Derivados de ácido hialurónico de aril/alquilvinil sulfona.
Campo de la invenciónLa presente invención se refiere a lamodificación de ácido hialurónico (HA) con aril o alquilvinilsulfonas para producir derivados de HA con aril/alquil vinilsulfonas (AVS-HA), a los derivadosAVS-HA como tales, a su producción, y a susaplicaciones y usos, particularmente en la industria cosmética ybiomédica.
Antecedentes de la invenciónLos heteropolisacáridos más abundantes delcuerpo son los glicosaminoglicanos. Los glicosaminoglicanos sonpolímeros de carbohidratos de cadena recta, que consisten enunidades repetitivas de disacáridos (salvo el queratán sulfato quees ramificado en la región del núcleo de los carbohidratos). Lasunidades de disacáridos generalmente comprenden, como una primeraunidad de sacárido, uno de dos azúcares modificados -N-acetilgalactosamina (GalNAc) oN-acetilglucosamina (GlcNAc). La segunda unidad esnormalmente un ácido urónico, tal como ácido glucurónico (GlcUA) oiduronato.
Los glicosaminoglicanos son moléculas cargadasnegativamente, y tienen una conformación extendida que imparte altaviscosidad cuando está en solución. Los glicosaminoglicanos seencuentran principalmente en la superficie de las células o en lamatriz extracelular. Los glicosaminoglicanos también tienen bajacomprimibilidad en solución y, como resultado, son ideales comofluido de lubrificación fisiológico, por ej., para lasarticulaciones. La rigidez de los glicosaminoglicanos proporcionaintegridad estructural a las células y proporciona vías de pasoentre las células, permitiendo la migración celular. Losglicosaminoglicanos de mayor importancia fisiológica son hialuronano, condroitina sulfato, heparina, glucosaminida sulfatoN-acetiltransferasa, dermatan sulfato, y queratansulfato. La mayoría de los glicosaminoglicanos están unidos demanera covalente a una proteína central de proteoglicano a través de estructuras de oligosacárido específico. El hialuronano formaagregados grandes con determinados proteoglicanos, pero es unaexcepción ya que las cadenas de carbohidratos libres formancomplejos no covalentes con proteoglicanos.
Se han identificados numerosas funciones delhialuronano en el cuerpo (véase, Laurent T. C. y Fraser J. R. E.,1992, FASEB J. 6: 2397-2404; y Toole B.P., 1991, "Proteoglycans and hyaluronan in morphogenesis anddifferentiation". En: Cell Biology of the Extracellular Matrix,pp. 305-341, Hay E. D., ed., Plenum, New York). El hialuronano está presente en el cartílago hialino, líquido sinovial,y tejido de la piel, tanto en la dermis como en la epidermis.También se cree que el hialuronano desarrolla un papel en numerosasfunciones fisiológicas, tales como adhesión, desarrollo, motilidadcelular, cáncer, angiogénesis, y cicatrización de heridas. Debido alas propiedades físicas y biológicas únicas del hialuronano, seemplea en cirugía ocular y de articulaciones y está siendo evaluadoen otros procedimientos médicos.
Los términos "hialuronano" o "ácidohialurónico" son usados en la bibliografía para referirse a lospolisacáridos ácidos con diferentes pesos moleculares constituidos por residuos de ácidos D-glucurónico yN-acetil-d-glucosamina,que ocurren naturalmente en las superficies de las células, en lassustancias básicas extracelulares del tejido conjuntivo devertebrados, en el líquido sinovial de las articulaciones, en el humor vítreo, en el tejido del cordón umbilical humano y en lascrestas de los gallos.
El término "ácido hialurónico" de hecho esnormalmente usado para referirse a toda una serie de polisacáridoscon residuos alternantes de ácidos D-glucurónico yN-acetil-d-glucosaminacon pesos moleculares variables o incluso fracciones degradadas delmismo, y por lo tanto sería más correcto usar el término plural de"ácidos hialurónicos". El término singular, no obstante, seráusado a pesar de todo en esta descripción; además se usaráfrecuentemente la abreviatura "HA" en lugar de este términocolectivo.
El HA juega un papel importante en el organismobiológico como soporte mecánico para las células de muchos tejidos,tales como la piel, tendones, músculos y cartílago, es uncomponente principal de la matriz intercelular. el HA también forma parte importante en los procesos biológicos, tales como lahidratación de tejidos y lubricación.
El HA puede ser extraído de los tejidosnaturales arriba mencionados, aunque hoy se prefiere prepararlo pormétodos microbiológicos para minimizar el riesgo potencial detransferencia de agentes infecciosos, y para aumentar launiformidad, calidad y disponibilidad del producto.
el HA y su varias fracciones de tamaño moleculary las sales derivadas respectivas han sido usados comomedicamentos, especialmente en el tratamiento de artropatías, comoagente auxiliar y/o sustituto de órganos y tejidos naturales, especialmente en oftalmología y cirugía cosmética, y como agentes enpreparaciones cosméticas. También se han desarrollado productos dehialuronano para el uso en ortopedia, reumatología, ydermatología.
El HA puede también ser usado como un aditivopara varios materiales poliméricos usados para artículos sanitariosy quirúrgicos, tales como poliuretanos, poliésteres, etc. con elefecto de hacer estos materiales biocompatibles.
Resumen de la invenciónLa invención se refiere a la preparación de unageneración nueva de ácido hialurónico derivado de reactivosmonofuncionales de vinil sulfona.
Los reactivos monofuncionales de vinil sulfonatienen la fórmula general (CH_{2}=CH-SO_{2}-R) donde R esun grupo arilo o alquilo que es preferible pero no necesariamentehidrofóbico. La reacción que produce la modificación se desarrolla entre el grupo vinilo reactivo del reactivo de sulfona y lasfracciones de hidróxilo del ácido hialurónico.
La invención puede utilizarse para preparar unagama amplia de derivados dependiendo de la naturaleza del grupo Rdependiente. Los compuestos comercialmente disponibles en elmercado incluyen metil-, etil-, fenil-, p-tolil-,octil- y otras alquil-/aril vinil sulfonas.
A diferencia de la divinil sulfona (DVS), losreactivos de R-vinil sulfona son monofuncionalesevitando de ese modo cualquier reticulación del HA.
Los derivados resultantes, modificados congrupos hidrofóbicos, pueden encontrar aplicación en la industria decosméticos como emulsionantes o en sistemas de administraciónavanzados, tales como nanocápsulas. También pueden ser usados parala hidratación de la piel a través de la formación de una película.Las propiedades de los derivados permiten la producción debiomaterias nuevas manteniendo al mismo tierno la biocompatibilidady biodegradabilidad del hialuronano original.
El método se basa en una química bienestablecida (DVS ha sido usado desde hace más de 20 años parareticular HA) y tiene varias ventajas por ser un método muy versátil, el HA se usa como su sal sódica, esto puede hacerse comouna "síntesis en una sola operación sintética", la reacción sedesarrolla a temperatura ambiente, es un proceso simple y corto, yla purificación posterior puede hacerse muy eficazmente sin dejarresiduos de reactivos de vinil sulfona.
Hay una demanda, particularmente en la industriacosmética y biomédica, de compuestos a base de o derivados de ácidohialurónico que tengan determinadas características alteradas encomparación con el HA no modificado. Las propiedades de interés sonla mejor capacidad de estabilizar espuma, y la capacidad paramezclar con materiales no hidrofílicos, tal como se usa normalmenteen los productos cosméticos.
La invención proporciona productos amfifílicosderivados de HA con propiedades beneficiosas en aplicacionescosméticas o biomédicas. Estos productos se unen más firmemente ala piel de modo que éstos no son fácilmente lavados. Los derivadosAVS-HA son también adecuados para el uso enformulaciones cosméticas o biomédicas más avanzadas, por ej., en laformación de nano/macro cápsulas o nano/macro esferas paraadministrar compuestos activos o fármacos. Los derivados AVS-HA de peso molecular inferior (PM) penetran enla piel más eficazmente que los HA no derivados de PMcomparable.
Por consiguiente, en un primer aspecto lainvención se refiere a un derivado de ácido hialurónicocomprendiendo n unidades repetitivas y teniendo la fórmula general estructural (I):
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donde, en al menos una unidad derepetición, uno o más de R1, R2, R3, R4 comprende una aril/alquilsulfona unida a un éter que tiene la fórmula general estructural(II), donde R comprende un grupo alquilo o arilo, y por el contrarioR1, R2, R3, R4 son grupos hidróxilo,OH:
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En otras palabras, un aspecto de la invención serefiere a un derivado de ácido hialurónico, donde uno o más gruposhidróxilo del ácido hialurónico ha sido hecho reaccionar con uno omás compuestos monofuncionales alquil/aril vinil sulfona, para formar un enlace de éter entre el ácido hialurónico y el uno o máscompuestos de alquil/aril sulfona resultante.
En un segundo aspecto, la invención se refiere aun derivado de ácido hialurónico, donde se ha producido unareacción de adición entre uno o más grupos hidróxilo del ácidohialurónico y uno o más compuestos monofuncionales dearil-/alquil-vinil sulfona, para formar un enlace deéter entre el ácido hialurónico y el uno o más compuestos dearil/alquil sulfona resultante.
En un tercer aspecto, la invención se refiere aun proceso para producir un derivado de ácido hialurónico, elproceso incluyendo las etapas de:
- (a)
- hacer reaccionar un ácido hialurónicocon uno o más compuestos de alquil-/aril-vinil sulfona teniendo la fórmula general estructural (III) bajocondiciones alcalinas en una solución acuosa, por la cual se formael derivado de ácido hialurónico; y
- (b)
- recuperar el derivado de ácidohialurónico.
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En un cuarto aspecto, la invención se refiere auna composición que comprende un derivado de ácido hialurónico taly como se define en el primer o segundo aspecto, y una sustanciaactiva, preferiblemente la sustancia activa es un agente farmacológicamente activo.
Un quinto aspecto de la invención se refiere auna composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz deun derivado de ácido hialurónico tal y como se define en el primero segundo aspecto, junto con un soporte, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Un sexto aspecto se refiere a una composiciónfarmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un derivado deácido hialurónico tal y como se define en el primer o segundoaspecto como un vehículo, junto con un agente farmacológicamente activo.
Un séptimo aspecto se refiere a un artículocosmético comprendiendo como sustancia activa una cantidad eficazde un derivado de ácido hialurónico tal y como se define en elprimer o segundo aspecto, o una composición tal y como se define en cualquiera del cuarto, quinto o sexto aspecto.
En un octavo aspecto, la invención se refiere aun artículo sanitario, médico o quirúrgico que comprende underivado de ácido hialurónico tal y como se define en el primer osegundo aspecto, o una composición tal y como se define encualquiera del cuarto, quinto, o sexto aspecto, preferiblemente elartículo siendo un pañal, una compresa, una esponja quirúrgica, unaesponja para cicatrizar heridas, o una parte comprendida en unatirita u otro material de apósito.
Un aspecto importante se refiere a una cápsula omicrocápsula de medicamento que comprende un derivado de ácidohialurónico tal y como se define en el primer o segundo aspecto, ouna composición tal y como se define en cualquiera del cuarto,quinto, o sexto aspecto.
Los últimos aspectos de la invención se refierena métodos para realizar procedimientos en oftalmología, en eltratamiento de osteoartritis o cáncer, pérdida de pelo o calvicie,de tratamiento de una herida, de realizar una administración dérmicao transdérmica de un agente farmacológicamente activo, oadministración dérmica de un cosmético, la mejora que comprende eluso de un derivado de ácido hialurónico tal y como se define en elprimer o segundo aspecto, o una composición tal y como se define encualquiera del cuarto, quinto, o sexto aspecto.
Varios aspectos se refieren a usos de underivado de ácido hialurónico tal y como se define en cualquieradel primer o segundo aspecto, o una composición tal y como sedefine en cualquiera del cuarto, quinto, o sexto aspecto, para laproducción de un medicamento para el tratamiento de osteoartritis,cáncer, la producción de un medicamento para un tratamientooftalmológico, la producción de un medicamento para el tratamientode heridas, la producción de un medicamento para angiogénesis, la producción de un medicamento para el tratamiento de pérdida de peloo calvicie, o la producción de una hidratante.
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Breve descripción de los dibujosFigura 1: espectro de RMN ^{1}H (HA, 300kDa).
Figura 2: espectro de RMN ^{1}H,(PVS-HA de HA 300 kDa) Proporción de PVS:HA 1.5:1.
Figura 3: espectro de RMN ^{1}H,(PVS-HA de HA 300 kDa) Proporción de PVS:HA 1.5.
Figura 4: espectro de RMN ^{1}H(PVS-HA de HA 300 kDa) Proporción de PVS:HA 10:1
Figura 5: espectro IR, (PVS-HAde HA 300 kDa) Proporción de PVS:HA 10:1.
Figura 6: espectro de RMN ^{1}H,(EVS-HA de HA 300 kDa) Proporción de EVS:HA1.5:1.
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Descripción detallada de la invenciónÁcido Hialurónico"Ácido hialurónico" es definido aquí comoun glicosaminoglicano no sulfatado compuesto por unidadesrepetitivas de disacárido de N-acetilglucosamina(GlcNAc) y ácido glucurónico (GlcUA) unidas por enlacesbeta-1,4 y beta-1,3 glicosídicos alternantes. El ácido hialurónico es también conocido comohialuronano, hialuronato, o HA. Los términos hialuronano y ácidohialurónico son usados de forma intercambiable aquí.
Las crestas de gallo son una fuente comercialsignificante de hialuronano. Los microorganismos son una fuentealternativa. La patente U.S. n°. 4,801,539 expone un método defermentación para preparar ácido hialurónico que implica una cepa deStreptococcus zooepidemicus con rendimientos proporcionadosde aproximadamente 3,6 g de ácido hialurónico por litro. La PatenteEuropea no. EP0694616 expone procesos de fermentación usando unacepa mejorada deStreptococcus zooepidemicus conrendimientos proporcionados de aproximadamente 3,5 g de ácido hialurónico por litro. Como se describe en WO 03/054163 (Novozymes),que se incorpora aquí en su totalidad, el ácido hialurónico o salesderivadas pueden ser producidas por recombinación, por ej., en unhuésped deBacillus gram positivo.
Las hialuronano sintasas de vertebrados,patógenos bacterianos y virus algales han sido descritas(DeAngelis, P. L., 1999, Cell. Mol. Life Sci. 56:670-682). WO 99/23227 expone un Grupo I dehialuronato sintasa deStreptococcus equisimilis. WO 99/51265 y WO 00/27437 describen una hialuronato sintasa de Grupo IIdePasturella multocida. Ferrettiet al. describen eloperón de hialuronano sintasa deStreptococcus pyogenes, queestá compuesto de tres genes, hasA, hasB, y hasC, que codifican hialuronato sintasa, UDP glucosa dehidrogenasa, yUDP-glucosa pirofosforilasa, respectivamente (Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 98, 4658-4663, 2001). WO99/51265 describe un segmento de ácido nucleico que tiene unaregión de codificación para una hialuronano sintasa deStreptococcus equisimilis.
Como el hialuronano de una célula deBacillus recombinante es expresada directamente al medio decultivo, se puede usar un proceso simple para aislar el hialuronanodel medio de cultivo. Primero, las células deBacillus ydetrito celular son físicamente eliminados del medio de cultivo. Elmedio de cultivo puede ser diluido primero, si se desea, parareducir la viscosidad del medio. Muchos métodos son conocidos porlos expertos en la técnica para la eliminación de células del mediode cultivo, tal como centrifugado o microfiltración. Si se desea,el sobrenadante restante puede luego ser filtrado, tal como porultrafiltración, para concentrar y eliminar contaminantes demoléculas pequeñas del hialuronano. Tras la eliminación de las células y detrito celular se realiza una precipitación simple delhialuronano del medio por mecanismos conocidos. Se puede usar sal,alcohol, o combinaciones de sal y alcohol para precipitar elhialuronano del filtrado. Una vez reducido a un precipitado, el hialuronano puede ser fácilmente aislado de la solución por mediosfísicos. El hialuronano puede ser secado o concentrado de lasolución filtrada usando técnicas de evaporación conocidas en latécnica, tal como secado por pulverización.
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El primer aspecto de la invención se refiere aun derivado de ácido hialurónico comprendiendo n unidadesrepetitivas y teniendo la fórmula general estructural (I):
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donde, en al menos una unidadrepetitiva, uno o más de R1, R2, R3, R4 comprende una aril/alquilsulfona unida a un éter teniendo la fórmula general estructural(II), donde R comprende un grupo alquilo o arilo, y por elcontrario R1, R2, R3, R4 son grupos hidróxilo,OH:
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En otras palabras, un aspecto de la invención serefiere a un derivado de ácido hialurónico, donde se produce unareacción de adición entre uno o más grupos hidróxilo del ácidohialurónico y uno o más compuestos monofuncionales de aril-/alquil vinil sulfona, para formar un enlace de éter entre el ácidohialurónico y el uno o más compuestos de aril/alquil sulfonaresultantes.
Una forma de realización preferida se refiere alderivado de ácido hialurónico de la invención, donde el uno o máscompuestos monofuncionales de aril-/alquil-vinil sulfona tienen la fórmula general estructural (III), donde Rcomprende un grupo alquilo o arilo.
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Aún otra forma de realización preferida serefiere al derivado de ácido hialurónico de la invención, donde doso más de R1, R2, R3, R4 comprenden una o más aril/alquil sulfonaunida a un éter teniendo la fórmula general estructural (II); o donde tres o más de R1, R2, R3, R4 comprenden uno o más aril/alquilsulfonas unidas a un éter teniendo la fórmula general estructural(II); o de hecho donde todos R1, R2, R3, R4 comprenden una o másaril/alquil sulfonas unidas a un éter teniendo la fórmula generalestructural (II).
La reacción principal o sitio de adición en elproceso de la invención es el hidróxilo primario de la unidadrepetitiva del ácido hialurónico, también mostrado como R4 en lafórmula estructural (I).
Por consiguiente, una forma de realizaciónpreferida se refiere al derivado de HA de la invención, donde almenos R4 comprende una aril/alquil sulfona unida a un éter teniendola fórmula general estructural (II).
Se pueden concebir muchos grupos alquilo o arilodiferentes adecuados en los componentes monofuncionales dealquil-/aril-vinil sulfona para el uso en lapresente invención.
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Una forma de realización preferida se refiere alderivado de HA de la invención, donde R comprende un grupo alquilo,preferiblemente el grupo alquilo es hidrofóbico, preferiblemente elgrupo alquilo comprende un grupo alquiloC_{1}-C_{20}, preferiblemente metilo, etilo,propilo, 2-octenilo, 2-nonenilo,2-dodecenilo, 2-hexadecenilo o2-octadecenilo.
Otra forma de realización preferida se refiereal derivado de HA de la invención, donde R comprende un grupoarilo, preferiblemente el grupo arilo es hidrofóbico, y máspreferiblemente el grupo arilo es fenilo op-toluilo.
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Peso MolecularEl nivel de ácido hialurónico puede serdeterminado según el método de carbazol modificado (Bitter y Muir,1962, Anal Biochem. 4: 330-334). Además, el peso molecular promedio del ácido hialurónico puede ser determinadousando métodos estándares en la técnica, tales como aquellosdescrito por Uenoet al., 1988, Chem. Pharm. Bull. 36,4971-4975; Wyatt, 1993, Anal. Chim. Acta 272:1-40; y Wyatt Technologies, 1999, "lightScattering University DAWN Course Manual" y "DAWN EOSManual" Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara,California.
En una forma de realización preferida, losderivados de ácido hialurónico obtenidos por los métodos de lapresente invención tienen un peso molecular de aproximadamente1,000 a aproximadamente 10,000,000 Da. En una forma de realizaciónmás preferida, los derivados de ácido hialurónico obtenidos por los métodos de la presente invención tienen un peso molecular deaproximadamente 5,000 a aproximadamente 5,000,000 Da. En una formade realización aún más preferida, los derivados de ácidohialurónico obtenidos por los métodos de la presente invencióntienen un peso molecular de aproximadamente 10,000 a aproximadamente 3,000,000 Da.
Otra forma de realización preferida se refiereal producto del primer aspecto, donde el ácido hialurónico o salderivada tiene un peso molecular en el rango de entre 300,000 y3,000,000; preferiblemente en el rango de entre 400,000 y 2,500,000;más preferiblemente en el rango de entre 500,000 y 2,000,000; y dela forma más preferible en el rango de entre 600,000 y 1,800,000Da.
Cuando se usa ácido hialurónico o su salproducido por recombinación en los métodos de la invención paraproducir los productos o composiciones de la invención, puede serventajoso para algunas aplicaciones reducir primero el pesomolecular promedio del ácido hialurónico o derivado o sal derivada.Por ejemplo, varios fabricantes han informado de las denominadasfracciones con bajo peso molecular del ácido hialurónico, quepueden penetrar la barrera de la piel para restablecer el contenidonatural de ácido hialurónico en la piel, en consecuencia fraccionesde este tipo son particularmente adecuadas para composicionescosméticas vendidas como agentes antienvejecimiento de la piel yantiarrugas. Para aplicaciones alimenticias, se ha demostrado queel ácido hialurónico de bajo PM penetra la barrera gastrointestinal, aumentando de ese modo su biodisponibilidad. Finalmente, el ácidohialurónico de bajo PM exhibe un efecto antiinflamatorio y tieneaplicaciones potenciales en el tratamiento de enfermedadesinflamatorias. Puede conseguirse una reducción del peso molecularpromedio de un ácido hialurónico o derivado o sal derivada mediante métodos estándares en la técnica, tales como, tratamiento térmicosimple, degradación enzimática, sonicación con ultrasonidos, ohidrólisis ácida. Véase, por ej., la patente estadounidense6,020,484, que describe una técnica de tratamiento por ultrasonidosdel HA incluyendo NaOCl como aditivo, y T. Miiazakiet al.(2001) Degradación y Estabilidad de los Polímeros, 74:77-85.
Por consiguiente, una forma de realizaciónpreferida se refiere al derivado de HA de la invención, donde elácido hialurónico o derivado o sal derivada tiene un peso molecularpromedio bajo en el rango de entre 10,000 y 3,000,000 Da;preferiblemente en el rango de entre 10,000 y 50,000 Da; opreferiblemente en el rango de entre 50,000 y 500,000 Da; inclusomás preferiblemente en el rango de entre 80,000 y 300,000 Da.
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Grado de sustitución (DS)El DS fue determinado por espectroscopia de RMN^{1}H (10 mg/ml, D_{2}O, 80°C, 128 scans, 400MHz) según elEjemplo 6 abajo, donde los picos del Grupo OSA fueron asignadosusando una RMN 2D(gCOSY). El DS fue luego calculadocomparando la intensidad de los protones de vinilo de OSA (5.4 y5.6 ppm) con aquello de los protones de acetilo (2.0 ppm).
En una forma de realización preferida elderivado de HA del primer aspecto tiene un Grado de Sustitución(DS) en el rango de 0.1-100%, preferiblemente1-90%, más preferiblemente 2-80%,aún más preferiblemente 4-70%, incluso más preferiblemente 8-60%, o 10-50%,14-40%, 16-30%, o de la forma máspreferible en el rango de 18-25%.
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ProducciónEn los métodos de la presente invención puedeusarse HA producido por recombinación. Este tipo de HA puede serproducido por un proceso, donde las células huéspedes de producciónde HA son cultivadas en un medio nutritivo adecuado para laproducción del ácido hialurónico usando métodos conocidos en latécnica. Por ejemplo, la célula puede ser cultivada por cultivo enmatraz vibrante, fermentación a pequeña escala o a gran escala(incluyendo fermentaciones continuas, por lote, discontinuas o deestado sólido) en laboratorio o fermentadores industrialesrealizadas en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan quelas enzimas implicadas en la síntesis de ácido hialurónico seanexpresadas y aislar el ácido hialurónico. El cultivo se desarrollaen un medio nutritivo adecuado comprendiendo fuentes de nitrógeno ycarbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles en los proveedorescomerciales o pueden ser preparados según composiciones publicadas(por ej., en catálogos de la American Type Culture Collection). Elácido hialurónico segregado puede ser recuperado directamente delmedio.
El ácido hialurónico resultante puede seraislado por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ácidohialurónico puede ser aislado del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluyendo, pero sin limitarse acentrifugado, filtración, extracción, secado por pulverización,evaporación, o precipitación. El ácido hialurónico aislado puedeluego ser adicionalmente purificado por una variedad deprocedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero sinlimitarse a cromatografía (por ej., de intercambio iónico, deafinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque, y exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (por ej., isoelectroenfoquepreparatorio), solubilidad diferencial (por ej., precipitación desulfato amónico), o extracción (véase, por ej., purificación deproteínas, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers,Nueva York, 1989).
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Células huéspedesUna forma de realización preferida se refiere acuando el ácido hialurónico o sal derivada es producido porrecombinación, preferiblemente por una bacteria gram positiva océlula huésped, más preferiblemente por una bacteria del géneroBacillus.
La célula huésped puede ser cualquier célula deBacillus adecuada para la producción recombinante de ácidohialurónico. La célula huésped deBacillus puede ser unacélula deBacillus tipo salvaje o un mutante de la misma.Células deBacillus útiles en la práctica de la presenteinvención incluyen, pero no se limitan a, células deBacillusagaraderhens, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens,Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacilluscoagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus,Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, yBacillusthuringiensis. Las células de Bacillus subtilis mutanteparticularmente adaptadas para la expresión recombinante estándescritas en WO 98/22598. Las células deBacillus sinencapsulación son particularmente útiles en la presenteinvención.
En una forma de realización preferida, la célulahuésped deBacillus es una célula deBacillusamyloliquefaciens, Bacillus clausii, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus oBacillussubtilis. En una forma de realización más preferida, la céluladeBacillus es una célula deBacillus amyloliquefaciens. En otra forma de realización más preferida,la célula deBacillus es una célula deBacillusclausii. En otra forma de realización más preferida, la céluladeBacillus es una célula deBacillus lentus. En otraforma de realización más preferida, la célula deBacillus esuna célula deBacillus licheniformis. En otra forma derealización más preferida, la célula deBacillus es unacélula deBacillus subtilis. En una forma de realización aúnmás preferida, la célula huésped deBacillus esBacillussubtilis A164\Delta5 (véase patente U.S. n°. 5,891,701) oBacillus subtilis 168\Delta4.
La transformación de la célula huésped deBacillus con un constructo de ácido nucléico de la presenteinvención puede, por ejemplo, ser efectuada por transformación delprotoplasto (véase, por ej., Chang y Cohen, 1979, Genética molecular general 168: 111-115), usando célulascompetentes (véase, por ej., Young y Spizizen, 1961, revista deBacteriología 81: 823-829, o Dubnau yDavidoff-Abelson, 1971, Revista de BiologíaMolecular 56: 209-221), por electroporación (véase,por ej., Shigekawa y Dower, 1988, Biotécnicas 6:742-751), o por conjugación (véase, por ej., Koenler y Thorne, 1987, Revista de Bacteriología 169:5271-5278).
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Proceso de derivaciónEn un tercer aspecto, la invención se refiere aun proceso para producir un derivado de ácido hialurónico, elproceso incluyendo las etapas de:
- (a)
- hacer reaccionar un ácido hialurónicocon uno o más compuestos de alquil-/aril-vinil sulfona teniendo la fórmula general estructural (III) bajocondiciones alcalinas en una solución acuosa, por la cual elderivado de ácido hialurónico es formado; y
- (b)
- recuperar el derivado de ácidohialurónico.
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Una forma de realización preferida se refiere alproceso del tercer aspecto, donde el grupo alquilo/arito, R en(III), comprende un grupo alquilo, preferiblemente un grupo alquilohidrofóbico, más preferiblemente el grupo alquilo comprende un grupo alquilo C_{1}-C_{20}, y de la forma máspreferible el grupo alquilo comprende un metilo, etilo, propilo,2-octenilo, 2-nonenilo, 2dodecenilo, 2-hexadecenilo o2-octadecenilo; o donde el grupo alquilo/arilocomprende un grupo arilo, preferiblemente un grupo arilo hidrofóbico, y más preferiblemente el grupo arilo comprende fenilo op-toluilo.
También se prefiere que diferentes compuestosmonofuncionales de vinil sulfona puedan ser empleados al mismotiempo, conduciendo a la adición de varios compuestos de alquil oaril sulfona diferentes a la molécula de HA.
Por consiguiente, una forma de realizaciónpreferida se refiere al proceso del tercer aspecto, donde elprimero o más compuestos de alquil-/aril-vinilsulfona comprenden dos o más grupos alquilo y/o arilo diferentes.Preferiblemente, los dos o más grupos alquilo/arilo diferentescomprenden un grupo alquilo, preferiblemente un grupo alquilohidrofóbico, más preferiblemente el grupo alquilo comprende un grupo alquilo C_{1}-C_{20}, y de la forma máspreferible el grupo alquilo comprende un metilo, etilo, propilo,2-octenilo, 2 nonenilo,2-dodecenilo, 2-hexadecenilo o2-octadecenilo; o los dos o más gruposalquilo/arilo diferentes comprenden un grupo arilo, preferiblemente un grupo arilo hidrofóbico, y más preferiblemente el grupo arilocomprende fenilo o p-toluilo.
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Otros ingredientesEn una forma de realización preferida, lascomposiciones que comprenden un derivado de HA de la invenciónpuede también comprender otros ingredientes, preferiblemente una omás sustancias activas, preferiblemente una o más sustancias farmacológicamente activas, y también preferiblemente un excipientehidrosoluble, tal como lactosa.
Ejemplos no limitativos de una sustancia activao sustancia farmacológicamente activa que puede ser usada en lapresente invención incluyen fármacos a base de proteína y/opéptidos, tales como, hormona de crecimiento humano, hormona de crecimiento bovina, hormona de crecimiento porcina, hormona decrecimiento de liberación de hormonas/péptidos, factor deestimulación de colonias de granulocitos, factor de estimulación decolonias-macrófagos de granulocitos, factor deestimulación de colonias de macrófagos, eritropoyetina, proteínamorfogénica de huesos, interferón o su derivado, insulina o suderivado, atriopeptina III, anticuerpo monoclonal, factor de necrosis tumoral, factor macrófago activante, interleuquina, factorde degeneración tumoral, factor de crecimiento de tipo insulina,factor de crecimiento epidérmico, activador delt-plasminógeno, factor IIV, factor IIIV yuroquinasa.
Un excipiente hidrosoluble puede ser incluidopara estabilizar el (los) ingrediente(s) activo(s),tal excipiente puede incluir una proteína, por ej., albúmina o gelatina; un aminoácido, tal como glicina, alanina, ácido glutámico,arginina, lisina y una sal derivada; carbohidratos tales comoglucosa, lactosa, xilosa, galactosa, fructosa, maltosa, sacarosa,dextrano, manitol, sorbitol, trehalosa y sulfato de condroitina; unasal inorgánica tal como fosfato; un tensioactivo tal como TWEEN® (ICI), polietilenoglicol, y una mezcla del mismo. El excipiente oestabilizador puede ser usado en una cantidad que varía de 0.001 a99% en peso del producto.
Diferentes aspectos de la invención se refierena varias composiciones y fármacos comprendiendo, entre otrosingredientes, una cantidad eficaz del producto tal y como se defineen el primer aspecto, y una sustancia activa, preferiblemente la sustancia activa siendo un agente farmacológicamente activo; unsoporte, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable,preferiblemente un excipiente hidrosoluble, y de la forma máspreferible lactosa.
Además, aspectos de la invención se refieren aartículos que comprenden un derivado de HA tal y como se define enel primer aspecto o una composición tal y como se define en losaspectos y formas de realización sobre, por ej., un artículo cosmético, un artículo sanitario, un artículo médico o quirúrgico.En un último aspecto, la invención se refiere a una cápsula omicrocápsula de medicamento que comprende un producto tal y como sedefine en el primer aspecto o una composición tal y como se defineen otros aspectos y formas de realización de la invención.
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EjemplosEjemplo 1HA derivado con fenil vinil sulfona (PVS)(PVS-HA) con una relación de PVS:HA de 1.5:1\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 16
Se disolvió HA en agua milliQ (10 ml) durantetoda la noche a temperatura ambiente. Se añadió NaOH a la soluciónacuosa de HA bajo agitación. Se disolvió PVS en acetona (10 ml) yla solución resultante fue añadida gota a gota después de 4-5 minutos usando un embudo de separación. Lamezcla fue agitada durante toda la noche a temperatura ambiente. Lamezcla cruda fue luego purificada en una bolsa de diálisis(Spectra/Por®, corte 14 kDa) sumergida en agua milliQ (7.5 L). Secambió el agua milliQ 3 veces, después de 3 horas, luego después deuna noche y finalmente después de 3 horas. La diálisis fue vigiladamidiendo la conductividad del agua milliQ y se detuvo cuando laconductividad fue menor de 5 \mu ES/cm. El producto purificado fue finalmente diluido en agua milliQ (50 ml) y liofilizado.
La reacción dio un material blanco esponjoso de94.5 mg, parcialmente soluble en agua milliQ. La composición delproducto purificado fue analizada por TLC. Los valores de tiempo deretención mostraron que no quedó ningún residuo de PVS en el producto purificado. La estructura del producto purificado fueconstatada por RMN ^{1}H y reveló un grado de sustitución (DS)del 11% por unidad de disacárido de repetición (figura 2). Tambiénse usó FT-IR para confirmar la formación de HAderivado de fenil vinil sulfona.
Se realizó un estudio bajo la influencia de lacantidad de PVS implicada en la reacción. Este estudio mostró quecantidades más altas de PVS daban mayores grados de sustitución.Estos fueron normalmente entre 11% y 55% para relaciones de PVS:HAque variaban de 5:1 a 10:1 (Ejemplo 2).
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Ejemplo 2HA derivado con fenil vinil sulfona (PVS)(PVS-HA) con una relación de PVS:HA de 5:1 y10:1\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 27
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Los derivados arriba fueron preparados según elmétodo descrito en el Ejemplo 1. La relación NaOH:HA fue 1:1. Elgrado de sustitución de los derivados es mostrado en la tabla3.
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TABLA 3Grado de sustitución de derivadosPVS-HA con las relaciones PVS:HA 5:1 y10:18
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La figura 3 y la figura 4 representan losespectros de RMN de los derivados. La figura 5 representa unespectro de IR que confirma la inserción de PVS en cadenas de HA.La atribución de las bandas es presentada en la tabla 4.
TABLA 4Número de ondas y naturaleza de las bandasadicionales observado en el espectro de PVA-HA encomparación con el espectro de HA (relación de PVS:HA10:1)9
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Ejemplo 3HA derivado con etil vinil sulfona (EVS)(EVS-HA) con una relación de EVS:HA de 1.5:1\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 510
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El derivado EVS-HA fue preparadosegún el método descrito en el Ejemplo 1. La reacción dio unmaterial blanco esponjoso, soluble en agua milliQ (12.5 g/l). La estructura del producto purificado fue constatada por RMN ^{1}H yreveló un grado de sustitución del 13.5% por unidad de disacáridorepetitiva (figura 6). Éste fue calculado comparando la señal deprotones de metilo en el sustituyente y aquella de protones de metilo en HA.
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Documentos citados en la descripciónEsta lista de documentos citados por elsolicitante ha sido recopilada exclusivamente para la informacióndel lector y no forma parte del documento de patente europea. Lamisma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sinembargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores uomisiones.
Documentos de patente citados en la descripción- \bullet US 4801539 A[0033]
- \bullet WO 0027437 A[0034]
- \bullet EP 0694616 A[0033]
- \bullet US 6020484 A[0048]
- \bullet WO 03054163 A[0033]
- \bullet WO 9822598 A[0055]
- \bullet WO 9923227 A[0034]
- \bullet US 5891701 A[0056]
\bullet WO 9951265 A [0034] [0034]
Literatura no perteneciente a patentes citada en ladescripción\bulletLaurent T. C.;Fraser J.R. E.FASES J.,1992, vol. 6,2397-2404 [0004]
\bullet Proteoglycans and hyaluronan inmorphogenesis and differentiation.Toole B.P. Cell Biology ofthe Extracellular Matrix.Plenum,1991,305-341 [0004]
\bulletDeAngelis, P. L.Cell. Mol.Life Sci.,1999, vol. 56, 670-682[0034]
\bulletProc. Natl. Acad. Sci. USA.,2001, vol. 98, 4658-4663 [0034]
\bulletBitter; Muir.AnalBiochem.,1962, vol. 4, 330-334[0045]
\bulletUenoet al. Chem. Pharm.Bull.,1988, vol. 36, 4971-4975[0045]
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