgation incluent, mais sans s'y limiter, les acides ribonucléiques (ARN), les acides désoxyribonucléiques (ADN), les acides nucléiques à thréose (ANT), les acides nucléiques à glycol (ANG), les acides nucléiques peptidiques (PNA, de l’anglais « peptide nucleic acids »), les acides nucléiques bloqués (LNA, de l’anglais « locked nucleic acids » ; y compris les LNA ayant une configuration β-D-ribo, les a-LNA ayant une configuration a-L-ribo (un diastéréoisomère de LNA), les 2'-amino-LNA ayant une fonctionnalisation 2'-amino, et les 2'-amino-a-LNA ayant une fonctionnalisation 2'-amino), les acides nucléiques d'éthylène (ENA, de l’anglais « ethylene nucleic acids »), les acides nucléiques de cyclohexényle (CeNA, de l’anglais « cyclohexenyl nucleic acids ») ou les hybrides ou combinaisons de ceux-ci. Par conséquent, le polynucléotide TNFR2 AFFIMER® codé peut être délivré par de l'ADN plasmidique, de l'ADN de minicercle, de l'ARNm, des réplicons d'ARN et similaires. Les moyens de délivrance incluent la transfection utilisant l'électroporation, l'utilisation de la lipofection et d'autres réactifs de transfection, la délivrance d'ADN nu, la délivrance de particules d'or et autres moyens connus dans l'art.Examples of nucleic acids or polynucleotides for the encoded TNFR2 AFFIMER® agents of the present disclosure include, but are not limited to, ribonucleic acids (RNA), deoxyribonucleic acids (DNA), threose nucleic acids (TNA), glycol nucleic acids (GNA), peptide nucleic acids (PNA), locked nucleic acids (LNA; including LNA having a β-D-ribo configuration, a-LNA having an a-L-ribo configuration (a diastereomer of LNA), 2'-amino-LNA having a 2'-amino functionalization, and 2'-amino-a-LNA having a 2'-amino functionalization), ethylene nucleic acids (ENA) "), cyclohexenyl nucleic acids (CeNA), or hybrids or combinations thereof. Accordingly, the encoded TNFR2 AFFIMER® polynucleotide may be delivered by plasmid DNA, minicircle DNA, mRNA, RNA replicons, and the like. Means of delivery include transfection using electroporation, use of lipofection and other transfection reagents, delivery of naked DNA, delivery of gold particles, and other means known in the art.
Procédés et systèmes d'expression pour la production de protéinesExpression methods and systems for protein production
Les protéines d'agent TNFR2 AFFIMER® décrites ici peuvent être produites par n'importe quel procédé approprié connu dans l'art. De tels procédés vont des procédés de synthèse directe de protéines à la construction d'une séquence d'ADN codant pour des séquences polypeptidiques et à l'expression de ces séquences dans un hôte approprié. Pour les protéines à agent AFFIMER® recombinantes comprenant d'autres modifications, telles que des modifications chimiques ou une conjugaison, la protéine à agent AFFIMER® recombinante peut être encore manipulée chimiquement ou enzymatiquement après isolement depuis la cellule hôte ou synthèse chimique. Le polypeptide AFFIMER® peut être sécrété ou associé à la membrane de la cellule d'expression, par exemple par ancrage ou fixation (de l’anglais « tethering »), comme par inclusion d'un domaine transmembranaire.The AFFIMER® TNFR2 agent proteins described herein may be produced by any suitable method known in the art. Such methods range from direct protein synthesis methods to constructing a DNA sequence encoding polypeptide sequences and expressing these sequences in a suitable host. For recombinant AFFIMER® agent proteins comprising other modifications, such as chemical modifications or conjugation, the recombinant AFFIMER® agent protein may be further chemically or enzymatically manipulated after isolation from the host cell or chemical synthesis. The AFFIMER® polypeptide may be secreted or associated with the membrane of the expressing cell, for example by tethering, such as by inclusion of a transmembrane domain.
La présente divulgation inclut des procédés recombinants et des acides nucléiques pour exprimer par de manière recombinante les protéines à agent AFFIMER® recombinantes de la présente divulgation comprenant (i) l’introduction dans une cellule hôte d’un polynucléotide codant pour la séquence d'acides aminés dudit agent AFFIMER®, par exemple, où le polynucléotide est dans un vecteur et/ou est lié de manière opérationnelle à un promoteur ; (ii) la culture de la cellule hôte (par ex. eucaryote ou procaryote) dans des conditions favorables à une expression du polynucléotide et, (iii) optionnellement, l’isolation de l'agent AFFIMER® depuis la cellule hôte et/ou le milieu dans lequel la cellule hôte est cultivée. Voir par ex. WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 or WO 2009/068627.The present disclosure includes recombinant methods and nucleic acids for recombinantly expressing the recombinant AFFIMER® agent proteins of the present disclosure comprising (i) introducing into a host cell a polynucleotide encoding the amino acid sequence of said AFFIMER® agent, for example, wherein the polynucleotide is in a vector and/or is operably linked to a promoter; (ii) culturing the host cell (e.g., eukaryotic or prokaryotic) under conditions favorable to expression of the polynucleotide; and (iii) optionally, isolating the AFFIMER® agent from the host cell and/or the medium in which the host cell is cultured. See e.g. WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 or WO 2009/068627.
Dans certains modes de réalisation, une séquence d'ADN codant pour une protéine à agent AFFIMER® recombinante d'intérêt peut être construite par synthèse chimique en utilisant un synthétiseur d'oligonucléotides. Les oligonucléotides peuvent être conçus sur la base de la séquence d'acides aminés du polypeptide souhaité et en sélectionnant les codons qui sont favorisés dans la cellule hôte dans laquelle le polypeptide recombinant d'intérêt sera produit. Des procédés standard peuvent être appliqués pour synthétiser une séquence polynucléotidique codant pour un polypeptide d'intérêt isolé. Par exemple, une séquence complète d'acides aminés peut être utilisée pour construire un gène rétrotraduit. En outre, un oligomère d'ADN contenant une séquence nucléotidique codant pour le polypeptide isolé particulier peut être synthétisé. Par exemple, plusieurs petits oligonucléotides codant pour des parties du polypeptide souhaité peuvent être synthétisés puis ligaturés (en anglais « ligated »). Les oligonucléotides individuels contiennent typiquement des extensions 5' ou 3' pour un assemblage complémentaire.In some embodiments, a DNA sequence encoding a recombinant AFFIMER® agent protein of interest can be constructed by chemical synthesis using an oligonucleotide synthesizer. Oligonucleotides can be designed based on the amino acid sequence of the desired polypeptide and selecting codons that are favored in the host cell in which the recombinant polypeptide of interest will be produced. Standard methods can be applied to synthesize a polynucleotide sequence encoding an isolated polypeptide of interest. For example, a complete amino acid sequence can be used to construct a back-translated gene. Additionally, a DNA oligomer containing a nucleotide sequence encoding the particular isolated polypeptide can be synthesized. For example, several small oligonucleotides encoding portions of the desired polypeptide can be synthesized and then ligated. Individual oligonucleotides typically contain 5' or 3' extensions for complementary assembly.
Une fois qu'une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine à agent AFFIMER® recombinante de la divulgation a été obtenue, le vecteur pour la production de la protéine à agent AFFIMER® recombinante peut être produit par la technologie à ADN recombinant en utilisant des techniques bien connues du métier. Des procédés bien connus de la personne du métier peuvent être utilisés pour construire des vecteurs d'expression contenant les séquences codant pour l'agent AFFIMER® recombinant et des signaux de contrôle transcriptionnels et traductionnels appropriés. Ces procédés incluent, par exemple, des techniques à ADN recombinant in vitro, des techniques de synthèse et une recombinaison génétique in vivo. (Voir, par ex. les techniques décrites dans Sambrook et al, 1990, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al. eds., 1998, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY).Once a nucleic acid sequence encoding a recombinant AFFIMER® agent protein of the disclosure has been obtained, the vector for producing the recombinant AFFIMER® agent protein can be produced by recombinant DNA technology using techniques well known in the art. Methods well known to those skilled in the art can be used to construct expression vectors containing the sequences encoding the recombinant AFFIMER® agent and appropriate transcriptional and translational control signals. Such methods include, for example, in vitro recombinant DNA techniques, synthetic techniques, and in vivo genetic recombination. (See, e.g., techniques described in Sambrook et al, 1990, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al. eds., 1998, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY).
Un vecteur d'expression comprenant la séquence nucléotidique d'une protéine à agent AFFIMER® recombinante peut être transféré à une cellule hôte par des techniques conventionnelles (par ex. électroporation, transfection liposomale, et précipitation au phosphate de calcium) et les cellules transfectées sont ensuite cultivées par des techniques conventionnelles pour produire la protéine à agent AFFIMER® recombinante de la divulgation. Dans des modes de réalisation spécifiques, l'expression de la protéine à agent AFFIMER® recombinante est régulée par un promoteur spécifique d'un tissu, constitutif, ou inductible.An expression vector comprising the nucleotide sequence of a recombinant AFFIMER® agent protein can be transferred to a host cell by conventional techniques (e.g., electroporation, liposomal transfection, and calcium phosphate precipitation) and the transfected cells are then cultured by conventional techniques to produce the recombinant AFFIMER® agent protein of the disclosure. In specific embodiments, expression of the recombinant AFFIMER® agent protein is regulated by a tissue-specific, constitutive, or inducible promoter.
Le vecteur d'expression peut comprendre une origine de réplication, telle qu'elle peut être sélectionnée sur la base du type de cellule hôte utilisée pour l'expression. A titre d'exemple, l'origine de réplication du plasmide pBR322 (Produit n° 303-3s, New England Biolabs, Beverly, Massachussets) est utile pour la plupart des bactéries Gram- négatives tandis que diverses origines provenant de SV40, de polyome, d’adénovirus, du virus de la stomatite vésiculaire (VSV) ou des papillomavirus (tels que HPV ou BPV) sont utiles pour cloner des vecteurs dans des cellules de mammifères. Généralement, le composant origine de réplication n'est pas nécessaire pour les vecteurs d'expression de mammifère (par ex. l'origine du SV40 est souvent utilisée car elle contient le promoteur précoce).The expression vector may include an origin of replication, such as may be selected based on the type of host cell used for expression. For example, the origin of replication of plasmid pBR322 (Product No. 303-3s, New England Biolabs, Beverly, Mass.) is useful for most Gram-negative bacteria while various origins from SV40, polyoma, adenovirus, vesicular stomatitis virus (VSV), or papillomaviruses (such as HPV or BPV) are useful for cloning vectors in mammalian cells. Generally, the origin of replication component is not required for mammalian expression vectors (e.g., the SV40 origin is often used because it contains the early promoter).
Le vecteur peut comprendre au moins un gène marqueur sélectionnable, par ex. des éléments génétiques qui codent pour une protéine nécessaire à la survie et à la croissance d'une cellule hôte cultivée dans un milieu de culture sélectif. Les gènes marqueurs de sélection typiques codent pour des protéines qui (a) confèrent une résistance aux antibiotiques ou à d'autres toxines, par ex. l'ampicilline, la tétracycline ou la kanamycine pour les cellules hôtes procaryotes, (b) complètent les déficiences auxotrophes de la cellule ; ou (c) fournissent des éléments nutritifs critiques non disponibles en provenance de milieux complexes. Les marqueurs sélectionnables préférés sont le gène de résistance à la kanamycine, le gène de résistance à l'ampicilline et le gène de résistance à la tétracycline. Un gène de résistance à la néomycine peut également être utilisé pour la sélection dans des cellules hôtes procaryotes et eucaryotes. D'autres gènes de sélection peuvent être utilisés pour amplifier le gène qui sera exprimé. L'amplification est un processus où des gènes qui sont plus sollicités pour la production d'une protéine critique pour la croissance sont réitérés en tandem au sein des chromosomes de générations successives de cellules recombinantes. Des exemples de marqueurs sélectionnables pour des cellules de mammifères comprennent la dihydrofolate réductase (DHFR) et la thymidine kinase. Les transformants de cellules de mammifères sont placés sous une pression de sélection où seuls les transformants sont uniquement adaptés pour survivre en vertu du marqueur présent dans le vecteur. La pression de sélection est imposée en cultivant les cellules transformées dans des conditions dans lesquelles la concentration en agent de sélection dans le milieu est modifiée successivement, conduisant ainsi à une amplification à la fois du gène de sélection et de l'ADN qui code pour la protéine à agent AFFIMER® recombinante. En conséquence, des quantités accrues de la protéine à agent AFFIMER® recombinante sont synthétisées à partir de l'ADN amplifié.The vector may comprise at least one selectable marker gene, e.g., genetic elements that encode a protein required for the survival and growth of a host cell cultured in a selective culture medium. Typical selectable marker genes encode proteins that (a) confer resistance to antibiotics or other toxins, e.g., ampicillin, tetracycline, or kanamycin for prokaryotic host cells, (b) complement auxotrophic deficiencies of the cell; or (c) provide critical nutrients not available from complex media. Preferred selectable markers are the kanamycin resistance gene, the ampicillin resistance gene, and the tetracycline resistance gene. A neomycin resistance gene may also be used for selection in prokaryotic and eukaryotic host cells. Other selectable genes may be used to amplify the gene to be expressed. Amplification is a process where genes that are in greater demand for the production of a protein critical for growth are reiterated in tandem within the chromosomes of successive generations of recombinant cells. Examples of selectable markers for mammalian cells include dihydrofolate reductase (DHFR) and thymidine kinase. Transformants of mammalian cells are placed under a selection pressure where only transformants are uniquely adapted to survive by virtue of the marker present in the vector. The selection pressure is imposed by culturing the transformed cells under conditions in which the concentration of the selection agent in the medium is successively varied, thereby leading to amplification of both the selection gene and the DNA that encodes the recombinant AFFIMER®-containing protein. As a result, increased amounts of the recombinant AFFIMER®-containing protein are synthesized from the amplified DNA.
Le vecteur peut également comprendre au moins un site de liaison au ribosome, qui sera transcrit dans l'ARNm comprenant la séquence codante pour la protéine à agent AFFIMER® recombinante. Par exemple, un tel site est caractérisé par une séquence Shine-Dalgarno (procaryotes) ou une séquence Kozak (eucaryotes). L'élément est typiquement situé en 3' du promoteur et en 5' de la séquence codante du polypeptide à exprimer. La séquence Shine-Dalgarno est variée mais est typiquement une polypurine (ayant une forte teneur en A-G). De nombreuses séquences de Shine-Dalgarno ont été identifiées, chacune d’entre elles pouvant être facilement synthétisée en utilisant les procédés exposés ci-dessus et utilisées dans un vecteur procaryote.The vector may also include at least one ribosome binding site, which will be transcribed into the mRNA comprising the coding sequence for the recombinant AFFIMER® agent protein. For example, such a site is characterized by a Shine-Dalgarno sequence (prokaryotes) or a Kozak sequence (eukaryotes). The element is typically located 3' to the promoter and 5' to the coding sequence of the polypeptide to be expressed. The Shine-Dalgarno sequence is varied but is typically a polypurine (having a high A-G content). Many Shine-Dalgarno sequences have been identified, each of which can be readily synthesized using the methods set forth above and used in a prokaryotic vector.
Les vecteurs d'expression contiendront typiquement un promoteur qui est reconnu par l'organisme hôte et lié de manière opérationnelle à une molécule d'acide nucléique codant pour la protéine à agent AFFIMER® recombinante. Un promoteur natif ou hétérologue peut être utilisé en fonction de la cellule hôte utilisée pour l'expression et le rendement souhaité.Expression vectors will typically contain a promoter that is recognized by the host organism and operably linked to a nucleic acid molecule encoding the recombinant AFFIMER® agent protein. A native or heterologous promoter may be used depending on the host cell used for expression and the desired yield.
Les promoteurs à utiliser avec des hôtes procaryotes incluent les systèmes promoteurs de la bêta-lactamase et du lactose ; la phosphatase alcaline, un système promoteur du tryptophane (trp) ; et des promoteurs hybrides tels que le promoteur tac. D'autres promoteurs bactériens connus conviennent également. Leurs séquences ont été publiées, et ils peuvent être ligaturés à une ou plus séquences d'acide nucléique souhaitées, en utilisant des lieurs ou des adaptateurs comme souhaité pour fournir des sites de restriction.Promoters for use with prokaryotic hosts include the beta-lactamase and lactose promoter systems; the alkaline phosphatase, tryptophan (trp) promoter system; and hybrid promoters such as the tac promoter. Other known bacterial promoters are also suitable. Their sequences have been published, and they can be ligated to one or more desired nucleic acid sequences, using linkers or adaptors as desired to provide restriction sites.
Les promoteurs à utiliser avec des levures hôtes sont également connus dans l'art. Les amplificateurs de levure sont avantageusement utilisés avec des promoteurs de levure. Les promoteurs appropriés pour une utilisation avec des cellules hôtes de mammifères sont bien connus et comprennent ceux obtenus à partir des génomes de virus tels que le virus du polyome, le virus de la variole aviaire, l'adénovirus (tel que l'adénovirus 2), le virus du papillome bovin, le virus du sarcome aviaire, le cytomégalovirus, un rétrovirus, le virus de l'hépatite-B et le plus préférablement le Virus Simien 40 (SV40, de l’anglais « Simian Virus 40 »). D'autres promoteurs appropriés de mammifères incluent des promoteurs de mammifères hétérologues, par ex. des promoteurs de choc thermique et le promoteur de l'actine.Promoters for use with yeast hosts are also known in the art. Yeast enhancers are advantageously used with yeast promoters. Promoters suitable for use with mammalian host cells are well known and include those obtained from the genomes of viruses such as polyoma virus, fowlpox virus, adenovirus (such as adenovirus 2), bovine papilloma virus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, a retrovirus, hepatitis B virus and most preferably Simian Virus 40 (SV40). Other suitable mammalian promoters include heterologous mammalian promoters, e.g., heat shock promoters and the actin promoter.
Des promoteurs supplémentaires qui peuvent être utilisés pour exprimer les agents de liaison sélectifs de la divulgation comprennent, mais ne sont pas limités à : la région du promoteur précoce du SV40 (Bernoist et Chambon, Nature, 290 : 304-310, 1981) ; le promoteur CMV ; le promoteur contenu dans la répétition terminale longue 3' du virus du sarcome de Rous (Yamamoto et al. (1980), Cell 22: 787-97) ; le promoteur de la thymidine kinase de l’herpès (Wagner et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1444-5) ; les séquences régulatrices du gène de la métallothionine (Brinster et al, Nature, 296 ; 39-42, 1982) ; les vecteurs d'expression procaryotes tels que le promoteur de bêta-lactamase (Villa-Kamaroff, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75; 3727-3731, 1978) ; ou le promoteur tac (DeBoer, et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 21-5). Sont également intéressantes les régions de contrôle transcriptionnel animales suivantes, qui démontrent une spécificité tissulaire et ont été utilisées chez des animaux transgéniques : la région de contrôle du gène de l'élastase I qui est active dans les cellules acineuses pancréatiques (Swift et al. (1984), Cell 38: 639-46 ; Ornitz et al. (1986), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald (1987), Hepatology 7: 425-515) ; la région de contrôle du gène de l'insuline qui est active dans les cellules bêta pancréatiques (Hanahan (1985), Nature 315: 115-22) ; la région de contrôle du gène de l'immunoglobuline qui est active dans les cellules lymphoïdes (Grosschedl et al. (1984), Cell 38 ; 647-58 ; Adames et al. (1985), Nature 318 ; 533-8 ; Alexander et al. (1987), Mol. Cell. Biol. 7: 1436-44) ; la région de contrôle du virus de la tumeur mammaire de la souris qui est active dans les cellules testiculaires, mammaires, lymphoïdes et mastocytaires (Leder et al. (1986), Cell 45: 485-95) ; la région de contrôle du gène de l'albumine qui est active dans le foie (Pinkert et al. (1987), Genes and Devel. 1: 268-76) ; la région de contrôle du gène de l’alpha-foetoprotéine qui est active dans le foie (Krumlauf et al. (1985), MoI. Cell. Biol. 5: 1639-48 ; Hammer et al. (1987), Science, 235: 53-8) ; la région de contrôle du gène de l’alpha 1-antitrypsine qui est active dans le foie (Kelsey et al. (1987), Genes and Devel. 1: 161-71) ; la région de contrôle du gène de la bêta-globine qui est active dans les cellules myéloïdes (Mogram et al., Nature, 315 338-340, 1985 ; Kollias et al. (1986), Cell 46: 89-94) ; la région de contrôle du gène de la protéine basique de la myéline qui est active dans les cellules oligodendrocytes du cerveau (Readhead et al. (1987), Cell, 48: 703-12) ; la région de contrôle du gène de la myosin chaîne légère-2 qui est active dans les muscles squelettiques (Sani (1985), Nature, 314 : 283-6) ; et la région de contrôle du gène de l'hormone de libération gonadotrope qui est active dans l'hypothalamus (Mason et al. (1986), Science 234: 1372-8).Additional promoters that may be used to express the selective linkers of the disclosure include, but are not limited to: the SV40 early promoter region (Bernoist and Chambon, Nature, 290:304-310, 1981); the CMV promoter; the promoter contained in the 3' long terminal repeat of Rous sarcoma virus (Yamamoto et al. (1980), Cell 22:787-97); the herpes thymidine kinase promoter (Wagner et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-5); the regulatory sequences of the metallothionein gene (Brinster et al., Nature, 296;39-42, 1982); prokaryotic expression vectors such as the beta-lactamase promoter (Villa-Kamaroff, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75; 3727-3731, 1978); or the tac promoter (DeBoer, et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 21-5). Also of interest are the following animal transcriptional control regions, which demonstrate tissue specificity and have been used in transgenic animals: the control region of the elastase I gene which is active in pancreatic acinar cells (Swift et al. (1984), Cell 38: 639-46; Ornitz et al. (1986), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald (1987), Hepatology 7: 425-515); the control region of the insulin gene which is active in pancreatic beta cells (Hanahan (1985), Nature 315: 115-22); the immunoglobulin gene control region which is active in lymphoid cells (Grosschedl et al. (1984), Cell 38; 647-58; Adames et al. (1985), Nature 318; 533-8; Alexander et al. (1987), Mol. Cell. Biol. 7: 1436-44); the mouse mammary tumor virus control region which is active in testicular, mammary, lymphoid, and mast cells (Leder et al. (1986), Cell 45: 485-95); the albumin gene control region which is active in the liver (Pinkert et al. (1987), Genes and Devel. 1: 268-76); the control region of the alpha-fetoprotein gene which is active in the liver (Krumlauf et al. (1985), MoI. Cell. Biol. 5: 1639-48; Hammer et al. (1987), Science, 235: 53-8); the control region of the alpha 1-antitrypsin gene which is active in the liver (Kelsey et al. (1987), Genes and Devel. 1: 161-71); the control region of the beta-globin gene which is active in myeloid cells (Mogram et al., Nature, 315 338-340, 1985; Kollias et al. (1986), Cell 46: 89-94); the myelin basic protein gene control region which is active in oligodendrocyte cells of the brain (Readhead et al. (1987), Cell, 48: 703-12); the myosin light chain-2 gene control region which is active in skeletal muscle (Sani (1985), Nature, 314: 283-6); and the gonadotropin-releasing hormone gene control region which is active in the hypothalamus (Mason et al. (1986), Science 234: 1372-8).
Une séquence amplificatrice (en anglais « enhancer sequence ») peut être insérée dans le vecteur pour augmenter la transcription dans les cellules hôtes eucaryotes. Plusieurs séquences amplificatrices disponibles à partir de gènes de mammifères sont connues (par ex. la globine, l'élastase, l'albumine, l'alpha-foeto-protéine et l'insuline). Typiquement, cependant, un amplificateur issu d'un virus sera utilisé. L'amplificateur SV40, l'amplificateur du promoteur précoce du cytomégalovirus, l'amplificateur du polyome et les amplificateurs de l'adénovirus sont des exemples d'éléments amplificateurs pour l'activation des promoteurs eucaryotes.An enhancer sequence can be inserted into the vector to increase transcription in eukaryotic host cells. Several enhancer sequences are known to be available from mammalian genes (e.g., globin, elastase, albumin, alpha-fetoprotein, and insulin). Typically, however, an enhancer from a virus will be used. Examples of enhancer elements for activation of eukaryotic promoters are the SV40 enhancer, the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer, and the adenovirus enhancers.
Alors qu'un amplificateur peut être épissé dans le vecteur en une position 5' ou 3' par rapport à la région codant pour le polypeptide, il est typiquement situé en un site 5' du promoteur.While an enhancer may be spliced into the vector at a position 5' or 3' relative to the polypeptide coding region, it is typically located at a site 5' of the promoter.
Les vecteurs pour exprimer les acides nucléiques incluent ceux qui sont compatibles avec les cellules hôtes bactériennes, d'insectes et de mammifères. Ces vecteurs incluent, entre autres, pCRII, pCR3 et pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, Californie), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, Californie), pET15 (Novagen, Madison, Wisconsin), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Californie), pETL (BlueBacII ; Invitrogen), pDSR-alpha (Publication PCT n° WO90/14363) et pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, New York).Vectors for expressing nucleic acids include those that are compatible with bacterial, insect, and mammalian host cells. These vectors include, but are not limited to, pCRII, pCR3, and pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, Calif.), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, Calif.), pET15 (Novagen, Madison, Wis.), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Calif.), pETL (BlueBacII; Invitrogen), pDSR-alpha (PCT Publication No. WO90/14363), and pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, N.Y.).
Des vecteurs supplémentaires possibles incluent, mais sans s'y limiter, les virus modifiés, cosmides, ou plasmides, mais le système de vecteur doit être compatible avec la cellule hôte sélectionnée. De tels vecteurs incluent, mais sans s'y limiter, des plasmides tels que des dérivés de plasmide Bluescript® (un phagémide à base de ColEl à nombre de copies élevé, de Stratagene Cloning Systems Inc., La Jolla, Californie), des plasmides de clonage PCR conçus pour cloner des produits PCR amplifiés par Taq (par ex. TOPO™, TA Cloning® Kit, dérivés de plasmide PCR2.1, Invitrogen, Carlsbad, Californie), et des vecteurs de mammifère, de levure ou de virus tels qu'un système d'expression de baculovirus (dérivés de plasmide pBacPAK, Clontech, Palo Alto, Californie). Les molécules recombinantes peuvent être introduites dans des cellules hôtes par transformation, transfection, infection, électroporation, ou autres techniques connues.Additional possible vectors include, but are not limited to, engineered viruses, cosmids, or plasmids, but the vector system must be compatible with the selected host cell. Such vectors include, but are not limited to, plasmids such as Bluescript® plasmid derivatives (a high copy number ColEl-based phagemid, from Stratagene Cloning Systems Inc., La Jolla, Calif.), PCR cloning plasmids designed to clone Taq-amplified PCR products (e.g., TOPO™, TA Cloning® Kit, PCR2.1 plasmid derivatives, Invitrogen, Carlsbad, Calif.), and mammalian, yeast, or viral vectors such as a baculovirus expression system (pBacPAK plasmid derivatives, Clontech, Palo Alto, Calif.). Recombinant molecules may be introduced into host cells by transformation, transfection, infection, electroporation, or other known techniques.
Les cellules hôtes eucaryotes et procaryotes, y compris les cellules de mammifères comme hôtes pour l'expression de la protéine à agent AFFIMER® recombinante décrite ici sont bien connues dans l'art et incluent de nombreuses lignées cellulaires immortalisées disponibles auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC, de l’anglais, soit « Collection de Cultures de Types Américaine »). Celles-ci incluent, entre autres, les cellules ovariennes de hamster chinois (CHO, de l’anglais « Chinese hamster ovary cells »), les NSO, les cellules SP2, les cellules HeLa, les cellules rénales de bébé hamster (BHK, de l’anglais « baby hamster kidney cells »), les cellules rénales de singe (COS), les cellules de carcinome hépatocellulaire humain (par ex. Hep G2), les cellules A549, les cellules 3T3, les cellules HEK-293 et un certain nombre d'autres lignées cellulaires. Les cellules hôtes de mammifères incluent les cellules humaines, de souris, de rat, de chien, de singe, de porc, de chèvre, de bovin, de cheval et de hamster. Les lignées cellulaires de préférence particulière sont sélectionnées en déterminant quelles lignées cellulaires ont des niveaux d'expression élevés. D'autres lignées cellulaires qui peuvent être utilisées sont des lignées cellulaires d'insectes, telles que les cellules Sf9, des cellules d'amphibiens, des cellules bactériennes, des cellules végétales et des cellules fongiques. Les cellules fongiques incluent les cellules de levures et de champignons filamenteux comprenant, par exemple, cellules de Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Physcomitrella patens and Neurospora crassa., Pichia sp., tout Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, tout Kluyveromyces sp., Candida albicans, any Aspergillus sp., Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, tout Fusarium sp., Yarrowia lipolytica, et Neurospora crassa.Eukaryotic and prokaryotic host cells, including mammalian cells as hosts for expression of the recombinant AFFIMER® agent protein described herein are well known in the art and include numerous immortalized cell lines available from the American Type Culture Collection (ATCC). These include, among others, Chinese hamster ovary (CHO) cells, NSO, SP2 cells, HeLa cells, baby hamster kidney (BHK) cells, monkey kidney (COS) cells, human hepatocellular carcinoma (e.g., Hep G2) cells, A549 cells, 3T3 cells, HEK-293 cells, and a number of other cell lines. Mammalian host cells include human, mouse, rat, dog, monkey, pig, goat, bovine, horse, and hamster cells. Particularly preferred cell lines are selected by determining which cell lines have high expression levels. Other cell lines that can be used are insect cell lines, such as Sf9 cells, amphibian cells, bacterial cells, plant cells, and fungal cells. Fungal cells include cells of yeasts and filamentous fungi including, for example, cells of Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Physcomitrella patens and Neurospora crassa., Pichia sp., any Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, any Kluyveromyces sp., Candida albicans, any Aspergillus sp., Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, any Fusarium sp., Yarrowia lipolytica, and Neurospora crassa.
Une variété de systèmes de vecteurs d'expression hôte peut être utilisée pour exprimer la protéine à agent AFFIMER® recombinante de la divulgation. De tels systèmes d'expression hôte représentent des véhicules par lesquels les séquences codantes de la protéine à agent AFFIMER® recombinante peuvent être produites puis purifiées, mais représentent également des cellules qui peuvent, lorsqu'elles sont transformées ou transfectées avec les séquences codantes nucléotidiques appropriées, exprimer la protéine à agent AFFIMER® recombinante de la divulgation in situ. Ceux-ci incluent, mais sans s'y limiter, des micro-organismes tels que des bactéries (par ex. E. coli et B. subtilis) transformées avec des vecteurs d'expression d'ADN de bactériophage, d'ADN plasmidique ou d'ADN cosmidique recombinant contenant des séquences codant pour la protéine à agent AFFIMER® ; de la levure (par ex. Saccharomyces pichia) transformée avec des vecteurs d'expression de levure recombinants contenant des séquences codant pour la protéine à agent AFFIMER® ; des systèmes de cellules d'insectes infectés avec des vecteurs d'expression de virus recombinants (par ex. baculovirus) contenant les séquences codant pour la protéine à agent AFFIMER® ; des systèmes cellulaires végétaux infectés par des vecteurs d'expression de virus recombinants (par ex. le virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV, de l’anglais « cauliflower mosaic virus ») et le virus de la mosaïque du tabac (TMV, de l’anglais « tobacco mosaic virus »)) ou transformés avec des vecteurs d'expression de plasmide recombinants (par ex. le plasmide Ti) contenant des séquences codant pour la protéine à agent AFFIMER® ; ou des systèmes cellulaires de mammifères (par ex. des cellules COS, CHO, BHK, 293, 293T, 3T3, des cellules lymphatiques (voir Brevet US n° 5,807,715), des cellules Per C.6 (cellules rétiniennes de rat développées par Crucell)) hébergeant des constructions d'expression recombinantes contenant des promoteurs dérivés du génome de cellules de mammifères (par ex. le promoteur de la métallothionéine) ou de virus de mammifères (par ex. le promoteur tardif de l'adénovirus ; le promoteur 7.5K du virus de la vaccine).A variety of host expression vector systems may be used to express the recombinant AFFIMER® agent protein of the disclosure. Such host expression systems represent vehicles by which the recombinant AFFIMER® agent protein coding sequences can be produced and then purified, but also represent cells that can, when transformed or transfected with the appropriate nucleotide coding sequences, express the recombinant AFFIMER® agent protein of the disclosure in situ. These include, but are not limited to, microorganisms such as bacteria (e.g., E. coli and B. subtilis) transformed with recombinant bacteriophage DNA, plasmid DNA, or cosmid DNA expression vectors containing AFFIMER® agent protein coding sequences; yeast (e.g., Saccharomyces pichia) transformed with recombinant yeast expression vectors containing AFFIMER® agent protein coding sequences; insect cell systems infected with recombinant virus expression vectors (e.g. baculovirus) containing AFFIMER® agent protein coding sequences; plant cell systems infected with recombinant virus expression vectors (e.g. cauliflower mosaic virus (CaMV) and tobacco mosaic virus (TMV)) or transformed with recombinant plasmid expression vectors (e.g. Ti plasmid) containing AFFIMER® agent protein coding sequences; or mammalian cell systems (e.g., COS, CHO, BHK, 293, 293T, 3T3 cells, lymphatic cells (see U.S. Patent No. 5,807,715), Per C.6 cells (rat retinal cells developed by Crucell)) harboring recombinant expression constructs containing promoters derived from the genome of mammalian cells (e.g., the metallothionein promoter) or mammalian viruses (e.g., the adenovirus late promoter; the vaccinia virus 7.5K promoter).
Dans les systèmes bactériens, un certain nombre de vecteurs d'expression peuvent être avantageusement sélectionnés en fonction de l'utilisation prévue pour la protéine à agent AFFIMER® recombinante exprimée. Par exemple, lorsqu'une grande quantité d'une telle protéine doit être produite, pour la génération de compositions pharmaceutiques de la protéine à agent AFFIMER® recombinante, des vecteurs qui dirigent l'expression de niveaux élevés de produits à protéines de fusion qui sont immédiatement purifiés peuvent être souhaitables. De tels vecteurs incluent, mais sans s'y limiter, le vecteur d'expression de E. coli pUR278 (Ruther et al. (1983) "Easy Identification Of cDNA Clones," EMBO J. 2:1791-1794), dans lequel la séquence codante de la protéine à agent AFFIMER® peut être ligaturée individuellement dans le vecteur en cadre avec la région codante lac Z de sorte qu'une protéine de fusion est produite ; vecteurs pIN (Inouye et al. (1985) "Up-Promoter Mutations In The Lpp Gene Of Escherichia coli," Nucleic Acids Res. 13:3101-3110 ; Van Heeke et al. (1989) "Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia coli," J. Biol. Chem. 24:5503-5509); etc. Les vecteurs pGEX peuvent également être utilisés pour exprimer des polypeptides étrangers en tant que protéines de fusion avec la glutathion S-transférase (GST). En général, ces protéines de fusion sont solubles et peuvent aisément être purifiées à partir de cellules lysées par adsorption et liaison à une matrice de billes de glutathion-agarose suivie d'une élution en présence de glutathion libre. Les vecteurs pGEX sont conçus pour inclure des sites de clivage de la protéase du facteur Xa ou de la thrombine afin que le produit du gène cible cloné puisse être libéré du groupement GST.In bacterial systems, a number of expression vectors may be advantageously selected depending on the intended use for the expressed recombinant AFFIMER® agent protein. For example, where a large quantity of such protein is to be produced, for the generation of pharmaceutical compositions of the recombinant AFFIMER® agent protein, vectors that direct the expression of high levels of fusion protein products that are readily purified may be desirable. Such vectors include, but are not limited to, the E. coli expression vector pUR278 (Ruther et al. (1983) "Easy Identification Of cDNA Clones," EMBO J. 2:1791-1794), wherein the coding sequence of the AFFIMER® agent protein may be individually ligated into the vector in frame with the lac Z coding region such that a fusion protein is produced; pIN vectors (Inouye et al. (1985) "Up-Promoter Mutations In The Lpp Gene Of Escherichia coli," Nucleic Acids Res. 13:3101-3110; Van Heeke et al. (1989) "Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia coli," J. Biol. Chem. 24:5503-5509); etc. pGEX vectors can also be used to express foreign polypeptides as fusion proteins with glutathione S-transferase (GST). In general, these fusion proteins are soluble and can be readily purified from lysed cells by adsorption and binding to a glutathione-agarose bead matrix followed by elution in the presence of free glutathione. pGEX vectors are designed to include factor Xa protease or thrombin cleavage sites so that the cloned target gene product can be released from the GST moiety.
Dans un système d'insecte, le virus de la polyédrose nucléaire d'Autographa californica (AcNPV, de l’anglais « Autographa californica nuclear polyhedrosis virus ») est utilisé comme vecteur pour exprimer des gènes étrangers. Le virus se développe dans les cellules de Spodoptera frugiperda. La séquence codante de la protéine à agent AFFIMER® peut être clonée individuellement dans des régions non essentielles (par ex. le gène de la polyédrine) du virus et placée sous le contrôle d'un promoteur d’AcNPV (par ex. le promoteur de la polyédrine).In an insect system, Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) is used as a vector to express foreign genes. The virus grows in Spodoptera frugiperda cells. The coding sequence of the AFFIMER® agent protein can be cloned individually into non-essential regions (e.g., the polyhedrin gene) of the virus and placed under the control of an AcNPV promoter (e.g., the polyhedrin promoter).
Dans les cellules hôtes de mammifères, un certain nombre de systèmes d'expression à base virale peut être utilisé. Dans les cas où un adénovirus est utilisé en tant que vecteur d'expression, la séquence d'intérêt codant pour la protéine à agent AFFIMER® peut être ligaturée à un complexe de contrôle de transcription/traduction d'adénovirus, par ex. le promoteur tardif et la séquence de tête tripartite (de l’anglais « tripartite leader sequence »). Ce gène chimère peut ensuite être inséré dans le génome de l'adénovirus par recombinaison in vitro ou in vivo. L'insertion dans une région non essentielle du génome viral (par ex. la région E1 ou E3) résultera en un virus recombinant qui est viable et capable d'exprimer la molécule d'immunoglobuline chez des hôtes infectés. (Voir par ex. Logan et al. (1984) "Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 81:3655-3659). Des signaux d'initiation spécifiques peuvent également être requis pour une traduction efficace des séquences insérées codant pour la protéine à agent AFFIMER®. Ces signaux comprennent le codon d'initiation ATG et les séquences adjacentes. De plus, le codon d'initiation doit être en phase avec le cadre de lecture de la séquence codante souhaitée pour assurer la traduction de l'insert entier. Ces signaux exogènes de contrôle de traduction et ces codons d'initiation peuvent avoir diverses origines, à la fois naturelles et synthétiques. L'efficacité de l'expression peut être amplifiée par l'inclusion d'éléments amplificateurs de transcription appropriés, de terminateurs de transcription, etc. (Voir Bitter et al. (1987) "Expression and Secretion Vectors For Yeast," Methods in Enzymol. 153:516-544).In mammalian host cells, a number of viral-based expression systems can be used. In cases where an adenovirus is used as the expression vector, the sequence of interest encoding the AFFIMER® agent protein can be ligated to an adenovirus transcription/translation control complex, e.g. the late promoter and tripartite leader sequence. This chimeric gene can then be inserted into the adenovirus genome by in vitro or in vivo recombination. Insertion into a non-essential region of the viral genome (e.g. the E1 or E3 region) will result in a recombinant virus that is viable and capable of expressing the immunoglobulin molecule in infected hosts. (See e.g. Logan et al. (1984) "Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 81:3655-3659). Specific initiation signals may also be required for efficient translation of the inserted sequences encoding the AFFIMER® agent protein. These signals include the ATG initiation codon and flanking sequences. In addition, the initiation codon must be in frame with the desired coding sequence to ensure translation of the entire insert. These exogenous translation control signals and initiation codons may have a variety of origins, both natural and synthetic. Efficiency of expression may be enhanced by the inclusion of appropriate transcription enhancer elements, transcription terminators, etc. (See Bitter et al. (1987) "Expression and Secretion Vectors For Yeast," Methods in Enzymol. 153:516-544).
De plus, une souche de cellule hôte peut être choisie, laquelle module l'expression des séquences insérées ou modifie et transforme le produit génique de la manière spécifique souhaitée. De telles modifications (par ex. une glycosylation) et traitements (par ex. clivage) de produits protéiques peuvent être importants pour la fonction de la protéine. Différentes cellules hôtes ont des mécanismes caractéristiques et spécifiques pour le traitement post-traductionnel et la modification de protéines et de produits géniques. Des lignées cellulaires ou des systèmes hôtes appropriés peuvent être choisis pour assurer la modification et le traitement corrects de la protéine étrangère exprimée. A cette fin, des cellules hôtes eucaryotes qui possèdent la machinerie cellulaire pour le bon traitement de la transcription primaire, la glycosylation et la phosphorylation du produit génique peuvent être utilisées. De telles cellules hôtes de mammifères incluent, mais sans s'y limiter, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 et T47D, CRL7030 et Hs578Bst.In addition, a host cell strain may be selected which modulates the expression of the inserted sequences or modifies and processes the gene product in the specific desired manner. Such modifications (e.g. glycosylation) and processing (e.g. cleavage) of protein products may be important for the function of the protein. Different host cells have characteristic and specific mechanisms for post-translational processing and modification of proteins and gene products. Appropriate cell lines or host systems may be selected to ensure the correct modification and processing of the expressed foreign protein. For this purpose, eukaryotic host cells which possess the cellular machinery for the correct processing of primary transcription, glycosylation and phosphorylation of the gene product may be used. Such mammalian host cells include, but are not limited to, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 and T47D, CRL7030 and Hs578Bst.
Pour une production à long terme et à haut rendement de protéines recombinantes, une expression stable est envisagée. Par exemple, des lignées cellulaires qui expriment de manière stable un anticorps de la divulgation peuvent être modifiées par ingénierie. Plutôt que d'utiliser des vecteurs d'expression qui contiennent des origines virales de réplication, les cellules hôtes peuvent être transformées avec de l'ADN contrôlé par des éléments de contrôle d'expression appropriés (par ex. promoteur, amplificateur, séquences, terminateurs de transcription, sites de polyadénylation, etc.) et un marqueur sélectionnable. A la suite de l'introduction de l'ADN étranger, les cellules d’ingénierie peuvent être laissées se développer pendant 1 à 2 jours dans un milieu enrichi, puis sont basculées vers un milieu sélectif. Le marqueur sélectionnable dans le plasmide recombinant confère une résistance à la sélection et permet aux cellules d'intégrer de manière stable le plasmide dans leurs chromosomes et de se développer pour former des foyers qui à leur tour peuvent être clonés et développés dans des lignées cellulaires. Ce procédé peut avantageusement être utilisé pour concevoir des lignées cellulaires qui expriment les protéines à agent AFFIMER® recombinantes de la divulgation. De telles lignées cellulaires d’ingénierie peuvent être particulièrement utiles dans le criblage et l'évaluation de composés qui interagissent directement ou indirectement avec les protéines à agent AFFIMER® recombinantes.For long-term, high-yield production of recombinant proteins, stable expression is contemplated. For example, cell lines that stably express an antibody of the disclosure can be engineered. Rather than using expression vectors that contain viral origins of replication, host cells can be transformed with DNA controlled by appropriate expression control elements (e.g., promoter, enhancer, sequences, transcription terminators, polyadenylation sites, etc.) and a selectable marker. Following introduction of the foreign DNA, the engineered cells can be allowed to grow for 1 to 2 days in enriched medium and then switched to selective medium. The selectable marker in the recombinant plasmid confers resistance to selection and allows the cells to stably integrate the plasmid into their chromosomes and grow to form foci that can in turn be cloned and expanded into cell lines. This method can advantageously be used to engineer cell lines that express the recombinant AFFIMER® agent proteins of the disclosure. Such engineered cell lines can be particularly useful in screening and evaluating compounds that interact directly or indirectly with the recombinant AFFIMER® agent proteins.
Un certain nombre de systèmes de sélection peut être utilisé, y compris, mais sans s'y limiter, la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex (Wigler et al. (1977) "Transfer of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene to Cultured Mouse Cells," Cell 11:223-232), l’hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransférase (Szybalska et al. (1962) "Genetics Of Human Cess Line. IV. DNA-Mediated Heritable Transformation of a Biochemical Trait," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 48:2026-2034), et l'adénine phosphoribosyltransférase (Lowy et al. (1980) "Isolation Of Transforming DNA: Cloning The Hamster Aprt Gene," Cell 22:817-823) dont les gènes peuvent être employés dans des cellules tk-, hgprt- ou aprt-, respectivement. Aussi, une résistance aux antimétabolites peut être utilisée comme base de sélection pour les gènes suivants : dhfr, qui confère une résistance au méthotrexate (Wigler et al. (1980) "Transformation Of Mammalian Cells With An Amplfiable Dominant-Acting Gene," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 77:3567-3570 ; O'Hare et al. (1981) "Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78:1527-1531) ; gpt, qui confère une résistance à l'acide mycophénolique (Mulligan et al. (1981) "Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78:2072-2076) ; neo, qui confère une résistance à l'aminoglycoside G-418 (Tachibana et al. (1991) "Altered Reactivity Of Immunoglobutin Produced By Human-Human Hybridoma Cells Transfected By pSV.2-Neo Gene," Cytotechnology 6(3):219-226; Tolstoshev (1993) "Gene Therapy, Concepts, Current Trials And Future Directions," Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) "The Basic Science of Gene Therapy," Science 260:926-932; and Morgan et al. (1993) "Human gene therapy," Ann. Rev. Biochem. 62:191-217). Des procédés couramment connus dans l'art de la technologie à ADN recombinant qui peuvent être utilisés sont décrits dans Ausubel et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY ; et aux chapitres 12 et 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, CURRENT PROTOCOLS IN HUMAN GENETICS, John Wiley & Sons, NY.; Colbere-Garapin et al. (1981) "A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells," J. Mol. Biol. 150:1-14 ; et hygro, qui confère une résistance à l'hygromycine (Santerre et al. (1984) "Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells," Gene 30:147-156).A number of selection systems can be used, including, but not limited to, herpes simplex virus thymidine kinase (Wigler et al. (1977) "Transfer of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene to Cultured Mouse Cells," Cell 11:223-232), hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (Szybalska et al. (1962) "Genetics Of Human Cess Line. IV. DNA-Mediated Heritable Transformation of a Biochemical Trait," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 48:2026-2034), and adenine phosphoribosyltransferase (Lowy et al. (1980) "Isolation Of Transforming DNA: Cloning The Hamster Aprt Gene," Cell 22:817-823) whose genes can be employed in cells tk-, hgprt- or aprt-, respectively. Also, resistance to antimetabolites can be used as a basis for selection for the following genes: dhfr, which confers resistance to methotrexate (Wigler et al. (1980) "Transformation Of Mammalian Cells With An Amplfiable Dominant-Acting Gene," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 77:3567-3570; O'Hare et al. (1981) "Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78:1527-1531); gpt, which confers resistance to mycophenolic acid (Mulligan et al. (1981) "Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78:2072-2076); neo, which confers resistance to the aminoglycoside G-418 (Tachibana et al. (1991) "Altered Reactivity Of Immunoglobutin Produced By Human-Human Hybridoma Cells Transfected By pSV.2-Neo Gene," Cytotechnology 6(3):219-226; Tolstoshev (1993) "Gene Therapy, Concepts, Current Trials And Future Directions," Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) "The Basic Science of Gene Therapy," Science 260:926-932; and Morgan et al. (1993) "Human gene therapy," Ann. Rev. Biochem. 62:191-217). Methods commonly known in the art of recombinant DNA technology that can be used are described in Ausubel et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY; and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, CURRENT PROTOCOLS IN HUMAN GENETICS, John Wiley & Sons, NY.; Colbere-Garapin et al. (1981) “A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells,” J. Mol. Biol. 150:1-14; and hygro, which confers resistance to hygromycin (Santerre et al. (1984) "Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells," Gene 30:147-156).
Les niveaux d'expression d'une protéine à agent AFFIMER® recombinante peuvent être augmentés par amplification vectorielle (pour consultation, voir Bebbington et Hentschel, "The Use of Vectors Based On Gene Amplification For The Expression Of Cloned Genes In Mammaian Cells", dans DNA CLONING, Tome 3. (Academic Press, New York, 1987)). Lorsqu'un marqueur dans le système de vecteur exprimant une protéine à agent AFFIMER® recombinante est amplifiable, une augmentation du niveau d'inhibiteur présent dans la culture de la cellule hôte augmentera le nombre de copies du gène marqueur. Puisque la région amplifiée est associée à la séquence nucléotidique de la protéine à agent AFFIMER® recombinante, la production de la protéine à agent AFFIMER® recombinante augmentera également (Crouse et al. (1983) "Expression and Amplification of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes," Mol. Cell. Biol. 3:257-266).Expression levels of a recombinant AFFIMER®-containing protein can be increased by vector amplification (for review, see Bebbington and Hentschel, "The Use of Vectors Based On Gene Amplification For The Expression Of Cloned Genes In Mammaian Cells," in DNA CLONING, Volume 3. (Academic Press, New York, 1987)). When a marker in the vector system expressing a recombinant AFFIMER®-containing protein is amplifiable, an increase in the level of inhibitor present in the host cell culture will increase the number of copies of the marker gene. Since the amplified region is associated with the nucleotide sequence of the recombinant AFFIMER®-containing protein, production of the recombinant AFFIMER®-containing protein will also increase (Crouse et al. (1983) "Expression and Amplification of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes," Mol. Cell. Biol. 3:257-266).
Lorsque l'agent AFFIMER® est une fusion d'anticorps AFFIMER® ou un autre complexe multiprotéique, la cellule hôte peut être cotransfectée avec deux vecteurs d'expression, par exemple le premier vecteur codant pour une chaîne lourde et le second vecteur codant pour un polypeptide dérivé d'une chaîne légère, l'un ou les deux desquels comprenant une séquence codant pour le polypeptide AFFIMER®. Les deux vecteurs peuvent contenir des marqueurs sélectionnables identiques qui permettent une expression égale des polypeptides des chaînes lourdes et légères. Alternativement, un unique vecteur peut être utilisé qui code à la fois pour les polypeptides des chaînes lourdes et légères. Dans de telles situations, la chaîne légère doit être placée avant la chaîne lourde pour éviter un excès de chaîne lourde libre toxique (Proudfoot (1986) "Expression and Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes," Nature 322:562-565; Kohler (1980) « Immunoglobulin Chain Loss In Hybridoma Lines, », Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 77:2197-2199). Les séquences codant pour les chaînes lourdes et légères peuvent inclure de l'ADNc ou de l'ADN génomique.Where the AFFIMER® agent is an AFFIMER® antibody fusion or other multiprotein complex, the host cell may be cotransfected with two expression vectors, for example, the first vector encoding a heavy chain and the second vector encoding a light chain-derived polypeptide, one or both of which comprise a sequence encoding the AFFIMER® polypeptide. Both vectors may contain identical selectable markers that allow for equal expression of the heavy and light chain polypeptides. Alternatively, a single vector may be used that encodes both the heavy and light chain polypeptides. In such situations, the light chain must be placed before the heavy chain to avoid an excess of toxic free heavy chain (Proudfoot (1986) "Expression and Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes," Nature 322:562-565; Kohler (1980) "Immunoglobulin Chain Loss In Hybridoma Lines," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 77:2197-2199). The sequences encoding the heavy and light chains may include cDNA or genomic DNA.
En général, les glycoprotéines produites dans une lignée cellulaire ou un animal transgénique particulier auront un schéma de glycosylation qui est caractéristique des glycoprotéines produites dans la lignée cellulaire ou l'animal transgénique. Par conséquent, le profil de glycosylation particulier de la protéine à agent AFFIMER® recombinante dépendra de la lignée cellulaire particulière ou de l'animal transgénique particulier utilisé pour produire la protéine. Dans certains modes de réalisation de fusions AFFIMER®/anticorps, un schéma de glycosylation comprenant uniquement des N-glycanes non fucosylés peut être avantageux, parce que dans le cas des anticorps, il a été démontré qu'il présente généralement une efficacité plus puissante que les homologues fucosylés à la fois in vitro et in vivo (Voir par exemple, Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003); Brevet U.S. NOS: 6,946,292 et 7,214,775).In general, glycoproteins produced in a particular cell line or transgenic animal will have a glycosylation pattern that is characteristic of the glycoproteins produced in the cell line or transgenic animal. Therefore, the particular glycosylation profile of the recombinant AFFIMER® agent protein will depend on the particular cell line or transgenic animal used to produce the protein. In certain embodiments of AFFIMER®/antibody fusions, a glycosylation pattern comprising only non-fucosylated N-glycans may be advantageous, because in the case of antibodies, it has been shown to generally exhibit more potent efficacy than fucosylated counterparts both in vitro and in vivo (See, e.g., Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003); U.S. Patent NOS: 6,946,292 and 7,214,775).
En outre, l'expression d'un agent AFFIMER® à partir de lignées cellulaires de production peut être amplifiée en utilisant un certain nombre de techniques connues. Par exemple, le système d'expression du gène de la glutamine synthétase (le système GS) est une approche courante pour amplifier l'expression dans certaines conditions. Le système GS est discuté en tout ou en partie en lien avec les brevets européens n° : 0216846, 0256055 et 0323997 et demande de brevet européen n° 89303964.4. Ainsi, dans certains modes de réalisation de l'invention, les cellules hôtes de mammifères (par ex. CHO) sont dépourvues du gène de la glutamine synthétase et sont cultivées en l'absence de glutamine dans le milieu dans lequel, cependant, le polynucléotide codant pour la chaîne d'immunoglobuline comprend un gène de la glutamine synthétase qui complète l'absence du gène dans la cellule hôte. De telles cellules hôtes contenant le liant (de l’anglais, « binder ») ou le polynucléotide ou le vecteur tel que décrit ici ainsi que les procédés d'expression, tels que décrits ici, pour fabriquer le liant en utilisant une telle cellule hôte font partie de la présente divulgation.In addition, expression of an AFFIMER® agent from production cell lines can be enhanced using a number of known techniques. For example, the glutamine synthetase gene expression system (the GS system) is a common approach to enhance expression under certain conditions. The GS system is discussed in whole or in part in connection with European Patent Nos.: 0216846, 0256055 and 0323997 and European Patent Application No. 89303964.4. Thus, in certain embodiments of the invention, mammalian host cells (e.g., CHO) lack the glutamine synthetase gene and are cultured in the absence of glutamine in the medium wherein, however, the polynucleotide encoding the immunoglobulin chain comprises a glutamine synthetase gene that complements the absence of the gene in the host cell. Such host cells containing the binder or polynucleotide or vector as described herein as well as expression methods, as described herein, for making the binder using such a host cell are part of the present disclosure.
L'expression de protéines recombinantes dans des systèmes de culture de cellules d'insectes (par ex. baculovirus) offre également un procédé robuste pour produire des protéines correctement repliées et biologiquement fonctionnelles. Les systèmes de baculovirus pour la production de protéines hétérologues dans des cellules d'insectes sont bien connus des personnes du métier.Expression of recombinant proteins in insect cell culture systems (e.g. baculovirus) also provides a robust method for producing correctly folded and biologically functional proteins. Baculovirus systems for the production of heterologous proteins in insect cells are well known to those skilled in the art.
Les protéines recombinantes à agent AFFIMER® produites par un hôte transformé peuvent être purifiées selon tout procédé approprié. Les procédés standard incluent la chromatographie (par ex. les chromatographies d'exclusion stérique [de l’anglais « sizing column chomatography », d'affinité, et de dimensionnement), la centrifugation, la solubilité différentielle ou toute autre technique standard pour la purification des protéines. Des étiquettes d'affinité telles que l'hexa-histidine, le domaine de liaison au maltose, la séquence d'enveloppe de la grippe, et la glutathion-S-transférase peuvent être attachées à la protéine pour permettre une purification facile par passage sur une colonne d'affinité appropriée. Les protéines isolées peuvent également être caractérisées physiquement à l'aide de techniques telles que la protéolyse, la spectrométrie de masse (MS), la résonance magnétique nucléaire (RMN), la chromatographie liquide à haute performance (HPLC, de l’anglais « high performance liquid chromatography ») et la cristallographie aux rayons X.AFFIMER®-enhanced recombinant proteins produced by a transformed host may be purified by any suitable method. Standard methods include chromatography (e.g., size exclusion chromatography, affinity, and sizing column chromatography), centrifugation, differential solubility, or other standard techniques for protein purification. Affinity tags such as hexahistidine, maltose binding domain, influenza envelope sequence, and glutathione-S-transferase may be attached to the protein to allow easy purification by passage through an appropriate affinity column. Isolated proteins may also be physically characterized using techniques such as proteolysis, mass spectrometry (MS), nuclear magnetic resonance (NMR), high performance liquid chromatography (HPLC), and X-ray crystallography.
Dans certains modes de réalisation, les protéines à agent AFFIMER® recombinantes produites en culture bactérienne peuvent être isolées, par exemple, par extraction initiale à partir de comprimés cellulaires, suivie d'au moins une étape de concentration, de relargage, d'échange d'ions aqueux ou de chromatographie d'exclusion stérique (de l’anglais « size exclusion chromatography »). La HPLC peut être utilisée pour les étapes finales de purification. Les cellules microbiennes employées dans l'expression d'une protéine recombinante peuvent être rompues par n'importe quel procédé commode, dont les cycles de congélation-décongélation, la sonication, la rupture mécanique ou l'utilisation d'agents de lyse cellulaire.In some embodiments, recombinant AFFIMER®-agent proteins produced in bacterial culture may be isolated, for example, by initial extraction from cell pellets, followed by at least one concentration, salting out, aqueous ion exchange, or size exclusion chromatography step. HPLC may be used for final purification steps. Microbial cells used in expression of a recombinant protein may be disrupted by any convenient method, including freeze-thaw cycling, sonication, mechanical disruption, or the use of cell lysing agents.
Procédés d'utilisation et compositions pharmaceutiquesMethods of use and pharmaceutical compositions
Les agents AFFIMER® de la divulgation sont utiles dans une variété d'applications comprenant, mais sans s'y limiter, des procédés de traitement thérapeutique, pour le lupus érythermatose disséminé (LES), la néphrite lupique (par ex. la néphrite lupique d’origine médicamenteuse), la thrombocytopénie immunitaire (ITP, de l’anglais « immune thrombocytopenia »), la polyarthrite rhumatoïde (PR), la sclérose en plaques (SEP), les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) (par ex. la maladie de Crohn et la colite/colite ulcéreuse), la maladie du greffon contre l'hôte (GvHD) (liée aux transplantations de cellules souches) également appelée rejet d'allogreffe, la transplantation/Transplantation d'Organe Solide (SOT, de l’anglais « Solid Organ Transplantation »), la cholangite biliaire primitive (CBP), le psoriasis, l’arthrite psoriasique, l’arthrite induite par le collagène, l’encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE), l’ovarite, la rhinite allergique, l’asthme, le syndrome de Sjogren, l’eczéma atopique, la myasthénie, la maladie de Basedow, la glomérulosclérose et/ou le cancer. Les procédés d'utilisation peuvent être des procédés in vitro, ex vivo ou in vivo.The AFFIMER® agents of the disclosure are useful in a variety of applications including, but not limited to, therapeutic treatment methods for systemic lupus erythematosis (SLE), lupus nephritis (e.g., drug-induced lupus nephritis), immune thrombocytopenia (ITP), rheumatoid arthritis (RA), multiple sclerosis (MS), inflammatory bowel disease (IBD) (e.g., Crohn's disease and ulcerative colitis/colitis), graft-versus-host disease (GvHD) (related to stem cell transplants) also known as allograft rejection, solid organ transplantation/transplantation (SOT), primary biliary cholangitis (PBC), psoriasis, psoriatic arthritis, inflammatory bowel disease (IBD) and osteoarthritis. collagen, experimental allergic encephalomyelitis (EAE), oophoritis, allergic rhinitis, asthma, Sjogren's syndrome, atopic eczema, myasthenia gravis, Graves' disease, glomerulosclerosis and/or cancer. The methods of use may be in vitro, ex vivo or in vivo methods.
Lupus Erythermatose DisséminéSystemic Lupus Erythermatosis
Le lupus érythémateux disséminé (LES), communément appelé simplement lupus, est une maladie auto-immune chronique qui peut provoquer un gonflement (inflammation) et des douleurs dans tout le corps. Il existe plusieurs types différents de lupus. Le lupus érythémateux disséminé est le plus fréquent. D’autres types de lupus incluent :Systemic lupus erythematosus (SLE), commonly referred to simply as lupus, is a chronic autoimmune disease that can cause swelling (inflammation) and pain throughout the body. There are several different types of lupus. Systemic lupus erythematosus is the most common. Other types of lupus include:
Lupus érythémateux cutané : Ce type de lupus affecte la peau - cutané est un terme qui signifie peau. Les personnes atteintes de lupus érythémateux cutané peuvent connaître des problèmes de peau comme une sensibilité au soleil et des éruptions. La perte de cheveux peut également être un symptôme de cette affection.Cutaneous lupus erythematosus: This type of lupus affects the skin - cutaneous is a term that means skin. People with cutaneous lupus erythematosus may experience skin problems such as sun sensitivity and rashes. Hair loss can also be a symptom of this condition.
Lupus d'origine médicamenteuse : Ces cas de lupus sont causés par certains médicaments. Les personnes atteintes de lupus d'origine médicamenteuse peuvent présenter bon nombre des mêmes symptômes que ceux du lupus érythémateux disséminé, mais il est généralement temporaire.Drug-induced lupus: These cases of lupus are caused by certain medications. People with drug-induced lupus may have many of the same symptoms as systemic lupus erythematosus, but it is usually temporary.
Lupus néonatal : Un type rare de lupus, le lupus néonatal est une affection que l'on retrouve chez les nourrissons à la naissance. Les enfants nés avec un lupus néonatal ont des anticorps qui leur ont été transmis depuis leur mère – qui avait soit le lupus au moment de la grossesse, soit peut présenter l’affection plus tard dans la vie. Tous les bébés nés d'une mère atteinte de lupus ne présenteront pas la maladie.Neonatal lupus: A rare type of lupus, neonatal lupus is a condition that is found in infants at birth. Children born with neonatal lupus have antibodies that were passed down to them from their mothers—who either had lupus at the time of pregnancy or may develop the condition later in life. Not all babies born to a mother with lupus will develop the disease.
Les thérapies qui peuvent être utilisées en combinaison avec les polypeptides TNFR2 AFFIMER® proposés ici incluent, par exemple : les stéroïdes (corticostéroïdes, y compris la prednisone) ; l’Hydroxychloroquine (Plaquenil®) ; l’Azathioprine (Imuran®); le Méthotrexate (Rheumatrex®) ; le Cyclophosphamide (Cytoxan®) et le Mycophénolate Mofétil (CellCept®) ; le Belimumab (Benlysta®) ; et/ou le Rituximab (Rituxan®).Therapies that may be used in combination with the AFFIMER® TNFR2 polypeptides offered herein include, for example: steroids (corticosteroids, including prednisone); Hydroxychloroquine (Plaquenil®); Azathioprine (Imuran®); Methotrexate (Rheumatrex®); Cyclophosphamide (Cytoxan®) and Mycophenolate Mofetil (CellCept®); Belimumab (Benlysta®); and/or Rituximab (Rituxan®).
Néphrite lupiqueLupus nephritis
La néphrite lupique est une complication fréquente chez les personnes atteintes de lupus érythémateux disséminé, plus connu sous le nom de lupus. La néphrite lupique survient lorsque les autoanticorps lupiques affectent les structures des reins qui filtrent les déchets. Ceci provoque une inflammation des reins et peut entraîner l’apparition de sang dans les urines, de protéines dans les urines, d’une pression artérielle élevée, d’une altération de la fonction rénale ou même d’une insuffisance rénale. Jusqu'à la moitié des adultes atteints de lupus systémique développent une néphrite lupique. Le lupus systémique entraîne des lésions des reins par les protéines du système immunitaire, ce qui nuit à leur capacité à filtrer les déchets.Lupus nephritis is a common complication in people with systemic lupus erythematosus, more commonly known as lupus. Lupus nephritis occurs when lupus autoantibodies affect the structures in the kidneys that filter waste. This causes inflammation of the kidneys and can lead to blood in the urine, protein in the urine, high blood pressure, impaired kidney function, or even kidney failure. Up to half of adults with systemic lupus develop lupus nephritis. Systemic lupus causes immune system proteins to damage the kidneys, impairing their ability to filter waste.
Polyarthrite rhumatoïdeRheumatoid arthritis
La polyarthrite rhumatoïde est un type d'arthrite chronique (permanente) qui touche les articulations des deux côtés du corps, comme les mains, les poignets et les genoux. Les objectifs à court terme des médicaments contre la polyarthrite rhumatoïde sont de réduire la douleur et le gonflement des articulations et/ou d'améliorer la fonction articulaire. L'objectif à long terme est de ralentir ou d'arrêter le processus de la maladie, en particulier les lésions articulaires.Rheumatoid arthritis is a chronic (lifelong) type of arthritis that affects joints on both sides of the body, such as the hands, wrists, and knees. The short-term goals of rheumatoid arthritis medications are to reduce joint pain and swelling and/or improve joint function. The long-term goal is to slow or stop the disease process, especially joint damage.
L'arthrite est un terme général qui décrit une inflammation des articulations. La polyarthrite rhumatoïde est un type d'arthrite chronique (permanente) (entraînant des douleurs et un gonflement) qui survient généralement dans les articulations de manière symétrique (des deux côtés du corps, comme les mains, les poignets et les genoux). Cette atteinte de plusieurs articulations aide à distinguer la polyarthrite rhumatoïde d’autres types d'arthrite.Arthritis is a general term that describes inflammation of the joints. Rheumatoid arthritis is a chronic (permanent) type of arthritis (causing pain and swelling) that usually occurs in the joints symmetrically (on both sides of the body, such as the hands, wrists, and knees). This involvement of multiple joints helps distinguish rheumatoid arthritis from other types of arthritis.
En plus d'affecter les articulations, la polyarthrite rhumatoïde peut occasionnellement affecter la peau, les yeux, les poumons, le cœur, le sang, les nerfs ou les reins.In addition to affecting the joints, rheumatoid arthritis can occasionally affect the skin, eyes, lungs, heart, blood, nerves, or kidneys.
Les thérapies qui peuvent être utilisées en combinaison avec les agents TNFR2 AFFIMER® proposés ici pour traiter la polyarthrite rhumatoïde peuvent inclure, par exemple :Therapies that may be used in combination with the TNFR2 AFFIMER® agents proposed herein to treat rheumatoid arthritis may include, for example:
Les médicaments qui diminuent la douleur et l'inflammation. Ces produits incluent les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), tels que l'ibuprofène (MOTRIN®), le naproxène (ALEVE®) et autres produits similaires. Un autre type de médicament - l'inhibiteur de la COX-2 - entre également dans cette catégorie de médicaments, offrant un soulagement aux signes et symptômes de la polyarthrite rhumatoïde. Le célécoxib (CELEBREX®), un inhibiteur de la COX-2, est disponible et utilisé aux États-Unis. Les inhibiteurs de la COX-2 ont été conçus pour présenter moins d'effets secondaires de saignement sur l'estomac.Medications that reduce pain and inflammation. These products include nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), such as ibuprofen (MOTRIN®), naproxen (ALEVE®), and similar products. Another type of medication - a COX-2 inhibitor - also falls into this category of medications, providing relief from the signs and symptoms of rheumatoid arthritis. Celecoxib (CELEBREX®), a COX-2 inhibitor, is available and used in the United States. COX-2 inhibitors were designed to have fewer side effects of stomach bleeding.
Antirhumatismaux modificateurs de maladie (ARMM). Contrairement aux autres AINS, les ARMM peuvent en réalité ralentir le processus de la maladie en modifiant le système immunitaire. Les ARMM plus anciens incluent le méthotrexate (TREXALL®), les sels d'or, la pénicillamine (CUPRIMINE®), l'hydroxychloroquine (PLAQUENIL®), la sulfasalazine (AZULFIDINE®), la cyclosporine (SANDIMMUNE®), le cyclophosphamide (CYTOXAN®) et le léflunomide (ARAVA®). Actuellement, le méthotrexate, le léflunomide, l'hydroxychloroquine et la sulfasalazine sont les plus couramment utilisés. (La cyclosporine, le cyclophosphamide, les sels d'or et la pénicillamine ne sont généralement plus utilisés.)Disease-modifying antirheumatic drugs (DMARDs). Unlike other NSAIDs, DMARDs can actually slow the disease process by altering the immune system. Older DMARDs include methotrexate (TREXALL®), gold, penicillamine (CUPRIMINE®), hydroxychloroquine (PLAQUENIL®), sulfasalazine (AZULFIDINE®), cyclosporine (SANDIMMUNE®), cyclophosphamide (CYTOXAN®), and leflunomide (ARAVA®). Currently, methotrexate, leflunomide, hydroxychloroquine, and sulfasalazine are the most commonly used. (Cyclosporine, cyclophosphamide, gold, and penicillamine are generally no longer used.)
Produits biologiques. Au-delà de ces ARMM plus "traditionnels", de nouveaux médicaments ont été approuvés. Actuellement, il existe sept classes différentes de médicaments et, dans certains cas, différentes sortes existent dans chaque classe. (Certains d'entre eux, comme les anti-TNF de classe, sont utilisés depuis 2000.) Collectivement, ces ARMM sont connus sous un autre nom – agents biologiques (ou agents de réponse biologique). Par rapport aux ARMM traditionnels, ces produits ciblent les molécules qui causent l'inflammation dans la polyarthrite rhumatoïde. Les cellules inflammatoires des articulations sont impliquées dans le développement de la polyarthrite rhumatoïde elle-même. Les agents biologiques réduisent le processus inflammatoire qui cause in fine les lésions articulaires observées dans la polyarthrite rhumatoïde. Les ARMM plus anciens fonctionnent un peu plus loin que les produits biologiques ; ils agissent en modifiant la propre réponse immunitaire du corps à l'inflammation. En attaquant les cellules à un niveau plus spécifique de l'inflammation elle-même, les produits biologiques sont considérés comme plus efficaces et plus spécifiquement ciblés. Les agents biologiques incluent l'étanercept (ENBREL®), l'infliximab (REMICADE®), l'adalimumab (HUMIRA®), l'anakinra (KINARET®), l'abatacept (ORENCIA®), le rituximab (RITUXAN®), le certolizumab pegol (CIMZIA®), le golimumab (SYMPONI ®), le tocilizumab (ACTEMRA®) et le tofacitinib (XELJANJ®). Certains des produits biologiques sont utilisés en association avec les ARMM traditionnels, en particulier avec du méthotrexate.Biologics. Beyond these more “traditional” DMARDs, newer drugs have been approved. Currently, there are seven different classes of drugs, and in some cases, different kinds exist within each class. (Some of these, like the TNF blockers, have been in use since 2000.) Collectively, these DMARDs are known by another name – biologics (or biologic response agents). Compared to traditional DMARDs, these drugs target the molecules that cause inflammation in rheumatoid arthritis. Inflammatory cells in the joints are implicated in the development of rheumatoid arthritis itself. Biologics reduce the inflammatory process that ultimately causes the joint damage seen in rheumatoid arthritis. Older DMARDs work a bit further than biologics; they work by altering the body’s own immune response to inflammation. By attacking cells at a more specific level than the inflammation itself, biologics are considered more effective and more specifically targeted. Biologics include etanercept (ENBREL®), infliximab (REMICADE®), adalimumab (HUMIRA®), anakinra (KINARET®), abatacept (ORENCIA®), rituximab (RITUXAN®), certolizumab pegol (CIMZIA®), golimumab (SYMPONI ®), tocilizumab (ACTEMRA®), and tofacitinib (XELJANJ®). Some of the biologics are used in combination with traditional DMARDs, particularly methotrexate.
Sclérose en plaquesMultiple sclerosis
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune. Avec ces affections, le système immunitaire attaque à tort les cellules saines. Chez les personnes atteintes de SEP, le système immunitaire attaque les cellules dans la myéline, la gaine protectrice qui entoure les nerfs dans le cerveau et la moelle épinière. Les lésions à la gaine de myéline interrompent les signaux nerveux allant du cerveau vers d'autres parties du corps. Les lésions peuvent entraîner des symptômes affectant le cerveau, la moelle épinière et les yeux.Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease. With these conditions, the immune system mistakenly attacks healthy cells. In people with MS, the immune system attacks cells in myelin, the protective sheath that surrounds nerves in the brain and spinal cord. Damage to the myelin sheath interrupts nerve signals from the brain to other parts of the body. The damage can cause symptoms affecting the brain, spinal cord, and eyes.
Il existe quatre types de sclérose en plaques :There are four types of multiple sclerosis:
Syndrome cliniquement isolé (SCI) : Lorsqu'une personne présente un premier épisode de symptômes de SEP, les fournisseurs de soins de santé le classent souvent en tant que SCI. Toutes les personnes atteintes de SCI ne développent pas de sclérose en plaques.Clinically isolated syndrome (CIS): When a person has a first episode of MS symptoms, health care providers often classify it as CIS. Not everyone with CIS develops multiple sclerosis.
SEP récurrente-rémittente (SEP-RR) : Il s'agit de la forme la plus courante de sclérose en plaques. Les personnes atteintes de SEP-RR ont des poussées - également appelées rechutes ou exacerbations - de symptômes nouveaux ou qui s'aggravent. Des périodes de rémission suivent (lorsque les symptômes se stabilisent ou disparaissent).Relapsing-remitting MS (RRMS): This is the most common form of multiple sclerosis. People with RRMS have attacks—also called relapses or exacerbations—of new or worsening symptoms. Periods of remission follow (when symptoms stabilize or disappear).
SEP primaire progressive (SEP-PP, de l’anglais « Primary progressive Multiple Sclerosis ») : Les personnes diagnostiquées d’une SEP-PP ont des symptômes qui s'aggravent lentement et progressivement sans aucune période de rechute ou de rémission.Primary progressive multiple sclerosis (PPMS): People diagnosed with PPMS have symptoms that slowly and gradually worsen without any periods of relapse or remission.
SEP secondaire progressive (SEP-SP, de l’anglais SPMS, ou « Secondary progressive Multiple Sclerosis ») : Dans de nombreux cas, les personnes initialement diagnostiquées avec une SEP-RR évoluent finalement vers une SEP-SP. Avec une sclérose en plaques secondaire progressive, on continue d'accumuler des lésions nerveuses. Les symptômes s'aggravent progressivement. Bien que l'on puisse encore éprouver des rechutes ou des poussées (lorsque les symptômes augmentent), on n'a plus de périodes de rémission par la suite (lorsque les symptômes se stabilisent ou disparaissent).Secondary progressive multiple sclerosis (SPMS): In many cases, people initially diagnosed with RRMS eventually progress to SPMS. With secondary progressive multiple sclerosis, nerve damage continues to accumulate. Symptoms gradually worsen. Although you may still experience relapses or flare-ups (when symptoms increase), you do not have periods of remission (when symptoms stabilize or disappear) afterward.
Les thérapies qui peuvent être utilisées en combinaison avec les polypeptides TNFR2 AFFIMER® proposés ici incluent, par exemple :Therapies that may be used in combination with the TNFR2 AFFIMER® polypeptides offered herein include, for example:
Des thérapies modificatrices de la maladie (DMT, de l’anglais « Disease-modifying therapies ») : Plusieurs médicaments disposent d’un agrément de la FDA pour le traitement à long terme de la SEP. Ces médicaments aident à réduire les rechutes (également appelées poussées ou attaques). Ils ralentissent la progression de la maladie. Et ils peuvent empêcher que de nouvelles lésions ne se forment sur le cerveau et la moelle épinière.Disease-modifying therapies (DMTs): Several medications have FDA approval for the long-term treatment of MS. These medications help reduce relapses (also called attacks or relapses). They slow the progression of the disease. And they can prevent new lesions from forming in the brain and spinal cord.
Des médicaments de gestion de rechutes : En cas d’attaque grave, un neurologue peut recommander une forte dose de corticostéroïdes. Le médicament peut réduire rapidement l'inflammation. Ils ralentissent les lésions à la gaine de myéline entourant les cellules nerveuses.Relapse management medications: In severe attacks, a neurologist may recommend a high dose of corticosteroids. The medication can quickly reduce inflammation. They slow damage to the myelin sheath surrounding nerve cells.
Une rééducation physique : La sclérose en plaques peut affecter les fonctions physiques. Rester en bonne forme physique et fort aide à maintenir la mobilité.Physical rehabilitation: Multiple sclerosis can affect physical functions. Staying physically fit and strong helps maintain mobility.
Le conseil en santé mentale : Faire face à une affection chronique peut être difficile sur le plan émotionnel. La SEP peut parfois affecter l'humeur et la mémoire. Travailler avec un neuropsychologue ou disposer d’un autre soutien émotionnel est un élément essentiel de la gestion de la maladie.Mental health counseling: Coping with a chronic condition can be emotionally challenging. MS can sometimes affect mood and memory. Working with a neuropsychologist or having other emotional support is an essential part of managing the disease.
Une maladie inflammatoire chronique de l'intestinChronic inflammatory bowel disease
Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) sont un groupe de troubles qui provoquent une inflammation chronique (douleur et gonflement) dans les intestins.Inflammatory bowel diseases (IBD) are a group of disorders that cause chronic inflammation (pain and swelling) in the intestines.
La maladie de Crohn et la colite ulcéreuse sont les principaux types de MICI. Les types incluent :Crohn's disease and ulcerative colitis are the main types of IBD. Types include:
La maladie de Crohn provoque des douleurs et un gonflement dans le tractus digestif. Elle peut affecter n'importe quelle partie depuis la bouche jusqu’à l'anus. Elle affecte le plus souvent l'intestin grêle et la partie supérieure du gros intestin.Crohn's disease causes pain and swelling in the digestive tract. It can affect anywhere from the mouth to the anus. It most commonly affects the small intestine and the upper part of the large intestine.
La colite ulcéreuse provoque un gonflement et des plaies (ulcères) dans le gros intestin (côlon et rectum).Ulcerative colitis causes swelling and sores (ulcers) in the large intestine (colon and rectum).
La colite microscopique provoque une inflammation intestinale qui n'est détectable qu'au microscope.Microscopic colitis causes intestinal inflammation that is only detectable under a microscope.
Les thérapies qui peuvent être utilisées en combinaison avec les polypeptides TNFR2 AFFIMER® proposés ici incluent, par exemple : les aminosalicylates (un médicament anti-inflammatoire comme la sulfasalazine, la mésalamine ou le balsalazide) minimisent l'irritation des intestins ; les antibiotiques traitent les infections et les abcès ; les produits biologiques interrompent les signaux provenant du système immunitaire qui provoquent une inflammation ; les corticostéroïdes, tels que la prednisone, maintiennent le système immunitaire sous contrôle et gèrent les poussées ; les immunomodulateurs calment un système immunitaire hyperactif ; les médicaments antidiarrhéiques ; les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) ; les vitamines et suppléments tels que les probiotiques.Therapies that may be used in combination with the AFFIMER® TNFR2 polypeptides offered here include, for example: aminosalicylates (an anti-inflammatory medication such as sulfasalazine, mesalamine, or balsalazide) minimize intestinal irritation; antibiotics treat infections and abscesses; biologics interrupt signals from the immune system that cause inflammation; corticosteroids, such as prednisone, keep the immune system in check and manage flare-ups; immunomodulators calm an overactive immune system; antidiarrheal medications; nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs); and vitamins and supplements such as probiotics.
Maladie du greffon contre l'hôteGraft versus host disease
La maladie du greffon contre l'hôte (GvHD) est une affection qui peut survenir après une greffe allogénique. Dans la GvHD, la moelle osseuse donnée ou les cellules souches du sang périphérique perçoivent le corps du receveur comme étranger, et les cellules/la moelle osseuse données attaquent le corps.Graft-versus-host disease (GvHD) is a condition that can occur after an allogeneic transplant. In GvHD, donated bone marrow or peripheral blood stem cells perceive the recipient's body as foreign, and the donated cells/bone marrow attack the body.
Il existe deux formes de GvHD : Maladie aiguë du greffon contre l'hôte (aGvHD, de l’anglais « Acute graft versus host disease ») ; et Maladie chronique du greffon contre l'hôte (cGvHD, de l’anglais « Chronic graft versus host disease »).There are two forms of GvHD: acute graft versus host disease (aGvHD); and chronic graft versus host disease (cGvHD).
PsoriasisPsoriasis
Le psoriasis est une affection cutanée chronique, c'est-à-dire une affection cutanée qui ne disparaît pas. Les personnes atteintes de psoriasis ont des plaques de peau épaisses, roses ou rouges couvertes d'écailles blanches ou argentées. Les aplats épais et squameux sont appelés plaques. Le psoriasis commence généralement au début de l'âge adulte, bien qu'il puisse commencer plus tard dans la vie. En plus des plaques rouges et squameuses, les symptômes du psoriasis incluent : des démangeaisons, une peau craquelée et sèche, un cuir chevelu squameux, des douleurs cutanées, des ongles piqués, fissurés ou friables, et des douleurs articulaires.Psoriasis is a chronic skin condition, meaning a skin condition that does not go away. People with psoriasis have thick, pink or red patches of skin covered in white or silvery scales. The thick, scaly patches are called plaques. Psoriasis usually begins in early adulthood, although it can start later in life. In addition to red, scaly patches, symptoms of psoriasis include: itchy, dry, cracked skin, scaly scalp, skin pain, pitted, cracked, or brittle nails, and joint pain.
Les thérapies qui peuvent être utilisées en combinaison avec les polypeptides TNFR2 AFFIMER® proposés ici incluent, par exemple : Des crèmes à base de stéroïdes, des crèmes hydratantes pour peaux sèches, l’anthraline (un médicament ralentissant la production de cellules cutanées), des lotions médicamenteuses, des shampoings et solutions pour le bain pour améliorer le psoriasis du cuir chevelu, des pommades à la vitamine D3, des crèmes à la vitamine A ou aux rétinoïdes, la luminothérapie, le PUVA (un traitement associant un médicament appelé psoralène avec exposition à une forme spéciale de lumière UV), le méthotrexate, les rétinoïdes, la cyclosporine et/ou les thérapies immunitaires.Therapies that may be used in combination with the AFFIMER® TNFR2 polypeptides offered herein include, for example: Steroid creams, moisturizers for dry skin, anthralin (a drug that slows the production of skin cells), medicated lotions, shampoos and baths to improve scalp psoriasis, vitamin D3 ointments, vitamin A or retinoid creams, light therapy, PUVA (a treatment that combines a drug called psoralen with exposure to a special form of UV light), methotrexate, retinoids, cyclosporine and/or immune therapies.
Syndrome de SjogrenSjogren's syndrome
Le syndrome de Sjögren est une maladie auto-immune permanente qui réduit la quantité d'humidité produite par les glandes des yeux et de la bouche. Il porte le nom d'Henrik Sjögren, un oculiste suédois qui a décrit l’affection pour la première fois. Bien qu’une bouche sèche et des yeux secs soient les principaux symptômes, la plupart des personnes qui ont ces problèmes n'ont pas le syndrome de Sjögren. La bouche sèche est aussi appelée xérostomie.Sjögren's syndrome is a lifelong autoimmune disease that reduces the amount of moisture produced by the glands in the eyes and mouth. It is named after Henrik Sjögren, a Swedish oculist who first described the condition. Although dry mouth and dry eyes are the main symptoms, most people who have these problems do not have Sjögren's syndrome. Dry mouth is also called xerostomia.
Il existe deux formes du syndrome de Sjögren : le syndrome de Sjögren primaire, qui se développe de lui-même, non à cause d'un autre problème de santé, et le syndrome de Sjögren secondaire, qui se développe en plus d'autres maladies auto-immunes telles que la polyarthrite rhumatoïde, le lupus et le rhumatisme psoriasique.There are two forms of Sjögren's syndrome: primary Sjögren's syndrome, which develops on its own, not because of another health problem, and secondary Sjögren's syndrome, which develops in addition to other autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, lupus, and psoriatic arthritis.
Les thérapies qui peuvent être utilisées en combinaison avec les polypeptides TNFR2 AFFIMER® proposés ici incluent, par ex. des traitements pour les yeux secs (par ex. des larmes artificielles, gouttes ophtalmiques sur ordonnance, bouchons lacrymaux, la chirurgie, des gouttes de sérum autologue), des traitements pour la sécheresse buccale (par ex. des producteurs de salive), des traitements des problèmes articulaires ou organiques (par ex. analgésiques, antirhumatismaux, immunosuppresseurs, stéroïdes, antifongiques et traitements de la sécheresse vaginale.Therapies that may be used in combination with the TNFR2 AFFIMER® polypeptides provided herein include, e.g., treatments for dry eyes (e.g., artificial tears, prescription eye drops, punctal plugs, surgery, autologous serum drops), treatments for dry mouth (e.g., saliva producers), treatments for joint or organ problems (e.g., analgesics, antirheumatic drugs, immunosuppressants, steroids, antifungals, and treatments for vaginal dryness.
Myasthénie auto-immuneAutoimmune myasthenia gravis
La myasthénie auto-immune (MG, de l’anglais « myasthenia gravis ») est une maladie auto-immune, ce qui signifie que le système immunitaire du corps attaque par erreur ses propres parties. La MG affecte la communication entre les nerfs et les muscles (la jonction neuromusculaire).Autoimmune myasthenia gravis (MG) is an autoimmune disease, which means that the body's immune system mistakenly attacks its own parts. MG affects the communication between nerves and muscles (the neuromuscular junction).
Les personnes atteintes de MG perdent la capacité de contrôler volontairement leurs muscles. Ils éprouvent une faiblesse musculaire et une fatigue de gravités variables. Ils peuvent ne pas être capables de bouger les muscles des yeux, visage, cou et membres. La MG est une maladie neuromusculaire permanente.People with MG lose the ability to voluntarily control their muscles. They experience muscle weakness and fatigue of varying severity. They may not be able to move the muscles of the eyes, face, neck, and limbs. MG is a lifelong neuromuscular disease.
La MG affecte environ 20 personnes sur 100.000. Les experts estiment que 36.000 à 60.000 Américains sont atteints de cette maladie neuromusculaire. Le nombre réel de personnes touchées peut être plus élevé, car certaines personnes atteintes de cas bénins peuvent ne pas savoir qu'elles sont atteintes de la maladie. La MG affecte majoritairement les femmes âgées de 20 à 40 ans et les hommes âgés de 50 à 80 ans. Environ un cas de MG sur 10 survient chez des adolescents (MG juvénile). La maladie peut toucher des personnes de tous âges mais est rare chez les enfants.MG affects about 20 out of every 100,000 people. Experts estimate that 36,000 to 60,000 Americans have this neuromuscular disease. The actual number of people affected may be higher because some people with mild cases may not know they have the disease. MG most commonly affects women ages 20 to 40 and men ages 50 to 80. About one in 10 cases of MG occurs in adolescents (juvenile MG). The disease can affect people of all ages but is rare in children.
La MG auto-immune est la forme la plus courante de cette maladie neuromusculaire. La MG auto-immune peut être :Autoimmune MG is the most common form of this neuromuscular disease. Autoimmune MG can be:
Oculaire : Les muscles qui déplacent les yeux et les paupières faiblissent. Les paupières peuvent s’affaisser ou il peut ne pas être possible de garder les yeux ouverts. Certaines personnes présentent une vision double. La faiblesse des yeux est souvent le premier signe de la MG. Près de la moitié des personnes atteintes de MG oculaire évoluent vers la forme généralisée dans les deux ans suivant le premier symptôme.Eye: The muscles that move the eyes and eyelids become weak. The eyelids may droop or it may not be possible to keep the eyes open. Some people experience double vision. Eye weakness is often the first sign of MG. About half of people with ocular MG progress to the generalized form within two years of the first symptom.
Généralisée : La faiblesse musculaire affecte les yeux et d'autres parties du corps telles que les visage, cou, bras, jambes et gorge. Il peut être difficile de parler ou d'avaler, de lever les bras au-dessus de la tête, de se lever depuis une position assise, de marcher de longues distances et de monter les escaliers.Generalized: Muscle weakness affects the eyes and other parts of the body such as the face, neck, arms, legs, and throat. It may be difficult to speak or swallow, raise the arms above the head, stand up from a sitting position, walk long distances, and climb stairs.
Les thérapies qui peuvent être utilisées en combinaison avec les polypeptides TNFR2 AFFIMER® fournis ici incluent, par exemple, les médicaments, les anticorps monoclonaux, l'immunoglobuline IV (IVIG), l'échange de plasma (plasmaphérèse) et/ou la chirurgie.Therapies that may be used in combination with the TNFR2 AFFIMER® polypeptides provided herein include, for example, drugs, monoclonal antibodies, IV immunoglobulin (IVIG), plasma exchange (plasmapheresis), and/or surgery.
CancerCancer
Il a été démontré que la liaison du TNF au TNFR2 favorise l'activation des cellules tumorales et des types de cellules associées aux tumeurs, tout en affectant la réponse immunitaire, comme les lymphocytes infiltrant la tumeur, pour créer un environnement dans lequel la tumeur peut progresser. En effet, l'expression de TNFR2 dans les tumeurs est associée à la progression de la maladie et à de mauvais résultats cliniques (Sheng Y, et al.). Par conséquent, les polypeptides TNFR2 AFFIMER® de la présente invention peuvent être utiles dans le traitement du cancer, soit en monothérapie soit en conjonction avec d'autres traitements du cancer tels que les immunothérapies, par ex. les thérapies CAR-T, les inhibiteurs de points de contrôle et les traitements anticancéreux conventionnels.TNF binding to TNFR2 has been shown to promote activation of tumor cells and tumor-associated cell types, while affecting the immune response, such as tumor-infiltrating lymphocytes, to create an environment in which the tumor can progress. Indeed, TNFR2 expression in tumors is associated with disease progression and poor clinical outcomes (Sheng Y, et al.). Therefore, the AFFIMER® TNFR2 polypeptides of the present invention may be useful in the treatment of cancer, either as monotherapy or in conjunction with other cancer treatments such as immunotherapies, e.g., CAR-T therapies, checkpoint inhibitors, and conventional anticancer therapies.
Préparations pharmaceutiques Les formulations sont préparées pour le stockage et l'utilisation par combinaison d’un agent AFFIMER® purifié de la présente divulgation avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable (par ex. un support ou excipient). Les personnes du métier considèrent généralement que les supports, excipients et/ou stabilisants pharmaceutiquement acceptables sont des ingrédients inactifs d'une formulation ou composition pharmaceutique.Pharmaceutical Preparations Formulations are prepared for storage and use by combining a purified AFFIMER® agent of the present disclosure with a pharmaceutically acceptable vehicle (e.g., a carrier or excipient). Pharmaceutically acceptable carriers, excipients and/or stabilizers are generally considered by those skilled in the art to be inactive ingredients of a pharmaceutical formulation or composition.
Dans certains modes de réalisation, un agent AFFIMER® décrit ici est lyophilisé et/ou stocké sous une forme lyophilisée. Dans certains modes de réalisation, une formulation comprenant un agent AFFIMER® décrit ici est lyophilisée.In some embodiments, an AFFIMER® agent described herein is lyophilized and/or stored in a lyophilized form. In some embodiments, a formulation comprising an AFFIMER® agent described herein is lyophilized.
Les véhicules pharmaceutiquement acceptables appropriés incluent, mais sans s'y limiter, des tampons non toxiques tels que le phosphate, le citrate et d'autres acides organiques ; des sels tels que le chlorure de sodium ; des antioxydants dont l'acide ascorbique et la méthionine ; les conservateurs tels que le chlorure d'octadécyldiméthylbenzylammonium, le chlorure d'hexaméthonium, le chlorure de benzalkonium, le chlorure de benzéthonium, le phénol, l'alcool butylique ou benzylique, les alkylparabènes tels que le méthyl- ou propylparabène, le catéchol, le résorcinol, le cyclohexanol, le 3-pentanol, le m-crésol ; des polypeptides de faible poids moléculaire (par ex. moins d'environ 10 résidus d'acides aminés) ; des protéines telles que l'albumine sérique, la gélatine ou les immunoglobulines ; les polymères hydrophiles tels que la polyvinylpyrrolidone ; des acides aminés tels que la glycine, la glutamine, l'asparagine, l'histidine, l'arginine ou la lysine ; les glucides tels que les monosaccharides, les disaccharides, le glucose, le mannose ou les dextrines ; des agents chélatants tels que l'EDTA ; les sucres tels que le saccharose, le mannitol, le tréhalose ou le sorbitol ; des contre-ions salifiants tels que le sodium ; les complexes métalliques tels que les complexes Zn-protéine ; et des tensioactifs non ioniques tels que le TWEEN ou le polyéthylène glycol (PEG). (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22.sup.nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London.).Suitable pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, nontoxic buffers such as phosphate, citrate and other organic acids; salts such as sodium chloride; antioxidants including ascorbic acid and methionine; preservatives such as octadecyldimethylbenzylammonium chloride, hexamethonium chloride, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, phenol, butyl or benzyl alcohol, alkylparabens such as methyl- or propylparaben, catechol, resorcinol, cyclohexanol, 3-pentanol, m-cresol; low molecular weight polypeptides (e.g., less than about 10 amino acid residues); proteins such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine or lysine; carbohydrates such as monosaccharides, disaccharides, glucose, mannose or dextrins; chelating agents such as EDTA; sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; salt-forming counterions such as sodium; metal complexes such as Zn-protein complexes; and nonionic surfactants such as TWEEN or polyethylene glycol (PEG). (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22.sup.nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London.).
Les compositions pharmaceutiques de la présente divulgation peuvent être administrées de n'importe quel nombre de manières pour un traitement soit local, soit systémique. L'administration peut être topique par patchs épidermiques ou transdermiques, pommades, lotions, crèmes, gels, gouttes, suppositoires, pulvérisateurs, liquides et poudres ; pulmonaire par inhalation ou insufflation de poudres ou d'aérosols, notamment par nébulisation, intratrachéale et intranasale ; orale ; ou parentérale y compris intraveineuse, intra-artérielle, intratumoralle, sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire (par ex. injection ou perfusion) ou intracrânienne (par ex. intrathécale ou intraventriculaire).The pharmaceutical compositions of the present disclosure may be administered in any number of ways for either local or systemic treatment. Administration may be topical by epidermal or transdermal patches, ointments, lotions, creams, gels, drops, suppositories, sprays, liquids and powders; pulmonary by inhalation or insufflation of powders or aerosols, including nebulization, intratracheal and intranasal; oral; or parenteral including intravenous, intraarterial, intratumoral, subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular (e.g. injection or infusion) or intracranial (e.g. intrathecal or intraventricular).
La formulation thérapeutique peut être sous forme posologique unitaire. De telles formulations incluent les comprimés, pilules, gélules, poudres, granulés, solutions ou suspensions dans de l'eau ou des milieux non aqueux, ou les suppositoires. Dans les compositions solides telles que les comprimés, le principal ingrédient actif est mélangé avec un support pharmaceutique. Les ingrédients de fabrication de comprimés classiques incluent l'amidon de maïs, le lactose, le saccharose, le sorbitol, le talc, l'acide stéarique, le stéarate de magnésium, le phosphate ou les gommes dicalciques, et les diluants (par ex. de l'eau). Ceux-ci peuvent être utilisés pour former une composition de préformulation solide contenant un mélange homogène d'un composé de la présente divulgation, ou un sel pharmaceutiquement acceptable non toxique de celui-ci. La composition de préformulation solide est ensuite subdivisée en formes posologiques unitaires d'un type décrit ci-dessus. Les comprimés, pilules, etc. de la formulation ou composition peuvent être enrobés ou mélangés d'une autre manière pour offrir une forme posologique offrant l'avantage d'une action prolongée. Par exemple, le comprimé ou la pilule peut comprendre une composition interne recouverte d'un composant externe. De plus, les deux composants peuvent être séparés par une couche entérique qui sert à résister à la désintégration et permet au composant interne de traverser intact l'estomac ou d'être retardé dans sa libération. Une variété de matériaux peut être utilisée pour ces couches ou revêtements entériques, de tels matériaux incluant un certain nombre d'acides polymériques et de mélanges d'acides polymériques avec des matériaux tels que la gomme laque, l'alcool cétylique et l'acétate de cellulose.The therapeutic formulation may be in unit dosage form. Such formulations include tablets, pills, capsules, powders, granules, solutions or suspensions in water or non-aqueous media, or suppositories. In solid compositions such as tablets, the principal active ingredient is mixed with a pharmaceutical carrier. Typical tableting ingredients include corn starch, lactose, sucrose, sorbitol, talc, stearic acid, magnesium stearate, dicalcium phosphate or gums, and diluents (e.g., water). These may be used to form a solid preformulation composition containing a homogeneous mixture of a compound of the present disclosure, or a non-toxic pharmaceutically acceptable salt thereof. The solid preformulation composition is then subdivided into unit dosage forms of a type described above. The tablets, pills, etc. of the formulation or composition may be coated or otherwise mixed to provide a dosage form having the advantage of prolonged action. For example, the tablet or pill may include an inner composition coated with an outer component. In addition, the two components may be separated by an enteric layer which serves to resist disintegration and allows the inner component to pass through the stomach intact or to be delayed in its release. A variety of materials may be used for such enteric layers or coatings, such materials including a number of polymeric acids and mixtures of polymeric acids with materials such as shellac, cetyl alcohol and cellulose acetate.
Les agents AFFIMER® décrits ici peuvent également être piégés dans des microcapsules. De telles microcapsules sont préparées, par exemple, par des techniques de coacervation ou par polymérisation interfaciale, par exemple, des microcapsules d'hydroxyméthylcellulose ou de gélatine et des microcapsules de poly-(méthacrylate de méthyle), respectivement, dans des systèmes colloïdaux de délivrance de médicament (par exemple, des liposomes, des microsphères d'albumine, des microémulsions, nanoparticules et nanocapsules) ou dans des macroémulsions tel que décrit dans Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 22.sup.nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London.The AFFIMER® agents described herein may also be entrapped in microcapsules. Such microcapsules are prepared, for example, by coacervation techniques or by interfacial polymerization, for example, hydroxymethylcellulose or gelatin microcapsules and poly-(methyl methacrylate) microcapsules, respectively, in colloidal drug delivery systems (e.g., liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules) or in macroemulsions as described in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22.sup.nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London.
Dans certains modes de réalisation, les formulations pharmaceutiques comprennent un agent AFFIMER® de la présente divulgation complexé avec des liposomes. Les procédés de production des liposomes sont connus des personnes du métier. Par exemple, certains liposomes peuvent être générés par évaporation en phase inverse avec une composition lipidique comprenant de la phosphatidylcholine, du cholestérol et de la phosphatidyléthanolamine dérivée de PEG (PEG-PE). Les liposomes peuvent être extrudés à travers des filtres de taille de pores définie pour produire des liposomes du diamètre souhaité.In some embodiments, the pharmaceutical formulations comprise an AFFIMER® agent of the present disclosure complexed with liposomes. Methods of producing the liposomes are known to those skilled in the art. For example, some liposomes may be generated by reverse phase evaporation with a lipid composition comprising phosphatidylcholine, cholesterol, and PEG-derived phosphatidylethanolamine (PEG-PE). The liposomes may be extruded through filters of defined pore size to produce liposomes of the desired diameter.
Dans certains modes de réalisation, des préparations à libération prolongée comprenant des agents AFFIMER® décrits ici peuvent être produites. Des exemples appropriés de préparations à libération prolongée incluent des matrices semi-perméables de polymères hydrophobes solides contenant un agent AFFIMER®, où les matrices sont sous la forme d'articles façonnés (par ex. des films ou microcapsules). Des exemples de matrices à libération prolongée incluent les polyesters, les hydrogels tels que le poly(2-hydroxyéthyl-méthacrylate) ou le poly(alcool vinylique), les polylactides, les copolymères d'acide L-glutamique et de 7 éthyl-L-glutamate, l'éthylène-acétate de vinyle non dégradable, les copolymères dégradables d'acide lactique et d'acide glycolique tels que le LUPRON DEPOT™. (microsphères injectables composées de copolymère d'acide lactique-acide glycolique et d'acétate de leuprolide), d'isobutyrate d'acétate de saccharose et d'acide poly-D-(-)-3-hydroxybutyrique.In some embodiments, sustained release preparations comprising AFFIMER® agents described herein may be produced. Suitable examples of sustained release preparations include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing an AFFIMER® agent, wherein the matrices are in the form of shaped articles (e.g., films or microcapsules). Examples of sustained release matrices include polyesters, hydrogels such as poly(2-hydroxyethyl methacrylate) or poly(vinyl alcohol), polylactides, copolymers of L-glutamic acid and 7-ethyl-L-glutamate, non-degradable ethylene vinyl acetate, degradable copolymers of lactic acid and glycolic acid such as LUPRON DEPOT™. (injectable microspheres composed of lactic acid-glycolic acid copolymer and leuprolide acetate), sucrose acetate isobutyrate and poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid.
Dans certains modes de réalisation, en plus de l'administration d'un agent AFFIMER® décrit ici, le procédé ou le traitement comprend en outre l'administration d'au moins un agent thérapeutique supplémentaire. Un agent thérapeutique supplémentaire peut être administré avant, concurremment à et/ou après l'administration de l'agent AFFIMER®. Des compositions pharmaceutiques comprenant un agent AFFIMER® et le(s) agent(s) thérapeutique(s) supplémentaire(s) sont également fournies. Dans certains modes de réalisation, l’au moins un agent thérapeutique supplémentaire comprend 1, 2, 3 ou plus agents thérapeutiques supplémentaires.In some embodiments, in addition to administering an AFFIMER® agent described herein, the method or treatment further comprises administering at least one additional therapeutic agent. An additional therapeutic agent may be administered prior to, concurrently with, and/or subsequent to administration of the AFFIMER® agent. Pharmaceutical compositions comprising an AFFIMER® agent and the additional therapeutic agent(s) are also provided. In some embodiments, the at least one additional therapeutic agent comprises 1, 2, 3, or more additional therapeutic agents.
La thérapie combinée avec deux ou plus agents thérapeutiques utilise souvent des agents qui agissent selon différents mécanismes d'action, bien que cela ne soit pas requis. La thérapie combinée utilisant des agents ayant des mécanismes d'action différents peut entraîner des effets additifs ou synergiques. La thérapie combinée peut autoriser une dose plus faible de chaque agent que celle utilisée en monothérapie, réduisant ainsi les effets secondaires toxiques et/ou augmentant l'indice thérapeutique de l'agent AFFIMER®.Combination therapy with two or more therapeutic agents often uses agents that act by different mechanisms of action, although this is not required. Combination therapy using agents with different mechanisms of action may result in additive or synergistic effects. Combination therapy may allow a lower dose of each agent than that used in monotherapy, thereby reducing toxic side effects and/or increasing the therapeutic index of the AFFIMER® agent.
Dans certains modes de réalisation des procédés décrits ici, la combinaison d'un agent AFFIMER® décrit ici et d'au moins un agent thérapeutique supplémentaire aboutit à des résultats additifs ou synergiques. Dans certains modes de réalisation, la thérapie combinée aboutit à une augmentation de l'indice thérapeutique de l'agent AFFIMER®. Dans certains modes de réalisation, la thérapie combinée aboutit à une augmentation de l'indice thérapeutique de(s) agent(s) thérapeutique(s). Dans certains modes de réalisation, la thérapie combinée entraîne une diminution de la toxicité et/ou des effets secondaires de l'agent AFFIMER®. Dans certains modes de réalisation, la thérapie combinée entraîne une diminution de la toxicité et/ou des effets secondaires de(s) agent(s) thérapeutique(s).In certain embodiments of the methods described herein, the combination of an AFFIMER® agent described herein and at least one additional therapeutic agent results in additive or synergistic results. In certain embodiments, the combination therapy results in an increase in the therapeutic index of the AFFIMER® agent. In certain embodiments, the combination therapy results in an increase in the therapeutic index of the therapeutic agent(s). In certain embodiments, the combination therapy results in a decrease in the toxicity and/or side effects of the AFFIMER® agent. In certain embodiments, the combination therapy results in a decrease in the toxicity and/or side effects of the therapeutic agent(s).
L'administration combinée peut inclure une coadministration, soit dans une seule formulation pharmaceutique soit en utilisant des formulations séparées, ou une administration consécutive dans l'un ou l'autre ordre mais généralement dans un laps de temps tel que tous les agents actifs puissent exercer leurs activités biologiques simultanément.Combined administration may include coadministration, either in a single pharmaceutical formulation or using separate formulations, or consecutive administration in either order but generally within a time period such that all active agents can exert their biological activities simultaneously.
On comprendra que la combinaison d'un agent AFFIMER® décrit ici et d'au moins un agent thérapeutique supplémentaire peut être administrée dans n'importe quel ordre ou concurremment. Dans certains modes de réalisation, l'agent AFFIMER® sera administré à des patients ayant préalablement subi un traitement avec un second agent thérapeutique. Dans certains autres modes de réalisation, l'agent AFFIMER® et un second agent thérapeutique seront administrés sensiblement simultanément ou concurremment. Par exemple, un sujet peut recevoir un agent AFFIMER® tout en subissant une trajectoire de traitement avec un second agent thérapeutique (par ex. une chimiothérapie). Dans certains modes de réalisation, un agent AFFIMER® sera administré sous 1 année du traitement avec un second agent thérapeutique. Dans certains modes de réalisation alternatifs, un agent AFFIMER® sera administré dans les 10, 8, 6, 4 ou 2 mois de tout traitement avec un second agent thérapeutique. Dans certains autres modes de réalisation, un agent AFFIMER® sera administré dans les ou la 4, 3, 2 ou 1 semaine(s) de tout traitement avec un second agent thérapeutique. Dans certains modes de réalisation, un agent AFFIMER® sera administré sous 5, 4, 3, 2 ou 1 jour(s) de tout traitement avec un second agent thérapeutique. On notera en outre que les deux agents ou traitements (ou plus) peuvent être administrés au sujet en l'espace de quelques heures ou minutes (par ex. sensiblement simultanément).It will be understood that the combination of an AFFIMER® agent described herein and at least one additional therapeutic agent may be administered in any order or concurrently. In some embodiments, the AFFIMER® agent will be administered to patients who have previously undergone treatment with a second therapeutic agent. In some other embodiments, the AFFIMER® agent and a second therapeutic agent will be administered substantially simultaneously or concurrently. For example, a subject may receive an AFFIMER® agent while undergoing a treatment trajectory with a second therapeutic agent (e.g., chemotherapy). In some embodiments, an AFFIMER® agent will be administered within 1 year of treatment with a second therapeutic agent. In some alternative embodiments, an AFFIMER® agent will be administered within 10, 8, 6, 4, or 2 months of any treatment with a second therapeutic agent. In some other embodiments, an AFFIMER® agent will be administered within 4, 3, 2, or 1 week(s) of any treatment with a second therapeutic agent. In some embodiments, an AFFIMER® agent will be administered within 5, 4, 3, 2, or 1 day(s) of any treatment with a second therapeutic agent. It will further be appreciated that the two (or more) agents or treatments may be administered to the subject within a matter of hours or minutes (e.g., substantially simultaneously).
Pour le traitement d'une maladie, la posologie appropriée d'un agent AFFIMER® de la présente divulgation dépend du type de maladie à traiter, de la sévérité et de l'évolution de la maladie, de la réactivité de la maladie, du fait que l'agent AFFIMER® est administré à des fins thérapeutiques ou préventives, des thérapies antérieures, des antécédents cliniques du patient, etc., le tout à la discrétion du médecin traitant. L'agent AFFIMER® peut être administré en une seule fois ou sur une série de traitements durant de plusieurs jours à plusieurs mois, ou jusqu'à ce qu'une guérison soit atteinte ou qu'une diminution de l'état de la maladie soit obtenue. Les schémas de dosage optimaux peuvent être calculés à partir des mesures d'accumulation de médicament(s) dans le corps du patient et varieront en fonction de la puissance relative de chaque agent individuel. Le médecin traitant peut déterminer des dosages optimaux, des méthodologies de dosage et les fréquences de répétition. Dans certains modes de réalisation, la posologie est de 0,01 ug à 100 mg/kg de poids corporel, de 0,1 ug à 100 mg/kg de poids corporel, de 1 ug à 100 mg/kg de poids corporel, de 1 mg à 100 mg/kg de de poids corporel, de 1 mg à 80 mg/kg de poids corporel, de 10 mg à 100 mg/kg de poids corporel, de 10 mg à 75 mg/kg de poids corporel, ou de 10 mg à 50 mg/kg de poids corporel. Dans certains modes de réalisation, le dosage de l'agent AFFIMER® est d'environ 0,1 mg à environ 20 mg/kg de poids corporel. Dans certains modes de réalisation, le dosage de l'agent AFFIMER® est environ 0,1 mg/kg de poids corporel. Dans certains modes de réalisation, le dosage de l'agent AFFIMER® est environ 0,25 mg/kg de poids corporel. Dans certains modes de réalisation, le dosage de l'agent AFFIMER® est environ 0,5 mg/kg de poids corporel. Dans certains modes de réalisation, le dosage de l'agent AFFIMER® est environ 1 mg/kg de poids corporel. Dans certains modes de réalisation, le dosage de l'agent AFFIMER® est environ 1.5 mg/kg de poids corporel. Dans certains modes de réalisation, le dosage de l'agent AFFIMER® est environ 2 mg/kg de poids corporel. Dans certains modes de réalisation, le dosage de l'agent AFFIMER® est environ 2.5 mg/kg de poids corporel. Dans certains modes de réalisation, le dosage de l'agent AFFIMER® est environ 5 mg/kg de poids corporel. Dans certains modes de réalisation, le dosage de l'agent AFFIMER® est environ 7.5 mg/kg de poids corporel. Dans certains modes de réalisation, le dosage de l'agent AFFIMER® est environ 10 mg/kg de poids corporel. Dans certains modes de réalisation, le dosage de l'agent AFFIMER® est environ 12.5 mg/kg de poids corporel. Dans certains modes de réalisation, le dosage de l'agent AFFIMER® est environ 15 mg/kg de poids corporel. Dans certains modes de réalisation, le dosage peut être administré une fois ou plus par jour, par semaine, par mois ou par an. Dans certains modes de réalisation, l'agent AFFIMER® est donné une fois par semaine, une fois toutes les deux semaines, une fois toutes les trois semaines ou une fois toutes les quatre semaines.For the treatment of disease, the appropriate dosage of an AFFIMER® agent of this disclosure depends on the type of disease being treated, the severity and course of the disease, the responsiveness of the disease, whether the AFFIMER® agent is being administered for therapeutic or preventive purposes, prior therapies, the patient's clinical history, etc., all at the discretion of the treating physician. The AFFIMER® agent may be administered as a single dose or over a series of treatments lasting from several days to several months, or until cure is achieved or abatement of the disease state is achieved. Optimal dosage regimens can be calculated from measurements of drug accumulation in the patient's body and will vary depending on the relative potency of each individual agent. The treating physician can determine optimal dosages, dosing methodologies, and repetition frequencies. In some embodiments, the dosage is from 0.01 ug to 100 mg/kg body weight, from 0.1 ug to 100 mg/kg body weight, from 1 ug to 100 mg/kg body weight, from 1 mg to 100 mg/kg body weight, from 1 mg to 80 mg/kg body weight, from 10 mg to 100 mg/kg body weight, from 10 mg to 75 mg/kg body weight, or from 10 mg to 50 mg/kg body weight. In some embodiments, the dosage of the AFFIMER® agent is from about 0.1 mg to about 20 mg/kg body weight. In some embodiments, the dosage of the AFFIMER® agent is about 0.1 mg/kg body weight. In some embodiments, the dosage of the AFFIMER® agent is about 0.25 mg/kg body weight. In some embodiments, the dosage of the AFFIMER® agent is about 0.5 mg/kg of body weight. In some embodiments, the dosage of the AFFIMER® agent is about 1 mg/kg of body weight. In some embodiments, the dosage of the AFFIMER® agent is about 1.5 mg/kg of body weight. In some embodiments, the dosage of the AFFIMER® agent is about 2 mg/kg of body weight. In some embodiments, the dosage of the AFFIMER® agent is about 2.5 mg/kg of body weight. In some embodiments, the dosage of the AFFIMER® agent is about 5 mg/kg of body weight. In some embodiments, the dosage of the AFFIMER® agent is about 7.5 mg/kg of body weight. In some embodiments, the dosage of the AFFIMER® agent is about 10 mg/kg of body weight. In some embodiments, the dosage of the AFFIMER® agent is about 12.5 mg/kg of body weight. In some embodiments, the dosage of the AFFIMER® agent is about 15 mg/kg of body weight. In some embodiments, the dosage may be administered once or more per day, per week, per month, or per year. In some embodiments, the AFFIMER® agent is given once per week, once every two weeks, once every three weeks, or once every four weeks.
Dans certains modes de réalisation, un agent AFFIMER® peut être administré à une dose de « charge » initiale supérieure, suivie d'au moins une dose inférieure. Dans certains modes de réalisation, la fréquence d'administration peut également changer. Dans certains modes de réalisation, un schéma posologique peut comprendre l'administration d'une dose initiale, suivie de doses supplémentaires (ou doses « d'entretien ») une fois par semaine, toutes les deux semaines, toutes les trois semaines ou chaque mois. Par exemple, un schéma posologique peut comprendre l'administration d'une dose de charge initiale, suivie d'une dose d'entretien hebdomadaire de, par exemple, la moitié de la dose initiale. Dans certains modes de réalisation, un schéma posologique comprend l'administration d'une dose de charge initiale, suivie de doses d'entretien de, par exemple, la moitié de la dose initiale toutes les deux semaines. Dans certains modes de réalisation, un schéma posologique comprend l'administration de trois doses initiales pendant 3 semaines, suivies de doses d'entretien, par exemple, de la même quantité toutes les deux semaines.In some embodiments, an AFFIMER® agent may be administered at a higher initial “loading” dose, followed by at least one lower dose. In some embodiments, the frequency of administration may also vary. In some embodiments, a dosage regimen may include administering an initial dose, followed by additional doses (or “maintenance” doses) once a week, every two weeks, every three weeks, or every month. For example, a dosage regimen may include administering an initial loading dose, followed by a weekly maintenance dose of, for example, half the initial dose. In some embodiments, a dosage regimen includes administering an initial loading dose, followed by maintenance doses of, for example, half the initial dose every two weeks. In some embodiments, a dosage regimen includes administering three initial doses over 3 weeks, followed by maintenance doses, for example, of the same amount every two weeks.
Comme cela est connu des personnes du métier, l'administration de tout agent thérapeutique peut entraîner des effets secondaires et/ou des toxicités. Dans certains cas, les effets secondaires et/ou les toxicités sont si graves qu'ils empêchent l'administration de l'agent particulier à une dose thérapeutiquement efficace. Dans certains cas, la thérapie médicamenteuse doit être interrompue, et d'autres agents peuvent être essayés. Cependant, de nombreux agents d'une même classe thérapeutique présentent souvent des effets secondaires et/ou des toxicités similaires, ce qui signifie que le patient doit soit arrêter la thérapie, soit, si possible, souffrir des effets secondaires désagréables associés à l'agent thérapeutique.As is known to those skilled in the art, the administration of any therapeutic agent may result in side effects and/or toxicities. In some cases, the side effects and/or toxicities are so severe that they preclude the administration of the particular agent at a therapeutically effective dose. In some cases, drug therapy must be discontinued, and other agents may be tried. However, many agents within the same therapeutic class often exhibit similar side effects and/or toxicities, meaning that the patient must either discontinue therapy or, if possible, suffer the unpleasant side effects associated with the therapeutic agent.
Dans certains modes de réalisation, le schéma de dosage peut être limité à un nombre spécifique d'administrations ou de "cycles". Dans certains modes de réalisation, l'agent AFFIMER® est administré pendant 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou plus cycles. Par exemple, l'agent AFFIMER® est administré toutes les 2 semaines pendant 6 cycles, l'agent AFFIMER® est administré toutes les 3 semaines pendant 6 cycles, l'agent AFFIMER® est administré toutes les 2 semaines pendant 4 cycles, l'agent AFFIMER® est administré toutes les 3 semaines pendant 4 cycles, etc. Les programmes de dosage peuvent être décidés et ensuite modifiés par les personnes du métier.In some embodiments, the dosing regimen may be limited to a specific number of administrations or "cycles." In some embodiments, the AFFIMER® agent is administered for 3, 4, 5, 6, 7, 8, or more cycles. For example, the AFFIMER® agent is administered every 2 weeks for 6 cycles, the AFFIMER® agent is administered every 3 weeks for 6 cycles, the AFFIMER® agent is administered every 2 weeks for 4 cycles, the AFFIMER® agent is administered every 3 weeks for 4 cycles, etc. Dosing schedules may be decided and subsequently modified by those skilled in the art.
Ainsi, la présente invention propose des procédés d'administration à un sujet des polypeptides ou agents décrits ici comprenant l'utilisation d'une stratégie de dosage intermittent pour administrer au moins un agent (par ex. deux ou trois agents), qui peut réduire les effets secondaires et/ou les toxicités associés à l’administration d'un agent AFFIMER®. Dans certains modes de réalisation, un procédé de traitement d'une maladie inflammatoire ou auto-immune chez un sujet humain comprend l'administration au sujet d'une dose thérapeutiquement efficace d'un agent AFFIMER® en combinaison avec une dose thérapeutiquement efficace d'un autre agent thérapeutique, l'un ou les deux agents étant administré(s) selon une stratégie de dosage intermittent. Dans certains modes de réalisation, la stratégie de dosage intermittent comprend l'administration d'une dose initiale d'un agent AFFIMER® au sujet et l'administration de doses ultérieures de l'agent AFFIMER® environ une fois toutes les 2 semaines. Dans certains modes de réalisation, la stratégie de dosage intermittent comprend l'administration d'une dose initiale d'un agent AFFIMER® au sujet et l'administration de doses ultérieures de l'agent AFFIMER® environ une fois toutes les 3 semaines. Dans certains modes de réalisation, la stratégie de dosage intermittent comprend l'administration d'une dose initiale d'un agent AFFIMER® au sujet et l'administration de doses ultérieures de l'agent AFFIMER® environ une fois toutes les 4 semaines. Dans certains modes de réalisation, l'agent AFFIMER® est administré en utilisant une stratégie à dosage intermittent et l'agent chimiothérapeutique est administré chaque semaine.Thus, the present invention provides methods of administering to a subject the polypeptides or agents described herein comprising using an intermittent dosing strategy to administer at least one agent (e.g., two or three agents), which may reduce side effects and/or toxicities associated with administration of an AFFIMER® agent. In some embodiments, a method of treating an inflammatory or autoimmune disease in a human subject comprises administering to the subject a therapeutically effective amount of an AFFIMER® agent in combination with a therapeutically effective amount of another therapeutic agent, wherein one or both agents are administered according to an intermittent dosing strategy. In some embodiments, the intermittent dosing strategy comprises administering an initial dose of an AFFIMER® agent to the subject and administering subsequent doses of the AFFIMER® agent approximately once every 2 weeks. In some embodiments, the intermittent dosing strategy comprises administering an initial dose of an AFFIMER® agent to the subject and administering subsequent doses of the AFFIMER® agent approximately once every 3 weeks. In some embodiments, the intermittent dosing strategy comprises administering an initial dose of an AFFIMER® agent to the subject and administering subsequent doses of the AFFIMER® agent approximately once every 4 weeks. In some embodiments, the AFFIMER® agent is administered using an intermittent dosing strategy and the chemotherapeutic agent is administered weekly.
D'autres modes de réalisation de l'invention sont exposés dans les clauses ci-dessous.Other embodiments of the invention are set forth in the clauses below.
1. Polypeptide d’ingénierie qui se lie spécifiquement au TNFR2 avec une Kd de 1×10-6M ou moins, dans lequel le polypeptide d’ingénierie est une variante d'une protéine Stéfine A.1. An engineered polypeptide that specifically binds to TNFR2 with a Kd of 1×10-6 M or less, wherein the engineered polypeptide is a variant of a Stefin A protein.
2. Polypeptide d’ingénierie selon la clause 1 comprenant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 %, au moins 90 %, au moins 95 ou au moins 98 % d'identité avec une séquence d'acides aminés de MIP-Xaa1-GLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVV-(Xaa)n-Xaa2-TNYYIKVRAGDNKYMHLKVF-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa)m-Xaa6-D-Xaa7-VLTGYQVDKNKDDELTGF (SEQ ID NO : 4),2. An engineered polypeptide according to clause 1 comprising an amino acid sequence having at least 80%, at least 90%, at least 95% or at least 98% identity with an amino acid sequence of MIP-Xaa1-GLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVV-(Xaa)n-Xaa2-TNYYIKVRAGDNKYMHLKVF-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa)m-Xaa6-D-Xaa7-VLTGYQVDKNKDDELTGF (SEQ ID NO: 4),
où Xaa, individuellement pour chaque occurrence, est un résidu d'acide aminé ; et n et m sont chacun, indépendamment, un entier de 3 à 20.where Xaa, individually for each occurrence, is an amino acid residue; and n and m are each, independently, an integer from 3 to 20.
3. Polypeptide d’ingénierie selon la clause 2 où la séquence d'acides aminés a 100 % d'identité avec une séquence d'acides aminés de MIP-Xaa1-GLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVV-(Xaa)n-Xaa2-TNYYIKVRAGDNKYMHLKVF-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa)m-Xaa6-D-Xaa7-VLTGYQVDKNKDDELTGF (SEQ ID NO : 4),3. An engineered polypeptide according to clause 2 wherein the amino acid sequence has 100% identity with an amino acid sequence of MIP-Xaa1-GLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVV-(Xaa)n-Xaa2-TNYYIKVRAGDNKYMHLKVF-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa)m-Xaa6-D-Xaa7-VLTGYQVDKNKDDELTGF (SEQ ID NO: 4),
où Xaa, individuellement pour chaque occurrence, est un résidu d'acide aminé ; et n et m sont chacun, indépendamment, un entier de 3 à 20.where Xaa, individually for each occurrence, is an amino acid residue; and n and m are each, independently, an integer from 3 to 20.
4. Polypeptide d’ingénierie selon la clause 1 comprenant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 %, au moins 90 %, au moins 95 ou au moins 98 % d'identité avec une séquence d'acides aminés de4. An engineered polypeptide according to clause 1 comprising an amino acid sequence having at least 80%, at least 90%, at least 95% or at least 98% identity with an amino acid sequence of
MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVD-(Xaa)n-GTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSL-(Xaa)m-EDLVLTGYQVDKNKDDELTGF (SEQ ID NO: 5),(SEQ ID NO: 5),
où Xaa, individuellement pour chaque occurrence, est un résidu d'acide aminé ; et n et m sont chacun, indépendamment, un entier de 3 à 20.where Xaa, individually for each occurrence, is an amino acid residue; and n and m are each, independently, an integer from 3 to 20.
5. Polypeptide d’ingénierie selon la clause 4 où la séquence d'acides aminés a 100 % d'identité avec une séquence d'acides aminés de5. An engineered polypeptide according to clause 4 where the amino acid sequence has 100% identity with an amino acid sequence of
MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVD-(Xaa)n-GTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSL-(Xaa)m-EDLVLTGYQVDKNKDDELTGF (SEQ ID NO: 5),(SEQ ID NO: 5),
où Xaa, individuellement pour chaque occurrence, est un résidu d'acide aminé ; et n et m sont chacun, indépendamment, un entier de 3 à 20.where Xaa, individually for each occurrence, is an amino acid residue; and n and m are each, independently, an integer from 3 to 20.
6. Polypeptide d’ingénierie selon l'une quelconque des clauses 1 à 5, dans lequel n est un nombre entier de 5 à 18.6. An engineered polypeptide according to any one of clauses 1 to 5, wherein n is an integer from 5 to 18.
7. Polypeptide d’ingénierie selon la clause 6, dans lequel n est un nombre entier de 7 à 15.7. An engineered polypeptide according to clause 6, wherein n is an integer from 7 to 15.
8. Polypeptide d’ingénierie selon la clause 7, dans lequel n est un nombre entier de 8 à 12.8. An engineered polypeptide according to clause 7, wherein n is an integer from 8 to 12.
9. Polypeptide d’ingénierie selon l'une quelconque des clauses 1 à 8, dans lequel n est un nombre entier de 5 à 18.9. An engineered polypeptide according to any one of clauses 1 to 8, wherein n is an integer from 5 to 18.
10. Polypeptide d’ingénierie selon la clause 9, dans lequel m est un nombre entier de 7 à 15.10. An engineered polypeptide according to clause 9, wherein m is an integer from 7 to 15.
11. Polypeptide d’ingénierie selon la clause 10, dans lequel m est un nombre entier de 8 à 12.11. An engineered polypeptide according to clause 10, wherein m is an integer from 8 to 12.
12. Polypeptide d’ingénierie selon l'une quelconque des clauses 1 à 11 qui se lie au TNFR2 avec un Kd de 1×10-7M.12. An engineered polypeptide according to any one of clauses 1 to 11 that binds to TNFR2 with a Kd of 1×10-7 M.
13. Polypeptide d’ingénierie selon la clause 12 qui se lie au TNFR2 avec un Kd de 1×10-8M.13. Engineered polypeptide according to clause 12 that binds to TNFR2 with a Kd of 1×10-8 M.
14. Polypeptide d’ingénierie selon l’une quelconque des clauses 1 à 13, dans lequel (Xaa)n comprend une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par les SEQ ID NO : 6-102.14. An engineered polypeptide according to any one of clauses 1 to 13, wherein (Xaa)n comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6-102.
15. Polypeptide d’ingénierie selon la clause 14, dans lequel (Xaa)n consiste en une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par les SEQ ID NO : 6-102.15. An engineered polypeptide according to clause 14, wherein (Xaa)n consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6-102.
16. Polypeptide d’ingénierie selon l’une quelconque des clauses 1 à 15, dans lequel (Xaa)m comprend une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par les SEQ ID NO : 103-199.16. An engineered polypeptide according to any one of clauses 1 to 15, wherein (Xaa)m comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 103-199.
17. Polypeptide d’ingénierie selon la clause 16, dans lequel (Xaa)m consiste en une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par les SEQ ID NO : 103-199.17. An engineered polypeptide according to clause 16, wherein (Xaa)m consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 103-199.
18. Polypeptide d’ingénierie selon la clause 14, dans lequel (Xaa)n comprend une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par les SEQ ID NO : 6, 11, 13, 16, 17, 24, 25, 29, 33, 41, 54, 65, 67, 73, 75, 82, 89, 90, 98 et 99.18. An engineered polypeptide according to clause 14, wherein (Xaa)n comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6, 11, 13, 16, 17, 24, 25, 29, 33, 41, 54, 65, 67, 73, 75, 82, 89, 90, 98 and 99.
19. Polypeptide d’ingénierie selon la clause 18, dans lequel (Xaa)n consiste en une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par les SEQ ID NO : 6, 11, 13, 16, 17, 24, 25, 29, 33, 41, 54, 65, 67, 73, 75, 82, 89, 90, 98 et 99.19. An engineered polypeptide according to clause 18, wherein (Xaa)n consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6, 11, 13, 16, 17, 24, 25, 29, 33, 41, 54, 65, 67, 73, 75, 82, 89, 90, 98 and 99.
20. Polypeptide d’ingénierie selon la clause 16, dans lequel (Xaa)m comprend une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par les SEQ ID NO : 103, 108, 110, 113, 114, 121, 122, 126, 130, 138, 151, 162, 164, 170, 172, 179, 186, 187, 195 et 196.20. An engineered polypeptide according to clause 16, wherein (Xaa)m comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 103, 108, 110, 113, 114, 121, 122, 126, 130, 138, 151, 162, 164, 170, 172, 179, 186, 187, 195 and 196.
21. Polypeptide d’ingénierie selon la clause 20, dans lequel (Xaa)m consiste en une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par les SEQ ID NO : 103, 108, 110, 113, 114, 121, 122, 126, 130, 138, 151, 162, 164, 170, 172, 179, 186, 187, 195 et 196.21. An engineered polypeptide according to clause 20, wherein (Xaa)m consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 103, 108, 110, 113, 114, 121, 122, 126, 130, 138, 151, 162, 164, 170, 172, 179, 186, 187, 195 and 196.
22. Polypeptide d’ingénierie selon la clause 1 comprenant une séquence d'acides aminés au moins 75 %, au moins 85 %, ou au moins 95 % d'identité avec une séquence d'acides aminés des SEQ ID No: 200, 205, 207, 210, 211, 218, 219, 223, 227, 235, 248, 259, 261, 267, 269, 276, 283, 284, 292 à 293, où la séquence exclut optionnellement un ou plus des vingt-et-un résidus carboxy terminaux.22. An engineered polypeptide according to clause 1 comprising an amino acid sequence having at least 75%, at least 85%, or at least 95% identity with an amino acid sequence of SEQ ID No: 200, 205, 207, 210, 211, 218, 219, 223, 227, 235, 248, 259, 261, 267, 269, 276, 283, 284, 292 to 293, wherein the sequence optionally excludes one or more of the twenty-one carboxy terminal residues.
23. Polypeptide d’ingénierie selon la clause 22 comprenant une séquence d'acides aminés ayant 100 % d'identité avec une séquence d'acides aminés des SEQ ID No: 200, 205, 207, 210, 211, 218, 219, 223, 227, 235, 248, 259, 261, 267, 269, 276, 283, 284, 292 à 293, où la séquence exclut optionnellement un ou plus des vingt-et-un résidus carboxy terminaux.23. An engineered polypeptide according to clause 22 comprising an amino acid sequence having 100% identity with an amino acid sequence of SEQ ID No: 200, 205, 207, 210, 211, 218, 219, 223, 227, 235, 248, 259, 261, 267, 269, 276, 283, 284, 292 to 293, wherein the sequence optionally excludes one or more of the twenty-one carboxy terminal residues.
24. Polypeptide d’ingénierie selon l'une quelconque des clauses 1 à 23, dans lequel le polypeptide de Stéfine A est un polypeptide de Stéfine A de mammifère.24. An engineered polypeptide according to any one of clauses 1 to 23, wherein the Stefin A polypeptide is a mammalian Stefin A polypeptide.
25. Polypeptide d’ingénierie selon l'une quelconque des clauses 1 à 24, dans lequel le polypeptide de Stéfine A est un polypeptide de Stéfine A humaine.25. An engineered polypeptide according to any one of clauses 1 to 24, wherein the Stefin A polypeptide is a human Stefin A polypeptide.
26. Polypeptide d’ingénierie selon l'une quelconque des clauses 1 à 25, comprenant en outre un peptide signal.26. An engineered polypeptide according to any one of clauses 1 to 25, further comprising a signal peptide.
27. Protéine de fusion comprenant un dimère, un trimère ou un tétramère du polypeptide d’ingénierie selon l'une quelconque des clauses 1 à 26, comprenant optionnellement un lieur ou plus.27. A fusion protein comprising a dimer, trimer or tetramer of the engineered polypeptide according to any one of clauses 1 to 26, optionally comprising one or more linkers.
28. Protéine de fusion selon la clause 10, dans laquelle le lieur est un lieur rigide.28. A fusion protein according to clause 10, wherein the linker is a rigid linker.
29. Protéine de fusion selon la clause 28, dans laquelle le lieur rigide est un lieur peptidique comprenant la séquence (EAAAK)n, où n vaut 1-6.29. A fusion protein according to clause 28, wherein the rigid linker is a peptide linker comprising the sequence (EAAAK)n, where n is 1-6.
30. Une protéine de fusion comprenant un ou plus des polypeptides d’ingénierie selon l’une quelconque des clauses 1 à 29 lié(s) à un groupement thérapeutique ou diagnostique.30. A fusion protein comprising one or more of the engineered polypeptides according to any one of clauses 1 to 29 linked to a therapeutic or diagnostic moiety.
31. Protéine de fusion selon la clause 30, dans laquelle le groupement thérapeutique est une protéine ou un peptide thérapeutique.31. Fusion protein according to clause 30, wherein the therapeutic moiety is a therapeutic protein or peptide.
32. Protéine de fusion selon la clause 31, dans laquelle le groupement thérapeutique est un anticorps.32. Fusion protein according to clause 31, wherein the therapeutic group is an antibody.
33. Protéine de fusion selon la clause 30, dans laquelle le groupement diagnostique est une protéine fluorescente.33. Fusion protein according to clause 30, wherein the diagnostic moiety is a fluorescent protein.
34. Polypeptide d’ingénierie selon l'une quelconque des clauses 1 à 26 ou la protéine de fusion selon l'une quelconque des clauses 27 à 33 comprenant en outre un groupement d'extension de demi-vie.34. An engineered polypeptide according to any one of clauses 1 to 26 or the fusion protein according to any one of clauses 27 to 33 further comprising a half-life extension moiety.
35. Polypeptide d’ingénierie ou protéine de fusion selon la clause 34, dans lequel le groupement d'extension de demi-vie est sélectionné parmi les domaines Fc d'anticorps, l'albumine sérique humaine, les protéines de liaison du sérum.35. An engineered polypeptide or fusion protein according to clause 34, wherein the half-life extension moiety is selected from antibody Fc domains, human serum albumin, serum binding proteins.
36. Polypeptide d’ingénierie ou protéine de fusion selon la clause 34, où le groupement d'extension de demi-vie est une variante d'une protéine Stéfine A qui se lie spécifiquement à l'albumine sérique humaine avec un Kd de 1×10-6M ou moins.36. An engineered polypeptide or fusion protein according to clause 34, wherein the half-life extension moiety is a variant of a Stefin A protein that specifically binds to human serum albumin with a Kd of 1×10-6 M or less.
37. Polypeptide d’ingénierie ou protéine de fusion selon l'une quelconque des clauses 1 à 36, dans lequel/laquelle le Kd est mesuré par analyse cinétique Biacore.37. An engineered polypeptide or fusion protein according to any of clauses 1 to 36, wherein the Kd is measured by Biacore kinetic analysis.
38. Polypeptide d’ingénierie ou protéine de fusion selon la clause 37, dans lequel/laquelle le Kd est mesuré comme exposé dans l'EXEMPLE 3, « essai Biacore ».38. An engineered polypeptide or fusion protein according to clause 37, wherein the Kd is measured as set forth in EXAMPLE 3, “Biacore assay”.
39. Polypeptide d’ingénierie ou protéine de fusion selon l'une quelconque des clauses 1 à 38, dans lequel le polypeptide d’ingénierie se lie au TNFR2 en tant que monomère avec une CI50 dans un essai de liaison en concurrence avec le TNFR2 de 1 uM ou moins, d'environ 100 nM ou moins, d'environ 40 nM ou moins, d’environ 20 nM ou moins, d’environ 10 nM ou moins, d’environ 1 nM ou moins, ou d’environ 0,1 nM ou moins.39. An engineered polypeptide or fusion protein according to any of clauses 1 to 38, wherein the engineered polypeptide binds to TNFR2 as a monomer with an IC50 in a competitive binding assay with TNFR2 of 1 uM or less, about 100 nM or less, about 40 nM or less, about 20 nM or less, about 10 nM or less, about 1 nM or less, or about 0.1 nM or less.
40. Polypeptide d’ingénierie ou protéine de fusion selon l'une quelconque des clauses 1 à 39, dans lequel/laquelle le TNFR2 est un TNFR2 de mammifère.40. An engineered polypeptide or fusion protein according to any of clauses 1 to 39, wherein the TNFR2 is a mammalian TNFR2.
41. Polypeptide d’ingénierie ou protéine de fusion selon la clause 40, dans lequel/laquelle le TNFR2 est un TNFR2 humain.41. An engineered polypeptide or fusion protein according to clause 40, wherein the TNFR2 is a human TNFR2.
42. Polypeptide d’ingénierie ou protéine de fusion selon la clause 40, dans lequel/laquelle le TNFR2 est un TNFR2 de souris.42. An engineered polypeptide or fusion protein according to clause 40, wherein the TNFR2 is a mouse TNFR2.
43. Polypeptide d’ingénierie ou protéine de fusion selon la clause 34, dans lequel le groupement d'extension de demi-vie est sélectionné dans le groupe constitué des SEQ ID NO : 471-477.43. An engineered polypeptide or fusion protein according to clause 34, wherein the half-life extension moiety is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 471-477.
44. Polynucléotide ou ensemble de polynucléotides codant pour le polypeptide d’ingénierie ou la protéine de fusion selon l'une quelconque des clauses 1 à 43.44. Polynucleotide or set of polynucleotides encoding the engineered polypeptide or fusion protein according to any of clauses 1 to 43.
45. Polynucléotide ou ensemble de polynucléotides selon la clause 44, comprenant une séquence d'acide nucléique ayant au moins 80 %, au moins 90 %, au moins 95 ou au moins 98 % d'identité avec une séquence sélectionnée dans le groupe constitué des SEQ ID NO : 297, 302, 304, 307, 308, 315, 316, 320, 324, 332, 345, 356, 358, 364, 366, 373, 380, 381, 389 et 290, où la séquence exclut optionnellement les nucléotides codant pour un ou plus des vingt-et-un résidus carboxy terminaux.45. A polynucleotide or set of polynucleotides according to clause 44, comprising a nucleic acid sequence having at least 80%, at least 90%, at least 95% or at least 98% identity with a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 297, 302, 304, 307, 308, 315, 316, 320, 324, 332, 345, 356, 358, 364, 366, 373, 380, 381, 389 and 290, wherein the sequence optionally excludes nucleotides encoding one or more of the twenty-one carboxy terminal residues.
46. Véhicule de distribution comprenant le polynucléotide de l’une des clauses 44 ou 45.46. Delivery vehicle comprising the polynucleotide of one of clauses 44 or 45.
47. Véhicule de distribution selon la clause 46, qui est un véhicule de distribution viral.47. Delivery vehicle as per clause 46, which is a viral distribution vehicle.
48. Véhicule de distribution selon la clause 47, dans lequel le véhicule de distribution viral est un vecteur adénoviral, un vecteur rétroviral, un vecteur lentiviral ou un vecteur viral adéno-associé (AAV).48. Delivery vehicle according to clause 47, wherein the viral delivery vehicle is an adenoviral vector, a retroviral vector, a lentiviral vector or an adeno-associated viral (AAV) vector.
49. Véhicule de distribution selon la clause 46, qui est un véhicule de distribution non viral.49. Delivery vehicle as per clause 46, which is a non-viral delivery vehicle.
50. Véhicule de distribution selon la clause 49, dans lequel le véhicule de distribution non viral est un liposome ou une nanoparticule lipidique.50. Delivery vehicle according to clause 49, wherein the non-viral delivery vehicle is a liposome or a lipid nanoparticle.
51. Plasmide ou minicercle comprenant le polynucléotide selon l'une quelconque des clauses 44 à 50.51. Plasmid or minicircle comprising the polynucleotide according to any one of clauses 44 to 50.
52. ARN messager (ARNm) comprenant un cadre de lecture ouvert codant pour le polypeptide d’ingénierie selon l'une quelconque des clauses 1 à 43.52. Messenger RNA (mRNA) comprising an open reading frame encoding the engineered polypeptide according to any of clauses 1 to 43.
53. L'ARNm selon la clause 52 comprenant en outre un cadre de lecture ouvert codant pour une liaison aux cellules immunitaires.53. The mRNA according to clause 52 further comprising an open reading frame encoding binding to immune cells.
54. Nanoparticule lipidique, optionnellement nanoparticule lipidique cationique, comprenant l'ARNm selon la clause 52 ou 53.54. Lipid nanoparticle, optionally cationic lipid nanoparticle, comprising mRNA according to clause 52 or 53.
55. Nanoparticule lipidique selon la clause 54, dans laquelle la nanoparticule lipidique est une nanoparticule lipidique cationique.55. A lipid nanoparticle according to clause 54, wherein the lipid nanoparticle is a cationic lipid nanoparticle.
56. Composition pharmaceutique comprenant le polypeptide d’ingénierie, la protéine de fusion ou le véhicule de distribution selon l'une quelconque des clauses 1 à 50, et optionnellement un excipient pharmaceutiquement acceptable.56. A pharmaceutical composition comprising the engineered polypeptide, fusion protein or delivery vehicle according to any one of clauses 1 to 50, and optionally a pharmaceutically acceptable excipient.
57. Conjugué comprenant le polypeptide d’ingénierie ou la protéine de fusion selon l’une quelconque des clauses 1 à 43 liée à un groupement pharmacologiquement actif.57. A conjugate comprising the engineered polypeptide or fusion protein according to any one of clauses 1 to 43 linked to a pharmacologically active moiety.
58. Procédé comprenant l'administration à un sujet de la composition pharmaceutique selon la clause 56.58. A method comprising administering to a subject the pharmaceutical composition according to clause 56.
59. Le procédé de la clause 58 où le sujet souffre du lupus érythermatose disséminé (LES), de la néphrite lupique (par ex. la néphrite lupique d’origine médicamenteuse), de la thrombocytopénie immunitaire (ITP), de la polyarthrite rhumatoïde (PR), de la sclérose en plaques (SEP), des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) (par ex. la maladie de Crohn et la colite/colite ulcéreuse), de la maladie du greffon contre l'hôte (GvHD) (liée aux transplantations de cellules souches) également appelée rejet d'allogreffe, de la transplantation/Transplantation d'Organe Solide (SOT), de la cholangite biliaire primitive (CBP), du psoriasis, de l’arthrite psoriasique, de l’arthrite induite par le collagène, de l’encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE), de l’ovarite, de la rhinite allergique, de l’asthme, du syndrome de Sjogren, de l’eczéma atopique, de la myasthénie, de la maladie de Basedow, de la glomérulosclérose ou du cancer.59. The procedure of clause 58 where the subject suffers from systemic lupus erythematosis (SLE), lupus nephritis (e.g. drug-induced lupus nephritis), immune thrombocytopenia (ITP), rheumatoid arthritis (RA), multiple sclerosis (MS), chronic inflammatory bowel disease (IBD) (e.g. Crohn’s disease and colitis/ulcerative colitis), graft versus host disease (GvHD) (related to stem cell transplants) also known as allograft rejection, solid organ transplantation/transplantation (SOT), primary biliary cholangitis (PBC), psoriasis, psoriatic arthritis, collagen-induced arthritis, experimental allergic encephalomyelitis (EAE), oophoritis, allergic rhinitis, asthma, Sjogren's syndrome, atopic eczema, myasthenia gravis, Graves' disease, glomerulosclerosis or cancer.
60. Polypeptide d’ingénierie, protéine de fusion ou véhicule de distribution selon l'une quelconque des clauses 1 à 50 pour utilisation en tant que médicament.60. Engineered polypeptide, fusion protein or delivery vehicle according to any of clauses 1 to 50 for use as a medicament.
61. Le polypeptide d’ingénierie, la protéine de fusion ou le véhicule de distribution de la clause 60 pour utilisation dans le traitement du lupus érythermatose disséminé (LES), de la néphrite lupique (par ex. la néphrite lupique d’origine médicamenteuse), de la thrombocytopénie immunitaire (ITP), de la polyarthrite rhumatoïde (PR), de la sclérose en plaques (SEP), des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) (par ex. la maladie de Crohn et la colite/colite ulcéreuse), de la maladie du greffon contre l'hôte (GvHD) (liée aux transplantations de cellules souches) également appelée rejet d'allogreffe, de la transplantation/Transplantation d'Organe Solide (SOT), de la cholangite biliaire primitive (CBP), du psoriasis, de l’arthrite psoriasique, de l’arthrite induite par le collagène, de l’encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE), de l’ovarite, de la rhinite allergique, de l’asthme, du syndrome de Sjogren, de l’eczéma atopique, de la myasthénie, de la maladie de Basedow, de la glomérulosclérose ou du cancer.61. The engineered polypeptide, fusion protein or delivery vehicle of clause 60 for use in the treatment of systemic lupus erythematosis (SLE), lupus nephritis (e.g. drug-induced lupus nephritis), immune thrombocytopenia (ITP), rheumatoid arthritis (RA), multiple sclerosis (MS), inflammatory bowel disease (IBD) (e.g. Crohn's disease and colitis/ulcerative colitis), graft-versus-host disease (GvHD) (related to stem cell transplantation) also known as allograft rejection, solid organ transplantation/transplantation (SOT), primary biliary cholangitis (PBC), psoriasis, psoriatic arthritis, collagen-induced arthritis, experimental allergic encephalomyelitis (EAE), oophoritis, allergic rhinitis, asthma, Sjogren's syndrome, atopic eczema, myasthenia gravis, Graves' disease, glomerulosclerosis or cancer.
62. Utilisation du polypeptide d’ingénierie, de la protéine de fusion ou du véhicule de distribution selon l’une quelconque des clauses 1 à 50 dans la fabrication d’un médicament pour le traitement du lupus érythermatose disséminé (LES), de la néphrite lupique (par ex. la néphrite lupique d’origine médicamenteuse), de la thrombocytopénie immunitaire (ITP), de la polyarthrite rhumatoïde (PR), de la sclérose en plaques (SEP), des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) (par ex. la maladie de Crohn et la colite/colite ulcéreuse), de la maladie du greffon contre l'hôte (GvHD) (liée aux transplantations de cellules souches) également appelée rejet d'allogreffe, de la transplantation/Transplantation d'Organe Solide (SOT), de la cholangite biliaire primitive (CBP), du psoriasis, de l’arthrite psoriasique, de l’arthrite induite par le collagène, de l’encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE), de l’ovarite, de la rhinite allergique, de l’asthme, du syndrome de Sjogren, de l’eczéma atopique, de la myasthénie, de la maladie de Basedow, de la glomérulosclérose ou du cancer.62. Use of the engineered polypeptide, fusion protein or delivery vehicle according to any of clauses 1 to 50 in the manufacture of a medicament for the treatment of systemic lupus erythematosis (SLE), lupus nephritis (e.g. drug-induced lupus nephritis), immune thrombocytopenia (ITP), rheumatoid arthritis (RA), multiple sclerosis (MS), chronic inflammatory bowel diseases (IBD) (e.g. Crohn's disease and colitis/ulcerative colitis), graft-versus-host disease (GvHD) (related to stem cell transplantation) also known as allograft rejection, solid organ transplantation/transplantation (SOT), primary biliary cholangitis (PBC), psoriasis, psoriatic arthritis, erythema multiforme (EPM)-induced arthritis, collagen, experimental allergic encephalomyelitis (EAE), oophoritis, allergic rhinitis, asthma, Sjogren's syndrome, atopic eczema, myasthenia gravis, Graves' disease, glomerulosclerosis or cancer.
63. Polypeptide d’ingénierie qui entre en concurrence pour la liaison au TNFR2 avec un polypeptide d’ingénierie selon l'une quelconque des clauses 1 à 43.63. An engineered polypeptide that competes for binding to TNFR2 with an engineered polypeptide according to any of clauses 1 to 43.
64. Polypeptide d’ingénierie qui se lie au même épitope sur TNFR2 que celui d'un polypeptide d’ingénierie selon l'une quelconque des clauses 1 à 43.64. An engineered polypeptide that binds to the same epitope on TNFR2 as an engineered polypeptide according to any of clauses 1 to 43.
65. Polypeptide d’ingénierie ou protéine de fusion selon l'une quelconque des clauses 1 à 64 qui comprend une séquence signal et/ou un domaine transmembranaire.65. An engineered polypeptide or fusion protein according to any one of clauses 1 to 64 which comprises a signal sequence and/or a transmembrane domain.
Le but de ces expériences a été d'identifier des polypeptides AFFIMER® agonistes spécifiques des TFNR2 humain et de souris.The aim of these experiments was to identify AFFIMER® polypeptides that are specific agonists of human and mouse TFNR2.
Exemple 1. Sélection de polypeptides AFFIMER® de liaison au TNFR2 à partir d’une bibliothèque d’exposition sur phagesExample 1. Selection of TNFR2-binding AFFIMER® polypeptides from a phage display library
Identification de clones candidatsIdentification of candidate clones
Les polypeptides TNFR2 AFFIMER® de la présente invention ont été identifiés par sélection à partir d'une bibliothèque de polypeptides AFFIMER® avec deux séquences de boucles aléatoires, chaque boucle ayant une longueur d'environ 9 acides aminés affichée dans un squelette de charpente polypeptidique AFFIMER® constant basé sur la séquence d'acides aminés de la Stéfine A. De telles procédures de sélection ont été décrites (voir, par ex. Tiede et al. Protein Eng Des Sel. 2014. 27(5): 145–155 et Hughes et al. Sci Signal. 2018. 10(505): eaaj2005). Selon de telles procédures, des suspensions de phages exprimant des protéines AFFIMER® ont été incubées avec du TNFR2 humain (ou de souris dans des expériences ultérieures) selon les besoins, les séquences desquelles étant présentées dans le Tableau 7.The AFFIMER® TNFR2 polypeptides of the present invention were identified by screening from an AFFIMER® polypeptide library with two random loop sequences, each loop having a length of about 9 amino acids displayed in a constant AFFIMER® polypeptide framework backbone based on the amino acid sequence of Stefin A. Such screening procedures have been described (see, e.g., Tiede et al. Protein Eng Des Sel. 2014. 27(5): 145–155 and Hughes et al. Sci Signal. 2018. 10(505): eaaj2005). According to such procedures, phage suspensions expressing AFFIMER® proteins were incubated with human (or mouse in subsequent experiments) TNFR2 as needed, the sequences of which are shown in Table 7.
Tableau 7. Séquences de protéines TNFR utilisées lors de la sélection (de Sino Biologicals).
Tableau 8. Antigènes commerciaux utilisés lors de la sélection. Les antigènes TNFR2 ayant les séquences présentées dans le Tableau 7 ainsi que d'autres protéines présentées ci-dessous ont été testés dans différents formats pour biotinylation et utilisation dans la sélection TNFR2 AFFIMER® et d'autres essais.
Dans certains cas, le TNFR2 a été biotinylé et capturé sur des billes de streptavidine et de neutravidine en alternance, alternativement le TNFR2 a été passivement absorbé par une surface. Les particules de phage non liées ont ensuite été enlevées par lavage et, en suite du lavage, le phage lié ont été élués. L'élution du phage lié a été accomplie par i exposition à la trypsine. Les particules de phage élués ont ensuite été utilisées pour infecter Escherichia coli (E. coli) et les bactéries infectées ont été incubées dans des conditions adaptées à la réplication du bactériophage. Après libération de particules de bactériophage par ces bactéries infectées, le cycle consistant à permettre aux particules de phage de se lier à l'antigène cible, à éluer les particules de phage liées, à propager les particules de phage éluées dans les bactéries, et à isoler les particules de phage libérées des bactéries infectées a été répété pour enrichir la population de bactériophages pour les particules de phage présentant des protéines qui se lient à l'antigène cible. Des conditions spécifiques ont été modifiées dans ces cycles, telles que l'augmentation du nombre d'étapes de lavage, la réduction de la quantité d'antigène disponible ou l'ajout d'un réactif de blocage, pour sélectionner des particules de phage exhibant des protéines qui se lient plus étroitement ou spécifiquement à l'antigène cible.In some cases, TNFR2 was biotinylated and captured on streptavidin and neutravidin beads alternately, alternatively TNFR2 was passively absorbed to a surface. Unbound phage particles were then removed by washing, and following washing, bound phage were eluted. Elution of bound phage was accomplished by exposure to trypsin. The eluted phage particles were then used to infect Escherichia coli (E. coli) and the infected bacteria were incubated under conditions suitable for bacteriophage replication. After release of bacteriophage particles from these infected bacteria, the cycle of allowing the phage particles to bind to the target antigen, eluting the bound phage particles, propagating the eluted phage particles in the bacteria, and isolating the released phage particles from the infected bacteria was repeated to enrich the bacteriophage population for phage particles displaying proteins that bind to the target antigen. Specific conditions were modified in these cycles, such as increasing the number of wash steps, reducing the amount of available antigen, or adding a blocking reagent, to select for phage particles displaying proteins that bind more tightly or specifically to the target antigen.
Après de multiples tours de sélection et d'amplification de la bibliothèque d'exposition sur phages (de l’anglais « phage display library », les protéines exprimées par les phages ont été exprimées et criblées par dosage immuno-enzymatique (ELISA, de l’anglais « enzyme-linked immunosorbent assay »). En bref, les polypeptides AFFIMER® ont été surexprimés à partir de vecteurs phagémides, les cellules bactériennes ont été lysées, et les lysats ont été utilisés comme substrats dans les ELISA. Dans ces ELISA, du TNFR2 humain, murin et de cynomolgus a été immobilisé sur une plaque, des lysats ont été ajoutés, et la quantité de polypeptide AFFIMER® se liant au TNFR2 dans chaque plaque a été mesurée à l'aide d'un anticorps détecteur spécifique de l'étiquette Myc exprimée sur les polypeptides AFFIMER® candidats. Les vecteurs phagémides codant pour les polypeptides AFFIMER® avec la meilleure activité de liaison au TNFR2 humain ont été séquencés pour identifier les séquences d'ADN des clones candidats pour un développement ultérieur. Des polypeptides TNFR1 ont également été utilisés pour distinguer la spécificité. Les séquences d'acides aminés de la boucle 2 et de la boucle 4 de chacun de ces clones candidats sont présentées dans le tableau 1.After multiple rounds of phage display library selection and amplification, proteins expressed by the phages were expressed and screened by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Briefly, AFFIMER® polypeptides were overexpressed from phagemid vectors, bacterial cells were lysed, and the lysates were used as substrates in the ELISAs. In these ELISAs, human, murine, and cynomolgus TNFR2 were immobilized on a plate, lysates were added, and the amount of AFFIMER® polypeptide binding to TNFR2 in each plate was measured using a detector antibody specific for the Myc tag expressed on the candidate AFFIMER® polypeptides. The phagemid vectors encoding the AFFIMER® polypeptides were AFFIMER® with the best binding activity to human TNFR2 were sequenced to identify the DNA sequences of candidate clones for further development. TNFR1 polypeptides were also used to distinguish specificity. The amino acid sequences of loop 2 and loop 4 of each of these candidate clones are shown in Table 1.
EXEMPLE 2 : Production d'AFFIMER® dans des cellules de mammifères en tant que protéine soluble et criblageEXAMPLE 2: Production of AFFIMER® in mammalian cells as a soluble protein and screening
Clonage dans un vecteur d'intérêtCloning into a vector of interest
Pour apprécier la capacité des protéines AFFIMER® sélectionnées à se lier au TNFR2 lorsqu'elles sont exprimées à la surface d'une cellule de mammifère, des groupes de cellules transfectées de manière transitoire ont été générés pour 30 clones « accélérés » (en anglais « fast-tracked ») sur la base des séquences les plus répétées lors de la sélection passive. Ces clones ont été utilisés pour la caractérisation initiale et l'optimisation de l’essai. Les séquences TNFR2 AFFIMER® et les cibles TNFR2 ont été clonées à partir du phagémide de l'Exemple 1 dans le vecteur d'expression de mammifère pD609kanR (vecteur personnalisé ATUM) pour expression dans des cellules Expi293F™ (ThermoFisher). La concentration moyenne obtenue à partir de l'expression a été de 2,8 mg/mL, avec 19 clones sélectionnés en fonction de leur pureté et jaugés par pour dégradation.To assess the ability of the selected AFFIMER® proteins to bind to TNFR2 when expressed on the surface of a mammalian cell, transiently transfected cell pools were generated for 30 “fast-tracked” clones based on the most repeated sequences during passive selection. These clones were used for initial characterization and optimization of the assay. The AFFIMER® TNFR2 sequences and TNFR2 targets were cloned from the phagemid of Example 1 into the mammalian expression vector pD609kanR (ATUM custom vector) for expression in Expi293F™ cells (ThermoFisher). The average concentration obtained from expression was 2.8 mg/mL, with 19 clones selected for purity and assayed for degradation.
Ces 19 clones ont été criblés sur des cellules exprimant Expi293F™hTNFR2 par cytométrie en flux à 1 µM et 0,1 µM tout en étant comparés aux témoins négatifs SQT-GLY et 3T0-GLY qui contiennent des glycines uniquement dans la Boucles 2 et la Boucles 4 et ne sont donc pas des liants spécifiques. Le signal détecté sur les cellules transfectées a été soustrait du signal obtenu sur les cellules Expi293F™ non transfectées. Parmi ceux-ci, 16 clones démontrent une liaison aux cellules hTNFR2-Expi293F™ à 1 µM > 10 % qu’une liaison à la lignée cellulaire parentale ait été soustraite. Les clones 15, 22 et 23 n'ont pas démontré de telle liaison (
Les protéines AFFIMER® purifiées de mammifère hTNFR2 ont été criblées dans l’essai rapporteur HEK Blue™ TNFα SEAP (Invivogen) selon les instructions du fabricant pour déterminer si elles pouvaient déclencher la voie NFkB et la production de SEAP (phosphatase alcaline embryonnaire sécrétée, de l’anglais « Secreted embryonic alkaline phosphatase ») via une liaison au TNFR2 lorsqu'elles sont regroupées (de l’anglais « clustered ») par un anticorps anti-his enduit sur la plaque. Dans cette expérience, 5 des clones accélérés (01, 09, 12, 21 et 26) ont démontré une capacité à déclencher la libération de SEAP, le clone 12 montrant l'agonisme le plus cohérent.Purified AFFIMER® mammalian hTNFR2 proteins were screened in the HEK Blue™ TNFα SEAP reporter assay (Invivogen) according to the manufacturer’s instructions to determine whether they could trigger the NFkB pathway and SEAP (Secreted embryonic alkaline phosphatase) production via binding to TNFR2 when clustered by an anti-His antibody coated on the plate. In this experiment, 5 of the accelerated clones (01, 09, 12, 21, and 26) demonstrated the ability to trigger SEAP release, with clone 12 showing the most consistent agonism.
90 autres polypeptides AFFIMER® ont été clonés à partir du phagémide et caractérisés de manière similaire. 55 clones ont été repris et la liaison confirmée par analyse Mirrorball. Une caractérisation plus poussée a été effectuée par ELSA en concurrence pour tester leur capacité à bloquer l'interaction entre hTNFR2-hFc-his-avi et le TNF-alpha recombinant. Une série d'expériences a été réalisée pour déterminer l'EC80 de hTNFR2-hFc-his-Avi lors de la liaison au hTNF alpha enrobé (593 pM). Les protéines AFFIMER® ont été testées à trois concentrations différentes (10, 1 et 0,1 µM) lorsque cela était possible, en présence de l'antigène hTNFR2 à sa CE80 déterminée. La détection de hTNFR2-hFc-his-Avi lié a été effectuée par l’anticorps anti-hFc-HRP. Parmi les 75 clones testés, 32 clones, qui ont montré un % d'inhibition supérieur à 65 % à 10 µM, ont été sélectionnés pour être caractérisés davantage afin de déterminer leur CI50 (
A ce stade, ces 55 clones ainsi que les 14 clones du groupe accéléré (13 agonistes, un négatif, clone 06) ont été clonés dans le vecteur pDisplay (Thermo Fisher). Ce vecteur contient un domaine transmembranaire de protéine PDGFR en C-term pour permettre l'expression d'Affiner à la surface des cellules d'expression et en tant que protéines solubles. Des étiquettes supplémentaires telles que HA en N-term sont également codées par ce vecteur permettant une vérification facile de l'expression d’Affimer. Une fois clonées, ces Affimer ont été transfectées de manière transitoire dans des cellules Expi293F™ pour une analyse SEAP comme décrit précédemment. En prenant toutes les données ensemble, 43 clones ont été sélectionnés pour une caractérisation supplémentaire.At this stage, these 55 clones as well as the 14 clones from the accelerated group (13 agonists, one negative, clone 06) were cloned into the pDisplay vector (Thermo Fisher). This vector contains a PDGFR protein transmembrane domain in C-term to allow Affimer expression on the surface of the expression cells and as soluble proteins. Additional tags such as HA in N-term are also encoded by this vector allowing easy verification of Affimer expression. Once cloned, these Affimers were transiently transfected into Expi293F™ cells for SEAP analysis as previously described. Taking all the data together, 43 clones were selected for further characterization.
EXEMPLE 3 : Caractérisation de 43 clones sélectionnésEXAMPLE 3: Characterization of 43 selected clones
Essai BiacoreBiacore Test
Les 43 clones sélectionnés ont été testés dans une analyse cinétique Biacore en tant que protéines solubles. En bref, des cinétiques multicycles ont été réalisées à l'aide d'une puce CM5 sur laquelle l'antigène dimérique hTNFR2-hFc-his-avi a été immobilisé à 500RU. Les protéines AFFIMER® ont été titrées à la baisse (de l’anglais « downtitrated ») dans un tampon HBS-EP+ à partir de 1 µM dans une série de dilutions à 1:2. Le temps d'association et la dissociation utilisés étaient respectivement de 200 s et 400 s à un débit de 20 µl/min avec une régénération avec 10 mM de glycine à pH 1,5 pendant 30 s à 30 µl/min. Douze clones ont montré une réponse très faible et aucune valeur KD n'a pu être estimée pour ceux-ci. Le clone 09 a été ajusté à l'aide du modèle de liaison à 1:1, cependant, la valeur KD rapportée était trop élevée (>E-05) pour être fiable avec la plage de concentration utilisée. Pour 16 clones, le signal atteint était adéquat et ils ont pu être ajustés avec succès en utilisant le modèle de liaison à 1:1, la courbe et leur ajustement sont compilés. Deux clones (21 et 69) qui sont des dimères ont été ajustés en utilisant à la fois le modèle de liaison à 1:1 et un état d'équilibre afin d'estimer leur KD, tandis que dans 12 clones, un faible Rmax a rendu difficile leur ajustement en utilisant le modèle de liaison à 1:1 et le modèle d'état d’équilibre (en anglais « Steady State ») a été utilisé à la place. Dans ce cas, la valeur KD obtenue n'a pas été rapportée ; à la place, un ordre de grandeur l'a été. Les résultats sont présentés en
Réactivité croisée ELISA de liaisonELISA cross-reactivity of binding
La spécificité des clones TNFR2 AFFIMER® pour hTNFR2 a été appréciée par ELISA lorsque les clones se liant au TNFR2 ont été comparés à leur liaison au TNFR1. Aucun des clones n'a montré de liaison au TNFR1 en tant qu'antigène recombinant. hTNFR1 a également été exprimé dans des cellules Expi293F™, et aucune liaison n'a été observée à ce hTNFR1 exprimé de manière cellulaire, confirmant l'absence de réactivité croisée entre les liants polypeptidiques hTNFR2 AFFIMER® avec hTNFR1.The specificity of the TNFR2 AFFIMER® clones for hTNFR2 was assessed by ELISA when the clones binding to TNFR2 were compared to their binding to TNFR1. None of the clones showed binding to TNFR1 as a recombinant antigen. hTNFR1 was also expressed in Expi293F™ cells, and no binding was observed to this cellularly expressed hTNFR1, confirming the absence of cross-reactivity between the hTNFR2 AFFIMER® polypeptide binders with hTNFR1.
En plus de leur liaison au TNFR2 humain, la liaison des clones au TNFR2 de souris a également été testée pour vérifier si l'un d'entre eux présentait une réaction croisée. Il y avait très peu de chances que cela se produise car l'homologie entre les deux protéines est d'environ 68 % pour le domaine extracellulaire, ce qui a été confirmé car aucun clone n'a démontré de liaison aux cellules Expi293F™ exprimant mTNFR2.In addition to their binding to human TNFR2, the binding of the clones to mouse TNFR2 was also tested to see if any of them were cross-reactive. This was very unlikely to occur as the homology between the two proteins is approximately 68% for the extracellular domain, which was confirmed as no clones demonstrated binding to Expi293F™ cells expressing mTNFR2.
HEK293 – Caractérisation par essai HEK BlueHEK293 – Characterization by HEK Blue test
Les 43 clones principaux ont été transfectés de manière transitoire dans des cellules HEK 293, ainsi que 4 témoins, SQT-Gly, 3t0-Gly, Vecteur vide et le clone 06 qui s'est révélé être négatif. Environ 29h après la transfection, la viabilité des cellules a été déterminée en utilisant un compteur de cellules, et l'expression de l'AFFIMER® a été déterminée par cytométrie en flux en utilisant un anticorps anti-HA. 48 heures après la transfection, les cellules HEK293 exprimant AFFIMER® ont été cocultivées avec des cellules rapporteuses HEK Blue à 4 densités cellulaires différentes, 40000, 20000, 10000 et 5000 avec un nombre fixe de cellules HEK Blue de 50 000 cellules/puits. En parallèle, le contrôle positif MR2-1 a également été incubé avec des cellules HEK Blue pendant 24h sur une plage de concentrations. Après 24h, la libération de SEAP dans le surnageant a été quantifiée en utilisant Quanti-Blue et une mesure d'absorbance 640 nm. La coloration des AFFIMER® avec un anticorps monoclonal anti-HA a montré des niveaux d'expression > 90 % dans chacune des deux expériences. Dans l’essai rapporteur de coculture, l'effet des protéines TNFR2 AFFIMER® exhibées sur HEK293 sur les cellules HEK-Blue était visible, ainsi que l'effet du clone MR2-1, permettant la sélection de 16 clones qui ont été classés de manière cohérente parmi les 20 meilleurs clones dans chacune des deux expériences. Ces résultats sont compilés en
Liaison cellulaire au TNFR2 humain et de cynomolgusCellular binding to human and cynomolgus TNFR2
Les 16 meilleurs agonistes ont été caractérisés en format soluble pour leur liaison au TNFR2 humain surexprimant Expi293F™ et au TNFR2 de cynomolgus surexprimant Expi293F. L'expérience a été répétée 3 fois et 2 lots différents de cellules transfectées de manière transitoire ont été utilisés. Tous les clones ont montré une liaison spécifique cohérent aux cellules hTNFR2-Expi293F™. Les clones 26 et 69 ont montré les meilleures CE50 sur à la fois les cellules exprimant TNFR2 humaines et de cynomolgus. 13 des 16 clones testés montrent une réactivité croisée avec le TNFR2 de cynomolgus. Les 3 clones sans réactivité croisée étaient les clones 001, 007 et 009. Sans nécessairement être les meilleurs liants, les clones DAW02-013, DAW02-044 et DAW02-112 sont les clones avec le moins de différence entre la liaison aux cellules surexprimant le TNFR2 humain et le TNFR2 de cynomolgus lorsque les 3 expériences sont compilées (
EXEMPLE 4. Constructions d'homodimères de fusion en ligneEXAMPLE 4. In-line fusion homodimer constructions
Les clones 001, 009 et 012 ont été choisis pour être formatés en tant qu'homodimères de fusion en ligne (ILF, de l’anglais « in-line fusion »), afin de déterminer si ce format serait un avantage pour déclencher un agonisme par rapport à la forme monomérique des clones, en tant que protéine soluble et lorsqu'il est affiché sur les cellules. Deux constructions ont été utilisées pour la génération des homodimères ILF avec un lieur flexible, un codon optimisé pour une expression de mammifère et un codon non optimisé. Les deux constructions ont été clonées dans un vecteur de sécrétion de mammifère (pD609-KanR) pour purifier la protéine recombinante et apprécier leurs niveaux d'expression, la qualité de la protéine, la cinétique de liaison à hTNFR2-hFc-his-avi par Biacore et l'activité agoniste dans un essai à rapporteur (en anglais, « reporter assay ») avec des cellules rapporteuses HEK. De plus, les deux constructions ont été clonées dans le vecteur pDisplay pour leur expression sur la surface cellulaire Expi293F™ et l'appréciation de leurs niveaux d'expression, de la liaison à hTNFR2-hFc-his-avi et de l'activité agoniste dans un essai à rapporteur de coculture avec des cellules rapporteuses HEK. L'optimisation des codons n'a pas amélioré les rendements ou la pureté des homodimères ILF solubles, ce qui a été confirmé par HPLC.Clones 001, 009, and 012 were selected to be formatted as in-line fusion (ILF) homodimers to determine whether this format would be an advantage for eliciting agonism over the monomeric form of the clones, both as a soluble protein and when displayed on cells. Two constructs were used for the generation of ILF homodimers with a flexible linker, a codon optimized for mammalian expression, and a non-optimized codon. Both constructs were cloned into a mammalian secretion vector (pD609-KanR) to purify the recombinant protein and assess their expression levels, protein quality, hTNFR2-hFc-his-avi binding kinetics by Biacore, and agonist activity in a reporter assay with HEK reporter cells. In addition, both constructs were cloned into the pDisplay vector for expression on the Expi293F™ cell surface and assessment of their expression levels, binding to hTNFR2-hFc-his-avi and agonist activity in a coculture reporter assay with HEK reporter cells. Codon optimization did not improve the yields or purity of soluble ILF homodimers, which was confirmed by HPLC.
Lorsqu'ils ont été analysés par Biacore, les clones 001 et 009 ont montré une affinité accrue dans leur format ILF soluble par rapport au format monomère soluble. Le Clone 12 n'a montré aucune réponse. Aucune différence n'a été observée entre les constructions d'optimisation des codons. Dans les essais SEAP, seul le clone 12 a montré un profil amélioré en tant que format ILF soluble, mais lorsqu'il est exhibé sur des cellules, dans les essais SEAP ainsi que dans les essais de présentation par cytométrie en flux, aucune différence n'a pu être déterminée entre les formats ILF et monomère.When analyzed by Biacore, clones 001 and 009 showed increased affinity in their soluble ILF format compared to the soluble monomeric format. Clone 12 showed no response. No differences were observed between the codon optimization constructs. In SEAP assays, only clone 12 showed an improved profile as a soluble ILF format, but when displayed on cells, in both SEAP assays and flow cytometric display assays, no differences could be determined between the ILF and monomeric formats.
Résumé de la sélection du polypeptide hTNFR2 AFFIMER® et caractérisation.Summary of hTNFR2 AFFIMER® polypeptide selection and characterization.
Plus de 2500 phages monoclonaux ont été criblés par ELISA sur phages avec un taux de succès supérieur à 60% avec une bonne diversité (20-40%). Lors du criblage dans l’ELISA sous forme d'extrait brut de cellules, plus de 400 clones ont montré une liaison à l'antigène hTNFR2. A ce stade, il a été décidé d'introduire une autre étape dans la campagne de criblage de sélection pour réduire le nombre de clones à cloner dans le vecteur d'expression de mammifère. En parallèle, il a également été décidé d'accélérer 30 clones de la sélection passive directement à l'expression en tant que protéines AFFIMER® solubles pour faciliter le développement d’essais et la construction de la cascade de criblage pour le reste des clones. 20 de ces clones ont passé les critères de qualité de production de protéines de plus de 80% de pureté par SEC-HPLC (de l’anglais « size exclusion chromatography - high performance liquid chromatography », soit « chromatographie d'exclusion stérique - chromatographie liquide à haute performance ») et ont été utilisés pour mettre en place différents essais ainsi que pour être caractérisés. 5 clones sur 20 ont démontré une activité agoniste dans un essai agoniste préliminaire où la protéine AFFIMER® soluble monomère a été regroupée avec un anticorps anti-his via leur étiquette histidine et incubée avec la lignée cellulaire rapporteuse HEK.More than 2500 monoclonal phages were screened by phage ELISA with a success rate of over 60% with good diversity (20-40%). When screened in the ELISA as crude cell extract, more than 400 clones showed binding to the hTNFR2 antigen. At this stage, it was decided to introduce another step in the selection screening campaign to reduce the number of clones to be cloned into the mammalian expression vector. In parallel, it was also decided to accelerate 30 clones from passive selection directly to expression as soluble AFFIMER® proteins to facilitate assay development and construction of the screening cascade for the remaining clones. 20 of these clones passed the quality criteria of protein production of more than 80% purity by SEC-HPLC (size exclusion chromatography - high performance liquid chromatography) and were used to set up different assays as well as to be characterized. 5 clones out of 20 demonstrated agonist activity in a preliminary agonist assay where the monomeric soluble AFFIMER® protein was pooled with an anti-his antibody via their histidine tag and incubated with the HEK reporter cell line.
Parallèlement au développement d’essais avec des clones accélérés, la campagne de criblage de phages a été finalisée et un total de 364 protéines humaines AFFIMER® se liant au TNFR2 ont été purifiées à partir du phagémide et leur liaison à une lignée cellulaire surexprimant le TNFR2 a été testée. A la suite de cet essai, 90 protéines AFFIMER® humaines se liant au TNFR2 ont été reformatées dans le vecteur d'expression de mammifère. 55 de ces clones ont passé les critères de qualité de production de protéines de plus de 80% de pureté par SEC-HPLC et ont été repris pour le reste des essais.In parallel with the development of accelerated clone assays, the phage screening campaign was finalized and a total of 364 human AFFIMER® TNFR2-binding proteins were purified from the phagemid and tested for binding to a TNFR2-overexpressing cell line. Following this assay, 90 human AFFIMER® TNFR2-binding proteins were reformatted into the mammalian expression vector. 55 of these clones passed the protein production quality criteria of >80% purity by SEC-HPLC and were taken forward for the remainder of the assays.
Le nombre total de clones (accélérés et non accélérés) a été restreint de 75 à 43 à la suite d'une série d'expériences s’intéressant à la liaison des protéines solubles AFFIMER® aux cellules surexprimant hTNFR2, l’essai agoniste avec des cellules rapporteuses HEK et les données préliminaires de l’essai agoniste utilisant des cellules rapporteuses HEK en coculture avec des protéines AFFIMER® exprimées à la surface des cellules Expi293F™. Ces 43 meilleurs clones ont été caractérisés en tant que protéines solubles pour leur liaison au TNFR2 humain par Biacore où 16 sur 43 ont vu leur KD calculé avec succès en utilisant un modèle de liaison à 1:1. Aucun des clones n'a démontré de liaison au TNFR1 humain par ELISA ou au TNFR2 de souris par liaison cellulaire. En tant que protéines AFFIMER® exhibées à la surface de HEK293, la capacité de ces 43 clones à déclencher un agonisme au TNFR2 dans une lignée cellulaire rapporteuse HEK lorsqu'ils sont en coculture a été testée. Une grande majorité des clones testés ont démontré un effet dépendant de la dose sur les cellules rapporteuses HEK (80%). 16 protéines AFFIMER® ont été sélectionnées comme meilleures agonistes et soumises à une caractérisation supplémentaire pour apprécier la liaison du TNFR2 de cynomolgus et la liaison du TNFR1 humain sur les cellules. Les 16 polypeptides hTNFR2 AFFIMER® sélectionnés sont les clones 001, 007, 009, 012, 013, 026, 027, 037, 044, 059, 069, 079, 100, 103, 112 et 115.The total number of clones (both accelerated and non-accelerated) was narrowed from 75 to 43 following a series of experiments investigating the binding of soluble AFFIMER® proteins to hTNFR2-overexpressing cells, the agonist assay with HEK reporter cells and preliminary data from the agonist assay using HEK reporter cells co-cultured with AFFIMER® proteins expressed on the surface of Expi293F™ cells. These top 43 clones were characterized as soluble proteins for their binding to human TNFR2 by Biacore where 16 out of 43 had their KD calculated successfully using a 1:1 binding model. None of the clones demonstrated binding to human TNFR1 by ELISA or mouse TNFR2 by cell binding. As AFFIMER® proteins displayed on the surface of HEK293, the ability of these 43 clones to trigger TNFR2 agonism in a HEK reporter cell line when cocultured was tested. A large majority of the clones tested demonstrated a dose-dependent effect on HEK reporter cells (80%). 16 AFFIMER® proteins were selected as the best agonists and subjected to further characterization to assess cynomolgus TNFR2 binding and human TNFR1 binding on the cells. The 16 selected AFFIMER® hTNFR2 polypeptides are clones 001, 007, 009, 012, 013, 026, 027, 037, 044, 059, 069, 079, 100, 103, 112 and 115.
L'utilisation d'homodimères de fusion en ligne en tant que protéines solubles vs. monomères a montré des avantages pour la liaison au TNFR2 recombinant par Biacore et un avantage possible dans l’essai d'agonisme de regroupement anti-his avec des cellules rapporteuses HEK. Cependant, aucun avantage n'a été démontré par rapport aux monomères lorsque les protéines AFFIMER® de fusion en ligne ont été exhibées sur des cellules pour déclencher la voie d'agonisme de la lignée cellulaire rapporteuse via TNFR2. La raison pour laquelle les homodimères de fusion en ligne n'ont pas obtenu de meilleurs résultats que les monomères dans ce dernier essai pourrait être que le format de fusion en ligne n'était pas bien exhibé sur la surface de la cellule et qu'une seule des deux protéines AFFIMER® était disponible pour la liaison ou que la limite de l’essai rapporteur avait été atteinte et qu'il n'était pas possible de discriminer entre les deux formats.The use of inline fusion homodimers as soluble proteins vs. monomers showed advantages for binding to recombinant TNFR2 by Biacore and a possible advantage in the anti-His clustering agonism assay with HEK reporter cells. However, no advantage was demonstrated over monomers when the inline fusion AFFIMER® proteins were displayed on cells to trigger the agonism pathway of the reporter cell line via TNFR2. The reason why inline fusion homodimers did not perform better than monomers in the latter assay could be that the inline fusion format was not well displayed on the cell surface and only one of the two AFFIMER® proteins was available for binding or that the limit of the reporter assay had been reached and it was not possible to discriminate between the two formats.
EXEMPLE 5. Polypeptides TNFR2 AFFIMER® de sourisEXAMPLE 5. Mouse TNFR2 AFFIMER® polypeptides
Campagne de sélection et de criblage de phagesPhage selection and screening campaign
L’aptitude d’antigènes TNFR2 murins, ayant la séquence telle que montrée dans le Tableau 7 mais dans différents formats, à être utilisés dans des essais pour sélectionner des polypeptides mTNFR2 AFFIMER® a été testée. Parmi les trois formats (mFc, hFc et étiqueté His), le mTNFR2-mFc a été choisi pour la biotinylation et l'utilisation dans les sélections AFFIMER® en raison de ses meilleures performances dans les essais.The suitability of murine TNFR2 antigens, having the sequence as shown in Table 7 but in different formats, for use in assays to select AFFIMER® mTNFR2 polypeptides was tested. Among the three formats (mFc, hFc and His-tagged), mTNFR2-mFc was chosen for biotinylation and use in AFFIMER® selections because of its better performance in the assays.
SélectionsSelections
Des sélections passives et par solution ont été effectuées sur les deux bibliothèques de phages AFFIMER® comme décrit pour la sélection d’hTNFR2 AFFIMER®. L'enrichissement a été observé lorsque la concentration en mTNFR2 a été maintenue à 10 nM au tour 3. Plus de 2000 protéines AFFIMER® présentées sur phage ont été criblées par ELISA de phages monoclonaux à partir des résultats du tour 2 et du tour 3. Parmi ces clones, plus de 900 ont démontré une liaison au mTNFR2, sans liaison non spécifique au Fc de souris détectable, au plastique, à la streptavidine ou à la neutravidine. Ceux-ci ont été définis comme des « succès » sur la base des critères d'absorbance 450nm-630nm au-dessus de 0,5 sur des plaques revêtues de mTNFR2 et en dessous de 0,05 sur des plaques revêtues d'antigènes de contrôle (c'est-à-dire Fc de souris, plastique, neutravidine). Le séquençage des succès ELISA sur phage a identifié 281 séquences de clones uniques, 109 desquels ayant démontré une liaison au mTNFR2 après ELISA sur des extraits bruts de cellules. Une analyse plus approfondie de la liaison à l'aide de cellules mTNFR2-Expi293F™ a réduit ce champ à 58 clones, identifiés comme clones 122-179 dans le Tableau 2.Passive and solution selections were performed on both AFFIMER® phage libraries as described for AFFIMER® hTNFR2 selection. Enrichment was observed when the mTNFR2 concentration was maintained at 10 nM in round 3. Over 2000 AFFIMER® phage-displayed proteins were screened by monoclonal phage ELISA from the results of round 2 and round 3. Of these clones, over 900 demonstrated binding to mTNFR2, with no detectable nonspecific binding to mouse Fc, plastic, streptavidin, or neutravidin. These were defined as “hits” based on the criteria of 450nm-630nm absorbance above 0.5 on mTNFR2-coated plates and below 0.05 on control antigen-coated plates (i.e. mouse Fc, plastic, neutravidin). Sequencing of phage ELISA hits identified 281 unique clone sequences, 109 of which demonstrated binding to mTNFR2 following ELISA on crude cell extracts. Further analysis of binding using mTNFR2-Expi293F™ cells narrowed this field to 58 clones, identified as clones 122-179 in Table 2.
Caractérisation des protéines solublesCharacterization of soluble proteins
Comme décrit pour la caractérisation du polypeptide hTNFR2 AFFIMER® ci-dessus, les polypeptides mTNFR2 AFFIMER® identifiés ont été clonés à partir de phagémides vers des vecteurs mammifères pour une expression dans des cellules Expi293F™. La pureté des protéines exprimées a ensuite été évaluée par SDS-PAGE et HPLC, et l'affinité par Biacore, ainsi que la liaison sur base cellulaire de mTNFR2 dans les cellules mTNFR2-Expi293F™. La spécificité pour mTNFR2 a été testée à l'aide d'ELISA et d’essais cellulaires utilisant mTNFR1 et mTNFR2 en tant que cibles, confirmant la spécificité des clones identifiés. Pour compléter la caractérisation des protéines solubles, la capacité des polypeptides AFFIMER® à bloquer la liaison du mTNFR2-mFC à mTNFα dans un ELISA a été testée, avec quatre clones (157, 160, 171 et 172) montrant une capacité concurrentielle claire dans la gamme testée.As described for the characterization of the hTNFR2 AFFIMER® polypeptide above, the identified mTNFR2 AFFIMER® polypeptides were cloned from phagemids into mammalian vectors for expression in Expi293F™ cells. The purity of the expressed proteins was then assessed by SDS-PAGE and HPLC, and the affinity by Biacore, as well as the cell-based binding of mTNFR2 in mTNFR2-Expi293F™ cells. Specificity for mTNFR2 was tested using ELISA and cell-based assays using mTNFR1 and mTNFR2 as targets, confirming the specificity of the identified clones. To complete the characterization of soluble proteins, the ability of AFFIMER® polypeptides to block mTNFR2-mFC binding to mTNFα in an ELISA was tested, with four clones (157, 160, 171 and 172) showing clear competitive ability in the range tested.
Essais de stimulation des lymphocytes TT-cell stimulation assays
L’essai de stimulation des lymphocytes T a été utilisé comme outil de dépistage puisque les lymphocytes T activées expriment des niveaux élevés de TNFR2, lorsqu'elles sont stimulées avec HM102 (agoniste du TNFR2), l'expression de CD25 augmente.T cell stimulation assay was used as a screening tool since activated T cells express high levels of TNFR2, when stimulated with HM102 (TNFR2 agonist) CD25 expression increases.
Les polypeptides mTNFR2 AFFIMER® ont d'abord été exprimés sur la surface cellulaire des HEK293. Ensuite, ces cellules ont été cocultivées pendant 48 heures avec des splénocytes BALB/c et enfin l'augmentation de l'expression de CD25 a été évaluée sur des lymphocytes T CD4 et CD8 positifs. L'expression des protéines AFFIMER® sur la surface cellulaire HEK293 a été appréciée par coloration par cytométrie en flux de l'étiquette HA présente au début du cadre de lecture ouvert avant les protéines AFFIMER® et la protéine d'ancrage cellulaire. Afin d'apprécier l'effet des protéines AFFIMER®-HEK sur les cellules CD4+ et CD8+, après 48h d'incubation, les cellules ont été colorées avec le panel de marqueurs suivant, coloration Live/Dead, CD90.2, CD4, CD8 et CD25.The mTNFR2 AFFIMER® polypeptides were first expressed on the cell surface of HEK293 cells. Then, these cells were cocultured for 48 hours with BALB/c splenocytes and finally the increase in CD25 expression was assessed on CD4 and CD8 positive T lymphocytes. The expression of AFFIMER® proteins on the HEK293 cell surface was assessed by flow cytometry staining of the HA tag present at the beginning of the open reading frame before the AFFIMER® proteins and the cell anchor protein. In order to assess the effect of AFFIMER®-HEK proteins on CD4+ and CD8+ cells, after 48h of incubation, the cells were stained with the following panel of markers, Live/Dead staining, CD90.2, CD4, CD8 and CD25.
Une dose-réponse a été observée dans l'expression de CD25 dans les lymphocytes T CD4+ et CD8+ en réponse aux cellules HEK293 exprimant les protéines mTNFR2 AFFIMER®, similaire à la réponse observée pour l'agoniste HM102 du TNFR2. La réponse obtenue dans les lymphocytes T CD8+ est plus forte que dans les lymphocytes T CD4+. Cependant, en se concentrant sur les deux nombres de cellules les plus élevés utilisés, un classement similaire des clones a été obtenu entre les sous-ensembles de lymphocytes T CD8+ et CD4+.A dose-response was observed in CD25 expression in CD4+ and CD8+ T cells in response to HEK293 cells expressing AFFIMER® mTNFR2 proteins, similar to the response observed for the TNFR2 agonist HM102. The response obtained in CD8+ T cells is stronger than in CD4+ T cells. However, focusing on the two highest cell numbers used, a similar ranking of clones was obtained between CD8+ and CD4+ T cell subsets.
Dans deux cycles de cette expérience d’essai, les six protéines AFFIMER® les mieux classées étaient cohérentes 174, 160, 175, 125, 157 et 179.In two cycles of this test experiment, the six top-ranked AFFIMER® proteins were consistent 174, 160, 175, 125, 157, and 179.
Résumé de la sélection du polypeptide mTNFR2 AFFIMER® et caractérisation.Summary of mTNFR2 AFFIMER® polypeptide selection and characterization.
Plus de 2000 phages monoclonaux ont été criblés par ELISA sur phages avec un taux de succès modéré de 35-60%, avec une bonne diversité (25-35%). Lors du criblage dans l’ELISA sous forme d'extrait brut de cellules, 109 clones ont montré une liaison à l'antigène mTNFR2. En utilisant la même cascade de criblage que pour le programme humain, il a été décidé de purifier les liants identifiés à partir du phagémide et de tester leur liaison à une lignée cellulaire surexprimant le TNFR2. A la suite de cet essai, 60 protéines AFFIMER® se liant au TNFR2 de souris ont été reformatées dans le vecteur d'expression de mammifère, produites et testées pour leurs propriétés biophysiques en tant que protéines solubles. 22 protéines Affimer ont passé les critères de qualité de production de protéines de pureté par SEC-HPLC supérieure à 80%. Les 22 clones ont été caractérisés dans différents essais en tant que protéines solubles, puis ont été exprimés à la surface de HEK293 pour un essai de coculture avec des splénocytes.More than 2000 monoclonal phages were screened by phage ELISA with a moderate success rate of 35-60%, with good diversity (25-35%). When screened in the ELISA as crude cell extract, 109 clones showed binding to the mTNFR2 antigen. Using the same screening cascade as for the human program, it was decided to purify the identified binders from the phagemid and test their binding to a TNFR2 overexpressing cell line. Following this assay, 60 AFFIMER® mouse TNFR2-binding proteins were reformatted into the mammalian expression vector, produced and tested for their biophysical properties as soluble proteins. 22 Affimer proteins passed the protein production quality criteria of >80% purity by SEC-HPLC. The 22 clones were characterized in different assays as soluble proteins and then were expressed on the surface of HEK293 for a coculture assay with splenocytes.
Bien que seulement 10 des 22 protéines Affimer aient montré des affinités de liaison nanomolaires à trois chiffres (KD) lorsque testées sur Biacore, il a été considéré que même une protéine Affimer avec une valeur KD plus élevée pourrait être une bonne agoniste une fois exhibée sur la surface cellulaire. Additionnellement, la performance des clones en tant que protéines solubles dépendait également de s'il s'agissait d'un dimère ou d'un trimère naturel. Pour ces raisons, les données Biacore ont été considérées dans le contexte de l'activité agoniste de mTNFR2 et n'ont pas été utilisées pour discriminer les clones. Lorsqu'ils ont été testés sur des cellules exprimant le TNFR2 de souris, 20 des 22 clones ont démontré une liaison spécifique avec une large gamme de valeurs CE50. Pour ce qui est des données Biacore, les résultats de liaison cellulaire n'ont été pris en compte que dans le contexte de l'activité agoniste du TNFR2 de souris et n'ont pas été utilisés pour discriminer les clones. Aucun des clones ne s'est lié au TNFR1 sous forme de protéines recombinantes ou exprimé à la surface d'une cellule. 5 des 22 clones ont démontré une inhibition complète de l'interaction entre le TNF-alpha et le TNFR2 dans un ELISA en concurrence.Although only 10 of the 22 Affimer proteins showed triple-digit nanomolar binding affinities (KD) when tested on Biacore, it was considered that even an Affimer protein with a higher KD value could be a good agonist when displayed on the cell surface. Additionally, the performance of the clones as soluble proteins also depended on whether they were a natural dimer or trimer. For these reasons, the Biacore data were considered in the context of mTNFR2 agonist activity and were not used to discriminate between clones. When tested on cells expressing mouse TNFR2, 20 of the 22 clones demonstrated specific binding with a wide range of EC50 values. For the Biacore data, the cell binding results were considered only in the context of mouse TNFR2 agonist activity and were not used to discriminate between clones. None of the clones bound to TNFR1 as recombinant proteins or expressed on the cell surface. 5 of the 22 clones demonstrated complete inhibition of the interaction between TNF-alpha and TNFR2 in a competitive ELISA.
Les 22 clones de souris ont également été exprimés à la surface des cellules HEK293 pour un essai de coculture avec des splénocytes. La principale lecture de l’essai était l'augmentation de l'expression de CD25 sur les lymphocytes T CD4+ et les lymphocytes T CD8+. Une grande majorité des clones testés a démontré un effet dépendant du dosage sur les lymphocytes T CD4+ et les lymphocytes T CD8+ (plus de 70%). Les clones ont été classés eu égard à l'expression de CD25 sur les lymphocytes T CD4+ et CD8+. Sur la base des résultats de cet essai clé, six protéines mTNFR2 AFFIMER® ont été identifiées : 174, 160, 175, 125, 157 et 179.The 22 mouse clones were also expressed on the surface of HEK293 cells for a coculture assay with splenocytes. The primary readout of the assay was the increase in CD25 expression on CD4+ T cells and CD8+ T cells. A large majority of the clones tested demonstrated a dosage-dependent effect on CD4+ T cells and CD8+ T cells (over 70%). Clones were ranked with respect to CD25 expression on CD4+ and CD8+ T cells. Based on the results of this key assay, six AFFIMER® mTNFR2 proteins were identified: 174, 160, 175, 125, 157 and 179.
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