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LLA de adultos y sigue siendo una enfermedad agresiva con supervivencia libre de enfermedad a 5 anos entre el 20 y el 50%. El pronostico sigue siendo pobre en ninos y adultos. Las recaidas tempranas son comunes en T-LLA y se asocian con un mal pronostico. La base del tratamiento actual es el diagnostico hemopatologico y se pueden agrupar en subtipos, basado en translocaciones cromosomicas y en perfiles de expresion genica (Inaba, H., et al., Acute lymphoblastic leukaemia. Lancet, 2013. 381(9881): p. 194355).Adult ALL and remains an aggressive disease with disease-free survival at 5 years between 20 and 50%. The prognosis is still poor in children and adults. Early relapses are common in T-ALL and are associated with poor prognosis. The basis of the current treatment is the hemopathological diagnosis and can be grouped into subtypes, based on chromosomal translocations and gene expression profiles (Inaba, H., et al., Acute lymphoblastic leukaemia. Lancet, 2013. 381 (9881): p .194355).
TCFL5 es un factor de transcripcion de la familia basic helix-loop-helix y uno de los 14 genes que caracterizan las leucemias TEL/AMLI-positivas (Gandemer V, Rio AG, de Tayrac M, et al. Five distinct biological processes and 14 differentially expressed genes characterize TEL/AML1-positive leukemia. BMC Genomics. 2007;8:385). Asimismo, ha sido identificado como uno de los 5 factores geneticos asociados a la resistencia a vincristina en LLA (Silveira VS, et al. Gene expression pattern contributing to prognostic factors in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leuk Lymphoma. 2013;54:310-314, Tabla 1). Silveira VS, et al. tambien describen una asociacion significativa entre niveles mas altos de expresion del gen TCFL5 y el estado de la medula osea y con un fenotipo B-LLA ETV6/RUNX1 negativo.TCFL5 is a transcription factor of the basic helix-loop-helix family and one of the 14 genes that characterize TEL / AMLI-positive leukemias (Gandemer V, Rio AG, of Tayrac M, et al. Five distinct biological processes and 14 differentially expressed genes characterize TEL / AML1-positive leukemia BMC Genomics. 2007; 8: 385). It has also been identified as one of the 5 genetic factors associated with vincristine resistance in ALL (Silveira VS, et al. Gene expression pattern contributing to prognostic factors in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leuk Lymphoma. 2013; 54: 310-314 , Table 1). Silveira VS, et al. They also describe a significant association between higher levels of TCFL5 gene expression and bone marrow status and with a negative B-LLA ETV6 / RUNX1 phenotype.
TCFL5 ha sido tambien descrito como un gen diana de NOTCH-1, un importante mediador en el desarrollo de leucemias T-LLA (Weerkamp, F., et al., Identification of Notch target genes in uncommitted T-cell progenitors: No direct induction of a T-cell specific gene program. Leukemia, 2006. 20(11): p. 1967-77). El factor de transcripcion CHA fue clonado por primera vez por los inventores, siendo descrito como una isoforma del gen TCFL5 (Rodriguez, C.I., N. Girones, and M. Fresno, Cha, a basic helix-loop-helix transcription factor involved in the regulation of upstream stimulatory factor activity. J Biol Chem, 2003. 278(44): p. 43135-45).TCFL5 has also been described as a NOTCH-1 target gene, an important mediator in the development of T-ALL leukemia (Weerkamp, F., et al., Identification of Notch target genes in uncommitted T-cell progenitors: No direct induction of a T-cell specific gene program Leukemia, 2006. 20 (11): p. 1967-77). The CHA transcription factor was first cloned by the inventors, being described as an isoform of the TCFL5 gene (Rodriguez, CI, N. Girones, and M. Fresno, Cha, a basic helix-loop-helix transcription factor involved in the regulation of upstream stimulatory factor activity J Biol Chem, 2003. 278 (44): p. 43135-45).
La estratificacion de los pacientes de LLA permite adaptar la intensidad de la terapia al riesgo de recaida del paciente, contribuyendo asi a mejorar la tasa de supervivencia de los pacientes y/o a evitar recaidas. Los perfiles de expresion genica pueden proporcionar una buena herramienta para la subclasificacion y la estratificacion terapeutica de los pacientes (Zhou, Y., et al., Advances in the molecular pathobiology of B-lymphoblastic leukemia. Hum Pathol 2012. 43: 1347-1362; Mullighan, C. G., Molecular genetics of B-precursor acute lymphoblastic leukemia. J Clin Invest 2012. 122: 3407-3415; Mullighan, C. G., Genomic profiling of B-progenitor acute lymphoblastic leukemia. Best Pract Res Clin Haematol 2011. 24: 489-503; Harvey, R. C., et al., Identification of novel cluster groups in pediatric high-riskThe stratification of ALL patients allows the intensity of the therapy to be adapted to the risk of relapse of the patient, thus contributing to improving the survival rate of the patients and / or preventing relapses. Gene expression profiles can provide a good tool for subclassification and therapeutic stratification of patients (Zhou, Y., et al., Advances in the molecular pathobiology of B-lymphoblastic leukemia. Hum Pathol 2012. 43: 1347-1362 ; Mullighan, CG, Molecular genetics of B-precursor acute lymphoblastic leukemia. J Clin Invest 2012. 122: 3407-3415; Mullighan, CG, Genomic profiling of B-progenitor acute lymphoblastic leukemia. Best Pract Res Clin Haematol 2011. 24: 489 -503; Harvey, RC, et al., Identification of novel cluster groups in pediatric high-risk
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B-precursor acute lymphoblastic leukemia with gene expression profiling: correlation with genome-wide DNA copy number alterations, clinical characteristics, and outcome. Blood 2010. 116: 4874-4884;Van Vlierberghe P, Ferrando A. The molecular basis of T cell acute lymphoblastic leukemia. J Clin Invest. 2012;122:3398-3406 ).B-precursor acute lymphoblastic leukemia with gene expression profiling: correlation with genome-wide DNA copy number alterations, clinical characteristics, and outcome. Blood 2010. 116: 4874-4884; Van Vlierberghe P, Ferrando A. The molecular basis of T cell acute lymphoblastic leukemia. J Clin Invest. 2012; 122: 3398-3406).
En EEUU se realizo un gran ensayo clmico denominado "high-risk ALL Therapeutically Applicable Research to Generate Effective Treatments” (TARGET) fruto de la colaboracion entre el Instituto Nacional del Cancer (NCI) y el Grupo de Oncologia Infantil (COG), para la identification y validation de nuevas dianas terapeuticas. Se analizaron 207 muestras de 272 (75%) pacientes de LLA de celulas B precursoras de alto riesgo de los pacientes participates en el ensayo clmico COG p9906 en un esfuerzo para identificar subgrupos de estos pacientes de alto riesgo caracterizados por presentar perfiles de expresion genica caracteristicos. Los resultados de dicho estudio se describen en la solicitud de patente WO2009/064481. En particular, se identificaron marcadores geneticos asociados con alto riesgo en pacientes de B-LLA y el uso de los mismos para el diagnostico, pronostico y/o en la determination de la eficacia del tratamiento. Mas espedficamente los metodos descritos comprenden la determinacion de los niveles de expresion de genes seleccionados del siguiente grupo: CENTG2 (ArfGAP with GTPase domain, ankyrin repeat and PH domain 1); PTPRM (protein tyrosine phosphatase, receptor type, M); STAPl (signal transducing adaptor family member 1); CCNJ (cyclin J); PCDH17 (procadherin 17); MCAM (melanoma cell adhesion molecule); CAPN3 (calpain 3); CABLESl (Cdk5 and Abl enzyme substrate 1); GPR155 (G protein-coupled receptor 155); MUC4 (mucin 4); GPRl 10 (G protein-coupled receptor 110); IGJ (immunoglobulin J polypeptide); NRXN3 (neurexin 3); CD99 (CD99 molecule); CRLF2 (cytokine receptor-like factor 2); ENAM (enamelin); TP53INP1 (tumor protein p53 inducible nuclear protein 1); IFITMl (interferon induced transmembrane protein 1); IFITM2 (interferon induced transmembrane protein 2); JJTTM3 (interferon induced transmembrane protein 3); TTYH2 (tweety homolog 2); SEMA6A (semaphorin 6A); TNFSF4 (tumor necrosis factor superfamily, member 4); y SLC37A3 (solute carrier family 37, member 3).In the USA, a large clinical trial called "high-risk ALL Therapeutically Applicable Research to Generate Effective Treatments" (TARGET) was carried out as a result of the collaboration between the National Cancer Institute (NCI) and the Children's Oncology Group (COG), for the identification and validation of new therapeutic targets 207 samples of 272 (75%) patients of high-risk precursor B-cell ALL of the patients participating in the COG p9906 clinical trial were analyzed in an effort to identify subgroups of these high-risk patients characterized by presenting characteristic gene expression profiles.The results of said study are described in patent application WO2009 / 064481. In particular, genetic markers associated with high risk were identified in B-ALL patients and their use for diagnosis, prognosis and / or in determining the efficacy of the treatment More specifically the methods described comprise the determination of the expression levels of genes selected from the following group: CENTG2 (ArfGAP with GTPase domain, ankyrin repeat and PH domain 1); PTPRM (protein tyrosine phosphatase, receptor type, M); STAPl (signal transducing adapter family member 1); CCNJ (cyclin J); PCDH17 (procadherin 17); MCAM (melanoma cell adhesion molecule); CAPN3 (calpain 3); CABLESl (Cdk5 and Abl enzyme substrate 1); GPR155 (G protein-coupled receptor 155); MUC4 (mucin 4); GPRl 10 (G protein-coupled receptor 110); IGJ (immunoglobulin J polypeptide); NRXN3 (neurexin 3); CD99 (CD99 molecule); CRLF2 (cytokine receptor-like factor 2); ENAM (enamelin); TP53INP1 (tumor protein p53 inducible nuclear protein 1); IFITMl (interferon induced transmembrane protein 1); IFITM2 (interferon induced transmembrane protein 2); JJTTM3 (interferon induced transmembrane protein 3); TTYH2 (tweety homolog 2); SEMA6A (semaphorin 6A); TNFSF4 (tumor necrosis superfamily factor, member 4); and SLC37A3 (solute carrier family 37, member 3).
WO2015/092755 reporta un metodo para el diagnostico o pronostico de leucemia linfoblastica aguda de alta hiperdiploidia (HeH-ALL en sus siglas en ingles) mediante la determinacion simultanea de la presencia/ausencia de los cromosomas 6, 18 y 21 utilizando la tecnologia iFISH.WO2015 / 092755 reports a method for the diagnosis or prognosis of acute high hyperdiploidy lymphoblastic leukemia (HeH-ALL) by simultaneous determination of the presence / absence of chromosomes 6, 18 and 21 using the iFISH technology.
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WO2008/019872 se refiere a un metodo para el diagnostico de leucemia linfoblastica aguda en ninos mediante la determination de los niveles de expresion de al menos 14 genes de los descritos en las tablas 1-4 o 5-16, en especial aquellos mostrados en la Figura 3 de dicha publication: DNTT, SBGR101, DEFA3, CAMP, FCER2, DEFA4, BPI, PGLYRP1, LTF, SBGR2, NM_003526, CEACAM8, RNASE3, y ELA2.WO2008 / 019872 refers to a method for the diagnosis of acute lymphoblastic leukemia in children by determining the expression levels of at least 14 genes of those described in Tables 1-4 or 5-16, especially those shown in Figure 3 of said publication: DNTT, SBGR101, DEFA3, CAMP, FCER2, DEFA4, BPI, PGLYRP1, LTF, SBGR2, NM_003526, CEACAM8, RNASE3, and ELA2.
Asi pues, a pesar de los avances en el tratamiento de la LLA, existe una necesidad urgente de identificar biomarcadores espedficos que permitan monitorizar la eficacia del tratamiento y el pronostico de la enfermedad. La mejora de los metodos pronosticos es esencial para poder predecir de manera fiable el riesgo del paciente y asi optimizar la estrategia de tratamiento permitiendo personalizar la terapia, reduciendo la toxicidad en pacientes de bajo riesgo y permitiendo terapias agresivas en pacientes de riesgo elevado.Thus, despite advances in the treatment of ALL, there is an urgent need to identify specific biomarkers that allow monitoring the efficacy of the treatment and the prognosis of the disease. The improvement of the prognostic methods is essential to be able to reliably predict the risk of the patient and thus optimize the treatment strategy by allowing to customize the therapy, reducing toxicity in low-risk patients and allowing aggressive therapies in high-risk patients.
La adoption de la terapia mas adecuada para cada paciente de LLA gracias a su correcta clasificacion en funcion del pronostico de la enfermedad permitira aumentar el porcentaje de exito del tratamiento, consiguiendo un mayor porcentaje de supervivencia y evitando recaidas, presentando tambien como ventaja la reduction de los costes de tratamiento y hospitalization asociados.The adoption of the most appropriate therapy for each ALL patient thanks to its correct classification according to the prognosis of the disease will allow to increase the success rate of the treatment, achieving a higher survival rate and avoiding relapses, also presenting the reduction of the associated treatment and hospitalization costs.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCIONBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
Los inventores efectuaron un analisis bioinformatico partiendo de datos de secuencias de RNAm de TCFL5 publicadas en las bases de datos de secuenciacion de RNA "RNAseq” (NCBI, Ensemble, Vega y EC gene) en el que se analizaron las uniones de exones, y se establecieron los mensajeros consenso expresados en humano (ver Figura 1 y Tabla I del Ejemplo 1). En base a dichos resultados, los inventores establecieron que el gen TCFL5 presenta a nivel de RNAm 6 isoformas mayoritarias distintas: (1) TCFL5R, (2) TCFL5R4b, (3) TCFL5R7, (4) TCFL5R4b6 (5) TCFL5R6 y (6) CHA (Tcfl5R2b o R2b), aumentando el numero de isoformas respecto a las 2 isoformas previamente descritas: TCFL5 y CHA.The inventors performed a bioinformatic analysis based on data from TCFL5 mRNA sequences published in the RNAseq RNA sequencing databases (NCBI, Ensemble, Vega and EC gene) in which the exon junctions were analyzed, and established consensus messengers expressed in human (see Figure 1 and Table I of Example 1.) Based on these results, the inventors established that the TCFL5 gene presents 6 different major isoforms at the mRNA level: (1) TCFL5R, (2) TCFL5R4b, (3) TCFL5R7, (4) TCFL5R4b6 (5) TCFL5R6 and (6) CHA (Tcfl5R2b or R2b), increasing the number of isoforms with respect to the 2 isoforms previously described: TCFL5 and CHA.
En el presente documento cuando se hace referencia a la isoforma TCFL5 se refiere a aquella que presenta E1, E2a, E3, E4 (E4a o E4b), E5 y E8; es decir, engloba a TCFL5R y TCFL5R4b.In this document, when referring to the TCFL5 isoform, it refers to that which has E1, E2a, E3, E4 (E4a or E4b), E5 and E8; that is, it encompasses TCFL5R and TCFL5R4b.
La isoforma CHA fue descrita previamente por los inventores (Rodriguez, C.I., N. Girones, and M. Fresno, Cha, a basic helix-loop-helix transcription factor involved in the regulation of upstream stimulatory factor activity. J Biol Chem, 2003. 278(44): p. 43135-45) y se originaThe CHA isoform was previously described by the inventors (Rodriguez, CI, N. Girones, and M. Fresno, Cha, a basic helix-loop-helix transcription factor involved in the regulation of upstream stimulatory factor activity. J Biol Chem, 2003. 278 (44): p. 43135-45) and originates
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debido a que CHA utiliza un promotor alternativo situado entre el exon 1 y 2, presentando como exon inicial E2b. A nivel RNAm CHA presenta E2b, E3, E4, E5 y E8. Asi pues se diferencia de TCFL5 por la ausencia de E1 y por presentar E2b en lugar de E2a (la porcion de la secuencia de E2a distinta de E2b se ha indicado en cursiva en la Figura 3).because CHA uses an alternative promoter located between exon 1 and 2, presenting as initial exon E2b. At the RNAm level, CHA presents E2b, E3, E4, E5 and E8. Thus, it differs from TCFL5 by the absence of E1 and by presenting E2b instead of E2a (the portion of the E2a sequence other than E2b has been indicated in italics in Figure 3).
Es importante considerar que el exon 2b contiene un 5’UTR y una region codificante coincidente con E2a por lo que a nivel proteico la secuencia correspondiente a E2 es identica en TCFL5 y CHA, y por tanto CHA se diferencia unicamente por la ausencia de la secuencia aminoaddica correspondiente a E1.It is important to consider that exon 2b contains a 5'UTR and a coding region coincident with E2a so that at the protein level the sequence corresponding to E2 is identical in TCFL5 and CHA, and therefore CHA differs only by the absence of the sequence Amino acid corresponding to E1.
Asimismo, los inventores detectaron por primera vez que para un mismo tejido, lmea celular o muestra de paciente, bajo las mismas condiciones experimentales, las isoformas TCFL5 y CHA (TCFL5R2b) presentan una expresion diferencial, en concreto se observaron distintos grados de expresion tanto a nivel de RNAm (Fig.2 y 7B) como proteico (Fig.7A).Likewise, the inventors detected for the first time that for the same tissue, cell line or patient sample, under the same experimental conditions, the TCFL5 and CHA (TCFL5R2b) isoforms have a differential expression, in particular different degrees of expression were observed both at mRNA level (Fig. 2 and 7B) as protein (Fig. 7A).
La determinacion precisa del riesgo de un paciente a sufrir una recaida constituye el paradigma fundamental en el tratamiento de la leucemia linfoblastica aguda (LLA). Dicha estratificacion de los pacientes en funcion del riesgo permite adaptar la intensidad de la terapia al riesgo de recaida del paciente. Considerando la expresion diferencial de dichas isoformas, los inventores emitieron la hipotesis de que el uso de TCFL5 como marcador pronostico y/o de diagnostico diferencial en LLA dependera de si se determinan los niveles de expresion de la isoforma TCFL5, de la isoforma CHA (TCFL5R2b) o de ambas.The precise determination of a patient's risk of relapse constitutes the fundamental paradigm in the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL). Said stratification of the patients according to the risk allows the intensity of the therapy to be adapted to the patient's relapse risk. Considering the differential expression of these isoforms, the inventors hypothesized that the use of TCFL5 as a prognostic marker and / or differential diagnosis in ALL will depend on whether the levels of expression of the TCFL5 isoform are determined, of the CHA isoform (TCFL5R2b ) or both.
En base a dicha hipotesis, procedieron al diseno de cebadores y sondas que detectan el RNAm de las isoformas TCFL5 y CHA respectivamente de manera espedfica e independiente, y ambas isoformas simultaneamente (TCFL5/CHA).Based on this hypothesis, they proceeded to design primers and probes that detect the mRNA of the TCFL5 and CHA isoforms respectively in a specific and independent manner, and both isoforms simultaneously (TCFL5 / CHA).
Los inventores establecieron una asociacion entre niveles bajos de expresion de TCFL5/CHA y un pronostico de LLA de alto riesgo (Fig.6C y Tabla VI del Ejemplo 5). En particular, observaron que la expresion de RNAm de TCFL5/CHA en el momento del diagnostico es mucho menor en las LLA de alto riesgo respecto de las LLA de riesgo no alto (medio o bajo) (Tabla VII del Ejemplo 5). En la Fig.6A (Tabla IV del Ejemplo 5) se muestra que en el momento del diagnostico la expresion de TCFL5/CHA en pacientes de LLA-T es menor que en pacientes de LLA-B, aunque la diferencia no es estadisticamente significativa.The inventors established an association between low levels of TCFL5 / CHA expression and a high-risk ALL prognosis (Fig. 6C and Table VI of Example 5). In particular, they observed that the expression of mRNA of TCFL5 / CHA at the time of diagnosis is much lower in high-risk ALL than in non-high-risk (medium or low) ALL (Table VII of Example 5). In Fig. 6A (Table IV of Example 5) it is shown that at the time of diagnosis the expression of TCFL5 / CHA in patients with ALL-T is less than in patients with ALL-B, although the difference is not statistically significant.
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Una asociacion entre niveles bajos de expresion de TCFL5/CHA y un pronostico de LLA de alto riesgo se observo tambien al analizar exclusivamente muestras de LLA-B (Tablas IX y X del Ejemplo 5) que es el grupo representado de manera mayoritaria en la cohorte analizada.An association between low levels of expression of TCFL5 / CHA and a prognosis of high-risk ALL was also observed when exclusively analyzing samples of ALL-B (Tables IX and X of Example 5) which is the group represented mostly in the cohort analyzed.
Asimismo, los inventores determinaron que existe una correlation entre los niveles de expresion de TCFL5/CHA en pacientes con LLA y la progresion de la enfermedad y/o eficacia del tratamiento. Mas espedficamente, observaron que la expresion de RNAm de TCFL5/CHA en LLA es significativamente menor en la recaida que en el diagnostico (Fig.6B y Tabla V del Ejemplo 5), dicha asociacion se observa especialmente en muestras de B-LLA (Tabla VIII del Ejemplo 5).Likewise, the inventors determined that there is a correlation between the levels of expression of TCFL5 / CHA in patients with ALL and the progression of the disease and / or efficacy of the treatment. More specifically, they observed that the expression of TCFL5 / CHA mRNA in ALL is significantly lower in relapse than in diagnosis (Fig. 6B and Table V of Example 5), this association is especially observed in samples of B-ALL (Table VIII of Example 5).
Por tanto, de acuerdo con dichos hallazgos la presente invention se refiere en un primer aspecto a un metodo para el pronostico y/o diagnostico diferencial de pacientes con leucemia linfoblastica aguda (LLA) que comprende las siguientes etapas:Therefore, according to these findings, the present invention relates in a first aspect to a method for the prognosis and / or differential diagnosis of patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL) comprising the following stages:
a. determinar, preferiblemente de manera simultanea, los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5 en una muestra biologica aislada de dicho paciente; yto. determine, preferably simultaneously, the expression levels of the TCFL5 and CHA isoforms of the TCFL5 gene in a biological sample isolated from said patient; Y
b. comparar los niveles de expresion de TCFL5/CHA en la muestra del paciente con valores de referencia,b. compare the levels of expression of TCFL5 / CHA in the patient sample with reference values,
donde una reduction en los valores de la muestra del paciente respecto a los valores de referencia es indicativa de LLA de alto riesgo.where a reduction in the values of the patient sample with respect to the reference values is indicative of high-risk ALL.
El termino "los niveles de expresion de TCFL5/CHA” tal y como se utiliza en la presente invencion hace referencia a los niveles de expresion de TCFL5 y CHA de manera conjunta.The term "TCFL5 / CHA expression levels" as used in the present invention refers to the TCFL5 and CHA expression levels together.
En un aspecto asociado, la presente invencion se refiere al uso in vitro de los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5 determinados, preferiblemente de manera simultanea, en una muestra biologica aislada de un paciente con leucemia linfoblastica aguda (LLA) para el pronostico y/o diagnostico diferencial de pacientes con LLA, donde una reduccion en los valores de TCFL5/CHA en la muestra del paciente respecto a valores de referencia es indicativa de LLA de alto riesgo.In an associated aspect, the present invention relates to the in vitro use of the levels of expression of the TCFL5 and CHA isoforms of the determined TCFL5 gene, preferably simultaneously, in an isolated biological sample of a patient with acute lymphoblastic leukemia (ALL) for the prognosis and / or differential diagnosis of patients with ALL, where a reduction in the values of TCFL5 / CHA in the patient sample with respect to reference values is indicative of high-risk ALL.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere tambien a un metodo para la monitorizacion de la progresion de la enfermedad y/o eficacia del tratamiento en pacientes con LLA que comprende las siguientes etapas:In another aspect, the present invention also relates to a method for monitoring disease progression and / or efficacy of treatment in patients with ALL comprising the following stages:
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a. determinar, preferiblemente de manera simultanea, los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5 en una muestra biologica aislada de dicho paciente; yto. determine, preferably simultaneously, the expression levels of the TCFL5 and CHA isoforms of the TCFL5 gene in a biological sample isolated from said patient; Y
b. comparar los niveles de expresion de TCFL5/CHA en la muestra del paciente con valores de referencia,b. compare the levels of expression of TCFL5 / CHA in the patient sample with reference values,
donde una reduction en los valores de la muestra del paciente respecto a los valores de referencia es indicativo de recaida.where a reduction in the values of the patient sample with respect to the reference values is indicative of relapse.
En un aspecto relacionado, la presente invention se refiere al uso in vitro de los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5 determinados, preferiblemente de manera simultanea, en una muestra biologica aislada de un paciente con leucemia linfoblastica aguda (LLA) para la monitorizacion de la progresion de la enfermedad y/o eficacia del tratamiento en pacientes con LLA, donde una reduccion en los valores de la muestra del paciente respecto a valores de referencia es indicativa de recaida.In a related aspect, the present invention relates to the in vitro use of the levels of expression of the TCFL5 and CHA isoforms of the determined TCFL5 gene, preferably simultaneously, in an isolated biological sample of a patient with acute lymphoblastic leukemia (ALL) for the monitoring of disease progression and / or efficacy of treatment in patients with ALL, where a reduction in the values of the patient sample with respect to reference values is indicative of relapse.
La invencion hace referencia tambien a un metodo para la determination del tratamiento mas adecuado para un paciente de LLA que comprende la clasificacion de dicho paciente de acuerdo con el metodo para el pronostico y/o diagnostico diferencial del primer aspecto de la invencion.The invention also refers to a method for determining the most appropriate treatment for an ALL patient that comprises the classification of said patient according to the method for the prognosis and / or differential diagnosis of the first aspect of the invention.
En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a un metodo para el tratamiento de pacientes de LLA donde dicho tratamiento se determina en funcion de la clasificacion de dicho paciente de acuerdo con el metodo para el pronostico y/o diagnostico diferencial del primer aspecto de la invencion.In a further aspect, the present invention relates to a method for the treatment of ALL patients where said treatment is determined based on the classification of said patient according to the method for the prognosis and / or differential diagnosis of the first aspect of the invention.
En otro aspecto, la invencion hace referencia a un kit para el pronostico, diagnostico diferencial y/o monitorizacion de pacientes con leucemia linfoblastica aguda (LLA) que comprende:In another aspect, the invention refers to a kit for the prognosis, differential diagnosis and / or monitoring of patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL) comprising:
a. un cebador y/o sonda que comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 70, y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%; yto. a primer and / or probe comprising or consisting of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 70, and sequences identical to any of them at least 75%; Y
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b. opcionalmente, instrucciones para el uso de dicho reactivo para la determination de los niveles de expresion de dichas isoformas en una muestra biologica aislada de dicho paciente.b. optionally, instructions for the use of said reagent for the determination of the expression levels of said isoforms in a biological sample isolated from said patient.
La invention se refiere tambien al uso de un kit para el pronostico, diagnostico diferencial y/o monitorizacion de pacientes con leucemia linfoblastica aguda (LLA) en un metodo de acuerdo con el primer aspecto de la invencion, donde dicho kit comprende:The invention also relates to the use of a kit for the prognosis, differential diagnosis and / or monitoring of patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL) in a method according to the first aspect of the invention, wherein said kit comprises:
a. un reactivo para determinar, preferiblemente de manera simultanea, los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5; yto. a reagent to determine, preferably simultaneously, the expression levels of the TCFL5 and CHA isoforms of the TCFL5 gene; Y
b. opcionalmente, instrucciones para el uso de dicho reactivo para la determinacion de los niveles de expresion de dichas isoformas en una muestra biologica aislada de dicho paciente.b. optionally, instructions for the use of said reagent for the determination of the expression levels of said isoforms in a biological sample isolated from said patient.
En un aspecto adicional, la invencion esta relacionada con una secuencia nucleotidica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 70, y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%.In a further aspect, the invention is related to a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 70, and sequences identical to any of them at least 75%.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURASBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
Fig.1: Transcritos RNAm consenso mayoritarios del gen TCFL5. Se determinaron mediante analisis de las uniones de exones sobre las bases de datos ya publicadas de secuencias de RNAseq del gen TCFL5.Fig. 1: Transcribed mRNA consensus majority of the TCFL5 gene. They were determined by analysis of exon junctions on already published databases of RNAseq sequences of the TCFL5 gene.
Fig.2: Transcritos de RNAm de TCFL5 correspondientes al exon E1 vs E2 codificantes presentes en diferentes celulas/tejidos. Se determinaron mediante analisis de las bases de datos ya publicadas de RNAseq referentes al gen TCFL5 y se representan por codigos de colores (mas oscuro mayor frecuencia), respecto a los 2 exones. Se observa una expresion alta de E2 codificante en celulas y tejidos donde la expresion de E1 es baja, indicando una expresion diferencial de CHA respecto al resto de isoformas del gen TCFL5 (presentan E1).Fig. 2: TCFL5 mRNA transcripts corresponding to exon E1 vs E2 encoders present in different cells / tissues. They were determined by analysis of the already published RNAseq databases referring to the TCFL5 gene and are represented by color codes (darker higher frequency), with respect to the 2 exons. A high expression of coding E2 is observed in cells and tissues where the expression of E1 is low, indicating a differential expression of CHA with respect to the other isoforms of the TCFL5 gene (they present E1).
Fig.3: Secuencia de TCFL5 RNAm (SEQ ID NO:1). Se indican las regiones 5’UTR y 3’UTR. Asimismo, se especifica la secuencia correspondiente a la region codificante en la que los distintos exones E1, E2, E3, E4, E5 y E8 se indican con alternancia de colores (gris y negro). En esta secuencia el exon 2 es E2a, la parte del exon 2a utilizado por TCFL5 peroFig. 3: Sequence of TCFL5 RNAm (SEQ ID NO: 1). The 5’UTR and 3’UTR regions are indicated. Likewise, the sequence corresponding to the coding region in which the different exons E1, E2, E3, E4, E5 and E8 are indicated with alternating colors (gray and black) is specified. In this sequence, exon 2 is E2a, the part of exon 2a used by TCFL5 but
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no por CHA es representada en cursiva y el ATG iniciador de CHA dentro del exon 2 se ha resaltado en negrita (la parte no traducida de este exon para CHA es distinta y representa el exon 2b, no mostrado). La region comun para ambas isoformas se muestra sombreada en gris. Asimismo, se han enmarcado unas de las secuencias utilizadas para el diseno de cebadores donde el cebador forward se une a E5 y el reverse a E8.not by CHA it is represented in italics and the CHA initiator ATG within exon 2 has been highlighted in bold (the untranslated part of this exon for CHA is different and represents exon 2b, not shown). The common region for both isoforms is shaded in gray. Likewise, some of the sequences used for the design of primers where the forward primer joins E5 and the reverse to E8 have been framed.
Fig.4: Alineamiento de las secuencias codificantes de TCFL5 y CHA (RNAm).Fig. 4: Alignment of the coding sequences of TCFL5 and CHA (mRNA).
Fig.5: Expresion de TCFL5 y CHA en celulas Jurkat: efectos de DAPT (inhibidor de Notchl) sobre los niveles de expresion de TCFL5/CHA a nivel protema (Western Blot).Fig. 5: Expression of TCFL5 and CHA in Jurkat cells: effects of DAPT (Notchl inhibitor) on levels of TCFL5 / CHA expression at the protein level (Western Blot).
Fig.6: Expresion de TCFL5/CHA en muestras de LLA obtenidas de pacientes: Los niveles de expresion de TCFL5/CHA a nivel de RNAm se muestran de manera individualizada para cada uno de los grupos de estudio. En las graficas se comparan los valores obtenidos en muestras (A) de B-ALL vs T-ALL, (B) recogidas en el momento de diagnostico vs recaidas y (C) clasificadas en funcion del grado de riesgo bajo, medio o alto de acuerdo con los criterios especificados en materiales y metodos.Fig. 6: Expression of TCFL5 / CHA in samples of ALL obtained from patients: The levels of expression of TCFL5 / CHA at the mRNA level are shown individually for each of the study groups. The graphs compare the values obtained in samples (A) of B-ALL vs T-ALL, (B) collected at the time of diagnosis vs. relapses and (C) classified according to the degree of low, medium or high risk of according to the criteria specified in materials and methods.
Fig.7: Expresion de TCFL5/CHA en muestras de leucemias ALL obtenidas de pacientes en el momento del diagnostico (LLA012, LL014) y recaida (LLA751, LLA783). (A) Expresion de las protemas CHA y TCFL5 por Western Blot; (B) Cuantificacion del RNAm de TCFL5/CHA por qRT-PCR.Fig. 7: Expression of TCFL5 / CHA in ALL leukemia samples obtained from patients at the time of diagnosis (LLA012, LL014) and relapse (LLA751, LLA783). (A) Expression of the CHA and TCFL5 proteins by Western Blot; (B) Quantification of the mRNA of TCFL5 / CHA by qRT-PCR.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIONDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
DefinicionesDefinitions
El termino “seguimiento o monitorizacion de la progresion de la enfermedad” como se usa en el presente documento se refiere a determinar la evolucion de la enfermedad, por ejemplo determinar si existe una recaida.The term "monitoring or monitoring of disease progression" as used herein refers to determining the evolution of the disease, for example determining whether there is a relapse.
El termino “eficacia de un tratamiento” como se usa en el presente documento se refiere al grado en el que un tratamiento logra el resultado deseado o previsto, por ejemplo, la capacidad de un farmaco para lograr el efecto deseado.The term "efficacy of a treatment" as used herein refers to the degree to which a treatment achieves the desired or intended result, for example, the ability of a drug to achieve the desired effect.
El termino “tratamiento” engloba tanto un tratamiento profilactico como terapeutico. ElThe term "treatment" encompasses both a prophylactic and therapeutic treatment. He
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termino “tratamiento terapeutico” como se usa en el presente documento se refiere a aquel cuyo objetivo es pasar de un estado de enfermedad o patologico a un estado de salud. El termino “tratamiento profilactico” tal y como se usa en el presente documento se refiere a la prevencion de un estado patologico.The term "therapeutic treatment" as used herein refers to one whose objective is to move from a disease or pathological state to a state of health. The term "prophylactic treatment" as used herein refers to the prevention of a pathological state.
El termino "cantidad terapeuticamente efectiva" como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad que es efectiva, tras la administracion de una dosis unica o multiple a un sujeto (por ejemplo, a un paciente humano) en el tratamiento profilactico o terapeutico de una enfermedad, trastorno o afeccion patologica.The term "therapeutically effective amount" as used herein, refers to an amount that is effective, after administration of a single or multiple dose to a subject (eg, a human patient) in prophylactic treatment or Therapeutic of a disease, disorder or pathological condition.
El termino "sonda" como se usa en el presente documento se refiere a acidos nucleicos producidos de forma sintetica o biologica, de entre 10 y 285 nucleotidos de longitud que contienen secuencias nucleotidicas espedficas que permiten una hibridacion espedfica y preferente bajo condiciones predeterminadas a las secuencias de acido nucleico diana, y opcionalmente se han modificado para la deteccion o para potenciar el rendimiento del ensayo. En general, es necesario un minimo de diez nucleotidos para obtener estadisticamente la especificidad y para formar productos de hibridacion estables, y un maximo de 285 nucleotidos representa en general un limite superior para la longitud en la que los parametros de reaccion se pueden ajustar facilmente para determinar secuencias erroneamente emparejadas e hibridacion preferente. Opcionalmente, las sondas pueden contener determinados elementos constitutivos que contribuyen a su funcionamiento correcto u optimo en determinadas condiciones de ensayo. Por ejemplo, las sondas se pueden modificar para mejorar su resistencia a la degradacion por nucleasas, para llevar a cabo la deteccion de ligandos (por ejemplo, marcaje con fluorescema) o para facilitar su captura sobre un soporte solido (por ejemplo, cola de polyA).The term "probe" as used herein refers to nucleic acids produced synthetically or biologically, between 10 and 285 nucleotides in length that contain specific nucleotide sequences that allow specific and preferential hybridization under predetermined conditions to the sequences. of target nucleic acid, and optionally have been modified for detection or to enhance assay performance. In general, a minimum of ten nucleotides is necessary to obtain statistically specificity and to form stable hybridization products, and a maximum of 285 nucleotides generally represents an upper limit for the length at which the reaction parameters can be easily adjusted for determine erroneously paired sequences and preferential hybridization. Optionally, the probes may contain certain constituent elements that contribute to their correct or optimal operation under certain test conditions. For example, the probes can be modified to improve their resistance to degradation by nucleases, to carry out the detection of ligands (for example, fluorescema labeling) or to facilitate their capture on a solid support (for example, polyA tail ).
El termino "cebadores" como se usa en el presente documento se refiere a oligonucleotidos o sondas que se pueden usar en un procedimiento de amplificacion, tal como una reaccion en cadena de la polimerasa ("PCR"), para amplificar una secuencia de nucleotidos. Los cebadores se disenan en base a la secuencia polinucleotidica de una secuencia diana particular, por ejemplo, una secuencia de RNAm espedfica. El diseno y la validacion de cebadores y sondas es bien conocido en la tecnica. Para procedimientos de PCR en tiempo real cuantitativa, vease, por ejemplo, Rodriguez A et al. (Methods Mol Biol., 2015, 1275:3156).The term "primers" as used herein refers to oligonucleotides or probes that can be used in an amplification procedure, such as a polymerase chain reaction ("PCR"), to amplify a nucleotide sequence. The primers are designed based on the polynucleotide sequence of a particular target sequence, for example, a specific mRNA sequence. The design and validation of primers and probes is well known in the art. For quantitative real-time PCR procedures, see, for example, Rodriguez A et al. (Methods Mol Biol., 2015, 1275: 3156).
El termino “espedfico" como se usa en el presente documento quiere decir que unaThe term "specific" as used herein means that a
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secuencia nucleotidica se hibridara a/amplificara una secuencia diana predeterminada y no se hibridara sustancialmente a/amplificara una secuencia no diana en las condiciones de ensayo, en general se usan condiciones restrictivas.Nucleotide sequence will hybridize to / amplify a predetermined target sequence and not substantially hybridize to / amplify a non-target sequence under test conditions, in general restrictive conditions are used.
El termino "hibridacion" como se usa en el presente documento se refiere a un procedimiento por el que, en condiciones de reaccion predeterminadas, dos hebras parcial, sustancial o completamente complementarias de acido nucleico se deja que entren en contacto de forma antiparalela para formar un acido nucleico bicatenario con enlaces de hidrogeno espedficos y estables, siguiendo reglas explicitas que hacen que las bases de acidos nucleicos se puedan emparejar entre si.The term "hybridization" as used herein refers to a process whereby, under predetermined reaction conditions, two partially, substantially or completely complementary strands of nucleic acid are allowed to come into contact in an antiparallel manner to form a double stranded nucleic acid with specific and stable hydrogen bonds, following explicit rules that make the nucleic acid bases can match each other.
El termino "parcialmente complementaria" tal y como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia nucleotidica que es al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% complementaria a una secuencia nucleotidica de referencia.The term "partially complementary" as used herein refers to a nucleotide sequence that is at least about 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% complementary to a reference nucleotide sequence.
El termino "sustancialmente complementaria" tal y como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia nucleotidica que es al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% complementaria a una secuencia nucleotidica de referencia.The term "substantially complementary" as used herein refers to a nucleotide sequence that is at least about 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% complementary to a reference nucleotide sequence.
El termino "hibridacion sustancial" quiere decir que la cantidad de hibridacion observada sera tal que alguien que observe los resultados considere el resultado positivo con respecto a los datos de hibridacion en controles positivos y negativos. Los datos que se consideran "ruido de fondo" no son de hibridacion sustancial.The term "substantial hybridization" means that the amount of hybridization observed will be such that someone who observes the results considers the positive result with respect to hybridization data in positive and negative controls. Data that are considered "background noise" are not of substantial hybridization.
El termino "condiciones de hibridacion restrictivas" quiere decir de aproximadamente 35 °C a 65 °C en una solucion salina de NaCl aproximadamente 0,9 molar. La restriction tambien se puede regir por dichos parametros de reaccion como la concentration y el tipo de especies ionicas presentes en la solucion de hibridacion, los tipos y concentraciones de agentes desnaturalizantes presentes, y la temperatura de hibridacion. En general, como las condiciones de hibridacion se vuelven mas restrictivas, son preferentes sondas mas largas si se van a formar hibridos estables. Como norma, la restriccion de las condiciones bajo las que va a tener lugar la hibridacion determinara ciertas caracteristicas de las sondas preferentes que se van a emplear.The term "restrictive hybridization conditions" means from about 35 ° C to 65 ° C in a saline solution of NaCl about 0.9 molar. The restriction can also be governed by such reaction parameters such as the concentration and type of ionic species present in the hybridization solution, the types and concentrations of denaturing agents present, and the hybridization temperature. In general, as hybridization conditions become more restrictive, longer probes are preferred if stable hybrids are to be formed. As a rule, the restriction of the conditions under which hybridization will take place will determine certain characteristics of the preferred probes to be used.
El termino "anticuerpo” incluye anticuerpos monoclonales y policlonales, asi como anticuerpos recombinantes. El termino “anticuerpo recombinante” tal y como se utiliza en laThe term "antibody" includes monoclonal and polyclonal antibodies, as well as recombinant antibodies. The term "recombinant antibody" as used in the
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presente invention se refiere a un anticuerpo producido o expresado utilizando un vector de expresion recombinante, donde el vector de expresion comprende un acido nucleico que codifica el anticuerpo recombinante, tal que la introduction del vector de expresion en una celula huesped apropiada resulta en la production o expresion del anticuerpo recombinante. Los anticuerpos recombinantes pueden ser anticuerpos quimericos o humanizados, anticuerpos mono- o multi-espetificos. El termino "anticuerpo" tambien se refiere a fragmentos y derivados de todos los anteriores, y puede comprender ademas cualquier variante de los mismos que retienen la capacidad de unirse espedficamente a un eprtopo. Los anticuerpos pueden incluir, pero no se limitan a anticuerpos monoclonales (mAbs), anticuerpos de dominio unico (sdAb), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), fragmentos Fab, F (ab')2, fragmentos Fv (sdFv) disulfuros, anti-idiotipo (anticuerpos anti-Id), intra- cuerpos, anticuerpos sinteticos, y fragmentos de union a eprtopo de cualquiera de los anteriores. El termino "anticuerpo" tambien se refiere a una protema de fusion que incluye una region equivalente a la region Fc de una inmunoglobulina.The present invention relates to an antibody produced or expressed using a recombinant expression vector, wherein the expression vector comprises a nucleic acid encoding the recombinant antibody, such that the introduction of the expression vector into an appropriate host cell results in the production or recombinant antibody expression. The recombinant antibodies can be chimeric or humanized antibodies, mono- or multi-specific antibodies. The term "antibody" also refers to fragments and derivatives of all of the foregoing, and may also comprise any variant thereof that retain the ability to specifically bind an eprtope. Antibodies may include, but are not limited to monoclonal antibodies (mAbs), single domain antibodies (sdAb), single chain antibodies (scFv), Fab fragments, F (ab ') 2, Fv fragments (sdFv) disulfides, anti -diotype (anti-Id antibodies), intra-bodies, synthetic antibodies, and epitope binding fragments of any of the foregoing. The term "antibody" also refers to a fusion protein that includes a region equivalent to the Fc region of an immunoglobulin.
El termino "kit" indica un conjunto de reactivos y coadyuvantes requeridos para un analisis. Aunque un kit consiste en la mayoria de los casos de varias unidades, tambien pueden estar disponibles los varios elementos de analisis presentados en una unica unidad, que deben considerarse como kits.The term "kit" indicates a set of reagents and adjuvants required for an analysis. Although a kit consists of most cases of several units, the various analysis elements presented in a single unit, which should be considered as kits, may also be available.
Un metodo para el pronostico y/o diagnostico diferencial de pacientes con leucemia linfoblastica aguda (LLA)A method for the prognosis and / or differential diagnosis of patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL)
En un primer aspecto la invencion se refiere a un metodo para el pronostico de pacientes con leucemia linfoblastica aguda (LLA) que comprende las siguientes etapas:In a first aspect the invention relates to a method for the prognosis of patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL) comprising the following stages:
a. determinar, preferiblemente de manera simultanea, los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5 en una muestra biologica aislada de dicho paciente; yto. determine, preferably simultaneously, the expression levels of the TCFL5 and CHA isoforms of the TCFL5 gene in a biological sample isolated from said patient; Y
b. comparar los niveles de expresion de TCFL5/CHA en la muestra del paciente con valores de referencia,b. compare the levels of expression of TCFL5 / CHA in the patient sample with reference values,
donde una reduction en los valores de la muestra del paciente respecto a los valores de referencia es indicativa de LLA de alto riesgo.where a reduction in the values of the patient sample with respect to the reference values is indicative of high-risk ALL.
El metodo segun el primer aspecto de la invencion permite el diagnostico diferencial, la clasificacion o estratificacion de los pacientes de LLA en base al pronostico e.g., LLA de alto riesgo.The method according to the first aspect of the invention allows differential diagnosis, classification or stratification of ALL patients based on the prognosis e.g., high-risk ALL.
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En un aspecto relacionado la invention se refiere a un metodo para el diagnostico diferencial de pacientes con leucemia linfoblastica aguda (LLA) que comprende las siguientes etapas:In a related aspect the invention relates to a method for the differential diagnosis of patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL) comprising the following stages:
a. determinar, preferiblemente de manera simultanea, los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5 en una muestra biologica aislada de dicho paciente; yto. determine, preferably simultaneously, the expression levels of the TCFL5 and CHA isoforms of the TCFL5 gene in a biological sample isolated from said patient; Y
b. comparar los niveles de expresion de TCFL5/CHA en la muestra del paciente con valores de referencia,b. compare the levels of expression of TCFL5 / CHA in the patient sample with reference values,
donde una reduction en los valores de la muestra del paciente respecto a los valores de referencia es indicativa de LLA de alto riesgo.where a reduction in the values of the patient sample with respect to the reference values is indicative of high-risk ALL.
Donde la expresion “determination simultanea” se refiere a la determination conjunta y mediante una unica reaction, por ejemplo mediante el uso de cebadores que amplifican la region comun a ambas isoformas (RNAm) y/o el uso de reactivos de afinidad que se unen espetificamente a los polipeptidos codificados por las mismas.Where the expression "simultaneous determination" refers to the joint determination and by a single reaction, for example by the use of primers that amplify the common region to both isoforms (mRNA) and / or the use of affinity reagents that bind specifically to the polypeptides encoded by them.
El gen TCFL5 (NCBI Gene ID: 10732) se ha descrito en humanos y codifica para un factor de transcription de tipo basic helix-loop-helix. Esta localizado en el cromosoma 20 (20q13.33) y presenta 8 exones(E1-E8) que sufren “splicing” alternativos dando lugar a 6 formas mayoritarias segun analisis bionformaticos llevados a cabo por los inventores de las bases de datos de secuenciacion de RNA “RNAseq” (NCBI, Ensemble, Vega y EC gene). Dichas isoformas del gen TCFL5 son: (1) TCFL5R, (2) TCFL5R4b, (3) TCFL5R7, (4) TCFL5R4b6 (5) TCFL5R6 y (6) CHA (Tcfl5R2b o R2b), aumentando el numero de isoformas respecto a las 2 isoformas previamente descritas: Tcfl5R y CHA (Tcfl5R2b). Ver Figura 1 y Tabla I del Ejemplo 1.The TCFL5 gene (NCBI Gene ID: 10732) has been described in humans and encodes a transcription factor of the basic helix-loop-helix type. It is located on chromosome 20 (20q13.33) and has 8 exons (E1-E8) that undergo alternative splicing giving rise to 6 major forms according to bionformatic analyzes carried out by the inventors of RNA sequencing databases "RNAseq" (NCBI, Ensemble, Vega and EC gene). Said isoforms of the TCFL5 gene are: (1) TCFL5R, (2) TCFL5R4b, (3) TCFL5R7, (4) TCFL5R4b6 (5) TCFL5R6 and (6) CHA (Tcfl5R2b or R2b), increasing the number of isoforms with respect to 2 previously described isoforms: Tcfl5R and CHA (Tcfl5R2b). See Figure 1 and Table I of Example 1.
La secuencia canonica de la variante de transcription o isoforma TCFL5 (RNAm) es TCFL5R y se identifica en la presente invencion como SEQ ID NO:1 (NCBI: NM_006602).The canonical sequence of the transcription variant or isoform TCFL5 (mRNA) is TCFL5R and is identified in the present invention as SEQ ID NO: 1 (NCBI: NM_006602).
La secuencia de la variante de transcription o isoforma CHA (RNAm) se identifica en la presente invencion como SEQ ID NO:2 (NCBI: AJ271337.1).The sequence of the transcription variant or isoform CHA (mRNA) is identified in the present invention as SEQ ID NO: 2 (NCBI: AJ271337.1).
Los polipeptidos codificados por las isoformas TCFL5 y CHA (RNAm) corresponden a las secuencias de aminoacidos SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4, respectivamente.The polypeptides encoded by the TCFL5 and CHA (mRNA) isoforms correspond to the amino acid sequences SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively.
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La determination de las isoformas TCFL5 y CHA de acuerdo con el metodo de la invention se realiza preferiblemente con reactivos que detectan ambas isoformas del gen TCFL5 (a nivel de RNAm o proteico) de manera simultanea, mas preferiblemente la detection y/o cuantificacion de dichas isoformas es espedfica para TCFL5 y CHA, no detectandose y/o cuantificandose otras isoformas del gen TCFL5.The determination of the TCFL5 and CHA isoforms according to the method of the invention is preferably carried out with reagents that detect both isoforms of the TCFL5 gene (at the mRNA or protein level) simultaneously, more preferably the detection and / or quantification of said Isoforms are specific for TCFL5 and CHA, not detecting and / or quantifying other isoforms of the TCFL5 gene.
En un modo de realization particular, los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA se determinan a nivel de RNA mensajero (RNAm).In a particular embodiment, the expression levels of the TCFL5 and CHA isoforms are determined at the level of messenger RNA (mRNA).
Los procedimientos de biologia molecular para cuantificar las secuencias de acidos nucleicos diana son bien conocidos en la tecnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a PCR de punto final, PCR competitiva, transcriptasa inversa asociada a PCR (RT- PCR), PCR cuantitativa (qPCR), transcriptasa inversa asociada a qPCR (RT-qPCR), PCR- pirosecuenciacion, PCR-ELISA, micromatrices de ADN, espectrometria de masas, ensayos de hibridacion in situ tales como inmunotransferencia por puntos (dot-blot) o ensayo de hibridacion in situ con fluorescencia (FISH), ADN ramificado (bDNA; Nolte, Adv. Clin. Chem. 1998,33:201-235) y versiones multiplex de dichos procedimientos (vease, por ejemplo, Andoh et al., Current Pharmaceutical Design, 2009;15,2066-2073), asi como la proxima generation de cualquiera de las tecnicas enumeradas y combinaciones de las mismas, todos los cuales estan dentro del alcance de la presente invencion. Dichos procedimientos pueden incluir tambien la pre-conversion del RNAm en cDNA a traves de la reaction con una transcriptasa inversa (RT), por ejemplo la reaccion de PCR es habitualmente precedida de la conversion del RNAm en cDNA y se refiere como RT-PCR.Molecular biology methods for quantifying target nucleic acid sequences are well known in the art. These procedures include, but are not limited to endpoint PCR, competitive PCR, reverse transcriptase associated with PCR (RT-PCR), quantitative PCR (qPCR), reverse transcriptase associated with qPCR (RT-qPCR), PCR-pyrosequencing, PCR -ELISA, DNA microarrays, mass spectrometry, in situ hybridization assays such as dot blotting or fluorescence in situ hybridization assay (FISH), branched DNA (bDNA; Nolte, Adv. Clin. Chem 1998,33: 201-235) and multiplex versions of such procedures (see, for example, Andoh et al., Current Pharmaceutical Design, 2009; 15,2066-2073), as well as the next generation of any of the techniques listed and combinations thereof, all of which are within the scope of the present invention. Such methods may also include pre-conversion of mRNA into cDNA through the reaction with a reverse transcriptase (RT), for example the PCR reaction is usually preceded by the conversion of mRNA into cDNA and is referred to as RT-PCR.
Los cebadores y/o sondas, en general, reaccionan ofreciendo una respuesta directa y lineal a cantidades crecientes de las secuencias de acidos nucleicos dianas. Gracias a la comparacion con estandares apropiados, se puede cuantificar facilmente la cantidad de una secuencia de acidos nucleicos dados en una muestra. Preferentemente, dicho procedimiento molecular para cuantificacion genica se selecciona del grupo que consiste en reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), PCR-pirosecuenciacion, hibridacion in situ con fluorescencia (FISH), micromatrices de ADN y PCR-ELISA.Primers and / or probes, in general, react by offering a direct and linear response to increasing amounts of target nucleic acid sequences. Thanks to the comparison with appropriate standards, the amount of a nucleic acid sequence given in a sample can be easily quantified. Preferably, said molecular procedure for genetic quantification is selected from the group consisting of quantitative polymerase chain reaction (qPCR), PCR-pyrosequencing, fluorescence in situ hybridization (FISH), DNA microarrays and PCR-ELISA.
Un procedimiento de cuantificacion preferido es FISH, que combina la hibridacion de sondas con microscopia optica fluorescente, microscopia laser confocal o citometria de flujo para laA preferred quantification procedure is FISH, which combines probe hybridization with fluorescent optical microscopy, confocal laser microscopy or flow cytometry for
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cuantificacion directa de secuencias diana individuals.direct quantification of individual target sequences.
Otro procedimiento de cuantificacion preferido es la PCR cuantitativa (qPCR) asociada a la transcriptasa inversa. La qPCR o PCR en tiempo real es bien conocidad por un experto en la materia. Se comercializan distintos instrumentos para llevar a cabo dicha reaccion, tales como ABI Prism 7700 SDS, GeneAmp 5700 SDS, ABI Prism 7900 HT SDS de Applied Biosystems; iCycler iQ de Bio-Rad; Smart Cycler de Cepheid; Rotor-Gene de Corbett Research; LightCycler de Roche Molecular Biochemicals y Mx4000 Multiplex de Stratagene. El procedimiento de qPCR permite la cuantificacion exacta del producto de PCR en tiempo real midiendo la acumulacion del producto de PCR muy pronto en la fase exponencial de la reaccion, reduciendo asi el sesgo en la cuantificacion ligado a la eficacia de la amplification de PCR que se produce en la PCR de punto final. La PCR en tiempo real es bien conocida en la tecnica y por tanto, no se describe en detalle en el presente documento. Una vision general de la tecnologia y los protocolos para qPCR estan disponibles, por ejemplo, de los proveedores mencionados anteriormente, por ejemplo,Another preferred quantification procedure is quantitative PCR (qPCR) associated with reverse transcriptase. The qPCR or real-time PCR is well known by an expert in the field. Different instruments are commercialized to carry out said reaction, such as ABI Prism 7700 SDS, GeneAmp 5700 SDS, ABI Prism 7900 HT SDS of Applied Biosystems; iCycler iQ from Bio-Rad; Cepheid Smart Cycler; Rotor-Gene from Corbett Research; LightCycler by Roche Molecular Biochemicals and Mx4000 Multiplex by Stratagene. The qPCR procedure allows the exact quantification of the PCR product in real time by measuring the accumulation of the PCR product very early in the exponential phase of the reaction, thus reducing the bias in the quantification linked to the efficiency of the PCR amplification that is produces in endpoint PCR. Real-time PCR is well known in the art and therefore, is not described in detail herein. An overview of the technology and protocols for qPCR are available, for example, from the providers mentioned above, for example,
http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html o
http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/pcr/quantitative-pcr/qpcr- technical-guide.html. Una revision del uso de qPCR en la cuantificacion de mRNA se encuentra por ejemplo en Wong ML y Medrano JF, Biotechniques 2005, 39(1):75-85.
http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html or
http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/pcr/quantitative-pcr/qpcr- technical-guide.html. A review of the use of qPCR in the quantification of mRNA is found for example in Wong ML and Medrano JF, Biotechniques 2005, 39 (1): 75-85.
Estan disponibles diferentes bioqtimicas de detection para qPCR. Se pueden usar todas ellas con los instrumentos de qPCR mencionados anteriormente. El termino “bioqtimica de deteccion” se refiere a un procedimiento para informar de la amplificacion del producto de PCR espedfico en PCR en tiempo real. Dichas bioqtimicas de deteccion se clasifican en dos grupos principales. El primer grupo comprende moleculas de intercalado de ADN de doble cadena: tales como SYBR Green I y EvaGreen; y el segundo grupo incluye oligonucleotidos marcados tipicamente con un fluoroforo. Este ultimo, a su vez, se ha dividido en tres subgrupos: (i) cebadores-sondas (Scorpions, Amplifluor®, LUX™, Cyclicons, Angler®); (ii) sondas de hidrolisis (TaqMan, MGB-TaqMan, Snake assay) y de hibridacion (Hybprobe or FRET, Molecular Beacons, HyBeacon™, MGB-Pleiades, MGB-Eclipse, ResonSense®, Yin-Yang or displacing); y (iii) analogos de acidos nucleicos (PNA, LNA®, ZNA ™, bases no naturales: Plexor™ primer, Tiny-Molecular Beacon), ver E. Navarro eta l. ,Clinica Chimica Acta, Volume 439, 15 January 2015, Pages 231-250.Different detection bioqtimics are available for qPCR. All of them can be used with the qPCR instruments mentioned above. The term "biochemical detection" refers to a procedure for reporting the amplification of the specific PCR product in real-time PCR. Said biochemical detection is classified into two main groups. The first group comprises double stranded DNA interleaving molecules: such as SYBR Green I and EvaGreen; and the second group includes oligonucleotides typically labeled with a fluorophore. The latter, in turn, has been divided into three subgroups: (i) primers-probes (Scorpions, Amplifluor®, LUX ™, Cyclicons, Angler®); (ii) hydrolysis (TaqMan, MGB-TaqMan, Snake assay) and hybridization (Hybprobe or FRET, Molecular Beacons, HyBeacon ™, MGB-Pleiades, MGB-Eclipse, ResonSense®, Yin-Yang or displacing) probes; and (iii) nucleic acid analogs (PNA, LNA®, ZNA ™, non-natural bases: Plexor ™ primer, Tiny-Molecular Beacon), see E. Navarro eta l. , Chimica Acta Clinic, Volume 439, January 15, 2015, Pages 231-250.
En un modo de realization preferente, dichas sondas son oligonucleotidos de doble marcaje, tales como sondas de hidrolisis o balizas moleculares. El extremo 5’ del oligonucleotido,In a preferred embodiment, said probes are double-labeled oligonucleotides, such as hydrolysis probes or molecular beacons. The 5 ’end of the oligonucleotide,
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tipicamente, se marca con una molecula indicadora (reporter) fluorescente tales como FAM, TET o JOE mientras que el extremo 3’ se marca con una molecula desactivadora (quencher), tales como TAM o BHQ1. La secuencia de la sonda es espedfica para una region de interes en la molecula diana amplificada. En un modo de realizacion mas preferente, dicha sonda es una sonda de hidrolisis que esta disenada de modo que la longitud de la secuencia situa el fluoroforo 5’ y la molecula desactivadora 3’ en proximidad suficientemente estrecha para suprimir la fluorescencia. Varias moleculas indicadoras y extintoras para su uso en sondas de qPCR son bien conocidas en la tecnica. Estas estan disponibles, por ejemplo, de
https://www.eurofinsgenomics.eu/en/dna-rna- oligonucleotides/optimised-application-oligos/qpcr-probes.aspx.Typically, it is marked with a fluorescent reporter molecule such as FAM, TET or JOE while the 3 'end is labeled with a quencher molecule, such as TAM or BHQ1. The probe sequence is specific for a region of interest in the amplified target molecule. In a more preferred embodiment, said probe is a hydrolysis probe that is designed so that the length of the sequence places the fluorophore 5 'and the deactivating molecule 3' in close proximity sufficiently narrow to suppress fluorescence. Several indicator and extinguishing molecules for use in qPCR probes are well known in the art. These are available, for example, from
https://www.eurofinsgenomics.eu/en/dna-rna- oligonucleotides / optimized-application-oligos / qpcr-probes.aspx.
Generalmente, para la cuantificacion de secuencias de nucleotidos se utilizan sondas y/o cebadores. El termino "un cebador y/o sonda” incluye espedficamente "cebadores y/o sondas”, englobando por ejemplo a un cebador, una sonda, un cebador y una sonda, una pareja de cebadores, y una pareja de cebadores y una sonda. Ambos terminos se utilizan de manera indistinta en la presente invencion.Generally, probes and / or primers are used to quantify nucleotide sequences. The term "a primer and / or probe" specifically includes "primers and / or probes", encompassing, for example, a primer, a probe, a primer and a probe, a pair of primers, and a pair of primers and a probe. Both terms are used interchangeably in the present invention.
Las sondas y/o cebadores utilizadas en el metodo de la invencion hibridan espedficamente con SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2. Dichas sondas y/o cebadores son parcialmente complementarias, preferiblemente sustancial o completamente complementarias a SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 o a fragmentos de las mismas tal y como se describe en el presente documento.The probes and / or primers used in the method of the invention hybridize specifically with SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2. Said probes and / or primers are partially complementary, preferably substantially or completely complementary to SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2 or fragments thereof as described herein.
Preferiblemente, una sonda y/o cebador es un secuencia de polinucleotidos de entre 10 y 30 nucleotidos, mas preferiblemente de entre 15 y 26 nucleotidos, aun mas preferiblemente de entre 18 y 22 nucleotidos, y aun mucho mas preferiblemente de alrededor de 20 nucleotidos. En una realizacion particular, dichos cebadores y/o sondas han sido modificados para la deteccion o para potenciar el rendimiento del ensayo.Preferably, a probe and / or primer is a sequence of polynucleotides of between 10 and 30 nucleotides, more preferably between 15 and 26 nucleotides, even more preferably between 18 and 22 nucleotides, and even more preferably of about 20 nucleotides. In a particular embodiment, said primers and / or probes have been modified for detection or to enhance assay performance.
En una realizacion particular, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 70 (ver Tabla III), y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%.In a particular embodiment, said primers and / or probes comprise or consist of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 70 (see Table III), and sequences identical to any of them in al minus 75%
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Preferiblemente, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 70 (ver Tabla III).Preferably, said primers and / or probes comprise or consist of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 70 (see Table III).
En otra realizacion particular, dichos cebadores y/o sondas son espedficos para la cuantificacion/amplificacion de una region comprendida entre los exones 3 y 8 de TCFL5R (SEQ ID NO: 1) permitiendo cuantificar de manera espedfica y simultanea la expresion de TCFL5 (independientemente de que el exon 4 presente la variante E4a o E4b) y CHA (TCFL5R2b).In another particular embodiment, said primers and / or probes are specific for the quantification / amplification of a region between exons 3 and 8 of TCFL5R (SEQ ID NO: 1) allowing to quantify the expression of TCFL5 in a specific and simultaneous manner (independently that exon 4 presents the variant E4a or E4b) and CHA (TCFL5R2b).
En dicho modo de realizacion particular, la determinacion de los niveles de expresion de las isoformas TCFL5/CHA a nivel RNAm se efectua mediante la cuantificacion de una secuencia comprendida entre el primer nucleotido de E3 y el ultimo nucleotido de E8.In said particular embodiment, the determination of the levels of expression of the TCFL5 / CHA isoforms at the mRNA level is performed by quantifying a sequence between the first nucleotide of E3 and the last nucleotide of E8.
En una realizacion preferida, dichos cebadores y/o sondas hibridan espedficamente con secuencias comprendidas en cualquiera de los exones E3, E4, E5 y/o E8, incluyendo cuando ambos cebadores hibridan en un mismo exon y cualquier combinacion de los mismos. Preferiblemente, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 42; y SEQ ID NO: 45 a SEQ ID NO: 62 (ver Tabla III), y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%. Mas preferiblemente, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una pareja de cebadores seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 42; y SEQ ID NO: 45 a SEQ ID NO: 62 (ver Tabla III).In a preferred embodiment, said primers and / or probes hybridize specifically with sequences comprised in any of exons E3, E4, E5 and / or E8, including when both primers hybridize to the same exon and any combination thereof. Preferably, said primers and / or probes comprise or consist of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 42; and SEQ ID NO: 45 to SEQ ID NO: 62 (see Table III), and sequences identical to any of them in at least 75%. More preferably, said primers and / or probes comprise or consist of a pair of primers selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 42; and SEQ ID NO: 45 to SEQ ID NO: 62 (see Table III).
En otra realizacion preferida, dichos cebadores y/o sondas hibridan espedficamente con secuencias comprendidas en cualquiera de los exones E3, E4 y/o E5 (amplificando una region comun a todas las isoformas), incluyendo cuando ambos cebadores hibridan en un mismo exon y cualquier combinacion de los mismos. Preferiblemente, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 42 (ver Tabla III), y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%. Mas preferiblemente, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una pareja de cebadores seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 42 (ver Tabla III).In another preferred embodiment, said primers and / or probes hybridize specifically with sequences comprised in any of exons E3, E4 and / or E5 (amplifying a region common to all isoforms), including when both primers hybridize to the same exon and any combination thereof. Preferably, said primers and / or probes comprise or consist of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 42 (see Table III), and sequences identical to any of them at least 75% . More preferably, said primers and / or probes comprise or consist of a pair of primers selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 42 (see Table III).
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En otra realizacion preferida, dichos cebadores y/o sondas amplifican la region comun y espedfica de las isoformas TCFL5R y CHA, mas espedficamente un cebador y/o sonda hibrida en E3 o E5 y el otro en E8, o ambos en E8.In another preferred embodiment, said primers and / or probes amplify the common and specific region of the TCFL5R and CHA isoforms, more specifically a primer and / or probe hybridized in E3 or E5 and the other in E8, or both in E8.
En una realizacion mas preferida, uno de los cebadores y/o sondas hibrida espedficamente con una secuencia comprendida en E5 y el otro en E8. Preferiblemente, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 45 a SEQ ID NO: 54 (ver Tabla III), y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%. Mas preferiblemente, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una pareja de cebadores seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 45 a SEQ ID NO: 54 (ver Tabla III).In a more preferred embodiment, one of the primers and / or probes hybridizes specifically with a sequence comprised in E5 and the other in E8. Preferably, said primers and / or probes comprise or consist of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 45 to SEQ ID NO: 54 (see Table III), and sequences identical to any of them at least 75% . More preferably, said primers and / or probes comprise or consist of a pair of primers selected from the group consisting of SEQ ID NO: 45 to SEQ ID NO: 54 (see Table III).
En otra realizacion mas preferida, uno de los cebadores y/o sondas hibrida espedficamente con una secuencia comprendida en E3 y el otro en E8. Preferiblemente, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 55 a SEQ ID NO: 56 (ver Tabla III), y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%. Mas preferiblemente, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una pareja de cebadores seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 55 a SEQ ID NO: 56 (ver Tabla III).In another more preferred embodiment, one of the primers and / or probes hybridizes specifically with a sequence comprised in E3 and the other in E8. Preferably, said primers and / or probes comprise or consist of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 55 to SEQ ID NO: 56 (see Table III), and sequences identical to any of them at least 75% . More preferably, said primers and / or probes comprise or consist of a pair of primers selected from the group consisting of SEQ ID NO: 55 to SEQ ID NO: 56 (see Table III).
En otra realizacion mas preferida adicional, ambos cebadores y/o sondas hibridan en E8. Preferiblemente, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57 a SEQ ID NO: 62 (ver Tabla III), y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%. Mas preferiblemente, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una pareja de cebadores seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57 a SEQ ID NO: 62 (ver Tabla III).In another more preferred embodiment, both primers and / or probes hybridize on E8. Preferably, said primers and / or probes comprise or consist of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 57 to SEQ ID NO: 62 (see Table III), and sequences identical to any of them at least 75% . More preferably, said primers and / or probes comprise or consist of a pair of primers selected from the group consisting of SEQ ID NO: 57 to SEQ ID NO: 62 (see Table III).
Mas preferiblemente, dichos cebadores y/o sondas comprenden o consisten en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 45 (Primer TCFL5/CHA 01 Forward): GAGACTGACAAGGCCACAACT, SEQ ID NO: 46 (Primer TCFL5/CHA 01 Reverse):More preferably, said primers and / or probes comprise or consist of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 45 (First TCFL5 / CHA 01 Forward): GAGACTGACAAGGCCACAACT, SEQ ID NO: 46 (First TCFL5 / CHA 01 Reverse) :
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CCGCAAAATACGCTCTCAA, y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%.CCGCAAAATACGCTCTCAA, and sequences identical to any of them in at least 75%.
Las secuencias oligonucleotidicas con una identidad de al menos un 75 % mencionadas en la presente invention presentan preferiblemente una identidad de al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, mas preferentemente, 96 %, 97 %, 98%, 99% o un 100% con las respectivas secuencias de referencia. Ademas, estas secuencias con una identidad de al menos un 75 % pueden tener el mismo numero de nucleotidos, o bien presentar mas o menos nucleotidos que la secuencia de referencia.The oligonucleotide sequences with an identity of at least 75% mentioned in the present invention preferably have an identity of at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, more preferably, 96 %, 97%, 98%, 99% or 100% with the respective reference sequences. In addition, these sequences with an identity of at least 75% may have the same number of nucleotides, or have more or less nucleotides than the reference sequence.
Los niveles de cuantificacion pueden ser absolutos o relativos. En general, es preferente que los niveles de expresion se normalicen. La normalization se puede realizar con respecto a diferentes medidas en la muestra, tal como por peso de la muestra, cuantificacion de celulas humanas, cuantificacion de ADN total, y/o cuantificacion de los niveles de expresion de un gen de expresion constitutiva. Estos procedimientos son bien conocidos para un experto en la tecnica.Quantification levels can be absolute or relative. In general, it is preferred that the expression levels be normalized. Normalization can be performed with respect to different measurements in the sample, such as by sample weight, quantification of human cells, quantification of total DNA, and / or quantification of the expression levels of a constitutive expression gene. These procedures are well known to a person skilled in the art.
En un modo de realization particular, la normalizacion se lleva a cabo con respecto a la cuantificacion de los niveles de expresion de un gen de expresion constitutiva. En la presente invencion se entiende por "genes que se expresan de forma constitutiva" o "genes de expresion constitutiva", a aquellos genes que se ha descrito que se transcriben de manera constante. Ejemplos de genes que se expresan de forma constitutiva son 2- mioglobulina, ubiquitina, protema ribosomal 18S, ciclofilina A, GAPDH, protema de activation de la tirosina 3-monooxigenasa/triptofano 5-monooxigenasa (YWHAZ), beta- actina, p-2- microglobulina o hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (HPRT).In a particular embodiment, normalization is carried out with respect to the quantification of expression levels of a constitutive expression gene. In the present invention, "genes that are constitutively expressed" or "genes of constitutive expression" are understood to be those genes that have been described that are constantly transcribed. Examples of constitutively expressed genes are 2- myoglobulin, ubiquitin, 18S ribosomal protein, cyclophilin A, GAPDH, tyrosine activation protein 3-mono-oxygenase / tryptophan 5-mono-oxygenase (YWHAZ), beta-actin, p-2 - microglobulin or hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HPRT).
En un modo de realizacion preferente, la cuantificacion de los niveles de expresion de TCFL5/CHA se realiza por RT-qPCR y comprende la normalizacion de los niveles de expresion respecto a un gen de expresion constitutiva.In a preferred embodiment, the quantification of TCFL5 / CHA expression levels is performed by RT-qPCR and comprises the normalization of expression levels with respect to a constitutive expression gene.
La detection y/o cuantificacion de las isoformas TCFL5/CHA se puede llevar a cabo tambien a nivel proteico. Los polipeptidos codificados por las isoformas TCFL5 y CHA (RNAm)The detection and / or quantification of the TCFL5 / CHA isoforms can also be carried out at the protein level. The polypeptides encoded by the TCFL5 and CHA (mRNA) isoforms
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corresponden a las secuencias de aminoacidos referidas como SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4 en la presente invencion. Existen diversos metodos para la cuantificacion de peptidos y protemas bien conocidos por un experto en la materia, tales como inmunoensayos. Diversos tipos de inmunoensayos son conocidos por un experto en la materia para la cuantificacion de manera espedfica de protemas de interes, ya sea en solucion o utilizando un ensayo en fase solida. Dichos metodos estan basados en el uso de reactivos de afinidad, que pueden ser receptores o ligandos espedficos, por ejemplo anticuerpos, preferiblemente marcados. Por ejemplo, el Western Blot o inmunotransferencia permite comparar las abundancias de protemas separadas mediante un gel electroforetico, eg. SDS-PAGE. En esta tecnica, las protemas separadas por electroforesis en gel se transfieren sobre una lamina de material polimerico (generalmente de nitrocelulosa, nylon, o difluoruro de polivinilideno), donde se inmovilizan. Las protemas diana se revelan mediante el uso de una solucion que contiene un anticuerpo espedfico. El anticuerpo puede conjugarse directamente con un marcador radiactivo, fluorescente o enzimatico (metodo de deteccion directa) o bien se puede usar un anticuerpo secundario que reconoce el anticuerpo primario y por lo tanto amplifica la senal (metodo de deteccion indirecta o ensayo de tipo sandwich).correspond to the amino acid sequences referred to as SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 in the present invention. There are various methods for the quantification of peptides and proteins well known to a person skilled in the art, such as immunoassays. Various types of immunoassays are known to a person skilled in the art for the specific quantification of proteins of interest, either in solution or using a solid phase assay. Such methods are based on the use of affinity reagents, which may be specific receptors or ligands, for example antibodies, preferably labeled. For example, Western blotting or immunoblotting allows comparing abundances of proteins separated by an electrophoretic gel, eg. SDS-PAGE. In this technique, the proteins separated by gel electrophoresis are transferred onto a sheet of polymeric material (generally of nitrocellulose, nylon, or polyvinylidene difluoride), where they are immobilized. Target proteins are revealed by the use of a solution containing a specific antibody. The antibody can be conjugated directly with a radioactive, fluorescent or enzymatic marker (direct detection method) or a secondary antibody can be used that recognizes the primary antibody and therefore amplifies the signal (indirect detection method or sandwich type assay) .
Tradicionalmente, la cuantificacion espedfica de protemas en solucion se ha efectuado mediante inmunoensayos en un soporte solido. Tipicamente, se inmoviliza un anticuerpo de captura espedfico para la protema diana en una superficie polimerica o de plastico y se anade al soporte una solucion que contiene la protema de interes (por ejemplo, suero o lisado celular). Finalmente, se incuba la muestra en el soporte durante un tiempo para permitir que se formen los complejos antigeno-anticuerpo. A continuacion, se suelen realizar uno o mas lavados para eliminar la solucion y la protema diana se detecta con un segundo anticuerpo que reconoce un eprtopo de protema diferente al reconocido por el anticuerpo de captura. Al igual que en el caso del Western Blot, este anticuerpo de deteccion puede estar marcado directamente o puede ser reconocido con un anticuerpo secundario. Un inmunoensayo comunmente utilizado para la cuantificacion de protemas es el ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA) en el que el anticuerpo de deteccion lleva una enzima que convierte un sustrato comunmente incoloro en un compuesto coloreado o un sustrato no fluorescente en un compuesto fluorescente. Asimismo, en otros inmunoensayos en fase solida, el anticuerpo puede estar marcado con un isotopo radioactivo o con fluorescencia.Traditionally, the specific quantification of proteins in solution has been carried out by immunoassays on a solid support. Typically, a specific capture antibody for the target protein is immobilized on a polymeric or plastic surface and a solution containing the protein of interest (eg, serum or cell lysate) is added to the support. Finally, the sample is incubated on the support for a time to allow antigen-antibody complexes to form. Next, one or more washes are usually performed to remove the solution and the target protein is detected with a second antibody that recognizes a different protein epitope than the one recognized by the capture antibody. As in the case of Western Blot, this detection antibody can be directly labeled or can be recognized with a secondary antibody. An immunoassay commonly used for protein quantification is the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in which the detection antibody carries an enzyme that converts a commonly colorless substrate into a colored compound or a non-fluorescent substrate into a fluorescent compound. Also, in other solid phase immunoassays, the antibody may be labeled with a radioactive or fluorescent isotope.
Otros metodos que pueden ser utilizados para la cuantificacion de las isoformas TCFL5 y CHA de acuerdo con la invencion son tecnicas basadas en espectrometna de masas (MS)Other methods that can be used for the quantification of the TCFL5 and CHA isoforms according to the invention are techniques based on mass spectrometry (MS)
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tales como la cromatografia liquida acoplada a la espectrometria de masas (LC/MS), descrita por ejemplo en US2010/0173786, o el tandem LC-MS/MS (WO2012/155019, US2011/0039287, Rauh M., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2012 Feb 1;883-884:59-67), as^ como el uso de arrays de peptidos, protemas o anticuerpos y versiones multiplex de las tecnicas mencionadas, as^ como la proxima generation de dichas tecnicas y combinaciones de las mismas.such as liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC / MS), described for example in US2010 / 0173786, or the LC-MS / MS tandem (WO2012 / 155019, US2011 / 0039287, Rauh M., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2012 Feb 1; 883-884: 59-67), as well as the use of peptide, protein or antibody arrays and multiplex versions of the mentioned techniques, as well as the next generation of such techniques and combinations from the same.
En un modo de realization particular de la invention, opcionalmente en combination con una o mas de las caracteristicas descritas anteriormente, la cuantificacion de TCFL5/CHA se realiza mediante un inmunoensayo que comprende el uso de cualquier anticuerpo que detecte ambas isoformas, tales como HPA055223 (Sigma) o SAB4500152 (Sigma), o bien anticuerpos espedficos de cada una de ellas.In a particular embodiment of the invention, optionally in combination with one or more of the features described above, the quantification of TCFL5 / CHA is performed by an immunoassay comprising the use of any antibody that detects both isoforms, such as HPA055223 ( Sigma) or SAB4500152 (Sigma), or specific antibodies of each of them.
El grado de variation en los valores de expresion de TCFL5/CHA en la muestra del paciente respecto a los valores de referencia puede ser, por ejemplo, de al menos el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150% o mas. Preferiblemente, dicha variacion es estadisticamente significativa. Como se usa en este documento, "estadisticamente significativa" se refiere a un valor de p de menos de 0,05, por ejemplo, un valor de p de menos de 0,025, un valor de p de menos de 0,01 o un valor de p de menos de 0,005, utilizando una prueba estadistica apropiada. Un experto en la tecnica sabra definir aquellas pruebas estadisticas mas apropiadas. Preferentemente, en aquellos casos en los que haya una distribucion normal y homocedasticidad, se usa un modelo parametrico tal como la prueba de la t de student o la prueba de ANOVA; y cuando no se logre al menos uno de estos dos requisitos, entonces se usa, en general, un modelo no parametrico tal como la prueba de la U de Mann-Whitney o la prueba de Kruskal-Wallis.The degree of variation in the expression values of TCFL5 / CHA in the patient sample with respect to the reference values may be, for example, at least 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30 %, 35%, 40%, 45%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150% or more. Preferably, said variation is statistically significant. As used herein, "statistically significant" refers to a p-value of less than 0.05, for example, a p-value of less than 0.025, a p-value of less than 0.01 or a value of p of less than 0.005, using an appropriate statistical test. A person skilled in the art will know how to define the most appropriate statistical tests. Preferably, in those cases where there is a normal distribution and homocedasticity, a parametric model such as the student t test or the ANOVA test is used; and when at least one of these two requirements is not achieved, then, in general, a non-parametric model such as the Mann-Whitney U test or the Kruskal-Wallis test is used.
Las muestras biologicas para el uso en los metodos de la invencion pueden obtenerse a partir de una variedad de tejidos o fluidos biologicos, en particular de sangre, pero tambien pueden ser utilizadas muestras de medula osea, linfa, liquido cefalorraqtideo, liquido sinovial, y similares. Tales muestras se pueden separar por centrifugation, decantation, separation en gradiente de densidad, aferesis, selection por afinidad, FACS, etc. antes del analisis. Las muestras biologicas utilizadas en el metodo de la presente invencion son preferiblemente muestras de medula osea, de sangre periferica o de liquido cefalorraqtideo. Dichos tipos de muestra se utilizan de manera habitual en la practica clmica y un experto en la materia sabra identificar los medios adecuados para su obtencion y conservationBiological samples for use in the methods of the invention may be obtained from a variety of biological tissues or fluids, in particular blood, but bone marrow, lymph, cerebrospinal fluid, synovial fluid, and the like can also be used. . Such samples can be separated by centrifugation, decantation, density gradient separation, aferesis, affinity selection, FACS, etc. before the analysis The biological samples used in the method of the present invention are preferably samples of bone marrow, peripheral blood or cerebrospinal fluid. These types of samples are used routinely in clinical practice and a person skilled in the art will know how to identify the appropriate means for obtaining and conserving them.
(Coustan-Smith E et al., Blood. 2002 Oct 1;100(7):2399-402; Martinez-Laperche C et al.,(Coustan-Smith E et al., Blood. 2002 Oct 1; 100 (7): 2399-402; Martinez-Laperche C et al.,
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American journal of hematology 88: 359-64). Una vez obtenida la muestra biologica, se puede utilizar directamente, congelar, o mantener en un medio de cultivo apropiado. Varios medios de cultivo pueden ser empleados para mantener las celulas en cultivo. Las muestras se pueden obtener por cualquier procedimiento adecuado, tal como la extraccion de sangre, puncion venosa, biopsia, o similares.American journal of hematology 88: 359-64). Once the biological sample is obtained, it can be used directly, frozen, or kept in an appropriate culture medium. Several culture media can be used to keep the cells in culture. Samples can be obtained by any suitable procedure, such as blood collection, venous puncture, biopsy, or the like.
Las celulas mononucleares (MC) son generalmente aisladas de dicha muestra biologica, mediante metodos conocidos en el estado del arte. Las celulas mononucleares se aislan tipicamente mediante centrifugacion por gradiente de densidad, por ejemplo con Ficoll® o Percoll®.Mononuclear cells (MC) are generally isolated from said biological sample, by methods known in the state of the art. Mononuclear cells are typically isolated by density gradient centrifugation, for example with Ficoll® or Percoll®.
En una realizacion particular, la determinacion de los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA se efectua en una poblacion celular que se ha aislado de una muestra biologica del paciente mediante un procedimiento que comprende una centrifugacion por gradiente de densidad.In a particular embodiment, the determination of the expression levels of the TCFL5 and CHA isoforms is carried out in a cell population that has been isolated from a biological sample of the patient by a procedure comprising a density gradient centrifugation.
Tras el aislamiento de MCs de las muestras biologicas, una seleccion espedfica del tipo celular de interes puede llevarse a cabo usando uno de los muchos metodos descritos en la literatura, sobre la base de la expresion de marcadores de superficie celular espedficos y, si procede, de otras protemas, asi como la actividad de proliferacion, el metabolismo y / o el estado morfologico de las celulas. Tipicamente, la purificacion de una poblacion celular de interes en una muestra biologica comprende una seleccion positiva y/o negativa en base a la expresion de marcadores de superficie celular caracteristicos.After the isolation of MCs from biological samples, a specific selection of the cell type of interest can be carried out using one of the many methods described in the literature, based on the expression of specific cell surface markers and, if appropriate, of other proteins, as well as the activity of proliferation, metabolism and / or the morphological state of the cells. Typically, the purification of a cell population of interest in a biological sample comprises a positive and / or negative selection based on the expression of characteristic cell surface markers.
En otra realizacion particular, la determinacion de los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA se efectua en una poblacion de celulas de LLA que se ha aislado de una muestra biologica del paciente mediante un procedimiento que comprende ademas la seleccion positiva mediante el uso de marcadores de superficie celular asociados a leucemia.In another particular embodiment, the determination of the expression levels of the TCFL5 and CHA isoforms is performed in a population of ALL cells that has been isolated from a biological sample of the patient by a procedure that further comprises positive selection through the use of cell surface markers associated with leukemia.
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Tipicamente se utilizan combinaciones de marcadores celulares que se encuentran en LLA y no en lmeas celulares normales que se encuentren habitualmente tambien en dicha muestra biologica. Por ejemplo, las celulas LLA-B pueden ser seleccionadas por eliminacion de otras MCs tales como los linfocitos T (celulas CD2+, o CD3+), y/o por la presencia de marcadores de superficie espedficos, como por ejemplo CD19 (espedfico de linfocitos B), y/o CD10 (antigeno asociado a la leucemia linfoblastica). En una realizacion particular, las celulas de LLA-B se aislan mediante una seleccion que comprende la expresion de CD19, y/o CD10.Typically, combinations of cell markers that are found in ALL and not in normal cell lines that are usually also found in said biological sample are used. For example, LLA-B cells can be selected by removal of other MCs such as T lymphocytes (CD2 +, or CD3 + cells), and / or by the presence of specific surface markers, such as CD19 (B lymphocyte specimen ), and / or CD10 (antigen associated with lymphoblastic leukemia). In a particular embodiment, the LLA-B cells are isolated by a selection comprising the expression of CD19, and / or CD10.
La poblacion de celulas de LLA se puede seleccionar sobre la base de la expresion de al menos un marcador de superficie celular. La seleccion normalmente se lleva a cabo utilizando protemas que se unen espedficamente a una de dichas protemas de superficie celular, tipicamente anticuerpos, y que se puede vincular a soportes solidos (por ejemplo, partmulas o superficies de plastico) o pueden ser conjugadas con moleculas de marcaje (por ejemplo, un fluorocromo) que pueden ser detectadas por ejemplo mediante citometria de flujo.The population of ALL cells can be selected based on the expression of at least one cell surface marker. The selection is usually carried out using proteins that specifically bind to one of said cell surface protections, typically antibodies, and that can be linked to solid supports (e.g., particles or plastic surfaces) or can be conjugated with molecules of labeling (for example, a fluorochrome) that can be detected, for example, by flow cytometry.
Preferiblemente, la muestra biologica del paciente y la muestra biologica de referencia son del mismo tipo, es decir, tienen un mismo origen biologico y han sido aisladas utilizando los mismos procedimientos. Dichas muestras biologicas pueden ser tomadas alrededor del momento del diagnostico, antes, durante o despues del tratamiento, preferiblemente son tomadas alrededor del momento del diagnostico.Preferably, the patient's biological sample and the biological reference sample are of the same type, that is, they have the same biological origin and have been isolated using the same procedures. Said biological samples can be taken around the time of diagnosis, before, during or after treatment, preferably they are taken around the time of diagnosis.
Los valores de referencia pueden ser los niveles de expresion determinados para el producto de expresion en una o varias muestras de referencia (por ejemplo, valores medios +/- s.m.e.) o bien valores predeterminados. Tipicamente dicho valor de referencia se refiere como valor umbral o de corte (cut-off).The reference values may be the expression levels determined for the expression product in one or more reference samples (for example, mean values +/- s.m.e.) or predetermined values. Typically said reference value is referred to as threshold or cut-off value.
Una variedad de metodos estadisticos y matematicos para establecer el valor umbral o de corte son conocidos en el estado de la tecnica. Un valor de expresion umbral o de corte para un biomarcador particular puede ser seleccionado, por ejemplo, utilizando un analisis de Receiver Operating Characteristic (ROC). Un experto en la tecnica apreciara que dicho valorA variety of statistical and mathematical methods to establish the threshold or cut-off value are known in the state of the art. A threshold or cut-off expression value for a particular biomarker can be selected, for example, using a Receiver Operating Characteristic (ROC) analysis. One skilled in the art will appreciate that such value
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de corte se puede variar, por ejemplo, moviendolo a lo largo del grafico ROC, para obtener diferentes valores de sensibilidad o especificidad y por tanto afectando el rendimiento general del ensayo. El mejor punto de corte ("best cut-off”) se refiere al valor obtenido del grafico ROC para un biomarcador que produce la mejor sensibilidad y especificidad. Los valores de sensibilidad y especificidad se calculan sobre el rango de umbrales (cut-offs). Asi pues, los valores de umbral o de corte pueden ser seleccionados de manera que los valores de sensibilidad y / o especificidad son al menos aproximadamente 70%, y pueden ser, por ejemplo, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90 %, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o al menos 100% en al menos 60% de la poblacion de estudio, o en al menos 65%, 70 %, 75% o 80% de la poblacion de estudio.The cut-off can be varied, for example, by moving it along the ROC chart, to obtain different sensitivity or specificity values and therefore affecting the overall performance of the test. The best cut-off point refers to the value obtained from the ROC graph for a biomarker that produces the best sensitivity and specificity. Sensitivity and specificity values are calculated over the range of thresholds (cut-offs) Thus, the threshold or cut-off values can be selected so that the sensitivity and / or specificity values are at least about 70%, and can be, for example, at least 75%, at least 80%, at minus 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or at least 100% in at least 60% of the study population, or in at least 65%, 70%, 75% or 80% of the study population.
En una realizacion particular, las muestras de referencia o control para la obtencion de los valores de referencia corresponden a una o mas muestras de linfocitos aislados de donantes sanos (por ejemplo, de sangre periferica o de medula osea) o bien a lmeas establecidas de linfocitos B (Raji, ATCC® CCL-86™) o T humanos (Jurkat, Clone E6-1 (ATCC® TIB-152™).In a particular embodiment, the reference or control samples for obtaining the reference values correspond to one or more lymphocyte samples isolated from healthy donors (eg, peripheral blood or bone marrow) or to established lymphocyte lines. B (Raji, ATCC® CCL-86 ™) or human T (Jurkat, Clone E6-1 (ATCC® TIB-152 ™).
En otra realizacion particular, las muestras de referencia para la obtencion de los valores de referencia o control corresponden a una o mas muestras celulares de pacientes con LLA o a lmeas celulares establecidas de LLA. Tipicamente, las lmeas celulares y/o muestras celulares de donantes (sanos o pacientes) utilizadas han sido previamente caracterizadas, por ejemplo, de acuerdo a su fenotipo (e.g., LLA-B o LLA-T), inmunofenotipo (un panel standard incluye: CD10, CD19, CD20, CD34, CD38 y CD45), marcadores geneticos de LLA- B (e.g. PAX5, IKZF1, o EBF1) y citogeneticos (e.g., presencia de translocaciones MLL-AF4, ETV6-RUNX1 o BCR-ABL1. TEL-AML-1), o LLA-T (e.g. HOX11L2, LYL1 mas LMO2, TAL1 mas LMO1 o LMO2, HOX11, y MLL-EN, NOTCH1, c-MYC, etc) caracteristicas demograficas y/o clmicas del donante (e.g., edad, sexo, origen etnico, contaje de globulos blancos (WBC) etc.), y/o respuesta al tratamiento. Lmeas celulares caracteristicas de LLA-B incluyen pero no se limitan a CCL-120 (ATCC). Asimismo, lmeas celulares caracteristicas de LLA-T incluyen pero no se limitan a CCL-119, CCL-120.1, CRL-1552, CRL-2264, CRL-2265, PTS- CCL-119, CRM-CCL-119, CRM-CCL-119D, CRL-11386, TIB-195 (todas de ATCC).In another particular embodiment, the reference samples for obtaining the reference or control values correspond to one or more cell samples of patients with ALL or to established cell lines of ALL. Typically, cell lines and / or donor cell samples (healthy or patient) used have been previously characterized, for example, according to their phenotype (eg, LLA-B or LLA-T), immunophenotype (a standard panel includes: CD10, CD19, CD20, CD34, CD38 and CD45), genetic markers of LLA-B (eg PAX5, IKZF1, or EBF1) and cytogenetic (eg, presence of MLL-AF4, ETV6-RUNX1 or BCR-ABL1 translocations. TEL- AML-1), or LLA-T (eg HOX11L2, LYL1 plus LMO2, TAL1 plus LMO1 or LMO2, HOX11, and MLL-EN, NOTCH1, c-MYC, etc.) demographic and / or clinical characteristics of the donor (eg, age , sex, ethnicity, white blood cell count (WBC) etc.), and / or response to treatment. Cellular lines characteristic of LLA-B include but are not limited to CCL-120 (ATCC). Also, cell lines characteristic of LLA-T include but are not limited to CCL-119, CCL-120.1, CRL-1552, CRL-2264, CRL-2265, PTS-CCL-119, CRM-CCL-119, CRM-CCL -119D, CRL-11386, TIB-195 (all of ATCC).
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Preferiblemente, dichas muestras de pacientes han sido asociadas a pacientes de riesgo medio y/o bajo tanto LLA-B, como LLA-T .(Zhou, Y., You, M. J., Young, K. H., Lin, P., Lu, G., Medeiros, L. J., and Bueso-Ramos, C. E. (2012) Advances in the molecular pathobiology of B-lymphoblastic leukemia. Human pathology 43, 1347-136 Van Vlierberghe, P., and Ferrando, A. (2012) The molecular basis of T cell acute lymphoblastic leukemia. J Clin Invest 122, 3398-3406)Preferably, said patient samples have been associated with patients at medium and / or low risk both LLA-B and LLA-T. (Zhou, Y., You, MJ, Young, KH, Lin, P., Lu, G ., Medeiros, LJ, and Bueso-Ramos, CE (2012) Advances in the molecular pathobiology of B-lymphoblastic leukemia.Human pathology 43, 1347-136 Van Vlierberghe, P., and Ferrando, A. (2012) The molecular basis of T cell acute lymphoblastic leukemia. J Clin Invest 122, 3398-3406)
En un modo de realization particular del metodo de la invention se utiliza para el pronostico y/o diagnostico diferencial de pacientes de LLA-B o LLA-T. Preferiblemente, en pacientes de LLA-B. Independientemente del tipo de LLA diagnosticado, en un modo de realizacion preferido, dichos pacientes son ninos. La poblacion infantil en LLA se define tipicamente como aquellos pacientes que tienen menos de 20 anos. En una realizacion, preferida, dichos pacientes tienen entre 0 y 15 anos, e incluso entre 0-12 meses. En otra realizacion preferida, dichos pacientes tienen entre 1 y 19 anos.In a particular embodiment of the method of the invention it is used for the prognosis and / or differential diagnosis of patients with ALL-B or ALL-T. Preferably, in patients with ALL-B. Regardless of the type of ALL diagnosed, in a preferred embodiment, these patients are children. The child population in ALL is typically defined as those patients who are under 20 years old. In one preferred embodiment, said patients are between 0 and 15 years old, and even between 0-12 months. In another preferred embodiment, said patients are between 1 and 19 years old.
En el tratamiento de pacientes con LLA, es practica habitual el determinar el tratamiento mas adecuado en funcion del diagnostico, estratificacion o clasificacion del paciente como perteneciente a un grupo de riesgo, es decir se escoge o personaliza el tratamiento segun el grupo de riesgo al que pertenecen, siendo menos intenso en los de riesgo medio o bajo y mayor en los de riesgo alto.In the treatment of patients with ALL, it is common practice to determine the most appropriate treatment based on the diagnosis, stratification or classification of the patient as belonging to a risk group, that is, the treatment is chosen or customized according to the risk group to which they belong, being less intense in those of medium or low risk and greater in those of high risk.
La clasificacion de la enfermedad puede ser, por ejemplo, una clasificacion de preferencia basada en el riesgo de recaida (remision vs fracaso terapeutico); pero que tambien puede basarse en las caractensticas clmicas de los pacientes, en los datos citogeneticos; en el subtipo de leucemia; la respuesta al tratamiento y/o en la etiologia de la enfermedad.The classification of the disease can be, for example, a preference classification based on the risk of relapse (remission vs. therapeutic failure); but that can also be based on the clinical characteristics of the patients, on the cytogenetic data; in the subtype of leukemia; the response to the treatment and / or the etiology of the disease.
Tipicamente, se definen como pacientes de alto riesgo aquellos que presentan mayores probabilidades de recaida. Dichos criterios para la clasificacion y/o estratificacion de pacientes son bien conocidos por un experto en la materia y se describen por ejemplo en Ceppi F, et al., (2015) Risk factors for relapse in childhood acute lymphoblastic leukemia: prediction and prevention. Expert review of hematology 8: 57-70; Hunger SP, Mullighan CG (2015) Acute Lymphoblastic Leukemia in Children. The New England journal of medicineTypically, those with the highest chance of relapse are defined as high-risk patients. These criteria for the classification and / or stratification of patients are well known by a person skilled in the art and are described for example in Ceppi F, et al., (2015) Risk factors for relapse in childhood acute lymphoblastic leukemia: prediction and prevention. Expert review of hematology 8: 57-70; Hunger SP, Mullighan CG (2015) Acute Lymphoblastic Leukemia in Children. The New England journal of medicine
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373: 1541-52; Teachey DT, Hunger SP (2013) Predicting relapse risk in childhood acute lymphoblastic leukaemia. British journal of haematology 162: 606-20):373: 1541-52; Teachey DT, Hunger SP (2013) Predicting relapse risk in childhood acute lymphoblastic leukaemia. British journal of haematology 162: 606-20):
En general, se distinguen 3 grupos de riesgo en funcion de una evaluacion de los datos relativos a la edad del paciente y a los resultados obtenidos en una o mas de las siguientes pruebas geneticas y/o bioqdmicas:In general, 3 risk groups are distinguished based on an evaluation of the data related to the patient's age and the results obtained in one or more of the following genetic and / or biochemical tests:
Tecnicas de laboratorio generalmente usadas en el diagnostico y/o recaida:Laboratory techniques generally used in diagnosis and / or relapse:
- Hematimetria estandar con hemocitometro.- Standard hematimetry with hemocytometer.
- Citologia convencional en extension de muestra de medula osea y en citospin de muestra de liquido cefalorraqddeo.- Conventional cytology in bone marrow sample extension and in cerebrospinal fluid sample cytospin.
- Citometria de flujo multiparametrica, preferiblemente en muestra de medula osea.- Multiparametric flow cytometry, preferably in a bone marrow sample.
- Tecnicas citogeneticas clasicas y de bandeo de cromosomas, preferiblemente en muestra de medula osea.- Classic cytogenetic techniques and chromosome banding, preferably in a bone marrow sample.
- RT-PCR con cebadores espedficos para las translocaciones t(12;21), t(1;19), t(9;22) y t(4;11), preferiblemente en muestras de medula osea.- RT-PCR with specific primers for the translocations t (12; 21), t (1; 19), t (9; 22) and t (4; 11), preferably in bone marrow samples.
- FISH con sondas para las translocaciones t(12;21), t(1;19), t(9;22) y break apart en MLL, preferiblemente en muestras de medula osea.- FISH with probes for translocations t (12; 21), t (1; 19), t (9; 22) and break apart in MLL, preferably in bone marrow samples.
En base a los resultados obtenidos en dichas pruebas, los pacientes de LLA se suelen clasificar en uno de los siguientes grupos de riesgo:Based on the results obtained in these tests, ALL patients are usually classified into one of the following risk groups:
RIESGO ESTANDAR o RIESGO BAJO: El paciente debe reunir todos y cada uno de los siguientes criterios:STANDARD RISK or LOW RISK: The patient must meet each and every one of the following criteria:
- Edad >1 y <10 anos.- Age> 1 and <10 years.
- Leucocitos <20 x109/l al diagnostico.- Leukocytes <20 x109 / l at diagnosis.
- Inmunofenotipo no T.- Immunophenotype no T.
- Ausencia de infiltracion del SNC y/o testes.- Absence of infiltration of the CNS and / or tests.
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Citogenetica (uno de los dos criterios siguientes es suficiente):Cytogenetics (one of the following two criteria is sufficient):
■ Alta Hiperdiploidia (51-67 cromosomas), mdice de DNA 1,10-1,44 (siempre confirmado por otras tecnicas citogeneticas).■ High Hyperdiploidia (51-67 chromosomes), DNA index 1.10-1.44 (always confirmed by other cytogenetic techniques).
■ t(12;21) positiva Ausencia de t(1;19)■ t (12; 21) positive Absence of t (1; 19)
No reordenamiento MLLNo MLL rearrangement
Presencia de < 1.000 blastos/mm3 en dia +8 de la Induction, en sangre perifericaPresence of <1,000 blasts / mm3 in day +8 of the Induction, in peripheral blood
Presencia de < 5% de blastos y < 0,1% de enfermedad residual minima (ERM) en medula osea en d^a +15 de la Induccion y al final de la induccion IAPresence of <5% of blasts and <0.1% of minimal residual disease (MRE) in bone marrow in d ^ to +15 of Induction and at the end of AI induction
15 RIESGO ALTO: La existencia de cualquiera de los siguientes criterios determina la inclusion del paciente en este grupo:15 HIGH RISK: The existence of any of the following criteria determines the inclusion of the patient in this group:
- t(4;11) (MLL/AF4).- t (4; 11) (MLL / AF4).
- t(9;22) p190.- t (9; 22) p190.
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Hipodiploidia <44 cromosomas o mdice DNA <0,81 (se requiere confirmation por otras tecnicas).Hypodiploidia <44 chromosomes or DNA index <0.81 (confirmation by other techniques is required).
> 1.000 blastos en dia +8 de la Induccion, en sangre periferica.> 1,000 blasts in day +8 of Induction, in peripheral blood.
> 25% de blastos y >10% de ERM en el dia +15 de la Induccion, en medula osea. ERM > 1% en el dia +33 de la Induccion, en medula osea.> 25% blasts and> 10% MRE on the +15 day of Induction, in bone marrow. ERM> 1% on day +33 of Induction, in bone marrow.
- ERM > 0,1% antes de la Consolidation, en medula osea.- ERM> 0.1% before Consolidation, in bone marrow.
RIESGO MEDIO: Aquellos pacientes que no reunan los criterios de Riesgo Estandar ni de Riesgo Alto.MEDIUM RISK: Those patients who do not meet the criteria of Standard Risk or High Risk.
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Dichos criterios son descritos en mayor detalle en la Gwa de Recomendacion Terapeutica SEHOP/PETHEMA 2013.These criteria are described in greater detail in the Gwa of Therapeutic Recommendation SEHOP / PETHEMA 2013.
En un modo de realization particular, opcionalmente en combination con una o mas de las caracteristicas definidas descritas, dicho metodo comprende ademas la detection o cuantificacion de uno o mas marcadores geneticos descritos con valor pronostico para LLA, preferiblemente comprende la determination de la presencia de una o mas de las translocaciones seleccionadas del grupo que consiste en t(12;21), t(1;19), t(9;22) y t(4;11), Hipodiploid^a <44 cromosomas o mdice DNA <0,81.In a particular embodiment, optionally in combination with one or more of the defined characteristics described, said method further comprises the detection or quantification of one or more genetic markers described with prognostic value for ALL, preferably comprising determining the presence of a or more of the translocations selected from the group consisting of t (12; 21), t (1; 19), t (9; 22) and t (4; 11), hypodiploid ^ a <44 chromosomes or DNA index <0, 81.
Dicho metodo puede comprender ademas la determinacion de uno o mas de los parametros bioquimicos y/o clmicos descritos mas arriba habitualmente utilizados para la estratificacion de los pacientes de LLA en funcion del riesgo.Said method may also comprise the determination of one or more of the biochemical and / or chemical parameters described above commonly used for stratification of ALL patients according to risk.
El metodo de la invencion puede comprender ademas el almacenaje de los resultados obtenidos en dispositivo de almacenamiento de datos. En un modo de realizacion, dicho dispositivo de almacenamiento de datos es una lamina de papel. En un modo de realizacion preferente, dicho dispositivo de almacenamiento de datos es un medio legible por ordenador. Como se usa en el presente documento, "un medio legible por ordenador” puede ser cualquier aparato que pueda incluir, almacenar, comunicar, propagar o transportar los resultados de la determinacion del procedimiento de la invention. El medio puede ser un sistema (o aparato o dispositivo) electronico, magnetico, optico, electromagnetico, infrarrojo o semiconductor o un medio de propagation.The method of the invention may further comprise the storage of the results obtained in a data storage device. In one embodiment, said data storage device is a sheet of paper. In a preferred embodiment, said data storage device is a computer readable medium. As used herein, "a computer-readable medium" may be any apparatus that may include, store, communicate, propagate or transport the results of the determination of the process of the invention. The medium may be a system (or apparatus or device) electronic, magnetic, optical, electromagnetic, infrared or semiconductor or a means of propagation.
En un aspecto asociado, la presente invencion se refiere al uso in vitro de los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5 determinados, preferiblemente de manera simultanea, en una muestra biologica aislada de un paciente con leucemia linfoblastica aguda (LLA) para el pronostico y/o diagnostico diferencial de pacientes con LLA, donde una reduction en los valores de expresion de TCFL5/CHA en la muestra del paciente respecto a valores de referencia es indicativa de LLA de alto riesgo.In an associated aspect, the present invention relates to the in vitro use of the levels of expression of the TCFL5 and CHA isoforms of the determined TCFL5 gene, preferably simultaneously, in an isolated biological sample of a patient with acute lymphoblastic leukemia (ALL) for the prognosis and / or differential diagnosis of patients with ALL, where a reduction in the expression values of TCFL5 / CHA in the patient sample with respect to reference values is indicative of high-risk ALL.
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Metodo para la personalizacion del tratamiento en funcion del riesgoMethod for personalization of risk-based treatment
La invencion hace tambien referencia a un metodo para la personalizacion del tratamiento o para la determination del tratamiento mas adecuado en funcion del perfil de riesgo del paciente, donde dicho metodo comprende el pronostico y/o diagnostico diferencial en funcion del riesgo segun el metodo del primer aspecto de la invencion.The invention also refers to a method for the personalization of the treatment or for the determination of the most appropriate treatment according to the patient's risk profile, where said method comprises the differential prognosis and / or diagnosis depending on the risk according to the method of the first aspect of the invention.
En un aspecto relacionado, la invencion hace referencia a un metodo para el tratamiento de pacientes de LLA que comprende la administration de una cantidad terapeuticamente efectiva de un farmaco o combination de farmacos donde dicho tratamiento se determina en funcion de la clasificacion o estratificacion de dicho paciente en funcion del riesgo segun el metodo del primer aspecto de la invencion. Dicha terapia esta tipicamente formado por la asociacion de varios farmacos, puediendo incluir entre otros vincristina, prednisona y antraciclinas (daunorrubicina o idarubicinao doxorrubicina), L-asparaginasa, y metotrexato , etc((Inaba, H., M. Greaves, and C.G. Mullighan, Acute lymphoblastic leukaemia. Lancet, 2013. 381(9881): p. 1943-55).In a related aspect, the invention refers to a method for the treatment of ALL patients comprising the administration of a therapeutically effective amount of a drug or combination of drugs where said treatment is determined based on the classification or stratification of said patient. depending on the risk according to the method of the first aspect of the invention. Such therapy is typically formed by the association of several drugs, including, among others, vincristine, prednisone and anthracyclines (daunorubicin or idarubicin or doxorubicin), L-asparaginase, and methotrexate, etc. ((Inaba, H., M. Greaves, and CG Mullighan , Acute lymphoblastic leukaemia, Lancet, 2013. 381 (9881): p. 1943-55).
En la practica clmica actual aquellos pacientes de LLA clasificados como de alto riesgo recibiran un tratamiento quimioterapeutico de mayor intensidad. Una mayor intensidad del tratamiento se caracteriza por una mayor dosificacion y/o frecuencia de las administraciones respecto a la administracion del mismo farmaco o combinacion de farmacos en un paciente clasificado como de riesgo medio o bajo. Asimismo, un tratamiento de mayor intensidad puede consistir tambien en la administracion de otros farmacos cuya utilization se considera mas agresiva, por ejemplo al estar asociados a una mayor toxicidad.In current clinical practice, ALL patients classified as high risk will receive a chemotherapy treatment of greater intensity. A greater intensity of treatment is characterized by a higher dosage and / or frequency of administrations with respect to the administration of the same drug or combination of drugs in a patient classified as medium or low risk. Likewise, a treatment of greater intensity may also consist of the administration of other drugs whose use is considered more aggressive, for example, being associated with a higher toxicity.
Metodo para la monitorizacion de la enfermedad y/o eficacia del tratamientoMethod for disease monitoring and / or treatment efficacy
En otro aspecto, la presente invencion se refiere tambien a un metodo para la monitorizacion de la progresion de la enfermedad y/o eficacia del tratamiento en pacientes con LLA que comprende las siguientes etapas:In another aspect, the present invention also relates to a method for monitoring disease progression and / or efficacy of treatment in patients with ALL comprising the following stages:
a. determinar, preferiblemente de manera simultanea, los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5 en una muestra biologica aislada de dicho paciente; yto. determine, preferably simultaneously, the expression levels of the TCFL5 and CHA isoforms of the TCFL5 gene in a biological sample isolated from said patient; Y
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b. comparar los niveles de expresion de TCFL5/CHA en la muestra del paciente con valores de referencia,b. compare the levels of expression of TCFL5 / CHA in the patient sample with reference values,
donde una reduction en los valores de la muestra del paciente respecto a los valores de referencia es indicativo de recaida. Tipicamente, la toma de muestras se realiza al inicio del tratamiento, a lo largo del tratamiento y/o una vez finalizado el tratamiento, de manera dclica o puntual.where a reduction in the values of the patient sample with respect to the reference values is indicative of relapse. Typically, the sampling is carried out at the beginning of the treatment, throughout the treatment and / or once the treatment is finished, in a public or timely manner.
En un aspecto relacionado, la invention hace referencia al uso in vitro de los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5 determinados, preferiblemente de manera simultanea, en una muestra biologica aislada de un paciente con leucemia linfoblastica aguda (LLA) para la monitorizacion de pacientes con LLA, donde una reduccion en los valores de expresion de TCFL5/CHA en la muestra del paciente respecto a valores de referencia es indicativa de recaida.In a related aspect, the invention refers to the use in vitro of the expression levels of the TCFL5 and CHA isoforms of the determined TCFL5 gene, preferably simultaneously, in an isolated biological sample of a patient with acute lymphoblastic leukemia (ALL) for the monitoring of patients with ALL, where a reduction in the expression values of TCFL5 / CHA in the patient sample with respect to reference values is indicative of relapse.
En un aspecto adicional, la invencion se refiere a un metodo de obtencion de datos utiles para el pronostico, diagnostico diferencial y/o monitorizacion de pacientes con leucemia linfoblastica aguda (LLA) que comprende:In a further aspect, the invention relates to a method of obtaining useful data for the prognosis, differential diagnosis and / or monitoring of patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL) comprising:
a. determinar, preferiblemente de manera simultanea, los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5 en una muestra biologica aislada de dicho paciente.to. determine, preferably simultaneously, the levels of expression of the TCFL5 and CHA isoforms of the TCFL5 gene in a biological sample isolated from said patient.
Realizaciones particulares y caracteristicas preferidas de estos aspectos de la invencion se han definido en aspectos anteriores, en particular en el primer aspecto de la invencion.Particular embodiments and preferred features of these aspects of the invention have been defined in previous aspects, in particular in the first aspect of the invention.
Kit para el pronostico, diagnostico diferencial y/o monitorizacion de pacientes con LLAKit for the prognosis, differential diagnosis and / or monitoring of patients with ALL
En otro aspecto, la invencion hace referencia a un kit para el pronostico, diagnostico diferencial y/o monitorizacion de pacientes con leucemia linfoblastica aguda (LLA) que comprende:In another aspect, the invention refers to a kit for the prognosis, differential diagnosis and / or monitoring of patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL) comprising:
a. un cebador y/o sonda que comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 70, y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%; yto. a primer and / or probe comprising or consisting of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 70, and sequences identical to any of them at least 75%; Y
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b. opcionalmente, instrucciones para el uso de dicho cebador y/o sonda para la determination de los niveles de expresion de dichas isoformas en una muestra biologica aislada de dicho paciente.b. optionally, instructions for the use of said primer and / or probe for the determination of the expression levels of said isoforms in a biological sample isolated from said patient.
Preferiblemente, dicho cebador y/o sonda comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%. Otras secuencias preferidas han sido descritas bajo el primer aspecto de la invention.Preferably, said primer and / or probe comprises or consists of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 and sequences identical to any of them at least 75%. Other preferred sequences have been described under the first aspect of the invention.
Realizaciones particulares y caracteristicas preferidas de este aspecto de la invencion se han definido en aspectos anteriores, en particular en el primer aspecto de la invencion.Particular embodiments and preferred features of this aspect of the invention have been defined in previous aspects, in particular in the first aspect of the invention.
La invencion se refiere tambien al uso de un kit para el pronostico, diagnostico diferencial y/o monitorizacion de pacientes con LLA en un metodo de acuerdo con los aspectos anteriores de la invencion, donde dicho kit comprende:The invention also relates to the use of a kit for the prognosis, differential diagnosis and / or monitoring of patients with ALL in a method according to the previous aspects of the invention, wherein said kit comprises:
a. un reactivo para determinar, preferiblemente de manera simultanea, los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5; yto. a reagent to determine, preferably simultaneously, the expression levels of the TCFL5 and CHA isoforms of the TCFL5 gene; Y
b. opcionalmente, instrucciones para el uso de dicho reactivo para la determinacion de los niveles de expresion de dichas isoformas en una muestra biologica aislada de dicho paciente.b. optionally, instructions for the use of said reagent for the determination of the expression levels of said isoforms in a biological sample isolated from said patient.
Realizaciones particulares y caracteristicas preferidas de este aspecto de la invencion se han definido en aspectos anteriores, en particular en el primer aspecto de la invencion.Particular embodiments and preferred features of this aspect of the invention have been defined in previous aspects, in particular in the first aspect of the invention.
Secuencia nucleotidicasNucleotide sequence
En un aspecto adicional, la invencion esta relacionada con una secuencia nucleoridica, preferiblemente una sonda y/o cebador, que hibrida espedficamente a SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2. Dichas sondas y/o cebadores son parcialmente complementarias, preferiblemente sustancial o completamente complementarias a SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 o a fragmentos de las mismas tal y como se ha descrito en otros aspectos de la invencion.In a further aspect, the invention is related to a nucleoride sequence, preferably a probe and / or primer, which specifically hybridizes to SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2. Said probes and / or primers are partially complementary, preferably substantially or completely complementary to SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2 or fragments thereof as described in other aspects of the invention.
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Preferiblemente, dicha secuencia es seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 70, y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%; mas preferiblemente dicha secuencia es seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%. Otras secuencias preferidas han sido descritas bajo el primer aspecto de la invention.Preferably, said sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 70, and sequences identical to any of them at least 75%; more preferably said sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, and sequences identical to any of them in at least 75%. Other preferred sequences have been described under the first aspect of the invention.
En un aspecto relacionado, la invencion se refiere al uso de una secuencia nucleotidica que hibrida espedficamente a SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 como cebador y/o sonda en un metodo in vitro para el pronostico, diagnostico y/o monitorizacion de pacientes con LLA de acuerdo con los aspectos anteriores de la invencion. Preferiblemente, dicha secuencia es seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 70, y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%. Mas preferiblemente, dicha secuencia es seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%. Otras secuencias preferidas han sido descritas bajo el primer aspecto de la invencion.In a related aspect, the invention relates to the use of a nucleotide sequence that specifically hybridizes to SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2 as a primer and / or probe in an in vitro method for the prognosis, diagnosis and / or monitoring of patients with ALL according to the previous aspects of the invention. Preferably, said sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 70, and sequences identical to any of them at least 75%. More preferably, said sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 and sequences identical to any of them in at least 75%. Other preferred sequences have been described under the first aspect of the invention.
Realizaciones particulares y caracteristicas preferidas de estos aspectos de la invencion se han definido en aspectos anteriores, en particular en el primer aspecto de la invencion.Particular embodiments and preferred features of these aspects of the invention have been defined in previous aspects, in particular in the first aspect of the invention.
En otro aspecto, la invencion hace referencia a un metodo para la determination in vitro, preferiblemente de manera simultanea, de los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA del gen TCFL5 en una muestra biologica aislada de un paciente con leucemia linfoblastica aguda (LLA); donde los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA se determinan a nivel de RNAm mediante el uso de un cebador y/o sonda seleccionado del grupo que consiste en las secuencias SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 70, y secuencias identicas a cualquiera de las mismas en al menos 75%. Preferiblemente, dicho cebador y/o sonda consiste en una secuencia nucleotidica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 y una secuencia identica a cualquiera de las mismas en al menos 75%. Otras secuencias preferidas han sido descritas bajo el primer aspecto de la invencion.In another aspect, the invention refers to a method for the determination in vitro, preferably simultaneously, of the levels of expression of the TCFL5 and CHA isoforms of the TCFL5 gene in an isolated biological sample of a patient with acute lymphoblastic leukemia (ALL). ); where the expression levels of the TCFL5 and CHA isoforms are determined at the mRNA level by the use of a primer and / or probe selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 70, and identical sequences to any of them at least 75%. Preferably, said primer and / or probe consists of a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 and a sequence identical to any of them at least 75%. Other preferred sequences have been described under the first aspect of the invention.
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Realizaciones particulares y caracteristicas preferidas de estos aspectos de la invencion se han definido en aspectos anteriores, en particular en el primer aspecto de la invencion.Particular embodiments and preferred features of these aspects of the invention have been defined in previous aspects, in particular in the first aspect of the invention.
Se contempla que cualquier modo de realizacion analizado en esta memoria descriptiva se puede implementar con respecto a cualquier metodo, kit, reactivo o uso de la invencion, y viceversa. En particular, aquellas caracteristicas detalladas y realizaciones particulares relativas al primer aspecto de la invencion podran tambien implementarse respecto a otros aspectos de la invencion. Se entendera que los modos de realizacion particulares descritos en el presente documento se muestran a modo de ilustracion y no como limitaciones de la invencion. Los rasgos caracteristicos principales de la presente invencion se pueden emplear en varios modos de realizacion sin apartarse del alcance de la invencion. Los expertos en la tecnica reconoceran, o seran capaces de determinar usando no mas que experimentacion rutinaria, numerosos equivalentes a los procedimientos espedficos descritos en el presente documento. Se considera que estos equivalentes estan dentro del alcance de la presente invencion y estan contemplados por las reivindicaciones.It is contemplated that any embodiment analyzed in this specification can be implemented with respect to any method, kit, reagent or use of the invention, and vice versa. In particular, those detailed features and particular embodiments relating to the first aspect of the invention may also be implemented with respect to other aspects of the invention. It will be understood that the particular embodiments described herein are shown by way of illustration and not as limitations of the invention. The main characteristic features of the present invention can be used in various embodiments without departing from the scope of the invention. Those skilled in the art will recognize, or will be able to determine using no more than routine experimentation, numerous equivalents to the specific procedures described herein. These equivalents are considered to be within the scope of the present invention and are contemplated by the claims.
Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de experiencia de los expertos en la tecnica a la que pertenece la presente invencion. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes se incorporan en el presente documento por referencia en el mismo grado que si cada publicacion o solicitud de patente individual se indicase espedfica e individualmente para incorporarse por referencia.All publications and patent applications mentioned in the specification are indicative of the level of experience of those skilled in the art to which the present invention belongs. All publications and patent applications are incorporated herein by reference to the same degree as if each individual patent publication or application is indicated specifically and individually to be incorporated by reference.
El uso de la palabra "un" o "una" cuando se usa junto con el termino "que comprende" en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva puede querer decir "uno" pero tambien es coherente con el significado de "uno o mas", "al menos uno" y "uno o mas de uno". El uso del termino "o" en las reivindicaciones se usa para querer decir "y/o" a menos que se indique explicitamente para referirse a alternativas solo o las alternativas son mutuamente exclusivas, aunque la divulgacion respalda una definicion que se refiere solo a alternativas y "y/o". En toda esta solicitud, el termino "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la variacion de error inherente para el dispositivo, empleandose el procedimiento para determinar el valor, o la variacion que existe entre los sujetos de estudio.The use of the word "a" or "a" when used in conjunction with the term "comprising" in the claims and / or the specification may mean "one" but is also consistent with the meaning of "one or more "," at least one "and" one or more than one ". The use of the term "or" in the claims is used to mean "and / or" unless explicitly stated to refer to alternatives only or the alternatives are mutually exclusive, although the disclosure supports a definition that refers only to alternatives. and me". Throughout this application, the term "approximately" is used to indicate that a value includes the variation of error inherent in the device, the procedure being used to determine the value, or the variation that exists between the study subjects.
Como se usa en esta memoria descriptiva y reivindicaciones, las palabras "comprender" (y cualquier forma de comprender, tal como "comprenden" y "comprende"), "tener" (y cualquierAs used herein and claims, the words "understand" (and any way of understanding, such as "understand" and "understand"), "have" (and any
forma de tener, tal como "tienen" y "tiene"), "incluir" (y cualquier forma de incluir, tal comoway of having, such as "have" and "has"), "include" (and any way of including, such as
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"induye" y "incluyen") o "contener" (y cualquier forma de contener, tal como "contiene" y "contienen") son inclusivas o abiertas y no excluyen elementos o etapas del procedimiento no citados, adicionales. El termino “comprende” engloba y espedficamente describe "consiste esencialmente en" y “consiste en”. Como se usa en el presente documento, la expresion "que consiste esencialmente en" limita el alcance de una reivindicacion a los materiales o etapas especificados y a aquellos que no afectan materialmente a la(s) caracteristica(s) basica(s) y novedosa(s) de la invencion reivindicada. Como se usa en el presente documento, la expresion "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en la reivindicacion excepto, por ejemplo, impurezas habitualmente asociadas con el elemento o la limitacion."induces" and "include") or "contain" (and any form of containing, such as "contains" and "contain") are inclusive or open and do not exclude elements or stages of the procedure not mentioned, additional. The term "comprises" encompasses and specifically describes "consists essentially of" and "consists of". As used herein, the expression "consisting essentially of" limits the scope of a claim to the specified materials or stages and those that do not materially affect the basic (s) and novel (s) characteristic (s). s) of the claimed invention. As used herein, the expression "consisting of" excludes any element, stage or ingredient not specified in the claim except, for example, impurities usually associated with the element or limitation.
El termino "o combinaciones de los mismos" como se usa en el presente documento se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los puntos enumerados que preceden al termino. Por ejemplo, "A, B, C o combinaciones de los mismos" se pretende que incluya al menos uno de: A, B, C, AB, AC, BC o ABC, y si el orden es importante en un contexto particular, tambien BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC o CAB. Continuando con este ejemplo, se incluyen expresamente combinaciones que contienen repeticiones de uno o mas puntos o terminos, tales como BBB, AAA, AB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, y asi sucesivamente. El experto en la tecnica entendera que ripicamente no existe un limite sobre el numero de puntos o terminos en cualquier combinacion, a menos que sea evidente de otro modo a partir del contexto.The term "or combinations thereof" as used herein refers to all permutations and combinations of the items listed above the term. For example, "A, B, C or combinations thereof" is intended to include at least one of: A, B, C, AB, AC, BC or ABC, and if the order is important in a particular context, also BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC or CAB. Continuing with this example, combinations containing repetitions of one or more points or terms, such as BBB, AAA, AB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, and so on, are expressly included. The person skilled in the art will understand that typically there is no limit on the number of points or terms in any combination, unless it is evident otherwise from the context.
Como se usa en el presente documento, palabras de aproximacion tales como, sin limitacion, "sobre”, "alrededor de”, “aproximadamente” se refieren a una condicion que, cuando se modifica asi, se entiende que no es necesariamente absoluta o perfecta sino que se consideraria lo suficientemente proxima para los expertos en la tecnica para garantizar la designacion de la condicion como presente. La medida en que puede variar la descripcion dependera de lo grande que se pueda instituir un cambio y todavia reconozca un experto en la tecnica que el rasgo caracteristico modificado todavia tenga las caracteristicas y capacidades requeridas del rasgo caracteristico no modificado. En general, pero sujeto al analisis precedente, un valor numerico en el presente documento que se modifica por un palabra de aproximacion tal como "aproximadamente" puede variar desde el valor establecido en ± 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 12 o 15%, o menos, preferiblemente representa el valor establecido (± 0%)..As used herein, approximation words such as, without limitation, "about", "around", "approximately" refer to a condition that, when modified as such, is understood to be not necessarily absolute or perfect but it would be considered close enough for those skilled in the art to guarantee the designation of the condition as present. The extent to which the description may vary will depend on how large a change can be instituted and a person skilled in the art still recognizes that the modified characteristic trait still has the required characteristics and capabilities of the unmodified characteristic trait. In general, but subject to the preceding analysis, a numerical value in this document that is modified by an approximation word such as "approximately" may vary from the value established in ± 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 , 10, 12 or 15%, or less, preferably represents the set value (± 0%).
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EJEMPLOSEXAMPLES
Sitios WEB para el analisis de las bases de datos utilizadosWebsites for the analysis of the databases used
• Secuencias:• Sequences:
1.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/one.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
2.
http://www.ensembl.org/index.html2.
http://www.ensembl.org/index.html
3.
http://vega.sanger.ac.uk/index.html3.
http://vega.sanger.ac.uk/index.html
4.
http://genome.ewha.ac.kr/ECgene/Four.
http://genome.ewha.ac.kr/ECgene/
• Alineamientos:• Alignments:
1.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/one.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
2.
http://www.ensembl.org/index.html2.
http://www.ensembl.org/index.html
3.
http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/3.
http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/
4.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey/Four.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey/
Materiales y Metodos Obtencion de muestras de pacientesMaterials and Methods Obtaining patient samples
Se obtuvieron muestras de aspirado de medula osea en el momento del diagnostico o de la recaida, de 60 ninos con LLA (edades 0-15 anos) del Hospital Universitario Nino Jesus de Madrid. 18 LLA-T y 42 LLA-BBone marrow aspirate samples were obtained at the time of diagnosis or relapse of 60 children with ALL (ages 0-15 years) from the Nino Jesus University Hospital in Madrid. 18 LLA-T and 42 LLA-B
Clasificacion de los pacientesPatient Classification
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Se distinguieron 3 grupos de riesgo en funcion de una evaluacion de los datos relativos a la edad del paciente y a los resultados obtenidos en una o mas de las siguientes pruebas geneticas y/o bioqdmicas:Three risk groups were distinguished based on an evaluation of the data related to the patient's age and the results obtained in one or more of the following genetic and / or biochemical tests:
- Hematimetria estandar con hemocitometro.- Standard hematimetry with hemocytometer.
- Citolog^a convencional en extension de muestra de medula osea y en citospin de muestra de liquido cefalorraqddeo.- Conventional cytology in bone marrow sample extension and in cerebrospinal fluid sample cytospin.
- Citometria de flujo multiparametrica, preferiblemente en muestra de medula osea.- Multiparametric flow cytometry, preferably in a bone marrow sample.
- Tecnicas citogeneticas clasicas y de bandeo de cromosomas, preferiblemente en muestra de medula osea.- Classic cytogenetic techniques and chromosome banding, preferably in a bone marrow sample.
- RT-PCR con cebadores espedficos para las translocaciones t(12;21), t(1;19), t(9;22) y t(4;11), preferiblemente en muestras de medula osea.- RT-PCR with specific primers for the translocations t (12; 21), t (1; 19), t (9; 22) and t (4; 11), preferably in bone marrow samples.
- FISH con sondas para las translocaciones t(12;21), t(1;19), t(9;22) y break apart en MLL, preferiblemente en muestras de medula osea.- FISH with probes for translocations t (12; 21), t (1; 19), t (9; 22) and break apart in MLL, preferably in bone marrow samples.
En base a los resultados obtenidos en dichas pruebas, los pacientes de LLA se clasificaron en uno de los siguientes grupos de riesgo:Based on the results obtained in these tests, ALL patients were classified into one of the following risk groups:
RIESGO ESTANDAR o RIESGO BAJO: El paciente debe reunir todos y cada uno de los siguientes criterios:STANDARD RISK or LOW RISK: The patient must meet each and every one of the following criteria:
- Edad >1 y <10 anos.- Age> 1 and <10 years.
- Leucocitos <20 x109/l al diagnostico.- Leukocytes <20 x109 / l at diagnosis.
- Inmunofenotipo no T.- Immunophenotype no T.
- Ausencia de infiltracion del SNC y/o testes.- Absence of infiltration of the CNS and / or tests.
- Citogenetica (uno de los dos criterios siguientes es suficiente):- Cytogenetics (one of the following two criteria is sufficient):
■ Alta Hiperdiploidia (51-67 cromosomas), mdice de DNA 1,10-1,44 (siempre confirmado por otras tecnicas citogeneticas).■ High Hyperdiploidia (51-67 chromosomes), DNA index 1.10-1.44 (always confirmed by other cytogenetic techniques).
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■ t(12;21) positiva■ t (12; 21) positive
- Ausencia de t(1;19)- Absence of t (1; 19)
- No reordenamiento MLL- No MLL rearrangement
- Presencia de < 1.000 blastos/mm3 en d^a +8 de la Induction, en sangre periferica- Presence of <1,000 blasts / mm3 in d ^ to +8 of the Induction, in peripheral blood
- Presencia de < 5% de blastos y < 0,1% de enfermedad residual minima (ERM) en medula osea en dia +15 de la Induccion y al final de la induccion IA- Presence of <5% of blasts and <0.1% of minimal residual disease (MRE) in bone marrow on day +15 of Induction and at the end of AI induction
RIESGO ALTO: La existencia de cualquiera de los siguientes criterios determina la inclusion del paciente en este grupo:HIGH RISK: The existence of any of the following criteria determines the inclusion of the patient in this group:
- t(4;11) (MLL/AF4).- t (4; 11) (MLL / AF4).
- t(9;22) p190.- t (9; 22) p190.
- Hipodiploidia <44 cromosomas o mdice DNA <0,81 (se requiere confirmation por otras tecnicas).- Hypodiploidy <44 chromosomes or DNA index <0.81 (confirmation by other techniques is required).
- > 1.000 blastos en dia +8 de la Induccion, en sangre periferica.-> 1,000 blasts in day +8 of Induction, in peripheral blood.
- > 25% de blastos y >10% de ERM en el dia +15 de la Induccion, en medula osea.-> 25% blasts and> 10% ERM on the +15 day of Induction, in bone marrow.
- ERM > 1% en el dia +33 de la Induccion, en medula osea.- ERM> 1% on day +33 of Induction, in bone marrow.
- ERM > 0,1% antes de la Consolidation, en medula osea.- ERM> 0.1% before Consolidation, in bone marrow.
RIESGO MEDIO: Aquellos pacientes que no reunan los criterios de Riesgo Estandar ni de Riesgo Alto.MEDIUM RISK: Those patients who do not meet the criteria of Standard Risk or High Risk.
Western blotWestern blot
Se utilizaron 20 ng de protema correspondientes a las muestras de los pacientes por pocillo en geles al 10% de SDS-poliacrilamida y se aplicaron 90Voltios hasta que el frente de azul de bromocresol migro a la position deseada. Las protemas fueron transferidas (100Voltios a 4°C) a una membrana de nitrocelulosa durante 1h 30min con el buffer de transferencia.20 ng of protein were used corresponding to the patient samples per well in 10% SDS-polyacrylamide gels and 90Volts were applied until the bromocresol blue front migrated to the desired position. The proteins were transferred (100 Volts at 4 ° C) to a nitrocellulose membrane for 1h 30min with the transfer buffer.
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Una vez transferidas las protemas a la membrana de nitrocelulosa, se bloquearon uniones inespedficas mediante su incubacion durante una hora en una solucion de BSA (Suero de Albumina Bovina) al 5% en TBS-T. Antes de realizar el bloqueo, se realizo una tincion reversible con Rojo Ponceau que permite visualizar las protemas transferidas.Once the proteins were transferred to the nitrocellulose membrane, unstable bonds were blocked by incubation for one hour in a 5% solution of BSA (Bovine Albumine Serum) in TBS-T. Before blocking, a reversible staining was performed with Ponceau Red that allows visualizing the transferred proteins.
Los tiempos de incubacion al igual que las concentraciones utilizadas de los anticuerpos se realizaron siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se utilizo el anticuerpo policlonal anti TCFL5/CHA (SAB4500152, Sigma-Aldrich) y el anticuerpo secundario policlonal de cabra anti conejo Goat (A-21431, Invitrogen). Entre dichas incubaciones se realizan 3 lavados de 15min con TBS-T y el ultimo lavado con TBS.Incubation times as well as the concentrations of the antibodies used were made following the manufacturer's recommendations. The polyclonal anti TCFL5 / CHA antibody (SAB4500152, Sigma-Aldrich) and the goat rabbit polyclonal secondary antibody Goat (A-21431, Invitrogen) were used. Among these incubations, 3 15-minute washes are performed with TBS-T and the last wash with TBS.
El revelado de la membrana se realizo con el kit SuperSignal (Thermo Scientific) o el kit Immun-Star HRP (BIO_RAD) siguiendo las recomendaciones del fabricante.The development of the membrane was carried out with the SuperSignal kit (Thermo Scientific) or the Immun-Star HRP kit (BIO_RAD) following the manufacturer's recommendations.
Para la reutilizacion de las membranas se realizo un stripping con el Restore Western Blot Stripping Buffer (Thermo Scientific) siguiendo las recomendaciones del fabricante.For the reuse of the membranes a stripping was performed with the Restore Western Blot Stripping Buffer (Thermo Scientific) following the manufacturer's recommendations.
Aislamiento de celulas mononucleadas a partir de muestras de medula oseaIsolation of mononucleated cells from bone marrow samples
La extraction de celulas mononucleadas de pacientes se realizo mediante centrifugation por gradiente de densidad. Las muestras de medula osea de pacientes se diluyen a la mitad en PBS. En un tubo a parte se preparan 5 ml de Ficoll (Ficoll® Paque Plus, Sigma-Aldrich). La muestra de medula osea diluida se pone sobre el ficoll lentamente apoyando la punta sobre la pared del tubo para generar dos fases. Se centrifuga a 1500 rpm durante 25 minutos con deceleration baja a temperatura ambiente. Nos quedamos con la fase blanca que es donde se encuentran las celulas mononucleadas. Se lavan con PBS 1400 rpm durante 7 minutos para eliminar restos de ficoll. Tras el lavado, el pellet se resuspende en suero fetal bovino (FBS) y se criopreserva en viales de como maximo 12,5x106 celulas.The extraction of mononucleated cells from patients was performed by density gradient centrifugation. Bone marrow samples from patients are diluted in half in PBS. In a separate tube, 5 ml of Ficoll (Ficoll® Paque Plus, Sigma-Aldrich) are prepared. The diluted bone marrow sample is placed on the ficoll slowly resting the tip on the tube wall to generate two phases. It is centrifuged at 1500 rpm for 25 minutes with low deceleration at room temperature. We are left with the white phase that is where the mononucleated cells are found. Wash with PBS 1400 rpm for 7 minutes to remove traces of ficoll. After washing, the pellet is resuspended in fetal bovine serum (FBS) and cryopreserved in vials of a maximum of 12.5x106 cells.
Extraccion de RNA y RT-qPCR (Protocolo utilizado en el ejemplo 5)RNA extraction and RT-qPCR (Protocol used in example 5)
Una vez aisladas las celulas la extraccion del RNA se llevo a cabo con RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la retrotranscripcion se utilizo el Kit TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystem, Life Technologies) siguiendo el programa: un ciclo a 42°C durante 45 minutos y un ultimo ciclo a 99°C durante 3 minutos. Por ultimo para la PCR a tiempo real se utilizo SYBR GREEN PCR Master Mix (Applied Biosystem, Life Technologies) siguiendo el programa: un ciclo 50°C durante 2 min, 95°C duante 10 minutos, 40 ciclos a 95°C durante 15 segundos y 58°C durante 1 minutos, curva de melting continua. La secuencia de los oligonucleotidos utilizados son TCFL5/CHA_F (SEQ ID NO: 45): 5’ GAGACTGACAAGGCCACAACT 3’, TCFL5/CHA_R (SEQ ID NO:46): 5’Once the cells were isolated, RNA extraction was carried out with RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen) following the manufacturer's instructions. For the retrotranscription, the TaqMan Reverse Transcription Reagents Kit (Applied Biosystem, Life Technologies) was used following the program: one cycle at 42 ° C for 45 minutes and one last cycle at 99 ° C for 3 minutes. Finally, for real-time PCR, SYBR GREEN PCR Master Mix (Applied Biosystem, Life Technologies) was used following the program: one cycle 50 ° C for 2 min, 95 ° C for 10 minutes, 40 cycles at 95 ° C for 15 seconds and 58 ° C for 1 minutes, continuous melting curve. The sequence of the oligonucleotides used are TCFL5 / CHA_F (SEQ ID NO: 45): 5 ’GAGACTGACAAGGCCACAACT 3’, TCFL5 / CHA_R (SEQ ID NO: 46): 5 ’
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Extraccion de RNA y RT-qPCR (Protocolo utilizado en el ejemplo 6)RNA extraction and RT-qPCR (Protocol used in example 6)
Las muestras se conservaron en TRIzol (Life Technologies) a 70°C hasta su uso. La extraccion del RNA total se realizo con RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen) siguiendo las recomendaciones del fabricante.The samples were stored in TRIzol (Life Technologies) at 70 ° C until use. Total RNA extraction was performed with RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen) following the manufacturer's recommendations.
RT-qPCR cuantitativa. El RNAm se retrotranscribio a DNA complementary (DNAc) y se cuantificaron los genes con oligonucleotidos espedficos (SEQ ID NO: 45 (TCFL5/CHA 01 Forward) y SEQ ID NO: 46 (TCFL5/CHA 01 reverse) de la Tabla III) con el kit GoTaq 2-Step RT-PCR System (Promega) siguiendo las recomendaciones del fabricante.Quantitative RT-qPCR. The mRNA was retrotranscribed to complementary DNA (cDNA) and the genes were quantified with specific oligonucleotides (SEQ ID NO: 45 (TCFL5 / CHA 01 Forward) and SEQ ID NO: 46 (TCFL5 / CHA 01 reverse) of Table III) with the GoTaq 2-Step RT-PCR System kit (Promega) following the manufacturer's recommendations.
Para la amplification de los genes por PCR se sometieron las muestras a 95°C durante 5min, a continuation se realizaron 45 ciclos de 15s a 95°C, 30s a 59°C y 15s a 72°C; finalmente, se realiza un ciclo a 95°C en el termociclador ABIPrism 7900 HT SDS (Applied Biosystems).For the amplification of the genes by PCR, samples were subjected to 95 ° C for 5min, then 45 cycles of 15s at 95 ° C, 30s at 59 ° C and 15s at 72 ° C were performed; finally, a cycle is carried out at 95 ° C in the ABIPrism 7900 HT SDS (Applied Biosystems) thermal cycler.
Los calculos de cuantificacion de la expresion de genes se realizaron por el metodo de comparacion del ciclo umbral (Comparative Threshold Method, CT). Los valores obtenidos para cada gen se normalizaron con el gen House keeping HPRT (Hypoxantina-guanina fosforibosiltransferasa) para obtener el ACT, tras lo cual se normalizaron con el valor de la muestra control para obtener el AACT. La cantidad relativa, RQ, se calculo a partir de la siguiente formula RQ = 2"AACT Los cebadores utilizados para cuantificar la expresion de HPRT fueron HPRT- Forward (SEQ ID NO: 73): CTGGAAAGAATGTCTTGATTGTGG; y HPRT-Reverse (SEQ ID NO: 74): CATCTTGGATTATACTGCCTGAC.Calculations of quantification of gene expression were performed by the method of comparing the threshold cycle (Comparative Threshold Method, CT). The values obtained for each gene were normalized with the House keeping HPRT (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase) gene to obtain the ACT, after which they were normalized with the value of the control sample to obtain the AACT. The relative amount, RQ, was calculated from the following formula RQ = 2 "AACT The primers used to quantify the expression of HPRT were HPRT-Forward (SEQ ID NO: 73): CTGGAAAGAATGTCTTGATTGTGG; and HPRT-Reverse (SEQ ID NO : 74): CATCTTGGATTATACTGCCTGAC.
Analisis estadlsticosStatistical Analysis
Los analisis de significancia y correlation estadisticos de expresion genica, se realizaron con las herramientas de analisis de GraphPad (5.0 para Windows) mediante los tests de ANOVA y T de Student para los analisis individuales y, de Spearman para los estudios de correlacion tomando los datos como no parametricos.Statistical significance analysis and correlation of genetic expression were performed with GraphPad analysis tools (5.0 for Windows) using the Student ANOVA and T tests for individual analyzes and Spearman for correlation studies taking the data as non parametric.
ResultadosResults
5 Ejemplo 1.- Determinacion de mensajeros consenso e identificacion de nuevas isoformas de TCFL55 Example 1.- Determination of consensus messengers and identification of new isoforms of TCFL5
Se efectuo un analisis bioinformatico partiendo de datos de secuencias de RNAm de TCFL5 publicadas y analizando lecturas de uniones de exones, se establecieron los mensajeros 10 consenso expresados en humano aumentando la cifra de las 2 isoformas previamente descritas (TCFL5 y CHA) a 6 isoformas.A bioinformatic analysis was carried out based on data from published mRNA sequences of TCFL5 and analyzing exon junction readings, consensus messengers 10 expressed in human were established increasing the figure of the 2 isoforms previously described (TCFL5 and CHA) to 6 isoforms.
La Tabla I muestra los RNAm consenso o isoformas identificadas a partir de las secuencias de RNAm publicadas en las distintas bases de datos.Table I shows the consensus mRNAs or isoforms identified from the mRNA sequences published in the different databases.
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Tabla I. Se indican los codigos de acceso para cada uno de los RNAm de TCFL5 descritos en bases de datos y la asociacion de acuerdo con el analisis bioinformatico efectuado por los inventores.Table I. The access codes for each of the TCFL5 mRNAs described in databases and the association according to the bioinformatic analysis performed by the inventors are indicated.
10 La Tabla II proporciona datos adicionales referentes a las variantes o isoformas y a las10 Table II provides additional data regarding the variants or isoforms and the
secuencias de RNAm correspondientes.corresponding mRNA sequences.
En base a dicho analisis bioinformatico, se establecio que el gen TCFL5 se compone de 8 exones (ver Figura 1) siendo los exones 3 (E3) y 5 (E5) comunes a todas las isoformas. El 15 exon 1 (E1) esta presente en 5 de las 6 isoformas, faltando su expresion unicamente en la isoforma denominada CHA (R2b). El ultimo exon puede estar representado por el exon 8, en el caso de la isoforma consenso TCFL5 (TCFL5R) y la isoforma CHA, por el exon 7 o bien por el exon 6. A su vez, la isoforma consenso TCFL5 (TCFL5R) y la isoforma que acaba conBased on this bioinformatic analysis, it was established that the TCFL5 gene is composed of 8 exons (see Figure 1) with exons 3 (E3) and 5 (E5) common to all isoforms. Exon 1 (E1) is present in 5 of the 6 isoforms, its expression missing only in the isoform called CHA (R2b). The last exon may be represented by exon 8, in the case of the consensus isoform TCFL5 (TCFL5R) and the CHA isoform, by exon 7 or by exon 6. In turn, the consensus isoform TCFL5 (TCFL5R) and the isoform that ends with
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5 el exon 6, pueden presentar un exon 4 al cual le faltan los primeros codones (R4b6). Por su parte, la isoforma CHA presenta un exon 2 distinto al resto (E2b).5 exon 6, can present an exon 4 which lacks the first codons (R4b6). On the other hand, the CHA isoform has an exon 2 different from the rest (E2b).
Ejemplo 2.- Diseno de oligonucleotidos para la deteccion de TCFL5/CHAExample 2.- Design of oligonucleotides for the detection of TCFL5 / CHA
10 En base a dicha determinacion de los exones y variantes de los mismos que componen cada una de las isoformas, se procedio al diseno de cebadores que cuantifican TCFL5, CHA de manera independiente y TCFL5/CHA conjuntamente.10 Based on this determination of the exons and variants thereof that make up each of the isoforms, primers were designed that quantify TCFL5, CHA independently and TCFL5 / CHA together.
Para la cuantificacion de TCFL5/CHA se disenaron cebadores que amplificaran una region 15 comun a ambas isoformas, es decir la region comprendida entre los exones 3 y 8 (ver Figs. 1 y 3).For the quantification of TCFL5 / CHA primers were designed that amplify a region common to both isoforms, that is, the region between exons 3 and 8 (see Figs. 1 and 3).
Asimismo, para la cuantificacion de las isoformas TCFL5 y CHA de manera espedfica, es decir cuantificando unicamente las isoformas TCFL5 y CHA (TCFL5R2b), se disenaron 20 cebadores espedficos para la amplificacion de una region comprendida entre los exones 5 yLikewise, for the quantification of the TCFL5 and CHA isoforms in a specific manner, that is, by quantifying only the TCFL5 and CHA isoforms (TCFL5R2b), 20 specific primers were designed for the amplification of a region between exons 5 and
8 de TCFL5 (ver Figs. 1 y 3).8 of TCFL5 (see Figs. 1 and 3).
Tabla III.-Table III.-
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Ejemplo 3.- Diferente expresion de TCFL5 y CHA en tejidos y lineas celulares humanosExample 3.- Different expression of TCFL5 and CHA in human tissues and cell lines
Se analizo la expresion de E1 y E2 codificante en las bases de datos citadas anteriormente 10 y se observo una expresion preferente de E1 en cerebro, corazon, Wgado, pulmon, rinon y testiculo, mientras que el E2 se expreso preferencialmente en la lmea celular T Jurkat, celulas mononucleadas de sangre periferica (PBMNCs), monocitos y celulas T y B. Los resultados se muestran en la Fig. 2.The expression of coding E1 and E2 was analyzed in the databases mentioned above 10 and a preferential expression of E1 was observed in brain, heart, Wgado, lung, kidney and testicle, while E2 was preferentially expressed in the T cell line Jurkat, peripheral blood mononucleated cells (PBMNCs), monocytes and T and B cells. The results are shown in Fig. 2.
15 Ejemplo 4.- Determinacion de los niveles de expresion de TCFL5 y CHA en lineas celulares tratadas con DAPT15 Example 4.- Determination of the levels of expression of TCFL5 and CHA in cell lines treated with DAPT
Se determinaron mediante Western Blot los niveles de expresion de las isoformas TCFL5, CHA y HSP90 (como control), en celulas Jurkat (Clone E6-1, ATCC® TIB-152™). Los 20 resultados en la Fig.5 muestran que se observa una diferencia de expresion entre las isoformas CHA y TCFL5 para distintas concentraciones de DAPT.The expression levels of the TCFL5, CHA and HSP90 isoforms (as a control) were determined by Western Blot in Jurkat cells (Clone E6-1, ATCC® TIB-152 ™). The 20 results in Fig. 5 show that a difference in expression is observed between the CHA and TCFL5 isoforms for different concentrations of DAPT.
5 Ejemplo 5.- Comparacion de los niveles de expresion de TCFL5/CHA RNAm en muestras de pacientes de LLA (LLA-B vs LLA-T, diagnostico vs recaidas, riesgo alto vs medio vs bajo, y riesgo no alto vs riesgo alto)5 Example 5.- Comparison of TCFL5 / CHA mRNA expression levels in samples of ALL patients (ALL-B vs. ALL-T, diagnosis vs. relapse, high risk vs. medium vs. low, and non-high risk vs. high risk)
Los pacientes fueron clasificados en funcion del riesgo tal y como se describe en materiales 10 y metodos. Los niveles de expresion de RNAm de TCFL5/CHA fueron determinados mediante Real Time qPCR.Patients were classified according to risk as described in materials 10 and methods. The mRNA expression levels of TCFL5 / CHA were determined by Real Time qPCR.
Los datos se muestran en la Tablas IV-IX y en las graficas en la figura 6 A, B y C, correspondientes a los datos en las Tablas IV, V y VI respectivamente. Se observan 15 diferencias significativas entre las muestras en el momento del diagnostico vs recaidas, LLA- B vs LLA-T y entre muestras de pacientes con bajo, medio y alto riesgo de recaida.The data are shown in Tables IV-IX and in the graphs in Figure 6 A, B and C, corresponding to the data in Tables IV, V and VI respectively. There are 15 significant differences between the samples at the time of diagnosis vs. relapse, ALL-B vs. ALL-T and between samples of patients with low, medium and high risk of relapse.
Tabla IV.- LLA-B (B) versus LLA-T (T), solo muestras al diagnostico:Table IV.- ALL-B (B) versus ALL-T (T), only samples at diagnosis:
20 Tabla V.- Diagnosticos (DX) versus recaidas (REC):20 Table V.- Diagnostics (DX) versus relapses (REC):
5 Tabla VI.- Riesgo bajo (B), medio (M), alto (A), solo muestras al diagnostico:5 Table VI.- Low (B), medium (M), high (A) risk, only samples at diagnosis:
Tabla VII.- Riesgo no alto (NA) versus riesgo alto (A), solo muestras al diagnostico:Table VII.- Non-high risk (NA) versus high risk (A), only samples at diagnosis:
Las tablas siguientes presentan dichas comparaciones efectuadas solo con las muestras de 10 LLA-B (el grupo mas numeroso).The following tables present these comparisons made only with the 10 LLA-B samples (the largest group).
Tabla VIII.- Diagnosticos (DX) versus recaidas (REC):Table VIII.- Diagnostics (DX) versus relapses (REC):
5 Tabla IX.- Riesgo bajo (B), medio (M), alto (A), solo muestras al diagnostico:5 Table IX.- Low risk (B), medium (M), high (A), only samples at diagnosis:
Tabla X.- Riesgo no alto (NA) versus riesgo alto (A), solo muestras al diagnostico:Table X.- Non-high risk (NA) versus high risk (A), only samples at diagnosis:
eem = error estandar de la media; p = significacion estadisticaeem = standard error of the mean; p = statistical significance
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A los resultados de la tabla VI se le aplico un analisis de discriminates mediante el programa IBM SPSS Statistics Base con el objeto de averiguar el valor pronostico (predictivo de riesgo de recaida) de los valores de expresion de TCFL5/CHA. Los resultados indican que los valores de expresion de TCFL5/CHA permiten predecir un 87% de los pacientes de 15 alto riesgo (Tabla XI)A discriminant analysis was applied to the results of Table VI through the IBM SPSS Statistics Base program in order to determine the prognostic value (predictive of relapse risk) of the expression values of TCFL5 / CHA. The results indicate that the expression values of TCFL5 / CHA allow 87% of patients at high risk to be predicted (Table XI)
5 Tabla XI.- Pronostico segun los grupos de riesgo de recaida bajo, medio y alto segun los niveles de expresion de TCFL5/CHA.5 Table XI.- Forecast according to the risk groups of low, medium and high relapse according to the expression levels of TCFL5 / CHA.
Ejemplo 6.- Determinacion de TCFL5/CHA RNAm en pacientes de LLA (diagnostico vs recaidas)Example 6.- Determination of TCFL5 / CHA mRNA in ALL patients (diagnosis vs. relapse)
10 Determinacion de los niveles de expresion de las isoformas TCFL5 y CHA a nivel de RNAm y protema en muestras de pacientes de LLA clasificadas de alto o bajo riesgo de acuerdo con los criterios indicados en materiales y metodos. Los resultados se muestran en las Figuras 7A y 7B donde se observan mayores niveles de expresion de TCFL5/CHA en el momento del diagnostico.10 Determination of the levels of expression of the TCFL5 and CHA isoforms at the level of mRNA and protem in samples of ALL patients classified as high or low risk according to the criteria indicated in materials and methods. The results are shown in Figures 7A and 7B where higher levels of expression of TCFL5 / CHA are observed at the time of diagnosis.
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