Ссылка на родственные заявкиLink to related applications
По заявке на данное изобретение испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США № 62/304012, поданной 4 марта 2016 г., раскрытие которой включено в настоящий документ посредством ссылки.The present invention claims priority to U.S. Provisional Patent Application No. 62/304,012, filed March 4, 2016, the disclosure of which is incorporated herein by reference.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретенияPrior art of the present invention
Недавние исследования показали, что раковые заболевания человека и хронические инфекции можно лечить с помощью средств, которые модулируют иммунный ответ пациента на злокачественные или инфицированные клетки. См., например, Reck & Paz-Ares (2015) Semin. Oncol. 42:402. Агонистические антитела к CD40, такие как СР-870893 и дацетузумаб (SGN-40), были опробованы для лечения рака на основании убеждения, что они могут усилить такой иммунный ответ. См., например, Kirkwood et al. (2012), СА Cancer J. Clin. 62:309; Vanderheide & Glennie (2013), Clin. Cancer Res. 19:1035. Недавние эксперименты на мышах выявили, что антитела к CD40 с усиленной специфичностью в отношении ингибирующего Fc-рецептора FcYRIIb характеризуются увеличенной противоопухолевой эффективностью. См., например, международную патентную публикацию WO 2012/087928; Smith, et al. (2012), PNAS, 109(16):6181-6; Li & Ravetch (2012), Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA), 109:10966; Wilson et al. (2011), Cancer Cell, 19:101; White et al. (2011), J. Immunol. 187:1754.Recent studies have shown that human cancers and chronic infections can be treated with agents that modulate the patient’s immune response to malignant or infected cells. See, e.g., Reck & Paz-Ares (2015) Semin. Oncol. 42:402. CD40 agonist antibodies such as CP-870893 and dacetuzumab (SGN-40) have been tested for the treatment of cancer based on the belief that they can enhance this immune response. See, e.g., Kirkwood et al. (2012) CA Cancer J. Clin. 62:309; Vanderheide & Glennie (2013) Clin. Cancer Res. 19:1035. Recent experiments in mice have revealed that anti-CD40 antibodies with enhanced specificity for the inhibitory Fc receptor FcYRIIb have enhanced antitumor efficacy. See, e.g., International Patent Publication No. WO 2012/087928; Smith, et al. (2012), PNAS, 109(16):6181-6; Li & Ravetch (2012), Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA), 109:10966; Wilson et al. (2011), Cancer Cell, 19:101; White et al. (2011), J. Immunol. 187:1754.
Существует потребность в улучшенных агонистических антителах к CD40 человека для лечения рака и хронических инфекций у субъектов-людей. Такие антитела предпочтительно будут характеризоваться усиленной специфичностью в отношении ингибирующего Fc-рецептора FcYRIIb по сравнению с активирующими Fc-рецепторами и будут проявлять усиленную противоопухолевую и/или противоинфекционную активность.There is a need for improved agonist antibodies to human CD40 for the treatment of cancer and chronic infections in human subjects. Such antibodies will preferably have enhanced specificity for the inhibitory Fc receptor FcYRIIb compared to activating Fc receptors and will exhibit enhanced antitumor and/or anti-infective activity.
Краткое раскрытие настоящего изобретенияBrief summary of the present invention
В настоящем документе предусмотрены выделенные моноклональные антитела (например, мышиные моноклональные антитела, гуманизированные мышиные моноклональные антитела и моноклональные антитела человека), которые специфически связываются с CD40 человека (зрелая последовательность SEQ ID NO: 11), необязательно характеризующиеся модифицированными Fc-областями, которые усиливают специфичность в отношении связывания с рецептором FcYRIIb. Также предусмотрены (i) антитела, которые конкурируют с антителами, раскрытыми в настоящем документе, за связывание с CD40 человека, и (ii) антитела, которые связываются с теми же эпитопами, что и антитела, раскрытые в настоящем документе, т.е. антитела, которые конкурируют за связывание с CD40 человека с антителами, содержащими мутантную Fc-область, характеризующуюся одной или несколькими мутациями, соответствующими одной или нескольким мутациям в тяжелой цепи IgG, выбранным группы, состоящей из N297A, S267E (SE), S267E/L382F (SELF), G237D/P238D/P271G/A330R (V9) или G237D/P238D/H268D/P271G/A330R (V11) (SEQ ID NO: 3-7), такие как антитела, которые конкурируют за связывание с CD40 человека с mAb IgG1 клона 2141, которое также носит название СР-870,893.Provided herein are isolated monoclonal antibodies (e.g., murine monoclonal antibodies, humanized murine monoclonal antibodies, and human monoclonal antibodies) that specifically bind to human CD40 (mature sequence of SEQ ID NO: 11), optionally characterized by modified Fc regions that enhance the specificity for binding to the FcYRIIb receptor. Also provided are (i) antibodies that compete with the antibodies disclosed herein for binding to human CD40, and (ii) antibodies that bind to the same epitopes as the antibodies disclosed herein, i.e., antibodies that compete for binding to human CD40 with antibodies comprising a mutant Fc region characterized by one or more mutations corresponding to one or more mutations in an IgG heavy chain selected from the group consisting of N297A, S267E (SE), S267E/L382F (SELF), G237D/P238D/P271G/A330R (V9), or G237D/P238D/H268D/P271G/A330R (V11) (SEQ ID NOs: 3-7), such as antibodies that compete for binding to human CD40 with IgG1 mAb clone 2141, which is also referred to as CP-870,893.
Согласно некоторым вариантам осуществления антитело согласно настоящему изобретению содержит тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь содержит последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 и легкая цепь содержит CDRL1, CDRL2 и CDRL3 и Fc-варианты N297A, S267E (SE), S267E/L382F (SELF), G237D/P238D/P271G/A330R (V9), G237D/P238D/H268D/P271G/A330R (V11), как раскрыто в табл. 2, приведенной в конце описания.According to some embodiments, an antibody of the present invention comprises a heavy chain and a light chain, wherein the heavy chain comprises CDRH1, CDRH2 and CDRH3 sequences and the light chain comprises CDRL1, CDRL2 and CDRL3 and Fc variants N297A, S267E (SE), S267E/L382F (SELF), G237D/P238D/P271G/A330R (V9), G237D/P238D/H268D/P271G/A330R (V11), as disclosed in Table 2 below.
Согласно некоторым вариантам осуществления Fc-варианты включают в себя N297A (SEQ ID NO: 2, 3), SE (SEQ ID NO: 2, 4), SELF (SEQ ID NO: 2, 5), V9 (SEQ ID NO: 2, 6) и/или V11 (SEQ ID NO: 2, 7). Согласно альтернативным вариантам осуществления антитела к CD40 человека согласно настоящему изобретению включают в себя антитела, содержащие тяжелые и легкие цепи, состоящие по существу из последовательностей указанных тяжелых и легких цепей, или содержат тяжелые и легкие цепи, характеризующиеся по меньшей мере 80, 85, 90 и 95% идентичностью последовательностей по отношению к указанным последовательностям. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела к huCD40 согласно настоящему изобретению содержат модифицированные Fc-области с большей специфичностью в отношении связывания с FcYRIIb в отличие от связывания с активирующими рецепторами, чем антитела с Fc-областями, встречающимися в природе. Согласно определенным вариантам осуществления соотношение A/I для антитела к huCD40 согласно настоящему изобретению составляет меньше чем 5 и согласно предпочтительным вариантам осуществления меньше чем 1.In some embodiments, the Fc variants comprise N297A (SEQ ID NO: 2, 3), SE (SEQ ID NO: 2, 4), SELF (SEQ ID NO: 2, 5), V9 (SEQ ID NO: 2, 6), and/or V11 (SEQ ID NO: 2, 7). In alternative embodiments, the anti-human CD40 antibodies of the present invention comprise antibodies comprising heavy and light chains consisting essentially of the sequences of said heavy and light chains, or comprising heavy and light chains having at least 80%, 85%, 90%, and 95% sequence identity to said sequences. In some embodiments, the anti-huCD40 antibodies of the present invention comprise modified Fc regions with greater specificity for binding to FcYRIIb, as opposed to binding to activating receptors, than antibodies with naturally occurring Fc regions. In certain embodiments, the A/I ratio for an anti-huCD40 antibody of the present invention is less than 5, and in preferred embodiments, less than 1.
Согласно определенным вариантам осуществления настоящее изобретение относится к антителам к huCD40 или их антигенсвязывающим фрагментам, которые конкурируют за связывание, перекрестно блокируют или связываются с тем же эпитопом, что и одно или несколько антител, содержащих Fc-варианты N297A (SEQ ID NO: 2, 3), SE (SEQ ID NO: 2, 4), SELF (SEQ ID NO: 2, 5), V9 (SEQ ID NO: 2, 6) и/или V11 (SEQ ID NO: 2, 7), включая в себя человеческие или гуманизированные антитела.In certain embodiments, the present invention provides anti-huCD40 antibodies or antigen-binding fragments thereof that compete for binding, cross-block, or bind to the same epitope as one or more antibodies comprising Fc variants N297A (SEQ ID NO: 2, 3), SE (SEQ ID NO: 2, 4), SELF (SEQ ID NO: 2, 5), V9 (SEQ ID NO: 2, 6), and/or V11 (SEQ ID NO: 2, 7), including human or humanized antibodies.
Согласно некоторым вариантам осуществления антитело к huCD40 согласно настоящему изобретению содержит одну или несколько тяжелых цепей и одну или несколько легких цепей, например две тяжелые цепи и две легкие цепи.In some embodiments, an anti-huCD40 antibody of the present invention comprises one or more heavy chains and one or more light chains, such as two heavy chains and two light chains.
Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающаяIn some embodiments, the isolated antibody or antigen-binding protein thereof
- 1 048278 часть, которые:- 1 048278 part, which:
(i) специфически связываются с CD40 человека и (ii) содержат мутантную Fc-область, характеризующуюся одной или несколькими мутациями, соответствующими одной или нескольким мутациям в тяжелой цепи IgG, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3-7.(i) specifically bind to human CD40 and (ii) comprise a mutant Fc region characterized by one or more mutations corresponding to one or more mutations in an IgG heavy chain selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3-7.
Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть конкурируют за связывание с CD40 человека с СР-870,893 или ChiLob, 2141.In some embodiments, the isolated antibody or antigen-binding portion thereof competes for binding to human CD40 with CP-870,893 or ChiLob,2141.
Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть характеризуются усиленной специфичностью в отношении связывания с FcYRIIb.In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof has enhanced specificity for binding to FcYRIIb.
Настоящее изобретение дополнительно относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим вариабельные области тяжелой и/или легкой цепей антител к CD40 согласно настоящему изобретению или их антигенсвязывающих фрагментов, векторам экспрессии, содержащим молекулы нуклеиновой кислоты, клеткам, трансформированным векторами экспрессии, и способам получения антител путем экспрессии антител из клеток, трансформированных векторами экспрессии, и извлечения антитела.The present invention further relates to nucleic acids encoding the variable regions of the heavy and/or light chains of the CD40 antibodies of the present invention or antigen-binding fragments thereof, expression vectors comprising the nucleic acid molecules, cells transformed with the expression vectors, and methods for producing antibodies by expressing antibodies from cells transformed with the expression vectors and recovering the antibody.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим антитела к huCD40 согласно настоящему изобретению или их антигенсвязывающие фрагменты и фармацевтически приемлемый носитель.The present invention also relates to pharmaceutical compositions comprising the huCD40 antibodies of the present invention or antigen-binding fragments thereof and a pharmaceutically acceptable carrier.
Настоящее изобретение относится к способу усиления иммунного ответа у субъекта, предусматривающему введение эффективного количества антитела к huCD40 согласно настоящему изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента, субъекту так, чтобы усиливать иммунный ответ у субъекта. Согласно определенным вариантам осуществления субъект характеризуется наличием опухоли, и иммунный ответ против опухоли усиливается. Согласно другому варианту осуществления субъект характеризуется наличием вирусной инфекции, например хронической вирусной инфекции, и противовирусный иммунный ответ усиливается.The present invention relates to a method for enhancing an immune response in a subject, comprising administering an effective amount of an anti-huCD40 antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof to the subject so as to enhance an immune response in the subject. According to certain embodiments, the subject is characterized by the presence of a tumor, and the immune response against the tumor is enhanced. According to another embodiment, the subject is characterized by the presence of a viral infection, for example a chronic viral infection, and the antiviral immune response is enhanced.
Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования роста опухолей у субъекта, предусматривающему введение субъекту антитела к huCD40 согласно настоящему изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента так, чтобы ингибировать рост опухоли.The present invention also relates to a method of inhibiting tumor growth in a subject comprising administering to the subject an anti-huCD40 antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof so as to inhibit tumor growth.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способу лечения рака, например, с помощью иммунотерапии, предусматривающему введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества антитела к huCD40 согласно настоящему изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента, например, в виде фармацевтической композиции, тем самым осуществляя лечение рака. Согласно определенным вариантам осуществления рак представляет собой следующее: рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак матки/шейки матки, рак яичника, рак предстательной железы, рак яичка, рак пищевода, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, рак толстой и прямой кишки, рак толстой кишки, рак почки, рак головы и шеи, рак легкого, рак желудка, герминогенный рак, рак кости, рак печени, рак щитовидной железы, рак кожи, новообразование центральной нервной системы, лимфома, лейкоз, миелома, саркома и рак вирусного происхождения. Согласно определенным вариантам осуществления рак представляет собой метастатический рак, рефрактерный рак или рецидивирующий рак.The present invention further relates to a method of treating cancer, for example, by immunotherapy, comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of an anti-huCD40 antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof, for example, in the form of a pharmaceutical composition, thereby treating the cancer. In certain embodiments, the cancer is the following: bladder cancer, breast cancer, uterine/cervical cancer, ovarian cancer, prostate cancer, testicular cancer, esophageal cancer, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, colorectal cancer, colon cancer, kidney cancer, head and neck cancer, lung cancer, gastric cancer, germ cell cancer, bone cancer, liver cancer, thyroid cancer, skin cancer, central nervous system neoplasm, lymphoma, leukemia, myeloma, sarcoma, and cancer of viral origin. In certain embodiments, the cancer is metastatic cancer, refractory cancer, or recurrent cancer.
Согласно определенным вариантам осуществления описанные в настоящем документе способы модулирования иммунной функции и способы лечения предусматривают введение антитела к huCD40 согласно настоящему изобретению в комбинации или в виде биспецифического реагента с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, например, вторым иммуномодулирующим антителом.In certain embodiments, the methods of modulating immune function and methods of treatment described herein comprise administering an anti-huCD40 antibody of the present invention in combination or as a bispecific reagent with one or more additional therapeutic agents, such as a second immunomodulatory antibody.
Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials
На фиг. Ία-D показаны характеристики гуманизированных в отношении CD40/FcyR мышей и Fc-вариантов клона 2141 к CD40:Fig. Ία-D shows the characteristics of CD40/FcyR humanized mice and Fc variants of clone 2141 to CD40:
А: представлено репрезентативное окрашивание с помощью проточной цитометрии CD40 мыши или человека на указанных популяциях спленоцитов от CD40-/-huCD40+/+ мышей и мышей дикого типа.A: Representative flow cytometric staining of mouse or human CD40 on the indicated splenocyte populations from CD40-/- huCD40+/+ mice and wild-type mice is shown.
В: представляет собой репрезентативное окрашивание с помощью проточной цитометрии GC Вклеток из мезентериального лимфоузла указанного типа мышей. Гейтировали живые В220+ клетки. GC В-клетки показаны как CD38-Fashi.B: is a representative flow cytometric staining of GC B cells from the mesenteric lymph node of the indicated mouse type. Live B220+ cells were gated. GC B cells are shown as CD38-Fashi.
С: проиллюстрирован ELISA для обнаружения содержания в сыворотке специфического для H1N1 гриппа IgG от мышей, иммунизированных рекомбинантным H1N1 гриппа. Каждая точка представляет отдельную мышь.C: Illustrates ELISA for detection of serum H1N1 influenza-specific IgG levels from mice immunized with recombinant H1N1 influenza. Each dot represents an individual mouse.
D: проиллюстрирована специфичность связывания указанных Fc-вариантов Ab клона 2141 к CD40, оцененная с помощью ELISA с использованием рекомбинантного hCD40. Данные представлены как среднее. См. также табл. 1.D: The binding specificity of the designated Fc variants of Ab clone 2141 to CD40 is shown, assessed by ELISA using recombinant hCD40. Data are presented as mean. See also Table 1.
На фиг. 2 показано связывание hCD40 с CD40L мыши и человека с использованием анализа SPR с иммобилизованным CD40 человека и растворимым CD40L человека/мыши, титруемым от 33 до 0,5 нМ.Figure 2 shows the binding of hCD40 to mouse and human CD40L using an SPR assay with immobilized human CD40 and soluble human/mouse CD40L titrated from 33 to 0.5 nM.
На фиг. 3A и B показано, что человека mAb к CD40 требуют взаимодействия с FcyR для in vivo ак- 2 048278 тивности:Figure 3A and B show that human anti-CD40 mAbs require interaction with FcyR for in vivo activity:
A: показан профиль связывания с FcyR Fc-вариантов клона 2141 к CD40. См. также табл. 2, приведенную в конце описания.A: The FcyR binding profile of the Fc variants of clone 2141 to CD40 is shown. See also Table 2 at the end of the description.
B: показан анализ проточной цитометрии в отношении OVA-специфических CD8+ Т-клеток в крови гуманизированных в отношении CD40/FcyR мышей, иммунизированных с помощью DEC-OVA в присутствии или при отсутствии указанных анти-CD40 Fc-вариантов СР-890,873 (слева) или ChiLob 7/4 (справа). Каждая точка представляет отдельную мышь.B: Shows flow cytometry analysis of OVA-specific CD8+ T cells in the blood of humanized CD40/FcyR mice immunized with DEC-OVA in the presence or absence of the indicated anti-CD40 Fc variants CP-890,873 (left) or ChiLob 7/4 (right). Each dot represents an individual mouse.
На фиг. 4A-D показана увеличенная активность СР-870,893 с помощью Fc-инженерии для специфического в отношении FcyRIIB усиления:Figure 4A-D shows the enhanced activity of CP-870,893 by Fc engineering for FcyRIIB-specific enhancement:
А: показано кратность изменения аффинностей связывания hFcYRIIB и hFcYRIIB/hFcYRIIAR131 антиCD40 Fc-вариантов 2141 на основании измерений с помощью SPR. См. также табл. 2, приведенную в конце описания.A: Shows the fold change in binding affinities of hFcYRIIB and hFcYRIIB/hFcYRIIAR131 antiCD40 Fc variants 2141 as measured by SPR. See also Table 2 at the end of the text.
В: показан анализ проточной цитометрии в отношении OVA-специфических CD8+ Т-клеток в крови huCD40/FcYR мышей, иммунизированных с помощью DEC-OVA в присутствии или при отсутствии указанных анти-CD40 Fc-вариантов СР-870,893. Каждая точка представляет отдельную мышь.B: Shows flow cytometric analysis of OVA-specific CD8+ T cells in the blood of huCD40/FcYR mice immunized with DEC-OVA in the presence or absence of the indicated anti-CD40 Fc variants CP-870,893. Each dot represents an individual mouse.
С: показаны количества тромбоцитов в крови через 24 ч после введения Fc-вариантов СР-870,893 к CD40 гуманизированным в отношении CD40/FcyR мышам. Каждая точка представляет отдельную мышь.C: Platelet counts in blood are shown 24 h after administration of the Fc variants of CP-870,893 to CD40 humanized mice for CD40/FcyR. Each dot represents an individual mouse.
D: показаны hCD40+/hFcYRIIA+/hFcYRIIB+ или hCD40+/hFcYRIIA7hFcYRIIB+ мыши, которых иммунизировали с помощью DEC-OVA в присутствии CP-870,893-IgG2 и анализировали в отношении процентных отношений OVA-специфических CD8+ Т-клеток в крови на 7 день. См. также табл. 2, приведенную в конце описания.D: Shown are hCD40+ /hFcYRIIA+ /hFcYRIIB+ or hCD40+ /hFcYRIIA7hFcYRIIB+ mice that were immunized with DEC-OVA in the presence of CP-870,893-IgG2 and analyzed for the percentages of OVA-specific CD8+ T cells in blood on day 7. See also Table 2 below.
На фиг. 5А и В показана увеличенная активность СР-870,893 с помощью Fc-инженерии для специфического в отношении FcyRIIB усиления:Figures 5A and B show the enhanced activity of CP-870,893 by Fc engineering for FcyRIIB-specific enhancement:
А: показано изменение общей массы тела с течением времени после однократной инъекции Fcварианта СР-870,893 гуманизированным в отношении FcyR/CD40 мышам. Данные представлены как среднее ± SEM. n=4.A: Shows the change in total body weight over time following a single injection of the Fc variant CP-870,893 into FcyR/CD40 humanized mice. Data are presented as mean ± SEM. n=4.
В: показаны количества тромбоцитов в крови гуманизированных в отношении CD40/FcyR мышей через 7 дней после введения анти-CD40 Fc-вариантов СР-870,893. Каждая точка представляет отдельную мышь.B: Platelet counts in the blood of CD40/FcyR humanized mice are shown 7 days after administration of the anti-CD40 Fc variants CP-870,893. Each dot represents an individual mouse.
Подробное раскрытие настоящего изобретенияDetailed disclosure of the present invention
Настоящее изобретение относится к выделенным антителам, в частности моноклональным антителам, например гуманизированным или человеческим моноклональным антителам, которые специфически связываются с CD40 человека (huCD40) и характеризуются агонистической активностью. Предусмотрены последовательности для различных гуманизированных мышиных моноклональных антител к huCD40. Согласно определенным вариантам осуществления описанные в настоящем документе антитела происходят из конкретных мышиных последовательностей зародышевой линии тяжелой и легкой цепей и/или содержат конкретные структурные признаки, такие как области CDR, содержащие конкретные аминокислотные последовательности.The present invention relates to isolated antibodies, particularly monoclonal antibodies, such as humanized or human monoclonal antibodies, that specifically bind to human CD40 (huCD40) and exhibit agonist activity. Sequences for various humanized murine monoclonal antibodies to huCD40 are provided. In certain embodiments, the antibodies described herein are derived from specific murine germline heavy and light chain sequences and/or contain specific structural features, such as CDR regions containing specific amino acid sequences.
Дополнительно в настоящем документе предусмотрены способы получения таких антител, иммуноконъюгатов и биспецифических молекул, содержащих такие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, и фармацевтические композиции, составленные так, чтобы содержать антитела или фрагменты. Кроме того, в настоящем документе предусмотрены способы применения антител для усиления иммунного ответа, отдельно или в комбинации с другими иммуностимулирующими средствами (например, антителами) и/или противоопухолевыми или противоинфекционными видами терапии. Соответственно, описанные в настоящем документе антитела к huCD40 можно использовать в лечении в широком разнообразии терапевтических применений, включая в себя, например, ингибирование роста опухоли и лечение хронических вирусных инфекций.Additionally provided herein are methods of producing such antibodies, immunoconjugates, and bispecific molecules comprising such antibodies or antigen-binding fragments thereof, and pharmaceutical compositions formulated to comprise the antibodies or fragments. Additionally provided herein are methods of using the antibodies to enhance an immune response, alone or in combination with other immunostimulatory agents (e.g., antibodies) and/or anti-tumor or anti-infective therapies. Accordingly, the anti-huCD40 antibodies described herein can be used in treatment in a wide variety of therapeutic applications, including, for example, inhibition of tumor growth and treatment of chronic viral infections.
ОпределенияDefinitions
Для того чтобы настоящее описание было более понятным, сначала даны определения определенных терминов. Дополнительные определения представлены во всем подробном раскрытии настоящего изобретения.In order to make the present description more understandable, certain terms are first defined. Further definitions are provided throughout the detailed disclosure of the present invention.
CD40 относится к представителю 5 суперсемейства рецепторов TNF (TNFRSF5). Если иное не указано или не ясно из контекста, ссылки на CD40 в настоящем документе относятся к CD40 человека (huCD40) и антитела к CD40 относятся к антителам к CD40 человека. CD40 человека дополнительно описан в GENE ID NO: 958 и MIM (Mendelian Inheritance in Man): 109535. Последовательность CD40 человека (NP 001241.1), включая в себя 20 аминокислотную сигнальную последовательность, представлена в SEQ ID NO: 11.CD40 is a member of the TNF receptor superfamily member 5 (TNFRSF5). Unless otherwise stated or clear from context, references herein to CD40 refer to human CD40 (huCD40) and anti-CD40 antibodies refer to anti-human CD40 antibodies. Human CD40 is further described in GENE ID NO: 958 and MIM (Mendelian Inheritance in Man): 109535. The sequence of human CD40 (NP 001241.1), including the 20 amino acid signal sequence, is set forth in SEQ ID NO: 11.
CD40 взаимодействует с лигандом CD40 (CD40L), который также называется TNFSF5, gp39 и CD154. Если не указано иное или не ясно из контекста, ссылки на CD40L в настоящем документе относятся к CD40L человека (huCD40L). CD40L человека дополнительно описан в GENE ID NO: 959 иCD40 interacts with CD40 ligand (CD40L), which is also called TNFSF5, gp39, and CD154. Unless otherwise noted or clear from context, references herein to CD40L refer to human CD40L (huCD40L). Human CD40L is further described in GENE ID NO: 959 and
- 3 048278- 3 048278
MIM: 300386. Последовательность CD40L человека (NP 000065.1) представлена в SEQ ID NO: 12.MIM: 300386. The sequence of human CD40L (NP 000065.1) is shown in SEQ ID NO: 12.
Если иное не указано или не ясно из контекста, используемый в настоящем документе термин антитело может включать в себя целые антитела и любые антигенсвязывающие фрагменты (т.е. антигенсвязывающие части) или их отдельные цепи. Согласно одному варианту осуществления антитело относится к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями, или их антигенсвязывающий фрагмент. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (которая сокращенно в настоящем документе обозначена VH) и константной области тяжелой цепи. В определенных встречающихся в природе антителах IgG, IgD и IgA константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, CH2 и CH3. В определенных встречающихся в природе антителах каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (которая сокращенно в настоящем документе обозначена VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. Области VH и VL можно дополнительно разделить на области гипервариабельности, которые называются определяющие комплементарность области (CDR), чередующиеся с областями, которые являются более консервативными, которые называются каркасные области (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех каркасных областей (FR), расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая в себя различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента.Unless otherwise indicated or clear from context, the term "antibody" as used herein may include whole antibodies and any antigen-binding fragments (i.e., antigen-binding portions) or individual chains thereof. In one embodiment, an antibody refers to a glycoprotein comprising at least two heavy (H) chains and two light (L) chains linked together by disulfide bonds, or an antigen-binding fragment thereof. Each heavy chain is comprised of a heavy chain variable region (abbreviated herein as VH) and a heavy chain constant region. In certain naturally occurring IgG, IgD, and IgA antibodies, the heavy chain constant region is comprised of three domains, CH1, CH2, and CH3. In certain naturally occurring antibodies, each light chain is comprised of a light chain variable region (abbreviated herein as VL ) and a light chain constant region. The light chain constant region is comprised of a single domain,CL . The VH and VL regions can be further divided into regions of hypervariability, called complementarity determining regions (CDRs), interspersed with regions that are more conserved, called framework regions (FRs). Each VH and VL consists of three CDRs and four framework regions (FRs), arranged from amino terminus to carboxyl terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The variable regions of the heavy and light chains contain the binding domain that interacts with antigen. The constant regions of antibodies can mediate binding of immunoglobulin to tissues or host factors, including various cells of the immune system (e.g., effector cells) and the first component (C1q) of the classical complement system.
Антитела, как правило, специфически связываются со своим когнатным антигеном с высокой аффинностью, которая отражается в константе диссоциации (KD), составляющей 10-7-10-11 М или меньше. Любая KD больше чем приблизительно 10-6 М, как правило, рассматривается как указывающая на неспецифическое связывание. Используемое в настоящем документе антитело, которое связывается специфически с антигеном, относится к антителу, которое связывается с антигеном и по существу идентичными антигенами с высокой аффинностью, это означает, что характеризуется KD, составляющей 10-7 М или меньше, предпочтительно 10-8 М или меньше, даже более предпочтительно 5х10-9 М или меньше и наиболее предпочтительно 10-8-10-10 М или меньше, но не связывается с высокой аффинностью с неродственными антигенами. Антиген является по существу идентичным данному антигену, если он проявляет высокую степень идентичности последовательностей по отношению к данному антигену, например, если он проявляет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 97% или даже более предпочтительно по меньшей мере 99% идентичности последовательностей по отношению к последовательности данного антигена. В качестве примера антитело, которое специфически связывается с CD40 человека, также может давать перекрестную реакцию с CD40 из определенного вида не являющегося человеком примата (например, яванского макака), но может не давать перекрестную реакцию с CD40 из другого вида или с антигеном, отличным от CD40.Antibodies typically bind specifically to their cognate antigen with high affinity, which is reflected in a dissociation constant (KD) of 10-7 -10-11 M or less. Any KD greater than about 10-6 M is typically considered to indicate non-specific binding. As used herein, an antibody that binds specifically to an antigen refers to an antibody that binds to the antigen and substantially identical antigens with high affinity, which means that it has a KD of 10-7 M or less, preferably 10-8 M or less, even more preferably 5 x 10-9 M or less, and most preferably 10 -8 - 10-10 M or less, but does not bind with high affinity to unrelated antigens. An antigen is substantially identical to a given antigen if it exhibits a high degree of sequence identity with respect to the given antigen, for example if it exhibits at least 80%, at least 90%, preferably at least 95%, more preferably at least 97% or even more preferably at least 99% sequence identity with respect to the sequence of the given antigen. As an example, an antibody that specifically binds to human CD40 may also cross-react with CD40 from a certain species of non-human primate (e.g., cynomolgus macaque), but may not cross-react with CD40 from another species or with an antigen other than CD40.
Если не указано иное, иммуноглобулин может принадлежать к любому из широко известных изотипов, включая в себя без ограничения IgA, секреторный IgA, IgG и IgM. Изотип IgG разделен на подклассы в определенных видах: IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 у людей и IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG3 у мышей. Иммуноглобулины, например IgG1 человека, существуют в нескольких аллотипах, которые отличаются друг от друга не более чем несколькими аминокислотами. Если не указано иное, антитело может включать в себя, в качестве примера, моноклональные и поликлональные антитела; химерные и гуманизированные антитела; человеческие и не относящиеся к человеку антитела; полностью синтетические антитела и одноцепочечные антитела.Unless otherwise specified, an immunoglobulin may be of any of the commonly known isotypes, including, but not limited to, IgA, secretory IgA, IgG, and IgM. The IgG isotype is divided into subclasses in certain species: IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 in humans and IgG1, IgG2a, IgG2b, and IgG3 in mice. Immunoglobulins, such as human IgG1, exist in several allotypes that differ from each other by no more than a few amino acids. Unless otherwise specified, an antibody may include, by way of example, monoclonal and polyclonal antibodies; chimeric and humanized antibodies; human and non-human antibodies; wholly synthetic antibodies; and single-chain antibodies.
Используемый в настоящем документе термин антигенсвязывающая часть или антигенсвязывающий фрагмент антитела относится к одному или нескольким фрагментами антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, CD40 человека). Примеры связывающих фрагментов, включенные в термин антигенсвязывающая часть/фрагмент антитела, включают в себя (i) Fab-фрагмент - моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab')2фрагмент - бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком на шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, и (v) dAb-фрагмент (Ward et al. (1989), Nature, 341:544-546), состоящий из домена VH. Выделенная определяющая комплементарность область (CDR) или комбинация двух или более выделенных CDR, соединенных синтетическим линкером, могут содержать антигенсвязывающий домен антитела, если они способны связывать антиген.As used herein, the term "antigen-binding portion" or "antigen-binding fragment" of an antibody refers to one or more fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind to an antigen (e.g., human CD40). Examples of binding fragments included within the term "antigen-binding portion"/fragment of an antibody include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL , VH,CL and CH1 domains; (ii) a F(ab')2 fragment, a bivalent fragment comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region; (iii) an Fd fragment, consisting of the VH and CH1 domains; (iv) an Fv fragment, consisting of the VL and VH domains of one arm of an antibody, and (v) a dAb fragment (Ward et al. (1989), Nature, 341:544-546), consisting of the VH domain. An isolated complementarity determining region (CDR) or a combination of two or more isolated CDRs joined by a synthetic linker may comprise an antigen-binding domain of an antibody if they are capable of binding antigen.
Конструкты одноцепочечных антител также включены в настоящее изобретение. Хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются различными генами, их можно соединить с использованием рекомбинантных способов с помощью синтетического линкера, который обеспечивает их получение в виде единой белковой цепи, в которой области VL и VH спариваются с образованием моновалентных молекул, известных как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988), Science, 242:423-426; и Huston et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 85:5879-5883). Предусмотрено, что такие одноцепочечные антиSingle chain antibody constructs are also included in the present invention. Although the two domains of the Fv fragment, VL and VH, are encoded by different genes, they can be joined using recombinant techniques by a synthetic linker that enables them to be produced as a single protein chain in which the VL and VH regions are paired to form monovalent molecules known as single chain Fv (scFv); see, e.g., Bird et al. (1988), Science, 242:423-426; and Huston et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 85:5879-5883). It is envisaged that such single chain antibodies
- 4 048278 тела также включают термин антигенсвязывающая часть/фрагмент антитела. Указанные и другие потенциальные конструкты описаны в Chan & Carter (2010), Nat. Rev. Immunol. 10:301. Указанные фрагменты антител получают с использованием общепринятых техник, известных специалистам в настоящей области техники, и фрагменты подвергают скринингу в отношении применимости таким же образом, что и интактные антитела. Антигенсвязывающие части/фрагменты можно получить с помощью техник рекомбинантной ДНК или с помощью ферментативного или химического расщепления интактных иммуноглобулинов.- 4 048278 bodies also include the term antigen-binding portion/fragment of an antibody. These and other potential constructs are described in Chan & Carter (2010), Nat. Rev. Immunol. 10:301. These antibody fragments are prepared using conventional techniques known to those skilled in the art, and the fragments are screened for utility in the same manner as intact antibodies. Antigen-binding portions/fragments can be prepared using recombinant DNA techniques or by enzymatic or chemical cleavage of intact immunoglobulins.
Если не указано иное, слово фрагмент, используемый со ссылкой на антитело, например, в пункте формулы изобретения, относится к антигенсвязывающему фрагменту антитела так, что антитело или фрагмент имеют такое же значение, что и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.Unless otherwise indicated, the word fragment, when used in reference to an antibody, for example in a claim, refers to an antigen-binding fragment of the antibody, such that the antibody or fragment has the same meaning as the antibody or antigen-binding fragment thereof.
Биспецифическое или бифункциональное антитело представляет собой искусственное гибридное антитело, характеризующееся двумя различными парами тяжелых/легких цепей, что приводит к двум антигенсвязывающим сайтам со специфичностью в отношении различных антигенов. Биспецифические антитела можно получить с помощью различных способов, включая в себя слияние гибридом или связывание Fab'-фрагментов. См., например, Songsivilai & Lachmann (1990), Clin. Exp. Immunol. 79:315321; Kostelny et al. (1992), J. Immunol. 148, 1547-1553.A bispecific or bifunctional antibody is an artificial hybrid antibody characterized by two different heavy/light chain pairs, resulting in two antigen-binding sites with specificity for different antigens. Bispecific antibodies can be produced by a variety of methods, including hybridoma fusion or Fab' linkage. See, e.g., Songsivilai & Lachmann (1990), Clin. Exp. Immunol. 79:315321; Kostelny et al. (1992), J. Immunol. 148, 1547-1553.
Используемый в настоящем документе термин моноклональное антитело относится к антителу, которое проявляет одну специфичность связывания и аффинность в отношении конкретного эпитопа, или композиции антител, в которой все антитела проявляют одну специфичность связывания и аффинность в отношении конкретного эпитопа. Как правило, такие моноклональные антитела будут происходить из одной клетки или нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, и будут размножаться без преднамеренного введения каких-либо изменений последовательности. Соответственно, термин моноклональное антитело человека относится к моноклональному антителу, которое содержит вариабельные и необязательные константные области, происходящие из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Согласно одному варианту осуществления моноклональные антитела человека получают с помощью гибридомы, например, полученной путем слияния В-клетки, полученной от трансгенного или трансхромосомного не являющегося человеком животного (например, трансгенной мыши, характеризующейся геномом, содержащим трансген тяжелой цепи человека и трансген легкой цепи), с иммортализованной клеткой.As used herein, the term "monoclonal antibody" refers to an antibody that exhibits a single binding specificity and affinity for a particular epitope, or a composition of antibodies in which all of the antibodies exhibit a single binding specificity and affinity for a particular epitope. Typically, such monoclonal antibodies will be derived from a single cell or nucleic acid encoding the antibody and will be propagated without the deliberate introduction of any sequence changes. Accordingly, the term "human monoclonal antibody" refers to a monoclonal antibody that contains variable and optional constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences. According to one embodiment, human monoclonal antibodies are produced using a hybridoma, such as one produced by fusing a B cell derived from a transgenic or transchromosomal non-human animal (e.g., a transgenic mouse characterized by a genome comprising a human heavy chain transgene and a light chain transgene) with an immortalized cell.
Используемый в настоящем документе термин рекомбинантное антитело человека включает в себя все антитела человека, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с помощью рекомбинантных способов, такие как (a) антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным в отношении генов иммуноглобулина человека, или полученной из него гибридомы, (b) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной, чтобы экспрессировать антитело, например, из трансфектомы, (c) антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки антител человека, и (d) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные с помощью любых других способов, которые включают в себя сплайсинг последовательности гена иммуноглобулина человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека содержат вариабельные и константные области, которые используют конкретные последовательности иммуноглобулина зародышевой линии человека, кодируемые генами зародышевой линии, но которые включают в себя последующие реаранжировки и мутации, которые происходят, например, во время созревания антитела. Как известно в настоящей области техники (см., например, Lonberg (2005), Nature Biotech. 23(9):1117-1125), вариабельная область содержит антигенсвязывающий домен, который кодируется различными генами, которые реаранжируются с образованием антитела, специфического в отношении чужеродного антигена. В дополнение к реаранжировке вариабельную область можно дополнительно модифицировать с помощью многочисленных одноаминокислотных замен (также называемых соматической мутацией или гипермутацией) для увеличения аффинности антитела к чужеродному антигену. Константная область будет изменяться в дальнейшем ответе на антиген (т.е. переключение изотипа). Следовательно, реаранжированные и соматически мутированные последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды легких цепей и тяжелых цепей иммуноглобулина в ответ на антиген, могут не являться идентичными исходным последовательностям зародышевой линии, но вместо этого будут являться по существу идентичными или сходными (т.е. характеризоваться по меньшей мере 80% идентичностью).As used herein, the term "recombinant human antibody" includes all human antibodies that are produced, expressed, created, or isolated by recombinant methods, such as (a) antibodies isolated from an animal (e.g., a mouse) that is transgenic or transchromosomal for human immunoglobulin genes, or a hybridoma derived therefrom, (b) antibodies isolated from a host cell transformed to express the antibody, such as from a transfectoma, (c) antibodies isolated from a recombinant, combinatorial library of human antibodies, and (d) antibodies produced, expressed, created, or isolated by any other methods that involve splicing a human immunoglobulin gene sequence with other DNA sequences. Such recombinant human antibodies comprise variable and constant regions that utilize specific human germline immunoglobulin sequences encoded by germline genes, but which include subsequent rearrangements and mutations that occur, for example, during antibody maturation. As is known in the art (see, for example, Lonberg (2005), Nature Biotech. 23(9):1117-1125), the variable region comprises an antigen-binding domain that is encoded by different genes that rearrange to form an antibody specific for a foreign antigen. In addition to rearrangement, the variable region can be further modified by multiple single amino acid substitutions (also called somatic mutation or hypermutation) to increase the affinity of the antibody for the foreign antigen. The constant region will change in subsequent response to the antigen (i.e., isotype switching). Therefore, rearranged and somatically mutated nucleic acid sequences that encode immunoglobulin light chain and heavy chain polypeptides in response to an antigen may not be identical to the original germline sequences, but instead will be substantially identical or similar (i.e., have at least 80% identity).
Человеческое антитело (HuMAb) относится к антителу, характеризующемуся вариабельными областями, в которых как каркасные области, так и области CDR происходят из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Более того, если антитело содержит константную область, константная область также происходит из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Антитела человека согласно настоящему изобретению могут включать в себя аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, введенные случайным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или путем соматической мутации in vivo). Тем не менее не подразумевается, что используемый в настоящем документе термин антитело человека включает в себя антитела, в которых последовательности CDR, происходящиеA human antibody (HuMAb) refers to an antibody characterized by variable regions in which both the framework regions and the CDR regions are derived from human germline immunoglobulin sequences. Moreover, if the antibody comprises a constant region, the constant region is also derived from human germline immunoglobulin sequences. Human antibodies of the present invention may include amino acid residues not encoded by human germline immunoglobulin sequences (e.g., mutations introduced by random or site-directed mutagenesis in vitro or by somatic mutation in vivo). However, as used herein, the term human antibody is not intended to include antibodies in which the CDR sequences derived from
- 5 048278 из зародышевой линии другого вида млекопитающих, такого как мышь, были привиты на каркасные последовательности человека. Термины человеческие антитела и полностью человеческие антитела используют синонимично.- 5,048,278 from the germline of another mammalian species, such as the mouse, were grafted onto human scaffold sequences. The terms human antibodies and fully human antibodies are used synonymously.
Гуманизированное антитело относится к антителу, в котором несколько, большинство или все аминокислоты за пределами доменов CDR не относящегося к человеку антитела, например мышиного антитела, замещены соответствующими аминокислотами, происходящими из иммуноглобулинов человека. Согласно одному варианту осуществления гуманизированной формы антитела некоторые, большинство или все аминокислоты за пределами доменов CDR были замещены аминокислотами из иммуноглобулинов человека, тогда как некоторые, большинство или все аминокислоты в пределах одной или нескольких областей CDR являются неизменными. Небольшие добавления, делеции, вставки, замены или модификации аминокислот являются допустимыми при условии, что они не отменяют способность антитела связываться с конкретным антигеном. Гуманизированное антитело сохраняет антигенную специфичность, сходную с таковой у исходного антитела.A humanized antibody refers to an antibody in which some, most, or all of the amino acids outside the CDR domains of a non-human antibody, such as a murine antibody, are replaced with corresponding amino acids derived from human immunoglobulins. In one embodiment of a humanized form of an antibody, some, most, or all of the amino acids outside the CDR domains have been replaced with amino acids from human immunoglobulins, while some, most, or all of the amino acids within one or more CDR regions are unchanged. Minor additions, deletions, insertions, substitutions, or modifications of amino acids are permissible, provided that they do not abolish the ability of the antibody to bind to a particular antigen. A humanized antibody retains an antigen specificity similar to that of the parent antibody.
Химерное антитело относится к антителу, в котором вариабельные области происходят из одного вида и константные области происходят из другого вида, например к антителу, в котором вариабельные области происходят из мышиного антитела, а константные области происходят из человеческого антитела. Гибридное антитело относится к антителу, характеризующемуся тяжелыми и легкими цепями различных типов, такими как мышиная (родительская) тяжелая цепь и гуманизированная легкая цепь, или наоборот.A chimeric antibody refers to an antibody in which the variable regions are derived from one species and the constant regions are derived from another species, such as an antibody in which the variable regions are derived from a mouse antibody and the constant regions are derived from a human antibody. A hybrid antibody refers to an antibody characterized by heavy and light chains of different types, such as a mouse (parental) heavy chain and a humanized light chain, or vice versa.
Используемый в настоящем документе термин изотип относится к классу антител, например антитело IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD и IgE, который кодируется генами константной области тяжелой цепи.As used herein, the term isotype refers to a class of antibodies, such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, and IgE antibodies, that are encoded by the heavy chain constant region genes.
Аллотип относится к встречающимся в природе вариантам в пределах специфической изотипной группы, причем эти варианты отличаются одной или несколькими аминокислотами. См., например, Jefferis et al. (2009), mAbs 1:1.An allotype refers to naturally occurring variants within a specific isotype group, where these variants differ in one or more amino acids. See, e.g., Jefferis et al. (2009), mAbs 1:1.
Фразы антитело, распознающее антиген и антитело, специфическое в отношении антигена используют в настоящем документе взаимозаменяемо с термином антитело, которое специфически связывается с антигеном.The phrases "antibody that recognizes an antigen" and "antibody that is specific for an antigen" are used herein interchangeably with the term "antibody that specifically binds to an antigen."
Используемый в настоящем документе термин выделенное антитело относится к антителу, которое по существу не содержит другие антитела, характеризующиеся различными антигенными специфичностями (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с CD40, по существу не содержит антитела, которые специфически связывают антигены, отличные от CD40). Выделенное антитело, которое специфически связывается с эпитопом CD40, тем не менее, может характеризоваться перекрестной реактивностью с другими белками CD40 из другого вида.As used herein, the term "isolated antibody" refers to an antibody that is substantially free of other antibodies having different antigen specificities (e.g., an isolated antibody that specifically binds to CD40 is substantially free of antibodies that specifically bind antigens other than CD40). An isolated antibody that specifically binds to an epitope of CD40 may, however, have cross-reactivity with other CD40 proteins from another species.
Эффекторные функции являются результатом взаимодействия Fc-области антитела с определенными рецепторами Fc, включают в себя, но необязательно ограничиваются следующим: связывание C1q, комплементзависимая цитотоксичность (CDC), связывание с рецептором Fc, FcYR-опосредованные эффекторные функции, такие как ADCC и антителозависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз (ADCP) и отрицательная регуляция рецептора клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора; BCR). Такие эффекторные функции, как правило, нуждаются в объединении Fc-области с антигенсвязывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела).Effector functions result from the interaction of the Fc region of an antibody with certain Fc receptors, and include, but are not necessarily limited to, the following: C1q binding, complement-dependent cytotoxicity (CDC), Fc receptor binding, FcYR-mediated effector functions such as ADCC and antibody-dependent cell-mediated phagocytosis (ADCP), and negative regulation of a cell surface receptor (e.g., the B cell receptor; BCR). Such effector functions typically require the association of the Fc region with an antigen-binding domain (e.g., the variable domain of an antibody).
Рецептор Fc или FcR представляет собой рецептор, который связывается с Fc-областью иммуноглобулина. FcR, которые связываются с антителом IgG, содержат рецепторы семейства FcyR, включая в себя аллельные варианты и Альтернативно, сплайсированные формы указанных рецепторов. Семейство FcyR состоит из трех активирующих (FcyRI, FcyRIII и FcyRIV у мышей; FcyRIA, FcyRIIA и FcyRIIIA у людей) и одного ингибирующего (FcYRIIb, или эквивалентно FcyRIIB) рецептора. Различные свойства FcyR человека обобщенно представлены в табл. 1. Большинство врожденных эффекторных клеточных типов коэкспрессируют один или несколько активирующих FcyR и ингибирующий FcYRIIb, тогда как клетки - натуральные киллеры (NK-клетки) селективно экспрессируют один активирующий рецептор Fc (FcyRIII у мышей и FcyRIIIA у людей), но не экспрессируют ингибирующий FcYRIIb у мышей и людей. IgG1 человека связывается с большинством рецепторов Fc человека и считается эквивалентным мышиному IgG2a в отношении типов активирующих рецепторов Fc, с которыми он связывается.An Fc receptor or FcR is a receptor that binds to the Fc region of an immunoglobulin. FcRs that bind to an IgG antibody comprise the FcyR family of receptors, including allelic variants and alternatively spliced forms of these receptors. The FcyR family consists of three activating (FcyRI, FcyRIII, and FcyRIV in mice; FcyRIA, FcyRIIA, and FcyRIIIA in humans) and one inhibitory (FcYRIIb, or equivalently FcyRIIB) receptors. The various properties of human FcyRs are summarized in Table 1. 1. Most innate effector cell types coexpress one or more activating FcγRs and inhibitory FcγRIIb, whereas natural killer (NK) cells selectively express one activating Fc receptor (FcγRIII in mice and FcγRIIIA in humans) but do not express inhibitory FcγRIIb in mice or humans. Human IgG1 binds to most human Fc receptors and is considered equivalent to murine IgG2a with respect to the types of activating Fc receptors to which it binds.
- 6 048278- 6 048278
Таблица 1Table 1
Свойства FcyR человекаProperties of human FcyR
Fc-область (кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина), или Fc-домен, или Fc относится к С-концевой области тяжелой цепи антитела, которая опосредует связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая в себя связывание с рецепторами Fc, расположенными на различных клетках иммунной системы (например, эффекторных клетках), или с первым компонентом (C1q) классической системы комплемента. Таким образом, Fc-область содержит константную область антитела, за исключением первого домена константной области иммуноглобулина (например, СН1 или CL). В изотипах антител IgG, IgA и IgD Fc-область содержит константные домены CH2 и CH3 в каждой из двух тяжелых цепей антитела; Fc-области IgM и IgE содержат три константных домена тяжелой цепи (домены CH2-4) в каждой полипептидной цепи. Для IgG Fc-область содержит домены Cy2 и Cy3 иммуноглобулина и шарнир между Cy1 и Cy2. Хотя границы Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьировать, Fc-область тяжелой цепи IgG человека, как правило, определяется участком от аминокислотного остатка в положении С226 или Р230 (или аминокислоты между указанными двумя аминокислотами) до карбоксиконца тяжелой цепи, причем нумерацию проводят согласно EU-индексу согласно Kabat. Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD; см. также фиг. 3c-3f в публикации заявки на выдачу патента США № 2008/0248028. Домен CH2 Fc-области IgG человека продолжается от приблизительно аминокислоты 231 до приблизительно аминокислоты 340, тогда как домен CH3 расположен на С-концевой стороне домена CH2 в Fc-области, т.е. он продолжается от приблизительно аминокислоты 341 до приблизительно аминокислоты 447 IgG (включая в себя С-концевой лизин). Используемая в настоящем документе Fc-область может представлять собой нативную последовательность Fc, включая в себя любой аллотипический вариант или вариантную Fc (например, не встречающуюся в природе Fc). Fc также может относиться к этой области самой по себе или в контексте Fc-содержащего белкового полипептида, такого как связывающий белок, содержащий Fc-область, также носящий название Fc-слитый белок (например, антитело или иммуноадгезин).The Fc region (crystallizable fragment of immunoglobulin), or Fc domain, or Fc, refers to the C-terminal region of an antibody heavy chain that mediates binding of immunoglobulin to tissues or host factors, including binding to Fc receptors located on various cells of the immune system (e.g., effector cells) or to the first component (C1q) of the classical complement system. Thus, the Fc region contains the constant region of the antibody, excluding the first domain of the immunoglobulin constant region (e.g.,CH1 or CL). In the IgG, IgA, and IgD antibody isotypes, the Fc region contains the CH2 and CH3 constant domains in each of the two antibody heavy chains; the Fc regions of IgM and IgE contain three heavy chain constant domains (CH2-4 domains) in each polypeptide chain. For IgG, the Fc region contains the Cy2 and Cy3 domains of the immunoglobulin and the hinge between Cy1 and Cy2. Although the boundaries of the Fc region of an immunoglobulin heavy chain can vary, the Fc region of a human IgG heavy chain is generally defined by the region from amino acid residue C226 or P230 (or the amino acid between these two amino acids) to the carboxy terminus of the heavy chain, with numbering according to the EU index according to Kabat. Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD; see also Figs. 3c-3f of U.S. Patent Application Publication No. 2008/0248028. The CH2 domain of the Fc region of human IgG extends from approximately amino acid 231 to approximately amino acid 340, while the CH3 domain is located at the C-terminal end of the CH2 domain of the Fc region, i.e., it extends from approximately amino acid 341 to approximately amino acid 447 of IgG (including the C-terminal lysine). As used herein, an Fc region may be a native Fc sequence, including any allotypic variant or variant Fc (e.g., a non-naturally occurring Fc). Fc may also refer to this region by itself or in the context of an Fc-containing protein polypeptide, such as a binding protein comprising an Fc region, also called an Fc fusion protein (e.g., an antibody or an immunoadhesin).
Fc-область нативной последовательности или Fc нативной последовательности содержит аминокислотную последовательность, которая является идентичной аминокислотной последовательности Fc-области, встречающейся в природе. Fc-области человека нативной последовательности включают в себя Fc-область нативной последовательности IgG1 человека; Fc-область нативной последовательности IgG2 человека; Fc-область нативной последовательности IgG3 человека и Fc-область нативной последовательности IgG4 человека, а также их встречающиеся в природе варианты. Fc нативной последовательности включает в себя различные аллотипы Fc. См., например, Jefferis et al. (2009), mAbs 1:1.A native sequence Fc region or native sequence Fc comprises an amino acid sequence that is identical to the amino acid sequence of a naturally occurring Fc region. Native sequence human Fc regions include the native sequence Fc region of human IgG1; the native sequence Fc region of human IgG2; the native sequence Fc region of human IgG3; and the native sequence Fc region of human IgG4, as well as naturally occurring variants thereof. Native sequence Fc includes various Fc allotypes. See, e.g., Jefferis et al. (2009), mAbs 1:1.
Термин эпитоп или антигеннная детерминанта относится к сайту на антигене (например, huCD40), с которым специфически связывается иммуноглобулин или антитело. Эпитопы в пределах белковых антигенов могут быть образованы из смежных аминокислот (как правило, линейный эпитоп) или несмежных аминокислот, пространственно сближенных в результате укладки белка в третичную структуру (как правило, конформационный эпитоп). Эпитопы, образованные из смежных аминокислот, как правило, но не всегда, сохраняются при воздействии на них денатурирующих растворителей, тогда как, как правило, происходит потеря эпитопов, образованных укладкой в третичную структуру при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп, как правило, включает в себя по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот в уникальной пространственной конформации.The term epitope or antigenic determinant refers to a site on an antigen (e.g., huCD40) to which an immunoglobulin or antibody specifically binds. Epitopes within protein antigens may be formed from contiguous amino acids (usually a linear epitope) or non-contiguous amino acids brought into spatial proximity by folding of the protein (usually a conformational epitope). Epitopes formed from contiguous amino acids are generally, but not always, retained upon exposure to denaturing solvents, whereas epitopes formed by folding are generally lost upon treatment with denaturing solvents. An epitope typically includes at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15 amino acids in a unique spatial conformation.
Термин картирование эпитопов относится к способу идентификации молекулярных детерминант на антигене, вовлеченных в распознавание антитело-антиген. Способы определения того, какие эпитопы связаны данным антителом, хорошо известны в настоящей области техники и включают в себя, например, анализы иммуноблоттинг и иммунопреципитация, причем перекрывающиеся или смежные пептиды (например, из CD40) исследуют в отношении реактивности с данным антителом (например, антителом к CD40); рентгеновская кристаллография; двумерный ядерный магнитный резонанс; дрожжевой дисплей и HDX-MS (см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G.E. Morris,The term epitope mapping refers to a method for identifying the molecular determinants on an antigen that are involved in antibody-antigen recognition. Methods for determining which epitopes are bound by a given antibody are well known in the art and include, for example, immunoblotting and immunoprecipitation assays wherein overlapping or adjacent peptides (e.g., from CD40) are examined for reactivity with the antibody (e.g., an anti-CD40 antibody); x-ray crystallography; two-dimensional nuclear magnetic resonance; yeast display; and HDX-MS (see, for example, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G.E. Morris,
- 7 048278- 7 048278
Ed. (1996)).Ed. (1996)).
Термин связывается с одним и тем же эпитопом со ссылкой на два или более антитела означает, что антитела связываются с одинаковым сегментом аминокислотных остатков, как определено с помощью данного способа. Техники для определения того, связываются ли антитела с одним и тем же эпитопом на CD40, что и антитела, описанные в настоящем документе, включают в себя, например, способы картирования эпитопов, такие как рентгеновские анализы кристаллов комплексов антиген:антитело, которые обеспечивают атомное разрешение эпитопа, и масс-спектрометрия водородно-дейтериевого обмена (HDX-MS). Другие способы обеспечивают мониторинг связывания антитела с антигенными фрагментами (например, протеолитическими фрагментами) или с мутированными вариациями антигена, где потеря связывания из-за модификации аминокислотного остатка в антигенной последовательности часто считается показателем компонента эпитопа, такие как аланин-сканирующий мутагенез (Cunningham & Wells (1985), Science, 244:1081) или дрожжевой дисплей мутантных вариантов целевой последовательности. Кроме того, также можно использовать вычислительные комбинаторные способы картирования эпитопов. Указанные способы основаны на способности представляющего интерес антитела к аффинному выделению специфических коротких пептидов из комбинаторных пептидных библиотек фагового дисплея. Антитела, характеризующиеся одинаковыми или очень похожими VL и VH или одинаковыми последовательностями CDR, как предполагают, связываются с одинаковым эпитопом.The term "binds to the same epitope" when used with reference to two or more antibodies means that the antibodies bind to the same segment of amino acid residues as determined by the method. Techniques for determining whether antibodies bind to the same epitope on CD40 as the antibodies described herein include, for example, epitope mapping methods such as X-ray crystal assays of antigen:antibody complexes that provide atomic resolution of the epitope, and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS). Other methods monitor antibody binding to antigenic fragments (e.g., proteolytic fragments) or to mutated variations of an antigen, where loss of binding due to modification of an amino acid residue in the antigenic sequence is often considered indicative of an epitope component, such as alanine scanning mutagenesis (Cunningham & Wells (1985), Science, 244:1081) or yeast display of mutant variants of a target sequence. In addition, computational combinatorial epitope mapping methods can also be used. These methods rely on the ability of the antibody of interest to affinity isolate specific short peptides from combinatorial peptide phage display libraries. Antibodies having the same or very similar VL and VH or the same CDR sequences are predicted to bind the same epitope.
Антитела, которые конкурируют с другим антителом за связывание с мишенью, относятся к антителам, которые ингибируют (частично или полностью) связывание другого антитела с мишенью. Независимо от того, конкурируют ли два антитела друг с другом за связывание с мишенью, т.е. независимо от того, будет ли ингибировать и в какой степени одно антитело ингибирует связывание другого антитела с мишенью, можно определить с использованием известных конкурентных экспериментов. Согласно определенным вариантам осуществления антитело конкурирует за связывание и ингибирует связывание другого антитела с мишенью по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100%. Уровень ингибирования или конкуренции может являться различным в зависимости от того, какое антитело представляет собой блокирующее антитело (т.е. холодное антитело, которое инкубируют первым с мишенью). Конкурентные анализы можно проводить, как описано, например, в Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb. Protoc; 2006; doi: 10.1101/pdb.prot4277 или в главе 11 в Using Antibodies Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999. Конкурирующие антитела связываются с одним и тем же эпитопом, перекрывающимся эпитопом или с соседними эпитопами (например, о чем свидетельствует стерическое препятствие).Antibodies that compete with another antibody for binding to a target refer to antibodies that inhibit (partially or completely) the binding of another antibody to the target. Whether two antibodies compete with each other for binding to the target, i.e. whether and to what extent one antibody inhibits the binding of another antibody to the target, can be determined using known competition experiments. In certain embodiments, an antibody competes for binding and inhibits the binding of another antibody to the target by at least 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 or 100%. The level of inhibition or competition may vary depending on which antibody is the blocking antibody (i.e., the cold antibody that is incubated first with the target). Competitive assays can be performed as described, for example, in Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb. Protoc; 2006; doi: 10.1101/pdb.prot4277 or in Chapter 11 of Using Antibodies Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999. Competing antibodies bind to the same epitope, an overlapping epitope, or adjacent epitopes (e.g., as evidenced by steric hindrance).
Другие конкурентно-связывающие анализы включают в себя: твердофазный прямой или непрямой радиоиммуноанализ (RIA), твердофазный прямой или непрямой ферментный иммуноанализ (EIA), конкурентный сэндвич-анализ (см. Stahli et al. (1983), Methods in Enzymology 9:242); твердофазный прямой EIA с использованием биотина-авидина (см. Kirkland et al. (1986), J. Immunol. 137:3614); твердофазный прямой анализ с мечением, твердофазный прямой сэндвич-анализ с мечением (см. Harlow and Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); твердофазный прямой RIA с мечением с использованием метки I-125 (см. Morel et al. (1988), Mol. Immunol. 25(1):7); твердофазный прямой EIA с использованием биотина-авидина (Cheung et al. (1990), Virology 176:546) и прямой RIA с мечением (Moldenhauer et al. (1990), Scand. J. Immunol. 32:77).Other competitive binding assays include: solid-phase direct or indirect radioimmunoassay (RIA), solid-phase direct or indirect enzyme immunoassay (EIA), competitive sandwich assay (see Stahli et al. (1983), Methods in Enzymology 9:242); solid-phase direct EIA using biotin-avidin (see Kirkland et al. (1986), J. Immunol. 137:3614); solid-phase direct labeling assay, solid-phase direct labeling sandwich assay (see Harlow and Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); solid-phase direct labeling RIA using I-125 labeling (see Morel et al. (1988), Mol. Immunol. 25(1):7); solid-phase direct EIA using biotin-avidin (Cheung et al. (1990) Virology 176:546) and direct labeled RIA (Moldenhauer et al. (1990) Scand. J. Immunol. 32:77).
Используемые в настоящем документе термины специфическое связывание, селективное связывание, селективно связывается и специфически связывается относятся к антителу, связывающемуся с эпитопом на заданном антигене, но не с другими антигенами. Как правило, антитело (i) связывается с равновесной константой диссоциации (KD), составляющей приблизительно меньше чем 10-7 М, такой как приблизительно меньше чем 10-8, 10-9 или 10-10 М или даже ниже при определении с помощью, например, технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR) в приборе для проведения поверхностного плазмонного резонанса BIACORE® 2000 с использованием заданного антигена, например рекомбинантного CD40 человека, в качестве аналита и антитела в качестве лиганда, или анализа Скэтчарда связывания антитела с положительными в отношении антигена клетками, и (ii) связывается с заданным антигеном с аффинностью, которая по меньшей мере в два раза больше, чем его аффинность для связывания с неспецифическим антигеном (например, BSA, казеином), отличным от заданного антигена или близкородственного антигена. Соответственно, антитело, которое специфически связывается с CD40 человека относится к антителу, которое связывается с растворимым или связанным с клетками CD40 человека с KD, составляющей 10-7 М или меньше, например, приблизительно меньше чем 10-8, 10-9 или 10-10 М или даже ниже. Антитело, которое дает перекрестную реакцию с CD40 яванского макака, относится к антителу, которое связывается с CD40 яванского макака с KD, составляющей 10-7 М или меньше, например, приблизительно меньше чем 10-8, 10-9 или 10-10 М или даже ниже.As used herein, the terms specific binding, selective binding, selectively binds, and specifically binds refer to an antibody binding to an epitope on a given antigen but not to other antigens. Typically, the antibody (i) binds with an equilibrium dissociation constant (KD) of less than about 10-7 M, such as less than about 10-8 , 10-9 or 10-10 M, or even lower, when determined using, for example, surface plasmon resonance (SPR) technology in a BIACORE® 2000 Surface Plasmon Resonance Instrument using a given antigen, such as recombinant human CD40, as an analyte and the antibody as a ligand, or a Scatchard analysis of binding of the antibody to antigen-positive cells, and (ii) binds to the given antigen with an affinity that is at least two-fold greater than its affinity for binding to a non-specific antigen (e.g., BSA, casein) other than the given antigen or a closely related antigen. Accordingly, an antibody that specifically binds to human CD40 refers to an antibody that binds to soluble or cell-bound human CD40 with a KD of 10-7 M or less, such as about less than 10-8 , 10-9 or 10-10 M or even lower. An antibody that cross-reacts with cynomolgus monkey CD40 refers to an antibody that binds to cynomolgus monkey CD40 with a KD of 10-7 M or less, such as about less than 10-8 , 10-9 or 10-10 M or even lower.
Используемый в настоящем документе термин Κ^^ или KA относится к константе скорости ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген, тогда как используемый в настоящем документе термин ^исс или KD относится к константе скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Используемый в настоящем документе термин KD относится к равновесной константе диссоциации, которую получают из соотношения KD к KA (т.е. KD/KA) и выражают как молярную конAs used herein, the term K^^ or KA refers to the association rate constant of a particular antibody-antigen interaction, while the term KD or K A as used herein refers to the dissociation rate constant of a particular antibody-antigen interaction. As used herein, the term KD refers to the equilibrium dissociation constant, which is obtained from the ratio of KD to KA (i.e., KD/KA) and is expressed as a molar con
- 8 048278 центрацию (М). Значения KD для антител можно определить с использованием способов, общепринятых в настоящей области техники. Предпочтительный способ определения KD антитела представляет собой анализ биослойной интерферометрии (BLI), предпочтительно с использованием устройства ForteBio Octet RED, поверхностный плазмонный резонанс, предпочтительно с использованием биосенсорной системы, такой как система поверхностного плазмонного резонанса BIACORE® (см. пример 5), или проточную цитометрию и анализ Скэтчарда.- 8 048278 concentration (M). KD values for antibodies can be determined using methods generally accepted in the art. A preferred method for determining the KD of an antibody is biolayer interferometry (BLI) analysis, preferably using a ForteBio Octet RED device, surface plasmon resonance, preferably using a biosensor system such as the BIACORE® Surface Plasmon Resonance System (see Example 5), or flow cytometry and Scatchard analysis.
Термин ЕС50 в контексте in vitro или in vivo анализа с использованием антитела или его антигенсвязывающего фрагмента относится к концентрации антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которая вызывает ответ, который составляет 50% от максимального ответа, т.е. находится посередине между максимальным ответом и исходным значением.The term EC50 in the context of an in vitro or in vivo assay using an antibody or antigen-binding fragment thereof refers to the concentration of the antibody or antigen-binding fragment thereof that elicits a response that is 50% of the maximal response, i.e. midway between the maximal response and the baseline value.
Термин связывается с иммобилизованным CD40 относится к способности описанного в настоящем документе антитела связываться с CD40, например, экспрессированным на поверхности клетки или прикрепленным к твердой подложке.The term “binds to immobilized CD40” refers to the ability of an antibody described herein to bind to CD40, such as that expressed on the surface of a cell or attached to a solid support.
Используемый в настоящем документе термин дает перекрестную реакцию относится к способности описанного в настоящем документе антитела связываться с CD40 из другого вида. Например, описанное в настоящем документе антитело, которое связывается CD40 человека, также может связываться с CD40 из другого вида (например, CD40 яванского макака). Используемую в настоящем документе перекрестную реактивность можно измерить путем обнаружения специфической реактивности с очищенным антигеном в анализах связывания (например, SPR, ELISA), или связывания, или иным образом функционального взаимодействия с клетками, физиологически экспрессирующими CD40. Способы определения перекрестной реактивности включают в себя стандартные анализы связывания, описанные в настоящем документе, например, с помощью анализа поверхностного плазмонного резонанса BIACORE® (SPR) с использованием прибора BIACORE® 2000 SPR (Biacore AB, Uppsala, Sweden) или техник проточной цитометрии.As used herein, the term "cross-reacts" refers to the ability of an antibody described herein to bind to CD40 from another species. For example, an antibody described herein that binds human CD40 may also bind to CD40 from another species (e.g., cynomolgus monkey CD40). Cross-reactivity as used herein can be measured by detecting specific reactivity with purified antigen in binding assays (e.g., SPR, ELISA), or binding to or otherwise functionally interacting with cells physiologically expressing CD40. Methods for determining cross-reactivity include standard binding assays described herein, such as by BIACORE® Surface Plasmon Resonance (SPR) analysis using a BIACORE® 2000 SPR instrument (Biacore AB, Uppsala, Sweden) or flow cytometric techniques.
Используемый в настоящем документе термин встречающийся в природе применительно к объекту относится к тому факту, что объект может встречаться в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, которая присутствует в организме (включая в себя вирусы), которую можно выделить из источника в природе и которая преднамеренно не была модифицирована человеком в лаборатории, является встречающейся в природе.As used herein, the term naturally occurring with respect to an object refers to the fact that the object can be found in nature. For example, a polypeptide or polynucleotide sequence that is present in an organism (including viruses), that can be isolated from a source in nature, and that has not been intentionally modified by man in a laboratory is naturally occurring.
Полипептид относится к цепи, содержащей по меньшей мере два последовательно связанных аминокислотных остатка, без верхнего предела по длине цепи. Один или несколько аминокислотных остатков в белке могут содержать модификацию, такую как без ограничения гликозилирование, фосфорилирование или дисульфидная связь. Белок может содержать один или несколько полипептидов.A polypeptide refers to a chain containing at least two consecutively linked amino acid residues, with no upper limit on chain length. One or more amino acid residues in a protein may contain a modification such as, but not limited to, glycosylation, phosphorylation, or a disulfide bond. A protein may contain one or more polypeptides.
Подразумевается, что используемый в настоящем документе термин молекула нуклеиновой кислоты включает в себя молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может являться одноцепочечной или двухцепочечной и может представлять собой кДНК.As used herein, the term nucleic acid molecule is intended to include DNA molecules and RNA molecules. A nucleic acid molecule may be single-stranded or double-stranded and may be cDNA.
Также предусмотрены консервативные модификации последовательности в последовательности антитела, предусмотренной в настоящем документе, т.е. модификации нуклеотидной и аминокислотной последовательности, которые не отменяют связывание антитела, кодируемого нуклеотидной последовательностью или содержащего аминокислотную последовательность, с антигеном. Например, модификации можно ввести с помощью стандартных техник, известных в настоящей области техники, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативные модификации последовательности включают в себя консервативные аминокислотные замены, в которых аминокислотный остаток замещен аминокислотным остатком, характеризующимся сходной боковой цепью. Семейства аминокислотных остатков, характеризующихся сходными боковыми цепями, были определены в настоящей области техники. Указанные семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, прогнозируемый несущественный аминокислотный остаток в антителе к CD40 предпочтительно замещен другим аминокислотным остатком из того же семейства боковых цепей. Способы идентификации нуклеотидных и аминокислотных консервативных замен, которые не устраняют связывание антигена, хорошо известны в настоящей области техники. См., например, Brummell et al. (1993), Biochem. 32:1180-1187; Kobayashi et al. (1999), Protein Eng. 12(10):879-884; и Burks et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 94:412-417.Also contemplated are conservative sequence modifications in the antibody sequence provided herein, i.e., modifications of the nucleotide and amino acid sequence that do not abolish binding of the antibody encoded by the nucleotide sequence or comprising the amino acid sequence to an antigen. For example, modifications can be introduced using standard techniques known in the art, such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis. Conservative sequence modifications include conservative amino acid substitutions in which an amino acid residue is replaced by an amino acid residue characterized by a similar side chain. Families of amino acid residues characterized by similar side chains have been defined in the art. These families include amino acids with basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine), acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine, tryptophan), non-polar side chains (e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine), beta-branched side chains (e.g., threonine, valine, isoleucine), and aromatic side chains (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine). Thus, a predicted non-essential amino acid residue in an anti-CD40 antibody is preferably substituted with another amino acid residue from the same side chain family. Methods for identifying nucleotide and amino acid conservative substitutions that do not abolish antigen binding are well known in the art. See, for example, Brummell et al. (1993), Biochem. 32:1180-1187; Kobayashi et al. (1999), Protein Eng. 12(10):879-884; and Burks et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 94:412-417.
Альтернативно, согласно другому варианту осуществления мутации можно вводить случайным образом по всей или части кодирующей последовательности антитела к CD40, например, с помощью насыщающего мутагенеза, и полученные модифицированные антитела к CD40 можно подвергать скринингу в отношении улучшенной связывающей активности.Alternatively, in another embodiment, mutations can be introduced randomly throughout all or part of the coding sequence of the CD40 antibody, such as by saturation mutagenesis, and the resulting modified CD40 antibodies can be screened for improved binding activity.
- 9 048278- 9 048278
Для нуклеиновых кислот термин существенная гомология указывает на то, что две нуклеиновые кислоты или их обозначенные последовательности при оптимальном выравнивании и сравнении являются идентичными, с соответствующими нуклеотидными вставками или делециями по меньшей мере приблизительно на 80% нуклеотидов, как правило, по меньшей мере приблизительно на 90-95% и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 98-99,5% нуклеотидов. Альтернативно, существенная гомология существует, если сегменты будут гибридизоваться при условиях селективной гибридизации с комплементарной цепью.For nucleic acids, the term substantial homology indicates that two nucleic acids or designated sequences thereof, when optimally aligned and compared, are identical, with corresponding nucleotide insertions or deletions, in at least about 80% of the nucleotides, typically at least about 90-95%, and more preferably at least about 98-99.5% of the nucleotides. Alternatively, substantial homology exists if the segments will hybridize under selective hybridization conditions to the complementary strand.
Для полипептидов термин существенная гомология указывает на то, что два полипептида или их обозначенные последовательности при оптимальном выравнивании и сравнении являются идентичными, с соответствующими аминокислотными вставками или делециями, по меньшей мере приблизительно на 80% аминокислот, как правило, по меньшей мере приблизительно на 90-95% и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 98-99,5% аминокислот.For polypeptides, the term substantial homology indicates that two polypeptides or designated sequences thereof, when optimally aligned and compared, are identical, with appropriate amino acid insertions or deletions, in at least about 80% of the amino acids, typically at least about 90-95%, and more preferably at least about 98-99.5% of the amino acids.
Идентичность в процентах между двумя последовательностями представляет собой функцию от числа идентичных положений, общих для последовательностей при оптимальном выравнивании последовательностей (т.е. % гомологии = число идентичных положений/общее число положений х 100), с оптимальным выравниванием, определяемым с учетом числа разрывов и длины каждого разрыва, который необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение идентичности в процентах между двумя последовательностями можно осуществить с использованием математического алгоритма, описанного в неограничивающих примерах ниже.The percent identity between two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences in an optimal alignment of the sequences (i.e., % homology = number of identical positions/total number of positions x 100), with the optimal alignment determined by taking into account the number of gaps and the length of each gap that must be introduced to optimally align the two sequences. Comparison of sequences and determination of percent identity between two sequences can be accomplished using the mathematical algorithm described in the non-limiting examples below.
Идентичность в процентах между двумя нуклеотидными последовательностями можно определить с использованием программы GAP в пакете программного обеспечения GCG с использованием NWSgapdna. Матрица СМР и штраф за введение разрыва составляет 40, 50, 60, 70 или 80, и штраф за удлинение разрыва составляет 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Идентичность в процентах между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями также можно определить с использованием алгоритма Е. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)), который встроен в программу ALIGN (версия 2.0), с использованием таблицы весов замен остатков РАМ120, штрафа за удлинение разрыва, составляющего 12, и штрафа за введение разрыва, составляющего 4. Кроме того, идентичность в процентах между двумя аминокислотными последовательностями можно определить с использованием алгоритма НидлманаВунша, Needleman and Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. (48):444-453), который встроен в программу GAP в пакете программного обеспечения GCG, с использованием либо матрицы Blossum 62, либо матрицы РАМ250 и штрафа за введение разрыва, составляющего 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4, и штрафа за удлинение разрыва, составляющего 1, 2, 3, 4, 5 или 6.The percent identity between two nucleotide sequences can be determined using the GAP program in the GCG software package using NWSgapdna. The CMP matrix and gap introduction penalty are 40, 50, 60, 70, or 80, and the gap extension penalty is 1, 2, 3, 4, 5, or 6. The percent identity between two nucleotide or amino acid sequences can also be determined using the algorithm of E. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4:11–17 (1989)), which is built into the ALIGN program (version 2.0), using the PAM120 residue substitution weight table, a gap extension penalty of 12, and a gap introduction penalty of 4. Additionally, the percent identity between two amino acid sequences can be determined using the Needleman and Wunsch algorithm ((1970) J. Mol. Biol. (48):444–453), which is built into the GAP program in the GCG software package, using either the Blossum 62 matrix or the PAM250 matrix and a gap introduction penalty of 16, 14, 12, 10, 8, 6, or 4 and a gap extension penalty of 1, 2, 3, 4, 5, or 6.
Описанные в настоящем документе последовательности нуклеиновых кислот и белковые последовательности можно дополнительно использовать в качестве искомой последовательности для проведения поиска в общедоступных базах данных, например, для идентификации связанных с ней последовательностей. Такие поиски можно проводить с использованием программ NBLAST и XBLAST (версия 2.0) от Altschul, et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-10. Поиски нуклеотидов в BLAST можно проводить с помощью программы NBLAST, вес = 100, длина слова = 12 с получением нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот, описанным в настоящем документе. Поиски белков в BLAST можно проводить с помощью программы XBLAST, вес = 50, длина слова = 3 с получением аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам белков, описанных в настоящем документе. Для получения содержащих разрывы выравниваний для целей сравнения можно использовать Gapped BLAST, как описано в Altschul et at., (1997), Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST можно использовать параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST).The nucleic acid and protein sequences described herein can additionally be used as a target sequence to search publicly available databases, for example, to identify sequences related thereto. Such searches can be performed using the NBLAST and XBLAST (version 2.0) programs of Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. BLAST nucleotide searches can be performed using the NBLAST program, weight = 100, wordlength = 12, to obtain nucleotide sequences homologous to the nucleic acid molecules described herein. BLAST protein searches can be performed using the XBLAST program, weight = 50, wordlength = 3, to obtain amino acid sequences homologous to the protein molecules described herein. To obtain gapped alignments for comparison purposes, Gapped BLAST can be used as described in Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25(17):3389–3402. When using the BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of the respective programs (e.g., XBLAST and NBLAST) can be used.
Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, в клеточном лизате или в частично очищенной или по существу чистой форме. Нуклеиновая кислота является выделенной или ставшей по существу чистой, будучи очищенной от других клеточных компонентов или других примесей, например, других клеточных нуклеиновых кислот (например, других частей хромосомы) или белков, с помощью стандартных техник, включая в себя обработку щелочью/SDS, бэндинг с помощью CsCl, колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие способы, хорошо известные в настоящей области техники. См., F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).Nucleic acids may be present in whole cells, in a cell lysate, or in partially purified or substantially pure form. Nucleic acid is isolated or rendered substantially pure by being purified from other cellular components or other contaminants, such as other cellular nucleic acids (e.g., other portions of a chromosome) or proteins, by standard techniques including alkali/SDS treatment, CsCl banding, column chromatography, agarose gel electrophoresis, and other methods well known in the art. See, F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).
Подразумевается, что используемый в настоящем документе термин вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Один тип вектора представляет собой плазмиду, которая относится к кольцевой двухцепочечной петле ДНК, в которую можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Другой тип вектора представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК можно лигировать в вирусный геном. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую их вводят (например, бактериальные векторы, характеризующиеся бактериальной точкой начала репликации и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) можно интегрировать в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина и тем самым реплиAs used herein, the term vector is intended to refer to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it is linked. One type of vector is a plasmid, which refers to a circular double-stranded loop of DNA into which additional DNA segments can be ligated. Another type of vector is a viral vector, in which additional DNA segments can be ligated into the viral genome. Certain vectors are capable of autonomous replication within the host cell into which they are introduced (e.g., bacterial vectors characterized by a bacterial origin of replication and mammalian episomal vectors). Other vectors (e.g., non-episomal mammalian vectors) can integrate into the host cell's genome upon introduction into the host cell and thereby replicate.
- 10 048278 цировать вместе с геномом хозяина. Более того, определенные векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называются в настоящем документе рекомбинантные векторы экспрессии (или просто векторы экспрессии). В общем, векторы экспрессии, находящие применение в техниках рекомбинантной ДНК, часто находятся в форме плазмид. Согласно настоящему описанию изобретения термины плазмида и вектор можно использовать взаимозаменяемо, так как плазмида представляет собой наиболее часто используемую форму вектора. Тем не менее также предусмотрены другие формы векторов экспрессии, такие как вирусные векторы (например, дефектные в отношении репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.- 10 048278 copy together with the host genome. Moreover, certain vectors are capable of directing the expression of genes to which they are operably linked. Such vectors are referred to herein as recombinant expression vectors (or simply expression vectors). In general, expression vectors that find use in recombinant DNA techniques are often in the form of plasmids. In the present description of the invention, the terms plasmid and vector may be used interchangeably, since the plasmid is the most commonly used form of vector. However, other forms of expression vectors are also contemplated, such as viral vectors (e.g., replication-defective retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses), which serve equivalent functions.
Подразумевается, что используемый в настоящем документе термин рекомбинантная клеткахозяин (или просто клетка-хозяин) относится к клетке, которая содержит нуклеиновую кислоту, которая не присутствует естественным образом в клетке, и может представлять собой клетку, в которую ввели рекомбинантный вектор экспрессии. Следует понимать, что такие термины, как подразумевается, относятся не только к конкретной клетке субъекта, но также к потомству такой клетки. Поскольку определенные модификации могут происходить в последующих поколениях вследствие либо мутации, либо влияний окружающей среды, такое потомство не может, по сути, быть идентичным родительской клетке, но все еще включено в объем используемого в настоящем документе термина клетка-хозяин.As used herein, the term recombinant host cell (or simply host cell) is intended to refer to a cell that contains a nucleic acid that is not naturally present in the cell, and may be a cell into which a recombinant expression vector has been introduced. It should be understood that such terms are intended to refer not only to a particular cell of a subject, but also to the progeny of such a cell. Since certain modifications may occur in subsequent generations due to either mutation or environmental influences, such progeny may not be substantially identical to the parent cell, but are still included within the scope of the term host cell as used herein.
Иммунный ответ относится к биологическому ответу в организме позвоночного против чужеродных агентов, причем этот ответ защищает организм от указанного агента и заболеваний, вызванных ими. Иммунный ответ опосредован действием клетки иммунной системы (например, Т-лимфоцита, В-лимфоцита, клетки-натурального киллера (NK), макрофага, эозинофила, тучной клетки, дендритной клетки или нейтрофила) и растворимых макромолекул, производимых любой из указанных клеток или печенью (включая в себя антитела, цитокины и комплемент), которое приводит к селективному нацеливанию, связыванию, повреждению, разрушению и/или устранению из организма позвоночного инвазивных патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, злокачественных или других патологических клеток или в случае аутоиммунной реакции или патологического воспаления нормальных клеток или тканей человека. Иммунная реакция включает в себя, например, активацию или ингибирование Т-клетки, например эффекторной Т-клетки или Th-клетки, такой как CD4+ или CD8+ Т-клетка, или ингибирование или истощение Treg-клетки. Т-эффекторные (Teff) клетки относится к Т-клеткам (например, CD4+ и CD8+ Т-клеткам) с цитолитическими активностями, а также Т-хелперным (Th) клеткам, которые секретируют цитокины и активируют и направляют другие иммунные клетки, но не включают в себя регуляторные Т-клетки (Treg-клетки).The immune response refers to the biological response in a vertebrate organism against foreign agents, which response protects the organism from said agent and diseases caused by them. The immune response is mediated by the action of an immune system cell (e.g., a T lymphocyte, B lymphocyte, natural killer (NK) cell, macrophage, eosinophil, mast cell, dendritic cell, or neutrophil) and soluble macromolecules produced by any of these cells or by the liver (including antibodies, cytokines, and complement), which results in the selective targeting, binding, injury, destruction, and/or elimination from the vertebrate organism of invasive pathogens, pathogen-infected cells or tissues, malignant or other pathological cells, or, in the case of an autoimmune reaction or pathological inflammation, normal human cells or tissues. An immune response includes, for example, the activation or inhibition of a T cell, such as an effector T cell or a Th cell such as a CD4+ or CD8+ T cell, or the inhibition or depletion of a Treg cell. T effector (Teff ) cells refer to T cells (e.g., CD4+ and CD8+ T cells) with cytolytic activities, as well as T helper (Th) cells that secrete cytokines and activate and direct other immune cells, but do not include regulatory T cells (Treg cells).
Используемый в настоящем документе термин опосредованный Т-клетками ответ относится к ответу, опосредованному Т-клетками, включая в себя эффекторные Т-клетки (например, CD8+ клетки) и хелперные Т-клетки (например, CD4+ клетки). Опосредованные Т-клетками ответы включают в себя, например, Т-клеточную цитотоксичность и пролиферацию.As used herein, the term T cell-mediated response refers to a response mediated by T cells, including effector T cells (e.g., CD8+ cells) and helper T cells (e.g., CD4+ cells). T cell-mediated responses include, for example, T cell cytotoxicity and proliferation.
Используемый в настоящем документе термин ответ цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) относится к иммунному ответу, индуцированному цитотоксическими Т-клетками. Ответы CTL опосредованы, главным образом, CD8+ Т-клетками.As used herein, the term cytotoxic T lymphocyte (CTL) response refers to the immune response induced by cytotoxic T cells. CTL responses are mediated primarily by CD8+ T cells.
Иммуномодулятор или иммунорегулятор относится к средству, например компоненту сигнального пути, который может быть вовлечен в модулирование, регуляцию или модификацию иммунного ответа. Модулирование, регуляция или модификация иммунного ответа относится к любому изменению в клетке иммунной системы или в активности такой клетки (например, эффекторной Т-клетки). Такая модуляция включает в себя стимуляцию или подавление иммунной системы, что может проявляться в увеличении или уменьшении числа различных типов клеток, увеличении или уменьшении активности указанных клеток или любых других изменениях, которые могут происходить в иммунной системе. Идентифицированы как ингибирующие и стимулирующие иммуномодуляторы, некоторые из которых могут характеризоваться усиленной функцией в микроокружении опухоли. Согласно предпочтительным вариантам осуществления иммуномодулятор расположен на поверхности Т-клетки. Иммуномодулирующая мишень или иммунорегуляторная мишень представляет собой иммуномодулятор, который нацелен на связывание и чья активность изменяется за счет связывания вещества, средства, фрагмента, соединения или молекулы. Иммуномодулирующие мишени включают в себя, например, рецепторы на поверхности клетки (иммуномодулирующие рецепторы) и лиганды рецепторов (иммуномодулирующие лиганды).An immunomodulator or immunoregulator refers to an agent, such as a component of a signaling pathway, that can be involved in modulating, regulating or modifying an immune response. Modulating, regulating or modifying an immune response refers to any change in a cell of the immune system or in the activity of such a cell (e.g., an effector T cell). Such modulation includes stimulation or suppression of the immune system, which can be manifested by an increase or decrease in the number of different types of cells, an increase or decrease in the activity of these cells, or any other changes that can occur in the immune system. Inhibitory and stimulatory immunomodulators have been identified, some of which may have enhanced function in the tumor microenvironment. According to preferred embodiments, the immunomodulator is located on the surface of a T cell. An immunomodulatory target or immunoregulatory target is an immunomodulator that is targeted to bind and whose activity is altered by binding a substance, agent, fragment, compound or molecule. Immunomodulatory targets include, for example, cell surface receptors (immunomodulatory receptors) and receptor ligands (immunomodulatory ligands).
Иммунотерапия относится к лечению субъекта, пораженного заболеванием или подверженного риску появления заболевания или страдающего от рецидива заболевания, с помощью способа, предусматривающего индукцию, усиление, подавление или иным образом модификацию иммунного ответа.Immunotherapy refers to the treatment of a subject afflicted with a disease or at risk of developing the disease or suffering from a relapse of the disease by a method that involves inducing, enhancing, suppressing or otherwise modifying the immune response.
Иммуностимулирующая терапия или иммуностимуляторная терапия относится к терапии, которая приводит к увеличению (индукции или усилению) иммунного ответа у субъекта, например, для лечения рака.Immunostimulatory therapy or immunostimulatory therapy refers to therapy that results in an increase (induction or enhancement) of the immune response in a subject, such as for the treatment of cancer.
Потенцирующий эндогенный иммунный ответ означает увеличивающий эффективность или результативность существующего иммунного ответа у субъекта. Это увеличение эффективности и резульPotentiating the endogenous immune response means increasing the effectiveness or efficiency of an existing immune response in a subject. This increase in the effectiveness and efficiency
- 11 048278 тативности может быть достигнуто, например, путем преодоления механизмов, которые подавляют эндогенный иммунный ответ хозяина или путем симуляции механизмов, которые усиливают эндогенный иммунный ответ хозяина.- 11 048278 tativity can be achieved, for example, by overcoming mechanisms that suppress the endogenous immune response of the host or by simulating mechanisms that enhance the endogenous immune response of the host.
Используемый в настоящем документе термин связанные относится к ассоциации двух или более молекул. Связь может являться ковалентной или нековалентной. Связь также может являться генетической (например, рекомбинантно слитые). Такие связи могут быть достигнуты с использованием широкого разнообразия общепринятых техник, таких как химическое конъюгирование и получение рекомбинантных белков.As used herein, the term "linked" refers to an association of two or more molecules. The linkage may be covalent or non-covalent. The linkage may also be genetic (e.g., recombinant fusion). Such linkages may be achieved using a wide variety of conventional techniques, such as chemical conjugation and recombinant protein production.
Используемый в настоящем документе термин введение относится к физическому введению композиции, содержащей терапевтическое средство субъекту с использованием любого из различных способов и систем доставки, известных специалистам в настоящей области техники. Предпочтительные пути введения для антител, описанных в настоящем документе, включают в себя следующее: внутривенный, интраперитонеальный, внутримышечный, подкожный, спинальный или другие парентеральные пути введения, например, с помощью инъекции или инфузии. Используемая в настоящем документе фраза парентеральное введение означает способы введения, отличные от энтерального и местного введения, как правило, с помощью инъекции, и включает в себя без ограничения следующее: внутривенная, интраперитонеальная, внутримышечная, внутриартериальная, интратекальная, внутрилимфатическая, внутриочаговая, внутрикапсульная, интраорбитальная, интракардиальная, интрадермальная, транстрахеальная, подкожная, внутрикожная, внутрисуставная, подкапсульная, субарахноидальная, интраспинальная, эпидуральная и внутригрудинная инъекция и инфузия, а также in vivo электропорация. Альтернативно, описанное в настоящем документе антитело можно вводить посредством непарентерального пути, такого как местный, эпидермальный или мукозальный пути введения, например интраназально, перорально, вагинально, ректально, сублингвально или местно. Введение также можно проводить, например, один раз, много раз и/или в течение одного или нескольких длительных периодов.As used herein, the term "administration" refers to the physical introduction of a composition comprising a therapeutic agent into a subject using any of the various delivery methods and systems known to those skilled in the art. Preferred routes of administration for the antibodies described herein include the following: intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, spinal, or other parenteral routes of administration, such as by injection or infusion. As used herein, the phrase parenteral administration means routes of administration other than enteral and local administration, typically by injection, and includes, without limitation, the following: intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intrathecal, intralymphatic, intralesional, intracapsular, intraorbital, intracardiac, intradermal, transtracheal, subcutaneous, intradermal, intra-articular, subcapsular, subarachnoid, intraspinal, epidural, and intrasternal injection and infusion, as well as in vivo electroporation. Alternatively, an antibody described herein can be administered via a non-parenteral route, such as a topical, epidermal, or mucosal route, such as intranasally, orally, vaginally, rectally, sublingually, or topically. The administration can also be carried out, for example, once, multiple times and/or over one or more long periods.
Используемые в настоящем документе термины ингибирует или блокирует используют взаимозаменяемо, и они включают как частичное, так и полное ингибирование/блокирование по меньшей мере приблизительно на 50%, например, по меньшей мере приблизительно на 60, 70, 80, 90, 95, 99 или 100%.As used herein, the terms inhibits or blocks are used interchangeably and include both partial and complete inhibition/blocking by at least about 50%, such as at least about 60, 70, 80, 90, 95, 99, or 100%.
Используемый в настоящем документе термин рак относится к широкой группе заболеваний, харастеризующихся неконтролируемым ростом аномальных клеток в организме. Нерегулируемое клеточное деление может привести к образованию раковых опухолей или клеток, которые проникают в соседние ткани и могут метастазировать в отдаленные части организма через лимфатическую систему или кровоток.As used herein, the term cancer refers to a broad group of diseases characterized by the uncontrolled growth of abnormal cells in the body. Unregulated cell division can result in the formation of cancerous tumors or cells that invade nearby tissues and may metastasize to distant parts of the body through the lymphatic system or bloodstream.
Используемые в настоящем документе термины лечить, осуществление лечения и лечение относятся к любому типу вмешательства или процессу, выполняемому на субъекте, или введению активного средства субъекту с целью обратного развития, облегчения, уменьшения интенсивности, ингибирования или замедления или предотвращения прогрессирования, развития, тяжести или рецидива симптома, осложнения, состояния или биохимических признаков, связанных с заболеванием. Профилактика относится к введению субъекту, у которого отсутствует заболевание, для предотвращения возникновения заболевания или минимизации его эффектов, если оно возникает.As used herein, the terms treat, treat and cure refer to any type of intervention or process performed on a subject, or the administration of an active agent to a subject, for the purpose of reversing, alleviating, reducing the intensity of, inhibiting or slowing down, or preventing the progression, development, severity or recurrence of a symptom, complication, condition or biochemical feature associated with a disease. Prophylaxis refers to administration to a subject who does not have a disease to prevent the occurrence of the disease or to minimize its effects if it occurs.
Термин эффективная доза или эффективная дозировка определяют как количество, достаточное для достижения или по меньшей мере частичного достижения требуемого эффекта. Терапевтически эффективное количество или терапевтически эффективная дозировка лекарственного средства или терапевтического средства представляет собой любое количество лекарственного средства, которое при использовании отдельно или в комбинации с другим терапевтическим средством стимулирует обратное развитие заболевания, о чем свидетельствует снижение тяжести симптомов заболевания, увеличение частоты и продолжительности периодов без симптомов заболевания или предотвращение ухудшения или инвалидности вследствие заболевания. Профилактически эффективное количество или профилактически эффективная дозировка лекарственного средства представляет собой количество лекарственного средства, которое при введении отдельно или в комбинации с другим терапевтическим средством субъекту, подверженному риску развития заболевания или риску рецидива заболевания, ингибирует развитие или рецидив заболевания. Способность терапевтического или профилактического средства стимулировать обратное развитие заболевания или ингибировать развитие или рецидив заболевания можно оценить с использованием разнообразных способов, известных квалифицированному специалисту, например, у субъектов-людей во время клинических испытаний, в модельных системах с использованием животных, которые являются прогностическими в отношении эффективности у людей, или путем анализа активности средства в in vitro анализах.The term effective dose or effective dosage is defined as an amount sufficient to achieve or at least partially achieve the desired effect. A therapeutically effective amount or therapeutically effective dosage of a drug or therapeutic agent is any amount of a drug that, when used alone or in combination with another therapeutic agent, stimulates the regression of a disease, as evidenced by a decrease in the severity of disease symptoms, an increase in the frequency and duration of disease-free periods, or the prevention of worsening or disability due to the disease. A prophylactically effective amount or prophylactically effective dosage of a drug is an amount of a drug that, when administered alone or in combination with another therapeutic agent to a subject at risk of developing a disease or at risk of recurrence of the disease, inhibits the development or recurrence of the disease. The ability of a therapeutic or prophylactic agent to reverse disease progression or inhibit disease progression or recurrence can be assessed using a variety of methods known to those skilled in the art, such as in human subjects during clinical trials, in animal model systems that are predictive of efficacy in humans, or by assaying the activity of the agent in in vitro assays.
В качестве примера противоопухолевое средство представляет собой лекарственное средство, которое замедляет прогрессирование рака или стимулирует обратное развитие рака у субъекта. Согласно предпочтительным вариантам осуществления терапевтически эффективное количество лекарственного средства стимулирует обратное развитие рака до момента устранения рака. Стимулирование обратного развития рака означает, что введение эффективного количества лекарственного средства, отдельно или в комбинации с противоопухолевым средством, приводит к снижению роста или размера опухоли, некAs an example, an antineoplastic agent is a drug that slows the progression of cancer or promotes the regression of cancer in a subject. According to preferred embodiments, a therapeutically effective amount of the drug promotes the regression of cancer to the point of eliminating the cancer. Promoting the regression of cancer means that administration of an effective amount of the drug, alone or in combination with the antineoplastic agent, results in a decrease in the growth or size of the tumor,
- 12 048278 розу опухоли, уменьшению тяжести по меньшей мере одного симптома заболевания, увеличению частоты и продолжительности периодов без симптомов заболевания, предотвращению ухудшения или инвалидности вследствие заболевания или снижению иным образом интенсивности симптомов заболевания у пациента. Фармакологическая эффективность относится к способности лекарственного средства стимулировать обратное развитие рака у пациента. Физиологическая безопасность относится к приемлемо низкому уровню токсичности или других неблагоприятных физиологических эффектов на клеточном, органном и/или организменном уровне (неблагоприятных эффектов), являющихся результатом введения лекарственного средства.- 12 048278 tumor growth, reduction in the severity of at least one symptom of the disease, increase in the frequency and duration of periods without symptoms of the disease, prevention of deterioration or disability due to the disease, or otherwise reduction in the intensity of the symptoms of the disease in a patient. Pharmacological efficacy refers to the ability of a drug to stimulate the regression of cancer in a patient. Physiological safety refers to an acceptably low level of toxicity or other adverse physiological effects at the cellular, organ and/or organismal level (adverse effects) resulting from the administration of a drug.
В качестве примера для лечения опухолей терапевтически эффективное количество или дозировка лекарственного средства предпочтительно ингибирует клеточный рост или рост опухоли по меньшей мере приблизительно на 20%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 40%, даже более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 60% и еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 80% относительно не получивших лечение субъектов. Согласно наиболее предпочтительным вариантам осуществления терапевтически эффективное количество или дозировка лекарственного средства полностью ингибируют клеточный рост или рост опухоли, т.е. предпочтительно ингибируют клеточный рост или рост опухоли на 100%. Способность соединения ингибировать рост опухоли можно оценить с использованием анализов, описанных ниже. Ингибирование роста опухоли может не происходить непосредственно после лечения и может происходить только через определенный период времени или после повторного введения. Альтернативно, это свойство композиции можно оценить путем исследования способности соединения ингибировать клеточный рост, такое ингибирование можно измерить in vitro с помощью анализов, известных квалифицированному специалисту. Согласно другим предпочтительным вариантам осуществления, описанным в настоящем документе, можно наблюдать обратное развитие опухоли, и оно может продолжаться в течение периода, составляющего по меньшей мере приблизительно 20 дней, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 40 дней или даже более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 60 дней.As an example for the treatment of tumors, a therapeutically effective amount or dosage of a drug preferably inhibits cell growth or tumor growth by at least about 20%, more preferably at least about 40%, even more preferably at least about 60%, and even more preferably at least about 80% relative to untreated subjects. According to the most preferred embodiments, a therapeutically effective amount or dosage of a drug completely inhibits cell growth or tumor growth, i.e., preferably inhibits cell growth or tumor growth by 100%. The ability of a compound to inhibit tumor growth can be assessed using the assays described below. Inhibition of tumor growth may not occur immediately after treatment and may occur only after a certain period of time or after repeated administration. Alternatively, this property of the composition can be assessed by examining the ability of the compound to inhibit cell growth, such inhibition can be measured in vitro using assays known to those skilled in the art. According to other preferred embodiments described herein, tumor regression can be observed and can continue for a period of at least about 20 days, more preferably at least about 40 days, or even more preferably at least about 60 days.
Подразумевается, что используемая в настоящем документе комбинированная терапия, если иное не ясно из контекста, предусматривает введение двух или более терапевтических средств скоординированным образом и включает в себя без ограничения одновременное введение доз. В частности, комбинированная терапия включает в себя совместное введение (например, введение совместного состава или одновременное введение отдельных терапевтических композиций) и серийное или последовательное введение при условии, что введение одного терапевтического средства каким-то образом обусловлено введением другого терапевтического средства. Например, одно терапевтическое средство можно вводить только после того, как введено другое терапевтическое средство и ему обеспечена возможность действовать в течение заданного периода времени. См., например, Kohrt et al. (2011), Blood. 117:2423.As used herein, combination therapy, unless otherwise clear from the context, is intended to involve the administration of two or more therapeutic agents in a coordinated manner and includes, without limitation, simultaneous dosing. In particular, combination therapy includes co-administration (e.g., administration of a co-formulation or simultaneous administration of separate therapeutic compositions) and serial or sequential administration, provided that the administration of one therapeutic agent is in some way conditioned by the administration of the other therapeutic agent. For example, one therapeutic agent may be administered only after the other therapeutic agent has been administered and allowed to act for a predetermined period of time. See, e.g., Kohrt et al. (2011), Blood. 117:2423.
Термины пациент и субъект относятся к любому человеку, который получает или профилактическое, или терапевтическое лечение. Например, способы и композиции, описанные в настоящем документе, можно использовать для лечения субъекта, характеризующегося наличием рака.The terms patient and subject refer to any person who receives either prophylactic or therapeutic treatment. For example, the methods and compositions described herein can be used to treat a subject characterized by the presence of cancer.
Различные аспекты, описанные в настоящем документе, описаны более подробно в следующих разделах.The various aspects described in this document are described in more detail in the following sections.
I. Антитела к CD40.I. Antibodies to CD40.
Согласно настоящему изобретению раскрыты агонистические антитела к huCD40, характеризующиеся требуемыми свойствами для применения в качестве терапевтических средств в лечении таких заболеваний, как рак. Указанные свойства включают в себя одно или несколько из следующего: способность связываться с CD40 человека с высокой аффинностью, приемлемо низкая иммуногенность у субъектов-людей, способность связываться предпочтительно с FcYRIIb и отсутствие нежелательных особенностей в последовательности, которые могли бы снижать химическую стабильность антитела.The present invention discloses agonist antibodies to huCD40 that have desirable properties for use as therapeutic agents in the treatment of diseases such as cancer. These properties include one or more of the following: the ability to bind to human CD40 with high affinity, acceptably low immunogenicity in human subjects, the ability to bind preferentially to FcYRIIb, and the absence of undesirable sequence features that could reduce the chemical stability of the antibody.
Антитела к CD40, раскрытые в настоящем документе с помощью последовательности, связываются со специфическими эпитопами на CD40 человека. Другие антитела, которые связываются с такими же или близкородственными эпитопами, вероятно, будут характеризоваться такими же указанными требуемыми свойствами, и их можно обнаружить, выполняя конкурентные эксперименты.The CD40 antibodies disclosed herein by sequence bind to specific epitopes on human CD40. Other antibodies that bind to the same or closely related epitopes are likely to have the same desired properties as described and can be detected by performing competition experiments.
Антитела к huCD40, которые конкурируют с антителами к huCD40, раскрытыми в настоящем документе.Anti-huCD40 antibodies that compete with the anti-huCD40 antibodies disclosed herein.
Антитела к huCD40, которые конкурируют с антителами согласно настоящему изобретению за связывание с huCD40, можно получить с использованием протоколов иммунизации, сходных с протоколами, описанными в настоящем документе (примеры 1 и 2). Антитела, которые конкурируют за связывание с антителами к huCD40, раскрытыми в настоящем документе с помощью последовательности, также можно создать с помощью иммунизации мышей или другого не являющегося человеком животного с помощью CD40 человека или конструкта, содержащего его внеклеточный домен (остатки 21-193 SEQ ID NO: 11), или путем иммунизации с помощью фрагмента CD40 человека, содержащего эпитоп, связанный антителами к huCD40, раскрытыми в настоящем документе. Полученные антитела можно подвергать скринингу в отношении способности блокировать связывание антитела, содержащего мутантную Fc-область, характеризующуюся одной или несколькими мутациями, соответствующими однойAnti-huCD40 antibodies that compete with the antibodies of the present invention for binding to huCD40 can be generated using immunization protocols similar to those described herein (Examples 1 and 2). Antibodies that compete for binding with the anti-huCD40 antibodies disclosed herein by sequence can also be generated by immunizing mice or other non-human animals with human CD40 or a construct comprising its extracellular domain (residues 21-193 of SEQ ID NO: 11), or by immunizing with a fragment of human CD40 comprising an epitope bound by the anti-huCD40 antibodies disclosed herein. The resulting antibodies can be screened for the ability to block binding of an antibody comprising a mutant Fc region characterized by one or more mutations corresponding to one
- 13 048278 или нескольким мутациям в тяжелой цепи IgG, выбранным из группы, состоящей из N297A, SE, SELF, V9 и/или V11 (SEQ ID NO: 3-7), с CD40 человека с помощью способов, хорошо известных в настоящей области техники, например блокирование связывания с белком слияния внеклеточного домена CD40 и Fc-домена иммуноглобулина в ELISA или блокирование способности связываться с клетками, экспрессирующими huCD40 но своей поверхности, например, с помощью FACS. Согласно различным вариантам осуществления исследуемое антитело приводят в контакт с белком слияния CD40-Fc (или с клетками, экспрессирующими huCD40 на своей поверхности) перед, в то же время или после добавления антитела, содержащего мутантную Fc-область, характеризующуюся одной или несколькими мутациями, соответствующими одной или нескольким мутациям в тяжелой цепи IgG, выбранным из группы, состоящей из N297A, SE, SELF, V9 и/или V11 (SEQ ID NO: 3-7). Например, эксперименты по сортировке можно проводить для определения того, попадает ли исследуемое антитело в ту же группу (bin), что и антитела, раскрытые в настоящем документе с помощью последовательности, с помощью антител, раскрытых в настоящем документе с помощью последовательности в качестве эталонных антител и антител, подлежащих исследованию, в качестве исследуемых антител. Антитела, которые снижают связывание антител, раскрытых в настоящем документе с помощью последовательности, с CD40 человека (либо в виде Fc-слияния, либо на клетке), в частности, примерно при стехиометрических концентрациях, вероятно, связываются с одними и теми же, перекрывающимися или соседними эпитопами и, таким образом, могут характеризоваться общими требуемыми функциональными свойствами антитела, содержащего мутантную Fc-область, характеризующуюся одной или несколькими мутациями, соответствующими одной или нескольким мутациям в тяжелой цепи IgG, выбранным из группы, состоящей из N297A, SE, SELF, V9 и/или V11 (SEQ ID NO: 3-7).- 13 048278 or more mutations in the IgG heavy chain selected from the group consisting of N297A, SE, SELF, V9 and/or V11 (SEQ ID NO: 3-7), with human CD40 using methods well known in the art, such as blocking binding to a fusion protein of the extracellular domain of CD40 and the Fc domain of an immunoglobulin in an ELISA or blocking the ability to bind to cells expressing huCD40 on their surface, such as by FACS. In various embodiments, the antibody of interest is contacted with a CD40-Fc fusion protein (or with cells expressing huCD40 on their surface) before, at the same time as, or after the addition of an antibody comprising a mutant Fc region characterized by one or more mutations corresponding to one or more mutations in an IgG heavy chain selected from the group consisting of N297A, SE, SELF, V9, and/or V11 (SEQ ID NOs: 3-7). For example, sorting experiments can be conducted to determine whether the antibody of interest falls into the same bin as the antibodies disclosed herein by sequence, using the antibodies disclosed herein by sequence as reference antibodies and the antibodies to be studied as the antibodies of interest. Antibodies that reduce the binding of the antibodies disclosed herein by sequence to human CD40 (either as an Fc fusion or on a cell), in particular at approximately stoichiometric concentrations, are likely to bind to the same, overlapping, or adjacent epitopes and thus may share the desired functional properties of an antibody comprising a mutant Fc region characterized by one or more mutations corresponding to one or more mutations in an IgG heavy chain selected from the group consisting of N297A, SE, SELF, V9, and/or V11 (SEQ ID NOs: 3-7).
Соответственно, в настоящем документе предусмотрены антитела к huCD40, которые ингибируют связывание антител к huCD40, описанных в настоящем документе, с huCD40 на клетках по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% и/или чье связывание с huCD40 на клетках ингибируется антителами к huCD40, описанными в настоящем документе, по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%, например, что измерено с помощью ELISA или FACS, например с использованием анализа, описанного в следующем абзаце.Accordingly, provided herein are anti-huCD40 antibodies that inhibit the binding of the anti-huCD40 antibodies described herein to huCD40 on cells by at least 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100% and/or whose binding to huCD40 on cells is inhibited by the anti-huCD40 antibodies described herein by at least 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100%, for example as measured by ELISA or FACS, for example using the assay described in the next paragraph.
Иллюстративный конкурентный эксперимент для определения того, блокирует ли исследуемое антитело связывание эталонного антитела (т.е. конкурирует с эталонным антителом), можно провести следующим образом: клетки, экспрессирующие CD40, высевают с плотностью 105 клеток на лунку с образцом в 96-луночном планшете. Планшет помещают на лед с последующим добавлением неконъюгированного исследуемого антитела в концентрациях, находящихся в диапазоне от 0 до 50 мкг/мл (3-кратное титрование, начиная с самой высокой концентрации, составляющей 50 мкг/мл). Неродственный IgG можно использовать в качестве изотипного контроля для первого антитела и его добавляют в тех же концентрациях (3-кратное титрование, начиная с самой высокой концентрации, составляющей 50 мкг/мл). Образец, предварительно инкубированный с 50 мкг/мл немеченным эталонным антителом, можно включать в качестве положительного контроля для завершения блокирования (100% ингибирование), и образец без антитела в первичной инкубации можно использовать в качестве отрицательного контроля (отсутствие конкуренции; 0% ингибирование). Через 30 мин инкубации меченое, например биотинилированное, эталонное антитело добавляют в концентрации, составляющей 2 мкг/мл на лунку без отмывки. Образцы инкубируют в течение еще 30 мин на льду. Несвязанные антитела удаляют путем отмывки клеток с помощью буфера для FACS. Связанное с клетками меченое эталонное антитело обнаруживают с помощью средства, которое обнаруживает метку, например конъюгированный с РЕ стрептавидин (Invitrogen, № по кат. S21388) для обнаружения биотина. Образцы получают на проточном цитометре FACS Calibur Flow Cytometer (BD, San Jose) и анализируют с помощью программного обеспечения Flowjo (Tree Star, Inc, Ashland, OR). Результаты можно представить в виде % ингибирования (т.е. вычитание из 100% количество метки при каждой концентрации, деленное на количество метки, полученное без блокирующего антитела).An illustrative competition experiment to determine whether a test antibody blocks binding of a reference antibody (i.e., competes with the reference antibody) can be performed as follows: CD40 expressing cells are seeded at a density of 105 cells per sample well in a 96-well plate. The plate is placed on ice, followed by the addition of unconjugated test antibody at concentrations ranging from 0 to 50 μg/mL (titrated 3-fold, starting with the highest concentration of 50 μg/mL). Unrelated IgG can be used as an isotype control for the first antibody and is added at the same concentrations (titrated 3-fold, starting with the highest concentration of 50 μg/mL). A sample pre-incubated with 50 μg/mL unlabeled reference antibody can be included as a positive control to complete the blocking (100% inhibition) and a sample without antibody in the primary incubation can be used as a negative control (no competition; 0% inhibition). After 30 min of incubation, labeled, e.g. biotinylated, reference antibody is added at a concentration of 2 μg/mL per well without washing. Samples are incubated for an additional 30 min on ice. Unbound antibody is removed by washing the cells with FACS buffer. Cell-bound labeled reference antibody is detected with a means that detects the label, e.g. PE-conjugated streptavidin (Invitrogen, Cat #S21388) for biotin detection. Samples were acquired on a FACS Calibur Flow Cytometer (BD, San Jose) and analyzed using Flowjo software (Tree Star, Inc, Ashland, OR). Results can be reported as % inhibition (i.e., the amount of label at each concentration subtracted from 100%, divided by the amount of label obtained without blocking antibody).
Как правило, такой же эксперимент затем проводят наоборот, т.е. исследуемое антитело представляет собой эталонное антитело и эталонное антитело представляет собой исследуемое антитело. Согласно определенным вариантам осуществления антитело по меньшей мере частично (например, по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90%) или полностью (100%) блокирует связывание другого антитела с мишенью, например, CD40 человека или его фрагментом, и независимо от того, происходит ли ингибирование, когда одно или другое антитело является эталонным антителом. Эталонное антитело и исследуемое антитело перекрестно блокируют связывание друг друга с мишенью, когда антитела конкурируют друг с другом обоими путями, т.е. в конкурентных экспериментах, в которых сначала добавляют эталонное антитело, и в конкурентных экспериментах, в которых сначала добавляют исследуемое антитело.Typically, the same experiment is then conducted in reverse, i.e., the test antibody is the reference antibody and the reference antibody is the test antibody. In certain embodiments, the antibody at least partially (e.g., at least 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, or 90%) or completely (100%) blocks the binding of another antibody to a target, such as human CD40 or a fragment thereof, and regardless of whether the inhibition occurs when one or the other antibody is the reference antibody. The reference antibody and the test antibody cross-block each other's binding to the target when the antibodies compete with each other in both ways, i.e., in competition experiments in which the reference antibody is added first and in competition experiments in which the test antibody is added first.
Антитела к huCD40, которые связываются с одним тем же эпитопом.Antibodies to huCD40 that bind to the same epitope.
Антитела к huCD40, которые связываются с теми же или сходными эпитопами, что и антитела, раскрытые в настоящем документе, можно получить с использованием протоколов иммунизации, сходных сAnti-huCD40 antibodies that bind to the same or similar epitopes as the antibodies disclosed herein can be produced using immunization protocols similar to
- 14 048278 протоколами, описанными в настоящем документе. Полученные антитела можно подвергать скринингу в отношении высокоаффинного связывания с CD40 человека. Выбранные антитела затем можно исследовать в анализе дрожжевого дисплея, в котором варианты последовательностей huCD40 присутствуют на поверхности дрожжевых клеток, или с помощью экспериментов с водородно-дейтериевым обменом для определения точного эпитопа, связанного антителом.- 14 048278 protocols described herein. The resulting antibodies can be screened for high-affinity binding to human CD40. Selected antibodies can then be tested in a yeast display assay, in which variant huCD40 sequences are presented on the surface of yeast cells, or by hydrogen-deuterium exchange experiments to determine the precise epitope bound by the antibody.
Определения эпитопов можно осуществить с помощью любого способа, известного в настоящей области техники. Согласно различным вариантам осуществления считается, что антитела к huCD40 связываются с тем же эпитопом, что mAb к huCD40, раскрытое в настоящем документе, если они образуют контакт с одним или несколькими одинаковыми остатками в пределах по меньшей мере одной области huCD40; если они образуют контакты с большинством остатков в пределах по меньшей мере одной области huCD40; если они образуют контакты с большинством остатков в пределах каждой области huCD40; если они образуют контакт с большинством контактов по всей длине huCD40; если они образуют контакты в пределах всех одних и тех же различных областей CD40 человека; если они образуют контакт со всеми остатками на любой одной области на CD40 человека или если они образуют контакт со всеми одними и теми же остатками на всех одних и тех же областях. Эпитопные области представляют собой кластеры остатков в первичной последовательности.Epitope determinations can be made by any method known in the art. In various embodiments, anti-huCD40 antibodies are considered to bind the same epitope as an anti-huCD40 mAb disclosed herein if they make contact with one or more of the same residues within at least one region of huCD40; if they make contact with a majority of residues within at least one region of huCD40; if they make contact with a majority of residues within each region of huCD40; if they make contact with a majority of contacts along the entire length of huCD40; if they make contact within all of the same different regions of human CD40; if they make contact with all of the residues on any one region on human CD40; or if they make contact with all of the same residues on all of the same regions. Epitope regions are clusters of residues in the primary sequence.
Техники для определения антител, которые связываются с одним и тем же эпитопом на huCD40, что и антитела, описанные в настоящем документе, включают в себя рентгеновские анализы кристаллов комплексов антиген:антитело, которые обеспечивают атомное разрешение эпитопа. Другие способы обеспечивают мониторинг связывания антитела с фрагментами антигена или мутированными вариациями антигена, где потеря связывания из-за модификации аминокислотного остатка в антигенной последовательности часто считается показателем компонента эпитопа. Способы также могут быть основаны на способности представляющего интерес антитела к аффинному выделению специфических коротких пептидов (либо в нативной трехмерной форме, либо в денатурированной форме) из комбинаторных пептидных библиотек на основе фагового дисплея или с помощью протеазной обработки целевого белка. Затем пептиды рассматриваются как лидеры для определения эпитопа, соответствующего антителу, используемому для скрининга библиотеки пептидов. Для картирования эпитопов также разработаны вычислительные алгоритмы, которые, как было показано, отображают конформационные прерывистые эпитопы.Techniques for identifying antibodies that bind to the same epitope on huCD40 as the antibodies described herein include x-ray crystal assays of antigen:antibody complexes that provide atomic resolution of the epitope. Other methods monitor antibody binding to antigen fragments or mutated variations of the antigen, where loss of binding due to modification of an amino acid residue in the antigen sequence is often considered indicative of an epitope component. Methods can also be based on the ability of the antibody of interest to affinity isolate specific short peptides (either in native three-dimensional form or in denatured form) from phage display-based combinatorial peptide libraries or by protease digestion of the target protein. The peptides are then considered as leads to determine the epitope corresponding to the antibody used to screen the peptide library. Computational algorithms have also been developed for epitope mapping and have been shown to map conformational discontinuous epitopes.
Эпитоп или область, содержащую эпитоп, также можно идентифицировать с помощью скрининга в отношении связывания с серией перекрывающихся пептидов, охватывающих CD40. Альтернативно, способ согласно Jespers et al. (1994), Biotechnology, 12:899 можно использовать для направления выбора антител, характеризующихся одинаковым эпитопом и, следовательно, свойствами, сходными с антителами к CD40, описанными в настоящем документе. С использованием фагового дисплея сначала тяжелую цепь антитела к CD40 спаривают с репертуаром (предпочтительно человеческих) легких цепей для выбора CD40-связывающего антитела и затем новую легкую цепь спаривают с репертуаром (предпочтительно человеческих) тяжелых цепей для выбора (предпочтительно человеческого) связывающего CD40 антитела, характеризующегося тем же эпитопом или эпитопной областью, что и антитело к huCD40, описанное в настоящем документе. Альтернативные варианты антитела, описанного в настоящем документе, можно получить с помощью мутагенеза кДНК, кодирующей тяжелые и легкие цепи антитела.An epitope or region containing an epitope can also be identified by screening for binding to a series of overlapping peptides spanning CD40. Alternatively, the method of Jespers et al. (1994) Biotechnology 12:899 can be used to direct the selection of antibodies having the same epitope and hence properties similar to the anti-CD40 antibodies described herein. Using phage display, first the heavy chain of an anti-CD40 antibody is paired with a repertoire of (preferably human) light chains to select a CD40-binding antibody and then a new light chain is paired with a repertoire of (preferably human) heavy chains to select a (preferably human) CD40-binding antibody having the same epitope or epitope region as the anti-huCD40 antibody described herein. Alternative variants of the antibody described herein can be produced by mutagenesis of cDNA encoding the heavy and light chains of the antibody.
Аланин-сканирующий мутагенез, описанный Cunningham & Wells (1989), Science, 244:1081, или какую-либо другую форму точечного мутагенеза аминокислотных остатков в CD40 (такую как способ дрожжевого дисплея, предусмотренный в примере 6) также можно использовать для определения функционального эпитопа для антитела к CD40.Alanine scanning mutagenesis as described by Cunningham & Wells (1989), Science, 244:1081, or some other form of targeted mutagenesis of amino acid residues in CD40 (such as the yeast display method provided in Example 6) can also be used to determine a functional epitope for an antibody to CD40.
Эпитоп или эпитопную область (эпитопная область представляет собой область, содержащую эпитоп или перекрывающуюся с эпитопом), связанные специфическим антителом, также можно определить с помощью оценки связывания антитела с пептидами, содержащими фрагменты CD40. Серию перекрывающихся пептидов, включающих в себя последовательность CD40 (например, CD40 человека), можно синтезировать и подвергать скринингу в отношении связывания, например в прямом ELISA, кункурентном ELISA (где пептид оценивают в отношении его способности предотвращать связывание антитела к CD40, связанного с лункой титрационного микропланшета) или на чипе. Такие способы пептидного скрининга могут являться неспособными обнаружить некоторые прерывистые функциональные эпитопы, т.е. функциональные эпитопы, которые включают в себя аминокислотные остатки, которые не являются смежными в первичной последовательности полипептидной цепи CD40.An epitope or epitope region (an epitope region is a region containing or overlapping an epitope) bound by a specific antibody can also be determined by assessing binding of the antibody to peptides containing fragments of CD40. A series of overlapping peptides comprising a CD40 sequence (e.g., human CD40) can be synthesized and screened for binding, such as in a direct ELISA, a competitive ELISA (where the peptide is assessed for its ability to prevent binding of an anti-CD40 antibody bound to a well of a microtiter plate), or on an array. Such peptide screening methods may be unable to detect some discontinuous functional epitopes, i.e., functional epitopes that include amino acid residues that are not contiguous in the primary sequence of the CD40 polypeptide chain.
Эпитоп также можно идентифицировать с помощью основанного на MS белковом футпринтинге, таком как масс-спектрометрия водородно-дейтериевого обмена (HDX-MS) и быстрое фотохимическое окисление белков (FPOP). HDX-MS можно провести, например, как дополнительно описано в Wei et al. (2014), Drug Discovery Today, 19:95, способы которой специально включены посредством ссылки в настоящий документ. FPOP можно провести, как описано, например, в Hambley & Gross (2005), J. American Soc. Mass Spectrometry, 16:2057, способы которой специально включены посредством ссылки в настоящий документ.The epitope can also be identified using MS-based protein footprinting, such as hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) and rapid photochemical oxidation of proteins (FPOP). HDX-MS can be performed, for example, as further described in Wei et al. (2014), Drug Discovery Today, 19:95, the methods of which are expressly incorporated by reference herein. FPOP can be performed as described, for example, in Hambley & Gross (2005), J. American Soc. Mass Spectrometry, 16:2057, the methods of which are expressly incorporated by reference herein.
Эпитоп, связанный антителами к CD40, также можно определить с помощью структурных способов, таких как рентгеновское определение структуры кристаллов (например, WO 2005/044853), молекуThe epitope bound by CD40 antibodies can also be determined using structural methods such as X-ray crystal structure determination (e.g. WO 2005/044853), molecule
- 15 048278 лярное моделирование и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР), включая в себя ЯМР определение скоростей обмена H-D атомов водорода неустойчивых амидов в CD40 в свободном состоянии и связанного в комплексе с представляющим интерес антителом (Zinn-Justin et al. (1992), Biochemistry, 31:11335; Zinn-Justin et al. (1993), Biochemistry, 32:6884).- 15 048278 polar modeling and nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, including NMR determination of the H-D exchange rates of unstable amide hydrogen atoms in CD40 in the free state and bound in a complex with the antibody of interest (Zinn-Justin et al. (1992), Biochemistry, 31:11335; Zinn-Justin et al. (1993), Biochemistry, 32:6884).
В отношении рентгеновской кристаллографии кристаллизацию можно осуществить с использованием любого из способов, известных в настоящей области техники (например, Giege et al. (1994), Acta Crystallogr. D50:339; McPherson (1990), Eur. J. Biochem. 189:1), включая в себя микрообъем (например, Chayen (1997), Structure, 5:1269), диффузию из паровой фазы висячей капли (например, McPherson (1976), J. Biol. Chem. 251:6300), затравливание и диализ. Желательно использовать препарат белка, характеризующийся концентрацией, составляющей по меньшей мере приблизительно 1 мг/мл и предпочтительно приблизительно 10-20 мг/мл. Кристаллизация может быть наилучшим образом достигнута в растворе осадителя, содержащем полиэтиленгликоль 1000-20000 (PEG; средняя молекулярная масса в диапазоне от приблизительно 1000 до приблизительно 20000 Да), предпочтительно приблизительно 5000-7000 Да, более предпочтительно приблизительно 6000 Да, при этом концентрации находятся в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 30% (мас./об.). Кроме того, может быть желательно включить стабилизирующее белок средство, например глицерин, в концентрации, находящейся в диапазоне от приблизительно 0,5 до приблизительно 20%. Подходящая соль, такая как хлорид натрия, хлорид лития или цитрат натрия, также может являться желательной в растворе осадителя, предпочтительно в концентрации, находящейся в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 1000 мМ. Осадитель предпочтительно забуферивают до pH от приблизительно 3,0 до приблизительно 5,0, предпочтительно приблизительно 4,0. Конкретные буферы, применимые в растворе осадителя, могут варьировать и являются хорошо известными в настоящей области техники (Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Third ed., (1994), Springer-Verlag, New York). Примеры применимых буферов включают в себя без ограничения HEPES, Трис, MES и ацетат. Кристаллы можно выращивать в широком диапазоне температур, включая в себя 2, 4, 8 и 26°C.With respect to X-ray crystallography, crystallization can be accomplished using any of the methods known in the art (e.g., Giege et al. (1994), Acta Crystallogr. D50:339; McPherson (1990), Eur. J. Biochem. 189:1), including microvolume (e.g., Chayen (1997), Structure, 5:1269), hanging drop vapor diffusion (e.g., McPherson (1976), J. Biol. Chem. 251:6300), seeding, and dialysis. Desirably, a protein preparation having a concentration of at least about 1 mg/mL and preferably about 10-20 mg/mL is used. Crystallization can best be achieved in a precipitant solution comprising polyethyleneglycol 1000-20000 (PEG; average molecular weight in the range of about 1000 to about 20000 Da), preferably about 5000-7000 Da, more preferably about 6000 Da, with concentrations in the range of about 10 to about 30% (w/v). It may further be desirable to include a protein stabilizing agent, for example glycerol, in a concentration in the range of about 0.5 to about 20%. A suitable salt, such as sodium chloride, lithium chloride or sodium citrate, may also be desirable in the precipitant solution, preferably in a concentration in the range of about 1 to about 1000 mM. The precipitant is preferably buffered to a pH of about 3.0 to about 5.0, preferably about 4.0. Specific buffers useful in the precipitant solution can vary and are well known in the art (Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Third ed., (1994), Springer-Verlag, New York). Examples of useful buffers include, but are not limited to, HEPES, Tris, MES, and acetate. Crystals can be grown over a wide range of temperatures, including 2, 4, 8, and 26°C.
Кристаллы антитело:антиген можно исследовать с использованием хорошо известных техник рентгеновской дифракции и можно уточнять с использованием компьютерного программного обеспечения, такого как X-PLOR (Yale University, 1992, распространяемого Molecular Simulations, Inc.; см., например, Blundell & Johnson (1985), Meth. Enzymol. 114 & 115, H.W. Wyckoff et al., eds., Academic Press; публикация заявки на выдачу патента США № 2004/0014194) и BUSTER (Bricogne (1993), Acta Cryst. D49:37-60; Bricogne (1997), Meth. Enzymol. 276A:361-423, Carter & Sweet, eds.; Roversi et al. (2000), Acta Cryst. D56:1313-1323), раскрытия которых полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.Antibody:antigen crystals can be characterized using well-known X-ray diffraction techniques and can be refined using computer software such as X-PLOR (Yale University, 1992, distributed by Molecular Simulations, Inc.; see, e.g., Blundell & Johnson (1985), Meth. Enzymol. 114 & 115, H.W. Wyckoff et al., eds., Academic Press; U.S. Patent Application Publication No. 2004/0014194) and BUSTER (Bricogne (1993), Acta Cryst. D49:37-60; Bricogne (1997), Meth. Enzymol. 276A:361-423, Carter & Sweet, eds.; Roversi et al. (2000), Acta Cryst. D56:1313-1323), the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety.
Если не указано иное и со ссылкой на формулу изобретения, эпитоп, связанный антителом, представляет собой эпитоп, как определено с помощью способов HDX-MS.Unless otherwise stated and with reference to the claims, an epitope bound by an antibody is an epitope as determined by HDX-MS methods.
Антитела к CD40, которые связываются с высокой аффинностью.Antibodies to CD40 that bind with high affinity.
Согласно некоторым вариантам осуществления антитела к huCD40 согласно настоящему изобретению связываются с huCD40 с высокой аффинностью, подобно антителам к huCD40, раскрытым в настоящем документе, увеличивая вероятность того, что они являются эффективными терапевтическими средствами. Согласно различным вариантам осуществления антитела к huCD40 согласно настоящему изобретению связываются с huCD40 с KD, составляющей меньше чем 10, 5, 2, 1 нМ, 300 или 100 пМ. Согласно другим вариантам осуществления антитела к huCD40 согласно настоящему изобретению связываются с huCD40 с KD, составляющей 2 нМ - 100 пМ. Стандартные анализы для оценки связывающей способности антител по отношению к huCD40 включают в себя анализы ELISA, RIA, вестерн-блоттинг, биослойной интерферометрии (BLI) и анализ SPR BIACORE®.In some embodiments, the anti-huCD40 antibodies of the invention bind to huCD40 with high affinity, similar to the anti-huCD40 antibodies disclosed herein, increasing the likelihood that they are effective therapeutic agents. In various embodiments, the anti-huCD40 antibodies of the invention bind to huCD40 with aKD of less than 10 nM, 5 nM, 2 nM, 1 nM, 300 pM, or 100 pM. In other embodiments, the anti-huCD40 antibodies of the invention bind to huCD40 with a KD of 2 nM to 100 pM. Standard assays for assessing the binding activity of antibodies to huCD40 include ELISA, RIA, Western blot, biolayer interferometry (BLI), and the BIACORE® SPR assay.
Варианты последовательностей антитела к CD40.Sequence variants of anti-CD40 antibodies.
Некоторая вариабельность в последовательностях антитела, раскрытых в настоящем документе, может являться допустимой и все еще сохранять требуемые свойства антитела. Границы областей CDR определяют с использованием системы Kabat (Kabat, E.A., et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 913242). Соответственно, настоящее изобретение дополнительно относится к антителам к huCD40, содержащим последовательности CDR, которые являются по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичными последовательностям CDR антител, раскрытых в настоящем документе. Настоящее изобретение также относится к антителам к huCD40, содержащим последовательности вариабельного домена тяжелой и/или легкой цепей, которые являются по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичными последовательностям вариабельного домена тяжелой и/или легкой цепей антитела, содержащего мутантную Fc-область, характеризующуюся одной или несколькими мутациями, соответствующими одной или нескольким мутациям в тяжелой цепи IgG, выбранным из группы, состоящей из N297A, SE, SELF, V9 и/или V11 (SEQ ID NO: 3-7), и их гуманизированные производные).Some variability in the antibody sequences disclosed herein may be tolerated and still maintain the desired properties of the antibody. The boundaries of the CDR regions are defined using the Kabat system (Kabat, E. A., et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 913242). Accordingly, the present invention further provides anti-huCD40 antibodies comprising CDR sequences that are at least 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, or 99% identical to the CDR sequences of the antibodies disclosed herein. The present invention also relates to anti-huCD40 antibodies comprising heavy and/or light chain variable domain sequences that are at least 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 or 99% identical to the heavy and/or light chain variable domain sequences of an antibody comprising a mutant Fc region characterized by one or more mutations corresponding to one or more mutations in an IgG heavy chain selected from the group consisting of N297A, SE, SELF, V9 and/or V11 (SEQ ID NOs: 3-7), and humanized derivatives thereof).
Используемое в настоящем документе мышиное антитело содержит вариабельные области тяжелой или легкой цепей, которые происходят из конкретной последовательности зародышевой линии, если вариабельные области антител получают из системы, в которой используют гены иммуноглобулина зародышевой линии мыши, и последовательность антитела достаточно связана с зародышевой линией, чтоA mouse antibody as used herein comprises heavy or light chain variable regions that are derived from a particular germline sequence if the variable regions of the antibodies are obtained from a system that utilizes mouse germline immunoglobulin genes and the antibody sequence is sufficiently related to the germline that
- 16 048278 она, более вероятно, происходит из данной зародышевой линии, чем из любой другой. Такие системы включают в себя иммунизацию мыши представляющим интерес антигеном. Последовательность(и) зародышевой линии иммуноглобулина мыши, из которой(ых) происходит последовательность, можно идентифицировать путем сравнения аминокислотной последовательности антитела с аминокислотными последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линии мыши и выбора последовательности иммуноглобулина зародышевой линии, которая является самой близкой последовательностью (т.е. наивысший % идентичности) в отношении последовательности антитела. Мышиное антитело, которое происходит из конкретной последовательности иммуноглобулина зародышевой линии, может содержать различия аминокислот по сравнению с последовательностью зародышевой линии вследствие, например, встречающихся в природе соматических мутаций или преднамеренного введения сайт-направленной мутации. Тем не менее выбранное мышиное антитело, как правило, является по меньшей мере на 90% идентичным в аминокислотной последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии (например, области V). В определенных случаях мышиное антитело может являться меньшей мере на 95% или даже по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичным в аминокислотной последовательности относительно аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии (например, области V). Как правило, антитело, которое происходит из конкретной последовательности зародышевой линии мыши, будет проявлять не больше чем 10 различий аминокислот по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии (например, области V). В определенных случаях мышиное антитело может содержать не больше чем 5 или даже не больше чем 4, 3, 2 или 1 различия аминокислот по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии (например, области V).- 16 048278 it is more likely to be derived from a given germline than from any other. Such systems involve immunizing a mouse with an antigen of interest. The mouse germline immunoglobulin sequence(s) from which the sequence is/are derived can be identified by comparing the amino acid sequence of the antibody to the amino acid sequences of mouse germline immunoglobulins and selecting the germline immunoglobulin sequence that is the closest sequence (i.e., highest % identity) to the antibody sequence. A mouse antibody that is derived from a particular germline immunoglobulin sequence may contain amino acid differences compared to the germline sequence due to, for example, naturally occurring somatic mutations or the deliberate introduction of a site-directed mutation. However, the selected mouse antibody will typically be at least 90% identical in amino acid sequence to the amino acid sequence encoded by the germline immunoglobulin gene (e.g., the V region). In certain cases, the mouse antibody may be at least 95%, or even at least 96, 97, 98, or 99% identical in amino acid sequence to the amino acid sequence encoded by the germline immunoglobulin gene (e.g., the V region). Typically, an antibody that is derived from a particular mouse germline sequence will exhibit no more than 10 amino acid differences compared to the amino acid sequence encoded by the germline immunoglobulin gene (e.g., the V region). In certain cases, a mouse antibody may contain no more than 5 or even no more than 4, 3, 2, or 1 amino acid differences compared to the amino acid sequence encoded by the germline immunoglobulin gene (e.g., V region).
II. Сконструированные и модифицированные антитела.II. Engineered and modified antibodies.
Области VH и VL.Regions VH and VL.
Кроме того, предусмотрены сконструированные и модифицированные антитела, которые можно получить с использованием антитела, характеризующегося одной или несколькими последовательностями VH и/или VL, раскрытыми в настоящем документе, в качестве исходного материала для конструирования модифицированного антитела, причем модифицированное антитело может характеризоваться измененными свойствами по сравнению с исходным антителом. Антитело можно сконструировать путем модификации одного или нескольких остатков в пределах одной или обеих вариабельных областей (т.е. VH и/или VL), например в пределах одной или нескольких областей CDR и/или в пределах одной или нескольких каркасных областей. Дополнительно или альтернативно, антитело можно сконструировать путем модификации остатков в пределах константной(ых) области(ей), например, для изменения эффекторной(ых) функции(й) антитела.Also provided are engineered and modified antibodies that can be produced using an antibody characterized by one or more VH and/or VL sequences disclosed herein as a starting material for constructing a modified antibody, wherein the modified antibody can have altered properties compared to the original antibody. The antibody can be engineered by modifying one or more residues within one or both variable regions (i.e., VH and/or VL), such as within one or more CDR regions and/or within one or more framework regions. Additionally or alternatively, the antibody can be engineered by modifying residues within the constant region(s), such as to alter the effector function(s) of the antibody.
Один тип инженерии вариабельной области, который можно проводить, представляет собой привитие CDR. Такое привитие является особенно применимым в гуманизации не относящихся к человеку антител к CD40, которые конкурируют за связывание с антителами к huCD40, раскрытыми в настоящем документе, и/или связываются с тем же эпитопом, что и антитела к huCD40, раскрытые в настоящем документе. Антитела взаимодействуют с целевыми антигенами преимущественно посредством аминокислотных остатков, которые расположены в шести определяющих комплементарность областях (CDR) тяжелых и легких цепей. По этой причине аминокислотные последовательности в пределах CDR являются более разнообразными между отдельными антителами, чем последовательности за пределами CDR. Поскольку последовательности CDR отвечают за большинство взаимодействий антитела с антигеном, существует возможность экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства конкретных эталонных антител, путем конструирования экспрессионных векторов, которые включают в себя последовательности CDR из конкретного эталонного антитела, привитые на каркасные последовательности из другого антитела с отличающимися свойствами (см., например, Riechmann, L. et al. (1998), Nature, 332:323-327; Jones, P. et al. (1986), Nature, 321:522-525; Queen, С. et al. (1989), Proc. Natl Acad. Sci. (USA), 86:10029-10033; патент США № 5225539 на имя Winter, и патенты США № 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 на имя Queen et al.).One type of variable region engineering that can be performed is CDR grafting. Such grafting is particularly useful in humanizing non-human anti-CD40 antibodies that compete for binding with the anti-huCD40 antibodies disclosed herein and/or bind to the same epitope as the anti-huCD40 antibodies disclosed herein. The antibodies interact with target antigens primarily through amino acid residues that are located within the six complementarity determining regions (CDRs) of the heavy and light chains. For this reason, amino acid sequences within the CDRs are more diverse between individual antibodies than sequences outside the CDRs. Because CDR sequences are responsible for most antibody-antigen interactions, it is possible to express recombinant antibodies that mimic the properties of specific reference antibodies by constructing expression vectors that incorporate CDR sequences from a particular reference antibody grafted onto framework sequences from another antibody with different properties (see, e.g., Riechmann, L. et al. (1998), Nature, 332:323-327; Jones, P. et al. (1986), Nature, 321:522-525; Queen, C. et al. (1989), Proc. Natl Acad. Sci. (USA), 86:10029-10033; U.S. Patent No. 5,225,539 to Winter, and U.S. Patent Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762). and 6180370 to Queen et al.).
Такие каркасные последовательности можно получить из общедоступных баз данных ДНК или опубликованных ссылок, которые включают в себя последовательности генов антител зародышевой линии. Например, последовательности ДНК зародышевой линии для генов вариабельных областей тяжелых и легких цепей человека можно найти в базе данных последовательностей зародышевой линии человека VBase, а также в Kabat, E.A., et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NTH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I.M., et al. (1992), The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops, J. Mol. Biol. 227:776-798; и Cox, J.P.L. et al. (1994), A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage, Eur. J. Immunol. 24:827-836; содержание каждой из которых явно включено в настоящий документ посредством ссылки.Such framework sequences can be obtained from publicly available DNA databases or published references that include germline antibody gene sequences. For example, germline DNA sequences for the human heavy and light chain variable region genes can be found in the VBase human germline sequence database and in Kabat, E. A., et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NTH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992), The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops, J. Mol. Biol. 227:776-798; and Cox, J. P. L. et al. (1994), A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in Their Usage, Eur. J. Immunol. 24:827–836; the contents of each of which are expressly incorporated herein by reference.
Предпочтительные каркасные последовательности для применения в антителах, описанных в настоящем документе, представляют собой такие, которые являются структурно сходными с каркаснымиPreferred framework sequences for use in the antibodies described herein are those that are structurally similar to the framework
- 17 048278 последовательностями, используемыми в антителах, описанных в настоящем документе. Последовательности CDR1, 2 и 3 VH и последовательности CDR1, 2 и 3 VL можно привить на каркасные области, которые характеризуются последовательностью, идентичной последовательности, встречающейся в гене иммуноглобулина зародышевой линии, из которого происходит каркасная последовательность, или последовательности CDR можно привить на каркасные области, которые содержат вплоть до 20, предпочтительно консервативных, аминокислотных замен по сравнению с последовательностями зародышевой линии. Например, было обнаружено, что в определенных случаях предпочтительно мутировать остатки в пределах каркасных областей для поддержания или усиления антигенсвязывающей способности антитела (см., например, патенты США № 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 на имя Queen et al.).- 17,048,278 sequences used in the antibodies described herein. The VH CDR1, 2, and 3 sequences and the VL CDR1, 2, and 3 sequences can be grafted onto framework regions that have a sequence identical to a sequence found in the germline immunoglobulin gene from which the framework sequence is derived, or the CDR sequences can be grafted onto framework regions that contain up to 20, preferably conservative, amino acid substitutions compared to the germline sequences. For example, it has been found that in certain cases it is advantageous to mutate residues within the framework regions to maintain or enhance the antigen-binding ability of the antibody (see, e.g., U.S. Pat. Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762; and 6,180,370 to Queen et al.).
Описанные в настоящем документе сконструированные антитела включают в себя те, в которых модификации произвели в каркасных остатках в пределах VH и/или VL, например, для улучшения свойств антитела. Часто такие каркасные модификации производят для уменьшения иммуногенности антитела. Например, один подход состоит в том, чтобы возвратно мутировать один или несколько каркасных остатков до соответствующей последовательности зародышевой линии. Более конкретно, антитело, которое подверглось соматической мутации, может содержать каркасные остатки, которые отличаются от последовательности зародышевой линии, из которой происходит антитело. Такие остатки можно идентифицировать путем сравнения каркасных последовательностей антитела с последовательностями зародышевой линии, из которых происходит антитело. Для возвращения последовательностей каркасной области до их конфигурации зародышевой линии, соматические мутации можно возвратно мутировать до последовательности зародышевой линии с помощью, например, сайт-направленного мутагенеза или ПЦР-опосредованного мутагенеза. Подразумевается, что также предусмотрены такие возвратно мутированные антитела.The engineered antibodies described herein include those in which modifications have been made to framework residues within the VH and/or VL, for example, to improve the properties of the antibody. Often, such framework modifications are made to reduce the immunogenicity of the antibody. For example, one approach is to back-mutate one or more framework residues to the corresponding germline sequence. More specifically, an antibody that has undergone a somatic mutation may contain framework residues that differ from the germline sequence from which the antibody is derived. Such residues can be identified by comparing the framework sequences of the antibody to the germline sequences from which the antibody is derived. To return the framework region sequences to their germline configuration, somatic mutations can be back-mutated to the germline sequence using, for example, site-directed mutagenesis or PCR-mediated mutagenesis. Such back-mutated antibodies are also contemplated.
Другой тип каркасной модификации предусматривает мутирование одного или нескольких остатков в пределах каркасной области или даже в пределах одной или нескольких областей CDR для удаления Т-клеточных эпитопов, чтобы тем самым снизить потенциальную иммуногенность антитела. Этот подход также называется деиммунизация и описан более подробно в патентной публикации США № 20030153043, Carr et al.Another type of framework modification involves mutating one or more residues within the framework region or even within one or more CDR regions to remove T-cell epitopes, thereby reducing the potential immunogenicity of the antibody. This approach is also called deimmunization and is described in more detail in U.S. Patent Publication No. 20030153043, Carr et al.
Другой тип модификации вариабельных областей состоит в том, чтобы мутировать аминокислотные остатки в пределах областей CDR для улучшения одного или нескольких связывающих свойств (например, аффинности) представляющего интерес антитела. Сайт-направленный мутагенез или ПЦР-опосредованный мутагенез можно проводить для введения мутации(й) и воздействия на связывание антитела или другое функциональное свойство, представляющее интерес. Предпочтительно вводят консервативные модификации. Мутации могут представлять собой аминокислотные добавления, делеции или предпочтительно замены. Более того, как правило, изменяют не больше чем один, два, три, четыре или пять остатков в пределах области CDR.Another type of modification of the variable regions is to mutate amino acid residues within the CDR regions to improve one or more binding properties (e.g., affinity) of the antibody of interest. Site-directed mutagenesis or PCR-mediated mutagenesis can be performed to introduce mutation(s) and affect antibody binding or another functional property of interest. Preferably, conservative modifications are introduced. Mutations can be amino acid additions, deletions, or preferably substitutions. Moreover, typically no more than one, two, three, four, or five residues within the CDR region are changed.
Остатки метионина в CDR антител можно окислять, что приводит к потенциальному химическому разложению и последующему снижению активности антитела. Соответственно, также предусмотрены антитела к CD40, в которых один или несколько остатков метионина в CDR тяжелых и/или легких цепей замещены аминокислотными остатками, которые не подвергаются окислительному разложению. Аналогично сайты деаминирования можно удалить из антител к CD40, в частности, в CDR. Потенциальные сайты гликозилирования в пределах антигенсвязывающего домена предпочтительно удаляют для предотвращения гликозилирования, которое может препятствовать связыванию с антигеном. См., например, патент США № 5714350.Methionine residues in the CDRs of antibodies can be oxidized, resulting in potential chemical degradation and subsequent reduction in antibody activity. Accordingly, anti-CD40 antibodies are also provided in which one or more methionine residues in the CDRs of the heavy and/or light chains are replaced with amino acid residues that are not subject to oxidative degradation. Similarly, deamination sites can be removed from anti-CD40 antibodies, particularly in the CDRs. Potential glycosylation sites within the antigen-binding domain are preferably removed to prevent glycosylation that may interfere with antigen binding. See, for example, U.S. Patent No. 5,714,350.
Fc и модифицированные Fc.Fc and modified Fc.
Антитела согласно настоящему изобретению могут содержать вариабельные домены согласно настоящему изобретению, комбинированные с константными доменами, содержащими различные Fc-области, выбранные на основании биологических активностей (если таковые имеются) антитела для предусмотренного применения. Salfeld (2007), Nat. Biotechnol. 25:1369. IgG человека, например, можно классифицировать на четыре подкласса, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и каждый из указанных подклассов содержит Fc-область, характеризующуюся уникальным профилем для связывания с одним или несколькими рецепторами Fcy (активирующие рецепторы FcyRI (CD64), FcyRIIA, FcyRIIC (CD32a,c); FcyRIIIA и FcyRIIIB (CD16a,b) и ингибирующий рецептор FcyRIIB (CD32b), и для первого компонента комплемента (C1q). IgG1 и IgG3 человека связываются со всеми рецепторами Fcy; IgG2 связывается с FcyRIIAH131 и с пониженной аффинностью с FcyRIIAR131 FcyRIIIAV158; IgG4 связывается с FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIC и FcyRIIIAV158; ингибирующий рецептор FcyRIIB характеризуется пониженной аффинностью в отношении IgG1, IgG2 и IgG3, чем все другие рецепторы Fcy. Bruhns et al. (2009), Blood 113:3716. Исследования показали, что FcyRI не связывается с IgG2, и FcyRIIIB не связывается с IgG2 или IgG4. В общем, в отношении активности ADCC IgG1 человека >IgG3 человека IgG4 человека >IgG2 человека. Вследствие этого, например, константный домен IgG1, а не IgG2 или IgG4 можно выбрать для применения в лекарственном средстве, где необходима ADCC; IgG3 можно выбрать при активации экспрессирующих FcyRIIIA NK-клеток, моноцитов и макрофагов; и IgG4 можно выбрать, если антитело подлежит примеThe antibodies of the present invention may comprise the variable domains of the present invention combined with constant domains comprising different Fc regions selected based on the biological activities (if any) of the antibody for the intended use. Salfeld (2007) Nat. Biotechnol. 25:1369. Human IgG, for example, can be classified into four subclasses, IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4, and each of these subclasses contains an Fc region characterized by a unique binding profile for one or more Fcy receptors (the activating receptors FcyRI (CD64), FcyRIIA, FcyRIIC (CD32a,c); FcyRIIIA and FcyRIIIB (CD16a,b); and the inhibitory receptor FcyRIIB (CD32b), and for the first component of complement (C1q). Human IgG1 and IgG3 bind to all Fcy receptors; IgG2 binds to FcyRIIAH131 and with reduced affinity to FcyRIIAR131 FcyRIIIAV158; IgG4 binds to FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIC, and FcyRIIIAV158; The inhibitory receptor FcyRIIB has a lower affinity for IgG1, IgG2, and IgG3 than all other Fcy receptors. Bruhns et al. (2009) Blood 113:3716. Studies have shown that FcyRI does not bind IgG2, and FcyRIIIB does not bind IgG2 or IgG4. In general, with respect to ADCC activity, human IgG1 > human IgG3 and human IgG4 > human IgG2. As a result, for example, the constant domain of IgG1 rather than IgG2 or IgG4 may be selected for use in a drug where ADCC is required; IgG3 may be selected when FcyRIIIA-expressing NK cells, monocytes, and macrophages are activated; and IgG4 may be selected if the antibody is to be used
- 18 048278 нению для десенситизации пациентов с аллергией. IgG4 также можно выбрать, если необходимо, чтобы у антитела отсутствовали все эффекторные функции.- 18 048278 for desensitization of patients with allergies. IgG4 can also be selected if it is necessary that the antibody lack all effector functions.
Описанные в настоящем документе вариабельные области к huCD40 могут являться связанными (например, ковалентно связанными или слитыми) с Fc, например Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, которая может принадлежать к любому аллотипу или изоаллотипу, например для IgG1: G1m, G1m1(a), G1m2(x), G1m3(f), G1m17(z); для IgG2: G2m, G2m23(n); для IgG3: G3m, G3m21(g1), G3m28(g5), G3m11(b0), G3m5(b1), G3m13(b3), G3m14(b4), G3m10(b5), G3m15(s), G3m16(t), G3m6(c3), G3m24(c5), G3m26(u), G3m27(v). См., например, Jefferis et al. (2009), mAbs 1:1). На выбор аллотипа могут влиять потенциальные проблемы иммуногенности, например, для минимизации образования антител к антибактериальным лекарственным средствам.The huCD40 variable regions described herein may be linked (e.g., covalently linked or fused) to an Fc, such as an IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 Fc, which may be of any allotype or isoallotype, such as for IgG1: G1m, G1m1(a), G1m2(x), G1m3(f), G1m17(z); for IgG2: G2m, G2m23(n); for IgG3: G3m, G3m21(g1), G3m28(g5), G3m11(b0), G3m5(b1), G3m13(b3), G3m14(b4), G3m10(b5), G3m15(s), G3m16(t), G3m6(c3), G3m24(c5), G3m26(u), G3m27(v). See, e.g., Jefferis et al. (2009), mAbs 1:1). The choice of allotype may be influenced by potential immunogenicity issues, e.g., to minimize the formation of antibodies to antibacterial drugs.
Согласно предпочтительным вариантам осуществления антитела к CD40 согласно настоящему изобретению содержат Fc, которая связывается или характеризуется усиленным связыванием с FcYRIIb, что может обеспечивать усиленный агонизм. См., например, международную патентную публикацию WO 2012/087928; Li & Ravetch (2011), Science, 333:1030; Wilson et al. (2011), Cancer Cell, 19:101; White et al. (2011), J. Immunol. 187:1754. Описанные в настоящем документе вариабельные области могут являться связанными с Fc-вариантами, которые усиливают аффинность в отношении ингибирующего рецептора FcYRIIb, например для усиления индуцирующей апоптоз или адъювантной активности. Li & Ravetch (2012), Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA), 109:10966; публикация заявки на выдачу патента США № 2014/0010812. Такие варианты могут обеспечивать антитело с иммуномодулирующими активностями, связанными с FcYRIIb+ клетками, включая в себя, например, В-клетки и моноциты. Согласно одному варианту осуществления Fc-варианты обеспечивают селективно усиленную аффинность к FcYRIIb по отношению к одному или нескольким активирующим рецепторам. Такие варианты также могут проявлять усиленное опосредованное FcR перекрестное связывание, приводящее к усиленной терапевтической эффективности. Модификации для изменения связывания с FcYRIIb включают в себя одну или несколько модификаций в положении, выбранном из группы, состоящей из 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328 и 332, согласно EU-индексу. Иллюстративные замены для усиления аффинности к FcYRIIb включают в себя без ограничения 234D, 234Е, 234F, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239Е, 266М, 267D, 267Е, 268D, 268Е, 327D, 327Е, 328F, 328W, 328Y и 332Е. Иллюстративные замены включают в себя 235Y, 236D, 239D, 266М, 267Е, 268D, 268Е, 328F, 328W и 328Y. Другие Fc-варианты для усиления связывания с FcYRIIb включают в себя 235Y-267E, 236D-267E, 239D-268D, 239D-267E, 267E-268D, 267Е-268Е и 267E-328F. В частности, варианты S267E, G236D, S239D, L328F и I332E, включая в себя двойной вариант S267E-L328F, IgG1 человека, имеют особое значение для специфического усиления аффинности в отношении ингибирующего рецептора FcYRIIb. Chu et al. (2008), Mol. Immunol. 45:3926; публикация заявки на выдачу патента США № 2006/024298; WO 2012/087928. Усиленную специфичность в отношении FcYRIIb (в отличие от FcYRIIaR131) можно получить путем добавления замены P238D и других мутаций (Mimoto et al. (2013), Protein. Eng. Des. & Selection, 26:589; WO 2012/1152410), а также V262E и V264E (Yu et al. (2013), J. Am. Chem. Soc. 135:9723 и WO 2014/184545. См. табл. 2, приведенную в конце описания.In preferred embodiments, the anti-CD40 antibodies of the present invention comprise an Fc that binds or has enhanced binding to FcYRIIb, which can provide enhanced agonism. See, e.g., International Patent Publication No. WO 2012/087928; Li & Ravetch (2011), Science, 333:1030; Wilson et al. (2011), Cancer Cell, 19:101; White et al. (2011), J. Immunol. 187:1754. The variable regions described herein can be linked to Fc variants that enhance affinity for the inhibitory receptor FcYRIIb, e.g., to enhance apoptosis-inducing or adjuvant activity. Li & Ravetch (2012), Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA), 109:10966; US Patent Application Publication No. 2014/0010812. Such variants may provide an antibody with immunomodulatory activities associated with FcYRIIb+ cells, including, for example, B cells and monocytes. In one embodiment, the Fc variants provide selectively enhanced affinity for FcYRIIb for one or more activating receptors. Such variants may also exhibit enhanced FcR-mediated cross-linking, resulting in enhanced therapeutic efficacy. Modifications to alter binding to FcYRIIb include one or more modifications at a position selected from the group consisting of 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328 and 332, according to the EU index. Illustrative substitutions to enhance affinity for FcYRIIb include, but are not limited to, 234D, 234E, 234F, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F, 328W, 328Y, and 332E. Illustrative substitutions include 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, 328F, 328W, and 328Y. Other Fc variants for enhancing binding to FcYRIIb include 235Y-267E, 236D-267E, 239D-268D, 239D-267E, 267E-268D, 267E-268E, and 267E-328F. In particular, the S267E, G236D, S239D, L328F, and I332E variants, including the dual S267E-L328F variant, human IgG1 are of particular importance for specifically enhancing affinity for the inhibitory receptor FcYRIIb. Chu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926; U.S. Patent Application Publication No. 2006/024298; WO 2012/087928. Enhanced specificity for FcYRIIb (as opposed to FcYRIIaR131 ) can be obtained by adding the P238D substitution and other mutations (Mimoto et al. (2013), Protein. Eng. Des. & Selection, 26:589; WO 2012/1152410), as well as V262E and V264E (Yu et al. (2013), J. Am. Chem. Soc. 135:9723 and WO 2014/184545. See Table 2 at the end of the description.
Увеличение периода полужизни.Increased half-life.
Согласно определенным вариантам осуществления антитело является модифицированным для увеличения его биологического периода полужизни. Возможны различные подходы. Например, это можно осуществить путем увеличения аффинности связывания Fc-области в отношении FcRn. Согласно одному варианту осуществления антитело изменяют в пределах области СН1 или CL, чтобы оно содержало эпитоп связывания рецептора реутилизации, взятый из двух петель домена CH2 Fc-области IgG, как описано в патентах США № 5869046 и 6121022 на имя Presta et al. Другие иллюстративные Fc-варианты, которые увеличивают связывание с FcRn и/или улучшают фармакокинетические свойства, включают в себя замены в положениях 259, 308 и 434, включая в себя, например, 259I, 308F, 428L, 428М, 434S, 434Н, 434F, 434Y и 434М. Другие варианты, которые увеличивают связывание Fc с FcRn, включают в себя 250Е, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (Hinton et al. (2004), J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. (2006), Journal of Immunology, 176:346-356), 256A, 272A, 305A, 307A, 31 1A, 312A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al. (2001), Journal of Biological Chemistry, 276(9):6591-6604), 252F, 252Y, 252W, 254T, 256Q, 256E, 256D, 433R, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H (Dall'Acqua et al. (2002), Journal of Immunology, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al. (2006), Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524). См. патент США № 8367805.In certain embodiments, the antibody is modified to increase its biological half-life. Various approaches are possible. For example, this can be accomplished by increasing the binding affinity of the Fc region for FcRn. In one embodiment, the antibody is altered within theCH1 or CL region to comprise a salvage receptor binding epitope taken from two loops of the CH2 domain of the Fc region of IgG, as described in U.S. Patent Nos. 5,869,046 and 6,121,022 to Presta et al. Other exemplary Fc variants that enhance binding to FcRn and/or improve pharmacokinetic properties include substitutions at positions 259, 308, and 434, including, for example, 259I, 308F, 428L, 428M, 434S, 434H, 434F, 434Y, and 434M. Other variants that enhance Fc binding to FcRn include 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (Hinton et al. (2004), J. Biol. Chem. 279(8): 6213–6216, Hinton et al. (2006), Journal of Immunology, 176:346–356), 256A, 272A, 305A, 307A, 31 1A, 312A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al. (2001), Journal of Biological Chemistry, 276(9):6591–6604), 252F, 252Y, 252W, 254T, 256Q, 256E, 256D, 433R, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H (Dall'Acqua et al. (2002), Journal of Immunology, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al. (2006), Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524). See US Patent No. 8367805.
Модификацию определенных консервативных остатков в Fc IgG (I253, Н310, Q311, Н433, N434), такую как вариант N434A (Yeung et al. (2009), J. Immunol. 182:7663), предложили в качестве пути увеличения к аффинности FcRn, таким образом увеличивая период полужизни антитела в кровотоке. Международная патентная публикация WO 98/023289. Было показано, что комбинированный Fc-вариант, содержащий M428L и N434S, увеличивал связывание с FcRn и увеличивал период полужизни в сыворотке вплоть до пятикратного увеличения. Zalevsky et al. (2010), Nat. Biotechnol. 28:157. Комбинированный Fc-вариант, содержащий модификации Т307А, Е380А и N434A, также увеличивает период полужизниModification of certain conserved residues in IgG Fc (I253, H310, Q311, H433, N434), such as the N434A variant (Yeung et al. (2009) J. Immunol. 182:7663), has been proposed as a way to increase FcRn affinity, thereby increasing the circulating half-life of the antibody. International Patent Publication No. WO 98/023289. A combined Fc variant containing M428L and N434S was shown to enhance binding to FcRn and increase serum half-life by up to fivefold. Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28:157. A combined Fc variant containing the T307A, E380A, and N434A modifications also increased the half-life
- 19 048278 антител IgG1. Petkova et al. (2006), Int. Immunol. 18:1759. Кроме того, было показано, что комбинированные Fc-варианты, содержащие варианты M252Y-M428L, M428L-N434H, M428L-N434F, M428L-N434Y, M428L-N434A, M428L-N434M и M428L-N434S, также увеличивают период полужизни. Международная патентная публикация WO 2009/086320.- 19 048278 IgG1 antibodies. Petkova et al. (2006) Int. Immunol. 18:1759. In addition, combined Fc variants containing the M252Y-M428L, M428L-N434H, M428L-N434F, M428L-N434Y, M428L-N434A, M428L-N434M, and M428L-N434S variants were also shown to increase half-life. International Patent Publication WO 2009/086320.
Кроме того, комбинированный Fc-вариант, содержащий M252Y, S254T и Т256Е, увеличивает период полужизни почти в 4 раза. Dall'Acqua et al. (2006), J. Biol. Chem. 281:23514. Родственную модификацию IgG1, обеспечивающую увеличенную к аффинность FcRn, но сниженную зависимость от pH (M252Y-S254T-T256E-H433K-N434F), использовали для создания конструкта IgG1 (MST-HN Abdeg) для применения в качестве конкурирующего средства для предотвращения связывания других антител с FcRn, что привело к увеличенному клиренсу этого другого антитела, или эндогенного IgG (например, в условиях аутоиммунного состояния), или другого экзогенного (терапевтического) mAb. Vaccaro et al. (2005), Nat. Biotechnol. 23:1283; международная патентная публикация WO 2006/130834.In addition, a combined Fc variant containing M252Y, S254T, and T256E increases the half-life by nearly 4-fold. Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281:23514. A related modification of IgG1 that provides increased affinity for FcRn but reduced pH dependence (M252Y-S254T-T256E-H433K-N434F) was used to generate an IgG1 construct (MST-HN Abdeg) for use as a competitive agent to prevent binding of other antibodies to FcRn, resulting in increased clearance of that other antibody, or endogenous IgG (e.g., in an autoimmune condition), or another exogenous (therapeutic) mAb. Vaccaro et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:1283; International Patent Publication WO 2006/130834.
Другие модификации для увеличения связывания с FcRn описаны в Yeung et al. (2010), J. Immunol. 182:7663-7671; патентах США № 6277375; 6821505; международных патентных публикациях WO 97/34631; WO 2002/060919.Other modifications to enhance FcRn binding are described in Yeung et al. (2010) J. Immunol. 182:7663–7671; U.S. Patent Nos. 6,277,375; 6,821,505; International Patent Publication Nos. WO 97/34631; WO 2002/060919.
Согласно определенным вариантам осуществления гибридные изотипы IgG можно использовать для увеличения связывания с FcRn и потенциально увеличения периода полужизни. Например, гибридный вариант IgG1/IgG3 можно сконструировать с помощью замены положений IgG1 в области CH2 и/или CH3 аминокислотами из IgG3 в положениях, в которых два изотипа различаются. Таким образом, можно сконструировать гибридный вариант антитела IgG, который содержит одну или несколько замен, например 274Q, 276K, 300F, 339Т, 356Е, 358М, 384S, 392N, 397М, 422I, 435R и 436F. Согласно другим вариантам осуществления, описанным в настоящем документе, гибридный вариант IgG1/IgG2 можно сконструировать путем замены положений IgG2 в области CH2 и/или CH3 аминокислотами из IgG1 в положениях, в которых два изотипа различаются. Таким образом, можно сконструировать гибридный вариант антитела IgG, который содержит одну или несколько замен, например одну или несколько следующих аминокислотных замен: 233Е, 234L, 235L, -236G (относится к вставке глицина в положении 236) и 327А. См. патент США № 8629113. Создали гибрид последовательностей IgG1/IgG2/IgG4, который предположительно увеличивает период полужизни в сыворотке и улучшает экспрессию. Патент США № 7867491 (последовательность № 18 в указанном документе).In certain embodiments, hybrid IgG isotypes can be used to enhance binding to FcRn and potentially increase half-life. For example, a hybrid IgG1/IgG3 variant can be engineered by replacing positions of IgG1 in the CH2 and/or CH3 region with amino acids from IgG3 at positions where the two isotypes differ. Thus, a hybrid IgG antibody variant can be engineered that contains one or more substitutions, such as 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 422I, 435R, and 436F. According to other embodiments described herein, a hybrid IgG1/IgG2 variant can be constructed by replacing IgG2 positions in the CH2 and/or CH3 region with amino acids from IgG1 at positions where the two isotypes differ. Thus, a hybrid IgG antibody variant can be constructed that contains one or more substitutions, such as one or more of the following amino acid substitutions: 233E, 234L, 235L, -236G (refers to the insertion of a glycine at position 236), and 327A. See U.S. Patent No. 8,629,113. A hybrid of IgG1/IgG2/IgG4 sequences was created that is expected to increase serum half-life and improve expression. U.S. Patent No. 7,867,491 (sequence no. 18 therein).
Период полужизни антитела согласно настоящему изобретению в сыворотке также можно увеличить путем пегилирования. Антитело можно пегилировать, например, для увеличения биологического (например, сывороточного) периода полужизни антитела. Для пегилирования антитела антитело или его фрагмент, как правило, приводят в реакцию с полиэтиленгликольным (PEG) реагентом, таким как реакционноспособный сложный эфир или альдегидное производное PEG, при условиях, в которых одна или несколько групп PEG прикреплены к антителу или фрагменту антитела. Предпочтительно пегилирование проводят посредством реакции ацилирования или реакции алкилирования с реакционноспособной молекулой PEG (или аналогичным реакционноспособным водорастворимым полимером). Используемый в настоящем документе термин полиэтиленгликоль, как подразумевается, включает в себя любую из форм PEG, которые использовали для дериватизации других белков, такие как моно-(С1-С10)алкокси- или арилокси-полиэтиленгликоль или полиэтиленгликоль-малеимид. Согласно определенным вариантам осуществления антитело, подлежащее пегилированию, представляет собой негликозилированное антитело. Способы пегилирования белков известны в настоящей области техники, и их можно применять к антителам, описанным в настоящем документе. См., например, европейский патент № ЕР 0154316 на имя Nishimura et al., и ЕР 0401384 на имя Ishikawa et al.The serum half-life of an antibody of the present invention can also be increased by PEGylation. An antibody can be PEGylated, for example, to increase the biological (e.g., serum) half-life of the antibody. To PEGylate an antibody, the antibody or fragment thereof is typically reacted with a polyethylene glycol (PEG) reagent, such as a reactive ester or aldehyde derivative of PEG, under conditions in which one or more PEG groups are attached to the antibody or antibody fragment. Preferably, PEGylation is carried out via an acylation reaction or an alkylation reaction with a reactive PEG molecule (or similar reactive water-soluble polymer). As used herein, the term polyethylene glycol is intended to include any of the forms of PEG that have been used to derivatize other proteins, such as mono-(C1-C10 )alkoxy- or aryloxy-polyethylene glycol or polyethylene glycol-maleimide. In certain embodiments, the antibody to be PEGylated is a non-glycosylated antibody. Methods for PEGylating proteins are known in the art and may be applied to the antibodies described herein. See, for example, European Patent No. EP 0 154 316 to Nishimura et al., and EP 0 401 384 to Ishikawa et al.
Альтернативно, в определенных обстоятельствах может потребоваться уменьшить период полужизни антитела согласно настоящему изобретению, вместо его увеличения. Такие модификации, как I253A (Hornick et al. (2000), J. Nucl. Med. 41:355) и H435A/R, I253A или H31OA (Kim et al. (2000), Eur. J. Immunol. 29:2819) в Fc IgG1 человека могут уменьшить связывание FcRn, таким образом уменьшая период полужизни (увеличивая клиренс) для применения в ситуациях, в которых быстрый клиренс является предпочтительным, например, в медицинской визуализации. См. также Kenanova et al. (2005), Cancer Res. 65:622. Другие средства для усиления клиренса включают в себя форматирование антигенсвязывающих доменов согласно настоящему изобретению в виде фрагментов антител, у которых отсутствует способность связывать FcRn, таких как Fab-фрагменты. Такая модификация может снизить период полужизни антитела в кровотоке от пары недель до нескольких часов. Селективное пегилирование фрагментов антител затем можно использовать до тонкого регулирования (увеличения) периода полужизни фрагментов антител при необходимости. Chapman et al. (1999), Nat. Biotechnol. 17:780. Фрагменты антител также можно подвергнуть слиянию с альбумином сыворотки человека, например, в конструкте белка слияния, для увеличения периода полужизни. Yeh et al. (1992), Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA), 89:1904. Альтернативно, можно сконструировать биспецифическое антитело с первым антигенсвязывающим доменом согласно настоящему изобретению и вторым антигенсвязывающим доменом, который связывается с альбумином сыворотки человека (HSA). См. международную патентную публикацию WO 2009/127691 и ссылки на патенты, процитированные в ней. Альтернативно, специализированные полипептидные поAlternatively, in certain circumstances it may be desirable to decrease the half-life of an antibody of the present invention rather than increase it. Modifications such as I253A (Hornick et al. (2000) J. Nucl. Med. 41:355) and H435A/R, I253A, or H31OA (Kim et al. (2000) Eur. J. Immunol. 29:2819) in human IgG1 Fc can reduce FcRn binding, thereby decreasing the half-life (increasing clearance) for use in situations in which rapid clearance is advantageous, such as in medical imaging. See also Kenanova et al. (2005) Cancer Res. 65:622. Other means for enhancing clearance include formatting the antigen binding domains of the present invention as antibody fragments that lack the ability to bind FcRn, such as Fab fragments. Such modification can reduce the circulating half-life of the antibody from a couple of weeks to a few hours. Selective PEGylation of antibody fragments can then be used to fine-tune (increase) the half-life of the antibody fragments if desired. Chapman et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:780. Antibody fragments can also be fused to human serum albumin, such as in a fusion protein construct, to increase half-life. Yeh et al. (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA), 89:1904. Alternatively, a bispecific antibody may be constructed with a first antigen-binding domain according to the present invention and a second antigen-binding domain that binds to human serum albumin (HSA). See International Patent Publication No. WO 2009/127691 and the patent references cited therein. Alternatively, specialized polypeptide
- 20 048278 следовательности можно добавить к фрагментам антител для увеличения периода полужизни, например, полипептидные последовательности XTEN. Schellenberger et al. (2009), Nat. Biotechnol. 27:1186; международная патентная публикация WO 2010/091122.- 20 048278 sequences can be added to antibody fragments to increase half-life, for example, XTEN polypeptide sequences. Schellenberger et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:1186; International Patent Publication WO 2010/091122.
Дополнительные Fc-варианты.Additional Fc variants.
При использовании константного домена IgG4, как правило, предпочтительно, чтобы он включал в себя замену S228P, которая имитирует шарнирную последовательность в IgG1 и, тем самым, стабилизирует молекулы IgG4, например снижая обмен Fab-плечом между терапевтическим антителом и эндогенным IgG4 у пациента, подлежащего лечению. Labrijn et al. (2009), Nat. Biotechnol. 27:767; Reddy et al. (2000), J. Immunol. 164:1925.When using an IgG4 constant domain, it is generally preferred that it include the S228P substitution, which mimics the hinge sequence in IgG1 and thereby stabilizes IgG4 molecules, for example by reducing Fab-arm exchange between the therapeutic antibody and endogenous IgG4 in the patient to be treated. Labrijn et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:767; Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925.
Потенциальный сайт протеазного расщепления в шарнире конструктов IgG1 можно устранить с помощью модификаций D221G и K222S, увеличивая стабильность антитела, международная патентная публикация WO 2014/043344.A potential protease cleavage site in the hinge of IgG1 constructs can be eliminated by the D221G and K222S modifications, increasing the stability of the antibody, International Patent Publication WO 2014/043344.
Аффинности и связывающие свойства Fc-варианта в отношении его лигандов (рецепторов Fc) можно определить с помощью разнообразных способов in vitro анализа (биохимические или иммунологические анализы), известных в настоящей области техники, включая в себя без ограничения равновесные способы (например, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) или радиоиммуноанализ (RIA)) или кинетические (например, анализ SPR BIACORE®) и другие способы, такие как анализы непрямого связывания, анализы конкурентного ингибирования, резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET), гель-электрофорез и хроматография (например, гель-фильтрация). В указанных и других способах можно использовать метку на одном или нескольких компонентах, подлежащих исследованию, и/или применять разнообразные способы обнаружения, включая в себя без ограничения хромогенные, флуоресцентные, люминесцентные или изотопные метки. Подробное описание аффинностей связывания и кинетики можно найти в Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999), которая сфокусирована на взаимодействиях антител с иммуногенами.The affinities and binding properties of an Fc variant for its ligands (Fc receptors) can be determined using a variety of in vitro assays (biochemical or immunoassays) known in the art, including but not limited to equilibrium (e.g., enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or radioimmunoassay (RIA)) or kinetic (e.g., BIACORE® SPR assay) methods and other methods such as indirect binding assays, competitive inhibition assays, fluorescence resonance energy transfer (FRET), gel electrophoresis, and chromatography (e.g., gel filtration). These and other methods can employ a label on one or more components to be assayed and/or employ a variety of detection methods, including but not limited to chromogenic, fluorescent, luminescent, or isotopic labels. A detailed description of binding affinities and kinetics can be found in Paul, WE, ed., Fundamental Immunology,4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999), which focuses on antibody-immunogen interactions.
Согласно другим вариантам осуществления гликозилирование антитела модифицируют для увеличения или уменьшения эффекторной функции. Например, можно получить негликозилированное антитело, у которого полностью отсутствует эффекторная функция, путем мутирования консервативного остатка аспарагина в положении 297 (например, N297A), таким образом устраняя связывание комплемента и FcyRI. Bolt et al. (1993), Eur. J. Immunol. 23:403. См. также Тао & Morrison (1989), J. Immunol. 143:2595 (c использованием N297Q в IgG1 для устранения гликозилирования в положении 297).In other embodiments, glycosylation of an antibody is modified to increase or decrease effector function. For example, a nonglycosylated antibody that completely lacks effector function can be generated by mutating the conserved asparagine residue at position 297 (e.g., N297A), thereby abolishing complement fixation and FcyRI. Bolt et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:403. See also Tao & Morrison (1989) J. Immunol. 143:2595 (using N297Q in IgG1 to abolish glycosylation at position 297).
Хотя у негликозилированных антител, как правило, отсутствует эффекторная функция, можно вводить мутации для восстановления этой функции. Негликозилированные антитела, например, те, которые получены за счет мутаций N297A/C.7D/nmn Н или произведены в системах (например, Е. coli), которые не гликозилируют белки, можно дополнительно мутировать для восстановления связывания с FcyR, например, S298G и/или Т299АОили Н (WO 2009/079242) или E382V и M428I (Jung et al. (2010), Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA), 107:604).Although non-glycosylated antibodies generally lack effector function, mutations can be introduced to restore this function. Non-glycosylated antibodies, such as those generated by the N297A/C.7D/nmn H mutations or produced in systems (e.g., E. coli) that do not glycosylate proteins, can be further mutated to restore binding to FcyR, such as S298G and/or T299AO or H (WO 2009/079242) or E382V and M428I (Jung et al. (2010) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA), 107:604).
Гликоинженерию также можно использовать для модификации противовоспалительных свойств конструкта IgG путем изменения содержания а2,6-сиалила углеводных цепей, прикрепленных на Asn297 Fc-областей, причем увеличенная пропорция а2,6-сиалилированных форм приводит к усиленным противовоспалительным эффектам. См. Nimmerjahn et al. (2008), Ann. Rev. Immunol. 26:513. Напротив, снижение пропорции антител, содержащих а2,6-сиалилированные углеводы, может являться применимым в случаях, когда противовоспалительные свойства не нужны. Способы модификации содержания а2,6-сиалилирования антител, например, путем селективной очистки а2,6-сиалилированных форм или путем ферментативной модификации предусмотрены в публикации заявки на выдачу патента США № 2008/0206246. Согласно другим вариантам осуществления аминокислотную последовательность Fc-области можно модифицировать для имитации эффекта а2,6-сиалилирования, например, путем введения модификации F241A, международная патентная публикация WO 2013/095966.Glycoengineering can also be used to modify the anti-inflammatory properties of an IgG construct by altering the content of a2,6-sialyl carbohydrate chains attached to Asn297 of the Fc regions, with an increased proportion of a2,6-sialylated forms resulting in enhanced anti-inflammatory effects. See Nimmerjahn et al. (2008) Ann. Rev. Immunol. 26:513. Conversely, decreasing the proportion of antibodies containing a2,6-sialylated carbohydrates may be useful in cases where anti-inflammatory properties are not desired. Methods for modifying the a2,6-sialylation content of antibodies, such as by selective purification of the a2,6-sialylated forms or by enzymatic modification, are provided in U.S. Patent Application Publication No. 2008/0206246. In other embodiments, the amino acid sequence of the Fc region may be modified to mimic the effect of a2,6-sialylation, for example by introducing the modification F241A, International Patent Publication WO 2013/095966.
III. Физические свойства антител.III. Physical properties of antibodies.
Описанные в настоящем документе антитела могут содержать один или несколько сайтов гликозилирования в вариабельной области либо легкой, либо тяжелой цепи. Такие сайты гликозилирования могут приводить в результате к увеличенной иммуногенности антитела или изменению pK антитела вследствие измененного связывания с антигеном (Marshall et al. (1972), Ann. Rev. Biochem. 41:673-702; Gala and Morrison (2004), J. Immunol. 172:5489-94; Wallick et al. (1988), J. Exp. Med. 168:1099-109; Spiro (2002), Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al., (1985), Nature 316:452-7; Mimura et al., (2000), Mol. Immunol. 37:697-706). Известно, что гликозилирование происходит на мотивах, содержащих последовательность N-X-S/T. В некоторых случаях предпочтительно, чтобы антитело к huCD40 не содержало гликозилирование вариабельной области. Этого можно достичь либо путем выбора антител, которые не содержат мотив гликозилирования в вариабельной области, либо путем мутирования остатков в пределах области гликозилирования.The antibodies described herein may contain one or more glycosylation sites in the variable region of either the light or heavy chain. Such glycosylation sites may result in increased immunogenicity of the antibody or an altered pK of the antibody due to altered binding to antigen (Marshall et al. (1972), Ann. Rev. Biochem. 41:673-702; Gala and Morrison (2004), J. Immunol. 172:5489-94; Wallick et al. (1988), J. Exp. Med. 168:1099-109; Spiro (2002), Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al., (1985), Nature 316:452-7; Mimura et al., (2000), Mol. Immunol. 37:697-706). Glycosylation is known to occur at motifs containing the sequence N-X-S/T. In some cases, it is preferable for an anti-huCD40 antibody to lack variable region glycosylation. This can be achieved either by selecting antibodies that do not contain a glycosylation motif in the variable region or by mutating residues within the glycosylation region.
Согласно определенным вариантам осуществления описанные в настоящем документе антитела не содержат сайты изомерии аспарагина. Деамидирование аспарагина может происходить на последоваIn certain embodiments, the antibodies described herein do not contain asparagine isomerism sites. Asparagine deamidation may occur at a sequential
- 21 048278 тельностях N-G или D-G и может приводить к созданию остатка изоаспарагиновой кислоты, который вводит перегиб в полипептидную цепь и уменьшает ее стабильность (эффект изоаспарагиновой кислоты).- 21 048278 N-G or D-G moieties and can lead to the creation of an isoaspartic acid residue, which introduces a kink into the polypeptide chain and reduces its stability (isoaspartic acid effect).
Каждое антитело будет характеризоваться уникальной изоэлектрической точкой (pI), которая, как правило, попадает в диапазон pH, составляющий 6-9,5. pI для антитела IgG1, как правило, находится в пределах диапазона pH, составляющего 7-9,5, и pI для антитела IgG4, как правило, попадает в пределы диапазона pH, составляющего 6-8. Существует предположение, что антитела с pI за пределами нормального диапазона могут характеризоваться некоторой степенью разворачивания и нестабильности при in vivo условиях. Таким образом, предпочтительно, чтобы антитело к CD40 характеризовалось значением pI, которое попадает в нормальный диапазон. Этого можно достичь либо с помощью выбора антител с pI в нормальном диапазоне, либо с помощью мутирования заряженных поверхностных остатков.Each antibody will have a unique isoelectric point (pI), which typically falls within the pH range of 6-9.5. The pI for an IgG1 antibody will typically fall within the pH range of 7-9.5, and the pI for an IgG4 antibody will typically fall within the pH range of 6-8. It has been suggested that antibodies with pIs outside the normal range may exhibit some degree of unfolding and instability under in vivo conditions. Thus, it is preferable for an anti-CD40 antibody to have a pI that falls within the normal range. This can be achieved either by selecting antibodies with pIs in the normal range or by mutating charged surface residues.
Каждое антитело будет характеризоваться характерной температурой плавления, при этом повышенная температура плавления указывает на большую общую стабильность in vivo (Krishnamurthy R. and Manning M.C. (2002), Curr. Pharm. Biotechnol. 3:361-71). Как правило, предпочтительно, чтобы ТМ1 (температура исходного разворачивания) составляла больше чем 60°C, предпочтительно больше чем 65°C, даже более предпочтительно больше чем 70°C. Точку плавления антитела можно измерить с использованием дифференциальной сканирующей калориметрии (Chen et al. (2003), Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al. (1999), Immunol Lett. 68:47-52) или кругового дихроизма (Murray et al. (2002), J. Chromatogr. Sci. 40:343-9).Each antibody will have a characteristic melting temperature, with an elevated melting temperature indicating greater overall stability in vivo (Krishnamurthy R. and Manning M.C. (2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3:361-71). Generally, it is preferred that the TM1 (initial unfolding temperature) be greater than 60°C, preferably greater than 65°C, even more preferably greater than 70°C. The melting point of an antibody can be measured using differential scanning calorimetry (Chen et al. (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al. (1999) Immunol Lett. 68:47-52) or circular dichroism (Murray et al. (2002) J. Chromatogr. Sci. 40:343-9).
Согласно предпочтительному варианту осуществления выбирают антитела, которые быстро не разлагаются. Разложение антитела можно измерить с использованием капиллярного электрофореза (СЕ) и MALDI-MS (масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией) (Alexander A.J. and Hughes D.E. (1995), Anal. Chem. 67:3626-32).According to a preferred embodiment, antibodies are selected that do not degrade rapidly. Antibody degradation can be measured using capillary electrophoresis (CE) and MALDI-MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry) (Alexander A.J. and Hughes D.E. (1995) Anal. Chem. 67:3626-32).
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления выбирают антитела, которые характеризуются минимальными агрегационными эффектами, которые могут привести к запуску нежелательного иммунного ответа и/или измененным или неблагоприятным фармакокинетическим свойствам. Как правило, приемлемыми являются антитела с агрегацией, составляющей 25% или меньше, предпочтительно 20% или меньше, даже более предпочтительно 15% или меньше, даже более предпочтительно 10% или меньше и даже более предпочтительно 5% или меньше. Агрегацию можно измерить с помощью нескольких техник, включая в себя эксклюзионную колонку (SEC), высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC) и рассеяние света.According to another preferred embodiment, antibodies are selected that are characterized by minimal aggregation effects that can lead to the initiation of an undesirable immune response and / or altered or unfavorable pharmacokinetic properties. Typically, antibodies with an aggregation of 25% or less, preferably 20% or less, even more preferably 15% or less, even more preferably 10% or less, and even more preferably 5% or less are acceptable. Aggregation can be measured using several techniques, including size exclusion column (SEC), high performance liquid chromatography (HPLC) and light scattering.
IV. Молекулы нуклеиновой кислоты.IV. Nucleic acid molecules.
Другой описанный в настоящем документе аспект относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют антитела, описанные в настоящем документе. Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, в клеточном лизате или в частично очищенной или по существу чистой форме. Нуклеиновая кислота является выделенной или ставшей по существу чистой, когда ее очищают от других клеточных компонентов или других примесей, например других клеточных нуклеиновых кислот (например, другой хромосомной ДНК, например хромосомной ДНК, которая связана с выделенной ДНК в природе) или белков, с помощью стандартных техник, включая в себя обработку щелочью/SDS, бэндинг с помощью CsCl, колоночную хроматографию, рестрикционные ферменты, электрофорез в агарозном геле и другие способы, хорошо известные в настоящей области техники. См., F. Ausubel, et al., ed. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Описанная в настоящем документе нуклеиновая кислота может представлять собой, например, ДНК или РНК и может содержать или не содержать интронные последовательности. Согласно определенным вариантам осуществления нуклеиновая кислота представляет собой молекулу кДНК.Another aspect described herein relates to nucleic acid molecules that encode the antibodies described herein. The nucleic acids may be present in whole cells, in a cell lysate, or in partially purified or substantially pure form. A nucleic acid is isolated or rendered substantially pure when it is purified from other cellular components or other contaminants, such as other cellular nucleic acids (e.g., other chromosomal DNA, such as chromosomal DNA that is associated with the isolated DNA in nature) or proteins, using standard techniques, including alkali/SDS treatment, CsCl banding, column chromatography, restriction enzymes, agarose gel electrophoresis, and other methods well known in the art. See, F. Ausubel, et al., ed. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. The nucleic acid described herein may be, for example, DNA or RNA, and may or may not contain intron sequences. In certain embodiments, the nucleic acid is a cDNA molecule.
Описанные в настоящем документе нуклеиновые кислоты можно получить с использованием стандартных техник молекулярной биологии. Для антител, экспрессируемых гибридомами (например, гибридомами, полученными из трансгенных мышей, несущих гены иммуноглобулина человека, как описано дополнительно ниже), кДНК, кодирующие легкие и тяжелые цепи антитела, полученного с помощью гибридомы, можно получить с помощью стандартных техник ПЦР-амплификации или клонирования кДНК. Для антител, полученных из библиотеки генов иммуноглобулинов (например, с использованием техник фагового дисплея), нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, можно извлечь из библиотеки.The nucleic acids described herein can be prepared using standard molecular biology techniques. For antibodies expressed by hybridomas (e.g., hybridomas prepared from transgenic mice carrying human immunoglobulin genes, as described further below), cDNAs encoding the light and heavy chains of the antibody produced by the hybridoma can be prepared using standard PCR amplification or cDNA cloning techniques. For antibodies prepared from an immunoglobulin gene library (e.g., using phage display techniques), nucleic acid encoding the antibody can be recovered from the library.
Получив фрагменты ДНК, кодирующие сегменты VH и VL, с указанными фрагментами ДНК можно проводить дополнительные манипуляции с помощью стандартных техник рекомбинантной ДНК, например, для превращения генов вариабельных областей в гены полноразмерных цепей антитела, в гены Fab-фрагмента или в ген scFv. В указанных манипуляциях кодирующий VL или VH фрагмент ДНК функционально связан с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, такой как константная область антитела или гибкий линкер. Подразумевается, что термин функционально связанный, используемый в этом контексте, означает, что два фрагмента ДНК соединены так, чтобы аминокислотные последовательности, кодируемые двумя фрагментами ДНК, оставались в рамке считывания.Having obtained DNA fragments encoding the VH and VL segments, these DNA fragments can be further manipulated using standard recombinant DNA techniques, for example, to convert the variable region genes into full-length antibody chain genes, into Fab fragment genes, or into an scFv gene. In these manipulations, the VL or VH encoding DNA fragment is operably linked to another DNA fragment encoding another protein, such as an antibody constant region or a flexible linker. The term operably linked, as used in this context, is intended to mean that the two DNA fragments are joined such that the amino acid sequences encoded by the two DNA fragments remain in reading frame.
Выделенную ДНК, кодирующую область VH, можно превратить в ген полноразмерной тяжелой цепи путем функционального связывания кодирующей VH ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующейThe isolated DNA encoding the VH region can be converted into a full-length heavy chain gene by operatively linking the VH-encoding DNA to another DNA molecule encoding
- 22 048278 константные области тяжелой цепи (шарнир, СН1, CH2 и/или CH3). Последовательности генов константной области тяжелой цепи человека известны в настоящей области техники (см., например, Kabat, E.A., el al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), и фрагменты ДНК, включающие в себя указанные области, можно получить с помощью стандартной ПЦР-амплификации. Константная область тяжелой цепи может представлять собой константную область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD, например область IgG1. Для гена тяжелой цепи Fab-фрагмента кодирующая VH ДНК может являться функционально связанной с другой молекулой ДНК, кодирующей только константную область СН1 тяжелой цепи.- 22 048 278 heavy chain constant regions (hinge, CH1, CH2 and/or CH3). Human heavy chain constant region gene sequences are known in the art (see, for example, Kabat, EA, el al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), and DNA fragments comprising these regions can be obtained by standard PCR amplification. The heavy chain constant region may be an IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM or IgD constant region, such as an IgG1 region. For a Fab fragment heavy chain gene, the VH encoding DNA may be operably linked to another DNA molecule encoding only theCH1 constant region of the heavy chain.
Выделенную ДНК, кодирующую область VL, можно превратить в ген полноразмерной легкой цепи (а также ген легкой цепи Fab) путем функционального связывания кодирующей VL ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи, CL. Последовательности генов константной области легкой цепи человека известны в настоящей области техники (см., например, Kabat, E.A., et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), и фрагменты ДНК, включающие в себя указанные области, можно получить с помощью стандартной ПЦР-амплификации. Константная область легкой цепи может представлять собой каппа или лямбда константную область.The isolated DNA encoding the VL region can be converted into a full-length light chain gene (as well as a Fab light chain gene) by operably linking the VL-encoding DNA to another DNA molecule encoding the light chain constant region, CL. Sequences of human light chain constant region genes are known in the art (see, e.g., Kabat, E. A., et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), and DNA fragments comprising these regions can be obtained by standard PCR amplification. The light chain constant region can be a kappa or lambda constant region.
Для создания гена scFv кодирующие VH и VL ДНК фрагменты функционально связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например, кодирующим аминокислотную последовательность (Gly4-Ser)3, так, чтобы последовательности VH и VL можно было экспрессировать в виде непрерывного одноцепочечного белка, с областями VL и VH, соединенными гибким линкером (см., например, Bird et al. (1988), Science, 242:423-426; Huston et al. (1988)Proc. Natl Acad. Sci. (USA), 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990), Nature, 348:552-554).To generate the scFv gene, the VH and VL DNA fragments are operably linked to another fragment encoding a flexible linker, e.g., encoding the amino acid sequence (Gly4-Ser)3, so that the V H and V L sequences can be expressed as a continuous single-chain protein, with the V L and VH regions connected by a flexible linker (see, e.g., Bird et al. (1988) Science, 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl Acad. Sci. (USA), 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature, 348:552-554).
V. Создание антител.V. Creation of antibodies.
Различные антитела согласно настоящему изобретению, например, те, которые конкурируют или связываются с тем же эпитопом, что антитела к CD40 человека, раскрытые в настоящем документе, можно получить с использованием разнообразных известных техник, таких как стандартная техника гибридизации соматических клеток, описанная Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975). Хотя процедуры гибридизации соматических клеток являются предпочтительными, в принципе, также можно использовать другие техники для получения моноклональных антител, например вирусную или онкогенную трансформацию В-лимфоцитов, технику фагового дисплея с использованием библиотек генов антител человека.Various antibodies of the present invention, for example those that compete with or bind to the same epitope as the anti-human CD40 antibodies disclosed herein, can be prepared using a variety of known techniques, such as the standard somatic cell hybridization technique described by Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975). Although somatic cell hybridization procedures are preferred, in principle other techniques for producing monoclonal antibodies can also be used, such as viral or oncogenic transformation of B lymphocytes, phage display techniques using human antibody gene libraries.
Предпочтительная система с использованием животного для получения гибридом представляет собой систему с использованием мыши. Получение гибридом у мыши представляет собой очень хорошо налаженную процедуру. Протоколы иммунизации и техники для выделения иммунизированных спленоцитов для слияния известны в настоящей области техники. Также известны партнеры по слиянию (например, клетки миеломы мыши) и процедуры слияния.A preferred animal system for producing hybridomas is a mouse system. The production of hybridomas in mice is a very well established procedure. Immunization protocols and techniques for isolating immunized splenocytes for fusion are known in the art. Fusion partners (e.g., mouse myeloma cells) and fusion procedures are also known.
Химерные или гуманизированные антитела, описанные в настоящем документе, можно получить на основании последовательности мышиного моноклонального антитела, полученного, как описано выше. ДНК, кодирующую тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов, можно получить из представляющей интерес мышиной гибридомы и сконструировать так, чтобы она содержала не являющиеся мышиными (например, человеческие) последовательности иммуноглобулина с использованием стандартных техник молекулярной биологии. Например, для создания химерного антитела мышиные вариабельные области можно связывать с константными областями человека с использованием способов, известных в настоящей области техники (см., например, патент США № 4816567 на имя Cabilly et al.). Для создания гуманизированного антитела мышиные области CDR можно вставлять в каркасную область человека с использованием способов, известных в настоящей области техники (см., например, патент США № 5225539 на имя Winter и патенты США № 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 на имя Queen et al.).The chimeric or humanized antibodies described herein can be prepared based on the sequence of a murine monoclonal antibody prepared as described above. DNA encoding the immunoglobulin heavy and light chains can be obtained from a murine hybridoma of interest and engineered to contain non-mouse (e.g., human) immunoglobulin sequences using standard molecular biology techniques. For example, to create a chimeric antibody, murine variable regions can be linked to human constant regions using methods known in the art (see, e.g., U.S. Patent No. 4,816,567 to Cabilly et al.). To create a humanized antibody, the mouse CDR regions can be inserted into a human framework region using methods known in the art (see, e.g., U.S. Patent No. 5,225,539 to Winter and U.S. Patent Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762; and 6,180,370 to Queen et al.).
Согласно одному варианту осуществления антитела, описанные в настоящем документе, представляют собой моноклональные антитела человека. Такие моноклональные антитела человека, направленные против CD40 человека, можно создать с использованием трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих части иммунной системы человека вместо системы мыши. Указанные трансгенные и трансхромосомные мыши включают в себя мышей, которые в настоящем документе называются мыши HuMAb и мыши KM соответственно и обобщенно называются в настоящем документе мыши с Ig человека.In one embodiment, the antibodies described herein are human monoclonal antibodies. Such human monoclonal antibodies directed against human CD40 can be generated using transgenic or transchromosomal mice that carry portions of the human immune system instead of the mouse system. Said transgenic and transchromosomal mice include mice that are referred to herein as HuMAb mice and KM mice, respectively, and are collectively referred to herein as human Ig mice.
HuMAb mouse® (Medarex, Inc.) содержит мини-локусы гена иммуноглобулина человека, которые кодируют нереаранжированные последовательности тяжелых (μ и γ) и к легких цепей иммуноглобулина человека, вместе с нацеленными мутациями, которые инактивируют эндогенные локусы μ и к цепей (см., например, Lonberg, et al. (1994), Nature, 368(6474):856-859). Соответственно, мыши проявляют сниженную экспрессию IgM или к мыши, и в ответ на иммунизацию, введенные трансгены тяжелых и легких цепей человека подвергаются переключению класса и соматической мутации для создания высокоаффинных моноклональных IgGK человека (Lonberg, N. et al. (1994), ранее; обзор в Lonberg, N. (1994),HuMAb mouse® (Medarex, Inc.) contains human immunoglobulin gene miniloci that encode unrearranged sequences of the human immunoglobulin heavy (μ and γ) and κ light chains, together with targeted mutations that inactivate the endogenous μ and κ chain loci (see, e.g., Lonberg, et al. (1994), Nature, 368(6474):856–859). Accordingly, mice exhibit reduced expression of mouse IgM or κ, and in response to immunization, the introduced human heavy and light chain transgenes undergo class switching and somatic mutation to generate high-affinity monoclonal human IgGK (Lonberg, N. et al. (1994), previously; reviewed in Lonberg, N. (1994),
- 23 048278- 23 048278
Handbook of Experimental Pharmacology, 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995), Intern. Rev. Immunol. 13:65-93, и Harding, F. and Lonberg, N. (1995), Ann. NY. Acad. Sci. 764:536-546). Получение и применение мышей HuMab и геномные модификации, переносимые такими мышами, дополнительно описаны в Taylor, L. et al. (1992), Nucleic Acids Research, 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993), International Immunology, 5:647-656; Tuaillon et al. (1993), Proc. Natl Acad. Sci. (USA), 90:3720-3724; Choi et al. (1993), Nature Genetics, 4:117-123; Chen, J. et al. (1993), EMBO J. 12:821-830; Tuaillon et al. (1994), J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994), International Immunology, 6:579-591; и Fishwild, D. et al. (1996), Nature Biotechnology, 14:845-851, содержание всех из них полностью включены в настоящий документ посредством ссылки. См. дополнительно патенты США № 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 и 5770429; все на имя Lonberg и Kay; патент США № 5545807 на имя Surani et al.; публикации согласно РСТ № WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 и WO 99/45962, все на имя Lonberg и Kay; и публикация согласно РСТ № WO 01/14424 на имя Korman et al.Handbook of Experimental Pharmacology, 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995), Intern. Rev. Immunol. 13:65-93, and Harding, F. and Lonberg, N. (1995), Ann. NY. Acad. Sci. 764:536-546). The production and use of HuMab mice and the genomic modifications carried by such mice are further described in Taylor, L. et al. (1992), Nucleic Acids Research, 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993), International Immunology, 5:647-656; Tuaillon et al. (1993), Proc. Natl Acad. Sci. (USA), 90:3720-3724; Choi et al. (1993), Nature Genetics, 4:117-123; Chen, J. et al. (1993), EMBO J. 12:821-830; Tuaillon et al. (1994), J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994), International Immunology, 6:579-591; and Fishwild, D. et al. (1996), Nature Biotechnology, 14:845-851, the contents of all of which are incorporated herein by reference in their entireties. See additional U.S. Patent Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299 and 5,770,429; all to Lonberg and Kay; U.S. Patent No. 5,545,807 to Surani et al.; PCT Publication Nos. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884, and WO 99/45962, all to Lonberg and Kay; and PCT Publication No. WO 01/14424 to Korman et al.
Согласно определенным вариантам осуществления антитела, описанные в настоящем документе, получают с использованием мыши, которая несет последовательности иммуноглобулина человека на трансгенах и трансхромосомах, такой как мышь, которая несет трансген тяжелой цепи человека и трансхромосому легкой цепи человека. Такие мыши, которые в настоящем документе называются мыши KM, описаны подробно в публикации согласно РСТ № WO 02/43478 на имя Ishida et al.In certain embodiments, the antibodies described herein are produced using a mouse that carries human immunoglobulin sequences on transgenes and transchromosomes, such as a mouse that carries a human heavy chain transgene and a human light chain transchromosome. Such mice, referred to herein as KM mice, are described in detail in PCT Publication No. WO 02/43478 to Ishida et al.
Кроме того, альтернативные системы трансгенных животных, экспрессирующие гены иммуноглобулинов человека, доступны в настоящей области техники, и их можно использовать для получения антител к huCD40, описанных в настоящем документе. Например, можно использовать альтернативную трансгенную систему, которая называется Xenomouse (Abgenix, Inc.); такие мыши описаны, например, в патентах США № 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 и 6162963 на имя Kucherlapati et al.In addition, alternative transgenic animal systems expressing human immunoglobulin genes are available in the art and can be used to produce the huCD40 antibodies described herein. For example, an alternative transgenic system called Xenomouse (Abgenix, Inc.) can be used; such mice are described, for example, in U.S. Patents 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584; and 6,162,963 to Kucherlapati et al.
Более того, альтернативные системы трансхромосомных животных, экспрессирующие гены иммуноглобулинов человека, доступны в настоящей области техники, и их можно использовать для получения антител к CD40, описанных в настоящем документе. Например, можно использовать мышей, несущих как трансхромосому тяжелой цепи человека, так и трансхромосому легкой цепи человека, которые называются мыши TC; такие мыши описаны в Tomizuka et al. (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 97:722-727. Более того, коровы, несущие трансхромосомы тяжелой и легкой цепей человека, были описаны в настоящей области техники (Kuroiwa et al. (2002), Nature Biotechnology, 20:889-894), и их можно использовать для получения антител к huCD40, описанных в настоящем документе.Moreover, alternative transchromosomal animal systems expressing human immunoglobulin genes are available in the art and can be used to produce the anti-CD40 antibodies described herein. For example, mice carrying both a human heavy chain transchromosome and a human light chain transchromosome, called TC mice, can be used; such mice are described in Tomizuka et al. (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 97:722-727. Moreover, cows carrying human heavy and light chain transchromosomes have been described in the art (Kuroiwa et al. (2002), Nature Biotechnology, 20:889-894), and can be used to produce the anti-huCD40 antibodies described herein.
Дополнительные мышиные системы, описанные в настоящей области техники для получения антител человека, например антител человека к huCD40, включают в себя (i) мышь VELOCIMMUNE® (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), в которой эндогенные вариабельные области тяжелых и легких цепей мыши были замещены посредством гомологичной рекомбинации, вариабельными областями тяжелых и легких цепей человека, функционально связанными с эндогенными константными областями мыши так, чтобы у мышей производились химерные антитела (V человека/С мыши), и затем впоследствии их превращают в полностью человеческие антитела с использованием стандартных техник рекомбинантной ДНК; и (ii) мышь МеМо® (Merus Biopharmaceuticals, Inc.), в которой мышь содержит нереаранжированные вариабельные области тяжелых цепей человека, но одну реаранжированную общую вариабельную область легкой цепи человека. Такие мыши и их применение для получения антител описаны, например, в WO 2009/15777, US 2010/0069614, WO 2011/072204, WO 2011/097603, WO 2011/163311, WO 2011/163314, WO 2012/148873, US 2012/0070861 и US 2012/0073004.Additional mouse systems described in the art for producing human antibodies, such as human anti-huCD40 antibodies, include (i) the VELOCIMMUNE® mouse (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), in which the endogenous mouse heavy and light chain variable regions have been replaced by homologous recombination with human heavy and light chain variable regions operably linked to endogenous mouse constant regions such that the mice produce chimeric antibodies (human V/mouse C) and are then subsequently converted to fully human antibodies using standard recombinant DNA techniques; and (ii) the MeMo® mouse (Merus Biopharmaceuticals, Inc.), in which the mouse contains unrearranged human heavy chain variable regions but one rearranged human light chain common variable region. Such mice and their use for producing antibodies are described, for example, in WO 2009/15777, US 2010/0069614, WO 2011/072204, WO 2011/097603, WO 2011/163311, WO 2011/163314, WO 2012/148873, US 2012/0070861 and US 2012/0073004.
Моноклональные антитела человека, описанные в настоящем документе, также можно получить с использованием способов фагового дисплея для скрининга библиотек генов иммуноглобулинов человека. Такие способы фагового дисплея для выделения антител человека являются общепринятыми в настоящей области техники. См., например, патенты США № 5223409; 5403484 и 5571698 на имя Ladner et al.; патенты США № 5427908 и 5580717 на имя Dower et al.; патенты США № 5969108 и 6172197 на имя McCafferty et al.; и патенты США № 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081 на имя Griffiths et al.The human monoclonal antibodies described herein can also be prepared using phage display methods for screening human immunoglobulin gene libraries. Such phage display methods for isolating human antibodies are well established in the art. See, for example, U.S. Patent Nos. 5,223,409; and 5,571,698 to Ladner et al.; U.S. Patent Nos. 5,427,908 and 5,580,717 to Dower et al.; U.S. Patent Nos. 5,969,108 and 6,172,197 to McCafferty et al.; and U.S. Patent Nos. 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; and 6,593,081 to Griffiths et al.
Моноклональные антитела человека, описанные в настоящем документе, также можно получить с использованием мышей SCID, у которых иммунные клетки человека восстанавливают так, что ответ антител человека можно было получить при иммунизации. Такие мыши описаны, например, в патентах США № 5476996 и 5698767 на имя Wilson et al.The human monoclonal antibodies described herein can also be produced using SCID mice in which human immune cells have been reconstituted so that a human antibody response can be obtained upon immunization. Such mice are described, for example, in U.S. Patents 5,476,996 and 5,698,767 to Wilson et al.
Иммунизации.Immunizations.
Для создания полностью человеческих антител к CD40 человека, мышей или трансгенных или трансхромосомных мышей, содержащих гены иммуноглобулинов человека (например, мышей НСо12, НСо7 или KM), можно иммунизировать с помощью очищенного или обогащенного препарата антигена CD40 и/или клеток, экспрессирующих CD40, как описано для других антигенов, например, в Lonberg et al. (1994), Nature, 368(6474): 856-859; Fishwild et al. (1996), Nature Biotechnology, 14:845-851 и международной патентной публикации WO 98/24884. Альтернативно, мышей можно иммунизировать с помощьюTo generate fully human antibodies to human CD40, mice or transgenic or transchromosomal mice containing human immunoglobulin genes (e.g., HCo12, HCo7, or KM mice) can be immunized with a purified or enriched preparation of CD40 antigen and/or cells expressing CD40 as described for other antigens, e.g., in Lonberg et al. (1994), Nature, 368(6474): 856-859; Fishwild et al. (1996), Nature Biotechnology, 14:845-851, and International Patent Publication No. WO 98/24884. Alternatively, mice can be immunized with
- 24 048278- 24 048278
ДНК, кодирующей CD40 человека. Предпочтительно возраст мышей составляет 6-16 недель при первой инфузии. Например, очищенный или обогащенный препарат (5-50 мкг) рекомбинантного антигена CD40 человека можно использовать для иммунизации мышей интраперитонеально. В случае, когда иммунизации с использованием очищенного или обогащенного препарата антигена CD40 не привели в результате к образованию антител, мышей можно иммунизировать с помощью клеток, экспрессирующих CD40, например клеточной линии, для стимуляции иммунных ответов.DNA encoding human CD40. Preferably, the mice are 6-16 weeks old at the time of the first infusion. For example, a purified or enriched preparation (5-50 μg) of recombinant human CD40 antigen can be used to immunize mice intraperitoneally. In cases where immunizations using a purified or enriched preparation of CD40 antigen fail to result in antibody formation, mice can be immunized with cells expressing CD40, such as a cell line, to stimulate immune responses.
Накопленный опыт с различными антигенами показал, что трансгенные мыши HuMAb лучше отвечают, когда их изначально иммунизировали интраперитонеально (IP) или подкожно (SC) с помощью антигена в адъюванте Ribi, с последующими IP/SC иммунизациями через неделю (всего вплоть до 10) с помощью антигена в адъюванте Ribi.Cumulative experience with various antigens has shown that HuMAb transgenic mice respond best when they are initially immunized intraperitoneally (IP) or subcutaneously (SC) with antigen in Ribi adjuvant, followed by IP/SC immunizations one week later (up to 10 in total) with antigen in Ribi adjuvant.
Иммунный ответ можно подвергать мониторингу в течение всего протокола иммунизации, получая образцы плазмы с помощью ретроорбитальных кровопусканий. Плазму можно подвергать скринингу с помощью ELISA и FACS (как описано ниже), и мышей с достаточными титрами иммуноглобулина к CD40 человека можно использовать для слияний. Мышам можно вводить бустер-инъекцию внутривенно с помощью антигена за 3 дня до умерщвления и удаления селезенки и лимфатических узлов. Предполагают, что, возможно, потребуется выполнить 2-3 слияния для каждой иммунизации. От 6 до 24 мышей, как правило, иммунизируют для каждого антигена. Как правило, используют линии НСо7, НСо12 и KM. Кроме того, как НСо7, так и НСо12 трансген можно разводить вместе в одной мыши, характеризующейся двумя различными трансгенами тяжелой цепи человека (НСо7/НСо12).The immune response can be monitored throughout the immunization protocol by obtaining plasma samples by retro-orbital bleeds. Plasma can be screened by ELISA and FACS (as described below) and mice with sufficient titers of human CD40 immunoglobulin can be used for fusions. Mice can be boosted intravenously with antigen 3 days before sacrifice and removal of the spleen and lymph nodes. It is anticipated that 2-3 fusions may be necessary for each immunization. Between 6 and 24 mice are typically immunized for each antigen. Typically, the HCo7, HCo12, and KM strains are used. Additionally, both the HCo7 and HCo12 transgene can be bred together in a single mouse carrying two different human heavy chain transgenes (HCo7/HCo12).
Создание гибридом, производящих моноклоналъные антитела к CD40.Generation of hybridomas producing monoclonal antibodies to CD40.
Для создания гибридом, производящих моноклональные антитела, описанные в настоящем документе, спленоциты и/или клетки лимфатических узлов от иммунизированных мышей, можно выделить и произвести их слияние с соответствующей иммортализованной клеточной линией, такой как клеточная линия миеломы мыши. Полученные гибридомы можно подвергать скринингу в отношении продукции антигенспецифических антител. Например, одноклеточные суспензии лимфоцитов селезенки от иммунизированных мышей можно сливать с клетками несекреторной миеломы мыши Sp2/0 (ATCC, CRL 1581) с 50% PEG. Клетки помещают с плотностью, составляющей приблизительно 2х105, в плоскодонный титрационный микропланшет с последующей двухнедельной инкубацией в селективной среде, содержащей 10% фетальную сыворотку клона, 18% кондиционированную среду 653, 5% ориген (IGEN), 4 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 5 мМ HEPES, 0,055 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 ед./мл пенициллина, 50 мг/мл стрептомицина, 50 мг/мл гентамицина и 1х HAT (Sigma). Приблизительно через две недели клетки можно культивировать в среде, в которой HAT заменяют на НТ. Отдельные лунки затем можно подвергать скринингу с помощью ELISA в отношении моноклональных антител IgM и IgG человека. Как только происходит масштабный рост гибридомы, можно проводить наблюдение за средой, как правило, через 10-14 дней. Секретирующие антитела гибридомы можно повторно помещать на планшет, снова подвергать скринингу, и, если они все еще являются положительными в отношении IgG человека, моноклональные антитела можно субклонировать по меньшей мере дважды путем предельных разведений. Стабильные субклоны затем можно культивировать in vitro для создания небольших количеств антитела в среде культивирования тканей для определения характеристик.To generate hybridomas that produce the monoclonal antibodies described herein, splenocytes and/or lymph node cells from immunized mice can be isolated and fused with an appropriate immortalized cell line, such as a mouse myeloma cell line. The resulting hybridomas can be screened for production of antigen-specific antibodies. For example, single-cell suspensions of spleen lymphocytes from immunized mice can be fused with Sp2/0 mouse nonsecretory myeloma cells (ATCC, CRL 1581) with 50% PEG. Cells are plated at a density of approximately 2 x 105 in a flat-bottomed microtiter plate and incubated for 2 weeks in selective medium containing 10% fetal clone serum, 18% 653 conditioned medium, 5% Origen (IGEN), 4 mM L-glutamine, 1 mM sodium pyruvate, 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-mercaptoethanol, 50 U/ml penicillin, 50 mg/ml streptomycin, 50 mg/ml gentamicin, and 1x HAT (Sigma). After approximately 2 weeks, cells can be cultured in medium in which HAT is replaced by HT. Individual wells can then be screened by ELISA for human IgM and IgG monoclonal antibodies. Once large-scale growth of the hybridoma has occurred, the medium can be monitored, typically after 10-14 days. The antibody-secreting hybridoma can be re-plated, screened again, and if still positive for human IgG, the monoclonal antibodies can be subcloned at least twice by limiting dilutions. Stable subclones can then be cultured in vitro to generate small amounts of antibody in tissue culture medium for characterization.
Для очистки моноклональных антител выбранные гибридомы можно выращивать в двухлитровых роллерных колбах для очистки моноклональных антител. Супернатанты можно фильтровать и концентрировать до аффинной хроматографии с помощью белок А-сефарозы (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Элюированный IgG можно проверять с помощью гель-электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии для обеспечения чистоты. Буферный раствор можно заменить на PBS, и концентрацию можно определить с помощью OD280 с использованием коэффициента экстинкции, составляющего 1,43. Моноклональные антитела можно разделить на аликвоты и хранить при -80°C.For purification of monoclonal antibodies, selected hybridomas can be grown in 2-liter monoclonal antibody purification spinner flasks. Supernatants can be filtered and concentrated prior to affinity chromatography using protein A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Eluted IgG can be verified by gel electrophoresis and high-performance liquid chromatography to ensure purity. The buffer can be replaced with PBS, and the concentration can be determined by OD280 using an extinction coefficient of 1.43. Monoclonal antibodies can be aliquoted and stored at -80°C.
VI. Производство антител.VI. Production of antibodies.
Создание трансфектом, продуцирующих моноклональные антитела к CD40.Generation of transfectomas producing monoclonal antibodies to CD40.
Антитела согласно настоящему изобретению, включая в себя как конкретные антитела, для которых представлены последовательности, так и другие, родственные антитела к CD40, можно получить в трансфектоме клетки-хозяина с использованием, например, комбинации техник рекомбинантной ДНК и способов генной трансфекции, что хорошо известно в настоящей области техники (Morrison, S. (1985), Science, 229:1202).The antibodies of the present invention, including both the specific antibodies for which the sequences are provided and other related CD40 antibodies, can be produced in a host cell transfectoma using, for example, a combination of recombinant DNA techniques and gene transfection methods, as is well known in the art (Morrison, S. (1985), Science, 229:1202).
Например, для экспрессии антител или их фрагментов антител ДНК, кодирующие частичные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, можно получить с помощью стандартных техник молекулярной биологии (например, ПЦР-амплификация или клонирование кДНК с использованием гибридомы, которая экспрессирует антитело, представляющее интерес), и ДНК можно вставить в векторы экспрессии так, чтобы гены были функционально связаны с транскрипционными и трансляционными регуляторными последовательностями. В этом контексте подразумевается, что термин функционально связанный означает, что ген антитела лигирован в вектор так, чтобы транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности в пределах вектора выполняли свою предусмотренную функцию регуляцииFor example, to express antibodies or antibody fragments thereof, DNA encoding partial or full-length light and heavy chains can be obtained using standard molecular biology techniques (e.g., PCR amplification or cDNA cloning using a hybridoma that expresses the antibody of interest) and the DNA can be inserted into expression vectors such that the genes are operably linked to transcriptional and translational regulatory sequences. In this context, the term operably linked is intended to mean that the antibody gene is ligated into the vector such that the transcriptional and translational regulatory sequences within the vector perform their intended regulatory function.
- 25 048278 транскрипции и трансляции гена антитела. Вектор экспрессии и последовательности регуляции экспрессии выбирают так, чтобы они являлись совместимыми с используемой клеткой-хозяином экспрессии. Г ен легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела можно вставить в отдельный вектор или оба гена вставляют в один и тот же экспрессионный вектор. Гены антитела вставляют в экспрессионный(е) вектор(ы) с помощью стандартных способов (например, лигирование комплементарных рестрикционных сайтов на фрагменте гене антитела и вектора или лигирование тупых концов, если отсутствуют сайты рестрикции). Вариабельные области легких и тяжелых цепей антител, описанных в настоящем документе, можно использовать для создания полноразмерных генов антитела любого изотипа антител путем вставки их в экспрессионные векторы, уже кодирующие константные области тяжелой цепи и константные области легкой цепи требуемого изотипа так, чтобы сегмент VH являлся функционально связанным с сегментом(ами) CH в пределах вектора, и сегмент VL являлся функционально связанным с сегментом CL в пределах вектора. Дополнительно или альтернативно, рекомбинантный экспрессионный вектор может кодировать сигнальный пептид, который способствует секреции цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела можно клонировать в вектор так, чтобы сигнальный пептид был связан в одной рамке считывания с аминоконцом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (т.е. сигнальный пептид из не являющегося иммуноглобулином белка).- 25 048278 transcription and translation of the antibody gene. The expression vector and expression control sequences are selected to be compatible with the expression host cell used. The antibody light chain gene and the antibody heavy chain gene can be inserted into a separate vector, or both genes are inserted into the same expression vector. The antibody genes are inserted into the expression vector(s) using standard techniques (e.g., ligation of complementary restriction sites on the antibody gene fragment and the vector, or blunt-end ligation if restriction sites are not present). The variable regions of the light and heavy chains of the antibodies described herein can be used to generate full-length antibody genes of any antibody isotype by inserting them into expression vectors already encoding the heavy chain constant regions and the light chain constant regions of the desired isotype such that the VH segment is operably linked to the CH segment(s) within the vector and the VL segment is operably linked to the CL segment within the vector. Additionally or alternatively, the recombinant expression vector can encode a signal peptide that facilitates secretion of the antibody chain from the host cell. The antibody chain gene can be cloned into the vector such that the signal peptide is linked in frame to the amino terminus of the antibody chain gene. The signal peptide can be an immunoglobulin signal peptide or a heterologous signal peptide (i.e., a signal peptide from a non-immunoglobulin protein).
В дополнение к генам цепей антитела рекомбинантные экспрессионные векторы могут нести регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепей антитела в клеткехозяине. Подразумевается, что термин регуляторная последовательность включает в себя промоторы, энхансеры и другие контролирующие экспрессию элементы (например, сигналы полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепей антитела. Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Специалистам в настоящей области техники понятно, что строение экспрессионного вектора, включая в себя выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, подлежащей трансформации, уровень экспрессии требуемого белка и т.д. Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клеткехозяине млекопитающего включают в себя вирусные элементы, которые управляют высокими уровнями экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, происходящие из цитомегаловируса (CMV), вируса обезьян 40 (SV40), аденовируса (например, аденовирусный главный поздний промотор (AdMLP) и полиомы. Альтернативно, можно использовать невирусные регуляторные последовательности, такие как убиквитиновый промотор или β-глобиновый промотор. Кроме того, можно использовать регуляторные элементы, состоящие из последовательностей из различных источников, такие как промоторная система SRa, которая содержит последовательности из раннего промотора SV40 и длинный концевой повтор вируса Т-клеточного лейкоза типа 1 человека (Takebe, Y. et al. (1988), Mol. Cell Biol. 8:466-472).In addition to the antibody chain genes, recombinant expression vectors may carry regulatory sequences that control the expression of the antibody chain genes in a host cell. The term regulatory sequence is intended to include promoters, enhancers, and other expression control elements (e.g., polyadenylation signals) that control the transcription or translation of the antibody chain genes. Such regulatory sequences are described, for example, in Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Those skilled in the art will appreciate that the design of the expression vector, including the choice of regulatory sequences, may depend on factors such as the choice of host cell to be transformed, the level of expression of the desired protein, etc. Preferred regulatory sequences for expression in a mammalian host cell include viral elements that direct high levels of protein expression in mammalian cells, such as promoters and/or enhancers derived from cytomegalovirus (CMV), simian virus 40 (SV40), adenovirus (e.g., adenovirus major late promoter (AdMLP) and polyoma. Alternatively, non-viral regulatory sequences such as the ubiquitin promoter or the β-globin promoter can be used. Additionally, regulatory elements composed of sequences from a variety of sources can be used, such as the SRa promoter system, which contains sequences from the SV40 early promoter and the human T-cell leukemia virus type 1 long terminal repeat (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell Biol. 8:466-472).
В дополнение к генам цепей антител и регуляторным последовательностям рекомбинантные экспрессионные векторы могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки начала репликации) и селектируемые маркерные гены. Селектируемый маркерный ген облегчает выбор клеток-хозяев, в которые вектор был введен (см., например, патенты США № 4399216, 4634665 и 5179017, все на имя Axel et al.). Например, как правило, селектируемый маркерный ген придает устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую введен вектор. Предпочтительные селектируемые маркерные гены включают в себя ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для применения в dhfr-клетках-хозяевах с селекцией/амплификацией в присутствии метотрексата) и ген neo (для селекции в отношении G418).In addition to the antibody chain genes and regulatory sequences, recombinant expression vectors may carry additional sequences, such as sequences that regulate replication of the vector in host cells (e.g., origins of replication) and selectable marker genes. A selectable marker gene facilitates the selection of host cells into which the vector has been introduced (see, e.g., U.S. Patent Nos. 4,399,216, 4,634,665, and 5,179,017, all to Axel et al.). For example, typically a selectable marker gene confers resistance to drugs such as G418, hygromycin, or methotrexate to the host cell into which the vector has been introduced. Preferred selectable marker genes include the dihydrofolate reductase (DHFR) gene (for use in dhfr host cells with methotrexate-mediated selection/amplification) and the neo gene (for selection against G418).
Для экспрессии легких и тяжелых цепей экспрессионный(е) вектор(ы), кодирующий(е) тяжелые и легкие цепи, трансфицируют в клетку-хозяина с помощью стандартных техник. Подразумевается, что различные формы термина трансфекция включают в себя широкое разнообразие техник, обычно используемых для введения эндогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клеткухозяина, например электропорация, осаждение фосфатом кальция, трансфекция с использованием DEAE-декстарана и т.п. Хотя теоретически можно экспрессировать антитела, описанные в настоящем документе, или в прокариотических, или в эукариотических клетках-хозяевах, экспрессия антител в эукариотических клетках и наиболее предпочтительно клетках-хозяевах млекопитающих является наиболее предпочтительной, поскольку такие эукариотические клетки и особенно клетки млекопитающих более вероятно, чем прокариотические клетки, осуществляют сборку и секретируют характеризующееся правильной укладкой и иммунологически активное антитело. Прокариотическая экспрессия генов антител, как сообщалось, является неэффективной для продукции высоких выходов активного антитела (Boss, M.A. and Wood, C.R. (1985), Immunology Today, 6:12-13). Антитела согласно настоящему изобретению также можно получить в полученных с помощью гликоинженерии штаммах дрожжей Pichia pastoris. Li et al. (2006), Nat. Biotechnol. 24:210.To express the light and heavy chains, the expression vector(s) encoding the heavy and light chains are transfected into a host cell using standard techniques. The various forms of the term transfection are intended to include a wide variety of techniques commonly used to introduce endogenous DNA into a prokaryotic or eukaryotic host cell, such as electroporation, calcium phosphate precipitation, DEAE-dextran transfection, and the like. Although it is theoretically possible to express the antibodies described herein in either prokaryotic or eukaryotic host cells, expression of the antibodies in eukaryotic cells, and most preferably mammalian host cells, is most preferred because such eukaryotic cells, and especially mammalian cells, are more likely than prokaryotic cells to assemble and secrete a properly folded and immunologically active antibody. Prokaryotic expression of antibody genes has been reported to be inefficient in producing high yields of active antibody (Boss, M.A. and Wood, C.R. (1985), Immunology Today, 6:12-13). The antibodies of the present invention can also be produced in glycoengineered strains of the yeast Pichia pastoris. Li et al. (2006), Nat. Biotechnol. 24:210.
- 26 048278- 26 048278
Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител, описанных в настоящем документе, включают в себя клетки яичника китайского хомячка (клетки СНО) (включая в себя dhfr-клетки СНО, описанные в Urlaub and Chasm, (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 77:4216-4220, используемые с селектируемым маркером DHFR, например, как описано в R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982), Mol. Biol. 759:601-621), клетки миеломы NSO, клетки COS и клетки SP2. В частности, для применения с клетками миеломы NS0 другая предпочтительная экспрессионная система представляет собой система экспрессии генов GS, раскрытая в WO 87/04462, WO 89/01036 и ЕР 338841. Если рекомбинантные экспрессионные векторы, кодирующие гены антител, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, антитела получают путем культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для обеспечения возможности экспрессии антитела в клетках-хозяевах или более предпочтительно секреции антитела в среду культивирования, в которой выращивают клетки-хозяева. Антитела можно извлечь из среды культивирования с использованием стандартных способов очистки белка. N- и С-концы полипептидных цепей антитела согласно настоящему изобретению могут различаться от предполагаемой последовательности вследствие обычно наблюдаемых посттрансляционных модификаций. Например, С-концевые остатки лизина часто утрачиваются из тяжелых цепей антитела. Dick et al. (2008), Biotechnol. Bioeng. 100:1132. N-концевые остатки глутамина и в меньшей степени остатки глутамата часто превращаются в остатки пироглутамата как на легких, так и на тяжелых цепях терапевтических антител. Dick et al. (2007), Biotechnol. Bioeng. 97:544; Liu et al. (2011), J. Biol. Chem. 286:11211.Preferred mammalian host cells for expressing the recombinant antibodies described herein include Chinese hamster ovary cells (CHO cells) (including the dhfr-CHO cells described in Urlaub and Chasm, (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 77:4216-4220, used with a DHFR selectable marker, such as described in R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982), Mol. Biol. 759:601-621), NSO myeloma cells, COS cells, and SP2 cells. In particular, for use with NS0 myeloma cells, another preferred expression system is the GS gene expression system disclosed in WO 87/04462, WO 89/01036 and EP 338841. When recombinant expression vectors encoding antibody genes are introduced into mammalian host cells, the antibodies are produced by culturing the host cells for a period of time sufficient to allow expression of the antibody in the host cells or, more preferably, secreting the antibody into the culture medium in which the host cells are grown. The antibodies can be recovered from the culture medium using standard protein purification techniques. The N- and C-termini of the polypeptide chains of the antibody of the present invention may differ from the intended sequence due to commonly observed post-translational modifications. For example, C-terminal lysine residues are often lost from antibody heavy chains. Dick et al. (2008), Biotechnol. Bioeng. 100:1132. N-terminal glutamine residues and, to a lesser extent, glutamate residues are frequently converted to pyroglutamate residues on both the light and heavy chains of therapeutic antibodies. Dick et al. (2007), Biotechnol. Bioeng. 97:544; Liu et al. (2011), J. Biol. Chem. 286:11211.
VII. Анализы.VII. Analyses.
Описанные в настоящем документе антитела можно исследовать в отношении связывания с CD40 с помощью, например, стандартного ELISA. Вкратце, титрационные микропланшеты покрывают очищенным CD40 в концентрации 1-2 мкг/мл в PBS и затем блокируют с помощью 5% бычьего сывороточного альбумина в PBS. Разведения антитела (например, разведения плазмы от иммунизированных с помощью CD40 мышей) добавляют к каждой лунке и инкубируют в течение 1-2 ч при 37°C. Планшеты отмывают с помощью PBS/Tween и затем инкубируют со вторичным реагентом (например, для человеческих антител или антител, иным образом характеризующихся константной областью тяжелой цепью человека, козий Fc-специфический поликлональный реагент к IgG человека), конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) в течение 1 ч при 37°C. После отмывки планшеты проявляют с помощью субстрата ABTS (Moss Inc, продукт: ABTS-1000) и анализируют с помощью спектрофотометра при OD 415-495. Сыворотки от иммунизированных мышей затем дополнительно подвергают скринингу с помощью проточной цитометрии в отношении связывания с клеточной линией, экспрессирующей CD40 человека, но не с контрольной клеточной линией, которая не экспрессирует CD40. Вкратце, связывание антител к CD40 оценивают с помощью инкубации экспрессирующих CD40 клеток СНО с антителом к CD40 при разведении 1:20. Клетки отмывают и связывание обнаруживают с помощью РЕ-меченого Ab к IgG человека. Проточные цитометрические анализы проводят с использованием проточной цитометрии FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Предпочтительно для слияний будут использовать мышей, у которых развиваются самые высокие титры. Аналогичные эксперименты можно проводить с использованием детекционных антител к антителам мыши, если необходимо обнаружить мышиные антитела к huCD40.The antibodies described herein can be tested for binding to CD40 using, for example, a standard ELISA. Briefly, microtiter plates are coated with purified CD40 at a concentration of 1-2 μg/mL in PBS and then blocked with 5% bovine serum albumin in PBS. Dilutions of antibody (e.g., dilutions of plasma from mice immunized with CD40) are added to each well and incubated for 1-2 h at 37°C. Plates are washed with PBS/Tween and then incubated with a secondary reagent (e.g., for human antibodies or antibodies otherwise characterized by a human heavy chain constant region, goat Fc-specific polyclonal reagent against human IgG) conjugated to horseradish peroxidase (HRP) for 1 h at 37°C. After washing, the plates are developed with ABTS substrate (Moss Inc, product: ABTS-1000) and analyzed spectrophotometrically at OD 415-495. Sera from immunized mice are then further screened by flow cytometry for binding to a cell line expressing human CD40 but not to a control cell line that does not express CD40. Briefly, binding of anti-CD40 antibodies is assessed by incubating CD40-expressing CHO cells with anti-CD40 antibody at a 1:20 dilution. Cells are washed and binding is detected with PE-labeled anti-human IgG Ab. Flow cytometric analyses are performed using a FACScan flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA). Preferably, mice that develop the highest titers will be used for fusions. Similar experiments can be performed using anti-mouse detection antibodies if mouse anti-huCD40 antibodies are desired.
Анализ ELISA, как описано выше, можно использовать для скрининга в отношении антител и, таким образом, гибридом, которые производят антитела, которые показывают положительную реакционную способность в отношении иммуногена CD40. Гибридомы, которые производят антитела, которые связываются, предпочтительно с высокой аффинностью, с CD40, затем можно субклонировать и дополнительно определять характеристики. Один клон из каждой гибридомы, который сохраняет реакционную способность исходных клеток (согласно ELISA), затем можно выбрать для получения клеточного банка и для очистки антител.The ELISA assay as described above can be used to screen for antibodies and thus hybridomas that produce antibodies that show positive reactivity to the CD40 immunogen. Hybridomas that produce antibodies that bind, preferably with high affinity, to CD40 can then be subcloned and further characterized. One clone from each hybridoma that retains the reactivity of the original cells (according to ELISA) can then be selected for cell banking and antibody purification.
Для очистки антител к CD40 выбранные гибридомы можно выращивать в двухлитровых роллерных колбах для очистки моноклональных антител. Супернатанты можно фильтровать и концентрировать перед аффинной хроматографией с помощью белка А-сефарозы (Pharmacia, Piscataway, NJ). Элюированный IgG можно проверять с помощью гель-электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии для обеспечения чистоты. Буферный раствор можно заменить на PBS, и концентрацию можно определить с помощью OD280 с использованием коэффициента экстинкции, составляющего 1,43. Моноклональные антитела можно разделить на аликвоты и хранить при -80°C.To purify CD40 antibodies, selected hybridomas can be grown in 2-liter monoclonal antibody purification spinner flasks. Supernatants can be filtered and concentrated prior to affinity chromatography using protein A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). Eluted IgG can be verified by gel electrophoresis and high-performance liquid chromatography to ensure purity. The buffer can be exchanged for PBS, and the concentration can be determined by OD280 using an extinction coefficient of 1.43. Monoclonal antibodies can be aliquoted and stored at -80°C.
Для определения того, связываются ли выбранные моноклональные антитела к CD40 с уникальными эпитопами, каждое антитело можно биотинилировать с использованием коммерчески доступных реагентов (Pierce, Rockford, IL). Связывание биотинилированных MAb можно обнаружить с помощью меченного стрептавидином зонда. Конкурентные исследования с использованием немеченных моноклональных антител и биотинилированных моноклональных антител можно проводить с использованием покрытых CD40 планшетов для ELISA, как описано выше.To determine whether selected anti-CD40 mAbs bind to unique epitopes, each antibody can be biotinylated using commercially available reagents (Pierce, Rockford, IL). Binding of biotinylated MAbs can be detected using a streptavidin-labeled probe. Competition studies using unlabeled mAbs and biotinylated mAbs can be performed using CD40-coated ELISA plates as described above.
Для определения изотипа очищенных антител анализы ELISA для определения изотипа можно проводить с использованием реагентов, специфических в отношении антител конкретного изотипа. Например, для определения изотипа моноклонального антитела человека лунки титрационных микропланшетов можно покрывать 1 мкг/мл антитела к иммуноглобулину человека в течение ночи при 4°C. ПослеTo determine the isotype of purified antibodies, isotype ELISA assays can be performed using reagents specific for antibodies of a particular isotype. For example, to determine the isotype of a human monoclonal antibody, wells of microtiter plates can be coated with 1 μg/mL of anti-human immunoglobulin antibody overnight at 4°C.
- 27 048278 блокирования с помощью 1% BSA планшеты приводят в реакцию с 1 мкг/мл или меньше исследуемых моноклональных антител или очищенных изотопных контролей при окружающей температуре в течение 1-2 ч. Лунки затем можно приводить в реакцию со специфическими либо к IgG1 человека, либо к IgM человека конъюгированными со щелочной фосфатазой зондами. Планшеты проявляют и анализируют, как описано выше.- 27 048278 After blocking with 1% BSA, the plates are reacted with 1 μg/ml or less of the monoclonal antibodies to be tested or purified isotope controls at ambient temperature for 1-2 h. The wells can then be reacted with either human IgG1 or human IgM specific alkaline phosphatase-conjugated probes. The plates are developed and analyzed as described above.
Для исследования связывания моноклональных антител с живыми клетками, экспрессирующими CD40, можно использовать проточную цитометрию. Вкратце, клеточные линии, экспрессирующие мембраносвязанный CD40 (выращенные при стандартных условиях роста) смешивают с различными концентрациями моноклональных антител в PBS, содержащем 0,1% BSA, при 4°C в течение 1 ч. После отмывки клетки приводят в реакцию с меченным фикоэритрином (РЕ) антителом к IgG при тех же условиях, что и окрашивание первичного антитела. Образцы можно анализировать с помощью прибора FACScan с использованием свойств светового и бокового рассеяния для гейтирования отдельных клеток и определяют связывание меченых антител. Альтернативный анализ с использованием флуоресцентной микроскопии можно использовать в дополнение или вместо анализа проточной цитометрии. Клетки можно окрашивать точно, как описано выше, и исследовать с помощью флуоресцентной микроскопии. Этот способ позволяет визуализировать отдельные клетки, но может иметь сниженную чувствительность в зависимости от плотности антигена.Flow cytometry can be used to examine the binding of monoclonal antibodies to live cells expressing CD40. Briefly, cell lines expressing membrane-bound CD40 (grown under standard growth conditions) are mixed with various concentrations of monoclonal antibodies in PBS containing 0.1% BSA at 4°C for 1 h. After washing, the cells are reacted with phycoerythrin (PE)-labeled anti-IgG antibody under the same conditions as for primary antibody staining. Samples can be analyzed by FACScan using the light and side scatter properties to gate on individual cells and determine the binding of the labeled antibodies. An alternative assay using fluorescence microscopy can be used in addition to or instead of flow cytometric analysis. Cells can be stained accurately as described above and examined by fluorescence microscopy. This method allows visualization of individual cells but may have reduced sensitivity depending on the antigen density.
Антитела к huCD40 можно дополнительно исследовать в отношении реакционной способности по отношению к антигену CD40 с помощью вестерн-блоттинга. Вкратце, клеточные экстракты из клеток, экспрессирующих CD40, можно получать и подвергать электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. После электрофореза разделенные антигены будут переносить на нитроцеллюлозные мембраны, блокировать с помощью 20% мышиной сыворотки и зондировать с помощью моноклональных антител, подлежащих исследованию. Связывание IgG можно обнаружить с использованием щелочной фосфатазы к IgG и проявить с помощью таблеток субстрата BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).Anti-huCD40 antibodies can be further tested for reactivity with CD40 antigen by Western blotting. Briefly, cell extracts from CD40-expressing cells can be prepared and subjected to sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Following electrophoresis, separated antigens will be transferred to nitrocellulose membranes, blocked with 20% mouse serum, and probed with the monoclonal antibodies to be tested. IgG binding can be detected using anti-IgG alkaline phosphatase and developed with BCIP/NBT substrate tablets (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).
Способы анализа аффинности связывания, перекрестной реактивности и кинетики связывания различных антител к CD40 включают в себя стандартные анализы, известные в настоящей области техники, например анализ биослойной интерферометрии (BLI) и анализ поверхностного плазмонного резонанса (SPR) BIACORE® с использованием прибора для SPR BIACORE® 2000 (Biacore AB, Uppsala, Sweden).Methods for analyzing the binding affinity, cross-reactivity, and binding kinetics of various CD40 antibodies include standard assays known in the art, such as biolayer interferometry (BLI) assays and BIACORE® surface plasmon resonance (SPR) assays using a BIACORE® 2000 SPR instrument (Biacore AB, Uppsala, Sweden).
Согласно одному варианту осуществления антитело специфически связывается с внеклеточной областью CD40 человека. Антитело может специфически связываться с конкретным доменом (например, функциональным доменом) в пределах внеклеточного домена CD40. Согласно определенным вариантам осуществления антитело специфически связывается с внеклеточной областью CD40 человека и внеклеточной областью CD40 яванского макака. Предпочтительно антитело связывается с CD40 человека с высокой аффинностью.In one embodiment, the antibody specifically binds to the extracellular region of human CD40. The antibody may specifically bind to a particular domain (e.g., a functional domain) within the extracellular domain of CD40. In certain embodiments, the antibody specifically binds to the extracellular region of human CD40 and the extracellular region of cynomolgus monkey CD40. Preferably, the antibody binds to human CD40 with high affinity.
VIII. Биспецифические молекулы.VIII. Bispecific molecules.
Описанные в настоящем документе антитела можно использовать для образования биспецифических молекул. Антитело к CD40 или его антигенсвязывающие фрагменты могут являться дериватизированными или связанными с другой функциональной молекулой, например, другим пептидом или белком (например, другим антителом или лигандом для рецептора) для создания биспецифической молекулы, которые связываются по меньшей мере с двумя различными сайтами связывания или целевыми молекулами. Описанное в настоящем документе антитело может фактически являться дериватизированным или связанным больше чем с одной другой функциональной молекулой с образованием мультиспецифических молекул, которые связываются больше чем с двумя различными сайтами связывания и/или целевыми молекулами; такие мультиспецифические молекулы также, как подразумевается, включены в используемый в настоящем документе термин биспецифическая молекула. Для создания биспецифической молекулы, описанной в настоящем документе, описанное в настоящем документе антитело можно функционально связывать (например, путем химического сочетания, генетического слияния, нековалентной ассоциации или иным образом) с одной или несколькими другими связывающими молекулами, такими как другое антитело, фрагмент антитела, пептид или связывающий миметик, так, чтобы в результате образовывалась биспецифическая молекула.The antibodies described herein can be used to form bispecific molecules. An anti-CD40 antibody or antigen-binding fragments thereof can be derivatized or linked to another functional molecule, such as another peptide or protein (e.g., another antibody or a ligand for a receptor) to create a bispecific molecule that binds to at least two different binding sites or target molecules. An antibody described herein can, in fact, be derivatized or linked to more than one other functional molecule to form multispecific molecules that bind to more than two different binding sites and/or target molecules; such multispecific molecules are also intended to be included within the term bispecific molecule as used herein. To create a bispecific molecule as described herein, an antibody as described herein can be operably linked (e.g., by chemical coupling, genetic fusion, non-covalent association, or otherwise) to one or more other binding molecules, such as another antibody, antibody fragment, peptide, or binding mimetic, such that a bispecific molecule is formed.
Соответственно, в настоящем документе предусмотрены биспецифические молекулы, содержащие по меньшей мере одну первую связывающую специфичность в отношении CD40 и вторую связывающую специфичность в отношении второго целевого эпитопа. Согласно варианту осуществления, описанному в настоящем документе, в котором биспецифическая молекула является мультиспецифической, молекула может дополнительно включать в себя третью связывающую специфичность.Accordingly, provided herein are bispecific molecules comprising at least one first binding specificity for CD40 and a second binding specificity for a second target epitope. According to an embodiment described herein in which the bispecific molecule is multispecific, the molecule may further comprise a third binding specificity.
Согласно одному варианту осуществления биспецифические молекулы, описанные в настоящем документе, содержат в качестве связывающей специфичности по меньшей мере одно антитело или его фрагмент антитела, включая в себя, например, Fab, Fab', F(ab')2, Fv или одноцепочечный Fv. Антитело также может представлять собой димер легкой цепи или тяжелой цепи или любой их минимальный фрагмент, такой как Fv или одноцепочечный конструкт, как описано в Ladner et al. патент США № 4946778, содержание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.According to one embodiment, the bispecific molecules described herein comprise as a binding specificity at least one antibody or antibody fragment thereof, including, for example, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, or single-chain Fv. The antibody can also be a dimer of a light chain or a heavy chain, or any minimal fragment thereof, such as an Fv or single-chain construct, as described in Ladner et al. U.S. Patent No. 4,946,778, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.
- 28 048278- 28 048278
Наряду с тем, что моноклональные антитела человека являются предпочтительными, другие антитела, которые можно использовать в биспецифических молекулах, описанных в настоящем документе, представляют собой мышиные, химерные и гуманизированные моноклональные антитела.While human monoclonal antibodies are preferred, other antibodies that can be used in the bispecific molecules described herein include murine, chimeric, and humanized monoclonal antibodies.
Описанные в настоящем документе биспецифические молекулы можно получить путем конъюгирования составляющих связывающих специфичностей с использованием способов, известных в настоящей области техники. Например, каждую связывающую специфичность биспецифической молекулы можно получить отдельно и затем конъюгировать друг с другом. Если связывающие специфичности представляют собой белки или пептиды, разнообразные связывающие или перекрестно сшивающие средства можно использовать для ковалентного конъюгирования. Примеры перекрестно сшивающих средств включают в себя следующее: белок А, карбодиимид, №сукцинимидил^-ацетилтиоацетат (SATA), 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойная кислота) (DTNB), о-фенилендималеимид (oPDM), №сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) и сульфосукцинимидил-4-(№ малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC) (см., например, Karpovsky et al. (1984), J. Exp. Med. 160:1686; Liu, M.A. et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82:8648). Другие способы включают в себя те, которые описаны в Paulus (1985), Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985), Science, 229:81-83) и Glennie et al. (1987), J. Immunol. 139:2367-2375). Предпочтительные конъюгирующие средства представляют собой SATA и сульфо-SMCC, оба из которых доступны от Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).The bispecific molecules described herein can be prepared by conjugating the constituent binding specificities using methods known in the art. For example, each binding specificity of the bispecific molecule can be prepared separately and then conjugated to each other. If the binding specificities are proteins or peptides, a variety of coupling or cross-linking agents can be used for covalent conjugation. Examples of cross-linking agents include the following: protein A, carbodiimide, N-succinimidyl-N-acetylthioacetate (SATA), 5,5'-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB), o-phenylenedimaleimide (oPDM), N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate (SPDP), and sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) (see, e.g., Karpovsky et al. (1984), J. Exp. Med. 160:1686; Liu, M.A. et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82:8648). Other methods include those described in Paulus (1985), Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985), Science, 229:81-83) and Glennie et al. (1987), J. Immunol. 139:2367-2375). Preferred conjugating agents are SATA and sulfo-SMCC, both of which are available from Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Если связывающие специфичности представляют собой антитела, их можно конъюгировать с помощью соединения через сульфгидрильную связь С-концевых шарнирных областей двух тяжелых цепей. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления шарнирную область модифицируют, чтобы она содержала нечетное количество сульфгидрильных остатков, предпочтительно один, перед конъюгированием.If the binding specificities are antibodies, they can be conjugated by linking via a sulfhydryl bond of the C-terminal hinge regions of the two heavy chains. According to a particularly preferred embodiment, the hinge region is modified to contain an odd number of sulfhydryl residues, preferably one, before conjugation.
Альтернативно, обе связывающие специфичности могут кодироваться в одном и том же векторе и экспрессироваться и собираться в одной и той же клетке-хозяине. Этот способ является особенно применимым, если биспецифическая молекула представляет собой белок слияния mAb х mAb, mAb х Fab, Fab х F(ab')2 или лиганд х Fab. Описанная в настоящем документе биспецифическая молекула может представлять собой одноцепочечную молекулу, содержащую одно одноцепочечное антитело и связывающую детерминанту, или одноцепочечную биспецифическую молекулу, содержащую две связывающие детерминанты. Биспецифические молекулы могут содержать по меньшей мере две одноцепочечные молекулы. Способы получения биспецифических молекул описаны, например, в патента США № 5260203;5455030;4881175;5132405;5091513; 5476786; 5013653; 5258498 и 5482858.Alternatively, both binding specificities can be encoded in the same vector and expressed and assembled in the same host cell. This method is particularly useful if the bispecific molecule is a mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2, or ligand x Fab fusion protein. The bispecific molecule described herein can be a single chain molecule comprising one single chain antibody and a binding determinant, or a single chain bispecific molecule comprising two binding determinants. Bispecific molecules can comprise at least two single chain molecules. Methods for producing bispecific molecules are described, for example, in U.S. Patent Nos. 5,260,203; 5,455,030; 4,881,175; 5,132,405; 5,091,513; 5476786; 5013653; 5258498 and 5482858.
Связывание биспецифических молекул с их специфическими мишенями можно подтвердить с использованием принятых в настоящей области техники способов, таких как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (RIA), анализ FACS, биоанализ (например, ингибирование роста) или анализ вестерн-блоттинг. Каждый из указанных анализов, как правило, обнаруживает присутствие комплексов белок-антитело, представляющих конкретный интерес, с помощью использования меченого реагента (например, антитела), специфического в отношении представляющего интерес комплекса.Binding of the bispecific molecules to their specific targets can be confirmed using art-recognized methods such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), FACS analysis, bioassay (e.g., growth inhibition), or Western blot analysis. Each of these assays typically detects the presence of protein-antibody complexes of particular interest by using a labeled reagent (e.g., an antibody) specific for the complex of interest.
IX. Композиции.IX. Compositions.
Дополнительно предусмотрены композиции, например фармацевтические композиции, содержащие одно или несколько антител к CD40 или их антигенсвязывающих фрагментов, как описано в настоящем документе, составленные вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Такие композиции могут включать в себя одно или комбинацию (например, двух или более различных) антител, или иммуноконъюгатов, или биспецифических молекул, описанных в настоящем документе. Например, описанная в настоящем документе фармацевтическая композиция может содержать комбинацию антител (или иммуноконъюгатов или биспецифических молекул), которые связываются с различными эпитопами на целевом антигене или которые характеризуются взаимодополняющими активностями.Additionally provided are compositions, such as pharmaceutical compositions, comprising one or more CD40 antibodies or antigen-binding fragments thereof, as described herein, formulated together with a pharmaceutically acceptable carrier. Such compositions may include one or a combination (e.g., two or more different) antibodies or immunoconjugates or bispecific molecules described herein. For example, a pharmaceutical composition described herein may comprise a combination of antibodies (or immunoconjugates or bispecific molecules) that bind to different epitopes on a target antigen or that have complementary activities.
Согласно определенным вариантам осуществления композиция содержит антитело к CD40 в концентрации, составляющей по меньшей мере 1, 5, 10, 50, 100, 150, 200 мг/мл или находящейся в диапазоне 1-300 или 100-300 мг/мл.According to certain embodiments, the composition comprises an anti-CD40 antibody at a concentration of at least 1, 5, 10, 50, 100, 150, 200 mg/ml, or in the range of 1-300 or 100-300 mg/ml.
Описанные в настоящем документе фармацевтические композиции также можно вводить в комбинированной терапии, т.е. комбинированно с другими средствами. Например, комбинированная терапия может включать в себя описанное в настоящем документе антитело к CD40, комбинированное по меньшей мере с одним другим противоопухолевым и/или стимулирующим Т-клетки (например, активирующим) средством. Примеры терапевтических средств, которые можно использовать в комбинированной терапии, описаны более подробно ниже в разделе, относящемся к применениям антител, описанных в настоящем документе.The pharmaceutical compositions described herein may also be administered in combination therapy, i.e., in combination with other agents. For example, a combination therapy may include an anti-CD40 antibody described herein combined with at least one other anti-tumor and/or T-cell stimulating (e.g., activating) agent. Examples of therapeutic agents that may be used in combination therapy are described in more detail below in the section relating to uses of the antibodies described herein.
Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытые в настоящем документе терапевтические композиции могут включать в себя другие соединения, лекарственные средства и/или средства, используемые для лечения рака. Такие соединения, лекарственные средства и/или средства могут включать вIn some embodiments, the therapeutic compositions disclosed herein may include other compounds, drugs, and/or agents used to treat cancer. Such compounds, drugs, and/or agents may include
- 29 048278 себя, например, химиотерапевтические лекарственные средства, низкомолекулярные лекарственные средства или антитела, которые стимулируют иммунный ответ к данному раку.- 29 048278 themselves, such as chemotherapeutic drugs, small molecule drugs or antibodies that stimulate an immune response to a given cancer.
Используемый в настоящем документе термин фармацевтически приемлемый носитель включает в себя любое и все из следующего: растворители, дисперсионные среды, оболочки, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и замедляющие абсорбцию средства и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель является подходящим для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, с помощью инъекции или инфузии). В зависимости от пути введения активное соединение, т.е. антитело, иммуноконъюгат или биспецифическую молекулу, можно покрыть материалом для защиты соединения от действия кислот и других природных условий, которые могут инактивировать соединение.As used herein, the term pharmaceutically acceptable carrier includes any and all of the following: solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents, and the like, which are physiologically compatible. Preferably, the carrier is suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous, parenteral, spinal or epidermal administration (e.g., by injection or infusion). Depending on the route of administration, the active compound, i.e., the antibody, immunoconjugate or bispecific molecule, can be coated with a material to protect the compound from the action of acids and other environmental conditions that can inactivate the compound.
Описанные в настоящем документе фармацевтические соединения могут включать в себя одну или несколько фармацевтически приемлемых солей. Фармацевтически приемлемая соль относится к соли, которая сохраняет требуемую биологическую активность исходного соединения и не оказывает какихлибо нежелательных токсикологических эффектов (см., например, Berge, S.M., et al. (1977), J. Pharm. Sci. 66:1-19). Примеры таких солей включают в себя соли присоединения кислоты и соли присоединения оснований. Соли присоединения кислоты включают в себя те, которые получены из нетоксических неорганических кислот, таких как соляная, азотная, ортофосфорная, серная, бромистоводородная, йодистоводородная, фосфористая и т.п., а также из нетоксических органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и т.п. Соли присоединения основания включают в себя те, которые получены из щелочноземельных металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и т.п., а также из нетоксических органических аминов, таких как N.N'-дибензилэтилендиамин. N-метилглюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и т.п.The pharmaceutical compounds described herein may include one or more pharmaceutically acceptable salts. A pharmaceutically acceptable salt refers to a salt that retains the desired biological activity of the parent compound and does not exhibit any undesirable toxicological effects (see, e.g., Berge, S. M., et al. (1977), J. Pharm. Sci. 66:1-19). Examples of such salts include acid addition salts and base addition salts. Acid addition salts include those derived from non-toxic inorganic acids such as hydrochloric, nitric, phosphoric, sulfuric, hydrobromic, hydroiodic, phosphorous, and the like, as well as from non-toxic organic acids such as aliphatic mono- and dicarboxylic acids, phenyl-substituted alkanoic acids, hydroxyalkanoic acids, aromatic acids, aliphatic and aromatic sulfonic acids, and the like. Base addition salts include those derived from alkaline earth metals such as sodium, potassium, magnesium, calcium, etc., and non-toxic organic amines such as N.N'-dibenzylethylenediamine, N-methylglucamine, chloroprocaine, choline, diethanolamine, ethylenediamine, procaine, etc.
Описанная в настоящем документе фармацевтическая композиция также может включать в себя фармацевтически приемлемый антиоксидант. Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают в себя следующее: (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и т.п.; (2) жирорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и т.п.; и (3) металлохелатирующие средства, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), сорбит, винная кислота, ортофосфорная кислота и т.п.The pharmaceutical composition described herein may also include a pharmaceutically acceptable antioxidant. Examples of pharmaceutically acceptable antioxidants include the following: (1) water-soluble antioxidants such as ascorbic acid, cysteine hydrochloride, sodium bisulfate, sodium metabisulfite, sodium sulfite, and the like; (2) fat-soluble antioxidants such as ascorbyl palmitate, butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), lecithin, propyl gallate, alpha-tocopherol, and the like; and (3) metal chelating agents such as citric acid, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), sorbitol, tartaric acid, orthophosphoric acid, and the like.
Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые можно использовать в описанных в настоящем документе фармацевтических композициях, включают в себя следующее: вода, этанол, многоатомные спирты (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Правильную текучесть можно поддерживать, например, путем применения таких материалов оболочки, как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий и путем применения поверхностно-активных веществ.Examples of suitable aqueous and non-aqueous carriers that can be used in the pharmaceutical compositions described herein include the following: water, ethanol, polyhydric alcohols (such as glycerol, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.) and suitable mixtures thereof, vegetable oils such as olive oil, and injectable organic esters such as ethyl oleate. Proper fluidity can be maintained, for example, by the use of coating materials such as lecithin, by maintaining the required particle size in the case of dispersions, and by the use of surfactants.
Указанные композиции также могут содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие средства, эмульгирующие средства и диспергирующие средства. Предотвращение присутствия микроорганизмом можно достичь как с помощью процедур стерилизации, ранее, и путем включения различных антибактериальных и противогрибковых средств, например парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Кроме того, может быть предпочтительным включить в композиции изотонические средства, например сахара, хлорид натрия и т.п. Кроме того, пролонгированную абсорбцию инъекционной фармацевтической формы можно обеспечить путем включения в композицию средств, которые замедляют абсорбцию, например моностеарат алюминия и желатин.The said compositions may also contain adjuvants such as preservatives, wetting agents, emulsifying agents and dispersing agents. Preventing the presence of microorganisms can be achieved both by sterilization procedures, previously, and by including various antibacterial and antifungal agents, such as paraben, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, etc. In addition, it may be preferable to include isotonic agents in the compositions, such as sugars, sodium chloride, etc. In addition, prolonged absorption of the injectable pharmaceutical form can be ensured by including in the composition agents that slow down absorption, such as aluminum monostearate and gelatin.
Фармацевтически приемлемые носители включают в себя стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для получения стерильных растворов для немедленного применения для инъекций или дисперсии. Применение таких сред и средств для фармацевтически активных средств известно в настоящей области техники. За исключением случаев, когда какая-либо общепринятая среда или средство являются несовместимым с активным соединением, предусмотрено их применение в фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению. Дополнительные активные соединения также включены в композиции.Pharmaceutically acceptable carriers include sterile aqueous solutions or dispersions and sterile powders for the preparation of sterile extemporaneous injection solutions or dispersions. The use of such media and vehicles for pharmaceutically active agents is known in the art. Except in cases where any conventional medium or vehicle is incompatible with the active compound, their use in the pharmaceutical compositions of the present invention is envisaged. Additional active compounds are also included in the compositions.
Терапевтические композиции, как правило, должны являться стерильными и стабильными при условиях производства и хранения. Композицию можно составить в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие смеси. Правильную текучесть можно поддерживать, например, путем применения такой оболочки, как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Во многих случаях будет предпочтительTherapeutic compositions must generally be sterile and stable under the conditions of manufacture and storage. The composition may be formulated as a solution, microemulsion, liposome or other ordered structure suitable for high drug concentration. The carrier may be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, a polyhydric alcohol (e.g., glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycol, etc.), suitable mixtures thereof. Proper fluidity can be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin, by maintaining the required particle size in the case of dispersion and by the use of surfactants. In many cases, it will be preferable
- 30 048278 ным включить в композицию изотонические средства, например сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. Пролонгированную абсорбцию инъекционных композиций можно обеспечить путем включения в композицию средства, которое замедляет абсорбцию, например моностеаратные соли и желатин.- 30 048278 it is necessary to include in the composition isotonic agents, for example sugars, polyhydric alcohols, such as mannitol, sorbitol or sodium chloride. Prolonged absorption of injection compositions can be ensured by including in the composition an agent that slows down absorption, for example monostearate salts and gelatin.
Стерильные инъекционные растворы можно получить путем включения активного соединения в требуемом количестве в соответствующем растворителе с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, в случае необходимости, с последующей стерилизационной микрофильтрацией. Как правило, дисперсии получают путем введения активного соединения в стерильную несущую среду, которая содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъекционных растворов предпочтительные способы получения представляют собой вакуумную сушку и сублимационную сушку (лиофилизацию), которые дают в результате порошок активного ингредиента вместе с любым дополнительным требуемым ингредиентом из его предварительно подвергнутого стерилизационной фильтрации раствора.Sterile injectable solutions can be prepared by incorporating the active compound in the required amount in an appropriate solvent with one or a combination of ingredients enumerated above, if necessary, followed by sterilizing microfiltration. Generally, dispersions are prepared by incorporating the active compound into a sterile carrier medium which contains the basic dispersion medium and the required other ingredients from those enumerated above. In the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions, the preferred methods of preparation are vacuum drying and freeze-drying (lyophilization), which yield a powder of the active ingredient together with any additional required ingredient from a previously sterilizing-filtered solution thereof.
Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с материалом носителя с получением отдельной лекарственной формы, будет варьировать в зависимости от субъекта, подлежащего лечению, и конкретного способа введения. Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с материалом носителя с получением отдельной лекарственной формы будет, как правило, представлять собой такое количество композиции, которое производит терапевтический эффект. Как правило, из 100% это количество будет находиться в диапазоне от приблизительно 0,01 до приблизительно 99% активного ингредиента, предпочтительно от приблизительно 0,1 до приблизительно 70%, наиболее предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 30% активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.The amount of active ingredient that can be combined with a carrier material to form a single dosage form will vary depending on the subject being treated and the particular route of administration. The amount of active ingredient that can be combined with a carrier material to form a single dosage form will generally be that amount of the composition that produces a therapeutic effect. Typically, out of 100%, this amount will be in the range of about 0.01 to about 99% of the active ingredient, preferably about 0.1 to about 70%, most preferably about 1 to about 30% of the active ingredient in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.
Схемы введения дозировок регулируют для обеспечения оптимального требуемого ответа (например, терапевтического ответа). Например, можно вводить однократный болюс, несколько разделенных доз можно вводить в течение определенного времени или дозу можно пропорционально снизить или увеличить в соответствии с потребностями терапевтической ситуации. Особенно преимущественным является составление парентеральных композиций в единичной лекарственной форме для простоты введения и однородности дозировки. Используемая в настоящем документе единичная лекарственная форма относится к физически отдельным единицам, подходящим в качестве единичных дозировок для подлежащих лечению субъектов; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное так, чтобы производить требуемый терапевтический эффект, в ассоциации с требуемым фармацевтическим носителем. Технические характеристики описанных в настоящем документе единичных лекарственных форм продиктованы и напрямую зависят от (а) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, который необходимо достичь, и (b) ограничений, присущих области техники получения составов такого активного соединения для лечения чувствительности у индивидуумов.Dosage regimens are adjusted to provide the optimum desired response (e.g., therapeutic response). For example, a single bolus may be administered, several divided doses may be administered over a period of time, or the dose may be proportionally decreased or increased as required by the therapeutic situation. It is especially advantageous to formulate parenteral compositions in dosage unit form for ease of administration and uniformity of dosage. Dosage unit form, as used herein, refers to physically discrete units suitable as unitary dosages for the subjects to be treated, each unit containing a predetermined quantity of active compound calculated to produce the desired therapeutic effect, in association with the required pharmaceutical carrier. The performance characteristics of the dosage unit forms described herein are dictated by and directly dependent on (a) the unique characteristics of the active compound and the particular therapeutic effect sought to be achieved, and (b) the limitations inherent in the art of formulating such active compound for the treatment of sensitivity in individuals.
Для введения антитела дозировки находятся в диапазоне от приблизительно 0,0001 до 100 мг/кг и более типично 0,01-5 мг/кг массы тела хозяина. Например, дозировки могут составлять 0,3 мг/кг массы тела, 1 мг/кг массы тела, 3 мг/кг массы тела, 5 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела или могут находиться в пределах диапазона 1-10 мг/кг. Иллюстративная схема лечения предусматривает введение один раз в неделю, один раз каждые две недели, один раз каждые три недели, один раз каждые четыре недели, один раз в месяц, один раз каждые 3 месяца или один раз каждые 3-6 месяцев.For administration of the antibody, dosages are in the range of about 0.0001 to 100 mg/kg, and more typically 0.01-5 mg/kg of host body weight. For example, dosages may be 0.3 mg/kg body weight, 1 mg/kg body weight, 3 mg/kg body weight, 5 mg/kg body weight, or 10 mg/kg body weight, or may be within the range of 1-10 mg/kg. An exemplary treatment regimen includes once weekly, once every two weeks, once every three weeks, once every four weeks, once monthly, once every 3 months, or once every 3-6 months.
В некоторых способах одновременно вводят два или более моноклональных антитела с различными специфичностями связывания, и в этом случае дозировка каждого вводимого антитела попадает в указанные диапазоны. Терапевтическое антитело, как правило, вводят несколько раз. Интервалы между разовыми дозировками могут составлять, например, каждую неделю, каждый месяц, каждые три месяца или каждый год. Интервалы также могут быть нерегулярными, что показано путем измерения уровня антител к целевому антигену у пациента. В некоторых способах дозировку регулируют для достижения концентрации антитела в плазме, составляющей приблизительно 1-1000 мкг/мл и в некоторых способах приблизительно 25-300 мкг/мл.In some methods, two or more monoclonal antibodies with different binding specificities are administered simultaneously, in which case the dosage of each antibody administered falls within the specified ranges. The therapeutic antibody is typically administered multiple times. The intervals between single doses may be, for example, every week, every month, every three months, or every year. The intervals may also be irregular, as indicated by measuring the level of antibodies to the target antigen in the patient. In some methods, the dosage is adjusted to achieve a plasma antibody concentration of about 1-1000 μg/mL, and in some methods about 25-300 μg/mL.
Антитело можно вводить в виде состава с замедленным высвобождением, и в этом случае требуется менее частое введение. Дозировка и частота варьируют в зависимости от периода полужизни антитела у пациента. В общем, антитела человека показывают самый длительный период полужизни, за ними следуют гуманизированные антитела, химерные антитела и не относящиеся к человеку антитела. Дозировка и частота введения могут варьировать в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. В профилактических применениях относительно низкую дозировку вводят с относительно нечастными интервалами в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение в течение всей оставшейся жизни. В терапевтических применениях иногда требуется относительно высокая дозировка с относительно короткими интервалами, пока не снизиться или не прекратиться прогрессирование заболевания, и предпочтительно, пока пациент не продемонстрирует частичное или полное уменьшение интенсивности симптомов заболевания. Следовательно, пациенту необязательно можно вводить профилактическую схему, хотя во многих показаниях иммунной онколоThe antibody may be administered as a sustained-release formulation, in which case less frequent administration is required. The dosage and frequency vary depending on the half-life of the antibody in the patient. In general, human antibodies exhibit the longest half-life, followed by humanized antibodies, chimeric antibodies, and non-human antibodies. The dosage and frequency of administration may vary depending on whether the treatment is prophylactic or therapeutic. In prophylactic applications, a relatively low dosage is administered at relatively infrequent intervals over an extended period of time. Some patients continue to receive treatment for the rest of their lives. In therapeutic applications, a relatively high dosage is sometimes required at relatively short intervals until disease progression has decreased or ceased, and preferably until the patient has demonstrated partial or complete amelioration of disease symptoms. Consequently, the patient may not necessarily be administered a prophylactic regimen, although in many immune oncology indications
- 31 048278 гии дальнейшее лечение не требуется.- 31 048278 gyi no further treatment is required.
Фактические уровни дозировок активных ингредиентов в фармацевтических композициях, описанных в настоящем документе, можно изменять так, чтобы получить количество активного ингредиента, которое является эффективным для достижения требуемого терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и способа введения, не будучи токсичным для пациента. Выбранный уровень дозировки будет зависеть от разнообразных фармакокинетических факторов, включая в себя активность конкретных используемых композиций, описанных в настоящем документе, или их сложного эфира, соли или амида, путь введения, время введения, скорость выведения конкретного используемого активного соединения, продолжительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, используемые в комбинации с конкретными используемыми композициями, возраст, пол, массу, состояние, общее состояние здоровья и предшествующую медицинскую историю пациента, подлежащего лечению, и подобные факторы, хорошо известные в медицинской области техники.The actual dosage levels of the active ingredients in the pharmaceutical compositions described herein can be varied to obtain an amount of the active ingredient that is effective to achieve the desired therapeutic response for a particular patient, composition, and route of administration, without being toxic to the patient. The dosage level selected will depend on a variety of pharmacokinetic factors, including the activity of the particular compositions described herein or an ester, salt, or amide thereof used, the route of administration, the time of administration, the rate of elimination of the particular active compound used, the duration of treatment, other drugs, compounds, and/or materials used in combination with the particular compositions used, the age, sex, weight, condition, general health, and previous medical history of the patient to be treated, and similar factors well known in the medical art.
Терапевтически эффективная дозировка антитела к CD40, описанного в настоящем документе, предпочтительно приводит к уменьшению тяжести симптомов заболевания, увеличению частоты и продолжительности периодов без симптомов заболевания или предотвращению ухудшения или инвалидности вследствие заболевания. В контексте рака терапевтически эффективная доза предпочтительно предотвращает дополнительное ухудшение физических симптомов, ассоциированных с раком. Симптомы рака хорошо известны в настоящей области техники и включают в себя, например, следующее: необычные признаки невусов, изменение внешнего вида невуса, включая в себя следующее: асимметрия, граница, цвет и/или диаметр, область недавно пигментированной кожи, аномальный невус, затемненная область под ногтем, уплотнения в молочной железе, изменения сосков, кисты молочной железы, боль в молочной железе, смерть, потеря веса, слабость, чрезмерная усталость, затрудненное питание, потеря аппетита, хронический кашель, прогрессирующая одышка, кровохаркание, кровь в моче, кровь в кале, тошнота, рвота, метастазы в печени, метастазы в легких, метастазы в кости, ощущение переполнения желудка, метеоризм, жидкость в брюшной полости, вагинальное кровотечение, запор, вздутие живота, перфорация толстой кишки, острый перитонит (инфекция, лихорадка, боль), боль, рвота с кровью, тяжелая потливость, лихорадка, высокое кровяное давление, анемия, диарея, желтуха, головокружение, озноб, мышечные спазмы, метастазы в толстой кишке, метастазы в легких, метастазы в мочевом пузыре, метастазы в печени, метастазы в кости, метастазы в почках и метастазы в поджелудочной железе, затруднение глотания и т.п. Терапевтическую эффективность можно наблюдать сразу же после первого введения агонистического mAb к huCD40 согласно настоящему изобретению или ее можно наблюдать через определенный период времени и/или после введения серии доз. Такая отсроченная эффективность наблюдается только после нескольких месяцев лечения, вплоть до 6, 9 или 12 месяцев. Крайне важно не допустить преждевременного решения, что агонистическое mAb к huCD40 согласно настоящему изобретению не обладает терапевтической эффективностью ввиду отсроченной эффективности, проявляемой некоторыми иммуноонкологическими средствами.A therapeutically effective dosage of the CD40 antibody described herein preferably results in a reduction in the severity of disease symptoms, an increase in the frequency and duration of disease-free periods, or the prevention of worsening or disability due to the disease. In the context of cancer, a therapeutically effective dosage preferably prevents further worsening of physical symptoms associated with cancer. Symptoms of cancer are well known in the art and include, for example, the following: unusual features of a nevus, a change in the appearance of a nevus including the following: asymmetry, border, color and/or diameter, area of newly pigmented skin, abnormal nevus, darkened area under the nail, lumps in the breast, nipple changes, breast cysts, breast pain, death, weight loss, weakness, extreme fatigue, difficulty eating, loss of appetite, chronic cough, progressive shortness of breath, hemoptysis, blood in the urine, blood in the stool, nausea, vomiting, liver metastases, lung metastases, bone metastases, a feeling of fullness in the stomach, flatulence, fluid in the abdominal cavity, vaginal bleeding, constipation, bloating, colon perforation, acute peritonitis (infection, fever, pain), pain, vomiting blood, heavy sweating, fever, high blood pressure, anemia, diarrhea, jaundice, dizziness, chills, muscle cramps, colon metastasis, lung metastasis, bladder metastasis, liver metastasis, bone metastasis, kidney metastasis and pancreatic metastasis, difficulty swallowing, etc. Therapeutic efficacy can be observed immediately after the first administration of the huCD40 agonist mAb of the present invention or it can be observed after a certain period of time and/or after a series of doses. Such delayed efficacy is observed only after several months of treatment, up to 6, 9 or 12 months. It is extremely important not to prematurely conclude that the huCD40 agonist mAb of the present invention does not have therapeutic efficacy due to the delayed efficacy exhibited by some immuno-oncology agents.
Терапевтически эффективная доза может предотвращать или задерживать возникновение рака, например, может потребоваться, когда присутствуют ранние или предварительные признаки заболевания. Лабораторные анализы, используемые в диагностике рака, включают в себя анализы химических соединений (включая в себя измерение содержаний растворимого CD40 или CD40L) (Hock et al. (2006), Cancer, 106:2148; Chung & Lim (2014), J. Trans. Med. 12:102), гематологию, серологию и радиологию. Соответственно, любой клинический или биохимический анализ, который осуществляет мониторинг любого из вышеизложенного, можно использовать для определения того, является ли конкретное лечение терапевтически эффективной дозой для лечения рака. Специалист в настоящей области может определить такие количества на основе таких факторов, как размеры субъекта, степень тяжесть симптомов субъекта и конкретная композиция или выбранный путь введения.A therapeutically effective dose may prevent or delay the onset of cancer, such as may be required when early or preliminary signs of disease are present. Laboratory tests used in the diagnosis of cancer include assays of chemical compounds (including measurement of soluble CD40 or CD40L levels) (Hock et al. (2006) Cancer, 106:2148; Chung & Lim (2014) J. Trans. Med. 12:102), hematology, serology, and radiology. Accordingly, any clinical or biochemical assay that monitors any of the above can be used to determine whether a particular treatment is a therapeutically effective dose for treating cancer. One of skill in the art can determine such amounts based on factors such as the size of the subject, the severity of the subject's symptoms, and the particular formulation or route of administration chosen.
Описанную в настоящем документе композицию можно вводить посредством одного или нескольких путей введения с использованием одного или нескольких из разнообразных способов, известных в настоящей области техники. Как понятно специалисту в настоящей области техники, путь и/или способ введения будут варьировать в зависимости от требуемых результатов. Предпочтительные пути введения для описанных в настоящем документе антител включают в себя внутривенный, внутримышечный, интрадермальный, интраперитонеальный, подкожный, спинальный или другие парентеральные пути введения, например, с помощью инъекции или инфузии. Используемая в настоящем документе фраза парентеральное введение означает способ введения, отличный от энтерального и местного введения, как правило, с помощью инъекции и включает в себя без ограничения внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, внутрикапсульную, интраорбитальную, интракардиальную, интрадермальную, интраперитонеальную, транстрахеальную, подкожную, внутрикожную, внутрисуставную, подкапсульную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и внутригрудинную инъекцию и инфузию.The composition described herein can be administered via one or more routes of administration using one or more of the various methods known in the art. As will be appreciated by one of skill in the art, the route and/or mode of administration will vary depending on the desired results. Preferred routes of administration for the antibodies described herein include intravenous, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, subcutaneous, spinal, or other parenteral routes of administration, such as by injection or infusion. As used herein, the phrase parenteral administration means a route of administration other than enteral and local administration, typically by injection, and includes, without limitation, intravenous, intramuscular, intraarterial, intrathecal, intracapsular, intraorbital, intracardiac, intradermal, intraperitoneal, transtracheal, subcutaneous, intradermal, intra-articular, subcapsular, subarachnoid, intraspinal, epidural, and intrasternal injection and infusion.
Альтернативно, описанное в настоящем документе антитело можно вводить посредством непарентерального пути, такого как местный, эпидермальный или мукозальный путь введения, например, интраназально, перорально, вагинально, ректально, сублингвально или местно.Alternatively, the antibody described herein can be administered via a non-parenteral route, such as a topical, epidermal, or mucosal route, such as intranasally, orally, vaginally, rectally, sublingually, or topically.
- 32 048278- 32 048278
Активные соединения можно получить вместе с носителями, которые будут защищать соединения от быстрого высвобождения, такие как состав контролируемого высвобождения, включая в себя имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы получения таких составов запатентованы или, как правило, известны специалистам в настоящей области техники. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.The active compounds can be prepared together with carriers that will protect the compounds from rapid release, such as controlled release formulations, including implants, transdermal patches, and microencapsulated delivery systems. Biodegradable, biocompatible polymers can be used, such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid. Many methods for preparing such formulations are patented or generally known to those skilled in the art. See, for example, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Терапевтические композиции можно вводить с помощью медицинских устройств, известных в настоящей области техники. Например, согласно предпочтительному варианту осуществления описанную в настоящем документе терапевтическую композицию можно вводить с помощью безыгольного устройства для подкожных инъекций, такого как устройства, раскрытые в патентах США № 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824 или 4596556. Примеры хорошо известных имплантатов и модулей для применения с антителами к huCD40, описанными в настоящем документе, включают в себя следующее: патент США № 4487603, в котором раскрыт имплантируемый микроинфузионный насос для подачи лекарственного средства с контролируемой скоростью; патент США № 4486194, в котором раскрыто терапевтическое устройство для введения лекарственного средства через кожу; патент США № 4447233, патент США № 4447233, в котором раскрыт инфузионный насос для лекарственного средства для доставки лекарственных средств в точной скоростью инфузии; патент США № 4447224, в котором раскрыта имплантируемая инфузионная система с регулятором расхода для непрерывной доставки лекарственного средства; патент США № 4439196, в котором раскрыта осмотическая система доставки лекарственных средств, характеризующаяся многокамерными отсеками; и патент США № 4475196, в котором раскрыта осмотическая система доставки лекарственных средств. Указанные патенты включены в настоящий документ посредством ссылки. Многие другие такие имплантаты, системы доставки и модули известны специалистам в настоящей области техники.Therapeutic compositions can be administered using medical devices known in the art. For example, in a preferred embodiment, a therapeutic composition described herein can be administered using a needle-free subcutaneous injection device, such as the devices disclosed in U.S. Patent Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824 or 4,596,556. Examples of well-known implants and modules for use with the anti-huCD40 antibodies described herein include the following: U.S. Patent No. 4,487,603, which discloses an implantable microinfusion pump for delivering a drug at a controlled rate; U.S. Patent No. 4,486,194, which discloses a therapeutic device for administering a drug through the skin; U.S. Patent No. 4,447,233, U.S. Patent No. 4,447,233, which discloses a drug infusion pump for delivering drugs at a precise infusion rate; U.S. Patent No. 4,447,224, which discloses an implantable infusion system with a flow regulator for continuous drug delivery; U.S. Patent No. 4,439,196, which discloses an osmotic drug delivery system characterized by multi-chamber compartments; and U.S. Patent No. 4,475,196, which discloses an osmotic drug delivery system. These patents are incorporated herein by reference. Many other such implants, delivery systems and modules are known to those skilled in the art.
Согласно определенным вариантам осуществления описанные в настоящем документе антитела к huCD40 можно составить для обеспечения правильного распределения in vivo. Например, гематоэнцефалический барьер (ВВВ) не пропускает многие высокогидрофильные соединения. Для обеспечения проникновения описанных в настоящем документе терапевтических соединений через ВВВ (при необходимости) их можно составить, например, в липосомах. В отношении способов производства липосом, см., например, патенты США № 4522811; 5374548 и 5399331. Липосомы могут содержать один или несколько фрагментов, которые селективно транспортируются в конкретные клетки или органы и, таким образом, усиливают нацеленную доставку лекарственных средств (см., например, V.V. Ranade (1989), J. Clin. Pharmacol. 29:685). Иллюстративные нацеливающие фрагменты включают в себя фолат или биотин (см., например, патент США № 5416016 на имя Low et al.); маннозиды (Umezawa et al., (1988), Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); антитела (P.G. Bloeman et al. (1995), FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995), Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); рецептор поверхностно-активного белка А (Briscoe et al. (1995), Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994), J. Biol. Chem. 269:9090); см. также K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994), FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994; Immunomethods, 4:273.In certain embodiments, the anti-huCD40 antibodies described herein can be formulated to ensure proper distribution in vivo. For example, the blood-brain barrier (BBB) does not allow many highly hydrophilic compounds to pass through the BBB (if desired), and the therapeutic compounds described herein can be formulated, for example, in liposomes. For methods of making liposomes, see, for example, U.S. Pat. Nos. 4,522,811; and 5,399,331. Liposomes can contain one or more moieties that are selectively transported to specific cells or organs and thus enhance targeted drug delivery (see, for example, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Illustrative targeting moieties include folate or biotin (see, e.g., U.S. Patent No. 5,416,016 to Low et al.); mannosides (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); antibodies (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); surfactant protein A receptor (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); see also K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994), FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994; Immunomethods, 4:273.
X. Применения и способы.X. Applications and methods.
Описанные в настоящем документе антитела, композиции антител и способы характеризуются многочисленными in vitro и in vivo применимостями, включая в себя, например, усиление иммунного ответа путем агонизма передачи сигналов CD40. Согласно предпочтительному варианту осуществления описанные в настоящем документе антитела представляют собой человеческие или гуманизированные антитела. Например, описанные в настоящем документе антитела к huCD40 можно вводить в клетки в культуре, in vitro или ex vivo, или субъектам-людям, например, in vivo, для усиления иммунитета при различных заболеваниях. Соответственно, в настоящем документе предусмотрены способы модификации иммунного ответа у субъекта, предусматривающие введение субъекту описанного в настоящем документе антитела или его антигенсвязывающего фрагмента так, чтобы иммунный ответ у субъекта усиливался, стимулировался или положительно регулировался.The antibodies, antibody compositions, and methods described herein have numerous in vitro and in vivo utilities, including, for example, enhancing the immune response by agonizing CD40 signaling. In a preferred embodiment, the antibodies described herein are human or humanized antibodies. For example, the anti-huCD40 antibodies described herein can be administered to cells in culture, in vitro or ex vivo, or to human subjects, for example, in vivo, to enhance immunity in various diseases. Accordingly, provided herein are methods for modifying the immune response in a subject, comprising administering to the subject an antibody or antigen-binding fragment thereof described herein such that the immune response in the subject is enhanced, stimulated, or upregulated.
Предпочтительные субъекты включают в себя пациентов-людей, которые нуждаются в усилении иммунного ответа. Способы являются особенно подходящими для лечения пациентов-людей, характеризующихся наличием нарушения, которое можно лечить путем усиления иммунного ответа (например, опосредованного Т-клетками иммунного ответа). Согласно конкретному варианту осуществления способы являются особенно подходящими для лечения рака in vivo. Для достижения антигенспецифического усиления иммунитета описанные в настоящем документе антитела к huCD40 можно вводить вместе с представляющим интерес антигеном или антиген может уже присутствовать в организме субъекта, подлежащего лечению (например, несущего опухоль или вирус субъекта). Если антитела к CD40 вводят вместе с другим средством, их можно вводить отдельно или одновременно.Preferred subjects include human patients who require an immune response enhancement. The methods are particularly suitable for treating human patients characterized by the presence of a disorder that can be treated by enhancing an immune response (e.g., a T-cell-mediated immune response). According to a particular embodiment, the methods are particularly suitable for treating cancer in vivo. To achieve antigen-specific immune enhancement, the huCD40 antibodies described herein can be administered together with an antigen of interest, or the antigen can already be present in the subject to be treated (e.g., a subject bearing a tumor or a virus). If the CD40 antibodies are administered together with another agent, they can be administered separately or simultaneously.
Также предусмотрены способы обнаружения присутствия антигена CD40 человека в образце или измерения количества антигена CD40 человека, предусматривающие приведение в контакт образца иMethods for detecting the presence of human CD40 antigen in a sample or measuring the amount of human CD40 antigen are also provided, comprising contacting the sample and
- 33 048278 контрольного образца с моноклональным антителом человека или его антигенсвязывающим фрагментом, которые специфически связываются с CD40 человека, при условиях, которые обеспечивают возможность образования комплекса между антителом или его фрагментом и CD40 человека. Образование комплекса затем обнаруживают, причем разное образование комплекса в сравнении между образцом и контрольным образцом указывает на присутствие антигена CD40 человека в образце. Более того, описанные в настоящем документе антитела к CD40 можно использовать для очистки CD40 человека посредством иммуноаффинной очистки.- 33 048278 a control sample with a human monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to human CD40, under conditions that allow complex formation between the antibody or fragment thereof and human CD40. Complex formation is then detected, wherein differential complex formation, as compared to the sample and the control sample, indicates the presence of human CD40 antigen in the sample. Furthermore, the CD40 antibodies described herein can be used to purify human CD40 by immunoaffinity purification.
Учитывая способность описанных в настоящем документе антител к huCD40 усиливать костимуляцию Т-клеточных ответов, например антигенспецифических Т-клеточных ответов, в настоящем документе предусмотрены in vitro и in vivo способы применения описанных в настоящем документе антител, чтобы стимулировать, усиливать или положительно регулировать антигенспецифические Т-клеточные ответы, например противоопухолевые Т-клеточные ответы.Given the ability of the huCD40 antibodies described herein to enhance costimulation of T cell responses, such as antigen-specific T cell responses, provided herein are in vitro and in vivo methods of using the antibodies described herein to stimulate, enhance, or upregulate antigen-specific T cell responses, such as antitumor T cell responses.
Ответы CD4+ и CD8+ Т-клеток можно усиливать с использованием антител к CD40. Т-клетки могут представлять собой Teri-клетки. например CD4+ Тей-клетки, CD8+ Teff-клетки, хелперные (Th) Т-клетки и цитотоксические (Тс) Т-клетки.CD4+ and CD8+ T cell responses can be enhanced using CD40 antibodies. T cells can be Teri cells, such as CD4+T cells, CD8+ Teff cells, helper (Th) T cells, and cytotoxic (Tc) T cells.
Дополнительно предусмотрены способы усиления иммунного ответа (например, антигенспецифического Т-клеточного ответа) у субъекта, предусматривающие введение описанного в настоящем документе антитела к huCD40 субъекту так, чтобы усиливать иммунный ответ (например, антигенспецифический Т-клеточный ответ) у субъекта. Согласно предпочтительному варианту осуществления субъект представляет собой субъекта с опухолью, и иммунный ответ против опухоли усиливается. Опухоль может представлять собой солидную опухоль или опухоль жидких тканей, например, гематологической рак. Согласно определенным вариантам осуществления опухоль представляет собой иммуногенную опухоль. Согласно определенным вариантам осуществления опухоль является неиммуногенной. Согласно определенным вариантам осуществления опухоль является PD-Ll-положительной. Согласно определенным вариантам осуществления опухоль является PD-Ll-отрицательной. Субъект также может представлять собой субъекта-вирусоносителя, и иммунный ответ против вируса усиливается.Additionally provided are methods for enhancing an immune response (e.g., an antigen-specific T cell response) in a subject, comprising administering an anti-huCD40 antibody described herein to the subject so as to enhance an immune response (e.g., an antigen-specific T cell response) in the subject. In a preferred embodiment, the subject is a subject with a tumor, and the immune response against the tumor is enhanced. The tumor may be a solid tumor or a liquid tissue tumor, such as a hematological cancer. In certain embodiments, the tumor is an immunogenic tumor. In certain embodiments, the tumor is non-immunogenic. In certain embodiments, the tumor is PD-Ll positive. In certain embodiments, the tumor is PD-Ll negative. The subject may also be a subject that is a carrier of a virus, and the immune response against the virus is enhanced.
Дополнительно предусмотрены способы ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта, предусматривающие введение субъекту описанного в настоящем документе антитела к huCD40 так, чтобы ингибировать рост опухоли у субъекта. Также предусмотрены способы лечения хронической вирусной инфекции у субъекта, предусматривающие введение субъекту описанного в настоящем документе антитела к huCD40 так, чтобы лечить хроническую вирусную инфекцию у субъекта.Additionally provided are methods of inhibiting tumor cell growth in a subject comprising administering to the subject an anti-huCD40 antibody described herein so as to inhibit tumor growth in the subject. Also provided are methods of treating a chronic viral infection in a subject comprising administering to the subject an anti-huCD40 antibody described herein so as to treat the chronic viral infection in the subject.
Согласно определенным вариантам осуществления антитело к huCD40 вводят субъекту в виде смежной терапии. Лечение субъектов с раком с помощью антитела к huCD40 может приводить к долговременному пролонгированному ответу по сравнению с современным стандартом лечения; длительной выживаемости, составляющей по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10 или больше лет, выживаемости без рецидивов, составляющей по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или 10 или больше лет. Согласно определенным вариантам осуществления лечение субъекта с раком с помощью антитела к huCD40 предотвращает рецидив рака или задерживает появление рецидива рака, например, на 1, 2, 3, 4, 5 или 10 или больше лет. АнтиCD40 лечение можно использовать в качестве первой или второй линии лечения.In certain embodiments, the anti-huCD40 antibody is administered to the subject as an adjunctive therapy. Treating subjects with cancer with an anti-huCD40 antibody can result in a long-term, prolonged response compared to the current standard of care; a long-term survival of at least 1, 2, 3, 4, 5, 10 or more years, a relapse-free survival of at least 1, 2, 3, 4, 5 or 10 or more years. In certain embodiments, treating a subject with cancer with an anti-huCD40 antibody prevents recurrence of cancer or delays recurrence of cancer, such as by 1, 2, 3, 4, 5 or 10 or more years. Anti-CD40 treatment can be used as a first or second line treatment.
Указанные и другие способы, описанные в настоящем документе, раскрыты более подробно ниже. Рак.These and other methods described herein are described in more detail below. Cancer.
В настоящем документе предусмотрены способы лечения субъекта с раком, предусматривающие введение субъекту описанного в настоящем документе антитела к huCD40 так, чтобы осуществлять лечение субъекта, например, так, чтобы ингибировать или снижать рост злокачественных опухолей и/или чтобы опухоли регрессировали. Антитело к huCD40 можно использовать отдельно для ингибирования роста злокачественных опухолей. Альтернативно, антитело к huCD40 можно использовать в сочетании с другим средством, например, другими иммуногенными средствами, стандартными противоопухолевыми видами лечения или другими антителами, как описано ниже.Provided herein are methods for treating a subject with cancer comprising administering to the subject an anti-huCD40 antibody described herein to treat the subject, such as to inhibit or reduce the growth of malignant tumors and/or to cause tumors to regress. The anti-huCD40 antibody can be used alone to inhibit the growth of malignant tumors. Alternatively, the anti-huCD40 antibody can be used in combination with another agent, such as other immunogenic agents, standard anti-tumor therapies, or other antibodies, as described below.
Соответственно, в настоящем документе предусмотрены способы лечения рака, например, путем ингибирования роста опухолевых клеток, у субъекта, предусматривающие введение субъекту терапевтически эффективного количества описанного в настоящем документе антитела к huCD40 или его антигенсвязывающего фрагмента. Антитело может представлять собой гуманизированное антитело к huCD40, человеческое химерное антитело к huCD40 или гуманизированное не относящееся к человеку антитело к huCD40, например человеческое, химерное или гуманизированное антитело к huCD40, которое конкурирует за связывание или связывается с тем же эпитопом, что и по меньшей мере одно из антител к huCD40, конкретно описанных в настоящем документе.Accordingly, provided herein are methods of treating cancer, such as by inhibiting tumor cell growth, in a subject comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of an anti-huCD40 antibody or antigen-binding fragment thereof as described herein. The antibody can be a humanized anti-huCD40 antibody, a human chimeric anti-huCD40 antibody, or a humanized non-human anti-huCD40 antibody, such as a human, chimeric, or humanized anti-huCD40 antibody that competes for binding to or binds to the same epitope as at least one of the anti-huCD40 antibodies specifically described herein.
Раковые заболевания, чей рост можно ингибировать с использованием антител согласно настоящему изобретению, включают в себя раковые заболевания, как правило, отвечающие на иммунотерапию. Неограничивающие примеры злокачественных опухолей для лечения включают в себя следующее: плоскоклеточная карцинома, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, плококлеточный немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), не-NSCLC, глиома, рак желудочно-кишечного тракта, рак почки (например, светлоклеточная карцинома), рак яичника, рак печени, рак толстой и прямой кишки, ракCancers whose growth can be inhibited using the antibodies of the present invention include cancers that typically respond to immunotherapy. Non-limiting examples of malignant tumors to be treated include the following: squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, squamous cell non-small cell lung cancer (NSCLC), non-NSCLC, glioma, gastrointestinal cancer, renal cancer (e.g., clear cell carcinoma), ovarian cancer, liver cancer, colorectal cancer, cancer
- 34 048278 эндометрия, рак почки (например, почечноклеточная карцинома (RCC)), рак предстательной железы (например, гормонорефрактерная аденокарцинома предстательной железы), рак щитовидной железы, нейробластома, рак поджелудочной железы, глиобластома (мультиформная глиобластома), рак шейки матки, рак желудка, рак мочевого пузыря, гепатома, рак молочной железы, карцинома толстой кишки и рак (или карцинома) головы и шеи, рак желудка, герминогенная опухоль, детская саркома, синоназальная опухоль из клеток-натуральных киллеров, меланома (например, метастатическая злокачественная меланома, такая как кожная или интраокулярная злокачественная меланома), рак кости, рак кожи, рак матки, рак анальной области, рак яичка, карцинома фаллопиевых труб, карцинома эндометрия, карцинома шейки матки, карцинома влагалища, карцинома вульвы, рак пищевода, рак тонкой кишки, рак эндокринной системы, рак паращитовидной железы, рак надпочечника, саркома мягкой ткани, рак мочеиспускательного канала, рак полового члена, солидные опухоли детского возраста, рак мочеточника, карцинома почечной лоханки, новообразование центральной нервной системы (ЦНС), первичная лимфома ЦНС, опухолевый ангиогенез, опухоль позвоночника, глиома ствола головного мозга, аденома гипофиза, саркома Капоши, эпидермоидная рак, плоскоклеточная рак, Т-клеточная лимфома, вызванные факторами окружающей среды злокачественные опухоли, включая в себя раковые заболевания, вызванные асбестом, рак вирусного происхождения (например, связанная с вирусом папилломы человека (HPV) опухоль) и гематологический рак, происходящие из любой из двух основных линий дифференцировки клеток крови, т.е. миелоидной клеточной линии (которая производит гранулоциты, эритроциты, тромбоциты, макрофаги и тучные клетки) или лимфоидной клеточной линии (которая производит В-, Т-,- 34 048278 endometrial cancer, kidney cancer (eg, renal cell carcinoma (RCC)), prostate cancer (eg, hormone-refractory prostate adenocarcinoma), thyroid cancer, neuroblastoma, pancreatic cancer, glioblastoma (glioblastoma multiforme), cervical cancer, gastric cancer, bladder cancer, hepatoma, breast cancer, colon carcinoma and cancer (or carcinoma) of the head and neck, gastric cancer, germ cell tumor, childhood sarcoma, sinonasal natural killer cell tumor, melanoma (eg, metastatic malignant melanoma such as cutaneous or intraocular malignant melanoma), bone cancer, skin cancer, uterine cancer, anal cancer, testicular cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, esophageal cancer, small bowel cancer, endocrine cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, childhood solid tumors, ureteral cancer, renal pelvis carcinoma, central nervous system (CNS) neoplasm, primary CNS lymphoma, tumor angiogenesis, spinal tumor, brainstem glioma, pituitary adenoma, Kaposi's sarcoma, epidermoid carcinoma, squamous cell carcinoma, T-cell lymphoma, environmental malignancies including asbestos-induced cancers, cancers of viral origin (e.g., human papillomavirus (HPV)-associated tumor), and hematological cancers arising from either of the two major blood cell lineages, i.e. the myeloid cell line (which produces granulocytes, red blood cells, platelets, macrophages, and mast cells) or the lymphoid cell line (which produces B, T,
NK-клетки и плазматические клетки), такие как все типы лейкозов, лимфом и миелом, например, острые, хронические, лимфоцитарные и/или миелогенные лейкозы, такие как острый лейкоз (ALL), острый миелогенный лейкоз (AML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) и хронический миелогенный лейкоз (CML), недифференцированный AML (МО), миелобластный лейкоз (M1), миелобластный лейкоз (М2; с созреванием клеток), промиелоцитарный лейкоз (M3 или вариант M3 [M3 V]), миеломоноцитарный лейкоз (М4 или вариант М4 с эозинофилией [М4Е]), моноцитарный лейкоз (М5), эритролейкоз (M6), мегакариобластный лейкоз (М7), изолированная гранулоцитарная саркома и хлорома; лимфомы, такие как ходжкинская лимфома (HL), неходжкинская лимфома (NHL), В-клеточные лимфомы, Т-клеточные лимфомы, лимфоплазмоцитоидная лимфома, моноцитоидная В-клеточная лимфома, лимфома лимфоидной ткани слизистых оболочек (MALT), анапластическая (например, Ki 1+) крупноклеточная лимфома, Т-клеточная лимфома/лейкоз у взрослых, мантийноклеточная лимфома, ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома, ангиоцентрическая лимфома, Т-клеточная лимфома кишечника, первичная медиастинальная В-клеточная лимфома, Т-лимфобластная лимфома из клеток-предшественников, Т-лимфобластная лимфома/лейкоз (T-Lbly/T-ALL), периферическая Т-клеточная лимфома, лимфобластная лимфома, посттрансплантационное лимфопролиферативное нарушение, истинная гистиоцитарная лимфома, первичная лимфома центральной нервной системы, первичная выпотная лимфома, лимфобластная лимфома (LBL), гемопоэтические опухоли лимфоидного происхождения, острый лимфобластный лейкоз, диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома, лимфома Беркитта, фолликулярная лимфома, диффузная гистиоцитарная лимфома (DHL), иммунобластная крупноклеточная лимфома, Влимфобластная лимфома из клеток-предшественников, кожная Т-клеточная лимфома (CTLC) (также называемая фунгоидный микоз или синдром Сезари) и лимфоплазмоцитоидная лимфома (LPL) с макроглобулинемией Вальденстрёма; миеломы, такие как миелома IgG, миелома легких цепей, несекреторная миелома, вялотекущая миелома (также называемая невыраженной миеломой), солитарная плазмоцитома и множественные миеломы, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), волосатоклеточная лимфома; гемопоэтические опухоли миелоидного происхождения, опухоли мезенхимального происхождения, включая в себя фибросаркому и рабдомиосаркому; семинома, тератокарцинома, опухоли центральной и периферической нервной системы, включая в себя астроцитому, шванному; опухоли мезенхимального происхождения, включая в себя фибросаркому, рабдомиосаркому и остеосаркому; и другие опухоли, включая в себя следующее: меланома, пигментная ксеродерма, кератоакантома, семинома, фолликулярная рак щитовидной железы и тератокарцинома, гемопоэтические опухоли лимфоидного происхождения, например Т-клеточные и В-клеточные опухоли, включая в себя без ограничения Т-клеточные нарушения, такие как Т-пролимфоцитарный лейкоз (T-PLL), включая в себя лейкоз мелкоклеточного и церебриформного клеточного типа; лейкоз из больших гранулярных лимфоцитов (LGL) предпочтительно Т-клеточного типа; a/d T-NHL лимфома печени и селезенки; лимфома из периферических/посттимусных Т-клеток (плеоморфный и иммунобластный подтипы); ангиоцентрическая (назальная) Т-клеточная лимфома; рак головы или шеи, рак почки, рак прямой кишки, рак щитовидной железы; острая миелоидная лимфома, а также любые комбинации указанных заболеваний раком. Описанные в настоящем документе способы также можно использовать для лечения метастатического рака, рефрактерных злокачественных опухолей (например, злокачественных опухолей, рефрактерных к предыдущей иммунотерапии, например, с помощью блокирующего антитела к CTLA-4 или PD-1) и рецидивирующего рака.NK cells and plasma cells), such as all types of leukemia, lymphoma and myelomas, such as acute, chronic, lymphocytic and/or myelogenous leukemia such as acute leukemia (ALL), acute myelogenous leukemia (AML), chronic lymphocytic leukemia (CLL) and chronic myelogenous leukemia (CML), undifferentiated AML (UN), myeloblastic leukemia (M1), myeloblastic leukemia (M2; with cell maturation), promyelocytic leukemia (M3 or M3 variant [M3 V]), myelomonocytic leukemia (M4 or M4 variant with eosinophilia [M4E]), monocytic leukemia (M5), erythroleukemia (M6), megakaryoblastic leukemia (M7), isolated granulocytic sarcoma and chloroma; lymphomas such as Hodgkin lymphoma (HL), non-Hodgkin lymphoma (NHL), B-cell lymphomas, T-cell lymphomas, lymphoplasmacytoid lymphoma, monocytoid B-cell lymphoma, mucosa-associated lymphoid tissue (MALT) lymphoma, anaplastic (e.g., Ki 1+) large cell lymphoma, adult T-cell lymphoma/leukemia, mantle cell lymphoma, angioimmunoblastic T-cell lymphoma, angiocentric lymphoma, intestinal T-cell lymphoma, primary mediastinal B-cell lymphoma, T-lymphoblastic progenitor lymphoma, T-lymphoblastic lymphoma/leukemia (T-Lbly/T-ALL), peripheral T-cell lymphoma, lymphoblastic lymphoma, post-transplant lymphoproliferative disorder, true histiocytic lymphoma, Primary central nervous system lymphoma, primary effusion lymphoma, lymphoblastic lymphoma (LBL), hematopoietic tumors of lymphoid lineage, acute lymphoblastic leukemia, diffuse large B-cell lymphoma, Burkitt lymphoma, follicular lymphoma, diffuse histiocytic lymphoma (DHL), immunoblastic large cell lymphoma, B-cell progenitor lymphoma, cutaneous T-cell lymphoma (CTLC) (also called mycosis fungoides or Sezary syndrome), and lymphoplasmacytoid lymphoma (LPL) with Waldenstrom macroglobulinemia; myelomas such as IgG myeloma, light chain myeloma, nonsecretory myeloma, smoldering myeloma (also called indolent myeloma), solitary plasmacytoma and multiple myelomas, chronic lymphocytic leukemia (CLL), hairy cell lymphoma; hematopoietic tumors of myeloid origin, tumors of mesenchymal origin including fibrosarcoma and rhabdomyosarcoma; seminoma, teratocarcinoma, tumors of the central and peripheral nervous system including astrocytoma, schwannoma; tumors of mesenchymal origin including fibrosarcoma, rhabdomyosarcoma and osteosarcoma; and other neoplasms including the following: melanoma, xeroderma pigmentosum, keratoacanthoma, seminoma, follicular thyroid cancer and teratocarcinoma, hematopoietic neoplasms of lymphoid lineage such as T-cell and B-cell neoplasms including but not limited to T-cell disorders such as T-prolymphocytic leukemia (T-PLL) including small cell and cerebriform cell types; large granular lymphocyte leukemia (LGL) of predominantly T-cell type; a/d T-NHL lymphoma of the liver and spleen; peripheral/postthymic T-cell lymphoma (pleomorphic and immunoblastic subtypes); angiocentric (nasal) T-cell lymphoma; head and neck cancer, kidney cancer, colorectal cancer, thyroid cancer; acute myeloid lymphoma, as well as any combination of these cancers. The methods described herein can also be used to treat metastatic cancer, refractory malignancies (e.g., malignancies refractory to previous immunotherapy, such as with a blocking antibody to CTLA-4 or PD-1), and recurrent cancer.
Антитело к huCD40 можно вводить в виде монотерапии или в виде единственной иммуностимулирующей терапии, или его можно комбинировать с иммуногенным средством в стратегии противоопухоAnti-huCD40 antibody can be administered as monotherapy or as the only immunostimulatory therapy, or it can be combined with an immunogenic agent in an antitumor strategy.
- 35 048278 левых вакцин, таким как злокачественные клетки, очищенные опухолевые антигены (включая в себя рекомбинантные белки, пептиды и углеводные молекулы), клетки и клетки, трансфицированные генами, кодирующими иммунностимулирующие цитокины (Не et al. (2004), J. Immunol. 173:4919-28). Неограничивающие примеры противоопухолевых вакцин, которые можно использовать, включают в себя пептиды антигенов меланомы, такие как пептиды gp100, антигены MAGE, Trp-2, MART1 и/или тирозиназа, или опухолевые клетки, трансфицированные, чтобы экспрессировать цитокин GM-CSF. Были разработаны многие экспериментальные стратегии вакцинации против опухолей (см. Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; см. также Restifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, p. 3023-3043 в DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition). В одной из указанных стратегий вакцину получают с использованием аутологичных или аллогенных клеток опухоли. Было показано, что эти клеточные вакцины наиболее эффективны, когда опухолевые клетки трансдуцированы, чтобы экспрессировать GM-CSF. GM-CSF, как было показано, представляет собой мощный активатор презентации антигена для вакцинации опухоли. Dranoff et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 90:3539-43.- 35 048278 left vaccines, such as malignant cells, purified tumor antigens (including recombinant proteins, peptides and carbohydrate molecules), cells and cells transfected with genes encoding immune-stimulatory cytokines (He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28). Non-limiting examples of tumor vaccines that can be used include melanoma antigen peptides such as gp100 peptides, MAGE antigens, Trp-2, MART1 and/or tyrosinase, or tumor cells transfected to express the cytokine GM-CSF. Many experimental tumor vaccination strategies have been developed (see Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; see also Restifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043 in DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition). In one of these strategies, the vaccine is produced using autologous or allogeneic tumor cells. These cell vaccines have been shown to be most effective when tumor cells are transduced to express GM-CSF. GM-CSF has been shown to be a potent activator of antigen presentation for tumor vaccination. Dranoff et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 90:3539-43.
Изучение экспрессии генов и крупномасштабных профилей экспрессии генов в различных опухолях привело к определению так называемых опухолеспецифических антигенов. Rosenberg, S.A. (1999), Immunity, 10:281-7. Во многих случаях эти опухолеспецифические антигены представляют собой антигены дифференцировки, экспрессированные в опухолях и в клетке, из которой возникла опухоль, например, антигены меланоцитов gp100 антигены MAGE и Trp-2. Что еще более важно, может быть показано, что многие из этих антигенов представляют собой мишени опухолеспецифических Т-клеток, обнаруженных у хозяина. Агонисты CD40 можно использовать в сочетании с набором рекомбинантных белков и/или пептидов, экспрессированных в опухоли, с целью получения иммунного ответа на эти белки. Указанные белки в норме рассматриваются иммунной системой как собственные антигены, и поэтому она толерантна к ним. Опухолевый антиген может также включать в себя белок-теломеразу, который необходим для синтеза теломер хромосом и который экспрессируется более чем в 85% видов рака человека и находится только в ограниченном числе соматических тканей (Kim et al. (1994), Science, 266:2011-2013). Опухолевый антиген может также представлять собой неоантигены, экспрессированные в злокачественных клетках из-за соматических мутаций, которые изменяют белковую последовательность или создают слитые белки между двумя несвязанными последовательностями (т.е. bcr-abl в филадельфийской хромосоме) или идиотии из В-клеточных опухолей.The study of gene expression and large-scale gene expression profiles in various tumors has led to the definition of so-called tumor-specific antigens. Rosenberg, S.A. (1999) Immunity, 10:281-7. In many cases, these tumor-specific antigens are differentiation antigens expressed in the tumors and in the cell from which the tumor arose, such as the melanocyte antigens gp100, MAGE, and Trp-2 antigens. More importantly, many of these antigens can be shown to be targets of tumor-specific T cells found in the host. CD40 agonists can be used in combination with a panel of recombinant proteins and/or peptides expressed in the tumor to elicit an immune response to these proteins. These proteins are normally regarded as self-antigens by the immune system and are therefore tolerated. Tumor antigen may also include the protein telomerase, which is required for the synthesis of chromosome telomeres and is expressed in more than 85% of human cancers and is found only in a limited number of somatic tissues (Kim et al. (1994) Science 266:2011–2013). Tumor antigen may also represent neoantigens expressed in malignant cells due to somatic mutations that alter the protein sequence or create fusion proteins between two unrelated sequences (i.e., bcr-abl in the Philadelphia chromosome) or idiopathies from B-cell tumors.
Другие противоопухолевые вакцины могут включать в себя белки от вирусов, вовлеченные в развитие рака человека, таких как вирусы папилломы человека (HPV), вирусы гепатита (HBV и HCV) и вирус герпеса саркомы Капоши (KHSV). Другая форма опухолеспецифического антигена, который можно использовать в сочетании с ингибированием CD40, представляет собой очищенные белки теплового шока (HSP), выделенные из самой ткани опухоли. Эти белки теплового шока содержат фрагменты белков из опухолевых клеток, и эти HSP высокоэффективны при доставке в антигенпрезентирующие клетки для вызова опухолевого иммунитета (Suot & Srivastava (1995), Science, 269:1585-1588; Tamura et al. (1997), Science, 278:117-120).Other tumor vaccines may include proteins from viruses implicated in human cancer, such as human papillomavirus (HPV), hepatitis viruses (HBV and HCV), and Kaposi's sarcoma herpes virus (KHSV). Another form of tumor-specific antigen that can be used in combination with CD40 inhibition is purified heat shock proteins (HSPs) isolated from the tumor tissue itself. These HSPs contain fragments of proteins from tumor cells, and these HSPs are highly effective when delivered to antigen-presenting cells to elicit tumor immunity (Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura et al. (1997) Science 278:117-120).
Дендритные клетки (DC) представляют собой мощные антигенпрезентирующие клетки, которые можно использовать для примирования антигенспецифических ответов. DC можно получить ex vivo и нагрузить различными белковыми и пептидными антигенами, а также экстрактами опухолевых клеток (Nestle et al. (1998), Nature Medicine, 4:328-332). DC могут быть также трансдуцированы генетическими средствами, чтобы экспрессировать эти опухолевые антигены. DC были также слиты непосредственно с опухолевыми клетками для целей иммунизации (Kugler et al. (2000), Nature Medicine, 6:332-336). В качестве способа вакцинации иммунизация DC можно эффективно комбинировать с агонизмом CD40, чтобы активировать (реализовать) более мощные противоопухолевые ответы.Dendritic cells (DCs) are potent antigen-presenting cells that can be used to prime antigen-specific responses. DCs can be generated ex vivo and loaded with a variety of protein and peptide antigens as well as tumor cell extracts (Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4:328-332). DCs can also be transduced by genetic means to express these tumor antigens. DCs have also been fused directly to tumor cells for immunization purposes (Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336). As a vaccination strategy, DC immunization can be effectively combined with CD40 agonism to activate more potent antitumor responses.
Агонизм CD40 также можно комбинировать со стандартными видами лечения рака (например, операцией, облучением и химиотерапией). Агонизм CD40 можно эффективно комбинировать с химиотерапевтическими режимами. В этих случаях может быть возможным снижение дозы вводимого химиотерапевтического реагента (Mokyr et al. (1998), Cancer Research, 58:5301-5304). Пример такой комбинации представляет собой антитело к huCD40 в комбинации с декарбазином для лечения меланомы. Другой пример такой комбинации представляет собой антитело к huCD40 в комбинации с интерлейкином-2 (IL-2) для лечения меланомы. Научное обоснование комбинированного применения агонистов CD40 с химиотерапией заключается в том, что гибель клеток, которая представляет собой следствие цитотоксического действия большинства химиотерапевтических соединений, должна приводить к повышенному содержанию опухолевого антигена в антигенпрезентирующем пути. Другие комбинированные способы лечения, которые могут приводить к синергии с агонизмом CD40 через клеточную гибель, представляют собой облучение, операцию и выключение эндокринной функции. Каждый из этих протоколов создает источник опухолевого антигена в организме хозяина. Ингибиторы ангиогенеза также можно комбинировать с агонистами CD40. Ингибирование ангиогенеза приводит к гибели опухолевых клеток, которыеCD40 agonism can also be combined with standard cancer treatments (eg, surgery, radiation, and chemotherapy). CD40 agonism can be effectively combined with chemotherapeutic regimens. In these cases, it may be possible to reduce the dose of the chemotherapeutic agent administered (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58:5301-5304). An example of such a combination is an anti-huCD40 antibody in combination with decarbazine for the treatment of melanoma. Another example of such a combination is an anti-huCD40 antibody in combination with interleukin-2 (IL-2) for the treatment of melanoma. The scientific rationale for the combined use of CD40 agonists with chemotherapy is that cell death, which is a consequence of the cytotoxic action of most chemotherapeutic compounds, should result in increased levels of tumor antigen in the antigen-presenting pathway. Other combination therapies that may synergize with CD40 agonism via cell death include radiation, surgery, and endocrine shutoff. Each of these protocols creates a source of tumor antigen in the host. Angiogenesis inhibitors can also be combined with CD40 agonists. Inhibition of angiogenesis results in the death of tumor cells, which
- 36 048278 могут поставлять опухолевый антиген в антигенпрезентирующие пути хозяина.- 36 048278 can deliver tumor antigen to the host's antigen-presenting pathways.
Описанные в настоящем документе антитела к huCD40 также можно использовать в комбинации с биспецифическими антителами, которые нацеливают экспрессирующие рецепторы Fca или Fcy эффекторные клетки на опухолевые клетки (см., например, патенты США № 5922845 и 5837243). Биспецифические антитела можно использовать для нацеленного воздействия на два отдельных антигена. Например, биспецифические антитела к Fc-рецепторам/к опухолевым антигенам (например, Her-2/neu) использовали для нацеленного воздействия макрофагами на места расположения опухолей. Это нацеленное воздействие может более эффективно активировать опухолеспецифические ответы. Т-клеточная ветвь указанных ответов будет увеличена за счет агонизма CD40. Альтернативно, антиген можно доставить непосредственно в DC с использованием биспецифических антител, которые связываются с опухолевым антигеном и специфическим маркером клеточной поверхности дендритных клеток.The anti-huCD40 antibodies described herein can also be used in combination with bispecific antibodies that target Fca or Fcy receptor-expressing effector cells to tumor cells (see, e.g., U.S. Patent Nos. 5,922,845 and 5,837,243). Bispecific antibodies can be used to target two separate antigens. For example, Fc receptor/tumor antigen (e.g., Her-2/neu) bispecific antibodies have been used to target macrophages to tumor sites. This targeting can more effectively activate tumor-specific responses. The T cell arm of these responses will be enhanced by CD40 agonism. Alternatively, antigen can be delivered directly to DCs using bispecific antibodies that bind to a tumor antigen and a specific cell surface marker of dendritic cells.
Опухоли избегают иммунологического надзора хозяина с помощью большого разнообразия механизмов. Многие из этих механизмов могут быть преодолены путем инактивации иммуносупрессорных белков, которые экспрессируются опухолями. Они включают в себя среди прочих TGF-β (Kehrl et al. (1986), J. Exp. Med. 163:1037-1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992), Immunology Today, 13:198-200) и лиганд Fas (Hahne et al. (1996), Science, 274:1363-1365). Антитела к каждой из этих структур можно использовать в комбинации с антителами к huCD40, чтобы противодействовать эффектам иммуносупрессорного средства и способствовать противоопухолевым иммунным ответам в организме хозяина.Tumors evade host immunosurveillance by a wide variety of mechanisms. Many of these mechanisms can be overcome by inactivating immunosuppressive proteins that are expressed by tumors. These include, among others, TGF-β (Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163:1037–1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13:198–200), and Fas ligand (Hahne et al. (1996) Science 274:1363–1365). Antibodies to each of these structures can be used in combination with antibodies to huCD40 to counteract the effects of the immunosuppressive agent and promote antitumor immune responses in the host.
Антитела к CD40 способны эффективно заменить активность хелперных Т-клеток. Ridge et al. (1998), Nature, 393:474-478. Активация антител к костимулирующим Т-клетки молекулам, таким как CTLA-4 (например, патент США № 5811097), ОХ-40 (Weinberg et al. (2000), Immunol. 164:2160-2169), CD137/4-1BB (Melero et al. (1997), Nature Medicine, 3:682-685 (1997) и ICOS (Hutloff et al. (1999), Nature, 397:262-266), может также обеспечивать повышенные уровни активации Т-клеток. Ингибиторы PD1 или PD-L1 также можно использовать в сочетании с антителами к huCD40.Anti-CD40 antibodies can effectively replace helper T cell activity. Ridge et al. (1998) Nature 393:474-478. Activation of antibodies to T cell costimulatory molecules such as CTLA-4 (e.g., U.S. Patent 5,811,097), OX-40 (Weinberg et al. (2000) Immunol 164:2160-2169), CD137/4-1BB (Melero et al. (1997) Nature Medicine 3:682-685 (1997), and ICOS (Hutloff et al. (1999) Nature 397:262-266) can also provide increased levels of T cell activation. PD1 or PD-L1 inhibitors can also be used in combination with anti-huCD40 antibodies.
Существуют также несколько экспериментальных протоколов лечения, которые включают в себя ex vivo активацию и экспансию антигенспецифических Т-клеток и адоптивный перенос этих клеток реципиентам, чтобы стимулировать антигенспецифические Т-клетки против опухоли (Greenberg & Riddell (1999), Science, 285:546-51). Указанные способы также можно использовать для активации Т-клеточных ответов на инфекционные патогены, такие как CMV. Можно ожидать, что активация ex vivo в присутствии антител к CD40 увеличит частоту и активность адоптивно перенесенных Т-клеток.There are also several experimental treatment protocols that involve ex vivo activation and expansion of antigen-specific T cells and adoptive transfer of these cells into recipients to stimulate antigen-specific T cells against the tumor (Greenberg & Riddell (1999) Science 285:546-51). These methods can also be used to activate T cell responses to infectious pathogens such as CMV. Ex vivo activation in the presence of CD40 antibodies would be expected to increase the frequency and activity of adoptively transferred T cells.
Хронические вирусные инфекции.Chronic viral infections.
Согласно другому аспекту описанное в настоящем документе настоящее изобретение относится к способу лечения инфекционного заболевания у субъекта, предусматривающему введение субъекту антитела к huCD40 или его антигенсвязывающего фрагмента так, чтобы лечить инфекционное заболевание у субъекта.According to another aspect, the present invention described herein relates to a method of treating an infectious disease in a subject, comprising administering to the subject an anti-huCD40 antibody or antigen-binding fragment thereof so as to treat the infectious disease in the subject.
Аналогично его применению к опухолям, как обсуждалось выше, опосредованный антителом к CD40 агонизм можно использовать отдельно или в качестве адъюванта, в комбинации с вакцинами, чтобы усиливать иммунный ответ на патогены, токсины и аутоантигены. Примеры патогенов, для которых этот терапевтический подход является особенно применимым, включают в себя патогены, для которых в настоящее время отсутствует эффективная вакцина, или патогены, для которых общепринятые вакцины не являются абсолютно эффективными. Они включают в себя без ограничения ВИЧ, гепатиты (А, В и С), грипп, герпес, лямблию, малярию лейшманию, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. Агонизм CD40 является особенно применимым против развившихся инфекций, вызванных такими агентами, как ВИЧ, которые представляют измененные антигены во время всего течения инфекций. Указанные новые эпитопы распознаются как чужеродные в момент введения антитела к CD40 человека, таким образом вызывая сильный Т-клеточный ответ.Similar to its application to tumors, as discussed above, CD40 antibody-mediated agonism can be used alone or as an adjuvant, in combination with vaccines, to enhance the immune response to pathogens, toxins, and self-antigens. Examples of pathogens for which this therapeutic approach is particularly useful include pathogens for which there is currently no effective vaccine or pathogens for which conventional vaccines are not completely effective. These include, but are not limited to, HIV, hepatitis (A, B, and C), influenza, herpes, giardia, malaria, leishmania, Staphylococcus aureus, and Pseudomonas aeruginosa. CD40 agonism is particularly useful against established infections caused by agents such as HIV that present altered antigens throughout the course of the infection. These new epitopes are recognized as foreign upon administration of the human CD40 antibody, thus eliciting a strong T cell response.
Некоторые примеры патогенных вирусов, вызывающих инфекции, которые поддаются лечению способами, описанными в настоящем документе, включают в себя ВИЧ, вирус гепатита (А, В или С), вирус герпеса (например, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II и CMV, вирус Эпштейна-Барр), аденовирус, вирус гриппа, флавивирусы, эховирус, риновирус, вирус коксаки, коронавирус, респираторносинцитиальный вирус, вирус эпидемического паротита, ротавирус, вирус кори, вирус краснухи, парвовирус, вирус коровьей оспы, HTLV (вирус Т-клеточного лейкоза человека), вирус денге, папилломавирус, вирус контагиозного моллюска, полиовирус, вирус бешенства, вирус Джона Каннингема и вирус арбовирусного энцефалита.Some examples of pathogenic viruses that cause infections that are treatable with the methods described herein include HIV, hepatitis virus (A, B, or C), herpes virus (e.g., VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, and CMV, Epstein-Barr virus), adenovirus, influenza virus, flaviviruses, echovirus, rhinovirus, coxsackievirus, coronavirus, respiratory syncytial virus, mumps virus, rotavirus, measles virus, rubella virus, parvovirus, vaccinia virus, HTLV (human T-cell leukemia virus), dengue virus, papillomavirus, molluscum contagiosum virus, poliovirus, rabies virus, John Cunningham virus, and arbovirus encephalitis virus.
Некоторые примеры патогенных бактерий, вызывающих инфекционные заболевания, которые поддаются лечению способами, описанными в настоящем документе, включают в себя хламидии, риккетсии, микобактерии, стафилококки, стрептококки, пневмококки, менингококки и гонококки, клебсиеллы, протей, серратии, псевдомонады, легионеллы, возбудителей дифтерии, сальмонеллы, бациллы, возбудителей холеры, столбняка, ботулизма, сибирской язвы, чумы, лептоспироза и болезни Лайма.Some examples of pathogenic bacteria that cause infectious diseases that are treatable by the methods described herein include chlamydia, rickettsia, mycobacteria, staphylococci, streptococci, pneumococci, meningococci and gonococci, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, diphtheria, salmonella, bacilli, cholera, tetanus, botulism, anthrax, plague, leptospirosis, and Lyme disease.
Некоторые примеры патогенных грибов, вызывающих инфекционные заболевания, которые поддаются лечению способами, описанными в настоящем документе, включают в себя Candida (albicans,Some examples of pathogenic fungi that cause infectious diseases that are treatable with the methods described herein include Candida (albicans,
- 37 048278 krusei, glabrata, tropicalis и т.д.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger и т.д.), род Mucorales (mucor, absidia, rhizopus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis и Histoplasma capsulatum.- 37 048278 krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), genus Mucorales (mucor, absidia, rhizopus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis and Histoplasma capsulatum.
Некоторые примеры патогенных простейших, вызывающих инфекционные заболевания, которые поддаются лечению способами, описанными в настоящем документе, включают в Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii, Nippostrongylus brasiliensissis.Some examples of pathogenic protozoa that cause infectious diseases that are treatable by the methods described herein include Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleria fowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii, Nippostrongylus brasiliensissis.
Во всех вышеуказанных способах агонизм CD40 можно комбинировать с другими формами иммунотерапии, такими как лечение цитокинами (например, интерферонами, GM-CSF, G-CSF, IL-2) или терапия биспецифическими антителами, которая обеспечивает усиленную презентацию опухолевых антигенов. См., например, Holliger (1993), Proc. Nail. Acad. Sci. (USA), 90:6444-6448; Poljak (1994), Structure, 2:1121-1123.In all of the above approaches, CD40 agonism can be combined with other forms of immunotherapy, such as cytokine treatment (e.g., interferons, GM-CSF, G-CSF, IL-2) or bispecific antibody therapy, which provides enhanced presentation of tumor antigens. See, e.g., Holliger (1993), Proc. Nail. Acad. Sci. (USA), 90:6444–6448; Poljak (1994), Structure, 2:1121–1123.
Адъюванты вакцин.Vaccine adjuvants.
Описанные в настоящем документе антитела к huCD40 можно использовать для усиления антигенспецифических иммунных ответов путем совместного введения антитела к huCD40 с представляющим интерес антигеном, например вакциной. Соответственно, в настоящем документе предусмотрены способы усиления иммунного ответа на антиген у субъекта, предусматривающие введение субъекту (i) антигена и (ii) антитела к huCD40 или его антигенсвязывающего фрагмента так, чтобы усиливать иммунный ответ на антиген у субъекта. Антиген может представлять собой, например, опухолевый антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген или антиген из патогенного микроорганизма. Неограничивающие примеры таких антигенов включают в себя те, которые обсуждались в предыдущих разделах, такие как опухолевые антигены (или противоопухолевые вакцины), обсуждаемые выше, или антигены из вирусов, бактерий или других патогенов, описанных выше.The anti-huCD40 antibodies described herein can be used to enhance antigen-specific immune responses by co-administering the anti-huCD40 antibody with an antigen of interest, such as a vaccine. Accordingly, provided herein are methods for enhancing an immune response to an antigen in a subject, comprising administering to the subject (i) an antigen and (ii) an anti-huCD40 antibody or antigen-binding fragment thereof so as to enhance an immune response to the antigen in the subject. The antigen can be, for example, a tumor antigen, a viral antigen, a bacterial antigen, or an antigen from a pathogenic microorganism. Non-limiting examples of such antigens include those discussed in the previous sections, such as the tumor antigens (or tumor vaccines) discussed above, or antigens from viruses, bacteria, or other pathogens described above.
Подходящие пути введения композиций антител (например, моноклональных антител человека, мультиспецифических и биспецифических молекул и иммуноконъюгатов), описанных в настоящем документе in vivo и in vitro, хорошо известны в настоящей области техники и могут быть выбраны средними специалистами. Например, композиции антител можно вводить путем инъекции (например, внутривенной или подкожной). Подходящие дозировки используемых молекул будут зависеть от возраста и массы субъекта и концентрации и/или состава композиции антител.Suitable routes of administration of the antibody compositions (e.g., human monoclonal antibodies, multispecific and bispecific molecules, and immunoconjugates) described herein in vivo and in vitro are well known in the art and can be selected by those of ordinary skill in the art. For example, the antibody compositions can be administered by injection (e.g., intravenously or subcutaneously). Suitable dosages of the molecules used will depend on the age and weight of the subject and the concentration and/or composition of the antibody composition.
Как было описано ранее, описанные в настоящем документе антитела к huCD40 можно вводить совместно с одним или несколькими другими терапевтическими средствами, например цитотоксическим средством, радиотоксическим средством или иммуносупрессорным средством. Антитело может являться связанным со средством (в виде иммунокомплекса) или его можно вводить отдельно от средства. В последнем случае (раздельное введение) антитело можно вводить до, после или одновременно со средством или его можно вводить совместно с другими известными видами лечения, например противоопухолевой терапией, например облучением. Такие терапевтические средства включают в себя, среди прочего, противоопухолевые средства, такие как доксорубицин (адриамицин), цисплатин, блеомицин сульфат, кармустин, хлорамбуцил, дакарбазин и циклофосфамид, гидроксимочевина, которые сами по себе являются эффективными только на уровнях, которые являются токсическими или субтоксическими для пациента. Цисплатин вводят внутривенно в дозе 100 мг/мл каждые четыре недели и адриамицин вводят внутривенно в дозе 60-75 мг/мл один раз в 21 день. Совместное введение антител к CD40 или их антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, с химиотерапевтическими средствами, обеспечивает два противоопухолевых средства, которые действуют через разные механизмы, что приводит к цитотоксическому действию на опухолевые клетки человека. Такое совместное введение может решить проблемы, вызванные развитием устойчивости к лекарственным средствам или изменением антигенности опухолевых клеток, что может сделать их не реакционноспособными в отношении антитела.As previously described, the anti-huCD40 antibodies described herein can be co-administered with one or more other therapeutic agents, such as a cytotoxic agent, a radiotoxic agent, or an immunosuppressant agent. The antibody can be associated with the agent (as an immune complex) or it can be administered separately from the agent. In the latter case (separate administration), the antibody can be administered before, after, or simultaneously with the agent, or it can be co-administered with other known treatments, such as anti-tumor therapy, such as radiation. Such therapeutic agents include, but are not limited to, anti-tumor agents such as doxorubicin (Adriamycin), cisplatin, bleomycin sulfate, carmustine, chlorambucil, dacarbazine, and cyclophosphamide, hydroxyurea, which are themselves effective only at levels that are toxic or subtoxic to the patient. Cisplatin is administered intravenously at a dose of 100 mg/mL every four weeks and adriamycin is administered intravenously at a dose of 60-75 mg/mL once every 21 days. Co-administration of the CD40 antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein with chemotherapeutic agents provides two antitumor agents that act through different mechanisms, resulting in cytotoxic effects on human tumor cells. Such co-administration may overcome problems caused by the development of drug resistance or changes in the antigenicity of tumor cells, which may make them non-reactive with the antibody.
В объем, описанный в настоящем документе, также включены наборы, содержащие композиции антител, описанные в настоящем документе (например, антитела человека, биспецифические или мультиспецифические молекулы или иммуноконъюгаты), и инструкции для применения. Набор может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный реагент или один или несколько дополнительных антител человека, описанных в настоящем документе (например, человеческое антитело, характеризующееся взаимодополняющей активностью, которое связывается с эпитопом в антигене CD40, отличным от первого антитела человека). Наборы, как правило, включают в себя этикетку, на которой указано предусмотренное применение содержимого набора. Термин этикетка включает в себя любой письменный или печатный материал, поставляемый на наборе или с набором или который сопутствует набору иным образом.Also included within the scope described herein are kits containing the antibody compositions described herein (e.g., human antibodies, bispecific or multispecific molecules, or immunoconjugates) and instructions for use. The kit may further comprise at least one additional reagent or one or more additional human antibodies described herein (e.g., a human antibody having complementary activity that binds to an epitope on the CD40 antigen that is different from the first human antibody). Kits typically include a label that indicates the intended use of the contents of the kit. The term label includes any written or printed material supplied on or with the kit or that otherwise accompanies the kit.
Виды комбинированной терапии.Types of combination therapy.
В дополнение к видам терапии с использованием комбинаций, предусмотренным выше, описанные в настоящем документе антитела к CD40 также можно использовать в комбинированной терапии, например, для лечения рака, как описано ниже.In addition to the combination therapies provided above, the CD40 antibodies described herein may also be used in combination therapy, such as for the treatment of cancer, as described below.
Настоящее изобретение относится к способам комбинированной терапии, в которых антитело кThe present invention relates to methods of combination therapy in which an antibody to
- 38 048278 huCD40 вводят совместно с одним или несколькими дополнительными средствами, например антителами, которые являются эффективными в стимулировании иммунных ответов, чтобы, тем самым, дополнительно усиливать, стимулировать или положительно регулировать иммунные ответы у субъекта.- 38 048278 huCD40 is administered in conjunction with one or more additional agents, such as antibodies, that are effective in stimulating immune responses, to thereby further enhance, stimulate, or positively regulate immune responses in a subject.
Как правило, описанное в настоящем документе антитело к huCD40 можно комбинировать с (i) агонистом другого костимулирующего рецептора и/или (ii) антагонистом ингибирующего сигнала на Т-клетках, любой из которых приводит к усилению антигенспецифических Т-клеточных ответов (регуляторы контрольных точек иммунного ответа). Большинство костимулирующих и коингибирующих молекул представляют собой представителей суперсемейства иммуноглобулинов (IgSF), и описанные в настоящем документе антитела к CD40 можно вводить со средством, которое нацеленно воздействует на представителя семейства IgSF для увеличения иммунного ответа. Одно важное семейство мембраносвязанных лигандов, которые связываются с костимулирующими или коингибирующими рецепторами, представляет собой семейство В7, которое включает в себя В7-1, В7-2, В7-Н1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), В7-Н2 (ICOS-L), В7-НЗ, В7-Н4, В7-Н5 (VISTA) и В7-Н6. Другое семейство мембраносвязанных лигандов, которые связываются с костимулирующими или коингибирующими рецепторами, представляет собой семейство TNF молекул, которые связываются с представителями семейства когнатных рецепторов TNF, которые включают в себя CD40 и CD40L, ОХ-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-1BBL, CD137/4-1BB, TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LTeR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TL1A, TRAMP/DR3, EDAR, EDA1, XEDAR, EDA2, TNFR1, лимфотоксин α/TNFe, TNFR2, TNFa, LTeR, лимфотоксин α 1β2, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY, NGFR (см., например, Tansey (2009), Drug Discovery Today 00:1).In general, the anti-huCD40 antibody described herein may be combined with (i) an agonist of another costimulatory receptor and/or (ii) an antagonist of an inhibitory signal on T cells, either of which results in an enhancement of antigen-specific T cell responses (immune checkpoint regulators). Most costimulatory and coinhibitory molecules are members of the immunoglobulin superfamily (IgSF), and the anti-CD40 antibodies described herein may be administered with an agent that targets a member of the IgSF family to enhance the immune response. One important family of membrane-bound ligands that bind to costimulatory or coinhibitory receptors is the B7 family, which includes B7-1, B7-2, B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA), and B7-H6. Another family of membrane-bound ligands that bind to costimulatory or coinhibitory receptors is the TNF family of molecules that bind to members of the TNF cognate receptor family, which includes CD40 and CD40L, OX-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-1BBL, CD137/4-1BB, TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LTeR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TL1A, TRAMP/DR3, EDAR, EDA1, XEDAR, EDA2, TNFR1, lymphotoxin α/TNFe, TNFR2, TNFa, LTeR, lymphotoxin α 1β2, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY, NGFR (see, e.g., Tansey (2009), Drug Discovery Today 00:1).
Согласно другому аспекту антитела к huCD40 можно использовать в комбинации с антагонистами цитокинов, которые ингибируют Т-клеточную активацию (например, IL-6, IL-10, TGF-β, VEGF или другие иммуносупрессорные цитокины или цитокины, которые стимулируют Т-клеточную активацию, для стимуляции иммунного ответа, например, для лечения пролиферативных заболеваний, таких как рак.In another aspect, huCD40 antibodies can be used in combination with antagonists of cytokines that inhibit T cell activation (e.g., IL-6, IL-10, TGF-β, VEGF or other immunosuppressive cytokines or cytokines that stimulate T cell activation) to stimulate an immune response, such as for the treatment of proliferative diseases such as cancer.
Агонистические антитела к huCD40 и комбинированные виды терапии с помощью антител, описанные в настоящем документе, также можно использовать в сочетании с другими хорошо известными видами терапии, которые выбирают на основании их конкретной применимости в отношении показания, подлежащего лечению (например, рака). Комбинации описанных в настоящем документе агонистических антител к huCD40 можно использовать последовательно с известным(и) фармацевтически приемлемым(и) средством(ами).The huCD40 agonist antibodies and combination antibody therapies described herein may also be used in combination with other well-known therapies that are selected based on their particular utility for the indication being treated (e.g., cancer). Combinations of the huCD40 agonist antibodies described herein may be used sequentially with known pharmaceutically acceptable agent(s).
Например, агонистические антитела к huCD40 и комбинированные виды терапии с помощью антител, описанные в настоящем документе, можно использовать в комбинации (например, одновременно или отдельно) с дополнительным лечением, таким как облучение, химиотерапия (например, с использованием следующего: камптотецин (СРТ-11), 5-фторурацил (5-FU), цисплатин, доксорубицин, иринотекан, паклитаксел, гемцитабин, цисплатин, паклитаксел, карбоплатин-паклитаксел (Таксол), доксорубицин, 5-fu или камптотецин + apo21/TRAIL (6X combo)), один или несколько ингибиторов протеасомы (например, бортезомиб или MG132), один или несколько ингибиторов Bcl-2 (например, BH3I-2' (ингибитор bcl-xl), ингибитор индоламинадиоксигеназы-1 (IDO1) (например, INCB24360, АТ-101 (Е-(-)-производное госсипола), АВТ-263 (малая молекула), GX-15-070 (обатоклакс) или антагонисты MCL-1 (белок 1 дифференцировки клеток миелоидного лейкоза)), антагонисты iAP (ингибитор белка апоптоза) (например, smac7, smac4, низкомолекулярный smac-миметик, синтетические smac-пептиды (см. Fulda et al., Nat. Med. 2002; 8:808-15), ISIS23722 (LY2181308) или AEG-35156 (GEM-640)), ингибиторы HDAC (гистондеацетилазы), антитела к CD20- (например, ритуксимаб), ингибиторы ангиогенеза (например, бевацизумаб), антиангиогенные средства, нацеленные на VEGF и VEGFR (например, AVASTIN®), синтетические тритерпеноиды (см. Hyer et al. Cancer Research, 2005; 65:4799-808), модуляторы c-FLIP (клеточный ингибирующий FLICE белок) (например, природные и синтетические лиганды PPARy (активированный пролифератором пероксисом рецептор γ), 5809354 или 5569100), ингибиторы киназы (например, сорафениб), трастузумаб, цетуксимаб, темсиролимус, ингибиторы mTOR, такие как рапамицин и темсиролимус, бортезомиб, ингибиторы JAK2, ингибиторы HSP90, ингибиторы PI3K-AKT, леналилдомид, ингибиторы GSK3P, ингибиторы LAP и/или генотоксические лекарственные средства.For example, the huCD40 agonist antibodies and combination antibody therapies described herein can be used in combination (e.g., simultaneously or separately) with additional treatments such as radiation, chemotherapy (e.g., using the following: camptothecin (CPT-11), 5-fluorouracil (5-FU), cisplatin, doxorubicin, irinotecan, paclitaxel, gemcitabine, cisplatin, paclitaxel, carboplatin-paclitaxel (Taxol), doxorubicin, 5-fu, or camptothecin + apo21/TRAIL (6X combo)), one or more proteasome inhibitors (e.g., bortezomib or MG132), one or more Bcl-2 inhibitors (e.g., BH3I-2' (a bcl-xl inhibitor), indoleamine dioxygenase-1 (IDO1) inhibitor) (e.g. INCB24360, AT-101 (E-(-)-derivative of gossypol), ABT-263 (small molecule), GX-15-070 (obatoclax) or MCL-1 (myeloid leukemia cell differentiation protein 1) antagonists), iAP (inhibitor of apoptosis protein) antagonists (e.g. smac7, smac4, small molecule smac mimetic, synthetic smac peptides (see Fulda et al., Nat. Med. 2002; 8:808-15), ISIS23722 (LY2181308), or AEG-35156 (GEM-640)), HDAC (histone deacetylase) inhibitors, CD20- antibodies (e.g., rituximab), angiogenesis inhibitors (e.g., bevacizumab), antiangiogenic agents targeting VEGF and VEGFR (e.g., AVASTIN®), synthetic triterpenoids (see Hyer et al. Cancer Research, 2005; 65:4799-808), c-FLIP (cell-activated FLICE protein) modulators (e.g., natural and synthetic PPARy (peroxisome proliferator-activated receptor γ) ligands, 5809354 or 5569100), kinase inhibitors (e.g., sorafenib), trastuzumab, cetuximab, temsirolimus, mTOR inhibitors such as rapamycin and temsirolimus, bortezomib, JAK2 inhibitors, HSP90 inhibitors, PI3K-AKT inhibitors, lenalildomide, GSK3P inhibitors, LAP inhibitors and/or genotoxic drugs.
Агонистические антитела к huCD40 и комбинированные виды терапии с помощью антител, описанные в настоящем документе, можно дополнительно использовать в комбинации с одним или несколькими антипролиферативными цитотоксическими средствами. Классы соединений, которые можно использовать в качестве антипролиферативных цитотоксических средств, включают в себя без ограничения следующие:The huCD40 agonist antibodies and combination antibody therapies described herein may further be used in combination with one or more antiproliferative cytotoxic agents. Classes of compounds that may be used as antiproliferative cytotoxic agents include, but are not limited to, the following:
Алкилирующие средства (включая в себя без ограничения азотистые иприты, производные этиленимина, алкилсульфонаты, нитрозомочевины и триазены): урациловый иприт, хлорметин, циклофосфамид (CYTOXAN™), фосфамид, мелфалан, хлорамбуцил, пипоброман, триэтиленмеламин, триэтилентиофосфорамин, бусульфан, кармустин, ломустин, стрептозоцин, дакарбазин и темозоломид.Alkylating agents (including but not limited to nitrogen mustards, ethyleneimine derivatives, alkyl sulfonates, nitrosoureas, and triazenes): uracil mustard, chlormethine, cyclophosphamide (CYTOXAN™), phosphamide, melphalan, chlorambucil, pipobroman, triethylenemelamine, triethylenethiophosphoramine, busulfan, carmustine, lomustine, streptozocin, dacarbazine, and temozolomide.
Антиметаболиты (включая в себя без ограничения антагонисты фолиевой кислоты, аналоги пириAntimetabolites (including but not limited to folate antagonists, pyridoxine analogues,
- 39 048278 мидина, аналоги пуринов и ингибиторы аденозиндезаминазы): метотрексат, 5-фторурацил, флоксуридин, цитарабин, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, флударабинфосфат, пентастатин и гемцитабин.- 39 048278 midines, purine analogues and adenosine deaminase inhibitors): methotrexate, 5-fluorouracil, floxuridine, cytarabine, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, fludarabine phosphate, pentastatin and gemcitabine.
Подходящие антипролиферативные средства для комбинации с агонистическими антителами к huCD40 без ограничения представляют собой следующее: таксаны, паклитаксел (паклитаксел коммерчески доступен как TAXOL™), доцетаксел, дискодермолид (DDM), диктиостатин (DCT), пелорузид А, эпотилоны, эпотилон А, эпотилон В, эпотилон С, эпотилон D, эпотилон Е, эпотилон F, фураноэпотилон D, дезоксиэпотилон Bl, [17]-дегидродезоксиэпотилон В, [18]-дегидродезоксиэпотилоны В, С12,13-циклопропил-эпотилон А, соединенный мостиком С6-С8 эпотилон А, транс-9,10-дегидроэпотилон D, цис-9,10дегидроэпотилон D, 16-десметилэпотилон В, эпотилон В10, дискодеромолид, патупилон (ЕРО-906), KOS-862, KOS-1584, ZK-EPO, ABJ-789, XAA296A (дискодермолид), TZT-1027 (соблидотин), ILX-651 (тасидотин гидрохлорид), халихондрин В, эрибулин мезилат (Е-7389), гемиастерлин (HTI-286), Е-7974, цирптофицины, LY-355703, иммуноконъюгаты майтансиноидов (DM-1), MKC-1, АВТ-751, T1-38067, T-900607, SB-715992 (испинезиб), SB-743921, MK-0731, STA-5312, элеутеробин, 17-бета-ацетокси-2этокси-6-оксо-В-гомо-эстра-1,3,5(10)-триен-3-ол, циклострептин, изолаулималид, лаулималид, 4-эпи-7дегидрокси-14,16-дидеметил-(+)-дискодермолиды и криптотилон 1, в дополнение к другим стабилизирующим микротрубочки средствам, известным в настоящей области техники.Suitable antiproliferative agents for combination with huCD40 agonist antibodies include, but are not limited to, the following: taxanes, paclitaxel (paclitaxel is commercially available as TAXOL™), docetaxel, discodermolide (DDM), dictyostatin (DCT), peloruside A, epothilones, epothilone A, epothilone B, epothilone C, epothilone D, epothilone E, epothilone F, furanoepothilone D, deoxyepothilone Bl, [17]-dehydrodeoxyepothilone B, [18]-dehydrodeoxyepothilones B, C12,13-cyclopropyl-epothilone A,C6 -C8 -bridged epothilone A, trans-9,10-dehydroepothilone D, cis-9,10dehydroepothilone D, 16-desmethylepothilone B, epothilone B10, discoderomolide, patupilone (EPO-906), KOS-862, KOS-1584, ZK-EPO, ABJ-789, XAA296A (discodermolide), TZT-1027 (soblidotin), ILX-651 (tasidotin hydrochloride), halichondrin B, eribulin mesylate (E-7389), hemiasterlin (HTI-286), E-7974, cirptophycins, LY-355703, maytansinoid immunoconjugates (DM-1), MKC-1, ABT-751, T1-38067, T-900607, SB-715992 (ispinesib), SB-743921, MK-0731, STA-5312, eleutherobin, 17-beta-acetoxy-2-ethoxy-6-oxo-B-homo-estra-1,3,5(10)-trien-3-ol, cyclostreptin, isolaulimalide, laulimalide, 4-epi-7-dehydroxy-14,16-didemethyl-(+)-discodermolide and cryptotilone 1, in addition to other microtubule stabilizing agents known in the art.
В тех случаях, когда желательно перевести аберрантно пролиферативные клетки в состояние покоя в сочетании с лечением агонистическими антителами к huCD40, описанными в настоящем документе или до него, гормоны и стероиды (включая в себя синтетические аналоги), такие как 17а-этинилэстрадиол, диэтилстильбестрол, тестостерон, преднизон, флуоксиместерон, дромостонолон пропионат, тестолактон, мегестролацетат, метилпреднизолон, метилстеростерон, преднизолон, триамцинолон, хлортрианизен, гидроксипрогестерон, аминоглютетимид, эстрамустин, медроксипрогестеронацетат, лейпролид, флутамид, торемифен, ZOLADEX™, также можно вводить пациенту. При использовании описанных в настоящем документе способов или композиций другие средства, применяемые для модуляции роста опухоли или метастазирования в клинических условиях, такие как антимиметики, также можно вводить по желанию.In cases where it is desirable to induce quiescence of aberrantly proliferating cells in combination with treatment with huCD40 agonist antibodies as described herein or previously, hormones and steroids (including synthetic analogs) such as 17a-ethinyl estradiol, diethylstilbestrol, testosterone, prednisone, fluoxymesterone, dromostonolone propionate, testolactone, megestrol acetate, methylprednisolone, methylsterosterone, prednisolone, triamcinolone, chlorotrianisene, hydroxyprogesterone, aminoglutethimide, estramustine, medroxyprogesterone acetate, leuprolide, flutamide, toremifene, ZOLADEX™ may also be administered to the patient. When using the methods or compositions described herein, other agents used to modulate tumor growth or metastasis in a clinical setting, such as antimimetics, may also be administered if desired.
Специалистам в настоящей области техники известны способы безопасного и эффективного введения химиотерапевтических средств. Кроме того, их введение описано в стандартной литературе. Например, введение многих химиотерапевтических средств описано в Справочнике врачей (PDR), например, издание 1996 года (Medical Economics Company, Montvale, N.J. 07645-1742, USA); раскрытие которого включено в настоящий документ посредством ссылки.Methods for safely and effectively administering chemotherapeutic agents are known to those skilled in the art. In addition, their administration is described in the standard literature. For example, the administration of many chemotherapeutic agents is described in the Physicians' Reference Manual (PDR), e.g., the 1996 edition (Medical Economics Company, Montvale, N.J. 07645-1742, USA); the disclosure of which is incorporated herein by reference.
Химиотерапевтическое(ие) средство(а) и/или лучевую терапию можно вводить в соответствии с терапевтическими протоколами, хорошо известными в настоящей области техники. Специалистам в настоящей области техники будет очевидно, что введение химиотерапевтического(их) средства(средств) и/или лучевой терапии может варьировать в зависимости от подвергаемого лечению заболевания и известных эффектов химиотерапевтического(их) средства(средств) и/или лучевой терапии на это заболевание. Кроме того, в соответствии со знаниями квалифицированного врача, терапевтические протоколы (например, количество доз и время введения) могут варьировать в зависимости от наблюдаемого влияния вводимых терапевтических средств на пациента и с учетом наблюдаемых ответов заболевания на вводимые терапевтические средства.The chemotherapeutic agent(s) and/or radiation therapy may be administered in accordance with therapeutic protocols well known in the art. It will be apparent to those skilled in the art that the administration of the chemotherapeutic agent(s) and/or radiation therapy may vary depending on the disease being treated and the known effects of the chemotherapeutic agent(s) and/or radiation therapy on that disease. In addition, in accordance with the knowledge of a skilled physician, the therapeutic protocols (e.g., the number of doses and the timing of administration) may vary depending on the observed effect of the administered therapeutic agents on the patient and taking into account the observed responses of the disease to the administered therapeutic agents.
Настоящее раскрытие дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, которые не следует толковать как дополнительное ограничение. Содержание всех фигур и всех ссылок, последовательностей Genbank, патентов и опубликованных заявок на выдачу патентов, приведенных в настоящем описании, явно включено в настоящий документ посредством ссылки.The present disclosure is further illustrated by the following examples, which should not be construed as further limiting. The contents of all figures and all references, Genbank sequences, patents and published patent applications cited in this specification are expressly incorporated herein by reference.
ПримерыExamples
Пример 1.Example 1.
Получение гуманизированных мышей CD40/FcyR.Generation of humanized CD40/FcyR mice.
Для создания точной и эффективной модели, которая может легко оценить активность человеческих Fc-вариантов к CD40 и обеспечить выбор оптимизированного клинического кандидата, создали уникальную мышиную модель, гуманизированную в отношении CD40 и FcyR. Сначала создавали гуманизированных в отношении CD40 мышей в дефицитном в отношении CD40 мыши генетическом окружении. Оценивали профиль экспрессии трансгена ВАС CD40 человека на различных популяциях иммунных клеток у указанных мышей и обнаружили, что экспрессия CD40 человека на популяциях присутствующих в крови В-клеток, дендритных клеток, моноцитов и макрофагов, но не на популяциях Т-клеток, нейтрофилов и NK-клеток является сходной с профилем, встречающимся на клетках человека и их мышиных ортологах (фиг. 1A).To create an accurate and efficient model that can readily assess the activity of human Fc variants to CD40 and enable the selection of an optimized clinical candidate, we generated a unique mouse model humanized for CD40 and FcyR. We first generated humanized CD40 mice in a mouse CD40-deficient genetic background. We assessed the expression profile of the human CD40 BAC transgene on various immune cell populations in these mice and found that human CD40 expression on blood-borne B cell, dendritic cell, monocyte, and macrophage populations, but not on T cell, neutrophil, and NK cell populations, was similar to that seen on human cells and their mouse orthologs (Fig. 1A).
Функциональность трансгена huCD40 у указанных мышей подтверждали путем оценки образования зародышевых центров (GC), процесса, для которого необходима передача сигналов CD40 (Basso et al. (2004), Blood, 104, 4088-4096). Наряду с тем, что CD40-/-мыши теряли способность образовывать GC, этот фенотип восстанавливался при введении трансгена huCD40, фиг. 1В, опосредовано взаимодействием huCD40 с мышиным лигандом CD40, который характеризуется кинетикой связывания и аффинностью,The functionality of the huCD40 transgene in these mice was confirmed by assessing germinal center (GC) formation, a process that requires CD40 signaling (Basso et al. (2004) Blood, 104, 4088–4096). While CD40-/- mice lost the ability to form GCs, this phenotype was restored by introduction of the huCD40 transgene, Fig. 1B, mediated by the interaction of huCD40 with the murine CD40 ligand, which is characterized by binding kinetics and affinity,
- 40 048278 сходными с лигандом CD40 человека, фиг. 2. CD40-/- мыши характеризовались дефицитным ответом антигенспецифических IgG при иммунизации, который восстанавливался при введении трансгена huCD40, фиг. 1С, подтверждая, что трансген hCD40 функционально взаимодополняет дефицит CD40 мыши. Обобщенно указанные данные демонстрируют, что гуманизированные в отношении CD40 мыши повторяют профиль экспрессии и функцию гена человека. Для создания мышиной модели, в которой можно оценить полностью человеческие агонистические IgG против CD40 человека, указанных гуманизированных в отношении CD40 мышей скрещивали с ранее описанными гуманизированными в отношении FcyR мышами (охарактеризованными подробно в (DiLillo and Ravetch (2015), Cell, 161, 1035-1045; Smith et al. 2012, PNAS (USA), 109, 6181-6186), получая в результате линию мышей, экспрессирующую CD40 человека и альфа-цепи генов FCGR1A, FCGR2AR131, FCGR2BI232, FCRG3AF158 и FCGR3B под контролем их эндогенных человеческих регуляторных элементов на изогенном генетическом окружении, из которого удалены гомологичные гены мыши.- 40 048278 similar to the human CD40 ligand, Fig. 2. CD40-/ - mice had a deficient antigen-specific IgG response upon immunization that was restored by administration of the huCD40 transgene, Fig. 1C, confirming that the hCD40 transgene functionally complements the mouse CD40 deficiency. Taken together, these data demonstrate that mice humanized for CD40 recapitulate the expression profile and function of the human gene. To generate a mouse model in which to evaluate fully human agonist IgGs against human CD40, these humanized CD40 mice were crossed with previously described humanized FcyR mice (characterized in detail in (DiLillo and Ravetch (2015), Cell, 161, 1035–1045; Smith et al. 2012, PNAS (USA), 109, 6181–6186)) to generate a mouse line expressing human CD40 and the alpha chains of FCGR1A, FCGR2AR131, FCGR2BI232, FCRG3AF158, and FCGR3B under the control of their endogenous human regulatory elements in an isogenic genetic environment from which the homologous mouse genes have been removed.
FcYRa-null мыши содержат делецию Fcgr2b, Fcgr3 и Fcgr4 α-цепи FcyR, и их скрещивают с FcyRI-/мышами (Barnes et al. 2002, Immunity, 16, 379-389. Их создавали в C57BL/6 генетическом окружении и определяли их характеристики, как описано ранее (Smith, et al. (2012), PHAS USA, 109, 6181-6186). Гуманизированных в отношении FcyR мышей (FcYRa-null, hFcYRI+, FcYRIIaR131+, FcYRIIb+, FcYRIIIaF158+ и FcYRIIIb+) создавали и разносторонне охарактеризовали, как описано ранее (Smith, et al. (2012), PNAS (USA), 109, 6181-6186). Трансгенных в отношении CD40 человека мышей получали в C57BL/6 генетическом окружении с помощью пронуклеарной инъекции линеаризированной ВАС ДНК RP11-177B15 (Osoegawa, et al. (2001), Genome Research 11, 483-496) и скрещивали с нокаутными в отношении CD40 (CD40-/-) мышами (The Jackson Laboratory) для получения CD40-/-huCD40+/+ мышей. CD40-/-huCD40+/+мышей скрещивали с гуманизированными в отношении FcyR мышами для получения гуманизированных в отношении CD40 и FcyR мышей (называемых hCD40/FcYR), содержащих генотип CD40-/hCD40+Fcgra-/-Fcgr-/-hFCGRI+hFCGRIIA+hFCGRIIB+hFCGRIIIA+hFCGRIIIB+. hCD40/hFcRIIB+/hFcRIIA+ и hCD40/hFcRIIB+/hFcRIIA- мышей, описанных на фиг. 4D, получали во время скрещивания, описанного для создания hCD40/FcYR мышей.FcYRa-null mice contain a deletion of the Fcgr2b, Fcgr3, and Fcgr4 α-chain of FcyR and are crossed with FcyRI-/ mice (Barnes et al. 2002, Immunity, 16, 379-389. They were generated in a C57BL/6 genetic background and characterized as previously described (Smith, et al. (2012), PHAS USA, 109, 6181-6186). FcyR-humanized mice (FcYRa-null, hFcYRI+ , FcYRIIaR131+ , FcYRIIb+ , FcYRIIIaF158+, and FcYRIIIb+ ) were generated and extensively characterized as previously described (Smith, et al. (2012), PNAS (USA), 109, 6181-6186). Human CD40 transgenic mice were generated in a C57BL/6 genetic background by pronuclear injection of linearized BAC DNA RP11-177B15 (Osoegawa, et al. (2001), Genome Research 11, 483-496) and crossed with CD40 knockout (CD40-/- ) mice (The Jackson Laboratory) to generate CD40-/- huCD40+/+ mice. CD40-/- huCD40+/+ mice were crossed with FcyR humanized mice to generate CD40 and FcyR humanized mice (called hCD40/FcYR) containing the CD40-/ hCD40+ Fcgra-/- Fcgr-/- hFCGRI+ genotype. hFCGRIIA+ hFCGRIIB+ hFCGRIIIA+ hFCGRIIIB+ . The hCD40/hFcRIIB+ /hFcRIIA+ and hCD40/hFcRIIB+ /hFcRIIA- mice described in Fig. 4D were obtained during the crossing described for the generation of hCD40/FcYR mice.
Пример 2.Example 2.
OVA-специфический Т-клеточный ответ.OVA-specific T cell response.
Мышей иммунизировали посредством i.p. инъекции с помощью 2 мкг DEC-OVA (mIgG1-D265A) (полученного, как описано ранее (Li and Ravetch (2011), Science, 333, 1030-1034) в присутствии или при отсутствии 10 мкг IgG к CD40 (за исключением ChiLob IgG, которые использовали в дозе 40 мкг/мышь) с одним из различных Fc. Через 7 дней периферическую кровь собирали и окрашивали с помощью тетрамера H-2b FITC-конъюгированного анти-CD4, АРС-конъюгированного анти-CD8α и РЕ-конъюгированного пептида OVA SIINFEKL (tet-OVA, Beckman Coulter) и анализировали на BD LSRForttesa.Mice were immunized by i.p. injection with 2 μg DEC-OVA (mIgG1-D265A) (prepared as described previously (Li and Ravetch (2011), Science, 333, 1030–1034)) in the presence or absence of 10 μg anti-CD40 IgG (except ChiLob IgG, which was used at 40 μg/mouse) with one of the different Fcs. After 7 days, peripheral blood was collected and stained with H-2 tetramerb FITC-conjugated anti-CD4, APC-conjugated anti-CD8α, and PE-conjugated OVA SIINFEKL peptide (tet-OVA, Beckman Coulter) and analyzed on a BD LSRForttesa.
Пример 3.Example 3.
Проточная цитометрия.Flow cytometry.
Клеточные популяции определяли с помощью следующих маркеров; DC (человек: HLA-DR'BDCA1'CD209'CD3-CD14CD19CD59-; мышь: CD11b+CD11c+MHCII+F4/80), моноциты (человек: CD14'HLA-DR'CD15-; мышь: СО11ЬЪу6СТ4/80-СО11с-). макрофаги (человек: CD14+CD68+; мышь: CD11b+F4/80+Ly6C-Ly6G-): В-клетки (человек: CD19+; мышь: В220+), Т-клетки (человек: CD3+CD56-; мышь: CD3), NK-клетки (человек: CD16+CD56+CD3-; мышь: NK1.1), нейтрофилы (человек: CD15+CD16+CD49d-; мышь: CD11b+Ly6G+Ly6CmtF4/80).Cell populations were determined using the following markers: DC (human: HLA-DR'BDCA1'CD209'CD3- CD14CD19CD59- ; mouse: CD11b+ CD11c+ MHCII+ F4/80), monocytes (human: CD14'HLA-DR'CD15- ; mouse: CD11ЬЬу6CT4/80- CD11c- ). macrophages (human: CD14+CD68+; mouse: CD11b+ F4/80+ Ly6C-Ly6G- ), B cells (human: CD19+; mouse: B220+ ), T cells (human: CD3+CD56- ; mouse: CD3), NK cells (human: CD16+CD56+CD3- ; mouse: NK1.1), neutrophils (human: CD15+ CD16+CD49d- ; mouse: CD11b+ Ly6G+ Ly6Cmt F4/80).
Пример 4.Example 4.
Иммунизация H1N1.H1N1 immunization.
Мышей иммунизировали с помощью рекомбинантного H1N1 гриппа (Sino Biological Inc.) в присутствии Alum в качестве адъюванта. Через 11 дней кровь собирали и анализировали в отношении специфического к H1N1 гриппа IgG с использованием стандартного протокола ELISA.Mice were immunized with recombinant H1N1 influenza (Sino Biological Inc.) in the presence of Alum as an adjuvant. After 11 days, blood was collected and analyzed for H1N1 influenza-specific IgG using a standard ELISA protocol.
Пример 5.Example 5.
SPR.SPR.
Все эксперименты проводили с помощью системы поверхностного плазмонного резонанса (SPR) Biacore T100 (Biacore, GE Healthcare), как описано ранее (Bournazos, et al., 2014, Cell, 158, 1243-1253). Вкратце, эксперименты проводили при 25°C в HBS-EP+ буфере (10 мМ HEPES, pH 7,4; 150 мМ NaCl; 3,4 мМ EDTA; 0,005% (об./об.) поверхностно-активного вещества Р20). Для измерения аффинности варианты подкласса IgG для FcyR и IgG к рекомбинантному CD40 иммобилизовали на чипах Series S CM5 с помощью аминного сочетания и растворимые эктодомены образцов FcyR или CD40 вводили через проточные ячейки при различных концентрациях. Для некоторых FcyR измерения повторяли в противоположной ориентации при иммобилизации FcyR и введении растворимых IgG. Вычитали фоновое связывание с холостыми иммобилизованными проточными ячейками и константы аффинности рассчитывали с использованием программного обеспечения оценки BIAcore T100 (GE Healthcare) с использованием 1:1 модели связывания Ленгмюра.All experiments were performed using a Biacore T100 surface plasmon resonance (SPR) system (Biacore, GE Healthcare) as described previously (Bournazos, et al., 2014, Cell, 158, 1243-1253). Briefly, experiments were performed at 25°C in HBS-EP+ buffer (10 mM HEPES, pH 7.4; 150 mM NaCl; 3.4 mM EDTA; 0.005% (v/v) surfactant P20). To measure the affinity, IgG subclass variants of FcyR and IgG to recombinant CD40 were immobilized on Series S CM5 chips using amine coupling and soluble ectodomains of FcyR or CD40 samples were introduced through the flow cells at different concentrations. For some FcyRs, measurements were repeated in the opposite orientation with FcyR immobilized and soluble IgG introduced. Background binding to blank immobilized flow cells was subtracted and affinity constants were calculated using BIAcore T100 evaluation software (GE Healthcare) using a 1:1 Langmuir binding model.
- 41 048278- 41 048278
Пример 6.Example 6.
Конкурентный анализ на основе SPR.Competitive analysis based on SPR.
Конкурентные эксперименты SPR проводили на приборе Biacore T100 с использованием подвижного буфера, содержащего 10 мМ фосфата натрия, 130 мМ хлорида натрия, 0,05% Tween 20, pH 7,1 при 25°C, на поверхности, состоящей из hCD40-Fc, иммобилизованного на сенсорном чипе СМ5, с использованием стандартного аминного сочетания. Конкуренцию за связывание с hCD40L-Fc оценивали с использованием функции двойная инъекция (dual injection) в управляющем программном обеспечении Т100 путем инъекции молекулы 1 (исходное антитело или CD40L), сразу за которой следует инъекция концентрации молекулы 1 или смеси молекулы 1 вместе с молекулой 2. Ответы связывания сравнивали с контрольной инъекцией молекулы 2 отдельно. Все эксперименты проводили с использованием 180 с периодов времени ассоциации и диссоциации со скоростью потока, составляющей 30 мкл/мин. Поверхность успешно восстанавливали между циклами с использованием двух 15 с импульсов, содержащих 10 мМ глицина, pH 1,5 со скоростью потока, составляющей 30 мкл/мин.SPR competition experiments were performed on a Biacore T100 instrument using a running buffer containing 10 mM sodium phosphate, 130 mM sodium chloride, 0.05% Tween 20, pH 7.1 at 25°C on a surface consisting of hCD40-Fc immobilized on a CM5 sensor chip using standard amine coupling. Competition for binding to hCD40L-Fc was assessed using the dual injection function in the T100 control software by injecting molecule 1 (parent antibody or CD40L) immediately followed by an injection of a concentration of molecule 1 or a mixture of molecule 1 and molecule 2. Binding responses were compared to a control injection of molecule 2 alone. All experiments were performed using 180 s association and dissociation times at a flow rate of 30 μL/min. The surface was successfully recovered between cycles using two 15 s pulses containing 10 mM glycine, pH 1.5 at a flow rate of 30 μL/min.
Пример 7.Example 7.
ELISA связывания CD40.CD40 binding ELISA.
Специфичность и аффинность связывания подклассов IgG определяли с помощью ELISA с использованием рекомбинантного CD40 (Sino Biological Inc.). Планшеты для ELISA (Nunc) покрывали в течение ночи при 4°C с помощью рекомбинантного внеклеточного домена CD40 человека (1 мкг/лунка). Все последующие стадии проводили при комнатной температуре. После отмывки планшеты блокировали в течение 1 ч с помощью PBS/2% обезжиренного молока и впоследствии инкубировали в течение 1 ч с серийно разведенными IgG (1:3 последовательные разведения в PBS/2% обезжиренном молоке). После отмывки планшеты инкубировали в течение 1 ч с конъюгированным с HRP антителом к IgG человека (Jackson ImmunoResearch). Обнаружение проводили с использованием двухкомпонентного набора субстрата пероксидазы (KPL) и реакции останавливали с помощью добавления 1 М ортофосфорной кислоты. Поглощение при 405 нм регистрировали сразу с использованием спектрофотометра SpectraMax Plus (Molecular Devices) и вычитали фоновое поглощение из образцов - отрицательного контроля.The specificity and binding affinity of IgG subclasses were determined by ELISA using recombinant CD40 (Sino Biological Inc.). ELISA plates (Nunc) were coated overnight at 4°C with recombinant human CD40 extracellular domain (1 μg/well). All subsequent steps were performed at room temperature. After washing, plates were blocked for 1 h with PBS/2% skim milk and subsequently incubated for 1 h with serially diluted IgGs (1:3 serial dilutions in PBS/2% skim milk). After washing, plates were incubated for 1 h with HRP-conjugated anti-human IgG (Jackson ImmunoResearch). Detection was performed using a two-component peroxidase substrate kit (KPL) and reactions were stopped by the addition of 1 M phosphoric acid. Absorbance at 405 nm was recorded immediately using a SpectraMax Plus spectrophotometer (Molecular Devices) and background absorbance was subtracted from negative control samples.
Пример 8.Example 8.
Создание и получение Fc-вариантов к CD40.Creation and production of Fc variants to CD40.
Вариабельные тяжелые и легкие области клона 21.4.1 Ab к CD40 человека (патент США № 7338660) синтезировали (Genwize) и клонировали в экспрессионные векторы млекопитающего с каркасами IgG1 человека, IgG2 человека или каппа Fc человек, как описано ранее (Li and Ravetch (2011), Science, 333, 1030-1034). Для создания вариантов Fc-домена IgG1 человека (N297A, S267E, S267E/L328F, G237D/P238D/P271G/A330R, G237D/P238D/H268D/P271G/A330R) и IgG2 человека (C127S, C232S), сайтнаправленный мутагенез с использованием специфических праймеров проводили на основании набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange site-directed mutagenesis Kit II (Agilent Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Мутированные последовательности плазмиды подтверждали путем прямого секвенирования (Genewiz).The variable heavy and light regions of the human CD40 Ab clone 21.4.1 (U.S. Patent No. 7,338,660) were synthesized (Genwize) and cloned into mammalian expression vectors with human IgG1, human IgG2, or human kappa Fc backbones as described previously (Li and Ravetch (2011), Science, 333, 1030-1034). To generate Fc domain variants of human IgG1 (N297A, S267E, S267E/L328F, G237D/P238D/P271G/A330R, G237D/P238D/H268D/P271G/A330R) and human IgG2 (C127S, C232S), site-directed mutagenesis using specific primers was performed using the QuikChange site-directed mutagenesis Kit II (Agilent Technologies) according to the manufacturer's instructions. Mutated plasmid sequences were confirmed by direct sequencing (Genewiz).
Антитела создавали путем транзиентной трансфекции клеток HEK293T (АТСС), очищали с использованием смолы Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare), подвергали диализу в PBS и подвергали стерилизационному фильтрованию (0,22 мм), как описано ранее (Nimmerjahn, et al. (2005), Immunity, 23, 41-51). Чистоту оценивали с помощью SDS-PAGE и окрашивания Кумасси, и, по оценкам, она составляла >90%. Ab, используемые для in vivo экспериментов, количественно оценивали в отношении примесей эндотоксина (LPS) с помощью анализа лизата амёбоцитов мечехвоста (LAL) и подтверждали, что они характеризуются уровнями <0,1 ЕЭ/мкг. Поликлональный IgG человека приобретали у Bio X Cell.Antibodies were generated by transient transfection of HEK293T cells (ATCC), purified using Protein G Sepharose 4 Fast Flow resin (GE Healthcare), dialyzed into PBS, and sterilize-filtered (0.22 mm) as described previously (Nimmerjahn, et al. (2005), Immunity, 23, 41-51). Purity was assessed by SDS-PAGE and Coomassie staining and was estimated to be >90%. Abs used for in vivo experiments were quantified for endotoxin impurity (LPS) using the horseshoe crab amoebocyte lysate (LAL) assay and confirmed to have levels of <0.1 EU/μg. Human polyclonal IgG was purchased from Bio X Cell.
Пример 9.Example 9.
Стимуляция и лечение опухоли.Tumor stimulation and treatment.
Клетки МС38 (2x106) имплантировали подкожно и объемы опухоли измеряли каждые 2-3 дня с помощью электронного циркуля и регистрировали в виде объема с использованием формулы (L12xL2)/2, где L1 представляет собой самый короткий диаметр и L2 представляет собой самый длинный диаметр. Через 7 дней после инокуляции опухоли мышей рандомизировали по размеру опухоли (день 0) и вводили интраперитонеальную (i.p) инъекцию 200 мкг IgG к CD40 или контрольных IgG. Мыши получали дополнительное лечение 200 мкг IgG на 3 день. Для модели метастазирования в легкие В16 мышам вводили инъекцию внутривенно с 1x106 B16-F10 клетками и лечили с помощью 40 мкг указанных Ab в дни 1 и 4 после инъекции опухолевых клеток. На 14 день легкие собирали и анализировали в отношении присутствия поверхностных очагов метастазирования с использованием препаровальной лупы.MC38 cells (2x106) were implanted subcutaneously and tumor volumes were measured every 2-3 days with an electronic caliper and reported as volume using the formula (L12xL2 )/2 , where L1 is the shortest diameter and L2 is the longest diameter. Seven days after tumor inoculation, mice were randomized by tumor size (day 0) and givenan intraperitoneal (ip) injection of 200 μg of anti-CD40 IgG or control IgG. Mice received an additional treatment with 200 μg of IgG on day 3. For the B16 lung metastasis model, mice were injected intravenously with 1x106B16 -F10 cells and treated with 40 μg of the indicated Abs on days 1 and 4 after tumor cell injection. On day 14, the lungs were collected and analyzed for the presence of superficial foci of metastasis using a dissecting microscope.
Пример 10.Example 10.
Создание клинических кандидатов Fc-вариантов к CD40 человека.Generation of clinical candidates for Fc variants to human CD40.
Для исследования того, требует ли in vivo активность IgG человека, нацеленных на CD40 человека, взаимодействия с huFcYRIIB, и определить, можно ли такие взаимодействия дополнительно сконструировать для оптимизации активности исходного антитела, вариабельные области клона к 2141CD40 (СР-870,893, изначально изотип IgG2) клонировали в Fc-модифицированные Ab с различной способноTo investigate whether the in vivo activity of human IgGs targeting human CD40 requires interaction with huFcYRIIB and to determine whether such interactions could be further engineered to optimize the activity of the parent antibody, the variable regions of the anti-2141CD40 clone (CP-870,893, originally an IgG2 isotype) were cloned into Fc-modified Abs with varying levels of
- 42 048278 стью взаимодействовать с FcyR человека. Они включают в себя относящиеся к дикому типу IgG1 человека и серию мутированных IgG1 с увеличенными аффинностями связывания по отношению к huFcYRIIB. ELISA, фиг. 1D, и SPR (табл. 3) подтвердили, что различные Fc-домены, введенные в Ab клона 2141 не изменяли ни их специфичность связывания, ни их аффинность по отношению к CD40 человека. В табл. 4 обобщенно представлены аффинности различных Fc-вариантов клона 2141 к рекомбинантным huFcYRI, hFcYRIIA, huFcYRIIB и huFcYRIIIA, что оценивали с помощью SPR.- 42 048278 ability to interact with human FcγR. These include wild-type human IgG1 and a series of mutated IgG1s with increased binding affinities for huFcYRIIB. ELISA (Fig. 1D) and SPR (Table 3) confirmed that the different Fc domains introduced into clone 2141 Ab did not alter either their binding specificity or their affinity for human CD40. Table 4 summarizes the affinities of the different Fc variants of clone 2141 for recombinant huFcYRI, hFcYRIIA, huFcYRIIB, and huFcYRIIIA, as assessed by SPR.
Таблица 3Table 3
Аффинности Fc-вариантов клона 21.4.1 к CD40 человека Гтс-Еариаи~.....lidlTc! ~ кгм'м) |·ί····ι·ιι·ιι^ 7 :.r! i .’.Г- 1 Ί Ι;ι ig(n-.s267E/i.:rz8F ι ~ лг in' |Affinities of Fc variants of clone 21.4.1 to human CD40 GTc -Earia and~.....lidlTc! ~ kgm'm) |·ί····ι·ιι·ιι^ 7 :.r! i .'.Г- 1 Ί Ι;ι ig(n-.s267E/i.:rz8F ι ~ lg in' |
IgGI G2:?7D/P2:nm/H2r>8D -ι..IgGI G2:?7D/P2:nm/H2r>8D -ι..
/Р27 TG/ЛЛЗОП(VI M/P27 TG/LLZOP(VI M
IgG2 3,486*10* 1.081*10* 3.101*10* igi’,2- O32S (i^GZA) ΛΊΡΐι·'·' μιIgG2 3.486*10* 1.081*10* 3.101*10* igi’,2- O32S (i^GZA) ΛΊΡΐι·'·' μι
JgGa-O2Z£t«gGaB);: /. < 1..09640^ 3.088-.10^1JgG aO2 Z£t«gGaB); :/. < 1..09640^ 3.088-.10^1
Константы связывания получали с помощью анализа SPR с иммобилизованными IgG и растворимым CD40.Binding constants were obtained using SPR assays with immobilized IgG and soluble CD40.
Таблица 4Table 4
Константы связывания получали с помощью анализа SPR. Кратность=KD(IgG 1 )/KD(F c-вариант).Binding constants were obtained by SPR analysis. Fold = KD (IgG 1 )/KD (F c variant).
n. d. b, нет обнаруживаемого связывания; NA, нет данных.n.d.b, no detectable binding; NA, no data available.
Значения KD и кратность изменений по сравнению с IgG1 дикого типа для мутанта SE получали из ссылок (Smith et al. и Chu et al., 2008).KD values and fold changes compared to wild-type IgG1 for the SE mutant were obtained from references (Smith et al. and Chu et al., 2008).
Пример 11.Example 11.
Взаимодействие с FcyR необходимо для in vivo активности человеческих mAb к CD40.Interaction with FcyR is required for the in vivo activity of human mAbs to CD40.
Наряду с тем, что изотип IgG1 характеризуется относительно высокой аффинностью взаимодействий со всеми FcyR человека, изотип IgG2 СР-870,893 характеризуется очень низкими аффинностями связывания с FcyR человека, за исключением FcyRIIAH131 (фиг. 3A и табл. 4). Эффективность изотипов IgG1 и IgG2 к CD40 in vivo в контексте FcyR человека сравнивали путем исследования их способности активировать и осуществлять экспансию Т-клеток в гуманизированной в отношении CD40/FcyR модели. Овалбумин (OVA) доставляли к дендритным клеткам с помощью химерного Ab к DEC205, конъюгированного с OVA (DEC-OVA (Li and Ravetch (2011), Science, 333, 1030-1034)) вместе с любым из IgG1-Fc человека, IgG2-Fc человека или N297A Fc-null подклассов mAb к CD40 СР-870,893 и подвергали мониторингу в отношении присутствия OVA-специфических Т-клеток в кровотоке через 7 дней (фиг. 3B). Наряду с тем, что как изотип IgG1, так и изотип IgG2 характеризовались адъювантными эффектами на Т-клеточную активацию, IgG1 приводил к значительно более высокому Т-клеточному ответу по сравнению с изотипом IgG2 одного и того же клона к CD40. Активность IgG1 полностью отменялась путем введения мутации N297A, которая предотвращает связывание с FcyR, указывая на то, что взаимодействие с FcyR необходимо для агонистической активности IgG1 к CD40. Значительная активность IgG2 утрачивалась при исследовании в виде дегликозилированной формы, которая характеризуется сниженной аффинностью связывания с FcYRIIb по сравнению с IgG2 дикого типа. Это указывает также на FcYR-зависимую активность IgG2 к CD40 и дает основание предположить, что относительно сниженную активность IgG2 по сравнению с изотипом IgG1 можно объяснить его низкими аффинностями связываWhile the IgG1 isotype has relatively high affinity interactions with all human FcyRs, the IgG2 isotype CP-870,893 has very low binding affinities for human FcyRs except FcyRIIAH131 (Fig. 3A and Table 4). The in vivo potency of IgG1 and IgG2 isotypes for CD40 in the context of human FcyRs was compared by examining their ability to activate and expand T cells in a humanized CD40/FcyR model. Ovalbumin (OVA) was delivered to dendritic cells using a chimeric anti-DEC205 Ab conjugated to OVA (DEC-OVA (Li and Ravetch (2011) Science, 333, 1030–1034)) together with either the human IgG1-Fc, human IgG2-Fc, or N297A Fc-null subclasses of the anti-CD40 mAb CP-870,893 and monitored for the presence of OVA-specific T cells in the circulation after 7 days (Fig. 3B). While both IgG1 and IgG2 isotypes had adjuvant effects on T cell activation, IgG1 resulted in significantly higher T cell responses compared to the IgG2 isotype of the same anti-CD40 clone. IgG1 activity was completely abolished by introducing the N297A mutation, which prevents binding to FcyR, indicating that interaction with FcyR is required for the agonist activity of IgG1 for CD40. Significant activity of IgG2 was lost when tested as a deglycosylated form, which has reduced binding affinity for FcYRIIb compared to wild-type IgG2. This also indicates that the activity of IgG2 for CD40 is FcYR-dependent and suggests that the relatively reduced activity of IgG2 compared to the IgG1 isotype may be explained by its lower binding affinities.
- 43 048278 ния с FcyR человека. В отличие от этого вывода, агонистическая активность антитела к CD40 подкласса IgG2, как предполагали, являлась FcYR-независимой и представляла собой результат уникальной конфигурации шарнира IgG2 (White, et al. (2015), Cancer Cell, 27, 138-148), опосредованной перетасованными дисульфидными связями между шарниром IgG2 и областями СН1. Для исследования этой возможности конкретные цистеины СР-870,893 мутировали, что привело к замкнутым конформационным формам классической Y-конформации IgG2-A и более компактной конформации IgG2-B, полученной с помощью мутаций C232S и C127S соответственно (Allen et al. 2009, Biochemistry, 48, 3755-3766). Обе формы IgG2 приводят к активности, сходной с IgG2 дикого типа, указывая на то, что конформация шарнирной области не определяет in vivo агонистическую активность изотипа IgG2 этого клона Ab в контексте FcyR человека. Более того, in vivo агонистическая активность форм IgG2-A и IgG2-B СР-870,893 в трансгенных в отношении CD40 человека мышах в генетическом окружении либо FcyR мыши, либо FcyR человека сравнивали и обнаружили, что в окружении FcyR мыши только форма IgG2-B является активной, тогда как в окружении FcyR человека обе формы характеризуются значительной и сходной активностью. Данные, полученные для Ab СР-870,893, дополнительно поддерживают сходную иерархию в агонистической активности, наблюдаемую для IgG1 и форм 2А и 2В подкласса IgG2 ChiLob 7/4, другого агонистического клона Ab к CD40 человека, который распознает эпитоп, отличный от 2141. Наряду с тем, что подкласс IgG2 ChiLob 7/4, как сообщалось, характеризуется превосходной активностью по сравнению с его формой IgG1 при отсутствии или в присутствии FcyR мыши, также наблюдали, что для этого клона в присутствии FcyR человека подкласс IgG1 превосходит IgG2 и что обе конформационные формы IgG2 характеризуются сходной активностью. Как наблюдалось для СР-870,893, при анализе на huCD40/mFcYR мышах только форма IgG2-B является активной и приводит к значительно усиленной активности по сравнению с IgG2-A.- 43 048278 interaction with human FcyR. In contrast to this finding, the agonist activity of the IgG2 subclass antibody to CD40 was suggested to be FcYR-independent and was a result of a unique IgG2 hinge configuration (White, et al. (2015), Cancer Cell, 27, 138-148), mediated by shuffled disulfide bonds between the IgG2 hinge and CH1 regions. To investigate this possibility, specific cysteines of CP-870,893 were mutated, resulting in closed conformational forms of the classical Y-conformation of IgG2-A and a more compact conformation of IgG2-B obtained by C232S and C127S mutations, respectively (Allen et al. 2009, Biochemistry, 48, 3755-3766). Both forms of IgG2 result in activity similar to wild-type IgG2, indicating that the hinge conformation does not determine the in vivo agonist activity of the IgG2 isotype of this Ab clone in the context of human FcyR. Furthermore, the in vivo agonist activity of the IgG2-A and IgG2-B forms of CP-870,893 in human CD40 transgenic mice in the genetic background of either mouse FcyR or human FcyR was compared and it was found that in the mouse FcyR context only the IgG2-B form was active, whereas in the human FcyR context both forms had significant and similar activity. The data obtained for Ab CP-870,893 further support the similar hierarchy in agonist potency observed for IgG1 and the 2A and 2B forms of the IgG2 subclass of ChiLob 7/4, another agonist clone of Ab to human CD40 that recognizes an epitope distinct from 2141. While the IgG2 subclass of ChiLob 7/4 was reported to have superior potency compared to its IgG1 form in the absence or presence of murine FcyR, it was also observed that for this clone, in the presence of human FcyR, the IgG1 subclass was superior to IgG2 and that both conformational forms of IgG2 had similar potency. As observed for CP-870,893, when assayed in huCD40/mFcYR mice, only the IgG2-B form was active and resulted in significantly enhanced potency compared to IgG2-A.
Эти данные указывают на то, что в физиологическом контексте FcyR человека in vivo активность агонистических, человеческих IgG к CD40 зависит от взаимодействия с FcyR, но не от их конформации шарнира. Важно, что данные подчеркивают преимущество использования гуманизированной в отношении FcyR мышиной модели для изучения надлежащим образом активности IgG человека. Учитывая взаимодействие IgG человека с FcyR человека, указанные мыши позволяют избежать противоречивых результатов, которые можно получить с использованием IgG человека в моделях, содержащих FcyR мыши.These data indicate that in the physiological context of human FcyR, the in vivo activity of agonistic human IgGs to CD40 depends on the interaction with FcyRs but not on their hinge conformation. Importantly, the data highlight the advantage of using a humanized FcyR mouse model to properly study the activity of human IgG. Given the interaction of human IgG with human FcyRs, these mice avoid the inconsistent results that can be obtained using human IgG in mouse FcyR-containing models.
Пример 12.Example 12.
Оптимизированная активность IgG к CD40 человека, достигаемая с помощью Fc-вариантов, усиленных в отношении связывания с FcyRIIB, но не с FcyRIIA.Optimized anti-human CD40 IgG activity achieved with Fc variants enhanced for binding to FcγRIIB but not FcγRIIA.
Далее определяли, будет ли увеличение взаимодействий связывания между человеческими антителами к CD40 и hFcYRlIB приводить в результате к увеличенной in vivo эффективности. Аффинность и селективность связывания IgG человека с hFcYRIIB можно увеличить с помощью мутагенеза их Fc-домена. Fc-варианты СР-870,893, несущие точечные мутации S267E (SE) и S267E/L328F (SELF) (Chu et al. (2008), Molecular Immunology, 45, 3926-3933), дают в результате 30- и 70-кратно увеличенную аффинность связывания с hFcYRlIB, соответственно фиг. 4А и табл. 4). При введении гуманизированным в отношении FcyR/CD40 мышам указанные Fc-варианты приводят к небольшому, но значимому увеличению их способности активировать Т-клетки in vivo по сравнению как с IgG1 дикого типа, так и вариантами IgG2 СР-870,893, фиг. 4В).It was next determined whether increasing the binding interactions between human anti-CD40 antibodies and hFcYRlIB would result in increased in vivo potency. The binding affinity and selectivity of human IgG for hFcYRIIB can be increased by mutagenesis of their Fc domain. Fc variants of CP-870,893 carrying the S267E (SE) and S267E/L328F (SELF) point mutations (Chu et al. (2008) Molecular Immunology, 45, 3926–3933) result in 30- and 70-fold increased binding affinity for hFcYRlIB, respectively (Fig. 4A and Table 4). When administered to FcyR/CD40 humanized mice, these Fc variants resulted in a small but significant increase in their ability to activate T cells in vivo compared to both wild-type IgG1 and the IgG2 variants CP-870,893 (Fig. 4B).
Благодаря сходству последовательностей и структурному сходству между hFcYRIIA и hFcYRIIB мутации SE и SELF также приводят к увеличенной аффинности связывания с активирующим hFcYRIIA. Следовательно, несмотря на увеличение их аффинности связывания с ингибирующим hFcYRIIB, соотношение аффинностей связывания с FcyRIIA/FcyRIIB указанных мутированных IgG является сходным с таковым у IgG1 дикого типа, и таким образом, как было предсказано, приводят к ограниченной активности этого подкласса, как это наблюдалось на фиг. 4В. Для оптимизации взаимодействия FcyRIIB с Fc при отсутствии FcyRIIA создали Fc-варианты СР-870,893 с недавно описанными мутациями, G237D/P238D/P271G/A330R (V9) и G237D/P238D/H268D/P271G/A330R (V11), которые усиливают аффинность связывания специфически по отношению к hFcYRlIB, но не к hFcYRIIA (Mimoto et al. (2013), PEDS, 26, 589-598). Fc-варианты V9-CP-87O,893 и V11-CP-870,893 приводят к 32- и 97-кратно увеличенной аффинности связывания с hFcYRlIB и приблизительно 3-кратно сниженной аффинности связывания с hFcYRIIAR131, фиг. 4А и табл. 4). Оба Fc-варианта V9 и V11 характеризуются значительно улучшенной in vivo активностью по сравнению с подклассом IgG2 СР-870,893 (IgG2), и его SE- и SELF-Fc варианты характеризуются усиленной аффиностью в отношении как hFcYRIIB, так и hFcYRIIA. Вариант 2141-V11 приводит к 25-кратному увеличению Т-клеточной активации по сравнению с CP-870,893-IgG2 и 5-кратному увеличению по сравнению с активностью, полученной с помощью SELF-варианта, фиг. 4В. Сходную иерархию наблюдали для Fc-вариантов СР-870,893, когда изменение массы тела определяли после введения антител, фиг. 5А. Наряду с тем, что все исследуемые Fc-варианты приводили к статистически значимым снижениям массы тела после однократной инъекции антитела к CD40, группа, которой вводили инъекцию VH-варианта СР-870,893, характеризовалась наиболее значимым снижением.Due to the sequence and structural similarity between hFcYRIIA and hFcYRIIB, the SE and SELF mutations also result in increased binding affinity for the activating hFcYRIIA. Therefore, despite the increase in their binding affinity for the inhibitory hFcYRIIB, the FcyRIIA/FcyRIIB binding affinity ratio of these mutated IgGs is similar to that of wild-type IgG1, and thus is predicted to result in limited activity of this subclass, as observed in Fig. 4B. To optimize the interaction of FcyRIIB with Fc in the absence of FcyRIIA, Fc variants of CP-870,893 were generated with recently described mutations, G237D/P238D/P271G/A330R (V9) and G237D/P238D/H268D/P271G/A330R (V11), which enhance binding affinity specifically for hFcYRlIB but not for hFcYRIIA (Mimoto et al. (2013), PEDS, 26, 589–598). The V9-CP-870,893 and V11-CP-870,893 Fc variants result in 32- and 97-fold increased binding affinity for hFcYRlIB and approximately 3-fold decreased binding affinity for hFcYRIIAR131 (Fig. 4A and Table 4). Both the V9 and V11 Fc variants have significantly improved in vivo potency compared to the IgG2 subclass of CP-870,893 (IgG2), and its SE- and SELF-Fc variants have enhanced affinity for both hFcYRIIB and hFcYRIIA. The 2141-V11 variant resulted in a 25-fold increase in T cell activation compared to CP-870,893-IgG2 and a 5-fold increase compared to the activity obtained with the SELF variant, Figure 4B. A similar hierarchy was observed for the CP-870,893 Fc variants when body weight changes were measured following antibody administration, Figure 5A. While all Fc variants tested resulted in statistically significant decreases in body weight following a single injection of anti-CD40 antibody, the group injected with the CP-870,893 VH variant had the most significant decrease.
- 44 048278- 44 048278
Анализировали фармакокинетические (PK) свойства указанных Fc-вариантов для исследования того, приводят ли их различающееся связывание с FcyR к различающимся PK скоростям клиренса, что может объяснять их различающиеся агонистические активности. Обнаружили, что SELF и V11 Fc-варианты СР-870,893 характеризуются более быстрой скоростью клиренса, чем подкласс IgG2 (фиг. 4В), предположительно, в результате их усиленной активности связывания с FcRIIB. Тем не менее, несмотря на тот факт того, что SELF и V11 характеризуются более быстрыми скоростями клиренса, они проявляют превосходную агонистическую активность по сравнению с IgG2. Аналогично, несмотря на сходные PK свойства SELF и V11, V11 является превосходным агонистом по сравнению с SELF. Поэтому исключено, что возможность того, что различные свойства PK этих Fc-вариантов объясняют их агонистическую активность.The pharmacokinetic (PK) properties of these Fc variants were analyzed to investigate whether their differential binding to FcγR resulted in differential PK clearance rates that could explain their differential agonist activities. We found that SELF and V11 Fc variants of CP-870,893 had faster clearance rates than the IgG2 subclass (Figure 4B), presumably as a result of their enhanced binding activity to FcRIIB. However, despite the fact that SELF and V11 had faster clearance rates, they exhibited superior agonist activity compared to IgG2. Similarly, despite the similar PK properties of SELF and V11, V11 was a superior agonist compared to SELF. Therefore, we ruled out the possibility that the differential PK properties of these Fc variants explained their agonist activity.
Влияние взаимодействия с hFcYRIIA на активность СР-870,893 оценивали путем сравнения его активности у мышей, трансгенных в отношении CD40 человека и FcyRIIB человека, но не в отношении FcyRIIA, или мышей, трансгенных в отношении CD40 человека, FcyRIIB человека и FcyRIIA человека (фиг. 4С). Эффективность Т-клеточной активации CP-870,893-IgG2 значимо усиливалась при отсутствии FcyRIIA, указывая на отрицательную роль взаимодействия с FcyRIIA на агонистическую активность этого mAb к CD40.The effect of interaction with hFcYRIIA on the activity of CP-870,893 was assessed by comparing its activity in mice transgenic for human CD40 and human FcYRIIB but not for FcYRIIA, or mice transgenic for human CD40, human FcYRIIB, and human FcYRIIA (Fig. 4C). The efficiency of T cell activation by CP-870,893-IgG2 was significantly enhanced in the absence of FcYRIIA, indicating a negative role of interaction with FcYRIIA on the agonist activity of this mAb to CD40.
Настоящее изобретение демонстрирует, что инженерия СР-890,873 для усиленного взаимодействия с hFc','RIIB при сохранении низкого соотношения связывания FcyRIIA/FcyRIIB приводит к оптимизированной in vivo агонистической активности человеческих IgG к CD40.The present invention demonstrates that engineering CP-890,873 for enhanced interaction with hFc','RIIB while maintaining a low FcγRIIA/FcγRIIB binding ratio results in optimized in vivo human IgG anti-CD40 agonist activity.
Увеличенную иммуностимулирующую активность за счет селективного усиления связывания FcyRIIB продемонстрировали для mAb 2141 (СР-870,893), которое не блокирует связывание hCD40 с CD40L, демонстрируя, что агонистические человеческие mAb к CD40 можно оптимизировать за счет селективного усиления FcYRIIB-связывания посредством Fc-инженерии независимо от их связывающих эпитопов и их способности перекрестно блокировать связывание CD40L с CD40.Enhanced immunostimulatory activity by selectively enhancing FcγRIIB binding was demonstrated for mAb 2141 (CP-870,893), which does not block hCD40 binding to CD40L, demonstrating that agonistic human CD40 mAbs can be optimized by selectively enhancing FcγRIIB binding through Fc engineering regardless of their binding epitopes and their ability to cross-block CD40L binding to CD40.
Важность взаимодействий с FcyR для наиболее эффективного mAb к CD40 человека продемонстрировали в клинической практике, среди прочего, и то, как селективная манипуляция с FcyRвзаимодействиями с помощью Fc-инженерии усиливает активность указанных лекарственных средств. Эти выводы стали возможными благодаря использованию репрезентативной модели in vivo, которая точно отражает разнообразие и специфичность клеточного типа системы FcyR человека.The importance of FcyR interactions for the most effective mAbs to human CD40 has been demonstrated in clinical practice, among other things, and how selective manipulation of FcyR interactions by Fc engineering enhances the activity of these drugs. These findings were made possible by the use of a representative in vivo model that accurately reflects the diversity and cell type specificity of the human FcyR system.
Настоящее изобретение также опровергает представление о том, что эпитопная специфичность агонистического mAb к CD40 определяет его потребности в FcyR (FcYR-независимый по сравнению с FcyRзависимым соответственно) для активности. СР-870,893, ChiLob 7/4 не конкурируют со связыванием CD40L, но, как было доказано, являются FcYR-зависимыми для их оптимальной активности in vivo.The present invention also challenges the notion that the epitope specificity of an agonist mAb to CD40 determines its requirement for FcyR (FcYR-independent versus FcYR-dependent, respectively) for activity. CP-870,893, ChiLob 7/4 do not compete with CD40L binding but have been shown to be FcYR-dependent for their optimal activity in vivo.
Различные режимы действия можно наблюдать между различными клонами mAb, хотя они характеризуются общей целевой молекулой. Например, недавно обнаружили, что антагонистические mAb к PD-1 обладают потенциалом обеспечивать FcYRIIB-зависимый агонизм на основании их эпитопной специфичности (Dahan et al. (2015), Cancer Cell, 28, 285-295). Хотя мышиные модели могут быть очень информативными для оценки активности mAb, перевод активности mAb у мыши на терапевтическое средства для человека не является прямым, и терапевтические механизмы, наблюдаемые для мышиного mAb, можно изменить при разработке гомологичных человеческих IgG. Посредством гуманизации как CD40, так и FcyR создали модель мыши, которая позволяет in vivo оценивать клинические продукты, рассматривая активность, опосредованную как их Fab-доменами, так и Fc-доменами. Эти мыши обеспечивают возможность выбора лидера среди панели человеческих mAb к CD40 на основе их агонистической активности in vivo. Аналогичный подход следует использовать для создания мышей, гуманизированных в отношении других терапевтических мишеней в окружении huFcYR для оптимального выбора дополнительных иммуномодулирующих mAb.Different modes of action can be observed between different mAb clones, although they share a common target molecule. For example, PD-1 antagonist mAbs were recently found to have the potential to mediate FcYRIIB-dependent agonism based on their epitope specificity (Dahan et al. (2015), Cancer Cell, 28, 285-295). Although mouse models can be very informative for assessing mAb activity, the translation of mouse mAb activity to human therapeutics is not straightforward, and the therapeutic mechanisms observed for a mouse mAb can be modified by developing homologous human IgGs. By humanizing both CD40 and FcyR, we have created a mouse model that allows in vivo evaluation of clinical products by examining activity mediated by both their Fab and Fc domains. These mice provide the opportunity to select a leader among a panel of human CD40 mAbs based on their in vivo agonist activity. A similar approach should be used to generate mice humanized for other therapeutic targets in the huFcYR environment to optimally select additional immunomodulatory mAbs.
Хотя улучшенная агонистическая активность опосредована Fc-вариантами, усиленными как для связывания FcyRIIA, так и FcyRIIB (например, с помощью мутаций Fc S267E или S267E/L328F), их активность ограничена их усиленным связыванием с активирующим FcyRIIA. Таким образом, в настоящем исследовании Fc-варианты с селективным усилением при связывании исключительно с ингибирующим FcyRIIB были отмечены как наиболее эффективные производные mAb к CD40. Отсутствие активности мышиных mAb к CD40, несущих подкласс IgG2a, который предпочтительно связывает активирующие FcyR, связано с истощением CD40-экспрессирующих клеток (Li and Ravetch (2011), Science, 333, 10301034). Поскольку FcyRIIIA человека, но не FcyR IIA опосредует in vivo истощение с помощью mAb (DiLillo and Ravetch (2015), Cell, 161, 1035-1045), а мутанты S267E или S267E/L328F усилены по отношению к FcyRIIA, но не FcyRIIIA, сниженная эффективность mAb к CD40, опосредованная FcyRIIAвзаимодействием, не обусловлена истощением CD40-эксnрессирующих клеток. Механизм, который объясняет этот ингибирующий эффект за счет FcyRIIA, является предметом текущих исследований. Полиморфизм гистидина (Н)/аргинина (R) в положении 131 FcyRIIA обусловливает его аффинность связывания по отношению к IgG2, Fc'/RIIa111311 характеризуется приблизительно в 5 раз более высокой аффинноAlthough improved agonist activity is mediated by Fc variants enhanced for both FcyRIIA and FcyRIIB binding (e.g., via Fc S267E or S267E/L328F mutations), their activity is limited by their enhanced binding to activating FcyRIIA. Thus, in the present study, Fc variants selectively enhanced for binding exclusively to inhibitory FcyRIIB were noted as the most potent anti-CD40 mAb derivatives. The lack of activity of murine anti-CD40 mAbs bearing the IgG2a subclass that preferentially binds activating FcyRs is due to the depletion of CD40-expressing cells (Li and Ravetch (2011), Science, 333, 1030-1034). Because human FcyRIIIA but not FcyR IIA mediates in vivo depletion by mAbs (DiLillo and Ravetch (2015), Cell, 161, 1035–1045), and the S267E or S267E/L328F mutants are enhanced against FcyRIIA but not FcyRIIIA, the reduced potency of mAbs to CD40 mediated by FcyRIIA interaction is not due to depletion of CD40-expressing cells. The mechanism that explains this inhibitory effect by FcyRIIA is the subject of ongoing investigation. The histidine (H)/arginine (R) polymorphism at position 131 of FcyRIIA confers its binding affinity for IgG2, with Fc'/RIIa111311 having an approximately 5-fold higher affinity
- 45 048278 стью к IgG2, чем FcyRIIaR131 (van Sorge et al., 2003) Tissue Antigens, 61, 189-202). Из-за ингибирующего эффекта FcyRIIA на активность СР-870,893 пациенты, несущие генотип FcyRIIA131H/H, могут характеризоваться уменьшенным ответом на лечение с помощью СР-870,893. Гуманизированные мыши несут генотип FcyRIIA131R/R, но линию FcyRIIA131H/H создают так, что можно выявить вклад полиморфизма аллелей FcyRIIA в активность mAb к CD40.- 45 048278 affinity for IgG2 than FcyRIIaR131 (van Sorge et al., 2003) Tissue Antigens, 61, 189-202). Because of the inhibitory effect of FcyRIIA on CP-870,893 activity, patients carrying the FcyRIIA131H/H genotype may have a reduced response to treatment with CP-870,893. Humanized mice carry the FcyRIIA131R/R genotype, but the FcyRIIA131H/H line is designed so that the contribution of FcyRIIA allele polymorphism to CD40 mAb activity can be determined.
Пример 13.Example 13.
V11 Fc-вариант Ab к CD40 характеризуется превосходной противоопухолевой активностью.V11 Fc variant of Ab to CD40 is characterized by excellent antitumor activity.
Оценивали, может ли увеличенная агонистическая активность, наблюдаемая для FcyRIIBусиленных мутированных Fc-вариантов обусловливать увеличенную противоопухолевую активность mAb к CD40. Гуманизированных в отношении CD40/FcyR мышей инокулировали сингенными опухолями аденокарциномы толстой кишки МС38 и лечили с помощью 2141 -IgG2, -SELF и -V11 Fc-вариантов агонистического mAb к CD40 клона 2141. Лечение как с помощью IgG2 (СР-870,893), так и SELF Fc-вариантов приводит к сходным противоопухолевым эффектам (приблизительно 65% снижение объема опухоли по сравнению с не получившим лечение контролем и 20-33% не содержащих опухоль мышей соответственно). Тем не менее лечение с помощью Fc-варианта V11 приводит к весьма значительно улучшенному противоопухолевому ответу и обеспечивает полное выздоровление от опухолей всех мышей в этой группе. Сходный тренд наблюдали с использованием модели метастатической меланомы В16, к которой статистически значимое снижение числа метастазов в легких наблюдали только у мышей, получивших лечение с помощью V11, но не с помощью SELF или IgG2 Fc-вариантов. Эти данные указывают на то, что противоопухолевую активность СР-870,893 можно усилить с помощью Fc-инженерии антитела для обеспечения селективного усиления взаимодействия с FcyRIIB и выделить Fc-вариант V11 этого клона mAb в качестве оптимального клинического кандидата.We assessed whether the enhanced agonist activity observed for FcyRIIB-enhanced mutated Fc variants could account for the enhanced antitumor activity of anti-CD40 mAbs. CD40/FcyR-humanized mice were inoculated with syngeneic MC38 colon adenocarcinoma tumors and treated with 2141-IgG2, -SELF, and -V11 Fc variants of the anti-CD40 agonist mAb clone 2141. Treatment with both IgG2 (CP-870,893) and SELF Fc variants resulted in similar antitumor effects (approximately 65% reduction in tumor volume compared to untreated controls and 20-33% in tumor-free mice, respectively). However, treatment with the V11 Fc variant resulted in a very significantly improved antitumor response and resulted in complete tumor clearance in all mice in this group. A similar trend was observed using the B16 metastatic melanoma model, where a statistically significant reduction in lung metastases was observed only in mice treated with V11, but not with SELF or IgG2 Fc variants. These data indicate that the antitumor activity of CP-870,893 can be enhanced by Fc engineering of the antibody to selectively enhance interaction with FcγRIIB and highlight the V11 Fc variant of this mAb clone as an optimal clinical candidate.
Уникальная конформация шарнира IgG2 изотипа человека, как недавно сообщалось, усиливает агонистическую активность mAb к CD40 FcyR-независимым образом. Поэтому предположили, что превосходная агонистическая активность, наблюдаемая для СР-870,893, обусловлена его изотипом IgG2 по сравнению с изотипом IgG1 другого агонистического Ab к CD40 в клинических исследованиях, ChiLob 7/4 и SGN40. Когда ChiLob 7/4 и SGN40 создали в виде IgG2, они привели к усиленной эффективности по сравнению с их исходным изотипом IgG1 (White et al. (2015), Cancer Cell, 27, 138-148). Недостаток этого исследования заключается в том, что mAb оценивали только в присутствии (или при отсутствии) FcyR мыши и их зависимую от изотипа эффективность в правильном контексте FcyR человека не оценивали. В настоящем документе показано, что использование ChiLob 7/4 в виде IgG2 приводит к сниженной активности по сравнению с IgG1 в контексте FcyR человека. Дополнительно оценивали активность IgG1 по сравнению с подклассами IgG2, включая в себя формы 2А и 2В IgG2 как СР-870,893, так и ChiLob 7/4 и обнаружили, что IgG1 является более активным, чем IgG2, и его активность является FcyR-зависимой. Следовательно, сделали вывод, что превосходная агонистическая активность IgG2 к CD40 человека, наблюдаемая у мышей, не релевантна его клинической активности у людей. Более того, относительно высокая активность СР-870,893 по сравнению с другими mAb к CD40 не является результатом изотипа IgG2 и, вероятно, является результатом распознавания mAb уникального специфического агонистического эпитопа. Наконец, селективное усиление для FcyRIIb-связывания на сегодняшний день является наиболее эффективной стратегией усиления эффективности агонизма mAb к CD40.The unique hinge conformation of the human IgG2 isotype has recently been reported to enhance the agonist activity of CD40 mAbs in an FcyR-independent manner. Therefore, it was hypothesized that the superior agonist activity observed for CP-870,893 is due to its IgG2 isotype compared to the IgG1 isotype of other CD40 agonist Abs in clinical trials, ChiLob 7/4 and SGN40. When ChiLob 7/4 and SGN40 were engineered as IgG2, they yielded enhanced potency compared to their parental IgG1 isotype (White et al. (2015) Cancer Cell, 27, 138–148). A limitation of this study is that the mAbs were only evaluated in the presence (or absence) of mouse FcyR and their isotype-dependent potency in the correct human FcyR context was not assessed. Here, we demonstrate that the use of ChiLob 7/4 as an IgG2 results in reduced activity compared to IgG1 in the context of human FcyR. We further assessed the activity of IgG1 compared to IgG2 subclasses, including the 2A and 2B forms of IgG2, of both CP-870,893 and ChiLob 7/4 and found that IgG1 is more potent than IgG2 and its activity is FcyR-dependent. Therefore, we conclude that the superior agonist activity of IgG2 to human CD40 observed in mice is not relevant to its clinical activity in humans. Furthermore, the relatively high activity of CP-870,893 compared to other anti-CD40 mAbs is not a result of the IgG2 isotype and likely results from the mAb’s recognition of a unique, specific agonist epitope. Finally, selective enhancement of FcγRIIb binding is currently the most effective strategy for enhancing the potency of CD40 mAb agonism.
Таблица 2Table 2
Обобщенное представление перечня последовательностейGeneralized representation of a sequence listing
- 46 048278- 46 048278
SEQ Ш NO: 1 - Тяжелая цепь 2141-IgGlSEQ ID NO: 1 - Heavy chain 2141-IgGl
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPG QGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELN RLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS ATTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPG QGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELN RLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS ATTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ Ш NO: 2 - Легкая цепь 2141- IgGlSEQ ID NO: 2 - Light chain 2141 - IgGl
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKA PNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQANIFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV1 Последовательности легкой цепи для всех Fc-вариантов 2141 (СР-870,893) являются идентичными последовательности SEQ Ш NO: 2.DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKA PNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQANIFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV1 The light chain sequences for all Fc variants of 2141 (CP-870,893) are identical to the sequence of SEQ ID NO: 2.
- 47 048278- 47 048278
VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ Ш NO: 3 - Тяжелая цепь 2141-IgGl N297ASEQ ID NO:3 - Heavy chain 2141-IgGl N297A
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPG QGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELN RLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS ATTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPG QGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELN RLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS ATTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 4 - 2141-IgGl S267E - тяжелая цепьSEQ ID NO:4 - 2141-IgGl S267E - heavy chain
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPG QGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELN RLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS ATTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPG QGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELN RLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS ATTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 5 - 2141-IgGl S267E/L328F - тяжелая цепьSEQ ID NO:5 - 2141-IgGl S267E/L328F - heavy chain
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPG QGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELN RLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS ATTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPG QGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELN RLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS ATTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH
- 48 048278- 48 048278
KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAFPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAFPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 6 - 2141-IgGl- G237D/P238D/P271G/A330R (V9) - тяжелая цепьSEQ ID NO:6 - 2141-IgGl- G237D/P238D/P271G/A330R (V9) - heavy chain
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPG QGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELN RLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS ATTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGDDSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDGEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPRPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPG QGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELN RLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS ATTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGDDSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDGEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPRPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 7 - 2141-IgGl- G237D/P238D/H268D/P271G/A330R (VI1) - тяжелая цепьSEQ ID NO:7 - 2141-IgGl- G237D/P238D/H268D/P271G/A330R (VI1) - heavy chain
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPG QGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELN RLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS ATTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGDDSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSDEDGEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPRPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPG QGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELN RLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS ATTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGDDSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSDEDGEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPRPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
- 49 048278- 49 048278
SEQ Ш NO: 8 - 2141-IgG2 - тяжелая цепьSEQ ID NO: 8 - 2141-IgG2 - heavy chain
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPG QGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELN RLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ FNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISK TKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPG QGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELN RLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ FNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISK TKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 9 - 2141-IgG2 C127S - тяжелая цепьSEQ ID NO:9 - 2141-IgG2 C127S - heavy chain
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPG QGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELN RLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ FNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISK TKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPG QGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELN RLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ FNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISK TKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ Ш NO: 10 - 2141-IgG2 C232S - тяжелая цепьSEQ ID NO: 10 - 2141-IgG2 C232S - heavy chain
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPG QGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELN RLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ FNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISK TKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPG QGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELN RLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ FNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISK TKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ Ш NO: 13 Сигнальная последовательность MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPSEQ ID NO: 13 Signal sequence MVRLPLQCVLWGCLLTAVHP
В Перечне последовательностей представлены последовательности зрелых тяжелых и легких цепей (т.е. последовательности не включают в себя сигнальные пептиды). Сигнальная последовательность для получения антител согласно настоящему изобретению, например, в клетках человека, представлена в SEQ ID NO: 13.The Sequence Listing provides sequences of mature heavy and light chains (i.e., the sequences do not include signal peptides). The signal sequence for producing antibodies of the present invention, for example, in human cells, is provided in SEQ ID NO: 13.
Эквиваленты.Equivalents.
Специалистам в настоящей области техники будет понятно или они смогут установить, используя не более чем обычные эксперименты, многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления, раскрытых в настоящем документе. Подразумевается, что такие эквиваленты охвачены представленной ниже формулой изобретения.Those skilled in the art will recognize, or be able to ascertain using no more than routine experimentation, many equivalents to the specific embodiments disclosed herein. Such equivalents are intended to be covered by the claims below.
Перечень последовательностей <110> ЗЭ РОКФЕЛЛЕР ЮНИВЕРСИТИ <120> АНТИТЕЛА К CD40 С УСИЛЕННОЙ АГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮSequence listing <110> ZE ROCKEFELLER UNIVERSITY <120> CD40 ANTIBODIES WITH ENHANCED AGONISTIC ACTIVITY
- 50 048278 <130> 070413.20238 / RU1281 /RUBMS12725-PCT <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 456 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1- 50 048278 <130> 070413.20238 / RU1281 /RUBMS12725-PCT <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 456 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr 100 105 110Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr 100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Thr 115 120 125Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Thr 115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr IleSer Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
- 51 048278- 51 048278
195 200 205195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 210 215 220Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 210 215 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro SerLys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu TyrLys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445
- 52 048278- 52 048278
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Trp 20 25 30Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro Leu 85 90 95Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205
- 53 048278- 53 048278
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 3 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 3 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> synthetic sequence <400> 3<223> synthetic sequence <400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr 100 105 110Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr 100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Thr 115 120 125Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Thr 115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr IleSer Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
- 54 048278- 54 048278
195 200 205195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 210 215 220Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 210 215 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300
Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro SerLys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu TyrLys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445
- 55 048278- 55 048278
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 4 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 4 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> synthetic sequence <400> 4<223> synthetic sequence <400> 4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr 100 105 110Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr 100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Thr 115 120 125Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Thr 115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe ProSer Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr IleSer Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
- 56 048278- 56 048278
195 200 205195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 210 215 220Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 210 215 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270
Val Asp Val Glu His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285Val Asp Val Glu His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro SerLys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu TyrLys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445
- 57 048278- 57 048278
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 5 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 5 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> synthetic sequence <400> 5<223> synthetic sequence <400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr 100 105 110Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr 100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Thr 115 120 125Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Thr 115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe ProSer Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr IleSer Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
- 58 048278- 58 048278
195 200 205195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 210 215 220Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 210 215 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270
Val Asp Val Glu His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285Val Asp Val Glu His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335
Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro SerLys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu TyrLys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445
- 59 048278- 59 048278
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 6 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 6 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> synthetic sequence <400> 6<223> synthetic sequence <400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr 100 105 110Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr 100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Thr 115 120 125Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Thr 115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe ProSer Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr IleSer Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
- 60 048278- 60 048278
195 200 205195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 210 215 220Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 210 215 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240
Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285Val Asp Val Ser His Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335
Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro SerLys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu TyrLys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445
- 61 048278- 61 048278
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 7 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 7 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> synthetic sequence <400> 7<223> synthetic sequence <400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr 100 105 110Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr 100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Thr 115 120 125Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Thr 115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe ProSer Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr IleSer Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
- 62 048278- 62 048278
195 200 205195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 210 215 220Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 210 215 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240
Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270
Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335
Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro SerLys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu TyrLys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445
- 63 048278- 63 048278
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 8 <211> 452 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 8 <211> 452 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr 100 105 110Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr 100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr 130 135 140Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr 130 135 140
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe ProSer Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr 195 200 205Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr 195 200 205
- 64 048278- 64 048278
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val 210 215 220Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val 210 215 220
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 225 230 235 240Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 225 230 235 240
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 290 295 300Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 290 295 300
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro 325 330 335Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro 325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445
Ser Pro Gly LysSer Pro Gly Lys
450450
- 65 048278 <210> 9 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>- 65 048278 <210> 9 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> synthetic sequence <400> 9<223> synthetic sequence <400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr 100 105 110Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr 100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg Ser Thr 130 135 140Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg Ser Thr 130 135 140
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr 195 200 205Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr 195 200 205
- 66 048278- 66 048278
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val 210 215 220Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val 210 215 220
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 225 230 235 240Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 225 230 235 240
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 290 295 300Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 290 295 300
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro 325 330 335Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro 325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445
Ser Pro Gly LysSer Pro Gly Lys
450450
- 67 048278 <210> 10 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>- 67 048278 <210> 10 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> synthetic sequence <400> 10<223> synthetic sequence <400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr 100 105 110Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr 100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr 130 135 140Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr 130 135 140
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr 195 200 205Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr 195 200 205
- 68 048278- 68 048278
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val 210 215 220Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val 210 215 220
Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 225 230 235 240Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 225 230 235 240
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 290 295 300Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 290 295 300
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro 325 330 335Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro 325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445
Ser Pro Gly LysSer Pro Gly Lys
450450
- 69 048278 <210> 11 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11- 69 048278 <210> 11 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu 20 25 30Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu 20 25 30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val 35 40 45Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val 35 40 45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His 65 70 75 80Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His 65 70 75 80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr 85 90 95Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr 85 90 95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr 100 105 110Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr 100 105 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly 115 120 125Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly 115 120 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu 130 135 140Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu 130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys 145 150 155 160Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys 145 150 155 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln 165 170 175Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln 165 170 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu 180 185 190Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu 180 185 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile 195 200 205Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile 195 200 205
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn 210 215 220Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn 210 215 220
- 70 048278- 70 048278
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu 225 230 235 240Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu 225 230 235 240
Ile Asn Phe Pro AspIle Asn Phe Pro Asp
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His 245 250 255Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His 245 250 255
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser 260 265 270Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser 260 265 270
Val Gln Glu Arg Gln 275 <210> 12 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12Val Gln Glu Arg Gln 275 <210> 12 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu 20 25 30Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu 20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg 35 40 45Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg 35 40 45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val 50 55 60Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val 50 55 60
Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser 65 70 75 80Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser 65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys 85 90 95Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys 85 90 95
Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu 100 105 110Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu 100 105 110
Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser 115 120 125Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser 115 120 125
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly 130 135 140Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly 130 135 140
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln 145 150 155 160Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln 145 150 155 160
--
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/304,012 | 2016-03-04 |
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA048278B1true EA048278B1 (en) | 2024-11-14 |
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2021201231B2 (en) | Antibodies to tigit | |
| US11760805B2 (en) | Antibodies to CD40 with enhanced agonist activity | |
| JP7350467B2 (en) | Antibodies against CD40 | |
| EA048278B1 (en) | CD40 ANTIBODIES WITH ENHANCED AGONISTIC ACTIVITY | |
| EA041323B1 (en) | ANTIBODIES TO CD40 WITH ENHANCED AGONISTIC ACTIVITY | |
| BR112018067802B1 (en) | ISOLATED ANTIBODIES OR ANTIGEN-BINDING PORTION THEREOF AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION |