ES2550311T3 - Moléculas de unión a antígeno con afinidad de unión a receptores Fc y función efectora incrementadas - Google Patents

Abstract

Anticuerpo anti-CD20 de tipo II humanizado que comprende: (a) una región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 32 y SEC ID nº 40, y (b) la región variable de cadena ligera de KV1 de SEC ID nº 76.

Description

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polipéptido que presenta la secuencia de una región Fc de anticuerpo, o un fragmento de la misma, procedente de una especie que no es el ratón.

La invención se refiere asimismo a un vector de expresión que comprende cualquiera de los polinucleótidos aislados indicados anteriormente, y a una célula huésped según las reivindicaciones 12 a 17 que comprende dicho vector de expresión. En un aspecto adicional, la invención se refiere a una célula huésped según cualquiera de los polinucleótidos aislados que se han indicado anteriormente.

En un aspecto, la exposición se refiere a un polipéptido aislado que comprende: (a) una secuencia seleccionada de entre un grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 15, SEC ID nº 16 y SEC ID nº 17 (CDRs de VH-1), (b) una secuencia seleccionada de entre un grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 25, SEC ID nº 26 y SEC ID nº 27 (CDRs de VH-2) y la secuencia SEC ID nº 28, en el que dicho polipéptido es un polipéptido de fusión. En otro aspecto, se especifica un polipéptido aislado que comprende las secuencias SEC ID nº 18, SEC ID nº 19 y SEC ID nº 20 (CDRs de VL), en las que dicho polipéptido es un polipéptido de fusión.

La exposición se refiere además a un polipéptido quimérico que comprende la secuencia SEC ID nº 1 o una variante de la misma y un polipéptido quimérico que comprende la secuencia SEC ID nº 2 o una variante de la misma. En una realización, cualquiera de dichos polipéptidos comprende además una región Fc humana. Se describe un polipéptido quimérico que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 30, SEC ID nº 32, SEC ID nº 34, SEC ID nº 36, SEC ID nº 38, SEC ID nº 40, SEC ID nº 42, SEC ID nº 44, SEC ID nº 46, SEC ID nº 48, SEC ID nº 50, SEC ID nº 52, SEC ID nº 54, SEC ID nº 56, SEC ID nº 58, SEC ID nº 60, SEC ID nº 62, SEC ID nº 64, SEC ID nº 66, SEC ID nº 68, SEC ID nº 70 y SEC ID nº 72, o una variante de las mismas, y un polipéptido quimérico que comprende la secuencia SEC ID nº 76 o una variante de la misma. En una realización, cualquiera de dichos polipéptidos comprende además una región Fc humana.

En otro aspecto la exposición se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia derivada del anticuerpo B-Ly1 murino y una secuencia derivada de un polipéptido heterólogo y a una molécula de unión a antígeno que comprende dicho polipéptido. En una realización, la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo. En una realización preferente, el anticuerpo es quimérico. En otra realización preferente, el anticuerpo se encuentra humanizado o primatizado.

En un aspecto adicional, la exposición se refiere a un polipéptido aislado que comprende la secuencia SEC ID nº 13

o una variante de la misma y un polipéptido aislado que comprende la secuencia SEC ID nº 14.

En otro aspecto, la exposición se refiere a una MUA, que es capaz de competir con el anticuerpo B-Ly1 murino para la unión a CD20 y que es quimérica. En una realización, la MUA es un anticuerpo o un fragmento del mismo. En una realización adicional, la MUA es un anticuerpo recombinante que comprende una región VH que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 1, SEC ID nº 30, SEC ID nº 32, SEC ID nº 34, SEC ID nº 36, SEC ID nº 38, SEC ID nº 40, SEC ID nº 42, SEC ID nº 44, SEC ID nº 46, SEC ID nº 48, SEC ID nº 50, SEC ID nº 52, SEC ID nº 54, SEC ID nº 56, SEC ID nº 58, SEC ID nº 60, SEC ID nº 62, SEC ID nº 64, SEC ID nº 66, SEC ID nº 68, SEC ID nº 70 y SEC ID nº 72. En otra realización, la MUA es un anticuerpo recombinante que comprende una región VL que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 2 y SEC ID nº 76. La MUA es un anticuerpo recombinante que se encuentra humanizado. En otra realización, la MUA es un anticuerpo recombinante que comprende una región Fc humana. En una realización adicional, puede conjugarse cualquiera de las MUAs comentadas anteriormente con una fracción tal como una toxina o un marcaje radioactivo.

La exposición se refiere además a una MUA tal como se describe en la presente memoria, presentando dicha MUA oligosacáridos modificados. En una realización, los oligosacáridos modificados presentan una fucosilación reducida en comparación con los oligosacáridos no modificados. En otras realizaciones, los oligosacáridos modificados son híbridos o complejos. En una realización adicional, la MUA presenta una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados o de oligosacáridos no fucosilados bisectados en la región Fc de dicha molécula. En una realización, los oligosacáridos no fucosilados bisectados son híbridos. En una realización adicional, los oligosacáridos no fucosilados bisectados son complejos. En una realización, por lo menos 20% de los oligosacáridos en la región Fc de dicho polipéptido son no fucosilados o bisectados. En realizaciones más preferentes, por lo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75% o más de los oligosacáridos son no fucosilados o no fucosilados bisectados.

La exposición se refiere además a un polinucleótido codificante de cualquiera de las MUAs comentadas anteriormente, y vectores de expresión y células que comprenden dicha polinucleótido.

La exposición se refiere además a un método para producir una MUA, que es capaz de competir con el anticuerpo B-Ly1 murino para la unión a CD20 y en el que dicha MUA es quimérica, comprendiendo dicho método: (a) cultivar

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una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica una MUA de la presente invención en un medio bajo condiciones que permitan la expresión de dicho polinucleótido codificante de dicha MUA, y (b) recuperar dicha AMB del cultivo resultante.

En otro aspecto, la exposición se refiere a una composición farmacéutica según la reivindicación 18, que comprende la MUA de la invención. Se encuentra contemplado que la composición farmacéutica pueda comprender además un portador farmacéuticamente aceptable, un adyuvante o una combinación del os mismos.

En un aspecto adicional, la exposición se refiere a un método para tratar una enfermedad tratable mediante la reducción marcada de las células B. El método comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de las MUA de la presente invención en un sujeto humano que lo necesita. En una realización preferente, la enfermedad se trata mediante la administración de una MUA que es un anticuerpo quimérico o un fragmento quimérico de un anticuerpo.

En todavía otro aspecto, la exposición se refiere a una célula huésped manipulada para que exprese por lo menos un ácido nucleico codificante de un polipéptido que presenta actividad de GnTIII en una cantidad suficiente para modificar los oligosacáridos en la región Fc de los anticuerpos producidos por la célula huésped, en la que las MUAs son capaces de competir con el anticuerpo B-Ly1 murino para la unión a CD20 y en la que las MUAs son quiméricas. En una realización, el polipéptido que presenta actividad de GnTIII es un polipéptido de fusión. En otra realización, la MUA producida por la célula huésped es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En una realización adicional, la MUA comprende una región equivalente a la región Fc de una IgG humana.

La exposición se refiere además a un polinucleótido aislado que comprende por lo menos una región determinante de complementariedad del anticuerpo B-Ly1 murino, o una variante o forma truncada del mismo que contiene por lo menos los residuos determinantes de especificidad para dicha región determinante de complementariedad, en el que dicho polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión. Preferentemente dichos polinucleótidos aislados codifican un polipéptido de fusión que es una molécula de unión a antígeno. En una realización el polinucleótido comprende tres regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo B-Ly1 murino, o variantes o formas truncadas del mismo que contienen por lo menos los residuos determinantes de la especificidad para cada una de dichas tres regiones determinantes de complementariedad. En otra realización, el polinucleótido codifica la región variable entera de la cadena ligera o pesada de un anticuerpo quimérico (por ejemplo humanizado). La exposición se refiere además a los polipéptidos codificados por dichos polinucleótidos.

En otra realización, la exposición se refiere a una molécula de unión a antígeno que comprende por lo menos una región determinante de complementariedad del anticuerpo B-Ly1 murino, o una variante o forma truncada del mismo que contiene por lo menos los residuos determinantes de especificidad para dicha región determinante de complementariedad, y que comprende una secuencia derivada de un polipéptido heterólogo. En una realización, la molécula de unión a antígeno comprende tres regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo B-Ly1 murino, o variantes o formas truncadas del mismo que contienen por lo menos los residuos determinantes de especificidad para cada una de dichas tres regiones determinantes de complementariedad. En otro aspecto, la molécula de unión a antígeno comprende la región variable de una cadena ligera o pesada de anticuerpo. En una realización particularmente útil, la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo quimérico, por ejemplo humanizado. Dichas moléculas de unión a antígeno pueden utilizarse en el tratamiento de enfermedades, incluyendo los linfomas de células B.

La presente exposición es el primer caso conocido de manipulación de un anticuerpo anti-CD20 de tipo II para que presente funciones efectoras incrementadas, tales como la ADCC, conservando simultáneamente una potente capacidad de apoptosis. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-CD20 de tipo II manipulado que presenta una ADCC incrementada como resultado de dicha manipulación y sin pérdida de capacidad sustancial de inducir apoptosis. En una realización, los anticuerpos anti-CD20 de tipo II han sido manipulados para presentar un patrón alterado de glucosilación en la región Fc. En una realización particular, la glucosilación alterada comprende un nivel incrementado de residuos complejos bisectados en la región Fc. En otra realización particular, la glucosilación alterada comprende un número reducido de residuos fucosa en la región Fc. En otra realización, los anticuerpos anti-CD20 de tipo II han sido sometidos a manipulación del polipéptido. La invención se refiere asimismo a métodos de preparación de dichos anticuerpos de tipo II manipulados y a métodos de utilización de dichos anticuerpos en el tratamiento de diversos trastornos de las células B, incluyendo los linfomas de células B.

La célula huésped de la presente invención puede seleccionarse de entre el grupo que incluye, aunque sin limitación, una célula CHO, una célula BHK, una célula NSO, una célula SP2/0, una célula de mieloma YO, una célula de mieloma de ratón P3X63, una célula PER, una célula PER.C6 o una célula de hibridoma. En una realización, la célula huésped de la invención comprende además un polinucleótido transfectado que comprende un polinucleótido codificante de la región VL del anticuerpo B-Ly1 murino o variantes del mismo y una secuencia

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codificante de una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina humana. En otra realización, la célula huésped de la invención comprende además un polinucleótido transfectado que comprende un polinucleótido codificante de la región VH del anticuerpo B-Ly1 murino o variantes del mismo y una secuencia codificante de una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina humana.

En un aspecto adicional, la exposición se refiere a una célula huésped que produce una MUA que muestra una afinidad de unión a receptores Fc incrementada y/o una función efectora incrementada como resultado de la modificación de sus oligosacáridos. En una realización, la afinidad de unión incrementada es a un receptor Fc, particularmente al receptor FcγRIIIA. La función efectora contemplada en la presente invención puede seleccionarse de entre el grupo que incluye, aunque sin limitación, citotoxicidad celular mediada por Fc incrementada, unión incrementada a células NK, unión incrementada a macrófagos, unión incrementada a células polimorfonucleares, unión incrementada a monocitos, señalización directa incrementada inductora de apoptosis, maduración de células dendríticas incrementada y cebado incrementado de las células T.

En una realización adicional, la célula huésped de la presente invención comprende por lo menos un ácido nucleico codificante de un polipéptido que presenta actividad de GnTIII que se encuentra operablemente ligado a un elemento promotor constitutivo.

En otro aspecto, la exposición se refiere a un método para producir una MUA en una célula huésped, que comprende: (a) cultivar una célula huésped manipulada para expresar por lo menos un polinucleótido codificante de un polipéptido de fusión que presente actividad de GnTIII bajo condiciones que permitan la producción de dicha MUA y que permitan la modificación de los oligosacáridos presentes en la región Fc de dicha MUA, y (b) aislar dicha MUA, en donde dicha MUA es capaz d competir con el anticuerpo B-Ly1 murino para la unión a CD20, y en donde dicha MUA es quimérica. En una realización, el polipéptido que presenta actividad de GnTIII es un polipéptido de fusión, que preferentemente comprende el dominio catalítico de GnTIII y el dominio de localización en el Golgi de un polipéptido residente en el Golgi heterólogo seleccionado de entre el grupo que consiste del dominio de localización de la manosidasa II, el dominio de localización de β(1,2)-N-acetiglucosaminiltransferasa I ("GnTI"), el dominio de localización de manosidasa I, el dominio de localización de β(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa II ("GnTII") y el dominio de localización de α1-6-fucosiltransferasa nuclear. Preferentemente, el dominio de localización en el Golgi es de la manosidasa II o de GnTI.

En un aspecto adicional, la exposición se refiere a un método para modificar el perfil de glucosilación de una MUA anti-CD20 producida por una célula huésped, que comprende introducir en la célula huésped por lo menos un ácido nucleico o vector de expresión de la invención. En una realización, la MUA es un anticuerpo o un fragmento del mismo, comprendiendo preferentemente la región Fc de una IgG. Alternativamente, el polipéptido es una proteína de fusión que incluye una región equivalente a una región Fc de una IgG humana.

En un aspecto, la exposición se refiere a un anticuerpo quimérico recombinante, o a un fragmento del mismo, capaz de competir con el anticuerpo B-Ly1 murino para la unión a CD20 y que presenta una fucosilación reducida.

En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un método para modificar la glucosilación del anticuerpo recombinante o de un fragmento del mismo de la invención mediante la utilización de un polipéptido de fusión que presenta actividad de GnTIII y que comprende el dominio de localización de Golgi de un polipéptido residente en el Golgi heterólogo. En una realización, los polipéptidos de fusión de la invención comprenden el dominio catalítico de GnTIII. En otra realización, el dominio de localización en el Golgi se selecciona de entre el grupo que consiste del dominio de localización de la manosidasa II, el dominio de localización de GnTI, el dominio de localización de la manosidasa I, el dominio de localización de GnTII y el dominio de localización en el Golgi es de la manosidasa II o de GnTI.

En una realización, el método descrito en la presente memoria se refiere a producir un anticuerpo quimérico recombinante, o un fragmento del mismo, con oligosacáridos modificados, en el que dichos oligosacáridos modificados presentan una fucosilación reducida en comparación con los oligosacáridos no modificados. Según la presente invención, estos oligosacáridos modificados pueden ser híbridos o complejos. En otra realización, el método de la invención se refiere a la producción de un anticuerpo quimérico recombinante o un fragmento del mismo que presenta una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados bisectados en la región Fc de dicho polipéptido. En una realización, los oligosacáridos no fucosilados bisectados son híbridos. En otra realización, los oligosacáridos no fucosilados bisectados son complejos. En una realización adicional, el método de la invención se refiere a producir un anticuerpo quimérico recombinante o un fragmento del mismo en el que por lo menos 20% de los oligosacáridos de la región Fc de dicho polipéptido son no fucosilados bisectados. En otra realización preferente, por lo menos 35% de los oligosacáridos en la región Fc de dicho polipéptido son no fucosilados bisectados.

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En un aspecto adicional, la exposición se refiere a un anticuerpo quimérico recombinante o a un fragmento del mismo, que muestra una afinidad de unión de receptor Fc incrementada y/o una función efectora incrementada como resultado de la modificación de sus oligosacáridos. En una realización, la afinidad de unión incrementada es a un receptor activador de Fc. En una realización adicional, el receptor Fc es un receptor activador Fcγ, particularmente el receptor FcγRIII. La función efectora contemplada en la presente invención puede seleccionarse de entre el grupo que incluyen, aunque sin limitación, citotoxicidad celular mediada por Fc incrementada, un nivel incrementado de unión a células NK, un nivel incrementado de unión a macrófagos, un nivel incrementado de unión a células polimorfonucleares, un nivel incrementado de unión a monocitos, la señalización directa inductora de apoptosis incrementada, la maduración incrementada de las células dendríticas y un nivel incrementado de cebado de las células T.

En otro aspecto, la invención se refiere a un fragmento de anticuerpo quimérico recombinante que presenta la especificidad de unión del anticuerpo B-Ly1 murino y que contiene la región Fc, que ha sido manipulado para presentar una función efectora incrementada producido mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria.

En otro aspecto, se da a conocer una proteína de fusión que incluye un polipéptido que presenta la secuencia SEC ID nº 1 y una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina y manipulada para presentar una función efectora incrementada producida mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria.

En otro aspecto, la presente exposición se refiere a una proteína de fusión que incluye un polipéptido que presenta la secuencia SEC ID nº 2 y una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina y manipulada para que presenta una función efectora incrementada producida mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria.

En un aspecto, la presente exposición se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo quimérico recombinante, producido mediante cualquiera de los métodos de la presente invención, y un portador farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, la presente exposición se refiere a una composición farmacéutica que comprende un fragmento de anticuerpo quimérico recombinante producido mediante cualquiera de los métodos de la presente invención, y un portador farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, la presente exposición se refiere a una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión producida mediante cualquiera de los métodos de la presente invención, y un portador farmacéuticamente aceptable.

La exposición se refiere además a un método de tratamiento de una enfermedad tratable mediante la reducción marcada de las células B, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo quimérico recombinante o de un fragmento del mismo, producido mediante cualquiera de los métodos de la presente invención, en un sujeto humano que lo necesita.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 2) y de aminoácidos (SEC ID nº 1) de la región VH de B-Ly1 murino. FIG. 2. Secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 4) y de aminoácidos (SEC ID nº 3) de la región VL de B-Ly1 murino. FIG. 3. Unión de Rituximab® y de ch-B_Ly1 (Δ) a CD20 sobre células B de linfoma de Raji. FIG. 4. Reducción marcada de las células B por Rituximab® (O) y ch-B_Lyl (Δ) en sangre completa de tres clases diferentes de genotipo FcγRIIIa-158V/F: (A) sangre completa de un donante F/F, homocigótico para el receptor de menor afinidad, (B) sangre completa de un donante F/V, heterocigótico para el receptor de afinidad, y

(C) sangre completa de un donante V/V, homocigótico para el receptor de afinidad más alta. FIG. 5. Secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 11) y de aminoácidos (SEC ID nº 13) de la cadena pesada de un anticuerpo anti-CD20 quimérico. FIG. 6. Secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 12) y de aminoácidos (SEC ID nº 14) de la cadena ligera de un anticuerpo anti-CD20 quimérico. FIG. 7. Secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de las CDR del anticuerpo B-Ly1 murino. (A) CDR predichas para la región VH. (B) CDR predichas para la región VL. FIG. 8. Perfil de MALDI-TOF de un anticuerpo B-Ly1 quimérico glucomanipulado. (A) Tabla que muestra los porcentajes de picos específicos, (B) espectro de B-Ly1 quimérico glucomanipulado, (C) espectro de B-Ly1 quimérico glucomanipulado tratado con Endo-H. FIG. 9. Unión de diferentes anticuerpos anti-CD20 humanizados a células B Raji. Las diferencias entre el constructo B-HH2 y los constructos B-HL8 y B-HL11 se localizan en las regiones de marco 1 y 2, siendo las tres CDR idénticas. B-HL8 y B-HL11 presentan secuencias FR1 y FR2 que se derivan de la clase VH3 humana, mientras que el marco completo de B-HH2 se deriva de la clase VH1 humana. B-HL11 es un derivado de B-HL8 con la mutación única Glu1Gln, siendo Gln el residuo aminoácido en el constructo B-HH2. Lo anterior significa que el intercambio Glu-Gln no altera la afinidad o la intensidad de la unión. Las otras diferencias entre B-HH2 y

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B-HL8 son: 14 residuos de FR, de entre los que uno o más influirá sobre el comportamiento de unión a antígeno de este anticuerpo. FIG. 10. Unión del anticuerpo anti-CD20 humanizado BHL4-KV a células diana Raji. El constructo B-HL4 se derivada del anticuerpo B-HH2 mediante la sustitución del FR1 de B-HH2 por el de la secuencia VH1_45 de la línea germinal humana. Este constructo muestra una capacidad de unión a antígeno muy reducida, a pesar de presentar aminoácidos diferentes únicamente en tres posiciones en FR1. Estos residuos se encuentran situados en las posiciones 2, 14 y 30 según la numeración de Kabat. De estos, la posición 30 aparentemente es la posición con más influencia, debido a que es parte de la definición de Chothia de la CDR1. FIG. 11. Comparación entre el comportamiento de unión entre B-HH1, B-HH2, B-HH3 y el anticuerpo parental Bly1. Los datos muestran que todos los anticuerpos muestran un valor de EC50 similar, aunque el constructo B-HH1 se une con una intensidad/estequiometría menor que las variantes B-HH2 y B-HH3. B-HH1 puede distinguirse de B-HH2 y de B-HH3 por sus regiones CDR1 y CDR2 parcialmente humanas (definición de Kabat), así como el polimorfismo Ala/Thr en la posición 28 (numeración de Kabat). Esto indica que la posición 28, la CDR1 completa y/o la CDR2 completa resultan importantes para la interacción anticuerpo/antígeno. FIG. 12. Comparación entre B-HL1, B-HH1 y el anticuerpo parental B-ly1. Los datos mostraron la ausencia de cualquier actividad de unión en el constructo B-HL1, y aproximadamente la mitad de la intensidad/estequiometría de unión de B-HH1 que B-ly1. Tanto B-HL1 como B-HH1 han sido diseñados basándose en marcos aceptores derivados de la clase VH-1 humana. Entre otras diferencias, la posición 71 (numeración de Kabat) del constructo B-HL1 es una diferencia notable, que indica su importancia putativa para la unión de antígeno. FIG. 13. Análisis fluorocitométrico de la capacidad del anticuerpo anti-CD20 de unión a su antígeno. Los datos mostraron que los constructos B-HL2 y B-HL3 no presentaban actividad de unión a CD-20. FIG. 14. Apoptosis de los anticuerpos anti-CD20 en células Z-138 MCL. FIG. 15. Apoptosis por los anticuerpos anti-CD20. Datos del ensayo: se sembraron 5x105 células/pocillo en placas de 24 pocillos (5x105 células/ml) en medio de cultivo. Se añadieron a los pocillos 10 mg del anticuerpo respectivo, PBS como control negativo o camptotecina (CPT) 5 mM como control positivo. Las muestras se incubaron durante la noche (16 horas), se tiñeron con AnnV-FITC y se analizaron mediante FACS. El ensayo se realizó por triplicado. (*): Se ha restado la señal de PBS solo (PBS solo proporcionó una señal de 8% y 2%, AnnV+, para las células PR-1 y Z-138, respectivamente). Los anticuerpos utilizados fueron: C2B8 (quimérico, no glucomanipulado), BHH2-KV1 (humanizado, no glucomanipulado). Nota: este ensayo no implica la adición de células efectoras adicionales, únicamente dianas más anticuerpo o controles. FIG. 16. Eliminación de células diana por parte de anticuerpos anti-CD20 con células inmunológicas efectoras. Datos del ensayo: marcada reducción de las células B en la incubación durante la noche de sangre completa normal, y análisis para CD19+/CD3+ mediante FACS. ADCC utilizando PBMC como efectoras, 4 horas de incubación: proporción de efectora:diana de 25:1, eliminación de la diana medida mediante retención de calceína respecto a la lisis con detergente (100%) y a la lisis sin anticuerpo (0%). Anticuerpos utilizados: C2B8 (quimérico, forma no glucomanipulada), BHH2-KV1-wt (forma humanizada no glucomanipulada de BHH2-KV1), BHH2-KV1-GE (forma humanizada no glucomanipulada de BHH2-KV1). FIG. 17. Perfil de EM-MALDI/TOF de Fc-oligosacáridos liberados con PNGasa F de anticuerpo IgG1 B-ly1 anti-CD20 humano no modificado no glucomanipulado humanizado con BHH2-KV1. FIG. 18. Perfil de EM-MALDI/TOF de Fc-oligosacáridos liberados con PNGasaF de anticuerpo IgG1 B-ly1 anti-CD20 humano glucomanipulado humanizado con BHH2-KV1g1. La glucomanipulación se realizó mediante coexpresión en células huésped de genes de anticuerpo y del gen codificante de enzima con actividad catalítica de β-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa III (Gnt-III). FIG. 19. Perfil de EM-MALDI/TOF de Fc-oligosacáridos liberados con PNGasaF de anticuerpo IgG1 B-ly1 anti-CD20 humano glucomanipulado humanizado con BHH2-KV1g2. La glucomanipulación se realizó mediante coexpresión en células huésped de genes de anticuerpo y genes codificantes de enzima con actividad catalítica de β-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnT-III) y codificante de enzima con actividad catalítica de αmanosidasa II del Golgi. FIG. 20. Unión de anticuerpos no glucomanipulados y glucomanipulados a receptor FcγRIIIa expresado sobre la superficie de células CHO-CD16 recombinantes. FIG. 21. Apoptosis de anticuerpos anti-CD20 no manipulados con Fc y manipulados con Fc sobre células Z-138 MCL. Datos del ensayo: se sembraron 5x105 células/pocillo en placas de 24 pocillos (5x105 células/ml) en medio de cultivo. Se añadieron a los pocillos 10 mg del Ab respectivo, PBS para el control negativo. Las muestras se incubaron durante la noche (16 horas), se tiñeron con AnnV-FITC y se analizaron mediante FACS. El ensayo se realizó por triplicado. Anticuerpos utilizados: C2B8=rituximab (forma no glucomanipulada quimérica, igual a la forma comercial), BHH2-KV1 (forma no glucomanipulada humanizada, ver la fig. 6 para el perfil de glucosilación), BHH2-KV1g1 (forma glucomanipulada humanizada, ver la figura 7 para el perfil de glucosilación), BHH2-KV1g2 (forma glucomanipulada humanizada, ver la fig. 8 para el perfil de glucosilación). Nota: este ensayo no implica ninguna célula efectora adicional, únicamente dianas más anticuerpo o controles. (*): se ha restado la señal de PBS solo.

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orientación para determinar qué residuos aminoácidos pueden sustituirse, añadirse o delecionarse sin eliminar actividades de interés, comparando la secuencia del polipéptido particular con la de péptidos homólogos y minimizando el número de cambios de la secuencia de aminoácidos realizados en regiones de elevada homología (regiones conservadas) o sustituyendo aminoácidos por una secuencia de consenso.

Alternativamente, pueden sintetizarse variantes recombinantes codificantes dichos polipéptidos o polipéptidos similares o seleccionarse utilizando la "redundancia" del código genético. Pueden introducirse diversas sustituciones de codones, tales como cambios silenciosos que producen diversos sitios de restricción, para optimizar la clonación en un plásmido o vector vírico o la expresión en un sistema procariótico o eucariótico particular. Las mutaciones en la secuencia polinucleótida pueden reflejarse en el polipéptido o en dominios de otros péptidos añadidos al polipéptido para modificar las propiedades de cualquier parte del polipéptido, para cambiar características tales como las afinidades de unión a ligando, las afinidades entre cadenas o la tasas de degradación/renovación.

Preferentemente, las "sustituciones" de aminoácidos son el resultado de sustituir un aminoácido por otro aminoácido que presenta propiedades estructurales y/o químicas similares, es decir, sustituciones conservadoras de aminoácidos. Pueden realizarse sustituciones "conservadoras" de aminoácidos basándose en la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos implicados. Por ejemplo, entre los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) se incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; entre los aminoácidos neutros polares se incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; entre los aminoácidos cargados positivamente (básicos) se incluyen arginina, lisina e histidina, y entre los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) se incluyen el ácido aspártico y el ácido glutámico. Las "inserciones" o "deleciones" preferentemente son de entre aproximadamente 1 y 20 aminoácidos, preferentemente de entre 1 y 10 aminoácidos. La variación permitida puede determinarse experimentalmente mediante la realización sistemática de inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en una molécula de polipéptido utilizando técnicas de ADN recombinante y sometiendo a ensayo las variantes recombinantes resultantes para la actividad.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "humanizado" se utiliza para referirse a una molécula de unión a antígeno derivada de una molécula de unión a antígeno no humana, por ejemplo un anticuerpo murino, que conserva o que conserva sustancialmente las propiedades de unión a antígeno de la molécula parental pero que es menos inmunogénica en el ser humano. Esto puede conseguirse mediante diversos métodos, incluyendo: (a) la injertación de los dominios variables no humanos enteros en regiones constantes humanas para generar anticuerpos quiméricos, (b) injertar únicamente las CDRs no humanas en las regiones de marco y constantes humanas con o sin conservación de los residuos de marco críticos (por ejemplo aquellos que resultan importantes para conservan una buena afinidad de unión de antígeno o funciones de anticuerpo), o (c) trasplantar los dominios variables no humanos enteros aunque "cubriéndolos" con una sección de tipo humano mediante sustitución de los residuos superficiales. Dichos métodos se dan a conocer en Jones et al., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855, 1984; Morrison y Oi, Adv. Immunol. 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun. 28:489-498, 1991; Padlan, Molec. Immun. 31(3):169-217, 1994. Existen generalmente 3 regiones determinantes de complementariedad, o CDR (CDR1, CDR2 y CDR3) en cada uno de los dominios variables de cadena pesada y de cadena ligera de un anticuerpo, que se encuentran flanqueados por cuatro subregiones de marco (es decir, FR1, FR2, FR3 y FR4) en cada uno de los dominios variables de cadena pesada y de cadena ligera de un anticuerpo: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Puede encontrarse un comentario de anticuerpos humanizados en, entre otros, la patente US nº 6.632.927 y publicado en la solicitud de patente US nº 2003/0175269.

De manera similar, tal como se utiliza en la presente memoria, el término "primatizado" se utiliza para referirse a una molécula de unión a antígeno derivada de una molécula de unión a antígeno no de primate, por ejemplo un anticuerpo murino, que conserva o que conserva sustancialmente las propiedades de unión a antígeno de la molécula parental pero que es menos inmunogénica en primates.

En el caso de que existan dos o más definiciones de un término que se utilice y/o se encuentre aceptado en la técnica, la definición del término tal como se utiliza en la presente memoria pretende incluir todos dichos significados, a menos que se indique explícitamente lo contrario. Un ejemplo específico es la utilización de la expresión "región determinante de complementariedad" ("CDR") para describir los sitios de unión a antígeno no contiguos presentes dentro de la región variable de los polipéptidos tanto de cadena pesada como de cadena ligera. Esta región particular ha sido descrita por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 1983, y por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987, en donde las definiciones incluyen residuos aminoácidos solapantes o subconjuntos de los mismos en la comparación entre ellos. Sin embargo, la aplicación de cualquiera de las definiciones para referirse a una CDR de un anticuerpo o a variantes de la misma pretende encontrarse comprendido dentro del alcance de la expresión tal como se define y se utiliza en la presente memoria. Los residuos aminoácidos apropiados comprendidos por las CDR tal como se definen en cada una de la referencias anteriormente citadas se proporcionan a continuación en la Tabla I a título comparativo. Los números de residuo exactos comprendidos en una CDR particular variarán dependiendo de la secuencia y del

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Por ejemplo, una secuencia sujeto de 90 bases se alinea con una secuencia pregunta de 100 bases para determinar el porcentaje de identidad. Las deleciones se producen en el extremo 5' de la secuencia sujeto y, por lo tanto, la alineación FASTDB no muestra un apareamiento/alineación de las primeras 10 bases en el extremo 5'. Las 10 bases desapareadas representan 10% de la secuencia (número de bases en los extremos 5' y 3' no apareadas/número total de bases en la secuencia pregunta), de manera que se resta 10% de la puntuación de porcentaje de identidad calculada por el programa FASTDB. En el caso de que las 90 bases restantes se encontrasen perfectamente apareadas, el porcentaje de identidad final sería de 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia sujeto de 90 bases con una secuencia pregunta de 100 bases. En esta ocasión las deleciones son deleciones internas, de manera que no se encuentran bases en el lado 5' o 3' de la secuencia sujeto que no estén apareadas/alineadas con la secuencia pregunta. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Nuevamente, únicamente las bases situadas en el lado 5' y 3' de la secuencia sujeto que no están apareadas/alineadas con la secuencia pregunta son corregidas manualmente. No se realizan otras correcciones manuales para los fines de la presente invención.

La mención de un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia pregunta de aminoácidos de la presente invención se refiere a que dicha secuencia de aminoácidos del polipéptido sujeto es idéntica a la secuencia pregunta excepto en que la secuencia polipeptídica sujeto puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia pregunta de aminoácidos. En otras palabras, para obtener un polipéptido que presente una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a una secuencia pregunta de aminoácidos, deben insertarse, delecionarse o sustituirse por otro aminoácido hasta 5% de los residuos aminoácidos en la secuencia sujeto. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones aminoterminales o carboxiterminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier posición entre aquellas posiciones terminales, intercalados individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

En la práctica, si cualquier polipéptido particular es idéntico al 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a un polipéptido de referencia puede determinarse convencionalmente utilizando programas informáticos conocidos. Un método preferente para determinar la correspondencia global óptima entre una secuencia pregunta (una secuencia de la presente invención) y una secuencia sujeto, también denominado alineación global de secuencias, puede determinarse utilizando el programa informático FASTDB, basado en el algoritmo de Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990. En una alineación de secuencias, las secuencias pregunta y sujeto son ambas secuencias de nucleótidos o ambas secuencias de aminoácidos. El resultado de dicha alineación global de secuencias se proporciona en forma de porcentaje de identidad. Los parámetros preferentes utilizados en una alineación FASTDB de aminoácidos son: Matrix=PAM 0, k-tuplo=2, Penalización por desapareamiento=1, Penalización por unión=20, Longitud de grupo de aleatorización=0, Puntuación de corte=1, Tamaño de ventana=longitud de secuencia, Penalización por hueco=5, Penalización según tamaño de hueco=0,05, Tamaño de ventana=500 o la longitud de la secuencia sujeto de aminoácidos, la que sea más corta.

En el caso de que la secuencia sujeto sea más corta que la secuencia pregunta debido a deleciones N-terminales o C-terminales, no debido a deleciones internas, debe realizarse una corrección manual de los resultados. Esto se debe a que el programa FASTDB no considera los truncados N-terminales y C-terminales de la secuencia sujeto al calcular el porcentaje de identidad global. Para las secuencias sujeto truncadas en los extremos N-terminal y Cterminal, respecto a la secuencia pregunta, se corrige el porcentaje de identidad calculando el número de residuos de la secuencia pregunta que son N-terminales y C-terminales respecto a la secuencia sujeto, que no se encuentren apareadas/alineadas con un residuo correspondiente de la secuencia sujeto, en forma de porcentaje del número total de bases de la secuencia pregunta. Los resultados de alineación de secuencias de FASTDB permiten determinar si un residuo se encuentra apareado/alineado. A continuación, este porcentaje se resta del porcentaje de identidad, calculado con el programa FASTDB anteriormente indicado utilizando los parámetros especificados, alcanzando una puntuación final de porcentaje de identidad. Esta puntuación final de porcentaje de identidad es la que se utiliza para los fines de la presente invención. Únicamente los residuos N-terminales y C-terminales respecto de la secuencia sujeto que no se encuentren apareados/alineados con la secuencia pregunta se consideran para los fines de ajustar manualmente la puntuación de porcentaje de identidad. Es decir, únicamente las posiciones de residuos en la secuencia pregunta en el exterior de los residuos N-terminales y C-terminales más alejados de la secuencia sujeto.

Por ejemplo, una secuencia sujeto de 90 residuos aminoácidos se alinea con una secuencia pregunta de 100 residuos para determinar el porcentaje de identidad. La deleción se ha producido en el extremo N-terminal de la secuencia sujeto y, por lo tanto, la alineación FASTDB no muestra un apareamiento/alineación de los primeros 10 residuos en el extremo N-terminal. Los 10 residuos no apareados representan 10% de la secuencia (número de residuos en los extremos N-terminales y C-terminales no apareados/número total de residuos en la secuencia pregunta), de manera que se resta 10% de la puntuación de porcentaje de identidad calculada con el programa FASTDB. Si los 90 residuos restantes se encontrarse perfectamente apareados, el porcentaje final de identidad sería de 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia sujeto de 90 residuos con una secuencia pregunta de 100

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Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "citotoxicidad celular mediada por Fc incrementada" se define como un incremento del número de "células reconocidas por anticuerpos" que resultan lisadas en un tiempo dado, a una concentración dada de anticuerpo, o de proteínas de fusión con Fc, en el medio circundante a las células diana, mediante el mecanismo de citotoxicidad celular mediada por Fc definido anteriormente, y/o una reducción de la concentración de anticuerpo o de proteína de fusión con Fc, en el medio circundante a las células diana, necesario para conseguir la lisis de un número dado de "células reconocidas por anticuerpos", en un tiempo dado, mediante el mecanismo de citotoxicidad celular mediada por Fc. El incremento de la citotoxicidad celular mediada por Fc es respecto a la citotoxicidad celular mediada por el mismo anticuerpo, o proteína de fusión con Fc, producido por el mismo tipo de células huésped, utilizando los mismos métodos estándares de producción, purificación, formulación y almacenamiento, que son conocidos por el experto en la materia, pero que no ha sido producido por células huésped manipuladas para expresar la glucosiltransferasa GnTIII mediante los métodos descritos en la presente memoria.

La expresión "anticuerpo que presentan citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)" se refiere a un anticuerpo, tal como se define dicha expresión en la presente memoria, que presenta una ADCC incrementada según se determina mediante cualquier método adecuado conocido por el experto ordinario en la materia. Un ensayo ADCC in vitro aceptado es el siguiente:

1) el ensayo utiliza células diana que es conocido que expresan el antígeno diana reconocido por la región ligante de antígeno del anticuerpo, 2) el ensayo utiliza células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) aisladas de sangre de un donante sano seleccionado aleatoriamente, como células efectoras, 3) el ensayo se lleva a cabo siguiendo el protocolo siguiente:

i) las PBMCs se aíslan utilizando procedimientos estándares de centrifugación en gradiente de densidades y se suspenden a una densidad de 5 x 106 células/ml en medio de cultivo celular RPMI, ii) las células diana se cultivan mediante métodos de cultivo de tejido estándares, se recolectan de la fase de crecimiento exponencial con una viabilidad superior a 90%, se lavan en medio de cultivo celular RPMI, se marcan con 100 microCuries de 51Cr, se lavan dos veces con medio de cultivo celular y se resuspenden en medio de cultivo celular a una densidad de 105 células/ml, iii) se transfieren 100 microlitros de la suspensión de células diana final a cada pocillo de una placa de microtitulación de 46 pocillos, iv) el anticuerpo se diluye en serie de 4.000 ng/ml a 0,04 ng/ml en medio de cultivo celular y se añaden 50 microlitros de las soluciones de anticuerpo resultantes a las células diana en la placa de microtitulación de 96 pocillos, llevando a cabo ensayos por triplicado de concentraciones del anticuerpo que cubren el intervalo completo de concentraciones anteriormente indicado, v) para los controles de liberación máxima (MR), 3 pocillos adicionales en la placa que contiene las células diana marcadas reciben 50 microlitros de una solución acuosa al 2% (v/v) de detergente no iónico (Nonidet, Sigma, St. Louis) en lugar de la solución de anticuerpo (punto iv), anteriormente), v) para los controles de liberación espontánea (SR), 3 pocillos adicionales en la placa que contiene las células diana marcadas reciben 50 microlitros de medio de cultivo celular RPMI en lugar de la solución de anticuerpo (punto iv), anteriormente), vii) a continuación, la placa de microtitulación de 96 pocillos se centrifuga a 50 x g durante 1 minuto y se incuba durante 1 hora a 4ºC, viii) se añaden 50 microlitros de la suspensión de PBMCs (punto i), anteriormente) a cada pocillo, dando lugar a una proporción de efector:célula diana de 25:1 y las placas se introducen en un incubador bajo una atmósfera con 5% de CO2 a 37ºC durante 4 horas, ix) el sobrenadante libre de células de cada pocillo se recolecta y la radioactividad liberada experimentalmente (ER) se cuantifica utilizando un contador gamma, x) se calcula el porcentaje de lisis específica para cada concentración de anticuerpo según la fórmula (ER-MR)/(MR-SR) x 100, en la que ER es la radioactividad media cuantificada (ver el punto ix), anteriormente) para dicha concentración de anticuerpo, MR es la radioactividad media cuantificada (ver el punto ix), anteriormente) para los controles MR (ver el punto v), anteriormente), y SR es la radioactividad media cuantificada (ver el punto ix), anteriormente) para los controles SR (ver el punto vi), anteriormente).

4) la expresión "ADCC incrementada" se define como un incremento del porcentaje máximo de lisis específica observada dentro del intervalo de concentraciones de anticuerpo sometido a ensayo anteriormente, y/o una reducción de la concentración de anticuerpo necesaria para alcanzar la mitad del porcentaje máximo de lisis específica observado dentro del intervalo de concentraciones de anticuerpo sometidas a ensayo anteriormente. El incremento de la ADCC es relativo a la ADCC, que se ha medido utilizando el ensayo anteriormente indicado, mediada por el mismo anticuerpo, producido por el mismo tipo de células huésped, utilizando los mismos métodos estándares de producción, purificación, formulación y almacenamiento conocidos por el experto en la materia, pero que no ha sido producido por las células huésped manipuladas para sobreexpresar GnTIII.

En un aspecto, la presente exposición se refiere a moléculas de unión a antígeno que presentan la especificidad de unión del anticuerpo B-Ly1 murino, y al descubrimiento de que sus funciones efectoras pueden potenciarse

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mCi. Los criterios de obtención de imágenes para, por ejemplo, el marcaje de indio-111, típicamente son valores inferiores a aproximadamente 5 mCi.

Con respecto a los anticuerpos anti-CD20 marcados radioactivamente, la terapia con los mismos también puede

5 realizarse en un tratamiento terapéutico único o en tratamientos múltiples. Debido al componente radionucleido, resulta preferente que, antes del tratamiento, se "recolecten" células madre periféricas ("CMP") o de médula ósea ("MO") para los pacientes que experimenten toxicidad potencialmente letal de la médula ósea debida a la radiación. La MO y/o las CMP se recolectan utilizando técnicas estándares, y después se purgan y se congelan para la posible reinfusión. Además, resulta más preferente que antes del tratamiento se realice un estudio de dosimetría diagnóstica

10 utilizando un anticuerpo marcado diagnóstico (por ejemplo utilizando indio-111), un propósito del cual es garantizar que el anticuerpo terapéuticamente marcado (por ejemplo utilizando itrio-90) no resulte innecesariamente "concentrado" en cualquier órgano o tejido normal.

En una realización preferente, la presente exposición se refiere a un polinucleótido aislado que comprende una

15 secuencia que codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 3, posteriormente. La exposición se refiere además a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de nucleótidos mostrada en la Tabla 2, posteriormente. En otra realización, la exposición se refiere a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80%, 85%,

20 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos en la Tabla 3. La exposición comprende además un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que presental a secuencia de aminoácidos de cualquiera de los constructos en la Tabla 3 con sustituciones de aminoácidos conservadoras.

25 TABLA 2

CONSTRUCTO

SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS SEC ID nº

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TABLA 3

CONSTRUCTO

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Secuencia de señal de VL

MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC 78

En otra realización preferente, la presente exposición se refiere a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la fig. 1 ó en la fig. 2.

5 La exposición se refiere además a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en la fig. 5 o en la fig.

6. En otra realización, la exposición se refiere a un ácido nucleico aislado que comprende una secuenica que codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la fig. 5 o fig. 6. La exposición comprende además

10 un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que presenta cualquiera de las secuencias de aminoácidos fig. 1, fig. 2, fig. 5 o fig. 6 con sustituciones de aminoácidos conservadoras.

En otra realización, la presente exposición se refiere a un vector de expresión y/o a una célula huésped, que comprende uno o más polinucleótidos aislados indicados en la presente memoria.

15 Generalmente, puede utilizarse cualquier tipo de línea celular en cultivo para expresar la MUA de la presente invención. En una realización preferente, se utilizan células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, otras células de mamífero, células de levadura, células de insecto o células vegetales como la línea celular de fondo para

20 generar las células huésped manipuladas indicadas en la presente memoria.

La eficacia terapéutica de las MUA indicadas en la presente memoria puede potenciarse mediante la producción de las mismas en una célula huésped que expresa adicionalmente un polinucleótido codificante de un polipéptido que presenta actividad de GnTIII. En una realización preferente, el polipéptido que presenta actividad de GnTIII es un

25 polipéptido de fusión que comprende el dominio de localización en Golgi de un polipéptido residente en el Golgi. En

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incluyendo células de levadura transformadas con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen la secuencia codificante de una MUA de la presente invención, sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo baculovirus) que contienen la secuencia codificante de una MUA quimérica que presenta sustancialmente la misma especificidad de unión que el anticuerpo B-Ly1 murino; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo el virus del mosaico de la coliflor, VMCa; el virus del mosaico del tabaco, VMT) o transformados con vectores de expresión plásmidos recombinantes (por ejemplo el plásmido Ti) que contienen la secuencia codificante de la MUA de la invención; o sistemas de células animales infectados con vectores de expresión virus recombinante (por ejemplo adenovirus, virus vaccinia), incluyendo líneas celulares manipuladas para que contengan múltiples copias del AND codificante de una MUA quimérica que presenta sustancialmente la misma especificidad de unión que el anticuerpo B-Ly1 murino establemente amplificado (CHO/dhfr) o inestablemente amplificado en cromosomas dobles diminutos (por ejemplo líneas celulares murinas). En una realización, el vector que comprende el polinucleótido o polinucleótidos codificantes de la MUA de la invención es policistrónico. Además, en una realización la MUA comentada anteriormente es un anticuerpo o un fragmento del mismo. En una realización preferente la MUA es un anticuerpo humanizado.

Para los métodos de la presente exposición, se prefiere generalmente la expresión estable a la expresión transitoria debido a que típicamente consigue resultados más reproducibles y también permite más fácilmente la producción a gran escala. En lugar de utilizar vectores de expresión que contienen orígenes víricos de replicación, las células huésped pueden transformarse con los ácidos nucleicos codificantes respectivos controlados por los elementos de control de la expresión apropiados (por ejemplo promotor, intensificador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Tras la introducción del ADN foráneo, las células manipuladas pueden dejarse en cultivo durante 1 a 2 días en un medio enriquecido, y después pasarse a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante proporciona resistencia a la selección y permite la selección de células que han integrado establemente el plásmido en sus cromosomas y que crecen para formar focos que, a su vez, pueden clonarse y expandirse para formar líneas celulares.

Existen varios sistemas de selección que pueden utilizarse, incluyendo, aunque sin limitación, los genes de la timidina quinasa del virus herpes simplex (Wigler et al., Cell 11:223, 1977), de la hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026, 1962), y de la adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22:817, 1980), que pueden utilizarse en células tk-, hgprt-o aprt-, respectivamente. Además, puede utilizarse una resistencia antimetabolito como base de selección para los genes dhfr, que proporciona resistencia al metotrexato (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:3567, 1989; O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527, 1981), gpt, que proporciona resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072, 1981), neo, que proporciona resistencia al aminoglucósido G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1, 1981), e higro, que proporciona resistencia a la higromicina (Santerre et al., Gene 30:147, 1984). Recientemente, se han descrito genes seleccionables adicionales, por ejemplo trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano; hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047, 1988), el sistema de glutamina sintasa, y la ODC (ornitina descarboxilasa), que proporciona resistencia al inhibidor de la ornitina descarboxilasa, la 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, en: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, editor, 1987).

La presente exposición se refiere asimismo a un método para modificar el perfil de glucosilación de las MUA de la presente invención que son producidas por una célula huésped, que comprende expresar en dicha célula huésped un ácido nucleico codificante de una MUA de la invención y un ácido nucleico codificante de un polipéptido con actividad de GnTIII, o un vector que comprende dichos ácidos nucleicos. Preferentemente, el polipéptido modificado es IgG o un fragmento de la misma que comprende la región Fc. En una realización particularmente preferente, la MUA es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo.

Las MUA modificadas producidas por las células huésped de la invención muestran una afinidad de unión de receptor Fc incrementada y/o una función efectora incrementada como resultado de la modificación. En una realización particularmente preferente, la MUA es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo que contiene la región Fc. Preferentemente la afinidad de unión de receptor Fc incrementada es unión incrementada a un receptor activador Fcγ, tal como el receptor FcγRIIIa. La función efectora incrementada preferentemente es un incremento de uno o más de los siguientes: citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo incrementada, fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP) incrementada, secreción de citoquinas incrementada, incorporación incrementada de antígenos por parte de células presentadoras de antígeno mediada por complejo inmunológico, citotoxicidad celular mediada por Fc incrementada, unión incrementada a células NK, unión incrementada a macrófagos, unión incrementada a células polimorfonucleares (PMNs), unión incrementada a monocitos, entrecruzamiento incrementado de anticuerpos unidos a diana, señalización directa incrementada inductora de apoptosis, maduración de células dendríticas incrementada y cebado de células T incrementado.

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mediada por anticuerpos producidos por las células manipuladas con el ácido nucleico codificante de un polipéptido con actividad de GnTIII.

Identificación de transfectantes o transformantes que expresan la proteína que presenta un patrón de glucosilación modificado

Las células huésped que contienen la secuencia codificante de una MUA quimérica que presenta sustancialmente la misma especificidad de unión que el anticuerpo B-Ly1 murino y que expresan los producto génicos biológicamente activos pueden identificarse mediante por lo menos cuatro enfoques generales: (a) hibridación ADN-ADN o ADN-ARN, (b) presencia o ausencia de funciones génicas "marcadoras", (c) evaluación del nivel de transcripción según se mide a partir de la expresión de los transcritos de ARNm respectivos en la célula huésped, (d) detección del producto génico según medición mediante inmunoensayo o a partir de su actividad biológica.

En el primer enfoque, la presente de la secuencia codificante de una MUA quimérica que presenta sustancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpo Bly-1 murino y la secuencia codificante del polipéptido que presenta actividad de GnTIII pueden detectarse mediante hibridación ADN-ADN o ADN-ARN utilizando sondas que comprenden secuencias de nucleótidos que son homólogas a las secuencias codificantes respectivas, respectivamente, o partes o derivados de las mismas.

En el segundo enfoque, el vector de expresión recombinante/célula huésped puede identificarse y seleccionarse basándose en la presencia o ausencia de determinadas funciones génicas "marcadoras" por ejemplo actividad de timidina-quinasa, resistencia a antibióticos, resistencia al metotrexato, fenotipo de transformación, formación de cuerpo de oclusión en baculovirus, etc.). Por ejemplo, en el caso de que la secuencia codificante de la MUA de la invención, o de un fragmento de la misma, y la secuencia codificante del polipéptido que presenta actividad de GnTIII dentro de una secuencia de gen marcador del vector, puedan identificarse los recombinantes que contienen las secuencias codificantes respectivas a partir de la ausencia de la función del gen marcador. Alternativamente, puede introducirse un gen marcador en tándem con las secuencias codificantes bajo el control del mismo promotor o de uno diferente utilizado para controlar la expresión de las secuencias codificantes. La expresión del marcador en respuesta a la inducción o la selección indica la expresión de la secuencia codificante de la MUA de la invención y la secuencia codificante del polipéptido que presenta actividad de GnTIII.

En el tercer enfoque, puede evaluarse mediante ensayos de hibridación la actividad transcripcional de la región codificante de la MUA de la invención, o de un fragmento de la misma, y la secuencia codificante del polipéptido que presenta actividad de GnTIII. Por ejemplo, puede aislarse ARN y analizarse mediante transferencia northern utilizando una sonda homóloga a las secuencias codificantes de la MUA de la invención, o de un fragmento de la misma, y la secuencia codificante del polipéptido que presenta actividad de GnTIII o partes particulares de la misma. Alternativamente, pueden extraerse los ácidos nucleicos totales de la célula huésped y someterse a ensayo para la hibridación a dichas sondas.

En el cuarto enfoque, la expresión de los productos proteicos puede evaluarse inmunológicamente, por ejemplo mediante transferencias western, inmunoensayos tales como la radioinmunoprecipitación o inmunoensayos ligados a enzima. El ensayo definitivo del éxito del sistema de expresión, sin embargo, implica la detección de los productos génicos biológicamente activos.

Generación y utilización de MUA que presentan una función efectora incrementada, incluyendo la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos

En realizaciones preferentes, la presente invención proporciona glucoformas de MUA quiméricas que presentan sustancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpo B-Ly1 murino y que presentan una función efectora incrementada, incluyendo citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. La manipulación mediante glucosilación de anticuerpos ha sido descrita anteriormente (ver, por ejemplo, la patente US nº 6.602.684).

Algunos ensayos clínicos de anticuerpos monoclonales no conjugados (mAb) destinados al tratamiento de algunos tipos de cáncer recientemente han proporcionado resultados esperanzadores (Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25, 1997; Deo et al., Immunology Today 18:127, 1997). Se ha autorizado una IgG1 no conjugada quimérica para el linfoma no de Hodking de células B foliculares o de grado bajo (Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25, 1997), mientras que otro mAb no conjugado, una IgG1 humanizada que reconoce tumores de mama sólidos, también ha mostrado resultados prometedores en ensayos clínicos de fase III (Deo et al., Immunology Today 18:127, 1997). Los antígenos de estos dos mAbs se expresan a nivel elevado en sus células tumorales respectivas y los anticuerpos median en la potente destrucción tumoral por parte de células efectoras in vitro e in vivo. Por el contrario, muchos otros mAbs no conjugados con finas especificidades tumorales no pueden desencadenar funciones efectoras de suficiente potencia para resultar clínicamente útiles (Frost et al., Cancer 80:317-33, 1997; Surfus et al., J. Immunother. 19:184-91, 1996). Para algunos de estos mAbs más débiles,

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se observe el primer indicio, diagnóstico, aparición o incidencia de la enfermedad o trastorno, o durante remisiones de la enfermedad o trastorno.

La MUA indicada en la presente memoria se administra mediante cualquier medio, incluyendo las vías parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento inmunosupresor local, por vía intralesional. Entre las infusiones parenterales se incluyen las vías intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. Además, el antagonista puede administrarse convenientemente mediante infusión pulsada, por ejemplo con dosis decrecientes del antagonista. Preferentemente, la dosificación se proporciona mediante inyecciones, más preferentemente inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica.

Pueden administrarse otros compuestos, tales como agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, agentes inmunosupresores y/o citoquinas con los antagonistas en la presente memoria. La administración combinada incluye la coadministración utilizando formulaciones separadas o una única formulación farmacéutica, y la administración consecutiva en cualquier orden, en donde preferentemente transcurre un periodo de tiempo durante el que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas.

Resulta evidente que la dosis de la composición de la exposición necesaria para conseguir curaciones puede reducirse adicionalmente mediante la optimización de la programación.

Según la práctica de la exposición, el portador farmacéutico puede ser un portador lipídico. El portador lipídico puede ser un fosfolípido. Además, el portador lipídico puede ser un ácido graso. Además, el portador lipídico puede ser un detergente. Tal como se utiliza en la presente memoria, un detergente es cualquier sustancia que altera la tensión superficial de un líquido, generalmente reduciéndola.

En un ejemplo de la exposición, el detergente puede ser un detergente no iónico. Entre los ejemplos de detergentes no iónicos se incluyen, aunque sin limitación, polisorbato 80 (también conocido como Tween 80 o monooleato de polioxietilensorbitán), Brij y Triton (por ejemplo Triton WR-1339 y Triton A-20).

Alternativamente, el detergente puede ser un detergente iónico. Un ejemplo de un detergente iónico puede ser, aunque sin limitación, bromuro de alquiltrimetilamonio.

Además, según la exposición, el portador lipídico puede ser un liposoma. Tal como se utiliza en la presente solicitud, un "liposoma" es cualquier vesícula unida a membrana que contiene cualquier molécula de la invención o combinaciones de las mismas.

En las realizaciones siguientes, se mencionan aspectos específicos que resultan preferentes:

Ítem 1: polinucleótido aislado que comprende:

a.

una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 5, SEC ID nº 6 y SEC ID nº 7, y

b.

una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 21, SEC ID nº 22 y SEC ID nº 23, y

c. la secuencia SEC ID nº 24. Ítem 2: polinucleótido aislado que comprende las secuencias SEC ID nº 8, SEC ID nº 9 y SEC ID nº 10. Ítem 3: polinucleótido aislado según el ítem 1 ó 2, que codifica un polipéptido de fusión.Ítem 4: polinucleótido aislado que comprende la secuencia SEC ID nº 3.Ítem 5: polinucleótido aislado que comprende la secuencia SEC ID nº 4.Ítem 6: polinucleótido aislado según el ítem 4 ó 5, en el que dicho polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión. Ítem 7: polinucleótido aislado que comprende una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 80% con la secuencia SEC ID nº 3, en donde dicho polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.Ítem 8: polinucleótido aislado que comprende una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 80% con la secuencia SEC ID nº 4, en donde dicho polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.Ítem 9: polinucleótido aislado que comprende:

a.

una secuencia codificante de un polipéptido que presenta la secuencia SEC ID nº 1, y

b.

una secuencia codificante de un polipéptido que presenta la secuencia de una región Fc de anticuerpo, o

un fragmento del mismo, de una especie que no es el ratón.Ítem 10: polinucleótido aislado que comprende:

a.

una secuencia codificante de un polipéptido que presenta la secuencia SEC ID nº 2, y

b.

una secuencia codificante de un polipéptido que presenta la secuencia de una región Fc de anticuerpo, o

un fragmento del mismo, de una especie que no es el ratón.Ítem 11: polinucleótido aislado codificante de un polipéptido que presenta la secuencia SEC ID nº 1.

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ID nº 47, SEC ID nº 49, SEC ID nº 51, SEC ID nº 53, SEC ID nº 55, SEC ID nº 57, SEC ID nº 59, SEC ID nº 61, SEC ID nº 63, SEC ID nº 65, SEC ID nº 67, SEC ID nº 69 y SEC ID nº 71.Ítem 158: polinucleótido aislado que comprende una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 85% respecto a la secuencia SEC ID nº 75.Ítem 159: polinucleótido aislado que comprende una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 90% respecto a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 29, SEC ID nº 31, SEC ID nº 33, SEC ID nº 35, SEC ID nº 37, SEC ID nº 39, SEC ID nº 41, SEC ID nº 43, SEC ID nº 45, SEC ID nº 47, SEC ID nº 49, SEC ID nº 51, SEC ID nº 53, SEC ID nº 55, SEC ID nº 57, SEC ID nº 59, SEC ID nº 61, SEC ID nº 63, SEC ID nº 65, SEC ID nº 67, SEC ID nº 69 y SEC ID nº 71.Ítem 160: polinucleótido aislado que comprende una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 90% respecto a la secuencia SEC ID nº 75.Ítem 161: polinucleótido aislado que comprende una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 95% respecto a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 29, SEC ID nº 31, SEC ID nº 33, SEC ID nº 35, SEC ID nº 37, SEC ID nº 39, SEC ID nº 41, SEC ID nº 43, SEC ID nº 45, SEC ID nº 47, SEC ID nº 49, SEC ID nº 51, SEC ID nº 53, SEC ID nº 55, SEC ID nº 57, SEC ID nº 59, SEC ID nº 61, SEC ID nº 63, SEC ID nº 65, SEC ID nº 67, SEC ID nº 69 y SEC ID nº 71.Ítem 162: polinucleótido aislado que comprende una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 95% respecto a la secuencia SEC ID nº 75.Ítem 163: polinucleótido aislado que comprende una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 99% respecto a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 29, SEC ID nº 31, SEC ID nº 33, SEC ID nº 35, SEC ID nº 37, SEC ID nº 39, SEC ID nº 41, SEC ID nº 43, SEC ID nº 45, SEC ID nº 47, SEC ID nº 49, SEC ID nº 51, SEC ID nº 53, SEC ID nº 55, SEC ID nº 57, SEC ID nº 59, SEC ID nº 61, SEC ID nº 63, SEC ID nº 65, SEC ID nº 67, SEC ID nº 69 y SEC ID nº 71.Ítem 164: polinucleótido aislado que comprende una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 99% respecto a la secuencia SEC ID nº 75.Ítem 165: polinucleótido aislado que comprende:

a) una secuencia codificante de un polipéptido que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 30, SEC ID nº 32, SEC ID nº 34, SEC ID nº 36, SEC ID nº 38, SEC ID nº 40, SEC ID nº 42, SEC ID nº 44, SEC ID nº 46, SEC ID nº 48, SEC ID nº 50, SEC ID nº 52, SEC ID nº 54, SEC ID nº 56, SEC ID nº 58, SEC ID nº 60, SEC ID nº 62, SEC ID nº 64, SEC ID nº 66, SEC ID nº 68, SEC ID nº 70 y SEC ID nº 72, y b) una secuencia codificante de un polipéptido que presenta la secuencia de una región Fc de anticuerpo, o un fragmento del mismo, de una especie que no es el ratón.

Ítem 166: polinucleótido aislado que comprende: a) una secuencia codificante de un polipéptido que presenta la secuencia SEC ID nº 76, y b) una secuencia codificante de un polipéptido que presenta la secuencia de una región Fc de anticuerpo, o un fragmento de la misma, de una especie que no es el ratón.

Ítem 167: polinucleótido aislado codificante de un polipéptido que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 30, SEC ID nº 32, SEC ID nº 34, SEC ID nº 36, SEC ID nº 38, SEC ID nº 40, SEC ID nº 42, SEC ID nº 44, SEC ID nº 46, SEC ID nº 48, SEC ID nº 50, SEC ID nº 52, SEC ID nº 54, SEC ID nº 56, SEC ID nº 58, SEC ID nº 60, SEC ID nº 62, SEC ID nº 64, SEC ID nº 66, SEC ID nº 68, SEC ID nº 70 y SEC ID nº 72.Ítem 168: polinucleótido aislado codificante de un polipéptido que presenta la secuencia SEC ID nº 76.Ítem 169: polinucleótido aislado codificante de un polipéptido que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 30, SEC ID nº 32, SEC ID nº 34, SEC ID nº 36, SEC ID nº 38, SEC ID nº 40, SEC ID nº 42, SEC ID nº 44, SEC ID nº 46, SEC ID nº 48, SEC ID nº 50, SEC ID nº 52, SEC ID nº 54, SEC ID nº 56, SEC ID nº 58, SEC ID nº 60, SEC ID nº 62, SEC ID nº 64, SEC ID nº 66, SEC ID nº 68, SEC ID nº 70 y SEC ID nº 72.Ítem 170: polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que presenta la secuencia SEC ID nº 76. Ítem 171: vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado según cualquiera de los ítems 148 a 170.Ítem 172: vector según el ítem 171, en donde dicho vector es policistrónico.Ítem 173: célula huésped que comprende el vector de expresión según el ítem 171.Ítem 174: célula huésped que comprende un polinucleótido aislado según cualquiera de los ítems 148 a 170.Ítem 175: polipéptido humanizado que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 30, SEC ID nº 32, SEC ID nº 34, SEC ID nº 36, SEC ID nº 38, SEC ID nº 40, SEC ID nº 42, SEC ID nº 44, SEC ID nº 46, SEC ID nº 48, SEC ID nº 50, SEC ID nº 52, SEC ID nº 54, SEC ID nº 56, SEC ID nº 58, SEC ID nº 60, SEC ID nº 62, SEC ID nº 64, SEC ID nº 66, SEC ID nº 68, SEC ID nº 70 y SEC ID nº 72, o una variante de las mismas. Ítem 176: polipéptido humanizado que comprende la secuencia SEC ID nº 76 o una variante de la misma. Ítem 177: polinucleótido aislado codificante de un polipéptido que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 30, SEC ID nº 32, SEC ID nº 34, SEC ID nº 36, SEC ID nº 38, SEC ID nº 40, SEC ID nº 42, SEC ID nº 44, SEC ID nº 46, SEC ID nº 48, SEC ID nº 50, SEC ID nº 52, SEC ID nº

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