La presente invención se refiere a, inter alia, la modulación de la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo. En particular, la presente invención se refiere, en un aspecto, a la utilización de uno o más genes o proteínas cas para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo.The present invention relates to, inter alia, the modulation of the resistance of a cell against a target nucleic acid or a transcription product thereof. In particular, the present invention relates, in one aspect, to the use of one or more genes or cas proteins to modulate the resistance of a cell against a target nucleic acid or a transcription product thereof.
Los cultivos, tales como los cultivos iniciadores, son muy utilizados en la industria alimentaria en la preparación de productos fermentados, incluyendo productos lácteos (tales como yogur, mantequilla y queso), productos cárnicos, productos de panadería, vino y productos vegetales. La preparación de cultivos es laboriosa, ocupa mucho espacio y requiere muchos equipos, y existe un riesgo considerable de contaminación por bacterias descomponedoras de los alimentos y/o fagos durante la etapa de propagación. El colapso de los cultivos bacterianos debido a la infección por bacteriófagos (fagos) y su multiplicación es un problema importante durante el uso industrial de los cultivos bacterianos. Existen muchos tipos diferentes de fagos con mecanismos diversos para atacar a las bacterias. Además, aparecen nuevas cepas de bacteriófagos.Crops, such as starter crops, are widely used in the food industry in the preparation of fermented products, including dairy products (such as yogurt, butter and cheese), meat products, bakery products, wine and vegetable products. The preparation of crops is laborious, takes up a lot of space and requires a lot of equipment, and there is a considerable risk of contamination by food spoilage bacteria and / or phages during the propagation stage. The collapse of bacterial cultures due to infection by bacteriophages (phages) and their multiplication is an important problem during the industrial use of bacterial cultures. There are many different types of phages with different mechanisms to attack bacteria. In addition, new bacteriophage strains appear.
Entre las estrategias utilizadas para minimizar la infección por bacteriófagos, y de esta manera el colapso de un cultivo bacteriano, se incluye la utilización de: (i) cultivos iniciadores mixtos, e (ii) la utilización alternativa de cepas que presentan diferentes perfiles de susceptibilidad a los fagos (rotación de cepas).Strategies used to minimize bacteriophage infection, and thus the collapse of a bacterial culture, include the use of: (i) mixed starter cultures, and (ii) the alternative use of strains that have different susceptibility profiles to phages (strain rotation).
Se han realizado varios intentos para mejorar la resistencia de los cultivos para la utilización en la industria.Several attempts have been made to improve crop resistance for use in industry.
Pedersen et al. (7th Symposium on lactic acid bacteria: genetics, metabolism and applications, 1 a 5 de septiembre de 2002; Egmond aan Zee, Países Bajos) enseñan una cepa de Lactococcus lactis resistente a fagos que no presenta actividad de timidilato sintasa y que requiere timidina para la replicación del ADN.Pedersen et al. (7th Symposium on lactic acid bacteria: genetics, metabolism and applications, September 1 to 5, 2002; Egmond aan Zee, The Netherlands) teach a strain of phage-resistant Lactococcus lactis that does not exhibit thymidylate synthase activity and that requires thymidine to DNA replication.
La patente WO 01/14520 da a conocer una bacteria del ácido láctico que presenta una susceptibilidad reducida al ataque por como mínimo un tipo de bacteriófago. Dichas bacterias del ácido láctico comprenden un gen mutado implicado en el metabolismo de las piridinas, es decir pyrG, que resulta en un defecto en la CTP-sintetasa.WO 01/14520 discloses a lactic acid bacterium that has a reduced susceptibility to attack by at least one type of bacteriophage. Said lactic acid bacteria comprise a mutated gene involved in the metabolism of pyridines, that is pyrG, which results in a defect in CTP synthetase.
Kosuge et al. (Appl. Environ. Microbiol. volumen 64, número 11, páginas 43284332, 1998) y Kosuge et al. (FEMS Microbiology Letters 123(1/2):55-62, 1994) enseñan una bacteria Thermus thermophilus HB27 que se encuentra mutada en el gen proB y que es incapaz de utilizar la prolina para el crecimiento.Kosuge et al. (Appl. Environ. Microbiol. Volume 64, number 11, pages 43284332, 1998) and Kosuge et al. (FEMS Microbiology Letters 123 (1/2): 55-62, 1994) teach a Thermus thermophilus HB27 bacterium that is mutated in the proB gene and is unable to use proline for growth.
Sin embargo, existe una necesidad todavía de mejorar los cultivos para la utilización en la industria.However, there is still a need to improve crops for use in industry.
En la presente memoria se describe la utilización de loci CRISPR o un componente de los mismos para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.The present specification describes the use of CRISPR loci or a component thereof to modulate the resistance of a cell against a target nucleic acid or a transcription product thereof.
Las CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y uniformemente espaciadas) (también conocidas como SPIDR -repeticiones directas intercaladas por espaciadores) constituyen una familia de loci de ADN recientemente descrita. Los loci CRISPR están consituidos por repeticiones de ADN cortas y altamente conservadas (típicamente de 24 a 40 pb, repetidas 1 a 140 veces) que son parcialmente palindrómicas. Las secuencias repetidas (habitualmente específicas de una especie) se encuentran separadas por secuencias variables de longitud constante (típicamente de 20 a 58 pb, dependiendo del CRISPR). Se han encontrado hasta 20 loci CRISPR diferentes en un solo cromosoma.CRISPR (short palindromic repeats grouped and uniformly spaced) (also known as SPIDR - direct repetitions interspersed by spacers) constitute a family of recently described DNA loci. CRISPR loci are constituted by short and highly conserved DNA repeats (typically 24 to 40 bp, repeated 1 to 140 times) that are partially palindromic. Repeated sequences (usually specific to a species) are separated by variable sequences of constant length (typically 20 to 58 bp, depending on CRISPR). Up to 20 different CRISPR loci have been found on a single chromosome.
Aunque se desconoce la función biológica de los loci CRISPR, se han propuesto algunas hipótesis. Por ejemplo, se ha propuesto que podrían encontrarse implicadas en la unión del cromosoma a una estructura celular, o en la replicación del cromosoma y distribución de replicones (Jansen et al., 2002; Pourcel et al., 2005). Además, Mojica et al., 2005, han planteado la hipótesis de que CRISPR podría encontrarse implicado en proporcionar unidad específica contra el ADN foráneo, y Pourcel et al., (2005), han planteado la hipótesis de que los CRISPR son estructuras que pueden incorporar fragmentos de ADN foráneo como parte de un mecanismo de defensa. Bolotin et al., (2005), sugieren que los elementos espaciadores de CRISPR son trazas de invasiones pasadas por parte de elementos extracromosómicos, y han planteado la hipótesis de que proporcionan a la célula inmunidad frente a la infección por fagos, y más generalmente frente a la expresión de ADN foráneo mediante la codificación de un ARN antisentido. Bolotin et al., (2005), también sugieren que los genes cas resultan necesarios para la formación de CRISPR.Although the biological function of CRISPR loci is unknown, some hypotheses have been proposed. For example, it has been proposed that they might be involved in the chromosome binding to a cellular structure, or in the chromosome replication and replicon distribution (Jansen et al., 2002; Pourcel et al., 2005). In addition, Mojica et al., 2005, have hypothesized that CRISPR could be involved in providing specific unit against foreign DNA, and Pourcel et al., (2005), have hypothesized that CRISPR are structures that can incorporate foreign DNA fragments as part of a defense mechanism. Bolotin et al., (2005), suggest that the spacer elements of CRISPR are traces of past invasions by extrachromosomal elements, and have hypothesized that they provide the cell with immunity against phage infection, and more generally against to the expression of foreign DNA by encoding an antisense RNA. Bolotin et al., (2005), also suggest that cas genes are necessary for the formation of CRISPR.
En contraste con las enseñanzas de la técnica anterior, que plantean la hipótesis de que CRISPR o los espaciadores de CRISPR podrían encontrarse implicados en proporcionar inmunidad específica, la presente invención se basa, en parte, en el inesperado resultado de que los genes o proteínas cas resultan necesarios para la inmunidad contra un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.In contrast to the teachings of the prior art, which hypothesize that CRISPR or CRISPR spacers could be involved in providing specific immunity, the present invention is based, in part, on the unexpected result that genes or proteins cas they are necessary for immunity against a target nucleic acid or a transcription product thereof.
Todavía más inesperadamente, en el contexto de la presente invención se ha descubierto que uno o más genes o proteínas cas se encuentran asociados a dos o más repeticiones CRISPR dentro de los loci CRISPR. En otras palabras, los genes o proteínas cas aparentemente son específicos para una repetición CRISPR de ADN, implicando que los genes o proteínas cas y la secuencia repetida forman una pareja funcional. De acuerdo con lo anterior, puede utilizarse uno o más espaciadores de CRISPR conjuntamente con una o más de dichas parejas funcionales (es decir, repeticiones CRISPR y genes cas) con el fin de modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.Even more unexpectedly, in the context of the present invention it has been discovered that one or more genes or cas proteins are associated with two or more CRISPR repeats within the CRISPR loci. In other words, the cas genes or proteins are apparently specific for a CRISPR DNA repeat, implying that the cas genes or proteins and the repeated sequence form a functional partner. In accordance with the foregoing, one or more CRISPR spacers may be used in conjunction with one or more of said functional partners (ie, CRISPR repeats and cas genes) in order to modulate the resistance of a cell against a target nucleic acid or a transcription product thereof.
En una forma de realización, para que uno o más espaciadores de CRISPR proporcione inmunidad a la célula, la repetición o repeticiones CRISPR y el gen o genes o proteínas cas forman una combinación funcional, es decir, la repetición o repeticiones CRISPR y el gen o genes o proteínas cas son compatibles.In one embodiment, for one or more CRISPR spacers to provide immunity to the cell, the CRISPR repeat or repetitions and the gene or genes or proteins cas form a functional combination, that is, the CRISPR repeat or repeats and the gene or Cas genes or proteins are compatible.
De acuerdo con lo expuesto anteriormente, se sugiere en la presente memoria por primera vez que un gen o proteína cas influye sobre la resistencia, tal como la resistencia de una bacteria a uno o más bacteriófagos. En particular, el conocimiento de dos o más repeticiones CRISPR y/o de uno o más genes o proteínas cas para una célula dada resultará ventajoso para predecir, determinar y modificar su resistencia, por ejemplo su lisotipo, que define la resistencia/sensibilidad de una bacteria dada frente a diversos bacteriófagos. En consecuencia, la identificación y la detección de los loci CRISPR en, por ejemplo, las células y bacteriófagos, podrían ayudar a determinar, predecir y modificar el perfil de resistencia de una célula o las interacciones de fago-huésped.In accordance with the foregoing, it is suggested herein for the first time that a gene or protein cas influences resistance, such as the resistance of a bacterium to one or more bacteriophages. In particular, knowledge of two or more CRISPR repeats and / or one or more genes or cas proteins for a given cell will be advantageous for predicting, determining and modifying its resistance, for example its lysotype, which defines the resistance / sensitivity of a cell. bacteria given against various bacteriophages. Consequently, the identification and detection of CRISPR loci in, for example, cells and bacteriophages, could help determine, predict and modify the resistance profile of a cell or phage-host interactions.
Ventajosamente, la aplicación de uno o más loci de CRISPR, dos o más repeticiones CRISPR, uno o más genes o proteínas cas y/o uno o más espaciadores de CRISPR en la ingeniería genética podría conducir a variantes resistentes o sensibles de células para la utilización en una amplia diversidad de aplicaciones en la industria biotecnológica.Advantageously, the application of one or more CRISPR loci, two or more CRISPR repeats, one or more genes or cas proteins and / or one or more CRISPR spacers in genetic engineering could lead to resistant or sensitive cell variants for use. in a wide diversity of applications in the biotechnology industry.
En un aspecto, se proporciona la utilización de uno o más genes o proteínas cas para modular la resistencia en una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.In one aspect, the use of one or more cas genes or proteins to modulate resistance in a cell against a target nucleic acid or a transcription product thereof is provided.
En un segundo aspecto, se proporciona la utilización de una secuencia de ácidos nucleicos recombinantes que comprende por lo menos un gen cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR conjuntamente con por lo menos un espaciador de CRISPR, en el que por lo menos un espaciador de CRISPR es heterólogo respecto a por lo menos un gen cas y/o por lo menos dos repeticiones de CRISPR para modular la resistencia frente a un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.In a second aspect, the use of a recombinant nucleic acid sequence comprising at least one cas gene and at least two CRISPR repeats together with at least one CRISPR spacer is provided, in which at least one spacer of CRISPR is heterologous with respect to at least one cas gene and / or at least two repetitions of CRISPR to modulate resistance against a target nucleic acid or transcription product thereof.
En un tercer aspecto, se proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que consta esencialmente de por lo menos un gen cas.In a third aspect, a nucleic acid sequence is provided consisting essentially of at least one cas gene.
En un cuarto aspecto, se proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que consta esencialmente de por lo menos un gen cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR.In a fourth aspect, a nucleic acid sequence is provided consisting essentially of at least one cas gene and at least two CRISPR repeats.
En un quinto aspecto, se proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que consta esencialmente de por lo menos un gen cas y por lo menos un espaciador de CRISPR.In a fifth aspect, a nucleic acid sequence is provided consisting essentially of at least one cas gene and at least one CRISPR spacer.
En un sexto aspecto, se proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que consta esencialmente de por lo menos un gen cas, por lo menos un espaciador de CRISPR y por lo menos dos repeticiones CRISPR.In a sixth aspect, a nucleic acid sequence is provided consisting essentially of at least one cas gene, at least one CRISPR spacer and at least two CRISPR repeats.
En un séptimo aspecto se proporciona una secuencia de ácidos nucleicos recombinante que comprende por lo menos un gen cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR conjuntamente con por lo menos un espaciador de CRISPR, en el que el espaciador de CRISPR es heterólogo respecto a por lo menos un gen cas y/o por lo menos dos repeticiones CRISPR.In a seventh aspect, a recombinant nucleic acid sequence is provided comprising at least one cas gene and at least two CRISPR repeats in conjunction with at least one CRISPR spacer, in which the CRISPR spacer is heterologous with respect to less a cas gene and / or at least two CRISPR repetitions.
En un octavo aspecto se proporciona un constructo que comprende una o más de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la presente memoria.In an eighth aspect there is provided a construct comprising one or more of the nucleic acid sequences indicated herein.
En un noveno aspecto se proporciona un vector que comprende una o más de las secuencias de ácidos nucleicos o uno o más de los constructos indicados en la presente memoria.In a ninth aspect a vector is provided comprising one or more of the nucleic acid sequences or one or more of the constructs indicated herein.
En un décimo aspecto se proporciona una célula que comprende la secuencia de ácidos nucleicos o el constructo o el vector indicados en la presente memoria.In a tenth aspect a cell is provided comprising the nucleic acid sequence or the construct or vector indicated herein.
En un undécimo aspecto se proporciona un método para modular (por ejemplo proporcionar o incrementar) la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes:In an eleventh aspect a method is provided for modulating (for example providing or increasing) the resistance of a cell against a target nucleic acid or a transcription product thereof, which comprises the following steps:
En un duodécimo aspecto se proporciona un método para modular (por ejemplo proporcionar o incrementar) la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes:In a twelfth aspect a method is provided to modulate (for example provide or increase) the resistance of a cell against a target nucleic acid or a transcription product thereof, which comprises the following steps:
En un decimotercer aspecto se proporciona un método para modular (por ejemplo proporcionar o incrementar) la resistencia de una célula que comprende por lo menos unoIn a thirteenth aspect a method is provided for modulating (for example providing or increasing) the resistance of a cell comprising at least one
o más genes cas o proteínas de los mismos y dos o más repeticiones CRISPR frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar uno o más espaciadores de CRISPR en un organismo resistente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, e (ii) modificar la secuencia de uno o más espaciadores de CRISPR en la célula, de manera que el espaciador o espaciadores de CRISPR presenten homología respecto al espaciador o espaciadores de CRISPR en el organismo.or more cas genes or proteins thereof and two or more CRISPR repeats against a target nucleic acid or a transcription product thereof, comprising the following steps: (i) identify one or more CRISPR spacers in an organism resistant to target nucleic acid or transcription product thereof, and (ii) modify the sequence of one or more CRISPR spacers in the cell, so that the CRISPR spacer or spacers present homology with respect to the CRISPR spacer or spacers in the body.
En un decimocuarto aspecto, se proporciona un método para modular (por ejemplo reducir o disminuir) la resistencia de una célula que comprende por lo menos uno o más genes o proteínas cas y dos o más repeticiones CRISPR frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo, que comprende modificar uno o más genes o proteínas cas y/o dos o más repeticiones CRISPR en la célula.In a fourteenth aspect, a method is provided for modulating (for example reducing or decreasing) the resistance of a cell comprising at least one or more genes or cas proteins and two or more CRISPR repeats against a target nucleic acid or a product transcription thereof, which comprises modifying one or more genes or cas proteins and / or two or more CRISPR repeats in the cell.
En la presente memoria se enseña un método para identificar un espaciador de CRISPR o seudoespaciador de CRISPR para la utilización en la modulación de la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) preparar una célula que comprende por lo menos dos repeticiones CRISPR y por lo menos un gen o proteína cas, (ii) identificar por lo menos un espaciador de CRISPR o seudoespaciador de CRISPR en un organismo que es sustancialmente resistente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, (iii) modificar la secuencia del espaciador de CRISPR en la célula de manera que el espaciador de CRISPR presente homología respecto al espaciador del organismo, e (iv) determinar si la célula modula la resistencia frente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, en el que la modulación de la resistencia de la célula frente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo es indicativa de que el espaciador de CRISPR modula la resistencia de la célula.A method of identifying a CRISPR spacer or CRISPR pseudo-spacer for use in modulating the resistance of a cell against a target nucleic acid or a transcription product thereof, comprising the following steps, is taught herein: (i) preparing a cell comprising at least two CRISPR repeats and at least one gene or cas protein, (ii) identifying at least one CRISPR spacer or pseudo-spacer CRISPR in an organism that is substantially resistant to the target nucleic acid or transcription product thereof, (iii) modify the sequence of the CRISPR spacer in the cell so that the CRISPR spacer presents homology with respect to the organizer spacer, and (iv) determine whether the cell modulates resistance to nucleic acid target or transcription product thereof, in which the modulation of the resistance of the cell against the target nucleic acid or product or transcription thereof is indicative that the CRISPR spacer modulates cell resistance.
En la presente memoria se enseña un método para identificar un gen cas para la utilización en la modulación de la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico dianaA method to identify a cas gene for use in modulating the resistance of a cell against a target nucleic acid is taught herein.
o un producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) preparar una célula que comprende por lo menos un espaciador de CRISPR y por lo menos dos repeticiones CRISPR, (ii) manipular la célula de manera que comprende por lo menos un gen cas, e (iii) determinar si la célula modula la resistencia frente al ácido nucleico diana o producto de transición del mismo, en el que la modulación de la resistencia de la célula frente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo es indicativa de que el gen cas puede utilizarse para modular la resistencia de la célula.or a transcription product thereof, comprising the following steps: (i) preparing a cell comprising at least one CRISPR spacer and at least two CRISPR repeats, (ii) manipulating the cell in a manner that comprises at least a cas gene, and (iii) determine whether the cell modulates resistance against the target nucleic acid or transition product thereof, in which the modulation of the resistance of the cell against the target nucleic acid or transcription product thereof is indicative that the cas gene can be used to modulate cell resistance.
En la presente memoria se enseña un método para identificar una repetición CRISPR para la utilización en la modulación de la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) preparar una célula que comprende por lo menos un espaciador de CRISPR y por lo menos un gen cas, (ii) manipular la célula de manera que contenga la repetición de CRISPR, e (iii) determinar si la célula modula la resistencia frente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, en el que la modulación de la resistencia de la célula frente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo es indicativa de que la repetición CRISPR pueda utilizarse para modular la resistencia.A method for identifying a CRISPR repeat for use in modulating the resistance of a cell against a target nucleic acid or transcription product thereof, comprising the following steps, is taught herein: (i) preparing a cell comprising at least one CRISPR spacer and at least one cas gene, (ii) manipulating the cell so as to contain the repeat CRISPR, and (iii) determining whether the cell modulates resistance against the target nucleic acid or product transcription thereof, in which the modulation of the resistance of the cell against the target nucleic acid or transcription product thereof is indicative that the CRISPR repeat can be used to modulate the resistance.
En la presente memoria se enseña un método para identificar una combinación funcional de un gen cas y una repetición CRISPR, que comprende las etapas siguientes:A method for identifying a functional combination of a cas gene and a CRISPR repeat, comprising the following steps, is taught herein:
(a) determinar las secuencias del gen cas y la repetición CRISPR, (b) identificar una o más agrupaciones de genes cas según se determina mediante análisis de comparación de secuencias, (c) identificar una o más agrupaciones de repeticiones CRISPR, y (d) combinar las secuencias de gen cas y de repetición CRISPR que se encuentran dentro de la misma agrupación, en donde la combinación de las secuencias del gen cas y de la repetición CRISPR en la misma agrupación es indicativa de que la combinación es una combinación funcional.(a) determine the sequences of the cas gene and the CRISPR repeat, (b) identify one or more clusters of cas genes as determined by sequence comparison analysis, (c) identify one or more clusters of CRISPR repeats, and (d ) combining the sequences of the cas gene and CRISPR repeat that are within the same grouping, where the combination of the sequences of the cas gene and the CRISPR repeat in the same grouping is indicative that the combination is a functional combination.
En la presente memoria se enseña un método para modular el lisotipo de una célula bacteriana que comprende uno o más genes o proteínas cas y dos o más repeticiones CRISPR, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar uno o más seudoespaciadores de CRISPR en la secuencia genómica de un bacteriófago contra el que debe modularse la resistencia, e (ii) modificar la secuencia de uno o más espaciadores CRISPR de la célula bacteriana de manera que el espaciador o espaciadores CRISPR de la célula bacteriana presente homología respecto al espaciadorA method to modulate the lysotype of a bacterial cell comprising one or more genes or cas proteins and two or more CRISPR repeats, comprising the following steps is taught herein: (i) identify one or more CRISPR pseudo spacers in the Genomic sequence of a bacteriophage against which resistance should be modulated, and (ii) modify the sequence of one or more CRISPR spacers of the bacterial cell so that the bacterial cell CRISPR spacers or spacers present homology to the spacer
o seudoespaciadores de CRISPR del bacteriófago contra el que debe modularse la resistencia.or CRISPR pseudo spacers of the bacteriophage against which resistance should be modulated.
En un decimoquinto aspecto se proporciona un método para modular (por ejemplo proporcionar o incrementar) la resistencia de una célula bacteriana contra un bacteriófago, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar una secuencia (por ejemplo una secuencia conservada) en un bacteriófago (preferentemente una secuencia esencial para el funcionamiento o la supervivencia del bacteriófago), (ii) preparar un espaciador CRISPR que es homólogo respecto a la secuencia identificada, (iii) preparar un ácido nucleico que comprende por lo menos un gen cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR conjuntamente con el espaciador CRISPR, e (iv) introducir dicho ácido nucleico en la célula bacteriana, convirtiendo de esta manera a la célula bacteriana en resistente a dicho ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.In a fifteenth aspect a method is provided for modulating (for example providing or increasing) the resistance of a bacterial cell against a bacteriophage, which comprises the following steps: (i) identifying a sequence (for example a conserved sequence) in a bacteriophage ( preferably an essential sequence for the operation or survival of the bacteriophage), (ii) prepare a CRISPR spacer that is homologous to the identified sequence, (iii) prepare a nucleic acid comprising at least one cas gene and at least two CRISPR repeats together with the CRISPR spacer, and (iv) introducing said nucleic acid into the bacterial cell, thereby making the bacterial cell resistant to said target nucleic acid or transcription product thereof.
En un decimosexto aspecto se proporciona un método para modular (por ejemplo proporcionar o incrementar) la resistencia de una célula bacteriana frente a un ácido nucleico diana o producto de transcripción en un bacteriófago del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar uno o más seudoespaciadores de CRISPR en un genoma de bacteriófago que puede proporcionar resistencia frente al ácido nucleico dianaIn a sixteenth aspect a method is provided for modulating (for example providing or increasing) the resistance of a bacterial cell against a target nucleic acid or transcription product in a bacteriophage thereof, which comprises the following steps: (i) identify one or more pseudo-spacers of CRISPR in a bacteriophage genome that can provide resistance against the target nucleic acid
o producto de transcripción del mismo, (ii) preparar un ácido nucleico recombinante que comprende por lo menos un gen cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR conjuntamente con dicho espaciador o seudoespaciadores de CRISPR identificados, e (iii) introducir dicho ácido nucleico recombinante en dicha célula bacteriana, convirtiéndola de esta manera a la célula bacteriana en resistente a dicho ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.or transcription product thereof, (ii) preparing a recombinant nucleic acid comprising at least one cas gene and at least two CRISPR repeats in conjunction with said identified spacer or pseudo-spacers of CRISPR, and (iii) introducing said recombinant nucleic acid into said bacterial cell, thereby making the bacterial cell resistant to said target nucleic acid or transcription product thereof.
En un decimoséptimo aspecto se proporciona un método para modular la resistencia de una célula bacteriana que comprende uno o más genes o proteínas cas y dos o más repeticiones CRISPR contra un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo en un bacteriófago, que comprende las etapas siguientes:In a seventeenth aspect a method is provided to modulate the resistance of a bacterial cell comprising one or more genes or cas proteins and two or more CRISPR repeats against a target nucleic acid or transcription product thereof in a bacteriophage, comprising the steps following:
En un decimoctavo aspecto se proporciona un método para determinar la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo que comprende una o más combinaciones funcionales de repetición CRISPRcas y uno o más espaciadores CRISPR en la célula.In a eighteenth aspect a method is provided for determining the resistance of a cell against a target nucleic acid or a transcription product thereof comprising one or more CRISPRcas repeat functional combinations and one or more CRISPR spacers in the cell.
También se enseña en la presente memoria una célula obtenida u obtenible mediante el método o métodos descritos en la presente memoria.A cell obtained or obtainable by the method or methods described herein is also taught herein.
También se enseña en la presente memoria un espaciador CRISPR o un seudoespaciador de CRISPR obtenido u obtenible mediante el método o métodos descritos en la presente memoria.Also taught herein is a CRISPR spacer or a CRISPR pseudo-spacer obtained or obtainable by the method or methods described herein.
También se enseña en la presente memoria un gen cas obtenido u obtenible mediante el método o métodos descritos en la presente memoria.A cas gene obtained or obtainable by the method or methods described herein is also taught herein.
También se enseña en la presente memoria una repetición CRISPR obtenida u obtenible mediante el método o métodos descritos en la presente memoria.A CRISPR repeat obtained or obtainable by the method or methods described herein is also taught herein.
Es asimismo enseñada en la presente memoria una combinación funcional obtenida u obtenible mediante el(los) procedimiento(s) descrito(s) en la presente memoria.A functional combination obtained or obtainable by the method (s) described herein is also taught herein.
También se enseña en la presente memoria un locus CRISPR recombinante que comprende un espaciador CRISPR o un seudoespaciador de CRISPR y/o un gen cas, y/o una repetición CRISPR y/o una combinación funcional.A recombinant CRISPR locus comprising a CRISPR spacer or a pseudo-spacer of CRISPR and / or a cas gene, and / or a CRISPR repeat and / or a functional combination is also taught herein.
También se enseña en la presente memoria la utilización de una célula, un espaciador CRISPR o un seudoespaciador de CRISPR, un gen cas, una repetición CRISPR o una combinación funcional para modular la resistencia de una célula frente a unThe use of a cell, a CRISPR spacer or a CRISPR pseudo spacer, a cas gene, a CRISPR repeat or a functional combination to modulate the resistance of a cell against a cell is also taught herein.
ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.target nucleic acid or a transcription product thereof.
También se enseña en la presente memoria un cultivo celular que comprende una célula, un espaciador CRISPR o un seudoespaciador de CRISPR, un gen cas, una repetición CRISPR o una combinación funcional para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.Also taught herein is a cell culture comprising a cell, a CRISPR spacer or a pseudo-spacer of CRISPR, a cas gene, a CRISPR repeat or a functional combination to modulate the resistance of a cell against a target nucleic acid or a transcription product thereof.
También se enseña en la presente memoria un producto alimentario o pienso que comprende el cultivo indicado en la presente memoria.A food product or feed comprising the crop indicated herein is also taught herein.
Se enseña en la presente memoria un procedimiento para preparar un producto alimentario o pienso que comprende la utilización del cultivo indicado en la presente memoria.A process for preparing a food product or feed comprising the use of the culture indicated herein is taught herein.
Se enseña en la presente memoria un producto alimentario o pienso obtenido u obtenible mediante el procedimiento descrito en la presente memoria.A food product or feed obtained or obtainable by the method described herein is taught herein.
Se enseña en la presente memoria la utilización del cultivo indicado en la presente memoria para preparar un producto alimentario.The use of the culture indicated herein to prepare a food product is taught herein.
Se enseña en la presente memoria una secuencia de nucleótidos que comprende o que está constituida por la secuencia proporcionada en cualquiera de las secuencias SEC ID nº 7 a 10 y SEC ID nº 359 a 405, o una variante, fragmento, homólogo o derivado de la misma.A nucleotide sequence comprising or consisting of the sequence provided in any of the sequences SEQ ID No. 7 to 10 and SEQ ID No. 359 to 405, or a variant, fragment, homologue or derivative thereof is taught herein. same.
También se enseña en la presente memoria una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos indicada en la presente memoria.An amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence indicated herein is also taught herein.
Se enseña en la presente memoria un constructo o vector que comprende una o más de las secuencias de nucleótidos indicadas en la presente memoria.A construct or vector comprising one or more of the nucleotide sequences indicated herein is taught herein.
Se enseña en la presente memoria una célula huésped en la que se ha incorporado una o más de las secuencias de nucleótidos indicadas en la presente invención o el constructo o vector indicado en la presente memoria.A host cell is taught herein in which one or more of the nucleotide sequences indicated in the present invention or the construct or vector indicated herein has been incorporated.
En algunas formas de realización, se utiliza uno o más genes cas en combinación con dos o más repeticiones CRISPR.In some embodiments, one or more cas genes are used in combination with two or more CRISPR repeats.
En algunas formas de realización, por lo menos un gen o proteína cas y/o las dos o más repeticiones CRISPR proceden o pueden derivarse (preferentemente se derivan) de la misma célula.In some embodiments, at least one cas gene or protein and / or the two or more CRISPR repeats come from or can be derived (preferably derived) from the same cell.
En algunas formas de realización, por lo menos un gen o proteína cas y dos o más repeticiones CRISPR de manera natural pueden encontrase simultáneamente en la misma célula.In some embodiments, at least one cas gene or protein and two or more naturally occurring CRISPR repeats can be found simultaneously in the same cell.
En algunas formas de realizaciones, por lo menos un gen o proteína cas se utiliza en combinación con uno o más espaciadores CRISPR.In some forms of embodiments, at least one gene or cas protein is used in combination with one or more CRISPR spacers.
En algunas formas de realizaciones, el espaciador o espaciadores CRISPR proceden o pueden derivarse (preferentemente se derivan) de un organismo que es diferente de la célula a partir de la que puede derivarse (preferentemente se deriva) uno o más genes o proteínas cas y/o las dos o más repeticiones CRISPR.In some embodiments, the CRISPR spacer or spacers originate from or can be derived (preferably derived) from an organism that is different from the cell from which one or more cas or genes or proteins can be derived (preferably derived). or the two or more CRISPR repetitions.
En algunas formas de realización, el espaciador se obtiene de una célula que es resistente a un ácido nucleico diana.In some embodiments, the spacer is obtained from a cell that is resistant to a target nucleic acid.
En algunas formas de realización, el espaciador CRISPR es una secuencia sintética de ácidos nucleicos.In some embodiments, the CRISPR spacer is a synthetic nucleic acid sequence.
En algunas formas de realización, el espaciador o espaciadores CRISPR presenta homología respecto del ácido nucleico diana.In some embodiments, the CRISPR spacer or spacers have homology to the target nucleic acid.
En algunas formas de realización, el espaciador o espaciadores CRISPR presenta una identidad de 100% respecto al ácido nucleico diana a lo largo de por lo menos la longitud del núcleo del espaciador CRISPR.In some embodiments, the CRISPR spacer or spacers have a 100% identity with respect to the target nucleic acid along at least the length of the CRISPR spacer core.
En algunas formas de realización, por lo menos un gen o proteína cas se utiliza en combinación con por lo menos uno o más espaciadores CRISPR y por lo menos dos o más repeticiones CRISPR.In some embodiments, at least one gene or cas protein is used in combination with at least one or more CRISPR spacers and at least two or more CRISPR repeats.
En algunas formas de realización, el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo es ADN de bacteriófago o puede derivarse del mismo (preferentemente se deriva) a partir de.In some embodiments, the target nucleic acid or transcription product thereof is bacteriophage DNA or may be derived therefrom (preferably derived) from.
En algunas formas de realización, el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo es ADN de plásmido o se deriva del mismo (preferentemente se deriva del mismo).In some embodiments, the target nucleic acid or transcription product thereof is plasmid DNA or is derived from it (preferably derived from it).
En algunas formas de realización, el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo es un elemento genético móvil o puede derivarse del mismo (preferentemente se deriva del mismo).In some embodiments, the target nucleic acid or transcription product thereof is a mobile genetic element or may be derived therefrom (preferably derived therefrom).
En algunas formas de realización, el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo es un elemento trasponible o una secuencia de inserción o puede derivarse de cualquiera de los mismos (preferentemente se deriva de cualquiera de los mismos).In some embodiments, the target nucleic acid or transcription product thereof is a transposable element or an insertion sequence or can be derived from any of them (preferably derived from any of them).
En algunas formas de realización, el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo es un gen de resistencia a antibiótico o puede derivarse del mismo (preferentemente se deriva del mismo).In some embodiments, the target nucleic acid or transcription product thereof is an antibiotic resistance gene or may be derived therefrom (preferably derived therefrom).
En algunas formas de realización, el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo es un ácido nucleico codificante de un factor de virulencia o puede derivarse del mismo (preferentemente se deriva del mismo).In some embodiments, the target nucleic acid or transcription product thereof is a nucleic acid encoding a virulence factor or may be derived therefrom (preferably derived therefrom).
En algunas formas de realización, el factor de virulencia se selecciona de entre el grupo que consta de un ácido nucleico codificante de una toxina, una internalina y una hemolisina.In some embodiments, the virulence factor is selected from the group consisting of a nucleic acid encoding a toxin, an internalin and a hemolysin.
En algunas formas de realización, el gen o genes cas y las dos o más repeticiones CRISPR proceden o pueden derivarse (preferentemente se derivan) de la misma célula.In some embodiments, the cas gene or genes and the two or more CRISPR repeats come from or can be derived (preferably derived) from the same cell.
En algunas formas de realización, el gen o genes cas y las dos o más repeticiones CRISPR de manera natural se encuentran simultáneamente en la misma célula.In some embodiments, the cas gene or genes and the two or more naturally occurring CRISPR repeats are simultaneously found in the same cell.
En algunas formas de realización, los espaciadores CRISPR proceden o pueden derivarse (preferentemente se derivan) de un organismo que es diferente de la célula a partir de la que procede o puede derivarse (preferentemente se deriva) el gen o genes cas y/o las dos o más repeticiones CRISPR.In some embodiments, CRISPR spacers originate or may be derived (preferably derived) from an organism that is different from the cell from which it originates or may be derived (preferably derived) from the cas gene and / or genes. two or more CRISPR repetitions.
En algunas formas de realización, la célula es una célula receptora o una célula huésped.In some embodiments, the cell is a recipient cell or a host cell.
En algunas formas de realización, por lo menos un gen o proteína cas y/o las dos o más repeticiones CRISPR proceden o pueden derivarse (preferentemente se derivan) de la misma célula.In some embodiments, at least one cas gene or protein and / or the two or more CRISPR repeats come from or can be derived (preferably derived) from the same cell.
En algunas formas de realización, los espaciadores proceden o pueden derivarse (preferentemente se derivan) de un organismo que es diferente de la célula que comprende uno o más genes o proteínas cas y/o las dos o más repeticiones CRISPR.In some embodiments, the spacers proceed or may be derived (preferably derived) from an organism that is different from the cell comprising one or more cas genes or proteins and / or the two or more CRISPR repeats.
En algunas formas de realización, uno o más genes o proteínas cas y las dos o más repeticiones CRISPR se encuentran de manera natural simultáneamente en la misma célula.In some embodiments, one or more genes or cas proteins and the two or more CRISPR repeats naturally occur simultaneously in the same cell.
En algunas formas de realización, dicha modificación comprende insertar uno o más espaciadores CRISPR y/o seudoespaciadores de CRISPR en la célula.In some embodiments, said modification comprises inserting one or more CRISPR spacers and / or CRISPR pseudo spacers into the cell.
En algunas formas de realización, el espaciador de la célula presenta una homología de 100% respecto al espaciador CRISPR o seudoespaciador de CRISPR del organismo.In some embodiments, the cell spacer has a 100% homology with respect to the CRISPR spacer or CRISPR pseudo spacer of the organism.
En algunas formas de realización, dicha modificación comprende manipular genéticamente el espaciador CRISPR de la célula.In some embodiments, said modification comprises genetically manipulating the CRISPR spacer of the cell.
En algunas formas de realización, la totalidad o parte del espaciador en la célula ha sido modificado.In some embodiments, all or part of the spacer in the cell has been modified.
En algunas formas de realización, dicha modificación comprende la modificación de un espaciador recombinante.In some embodiments, said modification comprises the modification of a recombinant spacer.
En algunas formas de realización, dicha modificación se produce mediante mutación espontánea o mutagénesis.In some embodiments, said modification is produced by spontaneous mutation or mutagenesis.
En algunas formas de realización, el espaciador o espaciadores CRISPR en la célula han sido delecionadas.In some embodiments, the CRISPR spacer or spacers in the cell have been deleted.
En algunas formas de realización, la repetición o repeticiones CRISPR en la célula han sido delecionadas.In some embodiments, the CRISPR repeat or repetitions in the cell have been deleted.
En algunas formas de realización, el gen o genes cas han sido delecionados.In some embodiments, the cas gene or genes have been deleted.
En algunas formas de realización, se han delecionado CRISPR y/o uno o más genes cas.In some embodiments, CRISPR and / or one or more cas genes have been deleted.
En algunas formas de realización, por lo menos un gen o proteína cas y/o dos o más repeticiones CRISPR en la célula han sido delecionados.In some embodiments, at least one cas gene or protein and / or two or more CRISPR repeats in the cell have been deleted.
En algunas formas de realización, las secuencias de nucleótidos del gen cas y la repetición CRISPR proceden o pueden derivarse (preferentemente se derivan) de la misma cepa o de diferentes cepas.In some embodiments, the nucleotide sequences of the cas gene and the CRISPR repeat come or may be derived (preferably derived) from the same strain or from different strains.
En algunas formas de realización, las secuencias de nucleótidos del gen cas y la repetición CRISPR proceden o pueden derivarse (preferentemente se derivan) de la misma especie o de especies diferentes.In some embodiments, the nucleotide sequences of the cas gene and the CRISPR repeat originate or may be derived (preferably derived) from the same or different species.
En algunas formas de realización, las secuencias de nucleótidos del gen cas y la repetición CRISPR proceden o pueden derivarse (preferentemente se derivan) del mismo género o de diferentes géneros.In some embodiments, the nucleotide sequences of the cas gene and the CRISPR repeat originate or may be derived (preferably derived) from the same genus or from different genera.
En algunas formas de realización, las secuencias de nucleótidos del gen cas y la repetición CRISPR proceden o pueden derivarse (preferentemente se derivan) del mismo organismo o de organismos diferentes.In some embodiments, the nucleotide sequences of the cas gene and the CRISPR repeat come or may be derived (preferably derived) from the same organism or from different organisms.
En algunas formas de realización, el ácido nucleico diana en el bacteriófago es una secuencia de ácidos nucleicos altamente conservada.In some embodiments, the target nucleic acid in the bacteriophage is a highly conserved nucleic acid sequence.
En algunas formas de realización, el ácido nucleico diana en el bacteriófago codifica una proteína de especificidad de huésped.In some embodiments, the target nucleic acid in the bacteriophage encodes a host specificity protein.
En algunas formas de realización, el ácido nucleico diana en el bacteriófago codifica una proteína que resulta esencial para la supervivencia, replicación o crecimiento del bacteriófago.In some embodiments, the target nucleic acid in the bacteriophage encodes a protein that is essential for the survival, replication or growth of the bacteriophage.
En algunas formas de realización, el ácido nucleico diana en el bacteriófago codifica una helicasa, una primasa, una proteína estructural de cabeza o cola, una proteína con un dominio conservado (por ejemplo holina, lisina y otras) o una secuencia conservada de entre genes fágicos importantes.In some embodiments, the target nucleic acid in the bacteriophage encodes a helicase, a primase, a structural head or tail protein, a protein with a conserved domain (eg holine, lysine and others) or a conserved sequence between genes important phage.
En algunas formas de realización, el método para determinar la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo comprende la etapa adicional de comparar la secuencia de uno o más espaciadoresIn some embodiments, the method of determining the resistance of a cell against a target nucleic acid or a transcription product thereof comprises the additional step of comparing the sequence of one or more spacers.
CRISPR en la célula con la secuencia del ácido nucleico diana.CRISPR in the cell with the target nucleic acid sequence.
En algunas formas de realización, el método para determinar la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo comprende la etapa adicional de determinar el perfil de resistencia de la célula.In some embodiments, the method of determining the resistance of a cell against a target nucleic acid or a transcription product thereof comprises the additional step of determining the resistance profile of the cell.
En algunas formas de realización, dicho cultivo es un cultivo iniciador o un cultivo probiótico.In some embodiments, said culture is an initiator culture or a probiotic culture.
FIGURASFIGURES
Figura 1Figure 1
Representación esquemática de CRISPR1 de S. thermophilus CNRZ1066 (42 repeticiones).Schematic representation of CRISPR1 from S. thermophilus CNRZ1066 (42 repetitions).
Figura 2Figure 2
Análisis de gráfico de puntos de las secuencias de la proteína Cas (A) y de las secuencias del locus CRISPR (B). Los nombres de los organismos (género, especie, cepa) se indican en el lado derecho de cada gráfico de puntos (por ejemplo, Sth_LMG18311 = S. thermophilus LMG18311).Dot chart analysis of the sequences of the Cas protein (A) and the sequences of the CRISPR locus (B). The names of the organisms (genus, species, strain) are indicated on the right side of each dot plot (for example, Sth_LMG18311 = S. thermophilus LMG18311).
Figura 3Figure 3
Las secuencias de espaciador del locus CRISPR de S. thermophilus CNRZ1066 se buscaron con un programa BLAST (búsquedas de secuencias cortas prácticamente exactas utilizando BlastN en el sitio de internet del NCBI) frente a la base de datos de virus, y se alinearon con los resultados posteriores en los bacteriófagos de S. thermophilus. (A) La tabla indica las secuencias de espaciador del CRISPR de CNRZ1066, presentando las identidades de secuencia significativas con las secuencias fágicas (celdas negras). (B) Alineación de la secuencia interespaciadora nº 29 con ocho secuencias fágicas (nota: el espaciador nº 20 muestra similitud con varias proteínas de especificidad de huésped).The spacer sequences of the S. thermophilus CNRZ1066 CRISPR locus were searched with a BLAST program (virtually exact short sequence searches using BlastN on the NCBI website) versus the virus database, and aligned with the results later in S. thermophilus bacteriophages. (A) The table indicates the spacer sequences of the CRISPR of CNRZ1066, presenting the significant sequence identities with the phage sequences (black cells). (B) Alignment of the interspace sequence # 29 with eight phage sequences (note: spacer # 20 shows similarity with several host specificity proteins).
Figura 4Figure 4
Estructura secundaria de tallo-bucle putativa de una secuencia de repetición CRISPR de S. thermophilus. Se muestra únicamente una cadena de ADN.Secondary structure of putative stem-loop of a CRISPR repeat sequence of S. thermophilus. Only one strand of DNA is shown.
Figura 5Figure 5
La integración de un espaciador de CRISPR en el locus CRISPR de Streptococcus thermophilus proporciona resistencia frente a un bacteriófago al que muestra identidad el espaciador de CRISPR. La cepa parental DGCC7710 es sensible a los fagos, y la BIM DGCC7710RH1 es resistente a los fagos. La cepa BIM DGCC7710RH1 presenta un nuevo espaciador (Sn) en el locus CRISPR, que muestra una identidad de 100% respecto a la secuencia fágica. En la etapa (b), se reta la cepa con el fago 858 y se selecciona un mutante resistente a los fagos. En la etapa (c), el locus CRISPR I del mutante presenta un espaciador adicional que comparte una identidad de 100% con la región 31.921-31.950 pb del fago.The integration of a CRISPR spacer into the CRISPR locus of Streptococcus thermophilus provides resistance against a bacteriophage to which the CRISPR spacer shows identity. The parental strain DGCC7710 is phage sensitive, and the BIM DGCC7710RH1 is phage resistant. The BIM strain DGCC7710RH1 presents a new spacer (Sn) in the CRISPR locus, which shows a 100% identity with respect to the phage sequence. In step (b), the strain with phage 858 is challenged and a phage resistant mutant is selected. In step (c), the mutant CRISPR I locus has an additional spacer that shares a 100% identity with the region 31.921-31.950 bp of the phage.
Figura 6Figure 6
La integración de un espaciador de CRISPR en el locus CRISPR de Streptococcus thermophilus proporciona resistencia frente a un bacteriófago al que muestra identidad el espaciador de CRISPR. La cepa parental DGCC7710 es sensible a los fagos, y la cepa BIM DGCC7710RH2 es resistente a los fagos. La cepa BIM DGCC7710RH2 presenta un nuevo espaciador (Sn) en el locus CRISPR, que muestra una identidad de 100% respecto a la secuencia fágica. En la etapa (b) se reta la cepa con el fago 858 y se selecciona una cepa resistente a los fagos. En la etapa (c) se repitió independientemente el experimento y se seleccionó otro mutante. El locus CRISPR I del mutante presenta un espaciador adicional (diferente del que se encuentra presente en RH1) que comparte el 100% de identidad con la región 17.125-17.244 pb del fago.The integration of a CRISPR spacer into the CRISPR locus of Streptococcus thermophilus provides resistance against a bacteriophage to which the CRISPR spacer shows identity. The parental strain DGCC7710 is phage sensitive, and the BIM strain DGCC7710RH2 is phage resistant. The BIM strain DGCC7710RH2 has a new spacer (Sn) in the CRISPR locus, which shows a 100% identity with respect to the phage sequence. In step (b) the strain with phage 858 is challenged and a strain resistant to phage is selected. In step (c) the experiment was repeated independently and another mutant was selected. The CRISPR I locus of the mutant has an additional spacer (different from that present in RH1) that shares 100% identity with the region 17125-17.244 bp of the phage.
Figura 7Figure 7
Organización de los espaciadores de CRISPR I en diversas cepas de Streptococcus thermophilus. Los números indican la posición del espaciador. Se listan los nombres de las cepas a la izquierda. Las letras indican el tipo del espaciador de CRISPR, en donde los espaciadores idénticos se describen con un código similar de 2 letras. Los espaciadores con polimorfismos de nucleótidos únicos se etiquetan con una combinación idéntica de letras complementada con una etiqueta "prima". Los espaciadores únicos no se describen mediante una combinación de letras y se dejan en blanco.Organization of CRISPR I spacers in different strains of Streptococcus thermophilus. The numbers indicate the position of the spacer. The names of the strains are listed on the left. The letters indicate the type of the CRISPR spacer, where identical spacers are described with a similar 2-letter code. Spacers with single nucleotide polymorphisms are labeled with an identical combination of letters complemented by a "premium" tag. Unique spacers are not described by a combination of letters and are left blank.
Figura 8Figure 8
Homología de los espaciadores de CRISPR con secuencias conocidas, incluyendo secuencias cromosómicas bacterianas (sombreadas en gris), secuencias de plásmido de ADN (cuadrados negros) y secuencias genómicas fágicas (sombreadas en negro).Homology of CRISPR spacers with known sequences, including bacterial chromosomal sequences (shaded in gray), plasmid DNA sequences (black squares) and phage genomic sequences (shaded in black).
Figura 9Figure 9
Representación gráfica del sistema plásmido utilizado para manipular genéticamente varios constructos en Streptococcus thermophilus tal como describen Russell M.W. y T.R. Klaenhammer (2001) Efficient system for directed integration into the Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus gasseri chromosomes via homologous recombination, Applied and Environmental Microbiology 67:4361-4364.Graphical representation of the plasmid system used to genetically manipulate various constructs in Streptococcus thermophilus as described by Russell M.W. and T.R. Klaenhammer (2001) Efficient system for directed integration into the Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus gasseri chromosomes via homologous recombination, Applied and Environmental Microbiology 67: 4361-4364.
Figura 10Figure 10
Representación gráfica del plásmido utilizado para subclonar productos de PCR de los diversos constructos indicados en la presente memoria (cas1 KO, cas4 KO, RT y S1S2). El plásmido se encuentra comercializado por Invitrogen en el kit TOPO TA Cloning® .Graphical representation of the plasmid used to subclone PCR products of the various constructs indicated herein (cas1 KO, cas4 KO, RT and S1S2). The plasmid is marketed by Invitrogen in the TOPO TA Cloning® kit.
Figura 11Figure 11
Representación gráfica del plásmido utilizado para la recombinación homóloga en una forma de realización de la presente invención.Graphical representation of the plasmid used for homologous recombination in an embodiment of the present invention.
Figura 12Figure 12
Representación gráfica que ilustra la preparación del constructo CAS1KO en el que se ha interrumpido el gen cas1 mediante recombinación homóloga.Graphic representation illustrating the preparation of the CAS1KO construct in which the cas1 gene has been disrupted by homologous recombination.
Figura 13Figure 13
Representación gráfica que ilustra la preparación del constructo CAS4KO en el que se ha interrumpido el gen cas4 mediante recombinación homóloga.Graphic representation illustrating the preparation of the CAS4KO construct in which the cas4 gene has been disrupted by homologous recombination.
Figura 14Figure 14
Representación gráfica que ilustra la manipulación del constructo S1S2 utilizando cebadores específicos y reacciones de PCR iterativa. El primer panel ilustra todos los cebadores utilizados y la organización utilizada para las dos primeras reacciones de PCR (reacción nº 1 con los cebadores P1 y P2, y la reacción nº 2 con los cebadores P2 y P3). El segundo panel muestra que los productos de PCR obtenidos de las dos primeras reacciones de PCR, presentando el producto de la reacción nº 1 en la parte izquierda y el producto de la reacción nº 2 en la parte derecha. El tercer panel muestra la tercera reacción de PCR, utilizando una combinación de los productos de las dos primeras PCR como el molde para la tercera reacción de PCR, y el cebador P1 de la primera reacción conjuntamente con el cebador P4 de la segunda reacción. El cuarto panel muestra el producto de la PCR nº 3, que técnicamente genera el constructo S1S2.Graphical representation illustrating the manipulation of the S1S2 construct using specific primers and iterative PCR reactions. The first panel illustrates all the primers used and the organization used for the first two PCR reactions (reaction # 1 with primers P1 and P2, and reaction # 2 with primers P2 and P3). The second panel shows that the PCR products obtained from the first two PCR reactions, presenting the product of reaction # 1 on the left side and the product of reaction # 2 on the right side. The third panel shows the third PCR reaction, using a combination of the products of the first two PCRs as the template for the third PCR reaction, and the P1 primer of the first reaction together with the P4 primer of the second reaction. The fourth panel shows the product of PCR No. 3, which technically generates the S1S2 construct.
Figura 15Figure 15
Representación gráfica de los detalles para el diseño de los cebadores 2 y 3, que contienen secuencias clave para el experimento, derivado de espaciadores idénticos a las secuencias fágicas (los productos de PCR derivados de dichos cebadores de PCR generarán los espaciadores que finalmente proporcionarán resistencia a los fagos).Graphic representation of the details for the design of primers 2 and 3, which contain key sequences for the experiment, derived from spacers identical to the phage sequences (the PCR products derived from said PCR primers will generate the spacers that will eventually provide resistance to the phages)
Figura 16Figure 16
Representación gráfica de la integración del constructo S1S2.Graphical representation of the S1S2 construct integration.
Figura 17Figure 17
Representación gráfica de la preparación del constructo RT utilizando un enzima de restricción para generar el constructo RT a partir del constructo S1S2. Existen sitios de restricción BglI dentro de las repeticiones, permitiendo el corte de la parte "intermedia" del constructo. Tras la digestión enzimática, se utilizó una ligasa para empalmar entre sí los dos trozos terminales, generando de esta manera un nuevo constructo que presenta RT, pero que no presenta espaciadores.Graphical representation of the preparation of the RT construct using a restriction enzyme to generate the RT construct from the S1S2 construct. There are BglI restriction sites within the repetitions, allowing the "intermediate" part of the construct to be cut. After enzymatic digestion, a ligase was used to splice the two terminal pieces together, thus generating a new construct that presents RT, but does not have spacers.
Figura 18Figure 18
Representación gráfica de la integración del constructo RT.Graphical representation of the RT construct integration.
Figura 19Figure 19
Representación gráfica del constructo RT'.Graphical representation of the RT 'construct.
Figura 20Figure 20
Representación gráfica del constructo RT'.Graphical representation of the RT 'construct.
LOCUS CRISPRLOCUS CRISPR
Los loci CRISPR son una clase claramente distinguible de repeticiones de secuencia corta intercaladas (SSR) que fueron reconocidas por primera vez en E. coli (Ishino et al., J. Bacteriol. 169:5429-5433, 1987; Nakata et al., J. Bacteriol. 171:3553-3556, 1989). Se han identificado SSR intercaladas similares en Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena y Mycobacterium tuberculosis (Groenen et al., Mol. Microbiol. 10:1057-1065, 1993; Hoe et al., Emerg. Infect. Dis. 5:254-263, 1999; Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30, 1996; Mojica et al., Mol. Microbiol. 17:85-93, 1995). Los loci CRISPR difieren de otros SSR en la estructura de las repeticiones, que se han denominado repeticiones cortas uniformemente espaciadas (SRSR) (Janssen et al., OMICS J. Integ. Biol. 6:23-33, 2002; Mojica et al., Mol. Microbiol. 36:244-246, 2000). Las repeticiones son elementos cortos que existen en agrupaciones, que en todos los casos se presentan espaciados uniformemente por secuencias intermedias únicas de una longitud constante (Mojica et al., Mol. Microbiol. 36:244-246, 2000). Aunque las secuencias de repetición se encuentran altamente conservadas entre cepas, el número de repeticiones intercaladas y las secuencias de las regiones intercaladas difieren de cepa a cepa (van Embden et al., J. Bacteriol. 182:2393-2401, 2000).CRISPR loci are a clearly distinguishable class of intercalated short sequence repeats (SSRs) that were first recognized in E. coli (Ishino et al., J. Bacteriol. 169: 5429-5433, 1987; Nakata et al., J. Bacteriol. 171: 3553-3556, 1989). Similar interleaved SSRs have been identified in Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena and Mycobacterium tuberculosis (Groenen et al., Mol. Microbiol. 10: 1057-1065, 1993; Hoe et al., Emerg. Infect. Dis. 5: 254- 263, 1999; Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1307: 26-30, 1996; Mojica et al., Mol. Microbiol. 17: 85-93, 1995). CRISPR loci differ from other SSRs in the structure of repetitions, which have been called uniformly spaced short repetitions (SRSR) (Janssen et al., OMICS J. Integ. Biol. 6: 23-33, 2002; Mojica et al. , Mol. Microbiol. 36: 244-246, 2000). Repetitions are short elements that exist in clusters, which in all cases are uniformly spaced by single intermediate sequences of a constant length (Mojica et al., Mol. Microbiol. 36: 244-246, 2000). Although the repetition sequences are highly conserved among strains, the number of intercalated repetitions and the intercalated region sequences differ from strain to strain (van Embden et al., J. Bacteriol. 182: 2393-2401, 2000).
Las características estructurales comunes de los loci CRISPR han sido descritas por Jansen et al., 2002: (i) presencia de múltiples repeticiones directas cortas, que muestran muy poca o ninguna variación de secuencia dentro de un locus dado,The common structural characteristics of the CRISPR loci have been described by Jansen et al., 2002: (i) presence of multiple short direct repeats, which show very little or no sequence variation within a given locus,
(ii) presencia de secuencias espaciadoras no repetidas entre las repeticiones de tamaño similar, (iii) presencia de una secuencia líder común de unos cuantos cientos de pares de bases en la mayoría de especies que incluyen múltiples loci CRISPR, (iv) ausencia de marcos de lectura abierta largos dentro del locus, e (v) presencia de uno o más genes cas.(ii) presence of non-repeated spacer sequences between repetitions of similar size, (iii) presence of a common leader sequence of a few hundred base pairs in most species that include multiple CRISPR loci, (iv) absence of frames long open reading within the locus, and (v) presence of one or more cas genes.
Los CRISPR típicamente son secuencias cortas parcialmente palindrómicas de 24 a 40 pb que contienen repeticiones internas y terminales invertidas de hasta 11 pb. Aunque se han detectado elementos aislados, generalmente se encuentra organizados en agrupaciones (de hasta aproximadamente 20 ó más en cada genoma) de unidades repetidas espaciadas por secuencias intercaladas únicas de 20 a 58 pb. Los CRISPR generalmente son homogéneos en un genoma dado, siendo la mayoría idénticos. Sin embargo, existen ejemplos de heterogeneidad en, por ejemplo, las arqueobacteriasCRISPRs are typically short palindromic short sequences of 24 to 40 bp containing internal repeats and inverted terminals of up to 11 bp. Although isolated elements have been detected, they are usually organized in clusters (of up to about 20 or more in each genome) of repeated units spaced by unique interleaved sequences of 20 to 58 bp. CRISPRs are generally homogeneous in a given genome, the majority being identical. However, there are examples of heterogeneity in, for example, archeobacteria.
(Mojica et al., 2000).(Mojica et al., 2000).
A título de ejemplo, el genoma de Streptococcus thermophilus LMG18311 contiene 3 loci CRISPR; las secuencias repetidas de 36 pb son diferentes en CRISPR1 (34 repeticiones), CRISPR2 (5 repeticiones) y CRISPR3 (una única secuencia). Sin embargo, se encuentran perfectamente conservadas dentro de cada locus. Las repeticiones CRISPR1 y CRISPR2 se encuentran interespaciadas por 33 y 4 secuencias de 30 pb de longitud, respectivamente. Todas dichas secuencias interespaciadoras son diferentes entre sí. También son diferentes de las que se encuentran en la cepa CNRZ1066 (41 secuencias interespaciadoras en CRISPR1) y en la cepa LMD-9 (16 dentro de CRISPR1 y 8 dentro de CRISPR3), siendo ambos S. thermophilus. La figura 1 describe uno de los CRISPR identificados en S. thermophilus.By way of example, the genome of Streptococcus thermophilus LMG18311 contains 3 CRISPR loci; the repeated sequences of 36 bp are different in CRISPR1 (34 repetitions), CRISPR2 (5 repetitions) and CRISPR3 (a single sequence). However, they are perfectly preserved within each locus. The CRISPR1 and CRISPR2 repeats are interspaced by 33 and 4 sequences of 30 bp in length, respectively. All such interspacing sequences are different from each other. They are also different from those found in strain CNRZ1066 (41 interspacing sequences in CRISPR1) and in strain LMD-9 (16 within CRISPR1 and 8 within CRISPR3), both being S. thermophilus. Figure 1 describes one of the CRISPR identified in S. thermophilus.
Diversos métodos para identificar los loci CRISPR ya son conocidos en la técnica. A título de ejemplo, Jensen et al., 2002, describen un enfoque de tipo computerizado en el que se buscan secuencias de nucleótidos para encontrar motivos CRISPR utilizando el programa PATSCAN en el servidor de la Mathematics and Computer Science Division del Argonne National Laboratory, Argonne, IL, USA. El algoritmo que se utilizó para identificar los motivos CRISPR era p1 = a... bc...d p1 c...d p1 c ... d p1, en los que a y b son el límite inferior y superior de tamaño de la repetición y de p1, y c y d son el límite inferior y superior de tamaño de las secuencias espaciadoras. Los valores de a, b, c y d pueden modificarse entre aproximadamente 15 y aproximadamente 70 pb a incrementos de aproximadamente 5 pb.Various methods to identify CRISPR loci are already known in the art. As an example, Jensen et al., 2002, describe a computerized approach in which nucleotide sequences are sought to find CRISPR motifs using the PATSCAN program on the Mathematics and Computer Science Division server of the Argonne National Laboratory, Argonne , IL, USA. The algorithm used to identify the CRISPR motifs was p1 = a ... bc ... d p1 c ... d p1 c ... d p1, in which a and b are the lower and upper limit of the size of the repetition and of p1, ycyd are the lower and upper limit of spacer sequence size. The values of a, b, c and d can be modified between about 15 and about 70 bp at increments of about 5 bp.
Los loci CRISPR pueden identificarse utilizando gráficos de puntos (utilizando, por ejemplo, un programa informático denominado Dotter).CRISPR loci can be identified using dot graphs (using, for example, a computer program called Dotter).
Puede llevarse a cabo un análisis de similitud de secuencias utilizando diversos métodos bien conocidos en la técnica. A título de ejemplo, el análisis puede llevarse a cabo utilizando NCBI BLAST con una base de datos de genomas microbianos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) y GenBank.A sequence similarity analysis can be carried out using various methods well known in the art. As an example, the analysis can be carried out using NCBI BLAST with a database of microbial genomes (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) and GenBank.
La amplificación de los loci CRISPR ha sido descrita en, por ejemplo, Mojica et al., 2005, y en Pourcel et al., 2005. La amplificación de la región deseada del ADN puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El término "amplificación" se refiere en la presente memoria a la producción de copias adicionales de una secuencia de ácidos nucleicos. Ésta se lleva a cabo generalmente utilizando tecnologías de PCR bien conocidas en la técnica (Dieffenbach y Dveksler, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York, 1995).The amplification of the CRISPR loci has been described in, for example, Mojica et al., 2005, and in Pourcel et al., 2005. The amplification of the desired region of the DNA can be carried out by any method known in the art, including polymerase chain reaction (PCR). The term "amplification" refers herein to the production of additional copies of a nucleic acid sequence. This is generally carried out using PCR technologies well known in the art (Dieffenbach and Dveksler, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York, 1995).
La expresión "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" se refiere en la presente memoria a un método tal como el dado a conocer en las patentes US nº 4.683.195 y nº 4.683.202, que describen un método para incrementar la concentración de un segmento de una secuencia diana en una mezcla de ADN genómico sin clonación ni purificación. La longitud del segmento amplificado de la secuencia diana deseada se determina a partir de las posiciones relativas de dos cebadores oligonucleótidos y, por lo tanto, esta longitud es un parámetro controlable. En virtud del aspecto de repetición del procedimiento, el método se denomina "PCR". Debido a que los segmentos amplificados deseados de la secuencia diana se convierten en las secuencias predominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que han sido "amplificadas mediante PCR".The term "polymerase chain reaction" or "PCR" refers herein to a method such as that disclosed in US Pat. Nos. 4,683,195 and 4,683,202, which describe a method for increasing the concentration of a segment of a target sequence in a mixture of genomic DNA without cloning or purification. The length of the amplified segment of the desired target sequence is determined from the relative positions of two oligonucleotide primers and, therefore, this length is a controllable parameter. Under the repetition aspect of the procedure, the method is called "PCR." Because the desired amplified segments of the target sequence become the predominant sequences (in terms of concentration) in the mixture, they are said to have been "amplified by PCR."
En el enfoque de la PCR, los cebadores oligonucleótidos pueden diseñarse para la utilización en reacciones de PCR para amplificar la totalidad o parte de un locus CRISPR. El término "cebador" se refiere en la presente memoria a un oligonucleótido, de origen natural, tal como en un digerido de restricción purificado, o producido sintéticamente, que puede actuar como punto de inicio de síntesis al someterlo bajo condiciones en las que la síntesis de un producto de extensión de cebador que es complementario a una cadena de ácidos nucleicos resulta inducida (es decir, en presencia de nucleótidos y un agente inductor, tal como ADN polimerasa, y una temperatura y pH adecuados). El cebador puede ser de una cadena para máxima eficiencia de la amplificación, aunque alternativamente puede ser de doble cadena. En el caso de que sea de doble cadena, el cebador en primer lugar se trata para separar sus cadenas antes de utilizarse para preparar los productos de extensión. El cebador puede ser un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de los productos de extensión en presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los cebadores dependen de muchos factores, incluyendo la temperatura, la fuente del cebador y la utilización del método. Los cebadores de PCR típicamente presentan una longitud de aproximadamente 10 nucleótidos, y más típicamente de por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos.In the PCR approach, oligonucleotide primers can be designed for use in PCR reactions to amplify all or part of a CRISPR locus. The term "primer" refers herein to an oligonucleotide, of natural origin, such as a purified, or synthetically produced restriction digest, which can act as a starting point of synthesis by subjecting it under conditions in which the synthesis of a primer extension product that is complementary to a nucleic acid chain is induced (i.e., in the presence of nucleotides and an inducing agent, such as DNA polymerase, and a suitable temperature and pH). The primer can be a single chain for maximum amplification efficiency, although it can alternatively be a double chain. In the case that it is double-stranded, the primer is first treated to separate its chains before being used to prepare the extension products. The primer can be an oligodeoxyribonucleotide. The primer must be long enough to prime the synthesis of the extension products in the presence of the inducing agent. The exact lengths of the primers depend on many factors, including the temperature, the source of the primer and the use of the method. PCR primers typically have a length of about 10 nucleotides, and more typically of at least about 20 nucleotides.
Los métodos para diseñar cebadores de PCR y la clonación mediante PCR son generalmente conocidos en la técnica y se dan a conocer en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, 1989; ver también Innis et al., editores, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York, 1990); Innis y Gelfand, editores, PCR Strategies (Academic Press, New York), 1995; e Innis y Gelfand, editores, PCR Methods Manual (Academic Press, New York), 1999). Entre los métodos de PCR conocidos están comprendidos de manera no limitativa, los métodos que utilizan cebadores apareados, los cebadores anidados, los cebadores específicos únicos, los cebadores degenerados, los cebadores específicos de un gen, los cebadores específicos de un vector, los cebadores parcialmente desapareados, y similares.Methods for designing PCR primers and PCR cloning are generally known in the art and are disclosed in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, 1989; see also Innis et al., Editors, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York, 1990); Innis and Gelfand, editors, PCR Strategies (Academic Press, New York), 1995; and Innis and Gelfand, editors, PCR Methods Manual (Academic Press, New York), 1999). Known PCR methods include, but are not limited to, methods that use paired primers, nested primers, unique specific primers, degenerate primers, specific gene primers, specific vector primers, partially primers missing, and the like.
Los loci CRISPR pueden comprender, estar constituidos o esencialmente constituidos por ADN o ARN de origen genómico, sintético o recombinante.CRISPR loci may comprise, be constituted or essentially constituted by DNA or RNA of genomic, synthetic or recombinant origin.
Los loci CRISPR pueden ser de doble cadena o de una cadena, representando la cadena sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas.The CRISPR loci can be double stranded or single stranded, representing the sense chain or the antisense chain or combinations thereof.
Los loci CRISPR pueden prepararse mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante (por ejemplo ADN recombinante), tal como se describe en la presente memoria.CRISPR loci can be prepared by using recombinant DNA techniques (eg recombinant DNA), as described herein.
Las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria pueden obtenerse de bases de datos, tales como GenBank o el sitio de internet de JGI en http://genome-jgipsf.org/mic_home.html.The nucleotide sequences described herein can be obtained from databases, such as GenBank or the JGI website at http://genome-jgipsf.org/mic_home.html.
ORIENTACIÓN DE CRISPRCRISPR GUIDANCE
Para evitar dudas, en el contexto de la presente invención, el locus CRISPR se orienta de la manera siguiente.For the avoidance of doubt, in the context of the present invention, the CRISPR locus is oriented as follows.
El líder de CRISPR es un segmento de ADN conservado de tamaño definido. Por ejemplo, la secuencia líder de S. thermophilus CRISPR1 es el segmento de ADN que se inicia inmediatamente después del codón de parada del gen str0660, y que finaliza inmediatamente antes de la primera repetición. El líder de CRISPR se localiza en el extremo 5' del locus CRISPR. El líder de CRISPR se localiza inmediatamente cadena arriba de la primera repetición CRISPR del locus CRISPR.The leader of CRISPR is a segment of conserved DNA of defined size. For example, the leading S. thermophilus CRISPR1 sequence is the segment of DNA that begins immediately after the stop codon of the str0660 gene, and ends immediately before the first repetition. The CRISPR leader is located at the 5 'end of the CRISPR locus. The CRISPR leader is located immediately upstream of the first CRISPR repeat of the CRISPR locus.
La secuencia remolque de CRISPR es un segmento de ADN conservado de tamaño definido. Por ejemplo, la secuencia remolque del CRISPR1 de S. thermophilus es el segmento de ADN que se inicia inmediatamente después de la repetición terminal y que finaliza inmediatamente antes del codón de parada del gen str0661 (situado en la cadena de ADN opuesta). La secuencia remolque de CRISPR se localiza en el extremo 3' del locus CRISPR. La secuencia remolque de CRISPR se localiza inmediatamente cadena abajo de la repetición terminal.The trailer sequence of CRISPR is a segment of conserved DNA of defined size. For example, the trailer sequence of the S. thermophilus CRISPR1 is the segment of DNA that begins immediately after the terminal repeat and ends immediately before the stop codon of the str0661 gene (located in the opposite DNA chain). The trailer sequence of CRISPR is located at the 3 'end of the CRISPR locus. The trailer sequence of CRISPR is located immediately downstream of the terminal repetition.
A título de ejemplo, las secuencias líder y remolque de CRISPR en el locus CRISPR1 de Streptococcus thermophilus cepa CNRZ1066 son:As an example, the CRISPR leader and trailer sequences in the CRISPR1 locus of Streptococcus thermophilus strain CNRZ1066 are:
secuencia líder de CRISPR:CRISPR leader sequence:
5'-CAAGGACAGTTATTGATTTTATAATCACTATGTGGGTATAAAAACGTCAAA ATTTCATTTGAG -3'5'-CAAGGACAGTTATTGATTTTATAATCACTATGTGGGTATAAAAACGTCAAA ATTTCATTTGAG -3 '
secuencia remolque de CRISPR:CRISPR trailer sequence:
5'-TTGATTCAACATAAAAAGCCAGTTCAATTGAACTTGGCTTT-3'5'-TTGATTCAACATAAAAAGCCAGTTCAATTGAACTTGGCTTT-3 '
La secuencia líder de CRISPR corresponde a las posiciones 625.038 a 625.100, y la secuencia remolque de CRISPR corresponde a las posiciones 627.845 a 627.885 en el genoma total (CP000024) de Streptococcus thermophilus.The leading sequence of CRISPR corresponds to positions 625.038 to 625.100, and the trailer sequence of CRISPR corresponds to positions 627.845 to 627.885 in the total genome (CP000024) of Streptococcus thermophilus.
Para evitar dudas, el término "cadena arriba" se refiere a la dirección 5', y "cadena abajo" se refiere a la dirección 3'.For the avoidance of doubt, the term "chain up" refers to address 5 ', and "chain down" refers to address 3'.
CASCAS
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "gen cas" presenta el significado convencional utilizado en la técnica y se refiere a uno o más genes cas que generalmente se encuentran acoplados, asociados o se encuentran próximos o son contiguos a loci CRISPR flanqueantes.As used herein, the term "cas gene" has the conventional meaning used in the art and refers to one or more cas genes that are generally coupled, associated or are close to or contiguous to flanking CRISPR loci. .
Se presenta una revisión exhaustiva de la familia de la proteína Cas en Haft et al., Computational Biology 1, 6 e60, 2005. Tal como se describen en dicha referencia, se describen 41 familias génicas asociadas a CRISPR (cas), además de las cuatro familias génicas previamente conocidas. Demuestra que los sistemas CRISPR pertenecen a diferentes clases, con patrones de repetición, conjuntos de genes y rangos de especies diferentes.An exhaustive review of the Cas protein family is presented in Haft et al., Computational Biology 1, 6 e60, 2005. As described in that reference, 41 gene families associated with CRISPR (cas) are described, in addition to the four previously known gene families. It shows that CRISPR systems belong to different classes, with repeating patterns, gene sets and ranges of different species.
El número de genes cas en un locus CRISPR dado puede variar entre especies.The number of cas genes in a given CRISPR locus may vary between species.
En un aspecto, la presente invención se refiere a la utilización de uno o más genesIn one aspect, the present invention relates to the use of one or more genes.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a la utilización de uno o más genes o proteínas cas y uno o más espaciadores de CRISPR para modular la resistencia en una célula (por ejemplo una célula receptora) contra un ácido nucleico dianaIn a further aspect, the present invention relates to the use of one or more cas genes or proteins and one or more CRISPR spacers to modulate resistance in a cell (eg a recipient cell) against a target nucleic acid
En algunas formas de realización, uno o más de los genes y/o proteínas cas puede encontrarse naturalmente en una célula receptora y pueden integrarse o insertarse uno o más espaciadores heterólogos contiguamente a uno o más de los genes o proteínas cas.In some embodiments, one or more of the genes and / or cas proteins may naturally be found in a recipient cell and one or more heterologous spacers may be integrated or inserted contiguously to one or more of the genes or cas proteins.
En algunas formas de realización, apropiadamente uno o más de los genes y/o proteínas cas pueden ser heterólogos respecto a la célula receptora, y uno o más de los espaciadores puede ser homólogo o heterólogo. En este caso, los espaciadores pueden integrarse o insertarse contiguamente a uno o más de los genes o proteínas cas.In some embodiments, appropriately one or more of the genes and / or cas proteins may be heterologous to the recipient cell, and one or more of the spacers may be homologous or heterologous. In this case, the spacers can be integrated or inserted contiguously to one or more of the cas genes or proteins.
En un aspecto, la presente invención se refiere a la utilización de uno o más genesIn one aspect, the present invention relates to the use of one or more genes.
En un aspecto, la presente invención se refiere a la utilización de uno o más genesIn one aspect, the present invention relates to the use of one or more genes.
Las estructuras de CRISPR típicamente se encuentran en la proximidad de cuatro genes denominados cas1 a cas4. La organización más común de estos genes es cas3cas4-cas1-cas2. La proteína Cas3 aparentemente es una helicasa, mientras que Cas4 es similar a la familia RecB de exonucleasas y contiene un motivo rico en cisteínas, que sugiere la unión de ADN. Cas1 generalmente es altamente básica y es la única proteína Cas que se ha encontrado consistentemente en todas las especies que contienen loci CRISPR. Cas2 todavía no ha sido caracterizada. Cas1-4 típicamente se caracterizan por su estrecha proximidad a los loci CRISPR y por su amplia distribución en especies bacterianas y arqueobacterianas. Aunque no todos los genes cas1-4 se encuentran asociados a todos los loci CRISPR, la totalidad presenta múltiples subtipos.CRISPR structures are typically found in the vicinity of four genes called cas1 to cas4. The most common organization of these genes is cas3cas4-cas1-cas2. The Cas3 protein is apparently a helicase, while Cas4 is similar to the RecB family of exonucleases and contains a cysteine-rich motif, which suggests DNA binding. Cas1 is generally highly basic and is the only Cas protein that has been consistently found in all species that contain CRISPR loci. Cas2 has not yet been characterized. Cas1-4 are typically characterized by their close proximity to the CRISPR loci and by their wide distribution in bacterial and archaebacterial species. Although not all cas1-4 genes are associated with all CRISPR loci, the whole has multiple subtypes.
Bolotin et al., 2005, recientemente han informado de otra agrupación de tres genes asociados a estructuras de CRISPR en muchas especies bacterianas, denominadas en la presente memoria cas1B, cas5 y cas6.Bolotin et al., 2005, have recently reported another cluster of three genes associated with CRISPR structures in many bacterial species, referred to herein as cas1B, cas5 and cas6.
El gen cas puede ser cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y/o cas6. En una forma de realización, el gen cas es cas1.The cas gene can be cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 and / or cas6. In one embodiment, the cas gene is cas1.
El gen cas puede ser cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y/o cas6 o un fragmento, variante, homólogo o derivado de los mismos.The cas gene can be cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 and / or cas6 or a fragment, variant, homologue or derivative thereof.
Los genes cas pueden ser cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y/o cas6 o una pluralidad de los mismos o una combinación de los mismos, tal como cas1 y cas2; cas1 y cas3; cas1 y cas4; cas1 y cas1B; cas1 y cas5; cas1 y cas6; cas2 y cas3; cas2 y cas4; cas2 y cas1B; cas2 y cas5; cas2 y cas6; cas3 y cas4; cas3 y cas1B; cas3 y cas5; cas3 y cas6; cas4 y cas1B; cas4 y cas5; cas4 y cas6; cas1B y cas5; cas1B y cas6; cas1, cas2 y cas3; cas1, cas2 y cas4; cas1, cas2 y cas1B; cas1, cas2, cas3 y cas4; cas1, cas2, cas3 y cas1B; cas1, cas2, cas3 y cas5; cas1, cas2, cas3 y cas6; cas1, cas2, cas3, cas4 y cas1B; cas1, cas2, cas3, cas4 y cas5; cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B y cas6; cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5; cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B y cas6; cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y cas6; cas2, cas3 y cas4; cas2, cas3 y cas1B; cas2, cas3 y cas5; cas2, cas3 y cas6; cas2, cas3, cas4 y cas1B; cas2, cas3, cas4, y cas5; cas2, cas3, cas4 y cas6; cas2, cas3, cas4, cas1B y cas5; cas2, cas3, cas4, cas1B y cas6; cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y cas6; cas3, cas4 y cas1B; cas3, cas4 y cas5; cas3, cas4 y cas6; cas3, cas4, cas1B y cas5; cas3, cas4, cas1B y cas6; cas3, cas4, cas1B, cas5 y cas6; cas4, cas1B y cas5; cas4, cas1B y cas6; cas4, cas1B, cas5 y cas6; cas5 y cas6 ó una combinación de los mismos.The cas genes can be cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 and / or cas6 or a plurality thereof or a combination thereof, such as cas1 and cas2; cas1 and cas3; cas1 and cas4; cas1 and cas1B; cas1 and cas5; cas1 and cas6; cas2 and cas3; cas2 and cas4; cas2 and cas1B; cas2 and cas5; cas2 and cas6; cas3 and cas4; cas3 and cas1B; cas3 and cas5; cas3 and cas6; cas4 and cas1B; cas4 and cas5; cas4 and cas6; cas1B and cas5; cas1B and cas6; cas1, cas2 and cas3; cas1, cas2 and cas4; cas1, cas2 and cas1B; cas1, cas2, cas3 and cas4; cas1, cas2, cas3 and cas1B; cas1, cas2, cas3 and cas5; cas1, cas2, cas3 and cas6; cas1, cas2, cas3, cas4 and cas1B; cas1, cas2, cas3, cas4 and cas5; cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B and cas6; cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5; cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B and cas6; cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 and cas6; cas2, cas3 and cas4; cas2, cas3 and cas1B; cas2, cas3 and cas5; cas2, cas3 and cas6; cas2, cas3, cas4 and cas1B; cas2, cas3, cas4, and cas5; cas2, cas3, cas4 and cas6; cas2, cas3, cas4, cas1B and cas5; cas2, cas3, cas4, cas1B and cas6; cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 and cas6; cas3, cas4 and cas1B; cas3, cas4 and cas5; cas3, cas4 and cas6; cas3, cas4, cas1B and cas5; cas3, cas4, cas1B and cas6; cas3, cas4, cas1B, cas5 and cas6; cas4, cas1B and cas5; cas4, cas1B and cas6; cas4, cas1B, cas5 and cas6; cas5 and cas6 or a combination thereof.
Los genes cas pueden ser cas1 y cas2; cas1 y cas3 ; cas1 y cas4 ; cas1 y cas1B; cas1 y cas5; cas1 y cas6 ; cas2 y cas3 ; cas2 y cas4; cas2 y cas1B; cas2 y cas5; cas2 y cas6 ; cas3 y cas4; cas3 y cas1B; cas3 y cas5; cas3 y cas6 ; cas4 y cas1B; cas4 y cas5; cas4 y cas6; cas1B y cas5 o cas1B y cas6, o combinaciones de los mismos.The cas genes can be cas1 and cas2; cas1 and cas3; cas1 and cas4; cas1 and cas1B; cas1 and cas5; cas1 and cas6; cas2 and cas3; cas2 and cas4; cas2 and cas1B; cas2 and cas5; cas2 and cas6; cas3 and cas4; cas3 and cas1B; cas3 and cas5; cas3 and cas6; cas4 and cas1B; cas4 and cas5; cas4 and cas6; cas1B and cas5 or cas1B and cas6, or combinations thereof.
Los genes cas pueden ser cas1, cas2 y cas3 ; cas1, cas2 y cas4 ; cas1, cas2 y cas1B; cas1, cas2, cas3 y cas4 ; cas1, cas2, cas3 y cas1B; cas1, cas2, cas3 y cas5; cas1, cas2, cas3 y cas6; cas1, cas2, cas3, cas4 y cas1B; cas1, cas2, cas3, cas4 y cas5 ; cas1; cas2, cas3, cas4, cas1B y cas6 ; cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B y cas5 ; cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B y cas6; cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y cas6, o combinaciones de los mismos.The cas genes can be cas1, cas2 and cas3; cas1, cas2 and cas4; cas1, cas2 and cas1B; cas1, cas2, cas3 and cas4; cas1, cas2, cas3 and cas1B; cas1, cas2, cas3 and cas5; cas1, cas2, cas3 and cas6; cas1, cas2, cas3, cas4 and cas1B; cas1, cas2, cas3, cas4 and cas5; cas1; cas2, cas3, cas4, cas1B and cas6; cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B and cas5; cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B and cas6; cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 and cas6, or combinations thereof.
Los genes cas pueden ser cas2, cas2, cas3 y cas4; cas2, cas3 y cas1B; cas2, cas3 y cas5; cas2, cas3 y cas6; cas2, cas3, cas4 y cas1B; cas2, cas3, cas4, y cas5; cas2, cas3, cas4 y cas6; cas2, cas3, cas4, cas1B y cas5; cas2, cas3, cas4, cas1B y cas6; cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y cas6, o combinaciones de los mismos.The cas genes can be cas2, cas2, cas3 and cas4; cas2, cas3 and cas1B; cas2, cas3 and cas5; cas2, cas3 and cas6; cas2, cas3, cas4 and cas1B; cas2, cas3, cas4, and cas5; cas2, cas3, cas4 and cas6; cas2, cas3, cas4, cas1B and cas5; cas2, cas3, cas4, cas1B and cas6; cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 and cas6, or combinations thereof.
Los genes cas pueden ser cas3, cas4 y cas1B; cas3, cas4 y cas5; cas3, cas4 y cas6 ; cas3, cas4, cas1B y cas5; cas3, cas4, cas1B y cas6; cas3, cas4, cas1B, cas5 y cas6; cas4, cas1B y cas5; cas4, cas1B y cas6; cas4, cas1B, cas5 y cas6; cas5 y cas6 ó combinaciones de los mismos.The cas genes can be cas3, cas4 and cas1B; cas3, cas4 and cas5; cas3, cas4 and cas6; cas3, cas4, cas1B and cas5; cas3, cas4, cas1B and cas6; cas3, cas4, cas1B, cas5 and cas6; cas4, cas1B and cas5; cas4, cas1B and cas6; cas4, cas1B, cas5 and cas6; cas5 and cas6 or combinations thereof.
El gen cas puede ser uno o más de entre cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y/o cas6 o una pluralidad de los mismos, tal como una pluralidad de 2 genes cas cualesquiera, 3 genes cas cualesquiera, 4 genes cas cualesquiera, 5 genes casThe cas gene may be one or more of cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 and / or cas6 or a plurality thereof, such as a plurality of any 2 genes, any 3 genes, 4 genes. any 5 cas genes
cualesquiera, 6 genes cas cualesquiera o 7 genes cas cualesquiera.any, 6 genes with any or 7 genes with any.
La pluralidad de genes cas puede comprender, estar constituida o estar constituida esencialmente por una pluralidad de los mismos genes cas, tal como 2 genes cas,3 genes cas, 4 genes cas, 5 genes cas, 6 genes cas, 7 genes cas, 8 genes cas, 9 genes cas, 10 genes cas, 15 genes cas, 20 genes cas, 25 genes cas, 30 genes cas, 35 genes cas, 40 genes cas o incluso 50 ó más genes cas.The plurality of cas genes may comprise, be constituted or consist essentially of a plurality of the same cas genes, such as 2 cas genes, 3 cas genes, 4 cas genes, 5 cas genes, 6 cas genes, 7 cas genes, 8 cas genes, 9 cas genes, 10 cas genes, 15 cas genes, 20 cas genes, 25 cas genes, 30 cas genes, 35 cas genes, 40 cas genes or even 50 or more cas genes.
La pluralidad de genes cas puede comprender, estar constituida o constituida esencialmente por una pluralidad de genes cas diferentes, tal como 2 genes cas diferentes, 3 genes cas diferentes, 4 genes cas diferentes, 5 genes cas diferentes, 6 genes cas diferentes, 7 genes cas diferentes, 8 genes cas diferentes, 9 genes cas diferentes, 10 genes cas diferentes, 15 genes cas diferentes, 20 genes cas diferentes, 25 genes cas diferentes, 30 genes cas diferentes, 35 genes cas diferentes, 40 genes cas diferentes o incluso 50 o más genes cas diferentes.The plurality of cas genes may comprise, be constituted or constituted essentially by a plurality of different cas genes, such as 2 different cas genes, 3 different cas genes, 4 different cas genes, 5 different cas genes, 6 different cas genes, 7 genes different cas, 8 different cas genes, 9 different cas genes, 10 different cas genes, 15 different cas genes, 25 different cas genes, 30 different cas genes, 35 different cas genes, 40 different cas genes or even 50 or more different cas genes.
La pluralidad de genes cas puede comprender, estar constituida o constituida esencialmente por una pluralidad de genes cas iguales y/o diferentes, tal como 2 genes cas diferentes, 3 genes cas diferentes, 4 genes cas diferentes, 5 genes cas diferentes, 6 genes cas diferentes, 7 genes cas diferentes, 8 genes cas diferentes, 9 genes cas diferentes, 10 genes cas diferentes, 15 genes cas diferentes, 20 genes cas diferentes, 25 genes cas diferentes, 30 genes cas diferentes, 35 genes cas diferentes, 40 genes cas diferentes, o incluso 50 o más genes cas diferentes. El mismo gen cas puede duplicarse una pluralidad de veces.The plurality of cas genes may comprise, be constituted or constituted essentially by a plurality of the same and / or different cas genes, such as 2 different cas genes, 3 different cas genes, 4 different cas genes, 5 different cas genes, 6 cas genes different, 7 different cas genes, 8 different cas genes, 9 different cas genes, 10 different cas genes, 20 different cas genes, 25 different cas genes, 30 different cas genes, 35 different cas genes, 40 cas genes different, or even 50 or more different cas genes. The same cas gene can be duplicated a plurality of times.
Apropiadamente, la expresión "gen cas" se refiere a una pluralidad de genes cas, tal como entre 2 y 12 genes cas, más preferentemente entre 3 y 11 genes cas, más preferentemente entre 4 y 10 genes cas, más preferentemente entre 4 y 9 genes cas, más preferentemente entre 4 y 8 genes cas, más preferentemente entre 4 y 7 genes cas, tal como 4, 5, 6 ó 7 genes cas.Suitably, the term "cas gene" refers to a plurality of cas genes, such as between 2 and 12 cas genes, more preferably between 3 and 11 cas genes, more preferably between 4 and 10 cas genes, more preferably between 4 and 9 cas genes, more preferably between 4 and 8 cas genes, more preferably between 4 and 7 cas genes, such as 4, 5, 6 or 7 cas genes.
El gen o genes cas puede comprender, estar constituido o consituido esencialmente por ADN o ARN de origen genómico, sintético o recombinante.The cas gene or genes may comprise, be constituted or constituted essentially by DNA or RNA of genomic, synthetic or recombinant origin.
El gen o genes cas puede ser de doble cadena o de una cadena, representando la cadena sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas.The cas gene or genes can be double-stranded or single-stranded, representing the sense chain or the antisense chain or combinations thereof.
El gen o genes cas pueden prepararse mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante (por ejemplo ADN recombinante), tal como se describe en la presente memoria.The cas gene or genes can be prepared by the use of recombinant DNA techniques (eg recombinant DNA), as described herein.
Tal como se describe posteriormente en la presente memoria, el gen cas puede ser un fragmento de un gen cas, indicando de esta manera que el gen cas comprende una fracción de una secuencia de tipo salvaje. Apropiadamente, la secuencia comprende por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%,As described hereinbelow, the cas gene may be a fragment of a cas gene, thus indicating that the cas gene comprises a fraction of a wild-type sequence. Appropriately, the sequence comprises at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%,
o por lo menos 99% de la secuencia de tipo salvaje.or at least 99% of the wild type sequence.
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
3030
3535
4040
45 -2245 -22
Para algunas formas de realización resulta preferido que el gen cas sea el gen cas más próximo a la secuencia líder de la primera repetición CRISPR en el extremo 5' y del locus CRISPR, tal como cas4 o cas6.For some embodiments it is preferred that the cas gene be the closest cas gene to the leading sequence of the first CRISPR repeat at the 5 'end and of the CRISPR locus, such as cas4 or cas6.
La proteína Cas puede ser Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 y/o Cas6.The Cas protein can be Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 and / or Cas6.
La proteína Cas puede ser Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 y/o Cas6 o un fragmento, variante, homólogo o derivado de la misma.The Cas protein can be Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 and / or Cas6 or a fragment, variant, homologue or derivative thereof.
La proteína Cas puede ser Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 y/o Cas6 o una combinación de las mismas, tal como Cas1 y Cas2; Cas1 y Cas3; Cas 1y Cas4; Cas1 y Cas1B; Cas1 y Cas5; Cas1 y Cas6; Cas2 y Cas3; Cas2 y Cas4; Cas2 y Cas1B; Cas2 y Cas5; Cas2 y Cas6; Cas3 y Cas4; Cas3 y Cas1B; Cas3 y Cas5; Cas3 y Cas6; Cas4 y Cas1B; Cas4 y Cas5; Cas4 y Cas6; Cas1By Cas5; Cas1By Cas6; Cas1, Cas2 y Cas3; Cas1, Cas2 y Cas4; Cas1, Cas2 y Cas1B; Cas1, Cas2, Cas3 y Cas4; Cas1, Cas2, Cas3 y Cas1B; Cas1, Cas2, Cas3 y Cas5; Cas1, Cas2, Cas3 y Cas6; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4 y Cas1B; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4 y Cas5; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas6; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas5; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas6; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 y Cas6; Cas2, Cas3 y Cas4; Cas2, Cas3 y Cas1B; Cas2, Cas3 y Cas5; Cas2, Cas3 y Cas6; Cas2, Cas3, Cas4 y Cas1B; Cas2, Cas3, Cas4,y Cas5; Cas2, Cas3, Cas4 y Cas6; Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas5; Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas6; Cas2, Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 y Cas6; Cas3, Cas4 y Cas1B; Cas3, Cas4 y Cas5; Cas3, Cas4 y Cas6; Cas3, Cas4, Cas1By Cas5; Cas3, Cas4, Cas1By Cas6; Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 y Cas6; Cas4, Cas1By Cas5; Cas4, Cas1By Cas6 or Cas4, Cas1B, Cas5 y Cas6, Cas5 y Cas6.The Cas protein can be Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 and / or Cas6 or a combination thereof, such as Cas1 and Cas2; Cas1 and Cas3; Cas 1 and Cas4; Cas1 and Cas1B; Cas1 and Cas5; Cas1 and Cas6; Cas2 and Cas3; Cas2 and Cas4; Cas2 and Cas1B; Cas2 and Cas5; Cas2 and Cas6; Cas3 and Cas4; Cas3 and Cas1B; Cas3 and Cas5; Cas3 and Cas6; Cas4 and Cas1B; Cas4 and Cas5; Cas4 and Cas6; Cas1By Cas5; Cas1By Cas6; Cas1, Cas2 and Cas3; Cas1, Cas2 and Cas4; Cas1, Cas2 and Cas1B; Cas1, Cas2, Cas3 and Cas4; Cas1, Cas2, Cas3 and Cas1B; Cas1, Cas2, Cas3 and Cas5; Cas1, Cas2, Cas3 and Cas6; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4 and Cas1B; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4 and Cas5; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas6; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas5; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas6; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 and Cas6; Cas2, Cas3 and Cas4; Cas2, Cas3 and Cas1B; Cas2, Cas3 and Cas5; Cas2, Cas3 and Cas6; Cas2, Cas3, Cas4 and Cas1B; Cas2, Cas3, Cas4, and Cas5; Cas2, Cas3, Cas4 and Cas6; Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas5; Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas6; Cas2, Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 and Cas6; Cas3, Cas4 and Cas1B; Cas3, Cas4 and Cas5; Cas3, Cas4 and Cas6; Cas3, Cas4, Cas1By Cas5; Cas3, Cas4, Cas1By Cas6; Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 and Cas6; Cas4, Cas1By Cas5; Cas4, Cas1By Cas6 or Cas4, Cas1B, Cas5 and Cas6, Cas5 and Cas6.
La proteína Cas puede ser Cas1 y Cas2; Cas1 y Cas3; Cas1 y Cas4; Cas1 y Cas1B; Cas1 y Cas5; Cas1 y Cas6; Cas2 y Cas3; Cas2 y Cas4; Cas2 y Cas1B; Cas2 y Cas5; Cas2 y Cas6; Cas3 y Cas4; Cas3 y Cas1B; Cas3 y Cas5; Cas3 y Cas6; Cas4 y Cas1B; Cas4 y Cas5; Cas4 y Cas6; Cas1 By Cas5 or Cas1By Cas6 ó combinaciones de los mismos.The Cas protein can be Cas1 and Cas2; Cas1 and Cas3; Cas1 and Cas4; Cas1 and Cas1B; Cas1 and Cas5; Cas1 and Cas6; Cas2 and Cas3; Cas2 and Cas4; Cas2 and Cas1B; Cas2 and Cas5; Cas2 and Cas6; Cas3 and Cas4; Cas3 and Cas1B; Cas3 and Cas5; Cas3 and Cas6; Cas4 and Cas1B; Cas4 and Cas5; Cas4 and Cas6; Cas1 By Cas5 or Cas1By Cas6 or combinations thereof.
La proteína Cas puede ser Cas1, Cas2 y Cas3; Cas1, Cas2 y Cas4; Cas1, Cas2 y Cas1B; Cas1, Cas2, Cas3 y Cas4; Cas1, Cas2, Cas3 y Cas1B Cas1, Cas2, Cas3 y Cas5; Cas1, Cas2, Cas3 y Cas6; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4 y Cas1B; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4 y Cas5; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas6; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas5; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas6; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 y Cas6 o combinaciones de los mismos.The Cas protein can be Cas1, Cas2 and Cas3; Cas1, Cas2 and Cas4; Cas1, Cas2 and Cas1B; Cas1, Cas2, Cas3 and Cas4; Cas1, Cas2, Cas3 and Cas1B Cas1, Cas2, Cas3 and Cas5; Cas1, Cas2, Cas3 and Cas6; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4 and Cas1B; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4 and Cas5; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas6; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas5; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas6; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 and Cas6 or combinations thereof.
La proteína Cas puede ser Cas2, Cas3 y Cas4; Cas2, Cas3 y Cas1B; Cas2, Cas3 y Cas5; Cas2, Cas3 y Cas6; Cas2, Cas3, Cas4 y Cas1B; Cas2, Cas3, Cas4,y Cas5; Cas2, Cas3, Cas4 y Cas6; Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas5; Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas6; Cas2, Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 y Cas6 ó combinaciones de los mismos.The Cas protein can be Cas2, Cas3 and Cas4; Cas2, Cas3 and Cas1B; Cas2, Cas3 and Cas5; Cas2, Cas3 and Cas6; Cas2, Cas3, Cas4 and Cas1B; Cas2, Cas3, Cas4, and Cas5; Cas2, Cas3, Cas4 and Cas6; Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas5; Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas6; Cas2, Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 and Cas6 or combinations thereof.
La proteína Cas puede ser Cas3, Cas4 y Cas1B; Cas3, Cas4 y Cas5; Cas3, Cas4 y Cas6; Cas3, Cas4, Cas1By Cas5; Cas3, Cas4, Cas1By Cas6; Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 y Cas6; Cas4, Cas1By Cas5; Cas4, Cas1By Cas6; Cas4, Cas1B, Cas5 y Cas6; Cas5 y Cas6 ó combinaciones de los mismos.The Cas protein can be Cas3, Cas4 and Cas1B; Cas3, Cas4 and Cas5; Cas3, Cas4 and Cas6; Cas3, Cas4, Cas1By Cas5; Cas3, Cas4, Cas1By Cas6; Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 and Cas6; Cas4, Cas1By Cas5; Cas4, Cas1By Cas6; Cas4, Cas1B, Cas5 and Cas6; Cas5 and Cas6 or combinations thereof.
La proteína Cas puede ser una o más de entre Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 y/o Cas6 ó una pluralidad de los mismos, tal como una pluralidad de 2 genes cas cualesquiera, 3 genes cas cualesquiera, 4 genes cas cualesquiera, 5 genes cas cualesquiera, 6 genes cas cualesquiera o 7 genes cas cualesquiera.The Cas protein may be one or more of Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 and / or Cas6 or a plurality thereof, such as a plurality of any 2 genes, any 3 genes, 4 genes. any, 5 genes to any, 6 genes to any or 7 genes to any.
La pluralidad de proteínas Cas puede comprender, estar constituida o constituida esencialmente por una pluralidad de las mismas proteínas Cas, tal como 2 proteínas Cas, 3 proteínas Cas, 4 proteínas Cas, 5 proteínas Cas, 6 proteínas Cas, 7 proteínas Cas, 8 proteínas Cas, 9 proteínas Cas, 10 proteínas Cas, 15 proteínas Cas, 20 proteínas Cas, 25 proteínas Cas, 30 proteínas Cas, 35 proteínas Cas, 40 proteínas Cas, o incluso 50 ó más proteínas Cas diferentes.The plurality of Cas proteins may comprise, be constituted or constituted essentially by a plurality of the same Cas proteins, such as 2 Cas proteins, 3 Cas proteins, 4 Cas proteins, 5 Cas proteins, 6 Cas proteins, 7 Cas proteins, 8 proteins Cas, 9 Cas proteins, 10 Cas proteins, 15 Cas proteins, 20 Cas proteins, 25 Cas proteins, 30 Cas proteins, 35 Cas proteins, 40 Cas proteins, or even 50 or more different Cas proteins.
La pluralidad de proteínas Cas puede comprender, estar constituida o esencialmente constituida por una pluralidad de las mismas proteínas Cas tales como 2 proteínas Cas, 3 proteínas Cas, 4 proteínas Cas, 5 proteínas Cas, 6 proteínas Cas, 7 proteínas Cas, 8 proteínas Cas, 9 proteínas Cas, 10 proteínas Cas, 15 proteínas Cas, 20 proteínas Cas, 25 proteínas Cas, 30 proteínas Cas, 35 proteínas Cas, 40 proteínas Cas o incluso 50 o más proteínas Cas.The plurality of Cas proteins may comprise, be constituted or essentially constituted by a plurality of the same Cas proteins such as 2 Cas proteins, 3 Cas proteins, 4 Cas proteins, 5 Cas proteins, 6 Cas proteins, 7 Cas proteins, 8 Cas proteins , 9 Cas proteins, 10 Cas proteins, 15 Cas proteins, 20 Cas proteins, 25 Cas proteins, 30 Cas proteins, 35 Cas proteins, 40 Cas proteins or even 50 or more Cas proteins.
La pluralidad de proteínas Cas puede comprender, consistir o consistir esencialmente de una pluralidad de las mismas y/o diferentes proteínas Cas, tal como 2 proteínas Cas diferentes, 3 proteínas Cas diferentes, 4 proteínas Cas diferentes, 5 proteínas Cas diferentes, 6 proteínas Cas diferentes, 7 proteínas Cas diferentes, 8 proteínas Cas diferentes, 9 proteínas Cas diferentes, 10 proteínas Cas diferentes, 15 proteínas Cas diferentes, 20 proteínas Cas diferentes, 25 proteínas Cas diferentes, 30 proteínas Cas diferentes, 35 proteínas Cas diferentes, 40 proteínas Cas diferentes, o incluso 50 o más proteínas Cas diferentes. Las mismas proteínas Cas pueden duplicarse una pluralidad de veces.The plurality of Cas proteins may comprise, consist or consist essentially of a plurality of the same and / or different Cas proteins, such as 2 different Cas proteins, 3 different Cas proteins, 4 different Cas proteins, 5 different Cas proteins, 6 Cas proteins different, 7 different Cas proteins, 8 different Cas proteins, 9 different Cas proteins, 10 different Cas proteins, 15 different Cas proteins, 20 different Cas proteins, 25 different Cas proteins, 30 different Cas proteins, 35 different Cas proteins, 40 Cas proteins different, or even 50 or more different Cas proteins. The same Cas proteins can be duplicated a plurality of times.
Apropiadamente, la expresión "proteína Cas" se refiere a una pluralidad de proteínas Cas, tal como entre 2 y 12 proteínas Cas, más preferentemente entre 3 y 11 proteínas Cas, más preferentemente entre 4 y 10 proteínas Cas, más preferentemente entre 4 y 9 proteínas Cas, más preferentemente entre 4 y 8 proteínas Cas, más preferentemente entre 4 y 7 proteínas Cas, tal como 4, 5, 6 ó 7 proteínas Cas.Suitably, the term "Cas protein" refers to a plurality of Cas proteins, such as between 2 and 12 Cas proteins, more preferably between 3 and 11 Cas proteins, more preferably between 4 and 10 Cas proteins, more preferably between 4 and 9 Cas proteins, more preferably between 4 and 8 Cas proteins, more preferably between 4 and 7 Cas proteins, such as 4, 5, 6 or 7 Cas proteins.
La proteína o proteínas Cas puede encontrarse codificada por un gen cas que puede comprender ADN o ARN de origen genómico, sintético o recombinante.The Cas protein or proteins may be encoded by a cas gene that can comprise DNA or RNA of genomic, synthetic or recombinant origin.
La proteína o proteínas Cas puede encontrarse codificada por un gen cas que puede ser de doble cadena o de una cadena, representando la cadena sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas.The Cas protein or proteins may be encoded by a cas gene that can be double stranded or single stranded, representing the sense chain or the antisense chain or combinations thereof.
La proteína o proteínas Cas puede prepararse mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante (por ejemplo ADN recombinante), tal como se describe en la presente memoria.The Cas protein or proteins can be prepared by using recombinant DNA techniques (for example recombinant DNA), as described herein.
En un aspecto adicional, se proporciona un método para identificar un gen cas para la utilización en la modulación de la resistencia de una célula contra un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) preparar una célula que comprende por lo menos un espaciador de CRISPR y por lo menos dos repeticiones CRISPR, (ii) manipular la célula de manera que comprende por lo menos un gen cas, e (iii) determinar si la célula modula la resistencia contra el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, en donde la modulación de la resistencia de la célula contra el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo es indicativa de que el gen cas puede utilizarse para modular la resistencia de la célula.In a further aspect, a method is provided for identifying a cas gene for use in modulating the resistance of a cell against a target nucleic acid or transcription product thereof, which comprises the following steps: (i) preparing a cell comprising at least one CRISPR spacer and at least two CRISPR repeats, (ii) manipulating the cell so that it comprises at least one cas gene, and (iii) determining whether the cell modulates resistance against the target nucleic acid or transcription product thereof, wherein the modulation of the resistance of the cell against the target nucleic acid or transcription product thereof is indicative that the cas gene can be used to modulate the resistance of the cell.
Puede utilizarse uno o más genes cas para manipular una célula, tal como una célula receptora. En particular, puede utilizarse uno o más genes cas para manipular una célula, tal como una célula receptora, que en combinación con una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR y uno o más espaciadores de CRISPR puede utilizarse para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico dianaOne or more cas genes can be used to manipulate a cell, such as a recipient cell. In particular, one or more cas genes can be used to manipulate a cell, such as a recipient cell, which in combination with one or more, preferably two or more CRISPR repeats and one or more CRISPR spacers can be used to modulate the resistance of a cell. cell against a target nucleic acid
o un producto de transcripción del mismo. A título de ejemplo, el gen o genes cas pueden insertarse en el ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico de una célula, utilizando diversos métodos que son bien conocidos en la técnica. A título de ejemplo adicional, los genes cas pueden utilizarse como molde en el que se modifica (por ejemplo se muta) el ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico, de manera que se crean o se forman genes cas en el ADN de la célula. A título de ejemplo adicional, los genes cas pueden clonarse en un constructo, plásmido o vector y similar que después se transforma en la célula utilizando métodos tales como los indicados en la presente memoria.or a transcription product thereof. By way of example, the cas gene or genes can be inserted into the DNA of a cell (for example a recipient cell), such as plasmid DNA or genomic DNA of a cell, using various methods that are well known in the art. By way of an additional example, the cas genes can be used as a template in which the DNA of a cell (for example a recipient cell), such as plasmid DNA or genomic DNA, is modified (for example), so that create or form cas genes in the cell's DNA. By way of an additional example, the cas genes can be cloned into a construct, plasmid or vector and the like that is then transformed into the cell using methods such as those indicated herein.
Los genes cas pueden comprender o consistir de una agrupación cas seleccionada de entre el grupo constituido por una o más cualesquiera de entre SEC ID nº 461, SEC ID nº 466, SEC ID nº 473, SEC ID nº 478, SEC ID nº 488, SEC ID nº 493, SEC ID nº 498, SEC ID nº 504, SEC ID nº 509 y SEC ID nº 517.The cas genes may comprise or consist of a cas group selected from the group consisting of one or more any of SEQ ID No. 461, SEQ ID No. 466, SEQ ID No. 473, SEQ ID No. 478, SEQ ID No. 488, SEQ ID No. 493, SEQ ID No. 498, SEQ ID No. 504, SEQ ID No. 509 and SEQ ID No. 517.
Los genes cas pueden comprender o estar constituidos por uno o más cualesquiera de entre SEC ID nº 462 a nº 465, nº 467 a nº 472, nº 474 a nº 477, nº 479 a nº 487, nº 489 a nº 492, nº 494 a nº 497, nº 499 a nº 503, nº 505 a nº 508, nº 510 a nº 516 y/o nº 517 a nº 521.Cas genes may comprise or consist of any one or more of SEQ ID NO: 462 to 465, No. 467 to No. 472, No. 474 to No. 477, No. 479 to No. 487, No. 489 to No. 492, No. 494 to No. 497, No. 499 to No. 503, No. 505 to No. 508, No. 510 to No. 516 and / or No. 517 to No. 521.
Apropiadamente, por lo menos un gen o proteína cas se utiliza conjuntamente o en combinación con uno o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR y opcionalmente uno o más espaciadores de CRISPR.Suitably, at least one cas gene or protein is used together or in combination with one or more, preferably two or more CRISPR repeats and optionally one or more CRISPR spacers.
REPETICIÓN CRISPRCRISPR REPETITION
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "repetición CRISPR" presenta el significado convencional utilizado en la técnica, es decir, múltiples repeticiones directas cortas, que muestran una variación de secuencia nula o muy reducida dentro de un locus CRISPR dado.As used herein, the term "CRISPR repeat" has the conventional meaning used in the art, that is, multiple short direct repeats, which show a null or greatly reduced sequence variation within a given CRISPR locus.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "CRISPR" es sinónimo de la expresión "repetición CRISPR".As used herein, the term "CRISPR" is synonymous with the expression "CRISPR repetition."
El número de nucleótidos en una repetición es generalmente de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 40 pares de bases, pero puede ser de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 39 pares de bases, de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 37 pares de bases, de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 35 pares de bases, de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 33 pares de bases, de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 30 pares de bases, aproximadamente 21 a aproximadamente 40 pares de bases, aproximadamente 21 a aproximadamente 39 pares de bases, de entre aproximadamente 21 y aproximadamente 37 pares de bases, de entre aproximadamente 23 y aproximadamente 40 pares de bases, de entre aproximadamente 23 y aproximadamente 39 pares de bases, de entre aproximadamente 23 y aproximadamente 37 pares de bases, de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 40 pares de bases, de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 39 pares de bases, de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 37 pares de bases, de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 35 pares de bases,The number of nucleotides in a repeat is generally between about 20 and about 40 base pairs, but it can be between about 20 and about 39 base pairs, between about 20 and about 37 base pairs, between about 20 and approximately 35 base pairs, between approximately 20 and approximately 33 base pairs, between approximately 20 and approximately 30 base pairs, approximately 21 to approximately 40 base pairs, approximately 21 to approximately 39 base pairs, between approximately 21 and about 37 base pairs, between about 23 and about 40 base pairs, between about 23 and about 39 base pairs, between about 23 and about 37 base pairs, between about 25 and about 40 base pairs , between approximately 25 and approximately 39 base pairs, between approximately 25 and approximately 37 base pairs, between about 25 and about 35 base pairs,
o de aproximadamente 28 ó 29 pares de bases. El número de repeticiones puede encontrarse comprendido en el intervalo de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 140, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 30 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 35 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 40 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 45 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 135, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 130, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 125, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 120, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 115, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 110, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 105, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 95, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 90, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 80, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 70, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 60, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50, de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 140, de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 130, de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 120, de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 110, de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 95, de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 90, de entre aproximadamente 20 y aproximadamente entre aproximadamente 30 y aproximadamente 70, de entre aproximadamente 30 y aproximadamente 60, de entre aproximadamente 30 y aproximadamente 50, de entre aproximadamente 30 y aproximadamente 40, o de aproximadamente 32.or about 28 or 29 base pairs. The number of repetitions may be in the range of between about 1 and about 140, between about 1 and about 100, between about 2 and about 100, between about 5 and about 100, between about 10 and about 100, between about 15 and about 100, between about 20 and about 100, between about 25 and about 100, between about 30 and about 100, between about 35 and about 100, between about 40 and about 100, between approximately 45 and approximately 100, between approximately 50 and approximately 100, between approximately 1 and approximately 135, between approximately 1 and approximately 130, between approximately 1 and approximately 125, between approximately 1 and approximately 120, between approximately 1 and approximately 115, between 1 to about 110, between about 1 and about 105, between about 1 and about 100, between about 1 and about 95, between about 1 and about 90, between about 1 and about 80, between about 1 and about 70, between about 1 and about 60, between about 1 and about 50, between about 10 and about 140, between about 10 and about 130, between about 10 and about 120, between about 10 and about 110, between approximately 10 and approximately 95, between approximately 10 and approximately 90, between approximately 20 and approximately between approximately 30 and approximately 70, between approximately 30 and approximately 60, between approximately 30 and approximately 50, between approximately 30 and about 40, or about 32.
Apropiadamente, el número de nucleótidos en una repetición es generalmente de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 40 pares de bases, aunque puede ser de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 39 pares de bases, de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 37 pares de bases, de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 35 pares de bases, de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 33 pares de bases, de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 30 pares de bases, de entre aproximadamente 21 y aproximadamente 40 pares de bases, de entre aproximadamente 21 y aproximadamente 39 pares de bases, de entre aproximadamente 21 y aproximadamente 37 pares de bases, de entre aproximadamente 23 y aproximadamente 40 pares de bases, de entre aproximadamente 23 y aproximadamente 39 pares de bases, de entre aproximadamente 23 y aproximadamente 37 pares de bases, de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 40 pares de bases, de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 39 pares de bases, de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 37 pares de bases, de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 35 pares de bases, o de aproximadamente 28 ó 29 pares de bases.Suitably, the number of nucleotides in a repeat is generally between about 20 and about 40 base pairs, although it can be between about 20 and about 39 base pairs, between about 20 and about 37 base pairs, between about 20 and about 35 base pairs, between about 20 and about 33 base pairs, between about 20 and about 30 base pairs, between about 21 and about 40 base pairs, between about 21 and about 39 pairs of bases, between approximately 21 and approximately 37 base pairs, between approximately 23 and approximately 40 base pairs, between approximately 23 and approximately 39 base pairs, between approximately 23 and approximately 37 base pairs, between approximately 25 and about 40 base pairs, between about 25 and about 39 pairs of ba ses, between about 25 and about 37 base pairs, between about 25 and about 35 base pairs, or about 28 or 29 base pairs.
Apropiadamente, el número de repeticiones puede encontrarse comprendido en el intervalo de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 140, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 30 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 35 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 40 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 45 y aproximadamente 100, o de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100.Suitably, the number of repetitions may be in the range of between about 2 and about 140, between about 2 and about 100, between about 5 and about 100, between about 10 and about 100, between about 15 and about 100, between approximately 20 and approximately 100, between approximately 25 and approximately 100, between approximately 30 and approximately 100, between approximately 35 and approximately 100, between approximately 40 and approximately 100, between approximately 45 and approximately 100, or between about 50 and about 100.
Apropiadamente, el número de repeticiones puede encontrarse comprendido en el intervalo de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 135, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 130, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 125, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 120, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 115, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 110, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 105, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 95, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 90, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 80, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 70, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 60, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 50, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 40, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 30, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 20, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 9, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 7, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 6, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 4, o de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 3.Suitably, the number of repetitions may be in the range of between about 2 and about 135, between about 2 and about 130, between about 2 and about 125, between about 2 and about 120, between about 2 and about 115, between about 2 and about 110, between about 2 and about 105, between about 2 and about 100, between about 2 and about 95, between about 2 and about 90, between about 2 and about 80, between about 2 and about 70, between about 2 and about 60, between about 2 and about 50, between about 2 and about 40, between about 2 and about 30, between about 2 and about 20, between approximately 2 and approximately 10, between approximately between 2 and about 9, between about 2 and about 8, between about 2 and about 7, between about 2 and about 6, between about 2 and about 5, between about 2 and about 4, or between about 2 and about 3.
La repetición o repeticiones CRISPR pueden comprender, estar constituidas o esencialmente constituidas por ADN o ARN de origen genómico, sintético o recombinante.The CRISPR repeat or repetitions may comprise, be constituted or essentially constituted by DNA or RNA of genomic, synthetic or recombinant origin.
La repetición o repeticiones CRISPR pueden ser de doble cadena o de una cadena, representando la cadena sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas.The CRISPR repetition or repetitions may be double-stranded or single-stranded, representing the sense chain or the antisense chain or combinations thereof.
La repetición o repeticiones CRISPR pueden prepararse mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante (por ejemplo ADN recombinante), tal como se describe en la presente memoria.The CRISPR repeat or repetitions can be prepared by using recombinant DNA techniques (eg recombinant DNA), as described herein.
Puede utilizarse una o más de las repeticiones CRISPR para manipular una célula, tal como una célula receptora. En particular, puede utilizarse una o más, preferentemente dos o más, repeticiones CRISPR para manipular una célula, tal como una célula receptora, que en combinación con uno o más genes o proteínas cas y uno o más espaciadores de CRISPR puede utilizarse para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo. A título de ejemplo, la repetición o repeticiones CRISPR pueden insertarse en el ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico de una célula, utilizando diversos métodos que son bien conocidos en la técnica. A título de ejemplo adicional, la repetición o repeticiones CRISPR pueden utilizarse como molde a partir del que pueden modificarse (por ejemplo mutarse) el ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico, de manera que se crean una o más repeticiones CRISPR o se manipulan en el ADN de la célula. A título de ejemplo adicional, la repetición o repeticiones CRISPR pueden clonarse en un constructo, plásmido o vector y similar, que después se transforma en la célula utilizando métodos tales como los descritos en la presente memoria.One or more of the CRISPR repeats can be used to manipulate a cell, such as a recipient cell. In particular, one or more, preferably two or more, CRISPR repeats can be used to manipulate a cell, such as a recipient cell, which in combination with one or more cas genes or proteins and one or more CRISPR spacers can be used to modulate the resistance of a cell against a target nucleic acid or a transcription product thereof. By way of example, CRISPR repetition or repetitions can be inserted into the DNA of a cell (for example a recipient cell), such as plasmid DNA or genomic DNA of a cell, using various methods that are well known in the art. By way of an additional example, CRISPR repetition or repetitions can be used as a template from which the DNA of a cell (for example a recipient cell), such as plasmid DNA or genomic DNA, can be modified (eg mutated). that one or more CRISPR repeats are created or manipulated in the cell's DNA. By way of an additional example, the CRISPR repeat or repetitions can be cloned into a construct, plasmid or vector and the like, which is then transformed into the cell using methods such as those described herein.
En un aspecto adicional de la presente invención también se proporciona un método para identificar una repetición CRISPR para la utilización en la modulación de la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) preparar una célula que comprende por lo menos un espaciador CRISPR y por lo menos un gen cas, (ii) manipular la célula de manera que contenga una repetición CRISPR, e (iii) determinar si la célula modula la resistencia frente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, en el que la modulación de la resistencia de la célula frente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo es indicativa de que la repetición CRISPR puede utilizarse para modular la resistencia.In a further aspect of the present invention a method is also provided for identifying a CRISPR repeat for use in modulating the resistance of a cell against a target nucleic acid or transcription product thereof, which comprises the following steps: ( i) preparing a cell comprising at least one CRISPR spacer and at least one cas gene, (ii) manipulating the cell so that it contains a CRISPR repeat, and (iii) determining whether the cell modulates resistance to nucleic acid target or transcription product thereof, in which the modulation of the resistance of the cell against the target nucleic acid or transcription product thereof is indicative that the CRISPR repeat can be used to modulate the resistance.
Apropiadamente, se utiliza uno o más genes o proteínas cas conjuntamente o en combinación con uno o más, preferentemente dos o más, repeticiones CRISPR, y opcionalmente uno o más espaciadores de CRISPR. Apropiadamente, por lo menos un gen o proteína cas y la repetición o repeticiones CRISPR forman una combinación funcional tal como se describe posteriormente.Suitably, one or more genes or cas proteins are used together or in combination with one or more, preferably two or more, CRISPR repeats, and optionally one or more CRISPR spacers. Suitably, at least one cas gene or protein and the CRISPR repeat or repetitions form a functional combination as described below.
Un espaciador de CRISPR se encuentra flanqueado por dos repeticiones CRISPR. En otras palabras, un espaciador de CRISPR presenta por lo menos una repetición CRISPR en cada lado.A CRISPR spacer is flanked by two CRISPR repetitions. In other words, a CRISPR spacer has at least one CRISPR repeat on each side.
Las repeticiones CRISPR pueden comprender o consistir de la secuencia de nucleótidos proporcionada una o más cualesquiera de las secuencias SEC ID nº 1 a 22.CRISPR repeats may comprise or consist of the nucleotide sequence provided by one or more of the sequences SEQ ID NO: 1 to 22.
COMBINACIÓN FUNCIONALFUNCTIONAL COMBINATION
Tal como se ha mencionado anteriormente, en el contexto de la presente invención inesperadamente se ha descubierto que un conjunto dado de genes o proteínas cas se asocia en todos los casos con una secuencia repetida dada dentro de un locus CRISPR particular. En otras palabras, los genes o proteínas cas aparentemente son específicos para una repetición de ADN dada, implicando que los genes o proteínas cas y laAs mentioned above, in the context of the present invention it has unexpectedly been discovered that a given set of genes or cas proteins is associated in all cases with a repeated sequence given within a particular CRISPR locus. In other words, the genes or cas proteins are apparently specific for a given DNA repeat, implying that the genes or proteins cas and the
secuencia repetida forman una pareja funcional.Repeated sequence form a functional couple.
Por lo tanto, las combinaciones particulares de uno o más genes o proteínas cas y una o más, preferentemente, dos o más repeticiones CRISPR son utilizadas con el fin de que se confiera resistencia a un espaciador CRISPR contra un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo en una célula (por ejemplo una célula receptora). Por lo tanto, se ha descubierto inesperadamente que no es posible únicamente utilizar cualesquier genes o proteínas cas o cualquier repetición CRISPR. En su lugar, es una característica de la presente invención que la combinación sea funcional.Therefore, particular combinations of one or more genes or cas proteins and one or more, preferably, two or more CRISPR repeats are used in order to confer resistance to a CRISPR spacer against a target nucleic acid or transcription product. thereof in a cell (for example a recipient cell). Therefore, it has been unexpectedly discovered that it is not possible only to use any cas genes or proteins or any CRISPR repeat. Instead, it is a feature of the present invention that the combination be functional.
En el contexto de la combinación de repetición CRISPR-gen o proteína cas descrita en la presente memoria, el término "funcional" se refiere a que la combinación puede proporcionar resistencia frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo al utilizarla conjuntamente con un espaciador de CRISPR que se alinea o es homólogo a un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.In the context of the CRISPR-gene or cas protein repeat combination described herein, the term "functional" refers to the combination being able to provide resistance against a target nucleic acid or a transcription product thereof when used together. with a CRISPR spacer that aligns or is homologous to a target nucleic acid or transcription product thereof.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "combinación funcional de repetición CRISPR-cas" y "combinación funcional de repetición CRISPR-gen ca " incluye una combinación funcional en la que cas es un gen cas o una proteína Cas.As used herein, the expression "CRISPR-cas functional repeat combination" and "CRISPR-ca gene repeat functional combination" includes a functional combination in which cas is a cas gene or a Cas protein.
Apropiadamente, el gen o proteínas cas y/o por lo menos uno, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR proceden o pueden derivarse (preferentemente se derivan) de la misma célula (por ejemplo la misma célula receptora).Suitably, the cas gene and / or at least one, preferably two or more CRISPR repeats, proceed or may be derived (preferably derived) from the same cell (for example the same recipient cell).
En una forma de realización, el término "derivable" es sinónimo del término "obtenible".In one embodiment, the term "derivable" is synonymous with the term "obtainable."
En una forma de realización, el término "derivado" es sinónimo del término "obtenido".In one embodiment, the term "derivative" is synonymous with the term "obtained."
Apropiadamente, por lo menos un gen o proteína cas y/o por lo menos una, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR son derivables (preferentemente se derivan) del mismo locus CRISPR dentro de un genoma o plásmido, preferentemente un genoma o plásmido de la misma cepa, especie o género.Suitably, at least one cas gene or protein and / or at least one, preferably two or more CRISPR repeats are derivable (preferably derived) from the same CRISPR locus within a genome or plasmid, preferably a genome or plasmid thereof. strain, species or genus.
Apropiadamente, por lo menos un gen o proteína cas y/o por lo menos una, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR son derivables (preferentemente se derivan) del mismo locus CRISPR dentro de un único genoma o plásmido, preferentemente un único genoma o plásmido de la misma cepa, especie o género.Suitably, at least one cas gene or protein and / or at least one, preferably two or more CRISPR repeats are derivable (preferably derived) from the same CRISPR locus within a single genome or plasmid, preferably a single genome or plasmid of the same strain, species or genus.
Apropiadamente, por lo menos un gen o proteína cas y por lo menos una, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR se encuentran presentes simultáneamente naturalmente en la misma célula (por ejemplo una célula receptora).Suitably, at least one gene or cas protein and at least one, preferably two or more CRISPR repeats are simultaneously present naturally in the same cell (for example a recipient cell).
Apropiadamente, por lo menos un gen o proteína cas y una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR se encuentran presentes simultáneamente de manera natural en la misma célula (por ejemplo en una célula receptora).Suitably, at least one cas gene or protein and one or more, preferably two or more CRISPR repeats are naturally present simultaneously in the same cell (for example in a recipient cell).
Apropiadamente, por lo menos un gen o proteína cas y una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR se encuentran presentes simultáneamente de manera natural en el mismo genoma de una célula (por ejemplo una célula receptora).Suitably, at least one cas gene or protein and one or more, preferably two or more CRISPR repeats are naturally present simultaneously in the same genome of a cell (for example, a recipient cell).
Apropiadamente, por lo menos un gen o proteína cas y una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR se encuentran presentes naturalmente en el mismo genoma de una cepa, especie o género.Suitably, at least one cas gene or protein and one or more, preferably two or more CRISPR repeats are naturally present in the same genome of a strain, species or genus.
De acuerdo con lo expuesto anteriormente, en un aspecto adicional, se proporciona una combinación o ácido nucleico que consiste esencialmente de por lo menos dos repeticiones CRISPR y por lo menos un gen o proteína cas.In accordance with the foregoing, in a further aspect, a combination or nucleic acid is provided consisting essentially of at least two CRISPR repeats and at least one cas gene or protein.
En una forma de realización, la expresión "está esencialmente constituida por" se refiere a una combinación de por lo menos dos repeticiones CRISPR y por lo menos un gen o proteína cas y excluye por lo menos un componente adicional de un locus CRISPR, tal como la ausencia de uno o más espaciadores CRISPR y/o la ausencia de una o más secuencias líder comunes de un locus CRISPR.In one embodiment, the expression "is essentially constituted by" refers to a combination of at least two CRISPR repeats and at least one cas gene or protein and excludes at least one additional component of a CRISPR locus, such as the absence of one or more CRISPR spacers and / or the absence of one or more common leader sequences of a CRISPR locus.
En una forma de realización, la expresión "está esencialmente constituida por" se refiere a una combinación de por lo menos dos repeticiones CRISPR y por lo menos un gen o proteína cas únicamente y excluye todos los demás componentes de un locus CRISPR, tal como un locus CRISPR presente naturalmente.In one embodiment, the expression "is essentially constituted by" refers to a combination of at least two CRISPR repeats and at least one gene or cas protein only and excludes all other components of a CRISPR locus, such as a CRISPR locus naturally present.
En una forma de realización adicional, la expresión "está esencialmente constituida por" se refiere a una combinación de por lo menos dos repeticiones CRISPR y por lo menos un gen o proteína cas sólo y excluye todos los demás componentes de un locus CRISPR, tal como un locus CRISPR natural.In a further embodiment, the expression "is essentially constituted by" refers to a combination of at least two CRISPR repeats and at least one gene or cas protein only and excludes all other components of a CRISPR locus, such as a natural CRISPR locus.
En una forma de realización adicional, la expresión "está esencialmente constituida por" se refiere a una combinación de por lo menos dos repeticiones CRISPR y por lo menos un gen o proteína cas con la condición de que por lo menos un componente adicional del locus CRISPR natural se encuentre ausente (por ejemplo sustancialmente ausente).In a further embodiment, the expression "is essentially constituted by" refers to a combination of at least two CRISPR repeats and at least one cas gene or protein with the proviso that at least one additional component of the CRISPR locus natural is absent (for example substantially absent).
Apropiadamente, se proporciona una combinación de por lo menos dos repeticiones CRISPR y por lo menos un gen o proteína cas con la condición de que todos los demás componentes del locus CRISPR se encuentren ausentes (por ejemplo sustancialmente ausentes), preferentemente de que la totalidad de los demás componentes del locus CRISPR de la combinación natural de una o más repeticiones CRISPR y uno o más genes cas se encuentre ausente.Suitably, a combination of at least two CRISPR repeats and at least one gene or cas protein is provided provided that all other components of the CRISPR locus are absent (eg substantially absent), preferably that all of the the other components of the CRISPR locus of the natural combination of one or more CRISPR repeats and one or more cas genes are absent.
Apropiadamente, se utiliza por lo menos un gen o proteína cas en combinación o conjuntamente con uno o más espaciadores de CRISPR.Appropriately, at least one cas gene or protein is used in combination or in conjunction with one or more CRISPR spacers.
Apropiadamente, por lo menos un gen o proteína cas se utiliza en combinación o conjuntamente con por lo menos un espaciador de CRISPR y por lo menos uno o más, preferentemente, dos o más repeticiones CRISPR.Suitably, at least one cas gene or protein is used in combination or in conjunction with at least one CRISPR spacer and at least one or more, preferably, two or more CRISPR repeats.
En una forma de realización, el espaciador o espaciadores CRISPR proceden o son derivables (preferentemente se derivan) de un organismo (por ejemplo de un organismo donante) que es diferente de la célula (por ejemplo la célula receptora) a partir de la que proceden o son derivables (preferentemente que se deriva) uno o más genes o proteínas cas y/o una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR.In one embodiment, the CRISPR spacer or spacers originate or are derivable (preferably derived) from an organism (for example from a donor organism) that is different from the cell (for example the recipient cell) from which they originate or are derivable (preferably derived) one or more genes or proteins cas and / or one or more, preferably two or more CRISPR repeats.
Se encuentran contempladas diversas organizaciones de la repetición o repeticiones CRISPR y de por lo menos un gen o proteína cas, tales como las combinaciones funcionales de repeticiones CRISPR-cas.Various CRISPR repeat or repeat organizations and at least one cas gene or protein, such as the functional combinations of CRISPR-cas repeats, are contemplated.
La combinación puede comprender, estar constituida o esencialmente constituida por lo menos por cualquiera de entre 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 repeticiones CRISPR en combinación con cualquiera de entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 genes o proteínas cas, tal como 16 repeticiones CRISPR y 12 genes o proteínas cas, ó 18 repeticiones CRISPR y 20 genes o proteínas cas, o cualquier otra combinación de los mismos.The combination may comprise, be constituted or essentially constituted by at least any of between 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 CRISPR repetitions in combination with any of between 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 genes or cas proteins, such as 16 CRISPR repeats and 12 genes or cas proteins, or 18 CRISPR repeats and 20 cas genes or proteins, or any other combination thereof.
La repetición o repeticiones CRISPR y el gen o genes cas pueden organizarse de diversas maneras.The CRISPR repeat or repetitions and the cas gene or genes can be organized in various ways.
La combinación puede ser cas1-repetición (en la que la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones), cas2-repetición (en la que la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones), cas3-repetición (en la que la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones), cas4-repetición (en la que la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones), cas1B-repetición (en la que la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones), cas5-repetición (en la que la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones), y/o cas6-repetición (en la que la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones).The combination can be cas1-repetition (in which the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions), cas2-repetition (in which the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions), cas3-repetition (in which the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions), cas4-repetition (in which the repetition is so at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions), cas1B-repetition (in which the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions), cas5-repetition (in the that the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions), and / or cas6-repetition (in which the repetition is at least two repetitions , preferably with at least one spacer between repetitions).
El gen cas puede ser cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y/o cas6 o un fragmento, variante, homólogo o derivado del mismo.The cas gene may be cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 and / or cas6 or a fragment, variant, homologue or derivative thereof.
Los genes cas pueden ser cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y/o cas6, o una pluralidad de los mismos o una combinación de los mismos, tal como cas1 y cas2repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1 y cas3-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1 y cas4-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1 y cas6repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2 y cas3-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2 y cas4-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2 y cas6repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3 y cas4-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas4 y cas1Brepetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas4 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas4 y cas6-epetición; (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1B y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1B y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2 y cas3-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2 y cas4-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2 y cas1B-repètición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3 y cas4-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3, cas4 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3, cas4 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5, cas6repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3 y cas4-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3, cas4 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3, cas4 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3, cas4 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3, cas4, cas1B y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3, cas4, cas1B y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3, cas4 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3, cas4 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3, cas4 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3, cas4, cas1B y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3, cas4, cas1B y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3, cas4, cas1B, cas5 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas4, cas1B y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas4, cas1B y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas4, cas1B, cas5 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas5 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones).The cas genes can be cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 and / or cas6, or a plurality thereof or a combination thereof, such as cas1 and cas2repetition (where the repetition is at least two repetitions , preferably with at least one spacer between repetitions); cas1 and cas3-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1 and cas4-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1 and cas1B-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1 and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1 and cas6repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2 and cas3-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2 and cas4-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2 and cas1B-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2 and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2 and cas6repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas3 and cas4-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas3 and cas1B-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas3 and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas3 and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas4 and cas1Brepetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas4 and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas4 and cas6-epetition; (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1B and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1B and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2 and cas3-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2 and cas4-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2 and cas1B-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2, cas3 and cas4-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2, cas3 and cas1B-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2, cas3 and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2, cas3 and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2, cas3, cas4 and cas1B-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2, cas3, cas4 and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5, cas6repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2, cas3 and cas4-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2, cas3 and cas1B-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2, cas3 and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2, cas3 and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2, cas3, cas4 and cas1B-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2, cas3, cas4 and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2, cas3, cas4 and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2, cas3, cas4, cas1B and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2, cas3, cas4, cas1B and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas3, cas4 and cas1B-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas3, cas4 and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas3, cas4 and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas3, cas4, cas1B and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas3, cas4, cas1B and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas3, cas4, cas1B, cas5 and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas4, cas1B and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas4, cas1B and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas4, cas1B, cas5 and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas5 and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions).
Los genes cas pueden ser cas1 y cas2-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1 y cas3-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1 y cas4-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1 y cas1Brepetición(en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2 y cas3-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2 y cas4-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2 y cas1Brepetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3 y cas4-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3 y cas5repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas4 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas4 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas4 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1B y cas5repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones) o cas1B y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones) o combinaciones de los mismos.The cas genes can be cas1 and cas2-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1 and cas3-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1 and cas4-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1 and cas1Brepetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1 and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1 and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2 and cas3-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2 and cas4-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2 and cas1Brepetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2 and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2 and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas3 and cas4-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas3 and cas1B-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas3 and cas5repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas3 and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas4 and cas1B-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas4 and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas4 and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1B and cas5repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions) or cas1B and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between repetitions) or combinations thereof.
Los genes cas pueden ser cas1, cas2 y cas3-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2 y cas4-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3 y cas4-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3, cas4 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones) o combinaciones de los mismos.The cas genes can be cas1, cas2 and cas3-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2 and cas4-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2 and cas1B-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2, cas3 and cas4-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2, cas3 and cas1B-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2, cas3 and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2, cas3 and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2, cas3, cas4 and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions) or combinations thereof.
Los genes cas pueden ser cas2, cas3 y cas4-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3 y cas6-repeticion (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3, cas4 y cas1Brepetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3, cas4 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3, cas4 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3, cas4, cas1B y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3, cas4, cas1B y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones) o combinaciones de los mismos.The cas genes can be cas2, cas3 and cas4-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2, cas3 and cas1B-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2, cas3 and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2, cas3 and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2, cas3, cas4 and cas1Brepetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2, cas3, cas4 and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2, cas3, cas4 and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2, cas3, cas4, cas1B and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2, cas3, cas4, cas1B and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions) or combinations thereof.
Los genes cas pueden ser cas3, cas4 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3, cas4 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3, cas4 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3, cas4, cas1B y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3, cas4, cas1B y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3, cas4, cas1B, cas5 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas4, cas1B y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas4, cas1B y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas4, cas1B, cas5 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas5 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones) o combinaciones de los mismos.The cas genes can be cas3, cas4 and cas1B-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas3, cas4 and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas3, cas4 and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas3, cas4, cas1B and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas3, cas4, cas1B and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas3, cas4, cas1B, cas5 and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas4, cas1B and cas5-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas4, cas1B and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas4, cas1B, cas5 and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions); cas5 and cas6-repetition (where the repetition is at least two repetitions, preferably with at least one spacer between the repetitions) or combinations thereof.
En el caso de que la combinación de un gen cas y una repetición CRISPR comprenda más de un gen cas, se entenderá que la repetición CRISPR puede insertarse en el extremo 3' de los genes cas, en el extremo 5' de los genes cas, o incluso entre los genes cas, con la condición de que por lo menos uno de los genes cas siga siendo funcional.In the event that the combination of a cas gene and a CRISPR repeat comprises more than one cas gene, it will be understood that the CRISPR repeat can be inserted at the 3 'end of the cas genes, at the 5' end of the cas genes, or even among the cas genes, with the proviso that at least one of the cas genes remains functional.
En una forma de realización, puede utilizarse una primera combinación de repetición CRISPR-gen o proteína cas (que comprende por lo menos un gen o proteína cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR, en donde ambos son derivables (preferentemente derivados) del mismo locus CRISPR dentro de un genoma, en combinación con una segunda combinación de repetición CRISPR-gen o proteína cas (que comprende por lo menos un gen o proteína cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR, en donde ambos son derivables (preferentemente derivados) del mismo locus CRISPR o de un locus CRISPR diferente dentro de un genoma). De acuerdo con lo expuesto anteriormente, en la presente forma de realización de la invención, la primera y la segunda combinaciones son derivables (preferentemente derivadas) de los mismos loci CRISPR o de diferentes loci CRISPR dentro de un genoma.In one embodiment, a first CRISPR-gene or cas protein repeat combination (comprising at least one gene or cas protein and at least two CRISPR repeats, where both are derivable (preferably derived) from the same locus can be used CRISPR within a genome, in combination with a second CRISPR-gene or cas protein repeat combination (comprising at least one cas gene or protein and at least two CRISPR repeats, where both are derivable (preferably derived) from it CRISPR locus or a different CRISPR locus within a genome.) In accordance with the foregoing, in the present embodiment of the invention, the first and second combinations are derivable (preferably derived) from the same CRISPR loci or from different CRISPR loci within a genome.
De esta manera, la primera y segunda combinaciones de repetición CRISPR-gen o proteína cas incluso puede proceder de diferentes genomas, tal como de diferentes genomas dentro de la misma agrupación, tal como se describe en mayor detalle en la presente memoria.Thus, the first and second CRISPR-gene or cas protein repeat combinations may even come from different genomes, such as from different genomes within the same cluster, as described in greater detail herein.
En todavía una forma de realización adicional de la presente invención, puede utilizarse unas primera y/o segunda combinaciones de repetición CRISPR-gen o proteína cas (que comprende por lo menos un gen cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR derivables (preferentemente derivadas) del mismo locus CRISPR dentro de un genoma), en combinación con 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 ó más combinaciones de repetición CRISPR-gen o proteína cas (comprendiendo cada una por lo menos un gen o proteína cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR derivables (preferentemente derivadas) de los mismos loci CRISPR o de diferentes loci CRISPR dentro de un genoma). De acuerdo con lo expuesto anteriormente, en la presente forma de realización de la invención, las combinaciones son derivables (preferentemente derivadas) de los mismos loci CRISPR o de diferentes loci CRISPR dentro de un genoma.In still a further embodiment of the present invention, first and / or second CRISPR-gene or cas protein repeat combinations (comprising at least one cas gene and at least two derivative (preferably derived) CRISPR repeats may be used of the same CRISPR locus within a genome), in combination with 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 or more CRISPR-gene or protein cas repeat combinations (each comprising at least one gene or protein cas and at least two CRISPR repeats derivable (preferably derived) from the same CRISPR loci or from different CRISPR loci within a genome). In accordance with the foregoing, in the present embodiment of the invention, the combinations are derivable (preferably derived) from the same CRISPR loci or from different CRISPR loci within a genome.
En una forma de realización adicional de la invención, las combinaciones incluso pueden proceder de genomas diferentes, tal como de genomas diferentes dentro de la misma agrupación, tal como se describe en mayor detalle en la presente memoria.In a further embodiment of the invention, the combinations may even come from different genomes, such as from different genomes within the same grouping, as described in greater detail herein.
En otras palabras, para que la combinación de repetición CRISPR-gen o proteína cas proporcione resistencia, en algunas formas de realización, la repetición o repeticiones CRISPR y el gen o genes, o proteína o proteínas, cas se encuentran presentes simultáneamente de manera natural dentro del mismo locus CRISPR de un genoma. En algunas formas de realización, la(s) repetición(ones) CRISPR y la(s) proteína(s) o gen(es) cas de coocurrencia natural con el mismo locus CRISPR de un genoma. Estas combinaciones funcionales conjuntamente pueden proporcionar resistencia frente a unIn other words, in order for the CRISPR-gene or cas protein repeat combination to provide resistance, in some embodiments, the CRISPR repeat or repeat and the gene or genes, or protein or protein, cas are simultaneously present naturally within from the same CRISPR locus of a genome. In some embodiments, the CRISPR repeat (s) and the natural co-occurrence protein (s) or gene (s) with the same CRISPR locus of a genome. These functional combinations together can provide resistance against a
ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.target nucleic acid or a transcription product thereof.
En un aspecto adicional, se proporciona un método para identificar una combinación funcional de un gen o proteína cas y una repetición CRISPR, que comprende las etapas siguientes: (i) analizar las secuencias (por ejemplo las secuencias de ácidos nucleicos o de proteína) del gen o proteína cas, y la repetición CRISPR, (ii) identificar unaIn a further aspect, a method is provided for identifying a functional combination of a cas gene or protein and a CRISPR repeat, comprising the following steps: (i) analyzing the sequences (for example the nucleic acid or protein sequences) of the cas gene or protein, and CRISPR repeat, (ii) identify a
En un aspecto adicional se proporciona un método para identificar una combinación funcional de un gen o proteína cas y una repetición CRISPR para la utilización en la modulación de la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico dianaIn a further aspect a method is provided to identify a functional combination of a gene or cas protein and a CRISPR repeat for use in modulating the resistance of a cell against a target nucleic acid.
Apropiadamente, las secuencias del gen o proteína cas y la repetición CRISPR proceden o son derivables (preferentemente se derivan) de la misma cepa o de cepas diferentes.Appropriately, the sequences of the cas gene or protein and the CRISPR repeat come or are derivable (preferably derived) from the same strain or from different strains.
Apropiadamente, las secuencias del gen o proteína cas y la repetición CRISPR proceden o son derivables (preferentemente se derivan) de la misma especie o de especies diferentes.Appropriately, the sequences of the cas gene or protein and the CRISPR repeat come from or are derivable (preferably derived) from the same or different species.
Apropiadamente, las secuencias del gen o proteína cas y la repetición CRISPR se derivan o son derivables (preferentemente se derivan) del mismo género o de géneros diferentes.Appropriately, the sequences of the cas gene or protein and the CRISPR repeat are derived or derivable (preferably derived) from the same genus or from different genera.
Apropiadamente, las secuencias del gen o proteína cas y la repetición CRISPR se derivan o son derivables (preferentemente se derivan) del mismo organismo o de organismos diferentes.Appropriately, the sequences of the cas gene or protein and the CRISPR repeat are derived or derivable (preferably derived) from the same organism or from different organisms.
Apropiadamente, el análisis se lleva a cabo utilizando análisis de gráficos de puntos.Appropriately, the analysis is carried out using point graph analysis.
La combinación puede estar constituida, o esencialmente constituida por ADN o ARN de origen genómico, sintético o recombinante.The combination may be constituted, or essentially constituted by DNA or RNA of genomic, synthetic or recombinant origin.
La combinación puede estar constituida, o esencialmente constituida por ADN y ARN de origen genómico, sintético o recombinante.The combination may be constituted, or essentially constituted by DNA and RNA of genomic, synthetic or recombinant origin.
La combinación puede estar constituida, o esencialmente constituida por una repetición CRISPR de ADN de origen genómico, sintético o recombinante.The combination may be constituted, or essentially constituted by a CRISPR repeat of DNA of genomic, synthetic or recombinant origin.
La combinación puede estar constituida, o esencialmente constituida por una repetición CRISPR de ARN de origen genómico, sintético o recombinante.The combination may be constituted, or essentially constituted by a CRISPR repeat of RNA of genomic, synthetic or recombinant origin.
La combinación puede estar constituida, o esencialmente constituida por un gen cas de ADN de origen genómico, sintético o recombinante.The combination may be constituted, or essentially constituted by a DNA gene of genomic, synthetic or recombinant origin.
La combinación puede estar constituida, o esencialmente constituida por gen cas de ARN de origen genómico, sintético o recombinante.The combination may be constituted, or essentially constituted by RNA cas gene of genomic, synthetic or recombinant origin.
La combinación puede estar constituida, o esencialmente constituida por una repetición CRISPR de ADN y un gen cas de ADN de origen genómico, sintético o recombinante.The combination may be constituted, or essentially constituted by a CRISPR repeat of DNA and a DNA gene of genomic, synthetic or recombinant origin.
La combinación puede estar constituida, o esencialmente constituida por una repetición CRISPR de ADN y un gen cas de ARN de origen genómico, sintético o recombinante.The combination may be constituted, or essentially constituted by a CRISPR repeat of DNA and an RNA cas gene of genomic, synthetic or recombinant origin.
La combinación puede estar constituida, o esencialmente constituida por una repetición CRISPR de ARN y un gen cas de ADN de origen genómico, sintético o recombinante.The combination may be constituted, or essentially constituted by a CRISPR repeat of RNA and a DNA cas gene of genomic, synthetic or recombinant origin.
La combinación puede estar constituida, o esencialmente constituida por una repetición CRISPR de ARN y un gen cas de ARN de origen genómico, sintético o recombinante.The combination may be constituted, or essentially constituted by a CRISPR repeat of RNA and an RNA cas gene of genomic, synthetic or recombinant origin.
La repetición CRISPR puede ser de doble cadena o de una cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas.The CRISPR repetition can be double stranded or single stranded, representing the sense chain or the antisense chain or combinations thereof.
El gen cas puede ser de doble cadena o de una cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido, o combinaciones de las mismas.The cas gene can be double stranded or single stranded, representing the sense chain or the antisense chain, or combinations thereof.
La repetición CRISPR puede ser de doble cadena o de una cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas, y el gen cas puede ser de doble cadena o de una cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas.The CRISPR repetition can be double-stranded or single-stranded, representing the sense chain or antisense chain or combinations thereof, and the cas gene can be double-stranded or single-stranded, representing the sense or strand chain. antisense or combinations thereof.
La repetición CRISPR puede ser de doble cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas, y el gen cas puede ser de doble cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas.The CRISPR repeat may be double-stranded, representing the sense chain or the antisense chain or combinations thereof, and the cas gene may be double-stranded, representing the sense chain or the antisense chain or combinations thereof.
La repetición CRISPR puede ser de doble cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas, y el gen cas puede ser de una cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas.The CRISPR repetition may be double stranded, representing the sense chain or the antisense chain or combinations thereof, and the cas gene may be a chain, representing the sense chain or the antisense chain or combinations thereof.
La repetición CRISPR puede ser de una cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas, y el gen cas puede ser de doble cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas.The CRISPR repetition can be of a chain, representing the sense chain or the antisense chain or combinations thereof, and the cas gene can be double chain, representing the sense chain or the antisense chain or combinations thereof.
La repetición CRISPR puede ser de una cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas, y el gen cas puede ser de una cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas.The CRISPR repetition can be from a chain, representing the sense chain or the antisense chain or combinations thereof, and the cas gene can be from a chain, representing the sense chain or the antisense chain or combinations thereof.
Pueden utilizarse una o más de las combinaciones funcionales indicadas anteriormente para manipular una célula, tal como una célula receptora. En particular, puede utilizarse una o más combinaciones funcionales para manipular una célula, tal como una célula receptora, que en combinación con uno o más espaciadores de CRISPR pueden utilizarse para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo. A título de ejemplo, pueden insertarse combinaciones funcionales en el ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico de una célula, utilizando diversos métodos que son bien conocidos en la técnica. A título de ejemplo adicional, pueden utilizarse las combinaciones funcionales como molde en el que modificar (por ejemplo mutar) el ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico, de manera que se creen combinaciones funcionales en el ADN de la célula. A título de ejemplo adicional, pueden clonarse combinaciones funcionales en un constructo, plásmido o vector y similar que después se transformen en la célula, utilizando métodos tales como los descritos en la presente memoria.One or more of the functional combinations indicated above may be used to manipulate a cell, such as a recipient cell. In particular, one or more functional combinations can be used to manipulate a cell, such as a recipient cell, which in combination with one or more CRISPR spacers can be used to modulate the resistance of a cell against a target nucleic acid or transcription product of the same. By way of example, functional combinations can be inserted into the DNA of a cell (for example a recipient cell), such as plasmid DNA or genomic DNA of a cell, using various methods that are well known in the art. As a further example, functional combinations can be used as a template in which to modify (for example, mutate) the DNA of a cell (for example a recipient cell), such as plasmid DNA or genomic DNA, so that combinations are created functional in the cell's DNA. By way of an additional example, functional combinations can be cloned into a construct, plasmid or vector and the like that are then transformed into the cell, using methods such as those described herein.
En una forma de realización, la combinación funcional se obtiene o es obtenible mediante un método que comprende las etapas siguientes: (a) analizar las secuencias de un gen cas y una repetición CRISPR, (b) identificar una o más agrupaciones de genes cas, (c) identificar una o más agrupaciones de repeticiones CRISPR, y (d) combinar las secuencias de gen cas y de repetición CRISPR que se encuentran en la misma agrupación, en la que la combinación de las secuencias de gen cas y de repetición CRISPR dentro de la misma agrupación es indicativa de que la combinación es una combinación funcional.In one embodiment, the functional combination is obtained or obtainable by a method comprising the following steps: (a) analyze the sequences of a cas gene and a CRISPR repeat, (b) identify one or more clusters of cas genes, (c) identify one or more CRISPR repeat clusters, and (d) combine the CRISPR cas and repeat sequences found in the same cluster, in which the combination of the CRISPR cas and repeat sequences within of the same grouping is indicative that the combination is a functional combination.
Se describen agrupaciones con mayor detalle a continuación.Clusters are described in more detail below.
ESPACIADOR DE CRISPRCRISPR SPACER
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "espaciador de CRISPR" presenta el significado convencional utilizado en la técnica y se refiere a secuencias espaciadoras no repetitivas que se encuentran entre múltiples repeticiones directas cortas (es decir, repeticiones CRISPR) de loci CRISPR. En otras palabras, se encuentra un espaciador de CRISPR entre dos repeticiones CRISPR.As used herein, the term "CRISPR spacer" presents the conventional meaning used in the art and refers to non-repetitive spacer sequences that are between multiple short direct repeats (ie, CRISPR repeats) of CRISPR loci . In other words, a CRISPR spacer is found between two CRISPR repetitions.
Se ha encontrado que las secuencias espaciadoras de CRISPR en los procariotas con frecuencia presentan similitudes significativas con una diversidad de moléculas de ADN, tales como elementos genéticos (incluyendo, aunque sin limitación, cromosomas, bacteriófagos y plásmidos conjugativos). Resulta interesante que las células que portan dichos espaciadores de CRISPR son incapaces de ser infectados por moléculas de ADN que contienen secuencias homólogas a los espaciadores (Mojica et al., 2005).It has been found that CRISPR spacer sequences in prokaryotes often have significant similarities with a variety of DNA molecules, such as genetic elements (including, but not limited to, chromosomes, bacteriophages, and conjugative plasmids). Interestingly, the cells that carry such CRISPR spacers are unable to be infected by DNA molecules that contain sequences homologous to the spacers (Mojica et al., 2005).
Típicamente, el espaciador de CRISPR se encuentra naturalmente presente entre dos repeticiones directas cortas múltiples idénticas que son palindrómicas.Typically, the CRISPR spacer is naturally present between two identical multiple short direct repeats that are palindromic.
Apropiadamente, el espaciador de CRISPR es homólogo del ácido nucleico diana o del producto de transcripción del mismo de una secuencia identificada. Aunque la homología también puede considerarse en términos de similitud, en el contexto de la presente invención resulta preferido expresar la homología en términos de identidad de secuencia. Se considera que una secuencia homóloga incluye un espaciador de CRISPR, que puede ser por lo menos 70, 75, 80, 85 ó 90% idéntica, o por lo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99% idéntica a la secuencia de ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo o a una secuencia identificada.Appropriately, the CRISPR spacer is homologous to the target nucleic acid or transcription product thereof of an identified sequence. Although homology can also be considered in terms of similarity, in the context of the present invention it is preferred to express homology in terms of sequence identity. A homologous sequence is considered to include a CRISPR spacer, which may be at least 70, 75, 80, 85 or 90% identical, or at least 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 or 99% identical to the target nucleic acid sequence or to a transcription product thereof or to an identified sequence.
En algunas formas de realización, el espaciador de CRISPR es 100% idéntico a la secuencia de ácido nucleico diana.In some embodiments, the CRISPR spacer is 100% identical to the target nucleic acid sequence.
El número de espaciadores de CRISPR en un locus o en loci CRISPR dados puede variar entre especies.The number of CRISPR spacers in a given locus or in CRISPR loci may vary between species.
Apropiadamente, el número de espaciadores puede encontrarse comprendido entre aproximadamente 1 y aproximadamente 140, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 100, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 100, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100, entre aproximadamente 15 y aproximadamente 100, entre aproximadamente 20 y aproximadamente 100, entre aproximadamente 25 y aproximadamente 100, entre aproximadamente 30 y aproximadamente 100, entre aproximadamente 35 y aproximadamente 100, entre aproximadamente 40 y aproximadamente 100, entre aproximadamente 45 y aproximadamente 100 ó entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100.Suitably, the number of spacers can be comprised between about 1 and about 140, between about 1 and about 100, between about 2 and about 100, between about 5 and about 100, between about 10 and about 100, between about 15 and about 100 , between about 20 and about 100, between about 25 and about 100, between about 30 and about 100, between about 35 and about 100, between about 40 and about 100, between about 45 and about 100 or between about 50 and about 100.
Apropiadamente, el número de espaciadores puede encontrarse comprendido en el intervalo de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 135, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 130, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 125, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 120, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 115, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 110, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 105, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 95, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 90, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 80, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 70, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 60, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 40, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 30, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 9, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 8, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 7, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 6, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 4, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 3 o de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 2.Suitably, the number of spacers can be in the range of between about 1 and about 135, between about 1 and about 130, between about 1 and about 125, between about 1 and about 120, between about 1 and about 115, between about 1 and about 110, between about 1 and about 105, between about 1 and about 100, between about 1 and about 95, between about 1 and about 90, between about 1 and about 80, between about 1 and about 70, between about 1 and about 60, between about 1 and about 50, between about 1 and about 40, between about 1 and about 30, between about 1 and about 20, between approximately 1 and approximately 10, between approximately between 1 and about 9, between about 1 and about 8, between about 1 and about 7, between about 1 and about 6, between about 1 and about 5, between about 1 and about 4, between about 1 and about 3 or between about 1 and about 2.
Típicamente los espaciadores de CRISPR se identifican mediante análisis de secuencias como los tramos de ADN situados entre dos repeticiones.Typically, CRISPR spacers are identified by sequence analysis as the stretches of DNA located between two repetitions.
Tal como se describe en la presente memoria, en el contexto de la presente invención inesperadamente se ha descubierto que la utilización de uno o más genes o proteínas cas en combinación con una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR (preferentemente la combinación o combinaciones de las mismas) permite proporcionar la especificidad de inmunidad por parte de uno o más espaciadores de CRISPR en una célula, tal como una célula receptora.As described herein, in the context of the present invention it has unexpectedly been discovered that the use of one or more genes or cas proteins in combination with one or more, preferably two or more CRISPR repeats (preferably the combination or combinations thereof) allows the specificity of immunity to be provided by one or more CRISPR spacers in a cell, such as a recipient cell.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "especificidad de inmunidad" se refiere a que la inmunidad puede proporcionarse contra una secuencia de ácido nucleico específica o producto de transcripción de la misma utilizando una secuencia específica de espaciador de CRISPR específico (o de seudoespaciador de CRISPR). De acuerdo con lo anterior, un espaciador dado de CRISPR no proporciona resistencia frente a ninguna secuencia de ácido nucleico o producto de transcripción de la misma, sino únicamente frente a las secuencias que son homólogas del espaciador de CRISPR (o del seudoespaciador de CRISPR), tal como 100% idénticas.As used herein, the term "immunity specificity" refers to the fact that immunity can be provided against a specific nucleic acid sequence or transcription product thereof using a specific CRISPR spacer sequence (or of pseudo spacer of CRISPR). According to the above, a given CRISPR spacer does not provide resistance against any nucleic acid sequence or transcription product thereof, but only against sequences that are homologous to the CRISPR spacer (or CRISPR pseudo-spacer), such as 100% identical.
El espaciador o espaciadores CRISPR pueden derivarse o ser derivables (preferentemente derivarse) de un organismo, tal como un organismo donante, que es diferente a la célula, tal como la célula receptora o incluso un organismo donante adicional, a partir del que por lo menos un gen o proteína cas y/o una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR se derivan o son derivables (preferentemente se derivan). Los espaciadores de CRISPR pueden derivarse o ser derivables (preferentemente se derivan) de un organismo, tal como un organismo donante, que es heterólogo respecto a la célula, tal como la célula receptora o incluso un organismo donante adicional, a partir del que se derivan o son derivables (preferentemente se derivan) uno o más genes o proteínas cas y/o una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR. Por lo menos un gen o proteína cas y/o una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR puede derivarse o puede ser derivable (preferentemente se deriva) de una célula homóloga (es decir la misma), tal como una célula receptora homóloga.The CRISPR spacer or spacers may be derived or derivable (preferably derived) from an organism, such as a donor organism, which is different from the cell, such as the recipient cell or even an additional donor organism, from which at least a cas gene or protein and / or one or more, preferably two or more CRISPR repeats are derived or derivable (preferably derived). CRISPR spacers can be derived or derivable (preferably derived) from an organism, such as a donor organism, which is heterologous to the cell, such as the recipient cell or even an additional donor organism, from which they are derived. or are derivable (preferably derived) one or more genes or proteins cas and / or one or more, preferably two or more CRISPR repeats. At least one cas gene or protein and / or one or more, preferably two or more CRISPR repeats can be derived or can be derived (preferably derived) from a homologous cell (ie the same), such as a homologous receptor cell.
Para evitar dudas, el espaciador o espaciadores de CRISPR pueden diseñarse y producirse sintéticamente (por ejemplo utilizando técnicas de ADN recombinante).For the avoidance of doubt, the CRISPR spacer or spacers can be designed and produced synthetically (for example using recombinant DNA techniques).
En una forma de realización, los espaciadores de CRISPR son heterólogos (es decir diferentes) respecto a la célula, tal como la célula receptora, a partir de la que se derivan o son derivables (preferentemente se derivan) uno o más genes o proteínas cas y/o una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR, y por lo menos un gen o proteína cas y/o una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR se derivan o son derivables (preferentemente se derivan) de una célula homóloga, tal como una célula receptora homóloga.In one embodiment, the CRISPR spacers are heterologous (ie different) with respect to the cell, such as the recipient cell, from which they are derived or are derivable (preferably derived) one or more genes or proteins cas and / or one or more, preferably two or more CRISPR repeats, and at least one cas gene or protein and / or one or more, preferably two or more CRISPR repeats are derived or derivable (preferably derived) from a homologous cell , such as a homologous receptor cell.
En otra forma de realización, los espaciadores de CRISPR son heterólogos (es decir, diferentes) respecto a la célula, tal como la célula receptora, a partir de la que se derivan o son derivables (preferentemente se derivan).In another embodiment, the CRISPR spacers are heterologous (ie, different) with respect to the cell, such as the recipient cell, from which they are derived or are derivable (preferably derived).
En otra forma de realización, los espaciadores de CRISPR son heterólogos respecto a la célula, tal como la célula receptora, y por lo menos un gen o proteína cas y/o una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR se derivan o son derivables (preferentemente se derivan) de una célula homóloga, tal como una célula receptora homóloga.In another embodiment, the CRISPR spacers are heterologous to the cell, such as the recipient cell, and at least one gene or protein cas and / or one or more, preferably two or more CRISPR repeats are derived or derivable. (preferably derived) from a homologous cell, such as a homologous receptor cell.
En otra forma de realización, los espaciadores de CRISPR son heterólogos respecto a la célula, tal como la célula receptora, mientras que por lo menos un gen o proteína cas y/o una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR son homólogas respecto a la célula, tal como la célula receptora.In another embodiment, the CRISPR spacers are heterologous to the cell, such as the recipient cell, while at least one cas gene or protein and / or one or more, preferably two or more CRISPR repeats are homologous to the cell, such as the recipient cell.
En otra forma de realización, los espaciadores de CRISPR son heterólogos respecto a la célula receptora, mientras que la célula receptora es homóloga respecto a uno o más genes o proteínas cas y/o una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR.In another embodiment, the CRISPR spacers are heterologous to the recipient cell, while the recipient cell is homologous to one or more cas genes and / or one or more, preferably two or more CRISPR repeats.
En otra forma de realización, el espaciador de CRISPR según la presente invención es uno que no se encuentra naturalmente asociado a la repetición CRISPR y/o genes cas y/o combinación funcional de repetición CRISPR-gen cas. En otras palabras, el espaciador de CRISPR en el locus CRISPR recombinante según la presente invención es heterólogo respecto a la repetición CRISPR y/o genes cas del locus CRISPR.In another embodiment, the CRISPR spacer according to the present invention is one that is not naturally associated with CRISPR repeat and / or cas genes and / or CRISPR-gene cas repeat functional combination. In other words, the CRISPR spacer in the recombinant CRISPR locus according to the present invention is heterologous with respect to the CRISPR repeat and / or CRISPR locus cas genes.
Puede utilizarse uno o más espaciadores CRISPR para manipular una célula, tal como una célula receptora. En particular, puede utilizarse uno o más espaciadores CRISPR para manipular una célula, tal como una célula receptora, que en combinación con uno o más genes o proteínas cas y/o una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR (preferentemente una o más combinaciones funcionales de los mismos) pueden utilizarse para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.One or more CRISPR spacers can be used to manipulate a cell, such as a recipient cell. In particular, one or more CRISPR spacers can be used to manipulate a cell, such as a recipient cell, which in combination with one or more genes or proteins cas and / or one or more, preferably two or more CRISPR repeats (preferably one or more functional combinations thereof) can be used to modulate the resistance of a cell against a target nucleic acid or a transcription product thereof.
Apropiadamente puede utilizarse uno o más espaciadores de CRISPR para manipular una célula, tal como una célula receptora. En particular, se utiliza uno o más espaciadores CRISPR para manipular una célula, tal como una célula receptora, que en combinación con uno o más genes o proteínas cas puede utilizarse para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.Suitably one or more CRISPR spacers can be used to manipulate a cell, such as a recipient cell. In particular, one or more CRISPR spacers are used to manipulate a cell, such as a recipient cell, which in combination with one or more cas genes or proteins can be used to modulate the resistance of a cell against a target nucleic acid or product of transcription of it.
A título de ejemplo, los espaciadores CRISPR pueden insertarse en el ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como un ADN de plásmido o ADN genómico de una célula, utilizando diversos métodos que son bien conocidos en la técnica.By way of example, CRISPR spacers can be inserted into the DNA of a cell (for example a recipient cell), such as a plasmid DNA or genomic DNA of a cell, using various methods that are well known in the art.
A título de ejemplo adicional, los espaciadores de CRISPR pueden utilizarse como molde en el que modificar (por ejemplo mutar) el ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico, de manera que se creen espaciadores de CRISPR en el ADN de la célula.By way of an additional example, CRISPR spacers can be used as a template in which to modify (eg mutate) the DNA of a cell (for example a recipient cell), such as plasmid DNA or genomic DNA, so that they are created CRISPR spacers in the cell's DNA.
A título de ejemplo adicional, los espaciadores de CRISPR pueden clonarse en un constructo, plásmido o vector y similar que después se transforma en la célula, utilizandoAs an additional example, CRISPR spacers can be cloned into a construct, plasmid or vector and the like that is then transformed into the cell, using
métodos tales como los descritos en la presente memoria.methods such as those described herein.
En un aspecto adicional, también se proporciona un método para identificar un espaciador CRISPR para la utilización en la modulación de la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) preparar una célula que comprende por lo menos dos repeticiones CRISPR y por lo menos un gen o proteína cas, (ii) identificar por lo menos un espaciador de CRISPR en un organismo, tal como un organismo donante, (iii) modificar la secuencia del espaciador de CRISPR de la célula de manera que presente homología respecto al espaciador de CRISPR del organismo donante que comprende el ácido nucleico diana, e (iv) determinar si la célula modula la resistencia frente al ácido nucleico diana, en la que la modulación de la resistencia de la célula frente al ácido nucleico dianaIn a further aspect, a method is also provided for identifying a CRISPR spacer for use in modulating the resistance of a cell against a target nucleic acid or transcription product thereof, which comprises the following steps: (i) preparing a cell comprising at least two CRISPR repeats and at least one gene or cas protein, (ii) identifying at least one CRISPR spacer in an organism, such as a donor organism, (iii) modifying the spacer sequence of CRISPR of the cell so as to present homology with respect to the CRISPR spacer of the donor organism comprising the target nucleic acid, and (iv) determine whether the cell modulates resistance against the target nucleic acid, in which the modulation of the resistance of the cell against the target nucleic acid
o producto de transcripción del mismo es indicativa de que el espaciador de CRISPR modula la resistencia de la célula frente al ácido nucleico diana.or transcription product thereof is indicative that the CRISPR spacer modulates the resistance of the cell against the target nucleic acid.
Los espaciadores de CRISPR pueden comprender o consistir de la secuencia de nucleótidos proporcionar en una o más cualesquiera de entre las secuencias SEC ID nº 23 a 460 y/o SEC ID nº 522 a 665.The CRISPR spacers may comprise or consist of the nucleotide sequence to provide in any one or more of the sequences SEQ ID NO: 23 to 460 and / or SEQ ID NO: 522 to 665.
Un espaciador de CRISPR se encuentra flanqueado por dos repeticiones CRISPR. En otras palabras, un espaciador de CRISPR presenta por lo menos una repetición CRISPR en cada lado.A CRISPR spacer is flanked by two CRISPR repetitions. In other words, a CRISPR spacer has at least one CRISPR repeat on each side.
Sin pretender restringirse a ninguna teoría en particular, cuanto más alejado se encuentre un espaciador de CRISPR dado del extremo 5' del locus CRISPR (que comprende el gen o genes cas y/o la secuencia líder), menor será la resistencia proporcionada por el espaciador de CRISPR. De acuerdo con lo expuesto anteriormente, en una forma de realización de la presente invención resulta preferente que se modifique uno o más de los primeros 100 espaciadores de CRISPR desde el extremo 5' del locus CRISPR (que comprende los genes cas y/o la secuencia líder), más preferentemente se modifica uno o más de los primeros 50 espaciadores de CRISPR desde el extremo 5' del locus CRISPR (que comprende los genes cas y/o la secuencia líder), más preferentemente se modifica uno o más de los primeros 40 espaciadores de CRISPR desde el extremo 5' del locus CRISPR (que comprende los genes cas y/o la secuencia líder), más preferentemente se modifica uno o más de los primeros 30 espaciadores de CRISPR desde el extremo 5' del locus CRISPR (que comprende los genes cas y/o la secuencia líder), más preferentemente se modifica uno o más de los primeros 20 espaciadores de CRISPR desde el extremo 5' del locus CRISPR (que comprende los genes cas y/o la secuencia líder), más preferentemente se modifica uno o más de los primeros 15 espaciadores de CRISPR desde el extremo 5' del locus CRISPR (que comprende los genes cas y/o la secuencia líder) y más preferentemente se modifica uno o más de los primeros 10 espaciadores de CRISPR desde el extremo 5' del locus CRISPR (que comprende los genes cas y/o la secuencia líder).Without intending to restrict itself to any particular theory, the further a CRISPR spacer is from the 5 'end of the CRISPR locus (which comprises the cas gene or genes and / or the leader sequence), the lower the resistance provided by the spacer. of CRISPR. In accordance with the foregoing, in an embodiment of the present invention it is preferred that one or more of the first 100 CRISPR spacers be modified from the 5 'end of the CRISPR locus (comprising the cas genes and / or the sequence leader), more preferably one or more of the first 50 CRISPR spacers is modified from the 5 'end of the CRISPR locus (comprising the cas genes and / or the leader sequence), more preferably one or more of the first 40 is modified CRISPR spacers from the 5 'end of the CRISPR locus (comprising the cas genes and / or the leader sequence), more preferably one or more of the first 30 CRISPR spacers is modified from the 5' end of the CRISPR locus (comprising the cas genes and / or the leader sequence), more preferably one or more of the first 20 CRISPR spacers is modified from the 5 'end of the CRISPR locus (which comprises the cas genes and / or the leader sequence), more pref One or more of the first 15 CRISPR spacers is erectly modified from the 5 'end of the CRISPR locus (which comprises the cas genes and / or the leader sequence) and more preferably one or more of the first 10 CRISPR spacers is modified from the 5 'end of the CRISPR locus (which comprises the cas genes and / or the leader sequence).
Tal como apreciará el experto en la materia, diferentes bacterias presentan un número diferente de espaciadores de CRISPR.As the person skilled in the art will appreciate, different bacteria have a different number of CRISPR spacers.
NÚCLEO DE ESPACIADOR DE CRISPRCRISPR SPACER CORE
Para un tipo específico de CRISPR en una especie microbiana, el espaciador de CRISPR típicamente se encuentra representado por una longitud predominante definida, aunque el tamaño puede variar. Los tipos de CRISPR descritos hasta hoy se ha encontrado que contienen una longitud predominante de espaciado de entre aproximadamente 20 pb y aproximadamente 58 pb.For a specific type of CRISPR in a microbial species, the CRISPR spacer is typically represented by a predominantly defined length, although the size may vary. The types of CRISPR described to date have been found to contain a predominant spacing length of between about 20 bp and about 58 bp.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "núcleo de espaciador de CRISPR" se refiere a la longitud del espaciador observado más corto dentro de un tipo de CRISPR. De esta manera, a título de ejemplo, dentro del tipo 1 de CRISPR de Streptococcus thermophilus, la longitud predominante de espaciador es de 30 pb, con una minoría de espaciadores de tamaños comprendidos entre 28 pb y 32 pb. Por lo tanto, en el presente ejemplo particular (CRISPR de tipo 1 de S. thermophilus), el núcleo del espaciador de CRISPR se define como un tramo continuo de 28 pb.As used herein, the term "CRISPR spacer core" refers to the length of the spacer observed shorter within a type of CRISPR. Thus, by way of example, within the type 1 of CRISPR of Streptococcus thermophilus, the predominant spacer length is 30 bp, with a minority of spacers of sizes between 28 bp and 32 bp. Therefore, in the present particular example (CRISPR type 1 of S. thermophilus), the core of the CRISPR spacer is defined as a continuous stretch of 28 bp.
Apropiadamente, el núcleo del espaciador de CRISPR es homólogo respecto al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, o una secuencia identificada a lo largo de la longitud de la secuencia de núcleo. Aunque también puede considerarse la homología en términos de similitud, en el contexto de la presente invención resulta preferente expresar la homología en términos de identidad de secuencia. Se considera que una secuencia homóloga incluye un núcleo de espaciador de CRISPR, que puede ser por lo menos 90% idéntico o por lo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99% idéntico a la secuencia de ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo o a una secuencia identificada a lo largo de la longitud de la secuencia de núcleo.Suitably, the CRISPR spacer core is homologous to the target nucleic acid or transcription product thereof, or a sequence identified along the length of the core sequence. Although homology can also be considered in terms of similarity, in the context of the present invention it is preferred to express homology in terms of sequence identity. A homologous sequence is considered to include a CRISPR spacer core, which may be at least 90% identical or at least 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 or 99% identical to the sequence of target nucleic acid or a transcription product thereof or a sequence identified along the length of the core sequence.
Apropiadamente, el núcleo de espaciador de CRISPR es 100% idéntico a la secuencia de ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo o a una secuencia identificada a lo largo de la longitud de la secuencia de núcleo.Suitably, the CRISPR spacer core is 100% identical to the target nucleic acid sequence or to a transcription product thereof or to a sequence identified along the length of the core sequence.
SEUDOESPACIADOR DE CRISPRCRISPR PESO SPACER
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "seudoespaciador de CRISPR" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos presente en un organismo (por ejemplo un organismo donante), tal como un bacteriófago, que resulta preferentemente esencial para el funcionamiento y/o la supervivencia y/o replicación y/o infectividad y similar, y que forma una secuencia espaciadora de CRISPR y/o que puede utilizarse para formar o preparar una secuencia espaciadora de CRISPR que es complementaria u homóloga respecto al seudoespaciador de CRISPR, y/o que puede utilizarse para modular la resistencia.As used herein, the term "CRISPR pseudo-spacer" refers to a nucleic acid sequence present in an organism (for example a donor organism), such as a bacteriophage, which is preferably essential for functioning and / or survival and / or replication and / or infectivity and the like, and that forms a CRISPR spacer sequence and / or that can be used to form or prepare a CRISPR spacer sequence that is complementary or homologous to the CRISPR pseudo spacer, and / or that can be used to modulate the resistance.
Puede utilizarse uno o más seudoespaciadores de CRISPR o uno o más espaciadores de CRISPR que son complementarios u homólogos de uno o más seudoespaciadores de CRISPR para manipular una célula, tal como una célula receptora. En particular, puede utilizarse uno o más seudoespaciadores de CRISPR o espaciadores de CRISPR que sean complementarios u homólogos al espaciador o seudoespaciadores de CRISPR, para manipular una célula, tal como una célula receptora, que en combinación con uno o más genes o proteínas cas y/o una o más repeticiones CRISPR (por ejemplo una o más combinaciones funcionales de los mismos) pueda utilizarse para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo.One or more CRISPR pseudo spacers or one or more CRISPR spacers that are complementary or homologous to one or more CRISPR pseudo spacers can be used to manipulate a cell, such as a recipient cell. In particular, one or more CRISPR pseudo spacers or CRISPR spacers that are complementary or homologous to the CRISPR spacers or pseudo spacers can be used to manipulate a cell, such as a recipient cell, that in combination with one or more genes or cas proteins and / or one or more CRISPR repeats (for example one or more functional combinations thereof) can be used to modulate the resistance of a cell against a target nucleic acid or a transcription product thereof.
Puede utilizarse uno o más seudoespaciadores de CRISPR o uno o más espaciadores de CRISPR que sean complementarios u homólogos de uno o más seudoespaciadores de CRISPR para manipular una célula, tal como una célula receptora, que en combinación con uno o más genes o proteínas cas puede utilizarse para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo.One or more CRISPR pseudo spacers or one or more CRISPR spacers that are complementary or homologous to one or more CRISPR pseudo spacers can be used to manipulate a cell, such as a recipient cell, which in combination with one or more genes or cas proteins can used to modulate the resistance of a cell against a target nucleic acid or a transcription product thereof.
A título de ejemplo, los seudoespaciadores de CRISPR o el espaciador o espaciadores de CRISPR que son complementarios u homólogos de uno o más seudoespaciadores de CRISPR pueden insertarse en el ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como un ADN de plásmido o ADN genómico de una célula, utilizando diversos métodos que son bien conocidos en la técnica.By way of example, CRISPR pseudo spacers or CRISPR spacers or spacers that are complementary or homologous to one or more CRISPR pseudo spacers can be inserted into the DNA of a cell (for example a recipient cell), such as a plasmid DNA or genomic DNA of a cell, using various methods that are well known in the art.
A título de ejemplo adicional, los seudoespaciadores de CRISPR pueden utilizarse como molde en el que modificar (por ejemplo mutar) el ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico, de manera que se creen espaciadores de CRISPR en el ADN de la célula. A título de ejemplo adicional, pueden clonarse en un constructo, plásmido o vector, o similar, seudoespaciadores de CRISPR o uno o más espaciadores de CRISPR que sean complementarios u homólogos de uno o más seudoespaciadores de CRISPR, que después se transforman en una célula, utilizando métodos tales como los descritos en la presente memoria.By way of an additional example, CRISPR pseudo-spacers can be used as a template in which to modify (eg mutate) the DNA of a cell (for example a recipient cell), such as plasmid DNA or genomic DNA, so that they are created CRISPR spacers in the cell's DNA. By way of an additional example, they can be cloned into a construct, plasmid or vector, or the like, CRISPR pseudo spacers or one or more CRISPR spacers that are complementary or homologous to one or more CRISPR pseudo spacers, which are then transformed into a cell, using methods such as those described herein.
SECUENCIA DE ÁCIDOS NUCLEICOSSEQUENCE OF NUCLEIC ACIDS
En un aspecto adicional se proporciona una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo una secuencia de ácido nucleico recombinante o aislada) que está esencialmente constituida por lo menos por un gen o proteína cas.In a further aspect a nucleic acid sequence (for example a recombinant or isolated nucleic acid sequence) is provided which is essentially constituted by at least one cas gene or protein.
La secuencia de ácido nucleico puede ser ADN o ARN de origen genómico, sintético o recombinante, por ejemplo ADNc. La secuencia de nucleótidos puede ser de doble cadena o de una cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas. Las secuencias de ácidos nucleicos recombinantes pueden prepararse mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante, tal como se describe en la presente memoria. La secuencia de ácidos nucleicos diana puede ser un gen o derivarse de un gen.The nucleic acid sequence may be DNA or RNA of genomic, synthetic or recombinant origin, for example cDNA. The nucleotide sequence may be double stranded or single stranded, representing the sense chain or the antisense chain or combinations thereof. The recombinant nucleic acid sequences can be prepared by utilizing recombinant DNA techniques, as described herein. The target nucleic acid sequence can be a gene or be derived from a gene.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "que está esencialmente constituida por" en el contexto de la secuencia de ácido nucleico se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende uno o más genes cas y que excluye por lo menos un componente adicional de un locus CRISPR, tal como las repeticiones CRISPR, los espaciadores de CRISPR y/o la secuencia líder común.As used herein, the term "which is essentially constituted by" in the context of the nucleic acid sequence refers to a nucleic acid sequence that comprises one or more cas genes and that excludes at least one component. Additional CRISPR locus, such as CRISPR repeats, CRISPR spacers and / or the common leader sequence.
De acuerdo con lo expuesto anteriormente, en una forma de realización se proporciona una secuencia de ácido nucleico que está esencialmente constituida por lo menos por un gen cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR.In accordance with the foregoing, in one embodiment a nucleic acid sequence is provided that is essentially constituted by at least one cas gene and at least two CRISPR repeats.
En una forma de realización adicional, se proporciona una secuencia de ácido nucleico que está esencialmente constituida por lo menos por un gen cas y por lo menos un espaciador de CRISPR.In a further embodiment, a nucleic acid sequence is provided that is essentially comprised of at least one cas gene and at least one CRISPR spacer.
En una forma de realización adicional se proporciona una secuencia de ácido nucleico que consiste esencialmente de por lo menos un gen cas, por lo menos un espaciador de CRISPR y por lo menos dos repeticiones CRISPR.In a further embodiment, a nucleic acid sequence is provided consisting essentially of at least one cas gene, at least one CRISPR spacer and at least two CRISPR repeats.
En una forma realización adicional se proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos un gen cas, con la condición de que por lo menos un componente adicional de un locus CRISPR se encuentre ausente, apropiadamente, con la condición de que por lo menos un componente adicional de un locus CRISPR natural se encuentre ausente (por ejemplo sustancialmente ausente).In a further embodiment, a nucleic acid sequence is provided comprising at least one cas gene, with the proviso that at least one additional component of a CRISPR locus is properly absent, provided that at least an additional component of a natural CRISPR locus is absent (for example substantially absent).
En una forma de realización adicional se proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos un gen cas, con la condición de que los espaciadores de CRISPR del locus CRISPR se encuentre ausentes, apropiadamente con la condición de que los espaciadores de CRISPR de un locus CRISPR natural se encuentren ausentes (por ejemplo sustancialmente ausentes).In a further embodiment, a nucleic acid sequence is provided comprising at least one cas gene, with the proviso that the CRISPR spacers of the CRISPR locus are absent, properly provided that the CRISPR spacers of a Natural CRISPR locus are absent (for example substantially absent).
En una forma de realización adicional se proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos un gen cas, con la condición de que las repeticiones CRISPR del locus CRISPR se encuentre ausentes, apropiadamente con la condición de que las repeticiones CRISPR de un locus CRISPR natural se encuentren ausentes.In a further embodiment, a nucleic acid sequence is provided comprising at least one cas gene, with the proviso that the CRISPR repeats of the CRISPR locus are absent, properly provided that the CRISPR repeats of a CRISPR locus Natural are absent.
En una forma de realización adicional se proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos un gen cas, con la condición de que las secuencias líder comunes del locus CRISPR se encuentren ausentes, apropiadamente con la condición de que las secuencias líder comunes del locus CRISPR natural se encuentren ausentes.In a further embodiment, a nucleic acid sequence comprising at least one cas gene is provided, with the proviso that the common leader sequences of the CRISPR locus are absent, appropriately with the proviso that the common leader sequences of the locus Natural CRISPR are absent.
En una forma de realización adicional se proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos un gen cas, con la condición de que los espaciadores de CRISPR y las repeticiones CRISPR del locus CRISPR se encuentren ausentes, apropiadamente con la condición de que los espaciadores de CRISPR y las repeticiones CRISPR del locus CRISPR natural se encuentren ausentes.In a further embodiment, a nucleic acid sequence is provided comprising at least one cas gene, with the proviso that the CRISPR spacers and the CRISPR repeats of the CRISPR locus are absent, appropriately with the condition that the spacers of CRISPR and the CRISPR repetitions of the natural CRISPR locus are absent.
En una forma de realización adicional se proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos un gen cas, con la condición de que los espaciadores de CRISPR y las secuencias líder comunes del locus CRISPR se encuentren ausentes, apropiadamente con la condición de que los espaciadores de CRISPR y las secuencias líder comunes del locus CRISPR natural se encuentren ausentes.In a further embodiment, a nucleic acid sequence is provided comprising at least one cas gene, with the proviso that CRISPR spacers and the common leader sequences of the CRISPR locus are absent, appropriately provided that CRISPR spacers and the common leader sequences of the natural CRISPR locus are absent.
En una forma de realización adicional se proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos un gen cas, con la condición de que las repeticiones CRISPR y las secuencias líder comunes del locus CRISPR se encuentren ausentes, apropiadamente con la condición de que las repeticiones CRISPR y lasIn a further embodiment, a nucleic acid sequence is provided comprising at least one cas gene, with the proviso that the CRISPR repeats and the common leader sequences of the CRISPR locus are absent, appropriately with the condition that the repetitions CRISPR and the
secuencias líder comunes del locus CRISPR natural se encuentren ausentes.Common leader sequences of the natural CRISPR locus are absent.
En una forma de realización adicional se proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos un gen cas, con la condición de que las repeticiones CRISPR, los espaciadores de CRISPR y las secuencias líder comunes del locus CRISPR se encuentren ausentes, apropiadamente con la condición de que las repeticiones CRISPR, los espaciadores de CRISPR y las secuencias líder comunes del locus CRISPR natural se encuentren ausentes.In a further embodiment, a nucleic acid sequence is provided comprising at least one cas gene, with the proviso that CRISPR repeats, CRISPR spacers and common leader sequences of the CRISPR locus are absent, appropriately with the condition that the CRISPR repeats, the CRISPR spacers and the common leader sequences of the natural CRISPR locus are absent.
La secuencia de ácido nucleico y los ácidos nucleicos pueden aislarse o purificarse sustancialmente. El término "aislado" o la expresión "sustancialmente purificado" pretenden referirse a que las moléculas de ácido nucleico, o fragmentos o variantes biológicamente activos, homólogos o derivados de los mismos, se encuentran sustancialmente o esencialmente libres de componentes normalmente presentes en asociación con el ácido nucleico en su estado natural. Entre dichos componentes se incluyen otros materiales celulares, medios de cultivo de producción recombinante y diversos compuestos químicos utilizados en la síntesis química de los ácidos nucleicos.The nucleic acid sequence and nucleic acids can be isolated or substantially purified. The term "isolated" or the term "substantially purified" is intended to mean that nucleic acid molecules, or biologically active fragments or variants, homologous or derivatives thereof, are substantially or essentially free of components normally present in association with the nucleic acid in its natural state. Such components include other cellular materials, recombinant production culture media and various chemical compounds used in the chemical synthesis of nucleic acids.
Una secuencia de ácido nucleico o un ácido nucleico "aislado" típicamente se encuentra libre de secuencias de ácido nucleico que flanquean el ácido nucleico de interés en el ADN genómico del organismo a partir del que se deriva el ácido nucleico (tal como secuencias codificantes presentes en los extremos 5' ó 3'). Sin embargo, la molécula puede incluir algunas bases o grupos adicionales que no afectan negativamente a las características básicas de la composición.A nucleic acid sequence or an "isolated" nucleic acid is typically free of nucleic acid sequences flanking the nucleic acid of interest in the genomic DNA of the organism from which the nucleic acid is derived (such as coding sequences present in the 5 'or 3' ends). However, the molecule may include some additional bases or groups that do not adversely affect the basic characteristics of the composition.
La secuencia o secuencias de ácidos nucleicos pueden utilizarse para manipular una célula, tal como una célula receptora. A título de ejemplo, la secuencia de ácido nucleico puede insertarse en el ADN, tal como ADN de plásmido o ADN genómico, de una célula receptora, utilizando métodos tales como la recombinación homóloga. A título de ejemplo adicional, la secuencia o secuencias de ácido nucleico pueden utilizarse como molde en el que modificar (por ejemplo mutar) el ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico, de manera que se crea una o más secuencias de ácido nucleico en el ADN de la célula. A título de ejemplo adicional, la secuencia o secuencias de ácidos nucleicos pueden clonarse en un constructo, plásmido o vector y similar que después se transforma en la célula utilizando métodos tales como los descritos en la presente memoria.The nucleic acid sequence or sequences can be used to manipulate a cell, such as a recipient cell. By way of example, the nucleic acid sequence can be inserted into the DNA, such as plasmid DNA or genomic DNA, of a recipient cell, using methods such as homologous recombination. By way of an additional example, the nucleic acid sequence or sequences can be used as a template in which to modify (eg mutate) the DNA of a cell (for example a recipient cell), such as plasmid DNA or genomic DNA, so that one or more nucleic acid sequences are created in the cell's DNA. By way of an additional example, the nucleic acid sequence or sequences can be cloned into a construct, plasmid or vector and the like that is then transformed into the cell using methods such as those described herein.
Un espaciador de CRISPR se encuentra flanqueado por dos repeticiones CRISPR. En otras palabras, un espaciador de CRISPR presenta por lo menos una repetición CRISPR en cada lado.A CRISPR spacer is flanked by two CRISPR repetitions. In other words, a CRISPR spacer has at least one CRISPR repeat on each side.
SECUENCIA DE ÁCIDO NUCLEICO DIANASEQUENCE OF DIANA NUCLEIC ACID
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "secuencia diana de ácido nucleico" se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico o producto de transcripción de la misma frente a la que debe modularse la resistencia en una célula, tal como una célula receptora.As used herein, the term "nucleic acid target sequence" refers to any nucleic acid sequence or transcription product thereof against which resistance in a cell must be modulated, such as a recipient cell. .
La resistencia puede ser frente a la secuencia de ácido nucleico diana per se.The resistance may be against the target nucleic acid sequence per se.
Ventajosamente, lo expuesto anteriormente proporciona resistencia a una célula frente a un organismo donante a partir del que son derivables (preferentemente que se derivan) uno o más ácidos nucleicos. De esta manera, a título de ejemplo, la inserción de un seudoespaciador de CRISPR derivable (preferentemente derivado) de un bacteriófago o de uno o más espaciadores de CRISPR que son complementarios u homólogos de uno o más seudoespaciadores de CRISPR en una célula, tal como una célula receptora, puede proporcionar resistencia al bacteriófago. De esta manera, a título de ejemplo adicional, la inserción entre dos repeticiones CRISPR de un seudoespaciador de CRISPR derivable (preferentemente derivado) de un bacteriófago o de uno o más espaciadores de CRISPR que son complementarios u homólogos de uno o más seudoespaciadores de CRISPR en una célula, tal como una célula receptora, puede proporcionar resistencia frente al bacteriófago.Advantageously, the foregoing provides resistance to a cell against a donor organism from which one or more nucleic acids are derivable (preferably derived). Thus, by way of example, the insertion of a CRISPR pseudo-spacer derivable (preferably derived) from a bacteriophage or one or more CRISPR spacers that are complementary or homologous to one or more CRISPR pseudo-spacers in a cell, such as a recipient cell can provide resistance to the bacteriophage. Thus, by way of additional example, the insertion between two CRISPR repeats of a pseudo-spacer of CRISPR derivable (preferably derived) from a bacteriophage or one or more CRISPR spacers that are complementary or homologous to one or more pseudo-spacers of CRISPR in A cell, such as a recipient cell, can provide resistance against the bacteriophage.
La resistencia puede ser contra un producto de transcripción de la secuencia diana de ácido nucleico, tal como un transcrito de la secuencia diana de ácido nucleico (por ejemplo un transcrito de ARN (por ejemplo ARNm) (por ejemplo un transcrito de ARN de sentido o antisentido) o incluso un producto de transcripción polipéptido. Ventajosamente, lo expuesto anteriormente proporciona resistencia a una célula frente a un organismo donante a partir del que es derivable (preferentemente que se deriva) el producto de transcripción.The resistance may be against a transcription product of the nucleic acid target sequence, such as a transcript of the nucleic acid target sequence (for example an RNA transcript (for example mRNA) (for example a sense RNA transcript or antisense) or even a polypeptide transcription product Advantageously, the foregoing provides resistance to a cell against a donor organism from which the transcription product is derivable (preferably derived).
La secuencia diana de nucleótidos puede ser ADN o ARN de origen genómico, sintético o recombinante.The nucleotide target sequence can be DNA or RNA of genomic, synthetic or recombinant origin.
La secuencia de nucleótidos puede ser de doble cadena o de una cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas.The nucleotide sequence may be double stranded or single stranded, representing the sense chain or the antisense chain or combinations thereof.
La secuencia de nucleótidos puede prepararse mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante (por ejemplo ADN recombinante).The nucleotide sequence can be prepared by the use of recombinant DNA techniques (eg recombinant DNA).
La secuencia de nucleótidos puede ser igual a la forma natural, o puede ser derivable (preferentemente derivada) a partir de la misma.The nucleotide sequence may be the same as the natural form, or it may be derivable (preferably derived) from it.
La secuencia diana de ácido nucleico se puede derivar o puede ser derivable (preferentemente se deriva) de un gen.The target nucleic acid sequence can be derived or derivable (preferably derived) from a gene.
La secuencia diana de ácido nucleico se puede derivar o puede ser derivable (preferentemente se deriva) de una variante, homólogo, fragmento o derivado de un gen.The target nucleic acid sequence can be derived or derivable (preferably derived) from a variant, homologue, fragment or derivative of a gene.
En una forma de realización, la secuencia diana de ácido nucleico se deriva o es derivable (preferentemente se deriva) de un bacteriófago.In one embodiment, the nucleic acid target sequence is derived or derivable (preferably derived) from a bacteriophage.
En una forma de realización, la secuencia diana de ácido nucleico se deriva o es derivable (preferentemente se deriva) de ADN de plásmido.In one embodiment, the nucleic acid target sequence is derived or derivable (preferably derived) from plasmid DNA.
En una forma de realización, la secuencia diana de ácido nucleico se deriva o es derivable (preferentemente se deriva) de un elemento genético móvil.In one embodiment, the nucleic acid target sequence is derived or derivable (preferably derived) from a mobile genetic element.
En una forma de realización, la secuencia diana de ácido nucleico se deriva o es derivable (preferentemente se deriva) de un elemento trasponible o de una secuencia de inserción.In one embodiment, the nucleic acid target sequence is derived or derivable (preferably derived) from a transposable element or from an insertion sequence.
En una forma de realización, la secuencia diana de ácido nucleico se deriva o es derivable (preferentemente se deriva) de un gen que proporciona resistencia.In one embodiment, the nucleic acid target sequence is derived or derivable (preferably derived) from a gene that provides resistance.
En una forma de realización, la secuencia diana de ácido nucleico se deriva o es derivable (preferentemente se deriva) de un gen que proporciona resistencia a un antibiótico.In one embodiment, the nucleic acid target sequence is derived or derivable (preferably derived) from a gene that provides resistance to an antibiotic.
En una forma de realización, la secuencia diana de ácido nucleico se deriva o es derivable (preferentemente se deriva) de un factor de virulencia.In one embodiment, the nucleic acid target sequence is derived or derivable (preferably derived) from a virulence factor.
En una forma de realización, la secuencia diana de ácido nucleico se deriva o es derivable (preferentemente se deriva) de una toxina, una internalina o una hemolisina.In one embodiment, the nucleic acid target sequence is derived or derivable (preferably derived) from a toxin, an internalin or a hemolysin.
MODULACIÓN DE LA RESISTENCIAMODULATION OF THE RESISTANCE
En un aspecto adicional, se proporciona un método para modular la resistencia de una célula, tal como una célula receptora, frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.In a further aspect, a method is provided to modulate the resistance of a cell, such as a recipient cell, against a target nucleic acid or a transcription product thereof.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "modula la resistencia" puede referirse a suprimir, reducir, disminuir, inducir, proporcionar, restaurar, elevar, incrementar o, de otro modo, presentar un efecto sobre la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana.As used herein, the term "modulates resistance" may refer to suppressing, reducing, decreasing, inducing, providing, restoring, elevating, increasing or otherwise presenting an effect on the resistance of a cell against to a target nucleic acid.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "resistencia" no pretende implicar que una célula es 100% resistente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo, sino que incluye células que son tolerantes del ácido nucleico diana o de un producto de transcripción del mismo.As used herein, the term "resistance" is not intended to imply that a cell is 100% resistant to a target nucleic acid or a transcription product thereof, but includes cells that are tolerant of the target nucleic acid or of a transcription product thereof.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "resistencia a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo" se refiere a que se proporciona resistencia frente a una célula o a un organismo, tal como un fago, que comprende o que produce el ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.As used herein, the term "resistance to a target nucleic acid or to a transcription product thereof" refers to providing resistance against a cell or an organism, such as a phage, which comprises or that produces the target nucleic acid or a transcription product thereof.
Sin pretender vincularse a ninguna teoría en particular, se cree que la resistencia o inmunidad no se encuentra ligada a la "entrada" de ADN foráneo en una célula (es decir, la penetración a través de la membrana celular). La inmunidad o resistencia, por el contrario, correspondería a una obstrucción, obstáculo, impedimento, barrera o evitación de la persistencia, mantenimiento o supervivencia del ácido nucleico entrante (por ejemplo en una forma lineal libre o integrado dentro del cromosoma bacteriano, fuera de un locus CRISPR o dentro de una molécula circular, tal como un plásmido), o a un obstrucción, obstáculo, impedimento, barrera o evitación de su replicación y/o transcripción y/o expresión.Without claiming to be bound by any particular theory, it is believed that resistance or immunity is not linked to the "entry" of foreign DNA into a cell (that is, penetration through the cell membrane). The immunity or resistance, on the other hand, would correspond to an obstruction, obstacle, impediment, barrier or avoidance of the persistence, maintenance or survival of the incoming nucleic acid (for example in a free linear form or integrated within the bacterial chromosome, outside a CRISPR locus or within a circular molecule, such as a plasmid), or to an obstruction, obstacle, impediment, barrier or avoidance of its replication and / or transcription and / or expression.
En una forma de realización, los componentes mínimos que proporcionan inmunidad o resistencia frente a un ácido nucleico diana o producto de expresión del mismo es por lo menos un gen cas (o una proteína Cas) y por lo menos dos repeticiones CRISPR flanqueantes de un espaciador.In one embodiment, the minimum components that provide immunity or resistance against a target nucleic acid or expression product thereof is at least one cas gene (or a Cas protein) and at least two flanking CRISPR repeats of a spacer. .
En una forma de realización, resulta preferido que la expresión "modular la resistencia" se refiere a inducir, proporcionar, elevar o incrementar la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana.In one embodiment, it is preferred that the term "modulate resistance" refers to inducing, providing, raising or increasing the resistance of a cell against a target nucleic acid.
En un aspecto se proporciona un método para modular (por ejemplo proporcionar o incrementar) la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar una secuencia (por ejemplo una secuencia conservada) en un organismo (preferentemente una secuencia esencial para el funcionamiento o la supervivencia del organismo),In one aspect a method is provided for modulating (for example providing or increasing) the resistance of a cell against a target nucleic acid or a transcription product thereof, which comprises the following steps: (i) identifying a sequence (for example a conserved sequence) in an organism (preferably an essential sequence for the functioning or survival of the organism),
(ii) preparar un espaciador de CRISPR que es una secuencia homóloga (apropiadamente idéntica al 100%) de la secuencia identificada, (iii) preparar un ácido nucleico que comprende por lo menos un gen cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR conjuntamente con el espaciador de CRISPR, e (iv) transformar una célula con dicho ácido nucleico, convirtiendo de esta manera a la célula en resistente a dicho ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.(ii) prepare a CRISPR spacer that is a homologous sequence (appropriately identical to 100%) of the identified sequence, (iii) prepare a nucleic acid comprising at least one cas gene and at least two CRISPR repeats in conjunction with the CRISPR spacer, and (iv) transforming a cell with said nucleic acid, thereby making the cell resistant to said target nucleic acid or transcription product thereof.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "secuencia conservada" en el contexto de la identificación de una secuencia conservada en un organismo no necesariamente debe encontrarse conservada en su sentido más estricto, debido a que el conocimiento de una secuencia de un organismo dado resultará suficiente. Además, la secuencia no es necesariamente parte de una entidad esencial, debido a que se cree que un espaciador inspirado en un gen esencial resultaría más eficiente en la provisión de inmunidad o resistencia.As used herein, the term "conserved sequence" in the context of the identification of a sequence conserved in an organism must not necessarily be conserved in its strictest sense, because the knowledge of a sequence of an organism given will be enough. In addition, the sequence is not necessarily part of an essential entity, because it is believed that a spacer inspired by an essential gene would be more efficient in providing immunity or resistance.
En una forma de realización, la secuencia conservada es una secuencia que resulta esencial para el funcionamiento y/o supervivencia y/o replicación y/o infectividad y similar de un organismo o de una célula. A título de ejemplo, la secuencia conservada puede ser una helicasa, una primasa, una proteína estructural de cabeza o cola, una proteína con un dominio conservado (por ejemplo holina, lisina y otras) o una secuencia conservada entre genes fágicos importantes.In one embodiment, the conserved sequence is a sequence that is essential for the functioning and / or survival and / or replication and / or infectivity and the like of an organism or a cell. By way of example, the conserved sequence may be a helicase, a primase, a structural head or tail protein, a protein with a conserved domain (eg holine, lysine and others) or a conserved sequence between important phage genes.
En un aspecto adicional, se proporciona un método para modular (por ejemplo para proporcionar o incrementar) la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar uno o más espaciadores de CRISPR en un organismo resistente frente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, (ii) preparar un ácido nucleico recombinante que comprende por lo menos un gen o proteína cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR conjuntamente con dicho espaciador o espaciadores identificados, eIn a further aspect, a method is provided to modulate (for example to provide or increase) the resistance of a cell against a target nucleic acid or a transcription product thereof, which comprises the following steps: (i) identify one or more CRISPR spacers in an organism resistant to the target nucleic acid or transcription product thereof, (ii) preparing a recombinant nucleic acid comprising at least one cas gene or protein and at least two CRISPR repeats together with said spacer or identified spacers, and
(iii) transformar una célula con dicho ácido nucleico recombinante, convirtiendo la célula receptora de esta manera en resistente a dicho ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.(iii) transforming a cell with said recombinant nucleic acid, thereby making the recipient cell resistant to said target nucleic acid or transcription product thereof.
En un aspecto adicional, se proporciona un método para modular (por ejemplo proporcionar o incrementar) la resistencia de una célula que comprende por lo menos unoIn a further aspect, a method is provided to modulate (for example provide or increase) the resistance of a cell comprising at least one
o más genes o proteínas cas y uno o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar uno o más espaciadores de CRISPR en un organismo resistente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, eor more genes or proteins cas and one or more, preferably two or more CRISPR repeats against a target nucleic acid or a transcription product thereof, comprising the following steps: (i) identify one or more CRISPR spacers in an organism resistant to the target nucleic acid or transcription product thereof, and
(ii) modificar la secuencia de uno o más espaciadores de CRISPR en la célula, de manera que el espaciador o espaciadores de CRISPR presenta homología respecto al espaciador(ii) modify the sequence of one or more CRISPR spacers in the cell, so that the CRISPR spacer or spacers have homology to the spacer
o espaciadores de CRISPR en el organismo.or CRISPR spacers in the body.
En una forma de realización, se modifica (por ejemplo se manipula genéticamente) uno o más espaciadores de CRISPR en una célula, tal como una célula receptora, de manera que el espaciador o espaciadores de CRISPR presentan homología respecto a uno o más espaciadores de CRISPR en un organismo, tal como un organismo donante, que es sustancialmente resistente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo con el fin de convertir la célula en resistente al ácido nucleico diana.In one embodiment, one or more CRISPR spacers in a cell, such as a receiving cell, is modified (for example, genetically manipulated) so that the CRISPR spacer or spacers have homology to one or more CRISPR spacers in an organism, such as a donor organism, that is substantially resistant to a target nucleic acid or a transcription product thereof in order to make the cell resistant to the target nucleic acid.
Apropiadamente, por lo menos un gen o proteína cas y una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR en la célula son una combinación funcional tal como se describe en la presente memoria.Suitably, at least one cas gene or protein and one or more, preferably two or more CRISPR repeats in the cell are a functional combination as described herein.
La manipulación genética puede incluir, aunque sin limitación, añadir (por ejemplo insertar), delecionar (por ejemplo eliminar) o modificar (por ejemplo mutar) la secuencia de uno o más espaciadores de CRISPR o en una célula de manera que el espaciador de CRISPR presente homología (por ejemplo homología incrementada tras la manipulación genética) respecto a uno o más espaciadores de CRISPR de un organismo donante. Esta etapa de manipulación resultará en que una célula que era sustancialmente sensible a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo sea sustancialmente resistente al ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo.Genetic manipulation may include, but is not limited to, add (for example insert), delete (for example, delete) or modify (for example, mutate) the sequence of one or more CRISPR spacers or in a cell such that the CRISPR spacer present homology (eg increased homology after genetic manipulation) with respect to one or more CRISPR spacers of a donor organism. This manipulation step will result in a cell that was substantially sensitive to a target nucleic acid or a transcription product thereof being substantially resistant to the target nucleic acid or a transcription product thereof.
La ingeniería genética puede comprender incluso, de manera no limitativa, añadir (por ejemplo insertar) o eliminar (por ejemplo extraer) la secuencia de dichos uno o más seudoespaciadores de CRISPR en una célula. Esta etapa de ingeniería producirá una célula que es sustancialmente sensible a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo que es sustancialmente resistente al ácido nucleico diana o al producto de transcripción del mismo.Genetic engineering can even include, but is not limited to, add (for example insert) or remove (for example, extract) the sequence of said one or more pseudo-spacers of CRISPR in a cell. This engineering step will produce a cell that is substantially sensitive to a target nucleic acid or a transcription product thereof that is substantially resistant to the target nucleic acid or transcription product thereof.
En otra forma de realización, la expresión "modular la resistencia" se refiere a suprimir, reducir o disminuir la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana.In another embodiment, the term "modulate resistance" refers to suppressing, reducing or decreasing the resistance of a cell against a target nucleic acid.
De esta manera, en un aspecto adicional, se proporciona un método para disminuirIn this way, in a further aspect, a method for reducing
o reducir la resistencia de una célula, tal como una célula receptora, que comprende por lo menos un gen o proteína cas y una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR frente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo.or reducing the resistance of a cell, such as a recipient cell, comprising at least one cas gene or protein and one or more, preferably two or more CRISPR repeats against a target nucleic acid or a transcription product thereof.
Según la presente forma de realización, el método comprende las etapas siguientes: (i) identificar uno o más espaciadores de CRISPR en un organismo que es sustancialmente resistente al ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo, e (ii) modificar la secuencia de uno o más espaciadores de CRISPR en la célula, de manera que el espaciador o espaciadores de CRISPR presentan un grado reducido de homología respecto al espaciador o espaciadores de CRISPR en el organismo.According to the present embodiment, the method comprises the following steps: (i) identify one or more CRISPR spacers in an organism that is substantially resistant to the target nucleic acid or a transcription product thereof, and (ii) modify the sequence of one or more CRISPR spacers in the cell, so that the CRISPR spacer or spacers have a reduced degree of homology with respect to the CRISPR spacer or spacers in the body.
En otra forma de realización se proporciona un método para modular (por ejemplo para reducir) la resistencia de una célula que comprende uno o más genes o proteínas cas y una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR frente a un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar un espaciador de CRISPR o un seudoespaciador de CRISPR en un organismo que comprende un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo contra el que debe modularse la resistencia, e (ii) identificar el espaciador de CRISPR en el organismo en el que debe modularse la resistencia, e (iii) adaptar la secuencia del espaciador de CRISPR en el organismo en el que debe modularse la resistencia, de manera que el espaciador de CRISPR presente un grado más bajo de homología respecto al espaciador de CRISPR o el seudoespaciador de CRISPR del organismo que comprende el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo frente al que debe modularse la resistencia.In another embodiment a method is provided to modulate (for example to reduce) the resistance of a cell comprising one or more genes or cas proteins and one or more, preferably two or more CRISPR repeats against a target nucleic acid or product transcription thereof, which comprises the following steps: (i) identify a CRISPR spacer or a CRISPR pseudo spacer in an organism comprising a target nucleic acid or a transcription product thereof against which resistance should be modulated, and ( ii) identify the CRISPR spacer in the organism in which the resistance should be modulated, and (iii) adapt the sequence of the CRISPR spacer in the organism in which the resistance should be modulated, so that the CRISPR spacer presents a degree lower homology with respect to the CRISPR spacer or the CRISPR pseudo-spacer of the organism comprising the target nucleic acid or transcription product of the same as the resistance must be modulated.
Se manipulan uno o más espaciadores de CRISPR en una célula sustancialmente resistente con el fin de convertir a la célula en sensible en un ácido nucleico diana. La manipulación genética puede incluir, aunque sin limitación, la adición (por ejemplo la inserción), la deleción (por ejemplo la eliminación) o la modificación de una o más combinaciones funcionales de repetición CRISPR-cas o partes o fragmentos de las mismas en la célula sustancialmente resistente y/o la adición (por ejemplo la inserción), la deleción (por ejemplo la eliminación) o la modificación de uno o más espaciadores de CRISPR o partes o fragmentos de los mismos en la célula sustancialmente resistente.One or more CRISPR spacers are manipulated in a substantially resistant cell in order to make the cell sensitive in a target nucleic acid. Genetic manipulation may include, but is not limited to, the addition (for example the insertion), the deletion (for example the deletion) or the modification of one or more functional CRISPR-cas repeat combinations or parts or fragments thereof in the substantially resistant cell and / or the addition (eg insertion), deletion (eg removal) or modification of one or more CRISPR spacers or parts or fragments thereof in the substantially resistant cell.
Dicha etapa de manipulación producirá a continuación una célula que es sustancialmente resistente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo, sensibilizándose sustancialmente frente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo.Said handling step will then produce a cell that is substantially resistant to a target nucleic acid or a transcription product thereof, being substantially sensitized against a target nucleic acid or a transcription product thereof.
Típicamente, con el fin de proporcionar sensibilidad a una célula, se espera que uno o más espaciadores de CRISPR, uno o más genes o proteínas cas, una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR o una o más combinaciones funcionales de repetición CRISPR-cas de una célula sustancialmente resistente se eliminen, se delecionen o se modifiquen de manera que ya no se proporcione resistencia.Typically, in order to provide sensitivity to a cell, one or more CRISPR spacers, one or more cas genes or proteins, one or more, preferably two or more CRISPR repeats or one or more CRISPR functional repeat combinations is expected to be Cases of a substantially resistant cell are removed, deleted or modified so that resistance is no longer provided.
Ventajosamente, las células que son sensibles a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo pueden prepararse de manera que sus niveles en un cultivo dado, tal como un cultivo inicial, puedan modularse (por ejemplo reducirse) según se desee. De esta manera, a título de ejemplo, puede desarrollarse un cultivo inicial que comprende dos o más cepas bacterianas de manera que todos los miembros del cultivo sean sensibles al mismo agente (por ejemplo un bacteriófago). De acuerdo con lo expuesto anteriormente, en el momento en que ya no se desee que el cultivo se encuentre vivo, éste puede ponerse en contacto con el mismo agente individual con el fin de matar todos los miembros del cultivo.Advantageously, cells that are sensitive to a target nucleic acid or a transcription product thereof can be prepared so that their levels in a given culture, such as an initial culture, can be modulated (eg reduced) as desired. Thus, by way of example, an initial culture comprising two or more bacterial strains can be developed so that all members of the culture are sensitive to the same agent (for example a bacteriophage). In accordance with the above, at the moment when it is no longer desired that the crop is alive, it can contact the same individual agent in order to kill all the members of the crop.
Además, incluso puede ser posible modular la sensibilidad de una célula a uno o más agentes (por ejemplo bacteriófago) de manera que el agente mate únicamente una proporción de las células en un cultivo dado, tal como 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 95% de las células en un cultivo dado.Furthermore, it may even be possible to modulate the sensitivity of a cell to one or more agents (eg bacteriophage) so that the agent kills only a proportion of the cells in a given culture, such as 10, 20, 30, 40, 50 , 60, 70, 80, 90 or 95% of the cells in a given culture.
En un aspecto, puede manipularse una célula, tal como una célula receptora, de manera que comprenda un espaciador de CRISPR o una secuencia correspondiente a un seudoespaciador de CRISPR, convirtiendo la célula en resistente a un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo. Apropiadamente, las células se manipulan de manera que el espaciador de CRISPR o la secuencia correspondiente al seudoespaciador de CRISPR se utilice conjuntamente con una combinación funcional de gen cas-repetición CRISPR, tal como se describe en la presente memoria.In one aspect, a cell, such as a receiving cell, can be manipulated so as to comprise a CRISPR spacer or a sequence corresponding to a CRISPR pseudo-spacer, making the cell resistant to a target nucleic acid or transcription product thereof. Suitably, the cells are manipulated so that the CRISPR spacer or the sequence corresponding to the CRISPR pseudo-spacer is used in conjunction with a functional combination of the CRISPR cas-repeat gene, as described herein.
En un aspecto, se manipula una célula que es resistente a un ácido nucleico dianaIn one aspect, a cell that is resistant to a target nucleic acid is manipulated
o producto de transcripción del mismo de manera que se inserte el espaciador de CRISPR que proporciona inmunidad frente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, en una célula que comprende una combinación funcional de gen cas-repetición CRISPR, convirtiendo de esta manera a la célula en resistente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.or transcription product thereof so that the CRISPR spacer that provides immunity against the target nucleic acid or transcription product thereof is inserted into a cell that comprises a functional combination of the CRISPR cas-repeat gene, thereby converting the cell in resistant to the target nucleic acid or transcription product thereof.
En un aspecto, se prepara un espaciador de CRISPR de una célula, tal como una célula receptora, y una combinación funcional de gen cas-repetición CRISPR de la misma célula o de células diferentes, tal como la misma célula receptora o células receptoras diferentes. A continuación, se manipula una célula adicional, tal como una célula receptora, de manear que comprenda la secuencia de espaciador de CRISPR y la combinación funcional de gen cas-repetición CRISPR, convirtiendo de esta manera a la célula en resistente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.In one aspect, a CRISPR spacer of a cell, such as a recipient cell, and a functional combination of CRISPR cas-repeat gene of the same or different cells, such as the same receptor cell or different receptor cells, is prepared. Next, an additional cell, such as a recipient cell, is manipulated to comprise the CRISPR spacer sequence and the functional combination of the CRISPR cas-repeat gene, thereby rendering the cell resistant to the target nucleic acid or transcription product thereof.
Un espaciador de CRISPR se encuentra flanqueado por dos repeticiones CRISPR. En otras palabras, un espaciador de CRISPR presenta por lo menos una repetición CRISPR en cada lado.A CRISPR spacer is flanked by two CRISPR repetitions. In other words, a CRISPR spacer has at least one CRISPR repeat on each side.
BACTERIÓFAGOBACTERIOPHAGUS
En un aspecto particularmente preferente de la presente invención, se modula la resistencia de una célula frente a un bacteriófago.In a particularly preferred aspect of the present invention, the resistance of a cell against a bacteriophage is modulated.
El bacteriófago es virulento para la célula.The bacteriophage is virulent for the cell.
El bacteriófago puede ser un bacteriófago virulento o atemperado.The bacteriophage can be a virulent or tempered bacteriophage.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "bacteriófago" presenta su significado convencional entendido en la técnica, es decir, un virus que infecta selectivamente los procariotas, tales como las bacterias. Muchos bacteriófagos son específicos de un género, especie o cepa de célula.As used herein, the term "bacteriophage" has its conventional meaning understood in the art, that is, a virus that selectively infects prokaryotes, such as bacteria. Many bacteriophages are specific to a genus, species or cell strain.
El bacteriófago puede ser un bacteriófago lítico o un bacteriófago lisogénico.The bacteriophage can be a lytic bacteriophage or a lysogenic bacteriophage.
Un bacteriófago lítico es uno que sigue la ruta lítica hasta completar el ciclo lítico, y que no entra en la ruta lisogénica. Un bacteriófago lítico experimenta replicación vírica que conduce a la lisis de la membrana celular, a la destrucción de la célula y a la liberación de progenie de partículas de bacteriófago que pueden infectar otras células.A lytic bacteriophage is one that follows the lytic path until the lytic cycle is completed, and does not enter the lysogenic path. A lytic bacteriophage undergoes viral replication that leads to cell membrane lysis, cell destruction and progeny release of bacteriophage particles that can infect other cells.
Un bacteriófago lisogénico es el que puede entrar en la ruta lisogénica, en la que el bacteriófago se convierte en una parte pasiva durmiente del genoma de la célula mediante el completado de su ciclo lítico.A lysogenic bacteriophage is one that can enter the lysogenic pathway, in which the bacteriophage becomes a dormant passive part of the cell genome by completing its lytic cycle.
El término "bacteriófago" es sinónimo del término "fago".The term "bacteriophage" is synonymous with the term "phage."
Aunque puede utilizarse la resistente frente a cualquier bacteriófago (incluyendo bacteriófagos de tipo salvaje, naturales, aislados o recombinantes), resultan preferidos los bacteriófagos activos contra bacterias. Más apropiadamente, los bacteriófagos activos contra bacterias que son patogénicas para plantas y/o animales (incluyendo seres humanos) resultan de interés particular.Although resistant against any bacteriophage (including wild-type, natural, isolated or recombinant bacteriophages) can be used, bacteriophages active against bacteria are preferred. More appropriately, bacteriophages active against bacteria that are pathogenic for plants and / or animals (including humans) are of particular interest.
A título de ejemplo, entre los bacteriófagos están comprendidos de manera no limitativa, los bacteriófagos que pueden infectar una bacteria que comprende naturalmente uno o más loci CRISPR. Se han identificado loci CRISPR en más de 40 procariotas (Jansen et al. 2002b, Mojica et al. 2005, Haft et al. 2005), incluyendo, aunque sin limitación, Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus, Halocarcula, Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobacterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Myxococcus, Campylobacter, Wolinella, Acinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pasteurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthamonas, Yersinia, Treponema y Thermotoga.By way of example, bacteriophages include, but are not limited to, bacteriophages that can infect a bacterium that naturally comprises one or more CRISPR loci. CRISPR loci have been identified in more than 40 prokaryotes (Jansen et al. 2002b, Mojica et al. 2005, Haft et al. 2005), including, but not limited to, Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus, Halocarcula, Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mybacterium, Microbacterium, Microbacterium, Microbacterium, Microbacterium, Microbacterium, Microbacterium, Microbacterium, Microbacterium, Microbacterium, Microbacterium Myxococcus, Campylobacter, Wolinella, Acinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pasteurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthamonas, Yersinia, Treponema and Thermotoga.
A título de ejemplo, entre los bacteriófagos están comprendidos de manera no limitativa, los bacteriófagos que pueden infectar bacterias pertenecientes a los géneros siguientes: Escherichia, Shigella, Salmonella, Erwinia, Yersinia, Bacillus, Vibrio, Legionella, Seudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Agrobacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Francisella, Brucella y Xanthomonas.By way of example, bacteriophages include, but are not limited to, bacteriophages that can infect bacteria belonging to the following genera: Escherichia, Shigella, Salmonella, Erwinia, Yersinia, Bacillus, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter , Listeria, Agrobacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Francisella, Brucella and Xanthomonas.
A título de ejemplo adicional, entre los bacteriófagos están comprendidos de manera no limitativa, los bacteriófagos que pueden infectar (o transducir) especies de bacterias del ácido láctico, una especie de Bifidobacterium, una especie de Brevibacterium, una especie de Propionibacterium, una especie de Lactococcus, una especie de Streptococcus, una especie de Lactobacillus, incluyendo Lactobacillus acidophilus, una especie de Enterococcus, una especie de Pediococcus, una especie de Leuconostoc y una especie de Oenococcus.As an additional example, bacteriophages include, but are not limited to, bacteriophages that can infect (or transduce) species of lactic acid bacteria, a species of Bifidobacterium, a species of Brevibacterium, a species of Propionibacterium, a species of Lactococcus, a species of Streptococcus, a species of Lactobacillus, including Lactobacillus acidophilus, a species of Enterococcus, a species of Pediococcus, a species of Leuconostoc and a species of Oenococcus.
A título de ejemplo adicional, entre los bacteriófagos están comprendidos de manera no limitativa, los bacteriófagos que pueden infectar Lactococcus lactis, incluyendo Lactococcus lactis subsp. lactis y Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii o Bifidobacterium longum.By way of an additional example, bacteriophages include, but are not limited to, bacteriophages that can infect Lactococcus lactis, including Lactococcus lactis subsp. lactis and Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuterbacterium Lauterbacterium Lauterbacterium Lauterbacterium Lactobacterium Lacterbacterium Lacterbacus
A título de ejemplo adicional, entre los bacteriófagos están comprendidos de manera no limitativa, los bacteriófagos que pueden infectar cualquier bacteria fermentativa susceptible de alteración por infección de bacteriófagos, incluyendo, aunque sin limitación, procedimientos para la producción de antibióticos, aminoácidos y solventes. Entre los productos producidos mediante fermentación que se ha conocido que han experimentado infección por bacteriófagos, y las bacterias de fermentación infectadas correspondientes, se incluyen los quesos Cheddar y cottage (Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactotoccus lactis subsp. cremoris), el yogur (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus), el queso suizo (S. thermophilus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus helveticus), el queso azul (Leuconostoc cremoris), el queso italiano (L. bulgaricus, S. thermophilus), viili (Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, Leuconostoc cremoris), yakult (Lactobacillus casei), caseína (Lactococcus lactis subsp. cremoris), natto (Bacillus subtilis var. natto), vino (Leuconostoc oenos), sake (Leuconostoc mesenteroides), polimixina (Bacillus polymixa), colistina (Bacillus colistrium), bacitracina (Bacillus licheniformis), ácido L-glutámico (Brevibacterium lactofermentum, Microbacterium ammoniaphilum), y acetona y butanol (Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharoperbutylacetonicum).By way of an additional example, bacteriophages include, but are not limited to, bacteriophages that can infect any fermentative bacterium susceptible to bacteriophage infection alteration, including, but not limited to, procedures for the production of antibiotics, amino acids and solvents. Products produced by fermentation that have been known to have experienced bacteriophage infection, and corresponding infected fermentation bacteria, include Cheddar and cottage cheeses (Lactococcus lactis subsp. Lactis, Lactotoccus lactis subsp. Cremoris), yogurt (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus), Swiss cheese (S. thermophilus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus helveticus), blue cheese (Leuconostoc cremoris), Italian cheese (L. bulgaricus, S. thermophilus), viili (Lactocopcus la subscopcus lactcoccus . cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, Leuconostoc cremoris), yakult (Lactobacillus casei), casein (Lactococcus lactis subsp. cremoris), natto (Bacillus subtilis var. natto), wine (Leuconostoc mesenose) (Leuconostoc mesenose) (Leuconostoc mesenose) , polymyxin (Bacillus polymixa), colistin (Bacillus colistrium), bacitracin (Bacillus licheniformis), L-glutamic acid (Brevibacterium lactofer mentum, Microbacterium ammoniaphilum), and acetone and butanol (Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharoperbutylacetonicum).
Son bacterias preferidas, S. thermophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus y/o L. acidophilus.They are preferred bacteria, S. thermophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus and / or L. acidophilus.
A título de ejemplo adicional, entre los bacteriófagos están comprendidos de manera no limitativa, los bacteriófagos que pueden infectar una bacteria que comprenden uno o más loci CRISPR heterólogos. La bacteria puede comprender uno o más loci CRISPR heterólogos, uno o más genes cas heterólogos, una o más repeticiones CRISPR heterólogas y/o uno o más espaciadores de CRISPR heterólogos.By way of an additional example, bacteriophages include, but are not limited to, bacteriophages that can infect a bacterium comprising one or more heterologous CRISPR loci. The bacterium may comprise one or more heterologous CRISPR loci, one or more heterologous cas genes, one or more heterologous CRISPR repeats and / or one or more heterologous CRISPR spacers.
Entre los bacteriófagos pueden estar comprendidos de manera no limitativa, bacteriófagos que pertenecen a cualquiera de las siguientes familias de virus: Corticoviridae, Cystoviridae, Inoviridae, Leviviridae, Microviridae, Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae o Tectiviridae.Bacteriophages may include, but are not limited to, bacteriophages belonging to any of the following virus families: Corticoviridae, Cystoviridae, Inoviridae, Leviviridae, Microviridae, Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae or Tectiviridae.
Para provocar la infección por bacteriófago de las células, el bacteriófago "infecta" una célula al inyectar o transferir su ácido nucleico en la célula, existiendo el ácido nucleico fágico de manera independiente del genoma e la célula. La infección puede conducir a la expresión (transcripción y traducción) del ácido nucleico del bacteriófago dentro de la célula y la continuación del ciclo vital del bacteriófago. En el caso de un bacteriófago recombinante, las secuencias recombinantes dentro del genoma fágico, tales como los ácidos nucleicos informadores, pueden expresarse también.To cause bacteriophage infection of the cells, the bacteriophage "infects" a cell by injecting or transferring its nucleic acid into the cell, with the phage nucleic acid independently of the genome in the cell. Infection can lead to the expression (transcription and translation) of the bacteriophage nucleic acid within the cell and the continuation of the bacteriophage's life cycle. In the case of a recombinant bacteriophage, recombinant sequences within the phage genome, such as reporter nucleic acids, can also be expressed.
Se ha encontrado que las secuencias de espaciador de CRISPR en procariotas con frecuencia presentan similitudes significativas con una diversidad de moléculas de ADN, tales como elementos genéticos (incluyuendo, aunque sin limitación, cromosomas, bacteriófagos y plásmidos conjugativos). Resulta interesante que las células que portan estos espaciadores de CRISPR son incapces de resultar infectados por moléculas de ADN que contienen secuencias homólogas a los espaciadores (Mojica et al. 2005).It has been found that CRISPR spacer sequences in prokaryotes often have significant similarities with a variety of DNA molecules, such as genetic elements (including, but not limited to, chromosomes, bacteriophages and conjugative plasmids). Interestingly, the cells that carry these CRISPR spacers are incapable of being infected by DNA molecules that contain sequences homologous to the spacers (Mojica et al. 2005).
En el contexto de la presente invención, uno o más seudoespaciadores particulares derivables o derivados de ADN de bacteriófago o de uno o más espaciadores de CRISPR que son complementarios u homólogos de uno o más seudoespaciadores de CRISPR, pueden añadirse a un locus CRISPR de una célula, tal como una célula receptora, con el fin de modular (por ejemplo proporcionar) resistencia frente a un bacteriófago particular, impidiendo sustancialmente de esta manera el ataque fágico.In the context of the present invention, one or more particular pseudo-spacers derivable or derived from bacteriophage DNA or one or more CRISPR spacers that are complementary or homologous to one or more CRISPR pseudo-spacers, can be added to a CRISPR locus of a cell , such as a recipient cell, in order to modulate (for example, provide) resistance against a particular bacteriophage, substantially preventing the phage attack.
Típicamente las dianas pueden ser regiones particulares del genoma fágico para preparar los seudoespaciadores, tal como genes codificantes de proteínas de especificidad de huésped, que proporcionan capacidad de reconocimiento de un fago particular-huésped, tales como helicasas, primasa, proteínas estructurales de cabeza o cola, proteínas con un dominio conservado (por ejemplo holina, lisina y otras) o secuencias conservadas entre genes fágicos importantes.Typically the targets can be particular regions of the phage genome to prepare pseudo-spacers, such as genes encoding host-specific proteins, which provide recognition ability of a particular phage-host, such as helicases, primase, structural head or tail proteins. , proteins with a conserved domain (eg holine, lysine and others) or sequences conserved between important phage genes.
Cualquier ácido nucleico que opere desde el genoma fágico puede proporcionar inmunidad frente al fago al insertarlo, por ejemplo, entre dos repeticiones en un locus CRISPR activo. La inmunidad puede ser más "eficiente" en el caso de que el espaciador de CRISPR corresponda a una secuencia interna de un gen fágico, e incluso más "eficiente" en el caso de que este gen codifique proteínas "esenciales" (por ejemplo el antirreceptor).Any nucleic acid that operates from the phage genome can provide immunity against the phage upon insertion, for example, between two repetitions in an active CRISPR locus. Immunity may be more "efficient" in the event that the CRISPR spacer corresponds to an internal sequence of a phageic gene, and even more "efficient" in the event that this gene encodes "essential" proteins (for example the antireceptor ).
De acuerdo con lo expuesto anteriormente, en un aspecto adicional, se proporciona un método para proporcionar resistencia a una célula (apropiadamente una célula bacteriana) frente a un bacteriófago, que comprende las etapas siguientes: (a) proporcionar uno o más seudoespaciadores de CRISPR de por lo menos un bacteriófago,In accordance with the foregoing, in a further aspect, a method is provided to provide resistance to a cell (appropriately a bacterial cell) against a bacteriophage, comprising the following steps: (a) providing one or more CRISPR pseudo spacers of at least one bacteriophage,
(b) identificar una o más combinaciones funcionales de repetición CRISPR-cas en por lo menos una célula que es sustancialmente sensible al bacteriófago, y (c) manipular uno o más loci CRISPR en la célula sustancialmente sensible de manera que comprende uno o más seudoespaciadores de CRISPR de un bacteriófago o uno o más espaciadores de CRISPR que son complementarios u homólogos de uno o más seudoespaciadores de CRISPR para convertir a la célula en resistente.(b) identify one or more CRISPR-cas repeat functional combinations in at least one cell that is substantially sensitive to the bacteriophage, and (c) manipulate one or more CRISPR loci in the substantially sensitive cell so that it comprises one or more pseudo-spacers CRISPR of a bacteriophage or one or more CRISPR spacers that are complementary or homologous to one or more CRISPR pseudo spacers to make the cell resistant.
En un aspecto adicional se proporciona un método para proporcionar resistencia a una célula (apropiadamente una célula bacteriana) frente a un bacteriófago, que comprende las etapas siguientes: (a) proporcionar uno o más seudoespaciadores de CRISPR de por lo menos un bacteriófago, (b) identificar una o más combinaciones funcionales de repetición CRISPR-cas en por lo menos una célula que es sustancialmente sensible al bacteriófago, y (c) insertar uno o más seudoespaciadores de CRISPR del bacteriófago o uno o más espaciadores de CRISPR que son complementarios u homólogos de uno o más seudoespaciadores de CRISPR en la célula sustancialmente sensible de manera que se convierte a la célula en sustancialmente resistente al bacteriófago.In a further aspect a method is provided for providing resistance to a cell (appropriately a bacterial cell) against a bacteriophage, comprising the following steps: (a) providing one or more CRISPR pseudo spacers of at least one bacteriophage, (b ) identify one or more CRISPR-cas repeat functional combinations in at least one cell that is substantially sensitive to the bacteriophage, and (c) insert one or more pseudo spacers from the bacteriophage CRISPR or one or more CRISPR spacers that are complementary or homologous of one or more CRISPR pseudo spacers in the substantially sensitive cell so that the cell becomes substantially resistant to bacteriophage.
En un aspecto adicional se proporciona un método para modular el lisotipo de una célula bacteriana, que comprende las etapas siguientes: (a) proporcionar uno o más seudoespaciadores de CRISPR de por lo menos un bacteriófago, (b) identificar una o más combinaciones funcionales de repetición CRISPR-cas en por lo menos una célula que es sustancialmente sensible al bacteriófago, y (c) manipular por lo menos un locus CRISPR en la célula sustancialmente sensible de manera que comprenda uno o más seudoespaciadores de CRISPR de un bacteriófago o uno o más espaciadores de CRISPR que son complementarios u homólogos de uno o más seudoespaciadores de CRISPR.In a further aspect a method is provided for modulating the lysotype of a bacterial cell, which comprises the following steps: (a) providing one or more CRISPR pseudo spacers of at least one bacteriophage, (b) identifying one or more functional combinations of CRISPR-cas repeat in at least one cell that is substantially sensitive to the bacteriophage, and (c) manipulate at least one CRISPR locus in the substantially sensitive cell so that it comprises one or more CRISPR pseudo spacers of a bacteriophage or one or more CRISPR spacers that are complementary or homologous to one or more CRISPR pseudo spacers.
En un aspecto adicional se proporciona un método para modular el lisotipo de una célula bacteriana que comprende las etapas siguientes: (a) proporcionar uno o más seudoespaciadores de CRISPR de por lo menos un bacteriófago, (b) identificar una o más combinaciones funcionales de repetición CRISPR-cas en por lo menos una célula que es sustancialmente sensible al bacteriófago, y (c) insertar uno o más seudoespaciadores de CRISPR del bacteriófago o uno o más espaciadores de CRISPR que son complementarios u homólogos de uno o más seudoespaciadores de CRISPR en la célula sustancialmente sensible.In a further aspect a method is provided for modulating the lysotype of a bacterial cell comprising the following steps: (a) providing one or more CRISPR pseudo spacers of at least one bacteriophage, (b) identifying one or more repeat functional combinations CRISPR-cas in at least one cell that is substantially sensitive to the bacteriophage, and (c) insert one or more pseudo-spacers of the bacteriophage CRISPR or one or more CRISPR spacers that are complementary or homologous to one or more pseudo-spacers of CRISPR in the substantially sensitive cell.
En un aspecto adicional se proporciona un método para proporcionar resistencia a una célula (apropiadamente una célula bacteriana) frente al bacteriófago, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar un seudoespaciador de CRISPR en un bacteriófago que comprende un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo frente al que debe modularse la resistencia, e (ii) modifica la secuencia del espaciador de CRISPR de la célula de manera que el espaciador de CRISPR de la célula presente homología respecto al seudoespaciador de CRISPR del bacteriófago que comprende el ácido nucleico diana.In a further aspect a method is provided for providing resistance to a cell (appropriately a bacterial cell) against the bacteriophage, which comprises the following steps: (i) identifying a pseudo-spacer of CRISPR in a bacteriophage comprising a target nucleic acid or a product of transcription thereof against which resistance must be modulated, and (ii) modifies the sequence of the CRISPR spacer of the cell so that the CRISPR spacer of the cell exhibits homology with respect to the pseudo-spacer of the bacteriophage comprising the nucleic acid Diana.
En un aspecto adicional se proporciona un método para proporcionar resistencia a una célula (apropiadamente una célula bacteriana) frente a un bacteriófago, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar un seudoespaciador de CRISPR en un bacteriófago que comprende un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo frente al que debe modularse la resistencia, e (ii) modificar la secuencia del espaciador de CRISPR de la célula de manera que el espaciador de CRISPR de la célula presente una homología o identidad de 100% respecto al seudoespaciador de CRISPR del bacteriófago que comprende el ácido nucleico diana.In a further aspect a method is provided to provide resistance to a cell (appropriately a bacterial cell) against a bacteriophage, comprising the following steps: (i) identifying a pseudo-spacer of CRISPR in a bacteriophage comprising a target nucleic acid or a transcription product thereof against which resistance must be modulated, and (ii) modify the sequence of the CRISPR spacer of the cell so that the CRISPR spacer of the cell has a homology or identity of 100% with respect to the CRISPR pseudo-spacer of the bacteriophage comprising the target nucleic acid.
En un aspecto adicional se proporciona un método para modular el lisotipo de una célula bacteriana, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar un seudoespaciador de CRISPR en un bacteriófago, que comprende un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo frente al que debe modularse la resistencia, e (ii) modificar la secuencia del espaciador de CRISPR de la célula de manera que el espaciador de CRISPR de la célula presente homología respecto al seudoespaciador de CRISPR del bacteriófago que comprende el ácido nucleico diana.In a further aspect a method is provided to modulate the lysotype of a bacterial cell, which comprises the following steps: (i) identify a pseudo-spacer of CRISPR in a bacteriophage, which comprises a target nucleic acid or a transcription product thereof against the that the resistance must be modulated, and (ii) modify the sequence of the CRISPR spacer of the cell so that the CRISPR spacer of the cell exhibits homology with respect to the pseudo-spacer of the bacteriophage comprising the target nucleic acid.
En un aspecto adicional se proporciona un método para modular el lisotipo de una célula bacteriana, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar un seudoespaciador de CRISPR en un bacteriófago que comprende un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo frente al que debe modularse la resistencia, e (ii) modificar la secuencia del espaciador de CRISPR de la célula de manera que el espaciador de CRISPR de la célula presenta una homología o identidad de 100% respecto al seudoespaciador de CRISPR del bacteriófago que comprende el ácido nucleico diana.In a further aspect a method is provided for modulating the lysotype of a bacterial cell, which comprises the following steps: (i) identifying a pseudo-spacer of CRISPR in a bacteriophage comprising a target nucleic acid or a transcription product thereof against which the resistance must be modulated, and (ii) modify the sequence of the CRISPR spacer of the cell so that the CRISPR spacer of the cell has a homology or identity of 100% with respect to the pseudo-spacer of the bacteriophage comprising the target nucleic acid .
Apropiadamente el espaciador de CRISPR de la célula bacteriana presenta una homología o identidad de 100% respecto a una secuencia, tal como un seudoespaciador de CRISPR, en el bacteriófago que comprende el ácido nucleico diana.Appropriately the bacterial cell CRISPR spacer has a homology or identity of 100% with respect to a sequence, such as a CRISPR pseudo spacer, in the bacteriophage comprising the target nucleic acid.
Apropiadamente el espaciador de CRISPR de la célula bacteriana forma una parte componente de un locus CRISPR que comprende una combinación funcional de repetición CRISPR-cas tal como se describe en la presente memoria.Suitably the bacterial cell CRISPR spacer forms a component part of a CRISPR locus that comprises a functional CRISPR-cas repeat combination as described herein.
Apropiadamente el ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo en el bacteriófago es una secuencia de ácido nucleico altamente conservada.Suitably the target nucleic acid or a transcription product thereof in the bacteriophage is a highly conserved nucleic acid sequence.
Apropiadamente, el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo en el bacteriófago es un gen codificante de una proteína de especificidad de huésped.Suitably, the target nucleic acid or transcription product thereof in the bacteriophage is a gene encoding a host specificity protein.
Apropiadamente, el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo en el bacteriófago codifica un enzima que resulta esencial para la supervivencia, replicación o crecimiento del bacteriófago.Appropriately, the target nucleic acid or transcription product thereof in the bacteriophage encodes an enzyme that is essential for the survival, replication or growth of the bacteriophage.
Apropiadamente, el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo en el bacteriófago codifica una helicasa, una primasa, una proteína estructural de cabeza o cola, o una proteína con un dominio conservado (por ejemplo holina, lisina y otras).Appropriately, the target nucleic acid or transcription product thereof in the bacteriophage encodes a helicase, a primase, a structural head or tail protein, or a protein with a conserved domain (eg holine, lysine and others).
Ventajosamente, pueden prepararse células bacterianas según la presente invención que presentan una "susceptibilidad reducida a la multiplicación o infección de bacteriófagos". Tal como se utiliza en la presente memoria, dicha expresión se refiere a que la bacteria presenta una susceptibilidad reducida o nula a la multiplicación o infección por bacteriófagos en comparación con la bacteria de tipo salvaje al cultivarla en, por ejemplo, un medio lácteo.Advantageously, bacterial cells according to the present invention can be prepared which have a "reduced susceptibility to bacteriophage multiplication or infection". As used herein, said expression refers to the bacterium having a reduced or no susceptibility to multiplication or infection by bacteriophages compared to the wild-type bacterium when grown in, for example, a dairy medium.
En una forma de realización, la expresión "baja susceptibilidad a la multiplicación de bacteriófagos" se refiere a que el nivel de multiplicación de bacteriófagos en una bacteria se encuentra por debajo de un nivel que podría provocar un efecto perjudicial a un cultivo en un periodo de tiempo dado. Entre dichos efectos perjudiciales en un cultivo se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la falta de coagulación de la leche durante la producción de productos lácteos fermentados (tales como el yogur o el queso), una reducción inadecuada o lenta del pH durante la producción de los productos lácteos fermentados (tales como yogur o queso), la maduración lenta del queso y el deterioro de la textura de un alimento hasta el punto en que no resulta apetecible o resulta inadecuado para el consumo humano.In one embodiment, the term "low susceptibility to bacteriophage multiplication" refers to the level of bacteriophage multiplication in a bacterium being below a level that could cause a detrimental effect on a culture in a period of given time. Such harmful effects on a crop include, but are not limited to, the lack of milk coagulation during the production of fermented milk products (such as yogurt or cheese), an inadequate or slow reduction of pH during production of fermented dairy products (such as yogurt or cheese), the slow maturation of cheese and the deterioration of the texture of a food to the point where it is not appetizing or is unsuitable for human consumption.
Para un conjunto equivalente de condiciones de cultivo, la susceptibilidad a un bacteriófago de una bacteria de la presente invención es, en comparación con la bacteria de tipo salvaje, 100 veces inferior (eficiencia de plaqueo [EOP]=10-2), preferentementeFor an equivalent set of culture conditions, the susceptibility to a bacteriophage of a bacterium of the present invention is, compared to the wild type bacterium, 100 times lower (plating efficiency [EOP] = 10-2), preferably
1.000 veces inferior (EOP=10-3), preferentemente 10.000 veces inferior (EOP=10-4), más preferentemente 100.000 veces inferior (EOP=10-5). Preferentemente, el nivel de multiplicación de los bacteriófagos en un cultivo se mide tras aproximadamente 14 horas de incubación del cultivo, más preferentemente tras aproximadamente 12 horas, más preferentemente tras aproximadamente 7 horas, más preferentemente tras aproximadamente 6 horas, más preferentemente tras aproximadamente 5 horas y más preferentemente tras aproximadamente 4 horas.1,000 times lower (EOP = 10-3), preferably 10,000 times lower (EOP = 10-4), more preferably 100,000 times lower (EOP = 10-5). Preferably, the level of bacteriophage multiplication in a culture is measured after about 14 hours of incubation of the culture, more preferably after about 12 hours, more preferably after about 7 hours, more preferably after about 6 hours, more preferably after about 5 hours and more preferably after about 4 hours.
En un aspecto adicional se proporciona un método para proporcionar sensibilidad a una célula (preferentemente una célula bacteriana) frente a un bacteriófago, que comprende las etapas siguientes: (a) proporcionar un seudoespaciador de CRISPR de por lo menos un bacteriófago, (b) identificar una o más combinaciones funcionales de repetición CRISPR-cas en una célula que es sustancialmente resistente al bacteriófago, yIn a further aspect a method is provided for providing sensitivity to a cell (preferably a bacterial cell) against a bacteriophage, comprising the following steps: (a) providing a CRISPR pseudo spacer of at least one bacteriophage, (b) identifying one or more CRISPR-cas repeat functional combinations in a cell that is substantially resistant to bacteriophage, and
(c) manipular por lo menos un locus CRISPR en la célula sustancialmente sensible de manera que comprende uno o más seudoespaciadores de CRISPR o uno o más espaciadores de CRISPR que son complementarios u homólogos a uno o más seudoespaciadores de CRISPR que presentan un grado reducido de homología en comparación con el locus o loci CRISPR en la célula sustancialmente resistente.(c) manipulating at least one CRISPR locus in the substantially sensitive cell such that it comprises one or more CRISPR pseudo spacers or one or more CRISPR spacers that are complementary or homologous to one or more CRISPR pseudo spacers that have a reduced degree of homology compared to the CRISPR locus or loci in the substantially resistant cell.
En un aspecto adicional se proporciona un método para modular (por ejemplo reducir) el lisotipo de una célula (preferentemente una célula bacteriana), que comprende uno o más genes o proteínas cas y una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar un seudoespaciador de CRISPR en un bacteriófago frente al que debe modularse la resistencia, e (ii) modificar la secuencia del espaciador de CRISPR de la célula de manera que el espaciador de CRISPR de la célula presente un grado reducido de homología respecto al seudoespaciador de CRISPR del bacteriófago que comprende el ácido nucleico diana.In a further aspect a method is provided for modulating (for example reducing) the lysotype of a cell (preferably a bacterial cell), which comprises one or more cas genes or proteins and one or more, preferably two or more CRISPR repeats, comprising the following steps: (i) identify a pseudo-spacer of CRISPR in a bacteriophage against which resistance should be modulated, and (ii) modify the sequence of the CRISPR spacer of the cell so that the CRISPR spacer of the cell has a degree reduced homology with respect to the pseudo-spacer of the bacteriophage CRISPR comprising the target nucleic acid.
En todavía un aspecto adicional se proporciona un método para modular (por ejemplo reducir o disminuir) la resistencia de una célula bacteriana, que comprende uno o más genes o proteínas cas y una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR frente a un bacteriófago, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar uno o más seudoespaciadores de CRISPR en un bacteriófago frente al que debe modularse la resistencia, (ii) identificar un espaciador de CRISPR en la célula bacteriana en la que debe modularse la resistencia, que es homólogo al espaciador o seudoespaciadores de CRISPR, e (iii) modificar la secuencia del espaciador de CRISPR en la célula bacteriana en la que debe modularse la resistencia, de manera que el espaciador de CRISPR presenta un grado de homología más bajo respecto al espaciador o seudoespaciadores de CRISPR del bacteriófago frente al que debe modularse la resistencia.In still a further aspect a method is provided for modulating (for example reducing or decreasing) the resistance of a bacterial cell, comprising one or more genes or cas proteins and one or more, preferably two or more CRISPR repeats against a bacteriophage, comprising the following steps: (i) identify one or more CRISPR pseudo spacers in a bacteriophage against which the resistance should be modulated, (ii) identify a CRISPR spacer in the bacterial cell in which the resistance must be modulated, which is homologous to the CRISPR spacer or pseudo-spacers, and (iii) modify the sequence of the CRISPR spacer in the bacterial cell in which the resistance should be modulated, so that the CRISPR spacer has a lower degree of homology with respect to the spacer or pseudo-spacers of CRISPR of the bacteriophage against which resistance should be modulated.
Apropiadamente, el espaciador de CRISPR de la célula presenta un grado reducido de homología, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90 ó 95% de la homología en comparación con el espaciador o seudoespaciadores de CRISPR del bacteriófago contra el que debe modularse la resistencia.Appropriately, the cell CRISPR spacer has a reduced degree of homology, such as 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90 or 95% of the homology compared to the CRISPR spacer or pseudo spacers of the bacteriophage against which the resistance should be modulated.
Por lo tanto, pueden prepararse células bacterianas según la presente invención que presentan una "susceptibilidad incrementada a la multiplicación de bacteriófagos". Tal como se utiliza en la presente memoria, dicha expresión se refiere a que la bacteria presenta una susceptibilidad incrementada o alta frente a la multiplicación de bacteriófagos en comparación con la bacteria de tipo salvaje al cultivarla en, por ejemplo, medio lácteo.Therefore, bacterial cells according to the present invention can be prepared which have an "increased susceptibility to bacteriophage multiplication". As used herein, said expression refers to the bacterium having an increased or high susceptibility to bacteriophage multiplication compared to the wild-type bacterium when grown in, for example, dairy medium.
En una forma de realización, la expresión "susceptibilidad elevada a la multiplicación de bacteriófagos" se refiere a que el nivel de multiplicación de bacteriófagos en una bacteria es superior a un nivel que podría provocar un efecto perjudicial en un cultivo en un periodo de tiempo dado. Entre dichos efectos perjudiciales en un cultivo se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la falta de coagulación de la leche durante la producción de productos lácteos fermentados (tales como yogur o queso), una reducción inadecuada o lenta del pH durante la producción de productos lácteos fermentados (tales como yogur o queso), la maduración lenta del queso y el deterioro de la textura de un alimento hasta el punto de que resulta inapetecible o inadecuada para el consumo humano. Para un conjunto equivalente de condiciones de cultivo, la susceptibilidad a un bacteriófago de una bacteria de la presente invención es, en comparación con la bacteria de tipo salvaje, 100 veces más alta, 1.000 veces más alta, 10.000 veces más alta óIn one embodiment, the expression "high susceptibility to bacteriophage multiplication" refers to the fact that the level of bacteriophage multiplication in a bacterium is greater than a level that could cause a detrimental effect on a culture in a given period of time. . Such damaging effects in a crop include, but are not limited to, the lack of milk coagulation during the production of fermented milk products (such as yogurt or cheese), an inadequate or slow reduction of the pH during the production of products Fermented dairy products (such as yogurt or cheese), the slow maturation of cheese and the deterioration of the texture of a food to the point that it is unappealable or unsuitable for human consumption. For an equivalent set of culture conditions, the susceptibility to a bacteriophage of a bacterium of the present invention is, compared to the wild-type bacterium, 100 times higher, 1,000 times higher, 10,000 times higher or
100.000 veces más alta (EOP=10-5). El nivel de multiplicación de bacteriófagos en un cultivo se mide tras aproximadamente 14 horas de incubación del cultivo, más preferentemente tras aproximadamente 12 horas, más preferentemente tras aproximadamente 7 horas, más preferentemente tras aproximadamente 6 horas, más preferentemente tras aproximadamente 5 horas y en una realización altamente preferente, tras aproximadamente 4 horas.100,000 times higher (EOP = 10-5). The level of bacteriophage multiplication in a culture is measured after about 14 hours of incubation of the culture, more preferably after about 12 hours, more preferably after about 7 hours, more preferably after about 6 hours, more preferably after about 5 hours and in a highly preferred embodiment, after about 4 hours.
Un espaciador de CRISPR se encuentra flanqueado por dos repeticiones CRISPR. En otras palabras, un espaciador de CRISPR presenta por lo menos una repetición CRISPR en cada lado.A CRISPR spacer is flanked by two CRISPR repetitions. In other words, a CRISPR spacer has at least one CRISPR repeat on each side.
BACTERIASBACTERIA
En una forma de realización adicional, la secuencia de ácidos nucleicos diana o un producto de transcripción de la misma se puede derivar o puede ser derivable (preferentemente se deriva) de una o más bacterias. De acuerdo con lo expuesto anteriormente, puede modularse la resistencia de una célula, por ejemplo una célula bacteriana, frente a bacterias o a un componente de las mismas.In a further embodiment, the target nucleic acid sequence or a transcription product thereof can be derived or derivable (preferably derived) from one or more bacteria. In accordance with the foregoing, the resistance of a cell, for example a bacterial cell, against bacteria or a component thereof can be modulated.
La secuencia de nucleótidos diana puede ser o derivarse de un gen que es o se asocia a la resistencia a la transferencia de plásmido a bacterias. Según la presente forma de realización de la presente invención, se modifica uno o más espaciadores de CRISPR en la célula de manera que el espaciador de CRISPR de la célula presente homología respecto al espaciador de CRISPR y/o el seudoespaciador de CRISPR contenido en el ADN de plásmido de la célula bacteriana, de manera que proporcione resistencia frente a uno o más plásmidos particulares, impidiendo de esta manera la transferencia de ADN foráneo a la célula. Específicamente pueden ser dianas regiones particulares dentro del ADN de plásmido de manera que se proporcione inmunidad frente al ADN de plásmido, tal como secuencias dentro del origen de replicación del plásmido o secuencias dentro de genes codificantes de las proteínas de replicación.The target nucleotide sequence may be or be derived from a gene that is or is associated with resistance to plasmid transfer to bacteria. According to the present embodiment of the present invention, one or more CRISPR spacers in the cell are modified so that the CRISPR spacer of the cell exhibits homology with respect to the CRISPR spacer and / or the CRISPR pseudo-spacer contained in the DNA. plasmid of the bacterial cell, so as to provide resistance against one or more particular plasmids, thereby preventing the transfer of foreign DNA to the cell. Specifically, particular regions within the plasmid DNA may be targeted so as to provide immunity against plasmid DNA, such as sequences within the origin of plasmid replication or sequences within genes encoding replication proteins.
De esta manera, según el presente aspecto, el método comprende las etapas siguientes: (i) identificar un espaciador de CRISPR y/o un seudoespaciador de CRISPR derivable (preferentemente derivado) del ADN de plásmido de una célula bacteriana frente a la que debe modularse la resistencia, e (ii) modificar la secuencia de un espaciador de CRISPR en la célula en la que debe modularse resistencia, de manera que el espaciador de CRISPR y/o seudoespaciador de CRISPR de la célula presenta homología respecto al espaciador de CRISPR contenido en el elemento o elementos genéticos móviles de la célula.Thus, according to the present aspect, the method comprises the following steps: (i) identify a CRISPR spacer and / or a CRISPR pseudo spacer derivable (preferably derived) from the plasmid DNA of a bacterial cell against which it should be modulated resistance, and (ii) modify the sequence of a CRISPR spacer in the cell in which resistance should be modulated, so that the CRISPR spacer and / or CRISPR pseudo spacer of the cell exhibits homology with respect to the CRISPR spacer contained in the mobile genetic element or elements of the cell.
En todavía un aspecto adicional se proporciona un método adicional para proporcionar resistencia a una célula frente a uno o más elementos genéticos móviles, que comprende las etapas siguientes: (a) identificar un espaciador de CRISPR y/o un seudoespaciador de CRISPR derivable (preferentemente derivado) de uno o más elementos genéticos móviles, (b) identificar una o más combinaciones funcionales de repetición CRISPR-cas en una célula que es sustancialmente sensible al elemento o elementos genéticos móviles, y (c) manipular el locus o loci CRISPR en la célula sustancialmente sensible, de manera que comprenda o presente homología respecto a uno o más espaciadores de CRISPR y/o seudoespaciadores de CRISPR procedentes del elemento o elementos genéticos móviles, para proporcionar resistencia a la célula.In still a further aspect an additional method is provided to provide resistance to a cell against one or more mobile genetic elements, which comprises the following steps: (a) identify a CRISPR spacer and / or a derivative CRISPR pseudo spacer (preferably derived ) of one or more mobile genetic elements, (b) identify one or more functional CRISPR-cas repeat combinations in a cell that is substantially sensitive to the mobile genetic element or elements, and (c) manipulate the CRISPR locus or loci in the cell substantially sensitive, so as to comprise or present homology with respect to one or more CRISPR spacers and / or CRISPR pseudo spacers from the mobile genetic element or elements, to provide resistance to the cell.
La secuencia de nucleótidos diana puede ser o derivarse de un gen que es o se asocia a la resistencia a antibióticos. El término "antibiótico" se entiende que se refiere a una composición o grupo químico que reduce la viabilidad o que inhibe el crecimiento o la reproducción de microbios. Entre los genes de resistencia a antibióticos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, blatem, blarob, blashv, aadB, aacC1, aacC2, aacC3, aacA4, mecA, vanA, vanH, vanX, satA, aacA-aphH, vat, vga, msrA sul y/o int. Entre los genes de resistencia a antibióticos se incluyen los se derivan o que son derivables (preferentemente que se derivan) de especies bacterianas, incluyendo, aunque sin limitación, los géneros Escherichia, Klebsiella, Seudomonas, Proteus, Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Haemophilus y Moraxella. Los genes de resistencia a antibióticos también incluyen los que se derivan o que son derivables (preferentemente que se derivan) de especies bacterianas, incluyendo, aunque sin limitación, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Seudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis.The target nucleotide sequence can be or be derived from a gene that is or is associated with antibiotic resistance. The term "antibiotic" is understood to refer to a chemical composition or group that reduces viability or that inhibits the growth or reproduction of microbes. Antibiotic resistance genes include, but are not limited to, blatem, blarob, blashv, aadB, aacC1, aacC2, aacC3, aacA4, mecA, vanA, vanH, vanX, satA, aacA-aphH, vat, vga, msrA sul and / or int. Antibiotic resistance genes include those derived from or derived from (preferably derived) from bacterial species, including, but not limited to, the genera Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Proteus, Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Haemophilus and Moraxella Antibiotic resistance genes also include those that are derived or that are derivable (preferably derived) from bacterial species, including, but not limited to, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis.
Pueden añadirse espaciadores de CRISPR y/o seudoespaciadores de CRISPR particulares derivables (preferentemente derivados) de genes codificantes de resistencia a antibióticos, dentro de un locus CRISPR de una célula, tal como una célula receptora, de manera que se evita la transferencia de genes que proporcionan resistencia a antibióticos a la célula, reduciendo de esta manera el riesgo de adquirir marcadores de resistencia a antibiótico. A título de ejemplo, entre las dianas también pueden incluirse vanR (un gen que proporciona resistencia a la vancomicina), o tetR, un gen que proporciona resistencia a la tetraciclina, o con diana en inhibidores de beta-lactamasa.Particular CRISPR spacers and / or pseudo-spacers of CRISPR may be added derivable (preferably derived) from antibiotic resistance coding genes, into a CRISPR locus of a cell, such as a recipient cell, so as to prevent the transfer of genes that provide antibiotic resistance to the cell, thereby reducing the risk of acquiring antibiotic resistance markers. By way of example, vanR (a gene that provides resistance to vancomycin), or tetR, a gene that provides resistance to tetracycline, or target in beta-lactamase inhibitors may also be included among the targets.
De esta manera, según el presente aspecto, el método comprende las etapas siguientes: (i) identificar uno o más espaciadores de CRISPR y/o seudoespaciadores de CRISPR derivables (preferentemente derivados) de una célula que comprende uno o más genes o marcadores de resistencia a antibióticos, e (ii) modificar la secuencia del espaciador de CRISPR en una célula que no comprende o que no expresa los genes o marcadores de resistencia a antibióticos, de manera que el espaciador de CRISPR de la célula presenta homología respecto a uno o más espaciadores de CRISPR y/o seudoespaciadores de CRISPR contenidos en la célula que comprende uno o más genesThus, according to the present aspect, the method comprises the following steps: (i) identify one or more CRISPR spacers and / or CRISPR pseudo spacers (preferably derived) from a cell comprising one or more genes or resistance markers to antibiotics, and (ii) modify the sequence of the CRISPR spacer in a cell that does not understand or does not express the antibiotic resistance genes or markers, so that the cell CRISPR spacer has homology to one or more CRISPR spacers and / or CRISPR pseudo spacers contained in the cell comprising one or more genes
o marcadores de resistencia a antibióticos.or antibiotic resistance markers.
En todavía un aspecto adicional se proporciona un método para modular la adquisición de marcadores de resistencia a antibióticos en una célula, que comprende las etapas siguientes: (a) identificar uno o más espaciadores de CRISPR y/o seudoespaciadores de CRISPR derivables (preferentemente derivados) de una célula que comprende uno o más genes o marcadores de resistencia a antibióticos, (b) identificar uno o más loci CRISPR en una célula que no comprende o que no expresa los genes o marcadores de resistencia a antibióticos, y (c) modificar la secuencia del espaciador de CRISPR en la célula que no comprende o que no expresa los genes o marcadores de resistencia a antibióticos, de manera que el espaciador de CRISPR y/o los seudoespaciadores de CRISPR presenta homología respecto al espaciador de CRISPR contenido en la célula resistente a la transferencia de genes que proporcionan resistencia a uno o más antibióticos.In still a further aspect a method is provided to modulate the acquisition of antibiotic resistance markers in a cell, which comprises the following steps: (a) identify one or more CRISPR spacers and / or derivative CRISPR pseudo spacers (preferably derivatives) of a cell comprising one or more antibiotic resistance genes or markers, (b) identify one or more CRISPR loci in a cell that does not understand or does not express antibiotic resistance genes or markers, and (c) modify the sequence of the CRISPR spacer in the cell that does not understand or does not express the antibiotic resistance genes or markers, so that the CRISPR spacer and / or CRISPR pseudo spacers has homology to the CRISPR spacer contained in the resistant cell to the transfer of genes that provide resistance to one or more antibiotics.
La secuencia de nucleótidos diana puede ser o derivarse de un gen que es o se asocia a genes codificantes de factores de virulencia. Pueden añadirse espaciadores de CRISPR y/o seudoespaciadores de CRISPR particulares derivables (preferentemente derivados) de genes codificantes de factores de virulencia, en un locus CRISPR de bacteria para proporcionar resistencia frente a la transferencia de genes que proporcionar virulencia en la bacteria. Por ejemplo, puede ser dianas factores que contribuyen comúnmente a la virulencia en los patógenos microbianos, tales como toxinas, internalinas y hemolisinas.The target nucleotide sequence may be or be derived from a gene that is or is associated with genes encoding virulence factors. Particular CRISPR spacers and / or particular CRISPR pseudo-spacers derivable (preferably derived) from virulence factor coding genes can be added in a bacterial CRISPR locus to provide resistance against gene transfer that provide virulence in the bacteria. For example, there may be targets that contribute commonly to virulence in microbial pathogens, such as toxins, internalins and hemolysins.
De esta manera, según el presente aspecto, el método comprende las etapas siguientes: (i) identificar uno o más espaciadores de CRISPR y/o seudoespaciadores de CRISPR derivables (preferentemente derivadas) de una célula que comprende uno o más factores de virulencia, e (ii) modificar la secuencia del espaciador de CRISPR en una célula que no comprende o que no expresa el factor o factores de virulencia o el marcadorThus, according to the present aspect, the method comprises the following steps: (i) identify one or more CRISPR spacers and / or CRISPR pseudo spacers derived (preferably derived) from a cell comprising one or more virulence factors, and (ii) modify the sequence of the CRISPR spacer in a cell that does not understand or does not express the virulence factor or factors or the marker
o marcadores de manera que el espaciador de CRISPR de la célula presenta homología respecto al espaciador o espaciadores de CRISPR y/o los seudoespaciadores de CRISPR contenidos en la célula que comprende uno o más factores de virulencia.or markers such that the CRISPR spacer of the cell has homology with respect to the CRISPR spacer or spacers and / or the CRISPR pseudo spacers contained in the cell comprising one or more virulence factors.
En todavía un aspecto adicional, se proporciona un método adicional para proporcionar resistencia a una célula frente a uno o más factores de virulencia o marcadores, que comprende las etapas siguientes: (a) identificar un espaciador de CRISPR y/o un seudoespaciador de CRISPR derivables (preferentemente derivados) de uno o más factores de virulencia o marcadores, (b) identificar una o más combinaciones funcionales de repetición CRISPR-cas en una célula que es sustancialmente sensible a uno o más factores de virulencia o marcadores, y (c) manipular el locus o loci CRISPR en la célula sustancialmente sensible de manera que comprenda uno o más espaciadores de CRISPR y/o seudoespaciadores de CRISPR procedentes de uno o más factores de virulencia o marcadores para convertir a la célula en resistente.In still a further aspect, an additional method is provided to provide resistance to a cell against one or more virulence factors or markers, comprising the following steps: (a) identify a CRISPR spacer and / or a derivative CRISPR pseudo-spacer (preferably derivatives) of one or more virulence factors or markers, (b) identify one or more CRISPR-cas repeat functional combinations in a cell that is substantially sensitive to one or more virulence factors or markers, and (c) manipulate the CRISPR locus or loci in the substantially sensitive cell so as to comprise one or more CRISPR spacers and / or CRISPR pseudo spacers from one or more virulence factors or markers to make the cell resistant.
Un espaciador de CRISPR se encuentra flanqueado por dos repeticiones CRISPR. En otras palabras, un espaciador de CRISPR presenta por lo menos una repetición CRISPR en cada lado.A CRISPR spacer is flanked by two CRISPR repetitions. In other words, a CRISPR spacer has at least one CRISPR repeat on each side.
MODIFICACIÓNMODIFICATION
Las secuencias de ácidos nucleicos pueden modificarse mediante la manipulación genética de secuencias de ácidos nucleicos.Nucleic acid sequences can be modified by genetic manipulation of nucleic acid sequences.
Puede modificarse la totalidad o parte de la secuencia de ácidos nucleicos.All or part of the nucleic acid sequence can be modified.
Puede modificarse la totalidad o parte de uno o más espaciadores de CRISPR, genes o proteínas cas, repeticiones CRISPR o loci CRISPR.All or part of one or more CRISPR spacers, cas genes or proteins, CRISPR repeats or CRISPR loci can be modified.
Pueden modificarse espaciadores de CRISPR, genes o proteínas cas, repeticiones CRISPR o loci CRISPR recombinantes.CRISPR spacers, cas genes or proteins, recombinant CRISPR repeats or CRISPR loci can be modified.
Pueden modificarse espaciadores de CRISPR, genes o proteínas cas, repeticiones de CRISPR o loci CRISPR naturales.CRISPR spacers, cas genes or proteins, natural CRISPR repeats or CRISPR loci can be modified.
Pueden modificarse genes o proteínas cas y repeticiones CRISPR naturales.Cas genes or proteins and natural CRISPR repeats can be modified.
La manipulación genética puede llevarse a cabo utilizando diversos métodos que son conocidos en la técnica y típicamente incluyen métodos bien conocidos, tales como la amplificación por PCR, la clonación y la mutagénesis sitio-dirigida. Las mutaciones pueden introducirse utilizando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos flanqueantes de los sitios de mutación deseados. Se da a conocer un método adecuado en Morinaga et al. (Biotechnology 2:646-649, 1984). Otro método para introducir mutaciones en secuencias de nucleótidos codificantes de enzima se describe en Nelson y Long (Analytical Biochemistry 180:147-151, 1989). Se describe un método adicional en Sarkar y Sommer (Biotechniques 8:404-407, 1990, "The megaprimer method of site directed mutagenesis"). En la actualidad puede disponerse kits comercializados para llevar a cabo mutagénesis sitio-dirigida. Se describen en detalle métodos de manipulación genética en: J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, volúmenes 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Ausubel F.M. et al. (1995 y suplementos periódicos; Current Protocols in Molecular Biology, capítulos 9, 13 y 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.);Genetic manipulation can be carried out using various methods that are known in the art and typically include well known methods, such as PCR amplification, cloning and site-directed mutagenesis. Mutations can be introduced using synthetic oligonucleotides. These oligonucleotides contain flanking nucleotide sequences from the desired mutation sites. A suitable method is disclosed in Morinaga et al. (Biotechnology 2: 646-649, 1984). Another method for introducing mutations in nucleotide sequences encoding the enzyme is described in Nelson and Long (Analytical Biochemistry 180: 147-151, 1989). An additional method is described in Sarkar and Sommer (Biotechniques 8: 404-407, 1990, "The megaprimer method of site directed mutagenesis"). Currently, commercialized kits may be available to carry out site-directed mutagenesis. Genetic manipulation methods are described in detail in: J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, volumes 1 to 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Ausubel F.M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, chapters 9, 13 and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.);
B. Roe, J. Crabtree y A. Kahn, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons, 1996; M.J. Gait (editor), Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, 1984; y D.M.J. Lilley y J.E. Dahlberg, Methods of Enzymology: DNA Structure, Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press, 1992.B. Roe, J. Crabtree and A. Kahn, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons, 1996; M.J. Gait (editor), Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, 1984; and D.M.J. Lilley and J.E. Dahlberg, Methods of Enzymology: DNA Structure, Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press, 1992.
La etapa de manipulación genética incluso puede incluir métodos tales como la recombinación homóloga que puede resultar particularmente útil en el caso de que, por ejemplo, se inserten o delecionen espaciadores de CRISPR.The genetic manipulation step may even include methods such as homologous recombination that can be particularly useful in the case where, for example, CRISPR spacers are inserted or deleted.
La etapa de manipulación genética incluso puede incluir la activación de una o más secuencias de ácidos nucleicos, tales como un locus CRISPR, repeticiones CRISPR, espaciadores de CRISPR, genes o proteínas cas, combinaciones funcionales de genes o proteínas cas y repeticiones CRISPR o incluso combinaciones de los mismos.The genetic manipulation step may even include the activation of one or more nucleic acid sequences, such as a CRISPR locus, CRISPR repeats, CRISPR spacers, cas genes or proteins, functional combinations of cas genes or proteins and CRISPR repeats or even combinations thereof.
Apropiadamente, pueden insertarse uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR en por lo menos un locus CRISPR.Appropriately, one or more CRISPR spacers or pseudo-spacers of CRISPR can be inserted into at least one CRISPR locus.
En una forma de realización, la modificación no interrumpe uno o más genes cas de por lo menos un locus CRISPR. En otra forma de realización, el gen o genes cas permanecen intactos.In one embodiment, the modification does not interrupt one or more cas genes of at least one CRISPR locus. In another embodiment, the cas gene or genes remain intact.
En una forma de realización, la modificación no interrumpe una o más repeticiones CRISPR de por lo menos un locus CRISPR. En una forma de realización, la repetición o repeticiones CRISPR permanece intacta.In one embodiment, the modification does not interrupt one or more CRISPR repetitions of at least one CRISPR locus. In one embodiment, the CRISPR repetition or repetitions remains intact.
Apropiadamente, puede insertarse uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR en por lo menos un locus CRISPR.Appropriately, one or more CRISPR spacers or pseudo-spacers of CRISPR can be inserted into at least one CRISPR locus.
Apropiadamente, puede insertarse uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR en el extremo 5' de por lo menos un locus CRISPR.Suitably, one or more CRISPR spacers or pseudo-spacers of CRISPR may be inserted at the 5 'end of at least one CRISPR locus.
En una forma de realización, la modificación comprende insertar por lo menos un espaciador de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR en una célula, tal como una célula receptora. En otra forma de realización, la modificación comprende insertar uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR en (por ejemplo para modificar o sustituir) uno o más espaciadores de CRISPR de una célula, tal como una célula receptora.In one embodiment, the modification comprises inserting at least one CRISPR spacer or CRISPR pseudo spacers into a cell, such as a recipient cell. In another embodiment, the modification comprises inserting one or more CRISPR spacers or CRISPR pseudo spacers in (for example to modify or replace) one or more CRISPR spacers of a cell, such as a receiving cell.
En una forma de realización, la modificación comprende insertar por lo menos un espaciador de CRISPR o un seudoespaciador de CRISPR de un organismo, tal como un organismo donante, en la célula. En otra forma de realización, la modificación comprende insertar uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo, tal como un organismo donante, en (por ejemplo para modificar o sustituir) unoIn one embodiment, the modification comprises inserting at least one CRISPR spacer or a CRISPR pseudo-spacer from an organism, such as a donor organism, into the cell. In another embodiment, the modification comprises inserting one or more CRISPR spacers or CRISPR pseudo spacers of an organism, such as a donor organism, into (for example to modify or replace) one
o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de una célula.or more CRISPR spacers or CRISPR pseudo spacers of a cell.
En una forma de realización, se insertan uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR, tal como uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo, tal como un organismo donante, en (por ejemplo para modificar o sustituir) uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de la célula.In one embodiment, one or more CRISPR spacers or pseudo-spacers of CRISPR, such as one or more CRISPR spacers or pseudo-spacers of CRISPR of an organism, such as a donor organism, are inserted into (for example to modify or replace) one or more CRISPR spacers or pseudo spacers of CRISPR of the cell.
En una forma de realización, se insertan uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR, tal como uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo, tal como un organismo donante, en (por ejemplo para modificar o sustituir) una o más repeticiones CRISPR, preferentemente dosIn one embodiment, one or more CRISPR spacers or pseudo-spacers of CRISPR, such as one or more CRISPR spacers or pseudo-spacers of CRISPR of an organism, such as a donor organism, are inserted into (for example to modify or replace) one or more CRISPR repetitions, preferably two
o más repeticiones CRISPR de la célula. En la presente forma de realización de la invención resulta preferido que por lo menos una combinación funcional de repetición CRISPR-cas permanezca intacta en la célula.or more CRISPR cell repetitions. In the present embodiment of the invention it is preferred that at least one functional CRISPR-cas repeat combination remains intact in the cell.
En una forma de realización, se insertan uno o más espaciadores CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR, tal como uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo, tal como un organismo donante, en (por ejemplo para modificar o sustituir) el mismo espaciador de CRISPR o espaciadores de CRISPR diferentes de la célula.In one embodiment, one or more CRISPR spacers or pseudo-spacers of CRISPR, such as one or more CRISPR spacers or pseudo-spacers of CRISPR of an organism, such as a donor organism, are inserted into (for example to modify or replace) the same CRISPR spacer or CRISPR spacers different from the cell.
En una forma de realización, se insertan uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR, tal como uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo, tal como un organismo donante, contiguamente (por ejemplo para modificar o sustituir) uno o más espaciadores de CRISPR o espaciadores de CRISPR de la célula.In one embodiment, one or more CRISPR spacers or pseudo-spacers of CRISPR, such as one or more CRISPR spacers or pseudo-spacers of CRISPR of an organism, such as a donor organism, are contiguously inserted (for example to modify or replace) one or more CRISPR spacers or CRISPR cell spacers.
En el contexto de la presente invención, el término "contiguo" se refiere a "a continuación de" en su sentido más amplio e incluye "directamente contiguo". De esta manera, en una forma de realización puede insertarse uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo "de manera directamente contigua" a uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de la célula, es decir, el espaciador o espaciadores de CRISPR o espaciador o espaciadores de CRISPR se insertan de manera que no existan nucleótidos intermedios entre los espaciadores.In the context of the present invention, the term "contiguous" refers to "following" in its broadest sense and includes "directly contiguous". Thus, in one embodiment, one or more CRISPR spacers or CRISPR pseudo spacers of an organism "directly contiguous" can be inserted into one or more CRISPR spacers or CRISPR pseudo spacers, that is, the spacer. or CRISPR spacers or CRISPR spacers or spacers are inserted so that there are no intermediate nucleotides between the spacers.
En otra forma de realización, el espaciador o espaciadores de CRISPR o el espaciador o seudoespaciadores de CRISPR se insertan de manera que existan por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 10.000, 100.000 ó inclusoIn another embodiment, the CRISPR spacer or spacers or the CRISPR spacer or pseudo spacers are inserted so that there are at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 10,000, 100,000 or even
En otra forma de realización, el nucleótido intermedio puede denominarse secuencia líder. Estas expresiones se utilizan intercambiablemente en la presente memoria. La secuencia líder puede ser de una longitud diferente en diferentes bacterias. Apropiadamente, la secuencia líder presenta una longitud de por lo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400 ó 500 ó más nucleótidos. Apropiadamente, la secuencia líder se encuentra entre el último gen cas (en el extremo 3') y la primera repetición CRISPR (en el extremo 5') del locus CRISPR.In another embodiment, the intermediate nucleotide may be called the leader sequence. These expressions are used interchangeably herein. The leader sequence can be of a different length in different bacteria. Appropriately, the leader sequence has a length of at least 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400 or 500 or more nucleotides. Appropriately, the leader sequence is between the last cas gene (at the 3 'end) and the first CRISPR repeat (at the 5' end) of the CRISPR locus.
En una forma de realización, la secuencia líder puede presentar una longitud comprendida entre aproximadamente 20 y 500 nucleótidos.In one embodiment, the leader sequence may have a length between about 20 and 500 nucleotides.
En una forma de realización, se insertan uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR, tal como uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo donante, contiguamente a una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR de la célula.In one embodiment, one or more CRISPR spacers or pseudo-spacers of CRISPR are inserted, such as one or more CRISPR spacers or pseudo-spacers of CRISPR of a donor organism, adjacent to one or more, preferably two or more CRISPR repeats of the cell.
En otra forma de realización, se insertan uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR, tal como uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo donante, contiguamente a uno o más genes cas de la célula.In another embodiment, one or more CRISPR spacers or pseudo-spacers of CRISPR are inserted, such as one or more CRISPR spacers or pseudo-spacers of CRISPR of a donor organism, contiguously to one or more cas genes of the cell.
En otra forma de realización, se insertan uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR, tal como uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo donante, contiguamente a los mismos o diferentes espaciadores de la célula receptora.In another embodiment, one or more CRISPR spacers or pseudo-spacers of CRISPR are inserted, such as one or more CRISPR spacers or pseudo-spacers of CRISPR of a donor organism, contiguously to the same or different spacers of the recipient cell.
En otra forma de realización, se insertan uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR, tal como uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo donante, cada uno insertado contiguamente a los mismos genes cas o diferentes genes cas de la célula receptora.In another embodiment, one or more CRISPR spacers or pseudo-spacers of CRISPR are inserted, such as one or more CRISPR spacers or pseudo-spacers of CRISPR of a donor organism, each adjacent to the same cas genes or different cas genes of the recipient cell
En otra forma de realización, uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR, tal como uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo donante, se insertan cada uno contiguamente a los mismos genes cas o en diferentes genes cas de la célula receptora.In another embodiment, one or more CRISPR spacers or pseudo-spacers of CRISPR, such as one or more CRISPR spacers or pseudo-spacers of CRISPR of a donor organism, are each contiguously inserted into the same cas genes or in different cas genes of the recipient cell
En otra forma de realización, dos o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR, tal como dos o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo donante, se insertan cada uno contiguamente a espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR y/o genes cas iguales o diferentes de la célula receptora.In another embodiment, two or more CRISPR spacers or pseudo-spacers of CRISPR, such as two or more CRISPR spacers or pseudo-spacers of a donor organism, are each contiguously inserted into CRISPR spacers or pseudo-spacers of CRISPR and / or same or different cas genes from the recipient cell.
En otra forma de realización, la secuencia del espaciador de CRISPR, tal como uno o más espaciadores de CRISPR de un organismo donante, de la célula receptora se modifica de manera que el espaciador de CRISPR presente homología respecto al espaciador de CRISPR del organismo donante.In another embodiment, the CRISPR spacer sequence, such as one or more CRISPR spacers of a donor organism, of the recipient cell is modified so that the CRISPR spacer exhibits homology to the CRISPR spacer of the donor organism.
En otra forma de realización, se modifica la secuencia del espaciador de la célula de manera que presente homología respecto al espaciador de CRISPR o seudoespaciador de CRISPR del organismo.In another embodiment, the cell spacer sequence is modified so that it exhibits homology to the CRISPR spacer or CRISPR pseudo spacer of the organism.
En una forma de realización, el espaciador de CRISPR presenta una homología de 100% respecto al espaciador de CRISPR del organismo donante.In one embodiment, the CRISPR spacer has a 100% homology with respect to the CRISPR spacer of the donor organism.
El espaciador o espaciadores CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR pueden comprender ADN o ARN de origen genómico, sintético o recombinante.The CRISPR spacer or spacers or CRISPR pseudo spacers may comprise DNA or RNA of genomic, synthetic or recombinant origin.
El espaciador o espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR pueden ser de doble cadena o de una cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas.The CRISPR spacer or spacers or CRISPR pseudo spacers can be double-stranded or single-stranded, representing the sense chain or the antisense chain or combinations thereof.
El espaciador o espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR pueden prepararse mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante (por ejemplo ADN recombinante) tal como se describe en la presente memoria.The CRISPR spacer or spacers or CRISPR pseudo spacers can be prepared by using recombinant DNA techniques (eg recombinant DNA) as described herein.
La modificación puede comprender insertar uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo, tal como un organismo donante, que es sustancialmente resistente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo en uno o más loci CRISPR de una célula sustancialmente sensible.The modification may comprise inserting one or more CRISPR spacers or CRISPR pseudo spacers of an organism, such as a donor organism, which is substantially resistant to a target nucleic acid or a transcription product thereof in one or more CRISPR loci of a cell substantially sensitive.
La modificación puede comprender insertar uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo, tal como un organismo donante, que son sustancialmente resistentes a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo en (por ejemplo entre) una combinación funcional de por lo menos dos repeticiones CRISPR y por lo menos un gen cas en una célula sustancialmente sensible.The modification may comprise inserting one or more CRISPR spacers or CRISPR pseudo spacers of an organism, such as a donor organism, which are substantially resistant to a target nucleic acid or a transcription product thereof in (for example, between) a functional combination of at least two CRISPR repeats and at least one cas gene in a substantially sensitive cell.
La modificación incluso puede comprender la modificación (por ejemplo la mutación) del ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico, de manera que se creen uno o más genes cas en el ADN de la célula. A título de ejemplo adicional, los genes cas pueden clonarse en un constructo, plásmido o vector y similar que después se transforma en la célula, utilizando métodos tales como los descritos en la presente memoria.The modification may even comprise the modification (eg mutation) of a cell's DNA (for example a recipient cell), such as plasmid DNA or genomic DNA, so that one or more cas genes are created in the DNA of the cell. cell. By way of an additional example, the cas genes can be cloned into a construct, plasmid or vector and the like that is then transformed into the cell, using methods such as those described herein.
La modificación incluso puede comprender la modificación (por ejemplo la mutación) del ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico, de manera que se creen uno o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR en el ADN de la célula. A título de ejemplo adicional, las repeticiones CRISPR pueden clonarse en un constructo, plásmido o vector y similar que después se transforma en la célula, utilizando métodos tales como los descritos en la presente memoria.The modification may even comprise the modification (for example the mutation) of the DNA of a cell (for example a recipient cell), such as plasmid DNA or genomic DNA, so that one or more, preferably two or more CRISPR repeats, are created in the cell’s DNA. By way of an additional example, CRISPR repeats can be cloned into a construct, plasmid or vector and the like that is then transformed into the cell, using methods such as those described herein.
La modificación incluso puede comprender la modificación (por ejemplo la mutación) del ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico, de manera que se creen una o más combinaciones funcionales de cas-repetición CRISPR en el ADN de la célula. A título de ejemplo adicional, pueden clonarse las combinaciones funcionales de cas-repetición CRISPR en un constructo, plásmido o vector y similar que después se transforma en la célula, utilizando métodos tales como los descritos en la presente memoria.The modification may even comprise the modification (eg mutation) of the DNA of a cell (for example a recipient cell), such as plasmid DNA or genomic DNA, so that one or more functional combinations of CRISPR cas-repeat are created in the cell’s DNA. As a further example, the functional combinations of CRISPR cas-repeat can be cloned into a construct, plasmid or vector and the like that is then transformed into the cell, using methods such as those described herein.
La modificación incluso puede comprender la modificación (por ejemplo la mutación) del ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico, de manera que se creen uno o más espaciadores de CRISPR en el ADN de la célula. A título de ejemplo adicional, los espaciadores de CRISPR pueden clonarse en un constructo, plásmido o vector y similar que después se transforman en la célula, utilizando métodos tales como los descritos en la presente memoria.The modification may even comprise the modification (for example the mutation) of the DNA of a cell (for example a recipient cell), such as plasmid DNA or genomic DNA, so that one or more CRISPR spacers are created in the DNA of the cell. By way of an additional example, CRISPR spacers can be cloned into a construct, plasmid or vector and the like that are then transformed into the cell, using methods such as those described herein.
En una forma de realización, un espaciador de CRISPR se encuentra flanqueado por dos repeticiones CRISPR. En otras palabras, un espaciador de CRISPR presenta por lo menos una repetición CRISPR en cada lado.In one embodiment, a CRISPR spacer is flanked by two CRISPR repetitions. In other words, a CRISPR spacer has at least one CRISPR repeat on each side.
Apropiadamente, la modificación comprender insertar uno o más espaciadores de CRISPR (por ejemplo espaciadores de CRISPR heterólogos) en la vecindad de (por ejemplo contiguos, apropiadamente, directamente contiguos a) uno o más genes cas y/o la secuencia líder. Apropiadamente, según la presente forma de realización de la presente realización, la organización del locus CRISPR natural se mantiene tras la inserción de unoAppropriately, the modification comprises inserting one or more CRISPR spacers (for example heterologous CRISPR spacers) in the vicinity of (e.g. contiguously, appropriately, directly contiguous a) one or more cas genes and / or the leader sequence. Appropriately, according to the present embodiment of the present embodiment, the organization of the natural CRISPR locus is maintained after insertion of one
o más espaciadores de CRISPR.or more CRISPR spacers.
AGRUPACIÓNGROUP
Inesperadamente también se ha descubierto que no resulta posible únicamente intercambiar combinaciones de repetición CRISPR-cas entre cualquier célula (por ejemplo cualquier cepa, especie o género de células) debido a que se cree que esto no resultará necesariamente en combinaciones funcionales de repetición CRISPR-cas.Unexpectedly it has also been discovered that it is not possible only to exchange CRISPR-cas repeat combinations between any cell (for example any strain, species or cell genus) because it is believed that this will not necessarily result in functional CRISPR-cas repeat combinations. .
Por el contrario, para que la combinación o combinaciones de repetición CRISPRcas resulten funcionales deberían ser compatibles. De acuerdo con lo anterior, se cree que no resulta posible intercambiar genes cas o repeticiones CRISPR entre diferentes loci CRISPR a menos que pertenezcan a la misma agrupación.On the contrary, for the combination or CRISPRcas repeat combinations to be functional they should be compatible. In accordance with the above, it is believed that it is not possible to exchange cas genes or CRISPR repeats between different CRISPR loci unless they belong to the same grouping.
Resulta todavía más inesperado que las agrupaciones no sigan la filogenia del "organismo". Específicamente, dentro de un organismo, puede existir más de un CRISPR. Este CRISPR o CRISPR pueden pertenecer a diferentes agrupaciones, aunque se encuentren presentes en el mismo organismo. En consecuencia, se cree que una combinación funcional de repetición CRISPR-cas requiere que la combinación se intercambie dentro de una agrupación y no dentro de un organismo.It is even more unexpected that clusters do not follow the phylogeny of the "organism." Specifically, within an organism, there may be more than one CRISPR. This CRISPR or CRISPR can belong to different groups, even if they are present in the same organism. Consequently, it is believed that a functional CRISPR-cas repeat combination requires that the combination be exchanged within a cluster and not within an organism.
Para evitar dudas, el término "agrupación" tal como se utiliza en la presente memoria no se refiere a una agrupación de genes situada en el mismo locus (típicamente formando un operón) sino al resultado del análisis de comparación de secuencias, tal como el análisis de comparación de múltiples secuencias y/o de múltiples alineaciones de secuencias y/o el análisis de gráficos de puntos. De acuerdo con lo expuesto anteriormente, puede llevarse a cabo el análisis de agrupaciones de los loci CRISPR utilizando diversos métodos que son conocidos en la técnica, tales como el análisis de gráfico de puntos tal como se enseña posteriormente en la presente memoria, por ejemplo, o múltiples alineaciones seguido del cálculo de un dendrograma.For the avoidance of doubt, the term "cluster" as used herein does not refer to a cluster of genes located in the same locus (typically forming an operon) but to the result of the sequence comparison analysis, such as the analysis for comparison of multiple sequences and / or multiple sequence alignments and / or dot plot analysis. In accordance with the foregoing, cluster analysis of CRISPR loci can be carried out using various methods that are known in the art, such as dot plot analysis as taught herein below, for example, or multiple alignments followed by the calculation of a dendrogram.
Ventajosamente, la utilización de una o más combinaciones de repetición CRISPRcas presentes simultáneamente de manera natural permite el intercambio de la combinación tanto dentro como entre una especie dada, permitiendo de esta manera manipular la resistencia de una cepa utilizando la combinación de una cepa diferente.Advantageously, the use of one or more naturally occurring CRISPRcas repeat combinations simultaneously allows the combination to be exchanged both within and between a given species, thus allowing to manipulate the resistance of a strain using the combination of a different strain.
La agrupación puede ser una clase, familia o grupo de secuencias.The grouping can be a class, family or group of sequences.
DETERMINACIÓN DE LA RESISTENCIADETERMINATION OF RESISTANCE
En un aspecto adicional se proporciona un método para determinar el perfil de resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "perfil de resistencia" se refiere a una o más entidades contra las que es sensible o resistente la célula. De acuerdo con lo anterior, el perfil de resistencia de una célula puede ser que la célula sea resistente a un primer bacteriófago, sensible a un segundo bacteriófago, resistente a un primer elemento genético móvil y sensible a un primer gen resistente a antibióticos, etc.In a further aspect a method is provided for determining the resistance profile of a cell against a target nucleic acid. As used herein, the term "resistance profile" refers to one or more entities against which the cell is sensitive or resistant. According to the above, the resistance profile of a cell may be that the cell is resistant to a first bacteriophage, sensitive to a second bacteriophage, resistant to a first mobile genetic element and sensitive to a first antibiotic resistant gene, etc.
Pueden detectarse o secuenciarse uno o más genes o proteínas cas y/o una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR y/o uno o más espaciadores de CRISPR, etc. dentro de una célula, de manera que se predice/determinar el perfil de resistencia probable de una célula particular.One or more genes or proteins cas and / or one or more may be detected or sequenced, preferably two or more CRISPR repeats and / or one or more CRISPR spacers, etc. within a cell, so that the probable resistance profile of a particular cell is predicted / determined.
Apropiadamente, se detectan o se secuencian uno o más espaciadores de CRISPR dentro de una célula, de manera que se predice/determinar el perfil de resistencia probable de una célula particular.Suitably, one or more CRISPR spacers are detected or sequenced within a cell, so that the probable resistance profile of a particular cell is predicted / determined.
Entre los métodos de detección adecuados pueden incluirse PCR, hibridación ADN-ADN (o la hibridación ADN-ARN, es decir, utilizando sondas de ADN o ARN que podría ser sintéticas, oligonucleótidos marcados, por ejemplo). También pueden utilizarse micromatrices de ADN.Suitable detection methods may include PCR, DNA-DNA hybridization (or DNA-RNA hybridization, that is, using DNA or RNA probes that could be synthetic, labeled oligonucleotides, for example). DNA microarrays can also be used.
Pueden detectarse o secuenciarse una o más combinaciones funcionales de casrepetición CRISPR y/o uno o más espaciadores de CRISPR dentro de una célula, de manera que se predice/determina el perfil de resistencia probable de una célula particular. A título de ejemplo, resulta posible predecir/determinar el perfil de resistencia probable de una célula bacteriana particular frente a uno o más bacteriófagos que puede utilizarseOne or more functional combinations of CRISPR casting and / or one or more CRISPR spacers within a cell can be detected or sequenced, so that the probable resistance profile of a particular cell is predicted / determined. As an example, it is possible to predict / determine the probable resistance profile of a particular bacterial cell against one or more bacteriophages that can be used
para predecir el lisotipo para la selección microbiana.to predict the lysotype for microbial selection.
Pueden secuenciarse uno o más genes cas y/o una o más repeticiones CRISPR además de uno o más espaciadores de CRISPR con el fin de verificar la compatibilidad del a combinación de gen cas-repetición CRISPR o incluso para identificar nuevas parejas compatibles de cas/repetición.One or more cas genes and / or one or more CRISPR repeats may be sequenced in addition to one or more CRISPR spacers in order to verify the compatibility of the CRISPR cas-repeat gene combination or even to identify new compatible cas / repeat partners. .
CÉLULA RECEPTORARECEIVING CELL
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "célula receptora" se refiere a cualquier célula en la que se modula o debe modularse la resistencia frente a un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.As used herein, the term "recipient cell" refers to any cell in which resistance to a target nucleic acid or transcription product thereof is modulated or must be modulated.
En una forma de realización, la célula receptora se refiere a cualquier célula que comprende el ácido nucleico recombinante según la presente invención.In one embodiment, the recipient cell refers to any cell comprising the recombinant nucleic acid according to the present invention.
La célula receptora puede comprender una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR y uno o más genes o proteínas cas. Apropiadamente, las repeticiones CRISPR y los genes o proteínas cas forman una combinación funcional en la célula receptora, tal como se describe en la presente memoria.The recipient cell may comprise one or more, preferably two or more CRISPR repeats and one or more genes or cas proteins. Appropriately, CRISPR repeats and cas genes or proteins form a functional combination in the recipient cell, as described herein.
La célula receptora puede comprender una o más repeticiones CRISPR modificadas y/o uno o más genes o proteínas cas modificadas. Apropiadamente, las repeticiones CRISPR modificadas y/o los genes o proteínas cas modificados forman una combinación funcional en la célula receptora, tal como se describe en la presente memoria.The recipient cell may comprise one or more modified CRISPR repeats and / or one or more modified cas genes or proteins. Suitably, the modified CRISPR repeats and / or the modified cas genes or proteins form a functional combination in the recipient cell, as described herein.
La célula receptora puede comprender una o más repeticiones CRISPR genéticamente manipuladas y/o uno o más genes o proteínas cas genéticamente manipulados. Apropiadamente, las repeticiones CRISPR genéticamente manipuladas y/o los genes o proteínas cas genéticamente manipulados forman una combinación funcional en la célula receptora, tal como se describe en la presente memoria.The recipient cell may comprise one or more genetically engineered CRISPR repeats and / or one or more genetically engineered genes or proteins. Appropriately, genetically engineered CRISPR repeats and / or genetically engineered cas genes or proteins form a functional combination in the recipient cell, as described herein.
La célula receptora puede comprender una o más repeticiones CRISPR recombinantes y/o uno o más genes o proteínas cas recombinantes. Apropiadamente, las repeticiones CRISPR recombinantes y/o los genes o proteínas cas recombinantes forman una combinación funcional en la célula receptora, tal como se describe en la presente memoria.The recipient cell may comprise one or more recombinant CRISPR repeats and / or one or more recombinant cas genes or proteins. Suitably, the recombinant CRISPR repeats and / or the recombinant cas genes or proteins form a functional combination in the recipient cell, as described herein.
La célula receptora puede comprender una o más repeticiones CRISPR naturales y por lo menos un gen o proteína cas natural. Apropiadamente, la repetición o repeticiones CRISPR y dicho por lo menos un gen o proteína cas forman una combinación funcional.The recipient cell may comprise one or more natural CRISPR repeats and at least one natural cas gene or protein. Appropriately, the CRISPR repeat or repetitions and said at least one cas gene or protein form a functional combination.
La expresión "de origen natural" se refiere a que existe naturalmente en la Naturaleza.The expression "of natural origin" refers to the fact that it exists naturally in Nature.
La célula receptora incluso puede comprender combinaciones de una o más repeticiones CRISPR naturales o recombinantes modificadas, manipuladas genéticamente, y uno o más genes o proteínas cas modificados, manipulados genéticamente, recombinantes o naturales. Apropiadamente, el espaciador o espaciadores CRISPR modificados, manipulados genéticamente, recombinantes o naturales, o por lo menos un gen o proteína cas modificado, manipulado genéticamente, recombinante o natural, forman una combinación funcional.The recipient cell may even comprise combinations of one or more natural or recombinant modified CRISPR repeats, genetically engineered, and one or more genetically engineered, recombinant or natural modified genes or proteins. Suitably, the modified CRISPR spacer or spacers, genetically engineered, recombinant or natural, or at least one modified, genetically engineered, recombinant or natural gene or cas protein, form a functional combination.
Apropiadamente, la célula receptora es una célula procariótica.Appropriately, the recipient cell is a prokaryotic cell.
Apropiadamente, la célula receptora es una célula bacteriana. Se indican en la presente memoria las células bacterianas adecuadas.Appropriately, the recipient cell is a bacterial cell. Suitable bacterial cells are indicated herein.
La célula bacteriana puede seleccionarse de una especie de bacteria del ácido láctico, una especie de Bifidobacterium, una especie de Brevibacterium, una especie de Propionibacterium, una especie de Lactococcus, una especie de Streptococcus, una especie de Lactobacillus, incluyendo especies de Enterococcus, especies de Pediococcus, una especie de Leuconostoc y especies de Oenococcus.The bacterial cell can be selected from a species of lactic acid bacteria, a species of Bifidobacterium, a species of Brevibacterium, a species of Propionibacterium, a species of Lactococcus, a species of Streptococcus, a species of Lactobacillus, including species of Enterococcus, species of Pediococcus, a species of Leuconostoc and species of Oenococcus.
Entre las especies adecuadas se incluyen, aunque sin limitación, Lactococcus lactis, incluyendo Lactococcus lactis subsp. lactis y Lactococcus lactis subsp. cremoris, Leuconostoc sp., Lactococcus lactis subsp. lactis biovar, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus helveticus, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus y Lactobacillus casei.Suitable species include, but are not limited to, Lactococcus lactis, including Lactococcus lactis subsp. lactis and Lactococcus lactis subsp. cremoris, Leuconostoc sp., Lactococcus lactis subsp. biovar lactis, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Lactobacillus helveticus, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei.
La célula en la que debe modularse la resistencia puede ser una célula bacteriana utilizada par ala fermentación de la carne (incluyendo de vaca, de cerdo y de ave de corral), incluyendo, aunque sin limitación, bacterias del ácido láctico, Pediococcus cerevisiae, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, especies de Micrococcus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus curvatus, Pediococcus pentosaceus, Staphylococcus xylosus y Staphylococcus vitulinus y mezclas de los mismos (Food Biotechnology 538-39The cell in which the resistance should be modulated may be a bacterial cell used for the fermentation of meat (including beef, pork and poultry), including, but not limited to, lactic acid bacteria, Pediococcus cerevisiae, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Micrococcus species, Lactobacillus sakei, Lactobacillus curvatus, Pediococcus pentosaceus, Staphylococcus xylosus and Staphylococcus vitulinus and mixtures thereof (Food Biotechnology 538-39
(D. Knorr, editor, 1987); C. Pederson, Microbiology of Fermented Foods 210-34 (2a edición, 1979); patente US nº 2.225.783).(D. Knorr, editor, 1987); C. Pederson, Microbiology of Fermented Foods 210-34 (2nd edition, 1979); US Patent No. 2,225,783).
La célula en la que debe modularse la resistencia puede ser una célula bacteriana utilizada para la fermentación de verduras (por ejemplo zanahorias, pepinos, tomates, pimientos y col), incluyendo, aunque sin limitación, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus pentosaceus y mezclas de los mismos (Food Biotechnology 540 (D. Knorr, editor, 1987); C. Pederson, Microbiology of Fermented Foods, 153-209 (2a edición, 1979); patentes US nº 3.024.116, nº 3.403.032, nº 3.932.674 y nº 3.897.307).The cell in which resistance should be modulated can be a bacterial cell used for the fermentation of vegetables (for example carrots, cucumbers, tomatoes, peppers and cabbage), including, but not limited to, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus pentosaceus and mixtures thereof (Food Biotechnology 540 (D. Knorr, editor, 1987); C. Pederson, Microbiology of Fermented Foods, 153-209 (2nd edition, 1979); US Patent No. 3,024,116, No. 3,403,032 , No. 3,932,674 and No. 3,897,307).
La célula en la que debe modularse la resistencia puede ser una célula bacteriana utilizada para la fermentación de masa formada a partir de cereales (por ejemplo trigo, centeno, arroz, avena, cebada y maíz).The cell in which the resistance must be modulated can be a bacterial cell used for the fermentation of dough formed from cereals (for example wheat, rye, rice, oats, barley and corn).
La célula en la que debe modularse la resistencia puede ser un célula bacteriana utilizada para la producción de vino. Típicamente, esto se consigue mediante la fermentación de jugo de fruta, típicamente mosto.The cell in which resistance must be modulated can be a bacterial cell used for wine production. Typically, this is achieved by fermentation of fruit juice, typically must.
La célula en la que debe modularse la resistencia puede ser una célula bacteriana utilizada para la fermentación de la leche para producir queso, tal como LactobacillusThe cell in which the resistance must be modulated can be a bacterial cell used for the fermentation of milk to produce cheese, such as Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, Bifidobacteria y Enterococci, etc., y mezclas de los mismos (Food Biotechnology 530 (D. Knorr, editor, 1987); C. Pederson, Microbiology of Fermented Foods 135-51 (2a edición, 1979)).delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, Bifidobacteria and Enterococci, etc., and mixtures thereof (Food Biotechnology 530 (D. Knorr, editor, 1987); C. Pederson, Microbiology of Fermented Foods 135-51 (2nd edition, 1979)).
La célula en la que debe modularse la resistencia puede ser una célula bacteriana utilizada para la fermentación de la leche para producir queso, tal como Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar, Lactococci, Bifidobacteria y Enterococci, etc., y mezclas de los mismos (Food Biotechnology 530 (D. Knorr, editor, 1987); C. Pederson, Microbiology of Fermented Foods, 135-51 (2a edición, 1979)). La célula en la que debe modularse la resistencia puede ser una célula bacteriana utilizada para la fermentación del huevo, tal como Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum y mezclas de los mismos (Food Biotechnology 538-39 (D. Knorr, editor, 1987)).The cell in which resistance must be modulated can be a bacterial cell used for the fermentation of milk to produce cheese, such as Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar, Lactococci, Bifidobacteria and Enterococci, etc., and mixtures thereof (Food Biotechnology 530 (D. Knorr, editor, 1987); C. Pederson, Microbiology of Fermented Foods, 135-51 (2nd edition, 1979)) . The cell in which resistance must be modulated can be a bacterial cell used for egg fermentation, such as Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum and mixtures thereof (Food Biotechnology 538-39 (D. Knorr, editor, 1987)).
La célula en la que debe modularse la resistencia puede ser una bacteria que comprende naturalmente uno o más loci CRISPR. Se han identificado loci CRISPR en más de 40 procariotas (Jansen et al. 2002b, Mojica et al. 2005, Haft et al. 2005), incluyendo, aunque sin limitación, Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus, Halocarcula, Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobcterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Myxococcus, Campylobacter, Wolinella, ACinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pasteurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthomonas, Yersinia, Treponema y Thermotoga.The cell in which the resistance must be modulated may be a bacterium that naturally comprises one or more CRISPR loci. CRISPR loci have been identified in more than 40 prokaryotes (Jansen et al. 2002b, Mojica et al. 2005, Haft et al. 2005), including, but not limited to, Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus, Halocarcula, Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Myblasmium, Biobacterium, Chlorobromeria, Microbacterium, Biobacterium, Biobacterium, Biobacterium, Biobacterium, bacterium Myxococcus, Campylobacter, Wolinella, ACinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pasteurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthomonas, Yersinia, Treponema and Thermotoga.
La célula en la que debe modularse la resistencia puede ser una bacteria para la utilización en composiciones cosméticas o farmacéuticas. Dicha composiciones pueden comprender un cultivo microbiano y/o una bacteria marcada y/o un cultivo celular según la presente invención. De esta manera, el cultivo microbiano y/o la bacteria marcada y/o un cultivo celular según la presente invención pueden ser compatibles en cosmética, o en farmacia o en terapia.The cell in which the resistance must be modulated may be a bacterium for use in cosmetic or pharmaceutical compositions. Said compositions may comprise a microbial culture and / or a labeled bacterium and / or a cell culture according to the present invention. In this way, the microbial culture and / or the labeled bacteria and / or a cell culture according to the present invention can be compatible in cosmetics, or in pharmacy or in therapy.
ORGANISMO DONANTEDONOR ORGANISM
En una forma de realización, la expresión "organismo donante" se refiere a un organismo o célula a partir del que son derivables la repetición CRISPR y/o el gen cas y/o una o más combinaciones de los mismos y/o espaciadores de CRISPR (preferentemente se derivan). Éstas pueden ser iguales o diferentes.In one embodiment, the term "donor organism" refers to an organism or cell from which the CRISPR repeat and / or the cas gene and / or one or more combinations thereof and / or CRISPR spacers are derived (preferably derived). These may be the same or different.
En una forma de realización, la expresión "organismo donante" se refiere a un organismo o célula a partir de la que son derivables (preferentemente se derivan) una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR y/o uno o más genes cas y/o una o más combinaciones de los mismos y/o espaciadores de CRISPR. Pueden ser iguales o diferentes.In one embodiment, the term "donor organism" refers to an organism or cell from which one or more are derived (preferably derived), preferably two or more CRISPR repeats and / or one or more cas genes and / or one or more combinations thereof and / or CRISPR spacers. They can be the same or different.
En una forma de realización, el espaciador de CRISPR o seudoespaciador de CRISPR se deriva sintéticamente.In one embodiment, the CRISPR spacer or CRISPR pseudo spacer is synthetically derived.
En una forma de realización, el organismo o célula donante comprende uno o más espaciadores de CRISPR, que proporciona la inmunidad específica contra un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.In one embodiment, the donor organism or cell comprises one or more CRISPR spacers, which provides specific immunity against a target nucleic acid or transcription product thereof.
En una forma de realización, el organismo o célula donante a partir del que es derivable (preferentemente que se deriva) el gen cas y/o la repetición de CRISPR y/o combinación de los mismos también es la célula/organismo receptor para el locus CRISPR recombinante. Pueden ser iguales o diferentes.In one embodiment, the donor organism or cell from which the cas gene and / or the repetition of CRISPR and / or combination thereof is also derivable (preferably derived) is also the recipient cell / organism for the locus. Recombinant CRISPR They can be the same or different.
En una forma de realización, el organismo o célula donante a partir de la que es derivable (preferentemente que se deriva) el espaciador de CRISPR también es la célula/organismo receptor para el locus CRISPR recombinante. Pueden ser iguales o diferentes.In one embodiment, the donor organism or cell from which the CRISPR spacer is derivable (preferably derived) is also the recipient cell / organism for the recombinant CRISPR locus. They can be the same or different.
En el caso de que el organismo donante sea una célula bacteriana, el organismo donante típicamente comprende un espacidor de CRISPR que proporciona la inmunidad específica contra el ´cido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.In the event that the donor organism is a bacterial cell, the donor organism typically comprises a CRISPR spacer that provides specific immunity against the target nucleic acid or transcription product thereof.
El organismo puede ser una célula bacteriana o un bacteriófago.The organism can be a bacterial cell or a bacteriophage.
Apropiadamente el organismo es un bacteriófago.Appropriately the organism is a bacteriophage.
CÉLULAS HUÉSPEDGUEST CELLS
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "célula huésped" se refiere a cualquier célula que comprende la combinación, el constructo o el vector y similar según la presente invención.As used herein, the term "host cell" refers to any cell comprising the combination, the construct or the vector and the like according to the present invention.
Las células huésped pueden transformarse o transfectarse con una secuencia de nucleótidos contenida en un vector, por ejemplo un vector de clonación. Dicha secuencia de nucleótidos puede encontrarse en un vector para la replicación y/o expresión de la secuencia de nucleótidos. Las células se seleccionan para que resulten compatibles con dicho vector y pueden ser, por ejemplo, células procarióticas (por ejemplo bacterianas).Host cells can be transformed or transfected with a nucleotide sequence contained in a vector, for example a cloning vector. Said nucleotide sequence can be found in a vector for replication and / or expression of the nucleotide sequence. The cells are selected to be compatible with said vector and can be, for example, prokaryotic cells (for example bacterial).
Algunos aspectos de la presente invención también se refieren a células huésped que comprenden la combinación, el constructo o el vector de la presente invención. El constructo o el vector puede comprender una secuencia de nucleótidos para la replicación y la expresión de la secuencia. Las células se seleccionan para resultar compatibles con el vector y pueden ser, por ejemplo, células procarióticas (por ejemplo bacterianas).Some aspects of the present invention also relate to host cells comprising the combination, the construct or the vector of the present invention. The construct or vector may comprise a nucleotide sequence for replication and sequence expression. The cells are selected to be compatible with the vector and can be, for example, prokaryotic cells (for example bacterial).
CONSTRUCTOCONSTRUCTION
En un aspecto adicional, se proporciona un constructo que comprende una o más de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la presente memoria.In a further aspect, a construct is provided comprising one or more of the nucleic acid sequences indicated herein.
El término "constructo", que es sinónimo de términos tales como "conjugado", "casete" e "híbrido", incluye una secuencia de nucleótidos directa o indirectamente unida a otra secuencia, tal como una secuencia reguladora (por ejemplo un promotor). A título de ejemplo, la presente invención comprende un constructo que comprende una secuencia de nucleótidos operablemente ligada a dicha secuencia reguladora. La expresión "operablemente ligado" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes indicados se encuentran en una relación que permite que funcionen de la manera pretendida. Una secuencia reguladora "operablemente ligada" a una secuencia codificante se encuentra ligada de manera que la expresión de la secuencia codificante se consigue bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.The term "construct," which is synonymous with terms such as "conjugate," "cassette," and "hybrid," includes a nucleotide sequence directly or indirectly linked to another sequence, such as a regulatory sequence (eg, a promoter). By way of example, the present invention comprises a construct comprising a nucleotide sequence operably linked to said regulatory sequence. The term "operably linked" refers to a juxtaposition in which the indicated components are in a relationship that allows them to function as intended. A regulatory sequence "operably linked" to a coding sequence is linked so that expression of the coding sequence is achieved under conditions compatible with the control sequences.
La expresión "secuencias reguladoras" incluye promotores e intensificadores y otras señales de regulación de la expresión.The term "regulatory sequences" includes promoters and enhancers and other expression regulation signals.
El término "promotor" se utiliza en el sentido normal de la técnica, por ejemplo un sitio de unión de ARN polimerasa.The term "promoter" is used in the normal sense of the art, for example an RNA polymerase binding site.
El constructo incluso puede contener o expresar un marcador, que permite la selección del constructo de secuencia de nucleótidos en, por ejemplo, una bacteria. Existen diversos marcadores que pueden utilizarse, por ejemplo los marcadores que proporcionan resistencia a antibióticos, por ejemplo resistencia a antibióticos bacterianos, tales como eritromicina, ampicilina, estreptomicina y tetraciclina.The construct can even contain or express a marker, which allows the selection of the nucleotide sequence construct in, for example, a bacterium. There are various markers that can be used, for example markers that provide antibiotic resistance, for example resistance to bacterial antibiotics, such as erythromycin, ampicillin, streptomycin and tetracycline.
VECTORVECTOR
El constructo puede ser un vector (por ejemplo un plásmido) o incluirse en el mismo.The construct can be a vector (for example a plasmid) or be included therein.
De esta manera, en un aspecto adicional se proporciona un vector que comprende uno o más de los constructos o secuencias indicadas en la presente memoria.Thus, in a further aspect a vector is provided comprising one or more of the constructs or sequences indicated herein.
El término "vector" incluye vectores de expresión y vectores de transformación y vectores lanzadera.The term "vector" includes expression vectors and transformation vectors and shuttle vectors.
La expresión "vector de transformación" se refiere a un constructo que puede ser transferido de una entidad a otra entidad, que puede ser de la especie o de una especie diferente. En el caso de que el constructo pueda ser transferido de una especie a otra, el vector de transformación en ocasiones se denomina "vector lanzadera".The term "transformation vector" refers to a construct that can be transferred from one entity to another entity, which can be of the species or of a different species. In the event that the construct can be transferred from one species to another, the transformation vector is sometimes called the "shuttle vector."
Los vectores pueden transformarse en una célula adecuada (por ejemplo una célula huésped), tal como se indica posteriormente.Vectors can be transformed into a suitable cell (for example a host cell), as indicated below.
Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores plásmido o fágicos proporcionados con un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión de dicho polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor.The vectors can be, for example, plasmid or phage vectors provided with an origin of replication, optionally a promoter for the expression of said polynucleotide and optionally a promoter regulator.
Los vectores pueden contener una o más secuencias de nucleótidos de marcador seleccionable. Los sistemas de selección más adecuados para los microorganismos industriales son los formados por el grupo de marcadores de selección que no requiereThe vectors may contain one or more selectable marker nucleotide sequences. The most suitable selection systems for industrial microorganisms are those formed by the group of selection markers that do not require
una mutación en el organismo huésped.a mutation in the host organism.
Los vectores pueden utilizarse in vitro, por ejemplo para la producción de ARN, o utilizarse para transfectar o transformar una célula huésped.The vectors can be used in vitro, for example for the production of RNA, or used to transfect or transform a host cell.
De esta manera, pueden incorporarse polinucleótidos en un vector recombinante (típicamente un vector replicable), por ejemplo un vector de clonación o de expresión. El vector puede utilizarse para replicar el ácido nucleico en una célula huésped compatible.In this way, polynucleotides can be incorporated into a recombinant vector (typically a replicable vector), for example a cloning or expression vector. The vector can be used to replicate the nucleic acid in a compatible host cell.
TRANSFECCIÓNTRANSFECTION
La introducción de un ácido nucleico (por ejemplo un constructo o un vector) en una célula puede llevarse a cabo mediante diversos métodos. Por ejemplo, puede utilizarse la transfección con fosfato de calcio, la transfección mediada por DEAEdextrano, la transfección mediada por lípidos catiónicos, la electroporación, la transducción o la infección. Dichos métodos se describen en muchos manuales de laboratorio estándares, tales como Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.The introduction of a nucleic acid (for example a construct or a vector) into a cell can be carried out by various methods. For example, transfection with calcium phosphate, transfection mediated by DEAEdextran, transfection mediated by cationic lipids, electroporation, transduction or infection can be used. Such methods are described in many standard laboratory manuals, such as Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
Las células que contiene ácidos nucleicos (por ejemplo un constructo o un vector) pueden seleccionarse mediante la utilización de, por ejemplo, eritromicina para células transfectadas con un ácido nucleico (por ejemplo un constructo o vector) que incluye un marcador de resistencia seleccionable.Cells containing nucleic acids (for example a construct or a vector) can be selected by using, for example, erythromycin for cells transfected with a nucleic acid (for example a construct or vector) that includes a selectable resistance marker.
TRANSFORMACIÓNTRANSFORMATION
Las enseñanzas sobre la transformación de las células se encuentran bien documentadas en la técnica, por ejemplo ver Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1995.The teachings on cell transformation are well documented in the art, for example see Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1995.
Una célula puede transformarse con un ácido nucleico (por ejemplo un constructo o vector). Las células transformadas con la secuencia de nucleótidos pueden cultivarse bajo condiciones adecuadas para la replicación o expresión de la secuencia de nucleótidos.A cell can be transformed with a nucleic acid (for example a construct or vector). Cells transformed with the nucleotide sequence can be cultured under conditions suitable for replication or expression of the nucleotide sequence.
INTRODUCCIÓNINTRODUCTION
En el contexto de la introducción de un ácido nucleico en una célula, en una forma de realización resulta preferente que el término "introducción" se refiera a uno o más de entre transformación, transfección, conjugación o transducción.In the context of the introduction of a nucleic acid into a cell, in one embodiment it is preferred that the term "introduction" refers to one or more of between transformation, transfection, conjugation or transduction.
CULTIVOS INICIADORESINITIATING CROPS
Los cultivos iniciadores se utilizan extensivamente en la industria alimentaria en la preparación de productos fermentados, incluyendo productos lácteos, tales como yogur y queso, productos cárnicos, productos de panadería, vino y productos vegetales.Starter crops are used extensively in the food industry in the preparation of fermented products, including dairy products, such as yogurt and cheese, meat products, bakery products, wine and vegetable products.
Entre los cultivos iniciadores utilizados en la preparación de muchos productos de leche fermentada, queso y mantequilla se incluyen cultivos de bacterias, generalmente clasificados como bacterias del ácido láctico. Dichos cultivos iniciadores bacterianos proporcionan características específicas a diversos productos lácteos mediante la realización de varias funciones.Among the starter cultures used in the preparation of many fermented milk, cheese and butter products are included cultures of bacteria, generally classified as lactic acid bacteria. Such bacterial starter cultures provide specific characteristics to various dairy products by performing various functions.
Los cultivos no concentrados comerciales de bacterias se denominan en la industria "cultivos madre" y se propagan en el sitio de producción, por ejemplo lechería, antes de añadirlas a un material de partida comestible, tal como leche, para la fermentación. El cultivo iniciador propagado en el sitio de producción para la inoculación en un material de partida comestible se denomina "iniciador en masa".Commercial non-concentrated cultures of bacteria are referred to in the industry as "mother cultures" and are propagated at the production site, for example, dairy, before adding them to an edible starting material, such as milk, for fermentation. The starter culture propagated at the production site for inoculation into an edible starting material is called "mass initiator."
Entre los cultivos iniciadores adecuados para la utilización en la presente invención pueden incluirse cualquier organismo que resulta útil en la industria alimentaria, cosméticaSuitable starter cultures for use in the present invention may include any organism that is useful in the food, cosmetic industry
o farmacéutica.or pharmaceutical.
Por ejemplo, el cultivo iniciador puede resultar adecuado para la utilización en la industria lechera. En el caso de que se utilice en la industria lechera, el cultivo iniciador puede seleccionarse de entre una especie de bacteria del ácido láctico, una especie de Bifidobacterium, una especie de Brevibacterium, una especie de Propionibacerium. Entre los cultivos iniciadores adecuados del grupo de las bacterias del ácido láctico se incluyen cepas utilizadas comúnmente de una especie de Lactococcus, una especie de Streptococcus, una especie de Lactobacillus, incluyendo Lactobacillus acidophilus, una especie de Enterococcus, una especie de Pediococcus, una especie de Leuconostoc y una especie de Oenococcus.For example, the starter culture may be suitable for use in the dairy industry. If used in the dairy industry, the starter culture can be selected from a species of lactic acid bacteria, a species of Bifidobacterium, a species of Brevibacterium, a species of Propionibacerium. Suitable starter cultures of the lactic acid bacteria group include commonly used strains of a species of Lactococcus, a species of Streptococcus, a species of Lactobacillus, including Lactobacillus acidophilus, a species of Enterococcus, a species of Pediococcus, a species of Leuconostoc and a kind of Oenococcus.
Los cultivos de bacterias del ácido láctico se utilizan comúnmente en la preparación de productos de leche fermentada, tales como suero de leche, yogur o nata amarga, y en la preparación de mantequilla o queso, por ejemplo Brie o Harvati. Entre las especies de Lactococcus se incluyen el ampliamente utilizado Lactococcus lactis, incluyendo Lactococcus lactis subsp. lactis y Lactococcus lactis subsp. cremoris.Lactic acid bacteria cultures are commonly used in the preparation of fermented milk products, such as buttermilk, yogurt or sour cream, and in the preparation of butter or cheese, for example Brie or Harvati. Lactococcus species include the widely used Lactococcus lactis, including Lactococcus lactis subsp. lactis and Lactococcus lactis subsp. cremoris
Entre otras bacterias del ácido láctico se incluyen Leuconostoc sp., Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus helveticus. Además, entre las especies probióticas, tales como las especies de Lactococcus, se incluyen el ampliamente utilizado Lactococcus lactis, incluyendo Lactococcus lactis subsp. lactis y Lactococcus lactis subsp. cremoris. Se utilizan comúnmente cultivos mesofílicos de bacterias del ácido láctico en la preparación de productos de leche fermentada, tales como suero de leche, yogur o nata amarga, y en la preparación de mantequilla y queso, por ejemplo Brie o Harvati. Entre otras especies de Lactococcus se incluyen Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis, Leuconostoc sp., Lactococcus lactis subsp. lactis biovar, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbruecki subsp. bulgaris y Lactobacillus helveticus. Además, pueden añadirse cepas probióticas, tales como Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacilus casei durante dicha preparación para intensificar el sabor o para promover la salud.Other lactic acid bacteria include Leuconostoc sp., Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Lactobacillus helveticus. In addition, probiotic species, such as Lactococcus species, include the widely used Lactococcus lactis, including Lactococcus lactis subsp. lactis and Lactococcus lactis subsp. cremoris Mesophilic cultures of lactic acid bacteria are commonly used in the preparation of fermented milk products, such as buttermilk, yogurt or sour cream, and in the preparation of butter and cheese, for example Brie or Harvati. Other Lactococcus species include Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis, Leuconostoc sp., Lactococcus lactis subsp. lactis biovar, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbruecki subsp. bulgaris and Lactobacillus helveticus. In addition, probiotic strains, such as Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacilus casei can be added during said preparation to enhance flavor or promote health.
Entre los cultivos de bacterias del ácido láctico utilizados comúnmente en la preparación de los quesos cheddar y Monterrey Jack se incluyen Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis y Lactococcus lactis subsp. cremoris o combinaciones de los mismos.Lactic acid bacteria cultures commonly used in the preparation of cheddar and Monterrey Jack cheeses include Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis and Lactococcus lactis subsp. cremoris or combinations thereof.
Entre los cultivos termofílicos de bacterias del ácido láctico utilizados en la preparación de quesos italianos, tales como queso de pasta filata o parmesano, se incluyen Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Pueden añadirse otras especies de Lactobacillus, tales como Lactobacillus helveticus, durante la preparación con el fin de obtener un sabor deseado.Thermophilic cultures of lactic acid bacteria used in the preparation of Italian cheeses, such as filata or Parmesan cheese, include Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Other Lactobacillus species, such as Lactobacillus helveticus, may be added during preparation in order to obtain a desired flavor.
Ventajosamente, el organismo de cultivo iniciador puede comprender o consistir de una cepa modificada genéticamente (preparada según los métodos deseados en la presente memoria) de entre las cepas de bacterias del ácido láctico indicadas anteriormente o de cualquier otra cepa de cultivo iniciador.Advantageously, the starter culture organism may comprise or consist of a genetically modified strain (prepared according to the methods desired herein) from among the lactic acid bacteria strains indicated above or from any other starter culture strain.
La selección de organismos para el cultivo iniciador de la invención dependerá del tipo particular de productos que debe prepararse y tratarse. De esta manera, por ejemplo para la preparación de queso y mantequilla, se utilizan ampliamente cultivos mesofílicos de especies de Lactococcus, especies de Leuconostoc y especies de Lactobacillus, mientras que para el yogur y otros productos de leche fermentada, típicamente se utilizan cepas termofílicas de especies de Streptococcus y de Lactobacillus.The selection of organisms for the starter culture of the invention will depend on the particular type of products to be prepared and treated. Thus, for example for the preparation of cheese and butter, mesophilic cultures of Lactococcus species, Leuconostoc species and Lactobacillus species are widely used, while for yogurt and other fermented milk products, thermophilic strains of Streptococcus and Lactobacillus species.
El cultivo iniciador incluso puede ser un cultivo iniciador seco.The starter culture can even be a dry starter culture.
El cultivo iniciador puede ser un cultivo iniciador concentrado.The starter culture can be a concentrated starter culture.
El cultivo iniciador puede ser un cultivo iniciador concentrado utilizado en una inoculación directa.The starter culture can be a concentrated starter culture used in direct inoculation.
El cultivo iniciador puede ser un cultivo iniciador congelado.The starter culture can be a frozen starter culture.
El cultivo iniciador puede consistir de una cepa bacteriana, es decir, un cultivo puro. En este caso, sustancialmente la totalidad, o por lo menos una parte significativa del cultivo iniciador bacteriano, generalmente comprendería la misma bacteria.The starter culture may consist of a bacterial strain, that is, a pure culture. In this case, substantially all, or at least a significant part of the bacterial starter culture, would generally comprise the same bacteria.
Alternativamente, el cultivo iniciador puede comprender varias cepas bacterianas, es decir, un cultivo mixto definido.Alternatively, the starter culture may comprise several bacterial strains, that is, a defined mixed culture.
BACTERIAS DEL ÁCIDO LÁCTICOBACTERIA OF THE LACTIC ACID
Los cultivos iniciadores particularmente adecuados, en particular cultivos iniciadores secos, para la utilización en la presente invención comprenden bacterias del ácido láctico.Particularly suitable starter cultures, in particular dry starter cultures, for use in the present invention comprise lactic acid bacteria.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "bacterias del ácido láctico" se refiere a bacterias microaerofílicas o anaeróbicas Gram-positivas que fermentan el azúcar con producción de ácidos, incluyendo ácido láctico como el ácido producido predominantemente, ácido acético, ácido fórmico y ácido propiónico. Las bacterias del ácido láctico industrialmente más útiles se encuentran entre las especies de Lactococcus, tales como Lactococcus lactis, especies de Lactobacillus, especies de Bifidobacterium, especies de Streptococcus, especies de Leuconostoc, especies de Pediococcus y especies de Propionibacterium.As used herein, the term "lactic acid bacteria" refers to Gram-positive microaerophilic or anaerobic bacteria that ferment sugar with acid production, including lactic acid such as predominantly produced acid, acetic acid, formic acid. and propionic acid. The most useful industrially useful lactic acid bacteria are found among Lactococcus species, such as Lactococcus lactis, Lactobacillus species, Bifidobacterium species, Streptococcus species, Leuconostoc species, Pediococcus species and Propionibacterium species.
Los cultivos iniciadores de la presente invención pueden comprender una o más especies de bacterias del ácido láctico, tales como Lactococcus lactis, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus o combinaciones de los mismos.The starter cultures of the present invention may comprise one or more species of lactic acid bacteria, such as Lactococcus lactis, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus or combinations thereof.
Los cultivos iniciadores de bacterias del ácido láctico se utilizan comúnmente en la industria alimentaria en forma de cultivos de una mezcla de cepas que comprenden una o más especies. Para varios cultivos de mezcla de cepas, tales como los cultivos iniciadores de yogur que comprenden cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus, existe una relación simbiótica entre las especies, en la que la producción de ácido láctico es mayor que la de los cultivos de una única cepa de bacteria del ácido láctico (Rajagopal et al., J. Dairy Sci. 73:894-899, 1990).Lactic acid bacteria starter cultures are commonly used in the food industry in the form of cultures of a mixture of strains comprising one or more species. For several strain mixture cultures, such as yogurt starter cultures comprising strains of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus, there is a symbiotic relationship between the species, in which the production of lactic acid is greater than that of the cultures of a single strain of lactic acid bacteria (Rajagopal et al., J. Dairy Sci. 73: 894-899, 1990).
PREPARACIÓN DE CULTIVOS INICIADORESPREPARATION OF INITIATING CROPS
Pueden prepararse cultivos iniciadores mediante técnicas bien conocidas en la técnica, tales como las dadas a conocer en la patente US nº 4.621.058. A título de ejemplo, pueden prepararse cultivos iniciadores mediante la introducción de un inóculo, por ejemplo una bacteria, en un medio de crecimiento para producir un medio inoculado y madurar el medio inoculado para producir un cultivo iniciador.Starter cultures can be prepared by techniques well known in the art, such as those disclosed in US Patent No. 4,621,058. By way of example, starter cultures can be prepared by introducing an inoculum, for example a bacterium, into a growth medium to produce an inoculated medium and mature the inoculated medium to produce an initiating culture.
PREPARACIÓN DE CULTIVOS INICIADORES SECOSPREPARATION OF DRY INITIATOR CROPS
Los cultivos iniciadores secos pueden prepararse mediante técnicas bien conocidas en la técnica, tales como las que se comentan en las patentes US nº 4.423.079 y nº 4.140.800.Dry starter cultures can be prepared by techniques well known in the art, such as those discussed in US Patent Nos. 4,423,079 and 4,140,800.
Los cultivos iniciadores secos para la utilización en la presente invención pueden encontrarse en forma de preparaciones sólidas. Entre los ejemplos de preparaciones sólidas están comprendidos de manera no limitativa, comprimidos, pellets, cápsulas, polvos, gránulos y triturados que pueden ser humectables, secados por atomización, secados por congelación o liofilizados.Dry starter cultures for use in the present invention may be in the form of solid preparations. Examples of solid preparations include, but are not limited to, tablets, pellets, capsules, powders, granules and crushings that can be wettable, spray dried, freeze dried or freeze dried.
Los cultivos iniciadores secos para la utilización en la presente invención pueden encontrarse en una forma de pellet ultracongelado o en forma de polvos secados por congelación. Los cultivos iniciadores secos en un pellet ultracongelado o en forma de polvos secados por congelación pueden prepararse según los métodos conocidos en la técnica.Dry starter cultures for use in the present invention may be in a form of deep-frozen pellet or in the form of freeze-dried powders. Dry starter cultures in a deep-frozen pellet or in the form of freeze-dried powders can be prepared according to methods known in the art.
Los cultivos iniciadores para la utilización en la presente invención pueden encontrarse en forma de concentrados que comprenden una concentración sustancialmente alta de una o más bacterias. Apropiadamente, los concentrados pueden diluirse con agua o resuspenderse en agua u otros diluyentes adecuados, por ejemplo un medio de crecimiento apropiado o aceites minerales o vegetales, para la utilización en la presente invención. Los cultivos iniciadores secos de la presente invención en forma de concentrados pueden prepararse según métodos conocidos en la técnica, por ejemplo mediante centrifugación, filtración o una combinación de dichas técnicas.The starter cultures for use in the present invention may be in the form of concentrates comprising a substantially high concentration of one or more bacteria. Suitably, the concentrates may be diluted with water or resuspended in water or other suitable diluents, for example an appropriate growth medium or mineral or vegetable oils, for use in the present invention. The dried starter cultures of the present invention in the form of concentrates can be prepared according to methods known in the art, for example by centrifugation, filtration or a combination of said techniques.
PRODUCTOPRODUCT
Entre los productos adecuados para la utilización en la presente invención se incluyen, aunque sin limitación, alimentos, productos cosméticos o productos farmacéuticos.Products suitable for use in the present invention include, but are not limited to, food, cosmetic products or pharmaceuticals.
Cualquier producto que se prepare a partir de un cultivo, o que comprenda el mismo, se encuentra contemplado según la presente invención. Entre ellos se incluyen, aunque sin limitación, frutas, legumbres, cultivos de pienso y verduras, incluyendo productos derivados, cereales y productos derivados de cereales, alimentos lácteos y productos derivados lácteos, carne, aves de corral, marisco, productos cosméticos y farmacéuticos.Any product that is prepared from a crop, or that comprises the same, is contemplated according to the present invention. These include, but are not limited to, fruits, legumes, feed crops and vegetables, including derived products, cereals and cereal products, dairy foods and dairy products, meat, poultry, seafood, cosmetic and pharmaceutical products.
El término "alimento" se utiliza en un sentido amplio e incluye piensos, productos alimentarios, ingredientes alimentarios, suplementos alimentarios y alimentos funcionales.The term "food" is used in a broad sense and includes feed, food products, food ingredients, food supplements and functional foods.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "ingrediente alimentario" incluye una formulación que se añade o puede añadirse a alimentos, e incluye formulaciones que pueden utilizarse a niveles bajos en una amplia diversidad de productos que requieren, por ejemplo, la acidificación o la emulsión.As used herein, the term "food ingredient" includes a formulation that is added or can be added to foods, and includes formulations that can be used at low levels in a wide variety of products that require, for example, acidification. or the emulsion.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "alimento funcional" se refiere a un alimento que puede proporcionar no sólo un efecto nutricional y/o una satisfacción del gusto, sino que también puede proporcionar un efecto beneficioso adicional al consumidor. Aunque no existe ninguna definición legal de alimento funcional, la mayoría de partes interesadas en este área concuerdan en que existen alimentos que se comercializan como presentando efectos específicos sobre la salud.As used herein, the term "functional food" refers to a food that can provide not only a nutritional effect and / or a satisfaction of taste, but can also provide an additional beneficial effect to the consumer. Although there is no legal definition of functional food, most stakeholders in this area agree that there are foods that are marketed as presenting specific health effects.
El término "alimento" cubre alimentos para los seres humanos, así como alimentos para animales (es decir, un pienso), un suplemento alimentario o un alimento funcional.The term "food" covers food for humans, as well as food for animals (ie, a feed), a food supplement or a functional food.
El alimento puede encontrarse en la forma de una solución o de un sólido, dependiendo de la utilización y/o modo de aplicación y/o modo de administración.The food may be in the form of a solution or a solid, depending on the use and / or mode of application and / or mode of administration.
Las células indicadas en la presente memoria pueden utilizarse en la preparación de productos alimentarios tales como uno o más de entre: productos de confitería, productos lácteos, productos cárnicos, productos de aves de corral, productos de pescado y productos de panadería.The cells indicated herein can be used in the preparation of food products such as one or more of: confectionery products, dairy products, meat products, poultry products, fish products and bakery products.
A título de ejemplo, la bacteria puede utilizarse como ingrediente para bebidas refrescantes, un zumo de fruta o una bebida que comprende proteínas de suero, tés dietéticos, bebidas de cacao, bebidas lácteas y bebidas de bacterias del ácido láctico, yogur, yogur líquido y vino.By way of example, the bacteria can be used as an ingredient for refreshing beverages, a fruit juice or a beverage comprising whey proteins, dietary teas, cocoa drinks, dairy drinks and lactic acid bacteria drinks, yogurt, liquid yogurt and came.
También se proporciona un método para preparar un alimento, comprendiendo el método la mezcla de células según la presente invención con un ingrediente alimentario (tal como un material de partida para un alimento). El método para preparar un alimento también es otro aspecto de la presente invención.A method for preparing a food is also provided, the method comprising mixing cells according to the present invention with a food ingredient (such as a starting material for a food). The method of preparing a food is also another aspect of the present invention.
Apropiadamente, un producto tal como se describe en la presente memoria es un producto lácteo. Más preferentemente, un producto lácteo tal como se describe en la presente memoria es uno o más de los siguientes: un yogur, un queso (tal como un queso cuajado láctico, un queso duro, un queso semiduro, un queso cottage), un suero de mantequilla, quark, una nata amarga, kéfir, una bebida fermentada basada en suero, un koumiss, una bebida láctea y una bebida de yogur.Suitably, a product as described herein is a dairy product. More preferably, a dairy product as described herein is one or more of the following: a yogurt, a cheese (such as a lactic curd cheese, a hard cheese, a semi-hard cheese, a cottage cheese), a whey of butter, quark, a sour cream, kefir, a fermented serum-based drink, a koumiss, a dairy drink and a yogurt drink.
En la presente memoria, el término "alimento" se utiliza en un sentido amplio, y cubre alimentos para seres humanos así como alimentos para animales (es decir, un pienso). En un aspecto preferente, el alimento es para el consumo humano.Here, the term "food" is used in a broad sense, and covers food for humans as well as food for animals (ie, a feed). In a preferred aspect, the food is for human consumption.
El término pienso tal como se utiliza en la presente memoria incluye material vegetal crudo y procesado y material no vegetal. El pienso puede ser cualquier pienso adecuado para el consumo por un animal, incluyendo pienso (animal) para ganado, por ejemplo pienso para aves de corral, pienso para peces o pienso para crustáceos, por ejemplo.The term "feed" as used herein includes raw and processed plant material and non-plant material. The feed can be any feed suitable for consumption by an animal, including feed (animal) for livestock, for example feed for poultry, feed for fish or feed for crustaceans, for example.
VARIANTES/HOMÓLOGOS/DERIVADOS/FRAGMENTOSVARIANTS / HOMOLOGISTS / DERIVATIVES / FRAGMENTS
La presente invención comprende la utilización de variantes, homólogos, derivados y fragmentos de los mismos, incluyendo variantes, homólogos, derivados y fragmentos de loci CRISPR, espaciadores de CRISPR, seudoespaciadores de CRISPR, genes o proteínas cas, repeticiones CRISPR, combinaciones funcionales de repetición CRISPR-gen cas y secuencias diana de ácidos nucleicos o productos de transcripción de los mismos.The present invention comprises the use of variants, homologues, derivatives and fragments thereof, including variants, homologues, derivatives and fragments of CRISPR loci, CRISPR spacers, pseudo-spacers of CRISPR, genes or cas proteins, CRISPR repeats, functional repeat combinations CRISPR-cas gene and nucleic acid target sequences or transcription products thereof.
El término "variante" se utiliza para referirse a un polipéptido natural o secuencias de nucleótidos que difieren de una secuencia de tipo salvaje.The term "variant" is used to refer to a natural polypeptide or nucleotide sequences that differ from a wild type sequence.
El término "fragmento" indica que un polipéptido o secuencia de nucleótidos comprende una fracción de una secuencia de tipo salvaje. Puede comprender una o más secciones contiguas grandes o una pluralidad de secciones pequeñas. La secuencia también puede comprender otros elementos de secuencia, por ejemplo puede ser una proteína de fusión con otra proteína. Preferentemente, la secuencia comprende por lo menso 50%, más preferentemente por lo menos 65%, más preferentemente por lo menos 80%, más preferentemente por lo menos 85%, más preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, más preferentemente por lo menos 96%, más preferentemente por lo menos 97%, más preferentemente por lo menos 98%, más preferentemente por lo menos 99% de la secuencia de tipo salvaje.The term "fragment" indicates that a polypeptide or nucleotide sequence comprises a fraction of a wild type sequence. It may comprise one or more large contiguous sections or a plurality of small sections. The sequence may also comprise other sequence elements, for example it may be a fusion protein with another protein. Preferably, the sequence comprises at least 50%, more preferably at least 65%, more preferably at least 80%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90%, more preferably at least 95% , more preferably at least 96%, more preferably at least 97%, more preferably at least 98%, more preferably at least 99% of the wild type sequence.
Preferentemente, el fragmento conserva 50%, más preferentemente 60%, más preferentemente 70%, más preferentemente 80%, más preferentemente 85%, más preferentemente 90%, más preferentemente 95%, más preferentemente 96%, más preferentemente 97%, o más preferentemente 98%, más preferentemente 99% de la actividad del polipéptido o secuencia de nucleótidos de tipo salvaje.Preferably, the fragment retains 50%, more preferably 60%, more preferably 70%, more preferably 80%, more preferably 85%, more preferably 90%, more preferably 95%, more preferably 96%, more preferably 97%, or more preferably 98%, more preferably 99% of the activity of the wild type nucleotide polypeptide or sequence.
Preferentemente, un espaciador de CRISPR o un seudoespaciador de CRISPR comprende por lo menos 50%, más preferentemente por lo menos 65%, más preferentemente por lo menos 80%, más preferentemente por lo menos 85%, más preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, más preferentemente por lo menos 96%, más preferentemente por lo menos 97%, más preferentemente por lo menos 98%, más preferentemente por lo menos 99% de la secuencia de tipo salvaje. Preferentemente, un espaciador de CRISPR conserva 50%, más preferentemente 60%, más preferentemente 70%, más preferentemente 80%, más preferentemente 85%, más preferentemente 90%, más preferentemente 95%, más preferentemente 96%, más preferentemente 97%, más preferentemente 98%, o más preferentemente 99% del polipéptido o secuencia de nucleótidos de tipo salvaje.Preferably, a CRISPR spacer or a CRISPR pseudo spacer comprises at least 50%, more preferably at least 65%, more preferably at least 80%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90%, more preferably at least 95%, more preferably at least 96%, more preferably at least 97%, more preferably at least 98%, more preferably at least 99% of the wild type sequence. Preferably, a CRISPR spacer retains 50%, more preferably 60%, more preferably 70%, more preferably 80%, more preferably 85%, more preferably 90%, more preferably 95%, more preferably 96%, more preferably 97%, more preferably 98%, or more preferably 99% of the wild type nucleotide polypeptide or sequence.
Preferentemente, un gen cas comprende por lo menos 50%, más preferentemente por lo menos 65%, más preferentemente por lo menos 80%, más preferentemente por lo menos 85%, más preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, más preferentemente por lo menos 96%, más preferentemente por lo menos 97%, más preferentemente por lo menos 98%, más preferentemente por lo menos 99% de la secuencia de tipo salvaje. Preferentemente, un gen cas conserva 50%, más preferentemente 60%, más preferentemente 70%, más preferentemente 80%, más preferentemente 85%, más preferentemente 90%, más preferentemente 95%, más preferentemente 96%, más preferentemente 97%, más preferentemente 98%, más preferentemente 60% o más preferentemente 99% de la actividad del polipéptido o secuencia de ácidos nucleicos de tipo salvaje.Preferably, a cas gene comprises at least 50%, more preferably at least 65%, more preferably at least 80%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90%, more preferably at least 95 %, more preferably at least 96%, more preferably at least 97%, more preferably at least 98%, more preferably at least 99% of the wild type sequence. Preferably, a cas gene retains 50%, more preferably 60%, more preferably 70%, more preferably 80%, more preferably 85%, more preferably 90%, more preferably 95%, more preferably 96%, more preferably 97%, more preferably 98%, more preferably 60% or more preferably 99% of the activity of the wild type nucleic acid polypeptide or sequence.
Preferentemente, una proteína Cas comprende por lo menos 50%, más preferentemente por lo menos 65%, más preferentemente por lo menos 80%, más preferentemente por lo menos 85%, más preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, más preferentemente por lo menos 96%, más preferentemente por lo menos 97%, más preferentemente por lo menos 98%, más preferentemente por lo menos 99% de la secuencia de tipo salvaje. Preferentemente, una proteína Cas conserva 50%, más preferentemente 60%, más preferentemente 70%, más preferentemente 80%, más preferentemente 85%, más preferentemente 90%, más preferentemente 95%, más preferentemente 96%, más preferentemente 97%, más preferentemente 98% o más preferentemente 99% de la actividad del polipéptido o secuencia de nucleótidos de tipo salvaje.Preferably, a Cas protein comprises at least 50%, more preferably at least 65%, more preferably at least 80%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90%, more preferably at least 95 %, more preferably at least 96%, more preferably at least 97%, more preferably at least 98%, more preferably at least 99% of the wild type sequence. Preferably, a Cas protein retains 50%, more preferably 60%, more preferably 70%, more preferably 80%, more preferably 85%, more preferably 90%, more preferably 95%, more preferably 96%, more preferably 97%, more preferably 98% or more preferably 99% of the activity of the wild type nucleotide polypeptide or sequence.
Preferentemente, una repetición CRISPR comprende por lo menos 50%, más preferentemente por lo menos 65%, más preferentemente por lo menos 80%, más preferentemente por lo menos 85%, más preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, más preferentemente por lo menos 96%, más preferentemente por lo menos 97%, más preferentemente por lo menos 98%, más preferentemente por lo menos 99% de la actividad del polipéptido o secuencia de nucleótidos de tipo salvaje. Preferentemente, una repetición CRISPR retiene una actividad de 50%, más preferentemente 60%, más preferentemente 70%, más preferentemente 80%, más preferentemente 85%, más preferentemente 90%, más preferentemente 95%, más preferentemente 96%, más preferentemente 97%, más preferentemente 98%, o todavía más preferentemente 99% del polipéptido o secuencia de nucleótidos de tipo salvaje.Preferably, a CRISPR repeat comprises at least 50%, more preferably at least 65%, more preferably at least 80%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90%, more preferably at least 95 %, more preferably at least 96%, more preferably at least 97%, more preferably at least 98%, more preferably at least 99% of the activity of the wild type nucleotide polypeptide or sequence. Preferably, a CRISPR repeat retains an activity of 50%, more preferably 60%, more preferably 70%, more preferably 80%, more preferably 85%, more preferably 90%, more preferably 95%, more preferably 96%, more preferably 97 %, more preferably 98%, or even more preferably 99% of the wild-type nucleotide polypeptide or sequence.
Preferentemente, una combinación funcional de repetición CRISPR-cas comprende por lo menos 50%, más preferentemente por lo menos 65%, más preferentemente por lo menos 80%, más preferentemente por lo menos 85%, más preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, más preferentemente por lo menos 96%, más preferentemente por lo menos 97%, más preferentemente por lo menos 98%, más preferentemente por lo menos 99% de la secuencia de tipo salvaje. Preferentemente, la combinación funcional de repetición CRISPR-cas conserva 50%, más preferentemente 60%, más preferentemente 70%, más preferentemente 80%, más preferentemente 85%, más preferentemente 90%, más preferentemente 95%, más preferentemente 96%, más preferentemente 97%, más preferentemente 98% o más preferentemente 99% del polipéptido o secuencia de nucleótidos de tipo salvaje.Preferably, a functional CRISPR-cas repeat combination comprises at least 50%, more preferably at least 65%, more preferably at least 80%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90%, more preferably at least 95%, more preferably at least 96%, more preferably at least 97%, more preferably at least 98%, more preferably at least 99% of the wild type sequence. Preferably, the CRISPR-cas functional repeat combination retains 50%, more preferably 60%, more preferably 70%, more preferably 80%, more preferably 85%, more preferably 90%, more preferably 95%, more preferably 96%, more preferably 97%, more preferably 98% or more preferably 99% of the wild type nucleotide polypeptide or sequence.
Preferentemente, una secuencia de ácido nucleico diana comprende por lo menos 50%, más preferentemente por lo menos 65%, más preferentemente por lo menos 80%, más preferentemente por lo menos 85%, más preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, más preferentemente por lo menos 96%, más preferentemente por lo menos 97%, más preferentemente por lo menos 98%, todavía más preferentemente por lo menos 99% de la secuencia de tipo salvaje. Preferentemente, una secuencia de ácido nucleico diana retiene una actividad de 50%, más preferentemente 60%, más preferentemente 70%, más preferentemente 80%, más preferentemente 85%, más preferentemente 90%, más preferentemente 95%, más preferentemente 96%, más preferentemente 97%, más preferentemente 98%, o todavía más preferentemente 99% del polipéptido o la secuencia de nucleótidos de tipo salvaje.Preferably, a target nucleic acid sequence comprises at least 50%, more preferably at least 65%, more preferably at least 80%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90%, more preferably by at least 95%, more preferably at least 96%, more preferably at least 97%, more preferably at least 98%, still more preferably at least 99% of the wild type sequence. Preferably, a target nucleic acid sequence retains an activity of 50%, more preferably 60%, more preferably 70%, more preferably 80%, more preferably 85%, more preferably 90%, more preferably 95%, more preferably 96%, more preferably 97%, more preferably 98%, or even more preferably 99% of the wild-type nucleotide polypeptide or sequence.
El fragmento puede ser un fragmento funcional.The fragment can be a functional fragment.
La expresión "fragmento funcional" de una molécula se refiere a un fragmento que conserva o que presenta sustancialmente la misma actividad biológica que la molécula intacta. En todos los casos, un fragmento funcional de una molécula conserva por lo menos 10%, y por lo menos aproximadamente 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de la actividad biológica de la molécula intacta.The term "functional fragment" of a molecule refers to a fragment that preserves or exhibits substantially the same biological activity as the intact molecule. In all cases, a functional fragment of a molecule retains at least 10%, and at least about 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% of the biological activity of the intact molecule.
El término "homólogo" se refiere a una entidad que presenta una determinada homología con las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de la base de datos. En la presente memoria el término "homología" es equivalente a "identidad".The term "homologue" refers to an entity that has a certain homology with the amino acid and nucleotide sequences of the database. Here the term "homology" is equivalent to "identity."
En el presente contexto, se considera que una secuencia homóloga incluye una secuencia de aminoácidos que puede ser por lo menos 75, 85 ó 90% idéntica, preferentemente por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia de la invención. Aunque también puede considerarse la homología en términos de similitud (es decir, residuos aminoácidos que presentan propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención resulta preferido expresar la homología en términos de identidad de secuencia.In the present context, a homologous sequence is considered to include an amino acid sequence that can be at least 75, 85 or 90% identical, preferably at least 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to The sequence of the invention. Although homology can also be considered in terms of similarity (i.e. amino acid residues that have similar chemical properties / functions), in the context of the present invention it is preferred to express homology in terms of sequence identity.
En el presente contexto, se considera que una secuencia homóloga incluye una secuencia de nucleótidos que puede ser por lo menos 75, 85 ó 90% idéntica, preferentemente por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia de la invención. Aunque la homología también puede considerarse en términos de similitud (es decir, residuos aminoácidos que presentan propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención resulta preferido expresar la homología en términos de identidad de secuencia.In the present context, a homologous sequence is considered to include a nucleotide sequence that can be at least 75, 85 or 90% identical, preferably at least 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to The sequence of the invention. Although homology can also be considered in terms of similarity (i.e. amino acid residues that have similar chemical properties / functions), in the context of the present invention it is preferred to express homology in terms of sequence identity.
Las comparaciones de homología pueden llevarse a cabo visualmente, o más habitualmente, con ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas informáticos disponibles comercialmente pueden calcular el % de homología entre dos o más secuencias.Homology comparisons can be carried out visually, or more commonly, with the help of readily available sequence comparison programs. These commercially available computer programs can calculate the% homology between two or more sequences.
El % de homología puede calcularse en secuencias contiguas, es decir, una secuencia alineada con otra secuencia, y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un residuo cada vez. Esto se denomina alineación "sin huecos". Típicamente, dichas alineaciones sin huecos se llevan a cabo únicamente a lo largo de únicamente un número relativamente reducido de residuos.The% homology can be calculated in contiguous sequences, that is, one sequence aligned with another sequence, and each amino acid in one sequence is compared directly with the corresponding amino acid in the other sequence, one residue at a time. This is called "no gaps" alignment. Typically, such alignments without gaps are carried out only along only a relatively small number of residues.
Aunque el anterior es un método muy simple y consistente, no considera que, por ejemplo, en una pareja de secuencias de otro modo idéntica, una inserción o una deleción provocará que los residuos aminoácidos siguientes se encuentren desalineados, resultando potencialmente de esta manera en una gran reducción del % de homología al llevar a cabo la alineación global. En consecuencia, la mayoría de métodos de comparación de secuencias están diseñados para producir alineaciones óptimas que consideran posibles inserciones y deleciones sin penalizar indebidamente la puntuación global de homología. Lo expuesto anteriormente se consigue mediante la inserción de "huecos" en la alineación de las secuencias para intentar maximizar la homología local.Although the above is a very simple and consistent method, it does not consider that, for example, in an otherwise identical sequence pair, an insertion or a deletion will cause the following amino acid residues to be misaligned, potentially resulting in a great reduction of% homology when carrying out the global alignment. Consequently, most sequence comparison methods are designed to produce optimal alignments that consider possible insertions and deletions without unduly penalizing the overall homology score. The above is achieved by inserting "gaps" in the sequence alignment to try to maximize local homology.
Sin embargo, dichos métodos más complejos asignan "penalizaciones por hueco" a cada hueco que se observa en la alienación, de manera que, para el mismo número de aminoácidos idénticos (una alineación de secuencias con el mínimo número de huecos, que refleja un grado de relación más alto entre las dos secuencias comparadas), alcanzará una puntuación más alta que una con muchos huecos. Típicamente se utilizan "costes de huecos afines" que cargan un coste relativamente alto a la existencia de un hueco y una penalización más pequeña a cada residuo posterior en el hueco. Éste es el sistema de puntuación de huecos utilizado más comúnmente. Evidentemente las penalizaciones de hueco elevadas producirán alineaciones optimizadas con menos huecos. La mayoría de programas de alienación permiten modificar las penalizaciones por hueco. Sin embargo, resulta preferido utilizar los valores por defecto al utilizar este tipo de software para las comparaciones de secuencias. Por ejemplo, al utilizar el paquete GCG Wisconsin Bestfit, la penalización de hueco por defecto para las secuencias de aminoácidos es -12 para un hueco y de -4 por cada extensión.However, these more complex methods assign "penalties per hole" to each hole observed in alienation, so that, for the same number of identical amino acids (an alignment of sequences with the minimum number of gaps, which reflects a degree higher ratio between the two sequences compared), it will reach a higher score than one with many gaps. Typically, "related hole costs" are used, which charge a relatively high cost to the existence of a hole and a smaller penalty to each subsequent waste in the hole. This is the most commonly used gap scoring system. Obviously high hole penalties will produce optimized alignments with fewer gaps. Most alienation programs allow you to modify penalties per hole. However, it is preferred to use the default values when using this type of software for sequence comparisons. For example, when using the GCG Wisconsin Bestfit package, the default gap penalty for amino acid sequences is -12 for one hole and -4 for each extension.
Por lo tanto, el cálculo del % máximo de homología en primer lugar requiere la producción de una alineación óptima, considerando las penalizaciones de hueco. Un programa informático adecuado para llevar a cabo dichas alineaciones es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., Nucleic Acids Research 12:387, 1984). Entre los ejemplos de otros programas que pueden llevar a cabo comparaciones de secuencias se incluyen, aunque sin limitación, el paquete BLAST (ver Ausubel et al., ibid, capítulo 18, 1999), FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 403-410, 1990), el conjunto GENEWORKS de herramientas de comparación, y CLUSTAL. Tanto BLAST como FASTA se encuentran disponibles para búsquedas fuera de línea y en línea (ver Ausubel et al., ibid, páginas 7-58 a 7-60, 1999). Sin embargo, para algunas aplicaciones, resulta preferido utilizar el programa GCG Bestfit. Una nueva herramienta denominada BLAST 2 Sequences también se encuentra disponible para comparar secuencias de proteínas y de nucleótidos (ver FEMS Microbiol. Lett. 174(2):247-50, 1999; FEMS Microbiol. Lett. 177(1):187-8, 1999).Therefore, the calculation of the maximum% homology in the first place requires the production of an optimal alignment, considering the gap penalties. A suitable computer program for carrying out such alignments is the GCG Wisconsin Bestfit package (University of Wisconsin, U.S.A .; Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 387, 1984). Examples of other programs that can perform sequence comparisons include, but are not limited to, the BLAST package (see Ausubel et al., Ibid, chapter 18, 1999), FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 403-410, 1990), the GENEWORKS set of comparison tools, and CLUSTAL. Both BLAST and FASTA are available for offline and online searches (see Ausubel et al., Ibid, pages 7-58 to 7-60, 1999). However, for some applications, it is preferred to use the GCG Bestfit program. A new tool called BLAST 2 Sequences is also available to compare protein and nucleotide sequences (see FEMS Microbiol. Lett. 174 (2): 247-50, 1999; FEMS Microbiol. Lett. 177 (1): 187-8 , 1999).
Aunque el % final de homología puede medirse en términos de identidad, elAlthough the final% homology can be measured in terms of identity, the
5 procedimiento de alineación típicamente no se basa en una comparación de parejas de todo-o-nada. Por el contrario, generalmente se utiliza una matriz de escala de puntuaciones de similitud que asigna puntuaciones a cada comparación por parejas basada en la similitud química o en la distancia evolutiva. Un ejemplo de este tipo de matriz que se utiliza comúnmente es la matriz BLOSUM62, la matriz por defecto para el5 alignment procedure is typically not based on a comparison of all-or-nothing couples. On the contrary, a similarity scale scale matrix is usually used that assigns scores to each pairwise comparison based on chemical similarity or evolutionary distance. An example of this type of matrix that is commonly used is the BLOSUM62 matrix, the default matrix for the
10 conjunto BLAST de programas. Los programas de GCG Wisconsin generalmente utilizan los valores por defecto públicos o una tabla de comparaciones de símbolos personalizados en caso de que se proporcione (ver el manual para el usuario para más detalles). Para algunas aplicaciones resulta preferido utilizar los valores por defecto públicos para el paquete de GCG, o en el caso de otro software, la matriz por defecto, tal como10 BLAST set of programs. GCG Wisconsin programs generally use public defaults or a table of custom symbol comparisons if provided (see user manual for details). For some applications it is preferred to use the public default values for the GCG package, or in the case of other software, the default matrix, such as
Tras producir el software una alineación óptima, resulta posible calcular el % deAfter producing the software an optimal alignment, it is possible to calculate the% of
homología, preferentemente el % de identidad de secuencias. El software típicamentehomology, preferably% sequence identity. Software typically
lleva a cabo lo anterior como parte de la comparación de secuencias y genera uncarries out the above as part of the sequence comparison and generates a
20 resultado numérico.20 numerical result.
En el caso de que se utilicen penalizaciones por hueco al determinar la identidad de secuencia, apropiadamente se utilizan los parámetros siguientes:In the event that pit penalties are used when determining sequence identity, the following parameters are appropriately used:
Para la comparación de secuencias de polipéptido, pueden utilizarse los ajustesFor comparison of polypeptide sequences, adjustments may be used.
siguientes: penalización por creación de HUECO de 3,0 y penalización por extensión defollowing: penalty for creation of HUECO of 3.0 and penalty for extension of
HUECO de 0,1. Apropiadamente, el grado de identidad con respecto a una secuencia deHOLLOW 0.1. Appropriately, the degree of identity with respect to a sequence of
30 aminoácidos se determina a lo largo de por lo menos 5 aminoácidos contiguos, se determina a lo largo de por lo menos 10 aminoácidos contiguos, a lo largo de por lo menos 15 aminoácidos contiguos, a lo largo de por lo menos 20 aminoácidos contiguos, a lo largo de por lo menos 30 aminoácidos contiguos, a lo largo de por lo menos 40 aminoácidos contiguos, a lo largo de por lo menos 50 aminoácidos contiguos, o a lo largo de por lo30 amino acids are determined along at least 5 contiguous amino acids, determined along at least 10 contiguous amino acids, along at least 15 contiguous amino acids, along at least 20 contiguous amino acids, along at least 30 contiguous amino acids, along at least 40 contiguous amino acids, along at least 50 contiguous amino acids, or along at least
35 menos 60 aminoácidos contiguos.35 minus 60 contiguous amino acids.
Las secuencias también pueden presentar deleciones, inserciones o sustitucionesThe sequences may also have deletions, insertions or substitutions.
de residuos aminoácidos, que produce un cambio silencioso y resulta en una sustanciaof amino acid residues, which produces a silent change and results in a substance
funcionalmente equivalente. Pueden realizarse sustituciones deliberadas de aminoácidosfunctionally equivalent. Deliberate amino acid substitutions can be made
40 basándose en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o naturaleza anfipática de los residuos, con la condición de que se conserve la actividad de unión secundaria de la sustancia. Por ejemplo, entre los aminoácidos cargados negativamente40 based on the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and / or amphipathic nature of the residues, provided that the secondary binding activity of the substance is preserved. For example, among negatively charged amino acids
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
3030
3535
4040
-83-83
se incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; entre los aminoácidos cargados positivamente se incluyen lisina y arginina; y entre los aminoácidos con grupos de cabeza polar no cargados que presentan valores de hidrofilicidad similares se incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina.aspartic acid and glutamic acid are included; positively charged amino acids include lysine and arginine; and among the amino acids with non-charged polar head groups that exhibit similar hydrophilicity values include leucine, isoleucine, valine, glycine, alanine, asparagine, glutamine, serine, threonine, phenylalanine and tyrosine.
Pueden realizarse sustituciones conservadoras, por ejemplo según la Tabla a continuación. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y apropiadamente en la misma fila en la tercera columna pueden sustituirse entre sí:Conservative substitutions can be made, for example according to the Table below. The amino acids in the same block in the second column and appropriately in the same row in the third column can replace each other:
La presente invención también comprende la sustitución homóloga (en la presente memoria se utiliza tanto el término sustitución como el término reemplazamiento para hacer referencia al intercambio de un residuo aminoácido existente pro un residuo alternativo), es decir, la sustitución de igual por igual, tal como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. La sustitución no homóloga también puede producirse, es decir, de una clase de residuo por otra, o alternativamente implicando la inclusión de aminoácidos no naturales, tales como la ornitina (en adelante denominada Z), la ornitina ácido diaminobutírico (en adelante denominada B), ornitina norleucina (en adelante denominada O), pirilalanina, tenilalanina, naftilalanina y fenilglicina.The present invention also comprises homologous substitution (both the term substitution and the term replacement are used herein to refer to the exchange of an existing amino acid residue for an alternative residue), that is, the equal substitution equally, such as basic by basic, acid by acid, polar by polar, etc. Non-homologous substitution may also occur, that is, from one class of residue to another, or alternatively involving the inclusion of unnatural amino acids, such as ornithine (hereinafter referred to as Z), ornithine diaminobutyric acid (hereinafter referred to as B) Ornithine norleucine (hereinafter referred to as O), pyrilalanine, tenylalanine, naphthylalanine and phenylglycine.
También pueden realizarse sustituciones por aminoácidos no naturales, incluyendo: aminoácidos alfa* y alfa-disustituidos, aminoácidos N-alquilo*, ácido láctico*, derivados haluro de aminoácidos naturales, tales como trifluorotirosina*, p-Cl-fenilalanina*, p-Br-fenilalanina*, p-I-fenilalanina*; L-alil-glicina*; β-alanina*; ácido L-α-aminobutírico*; ácido L-γ-aminobutírico*; ácido L-α-aminoisobutírico; ácido L-ε-aminocaproico#; ácido 7amino-heptanoico*; L-metionina-sulfona#'; L-norleucina*; L-norvalina*; p-nitro-Lfenilalanina*; L-hidroxiprolina#; L-tioprolina*; derivados metilo de fenilalanina (Phe), tales como 4-metil-Phe*, pentametil-Phe*, L-Phe(4-amino)#, L-Tyr(metil)*, L-Phe(4-isopropil)*; ácido L-Tic(1,2,3,4-tetrahidroisoquinolín-3-carboxilo)*; ácido L-diaminopropiónico# y LPhe(4-bencilo)*. La notación * se ha utilizado con el fin indicado en el comentario anterior (referente a la sustitución homóloga o no homóloga) para indicar la naturaleza hidrofóbica del derivado, mientras que # se utiliza para indicar la naturaleza hidrofílica del derivado, # indica características anfipáticas.Substitutions may also be made for unnatural amino acids, including: alpha * and alpha-disubstituted amino acids, N-alkyl * amino acids, lactic acid *, halide derivatives of natural amino acids, such as trifluorotyrosine *, p-Cl-phenylalanine *, p-Br -phenylalanine *, pI-phenylalanine *; L-allyl-glycine *; β-alanine *; L-α-aminobutyric acid *; L-γ-aminobutyric acid *; L-α-aminoisobutyric acid; L-ε-aminocaproic acid #; 7 amino-heptanoic acid *; L-methionine-sulfone # '; L-norleucine *; L-norvaline *; p-nitro-Lphenylalanine *; L-hydroxyproline #; L-thioproline *; methyl derivatives of phenylalanine (Phe), such as 4-methyl-Phe *, pentamethyl-Phe *, L-Phe (4-amino) #, L-Tyr (methyl) *, L-Phe (4-isopropyl) *; L-Tic (1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-3-carboxyl) * acid; L-diaminopropionic acid # and LPhe (4-benzyl) *. The notation * has been used for the purpose indicated in the previous comment (referring to homologous or non-homologous substitution) to indicate the hydrophobic nature of the derivative, while # is used to indicate the hydrophilic nature of the derivative, # indicates amphipathic characteristics.
Entre las secuencias de aminoácidos variantes se incluyen grupos espaciadores adecuados que pueden insertarse entre dos residuos aminoácidos cualesquiera de la secuencia, incluyendo grupos alquilo, tales como grupos metilo, etilo o propilo, además de aminoácidos espaciadores, tales como residuos glicina o β-alanina. Una forma adicional de variación incluye la presencia de uno o más residuos aminoácidos en forma peptoide que será bien entendido por el experto en la materia. Para evitar dudas, "la forma peptoide" se utiliza para referirse a residuos de aminoácidos variantes en los que el grupo sustituyente del carbono α se encuentra en el átomo de nitrógeno del residuo y no en el carbono α. Los procedimientos para preparar péptidos en la forma peptoide son conocidos en la técnica, por ejemplo de Simon R.J. et al., PNAS 89(20):9367-9371, 1992, y de Horwell D.C., Trends Biotechnol. 13(4): 132-134, 1995.Variant amino acid sequences include suitable spacer groups that can be inserted between any two amino acid residues of the sequence, including alkyl groups, such as methyl, ethyl or propyl groups, in addition to spacer amino acids, such as glycine or β-alanine residues. An additional form of variation includes the presence of one or more amino acid residues in peptoid form that will be well understood by the person skilled in the art. For the avoidance of doubt, "the peptoid form" is used to refer to variant amino acid residues in which the substituent group of carbon α is in the nitrogen atom of the residue and not in carbon α. Methods for preparing peptides in the peptoid form are known in the art, for example from Simon R.J. et al., PNAS 89 (20): 9367-9371, 1992, and Horwell D.C., Trends Biotechnol. 13 (4): 132-134, 1995.
Las secuencias de nucleótidos para la utilización en la presente invención pueden incluir nucleótidos sintéticos o modificados. Son conocidos en la técnica varios tipos diferentes de modificación de los oligonucleótidos. Entre ellos se incluyen los esqueletos de metilfosfonato y de fosforotioato y/o la adición de acridina o cadenas de polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. En el contexto de la presente invención debe apreciarse que las secuencias de nucleótidos pueden modificarse mediante cualquier método disponible de la técnica. Dichas modificaciones pueden llevarse a cabo para incrementar la actividad in vivo o periodo de vida de las secuencias de nucleótidos que resultan útiles en la presente invención.Nucleotide sequences for use in the present invention may include synthetic or modified nucleotides. Several different types of oligonucleotide modification are known in the art. These include the methyl phosphonate and phosphorothioate skeletons and / or the addition of acridine or polylysine chains at the 3 'and / or 5' ends of the molecule. In the context of the present invention it should be appreciated that nucleotide sequences can be modified by any method available in the art. Such modifications may be carried out to increase the in vivo activity or life span of the nucleotide sequences that are useful in the present invention.
TÉCNICAS GENERALES DE LA METODOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTEGENERAL TECHNIQUES OF RECOMBINANT DNA METHODOLOGY
La presente invención utiliza, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que se encuentran comprendidas dentro de las capacidades de un experto ordinario en la materia. Dichas técnicas se explican en la literatura (ver, por ejemplo, J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, volúmenes 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Ausubel F.M. et al. (1995 y suplementos periódicos; Current Protocols in Molecular Biology, capítulos 9, 13 y 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree y A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; M.J. Gait (editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, y D.M.J. Lilley y J.E. Dahlberg, Methods of Enzymology: DNA Structure, Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press, 1992). Cada uno de estos textos generales se incorpora como referencia a la presente memoria.The present invention uses, unless otherwise indicated, conventional techniques of chemistry, molecular biology, microbiology, recombinant DNA and immunology, which are within the capabilities of an ordinary person skilled in the art. These techniques are explained in the literature (see, for example, J. Sambrook, EF Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, volumes 1 to 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Ausubel FM et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, chapters 9, 13 and 16, John Wiley & Sons, New York, NY); B. Roe, J. Crabtree and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing : Essential Techniques, John Wiley &Sons; MJ Gait (editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, and DMJ Lilley and JE Dahlberg, Methods of Enzymology: DNA Structure, Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press, 1992). Each of these general texts is incorporated as a reference to this report.
A continuación se describe con mayor detalle la invención mediante Ejemplos, que se proporcionan como ayuda para el experto ordinario en la materia para la puesta en práctica de la invención y de manera no limitativa del alcance de la invención.The invention will be described in greater detail below by way of Examples, which are provided as an aid to the ordinary person skilled in the art for the implementation of the invention and not in a way that is not limiting the scope of the invention.
EJEMPLOSEXAMPLES
Ejemplo 1Example 1
Inserción de un espaciador específico de fago en un CRISPR funcional existente para proporcionar resistencia frente al fago correspondiente.Insertion of a specific phage spacer into an existing functional CRISPR to provide resistance against the corresponding phage.
Cepa -Streptococcus thermophilus ST0089Strain -Streptococcus thermophilus ST0089
Phago -2972Phago -2972
Streptococcus thermophilus ST0089 es una cepa industrialmente importante utilizada en la fabricación del yogur, puede manipularse genéticamente y es susceptible al fago virulento 2972. La secuencia genómica completa para el fago 2972 ha sido determinada recientemente.Streptococcus thermophilus ST0089 is an industrially important strain used in the manufacture of yogurt, can be genetically engineered and is susceptible to virulent phage 2972. The complete genomic sequence for phage 2972 has recently been determined.
Se determinaron los loci CRISPR en la cepa ST0089. Éstas se determinaron preferentemente mediante secuenciación del genoma completo de ST0089. Alternativamente, se identificaron los loci CRISPR mediante PCR utilizando conjuntos de cebadores con secuencias idénticas a los elementos CRISPR de S. thermophilus previamente identificados.The CRISPR loci in strain ST0089 were determined. These were preferably determined by sequencing the complete genome of ST0089. Alternatively, the CRISPR loci were identified by PCR using sets of primers with sequences identical to the previously identified S. thermophilus CRISPR elements.
Tras la identificación, se determinaron las secuencias de los loci de CRISPR, así como las regiones proximales, que deberían contener los genes cas relevantes.After identification, the sequences of the CRISPR loci were determined, as well as the proximal regions, which should contain the relevant cas genes.
Se seleccionó por lo menos un locus CRISPR-cas particular para la manipulación adicional. Se determinó la funcionalidad de este locus mediante análisis in silico de las regiones espaciadoras y sus homologías con las secuencias de ADN fágicas (es decir, la ausencia y/o presencia de secuencias de espaciador y la correlación con la infectividad fágica con la cepa ST0089). En ausencia de esta correlación, se supuso la funcionalidad basándose en la presencia de todos los elementos documentados (es decir, repeticiones, espaciadores, secuencias líder, genes cas, putativamente codificantes de proteínas de longitud completa).At least one particular CRISPR-cas locus was selected for further manipulation. The functionality of this locus was determined by in silico analysis of the spacer regions and their homologies with the phage DNA sequences (i.e., the absence and / or presence of spacer sequences and the correlation with the phage infectivity with the ST0089 strain) . In the absence of this correlation, functionality was assumed based on the presence of all documented elements (ie, repetitions, spacers, leader sequences, cas genes, putatively encoding full-length proteins).
Se seleccionaron una o más secuencias de espaciador adecuadas del genoma del fago 2972. Los criterios de los espaciadores seleccionados se basaron en: 1) la longitud de los espaciadores dentro del locus CRISPR seleccionado, 2) una identidad de aproximadamente 100% con la secuencia fágica, 3) puede seleccionarse teóricamente cualquier secuencia fágica.One or more suitable spacer sequences of the phage genome 2972 were selected. The criteria of the selected spacers were based on: 1) the length of the spacers within the selected CRISPR locus, 2) an identity of approximately 100% with the phage sequence. , 3) any theoretical sequence can be selected theoretically.
En el ejemplo más simple, se sintetiza químicamente una unidad CRISPR que consiste de una secuencia espaciadora de fago 2972, flanqueada por dos elementos repetidos (idénticos al locus CRISPR seleccionado). Por definición, esta "unidad CRISPR" sintética presenta una longitud aproximada de 100 pb y es excesivamente corta para garantizar la integración en el locus CRISPR.In the simplest example, a CRISPR unit is chemically synthesized consisting of a phage spacer sequence 2972, flanked by two repeated elements (identical to the selected CRISPR locus). By definition, this synthetic "CRISPR unit" has an approximate length of 100 bp and is too short to ensure integration into the CRISPR locus.
Por lo tanto, se construyó ADN flanqueante adicional conjuntamente con la unidad CRISPR. Un mínimo de 500 pb de ADN homólogo, idéntico al locus CRISPR diana flanquea la unidad CRISPR sintética, para facilitar la integración.Therefore, additional flanking DNA was constructed in conjunction with the CRISPR unit. A minimum of 500 bp of homologous DNA, identical to the target CRISPR locus flanks the synthetic CRISPR unit, to facilitate integration.
Existen por lo menos dos enfoques. Un constructo imita la adición de un nuevo espaciador al CRISPR existente. Alternativamente, se sustituye el locus CRISPR completo con la unidad CRISPR sintética.There are at least two approaches. A construct mimics the addition of a new spacer to the existing CRISPR. Alternatively, the complete CRISPR locus is replaced with the synthetic CRISPR unit.
El integrante CRISPR resultante se verifica mediante secuenciación de ADN del locus CRISPR antes del ensayo biológico.The resulting CRISPR member is verified by DNA sequencing of the CRISPR locus before the biological assay.
Se sometieron a ensayo los patrones de sensibilidad fágica del integrante CRISPR contra el fago 2972 y se compararon con la cepa parental.The physical sensitivity patterns of the CRISPR member against phage 2972 were tested and compared with the parental strain.
El integrante CRISPR construido demuestra con éxito la correlación directa entre la presencia de un espaciador específico dentro del contexto correcto de CRISPR-cas.The built CRISPR member successfully demonstrates the direct correlation between the presence of a specific spacer within the correct CRISPR-cas context.
Ejemplo 2Example 2
Se insertó un espaciador homólogo a un ADN fágico en una célula, tal como una célula receptora. La célula adquiere resistencia al fago. En un locus CRISPR dentro de la cepa seleccionada, se diseñó un nuevo espaciador de CRISPR a partir de ADN fágico (con 100% de identidad respecto al ADN fágico) dentro del gen antirreceptor y se inserta en la célula. La diana es el gen antirreceptor debido a que se ha encontrado que los espaciadores de CRISPR de otras cepas muestran similitud a genes antirreceptor fágicos. Cuatro cepas portadoras de espaciadores que muestran identidad a genes antirreceptor fágicos son resistentes al fago particular. Se expone el mutante a fago y adquiere resistencia al mismo.A spacer homologous to a phageic DNA was inserted into a cell, such as a recipient cell. The cell acquires resistance to the phage. In a CRISPR locus within the selected strain, a new CRISPR spacer was designed from phageal DNA (with 100% identity to phageal DNA) within the antireceptor gene and inserted into the cell. The target is the antireceptor gene because it has been found that CRISPR spacers from other strains show similarity to phage antireceptor genes. Four spacer-bearing strains that show identity to phage antireceptor genes are resistant to the particular phage. The mutant is exposed to phage and acquires resistance to it.
Ejemplo 3Example 3
Se preparó un plásmido que comprendía un espaciador de CRISPR, y se demostró que este plásmido no podía transferirse al interior de una célula que contenía el mismo espaciador, mientras que el plásmido sin el espaciador podía transformarse en la célula.A plasmid comprising a CRISPR spacer was prepared, and it was shown that this plasmid could not be transferred into a cell containing the same spacer, while the plasmid without the spacer could be transformed into the cell.
Ejemplo 4Example 4
Se insertó un espaciador en un huésped original, pero no en un locus CRISPR, y el mutante resultante conservaba su sensibilidad frente al fago, mostrando que el espaciador requiere encontrarse dentro de un ambiente particular dentro de un CRISPR y genes cas.A spacer was inserted in an original host, but not in a CRISPR locus, and the resulting mutant retained its sensitivity to the phage, showing that the spacer requires to be within a particular environment within a CRISPR and cas genes.
Ejemplo 5Example 5
Se insertó una combinación completa de repetición CRISPR-cas en una célula, tal como una célula receptora, para proporcionar inmunidad frente a un ácido nucleico entrante.A complete CRISPR-cas repeat combination was inserted into a cell, such as a recipient cell, to provide immunity against an incoming nucleic acid.
Ejemplo 6Example 6
Para una combinación particular de repetición CRISPR-cas presentes en dos cepas diferentes, el "intercambio" de espaciadores modificaba sus fenotipos (sensibilidad/resistencia frente al fago).For a particular combination of CRISPR-cas repeat present in two different strains, the "exchange" of spacers modified their phenotypes (sensitivity / resistance to phage).
Ejemplo 7Example 7
Se delecionaron uno o más genes cas (de una unidad funcional de CRISPR-cas). Los genes cas resultan necesarios para proporcionar inmunidad. Los mutantes de cas todavía son sensibles al fago, a pesar de la presencia del espaciador idéntico al ADN fágico.One or more cas genes (from a functional unit of CRISPR-cas) were deleted. Cas genes are necessary to provide immunity. Cas mutants are still sensitive to phage, despite the presence of the spacer identical to the phageal DNA.
Ejemplo 8Example 8
Se clonaron los genes cas delecionados en un plásmido. Resultó posible proporcionar los genes cas en trans al huésped. En el caso de que se desactive el gen cas, se restaura la inmunidad.Deleted cas genes were cloned in a plasmid. It was possible to provide the cas genes in trans to the host. In the event that the cas gene is deactivated, immunity is restored.
Ejemplo 9Example 9
Se prepararon diferentes combinaciones de cas-repetición CRISPR. No sólo resultan necesarios los genes o proteínas cas, sino también resultan necesarias parejas específicas de cas-repetición CRISPR para obtener funcionalidad. En el caso de que se proporcionen genes o proteínas cas de otro locus CRISPR, la cepa sigue siendo sensible al fago.Different combinations of CRISPR cas-repeat were prepared. Not only are the genes or cas proteins necessary, but specific CRISPR cas-repeat partners are also necessary to obtain functionality. In the event that genes or cas proteins from another CRISPR locus are provided, the strain remains sensitive to the phage.
Ejemplo 10Example 10
En el caso de que se delecione un espaciador de CRISPR particular de un locus CRISPR natural, se elimina la inmunidad frente a un fago dado y el huésped se convierte en sensible (pierde la resistencia) al fago respecto al que es homólogo el espaciador.In the event that a particular CRISPR spacer is deleted from a natural CRISPR locus, immunity against a given phage is eliminated and the host becomes sensitive (loses resistance) to the phage with respect to which the spacer is homologous.
Ejemplo 11Example 11
La integración de un espaciador de CRISPR en el locus CRISPR de una bacteria proporciona resistente frente a un bacteriófago al que muestra identidad el espaciador de CRISPR.The integration of a CRISPR spacer into the CRISPR locus of a bacterium provides resistance against a bacteriophage to which the CRISPR spacer shows identity.
(A) Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710RH1(A) Streptococcus thermophilus strain DGCC7710RH1
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710 (depositada en la "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" francesa bajo el número CNCM I-2423) presente por lo menos 3 loci CRISPR: CRISPR1, CRISPR2 y CRISPR3. En las cepas CNRZ1066 y LMG18311 para las que se conoce la secuencia genómica completa (Bolotin et al., 2004), CRISPR1 se encuentra localizado en el mismo locus cromosómico: entre str0660 (o stu0660) y str0661 (o stu0661).Streptococcus thermophilus strain DGCC7710 (deposited in the French "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" under the number CNCM I-2423) present at least 3 CRISPR loci: CRISPR1, CRISPR2 and CRISPR3. In strains CNRZ1066 and LMG18311 for which the complete genomic sequence is known (Bolotin et al., 2004), CRISPR1 is located in the same chromosomal locus: between str0660 (or stu0660) and str0661 (or stu0661).
En la cepa DGCC7710, CRISPR1 también se encuentra localizado en el mismo locus cromosómico, entre genes altamente similares. CRISPR1 de la cepa DGCC7710 contiene 33 repeticiones (incluyendo la repetición terminal) y, de esta manera, 32 espaciadores.In strain DGCC7710, CRISPR1 is also located in the same chromosomal locus, between highly similar genes. CRISPR1 of strain DGCC7710 contains 33 repetitions (including terminal repetition) and, thus, 32 spacers.
Todos dichos espaciadores son diferentes entre sí. La mayoría de estos espaciadores son nuevos (no descritos todavía dentro de los loci CRISPR), aunque cuatro espaciadores próximos a la secuencia remolque de CRISPR1 son idénticos a espaciadores de CRISPR1 ya conocidos:All such spacers are different from each other. Most of these spacers are new (not yet described within the CRISPR loci), although four spacers near the trailer sequence of CRISPR1 are identical to already known CRISPR1 spacers:
CRISPR1 de la cepa CNRZ703 (GenBank nº de acceso DQ072990),CRISPR1 of strain CNRZ703 (GenBank accession number DQ072990),
-el espaciador nº 32 de DGCC7710 es 100% idéntico al espaciador nº 30 del espaciador de CRISPR1 de la cepa CNR1703 (GenBank nº de acceso DQ072990).-the spacer No. 32 of DGCC7710 is 100% identical to the spacer No. 30 of the spacer of CRISPR1 of strain CNR1703 (GenBank accession No. DQ072990).
Bacteriófago virulentoVirulent bacteriophage
D858 es un bacteriófago perteneciente a la familia Siphoviridae de virus. Su secuencia genómica ha sido determinada por completo pero no ha sido publicada todavía. Este fago es virulento frente a S. thermophilus cepa DGCC7710.D858 is a bacteriophage belonging to the Siphoviridae family of viruses. Its genomic sequence has been determined completely but has not yet been published. This phage is virulent against S. thermophilus strain DGCC7710.
Mutante resistente a fagoPhage resistant mutant
Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710RH1 ha sido aislado como mutante naturalmente resistente a fago utilizando DGCC7710 como cepa parental, y el fago D858 como fago virulento.Streptococcus thermophilus strain DGCC7710RH1 has been isolated as a naturally occurring phage resistant mutant using DGCC7710 as a parental strain, and phage D858 as a virulent phage.
CRISPR1 de la cepa DGCC7710-RH1 contiene 34 repeticiones (incluyendo la repetición terminal) y, de esta manera, 33 espaciadores. En comparación con la secuencia de CRISPR1 de Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710, la secuencia de CRISPR1 de Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710-RH1 presenta un nuevo espaciador adicional (y evidentemente una repetición adicional que flanquea el nuevo espaciador) en un extremo del locus CRISPR (es decir, próximo a la secuencia líder, en el extremo 5' del locus CRISPR).CRISPR1 of strain DGCC7710-RH1 contains 34 repetitions (including terminal repetition) and, thus, 33 spacers. Compared to the CRISPR1 sequence of Streptococcus thermophilus strain DGCC7710, the CRISPR1 sequence of Streptococcus thermophilus strain DGCC7710-RH1 presents an additional new spacer (and obviously an additional repeat flanking the new spacer) at one end of the CRISPR locus (i.e. , next to the leader sequence, at the 5 'end of the CRISPR locus).
La totalidad de los demás espaciadores del locus CRISPR1 no resulta modificada.All other spacers of the CRISPR1 locus are not modified.
La secuencia de CRISPR1 (5'-3') de la cepa DGCC7710-RH1 es:The sequence of CRISPR1 (5'-3 ') of strain DGCC7710-RH1 is:
Leyenda Secuencia líder: 5'caaggacagttattgattttataatcactatgtgggtataaaaacgtcaaaatttcatttgag3' Secuencia integrada que comprende una repetición CRISPR, en mayúscula, y unLegendLeader Sequence:5'caaggacagttattgattttataatcactatgtgggtataaaaacgtcaaaatttcatttgag3 'Integrated sequence comprising a CRISPR repetition, in uppercase, and a
espaciador de CRISPR (es decir, la secuencia de etiqueta), en minúscula.CRISPR spacer (i.e. tag sequence), in lower case.
Repeticiones CRISPR:CRISPR repetitions:
Repetición terminal: 5' gtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacagt 3'Terminal repeat: 5 'gtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacagt 3'
Secuencia remolque: 5' ttgattcaacataaaaagccagttcaattgaacttggcttt 3'Trailer sequence: 5 'ttgattcaacataaaaagccagttcaattgaacttggcttt 3'
La secuencia del nuevo espaciador se encuentra presente dentro del genomaThe sequence of the new spacer is present within the genome
fágico de D858 y se encuentra representada en la presente memoria como SEC ID nº 534.of D858 and is represented herein as SEQ ID No. 534.
La secuencia del espaciador se encuentra entre las posiciones 31921 y 31950 pb (es decir, en la cadena positiva) del genoma de D858 (y presenta una identidad de 100% respecto a la secuencia genómica de D858 a lo largo de 30 nucleótidos):The spacer sequence is between positions 31921 and 31950 bp (that is, in the positive chain) of the D858 genome (and has a 100% identity with respect to the D858 genomic sequence along 30 nucleotides):
El nuevo espaciador que se encuentra integrado en el locus CRISPR1 de Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710-RH1 proporciona a esta cepa resistencia frente al fago D858, tal como se representa en la figura 5 y en la Tabla 1.The new spacer that is integrated into the CRISPR1 locus of Streptococcus thermophilus strain DGCC7710-RH1 provides this strain resistance against phage D858, as shown in Figure 5 and Table 1.
(B) Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710RH2(B) Streptococcus thermophilus strain DGCC7710RH2
Se ha aislado Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710-RH2 ha sido aislado en forma de un mutante natural resistente a fagos utilizando Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710 como la cepa parental y el fago D858 como el fago virulento.Streptococcus thermophilus strain DGCC7710-RH2 has been isolated as a natural phage resistant mutant using Streptococcus thermophilus strain DGCC7710 as the parental strain and phage D858 as the virulent phage.
CRISPR1 de Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710-RH2 contiene 34 repeticiones (incluyendo la repetición terminal) y de esta manera, 33 espaciadores. En comparación con la secuencia CRISPR1 de Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710, la secuencia CRISPR1 de Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710-RH2 presenta un nuevo espaciador adicional (y evidentemente una repetición adicional que flanquea al nuevo espaciador) en un extremo del locus CRISPR (es decir, próximo al líder, en el extremo 5' del locus CRISPR). Todos los demás espaciadores del locus CRISPR1 no han sido modificados.Streptococcus thermophilus strain DGCC7710-RH2 CRISPR1 contains 34 repeats (including terminal repetition) and thus, 33 spacers. Compared to the CRISPR1 sequence of Streptococcus thermophilus strain DGCC7710, the CRISPR1 sequence of Streptococcus thermophilus strain DGCC7710-RH2 presents an additional new spacer (and obviously an additional repetition flanking the new spacer) at one end of the CRISPR locus (i.e., near to the leader, at the 5 'end of the CRISPR locus). All other CRISPR1 locus spacers have not been modified.
La secuencia CRISPR1 (5'-3') de la cepa DGCC7710-RH2 es:The sequence CRISPR1 (5'-3 ') of strain DGCC7710-RH2 is:
LeyendaLegend
15 Secuencia líder: 5'caaggacagttattgattttataatcactatgtgggtataaaaacgtcaaaatttcatttgag3' Secuencia integrada que comprende una repetición CRISPR, en mayúscula, y un15 Leading sequence: 5'caaggacagttattgattttataatcactatgtgggtataaaaacgtcaaaatttcatttgag3 'Integrated sequence comprising a CRISPR repeat, in uppercase, and a
20 espaciador CRISPR (es decir, la secuencia de etiquetado), en minúscula. Repeticiones CRISPR: Repetición terminal: 5' gtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacagt 3' Secuencia remolque: 5' ttgattcaacataaaaagccagttcaattgaacttggcttt 3'20 CRISPR spacer (that is, the tagging sequence), in lower case. CRISPR repetitions: Terminal repetition: 5 'gtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacagt 3' Trailer sequence: 5 'ttgattcaacataaaaagccagttcaattgaacttggcttt 3'
Se ha demostrado que la secuencia del nuevo espaciador se encuentra presente 5 dentro del genoma del fago D858.It has been shown that the sequence of the new spacer is present within the phage genome D858.
La secuencia del espaciador (representado en la presente memoria como SEC ID nº 535) se encuentra entre las posiciones 17.215 y 17.244 pb (es decir, en la cadena positiva) del genoma de D858 (y presenta una identidad de 100% respecto a la secuenciaThe spacer sequence (represented herein as SEQ ID No. 535) is between positions 17,215 and 17,244 bp (i.e. in the positive chain) of the D858 genome (and has a 100% identity with respect to the sequence
10 genómica de D858 a lo largo de 30 nucleótidos):10 genomic of D858 along 30 nucleotides):
El nuevo espaciador que se encuentra integrado en el locus CRISPR1 deThe new spacer that is integrated into the CRISPR1 locus of
15 Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710-RH2 proporciona a Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710-RH2 una resistencia frente al fago D858, tal como se representa en la figura 6 y en la Tabla 1.Streptococcus thermophilus strain DGCC7710-RH2 provides Streptococcus thermophilus strain DGCC7710-RH2 with resistance against phage D858, as depicted in Figure 6 and Table 1.
20 Ejemplo 1220 Example 12
Integración y desactivación de constructoIntegration and deactivation of construct
Materiales y métodos 25 Cepas y plásmidosMaterials and methods 25 Strains and plasmids
Escherichia coli EC1.000 proporciona pORI28 (Russell y Klaenhammer, 2001). 30 Escherichia coli pCR2.1TOPO proporciona pTOPO (Invitrogen nº de catálogo K4500-01)Escherichia coli EC1,000 provides pORI28 (Russell and Klaenhammer, 2001). 30 Escherichia coli pCR2.1TOPO provides pTOPO (Invitrogen catalog no. K4500-01)
pTOPO es un plásmido utilizado para la subclonación de los diversos constructos 35 pTOPOcas1ko contiene un fragmento integral de cas1.pTOPO is a plasmid used for the subcloning of the various constructs pTOPOcas1ko contains an integral fragment of cas1.
pTOPOcas4ko contiene un fragmento integral de cas4.pTOPOcas4ko contains an integral fragment of cas4.
pTOPOS1S2 contiene el constructo de espaciador S1S2. pTOPORT contiene el constructo de repetición terminal RT. 5 pORI28 es un plásmido utilizado para la integración de los diversos constructos en el cromosoma de las cepas de Streptococcus thermophilus. pORIcas1ko contiene un fragmento integral de cas1.pTOPOS1S2 contains the spacer construct S1S2. pTOPORT contains the RT terminal repeat construct. 5 pORI28 is a plasmid used for the integration of the various constructs in the chromosome of Streptococcus thermophilus strains. pORIcas1ko contains an integral fragment of cas1.
10 pORIcas4ko contiene un fragmento integral de cas4. pORIS1S2 contiene el constructo de espaciador S1S2. purist contiene el constructo de repetición terminal RT.10 pORIcas4ko contains an integral fragment of cas4. pORIS1S2 contains the spacer construct S1S2. purist contains the RT terminal repeat construct.
15 Cebadores15 primers
Cas1Cas1
5’-caaatggatagagaaacgc-3’ and 5’-ctgataaggtgttcgttgtcc-3’5’-caaatggatagagaaacgc-3 ’and 5’-ctgataaggtgttcgttgtcc-3’
Cas4Cas4
5’-ggagcagatggaatacaagaaagg-3’ and 5’-gagagactaggttgtctcagca-3’5’-ggagcagatggaatacaagaaagg-3 ’and 5’-gagagactaggttgtctcagca-3’
S1S2 y RTS1S2 and RT
P15’-acaaacaacagagaagtatetcattg-3’ P2 5’-aacgagtacactcactatttgtacg-3’ P3 5’tccactcacgtacaaatagtgagtgtactcgtttttgtattctcaagatttaagtaactgtacagtttgattcaacataaaaag-3’ P4 5’-ctttccttcatcctcgctttggtt-3’P15’-acaaacaacagagaagtatetcattg-3 ’P2 5’-aacgagtacactcactatttgtacg-3 ’P3 5’tccactcacgtacaaatagtgagtgtactcgtttttgtattctcaagatttaagtaactgtacagtttgattcaacataaaaag-3 ’P4 5’-ctttccttcatcctcgctttggtt-3 ’
Se obtuvieron las cepas y fagos de la Danisco Culture Collection, o de material deThe strains and phages of the Danisco Culture Collection, or material of
referencia (Russell y Klaenhammer, Applied and Environmental Microbiology 67:43691reference (Russell and Klaenhammer, Applied and Environmental Microbiology 67: 43691
4364, 2001; Levesque et al., Applied and Environmental Microbiology 71:4057-4068,4364, 2001; Levesque et al., Applied and Environmental Microbiology 71: 4057-4068,
La preparación, purificación y ensayos de fagos se llevaron a cabo utilizando losThe preparation, purification and phage assays were carried out using the
métodos descritos anteriormente (Duplessis et al., Virology 340:192-208, 2005; Levesquemethods described above (Duplessis et al., Virology 340: 192-208, 2005; Levesque
et al., Applied and Environmental Microbiology 71:4057-4068, 2005).et al., Applied and Environmental Microbiology 71: 4057-4068, 2005).
25 Se cultivaron cepas de Streptococcus thermophilus a 37ºC o a 42ºC en M17 (Difco Laboratories) suplementado con lactosa o sacarosa al 0,5%. Para la infección por fagos, se añadió CaCl2 10 mM al medio previamente a la infección por fagos, tal como se ha descrito anteriormente (Duplessis et al., Virology 340:192-208, 2005; Levesque et al.,Strains of Streptococcus thermophilus were grown at 37 ° C or 42 ° C in M17 (Difco Laboratories) supplemented with 0.5% lactose or sucrose. For phage infection, 10 mM CaCl2 was added to the medium prior to phage infection, as described above (Duplessis et al., Virology 340: 192-208, 2005; Levesque et al.,
30 Applied and Environmental Microbiology 71:4057-4068, 2005).30 Applied and Environmental Microbiology 71: 4057-4068, 2005).
Los enzimas utilizados para llevar a cabo las digestiones de restricción y la PCR seEnzymes used to carry out restriction digestion and PCR are
obtuvieron de Invitrogen y se utilizaron siguiendo las instrucciones del fabricante. Las PCRobtained from Invitrogen and were used following the manufacturer's instructions. PCR
se llevaron a cabo en un termociclador de gradiente Eppendorf Mastercycler tal como sewere carried out in an Eppendorf Mastercycler gradient thermal cycler as
35 ha descrito anteriormente (Barrangou et al., Applied and Environmental microbiology 68:2877-2884, 2002).35 described above (Barrangou et al., Applied and Environmental microbiology 68: 2877-2884, 2002).
La inactivación génica y la inserción de plásmido específica de sitio mediante recombinación homóloga en el cromosoma de Streptococcus thermophilus se llevaron a cabo mediante subclonación en el sistema pCR2.1TOPO de Invitrogen, la clonación posterior en el sistema pORI utilizando Escherichia coli como huésped y los constructos se purificaron finalmente y se transformaron en Streptococcus thermophilus tal como se ha descrito anteriormente (Russell y Klaenhammer, Applied and Environmental Microbiology 67:43691-4364, 2001).Gene inactivation and site-specific plasmid insertion by homologous recombination on the Streptococcus thermophilus chromosome were carried out by subcloning in the Invitrogen pCR2.1TOPO system, subsequent cloning into the pORI system using Escherichia coli as host and constructs they were finally purified and transformed into Streptococcus thermophilus as described previously (Russell and Klaenhammer, Applied and Environmental Microbiology 67: 43691-4364, 2001).
(1) Integración del constructo RT(1) RT construct integration
Utilizando el constructo RT construido tal como se muestra en la figura 17, se insertó el constructo inmediatamente después de cas4, tal como se muestra en la figuraUsing the RT construct constructed as shown in Figure 17, the construct was inserted immediately after cas4, as shown in Figure
18.18.
La cepa parental DGCC7778 es resistente al fago 858.The parental strain DGCC7778 is resistant to phage 858.
La cepa parental presentaba dos espaciadores (S1 y D2) que eran idénticos al ADN del fago 858.The parental strain had two spacers (S1 and D2) that were identical to phage 858 DNA.
La cepa resultante (RT) perdía resistencia frente al fago 858, tal como se muestra en la Tabla 1. Esto demuestra que resulta necesario que los genes cas sean inmediatamente contiguos al espaciador o espaciadores para proporcionar resistencia.The resulting strain (RT) lost resistance against phage 858, as shown in Table 1. This demonstrates that it is necessary that the cas genes be immediately adjacent to the spacer or spacers to provide resistance.
(2) Desactivación de cas1(2) Deactivation of cas1
Tal como se muestra en la figura 12, se manipuló la cepa parental DGCC7778 de manera que se interrumpiese el gen cas1. Tal como se muestra en la Tabla 1, lo anterior resultó en una pérdida de resistencia, lo que significa que cas1 resulta necesario para proporcionar resistencia.As shown in Figure 12, parental strain DGCC7778 was manipulated so that the cas1 gene was interrupted. As shown in Table 1, the above resulted in a loss of resistance, which means that cas1 is necessary to provide resistance.
(3) Desactivación de cas4(3) Deactivation of cas4
Tal como se muestra en la figura 12, se manipuló la cepa parental DGCC7778 de manera que se interrumpiese el gen cas4.As shown in Figure 12, parental strain DGCC7778 was manipulated so that the cas4 gene was interrupted.
(4) Integración del constructo S1S2(4) Integration of the S1S2 construct
Tal como se muestra en las figuras 14 a 16, el constructo S1S2 se encuentra integrado en la cepa parental DGCC7710.As shown in Figures 14 to 16, the S1S2 construct is integrated into the parental strain DGCC7710.
SUMARIOSUMMARY
Los CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y uniformemente espaciadas) (también conocidas como SPIDR, repeticiones directas intercaladas por espaciadores) constituyen una familia de loci de ADN recientemente descritos ampliamente distribuidos en los genomas procarióticos. Se encuentran constituidos por repeticiones palindrómicas de ADN cortas y altamente conservadas que se encuentran uniformemente espaciadas por secuencias altamente polimórficas de aproximadamente la misma longitud. Además, los genes cas (genes asociados a CRISPR) habitualmente se encuentran presentes contiguamente a las secuencias de CRISPR. En la literatura, todavía no se ha atribuido ninguna función fisiológica clara a las secuencias CRISPR o a los genes cas.CRISPR (short palindromic repeats grouped and uniformly spaced) (also known as SPIDR, direct repetitions interspersed by spacers) constitute a family of recently described DNA loci widely distributed in prokaryotic genomes. They are constituted by palindromic repetitions of short and highly conserved DNAs that are evenly spaced by highly polymorphic sequences of approximately the same length. In addition, the cas genes (genes associated with CRISPR) are usually present adjacent to the CRISPR sequences. In the literature, no clear physiological function has yet been attributed to CRISPR sequences or cas genes.
En la presente memoria se sugiere que las secuencias de CRISPR en combinación con genes cas pueden utilizarse para proporcionar resistencia frente al ácido nucleico entrante. En particular, se propone que los espaciadores dentro de los loci CRISPR proporcionan la especificidad para la inmunidad frente al ácido nucleico entrante. En consecuencia, se sugiere que los genes cas en asociación con las secuencias CRISPR se utilicen para proporcionar a las células resistencia frente a secuencias particulares de ácidos nucleicos, tales como bacteriófagos, plásmidos, trasposones y secuencias de inserción. Además, estos elementos pueden manipularse para generar inmunidad dirigida contra secuencias particulares de ácidos nucleicos, tales como componentes fágicos, genes de resistencia a antibióticos, factores de virulencia, secuencias nuevas, elementos no deseables y similares. De esta manera, el simple conocimiento de, inter alia, secuencias de espaciadores de CRISPR para una cepa bacteriana dada resultaría una ventaja para determinar su lisotipo (el lisotipo define la resistencia/sensibilidad de una bacteria dada frente a diversos bacteriófagos) y para predecir su capacidad de sobrevivir a la exposición a secuencias de ácidos nucleicos definidas. En consecuencia, la caracterización de los loci CRISPR en bacterias podría ayudar a determinar, predecir y modificar la interacción huésped-fago. La aplicación particular de manipulación genética de CRISPR, mediante adición, deleción o modificación de secuencias de espaciador podría conducir a variantes bacterianas resistentes a fagos.It is suggested herein that the CRISPR sequences in combination with cas genes can be used to provide resistance against the incoming nucleic acid. In particular, it is proposed that the spacers within the CRISPR loci provide the specificity for immunity against the incoming nucleic acid. Accordingly, it is suggested that the cas genes in association with the CRISPR sequences be used to provide the cells with resistance to particular nucleic acid sequences, such as bacteriophages, plasmids, transposons and insertion sequences. In addition, these elements can be manipulated to generate immunity directed against particular nucleic acid sequences, such as phage components, antibiotic resistance genes, virulence factors, new sequences, undesirable elements and the like. Thus, the simple knowledge of, inter alia, CRISPR spacer sequences for a given bacterial strain would be an advantage to determine its lysotype (the lysotype defines the resistance / sensitivity of a given bacterium against various bacteriophages) and to predict its ability to survive exposure to defined nucleic acid sequences. Consequently, the characterization of the CRISPR loci in bacteria could help determine, predict and modify the host-phage interaction. The particular application of CRISPR genetic manipulation, by addition, deletion or modification of spacer sequences could lead to phage resistant bacterial variants.
Los CRISPRS (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y uniformemente espaciadas), también conocidos como SPIDR (repeticiones directas intercaladas por espaciadores) forman una nueva familia de secuencias repetidas que han sido identificadas en secuencias genómicas completas, en numerosos procariotas, mayoritariamente en cromosomas aunque también en plásmidos (Mojica et al. 2000; Jansen et al. 2002a). Los loci CRISPR están constituidos por repeticiones de ADN cortas y altamente conservadas (24 a 40 pb, repetidas entre 1 y 140 veces) que son parcialmente palindrómicas. Aunque existen determinados límites a la degeneración de las bases entre repeticiones de diferentes loci y especies, no existe ninguna secuencia absolutamente conservada en todas las repeticiones observadas. Además, las repeticiones aparentemente se encuentran orientadas dentro de un locus particular con respecto a los genes vecinos. Entre estas secuencias repetidas (habitualmente específicas para una especie) se encuentran intercaladas secuencias polimórficas de longitud constante (20 a 58 pb dependiendo del CRISPR) que se denominan "espaciadores". Se han encontrado hasta 20 loci CRISPR diferentes dentro de un solo cromosoma. La figura 1 describe uno de los CRISPR identificados en Streptococcus thermophilus CNRZ1066.CRISPRS (short palindromic repeats grouped and uniformly spaced), also known as SPIDR (direct repetitions interspersed by spacers) form a new family of repeated sequences that have been identified in complete genomic sequences, in numerous prokaryotes, mostly in chromosomes but also in plasmids (Mojica et al. 2000; Jansen et al. 2002a). CRISPR loci consist of short and highly conserved DNA repeats (24 to 40 bp, repeated between 1 and 140 times) that are partially palindromic. Although there are certain limits to the degeneration of the bases between repetitions of different loci and species, there is no absolutely conserved sequence in all observed repetitions. In addition, the repetitions are apparently oriented within a particular locus with respect to neighboring genes. Among these repeated sequences (usually specific for a species), polymorphic sequences of constant length (20 to 58 bp depending on the CRISPR) are interspersed which are called "spacers." Up to 20 different CRISPR loci have been found within a single chromosome. Figure 1 describes one of the CRISPR identified in Streptococcus thermophilus CNRZ1066.
Por ejemplo, el genoma de S. thermophilus LMG18311 contiene 3 loci CRISPR. Las secuencias repetidas de 36 pb son diferentes en CRISPR1 (34 repeticiones), CRISPR2 (5 repeticiones) y CRISPR3 (una única secuencia); sin embargo, se encuentran perfectamente conservadas dentro de cada locus. Las repeticiones CRISPR1 y CRISPR2 se encuentran, respectivamente, espaciadas por 33 y 4 secuencias de 30 pb de longitud. Todos dichos espaciadores son diferentes entre sí (aparte de excepciones menores: unos pocos espaciadores pueden encontrarse presentes dos veces dentro de un locus CRISPR dado). También son diferentes de los observados en otras cepas, tales como CNRZ1066 (41 espaciadores dentro de CRISPR1) o LMD-9 (16 espaciadores dentro de CRISPR1 y 8 dentro de CRISPR3), que son cepas de S. thermophilus que presentan genomas muy similares.For example, the genome of S. thermophilus LMG18311 contains 3 CRISPR loci. The repeated sequences of 36 bp are different in CRISPR1 (34 repetitions), CRISPR2 (5 repetitions) and CRISPR3 (a single sequence); however, they are perfectly preserved within each locus. The CRISPR1 and CRISPR2 repeats are, respectively, spaced by 33 and 4 sequences of 30 bp in length. All such spacers are different from each other (apart from minor exceptions: a few spacers may be present twice within a given CRISPR locus). They are also different from those observed in other strains, such as CNRZ1066 (41 spacers within CRISPR1) or LMD-9 (16 spacers within CRISPR1 and 8 within CRISPR3), which are S. thermophilus strains that have very similar genomes.
Aunque la función biológica de los loci CRISPR es desconocida, se han propuesto algunas hipótesis. Por ejemplo, se ha propuesto que podrían encontrarse implicados en la unión del cromosoma a una estructura celular, o en la replicación cromosómica y en la distribución de replicones, aunque no se ha informado de ninguna demostración experimental que confirme estas hipótesis.Although the biological function of CRISPR loci is unknown, some hypotheses have been proposed. For example, it has been proposed that they might be involved in the chromosome binding to a cellular structure, or in chromosomal replication and replicon distribution, although no experimental demonstration confirming these hypotheses has been reported.
Generalmente los loci CRISPR son inmediatamente contiguos a un grupo de 4 a 7 genes que se han denominado genes cas (asociados a CRISPR) (Jansen et al. 2002b). En la actualidad no se ha asignado ninguna función fisiológica clara a las proteínas Cas, aunque, para algunas de ellas, la presencia de motivos proteicos particulares sugiere que podrían actuar como una ADN girasa o como una ADN polimerasa. Estas agrupaciones de 4 a 7 genes cas, originadas de diferentes loci dentro de un genoma dado u originadas de diferentes microorganismos, pueden distinguirse y agruparse en diferentes tipos basándose en la similitud entre secuencias. Uno de los resultados principales en el contexto de la presente invención es que un conjunto dado de genes cas siempre se asocia a una secuencia repetida dada dentro de un locus CRISPR particular. En otras palabras, los genes cas [o las proteínas Cas] aparentemente son específicos para una repetición de ADN dada, implicando que los genes cas [o las proteínas Cas] y la secuencia repetida podrían formar una pareja funcional. Los análisis de gráficos de puntos indican que las agrupaciones y los grupos obtenidos al analizar las secuencias de las proteínas Cas son similares a las obtenidas al analizar las repeticiones CRISPR (tal como se muestra en la figura 2).Generally, CRISPR loci are immediately adjacent to a group of 4 to 7 genes that have been called cas genes (associated with CRISPR) (Jansen et al. 2002b). At present, no clear physiological function has been assigned to Cas proteins, although, for some of them, the presence of particular protein motifs suggests that they could act as a gyrase DNA or as a DNA polymerase. These clusters of 4 to 7 cas genes, originating from different loci within a given genome or originating from different microorganisms, can be distinguished and grouped into different types based on the similarity between sequences. One of the main results in the context of the present invention is that a given set of cas genes is always associated with a given repeated sequence within a particular CRISPR locus. In other words, the cas [or Cas proteins] genes are apparently specific for a given DNA repeat, implying that the cas [or Cas proteins] and the repeated sequence could form a functional partner. The analysis of dot plots indicates that the clusters and groups obtained by analyzing the sequences of the Cas proteins are similar to those obtained by analyzing the CRISPR repeats (as shown in Figure 2).
En S. thermophilus, una especie bacteriana para la que se han secuenciado varios genomas fágicos, los espaciadores de 30 pb con frecuencia son idénticos al ADN fágico (figura 3). Esta observación también se ha realizado para las secuencias de espaciadores de muchos otros géneros y especies de bacterianas para las que se conocen las secuencias de ADN fágico. Además, se ha mencionado anteriormente en por lo menos dos publicaciones recientes (Pourcel et al. 2005; Mojica et al. 2005). Por otra parte, la ausencia de una similitud de secuencias significativa para el resto de secuencias de espaciador podría explicarse por el hecho de que únicamente se encuentran disponibles actualmente unos pocos genomas fágicos. Basándose en similitudes de secuencias de ADN muy altas entre algunos espaciadores de CRISPR y secuencias de bacteriófagos, se propone que la especificidad de los espaciadores de CRISPR participa en la determinación del lisotipo de cepa. En apoyo de la propuesta de un efecto de las secuencias de espaciador de CRISPR sobre la inmunidad bacteriana frente a bacteriófagos, se encontró una proporción significativa de apareamientos de espaciadores con secuencias de genoma bacteriofágico dentro de genes probablemente implicados en la especificidad de huésped (ver la figura 3). Otra hipótesis sería que las secuencias de espaciador son reconocidas por la bacteria como ADN foráneo. De esta manera, la bacteria podría eliminar la molécula de ácido nucleico que porta dicha secuencia en el momento en que entra en la célula. Un argumento que apoya esta idea es la peculiar estructura deducida de CRISPR. En efecto, se propone que los elementos repetidos proporcionan una característica estructural, mientras que los espaciadores que contienen la secuencia proporcionan inmunidad específica contra ácidos nucleicos entrantes. Las repeticiones palindrómicas presentan el potencial de formar estructuras de horquilla (tallobucle) muy estables (ver la figura 4) y se encuentran separadas por espaciadores cuya tamaño corresponde a aproximadamente 3 vueltas de la hélice de ADN (aunque puede variar entre 2 y 5). De esta manera, cualquier locus CRISPR podría encontrarse altamente estructurado en una serie de horquillas de ADN uniformemente espaciadas.In S. thermophilus, a bacterial species for which several phage genomes have been sequenced, the 30 bp spacers are often identical to the phageal DNA (Figure 3). This observation has also been made for the spacer sequences of many other genera and bacterial species for which the phageal DNA sequences are known. In addition, it has been mentioned previously in at least two recent publications (Pourcel et al. 2005; Mojica et al. 2005). On the other hand, the absence of a significant sequence similarity for the rest of the spacer sequences could be explained by the fact that only a few phageal genomes are currently available. Based on similarities of very high DNA sequences between some CRISPR spacers and bacteriophage sequences, it is proposed that the specificity of the CRISPR spacers participate in the determination of the strain lysotype. In support of the proposal of an effect of CRISPR spacer sequences on bacterial immunity against bacteriophages, a significant proportion of pairings of spacers with bacteriophage genome sequences were found within genes likely involved in host specificity (see figure 3). Another hypothesis would be that spacer sequences are recognized by the bacterium as foreign DNA. In this way, the bacterium could eliminate the nucleic acid molecule that carries the sequence at the moment it enters the cell. An argument that supports this idea is the peculiar structure deduced from CRISPR. Indeed, it is proposed that repeated elements provide a structural characteristic, while spacers containing the sequence provide specific immunity against incoming nucleic acids. Palindromic repetitions have the potential to form very stable hairpin structures (tallobucle) (see Figure 4) and are separated by spacers whose size corresponds to approximately 3 turns of the DNA helix (although it can vary between 2 and 5). In this way, any CRISPR locus could be highly structured in a series of uniformly spaced DNA hairpins.
Ventajosamente, el lisotipo de una cepa bacteriana dada puede modificarse mediante la generación natural de derivados resistentes (mutantes insensibles a bacteriófagos) o mediante manipulación genética. Específicamente, pueden diseñarse soluciones de manipulación genética mediante, por ejemplo, adición, deleción o modificación de las secuencias de espaciador o incluso de un locus CRISPR completo.Advantageously, the lysotype of a given bacterial strain can be modified by the natural generation of resistant derivatives (bacteriophage-insensitive mutants) or by genetic manipulation. Specifically, genetic manipulation solutions can be designed by, for example, adding, deleting or modifying the spacer sequences or even a complete CRISPR locus.
Entre los ejemplos de aplicaciones de la presente invención se incluyen, aunque sin limitación:Examples of applications of the present invention include, but are not limited to:
(iii) Resistencia a elementos genéticos móviles. Pueden añadirse espaciadores de CRISPR particulares derivados de ADN de elemento genético móvil dentro de un locus CRISPR bacteriano de manera que se proporcione resistencia frente a elementos genéticos móviles, tal como elementos trasponibles y secuencias de inserción, impidiendo de esta manera la transferencia de ADN foráneo y la deriva genética. Específicamente, pueden ser dianas regiones particulares dentro de trasposones y secuencias de inserción de manera que se proporcione inmunidad frente a elementos genéticos móviles. Por ejemplo, entre las dianas pueden incluirse trasposones conjugativos (Tn916), trasposones de clase II (Tn501) o secuencias de inserción (IS26).(iii) Resistance to mobile genetic elements. Particular CRISPR spacers derived from mobile genetic element DNA can be added within a bacterial CRISPR locus so as to provide resistance against mobile genetic elements, such as transposable elements and insertion sequences, thereby preventing the transfer of foreign DNA and genetic drift Specifically, particular regions within transposons and insertion sequences may be targeted so as to provide immunity against mobile genetic elements. For example, among the targets can be included conjugative transposons (Tn916), class II transposons (Tn501) or insertion sequences (IS26).
bacteriano, reduciendo de esta manera el riesgo de adquisición de marcadores de resistencia a antibióticos. Por ejemplo, entre las dianas pueden incluirse vanR, un gen que proporciona resistencia a la vancomicina, o tetR, un gen que proporciona resistencia a la tetraciclina, o inhibidores de la beta-lactamasa.bacterial, thus reducing the risk of acquiring antibiotic resistance markers. For example, vanR, a gene that provides resistance to vancomycin, or tetR, a gene that provides resistance to tetracycline, or beta-lactamase inhibitors can be included among the targets.
(vii) Resistencia a secuencias nuevas. Pueden sintetizarse de novo secuencias de espaciador nuevas, manipuladas e integradas en un CRISPR dentro de un huésped bacteriano seleccionado con el fin de proporcionar resistencia a una secuencia nueva e idéntica particular presente en una molécula de ADN infecciosa.(vii) Resistance to new sequences. New spacer sequences can be synthesized de novo, manipulated and integrated into a CRISPR within a selected bacterial host in order to provide resistance to a particular new and identical sequence present in an infectious DNA molecule.
Debido a que los CRISPR se encuentran ampliamente distribuidos entre especies bacterianas, las aplicaciones anteriormente mencionadas podrían utilizarse en una amplia diversidad de organismos. Se han descrito loci CRISPR en varias bacterias Grampositivas (incluyendo bacterias del ácido láctico) y Gram-negativas. De esta manera, los loci CRISPR asociados a genes cas pueden utilizarse para caracterizar/modificar el lisotipo de cepa y generar resistencia a un ácido nucleico en un amplio abanico de bacterias. Además de las aplicaciones potencias para la resistencia a fagos, se ha mencionado en la literatura que las secuencias de CRISPR muestran cierta homología con elementos genéticos móviles, tales como plásmidos y trasposones (Mojica et al. 2005).Because CRISPRs are widely distributed among bacterial species, the aforementioned applications could be used in a wide variety of organisms. CRISPR loci have been described in several Gram-positive bacteria (including lactic acid bacteria) and Gram-negative bacteria. In this way, CRISPR loci associated with cas genes can be used to characterize / modify strain lysotype and generate resistance to a nucleic acid in a wide range of bacteria. In addition to the potential applications for phage resistance, it has been mentioned in the literature that CRISPR sequences show some homology with mobile genetic elements, such as plasmids and trasposons (Mojica et al. 2005).
En un aspecto adicional, se proporciona la utilización de una combinación de un locus CRISPR y uno o más genes cas para proporcionar resistencia frente a un ácido nucleico definido.In a further aspect, the use of a combination of a CRISPR locus and one or more cas genes is provided to provide resistance against a defined nucleic acid.
Apropiadamente, el ácido nucleico es ADN.Appropriately, the nucleic acid is DNA.
Apropiadamente, el ácido nucleico es ARN.Suitably, the nucleic acid is RNA.
Apropiadamente, el ácido nucleico es derivable (preferentemente derivado) a partir de un fago.Suitably, the nucleic acid is derivable (preferably derived) from a phage.
Apropiadamente, el ácido nucleico es derivable (preferentemente derivado) a partir de plásmido.Suitably, the nucleic acid is derivable (preferably derived) from plasmid.
Apropiadamente, el ácido nucleico es derivable (preferentemente derivado) a partir de un elemento genético móvil.Suitably, the nucleic acid is derivable (preferably derived) from a mobile genetic element.
Apropiadamente, el ácido nucleico es derivable (preferentemente derivado) a partir de un trasposón (Tn).Suitably, the nucleic acid is derivable (preferably derived) from a trasposon (Tn).
5 Apropiadamente, el ácido nucleico es derivable (preferentemente derivado) a partir de una secuencia de inserción (IS).5 Suitably, the nucleic acid is derivable (preferably derived) from an insertion sequence (IS).
Apropiadamente, el ácido nucleico es derivable (preferentemente derivado) a partir de elementos genéticos diana no deseables. 10 Apropiadamente, el ácido nucleico es derivable (preferentemente derivado) a partir de un gen de resistencia a antibiótico.Suitably, the nucleic acid is derivable (preferably derived) from undesirable target genetic elements. 10 Suitably, the nucleic acid is derivable (preferably derived) from an antibiotic resistance gene.
Apropiadamente, el ácido nucleico es derivable (preferentemente derivado) a partir 15 de un factor de virulencia.Suitably, the nucleic acid is derivable (preferably derived) from a virulence factor.
Apropiadamente, el ácido nucleico es derivable (preferentemente derivado) a partir de una isla de patogenicidad.Suitably, the nucleic acid is derivable (preferably derived) from an island of pathogenicity.
20 Apropiadamente, el ácido nucleico es derivable (preferentemente derivado) a partir de una secuencia nueva, con el fin de proporcionar resistencia frente a entidades portadoras de dicha molécula particular.Suitably, the nucleic acid is derivable (preferably derivative) from a new sequence, in order to provide resistance against carriers of said particular molecule.
En un aspecto adicional se proporciona la utilización de CRISPR para la 25 identificación y tipado.In a further aspect the use of CRISPR for identification and typing is provided.
En un aspecto adicional se proporciona la utilización de uno o más genes cas y unoIn a further aspect the use of one or more cas genes and one is provided
o más elementos CRISPR (por ejemplo una o más repeticiones CRISPR y/o espaciadoresor more CRISPR elements (for example one or more CRISPR repetitions and / or spacers
de CRISPR) para modular la resistencia en una célula frente a un ácido nucleico diana o 30 un producto de transcripción del mismo.CRISPR) to modulate the resistance in a cell against a target nucleic acid or a transcription product thereof.
TABLA 1TABLE 1
1 Fago utilizado para generar mutantes insensibles a bacteriófagos (BIM)1 Phage used to generate bacteriophage-insensitive mutants (BIM)
2 Sensibilidad a fagos de la cepa, S = sensible, R = resistente según se determina mediante ensayos de mancha y de plaqueo.2 Phage sensitivity of the strain, S = sensitive, R = resistant as determined by stain and plating assays.
3 Homología entre el nuevo espaciador del mutante y la secuencia de ADN del fago utilizado para generar el mutante3 Homology between the new mutant spacer and the phage DNA sequence used to generate the mutant
Los fagos retuvieron la capacidad de adsorberse a los mutantes.Phages retained the ability to adsorb to mutants.
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Streptococcus thermophilus
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Streptococcus thermophilus
AGGAAAAAACCCAAACAACCCAAAATGTTA
SEC ID nº 314 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TCTAATTCTGTCACCACGACTATATCGCCA
SEC ID nº 315 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AATCTGTGTGGGAAGTAAAGATTGAAGATG
SEC ID nº 316 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATAGTTTGTTAAGTCATACCCATTAAATTG SEQID317 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TCCACATGATTACAAAGCCACGCAAGACCT
SEC ID nº 318 29 ADN
Streptococcus thermophilus
GAAGACCAAAATTTGACAATGAGTCCTGC
SEC ID nº 319 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATTATATTTAAGTTGTAAATGTTGCTTTTC
SEC ID nº 320 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GCAGACATTGGCTCAACAAGTGATTATGAA
SEC ID nº 321 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TGTTCTCATAAATTGCCTTTCCTTTTTATG
SEC ID nº 322 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTTATCAAACATCAAGGATTGTAGATGAGG
SEC ID nº 323 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATTTCATTAGTAGCTTGATAAATGTTTCTA
SEC ID nº 324 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GAAAATACTATACTTTAAAAGAAATTTTAA
SEC ID nº 325 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TCTCCTCCGACATAATCTTTTGTCTTTCCG
SEC ID nº 326 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ACAAAAGCACTGCCACCTATAGAAGCATTT
SEC ID nº 327 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAAAACTTTATGCTATCCGTGTCAGTATAT
SEC ID nº 328 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTTTCAATGATTGAAAGCCCATAACTAACA
SEC ID nº 329 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTTTCATAGTTGTTACGAAATGTTTGGCAT
SEC ID nº 330 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CGATTTGCAATATGATGATATTGATGAATT
SEC ID nº 331 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTTAGATGCTAGTCCTAAGACTGTAGAGAC
SEC ID nº 332 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GTAATCAAGCGTATATAAGTCAGGACTATC
SEC ID nº 333 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATAACAGAAGGAGTAGGGGACGTAGGCGCG SEC ID nº 334 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTATTTGATAGGAATGTCAGTAATTTTTGA
SEC ID nº 335 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AACATTTCAGCGCTTACTTATCAATCTAAT
SEC ID nº 336 29 ADN
Streptococcus thermophilus
GTATTAGTAGGCATACGATTATGGAAGTA
SEC ID nº 337 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GATATATATATATATATTTATTTTAAATAT
SEC ID nº 338 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTGTCATAATAATTAAATCCAATAGGACTT
SEC ID nº 339 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GAAAATTTCTGTTGTGTTCTTAATATTAGC
SEC ID nº 340 30 ADN
Streptococcus vestibularis
GTACTTCAAAGGTTCTAACTACATAACACA
SEC ID nº 341 30 ADN
Streptococcus vestibularis
TAAAACCAGATGGTGGTTCTTCTGATACTA SEC ID nº 342 30 ADN
Streptococcus vestibularis
CATTTTCTTCAGTCAATTCGTTCTCAAGCG
SEC ID nº 343 30 ADN
Streptococcus vestibularis
AAAGGACGGGGGCAATGAACAAACGACAAC
SEC ID nº 344 29 ADN
Streptococcus vestibularis
TAATATCATTGATAGCTTCATCAAAGGCT
SEC ID nº 345 29 ADN
Streptococcus vestibularis
TAAATTGTTCCTTGACTCCGAACTGCCCT
SEC ID nº 346 30 ADN
Streptococcus vestibularis
AAACAATCGTTTATCTATCCTCAAAGGATG
SEC ID nº 347 30 ADN
Streptococcus vestibularis
ATAAAAAAACGCCTCAAAAACCGAGACAAC
SEC ID nº 348 30 ADN
Streptococcus vestibularis
TGGAAATCCCTTATATCGACAAATACGTTA
SEC ID nº 349 30 ADN
Streptococcus vestibularis
TTCCCAGTCGTTGATTTTTATTGAATACCC
SEC ID nº 350
ADN
Streptococcus vestibularis
GGACATCGAACAAGTCAATGCCGTAAGCTT
SEC ID nº 351 30 ADN
Streptococcus vestibularis
AATCTTTAACCGGATTGTAGAACCGTTCGG
SEC ID nº 352 30 ADN
Streptococcus vestibularis
TGCCTTTAAAATAACTAGATTTTACCATCA
SEC ID nº 353 29 ADN
Streptococcus vestibularis
GAGCAAGCACAAGCAAGCTTTACTATCCT
SEC ID nº 354 30 ADN
Streptococcus vestibularis
CAGATTGGTTTATCGAACAAGGTCGCAAGT
SEC ID nº 355 31 ADN
Streptococcus vestibularis
CAAAAGCTGTTGGTTAACGGTGCTTTGGGCA
SEC ID nº 356 30 ADN
Streptococcus vestibularis
CTTGTTTTTCCTCTGGGGTCTCTGCGACTT
SEC ID nº 357 30 ADN
Streptococcus vestibularis
GAAATAAACTGCCCAAACATTTTTATTTTC
SEC ID nº 358 ADN
Streptococcus vestibularis
TGAGTAAGCGACAAGCTAGAAATCAAGTCA
SEC ID nº 359 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATAGCTAAGATGGAAGAAGCATCAAGCACC
SEC ID nº 360 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CAGTATCTCAAACGCTGGATACAACAAGAT
SEC ID nº 361 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CCTACTCAGTGGACACCTGCAATTGAAGAC
SEC ID nº 362 29 ADN
Streptococcus thermophilus
CGATTGGAACGGGTGCTTATGGCCTTAAC
SEC ID nº 363 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GCGAACAATTGAATTTGTTAGAAAATGTCG
SEC ID nº 364 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GAAGCATTTATTAATATAGATGGTTCTGCT
SEC ID nº 365 28 ADN
Streptococcus thermophilus
TGCTGACGTATCTGTCCACTGTGTGCCA
SEC ID nº 366 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTTTTATACTTTGGGTAAATTACAAAATAG
SEC ID nº 367 31 ADN
Streptococcus thermophilus
TCAAGGTGTCGCCTTATGGAAAAGATGCTTG
SEC ID nº 368 31 ADN
Streptococcus thermophilus
TGTAAAAATTTCTAGACGTTTAGACACTTTA
SEC ID nº 369 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAATGATGATTGAATGCTTGAGATAGCAGT
SEC ID nº 370 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AATAAGAAGTTCTTGACGACCAACCGACAT
SEC ID nº 371 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TCGTCAACGTCGATACAGAACAACGTGCTT
SEC ID nº 372 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TGATTAGCAAATTTAAAACAGGATATTTGG
SEC ID nº 373 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAAGACAAGCCCAAGGGATTGAACTAGCAA
SEC ID nº 374 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CGAACAGTTGGCGAGAAATCCGTCTGGCGT SEC ID nº 375 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTACATTATTGATCATGTTTTTTCTCCTGT
SEC ID nº 376 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TAGAAGGCTCTGGAAATACAAAGCAATTCT
SEC ID nº 377 31 ADN
Streptococcus thermophilus
TAGAAGGCTCTGGTAAATACAAAGCAATTCT
SEC ID nº 378 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TCTGATGGCTCTTGGTAGGGAACTGGATAT
SEC ID nº 379 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTTGATGGCTCTTGGTAGGGAACTGGATAT
SEC ID nº 380 31 ADN
Streptococcus thermophilus
TTTTGATGGCTCTTGGTAGGGAACTGGATAT
SEC ID nº 381 29 ADN
Streptococcus thermophilus
ACAGAACAAAATGGTAGAATATATCATCT
SEC ID nº 382 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CCCTGGACAAGCTATCAGCACATATCCTTG SEC ID nº 383 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CGCTGTTGATGTAACCCGCTTTATATATAT
SEC ID nº 384 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GAATGAATGTATTAGAGCAAGCACTTGACC
SEC ID nº 385 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TAGACGAAAAGGAAGGAAAATAGCATGAGC
SEC ID nº 386 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATAACTCGATTGCTAACTTAAGCAAGCAGT
SEC ID nº 387 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTGCATGTGTAACCATGACTTCTTCGTCGT
SEC ID nº 388 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTTCGCTGGAAACTTCGTAGTCATACATAC
SEC ID nº 389 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAGACCGCTGTACTGGTTGGTATTCGTACC
SEC ID nº 390 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CAACCAAGCGAACACAGCAGTAGCACCGCA
SEC ID nº 391
29 ADN
Streptococcus thermophilus
ATGATGATGAAGTATCGTCATCTACTAAC
SEC ID nº 392 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTTCACCTCAAATCTTAGAGATGGACTAAA
SEC ID nº 393 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAAAGGTGCGTATGAAACTCATCCCAGCGG
SEC ID nº 394 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAGGGTTTAAGTCCTTCATAGAGTGGAAAA
SEC ID nº 395 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CCTCAAAGCTTAAAATTGGGCTGAAGTAGA
SEC ID nº 396 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GCAATTTATTCGCTTGATGTACTCACGTTT
SEC ID nº 397 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TATTTATTGCAAATGGTTACCATATTTTTA
SEC ID nº 398 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TATTTTAGCACTACGGTATCAGCGTATCTC
SEC ID nº 399 ADN
Streptococcus thermophilus
TGCTACGTGCTCTGGACGGGCGCTATCAGC
SEC ID nº 400 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAATGAACAGACAAGAAGCAACAGAAATTG
SEC ID nº 401 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAGTTGATCGTATCTATTTAGAATATCGCA
SEC ID nº 402 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATTCACTTTGACAGATACTAATGCTACATC
SEC ID nº 403 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CAAGCAGTGTAAAGGTGGTTTATATGTTAA
SEC ID nº 404 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CATAGTATAGCCGTCTTCTTTGATTGATTG
SEC ID nº 405 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CCATGGGTGCTAAAGGTGATGACTACCGCT
SEC ID nº 406 36 ADN
Streptococcus thermophilus
TTTCTAGGAATGGGTAATTATAGCGAGCTAGAAAGC
SEC ID nº 407 38 ADN
Streptococcus thermophilus
AGTTGGGAAGGTCTTGGAAAATCTATGGCAAAAAACCT
SEC ID nº 408 35 ADN
Streptococcus thermophilus
TATATGGTTCAAATGCGATTCAAAGACTATTCAAA
SEC ID nº 409 30 ADN
Streptococcus agalactiae
TAATTGCCAATGCTTACAATATCTTCGTCA
SEC ID nº 410 30 ADN
Streptococcus agalactiae
ATGTTCTGAATTACCTTTCTCGACACTCCG
SEC ID nº 411 30 ADN
Streptococcus agalactiae
ACCATCAAGGCTCTTATCTGCAGATTGTTA
SEC ID nº 412 30 ADN
Streptococcus agalactiae
AAATGGTTGCCAATGACTTTCTAGAGTGAT
SEC ID nº 413 30 ADN
Streptococcus agalactiae
ACAAAATCTTTTGTTGCTCCTGGACGTATT
SEC ID nº 414 30 ADN
Streptococcus agalactiae
ATGTAAGGTATTGTAAAACTTCTTCTTGCG
SEC ID nº 415 30 ADN
Streptococcus agalactiae
ACTGTTCCTATAATTAAAATAAAAGAGGTA SEC ID nº 416 30 ADN
Streptococcus agalactiae
TGTTCCAGTAAAAAGTAATTTTAAAGCATT
SEC ID nº 417 30 ADN
Streptococcus agalactiae
CGCTCGATTGATGCTATCAACTATATTGAA
SEC ID nº 418 30 ADN
Streptococcus agalactiae
TTCTTCAAGAGAACTTGTAGAACAGCTTCA
SEC ID nº 419 30 ADN
Streptococcus agalactiae
AAGGTACTTTTAGCTTGTTCTTGTGGTGTT
SEC ID nº 420 30 ADN
Streptococcus agalactiae
ACAGCTACTGTAAATTCTGCTTTTACGGTT
SEC ID nº 421 30 ADN
Streptococcus agalactiae
TAGTGCAGTTGTCAAGGAGATTGTGAGCGA
SEC ID nº 422 30 ADN
Streptococcus agalactiae
TTTAACCTTTGAAAATGTGAAAGGCTCGTA
SEC ID nº 423 30 ADN
Streptococcus agalactiae
GCGATGATGGTAAGTCATCATGGACAGCGT SEC ID nº 424 30 ADN
Streptococcus agalactiae
TTTTACACACGATGTCAGATATAATGTCAA
SEC ID nº 425 30 ADN
Streptococcus agalactiae
AGTACTGCACTAGGAATTGTAGAGATCAAA
SEC ID nº 426 30 ADN
Streptococcus agalactiae
CGTACCATCTATCAATTTACCGCAAGCTGT
SEC ID nº 427 30 ADN
Streptococcus agalactiae
TTAAAAGATTTAAACTATCAAGCGTCAATT
SEC ID nº 428 30 ADN
Streptococcus agalactiae
TTCTAAATGCTGGTGACTGCTTTGCATAAA
SEC ID nº 429 31 ADN
Streptococcus agalactiae
TTGCTGCTAGACCCAAACAGTTTATTTTTAG
SEC ID nº 430 30 ADN
Streptococcus agalactiae
TCCTTTTTTAGATAATGTGCGATCACGGAC
SEC ID nº 431 29 ADN
Streptococcus agalactiae
TTTTACCAATGCTTCCATATCGCTTATAT
SEC ID nº 432
30 ADN
Streptococcus agalactiae
TGGTTATACATTTACTAATCCATCAGCATT
SEC ID nº 433 30 ADN
Streptococcus agalactiae
AAGCTAATTCTCATCTCACCGAGATGGATA
SEC ID nº 434 30 ADN
Streptococcus agalactiae
AAAAACTCTTACCACTTACATACATGTATG
SEC ID nº 435 30 ADN
Streptococcus agalactiae
GCTGGAGATTTTACAAGCAGTTTGAATTTC
SEC ID nº 436 30 ADN
Streptococcus agalactiae
ATCACACCAGTCGTTATGATGGATGACTAT
SEC ID nº 437 30 ADN
Streptococcus agalactiae
TGTCAACAGTACGTGAGACGAGTGTGTAGG
SEC ID nº 438 30 ADN
Streptococcus agalactiae
TGAAGTTGATGGATATGTTGATTTAGAGCT
SEC ID nº 439 30 ADN
Streptococcus agalactiae
TAATCATTTTATGAGAGATACCGCCTCAAG
SEC ID nº 440
ADN
Streptococcus agalactiae
TTTAAAGAGATATCTGTTTCATCTTGCGGA
SEC ID nº 441 30 ADN
Streptococcus agalactiae
AATCACTTCTGCATAAATATCTTTTACTTC
SEC ID nº 442 30 ADN
Streptococcus agalactiae
AAACATCCGCAACGGGATAAATAAAGCTAG
SEC ID nº 443 30 ADN
Streptococcus agalactiae
AGTTTCTTGTGGGTTAGCTTGTCCACCGTA
SEC ID nº 444 30 ADN
Streptococcus agalactiae
GAACATGAAAGATTTTAAAAAAGAACATTT
SEC ID nº 445 30 ADN
Streptococcus agalactiae
AGAGGGGAAAATATCAATGCCGAATGCTGA
SEC ID nº 446 30 ADN
Streptococcus agalactiae
GATGGTACAAAATCATTTGTTGGTACTGAT
SEC ID nº 447 30 ADN
Streptococcus mutans
AAAAGGAAACGCCATTAATTAATATGGTGA
SEC ID nº 448 30 ADN
Streptococcus mutans
GATTGAACCAGCTAGCGCAGTTAGTGCTCT
SEC ID nº 449 30 ADN
Streptococcus mutans
CGCTAAAAGCTGTTGTGTCATCATAGTTAG
SEC ID nº 450 30 ADN
Streptococcus mutans
TAAATATTTTCAATTAGACAATAGACAAAC
SEC ID nº 451 30 ADN
Streptococcus mutans
TGCCTATGTATTCGGACATGACTTGCCACA
SEC ID nº 452 30 ADN
Streptococcus mutans
ATGTGAAAAGAAAGTAACTACTACATTTGA
SEC ID nº 453 30 ADN
Streptococcus pyogenes
TGCGCTGGTTGATTTCTTCTTGCGCTTTTT
SEC ID nº 454 30 ADN
Streptococcus pyogenes
TTATATGAACATAACTCAATTTGTAAAAAA
SEC ID nº 455 30 ADN
Streptococcus pyogenes
AGGAATATCCGCAATAATTAATTGCGCTCT
SEC ID nº 456 30 ADN
Streptococcus pyogenes
TAAATTTGTTTAGCAGGTAAACCGTGCTTT SEC ID nº 457 30 ADN
Streptococcus pyogenes
TTCAGCACACTGAGACTTGTTGAGTTCCAT
SEC ID nº 458 33 ADN
Streptococcus pyogenes
CTGTGACATTGCGGGATGTAATCAAAGTAAAAA
SEC ID nº 459 32 ADN
Streptococcus pyogenes
AAAGCAAACCTAGCAGAAGCAGAAAATGACTT
SEC ID nº 460 34 ADN .
Streptococcus pyogenes
TGATGTAATTGGTGATTTTCGTGATATGCTTTTT
(c) (III) CAS
SEC ID nº 461 5849 ADN
Streptococcus thermophilus
SEC ID 462 10 3387
ADN
Streptococcus thermophilus
SEC ID 463 5 912
ADN
Streptococcus thermophilus
SEC ID 464 324 ADN
Streptococcus thermophilus
SEC ID 465 1053
5 ADN Streptococcus thermophilus
SEC ID 476 15 324SEQ ID 476 15 324
ADNDNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
SEC ID 477 1053SEQ ID 477 1053
5 ADN Streptococcus thermophilus5 DNA Streptococcus thermophilus
SEC ID 478 7900 ADNSEQ ID 478 7900 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
SEC ID 479 624SEQ ID 479 624
10 ADN Streptococcus thermophilus10 Streptococcus thermophilus DNA
SEC ID 480 396SEQ ID 480 396
5 ADN Streptococcus thermophilus5 DNA Streptococcus thermophilus
SEC ID 481 330 ADNSEQ ID 481 330 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
SEC ID 482 732 ADNSEQ ID 482 732 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
SEC ID 483 5 2277SEQ ID 483 5 2277
ADNDNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
SEC ID 484 5 381SEQ ID 484 5 381
ADNDNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
SEC ID 486 20 900SEQ ID 486 20 900
ADNDNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
SEC ID 487 1074SEQ ID 487 1074
10 ADN Streptococcus thermophilus10 Streptococcus thermophilus DNA
SEC ID 488 1074SEQ ID 488 1074
ADNDNA
Streptococcus agalactiaeStreptococcus agalactiae
SEC ID 489 4113 ADNSEQ ID 489 4113 DNA
Streptococcus agalactiaeStreptococcus agalactiae
SEC ID 490 870SEQ ID 490 870
5 ADN Streptococcus agalactiae5 DNA Streptococcus agalactiae
SEC ID 491 327 ADNSEQ ID 491 327 DNA
Streptococcus agalactiaeStreptococcus agalactiae
SEC ID 492 666SEQ ID 492 666
20 ADN Streptococcus agalactiae20 Streptococcus agalactiae DNA
SEC ID 493 5 5995SEQ ID 493 5 5995
ADNDNA
Streptococcus agalactiaeStreptococcus agalactiae
SEC ID 494 4134 ADNSEQ ID 494 4134 DNA
Streptococcus agalactiaeStreptococcus agalactiae
SEC ID 495 5 870SEQ ID 495 5 870
ADNDNA
Streptococcus agalactiaeStreptococcus agalactiae
SEC ID 496 342SEQ ID 496 342
ADNDNA
Streptococcus agalactiaeStreptococcus agalactiae
SEC ID 497 666 ADNSEQ ID 497 666 DNA
Streptococcus agalactiaeStreptococcus agalactiae
SEC ID 498 15 6580SEQ ID 498 15 6580
ADNDNA
Streptococcus mutansStreptococcus mutans
SEC ID 499 4038 ADNSEQ ID 499 4038 DNA
Streptococcus mutansStreptococcus mutans
SEC ID 500 867SEQ ID 500 867
5 ADN Streptococcus mutans5 DNA Streptococcus mutans
SEC ID 502 573SEQ ID 502 573
20 ADN Streptococcus mutans20 Streptococcus mutans DNA
SEC ID 503 378SEQ ID 503 378
5 ADN Streptococcus mutans5 DNA Streptococcus mutans
10 SEC ID 504 5966 ADN10 SEQ ID 504 5966 DNA
Streptococcus pyogenesStreptococcus pyogenes
15fifteen
SEC ID 505 4107SEQ ID 505 4107
10 ADN Streptococcus pyogenes10 Streptococcus pyogenes DNA
SEC ID 506 870 ADNSEQ ID 506 870 DNA
Streptococcus pyogenesStreptococcus pyogenes
SEC ID 507 342SEQ ID 507 342
5 ADN Streptococcus pyogenes5 Streptococcus pyogenes DNA
SEC ID 508 663 ADNSEQ ID 508 663 DNA
Streptococcus pyogenesStreptococcus pyogenes
SEQ TD 509 8020SEQ TD 509 8020
20 ADN Streptococcus pyogenes20 Streptococcus pyogenes DNA
SEC ID 510 2409 ADNSEQ ID 510 2409 DNA
Streptococcus pyogenesStreptococcus pyogenes
SEC ID 511 729SEQ ID 511 729
5 ADN Streptococcus pyogenes5 Streptococcus pyogenes DNA
SEC ID 513 5 849SEQ ID 513 5 849
ADNDNA
Streptococcus pyogenesStreptococcus pyogenes
SEC ID 515 5 1026SEQ ID 515 5 1026
ADNDNA
Streptococcus pyogenesStreptococcus pyogenes
SEC ID 516 294 ADNSEQ ID 516 294 DNA
Streptococcus pyogenesStreptococcus pyogenes
SEC ID 517 5966SEQ ID 517 5966
5 ADN Streptococcus pyogenes5 Streptococcus pyogenes DNA
SEC ID 518 5 4107SEQ ID 518 5 4107
ADNDNA
Streptococcus pyogenesStreptococcus pyogenes
SEC ID 519 5 871SEQ ID 519 5 871
ADNDNA
Streptococcus pyogenesStreptococcus pyogenes
SEC ID 521 663SEQ ID 521 663
5 ADN Streptococcus pyogenes5 Streptococcus pyogenes DNA
10 (IV) FUNCTIONAL COMBINATIONS10 (IV) FUNCTIONAL COMBINATIONS
By way of example only, the following functional combinations may be used in accordance with the present invention.By way of example only, the following functional combinations may be used in accordance with the present invention.
15 Functional combination #1 cas sequences: SEC ID 461 to SEC ID 465, and SEC ID 473 to SEC ID 477 repeat sequences: SEC ID 1 to SEC ID 1015 Functional combination # 1 cas sequences: SEC ID 461 to SEC ID 465, and SEC ID 473 to SEC ID 477 repeat sequences: SEC ID 1 to SEC ID 10
Functional combintaion #2 20 cas sequences: SEC ID 466 to SEC ID 472, and SEC ID 478 to SEC ID 487 repeat sequences: SEC ID 11 and SEC ID 12Functional combintaion # 2 20 cas sequences: SEC ID 466 to SEC ID 472, and SEC ID 478 to SEC ID 487 repeat sequences: SEC ID 11 and SEC ID 12
Functional combination #3 cas sequences: SEC ID 488 to SEC ID 508, and SEC ID 517 to SEC ID 521 25 repeat sequences: SEC ID 13 to SEC ID 19Functional combination # 3 cas sequences: SEC ID 488 to SEC ID 508, and SEC ID 517 to SEC ID 521 25 repeat sequences: SEC ID 13 to SEC ID 19
Functional combination #4 cas sequences: SEC ID 509 to SEC ID 516 repeat sequences: SEC ID 20 and SEC ID 22Functional combination # 4cas sequences: SEC ID 509 to SEC ID 516repeat sequences: SEC ID 20 and SEC ID 22
3030
(V) FURTHER CRISPR SPACERS(V) FURTHER CRISPR SPACERS
SEC ID 522 30 ADNSEQ ID 522 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CAACACATTCAACAGATTAATGAAGAATACCAACACATTCAACAGATTAATGAAGAATAC
SEC ID 523 30 ADNSEQ ID 523 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TCCACTCACGTACAAATAGTGAGTGTACTCTCCACTCACGTACAAATAGTGAGTGTACTC
SEC ID 524 30 ADNSEQ ID 524 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GCCCTTCTAATTGGATTACCTTCCGAGGTGGCCCTTCTAATTGGATTACCTTCCGAGGTG
SEC ID 525 30 ADNSEQ ID 525 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CTCAGTCGTTACTGGTGAACCAGTTTCAATCTCAGTCGTTACTGGTGAACCAGTTTCAAT
SEC ID 526 30 ADNSEQ ID 526 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ATTGTCTATTACGACAACATGGAAGATGATATTGTCTATTACGACAACATGGAAGATGAT
SEC ID 527 31 ADNSEQ ID 527 31 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GAGTTTCTTTGTCAGACTCTAACACAGCCGCGAGTTTCTTTGTCAGACTCTAACACAGCCGC
SEC ID 528 30 ADNSEQ ID 528 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TTACTAGAGCGTGTCGTTAACCACTTTAAATTACTAGAGCGTGTCGTTAACCACTTTAAA
SEC ID 529 30 ADNSEQ ID 529 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TTCGTTAAAGTCACCTCGTGCTAGCGTTGCTTCGTTAAAGTCACCTCGTGCTAGCGTTGC
SEC ID 530SEQ ID 530
30 ADN30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ATAACGGTAGCAAATATAAACCTGTTACTGATAACGGTAGCAAATATAAACCTGTTACTG
SEC ID 531 30 ADNSEQ ID 531 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GAAGTAGCCATACAAGAAGATGGATCAGCAGAAGTAGCCATACAAGAAGATGGATCAGCA
SEC ID 532 29 ADNSEQ ID 532 29 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ATGTCACTGAGTGTCTAAGCATTGCGTACATGTCACTGAGTGTCTAAGCATTGCGTAC
SEC ID 533 30 ADNSEQ ID 533 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TGAATAAGCAGTTCTTGACGACCAACCGACTGAATAAGCAGTTCTTGACGACCAACCGAC
SEC ID 534 30 ADNSEQ ID 534 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TCAACAATTGCAACATCTTATAACCCACTTTCAACAATTGCAACATCTTATAACCCACTT
SEC ID 535 30 ADNSEQ ID 535 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TTACGTTTGAAAAGAATATCAAATCAATGATTACGTTTGAAAAGAATATCAAATCAATGA
SEC ID 536 30 ADNSEQ ID 536 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GCTCTACGACTTCTTCCACGAGTTCCTGCCGCTCTACGACTTCTTCCACGAGTTCCTGCC
SEC ID 537 30 ADNSEQ ID 537 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
AACACAGCAAGACAAGAGGATGATGCTATGAACACAGCAAGACAAGAGGATGATGCTATG
SEC ID 538SEQ ID 538
ADNDNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
AAGTAGTTGATGACCTCTACAATGGTTTATAAGTAGTTGATGACCTCTACAATGGTTTAT
SEC ID 539 30 ADNSEQ ID 539 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
AATAATTTATGGTATAGCTTAATATCATTGAATAATTTATGGTATAGCTTAATATCATTG
SEC ID 540 30 ADNSEQ ID 540 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
AATCAATACGACAAGAGTTAAAATGGTCTTAATCAATACGACAAGAGTTAAAATGGTCTT
SEC ID 541 30 ADNSEQ ID 541 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
AATCGTTCAAATTCTGTTTTAGGTACATTTAATCGTTCAAATTCTGTTTTAGGTACATTT
SEC ID 542 30 ADNSEQ ID 542 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
AATGACGAGGAGCTATTGGCACAACTTACAAATGACGAGGAGCTATTGGCACAACTTACA
SEC ID 543 30 ADNSEQ ID 543 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
AATTAAGGGCATAGAAAGGGAGACAACATGAATTAAGGGCATAGAAAGGGAGACAACATG
SEC ID 544 30 ADNSEQ ID 544 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ACAATTCTTCATCCGGTAACTGCTCAAGTGACAATTCTTCATCCGGTAACTGCTCAAGTG
SEC ID 545 30 ADNSEQ ID 545 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ACACTTGGCAGGCTTATTACTCAACAGCGAACACTTGGCAGGCTTATTACTCAACAGCGA
SEC ID 546 ADNSEQ ID 546 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ATAAACTATGAAATTTTATAATTTTTAAGAATAAACTATGAAATTTTATAATTTTTAAGA
SEC ID 547 30 ADNSEQ ID 547 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ATAACTGAAGGATAGGAGCTTGTAAAGTCTATAACTGAAGGATAGGAGCTTGTAAAGTCT
SEC ID 548 29 ADNSEQ ID 548 29 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ATAATGCCGTTGAATTACACGGCAAGTCAATAATGCCGTTGAATTACACGGCAAGTCA
SEC ID 549 30 ADNSEQ ID 549 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CAACCAACGGTAACAGCTACTTTTTACAGTCAACCAACGGTAACAGCTACTTTTTACAGT
SEC ID 550 30 ADNSEQ ID 550 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CATAGAGTGGAAAACTAGAAACAGATTCAACATAGAGTGGAAAACTAGAAACAGATTCAA
SEC ID 551 29 ADNSEQ ID 551 29 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CGACACAAGAACGTATGCAAGAGTTCAAGCGACACAAGAACGTATGCAAGAGTTCAAG
SEC ID 552 30 ADNSEQ ID 552 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CGATATTTAAAATCATTTTCATAACTTCATCGATATTTAAAATCATTTTCATAACTTCAT
SEC ID 553 30 ADNSEQ ID 553 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CGATTTGACAATCTGCTGACCACTGTTATCCGATTTGACAATCTGCTGACCACTGTTATC
SEC ID 554 30 ADNSEQ ID 554 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CTGTTCCTTGTTCTTTTGTTGTATCTTTTCCTGTTCCTTGTTCTTTTGTTGTATCTTTTC
SEC ID 555 30 ADNSEQ ID 555 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GAGCGAGCTCGAAATAATCTTAATTACAAGGAGCGAGCTCGAAATAATCTTAATTACAAG
SEC ID 556 30 ADNSEQ ID 556 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GCAGTATCAGCAAGCAAGCTGTTAGTTACTGCAGTATCAGCAAGCAAGCTGTTAGTTACT
SEC ID 557 30 ADNSEQ ID 557 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GCTGGCGAGGAAACGAACAAGGCCTCAACAGCTGGCGAGGAAACGAACAAGGCCTCAACA
SEC ID 558 30 ADNSEQ ID 558 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GCTTAGCTGTCCAATCCACGAACGTGGATGGCTTAGCTGTCCAATCCACGAACGTGGATG
SEC ID 559 30 ADNSEQ ID 559 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GGCGTCCCAATCCTGATTAATACTTACTCGGGCGTCCCAATCCTGATTAATACTTACTCG
SEC ID 560 30 ADNSEQ ID 560 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GTTCGCTAGCGTCATGTGGTAACGTATTTAGTTCGCTAGCGTCATGTGGTAACGTATTTA
SEC ID 561 30 ADNSEQ ID 561 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TCTATATCGAGGTCAACTAACAATTATGCTTCTATATCGAGGTCAACTAACAATTATGCT
SEC ID 562 30 ADNSEQ ID 562 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TGCATCGAGCACGTTCGAGTTTACCGTTTC SEC ID 563 30 ADNTGCATCGAGCACGTTCGAGTTTACCGTTTC SEC ID 563 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TGTTTGACAGCAAATCAAGATTCGAATTGTTGTTTGACAGCAAATCAAGATTCGAATTGT
SEC ID 564 30 ADNSEQ ID 564 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TTCATTCTTCCGT=GTRTGCGAATCCTTTCATTCTTCCGT = GTRTGCGAATCCT
SEC ID 565 30 ADNSEQ ID 565 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TGACTTAGCGAATTTAATCGCTAAGATATCTGACTTAGCGAATTTAATCGCTAAGATATC
SEC ID 566 30 ADNSEQ ID 566 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TTTATACTTTATCTTTTTAAAGAATGTATTTTTATACTTTATCTTTTTAAAGAATGTATT
SEC ID 567 30 ADNSEQ ID 567 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CCTAAAATCATTTTCAACGAGTTGCGATACCCTAAAATCATTTTCAACGAGTTGCGATAC
SEC ID 568 30 ADNSEQ ID 568 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
AATAAATTGCTATGATACAGCGTACCGATAAATAAATTGCTATGATACAGCGTACCGATA
SEC ID 569 30 ADNSEQ ID 569 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TGCTCTCTATGCGATTGGACGTCTGTCTAATGCTCTCTATGCGATTGGACGTCTGTCTAA
SEC ID 570 30 ADNSEQ ID 570 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
AAGAAAGATAAGAAAAAAGTAACACTACTT SEC ID 571 30 ADNAAGAAAGATAAGAAAAAAGTAACACTACTT SEC ID 571 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TCTCTTTCCATCGGTACTGGTATATCTCATTCTCTTTCCATCGGTACTGGTATATCTCAT
SEC ID 572 30 ADNSEQ ID 572 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ATTGGTAGCCAAGTAAATATCACCATTGATATTGGTAGCCAAGTAAATATCACCATTGAT
SEC ID 573 30 ADNSEQ ID 573 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TTCTTCAAATTCACCGACTGCAAAATTACATTCTTCAAATTCACCGACTGCAAAATTACA
SEC ID 574 30 ADNSEQ ID 574 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GCTTCCTAAGTGCATGAAAATCGCAAACGGGCTTCCTAAGTGCATGAAAATCGCAAACGG
SEC ID 575 30 ADNSEQ ID 575 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TATACCTGTCTATGTAAGGGAATTTAACTCTATACCTGTCTATGTAAGGGAATTTAACTC
SEC ID 576 30 ADNSEQ ID 576 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GGTGTAGGTGCTGTTGGTAAGTTGTTTAATGGTGTAGGTGCTGTTGGTAAGTTGTTTAAT
SEC ID 577 30 ADNSEQ ID 577 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GTGAAACAGGTTATCAAAAAACGTATATTGGTGAAACAGGTTATCAAAAAACGTATATTG
SEC ID 578 30 ADNSEQ ID 578 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TTATTCTTGGAATTATTACAGACCCTACTATTATTCTTGGAATTATTACAGACCCTACTA
SEC ID 579SEQ ID 579
30 ADN30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GCTTTCATTATATCACTTACTCATAAATCTGCTTTCATTATATCACTTACTCATAAATCT
SEC ID 580 30 ADNSEQ ID 580 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TAATCACCCCTTTTTCTAGCTCTTGATTGATAATCACCCCTTTTTCTAGCTCTTGATTGA
SEC ID 581 30 ADNSEQ ID 581 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CAAGCAGTGTAAAGGTGGTTTAAATGTTAACAAGCAGTGTAAAGGTGGTTTAAATGTTAA
SEC ID 582 30 ADNSEQ ID 582 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
AACCCGCGTGGTTATGGGCTTGAGGAGTGTAACCCGCGTGGTTATGGGCTTGAGGAGTGT
SEC ID 583 30 ADNSEQ ID 583 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ATATTAATAGCGATTCTATGCTACAACGTGATATTAATAGCGATTCTATGCTACAACGTG
SEC ID 584 30 ADNSEQ ID 584 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TCATCTTCTAAGTAAATACCACTGTCAGGGTCATCTTCTAAGTAAATACCACTGTCAGGG
SEC ID 585 29 ADNSEQ ID 585 29 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TTTTCGCAAAGTAAGCGAAGCTCTACGTGTTTTCGCAAAGTAAGCGAAGCTCTACGTG
SEC ID 586 30 ADNSEQ ID 586 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TTCTGTAGCCACTCCGTGGATGCCTTCAGCTTCTGTAGCCACTCCGTGGATGCCTTCAGC
SEC ID 587SEQ ID 587
ADNDNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TTCTTTAGTTCGGACACCCTCAACACCTATTTCTTTAGTTCGGACACCCTCAACACCTAT
SEC ID 588 30 ADNSEQ ID 588 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GCTTTGATTGGACGGAAAATGGTATCCCTGGCTTTGATTGGACGGAAAATGGTATCCCTG
SEC ID 589 . 31 ADNSEQ ID 589. 31 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TTCCTCATCTTTCTCCGCTTTTGCTAGACTTTTCCTCATCTTTCTCCGCTTTTGCTAGACTT
SEC ID 590 30 ADNSEQ ID 590 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TTAGACCAGATGGACAGATATTCTTCATCGTTAGACCAGATGGACAGATATTCTTCATCG
SEC ID 591 31 ADNSEQ ID 591 31 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TCATCAGAGTCAACAATCACGGGAAAGACCTTCATCAGAGTCAACAATCACGGGAAAGACCT
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Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ACACTCATCCTTATCCTGTAGTTCAAAACAACACTCATCCTTATCCTGTAGTTCAAAACA
SEC ID 593 30 ADNSEQ ID 593 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CAGCACTAGCCGCAAGCCCTTGTATATTAACAGCACTAGCCGCAAGCCCTTGTATATTAA
SEC ID 594 30 ADNSEQ ID 594 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TAGAAATCAAGGAACTTGGATGAAAAGTAATAGAAATCAAGGAACTTGGATGAAAAGTAA
SEC ID 595 ADNSEQ ID 595 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ATATGAAAGGGAAATGATATGAAGAATGAAATATGAAAGGGAAATGATATGAAGAATGAA
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Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TTTTGGGATACAACACGCAGTCGTTGACTTGTTTTGGGATACAACACGCAGTCGTTGACTTG
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Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GTTTGAGATGCCAATGTTTTTCAATCCTTGGTTTGAGATGCCAATGTTTTTCAATCCTTG
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Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GTATCAAAAGACGCATTCATGAAGCGAGCTGTATCAAAAGACGCATTCATGAAGCGAGCT
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Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
AAAAACAATTGAAATTCATAATCAGCGCTTAAAAACAATTGAAATTCATAATCAGCGCTT
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Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GCTTTTAACGTTTTAAGAGAATACCCTCTGCTTTTAACGTTTTAAGAGAATACCCTCT
SEC ID 601 30 ADNSEQ ID 601 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GTGACGCTGCAATGACTTGCCATAGTAATTGTGACGCTGCAATGACTTGCCATAGTAATT
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Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ATACTGGTATATAGTAATTCATACTTCATCATACTGGTATATAGTAATTCATACTTCATC
SEC ID 603 30 ADNSEQ ID 603 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TTGGTTTCATATTTACTCCTTTGTGTTTTG SEC ID 604 30 ADNTTGGTTTCATATTTACTCCTTTGTGTTTTG SEQ ID 604 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CTGATTTGGTCTTGTTCTTTTGTCCCTTTTCTGATTTGGTCTTGTTCTTTTGTCCCTTTT
SEC ID 605 30 ADNSEQ ID 605 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GCAGCAGTTGAGAACTTTAGCGTCCAGTGGGCAGCAGTTGAGAACTTTAGCGTCCAGTGG
SEC ID 606 30 ADNSEQ ID 606 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TGCTACTATGAAGGACGCTGTTGATACTTTTGCTACTATGAAGGACGCTGTTGATACTTT
SEC ID 607 30 ADNSEQ ID 607 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TCTTCTTTAATCTTTTTTAACGTCAACGTTTCTTCTTTAATCTTTTTTAACGTCAACGTT
SEC ID 608 30 ADNSEQ ID 608 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GTATCCATTAATATAGTAGCATTTCTATCAGTATCCATTAATATAGTAGCATTTCTATCA
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Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ATTCATTAATATCTGCAAGGATGTCTTGTTATTCATTAATATCTGCAAGGATGTCTTGTT
SEC ID 610 30 ADNSEQ ID 610 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GAGAAAGTAGCCCATTCGGCCCATTCGGGGGAGAAAGTAGCCCATTCGGCCCATTCGGGG
SEC ID 611 30 ADNSEQ ID 611 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TACTTGAGTTAGCTCTGGAAGTCATTTATC SEC ID 612 30 ADNTACTTGAGTTAGCTCTGGAAGTCATTTATC SEC ID 612 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CTGCATTTGTAACCATGACTTCTTCGTCGTCTGCATTTGTAACCATGACTTCTTCGTCGT
SEC ID 613 30 ADNSEQ ID 613 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
AATTTGTCATCGACATCTACCAACGCCCAGAATTTGTCATCGACATCTACCAACGCCCAG
SEC ID 614 30 ADNSEQ ID 614 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ATAAAATTATGCCACGTTTTGGCACTAGATATAAAATTATGCCACGTTTTGGCACTAGAT
SEC ID 615 30 ADNSEQ ID 615 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ATGTCTCTGAGGCTGTAGTAATTTACTTGTATGTCTCTGAGGCTGTAGTAATTTACTTGT
SEC ID 616 30 ADNSEQ ID 616 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CTTTAAAGAGTTGATTAAGTGCGTTACTGTCTTTAAAGAGTTGATTAAGTGCGTTACTGT
SEC ID 617 30 ADNSEQ ID 617 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
AAATGGGTTATGCTGTTCAATATGCGTCCCAAATGGGTTATGCTGTTCAATATGCGTCCC
SEC ID 618 30 ADNSEQ ID 618 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
AAACTGAAAACAACACAGACAATTCAACAAAAACTGAAAACAACACAGACAATTCAACAA
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Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GCCCAAAATGCTAGACGTTTGAATGACGGCGCCCAAAATGCTAGACGTTTGAATGACGGC
SEC ID 620SEQ ID 620
30 ADN30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ATGAAGAACGTGATTCACCTACGGTATGCTATGAAGAACGTGATTCACCTACGGTATGCT
SEC ID 621 31 ADNSEQ ID 621 31 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GCTTTTGCAGAATTGTCTCCAGTGCCGATTTGCTTTTGCAGAATTGTCTCCAGTGCCGATTT
SEC ID 622 30 ADNSEQ ID 622 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TGTACTCTATTGATTGCTTCATCTTTATTATGTACTCTATTGATTGCTTCATCTTTATTA
SEC ID 623 31 ADNSEQ ID 623 31 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CTTTCAAGATACTCATCAACCATTGATGTCACTTTCAAGATACTCATCAACCATTGATGTCA
SEC ID 624 30 ADNSEQ ID 624 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CTATGTCTTTACTGTTCTTCCAAAACCACCCTATGTCTTTACTGTTCTTCCAAAACCACC
SEC ID 625 30 ADNSEQ ID 625 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TGCTACGTGCTCTGTACGGGCGCTATCAGCTGCTACGTGCTCTGTACGGGCGCTATCAGC
SEC ID 626 30 ADNSEQ ID 626 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CGTGGCAGCGTGGTCGGGTTTAATAGCCCGCGTGGCAGCGTGGTCGGGTTTAATAGCCCG
SEC ID 627 29 ADNSEQ ID 627 29 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
AAGCCCAAGTCAGAGCATCCGTCCAAGCCAAGCCCAAGTCAGAGCATCCGTCCAAGCC
SEC ID 628SEQ ID 628
ADNDNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ATTGGGTTTCGGTAAGAACTAAACATACCAATTGGGTTTCGGTAAGAACTAAACATACCA
SEC ID 629 30 ADNSEQ ID 629 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CACAAAATAATTCGGTAGTTTTTACTAACTCACAAAATAATTCGGTAGTTTTTACTAACT
SEC ID 630 29 ADNSEQ ID 630 29 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TTTGACCGTTTATTTAGACGTGCTAAAGTTTTGACCGTTTATTTAGACGTGCTAAAGT
SEC ID 631 30 ADNSEQ ID 631 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CTTCACCTCAAATCTTAGAGCTGGACTAAACTTCACCTCAAATCTTAGAGCTGGACTAAA
SEC ID 632 30 ADNSEQ ID 632 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ATGTCTGAAAAATAACCGACCATCATTACTATGTCTGAAAAATAACCGACCATCATTACT
SEC ID 633 30 ADNSEQ ID 633 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GAAGCTCATCATGTTAAGGCTAAAACCTATGAAGCTCATCATGTTAAGGCTAAAACCTAT
SEC ID 634 30 ADNSEQ ID 634 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TAGTCTAAATAGATTTCTTGCACCATTGTATAGTCTAAATAGATTTCTTGCACCATTGTA
SEC ID 635 30 ADNSEQ ID 635 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ATTCGTGAAAAAATATCGTGAAATAGGCAAATTCGTGAAAAAATATCGTGAAATAGGCAA
SEC ID 636 30 ADNSEQ ID 636 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TCTAGGCTCATCTAAAGATAAATCAGTAGCTCTAGGCTCATCTAAAGATAAATCAGTAGC
SEC ID 637 31 ADNSEQ ID 637 31 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TAAAAACATGGGGCGGCGGTAATAGTGTAAGTAAAAACATGGGGCGGCGGTAATAGTGTAAG
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Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ACAACCAGCAAAGAGAGCGCCGACAACATTACAACCAGCAAAGAGAGCGCCGACAACATT
SEC ID 639 30 ADNSEQ ID 639 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TATAACACAGGTTTAGAGGATGTTATACTTTATAACACAGGTTTAGAGGATGTTATACTT
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Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CTAGAAGCTCAAGCGGTAAAAGTTGATGGCGCTAGAAGCTCAAGCGGTAAAAGTTGATGGCG
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Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CTTTGAGGGCAAGCCCTCGCCGTTCCATTTCTTTGAGGGCAAGCCCTCGCCGTTCCATTT
SEC ID 642 30 ADNSEQ ID 642 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
AACTACCAAGCAAATCAGCAATCAATAAGTAACTACCAAGCAAATCAGCAATCAATAAGT
SEC ID 643 30 ADNSEQ ID 643 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CTATAAGTGACAATCAGCGTAGGGAATACGCTATAAGTGACAATCAGCGTAGGGAATACG
SEC ID 644 30 ADNSEQ ID 644 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ATCAGTGCGGTATATTTACCGTAGACGCTA SEC ID 645 30 ADNATCAGTGCGGTATATTTACCGTAGACGCTA SEC ID 645 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
AACAGTTACTATTAATCACGATTCCAACGGAACAGTTACTATTAATCACGATTCCAACGG
SEC ID 646 30 ADNSEQ ID 646 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
AATTAGGGCGTCTTCCTTTATTCCGTGGTTAATTAGGGCGTCTTCCTTTATTCCGTGGTT
SEC ID 647 30 ADNSEQ ID 647 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ATAGCTTCATTGCGCTTTTTAATTTGACCTATAGCTTCATTGCGCTTTTTAATTTGACCT
SEC ID 648 30 ADNSEQ ID 648 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
AACAACAAAGCAAATACAACAGTAACAACCAACAACAAAGCAAATACAACAGTAACAACC
SEC ID 649 30 ADNSEQ ID 649 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CTAAACTACGTTTGAAGGTCTCAACTCCGTCTAAACTACGTTTGAAGGTCTCAACTCCGT
SEC ID 650 30 ADNSEQ ID 650 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GAGGTTGAATAGTGAGTGCACCATGTTTGTGAGGTTGAATAGTGAGTGCACCATGTTTGT
SEC ID 651 30 ADNSEQ ID 651 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
AGTAGAGAGACCAGCACACTACTGTACTACAGTAGAGAGACCAGCACACTACTGTACTAC
SEC ID 652 30 ADNSEQ ID 652 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CTTCGCACGAAAGTTTATTAGACAACTCGC SEC ID 653 30 ADNCTTCGCACGAAAGTTTATTAGACAACTCGC SEC ID 653 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TGATAGAGCTAGAATTGTCTTTTTTACCGATGATAGAGCTAGAATTGTCTTTTTTACCGA
SEC ID 654 30 ADNSEQ ID 654 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
AGATACTCTTGCTCGCCTCTGAACAACCAGAGATACTCTTGCTCGCCTCTGAACAACCAG
SEC ID 655 30 ADNSEQ ID 655 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GGTGAAAAAGGTTCACTGTACGAGTACTTAGGTGAAAAAGGTTCACTGTACGAGTACTTA
SEC ID 656 30 ADNSEQ ID 656 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TCAATGAGTGGTATCCAAGACGAAAACTTATCAATGAGTGGTATCCAAGACGAAAACTTA
SEC ID 657 30 ADNSEQ ID 657 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CCTTGTCGTGGCTCTCCATACGCCCATATACCTTGTCGTGGCTCTCCATACGCCCATATA
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Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TGTTTGGGAAACCGCAGTAGCCATGATTAATGTTTGGGAAACCGCAGTAGCCATGATTAA
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Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ACAGAGTACAATATTGTCCTCATTGGAGACACACAGAGTACAATATTGTCCTCATTGGAGACAC
SEQ TD 660 30 ADNSEQ TD 660 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CTCATATTCGTTAGTTGCTTTTGTCATAAACTCATATTCGTTAGTTGCTTTTGTCATAAA
SEC ID 661SEQ ID 661
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Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
AGAACTTTATCAAGATAAAACTACTTTAAAAGAACTTTATCAAGATAAAACTACTTTAAA
SEC ID 662 30 ADNSEQ ID 662 30 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
ATAGTATTAATTTCATTGAAAAATAATTGTATAGTATTAATTTCATTGAAAAATAATTGT
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Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
GCTTTCTAGCTCGCTATAATTACCCATTCCTAGAAAGCTTTCTAGCTCGCTATAATTACCCATTCCTAGAAA
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Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
TCAAAATATGTTATTACCTTGTATTTCATAATTCAATTAATCAAAATATGTTATTACCTTGTATTTCATAATTCAATTAA
SEC ID 665 39 ADNSEQ ID 665 39 DNA
Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus
CCACTTGCTGTGTACATCCTACCAGTTCCGCCTATGATGCCACTTGCTGTGTACATCCTACCAGTTCCGCCTATGATG
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| DK2426220T3 (en) | Labeled microorganisms, and methods for labeling | |
| ES2348069T3 (en) | USE OF GENES ASSOCIATED WITH CRISPR (CAS). | |
| AU2013234432B2 (en) | Cultures with improved phage resistance |