Die vorliegende Erfindung betrifft eine wäßrige Dispersion Fluorcarbon enthaltender Phospholipidvesikel und ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Diese Phospholipidvesikeldispersion ist vor allem als gastransportierendes Medium und als Diagnostikum sowohl in biologischen Systemen in vivo als auch in vitro einsetzbar.The present invention relates to an aqueous dispersion of fluorineCarbon-containing phospholipid vesicle and a process for theirManufacturing. This phospholipid vesicle dispersion is primarily asgas transporting medium and as a diagnostic both in biolosystems can be used in vivo as well as in vitro.
Fluorcarbone sind in der Form wäßriger Emulsionen wegen ihrer chemischen Inertheit und des Gaslösevermögens geeignet, in biologischen Systemen den Sauerstofftransport zu gewährleisten. In der geeigneten Form, d. h. im Gemisch mit Elektrolyten, Energieträgern und onkotisch wirkenden Substanzen können sie als Blutersatzstoffe und als spezielle O2-transportierende pharmazeutische Präparate zur Behandlung des Schocks, des Herzinfarkts und der cerebralen Ischämie angewendet werden. Weitere Anwendungen sind die Unterstützung der Radio- und Chemotherapie maligner Tumoren und als Kontrastmittel in der Röntgen-, Magnetresonanz- und Ultraschalldiagnostik.Fluorocarbons are suitable in the form of aqueous emulsions because of their chemical inertness and the gas solubility to ensure the transport of oxygen in biological systems. In the appropriate form, ie in a mixture with electrolytes, energy sources and oncotic substances, they can be used as blood substitutes and as special O2 -transporting pharmaceutical preparations for the treatment of shock, heart attack and cerebral ischemia. Other applications include the support of radio and chemotherapy for malignant tumors and as a contrast medium in X-ray, magnetic resonance and ultrasound diagnostics.
Als Fluorcarbone werden bevorzugt cyclische bzw. polycyclische Fluorkohlenstoffe, z. B. Perfluordecalin und tertiäre aliphatische oder cyclische Amine eingesetzt. Wegen der Geschwindigkeit der Exkretion der Fluorcarbone aus dem lebenden Organismus müssen Parameter wie Molekülmasse, Dampfdruck und kritische Löslichkeitstemperatur in n-Hexan (als ein Maß für die Lipidlöslichkeit) streng beachtet werden.Cyclic or polycyclic are preferred as fluorocarbonsFluorocarbons, e.g. B. perfluorodecalin and tertiary aliphaticor cyclic amines used. Because of the speed of the exCretion of fluorocarbons from the living organism must Parameters such as molecular weight, vapor pressure and critical solubility teststrictly in n-hexane (as a measure of lipid solubility)get noticed.
Die Herstellung wäßriger, mit dem menschlichen Blut kompatibler Fluorcarbonemulsionen macht biokompatible Emulgatoren erforderlich. Zu einem gewissen Maße erfüllen Ethylenoxid-Propylenoxid-Blockpolymeremulgatoren (im folgenden EO-PO-Blockpolymeremulgatoren genannt) diese Anforderungen. Dessen ungeachtet werden einige grundlegende Nebenwirkungen bei der Applikation von Fluorcarbonemulsionen den Blockpolymeremulgatoren zugeschrieben (Anaphylaktische Reaktionen, Komplementaktivierung, Leukocytopenie).The production of watery, more compatible with human bloodFluorocarbon emulsions require biocompatible emulsifiersLich. To a certain extent, ethylene oxide propylene oxideBlock polymer emulsifiers (hereinafter EO-PO block polymer emulsifiersren called) these requirements. Regardless, some willfundamental side effects when applying fluorocarbonemulsions attributed to block polymer emulsifiers (Anaphylakreactions, complement activation, leukocytopenia).
Zusätzlich sind einige physikalische Parameter der Emulsionsbildung und Emulsionsstabilisierung mit Blockpolymeremulgatoren nicht optimal gelöst. So ist die Stabilität entsprechender Fluorcarbonemulsionen bei Raumtemperatur und die notwendige Langzeitstabilität der Lagerung unbefriedigend; eine thermische Sterilisierung der medizinischen Präparate ist nicht möglich.In addition, some physical parameters of the emulsion areformation and emulsion stabilization with block polymer emulsifiers notoptimally solved. So is the stability of corresponding fluorocarbonemulsions at room temperature and the necessary long-term stabilitystorage unsatisfactory; thermal sterilizationmedical preparations are not possible.
Probleme, die die Resttoxizität des Blockpolymeremulgators betreffen, können überwunden werden, wenn an dessen Stelle Phospholipide, z. B. Ei- oder Sojalecithine, eingesetzt werden. YOKOYAMA (Green Gross Corp., Osaka) beansprucht mit US-Patent 39 62 439 (1976) eine Fluorcarbonemulsion als Blutersatzmittel, die ein Fluorcarbon mit 9 bis 11 Kohlenstoffatomen mit einer Konzentration von 10 bis 40% enthält und durch ein Phospholipid in Verbindung mit langkettigen Fettsäuren, deren Salzen oder Monoglyceriden als Emulgatorgemisch stabilisiert wird. H. SLOVITER schützt mit US-P 43 97 870 einen Prozeß zur Erhöhung der intravasalen Verweilzeit von Fluorcarbonemulsionen im Blutkreislauf des lebenden Organismus, indem in das zirkulierende Blut Lecithin als Emulgator zur Aufrechterhaltung einer hohen Blutlipidkonzentration injiziert wird. Der gleiche Erfinder beschreibt in US-P 44 97 829 ein Verfahren zur Herstellung stabiler Fluorcarbonemulsionen, wonach durch Ultraschalleinwirkung Phospholipide in physiologischen Lösungen mit Perfluordecalin, F-Methyldecalin, F-Tripropylamin oder F-Tributylamin in Konzentrationen von 30 bis 75% emulgiert werden. Die Teilchengrößen betragen im Durchschnitt 200 nm. Fluorcarbonemulsionen mit extrem hohen Fluorcarbongehalten von 30 bis 125% w/v in Form des F-Octylbromids werden von D. LONG jr. mit EP 3 07 087 (1988) beansprucht. Das Wesen der Erfindung ist, daß als Emulgatoren Lecithin, anionische Tenside oder Fluortenside Anwendung finden. Als onkotisch wirkende Komponente wird Mannitol eingesetzt, und zur Emulgierung dient ein spezieller Prozeß unter Einbeziehung einer Druckhomogenisierung.Problems related to the residual toxicity of the block polymer emulsifierfen can be overcome if in its place Phospholipide, e.g. B. egg or soy lecithins can be used.YOKOYAMA (Green Gross Corp., Osaka) claims US patent39 62 439 (1976) a fluorocarbon emulsion as a blood substitute,which is a fluorocarbon with 9 to 11 carbon atoms with a concontains concentration of 10 to 40% and in by a phospholipidConnection with long-chain fatty acids, their salts or monoglycerides is stabilized as an emulsifier mixture.H. SLOVITER protects with US-P 43 97 870 a process for increasingthe intravascular residence time of fluorocarbon emulsions in the bloodcirculation of the living organism by putting in the circulating bloodLecithin as an emulsifier to maintain high bloodlipid concentration is injected. The same inventor describesin US-P 44 97 829 a process for the preparation of stable fluorocarsbonemulsions, after which by ultrasonic exposure phospholipids inphysiological solutions with perfluorodecalin, F-methyldecalin, F-Tripropylamine or F-tributylamine in concentrations from 30 to75% can be emulsified. The particle sizes are on average200 nm.Fluorocarbon emulsions with extremely high fluorocarbon contents of 30up to 125% w / v in the form of F-octyl bromide are from D. LONG jr. WithEP 3 07 087 (1988) claims. The essence of the invention is thatas emulsifiers lecithin, anionic surfactants or fluorosurfactantsfind application. Mannitol is used as an oncotic componentused, and a special process is used for emulsificationInclusion of pressure homogenization.
Ein weiteres Beispiel für konzentrierte stabile wäßrige Fluorcarbonemulsionen wird von SCHWEIGHART und KAYHART von Air Products and Chemicals in EP 2 82 949 (1988) gegeben. Die Erfinder erzielen stabile Fluorcarbonemulsionen größer 60% w/v Fluorcarbon, indem neben einem Phospholipid-Emulgator 5 bis 30% Triglyceride langkettiger Fettsäuren als Co-surfactant angewendet werden. Eine bevorzugte Komposition besteht demnach aus 75% Perfluordecalin, 1 bis 2% Phospholipid und 20% Fettsäuretriglycerid. Bei einer optimalen Zusammensetzung der Emulsion beträgt die mittlere Teilchengröße 150 nm und ist bei 25°C 30 Tage stabil.Another example of concentrated stable aqueous fluorocarbonemulsions is provided by SCHWEIGHART and KAYHART by Air Productsand Chemicals in EP 2 82 949 (1988). The inventors achievestable fluorocarbon emulsions greater than 60% w / v fluorocarbon byin addition to a phospholipid emulsifier 5 to 30% triglycerides longchain fatty acids can be used as a co-surfactant. A bepreferred composition consists of 75% perfluorodecalin, 1up to 2% phospholipid and 20% fatty acid triglyceride. At aoptimal composition of the emulsion is the middle partsize 150 nm and is stable at 25 ° C for 30 days.
Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, eine wäßrige Dispersion Fluorcarbon enthaltender Phospholipidvesikel und ein Verfahren zu ihrer Herstellung zu entwickeln, wobei die Fluorcarbone, die bisher mit Lipiden und Zusatzstoffen in Form klassischer Emulsionen als Emulsionspartikel stabilisiert wurde, nunmehr in käfigartige Phospholipidbilayerstrukturen (Vesikel) eingeschlossen sind.The invention is based on the object of an aqueous dispersersion fluorocarbon-containing phospholipid vesicle and a processto develop their production, whereby the fluorocarbons,the so far with lipids and additives in the form of classic emulsSions was stabilized as an emulsion particle, now in a cagelike phospholipid bilayer structures (vesicles) includedare.
Es wurde erfindungsgemäß eine wäßrige Dispersion Fluorcarbon enthaltender Phospholipidvesikel gefunden, die dadurch gekennzeichnet ist, daß in der wäßrigen Dispersion die Phospholipidvesikel ein oder mehrere sauerstofftransportierende Fluorcarbone in einer Konzentration zwischen 2 und 100% w/v käfigartig und mit lammellarer Schichtstruktur ausgebildet eingeschlossen enthalten und die wäßrige Dispersion diese Phospholipidvesikel mit einer einheitlichen Teilchengröße zwischen 80 und 400 nm enthält.According to the invention, an aqueous fluorocarbon dispersion was entholding phospholipid vesicles found, which are characterizedis that in the aqueous dispersion the phospholipid vesiclesor more oxygen-transporting fluorocarbons in one conconcentration between 2 and 100% w / v cage-like and with lambellarLayered structure included included and the aqrige dispersion these phospholipid vesicles with a uniformContains particle size between 80 and 400 nm.
Die erfindungsgemäße Phospholipidvesikel sind die aus den natürlichen Phospholipiden hergestellten, wie aus Sojalecithine, Eilecithine, oder die aus den synthetischen Phospholipiden hergestellten, wie aus 1, 2-Dilauroyl-glycero-3-phosphorylcholin, 1,2-Distearoyl-glycero-3-phosphorylethanolamin, oder deren Derivate.The phospholipid vesicles according to the invention are those from the naturalLichen phospholipids made, such as from soy lecithins, egglecithins, or those derived from synthetic phospholipidsmade, as from 1,2-dilauroyl-glycero-3-phosphorylcholine, 1,2-Distearoyl-glycero-3-phosphorylethanolamine, or their derivatives.
Die erfindungsgemäßen sauerstofftransportierenden Fluorcarbone sind aus der Gruppe der geradkettigen und verzweigten Fluoralkane, der Mono- und Polycyclo-Fluoralkane, der aliphatischen tertiären Fluoramine, der cyclischen Fluoramine, der alicyclischen Fluoraminoether, der aliphatischen und polycyclischen Fluorether, der Bis-(Fluoralkyl)ethene, der Fluoralkylhalogenide oder aus Gemischen von diesen ausgewählt. (Das Symbol F - bzw. Fluor - bedeutet nach J.A. Young, J. Chem. Doc. 14 (1974) 98 den perfluorierten Zustand der nachfolgend genannten chemischen Verbindung.)The oxygen-transporting fluorocarbons according to the inventionare from the group of straight-chain and branched fluoroalkanes,the mono- and polycyclo-fluoroalkanes, the aliphatic tertiary Fluoramines, cyclic fluoramines, alicyclic fluorineaminoether, the aliphatic and polycyclic fluoroether, theBis- (fluoroalkyl) ethenes, the fluoroalkyl halides or from Gemiselected by these. (The symbol F - or fluorine - meansafter J.A. Young, J. Chem. Doc. 14 (1974) 98 den perfluorinatedCondition of the chemical compound mentioned below.)
Erfindungsgemäß bevorzugte sauerstofftransportierende Fluorcarbone sind Fluor-Octan bis Fluor-Dodecan, Fluor-n-butyl-cyclohexan, Fluor-Decalin, Fluor-Methyldecalin, Fluor-Tripropylamin, Fluor-Dibutylmethylamin, Fluor-Tributylamin, Fluor-Cyclohexylmethylmorpholin, Fluor-Alkylsubstituierte Cyclohexylmorpholine, Fluor-Cyclohexylpiperidin und deren Fluor-Alkylderivate, Fluor-Cyclohexyloxyethylmorpholin, Fluor-n-dihexylether, Fluor-2,5-dioxabicyclo[4.4.0]decan, Fluor-4-methyloxymethyl-2,5-dioxabicyclo[4.4.0]decan, Fluor-4-ethoxymethyl-2,5-dioxabicyclo[4.4.0]decan, Bis-(Fluorhexyl)ethen, Bis-(Fluorbutyl)ethen, Fluor-Octylchlorid, Fluor-Hexylbromid, Fluor-Octylbromid oder ein oder mehrere Gemische von diesen.Preferred oxygen-transporting fluorocarbons according to the inventionare fluoro-octane to fluoro-dodecane, fluoro-n-butyl-cyclohexane,Fluoro-decalin, fluoro-methyldecalin, fluoro-tripropylamine, fluoro-dibutylmethylamine,Fluoro-tributylamine, fluoro-cyclohexylmethylmorpholine,Fluoro-alkyl substituted cyclohexylmorpholines, fluoro-cyclohexylpiperidineand their fluoroalkyl derivatives, fluoro-cyclohexyloxyethylmorpholine,Fluoro-n-dihexyl ether, fluoro-2,5-dioxabicyclo [4.4.0] decane,Fluoro-4-methyloxymethyl-2,5-dioxabicyclo [4.4.0] decane,Fluoro-4-ethoxymethyl-2,5-dioxabicyclo [4.4.0] decane,Bis (fluorohexyl) ethene, bis (fluorobutyl) ethene, fluoro-octyl chloride,Fluoro-hexyl bromide, fluoro-octyl bromide or one or more mixturesof these.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte sauerstofftransportierende Fluorcarbone sind Fluor-Cyclohexylmethylmorpholin, PerfluorDecalin oder Fluor-Dibutylmethylamin.According to the invention particularly preferred oxygen-transportingFluorocarbons are fluorocyclohexylmethylmorpholine, perfluorDecalin or fluoro-dibutylmethylamine.
Weiterhin wurde erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung einer wäßrigen Dispersion Fluorcarbon enthaltender Phospholipidvesikel gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Phospholipid und ein oder mehrere sauerstofftransportierende Fluorcarbone wahlweise unter Zusatz eines Ethylenoxid-Propylenoxid-Blockpolymeremulgators in wäßriger Phase auf einen einheitlichen Teilchendurchmesser zwischen 80 und 400 nm homogenisiert und die Phase der Fluorcarbon enthaltenden Phospholipidvesikel, nach dem Entfernen des Emulgators, isoliert, wobei man das Phospholipid in einer Konzentration zwischen 2 und 12 Massenanteile in % und das oder die sauerstofftransportierenden Fluorcarbone in einer Konzentration von 2 bis 100% w/v einsetzen und den EO-PO- Blockpolymeremulgator in einer Konzentration zwischen 0,1 und 1,6 Massenanteile in %, insbesondere zwischen 0,5 und 0,9 Massenanteile in %, zusetzen kann.Furthermore, a method for the production according to the inventionan aqueous dispersion containing fluorocarbon phospholipidvesicle found, which is characterized in that onePhospholipid and one or more oxygen-transportingFluorocarbons optionally with the addition of an ethylene oxide propyleneoxide block polymer emulsifier in aqueous phase on one unithomogenized particle diameter between 80 and 400 nmand the phase of the fluorocarbon-containing phospholipid vesicles,after removal of the emulsifier, isolated, the Phospholipid in a concentration between 2 and 12 parts by massin% and the or the oxygen-transporting fluorocarbons ina concentration of 2 to 100% w / v and use the EO-PO- Block polymer emulsifier in a concentration between 0.1 and1.6% by mass, especially between 0.5 and 0.9 masshare in%.
Die erfindungsgemäße Homogenisierung in wäßriger Phase kann man bevorzugt bei einem Druck zwischen 100 und 700 atm., insbesondere zwischen 300 und 500 atm. oder mit Ultraschall einer Leistung zwischen 50 und 500 w/cm2 durchführen.The homogenization according to the invention in the aqueous phase can preferably be carried out at a pressure between 100 and 700 atm., In particular between 300 and 500 atm. or perform a power between 50 and 500 w / cm2 with ultrasound.
Die für das Herstellungsverfahren erfindungsgemäßen Phospholipide sind natürlich hergestellte, wie die Sojalecithine, die Eilecithine, oder die synthetisch hergestellten, wie 1,2-Dilauroyl-glycero-3-phosphorylcholin, 1,2-Distearoyl-glycero-3-phosphorylethanolamin, oder deren Derivate.The phospholipids according to the invention for the production processare naturally produced, like the soy lecithins, the egg lecithine, or the synthetically produced, such as 1,2-dilauroyl-glycero-3-phosphorylcholine, 1,2-distearoyl-glycero-3-phosphorylethanolamine, or their derivatives.
Für das Herstellungsverfahren kann man erfindungsgemäß als sauerstofftransportierende Fluorcarbone die aus der Gruppe der geradkettigen und verzweigten Fluoralkane, der Mono- und Polycyclo-Fluoralkane, der aliphatischen tertiären Fluoramine, der cyclischen Fluoramine, der alicyclischen Fluoraminoether, der aliphatischen und polycyclischen Fluorether, der Bis-(Fluoralkyl)-ethene, der Fluoralkylhalogenide oder aus Gemischen von diesen ausgewählt einsetzen.According to the invention, the manufacturing process can be considered acidicsubstance-transporting fluorocarbons from the group of straightchain and branched fluoroalkanes, the mono- and polycyclo-Fluoroalkanes, the aliphatic tertiary fluoramines, the cyclibetween fluoramines, alicyclic fluoraminoethers, aliphatiand polycyclic fluoroethers, the bis (fluoroalkyl) ethenes,the fluoroalkyl halides or selected from mixtures thereofdeploy.
Als erfindungsgemäß bevorzugt für das Herstellungsverfahren lassen sich als sauerstofftransportierende Fluorcarbone Fluor-Octan bis Fluor-Dodecan, Fluor-n-butylcyclohexan, Fluor-Decalin, Fluor-Methyldecalin, Fluor-Tripropylamin, Fluor-Dibutylmethylamin, Fluor-Tributylamin, Fluor-Cyclohexylmethylmorpholin, Fluor-Alkylsubstituierte Cyclohexylmorpholine, Fluor-Cyclohexylpiperidin und deren Fluor-Alkylderivate, Fluor-Cyclohexyloxyethylmorpholin, Fluor-2,5-dioxabicyclo[4.4.0]decan, Fluor-4methoxymethyl-2,5-dioxabicyclo[4.4.0]decan, Bis-(Fluorhexyl)ethen, Bis-(Fluorbutyl)-ethen, Fluor-Octylchlorid, Fluor-Hexylbromid, Fluor-Octylbromid oder ein oder mehrere Gemische von diesen einsetzen.As preferred according to the invention for the manufacturing processitself as oxygen-transporting fluorocarbons fluoro-octaneFluorododecane, fluoro-n-butylcyclohexane, fluoro-decalin, fluorineMethyldecalin, fluoro-tripropylamine, fluoro-dibutylmethylamine,Fluor-tributylamine, fluorocyclohexylmethylmorpholine, fluorineAlkyl substituted cyclohexylmorpholines, fluoro-cyclohexylpiperidine and its fluoro-alkyl derivatives, fluoro-cyclohexyloxyethylmorpholine, fluoro-2,5-dioxabicyclo [4.4.0] decane, fluoro-4methoxymethyl-2,5-dioxabicyclo [4.4.0] decane, bis (fluorohexyl)ethene, bis (fluorobutyl) ethene, fluoro-octyl chloride, fluoro-hexylbromide, fluoro-octyl bromide or one or more mixtures ofuse this.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte sauerstofftransportierende Fluorcarbone sind Fluor-Cyclohexylmethylmorpholin, Perfluor-Decalin oder Fluor-Dibutylmethylamin.According to the invention particularly preferred oxygen-transportingFluorocarbons are fluorocyclohexylmethylmorpholine, perfluoro-decalin or fluoro-dibutylmethylamine.
Als EO-PO-Blockpolymeremulgator kann man wahlweise erfindungsgemäß einen solchen im Molmassenbereich größer 6000 Dalton mit einem Ethylenoxid-Anteil im Emulgatormolekül zwischen 15 und 30% oder ein Gemisch von diesen Verbindungen einsetzen.The EO-PO block polymer emulsifier can be used according to the inventionone with a molecular weight greater than 6000 daltonsEthylene oxide content in the emulsifier molecule between 15 and 30% oruse a mixture of these compounds.
Die Bedingungen für das Herstellungsverfahren wurden erfindungsgemäß so gewählt, daß der Einschluß der Fluorcarbone in den Käfig der Bilayerstrukturen erfolgt und unilamellare bzw. multilamellare, auf die Teilchengröße bezogene, einheitliche Vesikel gebildet werden.The conditions for the manufacturing process were fictionaccordingly chosen so that the inclusion of the fluorocarbons in the cageof the bilayer structures and unilamellar or multilameluniform, vesicles based on particle sizebe formed.
Während bekanntermaßen durch Emulgatormoleküle in der Adsorptionsschicht von O/W-Systemen stabilisierte Emulsionspartikel thermodynamisch instabil sind, stellen lipidstabilisierte Partikel mit Bilayerstrukturen thermodynamisch stabile Systeme dar.While known to emulsifier molecules in the adsorptionlayer of emulsion particles stabilized by O / W systems thermodyare namically unstable, lipid-stabilized particles with Bilayer structures represent thermodynamically stable systems.
Untersuchungen an den entsprechenden Systemen haben ergeben, daß die resultierenden fluorcarbongefüllten Vesikel in ihrer Stabilität unabhängig von der Zeit sind. Eine Lagerung bei Raumtemperatur ist möglich ohne das üblicherweise auftretende Teilchenwachstum, und eine thermische Belastung bei 90°C ist ohne negative Auswirkungen durchführbar.Studies on the corresponding systems have shown thatthe resulting fluorocarbon-filled vesicles in their stabilityare independent of time. Storage at room temperatureis possible without the usual particle growth,and a thermal load at 90 ° C has no negative effectsfeasible.
Im Gegensatz zu den vorherrschenden konventionellen Fluorcarbonemulsionen sind die entsprechenden Vesikelstrukturen unabhängig von der Art des verwendeten Fluorcarbons und der vesikulierten Menge. Auf diesem Wege lassen sich unproblematisch hochkonzentrierte z. B. 100%ige w/v Lipidvesikel erzeugen. Vorteilhaft dabei ist die entgegen der Erwartung nur geringfügig ansteigende Viskosität.In contrast to the prevailing conventional fluorocarbonemulsions, the corresponding vesicle structures are independenton the type of fluorocarbon used and the vesiculatedAmount. In this way, you can concentrate without any problemsstepped z. B. Generate 100% w / v lipid vesicles. Advantageous hereis the visco that only slightly increases contrary to expectationssity.
Die Ausbildung der Vesikelstruktur bei den spezifischen Verfah rensbedingungen ist durch eine Anzahl von Untersuchungsmethoden (31P-NMR, Gelchromatographie, PCS, Stabilitätsuntersuchungen) verifiziert worden.The formation of the vesicle structure under the specific process conditions has been verified by a number of test methods (31 P-NMR, gel chromatography, PCS, stability tests).
Im Gegensatz zu wäßrigen Vesikeln weisen fluorcarbongefüllte Vesikel eine Polaritätsumkehr auf, d. h. die Fettsäurereste des Phospholipidmoleküls sind zum unpolaren Fluorcarbonkern der Vesikel ausgerichtet, die damit als inverse Vesikel anzusehen ist. Ungeachtet dessen, erfolgt der Aufbau der lamellaren Schichten, die bis zur Ausbildung flüssig-kristalliner Strukturen führen kann.In contrast to aqueous vesicles, fluorocarbon filledVesicle reverses polarity, i. H. the fatty acid residues of thePhospholipid molecules are the non-polar fluorocarbon nucleusAligned vesicles, which is therefore to be regarded as an inverse vesicle.Regardless, the lamellar layers build up,which lead to the formation of liquid-crystalline structurescan.
Die extreme Stabilität der Aggregate resultiert aus der Ausbildung multilamellarer Schichtstrukturen, der Orientierung negativer Oberflächenladungen und der Wasseraufnahme (Quellvermögen) der lamellaren Strukturen. Die für Emulsionssysteme entscheidende Depression der Grenzflächenspannung durch einen Emulgator ist für das vorliegende Phospholipidsystem nicht relevant.The extreme stability of the units results from the trainingmultilamellar layer structures, the orientation of negative onesSurface charges and water absorption (swelling capacity) of thelamellar structures. The decisive De for emulsion systemspression of the interfacial tension by an emulsifier is forthe present phospholipid system is not relevant.
Entsprechend dem Konzentrationsverhältnis von Fluorcarbon und zur Vesikulierung eingesetztem Phospholipid werden unilamellare gefüllte Phospholipidvesikel mit Vesikeldurchmessern von bis zu 100 nm erhalten. Ein Überschuß an Phospholipid in Bezug auf den theoretisch zu berechnenden unilamellaren Zustand ergibt multilamellare Vesikel mit elektronenmikroskopisch nachweisbaren konzentrischen Bilayern. Deren Teilchengrößen können bis auf Werte von über 400 nm ansteigen. Die Vereinheitlichung der Vesikeldurchmesser im Herstellungsprozeß ist von eminenter Bedeutung, da eine breite Teilchengrößenverteilung nachteilig für die biomedizinische Anwendung ist. Bekanntermaßen werden Partikel größer 400 nm zunehmend toxisch und durch sukzessive Phagozytierung im RES dem Blutkreislauf entzogen.According to the concentration ratio of fluorocarbon andVesiculation used phospholipid are unilamellar gefilled phospholipid vesicles with vesicle diameters up toGet 100 nm. An excess of phospholipid in relation to thetheoretically calculated unilamellar state results in multilamellar vesicles with electronically detectable concentric bilayers. Their particle sizes can be down to valuesrise above 400 nm. The unification of the vesiclesdiameter in the manufacturing process is of paramount importance becausea broad particle size distribution detrimental to the biomedicalAfrican application is. As is known, particles larger than 400 nmincreasingly toxic and due to successive phagocytosis in the RESBlood circulation withdrawn.
Der bei der Vesikulierung wahlweise zur Anwendung kommende EO-PO-Blockpolymeremulgator hat nicht die Aufgabe, die Fluorcarbon tropfen im klassischen Sinne zu stabilisieren, sondern in den Prozeß der Käfigbildung einzugreifen.The EO-PO- that is optionally used for vesiculationBlock polymer emulsifier does not have the task of fluorocarbon to stabilize drops in the classic sense, but in theIntervene process of cage formation.
Nach Vorstellung von P. Fromherz (Chem. Phys. Letters 94 (1983) 259) reduziert das Blockpolymer die Grenzflächenspannung an den Kanten des aus Bilayerschichten wachsenden sphärischen Aggregats und beschleunigt aus energetischen Gründen den Abschluß der Vesikelbildung bei einheitlichen Teilchengrößen.According to P. Fromherz (Chem. Phys. Letters 94 (1983)259) the block polymer reduces the interfacial tension at theEdges of the spherical aggregate growing from bilayer layersand accelerates the completion of Vesi for energetic reasonscone formation with uniform particle sizes.
Eine systematische Untersuchung der Bildung und Stabilität von Vesikeln mit Mischungen von Phospholipiden und Blockpolymeremulgatoren zwischen 0 und 100% hat maximale Stabilisierung für Gemische mit 90 bis 95% Phospholipid und 5 bis 10% EO-PO-Blockpolymer ergeben. Das Tensid kann bei Bedarf beispielsweise durch Dialyse gegen Wasser unter Beibehaltung der vorteilhaften Eigenschaften des Systems abgetrennt werden.A systematic study of the formation and stability ofVesicles with mixtures of phospholipids and block polymer emulgators between 0 and 100% has maximum stabilization for Gemix with 90 to 95% phospholipid and 5 to 10% EO-PO blockpolymer result. The surfactant can, for example, if necessaryDialysis against water while maintaining the beneficial propertiessystem.
Die Vorbereitung eines natürlichen Phospholipds kann beispielsweise wie folgt erfolgen:
Kommerzielles Sojalecithin der Zusammensetzung von ca. 30% Phosphatidylcholin, ca. 30% Phosphatidylethanolamin und ca. 30% Phosphatidylinositol wird in einem organischen Lösungsmittel (Chloroform, Chloroform/Methanol) gelöst. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer im Vakuum entfernt und das Phospholipidgemisch an der Kolbenwandung als Film abgeschieden. Durch Zugabe von destilliertem Wasser wird das Lecithin unter Liposomenbildung mit einer definierten Konzentration aufgenommen.A natural phospholipd can be prepared as follows, for example:
Commercial soy lecithin with the composition of approx. 30% phosphatidylcholine, approx. 30% phosphatidylethanolamine and approx. 30% phosphatidylinositol is dissolved in an organic solvent (chloroform, chloroform / methanol). The solvent is removed on a rotary evaporator in vacuo and the phospholipidge is mixed as a film on the flask wall. By adding distilled water, the lecithin is taken up with liposome formation at a defined concentration.
Die sauerstofftransportierenden Fluorcarbone werden nach bekannten und industriell eingeführen Verfahren hergestellt. Dabei werden die perfluorierten aliphatischen und cyclischen tertiären Amine bevorzugt durch elektrochemische Fluorierung der KW-Analoga in flüssigem Fluorwasserstoff (Simons-Prozeß) erzeugt (z. B. perfluorierte N-cyclohexylmethyl-Derivate sekundärer Amine; Groß, Rüdiger, Jonethal, DD-PS 2 80 130, 1988). Dagegen werden fluorierte Ether und Alkane bzw. Cycloalkane vorzugsweise durch Fluorierung mit Cobalt(III)fluorid in der Gasphase hergestellt (u. a. perfluorierte polycycloaliphatische Ether, DE-Patentanmeldung AZ-P 41 01 446.4, 1991). Ein weiteres Verfahren von Bedeutung ist die chemische Synthese ausgehend von perfluorierten Verbindungen wie Perfluoralkyljodiden. Auf diesem Wege ist der Zugang zu Verbindungen des Typs der Bis(F-Alkyl)ethene möglich.The oxygen-transporting fluorocarbons are knownand industrially introduced processes. In doing sothe perfluorinated aliphatic and cyclic tertiary aminespreferably by electrochemical fluorination of the KW analogues inliquid hydrogen fluoride (Simons process) generated (e.g. byfluorinated N-cyclohexylmethyl derivatives of secondary amines; Big,Rudiger, Jonethal, DD-PS 2 80 130, 1988). In contrast, fluorinatedEthers and alkanes or cycloalkanes preferably by fluorination made with cobalt (III) fluoride in the gas phase (including perfluorinated polycycloaliphatic ethers, DE patent application AZ-P 41 01 446.4, 1991). Another method of importance is thatchemical synthesis based on perfluorinated compounds such asPerfluoroalkyl iodides. In this way there is access to connectiongene of the type of bis (F-alkyl) ethenes possible.
Die Erfindung wird durch folgende Ausführungsbeispiele noch näher erläutert, wobei die Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist.The invention is illustrated by the following exemplary embodimentsexplained, the invention is not limited to these examplesis.
160 g hochreines F-Cyclohexylmethylmorpholin (Sdp. 174°C, kritische Löslichkeitstemperatur in n-Hexan 38,5°C, LD50 < 47,5 g/kg i.p. in der Maus) wurden mit 160 ml einer 7,4% Sojalecithin-Dispersion (kommerzielles Produkt, frei von Lysolecithin) unter Zusatz von 1,2 g eines EO-PO-Blockpolymeremulgators (Molmasse 8500, EO-Gehalt 20%) in einem Hochdruckhomogenisator unter Kühlung und Argonspülung bei 500 bar homogenisiert. Bei automatischer Registrierung der Vesikeldurchmesser wurde der Prozeß bis zu mittleren Teilchendurchmessern von 220 nm fortgeführt. Es wurden 200 ml einer 80% Vesikeldispersion erhalten, deren Struktur durch31P- und19F-NMR-Untersuchungen charakterisiert wurde. Die Sterilisierung der Vesikel-Phase erfolgte durch Autoklavierung bei 121°C für 20 Minuten. Die Sauerstofflöslichkeit betrug 35 ml O2/100 ml. Toxizitätsuntersuchungen i.v. in der Ratte waren negativ.160 g of highly pure F-cyclohexylmethylmorpholine (bp. 174 ° C, critical solubility temperature in n-hexane 38.5 ° C, LD50 <47.5 g / kg ip in the mouse) were treated with 160 ml of a 7.4% soy lecithin -Dis persion (commercial product, free of lysolecithin) with addition of 1.2 g of an EO-PO block polymer emulsifier (molecular weight 8500, EO content 20%) in a high pressure homogenizer with cooling and argon purge at 500 bar. With automatic registration of the vesicle diameter, the process was continued up to mean particle diameters of 220 nm. 200 ml of an 80% vesicle dispersion were obtained, the structure of which was characterized by31 P and19 F NMR studies. The vesicle phase was sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes. The oxygen solubility was 35 ml O2/100 ml. Iv toxicity studies in the rat were negative.
Die Komplettierung zum biokompatiblen Blutersatzmittel erfolgte mit einem Adjuvantienpaket von 20 Vol-% (Elektrolyte, Glucose, Albumin).The completion of the biocompatible blood substitute took placewith an adjuvant package of 20 vol% (electrolytes, glucose,Albumin).
60 g Perfluordecalin wurden mit 58 ml einer 8,6% wäßrigen Ei-Lecithin-Dispersion und 0,5 g Pluronic F 68 unter Eiskühlung und N2-Atmosphäre 15 Minuten mit einem Ultraschalldesintegrator (180 W/cm2) in Intervallen beschallt. Es wurde eine stabile 60% w/v PFD-Vesikeldispersion mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 140 nm und einer Viskosität von 11 cP erhalten. Das Tensid wurde durch Dialyse über eine semipermeable Membran abgetrennt. Die Vesikelstruktur wurde durch Linienform und Linienbreite (201,6 Hz) des31P-NMR-Signals bestätigt. Eine weitere Charakterisierung erfolgte durch Gelfiltration der wäßrigen Vesikeldispersion an einer Shodex OH pak B-Säule mit RI-Detektion (negativer Peak). Die Vesikeldispersion ist bei Raumtemperatur langzeitstabil. Alterungsversuche bei 90°C über 4 Stunden ergaben ein nur unerhebliches Teilchenwachstum und keine Zerstörung der Vesikelstruktur.60 g of perfluorodecalin were sonicated with 58 ml of an 8.6% aqueous egg lecithin dispersion and 0.5 g of Pluronic F 68 under ice cooling and N2 atmosphere for 15 minutes with an ultrasonic disintegrator (180 W / cm2 ) at intervals. A stable 60% w / v PFD vesicle dispersion with an average particle diameter of 140 nm and a viscosity of 11 cP was obtained. The surfactant was removed by dialysis over a semipermeable membrane. The vesicle structure was confirmed by the line shape and line width (201.6 Hz) of the31 P-NMR signal. A further characterization was carried out by gel filtration of the aqueous vesicle dispersion on a Shodex OH pak B column with RI detection (negative peak). The vesicle dispersion is long-term stable at room temperature. Aging tests at 90 ° C for 4 hours showed only insignificant particle growth and no destruction of the vesicle structure.
12,5 g F-Dibutylmethylamin (Sdp. 133°C, kritische Löslichkeitstemperatur in n-Hexan 46°C, LD50 < 55 g/kg) wurden mit 43 ml einer wäßrigen 5% Sojalecithin-Dispersion unter Kühlung und Inertgas US-homogenisiert. Der mittlere Teilchendurchmesser betrug 110 nm. Nach Komplettierung zum Blutersatzmittel wurde mit einer 20% Dispersion ein partieller Blutaustausch an Ratten vorgenommen. Mittels19F-NMR-tomographischer Untersuchungen am lebenden Tier sowie an isolierten Organen (Leber, Niere, Herz) wurde die F-DBMA Akkumulation bzw. Exkretion in zeitlicher Abhängigkeit verfolgt.12.5 g of F-dibutylmethylamine (bp. 133 ° C., critical solubility temperature in n-hexane 46 ° C., LD50 <55 g / kg) were mixed with 43 ml of an aqueous 5% soy lecithin dispersion with cooling and inert gas US Pat. homogenized. The mean particle diameter was 110 nm. After completion of the blood substitute, a partial blood exchange was carried out on rats using a 20% dispersion. The F-DBMA accumulation or excretion was monitored as a function of time using19 F-NMR tomographic examinations on living animals and on isolated organs (liver, kidney, heart).
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