ES2542070T3 - Células posparto derivadas de tejido del cordón umbilical y métodos de preparación y uso de las mismas para la reparación y regeneración de tejido blando - Google Patents

Abstract

Una población homogénea aislada de células derivadas de tejido del cordón umbilical humano, para su uso en inducir angiogénesis, en la que dicha población de células es obtenible por digestión enzimática de tejido del cordón umbilical humano libre de sangre con una metaloproteasa de matriz, proteasa neutra y enzima mucolítica, y en la que dicha población de células es capaz de auto-renovación y expansión en cultivo, tiene el potencial de diferenciarse en células de otros fenotipos, y en la que la población de células: a) produce cada uno de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, HLA-A, B, C y PDGFr-alfa, como se detecta por citometría de flujo; y b) no produce ninguno de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DR,DP,DQ, como se detecta por citometría de flujo.

Description

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diferenciación, es decir, se produce a partir de un citoblasto y es el producto intermedio en la producción de un tipo de células maduras o subconjunto de tipos de células. Este tipo de célula progenitora generalmente no es capaz de auto-renovarse. Por consiguiente, si este tipo de célula se cita en el presente documento, se denominará una célula progenitora no de auto-renovación o un progenitor intermedio o célula precursora.

Como se usa en el presente documento, la expresión se diferencia en un linaje mesodérmico, ectodérmico o endodérmico se refiere a una célula que se compromete a un linaje mesodérmico, ectodérmico o endodérmico específico, respectivamente. Ejemplos de células que se diferencian en un linaje mesodérmico o dan lugar a células mesodérmicas específicas incluyen, pero no se limitan a, células que son adipogénicas, condrogénicas, cardiogénicas, dermatogénicas, hematopoyéticas, endoteliales, miogénicas, nefrogénicas, urogenitogénicas, osteogénicas, pericardiogénicas, o del estroma. Ejemplos de células que se diferencian en linaje ectodérmico incluyen, pero no se limitan a, células epiteliales, células neurogénicas y células neurogliagénicas. Ejemplos de células que se diferencian en linaje endodérmico incluyen, pero no se limitan a, células pleurigénicas y hepatogénicas, células que dan lugar al revestimiento del intestino, y células que dan lugar a células pancreogénicas y viscerogénicas.

Los subconjuntos de células derivadas del posparto o células posparto (PPDC) se denominan células derivadas de la placenta (PDC) de la divulgación o células derivadas de tejido del cordón umbilical (UDC) de la invención. Las PPDC de la invención son células derivadas de tejido del cordón umbilical. Además, las células pueden describirse como que son células madre o progenitoras, siendo el último término usado en el sentido amplio. El término derivadas se usa para indicar que las células han sido obtenidas de su fuente biológica y cultivadas o manipuladas de otro modo in vitro (por ejemplo, cultivadas en un medio de crecimiento para expandir la población y/o para producir una línea celular). Las manipulaciones in vitro de células derivadas del posparto y las características únicas de las células derivadas del posparto de la presente invención se describen en detalle más adelante.

Se usan diversos términos para describir células en cultivo. Cultivo celular se refiere generalmente a células tomadas de un organismo vivo y cultivadas bajo condición controlada (“en cultivo”). Un cultivo celular primario es un cultivo de células, tejidos u órganos tomado directamente de organismos y antes del primer subcultivo. Las células se expanden en cultivo cuando se ponen en un medio de crecimiento en condiciones que facilitan el crecimiento y/o división celular, produciendo una mayor población de las células. Cuando las células se expanden en cultivo, la tasa de proliferación celular se mide algunas veces por la cantidad de tiempo necesario para que las células se dupliquen en número. Esto se denomina tiempo de duplicación.

Una línea celular es una población de células formadas por uno o más subcultivos de un cultivo celular primario. Cada ronda de subcultivo se denomina un pase. Cuando las células se subcultivan, se denomina que se han sometido a pases. Una población específica de células, o una línea celular, se denomina algunas veces o caracteriza por el número de veces que se ha sometido a pases. Por ejemplo, una población de células cultivadas que se ha sometido a diez pases puede denominarse un cultivo P10. El cultivo primario, es decir, el primer cultivo tras el aislamiento de las células del tejido, se designa P0. Tras el primer subcultivo, las células se describen como un cultivo secundario (P1 o pase 1). Después del segundo subcultivo, las células se convierten en un cultivo terciario (P2 o pase 2), etc. Se entenderá por aquellos expertos en la materia que puede haber muchos duplicaciones de la población durante el periodo de pases; por tanto, el número de duplicaciones de la población de un cultivo es mayor que el número de pases. La expansión de células (es decir, el número de duplicaciones de la población) durante el periodo entre pases depende de muchos factores, que incluyen, pero no se limitan a, la densidad de siembra, sustrato, medio y tiempo entre pases.

Un medio acondicionado es un medio en el que se ha cultivado una célula específica o población de células, y luego se retira. Mientras que las células se cultivan en el medio, secretan factores celulares que pueden proporcionar soporte trófico a otras células. Tales factores tróficos incluyen, pero no se limitan a, hormonas, citocinas, matriz extracelular (ECM), proteínas, vesículas, anticuerpos y gránulos. El medio que contiene los factores celulares es el medio acondicionado.

Generalmente, un factor trófico se define como una sustancia que promueve la supervivencia, crecimiento, proliferación, maduración, diferenciación y/o mantenimiento de una célula, o estimula la elevada actividad de una célula. El soporte trófico se usa en el presente documento para referirse a la capacidad para promover la supervivencia, crecimiento, proliferación, maduración, diferenciación y/o mantenimiento de una célula, o para estimular la elevada actividad de una célula.

Cuando se refiere a células de vertebrado cultivadas, el término senescencia (también senescencia replicativa o senescencia celular) se refiere a una propiedad atribuible a cultivos celulares finitos; concretamente, su incapacidad para crecer más allá de un número finito de duplicaciones de la población (algunas veces denominado límite de Hayflick). Aunque la senescencia celular se describió por primera vez usando células de tipo fibroblasto, la mayoría de los tipos de células humanas normales que pueden cultivarse satisfactoriamente en cultivo experimentan senescencia celular. La vida in vitro de diferentes tipos de células varía, pero la máxima vida normalmente es inferior a 100 duplicaciones de la población (esto es el número de duplicaciones para que todas las células en el cultivo se vuelvan senescentes y así hagan que el cultivo sea incapaz de dividirse). La senescencia no depende del tiempo

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HGF para factor de crecimiento de hepatocitos; hMSC para citoblastos mesenquimatosos humanos; HNF-I alfa para factor de transcripción específico de hepatocitos; HUVEC para células endoteliales de la vena umbilical humanas; I309 para una quimiocina y el ligando para el receptor CCR8 y es responsable de la quimioatracción de linfocitos T tipo TH2; IGF para factor de crecimiento similar a la insulina; IL-6 para interleucina-6; IL-8 para interleucina 8; K19 para queratina 19; K8 para queratina 8; KGF para factor de crecimiento de queratinocitos; MCP-1 para proteína 1 quimiotáctica de monocitos; MDC para quimiocina derivada de macrófagos; MIP1alfa para proteína 1 alfa inflamatoria de macrófagos; MIP1beta para proteína 1 beta inflamatoria de macrófagos; MMP para metaloproteasa de matriz (MMP); MSC para citoblastos mesenquimatosos; NHDF para fibroblastos dérmicos humanos normales; NPE para medios de expansión de progenitores neurales; OxLDLR para receptor de lipoproteínas de baja densidad oxidadas; PBMC para célula mononuclear de sangre periférica; PBS para solución salina tamponada con fosfato; PDC para célula derivada de la placenta; PDGFbb para factor de crecimiento derivado de plaquetas; PDGFr-alfa para receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas; PD-L2 para ligando 2 de muerte programada; PE para ficoeritrina; PO para “per os” (por la boca); PPDC para célula derivada del posparto; Rantes (o RANTES) para expresada y secretada por linfocitos T normales regulados tras la activación; rb para conejo; rh para humano recombinante; SC para subcutáneamente; SCID para inmunodeficiencia combinada grave; SDF-1alfa para factor 1 alfa derivado del estroma; SHH para erizo sónico; SMA para actina de músculo liso; SOP para procedimiento de operación estándar; TARC para quimiocina del timo y regulada por la activación; TCP para plástico de cultivo de tejido; TGFbeta2 para factor de crecimiento transformante beta2; TGFbeta-3 para factor de crecimiento transformante beta-3; TIMP1 para tejido inhibidor de la metaloproteinasa de matriz 1; TPO para trombopoyetina; TuJ1 para tubulina BIII; UDC para célula derivada del cordón umbilical; VEGF para factor de crecimiento endotelial vascular; vWF para factor de von Willebrand; y alfaFP para alfa-fetoproteína.

Descripción

En un aspecto, la invención proporciona células derivadas del posparto (PPDC) derivadas de tejido posparto libre de sangre para su uso como se cita en las reivindicaciones. Las PPDC de la divulgación pueden derivarse de placenta de un mamífero que incluye, pero no se limitan a, ser humano. Las células son capaces de auto-renovación y expansión en cultivo. Las células derivadas del posparto tienen el potencial de diferenciarse en células de otros fenotipos. La invención proporciona células que se derivan de tejido del cordón umbilical, a diferencia de sangre del cordón umbilical. La divulgación proporciona, en uno de sus varios aspectos, células que se derivan de tejido placentario.

Las células se han caracterizado en cuanto a varias de sus propiedades celulares, genéticas, inmunológicas y bioquímicas. Por ejemplo, las células se han caracterizado por su crecimiento por sus marcadores de la superficie celular, por su expresión génica, por su capacidad para producir ciertos factores tróficos bioquímicos y por sus propiedades inmunológicas.

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Caracterización de PPDC

Las PPDC pueden caracterizarse, por ejemplo, por las características de crecimiento (por ejemplo, capacidad de duplicación de la población, tiempo de duplicación, pases hasta la senescencia), análisis del cariotipo (por ejemplo, cariotipo normal; linaje materno o neonatal), citometría de flujo (por ejemplo, análisis de FACS), inmunohistoquímica y/o inmunocitoquímica (por ejemplo, para la detección de epítopes que incluyen, pero no se limitan a, vimentina, desmina, alfa-actina de músculo liso, citoqueratina 18, factor de von Willebrand, CD34, GROalfa, GCP-2, receptor 1 de lipoproteínas de baja densidad oxidadas y NOGO-A), pauta de expresión génica (por ejemplo, matrices GeneChip; reacción en cadena de la polimerasa (por ejemplo, PCR con transcriptasa inversa, PCR en tiempo real y PCR convencional)), matrices de proteínas, secreción de proteínas (por ejemplo, por ensayo de coagulación del plasma o análisis de medio acondicionado con PPDC, por ejemplo, por enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA)), análisis de anticuerpos (por ejemplo, ELISA; tinción de anticuerpos para marcadores de la superficie celular que incluyen, pero no se limitan a, CD10, CD13, CD31, CD34, CD44, CD45, CD73, CD80, CD86, CD90, CD117, CD141, CD178, receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFr-alfa), antígenos de clase I de HLA (HLA-A, HLA-B, HLA-C), antígenos de clase II de HLA (HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR), B7-H2 y PD-L2), reacción de linfocitos mixtos (por ejemplo, como medida de la estimulación de PBMC alógenas), y/u otros métodos conocidos en la técnica.

Las PPDC pueden someterse a al menos 40 duplicaciones de la población en cultivo. La duplicación de poblaciones puede calcularse como [In (célula final/célula inicial)/ln 2]. El tiempo de duplicación puede calcularse como (tiempo en cultivo (h)/ duplicación de la población).

Las PPDC indiferenciadas se producen preferentemente a partir de al menos uno de NOGO-A, GCP-2, factor de tejido, vimentina y alfa-actina de músculo liso; se prefieren más las células que producen cada uno de GCP-2, factor de tejido, vimentina y alfa-actina de músculo liso. En algunas realizaciones, dos, tres, cuatro o cinco de estos factores se producen por las PPDC.

En algunas realizaciones, las PPDC carecen de producción de al menos uno de NOGO-A, GRO-alfa, o receptor de lipoproteínas de baja densidad oxidadas, como se detecta por citometría de flujo. En algunas realizaciones, las PPDC carecen de producción de al menos dos o tres de estos factores.

Las PPDC de la divulgación pueden comprender al menos un marcador de la superficie celular de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 y HLA-A, B, C. Las PPDC producen preferentemente cada uno de estos marcadores de superficie. Las PPDC de la divulgación pueden caracterizarse por su falta de producción de al menos uno de CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G y HLA-DR,DP,DQ, como se detecta por citometría de flujo. Las PPDC carecen preferentemente de la producción de cada uno de estos marcadores de superficie. En algunas realizaciones, las PPDC presentan expresión, que con respecto a una célula humana que es un fibroblasto, un citoblasto mesenquimatoso, o una célula de la médula ósea de las crestas ilíacas, es elevada para al menos uno de interleucina 8; reticulon 1; ligando 1 de quimiocinas (motivo C-X-C) (actividad estimulante del crecimiento de melanoma, alfa); ligando 6 de quimiocinas (motivo C-X-C) (proteína 2 quimiotáctica de granulocitos); ligando 3 de quimiocinas (motivo C-X-C); y proteína 3 inducida por el factor de necrosis tumoral alfa; o al menos uno del miembro A2 de la superfamilia de lectina tipo C, tumor 1 de Wilms, miembro A2 de la familia de la aldehído deshidrogenasa 1, renina, receptor 1 de lipoproteínas de baja densidad oxidadas, proteína cinasa C zeta, clon IMAGEN:4179671, proteína hipotética DKFZp564F013, regulada por disminución en cáncer de ovario 1 y el clon DKFZp547K1113. PPDC preferidas expresan, con respecto a una célula humana que es un fibroblasto, un citoblasto mesenquimatoso, o una célula de la médula ósea de las crestas ilíacas, elevados niveles de interleucina 8; reticulon 1; ligando 1 de quimiocinas (motivo C-X-C) (actividad estimulante del crecimiento de melanoma, alfa); ligando 6 de quimiocinas (motivo C-X-C) (proteína 2 quimiotáctica de granulocitos); ligando 3 de quimiocinas (motivo C-X-C); y proteína 3 inducida por el factor de necrosis tumoral alfa; o elevados niveles del miembro A2 de la superfamilia de lectina tipo C, tumor 1 de Wilms, miembro A2 de la familia de la aldehído deshidrogenasa 1, renina, receptor 1 de lipoproteínas de baja densidad oxidadas, proteína cinasa C zeta, clon IMAGEN:4179671, proteína hipotética DKFZp564F013, regulada por disminución en cáncer de ovario 1 y el clon DKFZp547K1113. En PPDC en las que la expresión, con respecto a una célula humana que es un fibroblasto, un citoblasto mesenquimatoso, o una célula de la médula ósea de las crestas ilíacas, es elevada para al menos uno de interleucina 8; reticulon 1; ligando 1 de quimiocinas (motivo C-X-C) (actividad estimulante del crecimiento de melanoma, alfa); ligando 6 de quimiocinas (motivo C-X-C) (proteína 2 quimiotáctica de granulocitos); ligando 3 de quimiocinas (motivo C-X-C); y proteína 3 inducida por el factor de necrosis tumoral alfa, preferentemente no están presentes elevados niveles relativos de al menos uno del miembro A2 de la superfamilia de lectina tipo C, tumor 1 de Wilms, miembro A2 de la familia de la aldehído deshidrogenasa 1, renina, receptor 1 de lipoproteínas de baja densidad oxidadas, proteína cinasa C zeta, clon IMAGEN:4179671, proteína hipotética DKFZp564F013, regulada por disminución en cáncer de ovario 1 y el clon DKFZp547K1113. En PPDC en las que la expresión, con respecto a una célula humana que es un fibroblasto, un citoblasto mesenquimatoso, o una célula de la médula ósea de las crestas ilíacas, es elevada para al menos uno del miembro A2 de la superfamilia de lectina tipo C, tumor 1 de Wilms, miembro A2 de la familia de la aldehído deshidrogenasa 1, renina, receptor 1 de lipoproteínas de baja densidad oxidadas, proteína cinasa C zeta, clon IMAGEN:4179671, proteína hipotética DKFZp564F013, regulada por disminución en cáncer de ovario 1 y el clon DKFZp547K1113, preferentemente no están presentes elevados niveles relativos de al menos uno de interleucina 8;

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nasal, epitelio de las vías respiratorias, epitelio vaginal, epitelio corneal), células de la médula ósea, adipocitos, queratinocitos, células endoteliales vasculares (por ejemplo, células endoteliales aórticas, células endoteliales de la arteria coronaria, células endoteliales de la arteria pulmonar, células endoteliales de la arteria ilíaca, células endoteliales microvasculares, células endoteliales de la arteria umbilical, células endoteliales de la vena umbilical y progenitores endoteliales (por ejemplo, células CD34+, CD34+/CD117+)), mioblastos, miocitos, células del estroma y otras células de tejido blando, y mezclas de las mismas. Para el co-cultivo, puede ser deseable que las PPDC y las otras células deseadas se co-cultiven en condiciones en las que los dos tipos de células estén en contacto. Esto puede lograrse, por ejemplo, sembrando las células como una población de células heterogéneas en medio de cultivo o sobre un sustrato de cultivo adecuado. Alternativamente, las PPDC pueden cultivarse primero hasta confluencia y emplearse como sustrato para el segundo tipo de células deseadas en cultivo. En esta última realización, las células pueden separarse adicionalmente físicamente, por ejemplo, por una membrana o dispositivo similar, de forma que el otro tipo de célula pueda eliminarse y usarse por separado tras el periodo de co-cultivo. En otras realizaciones, las otras células deseadas se cultivan en contacto con el medio acondicionado, matriz extracelular y/o lisado celular de las PPDC. El uso de las PPDC en co-cultivo para promover la expansión y diferenciación de otros tipos de células puede encontrar aplicabilidad en investigación y en áreas clínicas/terapéuticas. Por ejemplo, la divulgación contempla que el co-cultivo de PPDC pueda utilizarse para facilitar el crecimiento y la diferenciación de células de un fenotipo dado en cultivo, por ejemplo, células de un fenotipo de tejido blando, para, por ejemplo, fines de investigación básica o para su uso en ensayos de cribado de fármacos. También puede utilizarse co-cultivo de PPDC para la expansión ex vivo de células de un fenotipo de tejido blando para la posterior administración para fines terapéuticos. Por ejemplo, pueden recogerse células de un individuo, expandirse ex vivo en co-cultivo con las PPDC, luego devolverse a ese individuo (transferencia autóloga) u otro individuo (transferencia singénica o alógena). En estas realizaciones, se apreciará que, tras la expansión ex vivo, la población de células que comprende las PPDC podría administrarse a un paciente en necesidad de tratamiento, por ejemplo, de una afección de tejido blando como se describe en el presente documento. Alternativamente, en situaciones en las que la transferencia autóloga es apropiada o deseable, las poblaciones de células co-cultivadas pueden separarse físicamente en cultivo, permitiendo la eliminación de las células autólogas para administración al paciente.

En algunas realizaciones, las PPDC inducen la angiogénesis en co-cultivo con células tales como, pero no se limitan a, células epiteliales (por ejemplo, células de la mucosa bucal, tubo gastrointestinal, epitelio nasal, epitelio de las vías respiratorias, epitelio vaginal, epitelio corneal), células de la médula ósea, adipocitos, queratinocitos, células endoteliales vasculares (por ejemplo, células endoteliales aórticas, células endoteliales de la arteria coronaria, células endoteliales de la arteria pulmonar, células endoteliales de la arteria ilíaca, células endoteliales microvasculares, células endoteliales de la arteria umbilical, células endoteliales de la vena umbilical y progenitores endoteliales (por ejemplo, células CD34+, CD34+/CD117+)), mioblastos, miocitos, células del estroma y otras células de tejido blando. Por ejemplo, factores angiogénicos, que incluyen pero no se limitan a, EPO, TIMP1, ANG2, PDGF-bb, TPO, KGF, HGF, FGF, VEGF y HBEGF, son liberados por las PPDC. Los métodos de inducción de la angiogénesis exponiendo una célula de tejido blando a una PPDC o producto de PPDC pueden realizarse in vitro o in vivo. Ejemplos de células de tejido blando que forman redes endoteliales según los métodos de la invención incluyen células endoteliales aórticas, células endoteliales de la arteria coronaria, células endoteliales de la arteria pulmonar, células endoteliales de la arteria ilíaca, células endoteliales microvasculares, células endoteliales de la arteria umbilical, células endoteliales de la vena umbilical y progenitores endoteliales (por ejemplo, células CD34+, CD34+/CD117+). Si el método se realiza in vivo, las PPDC o productos de PPDC o composiciones pueden administrarse a un paciente como se describe en el presente documento. Por ejemplo, una población de PPDC o composición puede administrarse a un paciente para proporcionar factores angiogénicos necesarios.

Las poblaciones de PPDC o composiciones de la invención, o el medio acondicionado, lisado celular o matriz extracelular de la divulgación, pueden usarse para producir una red vascular, como se demuestra en el Ejemplo 14. Los métodos de producción de una red vascular implican exponer una población de células de tejido blando a una población de células PPDC, lisado celular, matriz extracelular o medio acondicionado. La población de células de tejido blando contiene preferentemente al menos una célula de tejido blando de una célula endotelial aórtica, célula endotelial de la arteria coronaria, célula endotelial de la arteria pulmonar, célula endotelial de la arteria ilíaca, célula endotelial microvascular, célula endotelial de la arteria umbilical y célula endotelial de la vena umbilical. La invención proporciona las células de la invención para su uso en producir una red vascular in vivo. La divulgación también describe un método de producción de una red vascular que puede realizarse in vitro. Las redes vasculares así producidas pueden administrarse a un paciente como pauta terapéutica. En algunas realizaciones preferidas, las redes vasculares se administran como tratamiento de una afección de tejido blando, por ejemplo, pero no a modo de limitación, una afección vascular, tal como una enfermedad vascular o lesión o desarrollo vascular inapropiado. En algunos aspectos de la invención, la red vascular se administra por trasplante al paciente. En realizaciones preferidas, la vasculatura dañada o enferma se elimina antes del trasplante de la red vascular de la invención.

Medio acondicionado de PPDC

Otra realización de la divulgación caracteriza el uso de las PPDC para la producción de medio acondicionado, tanto a partir de PPDC indiferenciadas como de PPDC incubadas en condiciones que estimulan la diferenciación en un linaje dado. Tales medios acondicionados se contemplan para su uso en el cultivo de células in vitro o ex vivo, por

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Tabla 6-1. Resultados del cariotipo de las PPDC.

Tejido

Pasaje Conteo de Células Metafase Análisis de Células Metafase No. de cariotipos ISCN cariotipo

Placenta

22 20 5 2 46,XX

Umbilical

23 20 5 2 46,XX

Umbilical

6 20 5 2 46,XY

Placenta

2 20 5 2 46,XX

Umbilical

3 20 5 2 46,XX

Placenta-N

0 20 5 2 46,XY

Placenta-V

0 20 5 2 46,XY

Placenta-M

0 21 5 4 46,XY[18]/46,XX[3]

Placenta-M

4 20 5 2 46,XX

Placenta-N

9 25 5 4 46,XY[5]/46,XX[20]

Placenta-N C1

1 20 5 2 46,XY

Placenta-N C3

1 20 6 4 46,XY[2]/46,XX[18]

Placenta-N C4

1 20 5 2 46,XY

Placenta-N C15

1 20 5 2 46,XY

Placenta-N C20

1 20 5 2 46,XY

Placenta-N C22

1 20 5 2 46,XY

Clave: N-cara neonatal; V-región vellosidades: M-cara materna; C-Clon

30 Resumen. El análisis de cromosomas identifica PPDC derivadas de la placenta y del cordón umbilical cuyos cariotipos parecen normales como se interpreta por un laboratorio citogenético clínico. El análisis del cariotipo también identifica líneas celulares libres de células maternas, como se ha determinado por cariotipo homogéneo.

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Evaluación de marcadores de la superficie celular derivados del posparto humanos por citometría de flujo

Puede usarse la caracterización de proteínas de la superficie celular o “marcadores” por citometría de flujo para determinar la identidad de una línea celular. La coherencia de la expresión puede determinarse a partir de múltiples

40 donantes, y en células expuestas a diferentes condiciones de procesamiento y de cultivo. Se caracterizaron líneas celulares derivadas del posparto aisladas de la placenta y cordón umbilical por citometría de flujo, proporcionando así un perfil para la identificación de las células de la invención.

Material y métodos

45 Medios. Las células se cultivaron en medio de crecimiento de DMEM-baja glucosa (Gibco Carlsbad, CA), con 15 % (v/v) de suero bovino fetal (FBS); (Hyclone, Logan, UT), 0,001 % (v/v) de beta-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO) y 50 unidades/mililitro de penicilina, 50 microgramos/mililitro de estreptomicina (Gibco, Carlsbad, CA).

50 Recipientes de cultivo. Las células se cultivaron en matraces de cultivo de tejido T75, T150 y T225 tratados con plasma (Corning, Corning, NY) hasta que confluyeron. Las superficies de crecimiento de los matraces se recubrieron con gelatina incubando con 2 % (peso/volumen) de gelatina (Sigma, St. Louis, MO) durante 20 minutos a temperatura ambiente.

55 Tinción con anticuerpo. Las células adherentes en matraces se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS); (Gibco, Carlsbad, CA) y se desprendieron con tripsina/EDTA (Gibco, Carlsbad, CA). Las células se recogieron, se centrifugaron y se resuspendieron en 3 % (v/v) de FBS en PBS a una concentración de células de 1x107 por mililitro. Según las especificaciones del fabricante, el anticuerpo para el marcador de la superficie celular de interés (Tabla 7-1) se añadió a cien microlitros de suspensión de células y la mezcla se incubó en la oscuridad

60 durante 30 minutos a 4 ºC. Después de la incubación, las células se lavaron con PBS y se centrifugaron para eliminar el anticuerpo sin unir. Las células se resuspendieron en 500 microlitros de PBS y se analizaron por citometría de flujo.

Análisis de citometría de flujo. El análisis de citometría de flujo se realizó con un instrumento FACScalibur (Becton 65 Dickinson, San Jose, CA).

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Anticuerpos para marcadores de la superficie celular. Se usaron los siguientes anticuerpos para los marcadores de la superficie celular.

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Comparación de células derivadas de la placenta y del cordón umbilical. Se compararon células derivadas de la placenta con células derivadas del cordón umbilical en el pase 8.

Comparación pase a pase. Se analizaron las células de la placenta y del cordón umbilical en los pases 8, 15 y 20.

Comparación donante a donante. Para comparar diferencias entre donantes, las células derivadas de la placenta de diferentes donantes se compararon entre sí, y las células derivadas del cordón umbilical de diferentes donantes

45 se compararon entre sí.

Comparación del recubrimiento superficial. Células derivadas de la placenta cultivadas sobre matraces recubiertos de gelatina se compararon con células derivadas de la placenta cultivadas sobre matraces sin recubrir. Las células derivadas del cordón umbilical cultivadas sobre matraces recubiertos de gelatina se compararon con células derivadas del cordón umbilical cultivadas sobre matraces sin recubrir.

Comparación de enzimas de digestión. Se compararon cuatro tratamientos usados para el aislamiento y preparación de células. Se compararon las células derivadas de tejido posparto mediante el tratamiento con 1) colagenasa; 2) colagenasa/dispasa; 3) colagenasa/hialuronidasa; y 4) colagenasa/hialuronidasa/dispasa.

55 Comparación de las capas placentarias. Se compararon células aisladas del aspecto materno de tejido placentario con células aisladas de la región vellosa de tejido placentario y células aisladas del aspecto fetal neonatal de la placenta.

Resultados

Células derivadas de la placenta se compararon con células derivadas del cordón umbilical. Células derivadas de la placenta y del cordón umbilical analizadas por citometría de flujo dieron positivo para la producción de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa y HLA-A, B, C, indicado por los elevados valores de fluorescencia 65 con respecto al control de IgG. Estas células fueron negativas para la producción detectable de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DR, DP, DQ, indicado por valores de fluorescencia comparables al control de IgG. Se

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09-07-2015

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Tabla 8-6. Genes que se mostró que tenían elevada expresión en fibroblastos en comparación con las otras líneas celulares ensayadas.

Genes fibrobastos elevados

fosfatasa de especificidad dual 2

KIAA0527 proteina

Homo sapiens cADN: FLJ23224 fis, clon ADSU02206

dineína, citoplasmática, polipéptido intermedio 1

ankyrin 3, el nodo de Ranvier (ankyrin G)

inhibina, beta A (activina A, activina AB polipéptido alfa)

pirofosfatasa ectonucleotide / fosfodiesterasa 4 (función putativa)

KIAA1053 proteina

proteína asociada a microtúbulos 1A

proteína con dedos de zinc 41

HSPC019 proteina

Homo sapiens cADN: FLJ23564 fis, cloe LNG10773

ARNm sapiens Homo; ADNc DKFZp564A072 (del clon DKFZp564A072)

Proteína LIM (similar al enigma de proteína quinasa C de rata vinculante)

inhibidor de la luz kappa polipéptido potenciador del gen en las células B, la proteína-quinasa asociada complejo

proteína hipotética FLJ22004

(clon CTG-A4) secuencia de ARNm Humana

EST, Moderadamente similar al factor de citoquinas similar al receptor de 2; precursor CRL2 receptor de citoquinas [Homo sapiens]

factor de crecimiento transformante, beta 2

MGC29643 hipotética proteína

antígeno identificado por el anticuerpo monoclonal MRC OX-2

Tabla 8-7. Genes que se mostró que tenían elevada expresión en las células derivadas de ICBM en comparación con las otras líneas celulares ensayadas.

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Genes células ICBM elevadas

Proteínas cardiaca ankyrin repetidas

MHC de clase I región ORF

integrin, alpha 10

proteína hipotética FLJ22362

UDP-N-acetil-alfa-D-galactosamina: polipéptido N-acetilgalactosaminiltransferasa 3 (GalNAc-T3)

proteína inducida por interferón-44

SRY (región determinante del sexo Y) -Caja 9 (displasia campomelic, autosómica reversión sexual)

queratina proteína asociada 1-1

hippocalcina-tipo 1

dentado 1 (síndrome de Alagille)

proteoglicano 1, gránulo secretor

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Claims (1)

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