EP2255880A2 - System and method to prevent air bubbles in a hybridization chamber - Google Patents

Abstract

A system (1) with hybridizing chambers (5), to hybridize immobilized specimens on carriers (27), having chambers which are defined by the gap between the carrier and a cover (26), and which can be filled with a fluid, is new. The cover seals the chambers against the ambient air. A system (1) with hybridizing chambers (5), to hybridize immobilized specimens on carriers (27), having chambers which are defined by the gap between the carrier and a cover (26), and which can be filled with a fluid, is new. The cover seals the chambers against the ambient air. The system has a pressure assembly to build up the pressures within the chambers by 100 mbar to 1.4 bar over the ambient atmospheric level, to prevent the formation of air bubbles. The pressure is supplied by a pump (8) or a pressure gas bottle, linked to the chambers by pressure lines (10,11) with valves (12).

Description

Translated fromGerman

Die Erfindung betrifft, gemäss dem Oberbegriff des unabhängigen Anspruchs 1, ein Verfahren zum Verhindern von Luftblasen in den Hybridisierkammern eines Systems zum Hybridisieren von auf Objektträgern immobilisierten Nukleinsäureproben, Proteinen oder Gewebeschnitten. Dieses Verfahren umfasst das Bereitstellen einer im Wesentlichen spaltförmigen Hybridisierkammer zwischen einem Objektträger und einem Deckel, wobei der Deckel derart gegenüber dem Objektträger angeordnet wird, dass die Hybridisierkammer gegenüber der Umgebungsluft abgedichtet ist. Des Weiteren umfasst dieses Verfahren das im wesentlichen Füllen der bereitgestellten Hybridisierkammer mit einer Flüssigkeit.The invention relates, according to the preamble ofindependent claim 1, to a method for preventing air bubbles in the hybridization chambers of a system for hybridizing nucleic acid samples, proteins or tissue sections immobilized on slides. This method comprises providing a substantially gap-shaped hybridization chamber between a slide and a lid, wherein the lid is arranged opposite the slide such that the hybridization chamber is sealed from the ambient air. Furthermore, this method comprises substantially filling the provided hybridization chamber with a liquid.

Die Verwendung von DNA-Proben (DNA = Desoxyribosenukleinsäure) und insbesondere von Mikroarrays solcher Proben stellt der Forschung eine wichtige Technik zur gleichzeitigen bzw. simultanen Analyse von Tausenden von Genen zur Verfügung. Diese Technik umfasst die Immobilisierung von DNA-Proben aus vielen Genen auf einer festen Substrat-Oberfläche, wie z.B. auf einem gläsernen Objektträger für ein Lichtmikroskop. Die DNA-Proben werden bevorzugt in einem Array von Probenflecken oder "spots", d.h. in einem zweidimensionalen Gitter auf dem Substrat angeordnet und man kann später - ausgehend von einer bestimmten Position innerhalb eines solchen Arrays auf den Ursprung der entsprechenden DNA-Probe zurückschliessen. Die Technik umfasst typischerweise die Kontaktierung des DNA-Proben-Arrays mit RNA-Muster-Suspensionen bzw. -Lösungen (RNA = Ribosenukleinsäure) um damit spezifische Nukleotidsequenzen in den DNA-Proben nachzuweisen. Typischerweise werden auch Muster-Suspensionen verwendet, welche DNA, cDNA und/oder Proteine bzw. Polypeptide enthalten. RNA-Muster können mit einem sogenannten "tag" oder "label", d.h. einem Molekül versehen sein, welches z.B. ein Fluoreszenzlicht mit einer spezifischen Wellenlänge aussendet. Immobilisierte Proben können auch aminosäurehaltige (z.B. Proteine, Peptide) oder nukleinsäurehaltige (z.B. cDNA, RNA) Proben umfassen. Zu den immobilisierten Proben zugegebene Muster können beliebige Moleküle bzw. chemische Verbindungen umfassen, welche mit den immobilisierten Proben hybridisieren oder sich sonstwie mit diesen verbinden.The use of DNA samples (DNA = deoxyribose nucleic acid), and especially microarrays of such samples, provides research with an important technique for the simultaneous analysis of thousands of genes. This technique involves the immobilization of DNA samples from many genes on a solid substrate surface, such as on a glass slide for a light microscope. The DNA samples are preferably arranged in an array of sample spots or "spots", ie in a two-dimensional grid on the substrate, and it is later possible to deduce the origin of the corresponding DNA sample from a specific position within such an array. The technique typically involves contacting the DNA sample array with RNA pattern suspensions (RNA = ribose nucleic acid) with specific nucleotide sequences in them Detect DNA samples. Typically, pattern suspensions are also used which contain DNA, cDNA and / or proteins or polypeptides. RNA patterns can be provided with a so-called "tag" or "label", ie a molecule which, for example, emits a fluorescent light with a specific wavelength. Immobilized samples may also include amino acid-containing (eg, proteins, peptides) or nucleic acid-containing (eg, cDNA, RNA) samples. Samples added to the immobilized samples may comprise any molecules or chemical compounds that hybridize or otherwise associate with the immobilized samples.

Unter guten experimentellen Bedingungen hybridisieren bzw. binden die RNA-Muster an die immobilisierten DNA-Proben und bilden mit diesen zusammen hybride DNA-RNA-Stränge. Für jede der immobilisierten DNA-Proben und für spezielle RNA-Muster kann man Unterschiede in der Hybridisierung unter den DNA-Proben durch die Messung der Intensität und der Wellenlängenabhängigkeit der Fluoreszenz jedes einzelnen Mikroarray-Elements feststellen und so herausfinden, ob der Grad der Genexpression in den untersuchten DNA-Proben variiert. Mit der Verwendung von DNA-Mikroarrays können somit über die Expression von grossen Mengen von Genen und über deren Expressionsmuster umfassende Aussagen gemacht werden, obwohl nur geringe Mengen an biologischem Material eingesetzt werden müssen.Under good experimental conditions, the RNA patterns hybridize or bind to the immobilized DNA samples and together form hybrid DNA-RNA strands. For each of the immobilized DNA samples and for specific RNA patterns, differences in the hybridization among the DNA samples can be determined by measuring the intensity and wavelength dependency of the fluorescence of each individual microarray element to determine whether the level of gene expression in the DNA sample varies the examined DNA samples. With the use of DNA microarrays comprehensive statements can thus be made about the expression of large quantities of genes and their expression patterns, although only small amounts of biological material must be used.

DNA-Mikroarrays haben sich als erfolgreiche Werkzeuge etabliert und die Geräte zur Durchführung der DNA-Hybridisierung wurden laufend verbessert (vgl. z.B.US 6,238,910 oderEP 1 260 265 A1 des Anmelders der aktuellen Patentanmeldung). Diese Dokumente offenbaren eine Vorrichtung zum Bereitstellen eines Hybridisierraums für die Hybridisierung von Nukleinsäureproben auf einem Objektträger. Diese Vorrichtungen sind gegenüber dem Objektträger bewegbar ausgebildet und umfassen eine ringförmige Dichtung oder Dichtfläche zum Abschliessen des spaltförmigen Hybridisierraums gegenüber der Umgebungsluft, wobei durch die Dichtung oder Dichtfläche eine Oberfläche dieses Objektträgers beaufschlagt wird. Zudem umfasst diese Vorrichtungen Leitungen zum Zu- bzw. Ableiten von Medien in den Hybridisierraum hinein bzw. aus dem Hybridisierraum heraus sowie eine Probenzuführung. Eine verbesserte Temperaturkontrolle und eine Bewegung der Flüssigkeit mit z.B. RNA-Mustern gegenüber auf dem Objektträger immobilisierten DNA-Proben ist ebenfalls offenbart.DNA microarrays have established themselves as successful tools and devices for performing DNA hybridization have been continually improved (see, eg US 6,238,910 or EP 1 260 265 A1 the applicant of the current patent application). These documents disclose a device for providing a hybridization space for the hybridization of nucleic acid samples on a slide. These devices are designed to be movable relative to the slide and comprise an annular seal or sealing surface for closing the gap-shaped hybridization space with respect to the ambient air, wherein a surface of this slide is acted upon by the seal or sealing surface. In addition, these devices include lines for feeding or discharging media into the hybridization space or out of the hybridization space as well as a sample feed. An improved temperature control and a movement of the liquid with eg RNA patterns towards DNA samples immobilized on the slide is also disclosed.

Es kommt einerseits immer wieder vor, dass Luftblasen beim Einfüllen von Flüssigkeiten oder auch später in der Hybridisierkammer entstehen. Andererseits wurde versucht (vgl. z.B.US 6,186,659), Luftblasen gezielt als Agitationsmittel einzusetzen, um in der Hybridisierkammer eine gründlichere Durchmischung der Reagenzien zu erzielen. Im Allgemeinen sind aber im Hybridisiermedium anwesende Luftblasen nicht erwünscht, weil diese den meist sehr dünnen Flüssigkeitsfilm über den immobilisierten Proben stören. Dies kann zu einer Inhomogenität der Verteilung von Reagenzien im Hybridisiermedium und damit zu einer Verfälschung der Hybridisier-Resultate führen; schlimmstenfalls verdrängen grössere Luftblasen sogar das Hybridisiermedium von Teilen der auf dem Objektträger immobilisierten Proben.It happens on the one hand again and again that air bubbles occur during the filling of liquids or later in the hybridization chamber. On the other hand, an attempt was made (cf., eg US 6,186,659 ), Targeted use of air bubbles as an agitating agent in order to achieve a thorough mixing of the reagents in the hybridization. In general, however, air bubbles present in the hybridization medium are undesirable because they disturb the usually very thin liquid film over the immobilized samples. This can lead to an inhomogeneity of the distribution of reagents in the hybridization medium and thus to a falsification of the hybridization results; in the worst case, larger bubbles even displace the hybridization medium from parts of the slides immobilized on the slide.

Aus dem Stand der Technik sind zudem zahlreiche Methoden bekannt, um das spontane Auftreten von Luftblasen oder das Verbleiben derselben in der Kammer zu behindern. So wurde z.B. ein nichtparalleles Anordnen der die Hybridisierkammer definierenden Objektträger und Deckel vorgeschlagen (vgl.US 5,922, 591), oder die Hybridisiermedien werden während dem ganzen Hybridisierprozess aus der Kammer hinaus und wieder hinein befördert. Das Beimischen von Agenzien zu dem Hybridisiermedium, welche die Oberflächenspannung reduzieren oder das Behandeln der Oberflächen der Kammer mit wasserabstossenden chemischen Verbindungen mit dem Ziel, die Bildung von Luftblasen zu behindern, ist ebenfalls bekannt.In addition, numerous methods are known from the prior art to hinder the spontaneous occurrence of air bubbles or the retention of the same in the chamber. For example, a non-parallel arrangement of the slides and lids defining the hybridization chamber has been proposed (cf. US 5,922,591 ), or the hybridization media are transported out of the chamber and back into it throughout the hybridization process. The admixture of agents to the hybridization medium which reduce surface tension or treat the surfaces of the chamber with water repellent chemical compounds with the aim of hindering the formation of air bubbles is also known.

AusUS 6,458,526 ist eine Anordnung bekannt, mir welcher in den Hybridisierraum hineinragende "Blasenhälften 140" aus einem mit Lösungsmittel gesättigten Gas erzeugt werden. Es handelt sich bei diesen "Blasenhälften" eigentlich um kalottenförmige Grenzflächen von Gasräumen mit einem definierten Krümmungsradius. Diese "Blasenhälften" befinden sich an definierten Stellen der Kammer, wo sie die Hybridisierung der Proben nicht stören können. In einem vom Hybridisierraum abgetrennten Kompartiment befindet sich ein Lösungsmittel 160, welches im Hybridisiermedium enthalten ist. Über diesem Lösungsmittel wird eine gesättigte Atmosphäre 150 aufrecht erhalten, welche konstant mit den Gasräumen hinter den "Blasenhälften 140" verbunden ist (vgl.Fig. 2 inUS 6,458,526). Damit wird konstant eine mit dem Lösungsmittel gesättigte Atmosphäre an die kalottenförmigen Grenzflächen gebracht und dadurch der Partialdruck des im Hybridisiermedium anwesenden Lösungsmittels so beeinflusst, dass allenfalls vorhandene Luftblasen schrumpfen und eliminiert werden. Dieses Verfahren hat den Nachteil, dass diese kalottenförmigen Grenzflächen mittels speziellen Vorrichtungen geschaffen und aufrechterhalten werden müssen.Out US 6,458,526 For example, an arrangement is known which produces "bubble halves 140" protruding into the hybridization space from a solvent-saturated gas. These "bubble halves" are actually dome-shaped interfaces of gas spaces with a defined radius of curvature. These "bubble halves" are located at defined locations in the chamber where they can not interfere with the hybridization of the samples. In a compartment separated from the hybridization space there is a solvent 160 which is contained in the hybridization medium. Over this solvent becomes a saturated Atmosphere 150 maintained, which is constantly connected to the gas spaces behind the "bubble halves 140" (see. Fig. 2 in US 6,458,526 ). Thus, an atmosphere saturated with the solvent is constantly brought to the dome-shaped boundary surfaces and thereby the partial pressure of the solvent present in the hybridization medium is influenced so that any existing air bubbles shrink and are eliminated. This method has the disadvantage that these dome-shaped interfaces must be created and maintained by means of special devices.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung betrifft das Bereitstellen eines alternativen Verfahrens, mit welchem das Ausbilden von Luftblasen in einer Hybridisierkammer auf einfache Art und Weise verhindert werden kann.The object of the present invention is to provide an alternative method by which the formation of air bubbles in a hybridization chamber can be prevented in a simple manner.

Diese Aufgabe wird gemäss den Merkmalen des unabhängigen Anspruchs 1 dadurch gelöst, dass ein Verfahren zum Verhindern von Luftblasen in einer im wesentlichen spaltförmigen Hybridisierkammer eines Systems zum Hybridisieren von auf Objektträgern immobilisierten Nukleinsäureproben, Proteinen oder Gewebeschnitten vorgeschlagen wird, wobei das Verfahren umfasst:

1. (a) das Bereitstellen einer im Wesentlichen spaltförmigen Hybridisierkammer zwischen einem Objektträger und einem Deckel, wobei der Deckel derart gegenüber dem Objektträger angeordnet wird, dass die Hybridisierkammer gegenüber der Umgebungsluft abgedichtet ist; und
2. (b) das im wesentlichen Füllen der gemäss Schritt (a) bereitgestellten Hybridisierkammer mit einer Flüssigkeit.

This object is achieved according to the features ofindependent claim 1 by proposing a method for preventing air bubbles in a substantially gap-shaped hybridization chamber of a system for hybridizing nucleic acid samples, proteins or tissue sections immobilized on slides, the method comprising:

1. (a) providing a substantially gap-shaped hybridization chamber between a slide and a lid, wherein the lid is disposed opposite the slide so that the hybridization chamber is sealed from the ambient air; and
2. (b) substantially filling the hybridization chamber provided according to step (a) with a liquid.

Das erfindungsgemässe Verfahren istdadurch gekennzeichnet, dass es zudem umfasst:

• (c) das Ausbilden eines Kammer-Drucks in der Hybridisierkammer mit einer Druckeinrichtung dieses Systems; und
• (d) das Aufrechterhalten dieses Kammer-Drucks während eines Hybridisiervorgangs auf einem Wert, der mindestens 100 mbar über dem in der Umgebungsluft herrschenden, normalen atmosphärischen Druck liegt.

The method according to the invention ischaracterized in that it additionally comprises:

• (c) forming a chamber pressure in the hybridization chamber with a pressure device of that system; and
• (d) maintaining that chamber pressure during a hybridization operation at a value at least 100 mbar above the normal atmospheric pressure prevailing in the ambient air.

Zusätzliche, bevorzugte erfinderische Merkmale ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.Additional, preferred inventive features emerge from the dependent claims.

Das erfindungsgemässe Verfahren und ein System zu dessen Durchführung wird nun an Hand von schematischen, den Umfang der Erfindung nicht beschränkenden Zeichnungen von beispielhaften Ausführungsformen im Detail erläutert. Dabei zeigt:

Fig. 1

ein Schema eines zum Ausführen des erfindungsgemässen Verfahrens geeigneten, ersten Geräts bzw. Systems;

Fig. 2

einen derFig. 1 vonEP 1 260 265 A1 entsprechenden senkrechten Längsschnitt durch eine Anordnung mit einer Hybridisierkammer;

Fig. 3

eine derFig. 2 entsprechende, schematische Ansicht einer Anordnung mit einer Hybridisierkammer, von unten gesehen;

Fig. 4

einen derFig. 2 entsprechenden, senkrechten Längsschnitt durch eine Anordnung mit einer Hybridisierkammer, Deckel des Systems aufge- klappt;

Fig. 5

einen derFig. 2 entsprechenden, senkrechten Längsschnitt durch eine Anordnung mit einer Hybridisierkammer, Deckel des Systems geschlos- sen.

Fig. 6

ein Schema eines zum Ausführen des erfindungsgemässen Verfahrens geeigneten, zweiten Geräts bzw. Systems;

Fig. 7

eine schematische Ansicht einer besonderen, ersten Anordnung eines Deckels mit einer Hybridisierkammer, von unten gesehen;

Fig. 8

eine schematische Ansicht einer besonderen, zweiten Anordnung eines Deckels mit zwei Hybridisierkammern, von unten gesehen.

The method according to the invention and a system for carrying it out will now be explained in detail with reference to schematic drawings of exemplary embodiments which do not limit the scope of the invention. Showing:

Fig. 1

a diagram of a first device or system suitable for carrying out the method according to the invention;

Fig. 2

one of the Fig. 1 fromEP 1 260 265 A1 corresponding vertical longitudinal section through an arrangement with a hybridization chamber;

Fig. 3

one of the Fig. 2 corresponding schematic view of an arrangement with a hybridization chamber, seen from below;

Fig. 4

one of the Fig. 2 corresponding vertical longitudinal section through an arrangement with a hybridization chamber, lid of the system unfolded;

Fig. 5

one of the Fig. 2 corresponding vertical longitudinal section closed by an arrangement with a hybridization chamber, lid of the system.

Fig. 6

a diagram of a suitable for carrying out the inventive method, second device or system;

Fig. 7

a schematic view of a particular, first arrangement of a lid with a Hybridisierkammer, seen from below;

Fig. 8

a schematic view of a particular, second arrangement of a lid with two Hybridisierkammern, seen from below.

Figur 1 zeigt ein Schema eines zum Ausführen des erfindungsgemässen Verfahrens geeigneten Systems 1. Auf der linken Seite dieses Schemas sind eine Anzahl Gefässe 2 für die Aufbewahrung von flüssigen Hybridisiermedien, wie Waschflüssigkeiten ( W 3, W 2, W 1), Prähybridisier-Puffer (V-P), Alkohol-Reinigungsflüssigkeit (A-R), destilliertes Wasser (A.D.), sowie einen Behälter 3 mit Inertgas (N2) dargestellt. Jedem dieser Gefässe 2 ist ein individuelles Ventil 4 vorgeschaltet, über welches diese Medien den (auf der rechten Seite dargestellten) Hybridisierkammern 5 (S 1, S 2, S 3, S 4) zugeführt werden können. Die das Ventil 4 umfassenden Medienleitungen 6 münden in eine Sammelleitung 7, die wiederum in eine Förderpumpe 8 mündet, der ein Belüftungsventil 9 vorgeschaltet ist. Diese Förderpumpe 8 saugt über die Sammelleitung 7 flüssige Medien aus den Gefässen 2 an und pumpt sie über die Verteilleitung 10 in die Einlassleitungen 11, die über ein Einlassventil 12 in die Hybridisierkammern 5 münden. Die Hybridisiermedien verlassen die Hybridisierkammern 5 über eine Auslassleitung 13, welche je ein Auslassventil 14 umfassen und in eine Sammelleitung 15 einmünden. Diese Sammelleitung 15 mündet ihrerseits in eine Abfallleitung 16, welche mittels eines Abfallventils 17 verschliessbar ist. Die Verteilleitung 10 und die Sammelleitung 15 können über eine Verbindungsleitung 18 und ein Verbindungsventil 19 miteinander kommunizieren. Von dieser Verbindungsleitung 18 zweigt eine Entlastungsleitung 20 mit einem Entlastungsventil 21 ab und mündet in einen Sammelbehälter 22 mit einer Be- bzw. Entlüftungsöffnung 23. Dem Sammelbehälter 22 nachgeschaltet ist eine Förderpumpe 24, die über eine Übergangsleitung 25 mit der Abfallleitung 16 verbunden ist. FIG. 1 1 shows a diagram of asystem 1 suitable for carrying out the method according to the invention. On the left side of this scheme are a number ofcontainers 2 for the storage of liquid hybridising media, such as washing liquids (W 3,W 2, W 1), prehybridization buffer (VP) , Alcohol cleaning fluid (AR), distilled water (AD), and acontainer 3 with inert gas (N2) shown. Each of thesevessels 2 is preceded by anindividual valve 4, via which these media the (on the right side shown) Hybridisierkammern 5 (S 1,S 2,S 3, S 4) can be supplied. Thevalve lines 4comprehensive media lines 6 open into a manifold 7, which in turn opens into afeed pump 8, which is preceded by avent valve 9. Thisfeed pump 8 draws liquid media from thevessels 2 via the collecting line 7 and pumps them via thedistribution line 10 into the inlet lines 11, which open into thehybridization chambers 5 via aninlet valve 12. The hybridization media leave theHybridisierkammern 5 via anoutlet 13, which each comprise anoutlet valve 14 and open into amanifold 15. This manifold 15 in turn opens into awaste line 16, which is closable by means of awaste valve 17. Thedistribution line 10 and the manifold 15 can communicate with each other via a connectingline 18 and a connectingvalve 19. From thisconnection line 18 branches off adischarge line 20 with arelief valve 21 and opens into a collectingcontainer 22 with a loading or vent 23. Thecollection container 22 is followed by afeed pump 24 which is connected via atransition line 25 to thewaste line 16.

Zum besseren Verteilen der Hybridisiermedien in den Hybridisierkammern 5 ist das System 1 mit einem Agitationsmechanismus bzw. mit einer Agitationseinrichtung 32 ausgerüstet, wie diese aus der europäischen PatentanmeldungEP 1 260 265 A1 des Anmelders der aktuellen Patentanmeldung bekannt ist. Auf den Inhalt dieser PatentanmeldungEP 1 260 265 A1 wird hier ausdrücklich Bezug genommen, so dass dieser Inhalt als Teil der vorliegenden Patentanmeldung gilt.For better distribution of the Hybridisiermedien in theHybridisierkammern 5, thesystem 1 is equipped with an agitation mechanism or with anagitation device 32, as these from the Europeanpatent application EP 1 260 265 A1 the applicant of the current patent application is known. On the content of thispatent application EP 1 260 265 A1 is hereby incorporated by reference, so that this content is considered part of the present patent application.

Figur 2 zeigt einen derFig. 1 vonEP 1 260 265 A1 entsprechenden, senkrechten Längsschnitt durch eine Hybridisierkammer 5. Der Deckel 26 dieser Anordnung ist gegenüber dem Objektträger 27 bewegbar (hier um eine Achse schwenkbar ausgebildet, so dass der Hybridisierraum 5 durch eine einfache Bewegung geöffnet und geschlossen werden kann. Eine ringförmige Dichtfläche 28 dient zum Abschliessen des Hybridisierraums 5 durch Beaufschlagen einer Oberfläche 29 dieses Objektträgers 27. Diese Dichtfläche 28 kann eine abgesetzte Oberfläche des Deckels 26 sein, welche flach auf der Oberfläche 29 des Objektträgers 27 liegt; alternativ dazu kann z.B. auch eine Lippendichtung verwendet werden. Bevorzugt wird jedoch eine O-Ring-Dichtung als Dichtfläche 28. Die Anordnung umfasst Leitungen 11,13 zum Zu- bzw. Ableiten von Medien in den Hybridisierraum 5 hinein bzw. aus dem Hybridisierraum 5 heraus. Solche Medien können Reagenzien zum Durchführen der Hybridisierungsreaktion, wie z.B. Waschflüssigkeiten oder Puffer-Lösungen, aber auch inerte Gase (wie z.B. Stickstoff) zum Trocknen der Hybridisierungsprodukte auf den Objektträgern 27 bzw. zum Ausblasen der Hybridisierkammern 5 und der Medienleitungen 11,13 sein. Diese Zu- bzw. Ableitungen 11,13 für Hybridisiermedien münden bevorzugt in je einen Agitationsraum 30, 30'. Die Anordnung umfasst zudem eine verschliessbare Musterzuführung 31, durch welche von Hand RNA-enthaltende Flüssigkeiten oder andere Musterflüssigkeiten zupipettiert werden können. Die Musterzuführung 31 wird vorzugsweise mit einem Kunststoffpfropfen (nicht gezeigt) verschlossen. Alternativ dazu kann eine automatische bzw. robotisierte Musterzuführung vorgesehen werden, wie diese in unterschiedlichen Ausführungsformen inEP 1 260 265 A1 offenbart sind. FIG. 2 shows one of the Fig. 1 fromEP 1 260 265 A1 The cover 26 of this arrangement is movable relative to the slide 27 (here pivotable about an axis, so that thehybridization space 5 can be opened and closed by a simple movement.) Anannular sealing surface 28 serves to close off This sealingsurface 28 may be a stepped surface of thelid 26 lying flat on thesurface 29 of theslide 27, alternatively, for example, a lip seal may be used Ring seal as a sealingsurface 28. The arrangement includescables 11,13 for feeding or discharging media in thehybridization 5 in or out of thehybridization 5 out. Such media may be reagents for carrying out the hybridization reaction, such as wash liquors or buffer solutions, but also inert gases (such as nitrogen) for drying the hybridization products on theslides 27 or for blowing out thehybridization chambers 5 and themedia lines 11,13. These supply anddischarge lines 11, 13 for hybridization media preferably open into arespective agitation space 30, 30 '. The assembly also includes asealable pattern feeder 31 through which RNA-containing liquids or other sample liquids can be pipetted by hand. Thepattern feeder 31 is preferably closed with a plastic plug (not shown). Alternatively, an automatic or robotized pattern feeder may be provided, as indifferent embodiments EP 1 260 265 A1 are disclosed.

Die Anordnung umfasst eine medientrennende Agitationseinrichtung 32 zum Bewegen von Flüssigkeiten gegenüber auf der Oberfläche 29 der Objektträger 27 immobilisierten Proben von Nukleinsäuren, Proteinen oder Gewebeschnitten. In der inFigur 2 gezeigten Ausführungsform umfasst die Agitationseinrichtung 32 der Anordnung eine Membran 33. Diese Membran 33 trennt einen Druckraum 34, der über eine Druckleitung 35 mit einem Druckfluid (Gas oder Flüssigkeit) befüllbar ausgebildet ist, von einem Agitationsraum 30, der über eine Agitationsleitung 36 mit dem Hybridisierraum 5 verbunden ist. Nach dem Erreichen des thermischen Gleichgewichtes der Anordnung, dem Zugeben eines bestimmten Volumens an RNA-Musterflüssigkeit und dem Verschliessen der Musterzuführung 31 wird über die Druckleitung 35 vorzugsweise Luft oder ein anderes Gas (es könnte aber auch eine Flüssigkeit sein) stossweise in den Druckraum 34 gebracht oder daraus abgelassen, so dass sich die Membran 33 im gleichen Rhythmus durchbiegt und entsprechend den Agitationsraum 30 verkleinert bzw. vergrössert. Dadurch wird die Musterflüssigkeit im gleichen Rhythmus des Über- bzw. Unterdrucks und Entspannens im Hybridisierraum 5 gegen das eine oder das andere Ende bewegt, wo sich vorzugsweise an der gegen das Innere des Hybridisierraums 5 gerichteten Oberfläche 37 des Deckels 26 je ein Querströmkanal 38,38' befindet.The arrangement comprises a media-separatingagitation device 32 for moving liquids against samples of nucleic acids, proteins or tissue sections immobilized on thesurface 29 of theslides 27. In the in FIG. 2 In the embodiment shown, theagitation device 32 of the arrangement comprises amembrane 33. Thismembrane 33 separates apressure space 34, which is filled with a pressurized fluid (gas or liquid) via apressure line 35, from anagitation space 30 which communicates with the hybridization space via anagitation conduit 36 5 is connected. After reaching the thermal equilibrium of the arrangement, adding a certain volume of RNA sample liquid and closing the pattern feed 31, preferably air or another gas (but it could also be a liquid) is introduced into thepressure space 34 via thepressure line 35 or discharged therefrom, so that themembrane 33 bends at the same rhythm and correspondingly reduces or increases theagitation space 30. As a result, the sample liquid is moved in the same rhythm of overpressure or underpressure and relaxation inHybridisierraum 5 against one or the other end, where preferably at the directed towards the interior of theHybridisierraums 5surface 37 of thelid 26 each have a Querströmkanal 38,38 'is located.

Diese Querströmkanäle 38,38' erleichtern einerseits das Querverteilen der in der Musterlösung enthaltenen RNA-Moleküle. Dadurch wird bewirkt, dass die Musterflüssigkeit bzw. die Waschflüssigkeiten homogen über das gesamte im Hybridisierraum 5 anwesende Volumen verteilt werden. Zudem dienen die Querströmkanäle 38,38' auch als Flüssigkeits-Reservoir, so dass bei der durch die in der Vorrichtung eingebauten Agitationseinrichtung 32 erzeugte Pendelbewegung (gefüllter Doppelpfeil) der Musterlösung nicht dazuführt, dass Teile des Hybridisierraums 5 unbeabsichtigt trocken liegen.On the one hand, thesetransverse flow channels 38, 38 'facilitate lateral distribution of the RNA molecules contained in the sample solution. This has the effect that the sample liquid or the washing liquids are distributed homogeneously over the entire volume present in thehybridization chamber 5. In addition, theQuerströmkanäle 38,38 'serve as a liquid reservoir, so that when the built-indevice agitation device 32 generated pendulum movement (filled double arrow) of the sample solution does not dazuführt that parts of theHybridisierraums 5 are unintentionally dry.

Vorzugsweise ist ein zweiter, ebenfalls mit einer Membran 33' versehener Agitationsraum 30' über eine zweite Agitationsleitung 36' mit dem Hybridisierraum 5 verbunden. Wenn jetzt ein auf den Druckraum 34 abgegebener Druckstoss die erste Membran 33 in den ersten Agitationsraum 30 drückt, wird dieser Impuls über die erste Agitationsleitung 36 auf die Musterflüssigkeit im Hybridisierraum 5 übertragen. Die Musterflüssigkeit weicht etwas gegen die zweite Agitationsleitung 36' aus (kann diese sogar zum Teil füllen) und erhöht den Druck im zweiten Agitationsraum 30'. Dadurch biegt sich die zweite Membran 33' nach oben und wird dabei elastisch gedehnt. Sobald der Überdruck im Druckraum 34 nachlässt, federn beide Membranen 33,33' in ihre Ruheposition zurück und bewegen die Musterflüssigkeit im Hybridisierraum 4 in die entgegengesetzte Richtung. Durch diese Pendelbewegung kann mit der gezeigten Anordnung eine Musterflüssigkeit mit einem minimalen Volumen (im Bereich von ca. 100 µl) in weniger als einer Minute praktisch homogen im Hybridisierraum 5 verteilt werden. Vorzugsweise wird unmittelbar anschliessend an den Druckabbau im Druckraum 34 ein Unterdruck im Druckraum 34 erzeugt, so dass die dem vorangehenden Druckstoss entgegengesetzte Rückwärtsbewegung der Musterflüssigkeit im Hybridisierraum 5 noch verstärkt wird.Preferably, a second agitation space 30 ', also provided with a membrane 33', is connected to thehybridization space 5 via a second agitation conduit 36 '. If a pressure surge delivered to thepressure chamber 34 now presses thefirst diaphragm 33 into thefirst agitation space 30, this pulse is transmitted via thefirst agitation conduit 36 to the sample fluid in thehybridization space 5. The pattern liquid differs somewhat from the second agitation conduit 36 '(and may even partially fill it) and increases the pressure in the second agitation space 30'. As a result, the second membrane 33 'bends upwards and is elastically stretched. As soon as the overpressure in thepressure chamber 34 subsides, bothdiaphragms 33, 33 'spring back into their rest position and move the sample liquid in thehybridization space 4 in the opposite direction. As a result of this oscillating movement, with the arrangement shown, a sample liquid having a minimum volume (in the range of approximately 100 μl) can be distributed practically homogeneously in thehybridization chamber 5 in less than one minute. Preferably, immediately after the pressure reduction in thepressure chamber 34, a negative pressure in thepressure chamber 34 is generated, so that the backward movement of the sample liquid opposite the preceding pressure surge in thehybridization chamber 5 is enhanced.

Figur 3 zeigt eine Draufsicht auf die Anordnung vonFigur 2, von unten gesehen. Die O-Ring-Dichtung 28 begrenzt lateral den Hybridisierraum 5, der an seinen einander entgegengesetzten Enden je einen Querströmkanal 38,38' aufweist, welche als Vertiefung in der Oberfläche 37 des Deckels 26 vorgesehen sind. Der Objektträger 27 (hier ein Glasobjektträger für die Lichtmikroskopie) und dessen Grifffeld 55 sind gestrichelt eingezeichnet. Klar ersichtlich ist auch die Abdrückfeder 56, welche auf das Grifffeld 55 des Objektträgers 27 drückt. Beim Öffnen des Hybridisierraums 5 erleichtert diese Abdrückfeder 56 die automatische Trennung des Objektträgers 27 vom Deckel 26. Ebenfalls ersichtlich ist die Linienführung der Einlassleitung 11, der Auslassleitung 13 und der Druckleitung 35 sowie die Anordnung der Agitationsräume 30,30' und der Musterzuführung 31. Die Agitationsleitungen 36,36' und die Musterzuführung 31 münden in den Querströmkanälen 38,38'. FIG. 3 shows a plan view of the arrangement of FIG. 2 , seen from below. The O-ring seal 28 laterally delimits thehybridization space 5, which has at its opposite ends a respectivecross-flow channel 38, 38 ', which are provided as a depression in thesurface 37 of thecover 26. The slide 27 (here a glass slide for light microscopy) and thehandle panel 55 are shown in dashed lines. Clearly visible is theAbdrückfeder 56, which presses on thehandle panel 55 of theslide 27. When opening theHybridisierungsraums 5 thisAbdrückfeder 56 facilitates the automatic separation of theslide 27 from thelid 26. Also visible is the lines of theinlet line 11, theoutlet 13 and thepressure line 35 and the arrangement ofagitation rooms 30,30 'and thepattern feeder 31. Theagitation 36, 36 'and the pattern feed 31 open into theQuerströmkanälen 38,38'.

Alle Leitungen 11,13,35 zum Zu- bzw. Abführen von Medien münden vorzugsweise in einer gemeinsamen Anschlussebene 57 des Deckels 26, welche im Wesentlichen parallel zum Hybridisierraum 5 und vorzugsweise auf der gleichen Höhe wie der Hybridisierraum 5 angeordnet ist. Die Mündungsöffnungen der Leitungen 11,13,35 können wie gezeigt versetzt zu einander oder auf einer quer zu der Vorrichtung 1 verlaufenden Linie (nicht gezeigt) angeordnet sein. Aussparungen (leere Pfeile, vgl.Fig. 2) reduzieren den Wärmefluss von oder zu dem Deckel 26.Alllines 11, 13, 35 for the supply and removal of media preferably open in acommon connection plane 57 of thecover 26, which is arranged substantially parallel to thehybridization space 5 and preferably at the same height as thehybridization space 5. The mouth openings of theconduits 11, 13, 35 may be arranged as shown offset relative to one another or on a line (not shown) running transversely to thedevice 1. Recesses (empty arrows, cf. Fig. 2 ) reduce heat flow from or to thelid 26.

Die Druckleitungen 35, von welchen für jede der Hybridisierkammern 5 eine bestimmt ist, sind inFigur 1 gestrichelt dargestellt und gehen von einer Druckverteilleitung 39 aus. In diese Druckverteilleitung 39 münden eine Ausgleichsleitung 40 mit einem Ausgleichsventil 41, eine Überdruckzuleitung 42 mit einem Überdruckventil 43 und eine Unterdruckzuleitung 44 mit einem Unterdruckventil 45. Der Überdruck wird vorzugsweise mit einem kostengünstigen Gas (z.B. Luft) in einer Überdruckpumpe 46 erzeugt, in einem Überdruckbehälter 47 gespeichert und in die Überdruckzuleitung 42 eingespeist. Der Unterdruck wird in einer Untererdruckpumpe 48 erzeugt, in einem Unterdruckbehälter 49 gespeichert und in die Unterdruckzuleitung 44 eingespeist.The pressure lines 35, of which one is intended for each of thehybridization chambers 5, are shown in FIG FIG. 1 shown by dashed lines and start from apressure distribution line 39. In thispressure distribution line 39 open acompensation line 40 with a balancingvalve 41, apressure supply line 42 with apressure relief valve 43 and avacuum supply line 44 with a vacuum valve 45. The pressure is preferably generated with a low-cost gas (eg air) in apressure pump 46, in apressure vessel 47 stored and fed into thepressure supply line 42. The negative pressure is generated in alower pressure pump 48, stored in avacuum reservoir 49 and fed into thevacuum supply line 44.

Der Inertgasbehälter 3 ist über ein Gasventil 50 und eine Gasleitung 51 mit der Verteilleitung 10 verbunden, welche über Einlassleitungen 11 und je ein Einlassventil 12 in die Hybridisierkammern 5 münden. Mit Inertgas (z.B. mit Stickstoffgas) können je nach Ventilstellungen alle Hybridisierkammern 5 (einzeln oder in Gruppen) via die Verteilleitung 10 und die Einlassleitungen 11 über die Auslassleitungen 13 und die Sammelleitung 15 ausgeblasen werden. Werden nur das Gasventil 50, das Verbindungsventil 19 und das Entlastungsventil 21 geöffnet, so kann die Verteilleitung 10 in den Sammelbehälter 22 ausgeblasen werden. Werden nur das Gasventil 50, das Verbindungsventil 19 und das Abfallventil 17 geöffnet, so können die Verteilleitung 10 und die Sammelleitung 15 über die Abfallleitung 16 ausgeblasen werden.Theinert gas container 3 is connected via agas valve 50 and agas line 51 to thedistribution line 10, which open into thehybridization chambers 5 viainlet lines 11 and oneinlet valve 12 each. With inert gas (eg with nitrogen gas), depending on the valve positions, all the hybridization chambers 5 (individually or in groups) can be blown out via thedistribution line 10 and the inlet lines 11 via the outlet lines 13 and the manifold 15. If only thegas valve 50, the connectingvalve 19 and therelief valve 21 are opened, thedistribution line 10 can be blown into the collectingcontainer 22. Become only thegas valve 50, the connectingvalve 19 and thewaste valve 17 are opened, thedistribution line 10 and the manifold 15 can be blown out via thewaste line 16.

Figur 4 zeigt einen derFig. 2 entsprechenden, senkrechten Längsschnitt durch eine Anordnung mit einer Hybridisierkammer 5, wobei der Klapprahmen 54 mit dem darin eingesetzten Deckel 26 des Systems 1 aufgeklappt ist. Bevorzugt sind die Deckel 26 parallel zueinander und in einer Vierergruppe angeordnet, weil diese Anordnung gerade ein Mass für eine Kontaktplatte 53 des Temperaturkontrollthermostaten zulässt, auf welche ein Transportrahmen 52 in der Grösse einer Mikroplatte mit vier parallel zu einander angeordneten Objektträgern 27 passt. Jede dieser Vierergruppen ist einer an ein Temperatursteuergerät angeschlossenen Kontaktplatte 53 zugeordnet. Eine solche Kontaktplatte 53 ist somit zur flächigen Aufnahme der vier Objektträger 27 eines Transportrahmens 52 ausgebildet. Der Rahmen 52 umfasst Längswände, Querwände und im Wesentlichen parallel zu den Querwänden verlaufende Zwischenwände. Diese Wände umgeben Öffnungen, welche den Rahmen 52 vollständig durchdringen, wobei diese Öffnungen den direkten Kontakt zwischen der Kontaktplatte 53 des Thermostaten und den Objektträgern 27 ermöglichen. Weil die Objektträger 27 im Rahmen 52 sanft federnd gehalten sind und weil die Kontaktplatte 53 so ausgebildet ist, dass der Rahmen 52 ihr gegenüber etwas abgesenkt werden kann, liegen die Objektträger 27 direkt auf der Oberfläche der Kontaktplatte 53. Jede Vierergruppe einer Verfahrenseinheit umfasst eine um eine Achse 58 schwenkbare und gegenüber einer Grundplatte 59 verriegelbaren Klapprahmen 54 mit vier Sitzen, wobei in jeden dieser Sitze ein Deckel 26 einlegbar ist. Jede solche Verfahrenseinheit umfasst zudem eine Anschlussplatte 60 zum dichtenden Verbinden je einer Einlassleitung 11, Auslassleitung 13 und Druckleitung 35 des Systems 1 mit der Einlassleitung 11, Auslassleitung 13 und Druckleitung 35 eines Deckels 26. Als Dichtungen für diese Verbindungen werden vorzugsweise auf der Systemseite angeordnete O-Ringe bevorzugt (nicht gezeigt). FIG. 4 shows one of the Fig. 2 corresponding, vertical longitudinal section through an arrangement with ahybridization chamber 5, wherein thefolding frame 54 is unfolded with thelid 26 inserted therein of thesystem 1. Preferably, thecovers 26 are arranged parallel to each other and in a group of four, because this arrangement just allows a measure of acontact plate 53 of the temperature control thermostat on which atransport frame 52 in the size of a microplate with four parallel to each other slides 27 fits. Each of these groups of four is assigned to acontact plate 53 connected to a temperature controller. Such acontact plate 53 is thus designed for planar reception of the four slides 27 of atransport frame 52. Theframe 52 comprises longitudinal walls, transverse walls and intermediate walls extending substantially parallel to the transverse walls. These walls surround openings which completely penetrate theframe 52, these openings allowing direct contact between thecontact plate 53 of the thermostat and theslides 27. Because theslides 27 are held softly in theframe 52 and because thecontact plate 53 is formed so that theframe 52 can be slightly lowered toward it, theslides 27 lie directly on the surface of thecontact plate 53. Each quad of a processing unit comprises one anaxis 58 pivotable and lockable relative to abase plate 59folding frame 54 with four seats, in each of these seats alid 26 can be inserted. Each such process unit also comprises aconnection plate 60 for sealingly connecting each of aninlet line 11,outlet line 13 andpressure line 35 of thesystem 1 with theinlet line 11,outlet line 13 andpressure line 35 of alid 26. As seals for these compounds, preferably O arranged on the system side Rings preferred (not shown).

Figur 5 zeigt einen derFig. 2 entsprechenden, senkrechten Längsschnitt durch eine Anordnung mit einer Hybridisierkammer 5, wobei der in einen Klapprahmen 54 eingesetzte Deckel 26 des Systems geschlossen ist. Alle vier Hybridisierräume 5 einer durch eine Kontaktplatte 53 und einen solchen Klapprahmen 54 definierten Vierergruppe sind somit der Temperaturkontrolle eines Temperatursteuergeräts zugeordnet. Jede Vierergruppe einer Verfahrenseinheit umfasst, wie oben beschrieben, eine um eine Achse 58 schwenkbare und gegenüber einer Grundplatte 59 verriegelbaren Klapprahmen 54 mit vier Sitzen, wobei in jeden dieser Sitze ein Deckel 26 einlegbar ist. Um sicherzustellen, dass die Deckel 26 planparallel zu den Objektträgern 27 platziert werden können, weist der Klapprahmen 54 zudem noch ein Mittelgelenk (nicht gezeigt) mit einer zur Achse 58 parallelen Beweglichkeit auf. Damit die Dichtungen 28 die Hybridisierräume 5 zuverlässig abschliessen, wird über den Klapprahmen 54 ein zusätzlicher Druck auf die Deckel 26 ausgeübt, dies kann über Schrauben, Kipphebel oder ähnliche bekannte Vorrichtungen (nicht gezeigt) bewerkstelligt werden. FIG. 5 shows one of the Fig. 2 corresponding vertical longitudinal section through an arrangement with aHybridisierkammer 5, wherein the inserted into asnap frame 54cover 26 of the system is closed. All fourhybridization rooms 5 of a defined by acontact plate 53 and such afolding frame 54 group of four are thus associated with the temperature control of a temperature control device. Each group of four procedural unit comprises, as described above, a pivotable about anaxis 58 and lockable against abase plate 59folding frame 54 with four seats, wherein in each of these seats, alid 26 is inserted. To ensure that thecover 26 can be placed plane-parallel to theslides 27, thefolding frame 54 also has a central joint (not shown) with a parallel to theaxis 58 mobility. In order for theseals 28 to reliably seal thehybridization spaces 5, additional pressure is exerted on thecovers 26 via the snap-onframe 54; this can be accomplished via screws, rocker arms or similar known devices (not shown).

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass mittels Erzeugen eines Überdrucks in den Hybridisierkammern 5 das spontane Auftreten von Luftblasen während dem Hybridisieren verhindert werden kann. Dabei soll der Kammer-Druck über dem in der Umgebungsluft herrschenden, normalen atmosphärischen Druck liegen. Bevorzugt wird ein Kammerdruck, der mindestens um 100 mbar bis maximal um 1.4 bar höher ist als der Umgebungsdruck. Selbst höhere Drücke in der Kammer sind möglich, falls ihnen ein genügend grosser Anpressdruck zum Dichthalten der Kammer entgegenwirkt. Tatsächlich treten unter diesen Druckverhältnissen während der Hybridisierung keine Luftblasen mehr auf. Der diesem Phänomen zu Grunde liegende Funktionsmechanismus ist nicht restlos aufgeklärt. Es wird jedoch angenommen, dass der erhöhte Druck einerseits die Diffusionsrichtung im Bereich der O-Ring-Dichtung 28 bestimmt bzw. definiert, so dass keine Gasmoleküle der Umgebungsluft mehr in die Hybridisierkammer 5 diffundieren können. Andererseits findet auf Grund ihrer Druckabhängigkeit sicher auch eine Verschiebung der Phasengrenzen im Hybridisiermedium statt, so dass die spontane Luftblasenbildung unterdrückt wird. Im Zusammenhang mit dieser Erfindung werden deshalb alle Gasblasen im Hybridisiermedium - ungeachtet des Entstehungsprozesses in der Hybridisierkammer 5 - als "Luftblasen" bezeichnet.The present invention is based on the recognition that by generating an overpressure in thehybridization chambers 5, the spontaneous occurrence of air bubbles during hybridization can be prevented. Here, the chamber pressure should be above the prevailing in the ambient air, normal atmospheric pressure. A chamber pressure which is at least 100 mbar to at most 1.4 bar higher than the ambient pressure is preferred. Even higher pressures in the chamber are possible if counteracted by a sufficiently large contact pressure for sealing the chamber. In fact, no air bubbles occur under these pressure conditions during hybridization. The underlying mechanism of this phenomenon is not completely clear. However, it is assumed that the increased pressure on the one hand determines or defines the direction of diffusion in the region of the O-ring seal 28, so that no more gas molecules of the ambient air can diffuse into thehybridization chamber 5. On the other hand, due to its pressure dependence, a shift of the phase boundaries in the hybridization medium certainly takes place, so that the spontaneous formation of air bubbles is suppressed. In the context of this invention, therefore, all gas bubbles in the hybridization medium - irrespective of the formation process in the hybridization chamber 5 - are referred to as "air bubbles".

Erfindungsgemäss kann der verlangte Überdruck in den Hybridisierkammern 5 mittels einer Flüssigkeit, wie z.B. mittels eines von der Förderpumpe 8 in die Hybridisierkammern 5 gedrücktes Hybridisiermedium aus einem der Gefässe 2 erreicht werden (vgl.Fig. 1). Falls ein diese Hybridisierkammer 5 umfassendes System 1 eine Agitationseinrichtung 32 zum Bewegen der Hybridisiermedien gegenüber den immobilisierten Proben aufweist, so umfasst dieses System bevorzugt auch ein Federelement, welches den durch die Agitationseinrichtung 32 erzeugten Druckunterschieden federnd entgegenwirkt. Ein solches Federelement kann ein elastisches Rohrstück (nicht gezeigt) in einer entsprechenden Zu- oder Ableitung zu der Hybridisierkammer 5 sein; es kann aber auch ein federnd beaufschlagtes Expansionsgefäss (nicht gezeigt) vorgesehen sein, welches über eine Leitung mit der Hybridisierkammer 5 verbunden ist.According to the invention, the required overpressure in theHybridisierkammern 5 by means of a liquid, such as by means of one of thefeed pump 8 in theHybridisierkammern 5 pressed Hybridisiermedium be reached from one of the vessels 2 (see. Fig. 1 ). If asystem 1 comprising thishybridization chamber 5 has anagitation device 32 for moving the hybridization media with respect to the immobilized samples, then this system preferably also comprises a spring element which resiliently counteracts the pressure differences generated by theagitation device 32. Such a spring element may be an elastic tube piece (not shown) in a corresponding inlet or outlet to thehybridization chamber 5; but it can also be provided a spring-loaded expansion vessel (not shown), which is connected via a line to thehybridization chamber 5.

Alternativ dazu kann auch Inertgas aus dem Behälter 3 in die Verteilleitung 10 und die Einlassleitungen 11 gedrückt und über je ein Einlassventil 12 der verlangte Druck in den mit Proben und Hybridisiermedien bereits gefüllten Hybridisierkammern 5 aufgebaut werden. Bevorzugt sind Inertgase wie N₂ (Stickstoff), die keine chemische Wechselwirkung oder Reaktionen mit den Hybridisiermedien eingehen. Es kann zudem von Vorteil sein, wenn die Inertgase in den Hybridisiermedien nicht löslich sind. Zudem besteht die Möglichkeit, das aus einer Druckpumpe und einem Druckbehälter (ähnlich wie bei den mit 46 und 47 bezeichneten Elementen inFig. 1) stammende Gas in die Verteilleitung 10 einzuleiten. Nach dem Druckaufbau können alle Ventile wieder geschlossen und die Hybridisierung durchgeführt werden. Dabei dient das so aufgebaute Gaskissen, welches direkt mit dem für die Hybridisierung verwendeten Flüssigkeitsvolumen in Verbindung steht, als Federelement zum federnden Entgegenwirken auf die Agitationsdruckunterschiede. Falls dies, z.B. wegen eines minimalen aber konstanten Druckverlustes über die O-Ring-Dichtungen 28, erforderlich sein sollte, kann der verlangte Kammerdruck während der zumeist viele Stunden dauernden Hybridisierung sporadisch korrigiert oder erneuert bzw. konstant gehalten werden. Zu diesem Zweck können wahlweise auch eines oder beide der Ventile 12,14 (vgl.Fig. 1) offen gehalten werden.Alternatively, inert gas can also be forced out of thecontainer 3 into thedistribution line 10 and the inlet lines 11 and the required pressure can be built up via aninlet valve 12 into thehybridization chambers 5 already filled with samples and hybridization media. Preference is given to inert gases such as N₂ (nitrogen), which do not undergo any chemical interaction or reactions with the hybridization media. It may also be advantageous if the inert gases are not soluble in the Hybridisiermedien. In addition, there is the possibility of a pressure pump and a pressure vessel (similar to the elements designated 46 and 47 in Fig. 1 ) gas into thedistribution line 10 to initiate. After pressure build-up, all valves can be closed again and hybridization performed. In this case, the gas cushion thus constructed, which is directly related to the liquid volume used for the hybridization, serves as a spring element for resilient counteraction to the agitation pressure differences. If this is necessary, for example because of a minimal but constant pressure drop across the O-ring seals 28, the required chamber pressure may be sporadically corrected or renewed during the many hours of hybridization. Optionally, one or both of thevalves 12, 14 (cf. Fig. 1 ) are kept open.

Eine weitere Alternative (in den Figuren nicht dargestellt) besteht darin, eine Druckpumpe und einen Druckbehälter (ähnlich wie die mit 46 und 47 bezeichneten Elemente inFig. 1) oder einen Gasbehälter (wie z.B. der N₂-Behälter 3 inFig. 1) mit der Sammelleitung 15 zu verbinden und den Druck in den Hybridisierkammern 5 über ein Öffnen der Auslassventile 14 aufzubauen. Eine zusätzliche Alternative zum Bereitstellen eines Gaskissens, das als Federelement zum federnden Entgegenwirken auf die Agitationsdruckunterschiede dient, besteht darin, das aus einer Druckpumpe und einem Druckbehälter (ähnlich wie die mit 46 und 47 bezeichneten Elemente inFig. 1) oder aus einem Gasbehälter (wie z.B. der N₂-Behälter 3 inFig. 1) stammende Gas in eine der Leitungen zu führen, welche in zumindest eine der Verteilleitung 10 oder Sammelleitung 15 münden. Entsprechend können eines oder beide der Ventile 12,14 (vgl.Fig. 1) offen gehalten werden.Another alternative (not shown in the figures) is to use a pressure pump and a pressure vessel (similar to the elements labeled 46 and 47 in FIG Fig. 1 ) or a gas container (such as the N₂ container 3 in Fig. 1 ) to connect to the manifold 15 and the pressure in theHybridisierkammern 5 to build on an opening of theexhaust valves 14. An additional alternative to providing a gas cushion serving as a spring member for resiliently counteracting the agitation pressure differentials is that of a pressure pump and a pressure vessel (similar to those shown at 46 and 47 in FIG Fig. 1 ) or from a gas container (such as the N₂ container 3 in Fig. 1 ) to lead gas in one of the lines which open into at least one of thedistribution line 10 ormanifold 15. Accordingly, one or both of thevalves 12, 14 (cf. Fig. 1 ) are kept open.

Wird ein System 1 mit Anordnungen verwendet, welche (wie oben beschrieben) zwei Agitationsmembranen 33,33' umfassen, so kann während dem vorbereitenden Agitieren der Hybridisationsmedien in den Hybridisierkammern 5 oder auch während dem Hybridisieren selbst, die Agitationseinrichtung 32 verwendet werden. Dabei muss einfach ein Agitationsdruck im Druckraum 34 erzeugt werden, der um ca. 0.5 bis 1 bar höherer ist als der gewünschte Kammerdruck von 100 mbar bis 1.4 bar über dem Umgebungsdruck. Der für die Agitation aufzuwendende Druck bewegt sich (je nach Umgebungsdruck) somit im Bereich von ca. 0.6 - 2.4 bar. Die zweite Membran 33' bildet in diesem Fall ein Federelement, welches diesem Agitationsdruck federnd entgegen wirkt.If asystem 1 is used with arrangements comprising twoagitation membranes 33, 33 '(as described above), theagitator 32 may be used during the preliminary agitation of the hybridization media in thehybridization chambers 5 or also during the hybridization itself. In this case, simply an agitation pressure in thepressure chamber 34 must be generated, which is higher by about 0.5 to 1 bar than the desired chamber pressure of 100 mbar to 1.4 bar above the ambient pressure. The pressure to be used for the agitation moves (depending on the ambient pressure) in the range of approx. 0.6 - 2.4 bar. The second diaphragm 33 'forms in this case a spring element which acts resiliently against this agitation pressure.

Typischerweise wird eine Hybridisierung wie folgt durchgeführt:

1. a) Ausspülen von Luftblasen und Flüssigkeitsresten aus der Verteilleitung 10 und derSammelleitung 15. Zu diesem Zweck werden nur die Ventile 4 (A.D.), 19und 17 geöffnet und es wird mit der Förderpumpe 8 destilliertes Wasser aus dem Gefäss 2 (A.D.) über das Ventil 4 (A.D.) indie Verteilleitung 10 gepumpt. Das destillierte Wasser strömt durchdas Verbindungsventil 19 indie Sammelleitung 15 und von dort überdas Abfallventil 17 indie Abfallleitung 16.
   Gleichzeitig werden dieHybridisierkammern 5 aufgebaut. Dies geschieht durch das Auflegen von (vorzugsweise ineinem Transportrahmen 52 gehaltenen)Objektträgern 27 mit darauf immobilisierten Proben auf dieKontaktplatte 53 eines Thermostats, durch dasEinsetzen von Deckeln 26 inden Klapprahmen 54 desSystems 1 zum Hybridisierenvon auf Objektträgern 27 immobilisierten Nukleinsäureproben, Proteinen oder Gewebeschnitten und durch das Verschliessen der Hybridisierkammern 5 mittels Herunterklappen derDeckel 26 auf die Objektträger 24 (vgl.Fig. 4 und 5). Dieses Herunterklappen verbindet dieEnden der Einlassleitungen 11,der Auslassleitungen 12 und der Druckleitungen 35der Agitationseinrichtung 32 jeder einzelnen Hybridisierkammer 5 mit den entsprechenden Leitungsenden desSystems 1. Vorzugsweise werden - entsprechend den vier ineinem Transportrahmen 52 aufgenommenen Objektträgern 27 -vier Deckel 26 ineinen Klapprahmen 54 eingesetzt.
2. b) Füllen und Thermostatisieren der Hybridisierkammern 5 mit Prähybridisier-Puffer. Zu diesem Zweck werden nur die Ventile 4 (V-P), 12, 14und 17 geöffnet und es wird mit der Förderpumpe 8 Prähybridisier-Puffer aus dem Gefäss 2 (V-P) über das Ventil 4 (V-P) indie Verteilleitung 10 und von dort über dieEinlassventile 12 indie Hybridisierkammern 5 gepumpt. Ein Teil des Prähybridisier-Puffers verlässt dieHybridisierkammern 5 über dieAuslassventile 14 und dieSammelleitung 15 und gelangt überdas Abfallventil 17 indie Abfallleitung 16. Dieser Vorgang verlangt besondere Beachtung, weil hier zum ersten Mal Luftblasen indie Hybridisierkammern 5 eingeschleppt werden können.
3. c) Ausblasen der Verteilleitung 10 und derSammelleitung 15. Zu diesem Zweck werden nur dieVentile 9, 19und 17 geöffnet und es wird mit der Förderpumpe 8 Luftüber das Belüftungsventil 9 angesaugt und über dieVerteilleitung 10,das Verbindungsventil 19 indie Sammelleitung 15 und von dort überdas Abfallventil 17 indie Abfallleitung 16 gepumpt.
4. d) Probenzugabe indie Hybridisierkammern 5. Zu diesem Zweck werden nur dieVentile 14 und 21 geöffnet. Die Proben werden mit einer Pipette über dieMusterzuführung 31im Deckel 26 indie Hybridisierkammern 5 gepresst. Dadurch wird ein entsprechendes Volumen Prähybridisier-Puffer ausden Hybridisierkammern 5 indie Auslassleitung 13 mitden geöffneten Auslassventilen 14 verdrängt. Dies wiederum verdrängt ein entsprechendes Volumen Luft aus derSammelleitung 15. Diese verdrängte Luft strömt durchdas geöffnete Entlastungsventil 21 indie Entlastungsleitung 20 und gelangt inden Sammelbehälter 22, den sie über dieEntlüftungsöffnung 23 verlässt. Dieser Vorgang verlangt besondere Beachtung, weil hier zum zweiten Mal Luftblasen indie Hybridisierkammern 5 eingeschleppt werden können.
5. e) Gleichmässiges Verteilen der Hybridisiermedien inden Hybridisierkammern 5 und gegenüber den aufden Objektträgern 27 immobilisierten Proben. Zu diesem Zweck sind zuerst alle Ventile geschlossen. Dann wird der Kammer-druck wie schon beschrieben erhöht und dieAgitationseinrichtung 32 in Betrieb genommen.
   Alle eventuell inden Hybridisierkammern 5 vorhandenen Luftblasen werden bei diesem Druckaufbau eliminiert.
6. f) Hybridisieren der Proben während beispielsweise 17 Stunden. Währen der Hybridisierung können die Medien inden Hybridisierkammern 5 konstant oder intermittierend agitiert werden. Dieser Vorgang verlangt besondere Beachtung, weil hier Luftblasen spontan inden Hybridisierkammern 5 entstehen können. Um dies zu verhindern, kann der Kammerdruck während der Hybridisierung korrigierend angepasst und konstant gehalten bzw. gemäss einem individuellen Programm verändert werden. Ein solches Programm kann das Erhöhen und Erniedrigen des Kammerdruckes in bestimmten Druck- und Zeitschritten definieren, so dass ein schonendes Hybridisieren der Proben gewährleistet ist, die eine solch spezielle Behandlung verlangen.
7. g) Waschen der hybridisierten Proben mit Puffern. Zu diesem Zweck wird zuerst der Kammerdruck auf Normaldruck reguliert, indem dieAuslassventile 14und das Abfallventil 17 geöffnet werden. Darauf werden Waschflüssigkeiten mittels der Förderpumpe 8 sequentiell und je nach Bedarf ausden Gefässen 2 durch die entsprechend geöffneten Ventile 4 indie Verteilleitung 10 und von da über die geöffneten Einlassventile 12 und dieEinlassleitungen 11 indie Hybridisierkammern 5 gepumpt. Die Waschflüssigkeiten und Waschabfälle verlassen dieHybridisierkammern 5 über dieAuslassleitungen 13 und die bereits geöffneten Auslassventile 14, werden inder Sammelleitung 15 zusammengeführt und durchdas geöffnete Abfallventil 17 indie Abfallleitung 16 abgeführt.
8. h) Trocknen der hybridisierten Proben aufden Objektträgern 27. Zu diesem Zweck werden nur dieVentile 12, 14und 17 geöffnet. Daraufwird das Inertgasventil 50 geöffnet und dieVerteilleitung 10, dieEinlassleitungen 11, dieHybridisierkammern 5, dieAuslassleitungen 13 und die Sammelleitung 15 überdas geöffnete Abfallventil 17 und dieAbfallleitung 16 mit Inertgas durchgespült bis die Proben trocken sind.
   Anschliessend könne die fertigen Proben entnommen werden.

Typically, hybridization is performed as follows:

1. a) rinsing out of air bubbles and liquid residues from thedistribution line 10 and the manifold 15. For this purpose, only the valves 4 (AD), 19 and 17 are opened and it is with thefeed pump 8 distilled water from the vessel 2 (AD) on the Valve 4 (AD) is pumped into thedistribution line 10. The distilled water flows through the connectingvalve 19 into the manifold 15 and from there via thewaste valve 17 into thewaste line 16.
   At the same time theHybridisierkammern 5 are constructed. This is done by placing slides (preferably held in a transport frame 52) on the contact plate with specimens immobilized thereon 53 of a thermostat, by the insertion oflids 26 in thesnap frame 54 of thesystem 1 for hybridizing nucleic acid samples immobilized onslides 27, proteins or tissue sections and by closing theHybridisierkammern 5 by folding down thelid 26 on the slides 24 (see. 4 and 5 ). This folding down connects the ends of theinlet ducts 11, theoutlet ducts 12 and thepressure ducts 35 of theagitator 32 of eachindividual hybridization chamber 5 to the respective duct ends of thesystem 1. Preferably, fourlids 26 are formed into one according to the four slides 27 received in atransport frame 52Folding frame 54 used.
2. b) filling and thermostating theHybridisierkammern 5 with prehybridization buffer. For this purpose, only the valves 4 (VP), 12, 14 and 17 are opened and it is with thefeed pump 8 prehybridization buffer from the vessel 2 (VP) via the valve 4 (VP) in thedistribution line 10 and from there via theintake valves 12 are pumped into theHybridisierkammern 5. A part of the prehybridization buffer leaves theHybridisierkammern 5 via theoutlet valves 14 and the manifold 15 and passes through thewaste valve 17 in thewaste line 16. This process requires special attention, because here for the first time air bubbles can be introduced into theHybridisierkammern 5.
3. c) blowing out of thedistribution line 10 and the manifold 15. For this purpose, only thevalves 9, 19 and 17 are opened and it is sucked with the feed pump 8 air through thevent valve 9 and thedistribution line 10, the connectingvalve 19 into the manifold 15th and pumped from there via thewaste valve 17 into thewaste line 16.
4. d) Sampling in theHybridisierkammern 5. For this purpose, only thevalves 14 and 21 are opened. The samples are pressed with a pipette via the pattern feed 31 in thelid 26 into thehybridization chambers 5. As a result, a corresponding volume of prehybridization buffer from thehybridization chambers 5 is introduced into theoutlet line 13 with the outlet valves open 14 displaced. This in turn displaces a corresponding volume of air from the manifold 15. This displaced air flows through theopen relief valve 21 into therelief line 20 and enters thesump 22, which it leaves via thevent opening 23. This process requires special attention, because here for the second time air bubbles can be introduced into theHybridisierkammern 5.
5. e) Uniform distribution of the Hybridisiermedien in theHybridisierkammern 5 and with respect to the immobilized on theslides 27 samples. For this purpose, first all valves are closed. Then the chamber pressure is increased as already described and theagitation device 32 is put into operation.
   Any air bubbles that may be present in thehybridization chambers 5 are eliminated in this pressure build-up.
6. f) hybridizing the samples for, for example, 17 hours. During hybridization, the media in thehybridization chambers 5 can be agitated constantly or intermittently. This process requires special attention because here air bubbles can spontaneously arise in theHybridisierkammern 5. To prevent this, the chamber pressure during the hybridization can be corrected and kept constant or changed according to an individual program. Such a program may define increasing and decreasing the chamber pressure in certain pressure and time increments so as to ensure gentle hybridization of the samples requiring such special treatment.
7. g) washing the hybridized samples with buffers. For this purpose, first, the chamber pressure is regulated to normal pressure by opening theexhaust valves 14 and thewaste valve 17. Thereafter, washing liquids by means of thefeed pump 8 sequentially and as needed from thevessels 2 through the correspondinglyopen valves 4 in thedistribution line 10 and from there via theopen inlet valves 12 and the inlet lines 11 pumped into theHybridisierkammern 5. The washing liquids and wastes leave theHybridisierkammern 5 via the outlet lines 13 and the alreadyopen exhaust valves 14 are merged in the manifold 15 and discharged through theopen waste valve 17 into thewaste line 16.
8. h) drying the hybridized samples on theslides 27. For this purpose, only thevalves 12, 14 and 17 are opened. Thereafter, theinert gas valve 50 is opened and thedistribution line 10, the inlet lines 11, thehybridization chambers 5, the outlet lines 13 and the manifold 15 are flushed through the openedwaste valve 17 and thewaste line 16 with inert gas until the samples are dry.
   Subsequently, the finished samples can be removed.

Alternativ zum eben beschriebenen Verfahrensschritt h) erfolgt das Trocknen der hybridisierten Proben auf den Objektträgern 27, indem nur die Ventile 12, 14 und 21 geöffnet werden. Darauf wird das Inertgasventil 50 geöffnet und die Verteilleitung 10, die Einlassleitungen 11, die Hybridisierkammern 5, die Auslassleitungen 13 und die Sammelleitung 15 über das geöffnete Entlastungsventil 21, die Entlastungsleitung 20, den Sammelbehälter 22 und die Entlüftungsöffnung 23 mit Inertgas durchgespült bis die Proben trocken sind.As an alternative to process step h) just described, the hybridized samples are dried on the microscope slides 27 by opening only thevalves 12, 14 and 21. Then theinert gas valve 50 is opened and thedistribution line 10, the inlet lines 11, theHybridisierkammern 5, the outlet lines 13 and the manifold 15 through theopen relief valve 21, thedischarge line 20, thesump 22 and thevent 23 flushed with inert gas until the samples dry are.

Bevorzugt wird auch eine alternative Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens, bei der auf die zweite Membran 33' der Agitationseinrichtung 32 verzichtet werden kann. Zu diesem Zweck muss ein anderes Medium die Funktion dieses Federelements übernehmen. Dies wird dadurch erreicht, dass nach dem Einfüllen aller an der Hybridisierung teilnehmenden Proben und Medien in die Hybridisierkammern 5 alle Ventile geschlossen (vgl. Schritte a-d) und darauf die Auslassventile 13 wieder geöffnet werden. Damit wird das mit Luft gefüllte Volumen der Sammelleitung 15 sowie der direkt anschliessende Teil der Abfallleitung 16 mit den mit Flüssigkeit gefüllten Volumina der Hybridisierkammern 5 verbunden. Die zwischen den geschlossenen Ventilen 17, 19 sowie 21 und den Musterflüssigkeiten in den Hybridisierkammern 5 eingeschlossene Luft ist elastisch komprimierbar und bildet nun das gewünschte Federelement.An alternative embodiment of the method according to the invention in which the second membrane 33 'of theagitation device 32 can be dispensed with is also preferred. For this purpose, another medium must take over the function of this spring element. This is achieved in that after filling all the samples and media participating in the hybridization into thehybridization chambers 5, all valves are closed (see steps ad) and then theoutlet valves 13 are opened again. Thus, the air-filled volume of the manifold 15 and the directly subsequent part of thewaste line 16 is connected to the liquid-filled volumes of theHybridisierkammern 5. The enclosed between theclosed valves 17, 19 and 21 and the sample liquids in theHybridisierkammern 5 air is elastically compressible and now forms the desired spring element.

Alternativ kann der Schritt c) mit einem Inertgas (z.B. N₂) ausgeführt werden: In diesem Fall können chemische Wechselwirkungen zwischen dem gasförmigen Federelement N₂ und den Proben ausgeschlossen werden.Alternatively, the step c) can be carried out with an inert gas (eg, N_2): In this case, chemical interactions between the gaseous spring element may include N_2, and the samples are excluded.

Physikalisches AusführungsbeispielPhysical embodiment

In einer ersten Versuchsreihe wurden die physikalischen Grundlagen untersucht. Dazu wurden mehrere 100 Objektträger ohne Proben bearbeitet. Die vorzugsweise aus einem Elastomer bestehenden O-Ring-Dichtungen 28 aus z.B. Neopren, Silikon, gedrehtem PTFE, Polyethylen oder Viton verhinderten alle erfolgreich einen Flüssigkeitsverlust. Grundvoraussetzung ist selbstverständlich, dass der Anpressdruck auf den Deckel 26, den O-Ring 28 und den Objektträger 27 genügend gross, d.h. deutlich höher als der erzeugte Kammerdruck ist. Die verwendeten Hybridisierkammern 5 umfassten zwischen dem Deckel 26 und dem Objektträger 27 eine Fläche von 21 x 65 mm. Der Kammerdruck wurde um 1 bar, d.h. um 10⁵ N/m² über den Normaldruck der Umgebung angehoben. Bei einer aktuellen, wirksamen Fläche von 13.65 cm² oder 1.365 x 10^-3 m² musste somit eine Kraft von mehr als 136.5 N bzw. von ca. 13.9 kp pro Hybridisierkammer 5 aufgewendet werden, damit sich diese nicht spontan öffnen konnten. Es wird angenommen, dass auch andere Dichtungsformen und Dichtungsmaterialien genügen und einen Flüssigkeitsaustritt verhindern, falls eine entsprechend dem Überdruck in der Hybridisierkammer 5 gewählte Schliesskraft auf den Deckel 26, die Dichtung 28 und den Objektträger 27 ausgeübt wird.In a first series of experiments, the physical fundamentals were investigated. For this purpose, several 100 slides without samples were processed. The preferably made of an elastomer O-ring seals 28 such as neoprene, silicone, twisted PTFE, polyethylene or Viton all successfully prevented a fluid loss. The basic requirement is of course that the contact pressure on thecover 26, the O-ring 28 and theslide 27 is sufficiently large, ie, significantly higher than the chamber pressure generated. Thehybridization chambers 5 used comprised between thecover 26 and theslide 27 an area of 21 × 65 mm. The chamber pressure was increased by 1 bar, ie by 10⁵ N / m² above the normal pressure of the environment. With a current effective area of 13.65 cm² or 1365 x 10^-3 m² , a force of more than 136.5 N or of approximately 13.9 kp perhybridization chamber 5 had to be used so that they could not spontaneously open. It is also believed that other seal shapes and sealing materials will suffice and prevent fluid leakage if a closing force selected according to the overpressure in thehybridization chamber 5 is applied to thecover 26,seal 28, and slide 27.

Während beim Standardgerät SN22 im Laufe des Bearbeitens von Slides bzw. Objektträgern mit hydrophoben Oberflächen regelmässig Luftblasen zu beobachten waren, wurden beim erfindungsgemässen Prototypen keinerlei Luftblasen festgestellt.While air bubbles were regularly observed in the standard device SN22 during the processing of slides or slides with hydrophobic surfaces, no air bubbles were detected in the prototype according to the invention.

Biologisches AusführungsbeispielBiological embodiment

Zum Durchführen eines Beispiels einer erfindungsgemäss unter erhöhtem Druck durchgeführten Hybridisierung wurden zwei Systeme zeitparallel und unabhängig voneinander eingesetzt. Es handelt sich dabei um ein Standardgerät des Anmelders (Tecan HS 400, Seriennummer 22; kurz SN22 genannt), welches bei Normaldruck betrieben wurde und um einen erfindungsgemässen Prototypen (kurz PT3 genannt), der bei einem um 0.8 bis 1.0 bar erhöhtem Kammerdruck betrieben wurde. Beide Geräte waren mit einem einander entsprechenden Agitationsmechanismus ausgerüstet, wie er grundsätzlich weiter oben beschrieben wurde. Diese Agitationseinrichtung 32 in SN22 wurde mit ca. 0.5 bar, diejenige in PT3 mit einem Agitationsdruck von ca. 1.5 bar betrieben. Bei beiden Geräte wurde das Einhalten der genauen Temperatur vorher überprüft; sie wurden (abgesehen von den erwähnten, testbedingten Unterschieden) mit genau gleichen Parametern (z.B. Temperaturen) betrieben. Dadurch wurde ermöglicht, dass von den erzielten Resultaten direkte Rückschlüsse auf die Ursachen gezogen werden konnten.To carry out an example of a hybridization performed according to the invention under elevated pressure, two systems were used simultaneously and independently of each other. It concerns a standard device of the applicant (Tecan HS 400,serial number 22, briefly SN22 called), which at normal pressure was operated and a prototype according to the invention (abbreviated to PT3), which was operated at a chamber pressure increased by 0.8 to 1.0 bar. Both devices were equipped with a corresponding agitation mechanism, as it was basically described above. Thisagitation device 32 in SN22 was operated at about 0.5 bar, that in PT3 at an agitation pressure of about 1.5 bar. In both devices, the observance of the exact temperature was checked in advance; they were (apart from the mentioned, test-related differences) operated with exactly the same parameters (eg temperatures). This made it possible to draw direct conclusions about the causes from the results obtained.

Die Hybridisierungsprozedur (Pufferzubereitung, Musterinjektion, Programmdefinierung an den verwendeten Hybridisier-Systemen) wurde gemäss den technischen Instruktionen von Alopex (ALOPEX GmbH, Fritz-Hornschuch-Str. 9, D-95326 Kulmbach, Bundesrepublik Deutschland) durchgeführt. In die Hybridisier-Systeme SN22 und PT3 wurden jeweils je zwei Objektträger 27 eingesetzt und bei 43 °C bzw. bei 61 °C prozessiert. Von den folgenden bearbeiteten Proben werden die Resultate besprochen:43 °C43 °CHS 400 SN22HS 400 PT3Objektträger #29, #31Objektträger #24, #2761 °C61 °CHS 400 SN22HS 400 PT3Objektträger #33, #34Objektträger #35, #37The hybridization procedure (buffer preparation, pattern injection, program definition on the hybridization systems used) was carried out according to the technical instructions of Alopex (ALOPEX GmbH, Fritz-Hornschuch-Str. 9, D-95326 Kulmbach, Federal Republic of Germany). In each case twoslides 27 were inserted into the hybridization systems SN22 and PT3 and processed at 43 ° C. or at 61 ° C. From the following processed samples the results are discussed:43 °C43 ° C HS 400 SN22 HS 400PT3 Slide # 29, # 31Slide # 24, # 2761 ° C61 ° C HS 400 SN22 HS 400PT3 Slide # 33, # 34Slide # 35, # 37

Verwendet wurde ein Testkit "HybCheck" von Alopex mit der Kit-Chargennummer: 040524). Dieses Testkit dient zur Überprüfung der Hybridisier-Systeme und ist so ausgelegt, dass die Hybridisiertemperaturen vordefiniert sind und dass die "OK" Signale nur bei exaktem Einhalten der vorgesehenen Temperaturen sowie der relevanten Testparameter in Bezug auf Waschen, Agitieren und Trocknen abgegeben werden. Bei den auf den Objektträgern 27 immobilisierten Proben handelt es sich hier um Oligonukleotide, deren Empfindlichkeit auf Temperaturdifferenzen bekannt ist.A test kit "HybCheck" from Alopex was used with the kit lot number: 040524). This kit is designed to validate hybridization systems and is designed to pre-define the hybridization temperatures and to deliver the "OK" signals only if the intended temperatures and test parameters related to washing, agitation and drying are maintained accurately. The samples immobilized on theslides 27 are these are oligonucleotides whose sensitivity to temperature differences is known.

Das ausgeführte Programm für jeden Probelauf lautet im Detail:
a) Zubereitung der "HybCheck Waschpuffer 1 und 2 It. Herstellerangaben;
b) Lösen von lyophilisierten, fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden in 250 µl auf eine Hybridisiertemperatur (43 °C bzw. 61 °C) vorgewärmtem HybCheck Puffer für die Hybridisierung;
c) Einlegen von je 2 Objektträgern (mit je 6 Sub Arrays) auf Position 1 und 2 in das Hybridisier-System, Verwendung der grossen Hybridisierungskammern (63,5 mm x 20 mm);
d) Schliessen der Hybridisierungskammern und Starten des Hybridisierungsprogrammes;
e) Hybridisierungsprogramm:

1. 1. Erstes Waschen bei 43 °C bzw. 61 °C,Dauer 30 sec;
2. 2. Injektion von 105 µl der Oligonukleotidlösung bei 43 °C bzw. 61 °C in jede Kammer;
3. 3. Hybridisierung bei 43 °C bzw. 61 °C; bei starker Agitation und während 60 min;
4. 4.Waschschritt 1bei 23 °C (Kanal 1) während 30 sec;Absaugen während 30 sec; 2 Wiederholungen;
5. 5.Waschschritt 2bei 23 °C (Kanal 2) während 30 sec;Absaugen während 30 sec; 2 Wiederholungen;
6. 6. Trocknen der objektträger während 3 min bei 23 °C;

f) Nach Beendigung der Hybridisierung wurden beide Objektträger herausgenommen und in einen Laser Scanner (Tecan LS400) eingelegt;
g) Messeinstellung des Laser Scanners:1. Scan Mode:einzelne Wellenlänge2. Laserwellenlänge:543 nm (grün)3. Filterwellenlänge:590nm4. Gain:1655. Autofokus Modus:HS Autofokus,Ebene 16. Scan Resolution:10 µm7. Pinhole:klein8. Oversampling Faktor:1h) Nach Messung im Laser Scanner wurden die erhaltenen Rohdaten ausgewertet wie folgt:The executed program for each test run is in detail:
a) Preparation of "HybCheck Wash Buffers 1 and 2 It. Manufacturer data;
b) dissolving lyophilized, fluorescently labeled oligonucleotides in 250 μl HybCheck buffer for hybridization preheated to a hybridization temperature (43 ° C and 61 ° C respectively);
c) placing 2 slides (each with 6 sub-arrays) inpositions 1 and 2 in the hybridization system, using the large hybridization chambers (63.5 mm x 20 mm);
d) closing the hybridization chambers and starting the hybridization program;
e) Hybridization program:

1. 1. First wash at 43 ° C or 61 ° C,duration 30 sec;
2. 2. Injection of 105 μl of the oligonucleotide solution at 43 ° C or 61 ° C into each chamber;
3. 3. hybridization at 43 ° C or 61 ° C; with strong agitation and during 60 min;
4. 4th washing step 1 at 23 ° C (channel 1) for 30 sec; Suction for 30 sec; 2 repetitions;
5. 5. washstep 2 at 23 ° C (channel 2) for 30 sec; Suction for 30 sec; 2 repetitions;
6. 6. drying the slides during 3 min at 23 ° C;

f) After hybridization was complete, both slides were removed and placed in a laser scanner (Tecan LS400);
g) Measurement setting of the laser scanner: 1. Scan Mode:single wavelength 2. laser wavelength: 543 nm (green) 3. Filter wavelength: 590nm 4. Gain: 165 5. Autofocus mode: HS autofocus,level 1 6. Scan Resolution: 10 μm 7. Pinhole: small 8. Oversampling factor: 1 h) After measurement in the laser scanner, the obtained raw data were evaluated as follows:

Hybridisierung bei 43 °C:Hybridization at 43 ° C:

1. 1. 6 Sub Arrays (6x9 Spots) auf einem Objektträger (Microslide)1. 6 sub arrays (6x9 spots) on a microscope slide (Microslide)
2. 2. Perfect Match (PM) bei 43 °C: 24 Spots pro Slide (4 pro Sub Array)2. Perfect Match (PM) at 43 ° C: 24 spots per slide (4 per sub array)
3. 3. Mismatch 1 (MM1) bei 43 °C: 24 Spots pro Slide (4 pro Sub Array)3. Mismatch 1 (MM1) at 43 ° C: 24 spots per slide (4 per sub array)
4. 4. Mismatch 2 (MM2) bei 43 °C: 24 Spots pro Slide (4 pro Sub Array)4. Mismatch 2 (MM2) at 43 ° C: 24 spots per slide (4 per sub array)
5. 5. Negative Controls: 36 Spots pro Slide (6 pro Sub Array)5. Negative Controls: 36 spots per slide (6 per sub array)
6. 6. Von allen PM's und MM1's pro Microslide (24 Einzelwerte) wurden der Mittelwert, die Standartabweichung und der CV berechnet. Dabei gilt:
   CV = (Standartabweichung/Mittelwert) x 1006. Of all PM's and MM1's per Microslide (24 individual values) the mean, the standard deviation and the CV were calculated. Where:
   CV = (standard deviation / mean) x 100
7. 7. Diskriminierung PM:MM1 (1:5) sowie Diskriminierung PM:MM2 (1:20) berechnet7. Discrimination PM: MM1 (1: 5) as well as Discrimination PM: MM2 (1:20) calculated
8. 8. Die CV-Wert und die Diskriminierungs-Werte als "OK" (falls CV über ein ganzes Slide < 18%) oder "failed" angegeben.8. The CV value and the discrimination values are indicated as "OK" (if CV over an entire slide <18%) or "failed".

Hybridisierung bei 61 °C:Hybridization at 61 ° C:

1. 1. 6 Sub Arrays (6x9 Spots) auf einem Objektträger (Microslide)1. 6 sub arrays (6x9 spots) on a microscope slide (Microslide)
2. 2. Perfect Match (PM) bei 61°C: 24 Spots pro Slide (4 pro Sub Array)2. Perfect Match (PM) at 61 ° C: 24 spots per slide (4 per sub array)
3. 3. Mismatch 1 (MM1) bei 61°C: 24 Spots pro Slide (4 pro Sub Array)3. Mismatch 1 (MM1) at 61 ° C: 24 spots per slide (4 per sub array)
4. 4. Mismatch 2 (MM2) bei 61°C: 24 Spots pro Slide (4 pro Sub Array)4. Mismatch 2 (MM2) at 61 ° C: 24 spots per slide (4 per sub array)
5. 5. Negativkontrollen: 36 Spots pro Slide (6 pro Sub Array)5. Negative controls: 36 spots per slide (6 per sub array)
6. 6. Von allen PM's und MM1's pro Microslide (24 Einzelwerte) wurden der Mittelwert, die Standartabweichung und der CV berechnet. Dabei gilt: CV = (Standartabweichung/Mittelwert) x 1006. Of all PM's and MM1's per Microslide (24 individual values) the mean, the standard deviation and the CV were calculated. Where: CV = (standard deviation / mean) x 100
7. 7. Diskriminierung PM:MM1 (1:5) sowie Diskriminierung PM:MM2 (1:20) berechnet7. Discrimination PM: MM1 (1: 5) as well as Discrimination PM: MM2 (1:20) calculated
8. 8. Die CV-Werte und die Diskriminierungs-Werte als "OK" (falls CV über ein ganzes Slide < 18%) oder "failed" angegeben.8. The CV values and the discrimination values are indicated as "OK" (if CV over an entire slide <18%) or "failed".

Die folgenden Ergebnisse wurden erzielt:43 °C / HS 400 SN22CV Perfect MatchOKCV Mismatch 1OKDiskriminierung Perfect Match and Mismatch 1OKDiskriminierung Perfect Match and Mismatch 2OKSpotqualitätOKNegativkontrollenOKEs wurde kein Gradient beobachtet43 °C / HS 400 PT3CV Perfect MatchOKCV Mismatch 1OKDiskriminierung Perfect Match and Mismatch 1OKDiskriminierung Perfect Match and Mismatch 2OKSpotqualitätOKNegativkontrollenOKEs wurde kein Gradient beobachtet61 °C / HS 400 SN22CV Perfect MatchOKCV Mismatch 1OKDiskriminierung Perfect Match and Mismatch 1OKDiskriminierung Perfect Match and Mismatch 2OKSpotqualität#33 failed, #34 OKNegative ControlsOKEs wurde kein Gradient beobachtet61°C / HS 400 PT3CV Perfect MatchOKCV Mismatch 1OKDiskriminierung Perfect Match and Mismatch 1OKDiskriminierung Perfect Match and Mismatch 2OKSpotqualitätfailedNegativkontrollenOKEs wurde kein Gradient beobachtetThe following results were achieved:43 ° C / HS 400 SN22 CV Perfect MatchOK CV Mismatch 1 OK Discrimination Perfect Match andMismatch 1 OK Discrimination Perfect Match andMismatch 2 OK spot quality OK negative controls OK No gradient was observed43 ° C / HS 400 PT3 CV Perfect MatchOK CV Mismatch 1 OK Discrimination Perfect Match andMismatch 1 OK Discrimination Perfect Match andMismatch 2 OK spot quality OK negative controls OK No gradient was observed61 ° C / HS 400 SN22 CV Perfect MatchOK CV Mismatch 1 OK Discrimination Perfect Match andMismatch 1 OK Discrimination Perfect Match andMismatch 2 OKspot quality # 33 failed, # 34 OK Negative Controls OK No gradient was observed61 ° C / HS 400 PT3 CV Perfect MatchOK CV Mismatch 1 OK Discrimination Perfect Match andMismatch 1 OK Discrimination Perfect Match andMismatch 2 OK spot quality failed negative controls OK No gradient was observed

Die gezeigten Resultate belegen nicht nur, dass beide verwendeten Geräte sehr brauchbare Resultate liefern. Vielmehr sind die in den beiden Geräten SN22 und PT3 erzielten Resultate (nach Temperaturen geordnet) einander so ähnlich, dass ein Einfluss des erhöhten Druckes auf die Hybridisierung ausgeschlossen werden kann.The results show not only that both devices used give very useful results. Rather, the results obtained in the two devices SN22 and PT3 (ordered by temperature) are so similar to each other that an influence of the increased pressure on the hybridization can be excluded.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist nicht auf den Einsatz in Hybridisierkammern beschränkt. Es kann auch in anderen Geräten angewendet bzw. eingesetzt werden, um dort das Auftreten von unerwünschten Luftblasen zu verhindern. Solche Geräte oder Instrumente können z.B. aus dem Bereich der Microfluidics-Technologie stammen, wie etwa "Lab on a Chip" - Systeme.The inventive method is not limited to the use in hybridization. It can also be used in other devices or used to prevent the occurrence of unwanted air bubbles. Such devices or instruments may e.g. from the field of microfluidics technology, such as "lab on a chip" systems.

DieFigur 6 zeigt ein Schema eines zum Ausführen des erfindungsgemässen Verfahrens geeigneten, zweiten Geräts bzw. Systems. Dieses System 1' unterscheidet sich von dem inFigur 1 dargestellten System 1 im Wesentlichen dadurch, dass jedem Deckel 26 zwei Hybridisierkammern 5A,5B zugeordnet sind. Diese beiden Hybridisierkammern 5A,5B können über einem einzelnen Objektträger mit beispielsweise zwei identischen DNA-Mikroarrays angeordnet werden. Es können aber auch zwei kleinere Objektträger 27 eingesetzt werden, von welchen jedes mit dem einen Deckel 26 zusammen nur jeweils eine Hybridisierkammer 5 definiert (nicht gezeigt). Jede Hybridisierkammer 5A,5B wird von der Verteilleitung 10 über je ein individuelles Einlassventil 12A,12B und je eine individuelle Einlassleitung 11A,11B mit Flüssigkeiten, wie Waschpuffer oder Hybridisiermedien versorgt. Somit können alle Hybridisierkammern wahlweise autark, d.h. unabhängig voneinander oder aber gemeinsam, d.h. simultan betrieben werden.The FIG. 6 shows a schematic of a suitable for carrying out the inventive method, second device or system. This system 1 'differs from that in FIG. 1 shownsystem 1 essentially by the fact that eachlid 26 twoHybridisierkammern 5A, 5B are assigned. These twohybridization chambers 5A, 5B can be arranged over a single slide with, for example, two identical DNA microarrays. However, it is also possible to use twosmaller slides 27, each of which together with onecover 26 only defines one hybridization chamber 5 (not shown). EachHybridisierkammer 5A, 5B is supplied by thedistribution line 10 via a respectiveindividual inlet valve 12A, 12B and oneindividual inlet line 11A, 11B with liquids, such as washing buffer or Hybridisiermedien. Thus, all Hybridisierkammern either self-sufficient, ie independently or jointly, ie operated simultaneously.

Um die in den beiden Hybridisierkammern 5A,5B unter jeweils einem Deckel 26 anwesenden Flüssigkeiten gegenüber den auf den Objektträgern immobilisierten Proben bewegen zu können, verfügt jeder Deckel 26 dieses besonders bevorzugten Systems 1' für jede einzelne Hybridisierkammer 5A,5B über einen eigenen, mit je einer Membran 33 versehenen Agitationsraum 30. Dieser Agitationsraum 30 ist jeweils mit einer Agitationsleitung 36 mit der Hybridisierkammer 5A,5B verbunden, wobei die Membran 33 den Agitationsraum 30 von einem Druckraum 34 trennt. Diese Druckräume 34 werden über die Druckleitung 35 mit einem Druckfluid befüllt und sporadisch, z.B., pulsierend mit dem Agitationsdruck beaufschlagt. InFigur 6 erfolgt die Beaufschlagung der Membranen 33 der Hybridisierkammern 5A,5B in Serie, d.h. synchron. Dies hat den Vorteil einer vereinfachten Bauweise, bei der nach dem Überdruckventil 43 keine weiteren Ventile oder Steuerelemente in der Druckverteilleitung 39 oder in den zu den Druckräumen 34 führenden Druckleitungen 35 vorgesehen werden müssen. Es kann jedoch auch vorgesehen sein, dass jede Membran 33 mit einer separaten Druckleitung 35 (parallel) unter Druck gesetzt wird (nicht gezeigt).In order to be able to move the liquids present in each of the twohybridization chambers 5A, 5B under acover 26 relative to the samples immobilized on the slides, each cover 26 of this particularly preferred system 1 'has itsown hybridization chamber 5A, 5B each with its own anagitation room 30 provided with amembrane 33. Thisagitation room 30 is connected in each case with anagitation line 36 to thehybridization chamber 5A, 5B, themembrane 33 separating theagitation space 30 from apressure space 34. Thesepressure chambers 34 are filled via thepressure line 35 with a pressurized fluid and sporadically, for example, acted upon pulsating with the agitation pressure. In FIG. 6 themembranes 33 of thehybridization chambers 5A, 5B are supplied in series, ie synchronously. This has the advantage of a simplified construction, in which after thepressure relief valve 43, no further valves or control elements in thepressure distribution line 39 or in the leading to thepressure chambers 34pressure lines 35 must be provided. However, it can also be provided that eachdiaphragm 33 is pressurized with a separate pressure line 35 (parallel) (not shown).

Die Auslasse 13A,13B eines Deckels 26 münden in die Auslassleitung 13 desselben und werden, wie bereits beiFigur 1 beschrieben, über das Auslassventil 14 der Sammelleitung 15 zugeführt. Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform dieses Systems 1' weist die Auslassleitung 13 einen vergrösserten Durchmesser auf und stellt so den Raum bereit, in welche ein als Federelement dienendes Gaskissen Platz findet. Dieses Federelement steht - direkt über eine durchgängige Fluidleitung, oder indirekt (durch ein Membran getrennt) - mit dem für die Hybridisierung verwendeten Flüssigkeitsvolumen in Verbindung. Dieses Federelement wirkt federnd den durch die Agitationseinrichtung 32 auf den Druckraum 34 ausgeübten Agitationsdruckunterschieden entgegen (ähnlich wie bereits im Zusammenhang mitFigur 1 beschrieben). Damit wird erreicht, dass der Kammer-Druck, der mittels einer Druckeinrichtung zum Verhindern von Luftblasen in den Hybridisierkammern 5 aufgebaut wird, unabhängig von Agitationsdruckunterschieden über dem in der Umgebungsluft herrschenden, normalen atmosphärischen Druck gehalten werden kann. Als Federelemente können auch Membranen dienen, welche direkt mit den Medien in den Hybridisierkammern 5 beaufschlagt werden, oder welche durch ein Flüssigkeitskissen oder ein Gaskissen von diesen Medien getrennt sind. Ein Federelement - egal wie es ausgebildet ist - ist vorzugsweise elastisch bzw. komprimier oder dehnbar ausgebildet und gleicht die Agitationsdruckunterschiede in den Hybridisierkammern 5 aus, so dass der Kammerdruck über eine bestimmte Zeit, z.B. während des ganzen Hybridisiervorgangs, so weit über dem in der Umgebungsluft herrschenden, normalen atmosphärischen Druck liegt, dass sich im Hybridisiermedium keine Gasblasen bilden können.Theoutlets 13A, 13B of alid 26 open into theoutlet 13 of the same and are, as already at FIG. 1 described, fed via theexhaust valve 14 of the manifold 15. According to a preferred embodiment of this system 1 ', theoutlet duct 13 has an enlarged diameter and thus provides the space in which a gas cushion serving as a spring element can be accommodated. This spring element is - directly via a continuous fluid line, or indirectly (separated by a membrane) - in communication with the volume of liquid used for the hybridization. This spring element resiliently counteracts the agitation pressure differences exerted by theagitation device 32 on the pressure chamber 34 (similar to what has already been mentioned in connection with FIG FIG. 1 described). This ensures that the chamber pressure, which is built up by means of a pressure device for preventing air bubbles in theHybridisierkammern 5, regardless of Agitationsdruckunterschieden above the prevailing in the ambient air, normal atmospheric pressure can be maintained. As spring elements can also serve membranes which are acted upon directly by the media in theHybridisierkammern 5, or which are separated by a liquid pad or a gas cushion from these media. A spring element - no matter how it is formed - is preferably elastic or compressible or stretchable and compensates for the Agitationsdruckunterschiede in theHybridisierkammern 5, so that the chamber pressure over a certain time, for example during the entire hybridization, so far above that in the ambient air ruling, normal atmospheric Pressure is that in the Hybridisiermedium no gas bubbles can form.

Zusätzlich zum dort beschriebenen System 1, umfasst das hier vorgestellte, bevorzugte System 1' eine Blasleitung 62, welche über ein Blasventil 63 vorzugsweise gerade zu der Stelle führt, wo der Auslass 13B in die Auslassleitung 13 mündet.In addition to thesystem 1 described therein, the preferred system 1 'presented here comprises ablow line 62, which via ablow valve 63 preferably leads straight to the point where theoutlet 13B opens into theoutlet line 13.

Mit dieser Blasleitung 62 wird wie folgt verfahren:

• Zuerstwird jede Hybridisierkammer 5A,5B mit Waschpuffer gefüllt. Dabei werden dieEinlassleitungen 11A,11B sowie dieAuslässe 13A,13Bund die Auslassleitung 13 ebenfalls mit Waschpuffer gefüllt. Nach dem Einpipetieren der Musterflüssigkeiten werden dieMusterzuführungen 31 und dieEinlassventile 12A,12B wieder geschlossen.Die Auslassventile 14 bleiben geöffnet. Werden nun dieBlasventile 63 geöffnet, so dringt Gas aus einem Kompressor oder einem Druckspeicher über die individuellen Blasleitungen 64 indie Auslassleitungen 13 ein und verdrängt den Waschpuffer aus diesenAuslassleitungen 13. Dieses Gas bildet dann das Gaskissen inder Auslassleitung 13. Durch deren vergrösserten Durchmesser, weist das Gaskissen das notwendige Volumen auf, um erfolgreich als Federelement dienen zu können. Durch die beim Agitieren auftretenden Druckspitzen wird das Gas in den Auslassleitungen entsprechend komprimiert und federt beim Nachlassen des Agitationsdruckes zurück. Dadurch entsteht die gewünschte Pendelbewegung der Medienim den Hybridisierkammern 5. In dieser eben beschriebenen Ausführungsform kann das Federelement als Teil des Agitationsmechanismus betrachtet werden; tatsächlich erübrigt sich hier das Anbringen einer zweiten Membran 33'. Ist allerdings der Querschnitt der Auslassleitung 13 zu klein, um den ganzen für die Federelement-Wirkung benötigten Raum zur Verfügung zu stellen, so kann ergänzend doch eine zweite Membran 33' (vgl. z.B.Fig. 1) vorgesehen werden.

Thisblow line 62 is operated as follows:

• First, eachhybridization chamber 5A, 5B is filled with wash buffer. In this case, theinlet lines 11A, 11B and theoutlets 13A, 13B and theoutlet 13 are also filled with washing buffer. After the sample liquids are pipetted in, thepattern feeders 31 and theinlet valves 12A, 12B are closed again. Theexhaust valves 14 remain open. If theblow valves 63 are now opened, gas from a compressor or a pressure accumulator flows via theindividual blow lines 64 into the outlet lines 13 and displaces the wash buffer from these outlet lines 13. This gas then forms the gas cushion in theoutlet line 13 , The gas cushion has the necessary volume to successfully serve as a spring element. Due to the pressure peaks occurring during agitation, the gas in the outlet lines is compressed accordingly and springs back when the agitation pressure decreases. This results in the desired pendulum movement of the media in theHybridisierkammern 5. In this embodiment just described, the spring element can be regarded as part of the Agitationsmechanismus; in fact, it is not necessary here to attach a second membrane 33 '. If, however, the cross-section of theoutlet line 13 is too small to make the entire space required for the spring element effect available, then a second membrane 33 '(cf., for example, FIG Fig. 1 ).

Figur 7 zeigt eine schematische Ansicht einer besonderen, ersten Anordnung eines Deckels 26 mit einer Hybridisierkammer 5, von unten gesehen. Der wesentliche Unterschied zu der inFigur 3 bereits gezeigten Ausführungsform liegt hier in der Auslassleitung 13 mit dem vergrösserten Durchmesser, wodurch der Raum für ein als Federelement dienendes Gaskissen bereit gestellt wird. In diese Auslassleitung 13 mündet in der Nähe ihres Endes der individuelle Auslass 13' der Hybridisierkammer 5. In dem gleichen Bereich mündet auch die dieser Hybridisierkammer 5 zugeordnete, individuelle Blasleitung 64. Alle Medienleitungen weisen je eine Anschlussöffnung auf, die in der gemeinsamen Anschlussebene 57 des Deckels 26 liegt. Diese fünf Öffnungen sind bevorzugt auf einer Linie angeordnet, sie können aber auch beliebig angeordnet sein. Alle anderen Teile entsprechen der Ausführungsform vonFig. 3. In diesem Ausführungsbeispiel ist eine zweite Membran 33' vorgesehen, welche einen zweiten Agitationsraum 30' verschliesst. Die zweite Membran 33' dient in diesem Fall zur Unterstützung des als Gaskissen in der Auslassleitung 13 angeordneten Federelements. Der zweite Agitationsraum 30' ist hier als geschlossener Raum ausgebildet und enthält ein Gaskissen, welches über die Membran 33' zusammendrückbar und wieder expandierbar ausgebildet ist. Falls die Auslassleitung 13 ein genügend grosses Gaskissen bereitstellt, kann auf die zweite Membran 33' und den zweiten Agitationsraum 30' verzichtet werden (vgl.Fig. 8). FIG. 7 shows a schematic view of a particular, first arrangement of alid 26 with ahybridization chamber 5, seen from below. The main difference to the in FIG. 3 already shown embodiment is here in theoutlet 13 with the enlarged diameter, whereby the space is provided for serving as a spring element gas cushion. The individual outlet 13 'of thehybridization chamber 5 opens into thisoutlet line 13 in the vicinity of its end. Theindividual blow line 64 assigned to thishybridization chamber 5 also discharges in the same region. All media lines each have a connection opening which is located in thecommon connection plane 57 of theCover 26 is located. These five openings are preferably arranged on a line, but they can also be arranged arbitrarily. All other parts correspond to the embodiment of Fig. 3 , In this embodiment, a second membrane 33 'is provided, which closes a second agitation space 30'. The second diaphragm 33 'in this case serves to support the spring element arranged as a gas cushion in theoutlet line 13. The second agitation space 30 'is here designed as a closed space and contains a gas cushion, which is formed on the membrane 33' compressible and re-expandable. If theoutlet line 13 provides a sufficiently large gas cushion, the second membrane 33 'and the second agitation space 30' can be dispensed with (cf. Fig. 8 ).

Figur 8 zeigt eine schematische Ansicht einer besonderen, zweiten Anordnung eines Deckels 26 mit zwei Hybridisierkammern 5A,5B, von unten gesehen. Wie die inFigur 7 gezeigte Ausführungsform, weist hier der Deckel 26 eine Auslassleitung 13 mit dem vergrösserten Durchmesser auf, wodurch der Raum für ein als Federelement dienendes Gaskissen bereit gestellt wird. In diesem Fall genügt der bereitgestellte Hohlraum, um die Wirkung als Federelement zu garantieren, deshalb weisen beide hinter einander liegenden Hybridisierkammern 5A,5B keine zweite Membran 33' und keinen zweiten Agitationsraum 30' auf. Die beiden individuellen Auslasse 13A,13B münden in diese Auslassleitung 13, wobei eine Mündung nahe dem Ende und die andere Mündung irgendwo in einem Mittenbereich der Auslassleitung 13 liegt. Die Agitation in den Hybridisierkammern 5A,5B wird über eine gemeinsame Agitationsleitung 35 betrieben. FIG. 8 shows a schematic view of a particular, second arrangement of alid 26 with twohybridization chambers 5A, 5B, seen from below. Like the in FIG. 7 In the embodiment shown here, thecover 26 has anoutlet duct 13 with the enlarged diameter, whereby the space for a gas cushion serving as a spring element is provided. In this case, the provided cavity is sufficient to guarantee the effect as a spring element, therefore, bothhybridization chambers 5A, 5B lying behind one another have no second membrane 33 'and no second agitation space 30'. The twoindividual outlets 13A, 13B open into thisoutlet duct 13, one mouth near the end and the other mouth lying somewhere in a central region of theoutlet duct 13. The agitation in theHybridisierkammern 5A, 5B is operated via acommon Agitationsleitung 35.

Alternativ kann auch je eine individuelle Agitationsleitung zu den Agitationskammern 30 der beiden Hybridisierkammern 5A,5B führen (nicht gezeigt). In diesem alternativen Falle könnte sich die Druckleitung 35 innerhalb des Deckels verzweigen, so dass nur ein gemeinsamer Anschluss für die individuellen Druckleitungen auf der gemeinsamen Anschlussebene 57 des Deckels 26 notwendig wäre. Es könnte aber auch vorgesehen sein, die beiden Hybridisierkammern 5A,5B mit je einer individuellen und unabhängigen Agitationseinrichtung 32 zu versehen. Dies wäre mit einer zusätzlichen Druckleitung 42' und Druckverteilleitung 39' sowie mit einer, pro Hybridisierkammer 5A,5B über einen zusätzlichen Anschluss in der gemeinsamen Anschlussebene 57 des Deckels 26 befüllbaren, individuellen Agitationsleitung 35' zu bewerkstelligen (nicht gezeigt).Alternatively, an individual agitation line may each lead to theagitation chambers 30 of the twohybridization chambers 5A, 5B (not shown). In this alternative case, thepressure line 35 could branch within the lid, so that only one common connection for the individual pressure lines on thecommon connection plane 57 of thecover 26 would be necessary. However, it could also be provided to provide the twohybridization chambers 5A, 5B each with an individual andindependent agitation device 32. This would be accomplished with an additional pressure line 42 'and pressure distribution line 39' and with an individual agitation line 35 'which can be filled perhybridization chamber 5A, 5B via an additional connection in thecommon connection plane 57 of the cover 26 (not shown).

Sinngemäss könnten auch mehr als zwei, z.B. drei Hybridisierkammern 5 pro Deckel 26 angeordnet werden. Die Anzahl der Hybridisierkammern 5 pro Deckel 26 ist lediglich durch die Praktikabilität der Anordnung der dazu notwendigen Zu- und Ableitungen, Dichtungen und Agitationsvorrichtungen limitiert. Dabei kann wahlweise ein einziger Objektträger 27 mehrere vorzugsweise mit einem Nukleotidarray versehene Bereiche aufweisen, so dass mit einem unterteilten Deckel 26 (vgl. z.B.Fig. 8) mehrere Hybridisierkammern 5 pro Deckel 26 und Objektträger 27 betrieben werden können. Es können aber auch kleinere Objektträger 27' vorgesehen sein, welche im wesentlichen gerade eine einzelne, kleinere Hybridisierkammer 5 definieren, so dass die mehrere Hybridisierkammern 5 pro Deckel 26, jedoch auf mehreren Objektträgern 27 betrieben werden können.Analogously, more than two, for example, threehybridization chambers 5 percover 26 could be arranged. The number ofHybridisierkammern 5 percover 26 is limited only by the practicality of the arrangement of the necessary supply and discharge lines, seals and Agitationsvorrichtungen. Optionally, asingle slide 27 may have a plurality of regions preferably provided with a nucleotide array, so that with a divided cover 26 (cf. Fig. 8 )several hybridization chambers 5 percover 26 and slide 27 can be operated. However, smaller slides 27 'may also be provided which essentially define just a single,smaller hybridization chamber 5 so that the plurality ofhybridization chambers 5 percover 26, but on a plurality ofslides 27, can be operated.

Claims (8)

Translated fromGerman

Verfahren zum Verhindern von Luftblasen in einer im wesentlichen spaltförmigen Hybridisierkammer (5) eines Systems (1) zum Hybridisieren von auf Objektträgern (27) immobilisierten Nukleinsäureproben, Proteinen oder Gewebeschnitten, wobei das Verfahren umfasst:(a) das Bereitstellen einer im Wesentlichen spaltförmigen Hybridisierkammer (5) zwischen einem Objektträger (27) und einem Deckel (26), wobei der Deckel (26) derart gegenüber dem Objektträger (27) angeordnet wird, dass die Hybridisierkammer (5) gegenüber der Umgebungsluft abgedichtet ist; und(b) das im wesentlichen Füllen der gemäss Schritt (a) bereitgestellten Hybridisierkammer (5) mit einer Flüssigkeit;dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zudem umfasst:(c) das Ausbilden eines Kammer-Drucks in der Hybridisierkammer (5) mit einer Druckeinrichtung dieses Systems (1); und(d) das Aufrechterhalten dieses Kammer-Drucks während eines Hybridisiervorgangs auf einem Wert, der mindestens 100 mbar über dem in der Umgebungsluft herrschenden, normalen atmosphärischen Druck liegt.A method of preventing air bubbles in a substantially slit hybridization chamber (5) of a system (1) for hybridizing nucleic acid samples, proteins or tissue slices immobilized on slides (27), the method comprising: (a) providing a substantially gap-shaped hybridization chamber (5) between a slide (27) and a lid (26), wherein the lid (26) is arranged opposite the slide (27) such that the hybridization chamber (5) is opposite to the Ambient air is sealed; and (b) substantially filling the hybridization chamber (5) provided according to step (a) with a liquid;characterized in that the method further comprises: (c) forming a chamber pressure in the hybridization chamber (5) with a pressure device of that system (1); and (d) maintaining that chamber pressure during a hybridization operation at a value at least 100 mbar above the normal atmospheric pressure prevailing in the ambient air.Verfahren gemäss Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet, dass ein Kammer-Druck erzeugt und aufrechterhalten wird, der um 0.1 bar bis maximal um 1.4 bar höher ist als der in der Umgebungsluft herrschende, normale atmosphärische Druck.A method according to claim 1,characterized in that a chamber pressure is generated and maintained, which is by 0.1 bar to a maximum of 1.4 bar higher than the prevailing in the ambient air, normal atmospheric pressure.Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2,dadurch gekennzeichnet, dass der Kammer-Druck mittels einer Flüssigkeit oder mittels eines Gases erzeugt wird.A method according to claim 1 or 2,characterized in that the chamber pressure is generated by means of a liquid or by means of a gas.Verfahren gemäss Anspruch 3,dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit zum Erzeugen des Kammer-Drucks ein von einer Förderpumpe (8) in eine Verteilleitung (10) und über Einlassventile (12) gegen die Flüssigkeit in der Hybridisierkammer (5) gedrücktes Hybridisiermedium ist.A method according to claim 3,characterized in that the liquid for generating the chamber pressure is one of a feed pump (8) in a distribution line (10) and via inlet valves (12) against the liquid in the Hybridisierkammer (5) pressed Hybridisiermedium.Verfahren gemäss Anspruch 3,dadurch gekennzeichnet, dass das Gas zum Erzeugen des Kammer-Drucks von einer Förderpumpe (8) über ein Belüftungsventil (9) angesogene Luft oder ein in einem Behälter (3) gespeichertes Inertgas ist, wobei dieses Gas über eine Verteilleitung (10) und über Einlassventile (11) gegen die Flüssigkeit in der Hybridisierkammer (5) gedrückt wird.A method according to claim 3,characterized in that the gas for generating the chamber pressure from a feed pump (8) via a vent valve (9) sucked air or in a container (3) stored inert gas, said gas via a distribution line ( 10) and is pressed via inlet valves (11) against the liquid in the hybridization chamber (5).Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2,dadurch gekennzeichnet, dass es zudem umfasst:(e) ein stossweises Aufbauen eines Agitationsdrucks in einem Druckraum (34), wobei der Agitationsdruck um 0.5 bis 1 bar höher ist als der Kammerdruck, wobei dieser Druckraum (34) im Deckel (26) angeordnet ist und durch eine Membran (33) von einem Agitationsraum (30) getrennt ist, und wobei der Agitationsraum (30) über eine Agitationsleitung (36) mit der Hybridisierkammer (5) verbunden ist.Process according to claim 1 or 2,characterized in that it additionally comprises: (E) a jerky build up of a Agitationsdrucks in a pressure chamber (34), wherein the agitation pressure by 0.5 to 1 bar is higher than the chamber pressure, said pressure chamber (34) in the lid (26) is arranged and by a membrane (33) of an agitation space (30) is separated, and wherein the agitation space (30) via an agitation line (36) with the hybridization chamber (5) is connected.Verfahren gemäss Anspruch 6,dadurch gekennzeichnet, dass es zudem umfasst:(f) ein federndes Entgegenwirken von durch die Agitationseinrichtung (32) auf den Druckraum (34) ausgeübten Agitationsdruckunterschieden mit einem Federelement, das mit dem für die Hybridisierung verwendeten Flüssigkeitsvolumen in Verbindung steht, und das als zweite, im Deckel (26) angeordnete Membran (33') oder als ein mit einem Gas gefülltes Volumen einer Sammelleitung (15) oder einer Auslassleitung (13) ausgebildet ist.A method according to claim 6,characterized in that it further comprises: (f) a resilient counteraction of agitation pressure differences exerted by the agitation device (32) on the pressure chamber (34) with a spring element which communicates with the volume of liquid used for the hybridization, and as a second membrane (26) arranged in the cover (26). 33 ') or as a gas-filled volume of a manifold (15) or an outlet conduit (13) is formed.Verfahren gemäss Anspruch 7,dadurch gekennzeichnet, dass der Kammerdruck unabhängig von den Agitationsdruckunterschieden um 0.1 bar bis maximal um 1.4 bar über dem in der Umgebungsluft herrschenden, normalen atmosphärischen Druck gehalten wird.A method according to claim 7,characterized in that the chamber pressure is kept independent of the Agitationsdruckunterschiedenes by 0.1 bar to a maximum of 1.4 bar above the prevailing in the ambient air, normal atmospheric pressure.

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