ES2883229T3 - Gen para la inducción de partenogénesis, un componente de la reproducción apomíctica - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para lograr la propagación a partir de una o más células gametofíticas o esporofíticas en un óvulo de una planta con flores en ausencia de fertilización con óvulos, comprendiendo el procedimiento: transformar una planta con flores con una construcción del gen ASGR-BBML que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 4, donde el ácido nucleico está operativamente unido a un promotor específico de la flor; obtener una o más células gametofíticas o esporofíticas de un óvulo de la planta transformada en ausencia de fertilización con óvulos; y obtener una planta progenie a partir de una o más células gametofíticas o esporofíticas, donde la planta progenie contiene uno o más conjuntos de cromosomas de la planta transformada, logrando así la propagación de la planta con flores en ausencia de fertilización con óvulos, donde la planta con flores es una monocotiledónea.

Description

DESCRIPCIÓN

Gen para la inducción de partenogénesis, un componente de la reproducción apomíctica

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención descrita en esta invención se refiere generalmente a genes implicados en la reproducción de plantas y procedimientos para usar los mismos.

ANTECEDENTES

La apomixis es un modo natural de reproducción asexual en plantas con flores; este procedimiento da como resultado la formación de semillas sin la participación de la meiosis o la fertilización del óvulo. Los procedimientos apomícticos evitan la meiosis y la fertilización, lo que conduce directamente a la formación de embriones clonales. Los híbridos apomícticos son híbridos de reproducción verdadera porque la progenie derivada de semillas de una planta apomíctica es genéticamente idéntica a la del progenitor materno. En otras palabras, los híbridos apomícticos son de origen clonal.

La apomixis se caracteriza por: 1) apomeiosis, que se refiere a la formación de sacos embrionarios no reducidos derivados de las células nucelares del ovario, y 2) partenogénesis, que se refiere al desarrollo del óvulo no reducido en un embrión. Muchos tipos de especies de plantas presentan una reproducción apomíctica y pueden propagarse asexualmente. Conner y col (2008) Plant Physiology 147 (3), 1396-1411 describe el análisis de secuencia de clones de cromosomas artificiales bacterianos de la región genómica aposporia específica de Pennisetum y Cenchrus. UniProt B3U4X0 describe la secuencia de proteínas de ASGR-BBM-like2. Yukio Akiyama y col (2011) BMC Evolutionary Biology 11 (1), 289 describe la evolución del cromosoma transmisor de apomixis en Pennisetum. Conner y col (2011) In Vitro Cellular and Developmental Biology Animal 47 (S1), 34-40 describe que ASGR-BBML es un gen candidato para inducir apomixis.

RESUMEN

Según un aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para lograr la propagación a partir de una o más células gametofíticas o esporofíticas en un óvulo de una planta con flores en ausencia de fertilización con óvulos, comprendiendo el procedimiento:

transformar una planta con flores con una construcción del gen ASGR-BBML que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 4, donde el ácido nucleico está operativamente unido a un promotor específico de la flor;

obtener una o más células gametofíticas o esporofíticas de un óvulo de la planta transformada en ausencia de fertilización con óvulos; y

obtener una planta progenie a partir de una o más células gametofíticas o esporofíticas, donde la planta progenie contiene uno o más conjuntos de cromosomas de la planta transformada, logrando así la propagación de la planta con flores en ausencia de fertilización con óvulos, donde la planta con flores es una monocotiledónea. Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un procedimiento para obtener una planta con flores capaz de reproducirse en ausencia de fertilización con óvulos, comprendiendo el procedimiento:

transformar una planta con flores con una construcción del gen ASGR-BBML que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 4, donde el ácido nucleico está operativamente unido a un promotor específico de la flor, obteniendo así una planta con flores capaz de reproducirse en ausencia de fertilización con óvulos, donde la planta con flores es una monocotiledónea. Según otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para producir semillas de una planta con flores en ausencia de fertilización con óvulos, comprendiendo el procedimiento:

transformar una planta con flores con una construcción del gen ASGR-BBML que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 4, donde el ácido nucleico está operativamente unido a un promotor específico de la flor;

obtener una o más células gametofíticas o esporofíticas de un óvulo de la planta transformada en ausencia de fertilización con óvulos; y

obtener semilla de una o más células gametofíticas o esporofíticas, donde la semilla contiene uno o más conjuntos de cromosomas de la planta transformada, produciendo así semilla de la planta con flores en ausencia de fertilización con óvulos, donde la planta con flores es una monocotiledónea.

Las realizaciones de la divulgación abarcan procedimientos para lograr la propagación a partir de una o más células gametofíticas o esporofíticas en un óvulo de una planta con flores en ausencia de fertilización con óvulos, los procedimientos incluyen: transformar una planta con flores con una construcción del genASGR-BBMLcapaz de codificar un polipéptido que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 4; obtener una o más células gametofíticas o esporofíticas de un óvulo de la planta transformada en ausencia de fertilización con óvulos; y derivar una planta progenie a partir de una o más células gametofíticas o esporofíticas, donde la planta progenie contiene uno o más conjuntos de cromosomas de la planta transformada, logrando así la propagación de la planta con flores en ausencia de fertilización con óvulos.

En algunas realizaciones, la construcción del genASGR-BBMLincluye además una o más regiones no traducidas (UTR). En algunas realizaciones, la construcción del genASGR-BBMLque incluye además una o más UTR puede tener al menos un 70 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o una línea completamente complementaria de la misma. En algunas realizaciones, la construcción del genASGR-BBMLincluye además un promotor. En algunas realizaciones, el promotor es capaz de regular la expresión de un polipéptido que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, el promotor incluye un nucleótido que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la SEQ. ID NO: 5 o una línea completamente complementaria del mismo. En algunas realizaciones, la construcción del genASGR-BBMLque incluye además una o más UTR y un promotor puede tener al menos un 70 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 una línea completamente complementaria de la misma

En algunas realizaciones, el embrión se puede formar a partir de un óvulo no reducido. En algunas realizaciones, el embrión se puede formar a partir de un óvulo reducido. En algunas realizaciones, el embrión se puede formar a partir de una célula somática.

En algunas realizaciones, una planta poliploide se puede transformar para producir una planta de progenie diploide o dihaploide. En algunas realizaciones, una planta diploide puede transformarse para producir una planta de progenie haploide. En algunas realizaciones, la planta de progenie haploide puede tratarse para lograr la duplicación de cromosomas y la producción de una planta homocigota. En algunas realizaciones, la planta progenie se puede obtener mediante cultivo.

En algunas realizaciones, la planta con flores puede ser una hierba o una leguminosa. En algunas realizaciones, la hierba puede ser una especie de mijo, arroz, maíz, trigo, sorgo o pasto varilla.

En algunas realizaciones, la planta con flores puede ser heterocigótica y puede transformarse para producir una descendencia clonal. En algunas realizaciones, la planta con flores puede ser heterocigótica y puede transformarse para producir una descendencia haploide.

En algunas realizaciones, los procedimientos de la presente divulgación pueden usarse para propagar uno o más rasgos hereditarios en la planta con flores.

La divulgación también abarca plantas o partes de plantas producidas por procedimientos para lograr la propagación a partir de una o más células gametofíticas o esporofíticas en un óvulo de una planta con flores en ausencia de fertilización con óvulos, los procedimientos incluyen: transformar una planta con flores con una construcción del genASGR-BBMLcapaz de codificar un polipéptido que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 4; obtener una o más células gametofíticas o esporofíticas de un óvulo de la planta transformada en ausencia de fertilización con óvulos; y derivar una planta progenie a partir de una o más células gametofíticas o esporofíticas, donde la planta progenie contiene uno o más conjuntos de cromosomas de la planta transformada, logrando así la propagación de la planta con flores en ausencia de fertilización con óvulos.

La divulgación también abarca procedimientos para obtener una planta con flores capaz de reproducirse en ausencia de fertilización con óvulos, incluyendo el procedimiento: transformar una planta con flores con una construcción del genASGR-BBMLcapaz de codificar un polipéptido que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia para el polipéptido de SEQ ID NO: 4, obteniendo así una planta con flores capaz de reproducirse en ausencia de fertilización con óvulos.

La divulgación también abarca plantas o partes de plantas producidas mediante procedimientos de obtención de una planta con flores capaz de reproducirse en ausencia de fertilización con óvulos, incluyendo el procedimiento: transformar una planta con flores con una construcción del genASGR-BBMLcapaz de codificar un polipéptido que tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 4, obteniendo así una planta con flores capaz de reproducirse en ausencia de fertilización con óvulos.

La divulgación también abarca procedimientos para producir semillas de una planta con flores en ausencia de fertilización con óvulos, incluyendo el procedimiento: transformar una planta con flores con una construcción del genASGR-BBMLobtener uno o más embriones de la planta transformada en ausencia de fertilización con óvulos; y producir semillas a partir del uno o más embriones que contienen uno o más conjuntos de cromosomas que se derivan únicamente de la planta madre transformada, obteniendo así la propagación de semillas de la planta en flor en ausencia de fertilización con óvulos.

La divulgación también abarca semillas producidas mediante procedimientos de producción de semillas de una planta con flores en ausencia de fertilización con óvulos, incluyendo el procedimiento: transformar una planta con flores con una construcción del genASGR-BBMLobtener una o más células gametofíticas o esporofíticas de un óvulo de la planta transformada en ausencia de fertilización con óvulos; y derivar semilla de una o más células gametofíticas o esporofíticas, donde la semilla contiene uno o más conjuntos de cromosomas de la planta transformada, produciendo así la semilla de la planta con flores en ausencia de fertilización con óvulos.

La divulgación también abarca construcciones del genASGR-BBMLcapaces de codificar un polipéptido que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 4, donde el polipéptido codificado por la construcción del genASGR-BBML,cuando se expresa en uno o más gametofitos o células esporofíticas en un óvulo de una planta con flores, pueden permitir que se logre la propagación en ausencia de fertilización con óvulos. En algunas realizaciones, la construcción del genASGR-BBMLpuede además incluir una o más UTR y un promotor, donde la construcción del genASGR-BBMLtiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 o una línea completamente complementaria de la misma.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Los expertos en la técnica comprenderán que los dibujos, que se describen a continuación, tienen únicamente fines ilustrativos. No se pretende que las enseñanzas limiten el alcance de la descripción del solicitante de ninguna forma.

La Figura 1 muestra la alineación de T-Coffee de un subconjunto de proteínasBabyBoom(BBM), BabyBoom-Like(BBM-like)yuna región genómica específica de aposporia(ASGR) -BBMcon dominios marcados.

La Figura 2 muestra un árbol filogenético de 26 proteínas similares a BBM. La historia evolutiva se infirió mediante el procedimiento de unión de vecinos (N. Saitou, M. Nei, Molecular Biology and Evolution 4:406-425 (1987)). Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el procedimiento basado en matrices JTT (DT Jones, WR Taylor, JM Thornton, Computer Applications in the Biosciences 8:275-282 (1992)). El árbol de consenso por bootstrap que se muestra se infirió a partir de 1000 réplicas (J. Felsenstein, Evolution 39:783-791 (1985)). Las ramas correspondientes a las particiones reproducidas en menos del 50 % de las réplicas de bootstrap se colapsaron. El porcentaje de árboles replicados en los que los taxones asociados se agruparon en la prueba de bootstrap se muestra junto a las ramas. Se eliminaron todas las posiciones ambiguas para cada par de secuencias. Hubo un total de 1067 posiciones en el conjunto de datos final. Los análisis evolutivos se realizaron en MEGA6 (K. Tamura y col., Molecular Biology and Evolution 30:2725-2729 (2013)).

La Figura 3 representa los resultados de la sobreexpresión de ASGR-BBML en Arabidopsis, incluida la formación de proyecciones tricomadas, como se muestra en la Figura 3A, brotes ectópicos, como se muestra en la Figura 3B, y flores ectópicas, como se muestra en la Figura 3C.

La Figura 4 muestra el desarrollo del embrión BCs en ausencia de polinización.

La Figura 5 representa los resultados de la hibridaciónin situde embriones globulares, como se muestra en la Figura 5A, y embriones en etapa posterior, como se muestra en las Figuras 5B y 5C, usando una sonda de oligonucleótidos de ácido nucleico bloqueada diseñada para dirigirse aASGR-BBMl .Las Figuras 5A, 5B y 5C representan los resultados del uso de una sonda antisentido; la Figura 5D representa los resultados del uso de una sonda de control.

La Figura 6 representa los resultados de los estudios de expresión deASGR-BBML.Las diferencias en la expresión deASGR-BBMLentre eventos de ARNi (S7>S4>S2>S5), como se muestra en la Figura 6A, se correlacionan con la frecuencia de óvulos con embriones multicelulares, pero no con el número de sacos embrionarios aposporosos por óvulo, como se muestra en la Figura 6B.

La Figura 7 representa un óvulo aclarado de una planta apomíctica derivada del cruce de BCs con el mijo perla transgénico que expresa GUS. La expresión se observa en los óvulos y en los embriones jóvenes. La Figura 7A muestra un saco embrionario aposporoso con un embrión bicelular. La Figura 7B muestra dos sacos de embriones aposporosos, el izquierdo con un embrión multicelular y el derecho en una etapa unicelular o bicelular.

La Figura 8 representa la expresión dePsASGR-BBMLen sacos de embriones sexuales. Se muestran los ovarios de tres descendientes sexuales derivados de una línea ToPsASGR-BBMLpromotor-GUS(Figura 8A-D). Las Figuras 8A y 8B son diferentes planos de enfoque del mismo ovario para mostrar tanto los sinérgicos (S) como los núcleos polares (PN) intactos. La expresión de GUS se detecta en el óvulo (E) de los sacos de embriones sexuales no fertilizados el día de la antesis. A veces se puede detectar una señal de GUS más débil en las células sinérgicas (Figura 8C). No se detecta señal e GUS en los núcleos polares (PN) o células antípodas (AN) del saco embrionario sexual maduro. La tinción de GUS se detecta en las células del embrión en desarrollo (EM) tres días después de la fertilización, pero no en el endospermo en desarrollo (EN) (Figura 8D). No se identifica ninguna otra tinción en el tejido ovárico.

La Figura 9 representa la alineación del ADNc con el ADN genómico. La secuencia alineada se muestra al comienzo de a Tg . Las líneas superiores contienen la secuencia de ADN genómico y las líneas inferiores contienen la secuencia de ADNc.

La Figura 10 muestra ejemplos de formación de embriones en sacos de embriones con núcleos polares. Las Figuras 10A, 10B y 10C representan estructuras de sacos embrionarios típicas del desarrollo sexual,es decir,todas tienen células antípodas que están ausentes de los sacos embrionarios aposporosos que se desarrollan enPennisetum.Cada saco embrionario contiene un embrión en desarrollo y una célula central no fertilizada, como lo muestran los núcleos polares persistentes. Las Figuras 10A, 10B y 10C representan la estructura del saco embrionario completo. Las Figuras 10D, 10E y 10F representan una ampliación del extremo del embrión (micropilar) del saco embrionario.

La Figura 11 representa el desarrollo de embriones partenogenéticos en ovarios de mijo perla tetraploide sexual que contiene el transgéngPsASGR-BBML.Las imágenes son de los ovarios recolectados y fijados 2 días después de la antesis, aclarados con salicilato de metilo y visualizados bajo óptica de contraste de fase a 20X. La Figura 11A representa un ovario de control con un saco embrionario estructuralmente maduro derivado de una línea de cultivo de tejido sin transformar sin fertilización. No se observa desarrollo de embriones. El desarrollo de embriones en ovarios no fertilizados se ve claramente en las líneas transgénicas sexuales g11a (Figura 11B) y g3f (Figura 11C) basándose en la apariencia de una estructura similar a un embrión (EM) en el extremo micropilar del saco embrionario; núcleos polares (NP) y células antípodas (A). La Figura 11D muestra que la formación de endospermo (EN) a los 2 días después de la antesis puede detectarse fácilmente cuando se permite la polinización, como se muestra para la línea g11a.

La Figura 12 representa un análisis de RT-PCR no cuantitativo de laexpresión de gPsASGR-BBMLen los ovarios. El ARN total se aisló a partir de ovarios sexuales (sexo) y apomícticos (apo-1, apo-2) BC8 en el día de la antesis y de los ovarios de líneas G3F y G52 a los 2 días después de la antesis. Se sometieron tres microgramos de ARN total a tratamiento con ADNasa, se sometieron a transcripción inversa y se amplificó una alícuota de la primera cadena de ADNc con cebadores específicosPsASGR-BBMLp779/80 (Y. Akiyama y col., BMC Evolutionary Biology, 11:289 (2011)) y cebadoresADF3p1127/28. La muestra de A d N genómico se aisló de una planta apomíctica BC8. Ladder es un marcador de ADN HI-LO (Minnesota Molecular, Minneapolis, MN). Los carriles de marcador y ADN se originaron en el mismo gel para ambos cebadores y se fusionaron con los carriles de RT-PCR para eliminar los carriles innecesarios.

La Figura 13 representa el análisis de citometría de flujo para determinar el tamaño del genoma de las plantas y la descendencia de To. Ejemplos de análisis del tamaño del genoma utilizando un citómetro de flujo BD-Accuri de plantas To y descendencia g3f (T¹). La Figura 13A representa el análisis de picos de sorgo y el tejido foliar de la línea To g11a. La Figura 13B muestra el análisis de picos de sorgo y descendencia 108 de g3f. La Figura 13C muestra el análisis de picos de sorgo y descendencia 101 de g3f. La Figura 13D representa el análisis de picos de la descendencia 105 y 107 de g3f. S2 y S4 designan picos de sorgo 2X/2C y 2X/4C, respectivamente. H2 y H4 designan descendencia diploide/dihaploide T¹(Figura 13C, 13D) con picos 2c y 4C, respectivamente. T2 y T4 designan la descendencia tetraploide To de mijo perla (Figura 13A) o tetraploide T¹(Figura 13B, 13D) con picos 2C y 4C, respectivamente.

La Figura 14 muestra la citometría de flujo de la semilla, que muestra la producción de descendencia reducida. La Figura 14A muestra 5 semillas de una planta tetraploide IA4X sin transformar con picos genómicos Ma (4n/2c) y Mb (4n/4c) basado en la comparación con picos genómicos de la hoja de sorgo Sa (2n/2c) y Sb (2n/4c) utilizado para un estándar. La Figura 14B muestra 5 semillas de la descendencia 104 de g3f que heredó el transgénPsASGR-BBM,pero siguió siendo una planta tetraploide. Semillas muestran picos de mijo genómico de Ma (4n/2c) y Mb (4n/4c) de embriones fertilizados junto con picos de mijo de embriones reducidos no fertilizados Mc (2n/2c) y Md (2n/4c) basado en la comparación con los picos genómicos de la hoja de sorgo Sa (2n/2c) y Sb (2n/4c) utilizado para un estándar. La Figura 14C muestra 5 semillas de descendencia 105 de g3f que heredó el transgénPsASGR-BBMy mostró una reducción del tamaño del genoma a un diploide/dihaploide. Semillas muestran picos de mijo genómico de Ma (2n/2c) y Mb (2n/4c) de embriones no reducidos junto con picos de mijo de embriones reducidos Me (1n/1c) y Mf (1n/2c) basado en la comparación con los picos genómicos de la hoja de sorgo Sa (2n/2c) y Sb (2n/4c) utilizado para un estándar.

La Figura 15 representa el desarrollo de embriones partenogenéticos en los ovarios de la descendencia sexual de las líneas g52 y g3f de mijo perla To que heredan el transgéngPsASGR-BBML.Ejemplos de ovarios recolectados y fijados 2 días después de la antesis, aclarados con salicilato de metilo y visualizados bajo óptica DIC a 20X. La Figura 15A representa un ovario de control con un saco embrionario estructuralmente maduro derivado de una línea de cultivo de tejido sin transformar sin fertilización. No se observa desarrollo de embriones. El desarrollo de embriones en ovarios no fertilizados se ve claramente en la descendencia sexual 306 de la línea transgénica g52 (Figura 15B) y la descendencia 105 de la línea transgénica g3f (Figura 15C) basada en la apariencia de una estructura similar a un embrión (EM) en el extremo micropilar del saco embrionario; núcleos polares (NP) y células antípodas (AN).

La Figura 16 representa los resultados del análisis de RT-PCR no cuantitativo de la expresión degPsASGR-BBMLen los ovarios de la descendencia de g3f. El ARN total se aisló de los ovarios el día de la antesis de la descendencia de g3f y g3f. Se sometieron tres microgramos de ARN total a tratamiento con ADNasa, se sometieron a transcripción inversa y se amplificó una alícuota de la primera cadena de ADNc con cebadores específicosPsASGR-BBMLp779/80 (Y. Akiyama y col., BMC Evolutionary Biology, 11:289 (2011)). La muestra de ADN genómico se aisló de una planta apomíctica BCs. Ladder es un marcador de ADN HI-LO (Minnesota Molecular). La Figura 17 representa los resultados del análisis de RT-PCR semicuantitativo de la reducción en la expresión dePsASGR-BBMLen las líneas F1 de ARNi apomíctico. Imagen de señales producidas después de la hibridación de productos de RT-PCR de tejido ovárico no polinizado de líneas ARNi F1 en el día de antesis para cuantificación. Se promediaron las señales de reacciones de PCR triplicadas para determinar la reducción final dePsASGR-BBMLen líneas de ASGR positivo/ARNi positivo en comparación con la planta de control (ASGR positivo/ARNi negativo). La señal de ADF3 se utilizó para normalizar las cantidades de ARN de partida para cada muestra. Las reducciones se calcularon utilizando la siguiente fórmula: (1- (señal promediada de línea de ARNi ASGR-BBML/señal promediada de ADF3) / (señal promediada de línea de control de ASGR-BBML /señal promediada de ADF3)) x 100 (Tabla 7).

La Figura 18 representa un ejemplo de observación histológica usada para determinar el número de células embrionarias en líneas de control y ARNi dePsASGR-BBML.La Figura 18A representa una sección y un recuento de células embrionarias de la planta de control S7-6T10. El desarrollo del embrión está marcado con un paréntesis. Este embrión contiene más de 16 células. La Figura 18B representa una sección de la línea de ARNi S5-5T-28. No se identifica desarrollo de embriones en este ovario (el óvulo está marcado con una flecha) que contiene 2 sacos embrionarios aposporosos indicados por estrellas.

La Figura 19 representa la citometría de flujo de embriones disecados, que muestra la producción de descendencia haploide en plantas transgénicas de arroz que llevan el transgénPsASGR-BBM.La figura 19A muestra picos genómicos de hojas de arroz sin transformar Ra (2n/2c) y Rb (2n/4C) y sorgo Sa (2n/2c) y Sb (2n/4c). El pico de arroz Rb y el pico de sorgo Sa se superponen debido a tamaños de genoma similares. La Figura 19B muestra 5 embriones disecados de la línea 26 de arroz To que contiene un transgénPsASGR-BBMtranscripcionalmente activo. Los 26 embriones de la línea de arroz muestran picos de arroz genómico de RRa (2n/2c) de embriones fertilizados junto con picos de arroz de embriones reducidos no fertilizados Rc (1n/1c) basado en la comparación con los picos genómicos de hojas de sorgo Sa (2n/2c) y Sb (2n/4C). La Figura 19C muestra 5 embriones disecados de la línea 34 de arroz T⁰que contiene un transgénPsASGR-BBMtranscripcionalmente activo. Los 34 embriones de la línea de arroz muestran picos de arroz genómico de RRa (2n/2c) de embriones fertilizados junto con picos de arroz de embriones reducidos no fertilizados Rc (1n/1c) basado en la comparación con los picos genómicos de hojas de sorgo Sa (2n/2c) y Sb (2n/4C).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

A menos que se especifique de cualquier otra manera, los términos se comprenderán de acuerdo con el uso convencional por los expertos en la materia en la materia relevante.

Como se usa en esta invención, los términos «planta» y «parte de la planta» pueden incluir inclusive, como indica el contexto, células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejido celular vegetal a partir de los cuales se pueden regenerar plantas, callos vegetales, grupos de plantas y células vegetales que son intactos en plantas o partes de plantas, tales como embriones, polen, óvulos, semillas, flores, granos, espigas, mazorcas, cáscaras, tallos, raíces, ápices de raíces, anteras y similares.

El término polinucleótido puede incluir los términos «ácido nucleico», «secuencia de ácido nucleico» y «oligonucleótido», como se entienden generalmente en la técnica esos términos. Lo que se incluye en un caso específico será apreciado por una persona experta en la técnica según lo indicado por el contexto, pero cuando ningún contexto particular limite el alcance, entonces se entenderá que el término es ampliamente inclusivo. Por lo tanto, el término polinucleótido también puede incluir ADN o ARN que contienen una o más bases modificadas. Por tanto, los ADN o ARN con cadenas principales modificadas para estabilidad o por otras razones son «polinucleótidos», como se pretende en esta invención con ese término. Además, los ADN o ARN que comprenden bases inusuales, como la inosina, o bases modificadas, como las bases tritiladas, por nombrar solo dos ejemplos, son polinucleótidos como se usa el término en esta invención. Se apreciará que se han realizado una gran variedad de modificaciones en el ADN y el ARN que sirven para muchos propósitos útiles conocidos por los expertos en la técnica. El término polinucleótido, tal como se emplea en esta invención, abarca tales formas de polinucleótidos modificadas químicas, enzimática o metabólicamente, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluidas células simples y complejas, entre otras.

Como se usa en esta invención, el término «transgénico» describe una planta no natural que contiene un genoma modificado por el hombre, donde la planta incluye en su genoma una molécula de ácido nucleico exógeno, que puede derivarse de la misma especie o de una diferente, incluyendo especies no vegetales. La molécula de ácido nucleico exógeno puede ser un elemento regulador génico tal como un promotor, potenciador u otro elemento regulador, o puede contener una secuencia codificante, que se puede unir a un elemento regulador génico nativo o heterólogo. Las plantas transgénicas que surgen de un cruce sexual o por autofecundación son descendientes de dicha planta.

Como se usa en esta invención, «polimorfismo» indica la presencia de una o más variaciones de una secuencia de ácido nucleico en uno o más locus en una población de uno o más individuos. La variación puede comprender, de modo no taxativo, uno o más cambios de base, la inserción de uno o más nucleótidos o la deleción de uno o más nucleótidos. Un polimorfismo incluye un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), una repetición de secuencia simple (SSR), indeles (inserciones y deleciones), un polimorfismo de longitud de fragmento de restricción, un haplotipo y una etiqueta SNP. Además, un polimorfismo puede incluir un marcador genético, un gen, una secuencia derivada de ADN, una secuencia derivada de ARN, un promotor, una región 5' no traducida de un gen, una región 3' no traducida de un gen, microARN, ARNip, un locus de rasgos cuantitativos (QTL), un marcador satélite, un transgén, mARN, ds mARN, un perfil transcripcional o un patrón de metilación. Un polimorfismo puede surgir de los procedimientos aleatorios en la replicación de ácido nucleico, mediante mutagénesis, como un resultado de elementos genómicos móviles, de la variación en el número de copias y durante el procedimiento de meiosis, como durante entrecruzamientos desiguales, la duplicación de genomas y rupturas y fusiones cromosómicas. La variación se puede encontrar comúnmente o puede existir con baja frecuencia dentro de una población, teniendo la primera mayor utilidad en el mejoramiento genético de plantas y la segunda puede estar asociada con una variación fenotípica rara pero importante.

Como se usa en esta invención, un «marcador» puede referirse a una secuencia de ácido nucleico polimórfico o característica de ácido nucleico. En un aspecto más amplio, un «marcador» puede ser una característica detectable que puede usarse para discriminar entre las diferencias hereditarias entre organismos. Ejemplos de tales características pueden incluir marcadores genéticos, composición de proteínas, niveles de proteínas, composición de aceite, niveles de aceite, composición de carbohidratos, niveles de carbohidratos, composición de ácidos grasos, niveles de ácidos grasos, composición de aminoácidos, niveles de aminoácidos, biopolímeros, productos farmacéuticos, composición de almidón, niveles de almidón, almidón fermentable, rendimiento de fermentación, eficiencia de fermentación, rendimiento de energía, compuestos secundarios, metabolitos, características morfológicas y características agronómicas.

Como se usa en esta invención, un «genotipo» puede referirse al componente genético del fenotipo, y esto puede caracterizarse indirectamente usando marcadores o caracterizarse directamente por secuenciación de ácidos nucleicos. Marcadores adecuados incluyen un carácter fenotípico, un perfil metabólico, un marcador genético o algún otro tipo de marcador. Un genotipo puede constituir un alelo para al menos un locus de marcador genético o un haplotipo para al menos una ventana de haplotipos. En algunas realizaciones, un genotipo puede representar un solo locus, y en otras puede representar un conjunto de locus de todo el genoma. En algunas realizaciones, el genotipo puede reflejar la secuencia de una parte de un cromosoma, un cromosoma completo, una parte del genoma y el genoma completo.

Como se usa en esta invención, una «construcción» o «construcción genética» puede referirse a un polinucleótido que codifica el gen particular de la construcción génica. Dichos polinucleótidos pueden unirse operativamente a una o más regiones no traducidas (UTR), y/o una o más regiones reguladoras secuencia/promotor de iniciación de transcripción capaz de dirigir la transcripción del polinucleótido en la célula huésped deseada, tal como tejidos de una planta transformada, regulando así la expresión de un gen dado. La expresión de un gen dado se puede determinar en términos de la cantidad de producto génico o proteína expresada, y se pueden usar una variedad de procedimientos para detectar niveles de expresión de proteínas, que incluyen, por ejemplo, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), transferencias Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia y similares.

La construcción de tales construcciones génicas que pueden emplearse junto con la presente invención es bien conocida por los expertos en la técnica a la luz de la presente divulgación. Véase,por ejemplo,Sambrook y col.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); Gelvin y col.; Plant Molecular Biology Manual (1990); Plant Biotechnology: Commercial Prospects and Problems, eds. Prakash y col.; Oxford & IBH Publishing Co.; New Delhi, India; (1993); y Heslot y col.; Molecular Biology and Genetic Engineering of Yeasts; CRC Press, Inc., USA; (1992). Por ejemplo, vectores de expresión de plantas pueden incluir (1) un gen de planta clonado bajo el control transcripcional de secuencias reguladoras 5' y 3' y (2) un marcador seleccionable dominante. Tales construcciones de genes vegetales también pueden contener, si se desea, una región reguladora del promotor (por ejemplo,una que confiera expresión inducible, constitutiva, regulada por el medio ambiente o del desarrollo, o específica/selectiva de células o tejidos), un sitio de inicio de la transcripción, un sitio de unión al ribosoma, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de terminación de la transcripción y/o una señal de poliadenilación. Pueden emplearse promotores constitutivos, preferidos por tejidos o inducibles. Por ejemplo, los expertos en la técnica conocen ciertos promotores que son capaces de iniciar la transcripción preferentemente en ciertos tejidos, tales como hojas, raíces, frutos, semillas o flores.

Como se usa en esta invención, un «vector» puede referirse a cualquier construcción de ácido nucleico que pueda entrar en una célula vegetal, incluidos ácidos nucleicos circulares o lineales, y/o ácidos nucleicos bacterianos, virales, fúngicos, vegetales y sintetizados, así como construcciones de ácidos nucleicos homólogos o heterólogos.

Como se usa en esta invención, los términos «transformar», «transformado» y «que transforma(n)» pueden referirse a la introducción de un gen extraño en una planta. Se conocen numerosos procedimientos para introducir genes extraños en plantas y se pueden usar para insertar secuencias de ácido nucleico en una planta hospedante, incluidos protocolos de transformación de plantas biológicos y físicos. Véase, por ejemplo, Miki y col. (1993) «Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants,» in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, ed. Glick and Thompson (CRC Press, Inc., Boca Raton), páginas 67-88. Los procedimientos elegidos pueden variar con la planta huésped, y los expertos en la técnica conocen muchos de estos procedimientos; estos incluyen procedimientos de transfección química como el fosfato de calcio, transferencia de genes mediada por microorganismos comoAgrobacterium(Horsch y col. (1985) Science 227:1229-1231), electroporación, microinyección y bombardeo biolístico. Casetes y vectores de expresión y los procedimientos de cultivoin vitropara la transformación de células o tejidos vegetales y la regeneración de plantas son conocidos y están disponibles. Véase, por ejemplo, Gruber y col. (1993) «Vectors for Plant Transformation,» in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, ed. Glick and Thompson (CRC Press, Inc., Boca Raton), páginas 89-119.

Una vez que se ha obtenido una sola planta transformada, por ejemplo, una planta transformada con un gen deseado, se pueden usar procedimientos de cultivo de plantas convencionales para transferir el gen estructural y las secuencias reguladoras asociadas mediante cruzamiento y retrocruzamiento. En general, tales técnicas de reproducción vegetal se utilizan para transferir un gen deseado a una planta específica,por ejemplo,una planta de cultivo u otro tipo de planta utilizada con fines comerciales. En consecuencia, los procedimientos de esta divulgación se pueden utilizar, por ejemplo, en el mejoramiento de plantas, cultivo de plantas, propagación de genotipos inestables y/o recesivos, producción de semillas y propagación de rasgos, así como otros fines relacionados con la reproducción de plantas.

Como se usa en esta invención, los términos «identidad de secuencia» o «identidad» en el contexto de dos secuencias de polipéptidos o ácidos nucleicos incluyen una referencia a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para una correspondencia máxima en una ventana de comparación especificada. Cuando se utiliza un porcentaje de identidad secuencial en referencia a proteínas se reconoce que las posiciones de los residuos que no son idénticas a menudo difieren por sustituciones de aminoácidos conservadoras, donde los residuos de aminoácidos se sustituyen por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y, por lo tanto, no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Las secuencias que difieren en dichas sustituciones conservadoras se dice que tiene «similitud secuencial» o «similitud». Los expertos en la técnica conocen bien los medios para realizar este ajuste. Normalmente, esto implica puntuar una sustitución conservadora como una falta de coincidencia parcial en lugar de completa, aumentando así el porcentaje de identidad de secuencia. Así, por ejemplo, cuando un aminoácido idéntico recibe una puntuación de 1 y una sustitución no conservadora recibe una puntuación de cero, una sustitución conservadora recibe una puntuación entre cero y 1. La puntuación de las sustituciones conservadoras se calcula, por ejemplo, como se implementó en el programa P^c/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California).

Los expertos en la técnica reconocen que el valor se determina comparando dos secuencias alineadas de manera óptima en una ventana de comparación, donde la parte de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir,huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece la base de ácido nucleico idéntico o el residuo de aminoácido en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.

El porcentaje de identidad/similaridad de secuencia es un número entero seleccionado del grupo que consiste de 50 a 99. Valores de identidad/similaridad de secuencia ejemplares incluyen 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, y 95 %. La identidad de secuencia se puede determinar usando, por ejemplo, los algoritmos GAP, CLUSTALW o BLASt, preferiblemente BLAST. Identidad sustancial de secuencias de nucleótidos o aminoácidos para estos fines normalmente significa identidad de secuencia de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, y 95 % o más.

Además, un experto en la técnica reconocerá que los valores de identidad de secuencia se pueden ajustar apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos teniendo en cuenta la degeneración de codones, similitud de aminoácidos, posicionamiento del marco de lectura y similares. Los polipéptidos que son «sustancialmente similares» comparten secuencias como se indicó anteriormente, excepto que las posiciones de los residuos, que no son idénticos, pueden diferir por cambios conservadores de aminoácidos. Otro indicio de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibridan entre sí en condiciones rigurosas, tal como se describió anteriormente. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean de aproximadamente 5 °C a aproximadamente 20 °C más bajas que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y un pH definidos. La Tm es la temperatura (con una fuerza iónica y un pH definidos) a la que el 50 % de la secuencia diana se hibrida a una sonda perfectamente adaptada. Normalmente, las condiciones de lavado rigurosas son aquellas en las que la concentración de sal es de aproximadamente 0,02 molar a pH 7 y la temperatura es de al menos aproximadamente 50, 55 o 60 °C. Sin embargo, los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí en condiciones rigurosas son aún sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico usando la máxima degeneración de codones permitida por el código genético. Una indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente reactivo de forma cruzada con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico.

Para una descripción de diversas bibliotecas, vectores, ácidos nucleicos, etc., véanse, por ejemplo, Stratagene Cloning Systems, Catalogs 1999 (La Jolla, CA); y Amersham Life Sciences, Inc, Catalog '99 (Arlington Heights, 111).

La especificación y las reivindicaciones utilizan las formas singulares «uno», «una» y «el/la». Estos términos están destinados a no excluir una interpretación plural, y pueden incluir preferiblemente una interpretación plural, dependiendo del contexto. Así, por ejemplo, la referencia a «un compuesto» puede incluir una variedad de tales compuestos, o varios de esos mismos compuestos, a menos que la interpretación sea contraria al contexto donde se usa.

La apomixis es un procedimiento de desarrollo natural de reproducción asexual donde la descendencia producida es genéticamente idéntica a la planta madre, lo que resulta en la propagación clonal de la planta materna a través de la semilla. Existen múltiples formas de apomixis en la naturaleza. Por ejemplo, la apomixis gametofítica se caracteriza por apomeiosis, que es la formación de sacos embrionarios no reducidos derivados de las células nucelares del ovario, así como por partenogénesis, que es el desarrollo del óvulo no reducido en un embrión. La capacidad de lograr la apomixis a través de ingeniería genética o introgresión puede tener un impacto económico importante para los cultivos agrícolas, ya que los programas de mejoramiento tendrían la capacidad de transmitir la apomixis a través de los gametos paternos y luego fijar genotipos híbridos/vigor a través de la propagación clonal de la semilla materna.

Aposporia es una forma de apomixis, que prevalece en la familia de las gramíneas. Esta forma gametofítica de apomixis se caracteriza por el fracaso de la meiosis (apomeiosis) o por la degeneración de productos meióticos y el desarrollo de sacos embrionarios a partir de células nucelares cromosómicamente no reducidas. En estos sacos embrionarios, el óvulo no reducido se desarrolla partenogenéticamente. Por tanto, la apomeiosis y la partenogénesis son dos componentes fundamentales de la apomixis. Los resultados descritos en esta invención demuestran la base molecular de la apomixis en una especie vegetal donde el procedimiento reproductivo ha evolucionado de forma natural. Este descubrimiento puede utilizarse para facilitar la propagación de combinaciones de genes superiores en plantas de cultivo. Un gen que induce el rasgo de apomixis ha sido muy buscado durante décadas. Un gen de este tipo puede ser de gran valor en el fitomejoramiento.

El presente trabajo describe especies apomícticas de los génerosPennisetumyCenchrus;ambos géneros pertenecen a la familia de las gramíneas, que es la familia más importante de plantas cultivadas Uno de los miembros de esta familia es el mijo perla (Pennisetum glaucumsyn.Cenchrus americanus),que es un cultivo de grano diploide sexual con producción significativa en los trópicos semiáridos. El géneroPennisetumtambién tiene muchas especies apomícticas, la mayoría de las cuales se han cruzado con mijo perla en un intento de introducir genes para la apomixis; sin embargo, la esterilidad masculina durante el retrocruzamiento ha limitado hasta ahora su uso para la transferencia convencional del rasgo de apomixis (Dujardin M., Hanna W., J. Hered. 74:277-279 (1983a); Dujardin M., Hanna W., Crop Sci. 23:156-160 (1983b); Dujardin M., Hanna W., Theor. Appl. Genet. 69:97-100 (1984); Dujardin M., Hanna W., Crop Sci. 25:59-62 (1985)). Se han logrado algunos avances con la transferencia convencional mediante el uso deP. squamulatumapomíctico (2n=8X=56) (Akiyama Y. y col., J. Hered. 97:521-524 (2006)) como progenitor masculino en cruces con mijo perla tetraploide inducido artificialmente (Dujardin M., Hanna W., J. Genet. Breed. 43:145-151 (1989)).

Aposporia es el tipo de reproducción apomíctica enPennisetumlCenchrus(Ozias-Akins P. y col., Funct. Integr. Genomics 3:94-104 (2003)),es decir,una o más células somáticas del nucellus comienzan a agrandarse, y el núcleo de cada inicial aposporosa sufre dos divisiones mitóticas sucesivas para producir un saco embrionario de cuatro núcleos. Los cuatro núcleos comprenden el óvulo, dos sinérgicos y un núcleo polar o, alternativamente, el óvulo, un sinérgico y dos núcleos polares. La célula central uni o binucleada debe fertilizarse en especies pseudogámicas para que se desarrolle el endospermo (Kojima A., Nagato Y., Sex. Plant Reprod. 5:79-85 (1992); Naumova T. y col., Acta Botanica Neerlandica 42:299-312 (1993); Nogler G., Gametophytic apomixis, in: B. M. Johri (Ed.), Embryology of Angisoperms, Springer, Berlin. pp. 475-518. (1984)). Por lo tanto, existe una presión de selección para la microsporogénesis normal que da como resultado polen viable, aunque la meiosis femenina puede ser irregular. El óvulo no reducido comienza el desarrollo partenogenético (Vielle J. y col., Link. Planta J. 8:309-316 (1995)) ya sea un poco antes o poco después de la fertilización única de la célula central enCenchrus ciliaris,apomíctico.

El fenotipo reproductivo de especies e híbridos en un género generalmente se puede determinar sin ambigüedades basándose en la selección de un número relativamente pequeño de pistilos limpios (que se han hecho ópticamente transparentes mediante tratamiento químico). El fenotipo del géneroPennisetumtambién se puede establecer mediante un gen marcador rojo dominante (Hanna W., Burton G., J. Heredity 83:386-388 (1992)) que, cuando está presente en el progenitor de polen de un cruce de prueba, permitirá la clasificación de la progenie roja como surgida a través de reproducción sexual.

El origen dePennisetum squamulatumde apomixes se ha descrito previamente (Patente EE. UU. N° 5.811.636). Además, se ha utilizado un marcador de ácido nucleico para identificar un clon que contiene el gen de interés (Patente EE. UU. No. 6,028,185), y se han caracterizado previamente algunos genes aposporiosos (Huo H. «Genetic analysis of the apospory-specific genomic region (ASGR) inPennisetum squamulatum:from mapping to candidate gene» (Tesis Doctoral) (2008). Obtenido de http <colon slash slash> dbs <dot> galib <dot> uga <dot> edu <slash> cgi-bin <slash> getd <dot> cgi?userid=galileo&serverno=9&instcode=ugal; Zeng Y. «Identification and characterization of apospory candidate genes in Pennisetum and Cenchrus» (Tesis Doctoral) (2008). Obtenido de http <dos puntos barra barra> dbs <punto> galib <punto> uga <punto> edu <barra> cgi-bin <barra> getd <punto> cgi?userid=galileo&serverno=9&instcode=ugal)). La apomixis se transmite por una región cromosómica no recombinante físicamente grande enP. squamulatum;esta región se conoce como región genómica aposporia específica (ASGR) (P. Ozias-Akins, D. Roche, WW Hanna, Proc Natl Acad Sci USA 95:5127-5132 (1998)), y los genesPsASGR-BabyBoom-Like(PsASGR-BBML)residen dentro de esta región (G. Gualtieri y col., Plant Physiology 140:963-971 (2006)).

La apomixis enPennisetumse ha mapeado molecularmente mediante marcadores RAPD, RFLP, AFLP y SCAR realizados en poblaciones de retrocruzamiento, así como a través de un cruce pseudoprueba entre el apomito heterocigotoP. squamulatum(como progenitor masculino) y el mijo perla sexual (Dujardin M., Hanna W., J. Genet. Breed. 43:145-151 (1989); Goel S. y col., Genetics 163:1069-1082 (2003); Ozias-Akins P. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5127-5132 (1998); Ozias-Akins P. y col.,. Theor. Appl. Genet. 85:632-638 (1993)). Se determinó que un solo grupo de vínculo del progenitor apomíctico era necesario y suficiente para la transmisión de la apomixis, y se ha transmitido un solo cromosoma intacto a la generación BCs, donde se ha encontrado que reside en un fondo tetraploide de mijo perla (Singh y col., Crop Sci. 50:892-902 (2011)). El mapeo en una segunda especie, a saber,C. ciliaris, haarrojado resultados similares (Jessup R. y col., Crop Sci. 42:1688-1694 (2002); Roche D. y col., Plant J. 19:203-208 (1999)). En ambas especies, el mapeo de alta resolución se evita mediante un bloqueo cromosómico no recombinante, aunque el tamaño del ASGR se ha reducido mediante recombinación a ~1/4 de un cromosoma o ~50 Mb. Recientemente se recuperó un recombinante en pasto buffel que demuestra la separación de apomeiosis y partenogénesis (Conner y col., Planta 238:51-63 (2013)). Este recombinante retuvo la porción de ASGR requerida para la formación de un saco embrionario aposporoso; sin embargo, se perdió la porción de ASGR necesaria para la partenogénesis. La comparación del ASGR entre asto buffel yP. squamulatummuestra conservación tanto a nivel macrosinténico como microsinténico (Goel S. y col., Genetics 173:389-400 (2006); Gualtieri G. y col., Plant Physiol 140963-971 (2006)).

Análisis de secuencia de ADN de clones de cromosomas artificiales bacterianos (Roche D. y col., Theor. Appl. Genet.

104:804-812 (2002)) mapeado a la ASGR se ha realizado para buscar sintenia entre el arroz y las dos especies apomícticas en estudio. Si bien se identificaron pequeñas regiones de microsintenia mientras que no se estableció macrosyntenia se identificaron 25 genesC. ciliarisy 23 deP. squamulatumASGR (Conner J. y col., Plant Physiol.147:1396-1411 (2008)), con los datos de secuenciación mostraron que, en general, la ASGR es una región rica en elementos transponibles y pobre en genes. La identificación de una secuencia de repetición terminal larga (LTR) muy abundante dentro de los datos de secuenciación de ASGR ha permitido el desarrollo de marcadores de polimorfismo amplificado específico de secuencia (SSAP), que se han utilizado para apuntar eficazmente al ASGR (Huo H. y col., Theor. Appl. Genet. 119:199-212 (2009)).

Como se describe en esta invención, enPennisetum squamulatum(L.)R.Br.,se ha encontrado que las apomixas se segregan como un único locus dominante, a saber, el ASGR, que contiene múltiples copias del genPsASGR-BBML.El presente estudio investigó la función dePsASGR-BBMLen plantas de mijo perla tetraploide sexual y plantas Fi apomícticas. Se encontró quePsASGRBBMLse expresaba en óvulos antes de la fertilización, y se descubrió que la expresión dePsASGR-BBMLen mijo perla sexual inducía la partenogénesis y la producción de descendencia haploide. Se encontró que la expresión reducida dePsASGR-BBMLen plantas transgénicas Fi apomícticas que heredan una construcción de silenciamiento dePsASGR-BBMLse corresponde con menos embriones partenogenéticos y número de células en embriones partenogenéticos. Estos datos demuestran el papel clave del genPsASGR-BBMLen la partenogénesis en la vía apomíctica.

Los resultados descritos en esta invención describen un gen encontrado en vectores de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) ASGR estrechamente ligados de ambas especies apomícticas, pero perdido en la planta C.ciliarisrecombinante que carece de partenogénesis; este gen tiene una alta similitud proteica con el genBABY BOOM(BBM)deBrassica napus. BBMse acuñó originalmente como el nombre del gen para una transcripción de ADNc que se indujo en cultivos de microesporas deBrassica napus(BnBBM)sometidos a embriogénesis somática (Boutilier K. y col., Plant Cell 14:1737-1749 (2002)). Las proteinas predichasBnBBM7 yBnBBM2son 98 % similares entre sí y también 85 % similares a su ortólogo deArabidopsis.

Estas tres proteínas tienen la característica clave de una región de dominio AP2. Dominios AP2, llamados así por una repetición de aminoácidos identificada en el genAPETALA2deArabidopsis(Jofuku K. y col., Plant Cell 6:1211-1225 (1994)), un gen de desarrollo de flores que también se mostró involucrado en la regulación de otros genes homeóticos florales, son dominios de unión al ADN de 60-70 aminoácidos (Pfam - PF00847). Estos dominios AP2 son característicos de una gran familia de proteínas de factores de transcripción que se agrupan debido a su similitud en esta región conservada, que está altamente conservada no solo entre BBM sino también entre otros genes de desarrollo relacionados de esta clase.

La familia de dominios de unión a ADN APETALA 2/FACTOR DE RESPUESTA A ETILENO (AP2/ERF) se ha identificado en un amplio grupo de plantas, como musgos, algas, gimnospermas y angiospermas. La familia de genes AP2 se divide en dos grupos, a saber, el tipo ERF (factor de unión al elemento de respuesta al etileno) y los grupos similares a AP2 (Weigel D. Plant Cell 7:388-389 (1995); Ohme-Takagi M. y Shinshi H. Plant Cell 7:173-182 (1995); Okamuro J. y col., Proceedings of the National Academy of Sciences 94:7076-7081 (1997)). El grupo similar a ERF se caracteriza por tener un solo dominio AP2; en este grupo, las funciones tienden a estar relacionadas con las respuestas al estrés (biótico y abiótico) (Riechmann J. y Meyerowitz E., Biol. Chem. 379:633-646 (1998)). Los genes de tipo AP2 contienen dos dominios AP2 (repetición 1 y 2) que tienen similitud entre sí y una región enlazadora interdominio corta; este grupo se puede dividir en dos grupos, a saber, los linajes eu-AP2 (que incluyenAPETELA2)y ANT (paraAINTEGUMENTA).El linaje ANT se puede dividir en sí mismo entre los linajes basalANT y euANT, que contienen motivos específicos euANT1 a 4 (S. Kim, PS Soltis, K. Wall, D.E. Soltis, Mol. Biol. Evol. 23:107-120 (2006)), que contienen los subgrupos de tipo PLETHORA, de tipo AINTEGUMENTA, de tipo AINTEGUMENt A-1, de tipo AINTEGUMENTA-5 y de tipo BBM. Las proteínas dentro de estos subgrupos tienen funciones críticas en el mantenimiento de los meristemas, la proliferación celular, iniciación y crecimiento de órganos, embriogénesis y formación de raíces (A. Horstman, V. Willemsen, K Boutilier, R. Heidstra, Trends in Plant Science 19:146-157 (2014)). El linajeANTes necesario para la iniciación del tegumento y el desarrollo de gametofitos femeninos, además del crecimiento temprano de otros primordios, con la excepción de las raíces (Elliott R. y col., Plant Cell 8:155-168 (1996); Klucher K. y col., The Plant Cell 8:137-153 (1996)). Los genesANT,AtBBMyBnBBMse encuentran dentro del clado ANT (Kim S. y col., Mol. Biol Evol. 23:107-120 (2006)).

Se ha descrito previamente un gen similar a BBM deZea mays Zeamays llamado ODP2 (Patente internacional N° WO2005075655; Patente EE. UU. No. 8.420.893). Sin embargo, el BBM específico de la apomixis difiere sustancialmente de los genes BBM del maíz fuera del dominio AP2. Las proteínas BBM, BBM-like y ASGR-BBM-like comparten un dominio bbm-1 conservado que no se ha identificado en otros miembros del linaje euANT. La deleción del dominio bbm-1 ha eliminado la capacidad de las plantas transgénicas de inducir la embriogénesis somática en cotiledones (S. El Ouakfaoui y col., Plant Mol Biol 74:313-326 (2010)). Un estudio filogenético publicado de las proteínas similares a BBM (S. El Ouakfaoui y col., Plant Mol Biol 74:313-326 (2010)) se amplió para incluir proteínas similares a BBM de monocotiledóneas recién secuenciadas. Se encontró que se formaba un clado distinto de proteínas deOryza sativa,incluidas las ASGRBBM, BBM1 (Os11g19060) y proteínas deSetaria italicayPanicum virgatumen la mayoría de los árboles filogénicos construidos (Figura 2). No se han informado estudios funcionales sobre los genes dentro de este clado, aparte dePsASGR-BBML,aunque la base de datos UniGene en NCBI (http <dos puntos barra barra> www <punto> ncbi <punto> nlm < punto> nih < punto> gov <barra> unigene) y la Base de Datos de la Matriz de Oligonucleótidos del Arroz (http <dos puntos barra barra> www <punto> ricearray <punto> org <barra> expression <barra> expression <punto> php) contiene datos de expresión limitados paraBBM1.

Si bien los genes BBM se han expresado a partir de especies sexuales en óvulos antes de la fertilización, hasta la fecha no se ha observado ni el desarrollo del embrión ni un fenotipo de apomixis. La expresión deBnBBMse ha observado en microsporas 3-4 días después de la inducción (en el momento en que estaban destinadas a convertirse en embriogénicas), persistiendo durante todo el período de tiempo probado (28 días después de la inducción) (Boutilier K. y col., Plant Cell 14:1737-1749 (2002); Malik M. y col., Plant Physiology 144:134-154 (2007)). La expresiónBnBBM, determinada por RT-PCR, también se ha observado en semillas/embriones globulares de 3 días, y se encontró que la expresión persistía durante todo el desarrollo del embrión (Malik M. y col., Plant Physiology 144:134-154 (2007)).BnBBMyBnLEC1(LEAFY COTYLEDON 1),cuya expresión ocurre principalmente durante la embriogénesis de microesporas y cigótica, se consideran marcadores de embriogénesis. También se encontró queBBMera detectable en óvulos deArabidopsisen el endospermo de núcleo libre, según lo establecido por hibridaciónin situ(Boutilier K. y col., Plant Cell 14:1737-1749 (2002)). Si bien se encontró que la expresión en el endospermo declinó una vez que se inició la celularización, hasta la fecha no ha habido evidencia publicada de expresión deBBMen óvulos o células cigóticas dentro de óvulos. Originalmente se consideró queBnBBMproporcionaba una ruta para la inducción de embriones adventicios en semillas, por lo tanto, embriones derivados maternalmente como una forma de apomixis (Patente EE. UU. N° 7.151.170). En embriones adventicios, no se produce ninguna alteración en el desarrollo del saco embrionario; más bien, las células somáticas del óvulo, generalmente nucellus, se dividen directamente para formar embriones. El embrión adventicio es, por tanto, apomixis esporofítica.

Mientras que la similitud de aminoácidos entre las regiones AP2 deASGR-BBMLyBnBBMes alta (96 %), la similitud disminuye significativamente fuera de esta región (35 % de similitud en sentido ascendente y 27 % de similitud en sentido descendente). Se han identificado tres duplicaciones genómicas altamente conservadas dePsASGR-BBMLa partir de BAC p203, p207 ligados a ASGR (JA Conner y col., Plant Physiol. 147:1396-411 (2008)) y p208 hasta la fecha. La secuencia p208PsASGR-BBMLes idéntica a la secuencia p207PsASGR-BBML2(EU559277.1), con la excepción del número de repeticiones AT (11 frente a 17) encontradas en el intrón 1. La conservación de la secuencia genética significa que es no está claro cuáles de las regiones genómicas dePsASGR-BBML se transcriben.El transcritoPsASGR-BBMLcodifica una proteína de 545 aminoácidos derivada del empalme de 8 exones, una UTR 5' de 73 pb y múltiples UTR 3', con longitudes que oscilan entre 30 y 258 pb. El genPsASGR-BBMLcontiene dos dominios de unión al ADN de AP2 y, por lo tanto, se prevé que funcione como factor de transcripción (Figura 1). También se ha encontrado que dos copias deASGR-BBMLunidas a ASGR están presentes enCenchrus ciliarisapomíctico (JA Conner y col., Plant Physiol. 147:1396-411 (2008)), ambos transcritos.CcASGR-BBM-like1contiene un marco de lectura abierto completo casi idéntico aPsASGR-BBMLmientras queCcASGR-BBMlike2contiene dos mutaciones sin sentido, la primera de las cuales se encuentra dentro del primer dominio AP2. También se han aislado deC. ciliaris, dos genesBBML(no ASGR-BBML) relacionados, pero no ligados a ASGR, y se ha encontrado que los ortólogos están presentes enP. squamulatum.Un estudio comparativo previo con arroz mostró queASGR-BBMLestaba más estrechamente relacionado con un genBBMen el locus de arroz Os11g19060 (Conner J. y col., Plant Physiol. 147:1396-1411 (2008)), para el cual no se ha identificado ninguna función hasta la fecha; se ha documentado expresión en semilla (5 días después de la polinización) y embrión (25 días después de la polinización), pero no en pistilo (ver http <dos puntos barra barra> arroz <punto> lantbiology <punto> msu <punto> edu <barra oblicua> cgi-bin <barra> ORF_infopage <punto> cgi? orf = LOC_Os11g19060). Además,ASGR-BBMLse conserva entre ocho especies apomícticas, dePennisetum,pero ausente de las siete especies sexuales analizadas (Akiyama Y. y col., BMC Evol. Biol. 11:289 (2011)).

Debido a la similitud proteica del genASGR-BBM-LIKE(ASGR-BBML)conBBM,se evaluó su uso como gen de «apomixis». Como se describe en esta invención, se identificó el genASGR-BBMLy se caracterizó su papel en la partenogénesis.Se descubrió que ASGR-BBMLtiene un papel importante como gen clave en la inducción de partenogénesis en la vía apomíctica.

Estos resultados demuestran queASGR-BBMLse puede utilizar para lograr la partenogénesis en plantas que normalmente no muestran este fenotipo. El conjunto de semillas de las líneas transformadas fue bajo, y los descendientes de plantas pueden seleccionarse para determinar el nivel de ploidía. De este modo, las líneas transgénicas partenogenéticas pueden producir descendencia que se reduce al nivel diploide (o haploide dentro del contexto del ciclo celular). Dado que la inducción de haploides seguida de la duplicación de cromosomas es una práctica de mejoramiento seguida en muchos cultivos de cereales para obtener líneas homocigóticas más rápidamente, estos hallazgos se pueden utilizar para la inducción de haploides en plantas sexuales o la reproducción clonal a través de una vía apomíctica dependiente de la no reducción cromosómica en los óvulos.

Habiendo descrito la invención en detalle, será evidente que modificaciones y variaciones son posibles sin apartarse del alcance de la invención definido en las reivindicaciones adjuntas. Además, debe apreciarse que todos los ejemplos de la presente divulgación se proporcionan como ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS

Se proporcionan los siguientes ejemplos no taxativos para ilustrar aun más la presente invención. Los expertos en la técnica deberían tener en cuenta que las técnicas descritas en los ejemplos que se encuentran a continuación representan enfoques que los inventores observaron que funcionan en la práctica de la descripción y, por lo tanto, puede considerarse que constituyen ejemplos de modos para su práctica.

EJEMPLO 1

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

Extracción de ADN

La extracción de ADN se logró mediante un protocolo de bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB) (J. Conner, G. Gunawan, P. Ozias-Akins, Planta 238:51-63 (2013)).

Amplificación de PCR

Se requirieron diferentes condiciones de PCR según las combinaciones de cebadores y la longitud del amplicón. La información del cebador y de PCR para todos los amplicones no publicados aparece en la Tabla 1. Las reacciones de PCR se realizaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, a menos que se indique lo contrario. Las reacciones se realizaron en un termociclador GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Foster City, Ca , EE. UU.).

Expresión tisular no cuantitativa por RT-PCR deASGR-BBML

La expresión deASGR-BBMLse confirmó mediante RT-PCR usando ARN aislado de varios tejidos, incluidos los siguientes: ovarios aislados un día antes de la antesis, a través del desarrollo de la semilla y hasta cinco días después de la antesis; anteras 1 día antes de la antesis; puntas de raíces recolectadas de plantas en macetas cultivadas en invernadero; tejido foliar recién emergente; y callo embriogénico derivado de líneas apomícticasPennisetumBCs (M. Singh y col., Crop Science 50:892-902 (2010)). El ARN total se extrajo de los diversos tejidos mediante el mini kit de plantas RNeasy (QIAGEN, Valencia, CA, EE. UU.) y se sometió a tratamiento con ADNasa (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Se utilizaron de tres a cinco microgramos de ARN total para la síntesis de ADNc de primera cadena mediante oligo-dT y SuperScriptIII (Invitrogen). Se usaron dos pl de la reacción de síntesis de ADNc de la primera cadena para la amplificación por PCR usando cebadores específicos deASGR-BBMLp779/80 (Y. Akiyama y col., BMC Evolutionary Biology, 11:289 (2011)) o cebadores del factor 3 despolimerizante de actina (ADF3) p1127/1128 que se utilizaron como control. Los productos de PCR se procesaron en un gel de agarosa al 1,25 %, se tiñeron con bromuro de etidio y se obtuvieron imágenes con el sistema Molecular Imager Gel Doc XR (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.).

Amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) dePsASGR-BBML

Los productos RACE para las UTR 5' y 3' paraPsASGR-BBMLse generaron mediante el kit GeneRacer RLM-RACE (Invitrogen) y se extrajo el ARN total de los tejidos de las espiguillas de la Línea apomíctica BC758 (M. Singh y col., Crop Science 50:892-902 (2010)). Los cebadores de PCR utilizados se enumeran en la Tabla 1. Los productos de PCR amplificados se purificaron en gel con el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) y se clonaron en un PCR4-TOPO (Invitrogen) o un Vector pGEM-T easy (Promega, Madison, WI, EE. UU.). La secuenciación de nucleótidos se realizó con un Sistema de Análisis Genético CEQ 8000 (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE. UU.), y las secuencias se procesaron con Vector NTI (Invitrogen).

Análisis de secuencia del transgénPsASGR-BBML

El ARN total se extrajo de los ovarios el día de la antesis para la descendencia de g3f, es decir, 105, 123, 144 y 159. Se sometieron tres pg de ARN a tratamiento con ADNasa (Invitrogen) y se usaron para la síntesis de ADNc de primera cadena usando oligo-dT y SuperScriptIII (Invitrogen). Se utilizaron dos pl de la reacción de síntesis de ADNc de la primera cadena para la amplificación por PCR mediante cebadores específicos del transgén p1792/p1801 y p2347/p423. Los productos de PCR amplificados se purificaron en gel con el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) y se clonaron en PCR4-TOPO (Invitrogen). La secuenciación de nucleótidos se llevó a cabo en el Laboratorio de Genómica y Bioinformática (Universidad de Georgia, Athens, GA). Se eliminaron los vectores y las secuencias de mala calidad, y luego se ensamblaron las secuencias recortadas usando Geneious Pro 5.6.6 (Biomatters Limited, Auckland, Nueva Zelanda).

Construcciones de transformación

Construcción PsASGR-BBMpromotor-GUSpCambia3301 se digirió conBamHI/NcoIpara eliminar el promotor CaMV 35S, que se reemplazó con un fragmentoBamHI/NcoI PsASGR-BBMLpromotorde 2.074 pb generado por PCR, que se amplificó a partir de BAC p208 (D. Roche y col. Theor Appl Genet., 104:804-812 (2002)) utilizando los cebadores p690 y p692. El sitio BamHI es endógeno al promotor y está ubicado justo corriente abajo de p690. Se incorporó un sitioNcoIen p692. El casete depoliA PsASGR-BBMLpromotor-GUS-Nosen pCambia3301 se eliminó mediante digestión con BamHI/BseYI, se despuntó y luego se colocó en pACH20 (AH Christensen, PH Quail, Transgenic Research, 5:213-218 (1996)) en un sitio HindIII despuntado y desfosforilado para crear el plásmido 2BE.

Construcción gPsASGR-BBMLEl vector pBluescript se diseñó con 2.074 pb del promotorPsASGRBBML,3540 pb del exón 8, región codificante dePsASGR-b Bm Lde 7 intrones de BAC p208 (D. Roche y col. Theor Appl Genet., 104:804-812 (2002)), y 609 pb 3' del codón de terminación, incluida la señal poli(A) predicha.

Construcción RNAi-BBM-3pEl vector de expresión binaria pMCG161 (http <dos puntos barra barra> www <punto> chromdb < punto> org) se utilizó para la construcción del vector ARNi. Se generó un amplicón de 425 pb que cubría el 52 % del último exón dePsASGRBBMLe incorporaba enzimas de restricción para la clonación en pMCG161 mediante los cebadores p966 y p967 y se insertaba en pMCG161 siguiendo las instrucciones disponibles en http<dospuntos barra barra> www <punto> chromdb <punto> org.

Construcción Ubi-HygropCB13 (H. Yang y col., Plant Cell Reports, 17:693-699 (1998)) se digirió conHindIII/BamHIara eliminar el promotor CaMV 35S y se reemplazó con el fragmento del promotor de ubiquitina de maízHindIII/BamHI(Ubi-1)de pAHC20 (A. H. Christensen, P. H. Quail, Transgenic Research, 5:213-218 (1996)).

Transformación de plantas

Los callos embriogénicos generados a partir de embriones inmaduros de 7-10 días de plantas IA4X sexuales tetraploides fueron bombardeados, seleccionados (25 mg/l Higromicina B o 15 mg/l PPT) y regenerados según un protocolo anterior (J. J. Goldman, W. W. Hanna, G. Fleming, P. Ozias-Akins, Plant Cell Rep., 21:999-1009 (2003)). Las líneasPsASGR-BBMpromotor-GUSfueron bombardeadas con una mezcla de plásmidos 2BE y p524EGFP.1 (GH Fleming, O. Olivares-Fuster, S. Del-Bosco, J.W. Grosser, In Vitro Cell Dev Biol Plant 36:450-455 (2000)), las líneasgPsASGR-BBMLfueron bombardeadas con una mezcla de plásmidosgPsASGR-BBML,p524EGFP.1 yUbi-Hygro,y las líneas ARNi fueron bombardeadas con plásmidoARNi-BBM-3p.

Rescate de Embriones

Los medios para el rescate de embriones se basaron en trabajos previos para embriones cigóticos dePennisetuma 5 DAP (C. Nitsch y col., «Production of haploid plants of Zea mays and Pennisetum through androgenesis.» Variabilidad en plantas regeneradas a partir de cultivo de tejidos. Praeger, Nueva York (1982): 69-91) y utilizó IX Nitsch & Medio basal de Nitsch c/ vitaminas (PhytoTechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS), 1 % sacarosa, ácido giberélico (1 mg/L), ácido indolacético (0,03 mg/L), agar al 0,75 %, pH 5,8 con mezcla conservante de plantas (PPM) al 0,2 % (Plant Cell Technology, Inc., Washington, DC). Las semillas en desarrollo (10 a 15 días después de la polinización) y maduras se esterilizaron de acuerdo con un protocolo anterior (J.J. Goldman, W.W. Hanna, G. Fleming, P. Ozias-Akins, Plant Cell Rep., 21:999-1009 (2003)). Los embriones se extrajeron quirúrgicamente, se colocaron con el escutelo hacia arriba en el medio y se monitoreó la elongación de las raíces y los brotes. Los embriones se dejaron en el medio GA/IAA por hasta 10 días y luego se descartan si no se produjo el crecimiento de raíces/brotes. La descendencia con crecimiento de raíces y brotes se trasladó a un medio IX Murashige & Skoog (MS) c/vitaminas (PhytoTechnology Laboratories) complementado con 3 % sacarosa, agar al 0,75 % pH 5,8 con PPM hasta que el crecimiento permitió el endurecimiento y el movimiento al invernadero.

Tinción de X-Gluc para la actividad de la B-glucuronidasa para las líneasPsASGR BBMpromotor-GUS

Se produjeron ocho líneas independientesPsASGR_BBMpromotor-GUSque contenían un transgén de longitud completa basado en amplificaciones de PCR superpuestas utilizando cebadores específicos del transgén, a saber p2354/p2355; p2349/p2350; y p2885/p2886 (Tabla 1). Se permitió que las líneasPsASGR_BBMpromotor-GUST⁰se autopolinizaran o se polinizaran de forma cruzada con polen apomíctico BCs-Línea 63. Se germinaron semillas de 5 líneas y luego se genotipificaron para herencia del ASGr si se cruzaron y el transgénPsASGR_BBMpromotor-GUSInicialmente, se examinaron los patrones de expresión génica dePsASGR_BBMpromotor-GUSde ovarios disecados un día antes de la antesis o el día de la antesis de las cabezas embolsadas antes de la extracción del estigma; los estigmas se eliminaron mecánicamente antes de la antesis.

Nuevas plantasPsASGR_BBMpromotor-GUS sehicieron germinar y se aislaron en un solo invernadero con el fin de controlar aún más la polinización involuntaria. Todas las cabezas se cortaron continuamente antes de la eliminación del polen para mantener el invernadero libre de polen de mijo. Los floretes se recolectaron un día antes de la antesis, y las anteras se retiraron manualmente. Las flores emasculadas se colocaron luego en medio IX MS, agar al 0,75 %, pH 5,8 con PPM al 0,2 %, y se incubaron en una cámara de crecimiento en condiciones de luz de día largo a 27 °C durante 24 horas. Los ovarios se disecaron y se incubaron en una solución de reacción X-Gluc (fosfato de sodio 100 mM/pH 7,0, EDTA 10 mM, ferrocianuro de potasio 0,5 mM, ferrocianuro de potasio 0,5 mM, Triton X-100 al 0,1 % y 5-bromo-4-cloro-3-p-D-glucurónido 1 mM) a 37 °C durante 48 horas. Los ovarios teñidos con X-Gluc se deshidrataron en etanol al 15, 30 y 50 % a temperatura ambiente durante 1 hora cada uno y luego se fijaron en FAA (etanol al 50 %, formaldehído al 3,7 % y ácido acético al 5 %) durante la noche. Los ovarios fijados con FAA se deshidrataron más en etanol al 70, 85, 90, 100 y 100 % a temperatura ambiente durante 1 hora cada uno, luego los ovarios deshidratados se limpiaron mediante una serie de soluciones de etanol: salicilato de metilo (3:1, 1:1, y 1:3 durante 1 hora cada uno). Los ovarios depurados se almacenaron en salicilato de metilo al 100 % durante 1 hora. Imágenes de contraste de fase de los ovarios fueron adquiridas con un microscopio Axioskop 2 Plus, una cámara AxioCam y el software Axio Vision 4.8 (Zeiss, Thornwood, NY).

Genotypado de lóneas transgénicas degPsASGR BBML/ Ubi Hygo

Se recuperaron nueve líneas independientes que contenían tanto las construccionesgPsASGR_BBMLcomoUbi_Hygo,basados en los resultados de la amplificación por PCR utilizando p1800/01 y p297/298, respectivamente

Citometría de flujo

Las muestras se procesaron para analizarlas en un citómetro de flujo BD Accuri C6 (BD Biosciences, San José, CA EE. UU.) o en un analizador Partec Ploidy (Partec, Munster, Alemania). El procedimiento implicó cortar tejido de hojas jóvenes de sorgo (control) y muestras (desconocidas) en 1000 pL de tampón de extracción de núcleos Tris-MgCl2 (Tris-HCl 0,2 M, pH 7,5, MgCl24 mM x 6h20, Triton X-100 al 0,5 %) y pasar la mezcla a través de un filtro desechable CellTrics de 30 pm (Partec). Se añadieron 500 pL de solución de ARNse/yoduro de propidio (BD Biosciences) a las muestras filtradas, que luego se incubaron en hielo durante 15 minutos. Para el análisis de citometría de flujo BD Accuri C6, la activación se estableció mediante la selección de objetos que exhibían una fuerte correlación entre las señales FL2 y FL3 usando una tasa de flujo de muestra de 14 pL por minuto. Se recopilaron al menos 3000 eventos para cada muestra dentro de la región cerrada. Las muestras se procesaron en el analizador Partec Ploidy hasta que se pudieron llamar picos con seguridad. El nivel de ploidía se determinó en base a los picos de muestra G1 y G2 en relación con los picos de control de sorgo G1 y G2.

Recuentos cromosómicos de punta de raíz

Si estaban disponibles, se recolectaron seis puntas de raíces sanas de la descendencia de g3f, se limpiaron de tierra, se colocaron en tubos Eppendorf con 300 pl de dH20, se trataron con óxido nitroso durante 2 a 2 A horas por debajo de 150 psi y finalmente se fijaron en etanol: ácido acético fresco (3:1) por un mínimo de 2 días. La región meristemática de la raíz se incubó en celulasa RS al 0,3 % (Karlan Research, Torrance, CA), pectoliasa Y23 al 0,3 % (Karlan Research) y citohelicasa al 0,3 % (Sigma-Aldrich, St. Louis) en tampón de citrato 30 mM, a un pH de 4,5 a 37 °C durante 60-90 minutos. Después de la digestión enzimática, se extendieron individualmente un mínimo de 3 puntas de raíces de cada planta en portaobjetos de vidrio. Se localizaron las extensiones cromosómicas, se fotografiaron digitalmente y luego se contó el número de cromosomas utilizando Adobe Photoshop CS6. El nivel de ploidía de cada planta se determinó utilizando un mínimo de 4 extensiones procedentes de al menos 2 portaobjetos.

Detección de ARNi

Se recuperaron dieciséis líneas IA4X tetraploides sexuales independientes que contenían la construcciónRNAi_BBM_3pbasada en la amplificación por PCR para el gen BAR y las inserciones de ARNi sentido y antisentido utilizando los siguientes cebadores: p992/p993, p1222/p1223 y p1224/p1125, respectivamente. Ocho líneas se cruzaron con polen deP. squamulatum,generando de ese modo descendencia F¹. Las plantas de la descendencia F¹de cada línea se seleccionaron con cebadores específicos de P. squamulatump1032/1035, cebadores deRNAi_BBM_3pp992/p993, p1222/p1223 y p1224/p1125, y cebadores específicos de ASGR Ugt197 (P. Ozias-Akins, D. Roche, W. W. Hanna, Proc Natl Acad Sci USA 95:5127-5132 (1998)). Posteriormente, plantas ASGRpositivo/ARNipositivo y ASGR-negativo/ARNi-positivo se analizaron para determinar la expresión del transgén de ARNi mediante análisis de RT-PCR del ARN total de tejido foliar y cebadores. p1226/p1227 derivados de la región del terminador de la octopina sintasa del transgén. Se eligieron veinticinco plantas de 5 líneas para análisis adicionales; incluyendo plantas 14 ASGR-positivo/ARNi-positivo, 5 ASGRpositivo/ARNi-negativo y 6 ASGR-negativo/ARNi-positivo.

Análisis Semicuantitativo de la Expresión dePsASGR-BBML

La cuantificación semicuantitativa por RT-PCR dePsASGR-BBMLPsASGR-BBML se basó en un protocolo anterior (E. Albertini y col., Plant Molecular Biology 56:879-894 (2004)). Cebadores de ADF3 p1127/1128 se utilizaron como control interno, junto con cebadores específicos dePsASGR-BBML,a saber p779/p780 (Y. Akiyama y col., BMC Evolutionary Biology, 11:289 (2011)). Cada ensayo utilizó 3,3 |jg de ARN total extraído de los ovarios el día de la antesis mediante el mini kit de plantas RNeasy (QIAGEN), y las muestras se sometieron a tratamiento con ADNasa (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) para la síntesis de ADNc de primera cadena utilizando oligodT y SuperScriptlII (Invitrogen). Se utilizaron dos j l de la reacción de síntesis de ADNc en todas las reacciones de PCR; todas las reacciones se realizaron por triplicado. Se encontró que el número de ciclos de PCR determinado empíricamente paraADF3yPsASGR-BBMLera de 26 y 40 ciclos, respectivamente. La formación de imágenes de hibridación se realizó mediante aparato para diagnóstico de imágenes con placas de fósforo (phosprorimaging) Storm (Amersham Biosciences, Pittsburgh, PA, EE. UU.), y las bandas se cuantificaron utilizando ImageQuant v5.0 siguiendo las instrucciones del fabricante (Amersham Biosciences).

Análisis histológico del desarrollo embrionario en líneas de ARNi

Las cabezas se colocaron en bolsas antes de la extracción del estigma y se eliminaron los estigmas antes de la antesis para evitar la polinización. Las espiguillas de las cabezas se recolectaron 2 días después de la antesis, se fijaron en FAA y luego se sometieron a un tratamiento de vacío de 30 minutos a 15 mm Hg antes de una fijación de 24 horas a temperatura ambiente. La deshidratación se inició con TBA1 (etanol al 40 %, alcohol butílico terciario al 10 % (TBA), agua destilada al 50 %) durante 2 horas, luego se transfirió a través de TBA2 (etanol al 50 %, TBA al 20 %, agua destilada al 30 %) durante 8 horas, TBA3 (etanol al 50 %, TBA al 35 %, agua destilada al 15 %) durante 1 hora, TBA 4 (etanol al 45 %, TBA al 55 %) durante 1 hora, TBA 5 (etanol al 25 %, TBA al 75 %) durante 1 hora y TBA 6 (TBA 100 %) durante 1 hora. Luego, los ovarios se transfirieron a TBA fresco al 100 % durante otras 8 horas antes de ser transferidos a TBA: aceite de parafina (Fisher, Pittsburgh, PA, EE. UU.) (1:1) a 58 °C durante la noche. Los ovarios se sometieron a tres cambios de Paraplast X-tra puro (Fisher, Pittsburgh, PA) durante 48 horas cada uno antes de la inclusión. A continuación, se llevó a cabo el seccionamiento de todas las muestras a 9 jm . Las muestras se tiñeron con safranina. O/verde rápido usando una modificación a un protocolo previamente descrito (Jensen 1962) donde las muestras incluidas y seccionadas se desparafinaron en etanol, luego se recubrieron con nitrocelulosa al 0,05 % (diluida de colodión, Fisher, Pittsburgh, PA) en éter-alcohol (50 % de dietil éter, etanol al 50 %) durante 30 segundos. La rehidratación de las muestras se logró mediante transferencia a través de etanol al 70 %, etanol al 30 % y agua destilada durante 5 minutos cada una. La tinción se realizó primero en solución de safranina O (4 g de safranina O, 100 ml de agua destilada, 100 ml de etanol al 95 %, 4 g de acetato de sodio) durante 5 minutos. A continuación, las muestras se sometieron a deshidratación en la siguiente serie de soluciones durante 5 minutos cada una: dos cambios de agua destilada, etanol al 50 %, etanol al 95 %, etanol al 100 %. Posteriormente, las muestras se tiñeron en una solución de color verde rápido (1 g de verde rápido, 100 ml de etanol al 100 %, 100 ml de Cellosolve y 100 ml de aceite de clavo) durante 4 segundos, luego se colocaron inmediatamente en aceite de clavo puro durante 10 segundos, antes de transferirlas rápidamente a mezcla aclaradora (50 % de aceite de clavo, 25 % de etanol, 25 % Histoclear). Los portaobjetos se aclararon finalmente en Histoclear durante 5 minutos y luego se montaron con Permount.

Análisis Filogenético

Las proteínas identificadas en el clado similar a BBM (S. El Ouakfaoui et al., Plant Mol Biol 74:313-326 (2010)) se descargaron de NCBI. A continuación, se realizó una búsqueda individual de cada miembro del clado Grass en Phytozome utilizando BLASTP y la proteína PsASGR-BBML completa. Se descargaron todas las proteínas con similitud conPsASGR-BBMLque se extienden más allá de los dominios AP2, mientras que las proteínas truncadas y las que no tienen un dominio bbm-1 (S. El Ouakfaoui y col., Plant Mol Biol 74:313-326 (2010)) fueron eliminadas. Las bases de datos diana de fitozomas empleadas fueron el proteoma deSorghum bicolorv1.4; proteoma deZea mays,proteoma deSetaria italica,proteoma dePanicum virgatumv0.0, proteoma deOryza sativay proteoma deBrachypodium distachyon.Las proteínas que resultaron ser idénticas entre el clado similar a BBM (S. El Ouakfaoui y col., Plant Mol Biol 74:313-326 (2010)) y Phytozome fueron eliminadas. Se alinearon veintiséis secuencias de aminoácidos utilizando múltiples programas de alineación basados en la web; los resultados fueron que tanto las alineaciones T-Coffee (http <dos puntos barra barra> tcoffee <punto> crg <punto> cat <barra> apps <barra> tcoffee <barra> do <punto> regular) y Mafft (http <dos puntos barra barra> mafft <punto> cbrc <punto> jp <barra> alignment <barra> server) identificaron los dominios más conservados del clado similar a BBM, especialmente dentro del término C de las proteínas sin editar. La alineación de T-Coffee produjo una longitud de secuencia de consenso de 1.067 aminoácidos con 283 posiciones conservadas para todas las proteínas (Figura 1). La alineación de Mafft produjo una longitud de consenso de 1.040 aminoácidos con 264 posiciones conservadas para todas las proteínas usando el comando E-INS-I. La alineación de T-Coffee se utilizó para crear árboles filogenéticos (P. Di Tommaso y col., Nucl. Acids Res. 39 (supl. 2): W13-W17 (2011)) a través del software MEGA6 (K. Tamura y col., Molecular Biology and Evolution 30:2725-2729 (2013)) (Figura 2).

EJEMPLO 2

SOBREEXPRESIÓN DE ASGR-BBML EN ARABIDOPSIS

Se identificó un ADNc deASGR-BBMLde longitud completa deP. squamulatummediante RACE 5' y 3'. Se encontró que el ADNc estaba sobreexpresado enArabidopsisusando el promotor CaMV35S, con efectos pleiotrópicos de sobreexpresión como la formación de brotes ectópicos, proyecciones con tricomas y flores incompletas (Figuras 3A-C). Se encontró que la fertilidad estaba alterada en estas líneas y se observó una segregación distorsionada del transgén. El fenotipo de sobreexpresión deASGR-BBMLse interpreta más fácilmente cuando la sobreexpresión está bajo el control de un promotor inducible.

EJEMPLO 3

EXPRESIÓN DE ASGR-BBML EN P. SQUAMULATUM, C. CILIARIS Y RETROCRUZAMIENTOS APÓMICOS

Se encontró que la transformación del mijo perla tetraploide sexual con la copia genómica de la construcción del gen ASGR-BBML, que incluye un promotor y 3'UTR, induce la formación de embriones en sacos embrionarios derivados meióticamente en ausencia de la correspondiente fertilización endospermática. La fertilización se evitó embolsando las cabezas antes de la extracción del estigma y la posterior eliminación del estigma/estilo antes de la extracción de la antera, siendo la evidencia de falta de fertilización en los óvulos la persistencia de dos núcleos polares en la célula central y la ausencia de formación de endospermo. La expresión deASGR-BBMLse observó previamente mediante RT-PCR en dos especies apomícticas (P. squamulatumy C.ciliaris)y en 7 y 8 líneas de retrocruzamientos apomícticos dePennisetum(M. Singh y col., Crop Science 50:892-902 (2010)) en los ovarios comenzando 1 día antes de la antesis y continuando hasta el desarrollo temprano de la semilla, en las anteras 1 día antes de la antesis y las raíces.

Se encontró que PsASGR-BBMLse expresaba en callos embriogénicos derivados de líneas apomícticas dePennisetumbC^s. En las especies apomícticas y los retrocruzamientos apomícticos, el desarrollo embrionario en sacos embrionarios aposporosos puede iniciarse antes de la liberación de polen, continuando durante varios días después de la liberación de polen cuando se previene la polinización y no se forma endospermo (Figura 4). Aunque los embriones globulares y en etapas posteriores mostraron una buena señal, los niveles bajos de expresión del genASGR-BBMLen tejidos reproductivos dieron como resultado experimentos de hibridaciónin situde ARN no concluyentes para etapas tempranas del desarrollo embrionario (Figuras 5A-D). Por tanto, la expresión se determinó mediante RT-PCR.

Pistilos no polinizados se examinaron tanto para la transcripción deASGR-BBMLcomo para el desarrollo del embrión antes del día de la liberación del polen y hasta dos días después de la liberación del polen; la polinización se evitó eliminando los estigmas. Se demostró que la expresión del genASGR-BBMLse correlaciona con el desarrollo partenogenético del óvulo no reducido enP. squamulatumy C.Ciliarisapomícticos; es decir, la expresión se detectó en ausencia de polinización asegurada por la eliminación de los estigmas antes de la dehiscencia de las anteras y el desprendimiento de polen (DAP0 en la Figura 6). Anteras, polen y raíces deP. squamulatumy C.ciliarismostraron expresión deASGR-BBML,pero no los estigmas ni el tejido foliar; sin embargo, la expresión en la hoja se demostró en las líneas apomícticasPennisetumBC⁷y BCs. El patrón temporal de expresión (mediante RT-PCR semicuantitativa) de un segundo gen expresado en embriones, específicamenteLEC,y los genesno-ASGR-BBMLidentificados en C.ciliaris,se retrasó ligeramente en comparación conASGR-BBML g. Se ha demostrado queAtBBM regula al alza su propia expresión, pero no regula directamente la expresión deLEC(Passarinho P. y col., Plant Mol. Biol. 68:225-237 (2008)). Por consiguiente, los genesno-ASGR-BBMLpueden ser dianas deASGR-BBML.

EJEMPLO 4

ELIMINACIÓN DE LA EXPRESIÓN ASGR-BBML

El mijo perla tetraploide se transformó con una parte de la región codificante deASGR-BBMLen una construcción de repetición invertida (IR) mediante bombardeo de microproyectiles y selección en fosfinotricina. La transcripción de la IR procedió a través del promotor CaMV 35S. El silenciamiento génico dependiente de la homología depende de la formación de ARN en horquilla y de la activación de la interferencia del ARN donde las transcripciones genéticas endógenas se dirigen a la degradación (Ossowski S. y col., Plant Journal 53:674-690 (2008); Eamens A. y col., Plant Physiology 147:456-468 (2008)). Según la hibridación por transferencia Southern, la IR deASGR-BBm Lno mostró una homología significativa con el mijo perla.

Las líneas de ARNi se generaron por transformación de IA4X tetraploide, pero no se esperaba ningún fenotipo de ARNi hasta que la IR se combinó con el ASGR por cruzamiento. Los cruces de líneas de ARNi IA4X conP. squamulatumprodujeron una progenie que combinó ambos genes y luego se examinaron para detectar la transcripción del transgén, cambios en la transcripción deASGR-BBMLy cambios en el desarrollo reproductivo. La transcripción deASGR-BBMLdeterminada por RT-PCR semicuantitativa varió en la progenie de varios eventos, como sigue: una reducción en la señal deASGR-BBML(Figura 6A) correlacionada con un desarrollo embrionario precoz reducido (Figura 6B) y evento S7>S4>S2>S5. Se hicieron observaciones similares mientras se analizaba una línea de eliminación que contenía una porción diferente del gen como una repetición invertida expresada bajo el control del promotor de la actina 1 del arroz.

Dado que no se obtuvo una eliminación completa de ninguno de estos experimentos, estos datos no correlacionaron la expresión deASGR-BBMLcon el grado de desarrollo del embrión frente a la causalidad (la expresióndeASGR-BBMLfue responsable de la inducción de embriones); por lo tanto, se llevaron a cabo experimentos adicionales para probar el papel deASGR-BBMLen la partenogénesis. Estos consistieron en las siguientes etapas: 1) transformación de mijo perla sexual con beta-glucuronidasa (GUS) como gen reportero, expresado bajo el control del promotor BBM nativo, y 2) transformación de mijo perla sexual conASGR-BBML,ya sea como ADNc o como ADN genómico bajo el control de su promotor nativo.

Aunque el patrón de expresión órgano-específico deASGR-BBMLse ha caracterizado ampliamente por RT-PCR en dos especies apomícticas (P. squamulatumyC. ciliaris)y retrocruzamientos apomícticos dePennisetum,esto no permite determinar la ubicación celular de expresión. La expresión en apomictas se observó en gineceo (pistilos) hasta 2 días antes de la polinización; también se observó expresión después de la polinización cuando los embriones comenzaron a desarrollarse y continuaron creciendo. Estos análisis se realizaron mediante RT-PCR porque los transcritos deASGR-BBMLson de baja abundancia en la ginecia en la antesis; por lo tanto, las transcripciones no se detectaron mediante hibridaciónin situ.

El patrón de expresión dePsASGR-BBMLse investigó a nivel celular en los ovarios antes de la fertilización mediante una construcción del promotor-GUS dePsASGR-BBML.En líneas apomícticas recuperadas de cruces con mijo perla transgénico, se identificaron óvulos no reducidos en división que expresaban GUS en sacos embrionarios aposporosos (Figura 7). En sacos embrionarios no fertilizados el día de antesis, se observó señal de GUS dentro del óvulo; a veces se producía una señal de GUS más débil en los sinérgicos (Figura 8A-C). La señal sinérgica se puede atribuir a una menor expresión dePsASGR-BBMLo a la fuga de la señal de GUS del óvulo. La presencia de células sinérgicas intactas y núcleos polares dentro del saco embrionario demuestra que la expresión dePsASGR-BBMLocurre antes de la fertilización. No se visualizó tinción de GUS en la célula central o células antípodas del saco embrionario sexual o en los tejidos de ovario circundantes (Figura 8A-C). La actividad de GUS también se identificó en células del embrión en desarrollo caracterizadas hasta 3 días después de la fertilización (Figura 8D); La actividad de GUS no se identificó en el endospermo en desarrollo.

Este patrón de expresión indica que BBM es autónomo de la célula y se expresa dentro de un marco de tiempo de desarrollo que es consistente en un papel en la partenogénesis. Para obtener una evidencia más definitiva, el mijo perla sexual se transformó conASGR-BBMLcomo ADNc o ADN genómico bajo el control de su promotor nativo. Las dos versiones de la construcción son como se describen a continuación de acuerdo con las secuencias proporcionadas en la Tabla 2 a continuación, que proporciona el ADNc, el ADN genómico, la secuencia de aminoácidos y la secuencia promotora de ASGR-BBML Construcción genómica: promotor ASGR-BBM de 2074 pb (p208) (que contiene una secuencia del sitio de restricción GGATCC BamHI de 6 residuos) corriente arriba de la región codificante de 3540 pb (exones: intrones) así como 610 pb de la 3'UTR. Construcción de ADNc: promotor ASGR-BBM de 2074 pb (que contiene una secuencia del sitio de restricción GGATCC BamHI de 6 residuos) fusionado a la región codificante de ADNc de 1.638 pb así como a 610 pb de la región 3 'UTR. La alineación del ADNc con el ADN genómico se muestra en la Figura 9.

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inicio se indican mediante un subrayado simple y los codones de terminación se indican mediante un subrayado doble.

GGATCCAGCCATGTCTAAACGATCAACAGATGACTGCCTAATATAAGGTTTTTGGGT TGTTGAATAATTAGGCAATATCCATATTAGATTCCGAAAGCAGTAAAACATGACAAT GATAGTAACTAGTATGCACGCATAAGACATACTAGACGATAGTAACAACATAACCA TGAACTCAGTAAACATGACTAAAGATTGGATCTTAGATCCGTACCTGGCGCTCAGAG TTGCAAGCACTGCGGAGGGCGTCGATACTTCGGGGAAGACAAGCGGCGCAGACGAA GCGACGACGGTGTTCCGGACGGCACGTAGCAGCCGACATTGAAGGCAATGCGCCCT CTCGTCAGGAGACTTGCTAGGAAGACGAGCCACGATGACGACGATTGAGCAGTCAC GCGGAGCACTTCCCAAAAACCTTATTCGCCCTCTCCCGGTGCAGGATCGCAAGGACG GACGGTTCCGGAGACCTGCTCTCCCAATCACCTGTGCACGCAGGTGTTCGGGATGGA GTAGATGGCGGCGGCGGCGGCGCAGCAGCGAGCGAGAGAGGCAAAGTCCTAACTC AGATCAGATCTATTTTAGGGATACCCTTTCATGGGGCCTTTCCGTAGATAGTCTATTG TGCATCTCTTCTGTGAGGGGGTGGTCCATTTTTATATGGAGGGAAACCTCCAACACC CTCGTCTATTAGCAATATGAGACTAATAGATGGTGTACCCCCTCATCACGCTAATGG GCCTTTGAGATTTATTCAGGAATTATTGGATTGGCTAATGGGCCAAGCCCAAAATTC CAACACAATCAAGTTTGCCTCGCATATCTCGATTCTCGAACCAACCTCCGAGCCATA TCTGATTGTAGACAAGTAAACAAACTCGGAGGCGGAAGGGGGAACTGACCCGTTGA ACGCCGTCACTGCCGGAACCGACGTCGCCGTCACTGAAGAAGAAGGAAGATGCTTC CGAACCACCCAATACAAAACCTCACTAATTCCTCGCTGACGCCAGAGCAGACGCCG ACGAAACGGGAAAGGAGTCAAAATACCTTATTCCATCGCCACCACATCATTTGGGC GCTGCTCGCTGATACGCCGGCGGGAGCGGTGGCAGCCAGGTGTACGCCCCCGCGGA CTGCGCGCCGGCTGGCCGGCCGGCCACCGGGGCCGGGGCCCTTCAATCTCTTAGGG CGTCCCCAACAAGGCTGATTCAGCTAGCTATTTGAGTGTACACATCAGCATGTATCC TACATGGAGGAAAGAGAGTATGCATTGAACATTGAGCCGGCTATTTGCTCGTCGCCT ATCTAGCACATCACCCAAGGCAGCGCTGTGTCTATGGCCTGGCAGAAAATATTGTTT AAATAACAAGTAGCCAGCTTTAGTAGATAGTACTTTCTCTTGCTGGCTTTTTTTTTTT TTGATAACAGCTCTTGCTGGCTTTTAGCGTGCCGGCTCCGAGCTACTCCCTCTGTCCC AGAATTTGAGTCGCCGGCCAACAGTGAAATGAGAGAGGGGCACGGAGTCCCAACGA CAGTAATATTGGGACAGGGAGTAGCAGCTATCCAGGACTGCTGTAGACGCCCTTAG TCCTCGACTCCTCGCAGCCTTTCGCCGTTGAAAGAATCACACCGCCCCCTGCAGTTA CGTGTTAACCCAACCCGGGCCATTGGTCAGTCCCTAACCCGGGCGGTTGACCGCTAG AAATTAGAATTAACCCTTGGTTAACACCGGTCAAAGCGCACATATGCGGTGCAATCT AATCGAAGTGGCCGCGTCATAATTACACACGCCCGCTCCTATACGTGTGCCCCGTTC ATACGCATGCTCACCTCGCGCGTTCCCATGAGGTTTCACACCCCTTGTGGGAATCCA AGGCGTCAGAGATTTATTGATCCCATTTCCCTAGCCTGCCTCGCCTCTCTATCTACTT GT GT GGAGATT AGAGC AC AGC AGC GAGA A AGGGC TT GC AGT C T AT A A AGGC GAC A A GAGCCCACACCCTCCTCTCTCTCTCTCTTCTCTCTCTCCATTTCTCTTCCCTAGGATCA GTGCTAGTGCTTGCAGCGGCCGCGTTCCGAGATGGGTTCCACCAACAACTGGCTGCG CTTCGCCTCGTTCTCCGGCGGCGGCGGCGCCAAGGATGCCGCGGCCCTGCTCCCGCT GCCGCCCTCGCCCCGTGGCGATGTCGACGAGGCCGGCGCAGAGCCGAAGCTCGAGG ACTTCCTCGGCCTGCAGGAGCCGAGCGCCGCCGCGGTGGGGGCTGGGCGGCCATTC GCGGTGGGTGGCGGTGCGAGCTCCATCGGGCTGTCCATGATCAGGAACTGGCTGCG

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GGATCCAGCCATGTCTAAACGATCAACAGATGACTGCCTAATATAAGGTTTTTGGGT TGTTGAATAATTAGGCAATATCCATATTAGATTCCGAAAGCAGTAAAACATGACAAT GATAGTAACTAGTATGCACGCATAAGACATACTAGACGATAGTAACAACATAACCA TGAACTCAGTAAACATGACTAAAGATTGGATCTTAGATCCGTACCTGGCGCTCAGAG TTGCAAGCACTGCGGAGGGCGTCGATACTTCGGGGAAGACAAGCGGCGCAGACGAA GCGACGACGGTGTTCCGGACGGCACGTAGCAGCCGACATTGAAGGCAATGCGCCCT CTCGTCAGGAGACTTGCTAGGAAGACGAGCCACGATGACGACGATTGAGCAGTCAC GCGGAGCACTTCCCAAAAACCTTATTCGCCCTCTCCCGGTGCAGGATCGCAAGGACG GACGGTTCCGGAGACCTGCTCTCCCAATCACCTGTGCACGCAGGTGTTCGGGATGGA GTAGATGGCGGCGGCGGCGGCGCAGCAGCGAGCGAGAGAGGCAAAGTCCTAACTC AGATCAGATCTATTTTAGGGATACCCTTTCATGGGGCCTTTCCGTAGATAGTCTATTG TGCATCTCTTCTGTGAGGGGGTGGTCCATTTTTATATGGAGGGAAACCTCCAACACC CTCGTCTATTAGCAATATGAGACTAATAGATGGTGTACCCCCTCATCACGCTAATGG GCCTTTGAGATTTATTCAGGAATTATTGGATTGGCTAATGGGCCAAGCCCAAAATTC CAACACAATCAAGTTTGCCTCGCATATCTCGATTCTCGAACCAACCTCCGAGCCATA TCTGATTGTAGACAAGTAAACAAACTCGGAGGCGGAAGGGGGAACTGACCCGTTGA ACGCCGTCACTGCCGGAACCGACGTCGCCGTCACTGAAGAAGAAGGAAGATGCTTC CGAACCACCCAATACAAAACCTCACTAATTCCTCGCTGACGCCAGAGCAGACGCCG ACGAAACGGGAAAGGAGTCAAAATACCTTATTCCATCGCCACCACATCATTTGGGC GCTGCTCGCTGATACGCCGGCGGGAGCGGTGGCAGCCAGGTGTACGCCCCCGCGGA CTGCGCGCCGGCTGGCCGGCCGGCCACCGGGGCCGGGGCCCTTCAATCTCTTAGGG CGTCCCCAACAAGGCTGATTCAGCTAGCTATTTGAGTGTACACATCAGCATGTATCC TACATGGAGGAAAGAGAGTATGCATTGAACATTGAGCCGGCTATTTGCTCGTCGCCT ATCTAGCACATCACCCAAGGCAGCGCTGTGTCTATGGCCTGGCAGAAAATATTGTTT AAATAACAAGTAGCCAGCTTTAGTAGATAGTACTTTCTCTTGCTGGCTTTTTTTTTTT TTGATAACAGCTCTTGCTGGCTTTTAGCGTGCCGGCTCCGAGCTACTCCCTCTGTCCC

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LÍNEAS DE MILLET DE PERLAS TRANSGÉNICAS QUE CONTIENEN gPsASGR-BBML

Las líneas transgénicas se regeneraron a partir de estos experimentos, y se bombardearon dos placas de tejidos embriogénicos de mijo perla para cada construcción. Para estas construcciones, el gen marcador seleccionado fue para la resistencia a la higromicina en lugar de la resistencia a la fosfinotricina. De 5 líneas de construcción de ADNc, que constan de 13 plantas en total, que se regeneraron y cribaron mediante aclaramiento de óvulos, 3 plantas mostraron una baja frecuencia de pequeños grupos de células en división densamente citoplasmáticas en el nucelo; sin embargo, ninguno de estos se interpretó claramente como la representación de una estructura embrionaria organizada más allá de la etapa globular.

De las nueve líneas transgénicas independientes (18 plantas) que contienen el transgén,gPsASGR-BBML,generado a partir de mijo perla tetraploide sexual, cuatro líneas, que constan de seis plantas, no se analizaron como resultado de la falta de floración o desaparición de la planta. Cuatro plantas dentro de 3 líneas mostraron evidencia de formación de embriones a partir de óvulos en ausencia de fertilización, y 3 plantas murieron antes del análisis de ovario. La evidencia de la falta de fertilización fue la persistencia de núcleos polares en la célula central del saco embrionario. La partenogénesis se ensayó dos días después de la antesis para las plantas transgénicas restantes usando una técnica de pistilo aclarado (BA Young, RT Sherwood, EC Bashaw, Can. J. Bot. 57:1668-1672 (1979)), y la observación se realizó mediante contraste de interferencia diferencial (DIC) o óptica de contraste de fase. La fertilización se evitó empacando cabezas antes de la extracción y eliminación de los estigmas/estilos antes de la antesis (ya que las plantas son protínicas, lo que significa que los estigmas se extienden antes que las anteras).

Como se muestra en la Tabla 3, la presencia de embriones que se desarrollan en el mismo saco embrionario donde persisten los núcleos polares (embrión PN) proporciona evidencia de que el saco embrionario no fue fertilizado y que el óvulo se está desarrollando partenogenéticamente. En la Figura 10 se muestran ejemplos de formación de embriones en sacos de embriones con núcleos polares. Dado que esto sería indicativo de partenogénesis en una planta sexual donde ocurre la meiosis, se espera que los embriones haploides, derivados partenogenéticamente, tengan la mitad del número de cromosomas y el contenido de ADN (Figura 10) de la planta madre. Descendencia #105 (Figura 10D) y #106 (Figura 10C) son ejemplos de individuos haploides (1n=2x) con la mitad del contenido de ADN esperado de la progenie de una planta diploide sexual (2n=4x) (p.ej. #100 (Figura 10B), #107 (Figura 10D) y #108 (Figuras 10A, 10C)). Si bien no todos los embriones se desarrollaron partenogenéticamente en estas líneas (saco embrionario PN), esto probablemente se debió a la penetrancia incompleta del fenotipo, así como a la segregación del transgén. Si bien no todos los sacos embrionarios se desarrollaron normalmente (ninguna estructura saco embrional/saco anormal) en estas líneas, esto probablemente se debió a la variación inducida por el cultivo de tejidos, la mala salud de las plantas, y/o un efecto pleiotrópico del transgén. Se puede obtener más información sobre estas alternativas mediante análisis genéticos. La eliminación del estigma no fue 100 %, resultando en polinización ocasional (última columna).

Tabla 3.

Todas las líneas contenían sacos de embriones estructuralmente maduros (Figura 11A), de los cuales tres líneas independientes (g3f, g11a y g52) mostraron partenogénesis (Figuras 11B, 11C) basada en la persistencia de núcleos polares en la célula central y la ausencia de desarrollo de endospermo, ya que el endospermo se puede visualizar fácilmente en sacos de embriones fertilizados de la misma etapa de desarrollo. Cuando no se evitó la polinización, las tres líneas demostraron la formación de endospermo en el día 2 (Figura 11D). Se analizaron un mínimo de 3 cabezas y 150 ovarios para cada una de las 3 líneas, donde el porcentaje de sacos embrionarios sexuales estructuralmente maduros (Figura 11A) en cada cabeza y el porcentaje de los que contenían embriones partenogenéticos a los 2 días después de la antesis fueron 66, 79, 71 y 35, 36, 35 para las líneas g11a, g52 y g3f, respectivamente. La expresión del transgén degPsASGR-BBMLse verificó mediante RT-PCR con ARN extraído de ovarios de polinización abierta 2 días después de la antesis para las líneas g52 y g3f (Figura 12). Para descartar posibles cambios de ploidía inducidos por la selección y regeneración del cultivo de tejidos, se analizaron las tres líneas TogPsASGR-BBMLmediante citometría de flujo (Figura 13A). Se demostró que las tres líneas mantienen un nivel de ploidía tetraploide.

Como resultado de las bajas tasas de germinación y el bajo número de semillas para las líneas g11a y g52, se empleó el rescate de embriones en semillas en desarrollo de 10 a 15 días después de la polinización y en semillas maduras no germinadas para recuperar la descendencia de las 3 líneas. La semilla analizada mediante citometría de flujo demostró la producción de descendencia reducida (Figura 14).

Polinización con plantas Red IA4X, que son líneas tetraploides sexuales que contienen un aleloRp1dominante que confiere una pigmentación roja oscura en la nervadura central y la vaina de las hojas ((W. W. Hanna, G. W. Burton, J Hered. 83:386-388 (1992)), se utilizó en múltiples cabezas y días para compensar en parte la posible esterilidad del polen de las líneas transgénicas. La planta g11a produjo un total de nueve semillas, dos de las cuales sobrevivieron a la siembra en invernadero. La planta g52 estableció 97 semillas, 31 de las cuales sobrevivieron a la siembra en invernadero. La planta g3f estableció cientos de semillas, de las cuales 194 se seleccionaron al azar, y 107 sobrevivieron a la siembra en invernadero.

Toda la descendencia se analizó para la herencia de un amplicón de 3694 pb que cubre el marco de lectura abierto degPsASGR-BBMLcomenzando cinco pares de bases corriente abajo del codón de inicio y amplificando en el 3' UTR (amplicón ORF). Las dos descendencias de g11a no mostraron herencia del transgén. Toda la descendencia de g52 mostró pigmentación roja de la nervadura central; estas se derivaron de la fertilización de sacos de embriones sexuales g52 con polen rojo IA4X. Nueve de las plantas descendientes portaban al menos una copia del amplicón ORF. Las plantas descendientes de g3f tenían una mezcla de pigmentación verde y roja de la nervadura central. Veintiséis plantas descendientes de g3f portaban al menos una copia del amplicón o Rf .

Todas las plantas descendientes de la línea g52 se analizaron para determinar la partenogénesis (Tabla 4, Figura 15B), lo que demostró que solo la descendencia que heredaba el amplicón ORF mostró partenogénesis 2 días después de la antesis. No se identificó formación de embriones en 791 sacos de embriones sexuales estructuralmente maduros de 21 descendientes g52 que no heredaron el amplicón ORF. Noventa sacos de embriones sexuales mostraron desarrollo embrionario, así como núcleos polares de los nueve descendientes g52 que heredaron el amplicón ORF. El porcentaje de óvulos que mostraron desarrollo embrionario osciló entre el 12 % y el 53 % en las diversas descendencias de g52.

Se analizó la partenogénesis en un subconjunto de plantas descendientes generadas a partir de la línea g3f (Tabla 5, Figura 15C). No se identificó formación de embriones en un total de 951 sacos de embriones sexuales estructuralmente maduros de 28 descendientes g3f que no heredaron el amplicón ORF. T res de los 26 descendientes que heredaron el amplicón ORF no estaban disponibles para el ensayo de partenogénesis porque no florecieron. De los 23 descendientes restantes que heredaron el ampicón ORF, 19 mostraron partenogénesis y cuatro no. El porcentaje de sacos embrionarios estructuralmente maduros en los que se observó desarrollo embrionario osciló entre 1 % al 52 % de las diversas descendencias de g3f que presentan partenogénesis. De los cuatro descendientes que portaban el transgén pero que no mostraban partenogénesis, se ensayaron las plantas 123, 144 y 159 para determinar la expresión del transgén mediante análisis de RT-PCR (Figura 16). En las tres descenias, se detectó expresión degPsASGR-BBMLen ovarios no polinizados el día de la antesis. Se secuenciaron dos amplicones específicos de transgén que cubren el transgén de ADNc degPsASGR-BBMLde la 5' UTR a la 3' UTR de las plantas 123, 144 y 159, junto con la planta 105 que también mostró partenogénesis. Se encontró que todas las secuencias eran idénticas a las secuencias de ADNc dePsASGR-BBMderivadas de las plantas apomícticas BC7 y BC8.

Debido a que la descendencia de g3f era una mezcla de pigmentación roja y verde de la nervadura central, se requirió la determinación del nivel de ploidía de los fenotipos verdes (Tabla 6). Seis descendientes fueron diploide/dihaploide en el tamaño del genoma analizado mediante citometría de flujo utilizando sorgo como referencia del tamaño del genoma (Figura 13B-C). La descendencia diploide/dihaploide se confirmó aún más mediante la mezcla prevista diploide/dihaploide y descendencia tetraploide juntas para generar 3 picos (Figura 13D). Los seis descendientes haploides portan el amplicón ORF; de los cuatro que florecieron, todos mostraron partenogénesis (Figura 15C). El papel dePsASGR-BBMlen el desarrollo apomíctico se evaluó en líneas transgénicas Fi apomícticas utilizando una estrategia de eliminación de ARNi con una construcción ARNi-BBM-3p. Como no fue posible la transformación y regeneración directas deP. squamulatumapomíctico, se empleó una estrategia alternativa y un protocolo de selección para generar plantas Fi apomícticas con expresión reducida dePsASGR-BBML.Después de la selección, tres plantas, cada una derivada de una línea diferente, con un genotipo de ASGR-positivo/ARNi-positivo mostró una expresión reducida del genPsASGR-BBMLbasado en un análisis semicuantitativo de la expresión dePsASGR-BBMLen el día de la polinización (Tabla 7, Figura 17), en comparación con el genotipo de control ASGR-positivo/ARNi-negativo. Se determinó que las tres plantas F1de expresión reducida dePsAS9R-BBML contenían el mismo porcentaje de óvulos con formación de saco embrionario aposporous como la planta de control (Tabla 7). A continuación, las plantas se polinizaron con polen rojo IA4X y se descubrió que la descendencia se derivaba a través de la apomixis basada en la falta de pigmentación roja de la nervadura central y fenotipos uniformes. Sin embargo, la observación histológica mostró que el número de ovarios que mostraban desarrollo embrionario partenogenético y el número de células en esos embriones 2 días después de la antesis se redujo significativamente en las líneas de expresión reducida dePsASGRBBML(Tabla 7, Figura 18).

El análisis de líneas transgénicas sexuales que portan el transgéngPsASGR-BBMLy producen formación de embriones independiente de la fertilización y la descendencia diploide/dihaploide, aunque con una penetrancia algo baja, demuestra que el genPsASGR-BBMLpor sí solo puede promover la partenogénesis en el mijo perla tetraploide sexual, que son plantas que normalmente no muestran este rasgo. Ninguna de las líneas T⁰o la descendencia de las líneas T⁰mostró una penetración completa del rasgo; esta penetrancia incompleta dentro de las líneas originales T⁰y la descendencia de las líneas g3f y g52 probablemente se deba a la segregación transgénica, los niveles de expresión transgénica, y/o factores genéticos desconocidos que interactúan conPsASGRBBML.Aunque la transcripción del transgén se identificó en la descendencia que no demostró partenogénesis, la cuantificación de los niveles de expresión del transgén es difícil debido a la variación en el porcentaje de sacos de embriones sexuales estructuralmente maduros y a la incapacidad de verificar que el ARN se extrae de ovarios que están en la misma etapa de desarrollo. La generación de líneas endógamas que contienen una única copia del transgéngPsASGR-BBMLo la expresión del transgéngPsASGRBBMLutilizando promotores específicos de óvulo con diferentes niveles de expresión sería ventajosa para confirmar estos problemas.

No se encontró que el nivel de ploidía fuera crítico para la partenogénesis inducida por el transgénPsASGR-BBML,ya que los cuatro descendientes diploides/dihaploides cromosómicamente reducidos generados a partir de g3f mostraron un intervalo similar de niveles de partenogénesis a la descendencia tetraploide no reducida Si bien la mayoría de los apomictos naturales son poliploides, se han identificado poblaciones naturales y diploides/dihaploides apomícticas recuperadas experimentalmente de varias especies. Por ejemplo, las plantas apomícticas poliploides pueden producir descendencia diploide/dihaploide a través de la separación genética de los locus de apomeiosis y partenogénesis (RD Noyes, JD Wagner, American Journal of Botany 101:1-10 (2014)) o mediante el desarrollo partenogenético de un óvulo reducido que lleva un locus de apomixis (M. Dujardin, W.W. Hanna, Theor Appl Genet 72:33-36 (1986)).

La falta de una línea transgénica Fi aposporosa que muestre la eliminación completa dePsASGRBBMLimpide la determinación de siPsASGR-BBMLes el único gen necesario para inducir la partenogénesis en plantas programadas para la vía de la apomixis a través de la herencia del ASGR. Sin embargo, dado que el número de ovarios que muestran desarrollo embrionario partenogenético y que el número de células en esos embriones a los 2 días después de la antesis se redujo significativamente en las líneas de expresión reducida F¹PsASGR-BBML, PsASGRBBMLclaramente tiene un papel importante en la partenogénesis en la vía reproductiva apomíctica.

Si bien los miembros del clado de factores de transcripción AP2 de tipo BBM han observado funciones en la embriogénesis somática y la proliferación celular, estos resultados han descubierto por primera vez la función dePsASGRBBMLen la partenogénesis. Vale la pena señalar que ni el maíz ni el sorgo tienen una proteinaPsASGR­ BBMLmás relacionada conPsASGR-BBMLque la especie de arroz más distante. Por lo tanto, esta función recién descubierta puede tener un gran impacto en la capacidad de manipular genéticamente la apomixis en especies de cultivos. Por lo tanto, esta técnica también puede usarse como un procedimiento alternativo para la inducción de haploides con el fin de obtener rápidamente líneas homocigotas para la reproducción.

Tabla 6. Nivel de ploidía de la descendencia de g3f con pigmentación verde de la nervadura central determinada por

T l 7. An li i x r i nP A R-BBMLrr ll m ri n ri l n l i n Fi ARNi.

EJEMPLO 6

LÍNEAS DE ARROZTRANSGÉNICO QUE CONTIENEN gPsASGR-BBML

La construcción genómicaPsASGR-BBMutilizada en la transformación de mijo perla, que incluía un promotor ASGR-BBM de 2074 pb (p208) (que contiene una secuencia del sitio de restricción GGATCC BamHI de 6 residuos) corriente arriba de la región codificante de 3540 pb (exón: intrones) más 610 pb de la 3'UTR y que reside en un plásmido de script azul, se transfirió usando enzimas en el sitio de clonación múltiple a pCambia1300 para transformación de arroz (Oryza sativaJaponica cv. Nipponbare). Se encontró que dieciséis líneas de arroz diferentes contenían la región codificante completa de la construcciónPsASGR-BBMbasándose en el análisis de PCR. Se aisló ARN de cuatro líneas diferentes de semillas de arroz en desarrollo y se ensayó la expresión del transgén PsASGR-BBM mediante RT-PCR no cuantitativa. Las cuatro líneas mostraron expresión del transgén PsASGR-BBM. Se utilizó citometría de flujo usando ~5 embriones de arroz en desarrollo disecados para determinar si la descendencia haploide (1n/1c) se generó a partir de líneas transgénicas de arroz que portaban el transgén PsASGR-BBM (Figura 19). Se utilizó sorgo como control para las muestras. Ocho líneas mostraron producción de descendencia haploide según este análisis.

INDUCCIÓN DE HAPLOIDES EN MAÍZ Y OTROS CULTIVOS

Lapresente invención puede usarse como un procedimiento alternativo para la inducción de haploides en maíz y otros cereales. Se han identificado líneas específicas de maíz que, cuando se utilizan como polinizadores, dan como resultado una baja (2-8 %) recuperación de frecuencia de la descendencia haploide a partir de la semilla del progenitor materno (Chang M. y Coe EH, «Doubled haploids,» pp.127-142, in Molecular Genetic Approaches to Maize Improvement, Kritz AL y Larkins B, Eds, Springer). Estas líneas se utilizan ampliamente en programas comerciales de mejoramiento de maíz en América del Norte y Europa.

La ventaja de la inducción de haploides en la reproducción es que se pueden fijar diferentes combinaciones de genes en cada línea una vez que el número de cromosomas se duplica de haploide a diploide. Esta rápida recuperación de líneas endógamas homocigotas permite la selección de padres endógamos que pueden generar híbridos de alta calidad y alto rendimiento. Se han identificado múltiples líneas inductoras de maíz y el mecanismo de inducción haploide informado para al menos una de ellas es la eliminación de cromosomas (Zhang Z. y col., Plant Cell Reports 27:1851-1860 (2008)). Es más probable que la eliminación de cromosomas después de la fertilización dé como resultado una contribución masculina a la descendencia haploide que la invención descrita en esta invención, donde se evita la fertilización del óvulo.

La inducción de haploides usando la presente invención puede ser útil en cultivos diferentes de maíz en los que las líneas inductoras son desconocidas. Cualquier individuo heterocigoto generará combinaciones de genes únicas en cada óvulo si los óvulos se forman a partir de productos derivados meióticamente y son haploides. Cada individuo haploide único se volverá homocigótico y fértil una vez que los cromosomas se dupliquen artificialmente mediante tratamiento químico. Las líneas homocigotas se pueden generar más rápidamente mediante el procedimiento descrito en esta invención para realizar pruebas en el campo.

EJEMPLO 8

EXPRESIÓN DE ASGR-BBML PARA INDUCIR LA DIVISIÓN DE ÓVULOS EN AUSENCIA DE FERTILIZACIÓN

Otro uso de esta invención es como componente de la apomixis. Tanto la apomeiosis como la partenogénesis son necesarias para la apomixis gametofítica funcional. La apomeiosis se puede lograr mediante una combinación de mutaciones que afectan a la meiosis (Crismani W. y col., J. Exp. Bot.64:55-65 (2013)), con el resultado de no reducción cromosómica en megasporas,es decir,mitosis en lugar de meiosis. Células somáticas que asumen un destino gametofítico a través de alteraciones epigenéticas (Grimanelli D., Curr. Opin. Plant Biol. 15:57-62 (2012)) también resultan en células parecidas a esporas no reducidas que potencialmente pueden dar lugar a gametos (óvulos) no reducidos. Independientemente de los medios que se formen los óvulos no reducidos, la expresión temporal y espacial adecuada deASGR-BBMLpuede inducir a los óvulos a comportarse como cigotos y dividirse en ausencia de fertilización. La división de un óvulo no reducido para formar el componente embrionario de una semilla satisface las condiciones para la apomixis siempre que el endospermo de la semilla también pueda completar el desarrollo para producir un propágulo viable.

EJEMPLO 9

USO DE APOMIXIS PARA UNA PRODUCCIÓN EFICIENTE DE SEMILLAS

La apomixis da como resultado la identidad genética de la descendencia de una planta madre. La planta madre puede ser altamente heterocigótica, pero dado que la apomixis pasa por alto la meiosis, no hay segregación de rasgos entre la progenie derivada de semillas. La apomixis puede usarse para una producción de semillas híbridas más eficiente en cultivos híbridos, como maíz y similares, eliminando la necesidad de usar padres masculinos y femeninos separados cultivados de forma aislada para generar semillas híbridas. La apomixis también se puede usar para la propagación de semillas de cultivos heterocigotos, como la patata y similares, que típicamente se propagan vegetativamente a través de tubérculos, órganos que pueden albergar y transmitir enfermedades a través de generaciones. La apomixis también puede promover el desarrollo de híbridos en cultivos donde los híbridos actualmente no están disponibles debido a la falta de líneas parentales que puedan cruzarse fácilmente a escala comercial. La apomixis se puede utilizar como una herramienta de reproducción para aumentar y probar un gran número de nuevos híbridos generados por la reproducción sexual, pero aumentados a través de la reproducción apomíctica. La presente invención, el desarrollo del óvulo en un embrión sin fertilización, es un componente esencial de la apomixis o reproducción clonal a través de semillas.

Los varios procedimientos y técnicas descritos anteriormente proveen una variedad de modos para implementar la solicitud. Por supuesto, debe entenderse que no necesariamente pueden alcanzarse todos los objetivos o ventajas descritos conforme a cualquier realización particular descrita en esta invención. Por lo tanto, los expertos en la técnica reconocerán, por ejemplo, que los procedimientos pueden ponerse en práctica en una forma que logre u optimice una ventaja o un conjunto de ventajas tal como se indica en esta invención, sin que necesariamente se logren otros objetivos o ventajas que puedan indicarse o sugerirse en esta invención. Se mencionan en esta invención una variedad de alternativas. Debe entenderse que algunas realizaciones preferidas incluyen específicamente una, otra o varias características, al tiempo que otras específicamente excluyen una, otra o varias características y que aun otras mitigan una característica específica mediante la inclusión de una, otra o varias características ventajosas.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para lograr la propagación a partir de una o más células gametofíticas o esporofíticas en un óvulo de una planta con flores en ausencia de fertilización con óvulos, comprendiendo el procedimiento: transformar una planta con flores con una construcción del gen ASGR-BBML que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 4, donde el ácido nucleico está operativamente unido a un promotor específico de la flor;

obtener una o más células gametofíticas o esporofíticas de un óvulo de la planta transformada en ausencia de fertilización con óvulos; y

obtener una planta progenie a partir de una o más células gametofíticas o esporofíticas, donde la planta progenie contiene uno o más conjuntos de cromosomas de la planta transformada, logrando así la propagación de la planta con flores en ausencia de fertilización con óvulos,

donde la planta con flores es una monocotiledónea.

2. El procedimiento de la Reivindicación 1, donde la construcción del gen ASGR-BBML comprende además una o más regiones no traducidas (UTR).

3. El procedimiento de la Reivindicación 2, donde la UTR tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o una línea completamente complementaria de la misma.

4. El procedimiento de la reivindicación 2, donde el promotor específico de la flor comprende un nucleótido que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5 o una línea completamente complementaria de la misma.

5. El procedimiento de la reivindicación 2, donde la construcción del gen ASGR-BBML tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 o una línea completamente complementaria de la misma.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, donde el embrión se forma a partir de un óvulo no reducido, un óvulo reducido o una célula somática.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, donde una planta poliploide se transforma para producir una planta de progenie diploide o dihaploide o una planta diploide se transforma para producir una planta de progenie haploide.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, donde la planta de progenie haploide se trata para lograr la duplicación de cromosomas y la producción de una planta homocigótica.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, donde la planta con flores comprende una hierba.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, donde la hierba es una especie de mijo, arroz, maíz, trigo, sorgo o pasto varilla.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, donde la planta con flores es heterocigota y se transforma para producir una descendencia clonal o es heterocigótica y se transforma para producir una descendencia haploide.

12. Un procedimiento para obtener una planta con flores capaz de reproducirse en ausencia de fertilización con óvulos, comprendiendo el procedimiento:

transformar una planta con flores con una construcción del gen ASGR-BBML que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 4, donde el ácido nucleico está operativamente unido a un promotor específico de la flor, por lo que se obtiene una planta con flores capaz de reproducirse en ausencia de fertilización con óvulos,

donde la planta con flores es una monocotiledónea.

13. Un procedimiento para producir semillas de una planta con flores en ausencia de fertilización con óvulos, comprendiendo el procedimiento:

transformar una planta con flores con una construcción del gen ASGR-BBML que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 4, donde el ácido nucleico está operativamente unido a un promotor específico de la flor;

obtener una o más células gametofíticas o esporofíticas de un óvulo de la planta transformada en ausencia de fertilización con óvulos; y

obtener semilla de una o más células gametofíticas o esporofíticas, donde la semilla contiene uno o más conjuntos de cromosomas de la planta transformada, produciendo así semilla de la planta con flores en ausencia de fertilización con óvulos,

donde la planta con flores es una monocotiledónea.

14. El procedimiento de la Reivindicación 12 o la Reivindicación 13, donde la construcción génica comprende además una o más UTR y donde la construcción génica ASGR-BBML tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 o una línea completamente complementaria de la misma.