ES2805347T3 - Perfilado molecular de tumores - Google Patents

Abstract

Un método para identificar un tratamiento candidato para un cáncer en un sujeto que lo necesita, que comprende realizar una secuenciación de ADN en una muestra obtenida del sujeto para determinar un perfil de mutaciones de secuenciación en un grupo de genes que comprende KRAS, BRAF, c-KIT y EGFR.

Description

DESCRIPCIÓN

Perfilado molecular de tumores

Antecedentes

Los estados patológicos en los pacientes normalmente se tratan con regímenes de tratamiento o terapias que se seleccionan según criterios clínicos; es decir, se selecciona una terapia o un régimen de tratamiento para un paciente en función de la determinación de que el paciente haya sido diagnosticado de una determinada enfermedad (cuyo diagnóstico se ha realizado a partir de ensayos de diagnóstico clásicos). Aunque los mecanismos moleculares subyacentes a los diferentes estados patológicos han sido objeto de estudios durante años, la aplicación específica del perfilado molecular de un individuo enfermo en la determinación de regímenes de tratamiento y terapias para ese individuo ha sido específica de la enfermedad y no se ha seguido ampliamente.

Algunos regímenes de tratamiento se han determinado usando perfilado molecular en combinación con la caracterización clínica de un paciente, tal como las observaciones realizadas por un médico (tal como un código de la Clasificación Internacional de Enfermedades, por ejemplo, y las fechas en que se determinaron dichos códigos), resultados de pruebas de laboratorio, rayos x, resultados de biopsias, declaraciones realizadas por el paciente y cualquier otra información médica en la que el médico normalmente se basa para realizar un diagnóstico de una enfermedad específica. Sin embargo, el uso de una combinación de material de selección basado en el perfilado molecular y en caracterizaciones clínicas (tales como el diagnóstico de un determinado tipo de cáncer) para determinar un régimen de tratamiento o una terapia presenta el riesgo de que se pueda pasar por alto un régimen de tratamiento eficaz para un individuo en particular, ya que algunos regímenes de tratamiento pueden funcionar bien para diferentes estados patológicos a pesar de que estén asociados con el tratamiento de un tipo particular de estado patológico.

Los pacientes con cáncer refractario y metastásico son de especial preocupación para los médicos tratantes. La mayoría de los pacientes con cáncer metastásico finalmente se quedan sin opciones de tratamiento para sus tumores. Estos pacientes tienen opciones muy limitadas una vez que su tumor haya progresado con terapias convencionales de primera línea y segunda línea (y, a veces, de tercera línea y más). Aunque estos pacientes pueden participar en ensayos clínicos de Fase I y Fase II para nuevos agentes antineoplásicos, en general, deben cumplir con criterios de elegibilidad muy estrictos para hacerlo. Los estudios han demostrado que cuando los pacientes participan en este tipo de ensayos, el nuevo agente antineoplásico puede dar tasas de respuesta de entre el 5 % y 10 % como media en los entornos de Fase I, de hasta el 12 % en los entornos de Fase II. Estos pacientes también tienen la opción de elegir recibir la mejor atención de apoyo para tratar sus síntomas.

Recientemente, ha habido una explosión de interés en el desarrollo de nuevos agentes antineoplásicos que estén más dirigidos contra un receptor de la superficie celular o un producto génico regulado positivamente o amplificado. Este enfoque ha tenido cierto éxito (por ejemplo, trastuzumab contra HER2/neu en células de cáncer de mama, rituximab contra CD20 en células de linfoma, bevacizamab contra VEGF y cetuximab contra EGFR). Sin embargo, los tumores de los pacientes, finalmente, siguen progresando con estas terapias. Si se midió un mayor número de dianas o hallazgos moleculares, tales como mecanismos moleculares, genes, proteínas expresadas en genes y/o combinaciones de los mismos en el tumor de un paciente, se pueden encontrar dianas o hallazgos moleculares adicionales que pueden utilizarse usando agentes terapéuticos específicos. La identificación de múltiples agentes que pueden tratar múltiples dianas o mecanismos subyacentes proporcionaría a los pacientes con cáncer una alternativa terapéutica viable a los regímenes de tratamiento que existen en la actualidad.

El análisis de perfilado molecular identifica uno o más perfiles individuales que suelen impulsar opciones de tratamiento personalizadas más informadas y eficaces, lo que puede producir una mejor atención al paciente y mejores resultados de tratamiento. La presente invención proporciona métodos y sistemas para identificar tratamientos para estos individuos mediante el perfilado molecular de una muestra del individuo.

Sumario de la invención

La presente divulgación proporciona métodos y sistemas para el perfilado molecular, usando los resultados del perfilado molecular para identificar tratamientos individuales. En algunos casos, los tratamientos no se identificaron inicialmente como un tratamiento para la enfermedad.

En un aspecto, la invención proporciona un método para identificar un tratamiento candidato para un sujeto que lo necesita, que comprende realizar una secuenciación de ADN en una muestra obtenida del sujeto para determinar un perfil de mutaciones de secuenciación en un grupo de genes que comprende KRAS, BRAF, c-KIT y EGFR. El método puede comprender además comparar la secuencia con una base de datos de reglas. La base de datos de reglas puede comprender un mapeo de tratamientos cuya actividad biológica es conocida contra las células cancerosas que: i) sobreexpresan o infraexpresan una o más proteínas incluidas en el perfil de expresión de IHC; ii) sobreexpresan o infraexpresan uno o más genes incluidos en el perfil de expresión de micromatriz; iii) no tienen mutaciones, o tienen una o más mutaciones en uno o más genes incluidos en el perfil de mutaciones de FISH (Fluorescent In Situ Hybridization);y/o iv) no tienen mutaciones, o tienen una o más mutaciones en uno o más genes incluidos en el perfil de mutaciones de secuenciación. El tratamiento candidato se puede identificar si: i) la etapa de comparación indica que el tratamiento debería tener actividad biológica contra el cáncer; e ii) la etapa de comparación no contraindica el tratamiento para tratar el cáncer.

El perfilado de expresión de IHC (ImmunoHistoChemistry)puede comprender el análisis de uno o más de SPARC, PGP, Her2/neu, ER, PR, c-kit, AR, CD52, PDGFR, TOP2A, TS, ERCC1, RRM1, BCRP, TOPO1, PTEN, MGMT y MRP 1.

El perfilado de expresión de micromatriz puede comprender el análisis de uno o más de ABCC1, ABCG2, ADA, AR, ASNS, BCL2, BIRC5, BRCA1, BRCA2, CD33, CD52, CD A, CES2, DCK, DHFR, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, ECGF1, EGFR, EPHA2, ERBB2, ERCC1, ERCC3, ESR1, FLT1, FOLR2, FYN, GART, GNRH1, GSTP1, HCK, HDAC1, HIF1A, HSP90AA1, IL2RA, HSP90AA1, KDR, KIT, LCK, LYN, MGMT, MLH1, MS4A1, MSH2, NFKB1, NFKB2, OGFR, PDGFC, PDGFRA, PDGFRB, PGR, POLA1, PTEN, PTGS2, RAF1, RARA, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRB, RXRG, SPARC, SRC, SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4, SSTR5, TK1, TNF, TOPI, TOP2A, TOP2B, TXNRD1, TYMS, VDR, VEGFA, VHL, YES1 y ZAP70.

En algunas realizaciones, el perfilado de mutaciones de FISH comprende analizar EGFR y/o HER2.

El perfilado de mutaciones de secuenciación comprende analizar uno o más de KRAS, BRAF, c-KIT y EGFR.

La divulgación proporciona un método para identificar un tratamiento candidato para un sujeto que lo necesita, que comprende: realizar un análisis de inmunohistoquímica (IHC) en una muestra del sujeto para determinar un perfil de expresión de IHC en al menos cinco de: SPARC, PGP, Her2/neu, ER, PR, c-kit, AR, CD52, PDGFR, TOP2A, TS, ERCC1, RRM1, BCRP, TOPO1, PTEN, MGMT y MRP1; realizar un análisis de micromatriz en la muestra para determinar un perfil de expresión de micromatriz en al menos cinco de: ABCC1, ABCG2, ADA, AR, ASNS, BCL2, BIRC5, BRCA1, BRCA2, CD33, CD52, CDA, CES2, DCK, DHFR, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, ECGF1, EGFR, EPHA2, ERBB2, ERCC1, ERCC3, ESR1, FLT1, FOLR2, FYN, GART, GNRH1, GSTP1, HCK, HDAC1, HIF1A, HSP90AA1, IL2RA, HSP90AA1, KDR, KIT, LCK, LYN, MGMT, MLH1, MS4A1, MSH2, NFKB1, NFKB2, OGFR, PDGFC, PDGFRA, PDGFRB, PGR, POLA1, PTEN, PTGS2, RAF1, RARA, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRB, RXRG, SPARC, SRC, SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4, SSTR5, TK1, TNF, TOPI, TOP2A, TOP2B, TXNRD1, TYMS, VDR, VEGFA, VHL, YES 1 y ZAP70; realizar un análisis de hibridaciónin situfluorescente (FISH) en la muestra para determinar un perfil de mutaciones de FISH en EGFR y/o HER2; realizar la secuenciación de ADN en la muestra para determinar un perfil de mutaciones de secuenciación en al menos uno de KRAS, BRAF, c-KIT y EGFR; y comparar el perfil de expresión de IHC, el perfil de expresión de micromatriz, el perfil de mutaciones de FISH y el perfil de mutaciones de secuenciación con una base de datos de reglas. La base de datos de reglas comprende un mapeo de tratamientos cuya actividad biológica es conocida contra las células cancerosas que: i) sobreexpresan o infraexpresan una o más proteínas incluidas en el perfil de expresión de IHC; ii) sobreexpresan o infraexpresan uno o más genes incluidos en el perfil de expresión de micromatriz; iii) no tienen mutaciones, o tienen una o más mutaciones en uno o más genes incluidos en el perfil de mutaciones de FISH (Fluorescent In Situ Hybridization);y/o iv) no tienen mutaciones, o tienen una o más mutaciones en uno o más genes incluidos en el perfil de mutaciones de secuenciación. El tratamiento candidato se identifica si: i) la etapa de comparación indica que el tratamiento debería tener actividad biológica contra el cáncer; e ii) la etapa de comparación no contraindica el tratamiento para tratar el cáncer. El perfilado de expresión de IHC se puede realizar en al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de los biomarcadores enumerados. El perfilado de expresión de micromatriz se puede realizar en al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de los biomarcadores enumerados.

La divulgación proporciona un método para identificar un tratamiento candidato para un cáncer en un sujeto que lo necesita, que comprende: realizar un análisis de inmunohistoquímica (IHC) en una muestra del sujeto para determinar un perfil de expresión de IHC en al menos el grupo de proteínas que consiste en: SPARC, PGP, Her2/neu, ER, PR, ckit, AR, CD52, PDGFR, TOP2A, IS, ERCC1, RRM1, BCRP, TOPO1, PTEN, MGMT y MRP1; realizar un análisis de micromatriz en la muestra para determinar un perfil de expresión de micromatriz en al menos el grupo de genes que consiste en ABCC1, ABCG2, ADA, AR, ASNS, BCL2, BIRC5, BRCA1, BRCA2, CD33, CD52, CDA, CES2, DCK, DHFR, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, ECGF1, EGFR, EPHA2, ERBB2, ERCC1, ERCC3, ESR1, FLT1, FOLR2, FYN, GART, GNRH1, GSTP1, HCK, HDAC1, HIF1A, HSP90AA1, IL2RA, HSP90AA1, KDR, KIT, LCK, LYN, MGMT, MLH1, MS4A1, MSH2, NFKB1, NFKB2, OGFR, PDGFC, PDGFRA, PDGFRB, PGR, POLA1, PTEN, PTGS2, RAF1, RARA, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRB, RXRG, SPARC, SRC, SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4, SSTR5, TK1, TNF, TOPI, TOP2A, TOP2B, TXNRD1, TYMS, VDR, VEGFA, VHL, YES1 y ZAP70; realizar un análisis de hibridaciónin situfluorescente (FISH) en la muestra para determinar un perfil de mutaciones de FISH en al menos el grupo de genes que consiste en EGFR y HER2; realizar la secuenciación de ADN en la muestra para determinar un perfil de mutaciones de secuenciación en al menos el grupo de genes que consiste en KRAS, BRAf , c-KIT y EGFR; y comparar el perfil de expresión de IHC, el perfil de expresión de micromatriz, el perfil de mutaciones de FISH y el perfil de mutaciones de secuenciación con una base de datos de reglas. La base de datos de reglas comprende un mapeo de tratamientos cuya actividad biológica es conocida contra las células cancerosas que: i) sobreexpresan o infraexpresan una o más proteínas incluidas en el perfil de expresión de IHC; ii) sobreexpresan o infraexpresan uno o más genes incluidos en el perfil de expresión de micromatriz; iii) tienen cero o más mutaciones en uno o más genes incluidos en el perfil de mutaciones de FISH; y/o iv) tienen cero o más mutaciones en uno o más genes incluidos en el perfil de mutaciones de secuenciación. El tratamiento candidato se identifica si: i) la etapa de comparación indica que el tratamiento debería tener actividad biológica contra el cáncer; e ii) la etapa de comparación no contraindica el tratamiento para tratar el cáncer.

En algunas realizaciones de los métodos de la invención, la muestra comprende tejido embebido en parafina fijado con formalina (FFPE,Formalin-Fixed Paraffin-Embedded),tejido recién congelado (FF,Fresh Frozen)o tejido comprendido en una solución que conserva las moléculas de ácido nucleico o proteína. En algunas divulgaciones, no se realiza ninguno de entre el análisis de micromatriz, el análisis mutacional de FISH o el análisis de mutaciones de secuenciación. Por ejemplo, no se puede realizar un método a menos que la muestra pase una prueba de control de calidad. La prueba de control de calidad comprende una proporción de A260/A280 o un valor Ct de RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)de ARNm de RPL13a. Por ejemplo, la prueba de control de calidad puede requerir una proporción de A260/A280 < 1,5 o que el valor Ct de RPL13a sea > 30.

El perfilado de expresión de micromatriz se puede realizar usando una micromatriz de baja densidad, una micromatriz de expresión, una micromatriz de hibridación genómica comparativa (CGH,Comparative Genomic Hybridization),una micromatriz de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP,Single Nucleotide Polymorphism,una matriz proteómica o una matriz de anticuerpos.

Los métodos pueden requerir el análisis de ciertos marcadores, Incluyendo marcadores adicionales.

El perfilado de expresión de IHC se puede realizar en al menos SPARC, TOP2A y/o PTEN. El perfilado de expresión de micromatriz se puede realizar en al menos CD52. El perfil de expresión de IHC consiste además en analizar uno o más de DCK, EGFR, BRCA1, CK 14, CK 17, CK 5/6, E-Cadherina, p95, PARP-1, SPARC y TLE3. El perfilado de expresión de IHC consiste además en analizar Cox-2 y/o Ki-67. El perfilado de expresión de micromatriz consiste además en analizar HSPCA. El perfilado de mutaciones de FISH consiste además en analizar c-Myc y/o TOP2A. El perfilado de mutaciones de secuenciación puede comprender analizar PI3K.

Se puede analizar una serie de genes y productos génicos de acuerdo con los métodos. Por ejemplo, los genes usados para el perfilado de expresión de IHC, el perfilado de expresión de micromatriz, el perfilado de mutaciones de FISH y el perfilado de mutaciones de secuenciación comprenden independientemente uno o más de ABCC1, ABCG2, ACE2, ADA, ADH1C, ADH4, AGT, Receptor de andrógenos, AR, AREG, ASNS, BCL2, BCRP, BDCA1, BIRC5, B-RAF, BRCA1, BRCA2, CA2, caveolina, CD20, CD25, CD33, CD52, CDA, CDK2, CDW52, CES2, CK 14, CK 17, CK 5/6, c-KIT, c-Myc, COX-2, Ciclina D1, DCK, DHFR, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, E-Cadherina, ECGF1, EGFR, EPHA2, Epiregulina, ER, ERBR2, ERCC1, ERCC3, EREG, ESR1, FLT1, receptor de folato, FOLR1, FOLR2, FSHB, FSHPRH1, FSHR, FYN, GART, GNRHi; GNRHR1, GSTP1, HCK, HDAC1, Her2/Neu, HGF, HIF1A, HIG1, HSP90, HSP90AA1, HSPCA, IL13RA1, IL2RA, KDR, KIT, K-RAS, LCK, LTB, Receptor de linfotoxina beta, LYN, MGMT, MLH1, MRP1, MS4A1, MSH2, Myc, NFKB1, NFKB2, NFKBIA, ODC1, OGFR, p53, p95, PARP-1, PDGFC, PDGFR, PDGFRA, PDGFRB, PGP, PGR, PI3K, POLA, POLA1, PPARG, PPARGC1, PR, PTEN, PTGS2, RAF1, RARA, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRB, RXRG, SPARC, SPARC MC, SPARC PC, SRC, SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4, SSTR5, Survivina, TK1, TLE3, TNF, TOPI, TOP2A, TOP2B, TOPO1, TOP02B, Topoisomerasa II, TS, TXN, TXNRD1, TYMS, VDR, VEGF, VEGFA, VEGFC, VHL, YES1 y ZAP70.

El análisis de expresión de micromatriz puede comprender identificar si un gen está regulado positiva o negativamente en relación con una referencia con significación estadística. La significación estadística se puede determinar con un valorpinferior o igual a 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005 o 0,0001. El valorptambién puede corregirse para comparaciones múltiples. La corrección para comparaciones múltiples puede incluir la corrección de Bonferroni o una modificación de la misma.

El análisis de IHC comprende determinar si el 30 % o más de dicha muestra es de intensidad de tinción 2 o superior.

Las reglas contenidas en la base de datos de reglas usada por los métodos de la invención pueden basarse en la eficacia de distintos tratamientos particulares para un gen o producto génico diana. La base de datos de reglas puede comprender las reglas enumeradas en el presente documento en la Tabla 1 y/o la Tabla 2.

En algunas realizaciones de los métodos de la invención, se identifica una lista priorizada de tratamientos candidatos. La priorización puede incluir ordenar los tratamientos de mayor prioridad a menor prioridad de acuerdo con los tratamientos basados en el análisis de micromatriz y el análisis bien de IHC o de FISH; tratamientos basados en el análisis de IHC, pero no en el análisis de micromatriz; y tratamientos basados en el análisis de micromatriz, pero no en análisis de IHC.

En algunas realizaciones de los métodos de la invención, el tratamiento candidato comprende la administración de uno o más agentes terapéuticos candidatos. El uno o más agentes terapéuticos candidatos pueden ser 5-fluorouracilo, abarelix, Alemtuzumab, aminoglutetimida, Anastrazol, inhibidores de la aromatasa (anastrazol, letrozol), asparaginasa, aspirina, ATRA, azacitidina, bevacizumab, bexaroteno, Bicalutamida, bortezomib, calcitriol, capecitabina, Carboplatino, celecoxib, Cetuximab, Terapia quimioendocrina, colecalciferol, Cisplatino, carboplatino, Ciclofosfamida, Ciclofosfamida/Vincristina, citarabina, dasatinib, decitabina, Doxorrubicina, Epirrubicina, epirrubicina, Erlotinib, Etopósido, exemestano, fluoropirimidinas, Flutamida, fiilvestrant, Gefitinib, Gefitinib y Trastuzumab, Gemcitabina, gonadorelina, Goserelina, hidroxiurea, Imatinib, Irinotecán, Ixabepilona, Lapatinib, Letrozol, Leuprolida, doxorrubicina liposomal, medroxiprogesterona, megestrol, metotrexato, mitomicina, nab-paclitaxel, octreotida, Oxaliplatino, Paclitaxel, Panitumumab, pegaspargasa, pemetrexed, pentostatina, sorafenib, sunitinib, Tamoxifeno, Tratamiento basado en tamoxifeno, Temozolomida, topotecán, toremifeno, Trastuzumab, VBMCP/Ciclofosfamida, Vincristina o cualquier combinación de los mismos. El uno o más agentes terapéuticos candidatos también pueden ser 5FU, bevacizumab, capecitabina, cetuximab, cetuximab gemcitabina, cetuximab irinotecán, ciclofosfamida, dietilestibesterol, doxorrubicina, erlotinib, etopósido, exemestano, fluoropirimidinas, gemcitabina, gemcitabina etopósido, gemcitabina pemetrexed, irinotecán, irinotecán sorafenib, lapatinib, lapatinib tamoxifeno, letrozol, letrozol capecitabina, mitomicina, nab-paclitaxel, nab-paclitaxel gemcitabina, nab-paclitaxel trastuzumab, oxaliplatino, oxaliplatino 5FU trastuzumab, panitumumab, pemetrexed, sorafenib, sunitinib, sunitinib, sunitinib mitomicina, tamoxifeno, temozolomida, temozolomida bevacizumab, temozolomida sorafenib, trastuzumab, vincristina o cualquier combinación de los mismos.

En realizaciones de los métodos de la invención, la muestra comprende células cancerosas. El cáncer puede ser un cáncer metastásico. El cáncer puede ser refractario a un tratamiento previo. El tratamiento previo puede ser el tratamiento convencional de atención para el cáncer. En ocasiones, el sujeto ha sido tratado previamente con uno o más agentes terapéuticos para tratar un cáncer. En ocasiones, el sujeto no ha sido tratado previamente con uno o más agentes terapéuticos candidatos identificados.

En algunas realizaciones, el cáncer comprende uno de próstata, pulmón, melanoma, microcítico (esófago/retroperitoneo), colangiocarcinoma, mesotelioma, cabeza y cuello (SCC), páncreas, neuroendocrino de páncreas, tumores microcíticos, gástrico, pseudomixoma peritoneal, canal anal (SCC), vagina (SCC), cuello uterino, renal, adenocarcinoma de asiento ecrino, adenocarcinoma de glándulas salivales, sarcoma de tejidos blandos uterinos (uterino), GIST (gástrico) o cáncer anaplásico de tiroides. En algunas realizaciones, el cáncer comprende un cáncer de los órganos accesorios, senos paranasales, oído medio e interno, glándulas suprarrenales, apéndice, sistema hematopoyético, huesos y articulaciones, médula espinal, mama, cerebelo, cuello uterino, tejido conjuntivo y blando, cuerpo uterino, esófago, ojo, nariz, globo ocular, trompa de Falopio, conductos biliares extrahepáticos, boca, conductos biliares intrahepáticos, riñón, apéndice-colon, laringe, labio, hígado, pulmón y bronquios, ganglios linfáticos, cerebral, espinal, cartílago nasal, retina, ojo, orofaringe, glándulas endocrinas, genital femenino, ovario, páncreas, pene y escroto, glándula pituitaria, pleura, glándula prostática, recto, pelvis renal, uréter, peritoneo, glándula salival, piel, intestino delgado, estómago, testículos, timo, glándula tiroidea, lengua, desconocido, vejiga urinaria, útero, vagina, labios genitales y vulva. En algunas realizaciones, la muestra comprende células seleccionadas del grupo que consiste en tejido adiposo, corteza suprarrenal, glándula suprarrenal, glándula suprarrenal: médula, apéndice, vejiga, sangre, vaso sanguíneo, hueso, cartílago óseo, cerebro, mama, cartílago, perfil de mutaciones, colon, colon sigmoide, células dendríticas, músculo esquelético, endometrio, esófago, trompa de Falopio, fibroblasto, vesícula biliar, riñón, laringe, hígado, pulmón, ganglio linfático, melanocitos, revestimiento mesotelial, células mioepiteliales, osteoblastos, ovario, páncreas, parótida, próstata, glándula salival, tejido sinusal, músculo esquelético, piel, intestino delgado, músculo liso, estómago, sinovio, tejido de revestimiento articular, tendón, testículos, timo, tiroides, útero y cuerpo del útero. En algunas realizaciones, el cáncer comprende un cáncer de mama, colorrectal, ovárico, de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico, colangiocarcinoma, mesotelioma, de glándulas sudoríparas o cáncer GIST.

La Supervivencia Libre de Progresión (SLP) o la Supervivencia Libre de Enfermedad (SLE) para el sujeto se puede prolongar usando los métodos de la invención. Por ejemplo, la SLP o SLE puede prolongarse al menos aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 100 % en comparación con el tratamiento previo. Además, Además, la esperanza de vida del paciente puede prolongarse usando los métodos de la invención para seleccionar un tratamiento candidato. Por ejemplo, la esperanza de vida del paciente se puede prolongar al menos 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mes, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 2 meses, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 13 meses, 14 meses, 15 meses, 16 meses, 17 meses, 18 meses, 19 meses, 20 meses, 21 meses, 22 meses, 23 meses, 24 meses, 2 años, 2,5 años, 3 años, 4 años o al menos 5 años.

Breve descripción de los dibujos

Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención haciendo referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en la que se utilizan los principios de la invención y los dibujos adjuntos de los cuales:

laFIG. 1ilustra un diagrama de bloques de una realización ilustrativa de un sistema para determinar la intervención médica individualizada para un determinado estado patológico que utiliza el perfilado molecular de una muestra biológica de un paciente que no es específica de la enfermedad.

LaFIG. 2es un diagrama de flujo de una realización ilustrativa de un método para determinar la intervención médica individualizada para un determinado estado patológico que utiliza el perfil molecular de una muestra biológica de un paciente que no es específica de la enfermedad.

LasFIG. 3Aa3Dilustran un informe de perfilado de un paciente a modo de ejemplo de acuerdo con la etapa 80 de laFIG. 2.

LaFIG. 4es un diagrama de flujo de una realización ilustrativa de un método para identificar una terapia farmacológica/un agente farmacológico capaz de interactuar con una diana.

LasFIG. 5-14son diagramas de flujo y diagramas que ilustran distintas partes de un sistema y método de descubrimiento de fármacos de medicina personalizada basado en información.

LasFIG. 15-25son impresiones de pantalla de ordenador asociadas con distintas partes del sistema y método de descubrimiento de fármacos de medicina personalizada basado en información mostrados en lasFIG. 5-14. LasFIG. 26A-26Hrepresentan una tabla que muestra la frecuencia de un cambio significativo en la expresión de proteínas expresadas en genes por tipo de tumor.

LasFIG. 27A-27Hrepresentan una tabla que muestra la frecuencia de un cambio significativo en la expresión de ciertos genes por tipo de tumor.

LasFIG. 28A-28Orepresentan una tabla que muestra la frecuencia de un cambio significativo en la expresión de ciertas proteínas expresadas en genes por tipo de tumor.

LaFIG. 29es una tabla que muestra biomarcadores (proteínas expresadas en genes) marcados como dianas por orden de frecuencia basándose en laFIG. 28.

LasFIG. 30A-30Orepresentan una tabla que muestra la frecuencia de un cambio significativo en la expresión para ciertos genes por tipo de tumor.

LaFIG. 31es una tabla que muestra genes marcados como dianas por orden de frecuencia basándose en laFIG.

30.

LaFIG. 32ilustra la supervivencia libre de progresión (SLP) usando la terapia seleccionada mediante perfilado molecular (período B) con la SLP para la terapia más reciente en la que el paciente acaba de tener un progreso (período A). Si la proporción de SLP (B)/SLP (A) > 1,3, entonces, la terapia seleccionada mediante perfilado molecular se define como beneficiosa para el paciente.

LaFIG. 33es un esquema de métodos para identificar tratamientos mediante perfilado molecular si se identifica una diana.

LaFIG. 34ilustra la distribución de los pacientes en el estudio como se realiza en el Ejemplo 1.

LaFIG. 35es un gráfico que muestra los resultados del estudio con pacientes que tienen una proporción de SLP > 1,3, que fue de 18/66 (27 %).

LaFIG. 36es una gráfica en cascada de todos los pacientes para el % de cambio máximo de los diámetros sumados de lesiones diana con respecto al diámetro de referencia.

LaFIG. 37ilustra la relación entre lo que el médico seleccionó como lo que usaría para tratar al paciente antes de saber lo que sugieren los resultados del perfilado molecular. No hubo coincidencias para los 18 pacientes con proporción de SLP > 1,3.

LaFIG. 38es un esquema de la supervivencia global de los 18 pacientes con una proporción de SLP > 1,3 frente al total de los 66 pacientes.

LaFIG. 39muestra un ejemplo de producción de resultados de perfilado de micromatriz y de las determinaciones realizadas usando un valor de punto de corte.

LasFIG. 40A-40Jilustran un informe de ejemplo de un paciente basado en el perfilado molecular.

Descripción detallada de la invención

La presente divulgación proporciona métodos y sistemas para identificar dianas para tratamientos mediante el uso del perfilado molecular. El enfoque del perfilado molecular proporciona un método para seleccionar un tratamiento candidato para un individuo que podría cambiar favorablemente el curso clínico para un individuo con una afección o enfermedad, tal como cáncer. El enfoque del perfilado molecular puede proporcionar un beneficio clínico para los individuos, tal como proporcionar una supervivencia libre de progresión (SLP) más larga, una supervivencia libre de enfermedad (SSE) más larga, una supervivencia global (SG) más larga o una esperanza de vida prolongada cuando se trata usando enfoques de perfilado molecular en comparación con los enfoques convencionales para seleccionar un régimen de tratamiento. El perfilado molecular puede sugerir tratamientos candidatos cuando una enfermedad es refractaria a las terapias actuales, por ejemplo, después de que un cáncer haya desarrollado resistencia a un tratamiento de atención convencional.

El perfilado molecular se puede realizar mediante cualquier medio conocido para detectar una molécula en una muestra biológica. El perfilado se puede realizar en cualquier muestra biológica aplicable. La muestra normalmente procede de un individuo con una enfermedad o un trastorno sospechoso o conocido, tal como, pero sin limitación, una muestra de biopsia de un paciente con cáncer. El perfilado molecular de la muestra también se puede realizar mediante cualquier cantidad de técnicas que evalúen la cantidad o el estado de un factor biológico, tales como una secuencia de ADN, una secuencia de ARNm o una proteína. Dichas técnicas incluyen, sin limitación, la inmunohistoquímica (IHC), la hibridaciónin situ(ISH), hibridaciónin situfluorescente (FISH), distintos tipos de micromatrices (matrices de expresión de ARNm, matrices de proteínas, etc.), distintos tipos de secuenciación (Sanger, pirosecuenciación, etc.), hibridación genómica comparativa (CGH), secuenciación NextGen, transferencia Northern, transferencia de Southern, inmunoensayo, y cualquier otra técnica apropiada en desarrollo para analizar la presencia o cantidad de una molécula biológica de interés. Uno cualquiera o más de estos métodos se pueden usar de manera simultánea o consecutiva.

El perfilado molecular se usa para seleccionar un tratamiento candidato para un trastorno en un sujeto. Por ejemplo, el tratamiento candidato puede ser un tratamiento que se sabe que tiene un efecto sobre las células que expresan diferencialmente genes identificados mediante técnicas de perfilado molecular. La expresión diferencial puede incluir sobreexpresión e infraexpresión de un producto biológico, por ejemplo, un gen, ARNm o proteína, en comparación con un control. El control puede incluir células similares a la muestra, pero sin la enfermedad. El control puede derivarse del mismo paciente, por ejemplo, una porción adyacente normal del mismo órgano que las células enfermas, o el control puede derivarse de tejidos sanos de otros pacientes. El control puede ser un control encontrado en la misma muestra, por ejemplo, un gen constitutivo o un producto del mismo (por ejemplo, ARNm o proteína). Por ejemplo, un ácido nucleico de control puede ser aquel que se sabe que no difiere dependiendo del estado canceroso o no canceroso de la célula. El nivel de expresión de un ácido nucleico de control se puede usar para normalizar los niveles de señal en las poblaciones de prueba y de referencia. Los genes de control de ejemplo incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, p-actina, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa y proteína ribosómica PI. Se pueden usar múltiples controles o tipos de controles. La fuente de la expresión diferencial puede variar. Por ejemplo, un número de copias de genes puede aumentarse en una célula, lo que produce una mayor expresión del gen. Como alternativa, la transcripción del gen puede modificarse, por ejemplo, mediante remodelación de cromatina, metilación diferencial, expresión diferencial o actividad de factores de transcripción, etc. La traducción también puede modificarse, por ejemplo, mediante la expresión diferencial de factores que degradan el ARNm, traducen el ARNm o silencian la traducción, por ejemplo, microARN o ARNip. En algunas realizaciones, la expresión diferencial comprende actividad diferencial. Por ejemplo, una proteína puede portar una mutación que aumenta la actividad de la proteína, tal como la activación constitutiva, contribuyendo así a un estado patológico. El perfilado molecular que revela cambios en la actividad puede usarse para guiar la selección del tratamiento.

Cuando se revelan múltiples dianas farmacológicas como expresadas diferencialmente por el perfilado molecular, se pueden establecer reglas de decisión para priorizar la selección de ciertos tratamientos. Se puede usar cualquier regla que ayude a priorizar el tratamiento para priorizar los tratamientos, por ejemplo, resultados directos del perfilado molecular, eficacia anticipada, historia previa con el mismo u otros tratamientos, efectos secundarios esperados, disponibilidad, coste, interacciones farmacológicas, y otros factores considerados por un médico tratante. El médico finalmente puede decidir el curso del tratamiento. Por consiguiente, el perfilado molecular puede seleccionar tratamientos candidatos en función de las características individuales de las células enfermas, por ejemplo, células tumorales y otros factores personalizados en un sujeto que necesita tratamiento, en lugar de depender de un enfoque tradicional de talla única para la terapia dirigida en contra de una cierta indicación. En algunos casos, los tratamientos recomendados son aquellos que normalmente no se usan para tratar la enfermedad o el trastorno padecido por el sujeto. En algunos casos, los tratamientos recomendados se usan una vez que las terapias convencional de atención ya no brindan la eficacia adecuada.

Los ácidos nucleicos incluyen desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y sus polímeros en forma monocatenaria o bicatenaria, y sus complementos. Los ácidos nucleicos pueden contener análogos de nucleótidos conocidos, o restos o enlaces de cadena principal modificados, que son sintéticos, de origen natural y de origen no natural, que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de forma similar a los nucleótidos de referencia. Ejemplos de dichos análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforoamidatos, metilfosfonatos, metil-fosfonatos quirales, 2-O-metil-ribonucleótidos, ácidos nucleicos peptídicos (ANP). La secuencia de ácido nucleico puede abarcar variantes de la misma modificadas conservativamente (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, las sustituciones de codones degenerados se pueden lograr mediante la generación de secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con restos de base mixta y/o de desoxiinosina (Batzeret al., Nucleic Acid Res.19:5081 (1991); Ohtsukaet al., J. Biol. Chem.260:2605-2608 (1985); Rossoliniet al., Mol. Cell Probes8:91-98 (1994)). El término ácido nucleico se puede usar indistintamente con gen, ADNc, ARNm, oligonucleótido y polinucleótido.

Una secuencia particular de ácido nucleico puede abarcar implícitamente la secuencia particular y las "variantes de corte y empalme" y las secuencias de ácido nucleico que codifican formas truncadas. De forma similar, una proteína particular codificada por un ácido nucleico puede abarcar cualquier proteína codificada por una variante de corte y empalme o una forma truncada de ese ácido nucleico. Las "variantes de corte y empalme", como su nombre sugiere, son productos de un corte y empalme alternativo de un gen. Tras la transcripción, se puede cortar y empalmar una transcripción de ácido nucleico inicial de manera que los productos de corte y empalme de ácido nucleico diferentes (alternativos) codifiquen diferentes polipéptidos. Los mecanismos para la producción de variantes de corte y empalme varían, pero incluyen el corte y empalme alternativo de exones. Los polipéptidos alternativos derivados del mismo ácido nucleico por transcripción de lectura completa también están abarcados por esta definición. Cualquier producto de una reacción de corte y empalme, incluyendo las formas recombinantes de los productos de corte y empalme, se incluyen en esta definición. Los ácidos nucleicos pueden truncarse en el extremo 5' o en el extremo 3'. Los polipéptidos pueden truncarse en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal. Las versiones truncadas de secuencias de ácido nucleico o polipéptido pueden ser de origen natural o creadas de forma recombinante.

Las expresiones "variante genética" y "variante de nucleótido" se usan en el presente documento indistintamente para referirse a cambios o alteraciones del gen humano de referencia o secuencia de ADNc en un locus particular, incluyendo, pero sin limitación, eliminaciones, inserciones, inversiones y sustituciones de bases de nucleótidos en las regiones codificantes y no codificantes. Las eliminaciones pueden ser de una sola base de nucleótidos, una porción o una región de la secuencia de nucleótidos del gen, o de toda la secuencia del gen. Las inserciones pueden ser de una o más bases de nucleótidos. La variante genética o la variante de nucleótido pueden aparecer en regiones reguladoras de la transcripción, regiones no traducidas de ARNm, exones, intrones, uniones de exón/intrón, etc. La variante genética o la variante de nucleótido pueden potencialmente dar lugar a codones de parada, desplazamientos del marco, eliminaciones de aminoácidos, formas de corte y empalme de la transcripción de genes alterados o secuencia de aminoácidos alterada.

Un alelo o alelo genético comprende, en general, un gen natural que tiene una secuencia de referencia o un gen que contiene una variante de nucleótido específica.

Un haplotipo se refiere a una combinación de variantes genéticas (nucleótidos) en una región de un ARNm o un ADN genómico en un cromosoma que se encuentra en un individuo. Por lo tanto, un haplotipo incluye una serie de variantes polimórficas unidas genéticamente que normalmente se heredan conjuntamente como una unidad.

Como se usa en el presente documento, la expresión "variante de aminoácido" se usa para referirse a un cambio de aminoácido con respecto a una secuencia de proteína humana de referencia procedente de variantes genéticas o variantes de nucleótido con respecto al gen humano de referencia que codifica la proteína de referencia. La expresión "variante de aminoácido" pretende abarcar no solo sustituciones de aminoácidos individuales, sino también eliminaciones, inserciones y otros cambios significativos de la secuencia de aminoácidos en la proteína de referencia.

El término "genotipo", como se usa en el presente documento significa los caracteres de nucleótido en un marcador de variante de nucleótido particular (o locus) en un alelo o en ambos alelos de un gen (o una región cromosómica particular). Con respecto a una posición particular de nucleótido de un gen de interés, el/los nucleótido/s en ese locus o su equivalente en uno o ambos alelos forman el genotipo del gen en ese locus. Un genotipo puede ser homocigoto o heterocigoto. Por consiguiente, "genotipado" significa determinar el genotipo, es decir, el/los nucleótido/s en un locus genético particular. El genotipado también se puede hacer determinando la variante de aminoácido en una posición particular de una proteína que se puede usar para deducir la/s variante/s de nucleótido correspondiente/s.

El término "locus" se refiere a una posición o a un sitio específico en una secuencia génica o proteína. Por lo tanto, puede haber uno o más nucleótidos contiguos en un determinado locus genético, o uno o más aminoácidos en un determinado locus de un polipéptido. Además, un locus puede referirse a una determinada posición en un gen donde uno o más nucleótidos han sido eliminados, insertados o invertidos.

Como se usa en el presente documento, los términos "polipéptido", "proteína", y "péptido" se usan indistintamente para referirse a una cadena de aminoácidos en la que los restos de aminoácido están unidos por enlaces peptídicos covalentes. La cadena de aminoácidos puede tener cualquier longitud de al menos dos aminoácidos, incluyendo las proteínas de longitud completa. A menos que se especifique lo contrario, el polipéptido, la proteína y el péptido también abarcan distintas formas modificadas de los mismos, Incluyendo, sin limitación, formas glicosiladas, formas fosforiladas, etc. Un polipéptido, una proteína o un péptido también puede denominarse producto génico.

En el presente documento, se presentan listas de genes y productos génicos que se pueden analizar mediante técnicas de perfilado molecular. Las listas de genes pueden presentarse en el contexto de las técnicas de perfilado molecular que detectan un producto génico (por ejemplo, un ARNm o una proteína). Un experto comprenderá que esto implica la detección del producto génico de los genes enumerados. De forma similar, las listas de productos génicos se pueden presentar en el contexto de las técnicas de perfilado molecular que detectan una secuencia de genes o un número de copias. Un experto comprenderá que esto implica la detección del gen correspondiente a los productos génicos, incluyendo, como ejemplo, el ADN que codifica los productos génicos. Como apreciarán los expertos en la materia, un "biomarcador" o "marcador" comprende un gen y/o un producto génico dependiendo del contexto.

Los términos "marcador" y "marcador detectable" pueden referirse a cualquier composición detectable mediante métodos espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos, químicos o similares. Dichos marcadores incluyen la biotina para la tinción con conjugado de estreptavidina marcado, perlas magnéticas (por ejemplo, DYNABEADS™), colorantes fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rojo Texas, rodamina, proteína verde fluorescente y similares), radiomarcadores (por ejemplo, 3H, 125l, 35S, 14C o 32P), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y otras comúnmente usadas en un ELISA) y marcadores calorimétricos, tales como oro coloidal o perlas de vidrio o de plástico coloreado (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.). Las patentes que enseñan el uso de dichos marcadores incluyen las patentes de EE.UU. n.° 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241. Los medios de detección de dichos marcadores son bien conocidos por los expertos en la materia. Por lo tanto, por ejemplo, pueden detectarse radiomarcadores usando película fotográfica o contadores de centelleo, pudiéndose detectar los marcadores fluorescentes usando un fotodetector para detectar la luz emitida. Los marcadores enzimáticos se detectan normalmente proporcionando a la enzima un sustrato y detectando el producto de reacción producido mediante la acción de la enzima sobre el sustrato, y los marcadores calorimétricos se detectan visualizando simplemente el marcador coloreado. Los marcadores pueden incluir, por ejemplo, ligandos que se unen a anticuerpos marcados, fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas y anticuerpos que pueden servir como miembros de pares de unión específicos para un ligando marcado. Una introducción a los marcadores, los procedimientos de marcaje y la detección de marcadores se encuentra en Polak y Van Noorden, "Introduction to Immunocytochemistry", 2a ed., Springer Verlag, NY (1997); y en "Haugland Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals", un manual y un catálogo combinados publicados por Molecular Probes, Inc. (1996).

Los marcadores detectables incluyen, pero sin limitación, nucleótidos (marcados o no marcados), compómeros, azúcares, péptidos, proteínas, anticuerpos, compuestos químicos, polímeros conductores, fracciones de unión tales como biotina, marcadores de masa, agentes calorimétricos, agentes emisores de luz, agentes quimioluminiscentes, agentes de dispersión de luz, marcadores fluorescentes, marcadores radioactivos, marcadores de carga (carga eléctrica o magnética), marcadores volátiles y marcadores hidrófobos, biomoléculas (por ejemplo, miembros de un par de unión de anticuerpo/antígeno, anticuerpo/anticuerpo, anticuerpo/fragmento de anticuerpo, anticuerpo/receptor de anticuerpos, anticuerpo/proteína A o proteína G, hapteno/anti-hapteno, biotina/avidina, biotina/estreptavidina, ácido fólico/proteína de unión a folato, vitamina B12/factor intrínseco, grupo reactivo químico/grupo reactivo químico complementario (por ejemplo, sulfhidrilo/maleimida, derivado de sulfhidrilo/haloacetilo, amina/isotriocianato, amina/succinimidil-éster y haluros de amina/sulfonilo) y similares.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, abarca anticuerpos naturales, así como anticuerpos no naturales, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos monocatenarios, quiméricos, anticuerpos bifuncionales y humanizados, así como fragmentos de unión al antígeno de los mismos, (por ejemplo, Fab', F(ab')², Fab, Fv y rlgG). Véase también, "Pierce Catalog and Handbook", 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, 111). Véase también, por ejemplo, Kuby, J., "Immunology", 3a ed., W. H. Freeman & Co., Nueva York (1998). Dichos anticuerpos no naturales pueden construirse usando síntesis de péptidos en fase sólida, pueden producirse de manera recombinante o pueden obtenerse, por ejemplo, mediante el cribado de bibliotecas combinatorias que consisten en cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables según lo descrito porHuse et al., Science246:1275-1281 (1989). Estos y otros métodos de fabricación, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, injertados con CDR, monocatenarios y bifuncionales son bien conocidos por los expertos en la materia. Véanse, por ejemplo, Winter y Harris,Immunol. Today14:243-246 (1993); Wardet al., Nature341:544-546 (1989); Harlow y Lane, "Antibodies", 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, Nueva York, 1988; Hilyardet al.,"Protein Engineering: A practical approach" (IRL Press 1992); Borrebaeck, "Antibody Engineering", 2a ed. (Oxford University Press 1995).

A menos que se especifique lo contrario, los anticuerpos pueden incluir anticuerpos policlonales y monoclonales. Los anticuerpos también incluyen formas modificadas genéticamente, tales como anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados) y anticuerpos heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos). El término también se refiere a fragmentos Fv monocatenarios recombinantes (scFv). El término anticuerpo también incluye moléculas bivalentes o biespecíficas, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos. Las moléculas bivalentes y biespecíficas se describen en, por ejemplo, Kostelnyet al.(1992)J Immunol148:1547, Pack y Pluckthun (1992)Biochemistry31:1579, Holligeret al.(1993)Proc Natl Acad SciEE.UU. 90:6444, Gruberet al.(1994)JImmunol:5368, Zhuet al.(1997)Protein Sci6:781, Huet al.(1997)Cancer Res.56:3055, Adamset al.(1993)Cancer Res.53:4026 y McCartney,et al.(1995)Protein Eng.8:301.

Normalmente, un anticuerpo tiene una cadena pesada y ligera. Cada cadena pesada y ligera contiene una región constante y una región variable, (las regiones también se conocen como "dominios"). Las regiones variables de cadena ligera y pesada contienen cuatro regiones marco interrumpidas por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR,Complementarity-Determining Regions).La extensión de las regiones marco y las CDR se han definido. Las secuencias de las regiones marco conservadas de diferentes cadenas ligeras o pesadas están relativamente conservadas dentro de una especie. La región marco conservada de un anticuerpo, es decir, las regiones marco conservadas combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para colocar y alinear las CDR en espacios tridimensionales. Las CDR son responsables principalmente de la unión a un epítopo de un antígeno. Las CDR de cada cadena se denominan normalmente CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente a partir del extremo N, y también se identifican normalmente por la cadena en la que está ubicada la CDR particular. Por lo tanto, una CDR3 V^hestá ubicada en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo en el que se encuentra, mientras que una CDR1 V^les la CDR1 del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en el que se encuentra. Las referencias a V^hse refieren a la región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina de un anticuerpo, incluyendo la cadena pesada de un Fv, scFv o Fab. Las referencias a V^lse refieren a la región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina, incluyendo la cadena ligera de un Fv, scFv, dsFv o Fab.

La expresión "Fv monocatenario" o "scFv (single chain Fv)"se refiere a un anticuerpo en el que los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera de un anticuerpo tradicional de dos cadenas se han unido para formar una cadena. Normalmente, se inserta un péptido conector entre las dos cadenas para permitir el plegamiento adecuado y la creación de un sitio de unión activo. Un "anticuerpo quimérico" es una molécula de inmunoglobulina en la que (a) la región constante, o una parte de la misma, se altera, Reemplaza o intercambia de forma que el sitio de unión al antígeno (región variable) está unida a una región constante de una clase diferente o alterada, función efectora y/o especie, o una molécula completamente diferente que transmite nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima, una toxina, una hormona, un factor de crecimiento, un fármaco, etc.; o (b) la región variable, o una parte de la misma, se altera, se sustituye o se intercambia por una región variable que tiene una especificidad de antígeno diferente o alterada.

Un "anticuerpo humanizado" es una molécula de inmunoglobulina que contiene una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor están reemplazados por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la región marco de Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los correspondientes restos no humanos. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en las CDR o secuencias marco. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno y, normalmente, dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones marco (FR) son las de una secuencia consenso de una inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también óptimamente al menos una porción de una región constante de una inmunoglobulina (Fc), normalmente, de una inmunoglobulina humana (Joneset al., Nature321:522-525 (1986); Riechmannet al., Nature332:323-327 (1988); y Presta,Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596 (1992)). La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo los métodos de Winter y colaboradores (Joneset al., Nature321:522-525 (1986); Riechmannet al., Nature332:323-327 (1988); Verhoeyenet al., Science239:1534-1536 (1988)), sustituyendo las CDR o secuencias de CDR de roedores por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos (patente de EE.UU. n.° 4.816.567) en donde sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana.

El término "epítopo"o la expresión "determinante antigénico" se refieren a un lugar sobre un antígeno al que se une un anticuerpo. Los epítopos pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como a partir de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos normalmente están preservados frente a la exposición a disolventes desnaturalizantes mientras que los epítopos formados por el plegamiento terciario normalmente se pierden tras el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo normalmente incluye al menos 3, y más habitualmente, al menos 5 u 8­ 10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar la conformación espacial de los epítopos incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear en 2 dimensiones. Véase, por ejemplo, "Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology", Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996).

Los términos "cebador", "sonda", y "oligonucleótido" se usan en el presente documento indistintamente para referirse a un fragmento o una secuencia de ácido nucleico relativamente corto. Pueden comprender ADN, ARN o un híbrido de los mismos, o análogos químicamente modificados o derivados de los mismos. Normalmente, son monocatenarios. Sin embargo, también pueden ser bicatenarios que tengan dos cadenas complementarias que se puedan separar mediante desnaturalización.

Normalmente, los cebadores, las sondas y los oligonucleótidos tienen una longitud de aproximadamente 8 nucleótidos a aproximadamente 200 nucleótidos, preferentemente, de aproximadamente 12 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos, y más preferentemente, de aproximadamente 18 a aproximadamente 50 nucleótidos. Pueden marcarse con marcadores detectables o modificarse usando maneras convencionales para distintas aplicaciones de biología molecular.

El término "aislado" cuando se usa en referencia a ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN genómicos, ADNc, ARNm o fragmentos de los mismos) pretende significar que una molécula de ácido nucleico está presente en una forma que está sustancialmente separada de otros ácidos nucleicos naturales que normalmente están asociados con la molécula. Debido a que un cromosoma natural (o un equivalente vírico del mismo) incluye una secuencia larga de ácido nucleico, un ácido nucleico aislado puede ser una molécula de ácido nucleico que solo tenga una porción de la secuencia de ácido nucleico en el cromosoma, pero no una o más porciones presentes en el mismo cromosoma. Más específicamente, un ácido nucleico aislado puede incluir secuencias de ácido nucleico de origen natural que flanqueen el ácido nucleico en el cromosoma natural (o un equivalente vírico del mismo). Un ácido nucleico aislado puede separarse sustancialmente de otros ácidos nucleicos naturales que se encuentren en un cromosoma diferente del mismo organismo. Un ácido nucleico aislado también puede ser una composición en la que la molécula de ácido nucleico especificada esté enriquecida significativamente para constituir al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o al menos el 99 % de los ácidos nucleicos totales de la composición.

Un ácido nucleico aislado puede ser un ácido nucleico híbrido que tenga la molécula de ácido nucleico especificada unida covalentemente a una o más moléculas de ácido nucleico que no sean los ácidos nucleicos que flanqueen de manera natural el ácido nucleico especificado. Por ejemplo, un ácido nucleico aislado puede estar en un vector: Además, el ácido nucleico especificado puede tener una secuencia de nucleótidos que sea idéntica a un ácido nucleico natural, o una forma modificada o muteína del mismo que tenga una o más mutaciones, tales como sustitución, eliminación/inserción, inversión de nucleótidos y similares.

Se puede preparar un ácido nucleico aislado a partir de una célula hospedadora recombinante (en la que los ácidos nucleicos se han amplificado y/o expresado de forma recombinante), o puede ser un ácido nucleico sintetizado químicamente que tenga una secuencia de nucleótidos natural o una forma modificada artificialmente de la misma.

La expresión "polipéptido aislado", como se usa en el presente documento, se define como una molécula de polipéptido que está presente en una forma diferente a la encontrada en la naturaleza. Por lo tanto, un polipéptido aislado puede ser un polipéptido de origen no natural. Por ejemplo, un polipéptido aislado puede ser un "polipéptido híbrido". Un polipéptido aislado también puede ser un polipéptido derivado de un polipéptido natural mediante adiciones o eliminaciones o sustituciones de aminoácidos. Un polipéptido aislado también puede ser un "polipéptido purificado", que se usa en el presente documento para referirse a una composición o preparación en la que la molécula de polipéptido especificada se enriquece significativamente para constituir al menos el 10 % del contenido de proteína total de la composición. Se puede obtener un "polipéptido purificado" a partir de células hospedadoras naturales o recombinantes mediante técnicas de purificación convencionales, o mediante síntesis química, como será evidente para los expertos en la materia.

Las expresiones "proteína híbrida", "polipéptido híbrido", "péptido híbrido", "proteína de fusión", "polipéptido de fusión" y "péptido de fusión" se usan en el presente documento indistintamente para referirse a un polipéptido no natural o un polipéptido aislado que tiene una molécula de polipéptido específica unida covalentemente a una o más moléculas de polipéptido distintas que no están unidas al polipéptido especificado en la naturaleza. Por lo tanto, una "proteína híbrida" puede ser dos proteínas naturales o fragmentos de las mismas unidos entre sí por un enlace covalente. Una "proteína híbrida" también puede ser una proteína formada uniendo covalentemente dos polipéptidos artificiales entre sí. Normalmente, pero no necesariamente, las dos o más moléculas de polipéptido están unidas o "fusionadas" entre sí por un enlace peptídico que forma una sola cadena polipeptídica no ramificada.

La expresión "condiciones de hibridación de alta rigurosidad", cuando se usa en conexión con la hibridación de ácido nucleico, incluye la hibridación realizada durante la noche a 42 °C en una solución que contiene formamida al 50 %, 5 x SSC (NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM), fosfato de sodio 50 mM, pH 7,6, 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10 % y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y cortado, con filtros de hibridación lavados en 0,1 x SSC a aproximadamente 65 °C. La expresión "condiciones de hibridación de rigurosidad moderada", cuando se usa en conexión con la hibridación de ácido nucleico, incluye la hibridación realizada durante la noche a 37 °C en una solución que contiene formamida al 50 %, 5 x SSC (NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM), fosfato de sodio 50 mM, pH 7,6, 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10 % y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y cortado, con filtros de hibridación lavados en 1 x SSC a aproximadamente 50 °C. Se observa que se pueden usar muchos otros métodos de hibridación, soluciones y temperaturas para lograr condiciones de hibridación de rigurosidad comparable, como será evidente para los expertos en la materia.

Con el fin de comparar dos secuencias diferentes de ácido nucleico o polipéptido, se puede describir que una secuencia (secuencia de prueba) es un porcentaje específico idéntica a otra secuencia (secuencia de comparación). El porcentaje de identidad se puede determinar mediante el algoritmo de Karlin y Altschul,Proc. Natl. Acad. Sci.EE.UU., 90:5873-5877 (1993), que se incorpora a distintos programas BLAST. El porcentaje de identidad se puede determinar mediante la herramienta "Secuencias BLAST 2", que está disponible en el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI,National Center for Biotechnology Information).Véase Tatusova y Madden,FEMS Microbiol. Lett.,174(2):247- 250 (1999). Para la comparación de a Dn -ADN por pares, el programa BLASTN se usa con parámetros predeterminados (por ejemplo, Apareamiento: 1; Desapareamiento: -2; Apertura de huecos: 5 penalizaciones; extensión de huecos: 2 penalizaciones; x_dropoff de huecos: 50; expectativa:

10; y tamaño de palabra: 11, con filtro). Para la comparación de secuencias de proteína-proteína por parejas, el programa BLASTP puede emplearse usando parámetros predeterminados (por ejemplo, Matriz: BLOSUM62; apertura de huecos: 11; extensión de hueco: 1; x dropoff: 15; expectativa: 10,0; y tamaño de palabra: 3, con filtro). El porcentaje de identidad de dos secuencias se calcula alineando una secuencia de prueba con una secuencia de comparación usando BLAST, determinando el número de aminoácidos o de nucleótidos en la secuencia de prueba alineada que son idénticos a aminoácidos o nucleótidos de la misma posición de la secuencia de comparación, y dividiendo el número de aminoácidos o nucleótidos idénticos entre el número de aminoácidos o nucleótidos de la secuencia de comparación. Cuando se usa BLAST para comparar dos secuencias, alinea las secuencias y produce el porcentaje de identidad sobre regiones definidas y alineadas. Si las dos secuencias están alineadas en toda su longitud, el porcentaje de identidad producido por BLAST es el porcentaje de identidad de las dos secuencias. Si BLAST no alinea las dos secuencias en toda su longitud, entonces, el número de aminoácidos o nucleótidos idénticos en las regiones no alineadas de la secuencia de prueba y la secuencia de comparación se considera cero, y el porcentaje de identidad se calcula sumando el número de aminoácidos o nucleótidos idénticos en las regiones alineadas, y dividiendo ese número entre la longitud de la secuencia de comparación.

Se pueden usar distintas versiones de los programas BLAST para comparar secuencias, por ejemplo, BLAST 2.1.2 o BLAST+ 2.2.22.

Un sujeto puede ser cualquier animal que pueda beneficiarse de los métodos de la invención, incluyendo, por ejemplo, seres humanos y mamíferos no humanos, tales como primates, roedores, caballos, perros y gatos. Los sujetos incluyen, sin limitación, organismos eucariotas, más preferentemente, un mamífero tal como un primate, por ejemplo, chimpancé o ser humano; vaca; perro; gato; un roedor, por ejemplo, cobaya, rata, ratón; conejo; o un ave; reptil; o pez. Los sujetos destinados específicamente al tratamiento usando los métodos descritos en el presente documento incluyen seres humanos. Un sujeto puede ser denominado un individuo o un paciente.

El tratamiento de una enfermedad o un individuo es un enfoque para obtener resultados médicos beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clínicos, pero no necesariamente una cura. Para los fines de la presente invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitación, el alivio o la mejora de uno o más síntomas, la reducción del alcance de la enfermedad, la estabilización (es decir, no empeoramiento) del estado patológico, la prevención de la transmisión de la enfermedad, el retraso o la ralentización de la progresión de la enfermedad, la mejora o paliación del estado patológico, y la remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. El tratamiento también incluye prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no recibe tratamiento o si recibe un tratamiento diferente. Un tratamiento puede incluir la administración de un agente terapéutico, que puede ser un agente que ejerza un efecto citotóxico, citostático o inmunomodulador en células enfermas, por ejemplo, células cancerosas u otras células que puedan potenciar un estado patológico, por ejemplo, células inmunitarias activadas. Los agentes terapéuticos seleccionados mediante los métodos de la invención no están limitados. Se puede seleccionar cualquier agente terapéutico donde se pueda establecer un vínculo entre el perfilado molecular y la posible eficacia del agente. Los agentes terapéuticos incluyen, sin limitación, moléculas pequeñas, terapias con proteínas, terapias con anticuerpos, terapia víricas, terapias génicas y similares. Los tratamientos o las terapias contra el cáncer incluyen terapias contra cánceres con mediación de la apóptosis y sin mediación de la apóptosis, que incluyen, sin limitación, quimioterapia, terapia hormonal, radioterapia, inmunoterapia y combinaciones de las mismas. Los agentes quimioterapéuticos comprenden agentes terapéuticos y una combinación de agentes terapéuticos que tratan, por ejemplo, destruyen, células cancerosas. Los ejemplos de diferentes tipos de fármacos quimioterapéuticos incluyen, sin limitación, agentes alquilantes (por ejemplo, derivados de mostaza nitrogenada, etileniminas, alquilsulfonatos, hidrazinas y triazinas, nitrosureas y sales metálicas), alcaloides vegetales (por ejemplo, alcaloides de la vinca, taxanos, podofilotoxinas y análogos de camptotecán), antibióticos antitumorales (por ejemplo, antraciclinas, cromomicinas y similares), antimetabolitos (por ejemplo, antagonistas de ácido fólico, antagonistas de pirimidina, antagonistas de purina e inhibidores de la adenosina desaminasa), inhibidores de la topoisomerasa I, inhibidores de la topoisomerasa II y antineoplásicos diversos (por ejemplo, inhibidores de la ribonucleótido reductasa, inhibidores de esteroides adrenocorticales, enzimas, agentes antimicrotúbulos y retinoides).

Una muestra, como se usa en el presente documento, incluye cualquier muestra relevante que se puede usar para el perfilado molecular, por ejemplo, cortes de tejidos tales como biopsias o tejidos extraídos durante procedimientos quirúrgicos u otros procedimientos, muestras de autopsia y cortes congelados tomados con fines histológicos. Dichas muestras incluyen sangre y fracciones o productos sanguíneos (por ejemplo, suero, capa leucocitaria, plasma, plaquetas, eritrocitos, y similares), esputo, tejido de células de la mejilla, células cultivadas (por ejemplo, cultivos primarios, explantes y células transformadas), heces, orina, otros fluidos biológicos o corporales (por ejemplo, fluido prostático, fluido gástrico, fluido intestinal, fluido renal, fluido pulmonar, líquido cefalorraquídeo y similares), etc. Una muestra puede procesarse de acuerdo con técnicas entendidas por los expertos en la materia. Una muestra puede estar, sin limitación, recién extraída, congelada o fijada. En algunas realizaciones, una muestra comprende tejido embebido en parafina fijado con formalina (FFPE) o tejido recién congelado (FF). Una muestra puede comprender células cultivadas, incluyendo estirpes celulares primarias o inmortalizadas derivadas de la muestra de un sujeto. Una muestra también puede referirse a un extracto de una muestra de un sujeto. Por ejemplo, una muestra puede comprender ADN, ARN o proteína extraída de un tejido o un fluido corporal. Muchas técnicas y kits comerciales están disponibles para tales fines. La muestra recién extraída del individuo puede tratarse con un agente para preservar el ARN antes de su posterior procesamiento, por ejemplo, lisis y extracción celular. Las muestras pueden incluir muestras congeladas recolectadas para otros fines. Las muestras pueden asociarse con información relevante tales como la edad, el género y los síntomas clínicos presentes en el sujeto; la fuente de la muestra; y los métodos de recolección y almacenamiento de la muestra. Normalmente, una muestra se obtiene de un sujeto.

Una biopsia comprende el proceso de extracción de una muestra de tejido para evaluación de diagnóstico o pronóstico, y la propia muestra de tejido. Cualquier técnica de biopsia conocida en la técnica puede aplicarse a los métodos de perfilado molecular de la presente invención. La técnica de biopsia aplicada puede depender del tipo de tejido que se vaya a evaluar (por ejemplo, colon, próstata, riñón, vejiga, ganglio linfático, hígado, médula ósea, célula sanguínea, pulmón, mama, etc.), El tamaño y tipo de tumor (por ejemplo, sólido o suspendido, sangre o ascitis), entre otros factores. Las técnicas representativas de biopsia incluyen, pero sin limitación, biopsia por escisión, biopsia incisional, biopsia con aguja, biopsia quirúrgica y biopsia de médula ósea. Una "biopsia por escisión" se refiere a la extirpación de una masa tumoral completa con un pequeño margen de tejido normal que la rodea. Una "biopsia incisional" se refiere a la extracción de una cuña de tejido que incluye un diámetro de sección transversal del tumor. El perfilado molecular puede usar una "biopsia con aguja gruesa" de la masa tumoral o una "biopsia por aspiración con aguja fina" que, en general, obtiene una suspensión de células dentro de la masa tumoral. Se analizan las técnicas de biopsia, por ejemplo, en "Harrison's Principles of Internal Medicine", Kasper,et al.,eds., 16a ed., 2005, Capítulo 70, y a lo largo de la Parte V.

Las técnicas convencionales de biología molecular conocidas en la técnica y no descritas específicamente se siguen, en general, como en Sambrooket al.,"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1989) y como en Ausubelet al.,"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989) y como en Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988) y como en Watsonet al.,"Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York y en Birrenet al.,(eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vol. 1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998) y la metodología establecida en las patentes de EE.UU. n.° 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR,Polymerase Chain Reaction)puede llevarse a cabo, en general, como en "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Academic Press, San Diego, Calif. (1990).

Perfilado de expresión génica

En algunas divulgaciones, los biomarcadores se evalúan mediante perfilado de expresión génica. Los métodos de perfilado de expresión génica incluyen métodos basados en el análisis de hibridación de polinucleótidos y métodos basados en la secuenciación de polinucleótidos. Los métodos usados comúnmente conocidos en la técnica para la cuantificación de la expresión de ARNm en una muestra incluyen transferencia Northern e hibridaciónin situ(Parker y Barnes (1999)Methods in Molecular Biology,106: 247-283); ensayos de protección con ARNasa (Hod (1992) "Biotechniques" 13: 852-854); y la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) (Weiset al.(1992)Trends in Genetics,8: 263-264). Como alternativa, se pueden emplear anticuerpos que puedan reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. Los métodos representativos para el análisis de expresión génica basado en secuenciación incluyen el análisis en serie de la expresión génica (SAGE,Serial Analysis of Gene Expression)y el análisis de expresión génica mediante secuenciación masiva de distintivos en paralelo (MPSS,Massively Parallel Signature Sequencing).

PCR de transcriptasa inversa(RT-PCR)

La RT-PCR se puede usar para determinar los niveles de ARN, por ejemplo, los niveles de ARNm o miARN, de los biomarcadores de la invención. La RT-PCR se puede usar para comparar dichos niveles de ARN de los biomarcadores en diferentes poblaciones de muestra, en tejidos normales y tumorales, con o sin tratamiento farmacológico, para caracterizar patrones de expresión génica, a fin de diferenciar entre ARN estrechamente relacionados y analizar la estructura del ARN.

La primera etapa es el aislamiento de ARN, por ejemplo, ARNm, de una muestra. El material de partida puede ser ARN total aislado de tumores humanos o estirpes celulares tumorales, y los tejidos normales o estirpes celulares correspondientes, respectivamente. Por lo tanto, el ARN puede aislarse de una muestra, por ejemplo, células tumorales o estirpes celulares tumorales, y compararse con el ADN agrupado de donantes sanos. Si la fuente de ARNm es un tumor primario, el ARNm se puede extraer, por ejemplo, de muestras de tejido congeladas o archivadas embebidas en parafina y fijadas (por ejemplo, fijadas con formalina).

Los métodos generales para la extracción de ARNm son bien conocidos en la técnica y se desvelan en libros de texto convencionales de biología molecular, entre los que se incluye Ausubelet al.(1997) "Current Protocols of Molecular Biology", John Wiley and Sons. Los métodos para la extracción de ARN de tejidos embebidos en parafina se desvelan, por ejemplo, en Rupp y Locker (1987)Lab Invest.56:A67, y De Andreset al., BioTechniques18:42044 (1995). En particular, el aislamiento del ARN se puede realizar usando un kit de purificación, un conjunto de tampones, y proteasa de fabricantes comerciales, tales como Qiagen, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (QUIAGEN Inc., Valencia, CA). Por ejemplo, el ARN total de las células en cultivo puede aislarse usando mini-columnas RNeasy de Qiagen. En el mercado, hay numerosos kits de aislamiento de ARN disponibles, y pueden usarse en los métodos.

Como alternativa, la primera etapa es el aislamiento de miARN de una muestra diana. El material de partida normalmente es ARN total aislado de tumores humanos o estirpes celulares tumorales, y los tejidos normales o estirpes celulares correspondientes, respectivamente. Por lo tanto, el ARN puede aislarse de una variedad de tumores primarios o estirpes celulares tumorales, con ADN agrupado de donantes sanos. Si la fuente de miARN es un tumor primario, el miARN se puede extraer, por ejemplo, de muestras de tejido congeladas o archivadas embebidas en parafina y fijadas (por ejemplo, fijadas con formalina).

Los métodos generales para la extracción de miARN son bien conocidos en la técnica y se desvelan en libros de texto convencionales de biología molecular, entre los que se incluye Ausubelet al.(1997) "Current Protocols of Molecular Biology", John Wiley and Sons. Los métodos para la extracción de ARN de tejidos embebidos en parafina se desvelan, por ejemplo, en Rupp y Locker (1987)Lab Invest.56:A67, y De Andreset al., BioTechniques18:42044 (1995). En particular, el aislamiento del ARN se puede realizar usando un kit de purificación, un conjunto de tampones, y proteasa de fabricantes comerciales, tales como Qiagen, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, el ARN total de las células en cultivo puede aislarse usando mini-columnas RNeasy de Qiagen. En el mercado, hay numerosos kits de aislamiento de ARN disponibles, y pueden usarse en los métodos de la invención.

Si el ARN comprende ARNm, miARN u otros tipos de ARN, el perfilado de expresión génica por RT-PCR puede incluir la transcripción inversa del molde de ARN en ADNc, seguida de la amplificación en una reacción de PCR. Las transcriptasas inversas usadas comúnmente incluyen, pero sin limitación, transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV-RT,Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase)y transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV-RT,Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase).La etapa de transcripción inversa normalmente se ceba usando cebadores específicos, hexámeros aleatorios o cebadores oligodT, dependiendo de las circunstancias y del objetivo del perfilado de expresión. Por ejemplo, el ARN extraído puede transcribirse de forma inversa usando un kit de PCR de ARN GeneAmp (Perkin Elmer, Calif., EE. UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc derivado se puede usar como molde en la reacción de PCR posterior.

Aunque la etapa de PCR puede usar una variedad de ADN polimerasas termoestables dependientes del ADN, normalmente, emplea la ADN polimerasa de Taq, que tiene una actividad nucleasa 5'-3', pero carece de una actividad endonucleasa de corrección 3'-5'. La PCR TaqMan normalmente utiliza la actividad nucleasa 5' de la polimerasa de Taq o Tth para hidrolizar una sonda de hibridación unida a su amplicón diana, pero se puede usar cualquier enzima con actividad nucleasa 5' equivalente. Se usan dos cebadores oligonucleotídicos para generar un amplicón típico de una reacción de PCR. Un tercer oligonucleótido, o sonda, se diseña para detectar la secuencia de nucleótidos ubicada entre los dos cebadores de PCR. La sonda no es extensible por la enzima ADN polimerasa de Taq, y está marcada con un colorante fluorescente indicador y un colorante fluorescente inactivador. Cualquier emisión inducida por láser del colorante indicador es apagada por el colorante inactivador cuando los dos colorantes se encuentran muy juntos, como lo están en la sonda. Durante la reacción de amplificación, la enzima ADN polimerasa de Taq escinde la sonda de una manera dependiente del molde. Los fragmentos de sonda resultantes se disocian en solución, y la señal del colorante indicador liberado está libre del efecto inactivador del segundo fluoróforo. Se libera una molécula de colorante indicador por cada nueva molécula sintetizada, y la detección del colorante indicador no apagado proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos.

La RT-PCR TaqMan™ se puede realizar usando equipos disponibles en el mercado, tal como, por ejemplo, el sistema ABI PRISM 7700™ Sequence Detection System™ (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, Calif., EE. UU.) o Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania). En una realización específica, el procedimiento de nucleasa 5' se ejecuta en un dispositivo de PCR cuantitativa en tiempo real como el ABI PRISM 7700™ Sequence Detection System™. El sistema consiste en un termociclador, un láser, un dispositivo acoplado a cargas (CCD,Charge-Coupled Device),una cámara y un ordenador. El sistema amplifica las muestras en un formato de 96 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, la señal fluorescente inducida por láser se recoge en tiempo real mediante cables de fibra óptica de los 96 pocillos, y se detecta en el CCD. El sistema incluye un software para controlar el instrumento y para analizar los datos.

Los datos de TaqMan se expresan inicialmente como Ct, o el ciclo umbral. Como se ha analizado anteriormente, se registran los valores de fluorescencia durante cada ciclo, y representan la cantidad de producto amplificado hasta ese punto en la reacción de amplificación. El punto en el que se registra la señal fluorescente por primera vez como estadísticamente significativa es el ciclo umbral (Ct).

Para minimizar los errores y el efecto de la variación de muestra a muestra, la RT-PCR, en general, se realiza usando un patrón interno. El patrón interno ideal se expresa a un nivel constante entre diferentes tejidos y no se ve afectado por el tratamiento experimental. Los ARN que se usan con mayor frecuencia para normalizar los patrones de expresión génica son los ARNm para los genes constitutivos gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) y p-actina.

La PCR cuantitativa en tiempo real (también reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real, QRT-PCR o Q-PCR,Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction)es una variación más reciente de la técnica RT-PCR. La Q-PCR puede medir la acumulación de productos de PCR a través de una sonda fluorigénica de doble marca (es decir, la sonda TaqMan™). La PCR en tiempo real es compatible tanto con la PCR competitiva cuantitativa, en donde se usa el competidor interno para cada secuencia diana para la normalización, y con la PCR comparativa cuantitativa usando un gen de normalización contenido dentro de la muestra, o un gen constitutivo para la RT-PCR. Véase, por ejemplo, Heldet al.(1996)Genome Research6:986-994.

Inmunohistoquímica(IHC)

La IHC es un proceso de localización de antígenos (por ejemplo, proteínas) en células de un tejido uniendo anticuerpos, específicamente a antígenos en los tejidos. El anticuerpo de unión al antígeno se puede conjugar o fusionar a un marcador que permita su detección, por ejemplo, mediante visualización. El marcador puede ser una enzima que pueda catalizar una reacción productora de color, tal como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rábano picante. La enzima puede fusionarse con el anticuerpo o unirse de forma no covalente, por ejemplo, usando un sistema de biotina-avadina. Como alternativa, el anticuerpo puede marcarse con un fluoróforo, tal como fluoresceína, rodamina, DyLight Fluor o Alexa Fluor. El anticuerpo de unión al antígeno se puede marcar directamente o puede ser reconocido por un anticuerpo de detección portador del marcador. Usando la IHC, se pueden detectar una o más proteínas. La expresión de un producto génico puede estar relacionada con su intensidad de tinción en comparación con los niveles de control. El producto génico se puede considerar expresado diferencialmente si su tinción varía al menos 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,2, 2,5, 2,7, 3,0, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces en la muestra frente al control.

Micromatriz

Los biomarcadores también pueden identificarse, confirmarse y/o medirse usando la técnica de micromatriz. Por lo tanto, los biomarcadores del perfil de expresión se pueden medir en tejido tumoral recién extraído o embebido en parafina, usando la tecnología de micromatriz. En este método, se colocan las secuencias polinucleotídicas de interés en placas, o se ordenan, sobre un sustrato de microchip. Las secuencias ordenadas se hibridan luego con sondas de ADN específicas de células o tejidos de interés. La fuente de ARNm puede ser ARN total aislado de una muestra, por ejemplo, tumores humanos o estirpes celulares tumorales y tejidos normales o estirpes celulares correspondientes. Por lo tanto, el ARN puede aislarse de una variedad de tumores primarios o estirpes celulares tumorales. Si la fuente de ARNm es un tumor primario, el ARNm se puede extraer, por ejemplo, de muestras de tejido congeladas o archivadas embebidas en parafina y fijadas (por ejemplo, fijadas con formalina), que se preparan y conservan rutinariamente en la práctica clínica diaria.

El perfil de expresión de biomarcadores se puede medir en tejido tumoral recién extraído o embebido en parafina, o en fluidos corporales usando la tecnología de micromatriz. En este método, se colocan las secuencias polinucleotídicas de interés en placas, o se ordenan, sobre un sustrato de microchip. Las secuencias ordenadas se hibridan luego con sondas de ADN específicas de células o tejidos de interés. Al igual que con el método de RT-PCR, la fuente de miARN normalmente es a Rn total aislado de tumores humanos o estirpes celulares tumorales, incluyendo fluidos corporales, tales como suero, orina, lágrimas y exosomas, y tejidos y estirpes celulares normales correspondientes. Por lo tanto, el ARN puede aislarse de una variedad de fuentes. Si la fuente de miARN es un tumor primario, el miARN se puede extraer, por ejemplo, de muestras de tejido congelado, que se preparan y conservan rutinariamente en la práctica clínica diaria.

En la técnica de micromatrices, Las inserciones amplificadas por PCR de clones de ADNc se pueden aplicar a un sustrato en una matriz densa. Se pueden aplicar al menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 15.000, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000 o al menos 50.000 secuencias de nucleótidos al sustrato. Cada secuencia puede corresponder a un gen diferente, o se pueden ordenar múltiples secuencias por gen. Los genes ordenados en micromatriz, inmovilizados en el microchip, son adecuados para la hibridación en condiciones rigurosas. Las sondas de ADNc marcadas con fluorescencia pueden generarse mediante la incorporación de nucleótidos fluorescentes mediante la transcripción inversa de ARN extraído de tejidos de interés. Las sondas de ADNc marcadas aplicadas al chip se hibridan con especificidad a cada punto de ADN de la matriz. Después de un lavado riguroso para eliminar las sondas unidas inespecíficamente, el chip se escanea mediante microscopía láser confocal o mediante otro método de detección, tal como una cámara CCD. La cuantificación de la hibridación de cada elemento ordenado permite la evaluación de la abundancia de ARNm correspondiente. Con fluorescencia de doble color, las sondas de ADNc marcadas por separado generadas a partir de dos fuentes de ARN se hibridan por pares con la matriz. La abundancia relativa de las transcripciones de las dos fuentes correspondientes a cada gen especificado se determina, por lo tanto, simultáneamente. La escala miniaturizada de la hibridación permite una evaluación conveniente y rápida del patrón de expresión para grandes cantidades de genes. Se ha demostrado que dichos métodos tienen la sensibilidad necesaria para detectar transcripciones raras, que se expresan en unas cuantas copias por célula, y para detectar de forma reproducible al menos aproximadamente el doble de diferencias en los niveles de expresión (Schenaet al.(1996)Proc. Natl. Acad. Sci.EE.Uu ., 93(2):106-149). El análisis de micromatriz puede realizarse mediante equipos disponibles en el mercado siguiendo los protocolos del fabricante, incluyendo, sin limitación la tecnología de micromatriz Affymetrix GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA), Agilent (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) o Illumina (Illumina, Inc., San Diego, CA).

El desarrollo de métodos de micromatriz para el análisis a gran escala de la expresión génica permite buscar sistemáticamente marcadores moleculares de clasificación del cáncer y predecir resultados en una variedad de tipos de tumores.

Se puede usar el kit de micromatriz del genoma humano completo de Agilent (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). El sistema puede analizar más de 41.000 genes humanos únicos y transcripciones representadas, todos con anotaciones de dominio público. El sistema se usa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se puede usar el DASL del genoma completo de Ilumina (Illumina Inc., San Diego, CA). El sistema ofrece un método para el perfilado simultáneo de más de 24.000 transcripciones a partir de una entrada mínima de ARN, tanto de fuentes de tejido recién congelado (FF) como de tejido embebido en parafina fijado con formalina (FFPE), de una manera de alto rendimiento.

El análisis de expresión de micromatriz comprende identificar si un gen o producto génico está regulado positiva o negativamente en relación con una referencia. La identificación se puede realizar usando una prueba estadística para determinar la significación estadística de cualquier expresión diferencial observada. La significación estadística se puede determinar usando una prueba estadística paramétrica. La prueba estadística paramétrica puede comprender, por ejemplo, un diseño factorial fraccionado, análisis de varianza (ANOVA), una prueba t, mínimos cuadrados, una correlación de Pearson, regresión lineal simple, regresión no lineal, regresión lineal múltiple o regresión no lineal múltiple. Como alternativa, la prueba estadística paramétrica puede comprender un análisis de varianza unidireccional, un análisis de varianza bidireccional o un análisis de varianza de medidas repetidas. La significación estadística se puede determinar usando una prueba estadística no paramétrica. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, una prueba de rango con signo de Wilcoxon, una prueba de Mann-Whitney, una prueba de Kruskal-Wallis, una prueba de Friedman, un coeficiente de correlación de orden clasificado de Spearman, un análisis de Kendall Tau y una prueba de regresión no paramétrica. La significación estadística se puede determinar a un valorpinferior a aproximadamente 0,05, 0,01,0,005, 0,001,0,0005 o 0,0001. Aunque los sistemas de micromatriz usados en los métodos pueden analizar miles de transcripciones, el análisis de datos solo necesita realizarse en las transcripciones de interés, reduciendo así el problema de las comparaciones múltiples inherentes a la realización de múltiples pruebas estadísticas. Los valoresptambién pueden corregirse para comparaciones múltiples, por ejemplo, usando una corrección de Bonferroni, una modificación de la misma u otra técnica conocida por los expertos en la materia, por ejemplo, la corrección de Hochberg, la corrección de Holm-Bonferroni, la corrección de Sidak o la corrección de Dunnett. También se puede tener en cuenta el grado de expresión diferencial. Por ejemplo, un gen puede considerarse como expresado diferencialmente cuando el cambio de expresión en comparación con el nivel de control es al menos 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,2, 2,5, 2,7, 3,0, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces diferente en la muestra frente al control. La expresión diferencial tiene en cuenta tanto la sobreexpresión como la infraexpresión. Un gen o producto génico puede considerarse regulado positiva o negativamente si la expresión diferencial cumple un umbral estadístico, un umbral de factor de cambio o ambos. Por ejemplo, los criterios para identificar la expresión diferencial pueden comprender tanto un valorpde 0,001 como un factor de cambio de al menos 1,5 veces (ascendente o descendente). Un experto comprenderá que dichas medidas estadísticas y de umbral pueden adaptarse para determinar la expresión diferencial mediante cualquier técnica de perfilado molecular desvelada en el presente documento.

Distintos métodos hacen uso de muchos tipos de micromatrices que detectan la presencia y potencialmente la cantidad de entidades biológicas en una muestra. Las matrices normalmente contienen fracciones direccionables que pueden detectar la presencia de la entidad en la muestra, por ejemplo, a través de una unión. Las micromatrices incluyen, sin limitación, micromatrices de ADN, tales como micromatrices de ADNc, micromatrices de oligonucleótidos y micromatrices de SNP, matrices de microARN, micromatrices de proteínas, micromatrices de anticuerpos, micromatrices de tejidos, micromatrices celulares (también denominadas micromatrices de transfección), micromatrices de compuestos químicos y matrices de carbohidratos (glucomatrices). Las matrices de ADN normalmente comprenden secuencias de nucleótidos direccionables que pueden unirse a secuencias presentes en una muestra. Las matrices de microARN, por ejemplo, la matriz MMChips de la Universidad de Louisville o los sistemas comerciales de Agilent, se pueden usar para detectar microARN. Las micromatrices de proteínas se pueden usar para identificar interacciones proteína-proteína, Incluyendo, sin limitación, la identificación de sustratos de proteínas quinasa, la activación de proteínas del factor de transcripción o para identificar los dianas de moléculas pequeñas biológicamente activas. Las matrices de proteínas pueden comprender una matriz de diferentes moléculas de proteína, comúnmente anticuerpos o secuencias de nucleótidos que se unen a proteínas de interés. Las micromatrices de anticuerpos comprenden anticuerpos localizados sobre el chip de proteínas, que se usan como moléculas de captura para detectar proteínas u otros materiales biológicos de una muestra, por ejemplo, de soluciones de lisado de células o tejidos. Por ejemplo, las matrices de anticuerpos se pueden usar para detectar biomarcadores de fluidos corporales, por ejemplo, suero u orina, para aplicaciones de diagnóstico. Las micromatrices de tejidos comprenden núcleos de tejido separados ensamblados en forma de matriz para permitir el análisis histológico múltiple. Las micromatrices celulares, también denominadas micromatrices de transfección, comprenden distintos agentes de captura, tales como anticuerpos, proteínas o lípidos, que pueden interactuar con las células para facilitar su captura en ubicaciones direccionables. Las micromatrices de compuestos químicos comprenden matrices de compuestos químicos, y se pueden usar para detectar proteínas u otros materiales biológicos que se unen a los compuestos. Las matrices de carbohidratos (glicomatrices) comprenden matrices de carbohidratos y pueden detectar, por ejemplo, proteínas que se unen a fracciones de azúcar. Un experto apreciará que se pueden usar tecnologías o mejoras similares de acuerdo con los métodos de la invención.

Análisis de expresión génica mediante secuenciación masiva de distintivos en paralelo(MPSS)

Este método, descrito por Brenneret al.(2000)Nature Biotechnology18:630-634, es un enfoque de secuenciación que combina la secuenciación de distintivos sin gel con la clonaciónin vitrode millones de moldes sobre microperlas separadas. En primer lugar, se construye una biblioteca de microperlas de moldes de ADN mediante clonaciónin vitro.A esto, le sigue el ensamblaje de una matriz plana de microperlas que contienen moldes en una celda de flujo a alta densidad. Los extremos libres de los moldes clonados en cada microperla se analizan simultáneamente, usando un método de secuenciación de distintivos basado en fluorescencia que no requiere separación de fragmentos de ADN. Se ha demostrado que este método proporciona simultáneamente y con precisión, en una sola operación, cientos de miles de secuencias de distintivos de genes de una biblioteca de ADNc.

Los datos de MPSS tienen muchos usos. Los niveles de expresión de casi todas las transcripciones se pueden determinar cuantitativamente; la abundancia de distintivos es representativa del nivel de expresión del gen en el tejido analizado. Los métodos cuantitativos para el análisis de frecuencias de marcadores y la detección de diferencias entre bibliotecas se han publicado e incorporado en bases de datos públicas para datos de SAGE™ y son aplicables a los datos de MPSS. La disponibilidad de secuencias genómicas completas permite la comparación directa de distintivos con secuencias genómicas y amplía aún más la utilidad de los datos de MPSS. Debido a que las dianas para el análisis de MPSS no están preseleccionadas (como en una micromatriz), los datos de MPSS pueden caracterizar la complejidad total de los transcriptomas. Esto es análogo a la secuenciación de millones de EST a la vez, y los datos de la secuencia genómica se pueden usar para que la fuente de la distintivos DE MPSS se pueda identificar fácilmente por medios computacionales.

Análisis en serie de la expresión génica(SAGE)

El análisis en serie de la expresión génica (SAGE) es un método que permite el análisis simultáneo y cuantitativo de una gran cantidad de transcripciones de genes, sin la necesidad de proporcionar una sonda de hibridación individual para cada transcripción. En primer lugar, se genera un marcador de secuencia corta (por ejemplo, de aproximadamente 10-14 pb) que contiene información suficiente para identificar de forma única una transcripción, siempre que el marcador se obtenga desde una posición única dentro de cada transcripción. Después, se unen muchas transcripciones entre sí para formar moléculas en serie largas, que pueden secuenciarse, revelando la identidad de los múltiples marcadores simultáneamente. El patrón de expresión de cualquier población de transcripciones puede evaluarse cuantitativamente determinando la abundancia de marcadores individuales e identificando el gen correspondiente a cada marcador. Véase, por ejemplo, Velculescuet al.(1995)Science270:484-487; y Velculescuet al.(1997)Cell88:243-51.

Perfilado del número de copias de ADN

Se puede usar cualquier método capaz de determinar un perfilado del número de copias de ADN de una determinada muestra para el perfilado molecular, siempre que la resolución sea suficiente para identificar los biomarcadores. El experto en la materia conoce y es capaz de usar una serie de plataformas diferentes para evaluar los cambios en el número de copias del genoma completo con una resolución suficiente para identificar el número de copias de uno o más biomarcadores. Algunas de las plataformas y técnicas se describen más adelante.

El análisis del perfil del número de copias implica la amplificación del ADN del genoma completo mediante un método de amplificación del genoma completo. El método de amplificación del genoma completo puede usar una polimerasa de desplazamiento de cadena y cebadores aleatorios.

El análisis del perfil del número de copias implica la hibridación de ADN amplificado del genoma completo con una matriz de alta densidad. La matriz de alta densidad tiene 5.000 o más sondas diferentes. La matriz de alta densidad puede tener 5.000, 10.000, 20.000, 50.000, 100.000, 200.000, 300.000, 400.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000, 900.000 o 1.000.000, o más sondas diferentes. Cada una de las diferentes sondas sobre la matriz puede ser un oligonucleótido que tiene de aproximadamente 15 a 200 bases de longitud. Cada una de las diferentes sondas en la matriz puede ser un oligonucleótido que tiene de aproximadamente 15 a 200, de 15 a 150, de 15 a 100, de 15 a 75, de 15 a 60 o de 20 a 55 bases de longitud.

Se emplea una micromatriz para ayudar a determinar el perfil del número de copias para una muestra, por ejemplo, células de un tumor. Las micromatrices normalmente comprenden una pluralidad de oligómeros (por ejemplo, polinucleótidos u oligonucleótidos de ADN o ARN, u otros polímeros), sintetizados o depositados sobre un sustrato (por ejemplo, soporte de vidrio) en un patrón matricial. Los oligómeros unidos al soporte son "sondas", que funcionan para hibridarse o unirse con un material de muestra (por ejemplo, ácidos nucleicos preparados u obtenidos de las muestras tumorales), en experimentos de hibridación. La situación inversa también se puede aplicar: la muestra se puede unir al sustrato de micromatriz y las sondas de oligómero están en solución para la hibridación. Cuando está en uso, la superficie de la matriz se pone en contacto con una o más dianas en condiciones que potencien la unión específica de alta afinidad de la diana con una o más de las sondas. En algunas configuraciones, la muestra de ácido nucleico está marcada con un marcador detectable, tal como un marcador fluorescente, de modo que la muestra hibridada y las sondas son detectables con el equipo de exploración. La tecnología de matriz de ADN ofrece el potencial de usar una multitud (por ejemplo, cientos de miles) de oligonucleótidos diferentes para analizar el perfilado del número de copias de ADN. Los sustratos usados para las matrices pueden ser de vidrio o sílice de superficie derivatizada, o superficies de membrana polimérica (véase, por ejemplo, en Z. Guo,et al., Nucleic Acids Res,22, 5456-65 (1994); U. Maskos, E. M. Southern,Nucleic Acids Res,20, 1679-84 (1992), y E. M. Southern,et al., Nucleic Acids Res,22, 1368-73 (1994). La modificación de las superficies de los sustratos matriciales se puede realizar mediante muchas técnicas. Por ejemplo, las superficies silíceas o de óxido metálico pueden derivatizarse con silanos bifuncionales, es decir, silanos que tienen un primer grupo funcional que permite la unión covalente a la superficie (por ejemplo, grupo Si-halógeno o grupo Si-alcoxi, como en -SiCl3 o -Si(OCH3)3, respectivamente) y un segundo grupo funcional que puede conferir las modificaciones químicas y/o físicas deseadas a la superficie para unir covalentemente o no covalentemente ligandos y/o los polímeros o monómeros para la matriz de sonda biológica. Las derivaciones sililadas y otras derivaciones superficiales que se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.° 5.624.711 de Sundberg, la patente de EE.UU. n.° 5.266.222 de Willis y la patente de EE.UU. n.° 5.137.765 de Farnsworth). Otros procesos para preparar matrices se describen en la patente de EE.UU. n.° 6.649.348, de Basset al.,asignada a Agilent Corp., que desvela matrices de ADN creadas mediante métodos de síntesisin situ.

La síntesis de matriz polimérica también se describe ampliamente en la bibliografía, incluyendo lo siguientes documentos: WO 00/58516, patentes de EE.UU. n.° 5.143.854, 5.242.974, 5.252.743, 5.324.633, 5.384.261, 5.405.783, 5.424.186, 5.451.683, 5.482.867, 5.491.074, 5.527.681, 5.550.215, 5.571.639, 5.578.832, 5.593.839, 5.599.695, 5.624.711, 5.631.734, 5.795.716, 5.831.070, 5.837.832, 5.856.101, 5.858.659, 5.936.324, 5.968.740, 5.974.164, 5.981.185, 5.981.956, 6.025.601, 6.033.860, 6.040.193, 6.090.555, 6.136.269, 6.269.846 and 6.428.752, 5.412.087, 6.147.205, 6.262.216, 6.310.189, 5.889.165 y 5.959.098 en las solicitudes PCT n.° PCT/US99/00730 (Publicación internacional n.° WO 99/36760) y PCT/US01/04285 (Publicación internacional n.° WO 01/58593).

Las matrices de ácido nucleico que son útiles en la presente invención incluyen, pero sin limitación, las que están disponibles en el mercado en Affymetrix (Santa Clara, California) bajo la marca GeneChip™. Se muestran matrices de ejemplo en el sitio web de affymetrix.com. Otro proveedor de micromatrices es Illumina, Inc., de San Diego, Calif, mostrándose ejemplos de matrices en su sitio web de illumina.com.

Los métodos de la invención pueden proporcionar la preparación de muestras. Dependiendo de la micromatriz y el experimento que se vaya a realizar, la muestra de ácido nucleico se puede preparar de una serie de maneras mediante métodos conocidos por el experto en la materia. En algunos aspectos de la invención, la muestra puede amplificarse mediante cualquier número de mecanismos. El procedimiento de amplificación más común usado implica la PCR. Véanse, por ejemplo, "PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification"(Ed. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, N.Y., 1992); "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" (Eds. Innis,et al.,Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Mattilaet al., Nucleic Acids Res.19, 4967 (1991); Eckertet al.,"PCR Methods and Applications" 1, 17 (1991); "PCR" (Eds. McPhersonet al.,IRL Press, Oxford); y las patentes de EE.UU. n.° 4.683.202, 4.683.195, 4.800.159, 4.965.188 y 5.333.675. En algunas realizaciones, la muestra puede amplificarse sobre la matriz (por ejemplo, la patente de EE.u U. n.° 6.300.070).

Otros métodos de amplificación adecuados incluyen la reacción en cadena de la ligasa (LCR,Ligase Chain Reaction)(por ejemplo, Wu y Wallace,Genomics4, 560 (1989), Landegrenet al., Science241, 1077 (1988) y Barringeret al. Gene89:117 (1990)), amplificación de la transcripción (Kwohet al., Proc. Natl. Acad. Sci.EE.UU., 86, 1173 (1989) y WO88/10315), replicación de secuencia auto-sostenida (Guatelliet al., Proc. Nat. Acad. Sci.EE. UU., 87, 1874 (1990) y WO90/06995), amplificación selectiva de secuencias de polinucleótidos diana (patente de EE.UU. n.° 6.410.276), reacción en cadena de la polimerasa cebada con secuencia consenso (CP-PCr ,Consensus Sequence Primed Polymerase chain reaction)(patente de EE.UU. n.° 4.437.975), reacción en cadena de la polimerasa cebada arbitrariamente (AP-PCR,Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction)(patentes de EE.Uu . n.° 5.413.909, 5.861.245) y amplificación de secuencia basada en ácido nucleico (NABSA,Nucleic Acid Based Sequence Amplificaron).(Véanse, las patentes de EE.UU. n.° 5.409.818, 5.554.517 y 6.063.603). Otros métodos de amplificación que pueden usarse se describen en las patentes de EE.UU. n.° 5.242.794, 5.494.810, 4.988.617 y en n.° de serie de EE.UU. 09/854.317.

Métodos adicionales de preparación de muestras y técnicas para reducir la complejidad de una muestra nucleica se describen en Donget al., Genome Research11, 1418 (2001), en las patentes de EE.UU. n.° 6.361.947, 6.391.592 y n.° de serie de EE.UU 09/916.135, 09/920.491 (publicación de solicitud de patente de EE.UU. 20030096235), 09/910.292 (publicación de solicitud de patente de EE.UU. 20030082543) y10/013.598.

Los métodos para realizar ensayos de hibridación de polinucleótidos están bien desarrollados en la técnica. Los procedimientos y las condiciones del ensayo de hibridación usados en los métodos variarán dependiendo de la aplicación, y se seleccionan de acuerdo con los métodos de unión generales conocidos, incluyendo los mencionados en: Maniatiset al."Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2a Ed. Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); "Berger and Kimmel Methods in Enzymology", Vol. 152, "Guide to Molecular Cloning Techniques" (Academic Press, Inc., San Diego, Calif, 1987); Young y Davism, P.N.A.S, 80: 1194 (1983). Los métodos y aparatos para llevar a cabo reacciones de hibridación repetidas y controladas se han descrito en las patentes de EE.UU. n.° 5.871.928, 5.874.219, 6.045.996 y 6.386.749, 6.391.623.

Los métodos de la invención también pueden implicar la detección de señales de hibridación entre ligandos después (y/o durante) la hibridación. Véanse las patentes de EE.UU. n.° 5.143.854, 5.578.832; 5.631.734; 5.834.758; 5.936.324; 5.981.956; 6.025.601; 6.141.096; 6.185.030; 6.201.639; 6.218.803; y 6.225.625, en n.° de serie de EE.UU. 10/389.194 y en la solicitud PCT PCT/US99/06097 (publicada como el documento WO99/47964).

Los métodos y aparatos para la detección de señales y el procesamiento de datos de intensidad se desvelan en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.° 5.143.854, 5.547.839, 5.578.832, 5.631.734, 5.800.992, 5.834.758; 5.856.092, 5.902.723, 5.936.324, 5.981.956, 6.025.601, 6.090.555, 6.141.096, 6.185.030, 6.201.639; 6.218.803; y 6.225.625, en n.° de serie de EE.UU. 10/389.194, 60/493.495 y en la solicitud PCT PCT/US99/06097 (publicada como el documento WO99/47964).

Análisis de secuencias

El perfilado molecular comprende métodos para genotipar uno o más biomarcadores determinando si un individuo tiene una o más variantes de nucleótidos (o variantes de aminoácidos) en uno o más de los genes o productos génicos. El genotipado de uno o más genes de acuerdo con los métodos de la invención, en algunas realizaciones, puede proporcionar más evidencia para seleccionar un tratamiento.

Los biomarcadores pueden analizarse mediante cualquier método útil para determinar alteraciones en los ácidos nucleicos o las proteínas que codifican. De acuerdo con una realización, el experto en la materia puede analizar mutaciones en el uno o más genes, incluyendo mutantes de eliminación, mutantes de inserción, mutantes de desplazamiento de marco, mutantes interruptores, mutantes sentido alterado y mutantes de corte y empalme.

El ácido nucleico usado para el análisis de uno o más genes puede aislarse de las células de la muestra de acuerdo con metodologías convencionales (Sambrooket al.,1989). El ácido nucleico, por ejemplo, puede ser ADN genómico o ARN de células fraccionadas o enteras, o miARN adquirido de exosomas o superficies celulares. Cuando se usa ARN, se puede desear convertir el ARN en un ADN complementario. En una realización, el ARN es ARN de célula completa; en otra, es ARN de poli-A; en otra, es ARN exosómico. Normalmente, el ácido nucleico se amplifica.

Dependiendo del formato del ensayo para analizar uno o más genes, el ácido nucleico específico de interés se identifica en la muestra directamente usando amplificación o con un segundo ácido nucleico conocido después de la amplificación. A continuación, se detecta el producto identificado. En determinadas aplicaciones, la detección puede realizarse por medios visuales (por ejemplo, tinción con bromuro de etidio de un gel). Como alternativa, la detección puede implicar la identificación indirecta del producto mediante quimioluminiscencia, gammagrafía radioactiva de radiomarcador o marcador fluorescente, o incluso mediante un sistema que usa señales de impulso eléctrico o térmico (Affymax Technology; Bellus, 1994).

Se sabe que existen distintos tipos de defectos en los biomarcadores. Las alteraciones incluyen, sin limitación, eliminaciones, inserciones, mutaciones puntuales y duplicaciones. Las mutaciones puntuales pueden ser silenciosas o pueden dar lugar a codones de parada, mutaciones de desplazamiento de marco o sustituciones de aminoácidos. Las mutaciones dentro y fuera de la región de codificación de uno o más genes pueden ocurrir y pueden analizarse de acuerdo con los métodos de la invención. El sitio diana de un ácido nucleico de interés puede incluir la región en donde varía la secuencia. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, polimorfismos que existen en diferentes formas, tales como variaciones de un solo nucleótido, repeticiones de nucleótidos, eliminación de múltiples bases (más de un nucleótido eliminado de la secuencia consenso), inserción de múltiples bases (más de un nucleótido insertado de la secuencia consenso), repeticiones de microsatélites (pequeñas cantidades de repeticiones de nucleótidos normalmente con de 5 a 1.000 unidades de repetición), repeticiones de dinucleótidos, repeticiones de trinucleótidos, reordenamientos de secuencias (incluyendo translocación y duplicación), secuencia quimérica (se fusionan dos secuencias de diferentes orígenes génicos entre sí) y similares. Entre los polimorfismos de secuencia, los polimorfismos más frecuentes en el genoma humano son las variaciones de una sola base, también denominadas polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). Los SNP son abundantes, estables y están ampliamente distribuidos en todo el genoma.

El perfilado molecular incluye métodos para realizar el haplotipado de uno o más genes. El haplotipo es un conjunto de determinantes genéticos ubicados en un solo cromosoma y normalmente contiene una combinación particular de alelos (todas las secuencias alternativas de un gen) en una región de un cromosoma. En otras palabras, el haplotipo es información de secuencia por fases en cromosomas individuales. Con mucha frecuencia, los SNP por fases en un cromosoma definen un haplotipo. Una combinación de haplotipos en los cromosomas puede determinar el perfil genético de una célula. Es el haplotipo lo que determina un vínculo entre un marcador genético específico y una mutación de la enfermedad. El haplotipado puede realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica. Los métodos comunes de puntuación de SNP incluyen la micromatriz de hibridación o la secuenciación directa en gel, revisados en Landgrenet al., Genome Research,8:769-776, 1998. Por ejemplo, solo se puede aislar una copia de uno o más genes de un individuo, y se determina el nucleótido en cada una de las posiciones de las variantes. Como alternativa, se puede usar una PCR específica del alelo o un método similar para amplificar solo una copia del uno o más genes de un individuo, y se determinan los SNP en las posiciones de las variantes. El método Clark conocido en la técnica también se puede emplear para realizar el haplotipado.

También se describe un método de haplotipado molecular de alto rendimiento en Tostet al., Nucleic Acids Res.,30(19):e96 (2002).

Por lo tanto, la/s variante/s adicional/es que está/n en desequilibrio de enlace con las variantes y/o los haplotipos de la presente invención pueden identificarse mediante un método de haplotipado conocido en la técnica, como será evidente para un experto en el campo de la genética y el haplotipado. Las variantes adicionales que están en desequilibrio de enlace con una variante o un haplotipo también pueden ser útiles en las distintas aplicaciones que se describen a continuación.

Para fines de genotipado y haplotipado, se pueden usar tanto ADN genómico como ARNm/ADNc, y ambos se denominan genéricamente en el presente documento "gen".

Se conocen numerosas técnicas para detectar variantes de nucleótidos en la técnica, y todas pueden usarse para el método. Las técnicas pueden estar basadas en proteínas o en ácidos nucleicos. En cualquier caso, las técnicas usadas deben ser suficientemente sensibles para detectar con precisión las pequeñas variaciones de nucleótidos o aminoácidos. Con mucha frecuencia, se utiliza una sonda que está marcada con un marcador detectable. A menos que se especifique lo contrario en una técnica particular descrita a continuación, se puede usar cualquier marcador adecuado conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, isótopos radiactivos, compuestos fluorescentes, biotina que se puede detectar usando estreptavidina, enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina), sustratos de una enzima, ligandos y anticuerpos, etc. Véanse Jablonskiet al., Nucleic Acids Res.,14:6115-6128 (1986); Nguyenet al., Biotechniques,13:116-123 (1992); Rigbyet al., J. Mol. Biol.,113:237-251 (1977).

En un método de detección basado en ácido nucleico, la muestra de ADN diana, es decir, una muestra que contiene ADN genómico, ADNc, ARNm y/o miARN, correspondiente al uno o más genes, debe obtenerse del individuo que se vaya a analizar. Se puede usar cualquier muestra tisular o celular que contenga ADN genómico, miARN, ARNm y/o ADNc (o una porción del mismo) correspondiente al uno o más genes. Para este fin, se puede obtener una muestra de tejido que contiene núcleo celular y, por lo tanto, ADN genómico del individuo. Las muestras de sangre también pueden ser útiles, excepto que solo los glóbulos blancos y otros linfocitos tienen núcleo celular, mientras que los glóbulos rojos no tienen núcleo y contienen solo ARNm o miARN. No obstante, también son útiles el miARN y ARNm, ya que pueden analizarse para detectar la presencia de variantes de nucleótidos en su secuencia o servir como molde para la síntesis de ADNc. Las muestras tisulares o celulares pueden analizarse directamente sin mucho procesamiento. Como alternativa, los ácidos nucleicos que incluyen la secuencia diana se pueden extraer, purificar y/o amplificar antes de someterse a los distintos procedimientos de detección que se analizan a continuación. Además de las muestras tisulares y celulares, también son útiles los ADNc o ADN genómicos de una biblioteca de ADNc o ADN genómico construida usando una muestra tisular o celular obtenida del individuo que se va a analizar.

Análisis de secuencias

Para determinar la presencia o ausencia de una variante de nucleótido particular, se secuencia el ADN genómico o ADNc diana, particularmente, la región que abarca el locus de la variante de nucleótido que se desea detectar. En general, se conocen distintas técnicas de secuenciación, y se usan ampliamente en la técnica, incluyendo el método Sanger y el método químico Gilbert. El método de pirosecuenciación controla la síntesis de ADN en tiempo real usando un sistema de detección luminométrica. Se ha demostrado que la pirosecuenciación es eficaz en el análisis de polimorfismos genéticos tales como polimorfismos de un solo nucleótido, y también se puede usar en la presente invención. Véanse Nordstromet al., Biotechnol. Appl. Biochem.,31(2): 107-112 (2000); Ahmadianet al., Anal. Biochem.,280:103-110(2000).

Las variantes de ácido nucleico pueden detectarse mediante un proceso de detección adecuado. Son ejemplos no limitantes de métodos de detección, la cuantificación, la secuenciación y similares; la detección masiva de amplicones modificados en masa (por ejemplo, espectrometría de masas por ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI,Matrix-Assisted Laser Desorption lonization)y espectrometría de masas por electronebulización (ES,Electrospray)),un método de extensión de cebadores (por ejemplo, iPLEX™; Sequenom, Inc.), métodos de microsecuenciación (por ejemplo, una modificación de la metodología de extensión de cebadores), métodos de determinación de secuencias de ligasa (por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.° 5.679.524 y 5.952.174, y el documento WO 01/27326), métodos de determinación de secuencias desapareadas (por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.° 5.851.770; 5.958.692; 6.110.684; y 6.183.958), secuenciación de ADN directa, polimorfismos en la longitud de fragmentos de restricción (RFLP,Restriction Fragment Length Polymorphism),análisis de oligonucleótidos específicos del alelo (ASO,Allele Specific Oligonucleotide),PCR específica de la metilación (MSPCR,Methylation-Specific PCR),análisis de pirosecuenciación, análisis de acicloprima, transferencia puntual inversa, micromatrices GeneChip, hibridación dinámica específica del alelo (DASH,Dynamic Allele-Specific Hybridization),sondas de ácido nucleico peptídico (PNA,Peptide Nucleic Acid)y ácidos nucleicos bloqueados (LNA,Locked Nucleic Acids),TaqMan, balizas moleculares, colorante intercalante, cebadores deFRET,(Fluorescence Resonance Energy Transfer),AlphaScreen, SNPstream, análisis de bits genéticos (GBA,Genetic Bit Analysis),minisecuenciación Multiplex, SNaPshot, ensayo GOOD, minisecuenciación de micromatriz, extensión de cebadores en matriz (APEX,Arrayed Primer Extension),extensión de cebadores de micromatriz (por ejemplo, métodos de determinación de secuencias de micromatriz), matrices de marcadores, microesferas codificadas, incorporación dirigida por molde (TDI,Template-Directed lncorporation), polarización de fluorescencia, ensayo colorimétrico de ligadura de oligonucleótidos (OLA,Oligonucleotide Ligation Assay),OLA codificado con secuencias, ligadura de micromatriz, reacción en cadena de la ligasa, sondas Padlock, ensayo Invader, métodos de hibridación (por ejemplo, hibridación usando al menos una sonda, hibridación usando al menos una sonda marcada con fluorescencia y similares), análisis de transferencia puntual convencionales, análisis de polimorfismo conformacional monocatenario (SSCP,Single Strand Conformational Polymorphism,por ejemplo, patentes de EE.UU. n.° 5.891.625 y 6.013.499; Oritaet al., Proc. Natl. Acad.Sci.EE.UU.

86: 27776-2770 (1989)), electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (DGGE,Denaturing Gradient Gel Electrophoresis),análisis de heterodúplex, detección de escisión de desapareamiento y técnicas descritas en Sheffieldet al., Proc. Natl. Acad. Sci.EE.UU. 49: 699-706 (1991), Whiteet al., Genomics12: 301-306 (1992), Grompeet al., Proc. Natl. Acad. Sci.EE.UU. 86: 5855-5892 (1989), y Grompe,Nature Genetics5: 111-117 (1993), clonación y secuenciación, electroforesis, el uso de sondas de hibridación y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR), PCR digital, secuenciación de nanoporos, chips y combinaciones de los mismos. La detección y cuantificación de alelos o parálogos se puede llevar a cabo usando los métodos de "tubo cerrado" descritos en la solicitud de patente de EE.UU. n.° 11/950.395, presentada el 4 de diciembre de 2007. La cantidad de una especie de ácido nucleico se puede determinar por espectrometría de masas, extensión de cebadores, secuenciación (por ejemplo, cualquier método adecuado, por ejemplo, secuenciación de nanoporos o pirosecuenciación), PCR cuantitativa (Q-PCR o QRT-PCR), PCR digital, combinaciones de los mismos y similares.

La expresión "análisis de secuencia", como se usa en el presente documento, se refiere a determinar una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, la de un producto de amplificación. Puede determinarse la secuencia completa o una secuencia parcial de un polinucleótido, por ejemplo, ADN o ARNm, y la secuencia de nucleótidos determinada puede denominarse "lectura" o "lectura de secuencia". Por ejemplo, los productos de amplificación lineal pueden analizarse directamente sin amplificación adicional en algunas realizaciones (por ejemplo, usando la metodología de secuenciación de una sola molécula). En determinadas realizaciones, los productos de amplificación lineal pueden someterse a una amplificación adicional y luego analizarse (por ejemplo, usando secuenciación mediante metodología de ligadura o pirosecuenciación). Las lecturas pueden someterse a diferentes tipos de análisis de secuencia. Se puede utilizar cualquier método de secuenciación adecuado para detectar y determinar la cantidad de especies de secuencias de nucleótidos, especies de ácido nucleico amplificado o productos detectables generados a partir de lo anterior. A continuación, se describen ejemplos de ciertos métodos de secuenciación.

Un aparato de análisis de secuencia o componente/s de análisis de secuencia incluye un aparato, y uno o más componentes usados en combinación con dicho aparato, que puede ser usado por un experto habitual en la materia para determinar una secuencia de nucleótidos resultante de los procesos descritos en el presente documento (por ejemplo, productos de amplificación lineal y/o exponencial). Los ejemplos de plataformas de secuenciación incluyen, sin limitación, la plataforma 454 (Roche) (Margulies, M.et al.2005Nature437, 376-380), el analizador genómico Illumina (o plataforma Solexa) o el Sistema SOLID (Applied Biosystems) o la tecnología de secuenciación de ADN de una sola molécula verdadera de Helicos (Harris TDet al.2008Science,320, 106-109), la tecnología en tiempo real, de una sola molécula (SMRT™) de Pacific Biosciences y la secuenciación de nanoporos (Soni G. V. y Meller A. 2007Clin Chem53: 1996-2001).

Dichas plataformas permiten la secuenciación de muchas moléculas de ácido nucleico aisladas de una muestra en altos órdenes de multiplexación de forma paralela (Dear Brief Funct Genomic Proteomic2003; 1: 397-416). Cada una de estas plataformas permite la secuenciación de moléculas individuales expandidas mediante clonación o no amplificadas de fragmentos de ácido nucleico. Ciertas plataformas implican, por ejemplo, la secuenciación mediante la ligadura de sondas modificadas con colorantes (incluyendo la ligadura cíclica y la escisión), la pirosecuenciación y la secuenciación de una sola molécula. Las especies de secuencias de nucleótidos, las especies de ácido nucleico de amplificación y los productos detectables generados a partir de las mismas pueden analizarse mediante dichas plataformas de análisis de secuencia.

La secuenciación por ligadura es un método de secuenciación de ácido nucleico que se basa en la sensibilidad de la ADN ligasa hacia el desapareamiento de bases. La ADN ligasa une los extremos del ADN que están correctamente apareados con la base. La combinación de la capacidad de la ADN ligasa para unir entre sí solo los extremos de ADN apareados correctamente con la base, con grupos mixtos de oligonucleótidos o cebadores marcados con fluorescencia, permite la determinación de la secuencia mediante la detección de la fluorescencia. Se pueden obtener lecturas de secuencia más largas incluyendo cebadores que contienen enlaces escindibles que se pueden escindir después de la identificación del marcador. La escisión en el conector elimina el marcador y regenera el fosfato 5' en el extremo del cebador ligado, preparando el cebador para otra serie de ligadura. En algunas realizaciones, los cebadores pueden marcarse con más de un marcador fluorescente, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4 o 5 marcadores fluorescentes.

La secuenciación por ligadura, en general, implica las siguientes etapas. Se pueden preparar poblaciones de perlas clonales en microrreactores de emulsión que contienen secuencias molde de ácido nucleico diana, componentes de reacción de amplificación, perlas y cebadores. Tras la amplificación, los moldes se desnaturalizan y se realiza el enriquecimiento de las perlas para separar las perlas con moldes extendidos de las perlas no deseadas (por ejemplo, perlas sin moldes extendidos). El molde en las perlas seleccionadas sufre una modificación en 3' para permitir la unión covalente al portaobjetos, y las perlas modificadas se pueden depositar sobre un portaobjetos de vidrio. Las cámaras de deposición ofrecen la capacidad de segmentar un portaobjetos en una, cuatro u ocho cámaras durante el proceso de carga de perlas. Para el análisis de secuencia, los cebadores se hibridan con la secuencia del adaptador. Un conjunto de cuatro sondas marcadas con colorante compite por la ligadura con el cebador de secuenciación. La especificidad de la ligadura de la sonda se logra mediante la interrogación de cada 4a y 5a base durante la serie de la ligadura. De cinco a siete series de ligadura, detección y escisión registran el color en cada quinta posición, estando el número de series determinado por el tipo de biblioteca usada. Tras cada serie de ligadura, se establece un nuevo desplazamiento del cebador complementario por una base en dirección 5' para otra serie de ligaduras. El reinicio del cebador y las series de ligadura (5-7 ciclos de ligadura por serie) se repiten secuencialmente cinco veces para generar 25-35 pares de bases de secuencia para un solo marcador. Con la secuenciación apareada, se repite este proceso para un segundo marcador.

La pirosecuenciación es un método de secuenciación de ácido nucleico basado en la secuenciación por síntesis, que se basa en la detección de un pirofosfato liberado en la incorporación de nucleótidos. En general, la secuenciación por síntesis implica sintetizar, un nucleótido a la vez, una cadena de ADN complementaria a la cadena cuya secuencia se busca. Los ácidos nucleicos diana pueden inmovilizarse en un soporte sólido, hibridarse con un cebador de secuenciación, incubarse con ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosina 5' fosfosulfato y luciferina. Las soluciones de nucleótidos se añaden y eliminan secuencialmente. La incorporación correcta de un nucleótido libera un pirofosfato, que interactúa con la ATP sulfurilasa y produce ATP en presencia de adenosina 5' fosfosulfato, lo que alimenta la reacción de la luciferina, que produce una señal quimioluminiscente que permite la determinación de la secuencia. La cantidad de luz generada es proporcional al número de bases añadidas. Por consiguiente, se puede determinar la secuencia en dirección 3' del cebador de secuenciación. Un sistema de ejemplo para la pirosecuenciación implica las siguientes etapas: ligar un ácido nucleico adaptador a un ácido nucleico bajo investigación e hibridar el ácido nucleico resultante a una perla; amplificar una secuencia de nucleótidos en una emulsión; clasificar las perlas usando un soporte sólido de múltiples pocillos en picolitros; y secuenciar las secuencias de nucleótidos amplificadas mediante la metodología de pirosecuenciación (por ejemplo, Nakanoet al.,"Singlemolecule PCR using water-in-oil emulsion",Journal of Biotechnology102: 117-124 (2003)).

Ciertas realizaciones de secuenciación de una sola molécula se basan en el principio de secuenciación por síntesis, y utilizan la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de un solo par (FRET de un solo par) como un mecanismo mediante el que los fotones se emiten como resultado de la incorporación exitosa de nucleótidos. Los fotones emitidos se suelen detectar usando dispositivos de pareja de cargas enfriados intensificados o de alta sensibilidad junto con microscopía de reflexión interna total (TlRM,Total interna! Reflection Microscopy).Los fotones solo se emiten cuando la solución de reacción introducida contiene el nucleótido correcto para su incorporación en la cadena de ácido nucleico creciente que se sintetiza como resultado del proceso de secuenciación. En la secuenciación de una sola molécula basada en FREt , la energía se transfiere entre dos colorantes fluorescentes, a veces, colorantes de polimetina cianina Cy3 y Cy5, a través de interacciones dipolo de largo alcance. El donante se excita en su longitud de onda de excitación específica y la energía del estado excitado se transfiere, no radiactivamente, al colorante aceptor, que, a su vez, se excita. El colorante aceptor finalmente regresa al estado fundamental por emisión radiactiva de un fotón. Los dos colorantes usados en el proceso de transferencia de energía representan el "par único" en la FRET de par único. Cy3 se suele usar como el fluoróforo donante y se suele incorporar como el primer nucleótido marcado. Cy5 se suele usar como fluoróforo aceptor y se usa como marcador de nucleótidos para adiciones de nucleótidos sucesivas después de la incorporación de un primer nucleótido marcado con Cy3. Los fluoróforos, en general, están dentro de los 10 nanómetros de cada uno para que la transferencia de energía se produzca con éxito.

Un ejemplo de un sistema que puede usarse basado en la secuenciación de una sola molécula, en general, implica hibridar un cebador con una secuencia de ácido nucleico diana para generar un complejo; asociando el complejo con una fase sólida; extender iterativamente el cebador mediante un nucleótido marcado con una molécula fluorescente; y capturar una imagen de señales de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia tras cada iteración (por ejemplo, patente de los EE.UU. n.° 7.169.314; Braslavskyet al., PNAS100(7): 3960-3964 (2003)). Dicho sistema puede usarse para secuenciar directamente productos de amplificación (productos amplificados lineal o exponencialmente) generados mediante los procesos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, los productos de amplificación pueden hibridarse con un cebador que contenga secuencias complementarias a las secuencias de captura inmovilizadas presentes sobre un soporte sólido, una perla o un portaobjetos de vidrio, por ejemplo. La hibridación de los complejos de cebador-producto de amplificación con las secuencias de captura inmovilizadas, inmoviliza los productos de amplificación en soportes sólidos para la secuenciación basada en FRET de un solo par mediante síntesis. El cebador suele ser fluorescente, de modo que se puede generar una imagen de referencia inicial de la superficie del portaobjetos con ácidos nucleicos inmovilizados. La imagen de referencia inicial es útil para determinar las ubicaciones en las que se está produciendo la verdadera incorporación de nucleótidos. Las señales de fluorescencia detectadas en ubicaciones de la matriz no identificadas inicialmente en la imagen de referencia de "solo cebador" se descartan como fluorescencia inespecífica. Después de la inmovilización de los complejos de cebador-producto de amplificación, los ácidos nucleicos unidos se suelen secuenciar en paralelo mediante las etapas iterativas de, a) extensión de polimerasa en presencia de un nucleótido marcado con fluorescencia; b) detección de fluorescencia usando microscopía apropiada, TIRM, por ejemplo; c) eliminación del nucleótido fluorescente; y d) volver a la etapa a con un nucleótido marcado con fluorescencia diferente.

En algunas realizaciones, la secuenciación de nucleótidos puede ser mediante métodos y procesos de secuenciación de un solo nucleótido en fase sólida. Los métodos de secuenciación de un solo nucleótido en fase sólida implican el contacto del ácido nucleico diana y el soporte sólido en condiciones en las que una sola molécula de ácido nucleico de muestra se hibrida con una sola molécula de un soporte sólido. Dichas condiciones pueden incluir proporcionar las moléculas de soporte sólidas y una sola molécula de ácido nucleico diana en un "microrreactor". Dichas condiciones también pueden incluir proporcionar una mezcla en la que la molécula de ácido nucleico diana pueda hibridarse con ácido nucleico en fase sólida sobre el soporte sólido. Los métodos de secuenciación de un solo nucleótido útiles en las realizaciones descritas en el presente documento se describen en la solicitud de patente provisional de EE.UU. con n.° de serie 61/021.871, presentada el 17 de enero de 2008.

En determinadas realizaciones, los métodos de detección de secuenciación de nanoporos incluyen (a) poner en contacto un ácido nucleico diana para la secuenciación ("ácido nucleico base", por ejemplo, molécula de sonda unida) con detectores específicos de secuencia, en condiciones en las que los detectores se hibridan específicamente a subsecuencias sustancialmente complementarias del ácido nucleico base; (b) detectar señales de los detectores; y (c) determinar la secuencia del ácido nucleico base de acuerdo con las señales detectadas. En determinadas realizaciones, los detectores hibridados con el ácido nucleico base se disocian del ácido nucleico base (por ejemplo, se disocian secuencialmente) cuando los detectores interfieren con una estructura de nanoporos a medida que el ácido nucleico base pasa a través de un poro, y se detectan los detectores disociados de la secuencia base. En algunas realizaciones, un detector disociado de un ácido nucleico base emite una señal detectable, y el detector hibridado con el ácido nucleico base emite una señal detectable diferente o señal no detectable. En determinadas realizaciones, los nucleótidos de un ácido nucleico (por ejemplo, molécula de sonda unida) se sustituyen con secuencias de nucleótidos específicas que corresponden a nucleótidos específicos ("representantes de nucleótidos"), dando lugar a un ácido nucleico expandido (por ejemplo, patente de EE.UU. n.° 6.723.513 ), y los detectores se hibridan con los representantes de nucleótidos en el ácido nucleico expandido, que sirve como ácido nucleico base. En dichas realizaciones, los representantes de nucleótidos pueden disponerse en una disposición de orden binario o superior (por ejemplo, Soni y Meller, "Clinical Chemistry" 53(11): 1996-2001 (2007)). En algunas realizaciones, un ácido nucleico no se expande, no da lugar a un ácido nucleico expandido, y sirve directamente a un ácido nucleico base (por ejemplo, una molécula de sonda unida sirve como un ácido nucleico base no expandido), y los detectores están directamente en contacto con el ácido nucleico base. Por ejemplo, un primer detector puede hibridarse con una primera subsecuencia y un segundo detector puede hibridarse con una segunda subsecuencia, donde el primer detector y el segundo detector tienen marcadores detectables que pueden distinguirse entre sí, y donde las señales del primer detector y el segundo detector se puede distinguir entre sí cuando los detectores se disocian del ácido nucleico base. En determinadas realizaciones, los detectores incluyen una región que se híbrida con el ácido nucleico base (por ejemplo, dos regiones), que puede tener una longitud de aproximadamente 3 a aproximadamente 100 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95 nucleótidos en longitud). Un detector también puede incluir una o más regiones de nucleótidos que no se hibridan con el ácido nucleico base. En algunas realizaciones, un detector es una baliza molecular. Un detector suele comprender uno o más marcadores detectables seleccionados independientemente de los descritos en el presente documento. Cada marcador detectable puede detectarse mediante cualquier proceso de detección conveniente capaz de detectar una señal generada por cada marcador (por ejemplo, magnético, eléctrico, químico, óptico y similares). Por ejemplo, se puede usar una cámara de CD para detectar señales de uno o más puntos cuánticos distinguibles vinculados a un detector.

En ciertas realizaciones de análisis de secuencias, las lecturas pueden usarse para construir una secuencia de nucleótidos mayor, lo que se puede facilitar identificando secuencias superpuestas en diferentes lecturas y usando secuencias de identificación en las lecturas. Dichos métodos de análisis de secuencia y software para construir secuencias de mayor tamaño a partir de lecturas son conocidos por el experto habitual en la materia (por ejemplo, Venteret al., Science291: 1304-1351 (2001)). Las lecturas específicas, las construcciones de secuencias de nucleótidos parciales y las construcciones de secuencias de nucleótidos completas se pueden comparar entre secuencias de nucleótidos dentro de una muestra de ácido nucleico (es decir, comparación interna) o se pueden comparar con una secuencia de referencia (es decir, comparación de referencia) en ciertas realizaciones de análisis de secuencia. Las comparaciones internas se pueden realizar en situaciones en las que se prepara una muestra de ácido nucleico a partir de múltiples muestras o de una sola fuente de muestra que contiene variaciones de secuencia. Las comparaciones de referencia a veces se realizan cuando se conoce una secuencia de nucleótidos de referencia y una diana es determinar si una muestra de ácido nucleico contiene una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente similar o igual, o diferente, a una secuencia de nucleótidos de referencia. El análisis de secuencia puede facilitarse mediante el uso del aparato de análisis de secuencia y los componentes descritos anteriormente.

Los métodos de detección de polimorfismos de extensión de cebador, también denominados en el presente documento métodos de "microsecuenciación", se llevan a cabo normalmente hibridando un oligonucleótido complementario a un ácido nucleico portador del sitio polimórfico. En estos métodos, el oligonucleótido normalmente se hibrida adyacente al sitio polimórfico. El término "adyacente", como se usa en referencia a los métodos de "microsecuenciación", se refiere al extremo 3' del oligonucleótido de extensión que, a veces, está a 1 nucleótido del extremo 5' del sitio polimórfico, a menudo, 2 o 3, y a veces, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos del extremo 5' del sitio polimórfico, en el ácido nucleico, cuando el oligonucleótido de extensión se hibrida con el ácido nucleico. El oligonucleótido de extensión se extiende luego en uno o más nucleótidos, a menudo, 1, 2 o 3 nucleótidos, y el número y/o tipo de nucleótidos que se añaden al oligonucleótido de extensión determina qué variante o variantes polimórficas están presentes. Los métodos de extensión de oligonucleótidos se desvelan, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. n.° 4.656.127; 4.851.331; 5.679.524; 5.834.189; 5.876.934; 5.908.755; 5.912.118; 5.976.802; 5.981.186; 6.004.744; 6.013.431; 6.017.702; 6.046.005; 6.087.095; 6.210.891; y WO 01/20039. Los productos de extensión pueden detectarse de cualquier manera, tal como mediante métodos de fluorescencia (véase, por ejemplo, Chen y Kwok,Nucleic Acids Research25: 347-353 (1997) y Chenet al., Proc. Natl. Acad. Sci.EE.UU. 94/20: 10756-10761 (1997)) o mediante métodos de espectrometría de masas (por ejemplo, espectrometría de masas MALDI-TOF) y otros métodos descritos en el presente documento. Los métodos de extensión de oligonucleótidos que usan espectrometría de masas se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. n.° 5.547.835; 5.605.798; 5.691.141; 5.849.542; 5.869.242; 5.928.906; 6.043.031; 6.194.144; y 6.258.538. Los métodos de detección por microsecuenciación suelen incluir un proceso de amplificación que continúa con la etapa de extensión. El proceso de amplificación normalmente amplifica una región de una muestra de ácido nucleico que comprende el sitio polimórfico. La amplificación puede llevarse a cabo utilizando los métodos descritos anteriormente, o por ejemplo, usando un par de cebadores oligonucleotídicos en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en la que un cebador oligonucleotídico normalmente es complementario a una región 3' del polimorfismo y el otro normalmente es complementario a una región 5' del polimorfismo. Se puede usar un par de cebadores de PCR en los métodos desvelados en la patente de EE.UU. N.° 4.683.195; 4.683.202; 4.965.188; 5.656.493; 5.998.143; 6.140.054; WO 01/27327; y WO 01/27329, por ejemplo. Los pares de cebadores de PCR también pueden usarse en cualquier máquina disponible en el mercado que realice PCR, tal como cualquiera de los sistemas GeneAmp™ disponibles de Applied Biosystems.

Otros métodos de secuenciación apropiados incluyen la secuenciación de Polonia multiplex (como se describe en Shendureet al.,"Accurate Multiplex Polony Sequencing of an Evolved Bacterial Genome",Sciencexpress,4 de agosto de 2005, Pág. 1, disponible en www.sciencexpress.org/4 Aug. 2005/Page1/10.1126/science. 1117389), que emplea microperlas inmovilizadas y secuenciación en reactores de picolitros microfabricados (como se describe en Margulieset al.,"Genome Sequencing in Microfabricated High-Density Picolitre Reactors",Nature,agosto de 2005, Disponible en www.nature.com/nature (publicado en línea el 31 de julio de 2005, doi:10.1038/nature03959).

La secuenciación del genoma completo también puede usarse para diferenciar alelos de transcripciones de ARN, en algunas realizaciones. Los ejemplos de métodos de secuenciación del genoma completo incluyen, pero sin limitación, métodos de secuenciación basados en nanoporos, secuenciación por síntesis y secuenciación por ligadura, como se ha descrito anteriormente.

H ibridaciónin situ

Los ensayos de hibridaciónin situson bien conocidos, y se describen, en general, en Angereret al., Methods Enzymol.

152:649-660 (1987). En un ensayo de hibridaciónin situ,las células, por ejemplo, de una biopsia, se fijan a un soporte sólido, normalmente, un portaobjetos de vidrio. Si se va a sondar ADN, las células se desnaturalizan con calor o álcali. Luego, las células se ponen en contacto con una solución de hibridación a una temperatura moderada para permitir la hibridación de sondas específicas que están marcadas. Las sondas se marcan preferentemente con radioisótopos o indicadores fluorescentes. La FISH (hibridaciónin situfluorescente) usa sondas fluorescentes que se unen solo a aquellas partes de una secuencia con las que muestran un alto grado de similitud de secuencia.

La FISH es una técnica citogenética usada para detectar y localizar secuencias polinucleotídicas específicas en las células. Por ejemplo, la FISH puede usarse para detectar secuencias de ADN en cromosomas. La FISH también se puede usar para detectar y localizar ARN específicos, por ejemplo, ARNm, dentro de muestras de tejido. En la FISH, se usan sondas fluorescentes que se unen a secuencias de nucleótidos específicas con las que muestran un alto grado de similitud de secuencia. La microscopía de fluorescencia se puede usar para determinar si las sondas fluorescentes están unidas y dónde. Además de detectar secuencias de nucleótidos específicas, por ejemplo, translocaciones, fusión, roturas, duplicaciones y otras anomalías cromosómicas, la FISH puede ayudar a definir los patrones espacio-temporales del número específico de copias de genes y/o la expresión de genes dentro de células y tejidos.

La hibridación genómica comparativa (CGH) emplea la cinética de la hibridaciónin situpara comparar los números de copia de diferentes secuencias de ADN o ARN de una muestra, o los números de copias de diferentes secuencias de a Dn o ARN de una muestra con los números de copias de las secuencias sustancialmente idénticas de otra muestra. En muchas aplicaciones útiles de CGH, el ADN o ARN se aísla de una célula o población de células en cuestión. Las comparaciones pueden ser cualitativas o cuantitativas. Se describen procedimientos que permiten determinar los números absolutos de copias de secuencias de ADN en todo el genoma de una célula o población de células si el número absoluto de copias se conoce o determina para una o varias secuencias. Las diferentes secuencias se diferencian entre sí por las diferentes ubicaciones de sus sitios de unión cuando se hibridan con un genoma de referencia, en general, cromosomas metafásicos, pero, en ciertos casos, núcleos interfásicos. La información del número de copias procede de las comparaciones de las intensidades de las señales de hibridación entre las diferentes ubicaciones del genoma de referencia. Los métodos, las técnicas y las aplicaciones de CGH son conocidos, como se describe en la patente de EE.UU. n.° 6.335.167, y en la aplicación de EE. UU. n.° de serie 60/804.818.

Otros m étodos de análisis de secuencia

Las variantes de ácido nucleico también se pueden detectar usando técnicas electroforéticas convencionales. Aunque la etapa de detección a veces puede estar precedida por una etapa de amplificación, no se requiere amplificación en las realizaciones descritas en el presente documento. En la técnica, se pueden encontrar ejemplos de métodos para la detección y cuantificación de un ácido nucleico usando técnicas electroforéticas. Un ejemplo no limitante comprende procesar una muestra (por ejemplo, una muestra de ácido nucleico mixta aislada del suero materno o una especie de ácido nucleico de amplificación, por ejemplo) en un gel de agarosa o poliacrilamida. El gel puede marcarse (por ejemplo, teñirse) con bromuro de etidio (véase, Sambrook y Russell, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 3a ed., 2001). La presencia de una banda del mismo tamaño que el patrón de control es una indicación de la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana, cuya cantidad puede compararse con el control en función de la intensidad de la banda, detectándose y cuantificándose así la secuencia diana de interés. En algunas realizaciones, se pueden usar enzimas de restricción capaces de distinguir entre alelos maternos y paternos para detectar y cuantificar especies de ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, se usan sondas oligonucleotídicas específicas de una secuencia de interés para detectar la presencia de la secuencia diana de interés. Los oligonucleótidos también se pueden usar para indicar la cantidad de moléculas de ácido nucleico diana en comparación con el patrón de control, en función de la intensidad de la señal impartida por la sonda.

La hibridación de la sonda específica de secuencia puede usarse para detectar un ácido nucleico particular en una mezcla o población mixta que comprenda otras especies de ácidos nucleicos. En condiciones de hibridación suficientemente rigurosas, las sondas se hibridan específicamente solo con secuencias sustancialmente complementarias. La rigurosidad de las condiciones de hibridación se puede relajar para tolerar cantidades variables de desapareamiento de secuencia. Se conoce una serie de formatos de hibridación en la técnica, que incluyen, pero sin limitación, ensayos de hibridación en fase de solución, fase sólida o en fase mixta. Los siguientes artículos proporcionan una visión general de los diversos formatos de ensayo de hibridación: Singeret al., Biotechniques4:230, 1986; Haaseet al., Methods in Virology,pág. 189-226, 1984; Wilkinson, "In situ Hybridization", Wilkinson ed., IRL Press, Oxford University Press, Oxford; y Hames y Higgins eds., "Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach", IRL Press, 1987.

Los complejos de hibridación pueden detectarse mediante técnicas conocidas en la técnica. Las sondas de ácido nucleico capaces de hibridarse específicamente con un ácido nucleico diana (por ejemplo, ARNm o ADN) pueden marcarse mediante cualquier método adecuado, y la sonda marcada puede usarse para detectar la presencia de ácidos nucleicos hibridados. Un método de detección comúnmente usado es la autorradiografía, usando sondas marcadas con 3H, 125l, 35S, 14C, 32P, 33P o similares. La elección del isótopo radiactivo depende de las preferencias de la investigación debido a la facilidad de la síntesis, la estabilidad y las semividas de los isótopos seleccionados. Otros marcadores incluyen compuestos (por ejemplo, biotina y digoxigenina), que se unen a anti-ligandos o anticuerpos marcados con fluoróforos, agentes quimioluminiscentes y enzimas. En algunas realizaciones, las sondas se pueden conjugar directamente con marcadores tales como fluoróforos, agentes quimioluminiscentes o enzimas. La elección del marcador depende de la sensibilidad requerida, la facilidad de conjugación con la sonda, las necesidades de estabilidad y la instrumentación disponible.

Como alternativa, se pueden usar el polimorfismo en la longitud de fragmentos de restricción (RFLP) y el método AFLP para el perfilado molecular. Si una variante de nucleótidos del ADN diana correspondiente al uno o más genes produce la eliminación o creación de un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción, entonces, la digestión del ADN diana con esa enzima de restricción particular generará un patrón de longitudes de fragmentos de restricción modificado. Por lo tanto, un RFLP o AFLP detectado indicará la presencia de una variante de nucleótido particular.

Otro enfoque útil es el ensayo de polimorfismos de conformación monocatenaria (SSCA,Single-Stranded Conformation Polymorphism Assay),que se basa en la movilidad alterada de un ADN diana monocatenario que abarca la variante de nucleótidos de interés. Un cambio de un solo nucleótido en la secuencia diana puede producir un patrón de apareamientos de bases intramoleculares diferente y, por lo tanto, una estructura secundaria diferente del ADN monocatenario, que puede detectarse en un gel no desnaturalizante. Véase Oritaet al., Proc. Natl. Acad. Sci.EE.UU., 86:2776-2770 (1989). Las técnicas basadas en gel desnaturalizante, tales como la electroforesis en gel desnaturalizado con fijación (CDGE,Clamped Denaturing Gel Electrophoresis)y la electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGe ,Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)detectan diferencias en las tasas de migración de secuencias mutantes en comparación con las secuencias de tipo silvestre en gel desnaturalizante. Véanse Milleret al., Biotechniques,5:1016-24 (1999); Sheffieldet al., Am. J. Hum, Genet.,49:699-706 (1991); Wartellet al., Nucleic Acids Res.,18:2699-2705 (1990); y Sheffieldet al., Proc. Natl. Acad. Sci.EE.UU., 86:232-236 (1989). Además, el análisis de conformación bicatenaria (DSCA,Double-Strand Conformation Analysis)también puede ser útil en la presente invención. Véase Arguelloet al., Nat. Genet.,18:192-194 (1998).

La presencia o ausencia de una variante de nucleótido en un determinado locus en el uno o más genes de un individuo también se puede detectar usando la técnica del sistema de mutación refractaria de amplificación (ARMS,Amplification Refractory Mutation System).Véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.° 0.332.435; Newtonet al., Nucleic Acids Res.,17:2503-2515 (1989); Foxet al., Br. J. Cancer,77:1267-1274 (1998); Robertsonet al., Eur. Respir.J., 12:477-482 (1998). En el método ARMS, se sintetiza un cebador que se aparea con la secuencia de nucleótidos en dirección inmediatamente 5' del locus que se está probando, excepto que el nucleótido del extremo 3' que corresponde al nucleótido del locus es un nucleótido predeterminado. Por ejemplo, el nucleótido del extremo 3' puede ser el mismo que el del locus mutado. El cebador puede tener cualquier longitud adecuada, siempre que se hibride con el ADN diana en condiciones rigurosas solo cuando su nucleótido del extremo 3' se aparee con el nucleótido del locus que se está probando. Preferentemente, el cebador tiene al menos 12 nucleótidos, más preferentemente, de aproximadamente 18 a 50 nucleótidos. Si el individuo evaluado tiene una mutación en el locus y el nucleótido se aparea con el nucleótido del extremo 3' del cebador, entonces, el cebador puede extenderse aún más al hibridarse con el molde de ADN diana, y el cebador puede iniciar una reacción de amplificación por PCR en combinación con otro cebador de PCR adecuado. Por el contrario, si el nucleótido en el locus es de tipo silvestre, entonces, no se puede lograr la extensión del cebador. Se pueden usar distintas formas de técnicas ARMS desarrolladas en los últimos años. Véase, por ejemplo, Gibsonet al., Clin. Chem.43:1336-1341 (1997).

Similar a la técnica ARMS es la mini secuenciación o el método de extensión de cebador de un solo nucleótido, que se basa en la incorporación de un solo nucleótido. Un cebador oligonucleotídico que se aparea con la secuencia de nucleótidos inmediatamente 5' con el locus que se está probando se hibrida con el ADN, ARNm o miARN diana en presencia de didesoxirribonucleótidos marcados. Un nucleótido marcado se incorpora o se une al cebador solo cuando los didesoxirribonucleótidos se aparean con el nucleótido en el locus variante que se está detectando. Por lo tanto, se puede desvelar la identidad del nucleótido en el locus variante basándose en el marcador de detección unido a los didesoxirribonucleótidos incorporados. Véanse Syvanenet al., Genomics,8:684-692 (1990); Shumakeret al. Hum. Mutat.,7:346-354 (1996); Chenet al., Genome Res.,10:549-547 (2000).

Otro conjunto de técnicas útiles en la presente invención es el denominado "ensayo de ligadura de oligonucleótidos" (OLA), en el que la diferenciación entre un locus de tipo silvestre y una mutación se basa en la capacidad de dos oligonucleótidos para hibridarse adyacentes entre sí en la molécula de ADN diana que permite que los dos oligonucleótidos se unan mediante una ADN ligasa. Véanse Landergrenet al., Science,241:1077-1080 (1988); Chenet al, Genome Res.,8:549-556 (1998); lannoneet al.,"Cytometry", 39:131-140 (2000). Por lo tanto, por ejemplo, para detectar una mutación de un solo nucleótido en un locus particular de uno o más genes, se pueden sintetizar dos oligonucleótidos, uno que tenga la secuencia en dirección inmediatamente 5' del locus con su nucleótido extremo 3' idéntico al nucleótido del locus variante del gen particular, teniendo el otro una secuencia de nucleótidos apareada con la secuencia en dirección inmediatamente 3' del locus del gen. Los oligonucleótidos pueden marcarse con el propósito de la detección. Al hibridarse con el gen diana en condiciones rigurosas, los dos oligonucleótidos se someten a ligadura en presencia de una ligasa adecuada. La ligadura de los dos oligonucleótidos indicaría que el ADN diana tiene una variante de nucleótido en el locus que se está detectando.

La detección de pequeñas variaciones genéticas también se puede lograr mediante una variedad de enfoques basados en la hibridación. Los oligonucleótidos específicos del alelo son los más útiles. Véanse Conneret al., Proc. Natl. Acad. Sci.EE.UU., 80:278-282 (1983); Saikiet al, Proc. Natl. Acad. Sci.EE.UU., 86:6230-6234 (1989). Las sondas de oligonucleótidos (específicas de alelos) que se hibridan específicamente con un alelo génico que tiene una variante génica particular en un locus particular, pero no con otros alelos pueden diseñarse mediante métodos conocidos en la técnica. Las sondas pueden tener una longitud de, por ejemplo, de 10 a aproximadamente 50 bases de nucleótidos. El ADN diana y la sonda de oligonucleótido pueden ponerse en contacto entre sí en condiciones suficientemente rigurosas, de modo que la variante de nucleótido pueda distinguirse del gen de tipo silvestre en función de la presencia o ausencia de hibridación. La sonda se puede marcar para proporcionar señales de detección. Como alternativa, la sonda oligonucleotídica específica del alelo puede usarse como un cebador de amplificación de PCR en una "PCR específica del alelo" y la presencia o ausencia de un producto de PCR de la longitud esperada indicaría la presencia o ausencia de una variante de nucleótido particular.

Otras técnicas útiles basadas en hibridación permiten la hibridación de dos ácidos nucleicos monocatenarios incluso en presencia de desapareamiento debido a la sustitución, inserción o eliminación de nucleótidos. El desapareamiento se puede detectar usando distintas técnicas. Por ejemplo, los dúplex hibridados pueden someterse a electroforesis. Los dúplex desapareados se pueden detectar en función de su movilidad electroforética, que es diferente de la de los dúplex perfectamente apareados. Véase Cariello,Human Genetics,42:726 (1988). Como alternativa, en un ensayo de protección de RNasa, se puede preparar una sonda de ARN que abarque el sitio de la variante de nucleótido que se vaya a detectar y que tenga un marcador de detección. Véanse Giuntaet al.,Diagn.Mol. Path.,5:265-270 (1996); Finkelsteinet al., Genomics,7:167-172 (1990); Kinszleret al., Science251:1366-1370 (1991). La sonda de ARN puede hibridarse con el ADN o ARNm diana formando un heterodúplex que luego se someta a la digestión con ribonucleasa RNasa A.

La ARNasa A digiere la sonda de ARN del heterodúplex solo en el sitio de desapareamiento. La digestión se puede determinar en un gel de electroforesis desnaturalizante en función de las variaciones de tamaño. Además, los desapareamientos también se pueden detectar mediante métodos de escisión química conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Robertset al., Nucleic Acids Res.,25:3377-3378 (1997).

En el ensayo mutS, se puede preparar una sonda que se aparee con la secuencia del gen que rodea el locus en el que se debe detectar la presencia o ausencia de una mutación, a excepción del uso de un nucleótido predeterminado en el locus variante. Al hibridar la sonda al ADN diana para formar un dúplex, la proteína mutS deE. colise pone en contacto con el dúplex. Como la proteína mutS se une solo a secuencias heterodúplex que contienen un desapareamiento de nucleótidos, la unión de la proteína mutS será indicativa de la presencia de una mutación. Véase Modrichet al., Ann. Rev. Genet,25:229-253 (1991).

Se ha desarrollado una gran variedad de mejoras y variaciones en la técnica basándose en las técnicas básicas descritas anteriormente que pueden ser útiles para detectar mutaciones o variantes de nucleótidos en la presente invención. Por ejemplo, las "sondas Sunrise" o "balizas moleculares" usan la propiedad de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), y dan lugar a una alta sensibilidad. Véase Wolfet al., Proc. Nat. Acad. Sci.EE.UU., 85:8790-8794 (1988). Normalmente, una sonda que abarca el locus de nucleótidos que se va a detectar se diseña en una estructura en forma de horquilla, y se marca con un fluoróforo de inactivación en un extremo y con un fluoróforo indicador en el otro extremo. En su estado natural, la fluorescencia del fluoróforo indicador es apagada por el fluoróforo inactivador debido a la proximidad de un fluoróforo al otro. Tras la hibridación de la sonda con el ADN diana, el extremo 5' se separa del extremo 3' y, por lo tanto, se regenera la señal de fluorescencia. Véanse Nazarenkoet al., Nucleic Acids Res.,25:2516-2521 (1997); Rychliket al., Nucleic Acids Res.,17:8543-8551 (1989); Sharkeyet al., Bio/Technology12:506-509 (1994); Tyagiet al., Nat. Biotechnol.,14:303-308 (1996); Tyagiet al., Nat. Biotechnol.,16:49-53 (1998). El sistema no dimérico asistido por homo-marcadores (HANDS,Homo-tag Assisted Non-Dimer System)se puede usar en combinación con los métodos de baliza molecular para suprimir la acumulación de cebadordímero. Véase Brownieet al., Nucleic Acids Res.,25:3235-3241 (1997).

El ensayo de ligadura de oligonucleótidos marcados con colorante es un método basado en FRET, que combina el ensayo OLA y la PCR. Véase Chenet al., Genome Res.8:549-556 (1998). TaqMan es otro método basado en FRET para detectar variantes de nucleótido. Una sonda TaqMan puede ser oligonucleótidos diseñados para tener la secuencia de nucleótidos del gen que abarca el locus variante de interés y para hibridarse diferencialmente con diferentes alelos. Los dos extremos de la sonda están marcados con un fluoróforo de inactivación y un fluoróforo indicador, respectivamente. La sonda TaqMan se incorpora a una reacción de PCR para la amplificación de una región del gen diana que contiene el locus de interés usando la polimerasa de Taq. Como la polimerasa de Taq presenta actividad exonucleasa 5'-3', pero no tiene actividad exonucleasa 3'-5', si la sonda TaqMan se hibrida en el molde de ADN diana, el extremo 5' de la sonda TaqMan será degradado por la polimerasa de Taq durante la reacción de PCR, separando así el fluoróforo indicador del fluoróforo inactivador, y liberando señales de fluorescencia. Véanse Hollandet al.,Proc. Natl. Acad. Sci.EE.UU., 88:7276-7280 (1991); Kalininaet al., Nucleic Acids Res.,25:1999-2004 (1997); Whit-combeet al., Clin. Chem,44:918-923 (1998).

Además, la detección en la presente invención también puede emplear una técnica basada en quimioluminiscencia.

Por ejemplo, se puede diseñar una sonda de oligonucleótido para hibridarse con el locus del gen de la variante o de tipo silvestre, pero no con ambos. La sonda se marca con un éster de acridinio altamente quimioluminiscente. La hidrólisis del éster de acridinio destruye la quimioluminiscencia. La hibridación de la sonda con el ADN diana evita la hidrólisis del éster de acridinio. Por lo tanto, la presencia o ausencia de una mutación particular en el ADN diana se determina midiendo los cambios de quimioluminiscencia. Véase Nelsonet al., Nucleic Acids Res.,24:4998-5003 (1996).

La detección de la variación genética en el gen también puede basarse en la técnica de "exploración de secuencia de escisión de base" (BESS,Base Excisión Sequence Scanning).El método BESS es un método de exploración de mutaciones basado en PCR. Se generan BESS T-Scan y BESS G-Tracker que son análogos a las escaleras T y G de la secuenciación didesoxi. Las mutaciones se detectan comparando la secuencia de ADN normal y mutante. Véase, por ejemplo, Hawkinset al.,"Electrophoresis", 20:1171-1176 (1999).

La espectrometría de masas se puede usar para el perfilado molecular. Véase Graberet al., Curr. Opin. Biotechnol.,9:14-18 (1998). Por ejemplo, en el método de extensión de base oligo de cebador (PROBE™), un ácido nucleico diana se inmoviliza en un soporte en fase sólida. Se hibrida un cebador con la diana en dirección inmediatamente 5' del locus para su análisis. La extensión del cebador se lleva a cabo en presencia de una mezcla seleccionada de desoxirribonucleótidos y didesoxirribonucleótidos. La mezcla resultante de cebadores recién extendidos se analiza luego mediante MALDI-TOF. Véase, por ejemplo, Monforteet al., Nat. Med.,3:360-362 (1997).

Además, las tecnologías de microchip o micromatriz también son aplicables al método de detección de la presente invención. Esencialmente, en microchips, se inmoviliza una gran cantidad de sondas de oligonucleótido diferentes en una matriz sobre un sustrato o portador, por ejemplo, un chip de silicio o portaobjetos de vidrio. Las secuencias de ácido nucleico diana que se van a analizar pueden ponerse en contacto con las sondas de oligonucleótido inmovilizadas en el microchip. Véanse Lipshutzet al., Biotechniques,19:442-447 (1995); Cheeet al., Science,274:610-614 (1996); Kozalet al., Nat. Med.2:753-759 (1996); Haciaet al., Nat. Genet,14:441-447 (1996); Saikiet al., Proc. Natl. Acad. Sci.EE.UU., 86:6230-6234 (1989); Gingeraset al., Genome Res.,8:435-448 (1998). Como alternativa, las múltiples secuencias de ácido nucleico diana que se van a estudiar se fijan sobre un sustrato y se pone en contacto una matriz de sondas con las secuencias diana inmovilizadas. Véase Drmanacet al., Nat. Biotechnol.,16:54-58 (1998). Se han desarrollado numerosas tecnologías de microchip que incorporan una o más de las técnicas descritas anteriormente para detectar mutaciones. Las tecnologías de microchip combinadas con herramientas de análisis computarizado permiten una detección rápida a gran escala. La adaptación de las tecnologías de microchip a la presente invención será evidente para el experto en la materia informado de la presente divulgación. Véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.° 5.925.525 de Fodoret al;Wilgenbuset al., J. Mol. Med.,77:761-786 (1999); Graberet al., Curr. Opin. Biotechnol.,9:14-18 (1998); Haciaet al., Nat. Genet.,14:441-447 (1996); Shoemakeret al., Nat. Genet.,14:450-456 (1996); DeRisiet al., Nat. Genet.,14:457-460 (1996); Cheeet al., Nat. Genet.,14:610-614 (1996); Lockhartet al., Nat. Genet.,14:675-680 (1996); Drobyshevet al. Gene,188:45-52 (1997).

Como se desprende de la presentación anterior de las técnicas de detección adecuadas, puede o no ser necesario amplificar el ADN diana, es decir, el gen, ADNc, ARNm, miARN o una porción del mismo para aumentar el número de moléculas de ADN diana, dependiendo de las técnicas de detección usadas. Por ejemplo, la mayoría de las técnicas basadas en PCR combinan la amplificación de una parte de la diana y la detección de las mutaciones. La amplificación por PCR es bien conocida en la técnica, y se describe en las patentes de EE.UU. n.° 4.683.195 y 4.800.159. Para las técnicas de detección no basadas en PCR, en caso necesario, la amplificación se puede lograr mediante, por ejemplo, multiplicación de plásmidosin vivo,o purificando el ADN diana de una gran cantidad de muestras tisulares o celulares. Véase, en general, Sambrooket al.,"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Sin embargo, incluso con muestras escasas, se han desarrollado muchas técnicas sensibles en las que se pueden detectar pequeñas variaciones genéticas tales como las sustituciones de un solo nucleótido sin tener que amplificar el ADN diana en la muestra. Por ejemplo, se han desarrollado técnicas que amplifican la señal en oposición al ADN diana, por ejemplo, empleando ADN ramificado o dendrímeros que puedan hibridarse con el ADN diana. Los ADN ramificados o dendriméricos proporcionan múltiples sitios de hibridación para que las sondas de hibridación se unan a los mismos, amplificando así las señales de detección. Véanse Detmeret al., J. Clin. Microbiol.,34:901-907 (1996); Collinset al., Nucleic Acids Res.,25:2979-2984 (1997); Hornet al., Nucleic Acids Res.,25:4835-4841 (1997); Hornet al., Nucleic Acids Res.,25:4842-4849 (1997); Nilsenet al., J. Theor. Biol.,187:273-284 (1997).

El ensayo Invader™ es otra técnica para detectar variaciones de un solo nucleótido que pueden usarse para el perfilado molecular de acuerdo con la invención. El ensayo Invader™ usa una nueva tecnología de amplificación de señal lineal que mejora los largos tiempos de respuesta requeridos por el análisis basado en secuencias de ADN de PCR típico. Véase Cookseyet al.,"Antimicrobial Agents and Chemotherapy" 44:1296-1301 (2000). Este ensayo se basa en la escisión de una estructura secundaria única formada entre dos oligonucleótidos superpuestos que se hibridan con la secuencia diana de interés para formar una "solapa". Cada "solapa" genera miles de señales por hora. Por lo tanto, los resultados de esta técnica se pueden leer fácilmente, y los métodos no requieren una amplificación exponencial de la diana de ADN. El sistema Invader™ usa dos sondas cortas de ADN, que se hibridan con una diana de ADN. La estructura formada mediante el evento de hibridación es reconocida por una enzima de escisión cleavasa especial que corta una de las sondas para liberar una pequeña "solapa" de ADN. Cada "solapa" liberada se une a una sonda marcada con fluorescencia para formar otra estructura de escisión. Cuando la enzima cleavasa corta la sonda marcada, la sonda emite una señal de fluorescencia detectable. Véanse, por ejemplo, Lyamichevet al., Nat. Biotechnol., 17:292-296 (1999).

El método de círculo rodante es otro método que evita la amplificación exponencial. Lizardiet al., Nature Genetics,19:225-232 (1998). Por ejemplo, Sniper™, una realización comercial de este método, es un sistema de puntuación de SNP sensible y de alto rendimiento diseñado para la detección fluorescente precisa de variantes específicas. Para cada variante de nucleótido, se diseñan dos sondas lineales específicas del alelo. Las dos sondas específicas del alelo son idénticas a excepción de la base 3', que varía para complementar el sitio de la variante. En la primera etapa del ensayo, el ADN diana se desnaturaliza y luego se hibrida con un par de sondas de oligonucleótido de círculo abierto, específicas del alelo, individuales. Cuando la base 3' complementa exactamente el ADN diana, se producirá preferentemente la ligadura de la sonda. La detección posterior de las sondas de oligonucleótido circularizadas se realiza mediante amplificación de círculo rodante, mediante la que los productos de la sonda amplificada se detectan por fluorescencia. Véase Clark y Pickering,Life Science News6, 2000, Amersham Pharmacia Biotech (2000).

Una serie de otras técnicas que evitan la amplificación en conjunto incluyen, por ejemplo, la dispersión Raman de resonancia mejorada en la superficie (SERRS,Surface-Enhanced Resonance Raman Scattering),la espectroscopía de correlación de fluorescencia y la electroforesis de una sola molécula. En la SERRS, un conjugado de cromóforoácido nucleico se absorbe sobre plata coloidal y se irradia con luz láser a una frecuencia resonante del cromóforo. Véase Grahamet al., Anal. Chem.,69:4703-4707 (1997). La espectroscopia de correlación de fluorescencia se basa en las correlaciones espacio-temporales entre las señales de luz fluctuantes y la captura de moléculas individuales en un campo eléctrico. Véase Figenet al., Proc. Natl. Acad. Sci.EE.UU., 91:5740-5747 (1994). En la electroforesis de una sola molécula, la velocidad electroforética de un ácido nucleico marcado con fluorescencia se determina midiendo el tiempo requerido para que la molécula viaje una distancia predeterminada entre dos rayos láser. Véase Castroet al., Anal. Chem.,67:3181-3186 (1995).

Además, los oligonucleótidos específicos del alelo (ASO) también se pueden usar en la hibridaciónin situusando tejidos o células como muestras. Las sondas de oligonucleótido que pueden hibridarse diferencialmente con la secuencia del gen de tipo silvestre o la secuencia del gen que alberga una mutación pueden marcarse con isótopos radiactivos, fluorescencia u otros marcadores detectables. Las técnicas de hibridaciónin situson bien conocidas en la técnica, y su adaptación a la presente invención para detectar la presencia o ausencia de una variante de nucleótido en uno o más genes de un individuo en particular debería ser evidente para un experto en la materia informado de la presente divulgación.

Las técnicas de detección basadas en proteínas también son útiles para el perfilado molecular, especialmente cuando la variante de nucleótido genera sustituciones o eliminaciones o inserciones de aminoácidos o cambios de marco que afectan la estructura primaria, secundaria o terciaria de la proteína. Para detectar las variaciones de aminoácidos, se pueden usar técnicas de secuenciación de proteínas. Por ejemplo, una proteína o un fragmento de la misma correspondiente a un gen se puede sintetizar mediante expresión recombinante usando un fragmento de ADN aislado de un individuo que se vaya a analizar. Preferentemente, se usa un fragmento de ADNc de no más de 100 a 150 pares de bases que abarca el locus polimórfico que se va a determinar. La secuencia de aminoácidos del péptido se puede determinar mediante métodos de secuenciación de proteínas convencionales. Como alternativa, la técnica de espectrometría de masas en tándem de microscopía HPLC puede usarse para determinar las variaciones de la secuencia de aminoácidos. En esta técnica, se realiza la digestión proteolítica en una proteína, y la mezcla de péptidos resultante se separa mediante separación cromatográfica en fase inversa. Luego se realiza una espectrometría de masas en tándem y se analizan los datos recopilados a partir de la misma. Véase Gatlinet al., Anal. Chem,72:757-763 (2000).

Otras técnicas de detección molecular basadas en proteínas incluyen ensayos de inmunoafinidad basados en anticuerpos selectivamente inmunorreactivos con proteínas codificadas por genes mutantes. Los métodos para producir dichos anticuerpos son conocidos en la técnica. Los anticuerpos se pueden usar para inmunoprecipitar proteínas específicas de muestras de solución o para la inmunotransferencia de proteínas separadas por, por ejemplo, geles de poliacrilamida. Los métodos inmunocitoquímicos también se pueden usar para detectar polimorfismos proteicos específicos en tejidos o células. También se pueden usar otras técnicas basadas en anticuerpos bien conocidas, que incluyen, por ejemplo, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA,Enzyme-Linked Immunosorbent Assay),radioinmunoensayo (RIA,RadioImmunoAssay),ensayos inmunorradiométricos (ERMA,ImmunoRadiometric Assays)y ensayos inmunoenzimáticos (IEMA,ImmunoEnzyAatic Assays),incluidos los ensayos de tipo sándwich con anticuerpos monoclonales o policlonales.

Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.° 4.376.110 y 4.486.530.

Por consiguiente, la presencia o ausencia de uno o más genes de la variante de nucleótido o la variante de aminoácido en un individuo puede determinarse usando cualquiera de los métodos de detección descritos anteriormente.

Normalmente, una vez que se determina la presencia o ausencia de una o más variantes de nucleótido o variantes de aminoácido génica, los médicos o asesores genéticos o pacientes u otros investigadores pueden ser informados del resultado. Específicamente, el resultado se puede emitir en una forma transmisible que se pueda comunicar o transmitir a otros investigadores o médicos o asesores genéticos o pacientes. Dicho forma puede variar, y puede ser tangible o intangible. El resultado con respecto a la presencia o ausencia de una variante de nucleótido de la presente invención en el individuo sometido a prueba se puede incorporar en declaraciones descriptivas, diagramas, fotografías, tablas, imágenes o cualquier otra forma visual. Por ejemplo, se pueden usar imágenes de electroforesis en gel de productos de PCR para explicar los resultados. Los diagramas que muestran dónde se produce una variante en el gen de un individuo también son útiles para indicar los resultados de las pruebas. Las declaraciones y las formas visuales se pueden grabar en un medio tangible, tal como documentos, medios legibles por ordenador, tales como disquetes, discos compactos, etc., o en un medio intangible, por ejemplo, un medio electrónico en forma de correo electrónico o sitio web en Internet. o intranet. Además, el resultado con respecto a la presencia o ausencia de una variante de nucleótido o una variante de aminoácido en el individuo sometido a prueba también puede registrarse en forma de sonido y transmitirse a través de cualquier medio adecuado, por ejemplo, líneas de cable analógicas o digitales, cables de fibra óptica, etc., por teléfono, facsímil, teléfono móvil inalámbrico, teléfono de Internet y similares.

Por lo tanto, la información y los datos sobre el resultado de una prueba pueden producirse en cualquier parte del mundo y transmitirse a una ubicación diferente. Por ejemplo, cuando se realiza un ensayo de genotipado en alta mar, la información y los datos sobre el resultado de una prueba se pueden generar y emitir en una forma transmisible como se ha descrito anteriormente. El resultado de la prueba en una forma transmisible, por lo tanto, puede importarse a EE. UU. Por consiguiente, la presente divulgación también abarca un método para producir una forma transmisible de información sobre el genotipo de las dos o más muestras sospechosas de cáncer de un individuo. El método comprende las etapas de (1) determinar el genotipo del ADN a partir de las muestras de acuerdo con los métodos; y (2) incorporar el resultado de la etapa de determinación a una forma transmisible. La forma transmisible es el producto del método de producción.

Datos y análisis

La práctica de la presente invención también puede emplear métodos, software y sistemas de biología convencionales. Los productos de software informáticos de la invención normalmente incluyen un medio legible por ordenador que tiene instrucciones ejecutables por ordenador para realizar las etapas lógicas del método de la invención. El medio legible por ordenador adecuado incluye disquete, CD-ROM/DVD/DVD-ROM, unidad de disco duro, memoria flash, ROM/RAM, cintas magnéticas, etc. Las instrucciones ejecutables por ordenador pueden estar escritas en un lenguaje informático adecuado o en una combinación de varios lenguajes. Se describen métodos básicos de biología computacional en, por ejemplo, Setubal y Meidaniset al.,"Introduction to Computational Biology Methods" (PWS Publishing Company, Boston, 1997); Salzberg, Searles, Kasif, (Ed.),Computational Methods in Molecular Biology,(Elsevier, Amsterdam, 1998); Rashidi y Buehler, "Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine"(CRC Press, Londres, 2000); y Ouelette y Bzevanis, "Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins" (Wiley & Sons, Inc., 2a ed., 2001). Véase la patente de EE.UU. n.° 6.420.108.

La presente invención también puede hacer uso de distintos productos de programas informáticos y software para una variedad de fines, tales como el diseño de sondas, la gestión de datos, análisis y el manejo de instrumentos. Véanse, las patentes de EE.UU. n.° 5.593.839, 5.795.716, 5.733.729, 5.974.164, 6.066.454, 6.090.555, 6.185.561. 6.188.783, 6.223.127, 6.229.911 y 6.308.170.

Adicionalmente, la presente divulgación se refiere a métodos para proporcionar información genética a través de redes tales como Internet como se muestra en los documentos de EE.u U. n.° 10/197.621 y 10/063.559 (publicación de EE.UU. n.° 20020183936), 10/065.856, 10/065.868, 10/328.818, 10/328.872, 10/423.403 y 60/482.389. Por ejemplo, se pueden realizar una o más técnicas de perfilado molecular en una ubicación, por ejemplo, una ciudad, un estado, un país o un continente, y los resultados se pueden transmitir a una ciudad, un estado, un país o un continente diferente. La selección del tratamiento se puede realizar total o parcialmente en la segunda ubicación. Los métodos de la invención comprenden la transmisión de información entre diferentes ubicaciones.

Perfilado molecular para la selección del tratamiento

Los métodos de la invención pueden proporcionar una selección de tratamiento candidato para un sujeto que lo necesita. El perfilado molecular se puede usar para identificar uno o más agentes terapéuticos candidatos para un individuo que padece una afección en la que uno o más de los biomarcadores desvelados en el presente documento son dianas para el tratamiento. Por ejemplo, el método puede identificar uno o más tratamientos de quimioterapia para un cáncer. La divulgación proporciona un método que comprende: realizar un análisis de inmunohistoquímica (IHC) en una muestra del sujeto para determinar un perfil de expresión de IHC en al menos cinco proteínas; realizar un análisis de micromatriz en la muestra para determinar un perfil de expresión de micromatriz en al menos diez genes; realizar un análisis de hibridaciónin situfluorescente (FISH) en la muestra para determinar un perfil de mutaciones de FISH en al menos un gen; realizar la secuenciación de ADN en la muestra para determinar un perfil de mutaciones de secuenciación en al menos un gen; y comparar el perfil de expresión de IHC, el perfil de expresión de micromatriz, el perfil de mutaciones de FISH y el perfil de mutaciones de secuenciación con una base de datos de reglas, en donde la base de datos de reglas comprende un mapeo de tratamientos cuya actividad biológica es conocida contra las células enfermas que: i) sobreexpresan o infraexpresan una o más proteínas incluidas en el perfil de expresión de IHC; ii) sobreexpresan o infraexpresan uno o más genes incluidos en el perfil de expresión de micromatriz; iii) tienen cero o más mutaciones en uno o más genes incluidos en el perfil de mutaciones de FISH; y/o iv) tienen cero o más mutaciones en uno o más genes incluidos en el perfil de mutaciones de secuenciación; e identificar el tratamiento si la comparación con la base de datos de reglas indica que el tratamiento debe tener actividad biológica contra las células enfermas; y la comparación con la base de datos de reglas no contraindica el tratamiento para tratar las células enfermas.

La enfermedad puede ser un cáncer. Las etapas de perfilado molecular se pueden realizar en cualquier orden. En algunas divulgaciones, no se realizan todas las etapas de perfilado molecular. Como ejemplo no limitante, el análisis de micromatriz no se realiza si la calidad de la muestra no alcanza un valor umbral, como se describe en el presente documento. En otro ejemplo, la secuenciación se realiza solo si el análisis FISH cumple con un valor umbral. Cualquier biomarcador relevante puede evaluarse usando una o más de las técnicas de perfilado molecular descritas en el presente documento o conocidas en la técnica. El marcador solo necesita tener alguna asociación directa o indirecta con un tratamiento para ser útil.

El perfilado molecular comprende el perfilado de al menos un gen (o producto génico) para cada técnica de ensayo que se realiza. Se pueden analizar diferentes números de genes con diferentes técnicas. Cualquier marcador desvelado en el presente documento que esté asociado directa o indirectamente con una diana terapéutica puede evaluarse en función de bien el gen, por ejemplo, la secuencia de ADN y/o el producto génico, por ejemplo, ARNm o proteína. Dicho ácido nucleico y/o polipéptido se puede perfilar según corresponda en cuanto a la presencia o ausencia, el nivel o la cantidad, la mutación, la secuencia, el haplotipo, el reordenamiento, el número de copias, etc. Se puede analizar un solo gen y/o uno o más productos genéticos correspondientes mediante más de una técnica de perfilado molecular. Un gen o producto génico (también denominado en el presente documento "marcador" o "biomarcador"), por ejemplo, un ARNm o una proteína, se evalúa usando técnicas aplicables (por ejemplo, para evaluar ADN, ARN, proteína), que incluyen, sin limitación, FISH, micromatriz, IHC, secuenciación o inmunoensayo. Por lo tanto, cualquiera de los marcadores desvelados en el presente documento puede analizarse mediante una sola técnica de perfilado molecular o mediante múltiples métodos desvelados en el presente documento (por ejemplo, un solo marcador es perfilado mediante uno o más de entre IHC, FISH, secuenciación, micromatriz, etc.). Se perfilan al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o al menos aproximadamente 100 genes o productos génicos mediante secuenciación. En algunas realizaciones, se perfilan al menos aproximadamente 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 11.000, 12.000, 13.000, 14.000, 15.000, 16.000, 17.000, 18.000, 19.000, 20.000, 21.000, 22.000, 23.000, 24.000, 25.000, 26.000, 27.000, 28.000, 29.000, 30.000, 31.000, 32.000, 33.000, 34.000, 35.000, 36.000, 37.000, 38.000, 39.000, 40.000, 41.000, 42.000, 43.000, 44.000, 45.000, 46.000, 47.000, 48.000, 49.000 o al menos aproximadamente 50.000 genes o productos génicos. El número de marcadores analizados puede depender de la técnica usada. Por ejemplo, la micromatriz y la secuenciación masiva paralela se prestan a análisis de alto rendimiento.

En algunas divulgaciones, se perfila una muestra de un sujeto que lo necesita usando métodos que incluyen, pero sin limitación, perfilado de expresión de IHC, perfilado de expresión de micromatriz, perfilado de mutaciones de FISH y/o perfilado de mutaciones por secuenciación (tal como por PCR, RT-PCR, pirosecuenciación) para uno o más de los siguientes: ABCC1, ABCG2, ACE2, ADA, ADH1C, ADH4, AGT, Receptor de andrógenos, AR, AREG, ASNS, BCL2, BCRP, BDCA1, BIRC5, B-RAF, BRCA1, BRCA2, CA2, caveolina, CD20, CD25, CD33, CD52, CDA, CDK2, CDW52, CES2, CK 14, CK 17, CK 5/6, c-KIT, c-Myc, COX-2, Ciclina D1, DCK, DHFR, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, E-Cadherina, ECGF1, EGFR, EPHA2, Epiregulina, ER, ERBR2, ERCC1, ERCC3, EREG, ESR1, FLT1, receptor de folato, FOLR1, FOLR2, FSHB, FSHPRH1, FSHR, FYN, GART, GNRH1, GNRHR1, GSTP1, HCK, HDAC1, Her2/Neu, HGF, HIF1A, HIG1, HSP90, HSP90AA1, HSPCA, IL13RA1, IL2RA, KDR, KIT, K-RAS, LCK, LTB, Receptor de linfotoxina beta, LYN, MGMT, MLH1, MRP1, MS4A1, MSH2, Myc, NFKB1, NFKB2, NFKBIA, ODC1, OGFR, p53, p95, PARP-1, PDGFC, PDGFR, PDGFRA, PDGFRB, PGP, PGR, PI3K, POLA, POLA1, PPARG, PPARGC1, PR, PTEN, PTGS2, RAF1, RARA, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRB, RXRG, SPARC, SPARC MC, SPARC PC, SRC, SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4, SSTR5, Survivina, TK1, TLE3, TNF, TOPI, TOP2A, TOP2B, TOPO1, T0P02B, Topoisomerasa II, TS, TXN, TXNRD1, TYMS, VDR, VEGF, VEGFA, VEGFC, VHL, YES1, ZAP70.

En algunas realizaciones, se realizan métodos de perfilado molecular adicionales. Estos pueden incluir, sin limitación, PCR, RT-PCR, Q-PCR, SAGE, MPSS, inmunoensayos y otras técnicas para evaluar los sistemas biológicos descritos en el presente documento o conocidos por los expertos en la materia. La elección de los genes y productos génicos que se van a analizar puede actualizarse con el tiempo a medida que se identifiquen nuevos tratamientos y nuevas dianas farmacológicas. Una vez que la expresión o mutación de un biomarcador se correlaciona con una opción de tratamiento, se puede evaluar mediante un perfilado molecular. Un experto apreciará que dicho perfilado molecular no se limita a las técnicas desveladas en el presente documento, sino que comprende cualquier metodología convencional para evaluar los niveles de ácido nucleico o proteína, información de secuencia o ambos. Los métodos de la invención también pueden aprovechar cualquier mejora de los métodos actuales o las nuevas técnicas de perfilado molecular desarrolladas en el futuro. En algunas realizaciones, un gen o producto génico se evalúa mediante una sola técnica de perfilado molecular. En otras realizaciones, un gen y/o producto génico se evalúa mediante múltiples técnicas de perfilado molecular. En un ejemplo no limitante, una secuencia de genes puede analizarse mediante uno o más análisis de FISH y pirosecuenciación, el producto génico de ARNm puede analizarse mediante uno o más de entre RT-PCR y micromatriz, y el producto génico de proteínas puede analizarse mediante uno o más de entre IHC e inmunoensayo. Un experto apreciará que la invención contempla cualquier combinación de biomarcadores y técnicas de perfilado molecular que sea beneficiosa para el tratamiento de la enfermedad.

Los genes y productos génicos que se sabe que desempeñan un papel en el cáncer y que se pueden analizar mediante cualquiera de las técnicas de perfilado molecular de la invención incluyen, sin limitación, 2AR, DISINTEGRINA A, ACTIVADOR DEL RECEPTOR DE ÁCIDO RETINOICO Y TIROIDEO (ACTR), ADAM 11, FACTOR INHIBIDOR DE LA ADIPOGÉNESIS (ADIF), SUBUNIDAD DE INTEGRINA ALFA 6, SUBUNIDAD DE INTEGRINA ALFA V, ALFA-CATENINA, AMPLIFICADO EN EL CÁNCER DE MAMA 1 (AIB1), AMPLIFICADO EN EL CÁNCER DE MAMA 3 (AIB3), AMPLIFICADO EN EL CÁNCER DE MAMA 4 (AIB4), PROTEÍNA SECRETASA PRECURSORA AMILOIDE (APPS), AP-2 GAMMA, ARPS, TRANSPORTADOR DE CASETES DE UNIÓN A ATP (ABCT), ESPECÍFICO DE LA PLACENTA (ABCP), MIEMBRO DE LA SUBFAMILIA C DE CASETES DE UNIÓN A ATP (ABCC1), BAG-1, BASIGINA (BSG), BCEI, FACTOR DE DIFERENCIACIÓN DE LINFOCITOS B (BCDF), LEUCEMIA 2 DE LINFOCITOS B (BCL-2), FACTOR ESTIMULATORIO DE LINFOCITOS B-2 (BSF-2), BCL-1, PROTEÍNA X ASOCIADA A BCL-2 (BAX), BCRP, SUBUNIDAD DE INTEGRINA BETA 1, SUBUNIDAD DE INTEGRINA BETA 3, SUBUNIDAD DE INTEGRINA BETA 5, INTERFERÓN BETA-2, BETA-CATENINA, BETA-CATENINA, SIALOPROTEINA ÓSEA (BSP), SECUENCIA INDUCIBLE POR ESTRÓGENOS DE CÁNCER DE MAMA (BCEI), PROTEÍNA DE RESISTENCIA AL CÁNCER DE MAMA (BCRP), CÁNCER DE MAMA DE TIPO 1 (BRCA1), CÁNCER DE MAMA DE TIPO 2 (BRCA2), SECUENCIA AMPLIFICADA DE CARCINOMA DE MAMA 2 (BCAS2), CADHERINA, CADHERINA 11 EPITELIAL, PROTEÍNA ASOCIADA A CADHERINA, RECEPTOR DE CALCITONINA (CTR), PROTEÍNA PLACENTAL DE CALCIO (CAPL), CALCICLINA, CALLA, CAMS, CAPL, ANTIGENO CARCINOEMBRIONARIO (CEA), CATENINA, ALFA 1, CATEPSINA B, CATEPSINA D, CATEPSINA K, CATEPSINA L2, CATEPSINA O, CATEPSINA O1, CATEPSINA V, CD10, CD146, CD147, CD24, CD29, CD44, CD51, CD54, CD61,

CD66e, CD82, CD87, CD9, CEA, PROTEÍNA DE UNIÓN AL RETINOL CELULAR 1 (CRBP1), c-ERBB-2, CK7, CK8, CK18, CK19, CK20, CLAUDIN-7, c-MET, COLAGENASA, FIBROBLASTO,

COLAGENASA, INTERSTICIAL, COLLAGENASE-3, ANTÍGENO DE LA LEUCEMIA LINFOCÍTICA AGUDA COMÚN (CALLA), CONEXINA 26 (Cx26), CONEXINA 43 (Cx43), CORTACTINA, COX-2, CTLA-8, CTR, CTSD, CICLINA D1, CICLOOXIGENASA-2, CITOQUERATINA 18, CITOQUERATINA 19, CITOQUERATINA 8, SERINA ESTEARASA 8 ASOCIADA A LINFOCITOS T CITOTÓXICOS (CTLA-8), ACTIVIDAD DE INHIBICIÓN DE LA DIFERENCIACIÓN (DIA), ADN AMPLIFICADO EN CARCINOMA MAMARIO 1 (DAM 1), ADN TOPOISOMERASA II ALFA, DR-NM23, E-CADHERINA, EMMPRINA, EMS1, FACTOR DE CRECIMIENTO DE CÉLULAS ENDOTELÉTICAS (ECGR), DERIVADO DE PLACAS (PD-ECGR), ENCEFALINASA, RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDÉRMICO (EGFR), EPISIALINA, ANTIGENO DE LA MEMBRANA EPITELIAL (EMA), ER-ALFA, ERBB2, ERBB4, ER-BETA, ERF-1, ACTIVIDAD POTENCIADORA DE ERITROIDES (EPA), ESR1, RECEPTOR DE ESTRÓGENOS-ALFA, RECEPTOR DE ESTRÓGENOS-BETA, ETS-1, INDUCTOR DE METALOPROTEINASA DE LA MATRIZ EXTRACELULAR (EMMPRIN), RECEPTOR DE FIBRONECTINA, POLIPÉPTIDO BETA (FNRB), SUBUNIDAD BETA DEL RECEPTOR DE FIBRONECTINA (FNRB), FLK-1, GA15.3, GA733.2, GALECTINA-3, GAMMA-CATENINA, PROTEÍNA DE LA UNIÓN GAP (26 kDa), PROTEÍNA DE LA UNIÓN GAP (43 kDa), PROTEÍNA DE LA UNIÓN GAP ALFA-1 (GJA1), PROTEÍNA DE LA UNIÓN GAP BETA-2 (GJB2), GCP1, GELATINASA A, GELATINASA B, GELATINASA (72 kDa), GELATINASA (92 kDa), GLIOSTATINA, PROTEÍNA DE INTERACCCIÓN CON RECEPTOR DE GLUCOCORTICOIDE 1 (GRIP1), GLUTATIONA S-TRANSFERASA p, GM-CSF, GRANULOCITO PROTEÍNA QUIMIOTÁCTICA 1 (GCP1), FACTOR ESTIMULANTE DE COLONIAS DE GRANULOCITOS Y MACRÓFAGOS, RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO UNIDO 7 (GRB-7), GSTp, HAP, PROTEÍNA AFÍN DE CHOQUE TÉRMICO 70 (HSC70), ANTÍGENO ESTABLE AL CALOR, FACTOR DE CRECIMIENTO DE HEPATOCITOS (HGF), RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO DE HEPATOCITOS (HGFR), FACTOR ESTIMULANTE DE HEPATOCÍTOS III (HSF III), HER-2, HER2/NEU, ANTÍGENO HERMES, HET, HHM, HIPERCALCEMIA HUMORAL DE TUMOR MALIGNO (HHM), ICERE-1, I NT-1, MOLÉCULA-1 DE ADHESIÓN INTERCELULAR (ICAM-1), FACTOR INDUCTOR DEL INTERFERÓN-GAMMA (IGIF), INTERLEUCINA-1 ALFA (IL-1A), INTERLEUCINA-1 BETA (IL-1B), INTERLEUCINA-11 (IL-11), INTERLEUCINA-17 (IL-17), INTERLEUCINA-18 (IL-18), INTERLEUCINA-6 (IL-6), INTERLEUCINA-8 (IL-8), INVERSAMENTE PROPORCIONAL A LA EXPRESIÓN 1 DEL RECEPTOR DE ESTRÓGENOS (ICERE-1), KAI1, KDR, QUERATINA 8, QUERATINA 18, QUERATINA 19, KISS-1, FACTOR INHIBIDOR DE LA LEUCEMIA (LIF), LIF, PERDIDO EN CÁNCER DE MAMA INFLAMATORIO (LIBC), LOT ("PERDIDO EN LA TRANSFORMACIÓN"), RECEPTADOR DE ALOJAMIENTO DE LINFOCITOS, FACTOR ESTIMULANTE DE COLONIAS DE MACRÓFAGOS, MAGE-3, MAMMAGLOBINA, MASPINA, MC56, M-CSF, MDC, MDNCF, MDR, MOLÉCULA DE ADHESIÓN DE CELULAS DE MELANOMA (MCAM), METALOENDOPEPTIDASA DE LA MEMBRANA (MME), ENDOPEPTIDASA NEUTRA ASOCIADA A LA MEMBRANA (NEP), PROTEÍNA RICA EN CISTEÍNA (MDC), METASTASINA (MTS-1), MLN64, MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP9, MMP11, MMP13, MMP14, MMP15, MMP16, MMP17, MOESINA, ARGININA-SERPINA DE MONOCITOS, FACTOR QUIMIOTÁCTICO DE NEUTRÓFILOS DERIVADO DE MONOCITOS, INHIBIDOR DE ACTIVADOR DE PASMÓGENO DERIVADO DE MONOCITOS, MTS-1, MUC-1, MUC18, ANTÍGENO ASOCIADO AL CÁNCER DE TIPO MUCINA (MCA), MUCINA, MUC-1, PROTEÍNA 1 DE RESISTENCIA A MÚLTIPLES FÁRMACOS (MDR, MDR1), PROTEÍNA 1 RELACIONADA CON LA RESISTENCIA A MÚLTIPLES FÁRMACOS (MRP, MRP-1), N-CADHERINA, NEP, NEU, ENDOPEPTIDASA NEUTRA, PÉPTIDO ACTIVADOR DE NEUTRÓFILOS 1 (NAP1), NM23-H1, NM23-H2, NME1, NME2, COACTIVATOR 1 DEL RECEPTOR NUCLEAR (NCoA-1), COACTIVATOR 2 DEL RECEPTOR NUCLEAR (NCoA-2), COACTIVATOR 3 DEL RECEPTOR NUCLEAR (NCoA-3), NUCLEÓSIDO DIFOSFATO QUINASA A (NDPKA), NUCLEÓSIDO DIFOSFATO QUINASA B (NDPKB), ONCOSTATINA M (OSM), ORNITINA DESCARBOXILASA (ODC), FACTOR DE DIFERENCIACIÓN DE OSTEOCLASTOS (ODF), RECEPTOR DEL FACTOR DE DIFERENCIACIÓN DE OSTEOCLASTOS (ODER), OSTEONECTINA (OSN, ON), OSTEOPONTINA (OPN), RECEPTOR DE OXITOCINA (OXTR), p27/kipl, PROTEÍNA ASOCIADA CON EL COINTEGRADOR p300/CBP (p/CIP), p53, p9Ka, PAI-1, PAI-2, ADENOMATOSIS PARATIROIDEA 1 (PRAD1), HORMONA DE TIPO HORMONA PARATIROIDEA (PTHLH), PÉPTIDO RELACIONADO CON LA HORMONA PARATIROIDEA (PTHrP), P-CADERINA, PD-ECGF,

PDGF, MUCINA URINARIA REACTIVA CON EL CACAHUETE (PUM), P-GLICOPROTEÍNA (P-GP), PGP-1, PHGS-2, PHS-2, PIP, PLACOGLOBINA, INHIBIDOR DEL ACTIVADOR DE PLASMINÓGENO (TIPO 1), INHIBIDOR DEL ACTIVADOR DE PLASMINÓGENO (TIPO 2), ACTIVADOR DE PLASMINÓGENO (TIPO TISULAR), ACTIVADOR DE PLASMINÓGENO (TIPO UROQUNASA), GLICOPROTEÍNA DE PLAQUETAS Ilia (GPS A), PLAU, GEN DEL ADENOMA PLEOMÓRFICO DE TIPO 1 (PLAGL1), MUCINA EPITELIAL POLIMORFICA (PEM), PRAD1, RECEPTOR DE PROGESTERONA (PgR), RESISTENCIA A LA PROGESTERONA, PROSTAGLANDINA ENDOPERÓXIDO SINTASA-2, PROSTAGLANDINA G/H SINTASA-2, PROSTAGLANDINA H SINTASA-2, pS2, PS6K, PSORIASINA, PTHLH, PTHrP, RAD51, RAD52, RAD54, RAP46, COACTIVADOR 3 ASOCIADO AL RECEPTOR (RAC3), REPRESOR DE LA ACTIVIDAD DEL RECEPTOR DE ESTROGENOS (REA), S100A4, S100A6, S100A7, S6K, SART-1, FACTOR DE UNIÓN A ARMAZÓN B (SAF-B), FACTOR DE DISPERSIÓN (SF), FOSFO-PROTEÍNA-1 SECRETADA (SPP-1), PROTEÍNA SECRETADA, ÁCIDA Y RICO EN CISTEÍNA (SPARC), ESTANICALCINA, COACTIVADOR-1 DE RECEPTOR DE ESTEROIDES (SRC-1), COACTIVADOR-2 DE RECEPTOR DE ESTEROIDES (SRC-2), COACTIVADOR-3 DE RECEPTOR DE ESTEROIDES (SRC-3), ACTIVADOR DE ARN DE RECEPTOR DE ESTEROIDES (SRA), ESTROMELISINA-1, ESTROMELISINA-3, TENASCINA-C (TN-C), PROTEASA 50 ESPECÍFICA DEL TESTÍCULO, TROMBOSPONDINA I, TROMBOSPONDINA II, TIMIDINA FOSFORILASA (TP), MOLÉCULA 1 ACTIVADORA DEL RECEPTOR DE HORMONA TIROIDEA (TRAM-1), PROTEÍNA DE UNIÓN ESTRECHA 1 (TJP1), TIMP1, TIMP2, TIMP3, TIMP4, ACTIVADOR DE PLASMINÓGENO DE TIPO TISULAR, TN-C, TP53, tPA, FACTOR INTERMEDIARIO TRANSCRIPCIONAL 2 (TIF2), FACTOR TRÉBOL 1 (TFF1), TSG101, TSP-1, TSP1, TSP-2, TSP2, TSP50, FACTOR ESTIMULANTE DE COLAGENASA DE CÉLULAS TUMORALES (TCSF), MUCINA EPITELIAL ASOCIADA A TUMOR, uPA, uPAR, UROQUINASA, ACTIVADOR DE PLASMINÓGENO TIPO UROQUINASA, RECEPTOR DE ACTIVADOR DE PLASMINÓGENO TIPO UROQUINASA (uPAR), UVOMORULINA, FACTOR DE CRECIMIENTO VASCULAR ENDOTELIAL, RECEPTOR 2 DEL FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR (VEGFR2), FACTOR A DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR, FACTOR DE PERMEABILIDAD VASCULAR, VEGFR2, ANTÍGENO BETA DE LINFOCITOS T MUY TARDÍO (VLA-BETA), VIMENTINA, POLIPÉPTIDO RECEPTOR ALFA DE VITRONECTINA (VNRA), RECEPTOR DE VITRONECTINA, FACTOR DE VON WILLEBRAND, VPF, VWF, WNT-1, ZAC, ZO-1 y ZONULA OCCLUDENS-1.

Los productos génicos usados para el perfilado de expresión de IHC incluyen, sin limitación, uno o más de SPARC, PGP, Her2/neu, ER, PR, c-kit, AR, CD52, PDGFR, TOP2A, TS, ERCC1, RRM1, BCRP, TOPO1, PTEN, MGMT y MRP1. También se puede realizar el perfilado de IHC de EGFR. EHC también se usa para detectar o analizar distintos productos génicos, Incluyendo, sin limitación, uno o más de los siguientes: EGFR, SPARC, c-kit, ER, PR, Receptor de andrógenos, PGP, RRM1, TOPO1, BRCP1, MRP1, MGMT, PDGFR, DCK, ERCC1, Timidilato sintasa, Her2/neu o T0P02A. IHC se puede usar para detectar una o más de las siguientes proteínas, incluyendo, sin limitación: ADA, AR, ASNA, BCL2, BRCA2, CD33, CDW52, CES2, DNMT1, EGFR, ERBB2, ERCC3, ESR1, FOLR2, GART, GSTP1, HDAC1, HIF1A, HSPCA, IL2RA, KIT, MLH1, MS4A1, MASH2, NFKB2, NFKBIA, OGFR, PDGFC, PDGFRA, PDGFRB, PGR, POLA, PTEN, PTGS2, RAF1, RARA, RXRB, SPARC, SSTR1, TK1, TNF, TOPI, TOP2A, TOP2B, TXNRD1, TYMS, VDR, VEGF, VHL o ZAP70.

El perfilado de expresión de micromatriz se puede usar para medir simultáneamente la expresión de uno o más genes o productos génicos, incluyendo, sin limitación, ABCC1, ABCG2, ADA, AR, ASNS, BCL2, BIRC5, BRCA1, BRCA2, CD33, CD52, CDA, CES2, DCK, DHFR, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, ECGF1, EGFR, EPHA2, ERBB2, ERCC1, ERCC3, ESR1, FLT1, FOLR2, FYN, GART, GNRH1, GSTP1, HCK, HDAC1, HIF1A, HSP90AA1, IL2RA, HSP90AA1, KDR, KIT, LCK, LYN, MGMT, MLH1, MS4A1, MSH2, NFKB1, NFKB2, OGFR, PDGFC, PDGFRA, PDGFRB, PGR, POLA1, PTEN, PTGS2, RAF1, RARA, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRB, RXRG, SPARC, SRC, SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4, SSTR5, TK1, TNF, TOPI, TOP2A, TOP2B, TXNRD1, TYMS, VDR, VEGFA, VHL, YES1 y ZAP70. Los genes usados para el perfilado de expresión de micromatriz pueden comprender uno o más de: EGFR, SPARC, c-kit, ER, PR, Receptor de andrógenos, PGP, RRM1, TOPO1, BRCP1, MRP1, MGMT, PDGFR, DCK, ERCC1, Timidilato sintasa, Her2/neu, T0P02A, ADA, AR, ASNA, BCL2, BRCA2, CD33, CDW52, CES2, DNMT1, EGFR, ERBB2, ERCC3, ESR1, FOLR2, GART, GSTP1, HDAC1, HIF1A, HSPCA, IL2RA, KIT, MLH1, MS4A1, MASH2, NFKB2, NFKBIA, OGFR, PDGFC, PDGFRA, PDGFRB, PGR, POLA, PTEN, PTGS2, RAF1, RARA, RXRB, SPARC, SSTR1, TK1, TNF, TOPI, TOP2A, TOP2B, TXNRD1, TYMS, VDR, VEGF, VHL o ZAP70. El perfilado de expresión de micromatriz se puede realizar usando una micromatriz de baja densidad, una micromatriz de expresión, una micromatriz de hibridación genómica comparativa (CGH), una micromatriz de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), una matriz proteómica, una matriz de anticuerpos u otra matriz como se desvela en el presente documento o es conocida por los expertos en la materia. Se pueden usar matrices de expresión de alto rendimiento. Dichos sistemas incluyen, sin limitación, sistemas disponibles en el mercado de Agilent o Illumina, como se describe con más detalle en el presente documento.

El perfilado de mutaciones de FISH puede usarse para perfilar uno o más de EGFR y HER2. Se puede usar FISH para detectar o probar uno o más de los siguientes genes, incluyendo, pero sin limitación: EGFR, SPARC, c-kit, ER, PR, Receptor de andrógenos, PGP, RRM1, TOPO1, BRCP1, MRP1, Mg MT, PDGFR, DCK, ERCC1, Timidilato sintasa, HER2 o T0P02A. Se puede usar FISH para detectar o probar distintos biomarcadores, Incluyendo, sin limitación, uno o más de los siguientes: ADA, AR, ASNA, BCL2, BRCA2, CD33, CDW52, CES2, DNMT1, EGFR, ERBB2, ERCC3, ESR1, FOLR2, GART, GSTP1, HDAC1, HIF1A, HSPCA, IL2RA, KIT, MLH1, MS4A1, MASH2, NFKB2, NFKBIA, OGFR, PDGFC, PDGFRA, PDGFRB, PGR, POLA, PTEN, PTGS2, RAF1, RARA, RXRB, SPARC, SSTR1, TK1, TNF, TOPI, TOP2A, TOP2B, TXNRD1, TYMS, VDR, VEGF, VHL o ZAP70.

Los genes usados para el perfil de mutaciones de secuenciación comprenden uno o más de KRAS, BRAF, c-KIT y EGFR. El análisis de secuenciación también puede comprender la evaluación de mutaciones en uno o más de ABCC1, ABCG2, ADA, AR, ASNS, BCL2, BIRC5, BRCA1, BRCA2, CD33, CD52, CDA, CES2, DCK, DHFR, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, ECGF1, EGFR, EPHA2, ERBB2, ERCC1, ERCC3, ESR1, FLT1, FOLR2, FYN, GART, GNRH1, GSTP1, HCK, HDAC1, HIF1A, HSP90AA1, IL2RA, HSP90AA1, KDR, KIT, LCK, LYN, MGMT, MLH1, MS4A1, MSH2, NFKB1, NFKB2, OGFR, PDGFC, PDGFRA, PDGFRB, PGR, P0LA1, PTEN, PTGS2, RAF1, RARA, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRB, RXRG, SPARC, SRC, SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4, SSTR5, TK1, INF, TOPI, TOP2A, TOP2B, TXNRD1, TYMS, VDR, VEGFA, VHL, YES1 y ZAP70.

La invención proporciona un método para identificar un tratamiento candidato para un sujeto que lo necesita que comprende realizar una secuenciación de ADN en una muestra obtenida del sujeto para determinar un perfil de mutaciones de secuenciación en un grupo de genes que comprende KRAS, BRAF, c-KIT y EGFR. Por ejemplo, el método puede identificar un agente quimioterapéutico para un individuo con cáncer. El método puede comprender: obtener una muestra del sujeto; realizar un análisis de inmunohistoquímica (IHC) en la muestra para determinar un perfil de expresión de IHC en al menos cinco de: SPARC, PGP, Her2/neu, ER, PR, c-ldt, AR, CD52, PDGFR, TOP2A, TS, ERCC1, RRM1, BCRP, TOPO1, PTEN, MGMT y MRP1; realizar un análisis de micromatriz en la muestra para determinar un perfil de expresión de micromatriz en al menos cinco de ABCC1, ABCG2, ADA, AR, ASNS, BCL2, BIRC5, BRCA1, BRCA2, CD33, CD52, CDA, CES2, DCK, DHFR, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, ECGF1, EGFR, EPHA2, ERBB2, ERCC1, ERCC3, ESR1, FLT1, FOLR2, FYN, GART, GNRH1, GSTP1, HCK, HDAC1, HIF1A, HSP90AA1, IL2RA, HSP90AA1, KDR, KIT, LCK, LYN, MGMT, MLH1, MS4A1, MSH2, NFKB1, NFKB2, OGFR, PDGFC, PDGFRA, PDGFRB, PGR, POLA1, PTEN, PTGS2, RAF1, RARA, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRB, RXRG, SPARC, SRC, SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4, SSTR5, TK1, TNF, TOPI, TOP2A, TOP2B, TXNRD1, TYMS, VDR, VEGFA, VHL, YES1 y ZAP70; realizar un análisis de hibridación fluorescentein situ(FISH) en la muestra para determinar un perfil de mutaciones de FISH en al menos uno de EGFR y HER2; realizar la secuenciación de ADN en la muestra para determinar un perfil de mutaciones de secuenciación en al menos uno de KRAS, BRAF, c-KIT y EGFR; y comparar el perfil de expresión de IHC, el perfil de expresión de micromatriz, el perfil de mutaciones de FISH y el perfil de mutaciones de secuenciación con una base de datos de reglas, en donde la base de datos de reglas comprende un mapeo de tratamientos cuya actividad biológica es conocida contra células enfermas que: i) sobreexpresan o infraexpresan una o más proteínas incluidas en el perfil de expresión de IHC; ii) sobreexpresan o infraexpresan uno o más genes incluidos en el perfil de expresión de micromatriz; iii) tienen cero o más mutaciones en uno o más genes incluidos en el perfil de mutaciones de FISH; y/o iv) tienen cero o más mutaciones en uno o más genes incluidos en el perfil de mutaciones de secuenciación; e identificar el tratamiento si la comparación con la base de datos de reglas indica que el tratamiento debe tener actividad biológica contra la enfermedad; y la comparación con la base de datos de reglas no contraindica el tratamiento para tratar la enfermedad. La enfermedad puede ser un cáncer. Las etapas de perfilado molecular se pueden realizar en cualquier orden. En algunas divulgaciones, no se realizan todos las etapas de perfilado molecular. Como ejemplo no limitante, el análisis de micromatriz no se realiza si la calidad de la muestra no alcanza un valor umbral, como se describe en el presente documento. El perfilado de expresión de IHC se puede realizar en al menos el 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de los productos génicos anteriores. El perfilado de expresión de micromatriz se puede realizar en al menos el 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de los genes enumerados anteriormente.

La divulgación proporciona un método para identificar un tratamiento candidato para un sujeto que lo necesita mediante el uso de perfilado molecular de conjuntos definidos de biomarcadores conocidos. Por ejemplo, el método puede identificar un agente quimioterapéutico para un individuo con cáncer. El método comprende: obtener una muestra del sujeto, en donde la muestra comprende tejido embebido en parafina fijado con formalina (FFPE) o tejido recién congelado, y en donde la muestra comprende células cancerosas; realizar un análisis de inmunohistoquímica (IHC) en la muestra para determinar un perfil de expresión de IHC en al menos: SPARC, PGP, Her2/neu, ER, PR, c-kit, AR, CD52, PDGFR, TOP2A, TS, ERCC1, RRM1, BCRP, TOPO1, PTEN, MGMT y MRP1; realizar un análisis de micromatriz en la muestra para determinar un perfil de expresión de micromatriz en al menos: ABCC1, ABCG2, ADA, AR, ASNS, BCL2, BIRC5, BRCA1, BRCA2, CD33, CD52, CDA, CES2, DCK, DHFR, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, ECGF1, EGFR, EPHA2, ERBB2, ERCC1, ERCC3, ESR1, FLT1, FOLR2, FYN, GART, GNRH1, GSTP1, HCK, HDAC1, HIF1A, HSP90AA1, IL2RA, HSP90AA1, KDR, KIT, LCK, LYN, MGMT, MLH1, MS4A1, MSH2, NFKB1, NFKB2, OGFR, PDGFC, PDGFRA, PDGFRB, PGR, POLA1, PTEN, PTGS2, RAF1, RARA, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRB, RXRG, SPARC, SRC, SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4, SSTR5, TK1, TNF, TOPI, TOP2A, TOP2B, TXNRD1, TYMS, VDR, VEGFA, VHL, YES1 y ZAP70; realizar un análisis de hibridación fluorescentein situ(FISH) en la muestra para determinar un perfil de mutaciones de FISH en al menos EGFR y HER2; realizar la secuenciación de ADN en la muestra para determinar un perfil de mutaciones de secuenciación en al menos KRAS, BRAF, c-KIT y EGFR. El perfil de expresión de IHC, el perfil de expresión de micromatriz, el perfil de mutaciones de FISH y el perfil de mutaciones de secuenciación se comparan con una base de datos de reglas, en donde la base de datos de reglas comprende un mapeo de tratamientos cuya actividad biológica es conocida contra las células enfermas que: i) sobreexpresan o infraexpresan una o más proteínas incluidas en el perfil de expresión de IHC; ii) sobreexpresan o infraexpresan uno o más genes incluidos en el perfil de expresión de micromatriz; iii) tienen cero o más mutaciones en uno o más genes incluidos en el perfil de mutaciones de FISH; o iv) tienen cero o más mutaciones en uno o más genes incluidos en el perfil de mutaciones de secuenciación; e identificar el tratamiento si la comparación con la base de datos de reglas indica que el tratamiento debe tener actividad biológica contra la enfermedad; y la comparación con la base de datos de reglas no contraindica el tratamiento para tratar la enfermedad. La enfermedad puede ser un cáncer. Las etapas de perfilado molecular se pueden realizar en cualquier orden. En algunas divulgaciones, no se realizan todos las etapas de perfilado molecular. Como ejemplo no limitante, el análisis de micromatriz no se realiza si la calidad de la muestra no alcanza un valor umbral, como se describe en el presente documento. El material biológico puede ser ARNm, y la prueba de control de calidad comprende una proporción de A260/A280 y/o un valor Ct de RT-PCR usando un gen constitutivo, por ejemplo, RPL13a. El ARNm puede no pasar la prueba de control de calidad si la proporción de A260/A280 < 1,5 o el valor Ct de RPL13a es > 30. En ese caso, el análisis de micromatriz puede no realizarse. Como alternativa, los resultados de la micromatriz pueden atenuarse, por ejemplo, dándoles una prioridad más baja en comparación con los resultados de otras técnicas de perfilado molecular.

El perfilado molecular siempre se puede realizar en ciertos genes o productos génicos, mientras que el perfilado de otros genes o productos génicos es opcional. Por ejemplo, el perfilado de expresión de IHC se puede realizar al menos en SPARC, TOP2A y/o PTEN. De forma similar, el perfilado de expresión de micromatriz se puede realizar en al menos CD52. En otras realizaciones, los genes, además de los enumerados anteriormente, se usan para identificar un tratamiento. Por ejemplo, el grupo de genes usados para el perfilado de expresión de IHC puede comprender además DCK, EGFR, BRCA1, CK 14, CK 17, CK 5/6, E-Cadherina, p95, PARP-1, SPARC y TLE3. El grupo de genes usados para el perfilado de expresión de IHC puede comprender además Cox-2 y/o Ki-67. HSPCA se puede analizar mediante análisis de micromatriz. La mutación de FISH se realiza en c-Myc y TOP2A. En algunas realizaciones, la secuenciación se realiza en PI3K.

Los métodos de la invención pueden usarse en cualquier entorno en donde la expresión diferencial o el análisis de mutaciones se hayan relacionado con la eficacia de distintos tratamientos. Los métodos se usan para identificar tratamientos candidatos para un sujeto que tiene un cáncer. En estas condiciones, la muestra usada para el perfilado molecular comprende preferentemente células cancerosas. El porcentaje de cáncer de una muestra se puede determinar mediante métodos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, usando técnicas de patología. Las células cancerosas también pueden enriquecerse a partir de una muestra, por ejemplo, usando técnicas de microdisección o similares. Es posible que sea necesario que una muestra tenga un cierto umbral de células cancerosas antes de usarse para el perfilado molecular. El umbral puede ser de al menos aproximadamente el 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 95 % de células cancerosas. El umbral puede depender del método de análisis. Por ejemplo, una técnica que revela la expresión en células individuales puede requerir un umbral más bajo que una técnica que use una muestra extraída de una mezcla de diferentes células. En algunas realizaciones, la muestra enferma se compara con una muestra normal tomada del mismo paciente, por ejemplo, tejido adyacente, pero no canceroso.

Selección del tratamiento

Los sistemas y métodos se pueden usar para seleccionar cualquier tratamiento cuya eficacia proyectada se pueda vincular a los resultados del perfilado molecular. La divulgación comprende el uso de resultados de perfilado moleculares para sugerir asociaciones con respuestas al tratamiento. Los biomarcadores apropiados para el perfilado molecular se pueden seleccionar en función del tipo de tumor de los sujetos. Estos biomarcadores sugeridos se pueden usar para modificar una lista predeterminada de biomarcadores. En otras realizaciones, el perfilado molecular es independiente del material fuente. En algunas realizaciones, se usan reglas para proporcionar los tratamientos de quimioterapia sugeridos basados en los resultados de la prueba de perfilado molecular. En una realización, las reglas se generan a partir de sumarios de la literatura en materia de oncología clínica revisada por pares. Se pueden usar reglas de opinión de expertos, pero son opcionales. En una realización, las citas clínicas se evalúan por su relevancia para los métodos de la invención usando una jerarquía derivada del sistema de clasificación de evidencias usado por el Grupo de T rabajo de Servicios Preventivos de Estados Unidos. La "mejor evidencia" se puede usar como base para una regla. Las reglas más simples se construyen en el formato de "si el biomarcador es positivo, entonces la opción de tratamiento uno, de lo contrario, la opción de tratamiento dos". Las opciones de tratamiento comprenden ningún tratamiento con un fármaco específico, tratamiento con un fármaco específico o tratamiento con una combinación de fármacos. En algunas realizaciones, se construyen reglas más complejas que implican la interacción de dos o más biomarcadores. En estos casos, las interacciones más complejas normalmente están respaldadas por estudios clínicos que analizan la interacción entre los biomarcadores incluidos en la regla. Finalmente, se puede generar un informe que describa la asociación de la respuesta a la quimioterapia y el biomarcador y una declaración resumida de la mejor evidencia que respalde los tratamientos seleccionados. En última instancia, el médico tratante decidirá el mejor curso de tratamiento.

Como ejemplo no limitante, el perfilado molecular podría revelar que el gen EGFR está amplificado o sobreexpresado, lo que indicaría la selección de un tratamiento que podría bloquear la actividad de EGFR, tal como los inhibidores de anticuerpos monoclonales cetuximab y panitumumab, o inhibidores de quinasas de molécula pequeña eficaces en pacientes con mutaciones activadoras en EGFR tales como gefitinib, erlotinib y lapatinib. Otros anticuerpos monoclonales anti-EGFR en desarrollo clínico incluyen zalutumumab, nimotuzumab y matuzumab. El tratamiento candidato seleccionado puede depender de la configuración desvelada por el perfilado molecular. Por ejemplo, los inhibidores de quinasas que se suelen prescribir con EGFR han resultado tener mutaciones activadoras. Continuando con la realización de ejemplo, el perfilado molecular también puede revelar que algunos o todos estos tratamientos probablemente sean menos eficaces. Por ejemplo, los pacientes que toman gefitinib o erlotinib finalmente desarrollan mutaciones de resistencia a fármacos en EGFR. Por consiguiente, la presencia de una mutación de resistencia a los fármacos contraindicaría la selección de los inhibidores de la quinasa de molécula pequeña. Un experto apreciará que este ejemplo se puede ampliar para guiar la selección de otros tratamientos candidatos que actúan contra genes o productos génicos cuya expresión diferencial se desvela mediante el perfilado molecular. De forma similar, los agentes candidatos que se sabe que son eficaces contra las células enfermas que portan ciertas variantes de ácido nucleico pueden seleccionarse si el perfilado molecular desvela dichas variantes.

Las terapias contra el cáncer que pueden identificarse como tratamientos candidatos mediante los métodos de la invención incluyen, sin limitación: ácido 13-cis-retinoico, 2-CdA, 2-clorodeoxiadenosina, 5-azacitidina, 5-fluorouracilo, 5-FU, 6-mercaptopurina, 6-MP, 6-TG, 6-tioguanina, Abraxane, Accutane®, Actinomicina-D, Adriamycin®, Adrucil®, Afinitor®, Agrylin®, Ala-Cort®, aldesleukina, Alemtuzumab, ALIMTA, alitretinoina, Alkaban-AQ®, Alkeran®, ácido retinoico todo trans, interferón alfa, Altretamina, Ametopterina, Amifostina, Aminoglutetimida, Anagrelida, Anandron®, Anastrozol, Arabinosilcitosina, Ara-C,

Aranesp®, Aredia®, Arimidex®, Aromasin®, Arranon®, trióxido de arsénico, asparaginasa, ATRA, Avastin®, azacitidina, BCG, BCNU, bendamustina, Bevacizumab, Bexaroteno, BEXXAR®, Bicalutamida, BiCNU, Blenoxane®, Bleomicina, Bortezomib, Busulfán, Busulfex®, C225, leucovorina calcio, Campath®, Camptosar®, Camptotecina-11, capecitabina, Carac™, Carboplatino, Carmustina, Carmustine Wafer, Casodex®, CC-5013, CCI-779, c Cn U, CDDP, CeeNU, Cerubidine®, Cetuximab, Clorambucilo, Cisplatino, Factor citrovomm, cladribina, Cortisona, Cosmegen®, CPT-11, Ciclofosfamida, Cytadren®, Citarabina, Citarabina liposomal, Cytosar-U®, Cytoxan®, Dacarbazina, Dacogen, Dactinomicina, Darbepoyetina Alfa, Dasatinib, DaunomIcina Daunorrubicina, Clorhidrato de danurrobicina, Daunorubicin Liposomal,

DaunoXome®, Decadron, decitabina, Delta-Cortef®, Deltasone®, Denileukin, Diftitox, DepoCyt™, Dexametasona, Acetato de dexametasona, Fosfato sódico de dexametasona, Dexasona, Dexrazoxano, DHAD, DIC, Diodex Docetaxel, Doxil®, Doxorrubicina, Doxorrubicina liposomal, Droxia™, DTIC, DTIC-Dome®, Duralone®, Efudex®, Eligard™, Ellence™, Eloxatin™, Elspar®, Emcyt®, Epirrubicina, Epoyetina Alfa, Erbitux, Erlotinib, Erwinia L-asparaginasa, Estramustina, Ethyol Etopophos®, Etopósido, Etopósito fosfato, Eulexin®, Everolimus, Evista®, Exemestano, Fareston®, Faslodex®, Femara®, filgrastim, Floxuridina, Fludara®, Fludarabina, Fluoroplex®, fluorouracilo, Fluorouracilo (crema), Fluoximasterona, Flutamida, ácido folínico, FUDR®, Fulvestrant, G-CSF, Gefitinib, Gemcitabina, Gemtuzumab ozogamicina, Gemzar, Gleevec™, Gliadel® Wafer, GM-CSF, Goserelina, factor estimulador de colonias de granulocitos, factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos, Halotestin®, Herceptin®, Hexadrol, Hexalen®, Hexametilmelamina, HMM, Hycamtin®, Hydrea®, Hydrocort Acetate®, Hidrocortisona, Hidrocortisona fosfato de sodio, Hidrocortisona succinato de sodio, Hidrocortisona fosfato, Hidroxiurea, Ibritumomab, Ibritumomab, Tiuxetan, Idamycin®, Idarrubicina, Ifex®, IFN-alfa, Ifosfamida, IL-11, IL-2, Imatinib mesilato, Imidazol Carboxamida, Interferón alfa. Interferón Alfa-2b (conjugado con PEG), Interleucina-2, Interleucina-11, Intron A® (interferón alfa-2b), Iressa®, Irinotecán, Isotretinoína, Ixabepilona, Ixempra™, Kidrolase (t), Lanacort®, Lapatinib, L-asparaginasa, LCR, Lenalidomida, Letrozol, leucovorina, Leukeran, Leukine™, Leuprolida, Leurocristina, Leustatin™, Liposomal Ara-C Liquid Pred®, Lomustina, L-PAM, L-Sarcolisina, Lupron®, Lupron Depot®, Matulane®, Maxidex, mecloretamina, Mecloretamina clorhidrato, Medralone®, Medrol®, Megace®, Megestrol, Megestrol Acetato, Melfalán, mercaptopurina, Mesna, Mesnex™, Metotrexato, Metotrexato sodio, Metilprednisolona, Meticorten®, Mitomicina, Mitomicina-C, Mitoxantrona, M-Prednisol®, MTC, MTX, Mustargen®, Mustina, Mutamycin®, Myleran®, Mylocel™, Mylotarg®, Navelbine®, Nelarabina, Neosar®, Neulasta™, Neumega®, Neupogen®, Nexavar®, Nilandron®, Nilutamida, Nipent®, Mostaza nitrogenada, Novaldex®, Novantrone®, Octreotida, Octreotida acetato, Oncospar®, Oncovin®, Ontak®, Onxal™, Oprevelkin, Orapred®, Orasone®, Oxaliplatino, Paclitaxel, Paclitaxel unido a proteína, Pamidronato, Panitumumab, Panretin®, Paraplatin®, Pediapred®, Interferón pegilado, pegaspargasa, Pegfilgrastim, PEG-INTRON™, PEG-L-asparaginasa, PEMETREXED, pentostatina, mostaza de fenilalanina, Platinol®, Platinol-AQ®, Prednisolona, Prednisona, Prelone®, Procarbazina, PROCRIT®, Proleukin®, Prolifeprospan 20 conimplante de carmustina, Purinethol®, Raloxifeno, Revlimid®, Rheumatrex®, Rituxan®, Rituximab, Roferon-A® (Interferón Alfa-2a), Rubex®, Rubidomicina clorhidrato, Sandostatin®, Sandostatin LAR®, sargramostim, Solu-Cortef®, Solu-Medrol®, sorafenib, SPRYCEL™, STI-571, Estreptozocina, SU11248, Sunitinib, Sutent®, Tamoxifeno, Tarceva®, Targretin®, Taxol®, Taxotere®, Temodar®, Temozolomida, Temsirolimus, Tenipósido, TESPA, Talidomida, Thalomid®, TheraCys®, Tioguanina, Thioguanine Tabloid®, Tiofosfoamida, Thioplex®, Tiotepa, TICE®, Toposar®, topotecán, Toremifeno, Torisel®, Tositumomab, Trastuzumab, Treanda®, Tretinoína, Trexall™, Trisenox®, TSPA, t Yk ERB®, VCR, Vectibix™, Velban®, Velcade®, VePesid®, Vesanoid®, Viadur™, Vidaza®, Vinblastina, Vinblastina sulfato, Vincasar Pfs®, vincristina, Vinorelbina, vinorelbina tartrato, VLB, VM-26, vorinostat, VP-16, Vumon®, Xeloda®, Zanosar®, Zevalin™, Zinecard®, Zoladex®, ácido zolendrónico, Zolinza, Zometa® y combinaciones de cualquiera de los mismos.

En algunas realizaciones, se crea una base de datos que mapea tratamientos y resultados de perfilados moleculares. La información del tratamiento puede incluir la eficacia proyectada de un agente terapéutico contra células que tienen ciertos atributos que pueden medirse mediante el perfilado molecular. El perfilado molecular puede incluir la expresión diferencial o mutaciones en ciertos genes, proteínas u otras moléculas biológicas de interés. A través del mapeo, se pueden comparar los resultados del perfilado molecular con la base de datos para seleccionar tratamientos. La base de datos puede incluir mapeos tanto positivos como negativos entre los tratamientos y los resultados de los perfilados moleculares. En algunas realizaciones, el mapeo se crea mediante la revisión de la bibliografía en busca de vínculos entre agentes biológicos y agentes terapéuticos. Por ejemplo, se puede revisar, en busca de posibles mapeos, un artículo de revista, una publicación de patente o publicación de solicitud de patente, una presentación científica, etc. El mapeo puede incluir resultadosin vivo,por ejemplo, estudios en animales o ensayos clínicos, o experimentosin vitro,por ejemplo, cultivo celular. Se puede introducir cualquier mapeo que se encuentre en la base de datos, por ejemplo, los efectos citotóxicos de un agente terapéutico contra las células que expresan un gen o una proteína. De esta manera, la base de datos se puede actualizar continuamente. Se apreciará que los métodos de la invención también se actualizan.

Las reglas para los mapeos pueden contener una variedad de información complementaria. En algunas realizaciones, la base de datos contiene criterios de priorización. Por ejemplo, se puede preferir un tratamiento con más eficacia proyectada en un entorno dado que un tratamiento con menor eficacia proyectada. Un mapeo derivado de un determinado entorno, por ejemplo, un ensayo clínico, puede tener prioridad frente a un mapeo derivado de otro entorno, por ejemplo, experimentos de cultivo celular. Se puede priorizar un tratamiento con un potente respaldo bibliográfico frente a un tratamiento respaldado por resultados más preliminares. Un tratamiento aplicado, en general, al tipo de enfermedad en cuestión, por ejemplo, cáncer de un determinado origen tisular, puede tener prioridad frente a un tratamiento que no esté indicado para esa enfermedad en particular. Los mapeos pueden incluir correlaciones positivas y negativas entre un tratamiento y un resultado de perfilado molecular. En un ejemplo no limitante, un mapeo podría sugerir el uso de un inhibidor de la quinasa como erlotinib contra un tumor que tenga una mutación activadora en EGFR, mientras que otro mapeo podría sugerir algo en contra de ese tratamiento si el EGFR también tuviera una mutación de resistencia a los fármacos. De forma similar, un tratamiento podría estar indicado como eficaz en células que sobreexpresen un determinado gen o proteína, pero indicado como no eficaz si el gen o la proteína están infraexpresados.

La selección de un tratamiento candidato para un individuo puede basarse en los resultados de perfilado molecular de uno cualquiera o más de los métodos descritos. Como alternativa, la selección de un tratamiento candidato para un individuo puede basarse en los resultados de perfilado molecular de más de uno de los métodos descritos. Por ejemplo, la selección del tratamiento para un individuo puede basarse en los resultados del perfilado molecular de FISH solo, IHC sola o análisis de micromatriz solo. La selección del tratamiento para un individuo puede basarse en los resultados del perfilado molecular de IHC, FISH y análisis de micromatriz; IHC y FISH; IHC y análisis de micromatriz, o FISH y análisis de micromatriz. La selección del tratamiento para un individuo también puede basarse en los resultados del perfilado molecular de secuenciación u otros métodos de detección de mutaciones. Los resultados del perfilado molecular pueden incluir análisis de mutación junto con uno o más métodos, tales como IHC, inmunoensayo y/o análisis de micromatriz. Se pueden usar diferentes combinaciones y resultados secuenciales. Por ejemplo, el tratamiento se puede priorizar de acuerdo con los resultados obtenidos mediante el perfilado molecular. La priorización se puede basar en el siguiente algoritmo: 1) IHC/FISH y micromatriz indican la misma diana como una primera prioridad; 2) resultado positivo de IHC solo como la siguiente prioridad; o 3) resultado positivo de micromatriz solo como la última prioridad. La secuenciación también se puede usar para guiar la selección. En algunas realizaciones, la secuenciación revela una mutación de resistencia al fármaco de modo que el fármaco afectado no se selecciona ni siquiera aunque las técnicas que incluyen IHC, micromatriz y/o FISH indique una expresión diferencial de la molécula diana. Cualquiera de dichas contraindicaciones, por ejemplo, la expresión diferencial o la mutación de otro gen o producto génico pueden anular la selección de un tratamiento.

En la Tabla 1, se presenta un listado de ejemplo de los resultados de expresión de micromatriz frente a los tratamientos predichos. El perfilado molecular se realiza para determinar si un gen o producto génico se expresa diferencialmente en una muestra en comparación con un control. El control puede ser cualquier control apropiado para el entorno, incluido, sin limitación, el nivel de expresión de un gen de control, tal como un gen constitutivo, la expresión del mismo gen en tejido sano del mismo o de otros individuos, una medida estadística, un nivel de detección, etc. Un experto apreciará que los resultados de cualquier técnica de perfilado molecular aplicable, por ejemplo, análisis de micromatriz de PCR, Q-PCR, RT-PCR, inmunoensayo, SAGE, IHC, FISH o secuenciación, pueden usarse para determinar el estado de expresión. El estado de expresión del gen o producto génico se usa para seleccionar agentes que se predice que son eficaces o no. Por ejemplo, la Tabla 1 muestra que la sobreexpresión del gen o la proteína ADA apunta a la pentostatina como un posible tratamiento. Por otro lado, la infraexpresión del gen o la proteína ADA implica resistencia a la citarabina, lo que sugiere que la citarabina no es un tratamiento óptimo.

TABLA 1: R l l rfil m l l r r mi n r i h

(continuación)

(continuación)

LaTabla 2presenta un sumario de reglas más exhaustivo para la selección del tratamiento. Para cada biomarcador de la tabla, se muestran un tipo de ensayo y los resultados del ensayo. Un sumario de la eficacia de distintos agentes terapéuticos dados los resultados del ensayo puede derivarse de la bibliografía médica u otra base de conocimiento médico. Los resultados se pueden usar para guiar la selección de determinados agentes terapéuticos según lo recomendado o no. En algunas realizaciones, la tabla se actualiza de manera continua a medida que se va disponiendo de nuevos informes de la bibliografía y tratamientos. De esta manera, el perfilado molecular de la invención evolucionará y mejorará con el tiempo. Las reglas de la Tabla 2 se pueden almacenar en una base de datos. Cuando se obtienen resultados de perfilado molecular, por ejemplo, expresión diferencial, o mutación de un gen o producto génico, los resultados se pueden comparar con la base de datos para guiar la selección del tratamiento. El conjunto de reglas de la base de datos se puede actualizar a medida que se vaya disponiendo de nuevos tratamientos y nuevos datos de tratamiento. En algunas realizaciones, la base de datos de reglas se actualiza de manera continua. En algunas realizaciones, la base de datos de reglas se actualiza periódicamente. La base de datos de reglas se puede actualizar al menos cada 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 10 días, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mes, 6 semanas, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 1 año, 18 meses, 2 años o al menos cada 3 años. Cualquier enfoque correlativo o comparativo relevante se puede usar para comparar los resultados del perfilado molecular con la base de datos de reglas. En una realización, un gen o producto génico se identifica como expresado diferencialmente mediante perfilado molecular. Se consulta la base de datos de reglas para seleccionar entradas para ese gen o producto génico. La información de selección del tratamiento seleccionado de la base de datos de reglas se extrae y se usa para seleccionar un tratamiento. La información, por ejemplo, para recomendar o no recomendar un tratamiento en particular, puede depender de si el gen o el producto génico está sobreexpresado o infraexpresado. En algunos casos, se pueden extraer múltiples reglas y tratamientos de la base de datos dependiendo de los resultados del perfilado molecular. En algunas realizaciones, las opciones de tratamiento se priorizan en una lista para presentarlas a un usuario final. En algunas realizaciones, las opciones de tratamiento se presentan sin información de priorización. En cualquier caso, un individuo, por ejemplo, el médico tratante o un cuidador similar, puede escoger entre las opciones disponibles.

Los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para prolongar la supervivencia de un sujeto al proporcionar opciones de tratamiento personalizadas. En algunas realizaciones, el sujeto ha sido tratado previamente con uno o más agentes terapéuticos para tratar la enfermedad, por ejemplo, un cáncer. El cáncer puede ser refractario a uno de estos agentes, por ejemplo, al adquirir mutaciones de resistencia a fármacos. En algunas realizaciones, el cáncer es metastásico. En algunas realizaciones, el sujeto no ha sido tratado previamente con uno o más agentes terapéuticos identificados por el método. Usando el perfilado molecular, los tratamientos candidatos se pueden seleccionar independientemente de la fase, la ubicación anatómica o el origen anatómico de las células cancerosas.

La supervivencia libre de progresión (SLP) denota las posibilidades de mantenerse libre de progresión de la enfermedad para un individuo o un grupo de individuos que padecen una enfermedad, por ejemplo, un cáncer, después de iniciar un curso de tratamiento. Puede referirse al porcentaje de individuos de un grupo cuya enfermedad es probable que se mantenga estable (por ejemplo, que no muestre signos de progresión) después de un período de tiempo específico. Las tasas de supervivencia libre de progresión son una indicación de la eficacia de un tratamiento particular. De forma similar, la supervivencia libre de enfermedad (SLE) denota las posibilidades de mantenerse libre de la enfermedad después de iniciar un determinado tratamiento para un individuo o un grupo de individuos que padecen un cáncer. Puede referirse al porcentaje de individuos de un grupo que probablemente no tengan la enfermedad después de un período de tiempo específico. Las tasas de supervivencia libre de enfermedad son una indicación de la eficacia de un tratamiento particular. Las estrategias de tratamiento se pueden comparar basándose en la SLP o SLE que se logra en grupos similares de pacientes. La supervivencia libre de enfermedad se suele usar con el término supervivencia global cuando se describe la supervivencia al cáncer.

El tratamiento candidato seleccionado mediante perfilado molecular de acuerdo con la invención puede compararse con un tratamiento seleccionado mediante perfilado no molecular comparando la supervivencia libre de progresión (SLP) usando la terapia seleccionada mediante perfilado molecular (período B) con la SLP para la terapia más reciente en la que el paciente acaba de progresar (período A). Véase laFIG. 32. En un entorno, se usó una proporción de SLP (B)/SLP (A) > 1,3 para indicar que la terapia seleccionada mediante perfilado molecular proporciona beneficios para el paciente (Robert Temple, "Clinical measurement in drug evaluation". Editado por Wu Ningano y G. T. Thicker John Wiley and Sons Ltd. 1995;VonHoff, D. D.Clin Can Res.4: 1079, 1999; Dhaniet al. Clin Cáncer Res.15: 118-123, 2009). Otros métodos para comparar el tratamiento seleccionado mediante perfilado molecular con un tratamiento seleccionado sin perfilado molecular incluyen determinar la tasa de respuesta (RECIST) y el porcentaje de pacientes sin progresión o fallecidos a los 4 meses. El término "aproximadamente", como se usa en el contexto de un valor numérico para la SLP, significa una variación de /- el diez por ciento (10 %) en relación con el valor numérico. La SLP de un tratamiento seleccionado mediante perfilado molecular se puede prolongar al menos un 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o al menos un 90 % en comparación con un tratamiento no seleccionado mediante perfilado molecular. En algunas realizaciones, la SLP de un tratamiento seleccionado mediante perfilado molecular puede prolongarse al menos en un 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %, 900 % o al menos aproximadamente un 1000 % en comparación con un tratamiento no seleccionado mediante perfilado molecular. En otras realizaciones más, la proporción de SLP (SLP con terapia seleccionada mediante perfilado molecular o nuevo tratamiento/SLP con terapia o tratamiento previo) es de al menos aproximadamente 1,3. En otras realizaciones más, la proporción de SLP es de al menos aproximadamente 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1.8, 1,9 o 2,0. En otras realizaciones más, la proporción de SLP es de al menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.

De forma similar, se puede comparar la SLE en pacientes cuyo tratamiento se selecciona con o sin perfilado molecular. En realizaciones, La SLE de un tratamiento seleccionado mediante perfilado molecular se prolonga al menos un 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o al menos un 90 % en comparación con un tratamiento no seleccionado mediante perfilado molecular. En algunas realizaciones, la SLE de un tratamiento seleccionado mediante perfilado molecular puede prolongarse al menos en un 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %, 900 % o al menos aproximadamente un 1000 % en comparación con un tratamiento no seleccionado mediante perfilado molecular. En otras realizaciones más, la proporción de SLE (SLE con terapia seleccionada mediante perfilado molecular o nuevo tratamiento/SLE con terapia o tratamiento previo) es de al menos aproximadamente 1,3. En otras realizaciones más, la proporción de SLE es de al menos aproximadamente 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1.8, 1,9 o 2,0. En otras realizaciones más, la proporción de SLE es de al menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.

En algunas realizaciones, el tratamiento candidato de la invención no aumentará la proporción de SLP o la proporción de SLE en el paciente, sin embargo, el perfilado molecular proporciona un beneficio incalculable para el paciente. Por ejemplo, en algunos casos, no se ha identificado un tratamiento preferible para el paciente. En dichos casos, el perfilado molecular proporciona un método para identificar un tratamiento candidato donde actualmente no se ha identificado ninguno. El perfilado molecular puede prolongar la SLP, la SLE o la esperanza de vida al menos 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mes, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 2 meses, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 13 meses, 14 meses, 15 meses, 16 meses, 17 meses, 18 meses, 19 meses, 20 meses, 21 meses, 22 meses, 23 meses, 24 meses o 2 años. El perfilado molecular puede prolongar la SLP, la SLE o la esperanza de vida al menos 2 años y medio, 3 años, 4 años, 5 años o más. En algunas realizaciones, los métodos de la invención mejoran el resultado de manera que el paciente se encuentra en remisión.

La eficacia de un tratamiento puede ser controlada por otras medidas. Una respuesta completa (RC) comprende una desaparición completa de la enfermedad: no hay enfermedad evidente en el examen, exploraciones u otras pruebas. Una respuesta parcial (RP) se refiere a que queda algo de enfermedad en el cuerpo, pero que ha habido una disminución en el tamaño o el número de lesiones en un 30 % o más. La enfermedad estable (EE) se refiere a una enfermedad que se ha mantenido relativamente sin cambios de tamaño y número de lesiones. En general, una disminución inferior al 50 % o un ligero aumento en el tamaño se describiría como enfermedad estable. La enfermedad progresiva (EP) significa que la enfermedad ha aumentado de tamaño o número con el tratamiento. En algunas realizaciones, el perfilado molecular de acuerdo con la invención produce una respuesta completa o una respuesta parcial. En algunas realizaciones, los métodos de la invención producen una enfermedad estable. En algunas realizaciones, la invención es capaz de lograr una enfermedad estable donde el perfilado no molecular produce una enfermedad progresiva.

Sistemas informáticos

Las redes de datos convencionales, el desarrollo de aplicaciones y otros aspectos funcionales de los sistemas (y componentes de los componentes operativos individuales de los sistemas) pueden no describirse en detalle en el presente documento. Además, las líneas de conexión mostradas en las distintas figuras contenidas en el presente documento pretenden representar relaciones funcionales y/o acoplamientos físicos de ejemplo entre los distintos elementos. Cabe señalar que muchas relaciones funcionales alternativas o adicionales o conexiones físicas pueden estar presentes en un sistema en la práctica.

Los distintos componentes del sistema analizados en el presente documento pueden incluir uno o más de los siguientes: un servidor host u otros sistemas informáticos que incluyen un procesador para procesar datos digitales; una memoria acoplada al procesador para almacenar datos digitales; un digitalizador de entrada acoplado al procesador para introducir datos digitales; un programa de aplicación almacenado en la memoria y accesible por el procesador para dirigir el procesamiento de datos digitales por el procesador; un dispositivo de visualización acoplado al procesador y la memoria para mostrar información derivada de datos digitales procesados por el procesador; y una pluralidad de bases de datos. Las distintas bases de datos usadas en el presente documento pueden incluir: datos de pacientes, tales como antecedentes familiares, demografía y datos ambientales, datos de muestras biológicas, datos de protocolos y tratamientos previos, datos clínicos de pacientes, datos de perfilado molecular de muestras biológicas, datos sobre fármacos terapéuticos y/o fármacos en investigación, una genoteca, una biblioteca de enfermedades, una biblioteca de fármacos, datos de rastreo de pacientes, datos de gestión de archivos, datos de gestión financiera, datos de facturación y/o datos similares útiles en el funcionamiento del sistema. Como apreciarán los expertos en la materia, el ordenador del usuario puede incluir un sistema operativo (por ejemplo, Windows NT, 95/98/2000, OS2, UNIX, Linux, Solaris, MacOS, así como distintos software y controladores de soporte convencionales normalmente asociados con los ordenadores. El ordenador puede incluir cualquier ordenador personal, ordenador de red, estación de trabajo, miniordenador, mainframe o similar. El ordenador del usuario puede estar en un hogar o en un entorno médico/comercial con acceso a una red. En una realización de ejemplo, el acceso es a través de una red o Internet a través de un paquete de software de navegador web disponible en el mercado.

Como se usa en el presente documento, el término "red" incluirá cualquier medio de comunicación electrónico que incorpore tanto componentes de hardware y de software. La comunicación entre las partes se puede lograr a través de cualquier canal de comunicación adecuado, tal como, por ejemplo, una red telefónica, una extranet, una intranet, Internet, un dispositivo de punto de interacción, un asistente digital personal (por ejemplo, Palm Pilot®, Blackberry®), teléfonos móviles, quiosco, etc.), comunicaciones en línea, comunicaciones por satélite, comunicaciones fuera de línea, comunicaciones inalámbricas, comunicaciones por transpondedor, red de área local (LAN,Local Area Network),red de área amplia (WAN,Wide Area Network),dispositivos en red o vinculados, teclado, ratón y/o cualquier comunicación o modalidad de entrada de datos adecuada. Además, aunque el sistema se describe con frecuencia en el presente documento como implementado con protocolos de comunicaciones TCP/IP, el sistema también se puede implementar usando IPX, Appletalk, IP-6, NetBIOS, OSI o cualquier número de protocolos existentes o futuros. Si la red tiene la naturaleza de una red pública, tal como Internet, puede ser ventajoso suponer que la red es insegura y que está abierta a los espías. La información específica relacionada con los protocolos, estándares y software de aplicaciones utilizados en conexión con Internet es conocida en general por los expertos en la materia y, como tal, no necesita ser detallada en el presente documento. Véanse, por ejemplo, DILIP NAIK, "INTERNET STa NdARDS AND PROTOCOLS" (1998); JAVA 2 COMPLETE, distintos autores, (Sybex 1999); DEBORAH RAY Y ERIC RAY, "MASTERING HTML 4.0" (1997); y LOSHIN, "TCP/IP CLEARLY EXPLAINED" (1997) y DAVID GOURLEY Y BRIAN TOTTY, "HTTP, THE DEFINITIVE GUIDE" (2002).

Los distintos componentes del sistema se pueden acoplar de manera independiente, separada o colectiva a la red a través de enlaces de datos que incluyen, por ejemplo, una conexión a un proveedor de servicios de Internet (ISP,Internet Service Provider)a través del bucle local, como se usa normalmente en conexión con la comunicación de módem convencional, módem por cable, redes Dish, ISDN, línea de abonado digital (DSL,Digital Subscriber Line)o distintos métodos de comunicación inalámbrica, véase, por ejemplo, GILBERT HELD, "UNDERSTANDING DATA COMMUNICATIONS" (1996). Cabe señalar que la red puede implementarse como otros tipos de redes, tal como una red de televisión interactiva (ITV,Interactive TeleVision).Además, el sistema contempla el uso, la venta o la distribución de cualquier bien, servicio o información a través de cualquier red que tenga una funcionalidad similar descrita en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, "transmitir" puede incluir el envío de datos electrónicos desde un componente del sistema a otro a través de una conexión de red. Adicionalmente, como se usa en el presente documento, los "datos" pueden incluir información integral, tal como comandos, consultas, archivos, datos para almacenamiento y similares en formato digital o en cualquier otro formato.

El sistema contempla usos en asociación con servicios web, computación de servicios públicos, computación generalizada e individualizada, soluciones de seguridad e identidad, computación autónoma, computación básica, movilidad y soluciones inalámbricas, código abierto, biometría, computación en red y/o computación en malla.

Cualquier base de datos analizada en el presente documento puede incluir una estructura relacional, jerárquica, gráfica u orientada a objetos y/o cualquier otra configuración de base de datos. Los productos de bases de datos comunes que pueden usarse para implementar las bases de datos incluyen DB2 de IBM (White Plains, NY), distintos productos de bases de datos disponibles de Oracle Corporation (Redwood Shores, CA), Microsoft Access o Microsoft SQL Server de Microsoft Corporation (Redmond, Washington), o cualquier otro producto de base de datos adecuado. Además, las bases de datos pueden organizarse de cualquier manera adecuada, por ejemplo, en forma de tablas de datos o tablas de búsqueda. Cada registro puede ser un solo archivo, una serie de archivos, una serie vinculada de campos de datos o cualquier otra estructura de datos. La asociación de ciertos datos se puede realizar a través de cualquier técnica de asociación de datos deseada, tal como las conocidas o puestas en práctica en la técnica. Por ejemplo, la asociación se puede lograr de forma manual o automática. Las técnicas de asociación automática pueden incluir, por ejemplo, una búsqueda en la base de datos, una fusión de bases de datos, GREP, AGREP, SQL, usando un campo clave en las tablas para acelerar las búsquedas, búsquedas secuenciales en todas las tablas y archivos, clasificación de registros en el archivo de acuerdo con un orden conocido para simplificar la búsqueda y/o similares. La etapa de asociación puede realizarse mediante una función de fusión de bases de datos, por ejemplo, usando un "campo clave" en bases de datos o sectores de datos preseleccionados.

Más en particular, un "campo clave" divide la base de datos de acuerdo con la clase de objetos de alto nivel definida por el campo clave. Por ejemplo, ciertos tipos de datos se pueden designar como un campo clave en una pluralidad de tablas de datos relacionadas, y las tablas de datos se pueden vincular en función del tipo de datos en el campo clave. Los datos correspondientes al campo clave en cada una de las tablas de datos vinculados son preferentemente iguales o del mismo tipo. Sin embargo, las tablas de datos que tienen datos similares, aunque no idénticos, en los campos clave también pueden vincularse usando AGREP, por ejemplo. Se puede usar cualquier técnica de almacenamiento de datos adecuada para almacenar datos sin un formato convencional. Los conjuntos de datos pueden almacenarse usando cualquier técnica adecuada, incluyendo, por ejemplo, almacenar archivos individuales usando una estructura de archivos ISO/IEC 7816-4; implementar un dominio mediante el cual se seleccione un archivo dedicado que muestre uno o más archivos elementales que contengan uno o más conjuntos de datos; usar conjuntos de datos almacenados en archivos individuales usando un sistema de archivo jerárquico; conjuntos de datos almacenados como registros en un solo archivo (incluyendo compresión, acceso a SQL, hash a través de una o más teclas, numérico, alfabético por primera tupla, etc.); Objeto binario grande (BLOB,Binary Large Object);almacenados como elementos de datos desagrupados codificados usando elementos de datos ISO/IEC 7816-6; almacenados como elementos de datos desagrupados codificados usando la notación de sintaxis abstracta ISO/IEC (ASN. 1) como en ISO/I EC 8824 y 8825; y/u otras técnicas patentadas que pueden incluir métodos de compresión fractal, métodos de compresión de imágenes, etc.

La capacidad de almacenar una amplia variedad de información en diferentes formatos se puede facilitar almacenando la información como un BLOB. Por tanto, cualquier información binaria se puede almacenar en un espacio de almacenamiento asociado con un conjunto de datos. El método BLOB puede almacenar conjuntos de datos como elementos de datos desagrupados formateados como un bloque de binario a través de una compensación de memoria fija usando asignación de almacenamiento fija, técnicas de cola circular o las mejores prácticas con respecto a la gestión de memorias (por ejemplo, memoria paginada, menos usada recientemente, etc.). Mediante el uso de métodos BLOB, la capacidad de almacenar distintos conjuntos de datos que tienen diferentes formatos facilita el almacenamiento de datos por parte de múltiples propietarios y no relacionados de los conjuntos de datos. Por ejemplo, un primer conjunto de datos que se puede almacenar puede ser proporcionado por una primera parte, un segundo conjunto de datos que se puede almacenar puede ser proporcionado por una segunda parte no relacionada y, todavía se puede proporcionar un tercer conjunto de datos que se puede almacenar, por una tercera parte no relacionado con la primera y segunda parte. Cada uno de estos tres conjuntos de datos de ejemplo puede contener información diferente que se almacena usando diferentes formatos y/o técnicas de almacenamiento de datos. Además, cada conjunto de datos puede contener subconjuntos de datos que también pueden ser distintos de otros subconjuntos.

Tal como se ha indicado anteriormente, los datos pueden almacenarse sin tener en cuenta un formato común. Sin embargo, en una realización de ejemplo, el conjunto de datos (por ejemplo, BLOB) se puede anotar de manera convencional cuando se proporciona para manipular los datos. La anotación puede comprender un encabezado corto, un avance u otro indicador apropiado relacionado con cada conjunto de datos que está configurado para transmitir información útil en la gestión de los distintos conjuntos de datos. Por ejemplo, la anotación puede denominarse "encabezado de condición", "encabezado", "avance" o "estado", en el presente documento, y puede comprender una indicación del estado del conjunto de datos o puede incluir un identificador correlacionado con un emisor o propietario de los datos. Posteriormente, se pueden usar bytes de datos para indicar, por ejemplo, la identidad del emisor o propietario de los datos, usuario, identificador de cuenta de transacción/membresía o similares. Cada una de estas anotaciones de condición se analiza adicionalmente en el presente documento.

La anotación del conjunto de datos también se puede usar para otros tipos de información de estado, así como para otros fines distintos. Por ejemplo, la anotación del conjunto de datos puede incluir información de seguridad que establezca niveles de acceso. Los niveles de acceso pueden, por ejemplo, configurarse para permitir que solo ciertas personas, niveles de empleados, empresas u otras entidades accedan a los conjuntos de datos, o para permitir el acceso a conjuntos de datos específicos basados en la transacción, el emisor o el propietario de los datos, el usuario o similar. Además, la información de seguridad puede restringir/permitir solo ciertas acciones, tales como acceder, modificar y/o borrar conjuntos de datos. En un ejemplo, la anotación del conjunto de datos indica que solo el propietario del conjunto de datos o el usuario pueden borrar un conjunto de datos, a distintos usuarios identificados se les puede permitir acceder al conjunto de datos para leer, y otros están totalmente excluidos del acceso al conjunto de datos. Sin embargo, también se pueden usar otros parámetros de restricción de acceso que permitan que distintas entidades accedan a un conjunto de datos con distintos niveles de permiso según corresponda. Los datos, incluido el encabezado o el avance, pueden ser recibidos por un dispositivo de interacción independiente configurado para añadir, borrar, modificar o aumentar los datos de acuerdo con el encabezado o el avance.

El experto en la materia también apreciará que, por razones de seguridad, cualquier base de datos, sistema, dispositivo, servidor u otros componentes del sistema pueden consistir en cualquier combinación de los mismos en una sola ubicación o en múltiples ubicaciones, en donde cada base de datos o sistema incluye cualquiera de las distintas características de seguridad adecuadas, tales como cortafuegos, códigos de acceso, cifrado, descifrado, compresión, descompresión y/o similares.

La unidad de computación del cliente web puede estar equipada además con un navegador de Internet conectado a Internet o una intranet que use un acceso telefónico convencional, cable, DSL o cualquier otro protocolo de Internet conocido en la técnica. Las transacciones que se originan en un cliente web pueden pasar a través de un cortafuegos para evitar el acceso no autorizado de los usuarios de otras redes. Además, se pueden implementar cortafuegos adicionales entre los distintos componentes del CMS para mejorar aún más la seguridad.

El cortafuegos puede incluir cualquier hardware y/o software configurado adecuadamente para proteger los componentes del CMS y/o los recursos informáticos empresariales de los usuarios de otras redes. Además, se puede configurar un cortafuegos para limitar o restringir el acceso a distintos sistemas y componentes detrás del cortafuegos para clientes web que se conecten a través de un servidor web. El cortafuegos puede residir en diferentes configuraciones, incluida la inspección de estado, el proxy y el filtrado de paquetes, entre otros. El cortafuegos puede integrarse dentro de un servidor web o cualquier otro componente del CMS, o puede residir además como una entidad separada.

Los ordenadores analizados en el presente documento pueden proporcionar un sitio web adecuado u otra interfaz gráfica de usuario basada en Internet a la que puedan acceder los usuarios. En una realización, Microsoft Internet Information Server (IIS), Microsoft Transaction Server (MTS) y Microsoft SQL Server, se usan junto con el sistema operativo de Microsoft, software del servidor web Microsoft NT, un sistema de bases de datos Microsoft SQL Server y un Microsoft Commerce Server. Adicionalmente, los componentes tales como Access o Microsoft SQL Server, Oracle, Sybase, Informix MySQL, Interbase, etc., se pueden usar para proporcionar un sistema de gestión de bases de datos compatible con Active Data Object (ADO).

Cualquiera de las comunicaciones, entradas, almacenamiento, bases de datos o pantallas analizados en el presente documento puede facilitarse a través de un sitio web que tenga páginas web. La expresión "página web", como se usa en el presente documento, no pretende limitar el tipo de documentos y aplicaciones que podrían usarse para interactuar con el usuario. Por ejemplo, un sitio web típico podría incluir, además de documentos HTML convencionales, distintos formularios, applets de Java, JavaScript, páginas de servidor activas (ASP,Active Server Pages),scripts de interfaz de puerta de enlace común (CGI,Common Gateway Interface Scripts),lenguaje de marcado extensible (XML,Extensible Markup Language),dynamic HTML, hojas de estilo en cascada (CSS,Cascading Style Sheets),aplicaciones auxiliares, complementos y similares. Un servidor puede incluir un servicio web que reciba una solicitud de un servidor web, incluyendo la solicitud una URL (http://yahoo.com/stockquotes/ge) y una dirección IP (123.56.789.234). El servidor web recupera las páginas web apropiadas y envía los datos o aplicaciones para las páginas web a la dirección IP. Los servicios web son aplicaciones que son capaces de interactuar con otras aplicaciones a través de un medio de comunicación, tal como Internet. Los servicios web generalmente se basan en estándares o protocolos tales como XML, XSLT, SOAP, WSDL y UDDI. Los métodos de servicios web son bien conocidos en la técnica y están cubiertos en muchos textos convencionales. Véase, por ejemplo, ALEXNGHIEM, "IT WEB SERVICES: A ROADMAP FOR THE ENTERPRISE" (2003).

La base de datos clínica basada en la web para el sistema y método tiene preferentemente la capacidad de cargar y almacenar archivos de datos clínicos en formatos nativos, y se puede buscar en cualquier parámetro clínico. La base de datos también es escalable y puede usar un modelo de datos EAV (metadatos) para introducir anotaciones clínicas de cualquier estudio para una fácil integración con otros estudios. Además, la base de datos clínica basada en la web es flexible y puede estar habilitada para XML y XSLT para poder añadir preguntas personalizadas de forma dinámica para el usuario. Además, la base de datos incluye exportabilidad a CDISC ODM.

Los profesionales también apreciarán que hay una serie de métodos para mostrar datos dentro de un documento basado en navegador. Los datos pueden representarse como texto convencional o dentro de una lista fija, lista desplazable, lista desplegable, campo de texto editable, campo de texto fijo, ventana emergente y similares. Del mismo modo, hay una serie de métodos disponibles para modificar datos en una página web, tales como, por ejemplo, entrada de texto libre con un teclado, selección de elementos del menú, casillas de verificación, casillas de opciones y similares.

El sistema y el método pueden describirse en el presente documento en términos de componentes de bloque funcionales, capturas de pantalla, selecciones opcionales y distintas etapas de procesamiento. Debe apreciarse que dichos bloques funcionales pueden realizarse mediante cualquier número de componentes de hardware y/o software configurados para realizar las funciones especificadas. Por ejemplo, el sistema puede emplear distintos componentes de circuitos integrados, por ejemplo, elementos de memoria, elementos de procesamiento, elementos lógicos, tablas de búsqueda y similares, que pueden llevar a cabo una variedad de funciones bajo el control de uno o más microprocesadores u otros dispositivos de control. De forma similar, los elementos de software del sistema pueden implementarse con cualquier lenguaje de programación o scripting tal como C, C++, Macromedia Cold Fusion, Microsoft Active Server Pages, Java, COBOL, ensamblador, PERL, Visual Basic, SQL Stored Procedures, lenguaje de marcado extensible (XML,Extensible Markup Language),con los distintos algoritmos implementados con cualquier combinación de estructuras de datos, objetos, procesos, rutinas u otros elementos de programación. Además, debe tenerse en cuenta que el sistema puede emplear cualquier número de técnicas convencionales para la transmisión de datos, señalización, procesamiento de datos, control de red y similares. Más aún, el sistema podría usarse para detectar o prevenir problemas de seguridad con un lenguaje de script del lado del cliente, tal como JavaScript, VBScript o similares. Para una introducción básica de la criptografía y la seguridad de la red, véase cualquiera de las siguientes referencias: (1) "AppliedCryptography: Protocols, Algorithms, And Source Code In C", de Bruce Schneier, publicado por John Wiley & Sons (segunda edición, 1995); (2) "Java Cryptography" de Jonathan Knudson, published by O'Reilly & Associates (1998); (3) "Cryptography & Network Security: Principles & Practice" de William Stallings, publicado por Prentice Hall.

Como se usa en el presente documento, la expresión "usuario final", "consumidor", "cliente", "médico tratante", "hospital" o "empresa" se pueden usar indistintamente entre sí, y cada uno significará cualquier persona, entidad, máquina, hardware, software o negocio. Cada participante está equipado con un dispositivo informático para interactuar con el sistema y facilitar el acceso y la entrada de datos en línea. El cliente tiene una unidad de computación en forma de ordenador personal, aunque se pueden usar otros tipos de unidades de computación, incluyendo ordenadores portátiles, blocs de notas, ordenadores de mano, decodificadores, teléfonos celulares, teléfonos de tonos y similares. El propietario/operador del sistema y método tiene una unidad de computación implementada en forma de un servidor de ordenador, aunque el sistema contempla otras implementaciones que incluyen un centro de computación que se muestra como un ordenador de marco principal, un mini-ordenador, un servidor de PC, una red de ordenadores ubicados en la misma o diferentes ubicaciones geográficas, o similares. Además, el sistema contempla el uso, la venta o la distribución de cualquier bien, servicio o información a través de cualquier red que tenga una funcionalidad similar descrita en el presente documento.

Cada cliente puede recibir una "cuenta" o un "número de cuenta". Como se usa en el presente documento, la cuenta o el número de cuenta puede incluir cualquier dispositivo, código, número, letra, símbolo, certificado digital, chip inteligente, señal digital, señal análoga, identificador/indicador biométrico u otro configurado adecuadamente para permitir que el consumidor acceda, interactúe o se comunique con el sistema (por ejemplo, uno o más de un código de autorización/acceso, número de identificación personal (PIN), código de internet, otro código de identificación y/o similar). El número de cuenta puede ubicarse o asociarse opcionalmente con una tarjeta de pago, tarjeta de crédito, tarjeta de débito, tarjeta de prepago, tarjeta en relieve, tarjeta electrónica, tarjeta de banda magnética, tarjeta de código de barras, transpondedor, tarjeta de radiofrecuencia o una cuenta asociada. El sistema puede incluir o interactuar con cualquiera de las tarjetas o dispositivos anteriores, o un mando que tenga un transpondedor y un lector RFID en comunicación de RF con el mando. Aunque el sistema puede incluir un mando, la divulgación no se limita a ello. De hecho, el sistema puede incluir cualquier dispositivo que tenga un transpondedor que esté configurado para comunicarse con el lector RFID a través de la comunicación de RF. Los dispositivos típicos pueden incluir, por ejemplo, un llavero, una etiqueta, una tarjeta, un teléfono celular, un reloj de pulsera o cualquier otra forma que pueda presentarse para ser interrogada. Además, el sistema, la unidad de computación o el dispositivo analizado en el presente documento puede incluir un "dispositivo de computación generalizado", que puede incluir un dispositivo tradicionalmente no computarizado que esté incrustado con una unidad de computación. El número de cuenta puede distribuirse y almacenarse en cualquier forma de dispositivo plástico, electrónico, magnético, de radiofrecuencia, inalámbrico, de audio y/o óptico capaz de transmitir o descargar datos desde el mismo a un segundo dispositivo.

Como apreciará un experto habitual en la técnica, el sistema puede realizarse como una personalización de un sistema existente, un producto complementario, software actualizado, un sistema independiente, un sistema distribuido, un método, un sistema de procesamiento de datos, un dispositivo para el procesamiento de datos y/o un producto de programa informático. Por consiguiente, el sistema puede adoptar completamente la forma de un software, completamente de un hardware o combinar aspectos de software y hardware. Además, el sistema puede adoptar la forma de un producto de programa informático en un medio de almacenamiento legible por ordenador que tenga medios de código de programa legibles por ordenador incorporados en el medio de almacenamiento. Se puede utilizar cualquier medio de almacenamiento legible por ordenador adecuado, incluidos discos duros, CD-ROM, dispositivos de almacenamiento óptico, dispositivos de almacenamiento magnético y/o similares.

El sistema y el método se describen en el presente documento con referencia a capturas de pantalla, diagramas de bloques e ilustraciones de diagramas de flujo de métodos, aparatos (por ejemplo, sistemas) y productos de programas informáticos de acuerdo con distintas realizaciones. Se entenderá que cada bloque funcional de los diagramas de bloques y las ilustraciones del diagrama de flujo, y las combinaciones de bloques funcionales de los diagramas de bloques y las ilustraciones del diagrama de flujo, respectivamente, pueden implementarse mediante instrucciones de programas informáticos.

Con referencia ahora a las FIG. 2-25, los flujos de proceso y las capturas de pantalla representados son simplemente divulgaciones. Por ejemplo, las etapas citadas en cualquiera de las descripciones de métodos o procesos pueden ejecutarse en cualquier orden y no se limitan al orden presentado. Se apreciará que la siguiente descripción hace referencias apropiadas no solo a las etapas y los elementos de la interfaz de usuario representados en las FIG. 2-25, sino también a los distintos componentes del sistema como se ha descrito anteriormente con referencia a la FIG. 1.

Estas instrucciones de programa informático pueden cargarse en un ordenador multiusos, ordenador especial u otro aparato de procesamiento de datos programable para producir una máquina, de modo que las instrucciones que se ejecutan en el ordenador u otro aparato de procesamiento de datos programable creen medios para implementar las funciones especificadas en el bloque o los bloques del diagrama de flujo. Estas instrucciones de programa informático también pueden almacenarse en una memoria legible por ordenador que pueda hacer que un ordenador u otro aparato de procesamiento de datos programable funcione de una manera particular, de modo que las instrucciones almacenadas en la memoria legible por ordenador produzcan un artículo de fabricación que incluya medios de instrucciones que implementan la función especificada en el bloque o los bloques del diagrama de flujo. Las instrucciones del programa informático también se pueden cargar en un ordenador u otro aparato de procesamiento de datos programable para hacer que se realice una serie de etapas operativas en el ordenador u otro aparato programable para producir un proceso implementado por el ordenador, de manera que las instrucciones que se ejecuten en el ordenador u otro aparato programable proporcionen etapas para implementar las funciones especificadas en el bloque o los bloques de diagrama de flujo.

Por consiguiente, los bloques funcionales de los diagramas de bloques y las ilustraciones del diagrama de flujo admiten combinaciones de medios para realizar las funciones especificadas, combinaciones de etapas para realizar las funciones especificadas y medios de instrucciones de programa para realizar las funciones especificadas. También se entenderá que cada bloque funcional de los diagramas de bloques y las ilustraciones de diagrama de flujo, y las combinaciones de bloques funcionales de los diagramas de bloques y de las ilustraciones de diagrama de flujo, pueden implementarse mediante sistemas informáticos especiales basados en hardware que realizan las funciones o etapas especificadas, o combinaciones adecuadas de hardware para fines especiales e instrucciones informáticas. Además, las ilustraciones de los flujos del proceso y las descripciones de los mismos pueden hacer referencia a ventanas de usuario, páginas web, sitios web, formularios web, avisos, etc. Los profesionales apreciarán que las etapas ilustradas que se describen en el presente documento pueden comprender cualquier cantidad de configuraciones, incluido el uso de ventanas, páginas web, formularios web, ventanas emergentes, avisos y similares. Debería apreciarse además que las múltiples etapas como se ilustran y describen pueden combinarse en páginas web y/o ventanas individuales, pero se han ampliado por simplicidad. En otros casos, las etapas ilustradas y descritas como etapas de un solo proceso pueden separarse en múltiples páginas web y/o ventanas, pero se han combinado para simplificar.

Los beneficios, otras ventajas y soluciones a los problemas se han descrito en el presente documento con respecto a realizaciones específicas. Sin embargo, los beneficios, las ventajas, las soluciones a los problemas y cualquier elemento que pueda hacer que se produzca algún beneficio, ventaja o solución, o que estos se hagan más pronunciados no deben interpretarse como características críticas, requeridas o esenciales, o elementos de todas y cada una de las reivindicaciones de la invención. Por consiguiente, el alcance de la invención no está limitado por nada más que las reivindicaciones adjuntas, en las que la referencia a un elemento en singular no pretende significar "uno y solo uno", a menos que se indique explícitamente, sino "uno o más". Además, no es necesario que un dispositivo o método aborde todos y cada uno de los problemas que se pretenden resolver con la presente invención, para que se abarque en las presentes reivindicaciones. Además, ninguna etapa de elemento, componente o método de la presente divulgación está destinado a ser dedicado al público, independientemente de si la etapa de elemento, componente o método se menciona explícitamente en las reivindicaciones. Como se usa en el presente documento, los términos "comprende", "que comprende" o cualquier otra variación de los mismos, están destinados a cubrir una inclusión no excluyente, tal como un proceso, un método, un artículo o un aparato que comprende una lista de elementos no incluye solo esos elementos, sino que puede incluir otros elementos no enumerados expresamente o inherentes a dicho proceso, método, artículo o aparato. Además, No se requiere ningún elemento descrito en el presente documento para la práctica de la invención, a menos que se describa expresamente como "esencial" o "crítico".

la FIG. 1 ilustra un diagrama de bloques de una realización de ejemplo de un sistema 10 para determinar la intervención médica individualizada para un determinado estado patológico que utiliza el perfilado molecular de una muestra biológica de un paciente. El sistema 10 incluye una interfaz de usuario 12, un servidor host 14 que incluye un procesador 16 para procesar datos, una memoria 18 acoplada al procesador, un programa de aplicación 20 almacenado en la memoria 18 y accesible por el procesador 16 para dirigir el procesamiento de los datos por el procesador 16, una pluralidad de bases de datos internas 22 y bases de datos externas 24, y una interfaz con una red de comunicaciones 26 por cable o inalámbrica (tal como Internet, por ejemplo). El sistema 10 también puede incluir un digitalizador de entrada 28 acoplado al procesador 16 para introducir datos digitales de los datos que se reciben desde la interfaz de usuario 12.

La interfaz de usuario 12 incluye un dispositivo de entrada 30 y una pantalla 32 para introducir datos en el sistema 10 y para mostrar información derivada de los datos procesados por el procesador 16. La interfaz de usuario 12 también puede incluir una impresora 34 para imprimir la información derivada de los datos procesados por el procesador 16, tales como informes de pacientes que pueden incluir resultados de pruebas para dianas y terapias farmacológicas propuestas basadas en los resultados de las pruebas.

Las bases de datos internas 22 pueden incluir, pero sin limitación, información y rastreo de muestras/muestras biológicas de pacientes, datos clínicos, datos de pacientes, rastreo de pacientes, gestión de archivos, protocolos de estudio, resultados de pruebas de pacientes a partir del perfilado molecular, e información de facturación y rastreo. Las bases de datos externas 24 pueden incluir, pero sin limitación, bibliotecas de fármacos, genotecas, bibliotecas de enfermedades y bases de datos públicas y privadas tales como UniGene, OMIM, GO, TIGR, GenBank, KEGG y Biocarta.

Métodos de perfilado molecular

Se pueden usar distintos métodos de acuerdo con el sistema 10. La FIG. 2 muestra un diagrama de flujo de una realización de ejemplo de un método 50 para determinar la intervención médica individualizada para un determinado estado patológico que utiliza el perfilado molecular de la muestra biológica de un paciente que no es específica de la enfermedad. Para determinar una intervención médica para un determinado estado patológico usando un perfilado molecular que es independiente del diagnóstico del linaje de la enfermedad (es decir, no está restringido a una sola enfermedad), se realiza al menos una prueba para al menos una diana de una muestra biológica de un paciente enfermo en la etapa 52. Una diana se define como cualquier hallazgo molecular que se pueda obtener de las pruebas moleculares. Por ejemplo, una diana puede incluir uno o más genes, una o más proteínas expresadas en genes, uno o más mecanismos moleculares y/o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, el nivel de expresión de una diana puede determinarse mediante el análisis de los niveles de ARNm o la diana o el gen, o los niveles de proteína del gen. Las pruebas para encontrar dichas dianas pueden incluir, aunque sin limitación, hibridaciónin situfluorescente (FISH), una hibridaciónin situ(ISH) y otras pruebas moleculares conocidas por los expertos en la materia. Se pueden usar métodos basados en PCR, tales como la PCR en tiempo real o la PCR cuantitativa. Además, análisis de micromatriz, tales como una micromatriz de hibridación genómica comparativa (CGH), una micromatriz de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), una matriz de proteómica o análisis de matriz de anticuerpos también se puede usar en los métodos develados en el presente documento. En algunas realizaciones, el análisis de micromatriz comprende identificar si un gen está regulado positiva o negativamente en relación con una referencia con una significación dep< 0,001. Las pruebas o los análisis de dianas también pueden comprender el análisis inmunohistoquímico (IHC). El análisis IHC puede comprender determinar si el 30 % o más de una muestra está teñida, si la intensidad de tinción es 2 o superior, o ambas.

Además, los métodos desvelados en el presente documento también incluyen el perfilado de más de una diana. Por ejemplo, Se puede identificar la expresión de una pluralidad de genes. Además, la identificación de una pluralidad de dianas en una muestra puede ser por un método o por distintos medios. Por ejemplo, la expresión de un primer gen puede determinarse por un método y el nivel de expresión de un segundo gen puede determinarse por un método diferente. Como alternativa, se puede usar el mismo método para detectar el nivel de expresión del primer y segundo gen. Por ejemplo, el primer método puede ser IHC y el segundo, mediante análisis de micromatriz, tal como la detección de la expresión génica de un gen.

El perfilado molecular también puede incluir la identificación de una variante genética, tal como una mutación, polimorfismo (tal como un SNP), eliminación o inserción de una diana. Por ejemplo, la identificación de un SNP en un gen se puede determinar mediante análisis de micromatriz, PCR en tiempo real o secuenciación. Otros métodos desvelados en el presente documento también se pueden usar para identificar variantes de una o más dianas.

Por consiguiente, se pueden realizar uno o más de los siguientes: un análisis IHC en la etapa 54, un microanálisis en la etapa 56 y otras pruebas moleculares conocidas por los expertos en la materia en la etapa 58.

Las muestras biológicas se obtienen de pacientes enfermos tomando una biopsia de un tumor, realizando una cirugía mínimamente invasiva si no hay un tumor reciente disponible, obteniendo una muestra de la sangre del paciente o una muestra de cualquier otro fluido biológico que incluya, pero sin limitación, extractos celulares, extractos nucleares, lisados celulares, o productos biológicos o sustancias de origen biológico tales como excreciones, sangre, sueros, plasma, orina, esputo, lágrimas, heces, saliva, extractos de membrana y similares.

En la etapa 60, se determina si una o más de las dianas que se probaron en la etapa 52 presentan un cambio en la expresión en comparación con una referencia normal para esa diana en particular. En un método de ejemplo, se puede realizar un análisis de IHC en la etapa 54 y se realiza una determinación de si alguna diana del análisis de IHC muestra un cambio en la expresión en la etapa 64 determinando si el 30 % o más de las células de la muestra biológica tenían una tinción de 2 o superior para la diana particular. Los expertos en la materia entenderán que habrá casos en los que la tinción 1 o superior indicará un cambio en la expresión, en tanto en cuento los resultados de la tinción pueden variar dependiendo del técnico que realice la prueba y del tipo de diana que se está probando. En otro método de ejemplo, se puede realizar un análisis de micromatriz en la etapa 56 y se realiza una determinación de si alguna diana del análisis de micromatriz muestra un cambio en la expresión en la etapa 66 identificando qué dianas están reguladas positivamente o reguladas negativamente, determinando si el factor de cambio en la expresión en particular para una diana particular con respecto a una referencia de tejido de origen normal es significativo enp<0,001. Un cambio en la expresión también puede evidenciarse por la ausencia de uno o más genes, proteínas expresadas en genes, mecanismos moleculares u otros hallazgos moleculares.

Después de determinar qué dianas presentan un cambio en la expresión en la etapa 60, se identifica al menos un agente no específico de la enfermedad que interactúa con cada diana que tiene una expresión cambiada en la etapa 70. Un agente puede ser cualquier fármaco o compuesto que tenga un efecto terapéutico. Un agente no específico de la enfermedad es un fármaco o compuesto terapéutico no asociado previamente con el tratamiento de la enfermedad diagnosticada del paciente que es capaz de interactuar con la diana de la muestra biológica del paciente que ha presentado un cambio en la expresión.

En la Tabla 3 que se presenta a continuación, se muestran algunos de los agentes inespecíficos de la enfermedad que interactúan con dianas específicas encontradas en diferentes pacientes con cáncer.

TABLA 3

Finalmente, en la etapa 80, se puede proporcionar un informe del perfil del paciente que incluya los resultados de la prueba del paciente para distintas dianas y cualquier terapia propuesta basada en esos resultados. Un ejemplo de informe 100 del perfil del paciente se muestra en lasFIG. 3A-3D. El informe 100 del perfil del paciente mostrado en laFIG. 3Aidentifica las dianas probadas 102, aquellas dianas probadas que presentaron cambios significativos en la expresión 104, y los agentes inespecíficos de la enfermedad propuestos para interactuar con las dianas 106. El informe 100 del perfil del paciente mostrado en laFIG. 3Bidentifica los resultados 108 del análisis inmunohistoquímico para ciertas proteínas 110 expresadas en genes y si una proteína expresada en gen es una diana molecular 112 determinando si el 30% o más de las células tumorales tuvieron una tinción 2 o superior. El informe 100 también identifica pruebas inmunohistoquímicas que no se realizaron 114. El informe 100 del perfil del paciente mostrado en laFIG. 3Cidentifica los genes analizados 116 con un análisis de micromatriz, y si los genes resultaron estar infraexpresados o sobreexpresados 118 en comparación con una referencia. Finalmente, el informe 100 del perfil del paciente mostrado en laFIG. 3Didentifica la historia clínica 120 del paciente y las muestras que se enviaron 122 del paciente. Las técnicas de perfilado molecular se pueden realizar en cualquier lugar, por ejemplo, un país extranjero, y los resultados se pueden enviar por red a una parte apropiada, por ejemplo, al paciente, a un médico, a un laboratorio u a otra parte ubicada de forma remota.

LaFIG. 4muestra un diagrama de flujo de una realización ilustrativa de un método 200 para identificar una terapia farmacológica/un agente farmacológico capaz de interactuar con una diana. En la etapa 202, se identifica una diana molecular que presenta un cambio en la expresión en distintos individuos enfermos. A continuación, en la etapa 204, se administra una terapia/agente farmacológico a los individuos enfermos. Después administración de la terapia/del agente farmacológico, cualquier cambio en la diana molecular identificado en la etapa 202 se identifica en la etapa 206 para determinar si la terapia/el agente farmacológico administrado en la etapa 204 interactúa con las dianas moleculares identificadas en la etapa 202. Si se determina que la terapia/el agente farmacológico administrado en la etapa 204 interactúa con una diana molecular identificada en la etapa 202, la terapia/el agente farmacológico puede ser aprobado para el tratamiento de pacientes que muestren un cambio en la expresión de la diana molecular identificada en lugar de aprobar la terapia/el agente farmacológico para una enfermedad particular.

LasFIG. 5-14son diagramas de flujo y diagramas que ilustran distintas partes de un sistema y método de descubrimiento de fármacos de medicina personalizada basado en información. La FIG.5es un diagrama que muestra un sistema de ejemplo de apoyo de decisiones clínicas del sistema y método de descubrimiento de fármacos de medicina personalizada basado en información. Los datos obtenidos a través de la investigación clínica y la atención clínica, tales como datos de ensayos clínicos, datos de imágenes biomédicas/moleculares, genómica/proteómica/biblioteca de productos químicos/bibliografía/curación de expertos, rastreo de muestras biológicas/LIMS, antecedentes familiares/registros ambientales y datos clínicos se recopilan y almacenan como bases de datos y mercados de datos dentro de un almacén de datos. LaFIG. 6es un diagrama que muestra el flujo de información a través del sistema de soporte de decisiones clínicas del sistema y método de descubrimiento de fármacos de medicina personalizada basado en la información usando servicios web. Un usuario interactúa con el sistema introduciendo los datos en el sistema mediante la entrada/carga de conjuntos de datos basados en formularios, formulando consultas y ejecutando tareas de análisis de datos, y adquiriendo y evaluando representaciones de datos de salida. El almacén de datos del sistema basado en la web es donde los datos se extraen, se transforman y se cargan desde distintos sistemas de bases de datos. El almacén de datos también es donde se producen formatos comunes, mapeo y transformación. El sistema basado en la web también incluye mercados de datos que se crean basados en vistas de datos de interés.

Un diagrama de flujo de un sistema de ejemplo de apoyo de decisiones clínicas del sistema y método de descubrimiento de fármacos de medicina personalizada basado en la información de la presente invención se muestra en la FIG. 7. El sistema de gestión de información clínica incluye el sistema de gestión de información de laboratorio y la información médica contenida en los almacenes de datos y bases de datos incluye bibliotecas de información médica, tales como bibliotecas de fármacos, genotecas y bibliotecas de enfermedades, además de la extracción de textos de la bibliografía. Tanto los sistemas de gestión de la información relacionados con pacientes particulares como las bases de datos de información médica y los almacenes de datos se unen en un centro de cruce de datos donde se puede obtener información de diagnóstico y opciones terapéuticas. También se puede incorporar un sistema de gestión financiera en el sistema de soporte de decisiones clínicas del sistema y método de descubrimiento de fármacos de medicina personalizada basado en la información.

LaFIG. 8es un diagrama que muestra un sistema de ejemplo de rastreo y gestión de muestras biológicas que puede usarse como parte del sistema y método de descubrimiento de fármacos de medicina personalizada basado en la información. La FIG. 8 muestra dos centros médicos receptores que envían muestras a un banco de tejidos/sangre. Las muestras pueden pasar por análisis de laboratorio antes del envío. La investigación también se puede realizar en las muestras a través de análisis de micromatriz, genotipado y proteómico. Esta información se puede redistribuir al banco de tejidos/sangre. La FIG. 9representa un diagrama de flujo de un sistema de ejemplo de rastreo y gestión de muestras biológicas que puede usarse con el sistema y método de descubrimiento de fármacos de medicina personalizada basado en la información de la presente invención. El centro médico receptor obtiene muestras de los pacientes y luego las envía a un laboratorio de perfilado molecular que también puede realizar análisis y aislamiento de ARN y ADN.

Un diagrama que muestra un método para mantener un vocabulario clínico estandarizado para su uso con el sistema y el método de descubrimiento de fármacos de medicina personalizada basado en la información se muestra en laFIG. 10. LaFIG. 10ilustra cómo las observaciones del médico y la información del paciente asociada con el paciente de un médico pueden ponerse a disposición de otro médico para permitir que el otro médico utilice los datos para tomar decisiones de diagnóstico y terapéuticas para sus pacientes.

LaFIG. 11muestra un esquema de una base de datos de expresión génica de micromatriz de ejemplo que puede usarse como parte del sistema y método de descubrimiento de fármacos de medicina personalizada basado en la información. La base de datos de expresión génica de micromatriz incluye bases de datos externas y bases de datos internas a las que se puede acceder a través del sistema basado en la web. Las bases de datos externas pueden incluir, pero sin limitación, UniGene, GO, TIGR, GenBank, KEGG. Las bases de datos internas pueden incluir, pero sin limitación, el rastreo de tejidos, LIMS, datos clínicos y rastreo de pacientes. LaFIG. 12muestra un diagrama de un almacén de datos de bases de datos de expresión génica de micromatriz de ejemplo que puede usarse como parte del sistema y método de descubrimiento de fármacos de medicina personalizada basado en la información. Los datos de laboratorio, los datos clínicos y los datos de los pacientes pueden almacenarse en el almacén de datos de la base de datos de expresión génica de micromatriz y, a su vez, se puede acceder a los datos mediante una publicación pública/privada y usarlos mediante herramientas de análisis de datos.

Otro esquema que muestra el flujo de información a través de un sistema y método de descubrimiento de fármacos de medicina personalizada basado en la información se muestra en laFIG. 13. Al igual que laFIG. 7, el esquema incluye gestión de información clínica, gestión de información médica y bibliográfica, y gestión financiera del sistema y método de descubrimiento de fármacos de medicina personalizada basado en la información. LaFIG. 14es un esquema que muestra una red de ejemplo del sistema y método de descubrimiento de fármacos de medicina personalizada basado en la información de la presente invención. Los pacientes, los médicos, los centros médicos receptores y los laboratorios comparten e intercambian una variedad de información con el fin de proporcionar al paciente una terapia o un agente propuesto basado en distintas dianas identificadas.

LasFIG. 15-25son impresiones de pantalla de ordenador asociadas con distintas partes del sistema y método de descubrimiento de fármacos de medicina personalizada basado en información mostrados en lasFIG. 5-14. LasFIG.

15 y 16muestran pantallas de ordenador donde se introduce la información del médico y la información de la compañía de seguros en nombre de un cliente. LasFIG. 17-19muestran pantallas de ordenador en las que se puede introducir información para solicitar análisis y pruebas en muestras de pacientes.

LaFIG. 20es una pantalla de ordenador que muestra los resultados de análisis de micromatriz de genes específicos probados con muestras de pacientes. Esta información y pantalla de ordenador es similar a la información detallada en el informe del perfil del paciente que se muestra en la FiG.3C.LaFIG.22es una pantalla de ordenador que muestra los resultados de la prueba de inmunohistoquímica para un paciente en particular para distintos genes. Esta información es similar a la información contenida en el informe del perfil del paciente que se muestra en laFIG. 3B.

LaFIG. 21es una pantalla de ordenador que muestra opciones de selección para encontrar pacientes concretos, ordenar pruebas y/o resultados, emitir informes de pacientes y rastrear casos/pacientes actuales.

LaFIG.23es una pantalla de ordenador que describe algunas de las etapas para crear un informe de perfil de paciente como se muestra en lasFIG. 3Aa3D. LaFIG. 24muestra una pantalla de ordenador para ordenar una prueba de inmunohistoquímica de una muestra de paciente y laFIG. 25muestra una pantalla de ordenador para introducir información sobre un sitio de tumor primario para análisis de micromatriz. Los expertos en la materia entenderán que se puede utilizar cualquier número y variedad de pantallas de ordenador para introducir la información necesaria para utilizar el sistema y método de descubrimiento de fármacos de medicina personalizada basado en la información y para obtener información resultante de la utilización del sistema y método de descubrimiento de fármacos de medicina personalizada basado en la información.

LasFIG. 26-31representan tablas que muestran la frecuencia de un cambio significativo en la expresión de ciertos genes y/o proteínas expresadas por tipo de tumor, es decir, el número de veces que un gen y/o una proteína expresada en un gen se indicó como diana por tipo de tumor al estar sobreexpresado o infraexpresado significativamente (véanse también los Ejemplos 1-3). Las tablas muestran el número total de veces que un gen y/o una proteína expresada en un gen se sobreexpresó o infraexpresó en un tipo de tumor en particular y si el cambio en la expresión se determinó mediante análisis de inmunohistoquímica (FIG.26, FIG.28) o análisis de micromatriz (FIG.27, 30). Las tablas también identifican el número total de veces que se produjo una sobreexpresión de cualquier proteína expresada en un gen en un tipo de tumor particular usando inmunohistoquímica, y el número total de veces que se produjo una sobreexpresión o infraexpresión de cualquier gen en un tipo de tumor particular usando análisis de micromatriz de genes.

Por lo tanto, la presente divulgación proporciona métodos y sistemas para analizar tejido enfermo usando pruebas de IHC y pruebas de micromatriz de genes de acuerdo con IHC y pruebas de micromatriz como se ha descrito anteriormente. Los pacientes pueden estar en una fase avanzada de la enfermedad. Se pueden determinar los patrones de biomarcadores o el distintivo de biomarcador en una serie de tipos de tumores, tipos de tejidos enfermos o células enfermas, que incluyen adiposos, corteza suprarrenal, glándula suprarrenal, glándula suprarrenal: médula, apéndice, vejiga, vaso sanguíneo, hueso, cartílago óseo, cerebro, mama, cartílago, cuello uterino, colon, colon sigmoide, células dendríticas, músculo esquelético, endometrio, esófago, trompa de Falopio, fibroblastos, vesícula biliar, riñón, laringe, hígado, pulmón, ganglio linfático, melanocitos, revestimiento mesotelial, células mioepiteliales, osteoblastos, ovario, páncreas, parótida, próstata, glándulas salivales, tejido sinusal, músculo esquelético, piel, intestino delgado, músculo liso, estómago, sinovio, tejido de revestimiento articular, tendón, testículos, timo, tiroides, útero y cuerpo uterino.

Los métodos de la presente invención pueden usarse para seleccionar un tratamiento de cualquier cáncer, incluyendo, pero sin limitación, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de colon y/o recto, leucemia, cáncer de piel, cáncer de huesos, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de cerebro, cáncer de laringe, vesícula biliar, paratiroides, tiroides, suprarrenal, tejido neuronal, cabeza y cuello, estómago, bronquios, riñones, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas tanto de tipo ulcerante como de tipo papilar, carcinoma de piel metastásico, osteosarcoma, sarcoma de Ewing, sarcoma de células veticulosas, mieloma, tumor de células gigantes, tumor de pulmón microcítico, carcinoma de células de los islotes, tumor cerebral primario, tumores linfocíticos y granulocíticos agudos y crónicos, tumor de células pilosas, adenoma, hiperplasia, carcinoma medular, feocromocitoma, neuroma de la mucosa, ganglioneuroma intestinal, tumor del nervio corneal hiperplásico, tumor del hábito marfanoide, tumor de Wilm, seminoma, tumor de ovario, leiomioma, displasia cervical y carcinomain situ,neuroblastoma, retinoblastoma, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma maligno, lesión cutánea tópica, micosis fungoide, rabdomiosarcoma, sarcoma de Kaposi, sarcoma osteogénico y de otro tipo, hipercalcemia maligna, tumor de células renales, policitemia vera, adenocarcinoma, glioblastoma multiforma, leucemias, linfomas, melanomas malignos y carcinomas epidermoides.

Los patrones de biomarcadores o el distintivo de biomarcador en una serie de tipos de tumores, tipos de tejidos enfermos o células enfermas, que incluyen órganos accesorios, senos paranasales, oído medio e interno, glándulas suprarrenales, apéndice, sistema hematopoyético, huesos y articulaciones, médula espinal, mama, cerebelo, cuello uterino, tejido conjuntivo y blando, cuerpo uterino, esófago, ojo, nariz, globo ocular, trompa de Falopio, conductos biliares extrahepáticos, otras partes de la boca, conductos biliares intrahepáticos, riñón, apéndice-colon, laringe, labio, hígado, pulmón y bronquio, ganglios linfáticos, cerebral, espinal, cartílago nasal, excl. retina, ojo, sin especificar, orofaringe, otras glándulas endocrinas, otros órganos genitales femeninos, ovario, páncreas, pene y escroto, glándula pituitaria, pleura, glándula prostática, recto, pelvis renal, metro, peritoneo, glándulas salivales, piel, intestino delgado, estómago, testículos, timo, glándula tiroidea, lengua, desconocido, vejiga urinaria, el útero, sin especificar, vagina y labios vaginales, y vulva, sin especificar también se pueden determinar.

Por lo tanto, los patrones de biomarcadores o los conjuntos de distintivos de biomarcadores se pueden usar para determinar un agente terapéutico o un protocolo terapéutico que sea capaz de interactuar con el patrón de biomarcadores o conjunto de distintivos. Por ejemplo, con el cáncer de mama avanzado, el análisis de inmunohistoquímica puede usarse para determinar una o más proteínas expresadas en genes que están sobreexpresadas. Por consiguiente, se puede identificar un patrón de biomarcadores o un conjunto de distintivos de biomarcadores para el cáncer de mama en fase avanzada, y se puede identificar un agente terapéutico o protocolo terapéutico que sea capaz de interactuar con el patrón de biomarcadores o conjunto de distintivos.

Estos ejemplos de patrones de biomarcadores o conjuntos de distintivos de biomarcadores para el cáncer de mama en fase avanzada son solo un ejemplo del extenso número de patrones de biomarcadores o conjuntos de distintivos de biomarcadores para una serie de enfermedades o cánceres en fase avanzada que se pueden identificar a partir de las tablas representadas en las FIG. 26-31. Además, se puede identificar una serie de terapias o protocolos terapéuticos inespecíficos de la enfermedad para tratar pacientes con estos patrones de biomarcadores o conjuntos de distintivos de biomarcadores utilizando las etapas del método descritas anteriormente, tal como se representa en lasFIG. 1-2y lasFIG. 5-14.

Los patrones de biomarcadores y/o conjuntos de distintivos de biomarcadores desvelados en la tabla representada en lasFIG. 26 y 28, y las tablas representadas en lasFIG. 27 y 30se pueden usar para una serie de fines que incluyen, pero sin limitación, detección específica del cáncer/enfermedades, tratamiento específico del cáncer/enfermedades e identificación de nuevas terapias o protocolos farmacológicos para cánceres/enfermedades específicos. Los patrones de biomarcadores y/o conjuntos de distintivos de biomarcadores desvelados en la tabla representada en lasFIG. 26 y 28, y en las tablas representadas en lasFIG. 27 y 30también pueden representar perfiles de expresión resistentes a fármacos para el tipo de tumor o tipo de cáncer específico. Los patrones de biomarcadores y/o conjuntos de distintivos de biomarcadores desvelados en la tabla representada en lasFIG. 26 y 28, y en las tablas representadas en lasFIG. 27 y 30representan perfiles resistentes a los fármacos en fase avanzada.

Los patrones de biomarcadores y/o conjuntos de distintivos de biomarcadores pueden comprender al menos un biomarcador. Los patrones de biomarcadores o conjuntos de distintivos pueden comprender al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 biomarcadores. En algunas realizaciones, los conjuntos de distintivos de biomarcadores o los patrones de biomarcadores pueden comprender al menos 15, 20, 30, 40, 50 o 60 biomarcadores. En algunas realizaciones, los conjuntos de distintivos de biomarcadores o patrones de biomarcadores pueden comprender al menos 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 15.000, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000 o 50.000 biomarcadores. El análisis de uno o más biomarcadores puede realizarse mediante uno o más métodos. Por ejemplo, el análisis de 2 biomarcadores se puede realizar usando micromatrices. Como alternativa, un biomarcador se puede analizar mediante IHC y el otro, mediante micromatriz. Cualquiera de dichas combinaciones de métodos y biomarcadores se contemplan en el presente documento.

El uno o más biomarcadores se pueden seleccionar del grupo que consiste en, pero sin limitación: Her2/Neu, ER, PR, c-kit, EGFR, MLH1, MSH2, CD20, p53, Ciclina D1, bc12, COX-2, Receptor de andrógenos, CD52, PDGFR, AR, CD25, VEGF, HSP90, PTEN, RRM1, SPARC, Survivina, TOP2A, BCL2, HIF1A, AR, ESR1, PDGFRA, KIT, PDGFRB, CDW52, ZAP70, PGR, SPARC, GART, GSTP1, NFKBIA, MSH2, TXNRD1, HDAC1, PDGFC, PTEN, CD33, TYMS, RXRB, ADA, TNF, ERCC3, RAF1, VEGF, TOPI, TOP2A, BRCA2, TK1, FOLR2, TOP2B, MLH1, IL2RA, DNMT1, HSPCA, ERBR2, ERBB2, SSTR1, VHL, VDR, PTGS2, POLA, CES2, EGFR, OGFR, ASNS, NFKB2, RARA, MS4A1, DCK, DNMT3A, EREG, Epiregulina, FOLR1, GNRH1, GNRHR1, FSHB, FSHR, FSHPRH1, receptor de folato, HGF, HIG1, IL13RA1, LTB, ODC1, PPARG, PPARGC1, Receptor de linfotoxina beta, Myc, Topoisomerasa II, TOP02B, TXN, VEGFC, ACE2, ADH1C, ADH4, AGT, AREG, CA2, CDK2, caveolina, NFKB1, ASNS, BDCA1, CD52, DHFR, DNMT3B, EPHA2, FLT1, HSP90AA1, KDR, LCK, MGMT, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRG, SRC, SSTR2, SSTR3, SSTR4, SSTR5, VEGFA o YES1.

Por ejemplo, se puede analizar una muestra biológica de un individuo para determinar un patrón de biomarcadores o un conjunto de distintivos de biomarcadores que comprenda un biomarcador tal como HSP90, Survivina, RRM1, SSTRS3, DNMT3B, VEGFA, SSTR4, RRM2, SRC, RRM2B, HSP90AA1, STR2, FLT1, SSTR5, YES1, BRCA1, RRM1, DHFR, KDR, EPHA2, RXRG o LCK. En otras realizaciones, el biomarcador SPARC, HSP90, TOP2A, PTEN, Survivina o RRM1 forma parte del patrón de biomarcadores o conjunto de distintivos de biomarcadores. En otras realizaciones más, el biomarcador MGMT, SSTRS3, DNMT3B, VEGFA, SSTR4, RRM2, SRC, RRM2B, HSP90AA1, STR2, FLT1, SSTR5, YES1, BRCA1, RRM1, DHFR, KDR, EPHA2, RXRG, CD52 o LCK está incluido en el patrón de biomarcadores o conjunto de distintivos de biomarcadores.

El nivel de expresión de HSP90, Survivina, RRM1, SSTRS3, DNMT3B, VEGFA, SSTR4, RRM2, SRC, RRM2B, HSP90AA1, STR2, FLT1, SSTR5, YES1, BRCA1, RRM1, DHFR, KDR, EPHA2, RXRG o LCK puede determinarse y usarse para identificar un agente terapéutico para un individuo. El nivel de expresión del biomarcador se puede usar para formar un patrón de biomarcadores o un conjunto de distintivos de biomarcadores. La determinación del nivel de expresión puede realizarse analizando los niveles de ARNm o de proteína, tal como mediante análisis de micromatriz o IHC. En algunas realizaciones, el nivel de expresión de un biomarcador se realiza mediante IHC, tal como para SPARC, TOP2A o PTEN, y se usa para identificar un agente terapéutico para un individuo. Los resultados del IHC se pueden usar para formar un patrón de biomarcadores o un conjunto de distintivos de biomarcadores. En otras realizaciones más, se analiza una muestra biológica de un individuo o sujeto para determinar el nivel de expresión de CD52, tal como determinando el nivel de expresión de ARNm mediante métodos que incluyen, pero sin limitación, análisis de micromatriz. El nivel de expresión de CD52 se puede usar para identificar un agente terapéutico para el individuo. El nivel de expresión de CD52 se puede usar para formar un patrón de biomarcadores o un conjunto de distintivos de biomarcadores.

Como se describe en el presente documento, se puede usar el perfilado molecular de una o más dianas para determinar o identificar un agente terapéutico para un individuo. Por ejemplo, el nivel de expresión de uno o más biomarcadores se puede usar para determinar o identificar un agente terapéutico para un individuo. El uno o más biomarcadores, tales como los desvelados en el presente documento, se pueden usar para formar un patrón de biomarcadores o un conjunto de distintivos de biomarcadores, lo que se usa para identificar un agente terapéutico para un individuo. En algunas realizaciones, el agente terapéutico identificado es aquel con el que el individuo no ha sido tratado previamente.

Por ejemplo, se ha establecido un patrón de biomarcadores de referencia para un agente terapéutico particular, de modo que los individuos con el patrón de biomarcadores de referencia responderán a ese agente terapéutico. Un individuo con un patrón de biomarcadores que difiere del de la referencia, por ejemplo, la expresión de un gen en el patrón de biomarcadores cambia o es diferente de la de la referencia, no se le administraría ese agente terapéutico. En otro ejemplo, se recomienda que un individuo que presenta un patrón de biomarcador que sea igual o sustancialmente igual a la referencia sea tratado con ese agente terapéutico. En algunas realizaciones, el individuo no ha sido tratado previamente con ese agente terapéutico y, por lo tanto, se ha identificado un nuevo agente terapéutico para el individuo.

Ejemplos

Ejemplo 1: Pruebas de IHC y micromatriz en más de 500 pacientes

Los datos reflejados en la tabla representada en lasFIG. 26A-Hy lasFIG. 27A-27Hse refieren a 544 pacientes cuyo tejido enfermo se sometió a la prueba de IHC (FIG. 26) y 540 pacientes cuyo tejido enfermo se sometió a la prueba de micromatriz de genes (FIG. 27) de acuerdo con la prueba de IHC y micromatriz como se ha descrito anteriormente. Todos los pacientes estaban en fases avanzadas de la enfermedad.

Los datos muestran patrones de biomarcadores o el distintivo de biomarcador en una serie de tipos de tumores, tipos de tejidos enfermos o células enfermas, que incluyen adiposos, corteza suprarrenal, glándula suprarrenal, glándula suprarrenal: médula, apéndice, vejiga, vaso sanguíneo, hueso, cartílago óseo, cerebro, mama, cartílago, cuello uterino, colon, colon sigmoide, células dendríticas, músculo esquelético, endometrio, esófago, trompa de Falopio, fibroblastos, vesícula biliar, riñón, laringe, hígado, pulmón, ganglio linfático, melanocitos, revestimiento mesotelial, células mioepiteliales, osteoblastos, ovario, páncreas, parótida, próstata, glándulas salivales, tejido sinusal, músculo esquelético, piel, intestino delgado, músculo liso, estómago, sinovio, tejido de revestimiento articular, tendón, testículos, timo, tiroides, útero y cuerpo del útero.

En 99 individuos con cáncer de mama avanzado, el análisis de inmunohistoquímica de 20 proteínas expresadas en genes(FIG.26B)mostró que las proteínas expresadas en genes analizadas se sobreexpresaron un total de 367 veces y que el 16,35 % de esa sobreexpresión total fue atribuible a la sobreexpresión de HSP90, seguida del 12,53 % de la sobreexpresión atribuible a la sobreexpresión de TOP2A, y el 11,17 % de la sobreexpresión fue atribuible a SPARC. Además, el 9,81 % de la sobreexpresión fue atribuible a la sobreexpresión del receptor de andrógenos, el 9,54 % de la sobreexpresión fue atribuible a la sobreexpresión de PDGFR, y el 9,26 % de la sobreexpresión fue atribuible a la sobreexpresión de c-kit.

Por consiguiente, se puede identificar un patrón de biomarcadores o un conjunto de distintivos de biomarcadores para el cáncer de mama en fase avanzada, y se puede identificar un agente terapéutico o protocolo terapéutico que sea capaz de interactuar con el patrón de biomarcadores o conjunto de distintivos.

A partir de los datos de micromatriz de la tabla representada por lasFIG 27A-H, se muestra otro patrón de biomarcadores o conjunto de distintivos de biomarcadores para el cáncer de mama en fase avanzada. Por ejemplo, en 100 individuos con cáncer de mama avanzado (FIG. 27B), el análisis de micromatriz de genes de 64 genes mostró que los genes analizados presentaron un cambio en la expresión un total de 1.158 veces, y que el 6,39 % de ese cambio total en la expresión fue atribuible al cambio en la expresión de SSTR3, seguido por el 5,79 % del cambio en la expresión atribuible al cambio en la expresión de VDR y el 5,35 % del cambio en la expresión que es atribuible al cambio en la expresión de BRCA2. Por consiguiente, se puede identificar otro patrón de biomarcadores o un conjunto de distintivos de biomarcadores para el cáncer de mama en fase avanzada, y se puede identificar otro agente terapéutico o protocolo terapéutico que sea capaz de interactuar con este patrón de biomarcadores o conjunto de distintivos.

Ejemplo 2: Prueba de IHC de más de 1300 pacientes

LasFIG. 28Aa28Orepresentan una tabla que muestra la frecuencia de un cambio significativo en la expresión de ciertas proteínas expresadas en genes por tipo de tumor, es decir, el número de veces que una proteína expresada en un gen se indicó como diana por tipo de tumor al estar sobreexpresada significativamente mediante análisis de inmunohistoquímica. La tabla también identifica el número total de veces que se produjo una sobreexpresión de cualquier proteína expresada en un gen en un tipo de tumor particular usando inmunohistoquímica.

Los datos reflejados en la tabla representada en lasFIG. 28Aa28Ose refieren a 1392 pacientes cuyo tejido enfermo se sometió a pruebas de IHC de acuerdo con las pruebas de IHC como se ha descrito anteriormente. Todos los pacientes estaban en fases avanzadas de la enfermedad.

Los datos muestran patrones de biomarcadores o el distintivo de biomarcador en una serie de tipos de tumores, tipos de tejidos enfermos o células enfermas, que incluyen órganos accesorios, senos paranasales, oído medio e interno, glándulas suprarrenales, apéndice, sistema hematopoyético, huesos y articulaciones, médula espinal, mama, cerebelo, cuello uterino, tejido conjuntivo y blando, cuerpo uterino, esófago, ojo, nariz, globo ocular, trompa de Falopio, conductos biliares extrahepáticos, otras partes de la boca, conductos biliares intrahepáticos, riñón, apéndice-colon, laringe, labio, hígado, pulmón y bronquio, ganglios linfáticos, cerebral, espinal, cartílago nasal, excl. retina, ojo, sin especificar, orofaringe, otras glándulas endocrinas, otros órganos genitales femeninos, ovario, páncreas, pene y escroto, glándula pituitaria, pleura, glándula prostática, recto, pelvis renal, uréter, peritoneo, glándulas salivales, piel, intestino delgado, estómago, testículos, timo, glándula tiroidea, lengua, desconocido, vejiga urinaria, el útero, sin especificar, vagina y labios vaginales, y vulva, sin especificar.

En 254 individuos con cáncer de mama avanzado, el análisis de inmunohistoquímica de 19 proteínas expresadas en genes(FIG.28C)mostró que las proteínas expresadas en genes analizadas se sobreexpresaron un total de 767 veces y que el 13,43 % de esa sobreexpresión total fue atribuible a la sobreexpresión de SPARC, seguida del 12,26 % de la sobreexpresión atribuible a la sobreexpresión de c-kit, y el 11,47 % de la sobreexpresión fue atribuible a EGFR. Además, el 11,34 % de la sobreexpresión fue atribuible a la sobreexpresión del receptor de andrógenos, el 11,08 % de la sobreexpresión fue atribuible a la sobreexpresión de HSP90, y el 10,43 % de la sobreexpresión fue atribuible a la sobreexpresión de PDGFR. Por consiguiente, se puede identificar un patrón de biomarcadores o un conjunto de distintivos de biomarcadores para el cáncer de mama en fase avanzada, y se puede identificar un agente terapéutico o protocolo terapéutico que sea capaz de interactuar con el patrón de biomarcadores o conjunto de distintivos.

LaFIG.29representa una tabla que muestra biomarcadores (proteínas expresadas en genes) marcados como dianas por orden de frecuencia en todos los tejidos que se probaron con IHC. La inmunohistoquímica de las 19 proteínas expresadas en genes mostró que las 19 proteínas expresadas en genes fueron marcadas 3878 veces como diana en los distintos tejidos probados y que EGFR fue la proteína expresada en gen que se sobreexpresó con mayor frecuencia seguida de s Pa RC.

Ejemplo 3: Prueba de Micromatriz de más de 300 pacientes

LasFIG. 30Aa30Orepresentan una tabla que muestra la frecuencia de un cambio significativo en la expresión de ciertos genes por tipo de tumor, es decir, el número de veces que un gen se marcó como diana por tipo de tumor como sobreexpresado o infraexpresado significativamente mediante análisis de micromatriz. La tabla también identifica el número total de veces que se produjo una sobreexpresión o infraexpresión de cualquier gen en un tipo de tumor en particular usando el análisis de micromatriz de genes.

Los datos reflejados en la tabla representada en lasFIG. 30Aa30Ose refieren a 379 pacientes cuyo tejido enfermo se sometió a una prueba de micromatriz de genes de acuerdo con las pruebas de micromatriz que se han descrito anteriormente. Todos los pacientes estaban en fases avanzadas de la enfermedad. Los datos muestran patrones de biomarcadores o el distintivo de biomarcador en una serie de tipos de tumores, tipos de tejidos enfermos o células enfermas, que incluyen órganos accesorios, senos paranasales, oído medio e interno, glándulas suprarrenales, canal anal y ano, apéndice, sangre, médula ósea y sistema hematopoyético, huesos y articulaciones, cerebro y nervios craneales y médula espinal (excl. ventrículo y cerebelo), mama, cerebelo, cuello uterino, tejido conjuntivo y blando, cuerpo uterino, esófago, ojo, sin especificar, globo ocular, trompa de Falopio, vesícula biliar, conductos biliares extrahepáticos, encía, base de la boca y otras partes de la boca, conductos biliares intrahepáticos, riñón, Intestino delgado (excl. apéndice - colon), laringe, labio, hígado, pulmón y bronquio, ganglios linfáticos, meninges (cerebral, espinal), cavidad nasal (incluyendo el cartílago nasal), órbita ocular y glándula lacrimal (excl. retina, ojo, sin especificar), orofaringe, otras glándulas endocrinas, otros órganos genitales femeninos, ovario, páncreas, pene y escroto, glándula pituitaria, pleura, glándula prostática, recto, pelvis renal y uréter, retroperitoneo y peritoneo, glándulas salivales, piel, intestino delgado, estómago, testículos, timo, glándula tiroidea, lengua, desconocido, órganos digestivos inespecíficos, vejiga urinaria, útero, sin especificar, vagina y labios vaginales, y vulva, sin especificar.

Por ejemplo, en 168 individuos con cáncer de mama avanzado(FIG. 30C), el análisis de micromatriz de 63 genes mostró que los genes analizados estaban sobreexpresados o infraexpresados un total de 1863 veces y que el 5,05 % de ese cambio total en la expresión era atribuible al cambio de SSTR3 en la expresión, seguido del 4,83 % del cambio en la expresión atribuible al cambio de NKFBIA en la expresión y del 4,62 % del cambio en la expresión atribuible a VDR. Además, el 4,35 % del cambio en la expresión fue atribuible al cambio de expresión de MGMT, el 4,19 % del cambio en la expresión fue atribuible al cambio de expresión de ADA, y el 3,97 % del cambio en la expresión fue atribuible al cambio en la expresión de CES2.

La FIG. 31 representa una tabla que muestra los biomarcadores como dianas por orden de frecuencia en todos los tejidos que se probaron.

Ejemplo 4: Un estudio piloto que utiliza el perfilado molecular de tumores de pacientes para encontrar dianas y seleccionar tratamientos para cánceres refractarios

El objetivo principal era comparar la supervivencia libre de progresión (SLP) usando un régimen de tratamiento seleccionado mediante perfilado molecular con la SLP para el régimen más reciente en el que el paciente progresó (por ejemplo, los pacientes son su propio control) (FIG. 32). El enfoque del perfilado molecular se consideró de beneficio clínico para el paciente individual que tenía una proporción de SLP (SLP con terapia seleccionada mediante perfilado molecular/SLP con terapia previa) de > 1,3.

El estudio también se realizó para determinar la frecuencia con la que el perfilado molecular por IHC, FISH y micromatriz produjo una diana contra la que hay un agente terapéutico disponible en el mercado y para determinar la tasa de respuesta (RECIST) y el porcentaje de pacientes sin progresión o que fallecieron a los 4 meses.

El estudio se realizó en 9 centros en todo Estados Unidos. En la FIG. 33, se representa una descripción general del método. Como se puede observar en la FIG. 33, el paciente fue examinado y accedió a someterse al estudio. La elegibilidad del paciente fue verificada por uno de los dos monitores médicos. Los mismos médicos confirmaron si los pacientes habían progresado en su terapia previa y cuánto tiempo duraba esa SLP (TTP). Luego se realizó una biopsia tumoral, como se analiza a continuación. El tumor se analizó usando análisis IHC, FISH (en material embebido en parafina) y micromatriz (en tejido recién congelado).

Los resultados de IHC/FISH y micromatriz se entregaron a dos médicos del estudio que, en general, usaron el siguiente algoritmo para sugerir la terapia al médico que estaba atendiendo al paciente: 1) IHC/FISH y micromatriz indicando la misma diana fue la primera prioridad; 2) resultado positivo de IHC solo como siguiente prioridad; y 3) resultado positivo de micromatriz solo como la última prioridad.

El médico del paciente fue informado del tratamiento sugerido, y el paciente fue tratado con el/los agente/s sugerido/s (recomendaciones del prospecto). El estado patológico del paciente se evaluó cada 8 semanas y el CTCAE versión 3.0 del NCI evaluó los efectos adversos.

Para ser elegible para el estudio, el paciente debía: 1) proporcionar consentimiento informado y autorización HIPAA; 2) tener algún tipo histológico de cáncer metastásico; 3) haber progresado según los criterios RECIST en al menos 2 regímenes previos para enfermedad avanzada; 4) poder someterse a una biopsia o procedimiento quirúrgico para la obtención de muestras tumorales; 5) tener >18 años, tener una esperanza de vida > 3 meses y un estado de desempeño del Grupo Oriental Cooperativo de Oncología (ECOG,Eastern Cooperative Oncology Group)o 0-1; 6) tener una enfermedad medible o evaluable; 7) ser refractario a la última línea de terapia (progresión documentada de la enfermedad con el último tratamiento; recibido > 6 semanas del último tratamiento; interrumpido el último tratamiento para la progresión); 8) tener una función adecuada de órganos y médula ósea; 9) tener métodos adecuados de control de la natalidad; y 10) si hay metástasis del SNC, controlarla adecuadamente. La escala de rendimiento del ECOG se describe en Oken, M. M., Creech, R. H., Tormey, D. C., Horton, J., Davis, T. E., McFadden, E. T., Carbone, P. P.: "Toxicity And Response Criteria Of The Eastern Cooperative Oncology Group".Am J Clin Oncol5:649-655, 1982, que se incorpora a modo de referencia en su totalidad. Antes de realizar el perfilado molecular, el investigador principal del centro que atiende al paciente debe designar con qué trataría al paciente si no hubiera resultados de perfilado molecular disponibles.

Métodos

Todas las biopsias se realizaron en los centros locales de los investigadores. Para las biopsias con aguja, se realizaron 2-3 biopsias con núcleo de aguja de calibre 18. Para el análisis de micromatriz de ADN (MA), el tejido se congeló inmediatamente y se envió en hielo seco a través de FedEx a un laboratorio central con certificación CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments,enmiendas para mejorar los laboratorios clínicos), Caris MPI en Phoenix, Arizona. Para la IHC, los bloques de parafina se enviaron en envases fríos. La IHC se consideró positiva para la diana si 2 en > 30 % de las células. La m A se consideró positiva para una diana si la diferencia en la expresión de un gen entre el tejido tumoral y el tejido del órgano de control estaba en un nivel de significación dep< 0,001.

I) JHC

Para los estudios de IHC, las muestras de tumor embebidas en parafina y fijadas con formalina tenían cortes de estos bloques enviados para la prueba de IHC para las siguientes proteínas: EGFR, SPARC, c-kit, ER, PR, Receptor de andrógenos, PGP, RRM1, TOPO1, BRCP1, MRP1, MGMT, PDGFR, DCK, ERCC1, Timidilato sintasa, Her2/neu y TOP02A. No se llevaron a cabo IHC para todas las proteínas en todos los tumores de los pacientes.

Se seccionaron bloques de tejido de pacientes embebidos en parafina fijados con formalina (4 pm de espesor) y se montaron sobre portaobjetos de vidrio. Tras la desparafinación y la rehidratación a través de una serie de alcoholes graduados, se realizó el pretratamiento según lo requerido para exponer el antígeno seleccionado como diana.

Her-2 y EGFR se tiñeron según lo especificado por el vendedor (DAKO, Dinamarca). Todos los demás anticuerpos se adquirieron de fuentes comerciales y se visualizaron con un kit de detección de polímero libre de biotina DAB. Se usó tejido de control positivo apropiado para cada anticuerpo. Los portaobjetos de control negativo se tiñeron reemplazando el anticuerpo primario con un reactivo de control negativo de isotipo adecuadamente apareado. Todos los portaobjetos se sometieron a contratinción con hematoxilina como etapa final y se colocó la cubierta. Las secciones de micromatriz de tejidos se analizaron mediante FISH para el número de copias de EGFR y HER-2/neu según las instrucciones del fabricante. La FISH para HER-2/neu (se realizó con el kit de sonda de ADN de HER2 PathVysion (Vysis, Inc). La FISH para EGFR se realizó con la sonda de EGFR/CEP 7 LSI (Vysis).

Todos los portaobjetos fueron evaluados semicuantitativamente por un primer patólogo, quien confirmó el diagnóstico original y leyó cada una de las manchas inmunohistoquímicas usando un microscopio óptico. Se realizaron algunas tinciones inmunohistoquímicas de linaje para confirmar el diagnóstico original, según fue necesario. Se determinaron la intensidad y el grado de tinción; se registraron tanto resultados positivos para la tinción específica del tumor de células tumorales como resultados altamente positivos (>+2) y generalizados (>30 %) de tinción específica del tumor. Un segundo patólogo realizó un control de calidad convencional del 10 %.

ID de Micromatriz

Las muestras tumorales obtenidas para la micromatriz se congelaron rápidamente en los 30 minutos posteriores a la resección y se transmitieron a Caris-MPI en hielo seco. Se dispusieron los fragmentos de tumor congelados en una alícuota de 0,5 ml de solución de isotiocianato de guanidina 0,5 M congelada en un tubo de vidrio, y simultáneamente, se descongelaron y homogeneizaron con un homogeneizador de ondas acústicas enfocado de Covaris. Se añadió una alícuota de 0,5 ml de TriZol, se mezcló, y la solución se calentó hasta 65 °C durante 5 minutos, luego se enfrió en hielo y se sometió a separación de fases mediante la adición de cloroformo seguido de centrifugación. Se añadió un volumen igual de etanol al 70 % a la fase acuosa y la mezcla se cromatografió en una columna Qiagen Rneasy. Se unió el ARN específicamente y luego se eluyó.

Se analizó la integridad del ARN mediante la evaluación de la proporción de ARN ribosómico 28S a 18S en un bioanalizador de Agilent. De dos a cinco microgramos de ARN tumoral y de dos a cinco microgramos de ARN de una muestra de un tejido normal representativo del tejido de origen del tumor se convirtieron por separado en ADNc y luego se marcaron durante la amplificación de la polimerasa T7 con CTP marcado con flúor de contraste (Cy3, Cy5). El tumor marcado y su referencia de tejido de origen se hibridaron con un chip de matrices HlAv260 mer olio de Agilent con 17.085 sondas únicas.

Las matrices contienen sondas para 50 genes para los que existe un posible agente terapéutico que podría interactuar con ese gen (bien con alta o con baja expresión). Esos 50 genes incluyen: ADA, AR, ASNA, BCL2, BRCA2, CD33, CDW52, CES2, DNMT1, EGFR, ERBB2, ERCC3, ESR1, FOLR2, GART, GSTP1, HDAC1, HIF1A, HSPCA, IL2RA, KIT, MLH1, MS4A1, MASH2, NFKB2, NFKBIA, OGFR, PDGFC, PDGFRA, PDGFRB, PGR, POLA, PTEN, PTGS2, RAF1, RARA, RXRB, SPARC, SSTR1, TK1, TNF, TOPI, TOP2A, TOP2B, TXNRD1, TYMS, VDR, VEGF, VHL y ZAP70.

Los chips se hibridaron de 16 a 18 horas a 60 °C y luego se lavaron para eliminar la sonda hibridada en condiciones no rigurosas y se exploraron con un escáner de micromatriz de Agilent. Se extrajeron los datos de la intensidad de fluorescencia, se normalizaron y analizaron usando el software Feature Extraction de Agilent. Se consideró que la expresión génica era diferente de su referencia en función de una estimación de la significación del alcance del cambio, que se estimó usando un modelo de error que tiene en cuenta los niveles de señal a ruido para cada canal, y usa una gran cantidad de controles positivos y negativos replicados sobre el chip para condicionar la estimación. Los cambios de expresión a nivel dep< 0,001 se consideraron significativamente diferentes.

III) Consideraciones estadísticas

El protocolo requería que se inscribieran 92 pacientes planificados, de los cuales aproximadamente 64 pacientes serían tratados con terapia asignada mediante perfilado molecular. Se proyectó que los otros 28 pacientes no tendrían resultados de perfilado molecular disponibles debido a (a) incapacidad para realizar una biopsia al paciente; (b) ninguna diana identificada mediante el perfilado molecular; o (c) deterioro del estado de rendimiento. Se requirió que sesenta y cuatro pacientes recibieran tratamiento de perfilado molecular para rechazar la hipótesis nula (Ho) de que: <15%de los pacientes tendrían una proporción de SLP >1,3 (por ejemplo, un resultado no prometedor).

IV) Selección del tratamiento

El tratamiento para los pacientes basado en los resultados del perfilado molecular se seleccionó usando el siguiente algoritmo: 1) IHC/FISH y micromatriz indican la misma diana; 2) resultado positivo de IHC solo; 3) resultado positivo de micromatriz solo. El médico del paciente fue informado del tratamiento sugerido y el paciente fue tratado según las recomendaciones del prospecto. Se evaluó el estado patológico cada 8 semanas. Los efectos adversos se evaluaron con CTCAE versión 3.0 del NCI.

Resultados

La distribución de los pacientes se representa en el diagrama de laFIG. 34y las características de los pacientes se muestran en lasTABLAS 4y5. Como se puede ver en laFIG. 34, 106 pacientes accedieron al estudio y fueron evaluados. Hubo 20 pacientes que no procedieron al perfilado molecular por los motivos descritos en laFIG. 34(principalmente por empeoramiento del estado o retirada de su consentimiento o porque no querían una terapia adicional). Hubo 18 pacientes que no fueron tratados tras el perfilado molecular (principalmente debido al empeoramiento de su estado o a la retirada del consentimiento porque no querían terapia adicional). Hubo 68 pacientes tratados, 66 de ellos fueron tratados de acuerdo con los resultados del perfilado molecular y 2 no fueron tratados de acuerdo con los resultados del perfilado molecular. Uno de los dos fue tratado con otro agente porque el médico que atendía al paciente sintió la urgencia de tratarlo, y el otro fue tratado con otro agente porque la compañía de seguros no cubría el tratamiento sugerido por el perfilado molecular.

La mediana del tiempo para que los resultados del perfilado molecular fueran accesibles para un médico fue de 16 días desde la biopsia (intervalo de 8 a 30 días) y una mediana de 8 días (intervalo de 0 a 23 días) desde la recepción de la muestra de tejido para el análisis. Algunos retrasos moderados fueron causados por los equipos locales que no enviaron los bloques de los pacientes de inmediato (debido a la necesidad de un estudio de patología de la muestra). Los tumores de los pacientes fueron enviados desde 9 sitios en todo Estados Unidos, incluidos: Greenville, SC; Tyler, TX; Beverly Hills, California; Huntsville, AL; Indiannapolis, IN; San Antonio, TX; Scottsdale, AZ y Los Angeles, California.

LaTabla 4detalla las características de los 66 pacientes que tuvieron un perfilado molecular realizado en sus tumores y que recibieron tratamiento de acuerdo con los resultados del perfilado molecular. Como se ve en laTabla 1, de los 66 pacientes, la mayoría eran mujeres, con una mediana de edad de 60 (intervalo de 27-75). El número de regímenes de tratamiento previo fue de 2-4 en el 53 % de los pacientes y de 5-13 en el 38 % de los pacientes. Hubo 6 pacientes (9 %) que solo recibieron 1 terapia previa porque no había disponible una terapia activa de 2a línea aprobada. Veinte pacientes habían progresado en terapias previas de fase I. La mayoría de los pacientes tenían un estado de rendimiento ECOG de 1.

T l 4: r rí i l i n n =

Como se ve en la Tabla 5, los tipos de tumores de los 66 pacientes incluyeron cáncer de mama 18 (27 %), colorrectal 11 (17 %), de ovario 5 (8 %) y 32 pacientes (48 %) estaban en las categorías misceláneas. Muchos pacientes tenían los tipos de cáncer más raros.

Tab 66)

Criterio de valoración principal: Proporción de SLP > 1,3

En lo que respecta al criterio de valoración principal para el estudio (proporción de SLP > 1,3), en los 66 pacientes tratados de acuerdo con los resultados del perfilado molecular, el número de pacientes con proporción de SLP superior o igual a 1,3 fue 18 del 66 o 27 %, prueba no paramétrica unilateral, de una muestra, con IC del 95 % del 17-38 %,p= 0,007. La hipótesis nula era que < 15 % de esta población de pacientes tendría una proporción de SLP > 1,3. Por lo tanto, se rechaza la hipótesis nula, y la conclusión de los presentes inventores es que este enfoque de perfilado molecular es beneficioso. La FIG. 35 detalla la comparación de la SLP con terapia de perfilado molecular (las barras) frente a la SLP (TTP) en la última terapia previa del paciente (los recuadros) para los 18 pacientes. La mediana de la proporción de SLP es de 2,9 (intervalo de 1,3-8,15).

Al examinar el criterio de valoración principal, como se muestra en la Tabla 6, se logró una proporción de SLP >1,3 en 8/18 (44 %) pacientes con cáncer de mama, 4/11 (36 %) pacientes con cáncer colorrectal, 1/5 (20 %) de pacientes con cáncer de ovario y 5/32 (16 %) pacientes en la miscelánea de tipos de tumores (cabe señalar que la miscelánea de tipos de tumores con proporción de SLP > 1,3 incluían: pulmón 1/3, colangiocarcinoma 1/3, mesotelioma 1/2, tumor de glándulas sudoríparas ecrinas 1/1 y GIST (gástrico) 1/1).

Número total de tipos de tumor tratados con proporción de SFP > 1,3

Tabla 6: Criterio de valoración principal: proporción de SLP > 1,3 por tipo de tumor

*pulmón 1/3, colangiocarcinoma 1/2, mesotelioma 1/2, glándulas sudoríparas ecrinas 1/1, GIST (gástrico) 1/1

El tratamiento que recibieron los 18 pacientes con SLP > 1,3 basándose en el perfilado se detalla en la Tabla 7. Como se puede ver en esa tabla, para los pacientes con cáncer de mama, el tratamiento varió de dietilestibesterol a nab paclitaxel gemcitabina a doxorrubicina. Los tratamientos para los pacientes con otros tipos de tumores también se detallan en la Tabla 7. En general, 14 fueron tratados con combinaciones y 4 fueron tratados con agentes únicos.

Tabla 7:Tratamiento que recibieron 18 pacientes con proporción de SLP > 1,3 (basado en el perfilado molecular

Criterios de valoración secundarios

Los resultados para el criterio de valoración secundario para este estudio son los siguientes. La frecuencia con la que el perfilado molecular del tumor de los pacientes proporcionó una diana en los 86 pacientes en los que se intentó el perfilado molecular fue de 84/86 (98 %). Desglosado por metodología, 83/86 (97 %) proporcionaron una diana mediante IHC/FISH y 81/86 (94 %) proporcionaron una diana mediante micromatriz. Se analizó la integridad del ARN mediante la evaluación de la proporción de ARN ribosómico 28S a 18S en un bioanalizador de Agilent. 83/86 (97 %) muestras resultaron tener proporciones de 1 o superiores, y dieron altas proporciones de reproducibilidad intra-chip. Esto demuestra que se puede obtener una muy buena recolección y envío de muestras de pacientes en todo Estados Unidos y excelentes resultados técnicos.

Según los criterios RECIST en 66 pacientes, hubo 1 respuesta completa y 5 respuestas parciales para una tasa de respuesta general del 10 % (una RC en una paciente con cáncer de mama y RP en pacientes con cáncer de mama, ovario, colorrectal y NSCL). Los pacientes sin progresión a los 4 meses incluían 14 de 66 o el 21 %.

En un análisis exploratorio, se generó un diagrama de cascada para todos los pacientes para el % de cambio máximo de los diámetros sumados de las lesiones diana con respecto a los diámetros iniciales. En la FIG. 36, se muestran los pacientes que tuvieron progresión y los pacientes que tuvieron alguna contracción de su tumor en algún momento durante su curso junto con esas respuestas parciales según los criterios RECIST. Hay una cierta contracción de los tumores de los pacientes en más del 47 % de los pacientes (donde se completaron 2 o más evaluaciones).

Otros análisis - Seguridad

En cuanto a los análisis de seguridad, no hubo muertes relacionadas con el tratamiento. Hubo nueve eventos adversos graves relacionados con el tratamiento, que incluyeron anemia (2 pacientes), neutropenia (2 pacientes), deshidratación (1 paciente), pancreatitis (1 paciente), náuseas (1 paciente), vómitos (1 paciente) y neutropenia febril (1). Solo se suspendió el tratamiento de un paciente (1,5 %) debido a un evento adverso relacionado con el tratamiento de fatiga de grado 2.

Otros análisis - Relación entre lo que habría seleccionado el médico encargado del paciente y lo que seleccionó el perfilado molecular

También se examinó la relación entre lo que el médico seleccionó para tratar al paciente antes de conocer los resultados sugeridos por el perfilado molecular para el tratamiento. Como se detalla en la FIG. 37, no existe un patrón entre los dos. Más específicamente, no se observaron coincidencias para los 18 pacientes con una proporción de SLP > 1,3.

En la FIG. 38, se muestra la supervivencia global para los 18 pacientes con una proporción de SLP > 1,3 frente a los 66 pacientes. Este análisis exploratorio se realizó para ayudar a determinar si la proporción de SLP tenía alguna relevancia clínica. La supervivencia global para los 18 pacientes con una proporción de SLP > 1,3 es de 9,7 meses frente a 5 meses para toda la población - rango logarítmico 0,026. Este análisis exploratorio indica que la proporción de SLP está correlacionada con otro parámetro clínico más.

Conclusiones

Este estudio piloto prospectivo multicéntrico demuestra: (a) la viabilidad de medir dianas moleculares en tumores de pacientes de 9 centros diferentes en EE. UU. con buena calidad y suficiente recolección de tumores, y de tratar a los pacientes en función de esos resultados; (b) este enfoque de perfilado molecular proporcionó una mayor SLP para los pacientes en un régimen sugerido por el perfilado molecular en comparación con el régimen en el que acababan de progresar para el 27 % de los pacientes (intervalo de confianza del 17-38 %)p= 0,007; y (c) este es un resultado prometedor que demuestra el uso y los beneficios del perfilado molecular.

Los resultados también demuestran que los pacientes con cáncer refractario comúnmente pueden tener dianas simples (tales como ER) para las que hay terapias disponibles, y pueden ser beneficiosas para ellos. El perfilado molecular de los pacientes que han agotado otras terapias y que quizás sean candidatos para ensayos de fase I o II podría haber realizado este perfilado molecular.

Ejemplo 5: Sistema de perfilado molecular

Un sistema tiene varios componentes individuales que incluyen una matriz de expresión génica que usa el chip 44K de Agilent capaz de determinar el nivel de expresión relativa de aproximadamente 44.000 secuencias diferentes a través de RT-PCR a partir de ARN extraído de tejido recién congelado. Debido a los aspectos prácticos implicados en la obtención de tejido recién congelado, solo una parte de las muestras puede ejecutar el análisis 44K de Agilent. Además de esta matriz de expresión génica, el sistema también realiza un subconjunto de 40 ensayos de inmunohistoquímica diferentes en tejido de cáncer embebido en parafina fijado con formalina (FFPE). Finalmente, se determina el número de copias de genes para una serie de genes mediante FISH (hibridación fluorescentein situ)y se realiza el análisis de mutaciones mediante secuenciación de ADN para varias mutaciones específicas. Todos estos datos se almacenan para cada caso de paciente. Los resultados de micromatriz para más de 64 genes que han demostrado tener un impacto en las opciones terapéuticas se usan para generar un informe final. También se presentan los datos de los análisis de IHC, FISH y secuenciación de ADN. El informe es explicado por un oncólogo en ejercicio. Una vez presentados los datos, las decisiones finales recaen en el médico tratante.

Ejemplo 6: Análisis de expresión de Illumina

El ensayo DASL del genoma completo de Illumina (Illumina Inc., San Diego, CA) ofrece un método para perfilar simultáneamente más de 24.000 transcripciones a partir de una entrada mínima de ARN, tanto de fuentes de tejido recién congelado (FF) como de tejido embebido en parafina fijado con formalina (FFPE), de una manera de alto rendimiento. El análisis usa el ensayo DASL del genoma completo con UDG (Illumina, n.° de cat DA-903-1024/DA-903-1096), el horno de hibridación de Illumina y el sistema de Illumina iScan.

El ensayo DASL del genoma completo se realiza siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN total aislado de cualquiera de las fuentes FF o FFPE se convierte en ADNc usando cebadores de oligo(dT) biotinilado y cebadores nonámeros aleatorios. El uso de cebadores de oligo(dT) y nonámeros aleatorios ayuda a garantizar la síntesis de ADNc de fragmentos de ARN degradados, tales como los obtenidos a partir de tejido FFPE. El ADNc biotinilado luego se hibrida con los grupos de sondas de la agrupación del ensayo DASL (DAP,DASL Assay Pool).Los grupos de sondas contienen oligonucleótidos diseñados específicamente para interrogar cada secuencia diana en las transcripciones. Las sondas abarcan alrededor de 50 bases, lo que permite el perfilado de ARN parcialmente degradado.

El conjunto de sondas del ensayo consiste en un oligonucleótido en dirección 5' que contiene una secuencia específica del gen y una secuencia de cebador de PCR universal (PI) en el extremo 5', y un oligonucleótido en dirección 3' que contiene una secuencia específica del gen y una secuencia de cebador de PCR universal (P2) en el extremo 3'. El oligonucleótido en dirección 5' se hibrida con el sitio de ADNc seleccionado como diana, y luego se extiende y se liga a su correspondiente oligonucleótido en dirección 3' para crear un molde de PCR d 36.2, Lanzamiento 22 que pueda amplificarse con cebadores universales de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

T l . n ni R f * l hi H m nR f- B hi

Los productos de PCR resultantes se hibridan con el BeadChip de expresión HumanRef-8 para determinar la presencia o ausencia de genes específicos. El BeadChip HumanRef-8 presenta contenido actualizado que abarca > 24.000 transcripciones anotadas derivadas de la base de datos secuencias de referencia (RefSeq) del Centro Nacional de Información de Biotecnología (Creación 36.2, Lanzamiento 22) (Tabla 8).

*Bui

Tras la hibridación, los BeadChips de expresión HumanRef-8 se exploran usando el sistema iScan. Este sistema incorpora láseres de alto rendimiento, sistemas ópticos y de detección para una rápida exploración cuantitativa. El sistema ofrece una alta relación de señal a ruido, alta sensibilidad, bajo límite de detección y amplio rango dinámico, lo que conduce a una calidad de datos excepcional.

El análisis de la expresión génica del genoma completo usando micromatrices de química DASL permite una estimación de si un gen particular está produciendo más o menos ARNm en el tumor que en el tipo de célula del que se deriva el tumor. Según la actividad, mayor o menor, de un gen dado, puede aumentar la probabilidad de que un tumor responda a un tratamiento terapéutico en particular según el tipo de cáncer que se esté tratando. La expresión diferencial de genes del tumor de un sujeto en comparación con el tejido normal puede proporcionar una herramienta de diagnóstico útil para ayudar a un oncólogo a determinar la vía de tratamiento adecuada.

La química DASL aborda la limitación de trabajar con ARN FFPE degradado al desviarse de las metodologías tradicionales de micromatriz de hibridación directas. Sin embargo, hay mucha variabilidad en los métodos de fijación del tejido FFPE, lo que puede conducir a niveles más altos de degradación del ARN. El ensayo DASL puede usarse para ARN parcialmente degradados, pero no para ARN completamente degradados. Para calificar las muestras de ARN antes del análisis del ensayo DASL, se verifica la calidad del ARN usando un método qPCR en tiempo real en el que el gen de la proteína ribosómica altamente expresado, RPL13a, se amplifica usando la química de SYBR verde. Si una muestra tiene un valor de umbral de ciclo < 29, se considera que la muestra está lo suficientemente intacta como para proceder con la química DASL. Véase "Biotinylated cDNA Pre-Qualification", Illumina, Inc.; Abramovitz, M.,et al.,"Optimization of RNA extraction from FFPE tissues for expression profiling in the DASL assay".Biotechniques,2008. 44(3): pág. 417-23. Cualquier muestra que tenga una proporción A260/A280 <1.5, o un valor de RPL13a Ct> 30 se considera demasiado degradada o demasiado modificada para ser procesada usando la química de expresión del gen DASL del genoma completo. Abramovitz, M.,et al.

Antes de la hibridación en el BeadChip de expresión HumanRef-8, la muestra se precipita. El precipitado de muestra tendrá la forma de un microgránulo azul. Si el microgránulo azul no es visible para esa muestra, la muestra se debe volver a procesar antes de la hibridación en el BeadChip.

Aunque el ensayo DASL del genoma completo examina la expresión de miles de genes, solo es necesario analizar la expresión de los genes de interés.

Con el fin de estandarizar la presentación de los datos de los pacientes usando la tecnología DASL del genoma completo de Illumina, se usa el siguiente algoritmo. Los datos se obtienen usando el software Genome Studios v2009.1 (Módulo de expresión de genes, versión 1.1.1).

Etapa 1: Los valorespde detección determinados por el software Genome Studios deben ser inferiores a 0,01. Este valor se determina examinando la variabilidad de las señales generadas por las copias duplicadas de la misma sonda para un determinado gen en relación con la variabilidad observada en las sondas de control negativo presentes en la matriz. Si el valorpde detección bien para el control o para la muestra del paciente es superior a 0,01 para un determinado gen, la expresión para ese gen se presenta como "Indeterminado". Se seleccionó un punto de corte de 0,01, ya que indica que hay menos de un uno por ciento de posibilidades de que los datos se observen dado que la hipótesis nula de que no hay cambio en la expresión es verdadera. El valorppuede corregirse para comparaciones múltiples.

Etapa 2: El valorpde la expresión diferencial debe ser inferior a 0,001. Este valorpse determina usando la siguiente ecuación: 1/(10A(D/(10*SIGNO(MP-MC)))). En esta ecuación, "D" representa la puntuación de la expresión diferencial generada por Genome Studios. El "MP" y el "MC" representan las unidades de fluorescencia relativa (UFR) obtenidas en la matriz de un determinado gen para la muestra del paciente (MP) y para la muestra de control (MC) respectivamente. La función "SIGNO" convierte el signo del valor generado restando las UFR de la MC de las UFR de la Mp en un valor numérico. Si la MP menos la MC es > 0, se generará un valor de 1. Si la MP menos la MC es < 0, se generará un valor de -1. Si la MP es igual a la MC, se generará un valor de 0. Si el valorpde la expresión diferencial es superior a 0,001 para cualquier gen en particular, la expresión para ese gen se presenta como "Invariable". Se seleccionó un valor de corte de 0,001 porque los genes que pasan este umbral pueden validarse como expresados diferencialmente mediante métodos alternativos aproximadamente el 95 % del tiempo.

Etapa 3: Si la proporción de expresión es inferior a 0,66 para un gen en particular, la expresión para ese gen se presentará como "infraexpresado". Si la proporción de expresión es superior a 1,5, la expresión para ese gen se presentará como "Sobreexpresado". Si la proporción de la expresión está entre 0,66 y 1,5, la expresión de un gen en particular se presentará como "Invariable". La proporción de la expresión se determina dividiendo las UFR para un gen de la muestra del paciente entre las UFR para el mismo gen de la muestra de control (MP/MC). "Invariable" indica que no hay diferencia en la expresión de este gen entre los tejidos tumorales y de control a un nivel de significación dep<= 0,001. Se seleccionó un nivel de significación <= 0,001, pues los genes que pasan este umbral pueden validarse como expresados diferencialmente mediante métodos alternativos aproximadamente el 95 % del tiempo.

"No informativo (NI)" indica que los datos obtenidos bien para la muestra del paciente o para la muestra de control no fueron de calidad suficientemente alta como para determinar con confianza al nivel de expresión de esa transcripción de ARN en particular.

Etapa 4: En algunos casos donde solo se usan muestras FFPE, todos los genes que se identifican como "infraexpresados", usando el algoritmo anterior, se presentarán como "Indeterminados". Esto se debe a la naturaleza degradada del ARN obtenido de las muestras FFpE y, como tal, puede que no sea posible determinar si las UFR reducidas para un gen en la muestra del paciente en relación con la muestra de control se deben a la presencia reducida de ese ARN en particular o si el ARN está altamente degradado e impide la detección de esa transcripción de ARN en particular. Con tecnologías mejoradas, se presentan algunos o todos los genes como "infraexpresados" con muestras FFPE.

LaFIG.39muestra los resultados obtenidos del perfilado de micromatriz de una muestra FFPE. El ARN total se extrajo del tejido tumoral y se convirtió en ADNc. La muestra de ADNc se sometió luego a un análisis de micromatriz de genoma completo (24K) usando el proceso de hibridación, selección, extensión y ligadura mediado por ADNc (BASE) de Illumina. Luego se comparó la expresión de un subconjunto de 80 genes con un control normal específico del tejido y se determinaron las proporciones de expresión relativas de estos 80 genes diana indicados en la figura, así como la significación estadística de la expresión diferencial.

Ejemplo 7: Sistema de perfilado molecular e informe

Un sistema tiene varios componentes individuales que incluyen una matriz de expresión génica que usa el ensayo DASL del genoma completo de Illumina como se describe en el Ejemplo 6. Además de esta matriz de expresión génica, el sistema también realiza un subconjunto de ensayos de inmunohistoquímica en tejido de cáncer embebido en parafina fijado con formalina (FFPE). Finalmente, se determina el número de copias de genes para una serie de genes mediante FISH (hibridación fluorescentein situ)y se realiza el análisis de mutaciones mediante secuenciación de ADN para varias mutaciones específicas. Todos estos datos se almacenan para cada caso de paciente. Se presentan los datos procedentes de los análisis de micromatriz, IHC, FISH y secuenciación de ADN. Todos los experimentos de laboratorio se realizan de acuerdo con los procedimientos operativos convencionales (SOP,Standard Operating Procedures).

El ADN para el análisis de mutaciones se extrae de tejidos embebidos en parafina fijados con formalina (FFPE) después de la macrodisección de los portaobjetos fijados en un área que contiene un % de núcleos tumorales > 10 % según lo determinado por un patólogo. El ADN extraído solo se usa para el análisis de mutaciones si el % de núcleos tumorales > 10 %. El ADN se extrae usando el kit para tejido FFPE de ADN QIAamp de acuerdo con las instrucciones del fabricante (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Se usa el kit Mutector I BRAF para BRAF (TrimGen, n.° de cat MH 1001­ 04) para detectar mutaciones de BRAF (TrimGen Corporation, Sparks, MD). El kit de prueba de mutaciones de KRAS DxS (DxS, n.° KR-03) se usa para detectar las mutaciones de KRAS (QIAGEN Inc., Valencia, CA). La secuenciación de BRAF y KRAS del ADN amplificado se realiza usando la química del Terminador VI 1 BigDye® de Applied Biosystem, Carlsbad, CA).

La IHC se realiza de acuerdo con protocolos convencionales. Los sistemas de detección de IHC varían según el marcador e incluyen el dispositivo Autostainer Plus de Dako (Dako North America, Inc., Carpinteria, CA), Ventana Medical Systems Benchmark® XT (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) y el Sistema Bond de Leica/Vision Biosystems (Leica Microsystems Inc., Bannockburn, IL). Todos los sistemas funcionan de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La FISH se realiza en tejido embebido en parafina fijado con formalina (FFPE). Los portaobjetos de tejido FFPE para la FISH deben teñirse con hematoxilina y Eosina (H & E) y entregarse a un patólogo para su evaluación. Los patólogos marcarán las áreas de tumor para someterlas a FISH para su análisis. El informe del patólogo debe mostrar que el tumor está presente y que es suficiente para realizar un análisis completo. La FISH se realiza usando el Abbott Molecular VP2000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Abbott Laboratories, Des Plaines, LA).

En lasFIG. 40A-40J, se muestra un informe generado por el sistema. LaFIG. 40Amuestra que la paciente tenía un tumor primario en el ovario. Se usó una muestra de bloque de parafina. LasFIG. 40A-40Bilustran una lista resumida de los biomarcadores identificados como expresados diferencialmente según el análisis de micromatriz o IHC. Se presentan las opciones de tratamiento correspondientes a cada biomarcador expresado diferencialmente. El médico del sujeto puede decidir qué tratamientos candidatos aplicar. LaFIG.40Cpresenta una tabla de evidencia bibliográfica que vincula los tratamientos candidatos a los biomarcadores. LaFIG. 40Dpresenta los resultados del análisis IHC y laFIG.40Epresenta los resultados del análisis de micromatriz. LasFIG.40F-40Gpresentan una descripción resumida de los biomarcadores expresados diferencialmente. LasFIG. 40H-40Ipresentan una descripción resumida de la bibliografía que respalda las terapias candidatas vinculadas a los biomarcadores expresados diferencialmente con una calificación del nivel de evidencia asociado a cada publicación. LaFIG.40Cpresenta una tabla que explica los códigos para el nivel de evidencia.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para identificar un tratamiento candidato para un cáncer en un sujeto que lo necesita, que comprende realizar una secuenciación de ADN en una muestra obtenida del sujeto para determinar un perfil de mutaciones de secuenciación en un grupo de genes que comprende KRAS, BRAF, c-KIT y EGFR.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende además:

(i) comparar el perfil de mutaciones de secuenciación con una base de datos de reglas, en donde la base de datos de reglas comprende un mapeo de tratamientos cuya actividad biológica es conocida contra las células cancerosas que tienen cero o más mutaciones en uno o más genes incluidos en el perfil de mutaciones de secuenciación; e (ii) identificar el tratamiento candidato si:

i. la comparación indica que el tratamiento debería tener actividad biológica contra el cáncer; e

ii) la comparación no contraindica el tratamiento para tratar el cáncer.

3. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde la muestra comprende tejido embebido en parafina fijado con formalina (FFPE), tejido recién congelado (FF) o tejido comprendido en una solución que conserva las moléculas de ácido nucleico o proteína.

4. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el grupo de genes comprende además PI3K.

5. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el grupo de genes comprende además uno o más de ABCC1, ABCG2, ACE2, ADA, ADH1C, ADH4, AGT, Receptor de andrógenos, AR, AREG, ASNS, BCL2, BCRP, BDCA1, BIRC5, B-RAF, BRCA1, BRCA2, CA2, caveolina, CD20, CD25, CD33, CD52, CDA, CDK2, CDW52, CES2, CK 14, CK 17, CK 5/6, c-KIT, c-Myc, COX-2, Ciclina D1, DCK, DHFR, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, E-Cadherina, ECGF1, EGFR, EPHA2, Epiregulina, ER, ERBR2, ERCC1, ERCC3, EREG, ESR1, FLT1, receptor de folato, FOLR1, FOLR2, FSHB, FSHPRH1, FSHR, FYN, GART, GNRH1, GNRHR1, GSTP1, HCK, HDAC1, Her2/Neu, HGF, HIF1A, HIG1, HSP90, HSP90AA1, HSPCA, IL13RA1, IL2RA, KDR, KIT, K-RAS, LCK, LTB, Receptor de linfotoxina beta, LYN, MGMT, MLH1, MRP1, MS4A1, MSH2, Myc, NFKB1, NFKB2, NFKBIA, ODC1, OGFR, p53, p95, PARP-1, PDGFC, PDGFR, PDGFRA, PDGFRB, PGP, PGR, PI3K, POLA, POLA1, PPARG, PPARGC1, PR, PTEN, PTGS2, RAF1, RARA, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRB, RXRG, SPARC, SPARC MC, SPARC PC, SRC, SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4, SSTR5, Survivina, TK1, TLE3, TNF, TOP1, TOP2A, TOP2B, TOPO1, TOPO2B, Topoisomerasa II, TS, TXN, TXNRD1, TYMS, VDR, VEGF, VEGFA, VEGFC, VHL, YES1 y ZAP70.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde las reglas contenidas en la base de datos de reglas se basan en la eficacia de distintos tratamientos particulares para un gen o producto génico diana.

7. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el tratamiento candidato comprende la administración de uno o más agentes terapéuticos candidatos.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde:

(i) el uno o más agentes terapéuticos candidatos comprenden 5-fluorouracilo, abarelix, Alemtuzumab, aminoglutetimida, Anastrazol, asparaginasa, aspirina, ATRA, azacitidina, bevacizumab, bexaroteno, Bicalutamida, bortezomib, calcitriol, capecitabina, Carboplatino, celecoxib, Cetuximab, Terapia quimioendocrina, colecalciferol, Cisplatino, carboplatino, Ciclofosfamida, Ciclofosfamida/Vincristina, citarabina, dasatinib, decitabina, Doxorrubicina, Epirrubicina, Erlotinib, Etopósido, exemestano, Flutamida, fulvestrant, Gefitinib, Gefitinib Trastuzumab, gemcitabina, gonadorelina, Goserelina, hidroxiurea, Imatinib, Irinotecán, Ixabepilona, Lapatinib, Letrozol, Leuprolida, doxorrubicina liposomal, medroxiprogesterona, megestrol, metotrexato, mitomicina, nabpaclitaxel, octreotida, oxaliplatino, Paclitaxel, Panitumumab, pegaspargasa, pemetrexed, pentostatina, sorafenib, sunitinib, Tamoxifeno, temozolomida, topotecán, toremifeno, Trastuzumab, VBMCP/Ciclofosfamida, Vincristina o cualquier combinación de los mismos; e/o

(ii) el uno o más agentes terapéuticos candidatos comprenden inhibidores de la aromatasa; e/o

(iii) el uno o más agentes terapéuticos candidatos comprenden fluoropirimidinas; e/o

(iv) el uno o más agentes terapéuticos candidatos comprenden 5FU, bevacizumab, capecitabina, cetuximab, cetuximab gemcitabina, cetuximab irinotecán, ciclofosfamida, dietilestibesterol, doxorrubicina, erlotinib, etopósido, exemestano, gemcitabina, gemcitabina etopósido, gemcitabina pemetrexed, irinotecán, irinotecán sorafenib, lapatinib, lapatinib tamoxifeno, letrozol, letrozol capecitabina, mitomicina, nab-paclitaxel, nabpaclitaxel gemcitabina, nab-paclitaxel trastuzumab, oxaliplatino, oxaliplatino 5FU trastuzumab, panitumumab, pemetrexed, sorafenib, sunitinib, sunitinib mitomicina, tamoxifeno, temozolomida, temozolomida bevacizumab, temozolomida sorafenib, trastuzumab, vincristina o cualquier combinación de los mismos.

9. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde la muestra comprende células cancerosas.

10. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde:

(i) el sujeto ha sido tratado previamente con uno o más agentes terapéuticos para tratar un cáncer; e/o

(ii) el sujeto no ha sido tratado previamente con uno o más agentes terapéuticos candidatos identificados.

11. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde la secuenciación de ADN se realiza:

(i) usando al menos una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), pirosecuenciación, PCR en tiempo real, secuenciación de Sanger, secuenciación NextGen, p Cr específica de la metilación (MSPCR), polimorfismos en la longitud de fragmentos de restricción (RFLP), una micromatriz de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), hibridaciónin situ(ISH) e hibridación fluorescentein situ(FISH); e/o

(ii) para identificar al menos una mutación puntual, un polimorfismo, una eliminación, una inserción, una sustitución, una translocación, una fusión, una rotura, una duplicación, una amplificación y una repetición.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, o 10, en donde

(i) el cáncer comprende un cáncer metastásico; e/o

(ii) el cáncer es refractario a un tratamiento previo; e/o

(iii) el cáncer es refractario a un tratamiento previo y el tratamiento previo comprende el estándar de atención para el cáncer.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde

(i) el cáncer comprende un cáncer de próstata, cáncer de pulmón, melanoma, cáncer de esófago/retroperitoneal microcítico, colangiocarcinoma, mesotelioma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, pseudomixoma peritoneal, cáncer del canal anal, cáncer de vagina, cáncer de cuello uterino, cáncer renal, adenocarcinoma de asiento ecrino, adenocarcinoma de glándulas salivales, sarcoma de tejidos blandos uterinos, GIST o cáncer anaplásico de tiroides; e/o

(ii) el cáncer comprende un cáncer del oído medio, oído interno, apéndice, huesos, articulaciones, médula espinal, mama, tejido conjuntivo, esófago, nariz, conductos biliares extrahepáticos, boca, conductos biliares intrahepáticos, riñón, apéndice-colon, laringe, hígado, pulmón, bronquio, ganglios linfáticos, cerebral, espinal, ojo, orofaringe, glándulas endocrinas, genital femenino, pene, escroto, pleura, recto, pelvis renal, uréter, peritoneo, glándulas salivales, piel, intestino delgado, estómago, testículos, lengua o vejiga urinaria; e/o

(iii) el cáncer comprende un cáncer de tejido blando; e/o

(iv) el cáncer comprende cáncer neuroendocrino del páncreas, un cáncer de senos paranasales, un cáncer de labio, un cáncer de cartílago nasal, un cáncer de retina, un cáncer del sistema hematopoyético, un cáncer de pelvis renal o un cáncer de órganos accesorios; y/o

(v) el cáncer comprende un cáncer de las glándulas suprarrenales, cerebelo, cuello uterino, cuerpo uterino, globo ocular, trompa de Falopio, ovario, páncreas, glándula pituitaria, glándula prostática, timo, glándula tiroidea, vagina, labios genitales o vulva; y/o

(vi) el cáncer comprende un cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, colangiocarcinoma, mesotelioma, cáncer de glándulas sudoríparas o GIST; y/o

(vii) el cáncer comprende un cáncer de pulmón no microcítico.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde

(i) la muestra comprende células seleccionadas del grupo que consiste en tejido adiposo, corteza suprarrenal, glándula suprarrenal, glándula suprarrenal: médula, apéndice, vejiga, sangre, vaso sanguíneo, hueso, cartílago óseo, cerebro, mama, colon, células dendríticas, músculo esquelético, esófago, trompa de Falopio, fibroblastos, vesícula biliar, riñón, laringe, hígado, pulmón, ganglio linfático, melanocitos, revestimiento mesotelial, células mioepiteliales, ovario, páncreas, parótida, próstata, glándulas salivales, tejido sinusal, piel, intestino delgado, músculo liso, estómago, sinovio, testículos, timo, tiroides y útero; e/o

(ii) la muestra comprende osteoblastos, células del tejido de revestimiento articular, células del tendón o células del endometrio; e/o

(iii) la muestra comprende células seleccionadas del grupo que consiste en cuello uterino, colon sigmoide y cuerpo uterino.

15. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde

(i) se prolonga la supervivencia libre de progresión (SLP) o la supervivencia libre de enfermedad (SLE) para el sujeto; e/o

(ii) se prolonga la SLP o la SLE en al menos un 30 % en comparación con el tratamiento previo.