VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUR DETEKTION VON MOLEKÜLEN MITTELS IMPEDANZSPEKTROSKOPIE METHOD AND DEVICE FOR DETECTING MOLECULES BY MEANS OF IMPEDANCE SPECTROSCOPY
Beschreibungdescription
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Detektion von Molekülen mittels Impedanzmessung und eine Vorrichtung zur Durchführung solcher Verfahren.The invention relates to a new method for the detection of molecules by means of impedance measurement and a device for carrying out such methods.
Die Möglichkeit der Detektion einer oder mehrerer unterschiedlicher immobilisierter Molekülstrukturen ist ein essentieller Bestandteil vieler biochemischer Untersuchungen. Typischerweise werden die Molekülstrukturen aus Liganden gebildet, die durch spezifische Rezeptoren erkannt werden, wie Antikörper, Antigene, Enzyme, Enzyminhibitoren und -aktivatoren, Proteine, Nukleinsäuren,The possibility of detecting one or more different immobilized molecular structures is an essential part of many biochemical studies. The molecular structures are typically formed from ligands which are recognized by specific receptors, such as antibodies, antigens, enzymes, enzyme inhibitors and activators, proteins, nucleic acids,
Hormone, Agonisten und Antagonisten für Zellmembranrezeptoren, Oligosaccharide, Lectine, Toxine, Pathogene, Bakterien, monoklonale Antikörper etc.. Die Erkennung der Präsens solcher Moleküistrukturen ist insbesondere in der Wirkstoffentwicklung der pharmazeutischen Industrie, der Therapieverfolgung bei medizinischer Behandlung, der medizinischen Diagnostik aber auch in den Agrarwissenschaften und der Forensik von Bedeutung.Hormones, agonists and antagonists for cell membrane receptors, oligosaccharides, lectins, toxins, pathogens, bacteria, monoclonal antibodies etc. The detection of the presence of such molecular structures is particularly in drug development in the pharmaceutical industry, therapy tracking in medical treatment, medical diagnostics, but also in agricultural sciences and forensics.
Zum Zwecke der Detektion sind eine ganze Reihe von Verfahren entwickelt worden, wie Autoradiographie, Massenspektrometrie oder optische Auslesung z. B. mittels Fluoreszenzspektroskopie.For the purpose of detection, a whole series of methods have been developed, such as autoradiography, mass spectrometry or optical readout, e.g. B. by means of fluorescence spectroscopy.
Die Nachteile dieser Verfahren sind vielfältig. Die meisten bedürfen einer radioaktiven oder fluoreszierenden Markierung der Moleküle, andere, wie die Massenspektrometrie sind apparativ aufwendig und schwierig zu miniaturisieren.The disadvantages of these methods are numerous. Most of them require radioactive or fluorescent labeling of the molecules, others, such as mass spectrometry, are complex in terms of equipment and difficult to miniaturize.
Aus diesem Grunde wird in zunehmendem Maße daran gearbeitet, elektrische oder elektrochemische Verfahren zur die Detektion von Molekülstrukturen zu nutzen. Beispiele für solche Verfahren und Vorrichtungen sind z. B. offenbart in WO 88/09499, EP 0543550, US 5653939, WO 97/21094 und WO 97/34140. Bei den dort beschriebenen Verfahren werden die zu detektierenden Moleküle inFor this reason, work is increasingly being carried out on using electrical or electrochemical methods for the detection of molecular structures. Examples of such methods and devices are e.g. B. disclosed in WO 88/09499, EP 0543550, US 5653939, WO 97/21094 and WO 97/34140. In the methods described there, the molecules to be detected are in
Form einer dünnen Lage entweder direkt auf dem mit Elektroden bestücktenForm a thin layer either directly on the one equipped with electrodes
Meßchip oder auf einer dafür vorgesehenen Schicht auf dem Chip immobilisiert.Measuring chip or immobilized on a designated layer on the chip.
Bislang konnte noch keines dieser Verfahren in größerem Umfang demonstriert werden.So far, none of these processes has been demonstrated on a large scale.
In US 4787963 und WO 96/01836 wird ein Verfahren vorgestellt, wie die Immobilisierung der Moleküle elektrisch gesteuert und beschleunigt werden kann.In US 4787963 and WO 96/01836 a method is presented how the immobilization of the molecules can be electrically controlled and accelerated.
Ein Nachteil der bislang vorgestellten elektrischen Detektionsverfahren ist, daß dieA disadvantage of the electrical detection methods presented so far is that
Immobilisierung auf eine sehr dünne, in der Regel monomolekulare Schicht beschränkt ist, daraus resultiert eine relativ geringe räumliche Dichte der zur Meßsignaländerung beitragenden immobilisierten Moleküle und Unempfindlichkeit der Messung bei hohem Hintergrundpegel. Hier konnte bislang nur durch einen Verstärkungseffekt aufgrund einer katalytisch wirksamen Markierung wie in WO 97/34140 beschrieben ein gutes Signal/Rausch Verhältnis erreicht werden.Immobilization is limited to a very thin, usually monomolecular layer, which results in a relatively low spatial density of the immobilized molecules contributing to the measurement signal change and insensitivity of the measurement at a high background level. So far, a good signal-to-noise ratio could only be achieved by an amplification effect due to a catalytically effective marking as described in WO 97/34140.
Weitere Nachteile der bislang vorgestellten Verfahren sind mit der Anbindung von Fängermolekülen auf eine bereits auf einem mit Elektroden versehenen Träger aufgebrachte Anbindungsschicht (diese Schicht kann auch die Elektrode selbst sein) verknüpft. So erfordert die Anbindung aufgrund der vorgegebenen, sehr kleinen Elektrodenpositionen eine hohe absolute Genauigkeit bei der Dispensierpositionierung .Further disadvantages of the methods presented so far are linked to the attachment of capture molecules to an attachment layer which has already been applied to a support provided with electrodes (this layer can also be the electrode itself). The connection, due to the specified, very small electrode positions, requires a high absolute accuracy in dispensing positioning.
Aufgabe der Erfindung ist es ein Verfahren zur elektrischen Detektion von Molekülen zur Verfügung zu stellen, das gegenüber dem Stand der Technik ein verbessertes Signal/Rausch-Verhältnis und damit eine erhöhte Effizienz besitzt.The object of the invention is to provide a method for the electrical detection of molecules which has an improved signal / noise ratio and thus an increased efficiency compared to the prior art.
Die Aufgabe wird durch die Nutzung eines dreidimensionalen, aus elektrisch nicht leitfähigem Material bestehenden porösen Trägers gelöst, in dem Fängermoleküle fixiert sein können. Der Träger wird dann einer gegebenenfalls zu detektierende Moleküle oder Molekülkomplexe enthaltenden Lösung ausgesetzt. Die Beladung des Trägers mit Molekülen oder Molekülkomplexen kann anschließend mit Hilfe von Impedanzmessungen bestimmt werden. Die elektrische Auslesung erfolgt durch gegeneinander geschaltete Elektroden, zwischen denen eine Wechselspannung unterschiedlicher Frequenz angelegt wird. Die Frequenz der Wechsel Spannung sowie die Stärke der angelegten Wechselspannung sind frei wählbar . Der typische Frequenzbereich reicht dabei vonThe object is achieved by using a three-dimensional, porous carrier made of electrically non-conductive material, in which the catcher molecules can be fixed. The carrier is then exposed to a solution which may contain molecules or molecular complexes to be detected. The loading of the carrier with molecules or molecular complexes can then be determined with the aid of impedance measurements. The electrical reading is carried out by electrodes connected to each other, between which an alternating voltage of different frequency is applied. The frequency of the AC voltage and the strength of the AC voltage applied are freely selectable. The typical frequency range ranges from
0,1 Hz bis 20 MHz, bevorzugt ist ein Bereich von 100 Hz bis 5 MHz. Der typische Spannungsbereich reicht von 0, 1 mV bis zu 10 V, bevorzugt ist hier 1 bis 100 mV. Ebenso frei wählbar ist die geometrische Anordnung und Größe der Elektroden, durch die auch die Wahl der vorteilhaftesten Frequenz und Spannung gesteuert werden kann. Vorteilhaft ist ein schichtförmiger Aufbau aus zwei Lagen kreisförmiger0.1 Hz to 20 MHz, a range from 100 Hz to 5 MHz is preferred. The typical voltage range extends from 0.1 mV to 10 V, preferably 1 to 100 mV. The geometric arrangement and size of the electrodes can also be freely selected, by means of which the choice of the most advantageous frequency and voltage can also be controlled. A layered structure consisting of two layers of circular shape is advantageous
Elektroden zwischen die der beladene Träger eingeführt wird. Die Elektrodenlagen werden so justiert das sich ein weitgehend homogenes Feld zwischen den einzelnen gegenüberliegenden Elektroden ausbilden kann. Die gegeneinander schaltbaren Elektroden können aber auch koplanar in einer Ebene liegen. Sie können z. B. streifenförmig, kreisförmig oder auch konzentrisch angeordnet sein. Insbesondere regelmäßig-matrixförmige Anordnungen der einzelnen Elektroden haben sich bewährt. Je nach Problemstellung kann allerdings eine speziell angepaßte geometrische Anordnung der Elektroden vorgenommen werden. Bevorzugt sollte der Durchmesser oder die in Richtung der benachbarten bzw. als Gegenelektrode verwendeten Elektrode zeigende Kantenlänge L der Elektroden ungefähr demElectrodes between which the loaded carrier is inserted. The electrode positions are adjusted in such a way that a largely homogeneous field can form between the individual opposite electrodes. The electrodes that can be switched against each other can also be coplanar in one plane. You can e.g. B. be arranged in strips, circular or concentric. In particular, regular matrix arrangements of the individual electrodes have proven successful. Depending on the problem, however, a specially adapted geometric arrangement of the electrodes can be carried out. Preferably, the diameter or the edge length L of the electrodes pointing in the direction of the adjacent electrode or used as counterelectrode should be approximately that
Abstand zwischen den Elektroden entsprechen. Die optimale Dicke des Trägers beträgt dann 2L bis 4L. Eine solche Geometrie gewährleistet eine sehr gute Durchdringung des Trägervolumens mit dem angelegten Wechselfeld.Distance between the electrodes. The optimal thickness of the carrier is then 2L to 4L. Such a geometry ensures a very good penetration of the carrier volume with the alternating field created.
Durch die Verwendung eines Trägers in Verbindung mit der Verwendung derBy using a carrier in conjunction with the use of the
Impedanzspektroskopie werden vielfältige, bisher ungelöste Probleme beseitigt. Eine direkte Anbindung der Fänger- bzw. Zielstrukturen an den Elektroden ist nicht mehr nötig. Die einzelnen porösen Träger besitzen eine große Oberfläche, so daß eine hohe Anreicherung von zu detektierenden Molekülen im Träger erreicht wird. Zusätzlich gewährleistet der Träger eine optimale Raumausnutzung über und/oder zwischen den Elektroden. Dadurch steigt die Sensitivität der Messung und das Signal/Rausch-Verhältnis wird erhöht. Mit Steigerung der Sensitivität der Messung wird auch eine quantitative Bestimmung der Trägerbeladung mit den zu detektierenden Molekülen und Molekülkomplexen möglich, was impedometrische Meßverfahren aus dem Stand der Technik nicht erlauben. Zusätzlich ermöglicht derImpedance spectroscopy eliminates a variety of previously unsolved problems. A direct connection of the catcher or target structures to the electrodes is no longer necessary. The individual porous supports have a large surface area, so that a high concentration of molecules to be detected is achieved in the support. In addition, the carrier ensures optimal use of space above and / or between the electrodes. This increases the sensitivity of the measurement and increases the signal / noise ratio. With an increase in the sensitivity of the measurement, a quantitative determination of the carrier loading with the molecules and molecular complexes to be detected is also possible, which is impedometric Do not allow measuring methods from the prior art. In addition, the
Einsatz eines Trägers die räumliche Trennung des Beladungsprozesses vomUse of a carrier the spatial separation of the loading process from the
Messvorgang. Wasch- und Trocknungsschritte können ebenfalls einfach außerhalb der Messvorrichtung durchgeführt werden. Somit werden herkömmliche Medien wie Gele und Membranen direkt für die Impedanzmessungen zugänglich. Es können folglich auch Reaktionsmedien verwendet werden, die in direktem Kontakt mit denMeasurement. Washing and drying steps can also be carried out simply outside the measuring device. This means that conventional media such as gels and membranes are directly accessible for impedance measurements. Consequently, reaction media can also be used which are in direct contact with the
Elektroden ungewünschte Wechselwirkungen eingehen würden.Electrodes would enter undesired interactions.
Als Träger kommen alle dreidimensionalen aus elektrisch nicht leitfähigen Materialien bestehenden porösen Stoffe in Frage. Die Permeabilität muß dieAll three-dimensional porous materials made of electrically non-conductive materials can be used as supports. The permeability must
Beladung des Trägers mit Fängermolekülen oder direkt mit den zu detektierenden Molekülen oder mit Fänger-/Zielstruktur-Komplexen erlauben. Die Beladung kann ebenfalls durch eine Vorabbestückung des Trägers mit Fängermolekülen erfolgen, wobei dann die anschließende Zugänglichkeit der zu detektierenden Moleküle oder Molekülkomplexen zu den trägerfixierten Fängermolekülen gewährleistet sein muß.Allow the carrier to be loaded with capture molecules or directly with the molecules to be detected or with capture / target structure complexes. The loading can also be carried out by pre-loading the carrier with capture molecules, in which case the subsequent accessibility of the molecules or molecular complexes to be detected to the carrier-fixed capture molecules must be ensured.
Bevorzugt liegen die Porengrößen des Trägers im Bereich zwischen 50 nm und 500 nm. Über die Porengröße können der Beladungsgrad und die Homogenität der Beladung eingestellt werden. Der Träger muß darüber hinaus die Fängermoleküle fixieren können. Dies kann z. B. über kovalente Bindungen aber auch über zwischenmolekulare Wechselwirkungen, wie der Absorption und Adsorption, erfolgen. Bevorzugt ist eine Ausführung, in der die Fängermoleküle z.B. durch Temperierung oder UV-Behandlung der Membran immobilisiert werden und die zu detektierenden Moleküle oder Molekülkomplexe danach spezifisch an die passenden Fängermoleküle gebunden werden .The pore sizes of the support are preferably in the range between 50 nm and 500 nm. The degree of loading and the homogeneity of the loading can be adjusted via the pore size. The carrier must also be able to fix the capture molecules. This can e.g. B. on covalent bonds but also on intermolecular interactions, such as absorption and adsorption. An embodiment is preferred in which the capture molecules e.g. are immobilized by temperature control or UV treatment of the membrane and the molecules or molecular complexes to be detected are then specifically bound to the appropriate capture molecules.
Als Trägermateriaiien kommen z. B. Polymere, Fasern, Membranen, Gele oder chromatographische Trennmaterialien in Frage. So können z. B. Biopolymere, wie Cellulose, Dextran oder Agarose, synthetische Polymere, wie Polyamide, Methacryiate Polyvinylbenzol oder Polystyrol, anorganische Polymere, wie unsubstituierte oder alkylierte Kieselsäure, Membranen, wie PolyvinylidenfluoridAs carrier materials such. B. polymers, fibers, membranes, gels or chromatographic separation materials in question. So z. B. biopolymers such as cellulose, dextran or agarose, synthetic polymers such as polyamides, methacrylates, polyvinylbenzene or polystyrene, inorganic polymers such as unsubstituted or alkylated silica, membranes such as polyvinylidene fluoride
(PVDF)-, Polypropylen-, Nylon-, Nitrocellulose- oder Celluloseacetatmembranen, Gele, wie Agarose- oder Polyacrylamidgele als Träger eingesetzt werden. Gegebenenfalls können die Trägermaterialien durch entsprechende Substitutionen funktionalisiert sein, um eine Anbindung von Molekülen zu ermöglichen oder zu unterstützen.(PVDF), polypropylene, nylon, nitrocellulose or cellulose acetate membranes, gels such as agarose or polyacrylamide gels can be used as carriers. If necessary, the carrier materials can be replaced by appropriate substitutions be functionalized to enable or support the attachment of molecules.
Die Beladung des Trägers kann auch direkt mit den zu detektierenden Molekülen oder Molekülkomplexen erfolgen. Dazu kann auf herkömmliche chromatographische oder elektrophoretische Techniken eventuell in Verbindung mit Blotverfahren zurückgegriffen werden.The carrier can also be loaded directly with the molecules or molecular complexes to be detected. Conventional chromatographic or electrophoretic techniques may be used in connection with blot methods.
So kann z. B. die Beladung eines Polyacrylamidgelträgers unter gleichzeitiger Auftrennung einer Proteine enthaltenden Lösung aus 0,1 % SDS in Tris-HCI/Tris-So z. B. loading a polyacrylamide gel carrier with simultaneous separation of a protein-containing solution from 0.1% SDS in Tris-HCl / Tris
Glycin-Puffersystemen mittels herkömmlicher Gelelektrophorese erfolgen. Die Auftrennung erfolgt dabei anhand der Größe der denaturierten Peptidketten. Ebenso ist die Verwendung von 2D-Elektrophoresegelen als Träger möglich. Die Beladung und der erste Trennungschritt erfolgen üblicherweise durch isoelektrische Fokussierung unter nicht denaturierenden Bedingungen anhand eines immobilisierten pH-Gradienten zwischen pH 3 und pH 10. Als zweiter Trennungsschritt kann dann eine SDS-Polyacralamid-Gelelektrophorese angeschlossen werden.Glycine buffer systems are carried out using conventional gel electrophoresis. The separation is based on the size of the denatured peptide chains. It is also possible to use 2D electrophoresis gels as supports. The loading and the first separation step are usually carried out by isoelectric focusing under non-denaturing conditions using an immobilized pH gradient between pH 3 and pH 10. SDS polyacralamide gel electrophoresis can then be connected as a second separation step.
Analog kann auch die Beladung von Trägern mit Nukleinsäuren erfolgen. So können zum Beispiel DNA-Fragmente auf ein Agarosegel (in der Regel 1 - 3%ig) elektrophoretisch aufgebracht und getrennt werden. Als Puffer werden z. B. Tris- Acetat- oder Tris-Borat-Puffer eingesetzt.The loading of carriers with nucleic acids can also be carried out analogously. For example, DNA fragments can be electrophoretically applied to an agarose gel (usually 1-3%) and separated. As a buffer z. B. Tris acetate or Tris borate buffer used.
Ebenso kann über einen elektrophoretischen Shift-Assay die Beladung einesAn electrophoretic shift assay can also be used to load a
Trägers mit DNA-Protein-Komplexen erfolgen. Als Träger werden in diesem Fall bevorzugt Polyacrylamidgele verwendet.Carrier with DNA-protein complexes. In this case, polyacrylamide gels are preferably used as carriers.
Die pufferhaltigen Gele können direkt über einer Elektrodenschicht mittels Impedanzmessung elektrisch ausgelesen werden. Es besteht aber auch dieThe buffer-containing gels can be read out electrically over an electrode layer by means of impedance measurement. But there is also
Möglichkeit über Blotverfahren, bevorzugt durch Elektroblotting, die Proteine oder Nukleinsäurefragmente auf eine geeignete Membran, aufzubringen und den Puffer auszuwaschen. Bei der Membranbeladung mit Proteinen werden bevorzugt Polyvinylidenfluorid (PVDF)- oder Polypropyienmembranen, bei der Beladung mitPossibility of applying the proteins or nucleic acid fragments to a suitable membrane using blot processes, preferably by electroblotting, and washing out the buffer. When membrane loading with proteins are preferred Polyvinylidene fluoride (PVDF) or polypropylene membranes, when loaded with
Nukleinsäuren Nitrocellulose- oder Nylonmembranen verwendet.Nucleic acid nitrocellulose or nylon membranes used.
Vorteilhaft ist bei der impedometrischen Auslesung der Elektrophoresegele oder der Blotmembranen, daß keine Markierung der Proteine oder Nukleinsäurefragmente mehr nötig ist. Die Detektion erfolgt direkt über einer Elektrodenmatrix. Darüber hinaus ist die Impedanzmessung sehr empfindlich, es können noch sehr geringe Molekülkonzentrationen im Gel nachgewiesen werden. Probleme können allerdings aufgrund von Inhomogenitäten im Gel selbst oder im Puffer hervorgerufen werden. Solche Inhomgenitäten können durch nachgeschaltete Blotverfahren ausgeräumt werden.It is advantageous in the impedometric reading of the electrophoresis gels or the blot membranes that the proteins or nucleic acid fragments no longer have to be labeled. The detection takes place directly over an electrode matrix. In addition, the impedance measurement is very sensitive, very low molecular concentrations can still be detected in the gel. However, problems can be caused by inhomogeneities in the gel itself or in the buffer. Such inhomogeneities can be eliminated by subsequent blot processes.
Ein Vorteil der unspezifischen Beladung von Gelen un d Membranen ist, daß ein breites Spektrum von zu detektierenden Molekülen oder Molekülkomplexen untersucht werden kann, und zwar ohne einen spezifischen Bindungspartner kennen zu müssen bzw. auf einem Träger immobilisieren zu müssen.An advantage of the unspecific loading of gels and membranes is that a wide spectrum of molecules or molecular complexes to be detected can be examined, without having to know a specific binding partner or having to immobilize them on a support.
Neben der unspezifischen Beladung von Gelen und Membranen durch herkömmliche elektrophoretische und chromatographische Trennverfahren, gegebenenfalls mit anschließendem Blotvorgang, kann auch eine zielgerichteteIn addition to the non-specific loading of gels and membranes by conventional electrophoretic and chromatographic separation processes, possibly with a subsequent blotting process, a targeted one can also be used
Beladung des Trägers stattfinden. Dazu werden Fängermoleküle selektiv im Träger fixiert. Die Aufbringung von Fängermolekülen erfolgt z. B. mit Hilfe eines Dispensers, bevorzugt lateral strukturiert und in der Tiefe homogen . Die Durchdringung des Gels oder der Membran mit den Fängermolekülen kann durch Anlegen von Druckdifferenzen (Saugen mit Vakuum) oder mittels elektrischer Felder unterstützt und beschleunigt werden.Carrier loading take place. For this purpose, catcher molecules are selectively fixed in the carrier. Catcher molecules are applied e.g. B. with the help of a dispenser, preferably laterally structured and homogeneous in depth. The penetration of the gel or membrane with the capture molecules can be supported and accelerated by applying pressure differences (vacuuming) or by means of electrical fields.
Der so behandelte Träger kann dann der gegebenenfalls zu detektierende Zielstrukturen enthaltenden Reaktionslösung ausgesetzt werden. Danach wird der Träger durch Waschen von nicht spezifisch gebundenen Substanzen befreit, es bleiben nur die an den Fängermolekülen gebundenen Substanzen zurück.The carrier treated in this way can then be exposed to the reaction solution which may contain target structures to be detected. The carrier is then freed of non-specifically bound substances by washing, only the substances bound to the catcher molecules remain.
Die Beladung des Fängermoleküle enthaltenden Trägers kann darüber hinaus direkt auf der Elektrodenlage erfolgen. Durch eine elektrische Feldbehandlung ist dieser Prozeß beschleunigbar. Der beladene dreidimensionale poröse Träger wird dazu in einer geeigneten Pufferlösung getränkt (wie z.B. beschrieben in Nucleic AcidsThe carrier containing carrier molecules can also be loaded directly on the electrode layer. This is due to an electrical field treatment Process can be accelerated. For this purpose, the loaded three-dimensional porous carrier is soaked in a suitable buffer solution (as described, for example, in Nucleic Acids
Research, 1997, 25, (24), p. 4908), die die zu detektierenden Moleküle oderResearch, 1997, 25, (24), p. 4908), which are the molecules to be detected or
Molekülkomplexe enthält. Gleichzeitig oder nach der Tränkung mit der Pufferlösung wird der Träger in direkten oder indirekten Kontakt mit einer Elektrodenmatrix gebracht. Die selektiv mit Fängermolekülen beladenen Stellen des Netzwerks können dann über den Elektroden positioniert werden.Contains molecular complexes. At the same time or after the impregnation with the buffer solution, the support is brought into direct or indirect contact with an electrode matrix. The points of the network that are selectively loaded with capture molecules can then be positioned over the electrodes.
Geladene Zielstrukturen, wie im Falle von Nukleinsäurefragmenten, die eine negative Ladung tragen, können durch Anlegen eines elektrischen Feldes im Träger aufkonzentriert werden. Die nötige Zeit zur Beladung des Trägers wird so über eine stark beschleunigte Fänger-/Zielmoiekül-Erkennung verkürzt. In der Folge kann durch geeignetes Umpolen des Feldes eine Stringenzbehandlung erfolgen (wie z. B. beschrieben in Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94, 1119-1123, Feb. 1997). Nach Austausch der Pufferlösung kann dann die impedometrische Detektion erfolgen.Charged target structures, such as in the case of nucleic acid fragments that carry a negative charge, can be concentrated in the carrier by applying an electric field. The time required to load the carrier is thus reduced by means of a greatly accelerated catcher / target molecule detection. As a result, stringency treatment can be carried out by appropriately reversing the polarity of the field (as described, for example, in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 1119-1123, Feb. 1997). After changing the buffer solution, the impedometric detection can then be carried out.
Als Fängermoleküle können Verbindungen eingesetzt werden, die stabile Bindungen mit ihren Zielstrukturen eingehen. Besonders bevorzugt sind dabei spezifische wirkende Fängermoleküle, wie z. B. mono- oder polyklonale Antikörper, Antigene, Enzyme, Coenzyme, Enzyminhibitoren, Enzymaktivatoren, Liganden, Rezeptoren und deren korrespondierenden Agonisten und Antagonisten, Hormone, Hormonrezeptoren, Oligonukleotide, Nukleinsäuren, Nukleinsäure bindende Proteine und Peptide oder auch synthetische Paarungssysteme, wie PNA, p-RNA, p-DNA oder CNA. Aber auch unspezifisch wirkende Fängermoleküle, wie z. B. Lectine, Oligosaccharide sind verwendbar. Unter dem Begriff Zielstruktur fallen dabei alle spezifisch an die Fängermoleküle bindenden Substanzen, wie Moleküle oder Molekülkomplexe.Compounds which form stable bonds with their target structures can be used as capture molecules. Specifically acting capture molecules, such as, for. B. mono- or polyclonal antibodies, antigens, enzymes, coenzymes, enzyme inhibitors, enzyme activators, ligands, receptors and their corresponding agonists and antagonists, hormones, hormone receptors, oligonucleotides, nucleic acids, nucleic acid binding proteins and peptides or synthetic pairing systems, such as PNA, p -RNA, p-DNA or CNA. But also non-specific acting capture molecules, such as. B. lectins, oligosaccharides can be used. The term target structure includes all substances that bind specifically to the capture molecules, such as molecules or molecular complexes.
Über die sehr spezifisch wirkende Fängermolekül/Zielstrukturerkennung, wie z. B. bei einer Antigen-Antikörper-Reaktion oder einer Ligand-Rezeptor-Reaktion können vorhandene Zielstrukturen selektiv auf dem Träger angereichert werden.About the very specific acting capture molecule / target structure recognition, such as B. in an antigen-antibody reaction or a ligand-receptor reaction, existing target structures can be selectively enriched on the support.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird an eine Membran, die keine unspezifischen Bindungen mit Proteinen oder Nukleinsäuren eingeht, wie z. B. bei Celluloseacetatmembranen, Streptavidin kovalent gebunden. Die Anbindung kann z.In a preferred embodiment, a membrane that does not form non-specific bonds with proteins or nucleic acids, such as. B. at Cellulose acetate membranes, streptavidin covalently bound. The connection can e.g.
B. mit Carbonsäuregruppen funktionalisiertem Trägermaterial erfolgen, an die dannB. with carboxylic acid functionalized carrier material to which then
Aminogruppen enthaltende Fänger, wie z. B. Streptavidin kovalent gekoppelt werden können. Danach werden mit einem Dispenser biotinylierte Antikörper irreversibel an der Membran befestigt. So können unterschiedliche Antikörper an einem definiertenCatchers containing amino groups, such as. B. streptavidin can be covalently coupled. Afterwards, biotinylated antibodies are irreversibly attached to the membrane with a dispenser. So different antibodies can on a defined
Ort auf der Membran aufgebracht werden. Die Auftragungsorte werden von derPlace on the membrane. The places of application are from the
Form der Elektrodenlage bestimmt. So wird bei Verwendung eines Elektrodenarrays eine entsprechend matrixförmige Beladung der Membran vorgenommen. Die so preparierte Membran kann dann einer Antigene enthaltenden Lösung ausgesetzt werden. Die inkubierte Membran wird dann mit einer physiologischen Pufferlösung gewaschen und so auf der Elektrodenmatrix gelegt, daß die Durchdringung der mitShape of the electrode position determined. When using an electrode array, the membrane is loaded in a corresponding matrix. The membrane thus prepared can then be exposed to a solution containing antigens. The incubated membrane is then washed with a physiological buffer solution and placed on the electrode matrix so that the penetration of the membrane
Antikörpern beladenen Membranorte bei der impedometrischen Messung mitAntibody-loaded membrane locations with the impedometric measurement
Feldlinien möglichst groß ist.Field lines is as large as possible.
In einer weiteren Ausführungsform werden Antikörper mit einem Dispenser auf eine mit geringen Mengen Celluloseacetat versetzten Nitrocellulosemembran aufgebracht. Durch das Celluloseacetat wird die Aufnahmekapazität der Membran bezüglich der unspezifisch bindenden Proteine und Nukleinsäuren herabgesetzt. Die verbleibende Aufnahmekapazität der Membran wird vollständig mit den entsprechenden Fängermolekülen, z. B. mit Antikörpern gesättigt, so daß keine weiteren unspezifischen Bindungen an der Membran möglich sind.In a further embodiment, antibodies are applied with a dispenser to a nitrocellulose membrane mixed with small amounts of cellulose acetate. The cellulose acetate reduces the absorption capacity of the membrane with regard to the non-specifically binding proteins and nucleic acids. The remaining absorption capacity of the membrane is completely filled with the corresponding capture molecules, e.g. B. saturated with antibodies, so that no further non-specific bonds to the membrane are possible.
Es ist darüber hinaus möglich, auch herkömmliche Nitrocellulosemembranen oder Nylonmembranen als Träger zu verwenden . Die nach der Beladung mit Fängermolekülen nicht besetzten Bindungsstellen der Membran werden anschließend mit einer den Wechselstrom widerstand kaum oder in bekannter Weise beeinflussenden Substanz blockiert. Geeignete Blocker sind z. B. Polyamine, wie Spermidin oder auch Nukleinsäure freie käufliche Hybridisierungspuffer. Die beim Blotten üblicherweise verwendeten Blocker, wie z. B. Rinderserumalbumin oder Nukleinsäurefragmente mit unspezifischen Sequenzen können hier nicht verwendet werden. Nach der Blockierung der Membran kann dann die Fänger-/Zielstruktur Reaktion durchgeführt werden. Dazu wird die Membran einer die zu detektierende Moleküle oder Molekülkomplexe enthaltende Lösung ausgesetzt und anschließend mit physiologischer Pufferlösung gewaschen. Als Messvorrichtung wird bevorzugt ein schichtförmig aufgebauter Chip verwendet, der zumindest aus einer Elektroden enthaltenden Lage und dem darauf und/oder darunter aufgebrachten Träger besteht. Der Chip kann neben den Elektroden- undIt is also possible to use conventional nitrocellulose membranes or nylon membranes as supports. The binding sites of the membrane which are not occupied after the capture molecules have been loaded are subsequently blocked with a substance which has little or no known influence on the alternating current. Suitable blockers are e.g. B. polyamines, such as spermidine or nucleic acid free commercially available hybridization buffer. The blockers commonly used in blotting, such as. B. bovine serum albumin or nucleic acid fragments with non-specific sequences cannot be used here. After the membrane has been blocked, the capture / target structure reaction can then be carried out. For this purpose, the membrane is exposed to a solution containing the molecules or molecular complexes to be detected and then washed with physiological buffer solution. A layered chip is preferably used as the measuring device, which chip consists at least of a layer containing electrodes and the carrier applied thereon and / or below. The chip can next to the electrode and
Trägerschichten noch weitere funktionelle Schichten beinhalten, wie z. B. Isolationsschichten, Permeationsschichten oder Schichten, die zur Anbindung vonBacking layers include other functional layers, such as. B. insulation layers, permeation layers or layers that connect to
Molekülen oder weiteren Schichten funktionalisiert wurden.Molecules or other layers have been functionalized.
Beispiel 1example 1
Dieses Beispiel zeigt die hohe und beständige Beladungsmöglichkeit von geeigneten Membranen.This example shows the high and constant loading possibility of suitable membranes.
Eine kommerziell erhältliche Nylon-Membran (Nytran SuPerCharge, Dicke 200 μm) wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden lang mit einer 250 μmolaren Lösung eines 20- mer Oligonukleotids in 50 mmolarem L-Histidin-Puffer inkubiert. Das verwendete Oligo war am 3'-Ende mit einer Am ingruppe und am 5'-Ende mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy3 modifiziert. Nach der Inkubation wurde die Membran1/A commercially available nylon membrane (Nytran SuPerCharge, thickness 200 μm) was incubated at room temperature for 3 hours with a 250 μmol solution of a 20-mer oligonucleotide in 50 mmolar L-histidine buffer. The oligo used was modified at the 3 'end with an amine group and at the 5' end with the fluorescent dye Cy3. After the incubation, the membrane was1 /
Stunde lang bei 80° getempert. Danach wurde die Membran gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen. Die anschließende Auswertung des optischen Fluoreszenzsignals erfolgt gegen eine Eichkurve, ermittelt aus der Differenz der Flureszenzemission in Lösung und dem Fluoreszenzabsorptionswert der Membran. Es wurde eine Beladungsdichte von mehr als 1 mM je Liter ermittelt. Die Dichte nimmt von außen her zur Mitte der Membran hin ab, in der Mitte auf etwa die Hälfte des Oberflächenwertes.Annealed at 80 ° for one hour. The membrane was then washed thoroughly with distilled water. The subsequent evaluation of the optical fluorescence signal is carried out against a calibration curve, determined from the difference between the fluorescence emission in solution and the fluorescence absorption value of the membrane. A loading density of more than 1 mM per liter was determined. The density decreases from the outside towards the middle of the membrane, in the middle to about half the surface value.
Im Vergleich dazu führt eine typisch erreichbare Belegungsdichte auf planaren Oberflächen von ca. 1 fMol / mm2 nur zu einer vergleichbaren, über die 200 μm dickeIn comparison, a typically achievable coverage density on planar surfaces of approx. 1 fMol / mm2 only leads to a comparable one, over 200 μm thick
Membran verteilte Dichte von ca. 1 μMol je Liter.Membrane distributed density of approx. 1 μmol per liter.
Beispiel 2Example 2
Eine auf ein Glassubstrat fest aufgebrachte Nylon-Membran (Cast™ Slide, Dicke 200 μm) wurde mit Tropfen 250 μmolarer Lösung eines 20-mer Oligonukleotids in 50 mmolarem L-Histidin-Puffer für 3 h in gesättigter Wasserdampfatmosphäre inkubiert. Auch hier wurde nach Waschen mit destilliertem Wasser eine Beladungsdichte von mehr als 1 mM je Liter gemessen. Auf der dem Glas zugewandten Seite war die Beladungsdichte auf etwa 30% des Wertes auf der freien Oberfläche abgefallen. Die Membran wurde im folgenden einer elektrischen Impedanzmessung unterzogen.A nylon membrane (Cast ™ Slide, thickness 200 μm) firmly attached to a glass substrate was incubated with drops of 250 μmolar solution of a 20-mer oligonucleotide in 50 mmolar L-histidine buffer for 3 h in a saturated water vapor atmosphere. Here, too, a loading density of more than 1 mM per liter was measured after washing with distilled water. On the side facing the glass, the loading density had dropped to about 30% of the value on the free surface. The membrane was subsequently subjected to an electrical impedance measurement.
Dazu wurde eine Epoxy-Platine mit einer Kupferelektrode versehen, die aus zweiFor this purpose, an epoxy circuit board was provided with a copper electrode consisting of two
Halbkreisen (Radius ca. 3 mm) mit jeweiligen Zuleitungen bestand. Die beidenSemicircles (radius approx. 3 mm) with respective supply lines existed. The two
Halbkreise waren durch einen ca. 300 μm breiten Spalt voneinander getrennt. Nunmehr wurde die mit L-Histidin-Puffer getränkte, teilweise beladene Membran zurSemicircles were separated from one another by an approx. 300 μm wide gap. Now the partially loaded membrane soaked with L-histidine buffer became
Einstellung des Abstandes mit ihrer offenen Seite mit definierter Kraft gegen dieSetting the distance with its open side with a defined force against the
Kupferelektrode gedrückt, eine Wechselspannung von 0,1 bis 10 kHz und 10 mVCopper electrode pressed, an AC voltage of 0.1 to 10 kHz and 10 mV
Amplitude appliziert und der Betrag der Impedanz gemessen. Je nachdem, ob ein unbeladener oder beladener Bereich der Membran über dem Spalt positioniert wurde, ergab sich ein um ca. 10% niedrigerer oder höherer Betrag für denApplied amplitude and measured the amount of impedance. Depending on whether an unloaded or loaded area of the membrane was positioned over the gap, there was an approximately 10% lower or higher amount for the
Absolutwert der gemessenen Impedanz Absolut wurde eine Impedanz von 22 kOhm im beladenen Zustand gegenüber 20 kOhm im unbeladenen Zustand ermittelt.Absolute value of the measured impedance Absolutely, an impedance of 22 kOhm in the loaded state was determined compared to 20 kOhm in the unloaded state.
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