Die Erfindung betrifft eine Meßvorrichtung und ein Verfahren zur automatischen Konzentrationsbestimmung von Substraten biokatalytischer Reaktionen. Die Erfindung wird eingesetzt zur quantitativen Bestimmung solcher Substrate, die in Chemie, Biochemie, Biotechnologie, Pharmazie, Medizin und Umweltschutz Bedeutung besitzen.The invention relates to a measuring device and a methodfor the automatic determination of the concentration of substratesbiocatalytic reactions. The invention becomes aset for the quantitative determination of such substrates,those in chemistry, biochemistry, biotechnology, pharmacy,Medicine and environmental protection are important.
Analysenverfahren zur quantitativen Bestimmung chemischer Substanzen unter Verwendung von biologisch aktiven Verbindungen als Analysereagenz sind aus der modernen Analytik nicht mehr wegzudenken. Von herausragender Bedeutung sind dabei Enzyme und in neuerer Zeit auch höher integrierte Systeme, wie z. B. Mikroorganismen. Als Reagentien in löslichen Analysensystemen werden diese Biokatalysatoren bzw. Biokatalysatorsysteme schon seit vielen Jahren angewendet. Dabei zeigt sich aber, daß in vielen Fällen Enzyme und Mikroorganismen trotz ihrer unbestreitbaren Vorteile, wie hoher Spezifität, in löslichen Analysensystemen wegen ihrer nur einmaligen Verwendbarkeit viel zu teure Reagentien sind, um eine breite und umfangreiche Anwendung zu finden. Deshalb wird auch seit vielen Jahren nach Analysenmethoden und Vorrichtungen gesucht, bei denen die teuren Biokatalysatoren mehrfach eingesetzt werden können. In den Biosensorsystemen hat man mit Sicherheit Vorrichtungen entwickelt, bei denen diese Forderungen erfüllt sind ("Biosensors: Fundamentals and Applications" Oxford Univ. Press, 1987, Ed. by A. P. F. Turner, I. Karube and G. S. Wilson).Analytical method for the quantitative determination of chemicalSubstances using biologically active verbas analytical reagent are from modern analyticsindispensable. Are of paramount importancethereby enzymes and more recently also more integratedSystems such as B. microorganisms. As reagents inThese biocatalysts become soluble analysis systemsor biocatalyst systems for many yearsturns. But it turns out that in many casesEnzymes and microorganisms despite their undeniableAdvantages, such as high specificity, in soluble analyzessystems because of their one-time usabilitytoo expensive reagents are to be a wide and extensiveTo find application. That is why it has been around for many yearssearched for analytical methods and devices in whichthe expensive biocatalysts are used several timescan. In the biosensor systems you definitely haveDevices developed in which these requirementsare fulfilled ("Biosensors: Fundamentals and Applications"Oxford Univ. Press, 1987, Ed. by A. P. F. Turner, I.Karube and G. S. Wilson).
Gegenwärtig besitzen unter den Biosensoren die Enzymelektroden die größte Bedeutung. In Enzymelektroden, bei denen die Biokatalysatorkomponente Enzym immobilisiert und damit wiederverwendbar ist, sind die Vorteile der elektrochemischen Transduktoren, wie hohe Sensitivität und schnelle Meßwertbereitstellung, mit den Vorteilen der Enzyme, wie hohe Spezifität, miteinander verbunden. Diese aufgeführten Vorteile von Enzymelektroden erklären auch ihren Entwicklungsvorsprung unter den Biosensortypen, was auch in der Bereitstellung kommerzieller Geräte auf der Basis von Enzymelektroden zum Ausdruck kommt (F. W. Scheller et al., Biosensors 2 (1985) 135-160). Insbesondere kommerzielle Vorrichtungen mit Enzymelektroden, die auf dem amperometrischen Meßprinzip beruhen, besitzen einen hohen Entwicklungsstand und werden in klinischen Einrichtungen und Biotechnologiezentren eingesetzt.Currently, among the biosensors have the enzymeelectrodes are of the greatest importance. In enzyme electrodes, atwhich immobilize the biocatalyst component enzymeand thus reusable are the advantages ofelectrochemical transducers, such as high sensitivityand fast provision of measured values, with the advantages ofEnzymes, such as high specificity, linked together. TheseAdvantages of enzyme electrodes listed also explaintheir lead in development among biosensor types whatalso in the provision of commercial equipment at the Base of enzyme electrodes is expressed (F. W. Schelleret al., Biosensors 2 (1985) 135-160). Especially comMercial devices with enzyme electrodes, which on theamperometric measurement principle, have a highState of development and are in clinical facilities andBiotechnology centers used.
Unter den potentiometrischen Enzymelektroden mit immobilisierten Enzymen, die ionenselektive Elektroden als elektrochemische Transduktoren nutzen, sind jedoch bisher lediglich solche auf der Basis der teuren, gassensitiven Elektroden kommerziell erhältlich (F. W. Scheller et al., Biosensors 1 (1985) 135-160). Potentiometrische Enzymsensoren mit pH-Elektroden oder pH-sensitiven, ionenselektiven Feldeffekttransistoren als elektrochemische Transduktorelemente dagegen haben bisher lediglich als grundlegende Neuentwicklung bzw. Labormuster Bedeutung erlangt, weil die auf der Basis dieser elektrochemischen Transduktoren entwickelten Enzymsensoren erhebliche Nachteile haben (Kirstein et al., Biosensors 1 (1985) 117-130), wie wechselnde Sensitivitäten beim Vermessen gepufferter Analytlösungen oder unerwünschte Einflußnahme der Ionenaktivität, insbesondere aber der Wasserstoffionenaktivität auf das Meßergebnis. Diese Einflußnahme sich ständig verändernder Analytlösungsparameter, wie pH-Wert oder Pufferkapazität erlauben keine exakte Bestimmung der Analytkonzentration. Diese Probleme erklären auch das Fehlen von geeigneten Vorrichtungen und Geräten potentiometrischer Enzymsensoren mit pH-Elektroden und pH-ISFET's als Transducerelemente zur quantitativen, schnellen und effektiven Konzentrationsbestimmung der von erheblicher analytischer Bedeutung und im wesentlichen nur mit diesen Enzymsensortypen quantitativ zu bestimmenden chemischen Verbindungen, wie Harnstoff, Penicillin, Kreatinin, Lysin, Glutamat, Acetylcholin und Glutamin in biologischen Lösungen, wie z. B. Blut, Serum, Urin, Milch oder Fermentationslösungen. Aber auch die bei potentiometrischen Enzymsensorsystemen, bei denen lösliche Enzyme verwendet werden, vorgeschlagenen Lösungen sind auf potentiometrische Enzymsensorsysteme mit immobilisierten Enzymen nicht anwendbar. Sie beseitigen lediglich den Einfluß unterschiedlicher pH-Werte der Analytlösungen. Darüber hinaus erfordern sie einen erheblichen Geräteaufwand zur Dosierung exakter Mengen von Meß-, Analyt- und Enzymlösungen, wobei letztere nach jedem Meßvorgang wie bei den bisherigen traditionellen Analytbestimmungsmethoden mit löslichen Enzymen auch verworfen werden (M. Ripamonti, A. Mosca, E. Rovida et al., Clin. Chem. 1984, 30, 556-559).Among the potentiometric enzyme electrodes with immobilienzymes, the ion-selective electrodes as electrouse chemical transducers, but have so far been singleLich based on the expensive, gas sensitive electronicstrodes commercially available (F. W. Scheller et al., Biosensors 1 (1985) 135-160). Potentiometric enzyme sensorswith pH electrodes or pH-sensitive, ion-selectiveField effect transistors as electrochemical transducerselements, on the other hand, have so far only been considered basicNew development or laboratory sample gains importance becausebased on these electrochemical transducersdeveloped enzyme sensors have considerable disadvantages(Kirstein et al., Biosensors 1 (1985) 117-130), such aschanging sensitivities when measuring buffered analytesolutions or unwanted influence of ion activity,but especially the hydrogen ion activitythe measurement result. This influence is constantly changingthe analyte solution parameters, such as pH or buffer capacitydo not allow an exact determination of the analyte concentrationtion. These problems also explain the lack of suitableDevices and devices potentiometric enzymesensors with pH electrodes and pH ISFETs as transducerselements for quantitative, fast and effective condetermination of the concentration of significant analytical Beinterpretation and essentially only with these enzyme sensor typeschemical compounds to be determined quantitatively,such as urea, penicillin, creatinine, lysine, glutamate,Acetylcholine and glutamine in biological solutions, such ase.g. B. blood, serum, urine, milk or fermentation solutions.But also with potentiometric enzyme sensor systems,where soluble enzymes are used, proposedSolutions are available on potentiometric enzyme sensor systemsimmobilized enzymes not applicable. Eliminate themonly the influence of different pH values of the analytesolutions. They also require a significant amount Equipment expenditure for dosing exact amounts of measuring, analyteand enzyme solutions, the latter like after each measurementwith the previous traditional analyte determination methodscan also be discarded with soluble enzymes (M. Ripamonti,A. Mosca, E. Rovida et al., Clin. Chem. 1984, 30, 556-559).
Potentiometrische Biosensorsysteme mit immobilisierten Biokatalysatoren, wie sie in der Literatur beschrieben sind (R. B. Kobos in: Ion-selektive Electrodes in Anal. Chem., Plenum Press, New York and London, 1980, 1-84, Ed. by H. Freiser oder DD-WP 2 53 425 5) arbeiten auch lediglich nur in Meß- und Probenlösungen mit einheitlichen und vergleichbaren Eigenschaften zuverlässig und richtig bzw. vernachlässigen, wie im Falle des genannten Patentes, die die Meßergebnisse verfälschenden Einflüsse unterschiedlicher Pufferkapazitäten der Meßproben oder die unterschiedlichen Ansprechverhalten der elektrochemischen Transduktoren in diesen Zweielektrodensystemen.Potentiometric biosensor systems with immobilized biocatalysts as described in the literature(R. B. Kobos in: Ion-selective electrodes in Anal. Chem.,Plenum Press, New York and London, 1980, 1-84, Ed. by H.Freiser or DD-WP 2 53 425 5) only workin measurement and sample solutions with uniform and comparativereliable and correct or negligible propertiescasual, as in the case of the said patent, which theMeasuring results falsifying influences of differentBuffer capacities of the test samples or the differentResponse behavior of the electrochemical transducers inthese two-electrode systems.
Die als erhebliche Nachteile auftretenden Einflüsse von Störsubstanzen auf ein Meßergebnis traten aber nicht nur bei Biosensorsystemen auf, die auf dem potentiometrischen Meßprinzip beruhen. Man findet sie auch bei den weit verbreiteten und erhebliche Bedeutung besitzenden amperometrischen Biosensorsystemen. Diese Störeinflüsse auf das Meßergebnis bei amperometrischen Biosensorsystemen können bis zu einem gewissen Grade durch Immobilisierung zusätzlicher Anti-Interferenzschichten beseitigt werden, weil diese den Zutritt der Störsubstanzen bis zur die gewünschte biokatalytischen Reaktion katalysierenden Biokatalysatorschicht bzw. bis zum elektrochemischen Transduktor verhindern (R. Rennsberg, F. Schubert, F. Scheller, TIBS, 1986, 11, 216-220). Diese Vorgehensweise hat aber auch Nachteile, da zum einen schwierig herstellbare Multienzymmembranen verwendet werden müssen und zum anderen die abschirmende Wirkung der Anti-Interferenzschichten nur für vergleichsweise geringe Konzentrationen der Störsubstanzen wirksam sind. Diese Ausschlußkonzentrationen liegen z. B. bei Fermentationslösungen weit unter den Störsubstanzkonzentrationen, so daß die Anti-Interferenzschichten wegen der Überlastung bei hohen Störsubstanzkonzentrationen schnell unwirksam werden.The influences ofInterfering substances on a measurement result did not only occurin biosensor systems based on the potentiometricMeasuring principle. You can also find them in the far verwidespread and significant importance amperometrical biosensor systems. This interference on theMeasurement result with amperometric biosensor systems canto a certain extent through immobilization additionalanti-interference layers can be eliminated becausethese the access of the interfering substances up to the desired onebiocatalytic reaction catalyzing biocatalystlayer or up to the electrochemical transducerprevent (R. Rennsberg, F. Schubert, F. Scheller, TIBS,1986, 11, 216-220). But this procedure also hasDisadvantages, because on the one hand difficult to produce multienzyme membranes must be used and the othershielding effect of the anti-interference layers onlyfor comparatively low concentrations of the sturgeonsubstances are effective. These exclusion concentrationslie z. B. in fermentation solutions far belowInterfering substance concentrations so that the anti-interferencelayers due to overload with high interfering substanceconcentrations quickly become ineffective.
Das Ziel der Erfindung ist es, eine Meßvorrichtung und ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Biokatalysatorsubstraten zu entwickeln, wobei eine Verringerung manueller Arbeit wie Messen, Steuern und Auswerten bei gleichzeitiger Verbesserung von Genauigkeit, Zuverlässigkeit und Schnelligkeit angestrebt wird.The aim of the invention is a measuring device and aMethod for the quantitative determination of biocatalystto develop substrates, reducing manualWork like measuring, controlling and evaluating at the same timeImprove accuracy, reliability and speedis striven for.
Die Aufgabe der Erfindung besteht in der Entwicklung einer automatisch arbeitenden Meßapparatur mit Biosensoren und eines Verfahrens zur Bestimmung von Biokatalysatorsubstraten, mit der eine Verringerung der manuellen Arbeiten und eine effektive Bestimmung gewährleistet sind.The object of the invention is to develop aautomatically working measuring apparatus with biosensors anda method for determining biocatalyst substrates,with a reduction in manual work andan effective determination is guaranteed.
Die erfindungsgemäße Meßvorrichtung besteht aus einem kalibrierten, mittels eines programmierbaren Rechnersystems gesteuerten Meßsystem, das über einen Analog-Digital-Wandler mit einer Steuer- und Auswerteeinheit verbunden ist, einer Dateneingabeeinheit zu seiner Bedienung sowie einem Dokumentiergerät.The measuring device according to the invention consists of acalibrated using a programmable computer systemcontrolled measuring system using an analog-to-digital converteris connected to a control and evaluation unit,a data entry unit for its operation and oneDocumenting device.
Das Meßsystem enthält als wesentlichen Bestandteil ein Biosensorsystem. Das Biosensorsystem ist in einer thermostatierbaren Durchflußmeßzelle angeordnet und über seine elektrischen Leitungen und über den Analog-Digital-Wandler mit der Steuer- und Auswerteeinheit verbunden. Die Durchflußmeßzelle ist so konstruiert, daß in sie für einen Meßvorgang über eine Meßzuflußleitung mit durch die Steuer- und Auswerteeinheit steuerbarem Ventil die Meßlösung mit Hilfe einer Dosierpumpe aus einem Vorratsbehälter dosiert wird. Die Meßlösung wird durch einen Rührer gleichmäßig durchmischt. Die Meßlösung ist auf eine Pufferkonzentration von 2 mol/l bis 10-5 mol/l mit einem pH-Wert in der Nähe des pH-Optimums des jeweils immobilisierten Biokatalysators eingestellt. Nach einem Meßvorgang wird die Meßlösung mit Hilfe einer Absaugvorrichtung über eine Meßzellenabflußleitung mit durch die Steuer- und Auswerteeinheit steuerbarem, geöffnetem Ventil entfernt. Das Biosensorsystem enthält erfindungsgemäß mindestens drei elektrochemische Sensoren. Dabei dient der Analog-Digital-Wandler der Umwandlung der anfallenden Signale in die durch das Rechnersystem nur verarbeitbaren digitalen Signale. Ein Sensor ist in jedem Falle ein mit mindestens einem Biokatalysator beschichteter, elektrochemischer Sensor.The measuring system contains a bio sensor system as an essential component. The biosensor system is arranged in a flow cell which can be thermostated and is connected to the control and evaluation unit via its electrical lines and via the analog-digital converter. The flow measuring cell is constructed in such a way that the measuring solution is metered from it from a storage container with the aid of a metering pump for a measuring process via a measuring inflow line with a valve that can be controlled by the control and evaluation unit. The measuring solution is mixed evenly by a stirrer. The measuring solution is adjusted to a buffer concentration of 2 mol / l to 10-5 mol / l with a pH value close to the optimum pH of the immobilized biocatalyst. After a measuring process, the measuring solution is removed with the aid of a suction device via a measuring cell flow line with an open valve which can be controlled by the control and evaluation unit. According to the invention, the biosensor system contains at least three electrochemical sensors. The analog-digital converter is used to convert the resulting signals into the digital signals that can only be processed by the computer system. In any case, a sensor is an electrochemical sensor coated with at least one biocatalyst.
Mit einem Biokatalysator beschichtet bedeutet, daß Enzyme, Mikroorganismen, tierische, pflanzliche oder humane Zellen, Zellorganellen und andere biokatalytisch aktive Materialien, z. B. mit diesen Biokatalysatoren modifizierte Antikörper, Antigene, Haptene, Hormone oder Gemische der genannten Biokatalysatoren, auf den sensitiven Oberflächen des Sensors immobilisiert sind. Der zweite Sensor ist ebenfalls ein mit mindestens einem Biokatalysator beschichteter, elektrochemischer Sensor, er kann aber auch ein unbeschichteter, elektrochemischer Sensor sein, er muß aber von der gleichen Art wie der erste Sensor sein. Liegt dieser zweite Sensor jedoch in beschichteter Form vor, so ist auf der sensitiven Oberfläche dieses elektrochemischen Sensors mindestens ein Biokatalysator immobilisiert, der eine oder mehrere Störsubstanzen für den ersten Sensor umsetzt und damit bestimmen kann. Der dritte elektrochemische Sensor dient als Referenzsensor gegenüber den beiden anderen Sensoren. Er muß nicht in jedem Falle als dritter Sensor sichtbar im Biosensorsystem enthalten sein, da auch solche elektrochemischen Transduktoren für die Entwicklung des Biosensorsystems verwendet werden können, deren integraler und oft unsichtbarer Bestandteil dieser Referenzsensor ist. Sein Vorhandensein ist jedoch für das Funktionieren des Biosensorsystems eine unabdingbare Voraussetzung. Die elektrochemischen Transduktoren für die Sensoren können unterschiedlichster Art sein, so daß verschiedenartigste, durch die biokatalytische Reaktion erzeugte, physikalische Meßgrößen durch die Meßvorrichtung quantitativ bestimmt werden können. Erfindungsgemäß werden für die Entwicklung der Meßsensoren des Biosensorsystems ionenselektive Sensoren, z. B. pH-Elektroden bzw. pH-sensitive, ionenselektive Feldeffekttransistoren oder Sauerstoffelektroden vom Typ der Clark-Elektroden bzw. wie diese gleiche Eigenschaften besitzende und mit Mediatoren modifizierte Elektroden oder Leitfähigkeitselektroden verwendet. Bei Biosensorsystemen zur Bestimmung von Biokatalysatorsubstraten wie Harnstoff, Penicillin, Kreatinin, Aminosäuren, Acylcholinen, Peptiden oder einigen Sacchariden sind auf den pH-sensitiven Oberflächen der ionenselektiven Sensoren oder Leitfähigkeitselektroden des ersten Sensors solche Biokatalysatoren immobilisiert, bei deren biokatalytischer Wirkung nach Zugabe oben genannter Biokatalysatorsubstrate zur Meßlösung pH-Änderungen oder Änderungen anderer Ionenkonzentrationen auftreten. Solche Biokatalysatoren sind z. B. Enzyme wie Urease, Penicillinase, Penicillinacylase, Kreatininase, Deaminasen, Decarboxylasen, Proteasen und einige Kohlehydrate umzusetzenden Enzyme, z. B. Glukoseoxidase, aber auch höher integrierte biokatalytisch aktive Systeme wie Mikroorganismen, Zellen unterschiedlicher Herkunft, Zellorganellen, Organschnitte, die diese Enzymaktivitäten besitzen und mit diesen genannten Biokatalysatoren modifizierte Antikörper, Antigene, Haptene, Hormone und andere biologisch aktive Verbindungen. Biosensorsysteme mit auf diese beschriebene Weise beschichtetem ersten Sensor besitzen im allgemeinen einen unbeschichteten zweiten Sensor und einen Referenzsensor, wie er aus der Elektrochemie für pH-Werte messende Sensorsysteme bekannt ist. In einer anderen Variante ist das Biosensorsystem der Meßvorrichtung so aufgebaut, daß bei Verwendung von Sauerstoffkonzentration oder Konzentrationen seiner Reduktionsprodukte messenden Elektroden bzw. gleiche Eigenschaften besitzenden und mit elektrisch leitenden Verbindungen, den sogenannten Mediatoren, modifizierten Elektroden als Sensoren auf der sensitiven Oberfläche des ersten Sensors Biokatalysatoren immobilisiert sind, bei deren biokatalytischer Wirkung nach Zugabe ihrer Substrate zur Meßlösung Sauerstoff verbraucht oder gebildet wird. Zu diesen Biokatalysatoren zählt man die zu den Oxidreduktasen gehörenden Enzymen, die in ihrer Vielfalt allein oder in Kombination mit Enzymen aus anderen Enzymklassen, besonders aus der Enzymklasse der Hydrolasen oder als Bestandteil der bereits genannten höher integrierten biokatalytisch aktiven Systeme oder als Teil modifizierter Antikörper, Antigene, Haptene, Hormone und anderer biologisch aktiver Verbindungen auf dem ersten Sensor immobilisiert sind. Ihre Immobilisierung gestattet die quantitative Bestimmung ihrer Substrate. Der zweite Sensor ist bei diesen Systemen auch mit einem Biokatalysator beschichtet. Bevorzugt sind diese immobilisierten Biokatalysatoren ein Enzym oder mehrere Enzyme, die eine mit dem ersten Sensor interferierende Störsubstanz umsetzen und damit deren quantitati ve Bestimmung erlauben. Weniger bevorzugt werden dafür höher integrierte, biokatalytisch aktive Systeme verwendet. Referenzsensor ist ebenfalls eine aus der elektrochemischen Analytik allgemein bekannte Referenzelektrode.Coated with a biocatalyst means that enzymes,Microorganisms, animal, plant or human cells,Cell organelles and other biocatalytically active materials,e.g. B. antibodies modified with these biocatalysts,Antigens, haptens, hormones or mixtures of the named biocatalysts, on the sensitive surfaces of the sensorare immobilized. The second sensor is also a withat least one biocatalyst coated, electrochemical sensor, but it can also be an uncoated,electrochemical sensor, but it must be the sameKind of like the first sensor. This second sensor lieshowever, in a coated form, so on the sensitiveSurface of this electrochemical sensor at leastimmobilized a biocatalyst that has one or moreInterfering substances for the first sensor and thuscan determine. The third electrochemical sensor is usedas a reference sensor compared to the other two sensors.It does not have to be visible as a third sensor in every casebe included in the biosensor system, since such electrochemical transducers for the development of the biosensorsystems can be used, their integral andoften invisible part of this reference sensor.However, its presence is essential for the functioning of theBiosensor systems an essential requirement. Theelectrochemical transducers for the sensorsbe of the most different kind, so that the most varied,physical produced by the biocatalytic reactionMeasured quantities determined quantitatively by the measuring devicecan be. According to the invention for developmentof the measuring sensors of the biosensor system ion-selective Sensensors, e.g. B. pH electrodes or pH-sensitive, ion-selectivetive field effect transistors or oxygen electrodes fromType of Clark electrodes or the same as theseowning and modified with mediatorselectrodes or conductivity electrodes. At Biosensor systems for the determination of biocatalyst substratessuch as urea, penicillin, creatinine, amino acids, acylcholines, peptides or some saccharides are on thepH-sensitive surfaces of the ion-selective sensorsor conductivity electrodes of the first sensorImmobilized biocatalysts in their biocatalytic Effect after adding the above-mentioned biocatalyst substratesfor pH changes or changes in other ionsconcentrations occur. Such are biocatalystse.g. B. enzymes such as urease, penicillinase, penicillin acylase,Creatininase, deaminases, decarboxylases, proteases andsome enzymes to convert carbohydrates, e.g. B. Glucoseoxidase, but also more integrated biocatalytically activeSystems such as microorganisms, cells of different originsfuture, cell organelles, organ sections that these enzyme stocksvities and with these biocatalystsmodified antibodies, antigens, haptens, hormones andother biologically active compounds. Biosensor systemswith the first Sen coated in this waysor generally have an uncoated secondSensor and a reference sensor, like the one from the electroChemistry for pH sensor systems is known.In another variant, the biosensor system is the measurementdevice constructed so that when using acidsubstance concentration or concentrations of its reductionelectrodes that measure the product or have the same propertiespossessing and with electrically conductive connections, theso-called mediators, modified electrodes as Sensensors on the sensitive surface of the first sensorBiocatalysts are immobilized in their biocatalytable effect after adding their substrates to the measuring solutionOxygen is consumed or formed. To this bioCatalysts are considered to be oxide reductaseslistening enzymes, in their diversity alone or in comcombination with enzymes from other enzyme classes, especiallyfrom the hydrolase enzyme class or as a componentof the above-mentioned, higher integrated biocatalyticactive systems or as part of modified antibodies,Antigens, haptens, hormones and other biologically activeConnections are immobilized on the first sensor.Their immobilization allows quantitative determinationof their substrates. The second sensor is in these systemsalso coated with a biocatalyst. Are preferredthese immobilized biocatalysts are an enzyme orseveral enzymes that interfere with the first sensorImplementing interfering substance and thus its quantitative Allow determination. Less preferred are higherintegrated, biocatalytically active systems are used. Rightreference sensor is also one from the electrochemicalAnalytics commonly known reference electrode.
Ein zweites wesentliches Bauteil, das für die automatische Steuerung der Wechselwirkungen der mechanischen und elektronischen Elemente der Meßabläufe und für die Auswertung der Meßsignale zur Ergebnisbildung und -dokumentation verantwortlich ist, ist die rechnergestützte Steuer- und Auswerteeinheit. Sie besteht ausA second essential component that is used for automaticControl of the interaction of mechanical and electroAfrican elements of the measurement processes and for the evaluation ofMeasurement signals responsible for the formation and documentation of resultsis literal is the computer-aided control and evaluationunit. it consists of
Essentieller Bestandteil der Kalibrier- und Meßvorgangssteuerung der Auswerte- und Steuereinheit sind Vorrichtungen und Systeme, die gewährleisten, daß vor der Konzentrationsbestimmung der Biokatalysatorsubstratkonzen tration die Ermittlung der Korrekturfaktoren, die ein unterschiedliches Ansprechverhalten der Sensoren gegenüber auf das Biosensorsystem einwirkenden Störsubstanzen berücksichtigen und eine Kalibrierung mit einer definierten Biokatalysatorsubstratkonzentration, die in einem Kalibrierpuffer mit geeigneter Pufferkapazität aufgelöst ist, ermöglichen. Die Korrekturfaktoren für das Biosensorsystem werden ermittelt, indem Substrate oder Produkte der biokatalytischen Reaktion, die auf dem mit einem Biokatalysator besichteten ersten Sensor abläuft, in dem Mengen und Konzentrationen zur Meßlösung addiert werden, daß etwa gleichgroße Meßsignale erhalten werden, wie sie bei der durch die Biokatalysatoren realisierten biokatalytischen Reaktion nach der Substratzugabe zur Meßlösung auftreten. Für den Kalibriervorgang ist die Kalibrier- und Meßvorgangssteuerung der Steuer- und Auswerteeinheit so ausgelegt, daß zur Kompensierung von Toleranzen des Meßsystems und von Änderungen der Aktivitätszustände der immobilisierten Biokatalysatoren des Biosensorsystems mit Biokatalysatorsubstratkonzentrationen kalibriert wird, die in Kalibrierpuffern aufgelöst sind, deren Pufferkapazitäten sich aus den Mittelwerten der unterschiedlichen Pufferkapazitäten der zu vermessenden Meßproben mit den unbekannten Biokatalysatorsubstratkonzentrationen ergeben, und die nach an sich bekannten Verfahren bestimmt werden. Nach den Kalibrier- und Meßvorgängen werden mit der Vorrichtung zur Meßwertverarbeitung die anfallenden Meßsignale in Meßergebnisse umgewandelt. Dabei wird mit Hilfe von in die Vorrichtung zur Meßwertverarbeitung integrierten Bauteilen die Differenz aus dem Meßsignal des ersten Sensors und dem Meßsignal des zweiten Sensors gebildet, die mit dem Korrekturfaktor multipliziert wird, dieser Wert mit dem Wert für die Kalibrierkonzentration verglichen wird und der Vergleichswert nach Umrechnung in Konzentrationseinheiten (oder Aktivitätseinheiten) der zu bestimmenden Biokatalysatorsubstrate als Meßergebnis ermittelt, das durch digitale Anzeige oder über einen Monitor oder Drucker dokumentiert wird. Erfindungsgemäß wird die Meßvorrichtung zur Bestimmung der Penicillinkonzentration in Fermentationslösungen eingesetzt. Es wird ein Biosensorsystem verwendet, das aus einer pH-Elektrode, die mit einem penicillinspaltenden Enzym beschichtet ist, einer unbeschichteten pH-Elektrode und einer Referenzelektrode besteht und in der Meßzelle angeordnet ist. Zur Kalibrierung des Meßsystems wird die zur Ermittlung des Korrekturfaktors erforderliche Konzentration einer Mineralsäure, vorzugsweise Salzsäure, und die Pufferkapazität für den Kalibrierpuffer nach an sich bekannten Verfahren vorher bestimmt.Essential part of the calibration and measuring processControl of the evaluation and control unit are Vorrichand systems that ensure that before the Kondetermination of the concentration of the biocatalyst substrate concentrations tration the determination of the correction factors, the undifferent response behavior of the sensorsinterfering substances acting on the biosensor systemand a calibration with a defined biocataanalyzer substrate concentration in a calibration bufferwith a suitable buffer capacity.The correction factors for the biosensor system will beaverages by substrates or products of biocatalyticReaction based on that viewed with a biocatalystfirst sensor expires in the quantities and concentrationsbe added to the measuring solution that measuring about the same sizesignals are obtained, as in the case of the biocataanalyzers realized biocatalytic reaction after theAdd substrate to the measuring solution. For calibrationThe process is the calibration and measurement process control of theControl and evaluation unit designed so that to compensateTolerance of the measuring system and changesthe activity states of the immobilized biocatalystsof the biosensor system with biocatalyst substrate concentrationcalibrated, which is dissolved in calibration buffersare whose buffer capacities are derived from the mean valuesthe different buffer capacities of those to be measuredMeasurement samples with the unknown biocatalyst substrate conresult in concentrations, and according to known Verdriving can be determined. After the calibration and measurementgears with the device for processing measured valuesthe measurement signals are converted into measurement results.This is done with the help of the device for the measured valueprocessing integrated components the difference from theMeasurement signal of the first sensor and the measurement signal of the twoten sensors formed with the correction factor multiis copied, this value with the value for the calibrationconcentration is compared and the comparison value afterConversion to concentration units (or activityunits) of the biocatalyst substrates to be determined asMeasurement result determined by digital display oris documented on a monitor or printer. ErfinAccording to the measuring device for determining thePenicillin concentration in fermentation solutionsputs. A biosensor system is used which consists of a pH electrode with a penicillin-cleaving enzymeis coated, an uncoated pH electrode and oneThere is a reference electrode and arranged in the measuring cellis. To calibrate the measuring system, the determinationconcentration of the correction factor requiredMineral acid, preferably hydrochloric acid, and the buffering capacityfor the calibration buffer according to known methodsdetermined beforehand.
Die Bestimmung der Penicillinkonzentration und die vorherige Kalibrierung mit der bestimmten Konzentration an Salzsäure (10-2 n HCl) und einer definierten Penicillinkonzentration (30 mM Penicillin G/l), Pufferkonzentration 1 × 10-2 mol/l - 1 × 10-4 mol/l, pH = 6,0-8,11, erfolgen automatisch durch die Meßablaufsteuerung mit Hilfe der Meßzeiteinrichtung, der Zeitablaufsteuerung des Probenerkennungssystems und der Kalibrier- und Meßvorgangssteuerung, nach der Probenzugabe zur Meßlösung. In Abhängigkeit vom mit penicillinspaltenden Enzym beschichteten Sensor liegt die Meßzeit unter 20 Sekunden.The determination of the penicillin concentration and the previous calibration with the determined concentration of hydrochloric acid (10-2 N HCl) and a defined penicillin concentration (30 mM penicillin G / l), buffer concentration 1 × 10-2 mol / l - 1 × 10- 4 mol / l, pH = 6.0-8.11, are carried out automatically by the measurement sequence control with the aid of the measurement time device, the time sequence control of the sample detection system and the calibration and measurement process control, after the sample has been added to the measurement solution. Depending on the sensor coated with penicillin-splitting enzyme, the measuring time is less than 20 seconds.
Zur Bestimmung von Harnstoff in Serum wird erfindungsgemäß ein Biosensorsystem eingesetzt, das aus einer pH-Elektrode, die mit Urease beschichtet ist, aus einer zweiten unbeschichteten pH-Elektrode und einer Referenzelektrode besteht. Zur Ermittlung des Korrekturfaktors verwendet man eine Base, vorzugsweise 0,015 n Natronlauge. Die Kalibrierung erfolgt mit einer definierten Menge Harnstofflösung, vorzugsweise 10 mM Harnstoff/l, die Pufferkonzentration ist 1 × 10-3 mol/l bis 5 × 10-3 mol/l, der pH-Wert 6,8-7,4. Die Meßzeit liegt unter 30 Sekunden.To determine urea in serum, a biosensor system according to the invention is used which consists of a pH electrode coated with urease, a second uncoated pH electrode and a reference electrode. A base, preferably 0.015N sodium hydroxide solution, is used to determine the correction factor. The calibration is carried out with a defined amount of urea solution, preferably 10 mM urea / l, the buffer concentration is 1 × 10-3 mol / l to 5 × 10-3 mol / l, the pH 6.8-7.4. The measuring time is less than 30 seconds.
Die Bestimmung des Disaccharids Saccharose in Gegenwart von Glukose erfolgt mit einem Biosensorsystem, das aus einer mit einer Enzymmembran beschichteten Sauerstoff oder Reduktionsprodukte messende Elektrode besteht. In der Enzymmembran sind Saccharose (Invertase), Mutarotase und Glukoseoxidase enthalten. Die zweite Elektrode ist ebenfalls eine Sauerstoff- oder seine Reduktionsprodukte messende Elektrode, die mit Glukoseoxidase und gegebenenfalls Mutarotase beschichtet ist. Die dritte Elektrode ist eine Referenzelektrode. Der Korrekturfaktor wird mit einer definierten Menge Glukoselösung (10 mM Glukose/l) bestimmt, die Kalibrierung erfolgt mit einer Saccharoselösung (10 mM Saccharose), die Pufferkonzentration ist 2 mol/l und der pH-Wert 6,0 bis 7,5. Die Meßzeit liegt unter 30 Sekunden. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung des Disaccharids Laktose enthält in der Enzymmembran des ersten Sensors die Enzymeβ-Galaktosidase, Mutarotase und Glukoseoxidase und in der Enzymmembran des zweiten Sensors Glukoseoxidase und gegebenenfalls Mutarotase, und die dritte Elektrode ist die Referenzelektrode. Der Korrekturfaktor wird mit einer definierten Menge Glukoselösung (10 mM Glukose/l) bestimmt, die Kalibrierung des Meßsystems erfolgt mit einer definierten Menge Laktoselösung (10 mM Laktose), die Pufferkonzentration ist 2 mol/l bis 1 × 10-3 mol/l und der pH-Wert 6,0 bis 7,5.The disaccharide sucrose is determined in the presence of glucose using a biosensor system consisting of an electrode measuring oxygen or reduction products coated with an enzyme membrane. The enzyme membrane contains sucrose (invertase), mutarotase and glucose oxidase. The second electrode is also an electrode measuring oxygen or its reduction products, which is coated with glucose oxidase and, if appropriate, mutarotase. The third electrode is a reference electrode. The correction factor is determined with a defined amount of glucose solution (10 mM glucose / l), calibration is carried out with a sucrose solution (10 mM sucrose), the buffer concentration is 2 mol / l and the pH 6.0 to 7.5. The measuring time is less than 30 seconds. The method according to the invention for determining the disaccharide lactose contains the enzymesβ- galactosidase, mutarotase and glucose oxidase in the enzyme membrane of the first sensor and glucose oxidase and optionally mutarotase in the enzyme membrane of the second sensor, and the third electrode is the reference electrode. The correction factor is determined with a defined amount of glucose solution (10 mM glucose / l), the measuring system is calibrated with a defined amount of lactose solution (10 mM lactose), the buffer concentration is 2 mol / l to 1 × 10-3 mol / l and the pH 6.0 to 7.5.
Die Meßzeit liegt im Bereich von weniger als 30 Sekunden. Zur Bestimmung des Disaccharids Maltose nach dem erfindungsgemäßen Verfahren enthält die Enzymmembran des ersten Sensors Glukoamylase, Mutarotase und Glukoseoxidase und die Enzymmembran des zweiten Sensors Glukoseoxidase und gegebenenfalls Mutarotase. Die dritte Elektrode ist die Referenzelektrode. Der Korrekturfaktor wird auch hier mit einer definierten Menge Glukoselösung (10 mM Glukose/l) bestimmt, und die Kalibrierung des Meßsystems wird mit einer definierten Menge Maltoselösung (10 mM Maltose) vorgenommen, die Pufferkonzentration ist 2 mol/l bis 1 × 10-3 mol/l und der pH-Wert 6,0 bis 7,5.The measurement time is in the range of less than 30 seconds. To determine the disaccharide maltose according to the method according to the invention, the enzyme membrane of the first sensor contains glucoamylase, mutarotase and glucose oxidase and the enzyme membrane of the second sensor contains glucose oxidase and optionally mutarotase. The third electrode is the reference electrode. The correction factor is also determined here with a defined amount of glucose solution (10 mM glucose / l), and the calibration of the measuring system is carried out with a defined amount of maltose solution (10 mM maltose), the buffer concentration is 2 mol / l to 1 × 10-3 mol / l and the pH 6.0 to 7.5.
Die Meßzeit zur Bestimmung einer Meßprobe beträgt weniger als 30 Sekunden.The measuring time for determining a test sample isless than 30 seconds.
Mit der erfindungsgemäßen Meßvorrichtung können eine Vielzahl von Biokatalysatorsubstraten schnell und in einfacher Weise quantitativ bestimmt werden. Durch die rechnergestützte, automatisierte Ablaufsteuerung werden noch häufig anzutreffende manuelle und zeitaufwendige Arbeitsschritte, die sich aus den Meß-, Steuer- und Auswertevorgängen bei Analysenverfahren ergeben, wesentlich verringert. Durch die Beseitigung von bei bisher vorhandenen Meßvorrichtungen auftretenden Fehlerquellen werden mit der erfindungsgemäßen Meßvorrichtung zusätzlich auch die Richtigkeit und Zuverlässigkeit der Analysenmethoden unter Verwendung von Biosensoren erheblich verbessert.With the measuring device according to the invention aVariety of biocatalyst substrates quickly and in onebe quantitatively determined. Through the calculatorsupported, automated process control will still befrequently encountered manual and time-consuming worksteps that result from the measurement, control and evaluationresults in analytical processes, significantly verwrestles. By eliminating from existing onesSources of error occurring are identified withthe measuring device according to the invention also theAccuracy and reliability of the analysis methods underUse of biosensors significantly improved.
Die erfindungsgemäße Meßvorrichtung zur effektiven und automatischen Konzentrationsbestimmung von Biokatalysatorsubstraten wird nachfolgend anhand der durch sie verwirklichten Meßablauffolge beschrieben:The measuring device according to the invention for effective and autodetermination of the concentration of biocatalyst substratesis subsequently based on the measurement realized by themsequence described:
Fig. 1 stellt den prinzipiellen Aufbau der Meßvorrichtung dar und wird zur Darstellung der Meßabläufe herangezogen. Zur Bestimmung der Penicillinkonzentration in Fermentationslösungen wird das aus einer mit Penicillinase (EC 3.5.2.6.) beschichteten pH-Elektrode als Sensor (15) und einer unbeschichteten pH-Elektrode als Sensor (16) - beide Sensoren werden mit integriertem Referenzsensor (17) verwendet - bestehende Biosensorsystem (7) in der Meßzelle (5) angeordnet. Als nächste vorbereitende Schritte zur Penicillinbestimmung in Fermentationslösungen werden die zur Ermittlung des Korrekturfaktors erforderliche Konzentration einer Mineralsäure und danach die geeignete Pufferkapazität für den Kalibrierpuffer durch Titration von Fermentationslösungen bestimmt. Alle weiteren Arbeitsschritte - ausgenommen die Dosiervorgänge, die nicht Gegenstand dieser erfindungsgemäßen Meßvorrichtung sind, aber durchaus in den automatischen Meßablauf integriert werden können - erfolgen mit Hilfe der Meßzeiteinrichtung (18), der Zeitablaufsteuerung (19), der Meßablaufsteuerung (20), des Probenerkennungssystems (21) und der Kalibrier- und Meßvorgangssteuerung (22) automatisch bzw. werden nach visuellen und über die rechnergestützte Steuer- und Auswerteeinheit (3) gesteuerten Anweisungen ausgeführt. Alle nachfolgend beschriebenen Meßschritte unterliegen einem programmierten Meßablauf, der gesteuert wird durch die Meßablaufsteuerung (20). Zu Beginn des Einsatzes der Meßvorrichtung wird die Meßlösung aus dem Vorratsbehälter (11) mit Hilfe der Dosierpumpe (10) bei geöffnetem Ventil (9) und geschlossenem Ventil (13) über die Meßzellenzuflußleitung (8) in die Meßzelle (5) gepumpt, in die obiges Biosensorsystem (7) eintaucht. Nach Füllen der Meßzelle (5) mit der Meßlösung beginnt das Überprüfen des Grundzustandes der Meßsensoren (15) und (16). Bei nichtkonstanten Ausgangspotentialen der Meßsensoren (15) und (16) werden durch Befehle die Meßzelle geleert, wieder gefüllt und die Meßsensoren (15) und (16) damit so lange automatisch aquilibriert, bis die Ausgangspotentiale konstant sind. Gelingt das mit fünf der beschriebenen Spülvorgänge nicht, so erfolgt per Befehl über die Meßvorrichtungsteile (27) oder (28) die Ausschrift "Sensorwechsel". Bei konstanten Ausgangspotentialen wird der Befehl "Eingabe der Meßzeit" gegeben, der über die Dateneingabeeinheit (4) ausgeführt wird. In Abhängigkeit vom Aktivitätszustand des mit Penicillinase beschichteten Sensors (15) liegt bei der Bestimmung von Penicillin in Fermentationslösungen die Meßzeit im Bereich von zwei bis fünf Sekunden und ist in diesem Bereich über die Dateneingabeeinheit (4) der Meßzeiteinrichtung (18) der Steuer- und Auswerteeinheit (3) auch mitzuteilen, in der sie für die nachfolgenden Meßvorgänge abgespeichert wird. Als nächster Meßvorgangsschritt erfolgt die Bestimmung des Korrekturfaktors für das Biosensorsystem (7). Zu diesem Zweck werden nach Befehlserteilung 50 µl einer 10-2-normalen Salzsäurelösung zur Meßlösung addiert. Unmittelbar nach Erfassung der ersten Potentialänderungen durch das Probenerkennungssystem (21), das mit den Sensoren (15) und (16) über den Analog-Digital-Wandler (2) verbunden ist, wird der Meßzeitbeginn durch die in die Meßzeiteinrichtung (18) integrierte Zeitablaufsteuerung (19) ausgelöst. Nach Ablauf der programmierten Meßzeit wird der Meßvorgang - ebenfalls durch die Zeitablaufsteuerung (19) - abgebrochen. Die anfallenden Meßsignale gelangen danach in das Meßwertaufnahmesystem (23), von wo sie zur Berechnung des Korrekturfaktors durch die Vorrichtung zur Meßwertverarbeitung und Ergebnisbildung (24) abgerufen werden. Der hier ermittelte Korrekturfaktor wird zunächst im Zwischenspeicher (25) abgelegt. Nach der Bestimmung des Korrekturfaktors wird bei geschlossenem Ventil (9) und geöffnetem Ventil (13) die Meßzelle automatisch geleert und mit Meßlösung gefüllt, um den Grundzustand der Sensoren (15) und (16) wieder zu erreichen. Werden nach fünf Spülvorgängen die Ausgangspotentiale nicht erreicht, so wird wieder der Befehl "Sensorwechsel" erteilt und der Meßvorgang von Beginn an wiederholt. Bei Erreichen der Potentialgrundzustände wird als nächstes mit Hilfe der Kalibrier- und Meßvorgangssteuerung (22) das Meßsystem (1), genau genommen die Meßzelle (5) mit dem Biosensorsystem (7), mit einer definier ten Penicillinkonzentration kalibriert. Dazu wird nach Befehlserteilung zunächst über die Dateneingabeeinheit (4) die Kalibrierkonzentration von Penicillin G der Steuer- und Auswerteeinheit (3) mitgeteilt, wo sie im Zwischenspeicher (25) abgelegt wird. Die darauf folgende Aufforderung zur Kalibrierprobendosierung wird durch Addition von 50 µl einer Kalibrierlösung, die ein 1 × 10-2 molarer Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit 30 mM Penicillin G ist, zur Meßlösung in der Meßzelle (5) ausgeführt. Durch den Magnetrührer (6) wird die nun penicillinhaltige Meßlösung durchmischt, und das Penicillin G dringt in die Enzymmembran des Sensors (15) ein, wo auf Grund der biokatalytischen Reaktion das Penicillin G innerhalb der programmierten Meßzeit umgesetzt wird und damit eine pH-Änderung in der Enzymmembran verursacht wird. Der zweite Meßsensor (16) übt beim Kalibriervorgang noch keine Funktion aus, da im allgemeinen davon auszugehen ist, daß Meßlösung und Kalibrierlösung den gleichen pH-Wert besitzen. In gleicher Weise wie bei der Bestimmung des Korrekturfaktors beschrieben, wird unmittelbar nach Erfassung erster Potentialänderungen am Sensor (15) durch das Probenerkennungssystem (21) der Meßbeginn gestartet und die Meßzeit auch beendet. Am Ende der Meßzeit liegt eine der Penicillinkonzentration entsprechende pH-Wertänderung bzw. eine dieser entsprechende Spannung an, die durch das Meßwertaufnahmesystem (23) aufgenommen und als Meßsignal für die Kalibrierkonzentration ebenfalls im Zwischenspeicher (25) abgelegt wird. Die nächsten automatischen Meßablaufschritte sind wie oben beschrieben wieder die Spülvorgänge zum Erlangen des Grundzustandes des Meßsensors (15), einschließlich des eventuell erforderlichen Befehls zum "Sensorwechsel" mit nachfolgender "Eingabe der Meßzeit" als erneuter Meßablaufbeginn mit neuem Biosensorsystem (7). Der Kalibriervorgang kann gleichzeitig verbunden werden mit der - wegen des unvermeidlichen Aktivitätsverlustes der Enzymschicht - notwendigen Bestimmung des Aktivitätszustandes des Sensors (15). Dazu wurde in einem der Kalibrier- und Meßvorgangssteuerung (22) folgendem Erkennungssystem (26) für den Aktivitätszustand des Sensors (15) ein Mindestwert der zu erreichenden Spannung für die Kalibrierkonzentration des Penicillins G eingegeben und abgespeichert. Wird dieser Spannungswert nach Zugabe der Kalibrierlösung zur Meßlösung nicht erreicht, so erfolgt als erstes der Befehl über die Meßvorrichtungsteile (27) oder (28) "Verdoppelung des Kalibrierlösungsvolumens". Das bedeutet, daß man mit 50 µl einer 10-2 normalen Salzsäure und 100 µl Kalibrierlösungsvolumen den Meßablauf von "Eingabe der Meßzeit" an wiederholt. Wird auch dann der Wert für die vorgegebene Mindestspannung nicht erreicht, so erfolgt wieder der Befehl "Sensorwechsel".Fig. 1 shows the basic structure of the measuring device and is used to illustrate the measurement processes. To determine the penicillin concentration in fermentation solutions, this is made from a pH electrode coated with penicillinase (EC 3.5.2.6.) As a sensor (15 ) and an uncoated pH electrode as a sensor (16 ) - both sensors are equipped with an integrated reference sensor (17 ) used - existing biosensor system (7 ) in the measuring cell (5 ) angeord net. As the next preparatory steps for penicillin determination in fermentation solutions, the concentration of a mineral acid required to determine the correction factor and then the suitable buffer capacity for the calibration buffer are determined by titration of fermentation solutions. All other work steps - except for the dosing processes, which are not the subject of this measuring device according to the invention, but can certainly be integrated into the automatic measuring sequence - are carried out with the aid of the measuring time device (18 ), the time sequence control (19 ), the measuring sequence control (20 ), and the sample detection system (21 ) and the calibration and measuring process control (22 ) automatically or are executed according to vi suellen and via the computer-aided control and evaluation unit (3 ) controlled instructions. All measuring steps described below are subject to a programmed measuring sequence, which is controlled by the measuring sequence controller (20 ). At the beginning of the use of the measuring device, the measuring solution is pumped from the reservoir (11 ) with the aid of the metering pump (10 ) with the valve (9 ) and the valve (13 ) open via the measuring cell flow line (8 ) into the measuring cell (5 ), in the above biosensor system (7 ) is immersed. After filling the measuring cell (5 ) with the measuring solution, the checking of the basic state of the measuring sensors (15 ) and (16 ) begins. If the output potentials of the measuring sensors (15 ) and (16 ) are not constant, the measuring cell is emptied, filled again and the measuring sensors (15 ) and (16 ) are automatically equilibrated until the output potentials are constant. If this does not succeed with five of the flushing processes described, parts of the measuring device (27 ) or (28 ) are given the command "sensor change". In the case of constant output potentials, the command "input of the measuring time" is given, which is carried out via the data input unit (4 ). Depending on the activity state of the sensor (15 ) coated with penicillinase, when measuring penicillin in fermentation solutions the measuring time is in the range of two to five seconds and is in this area via the data input unit (4 ) of the measuring time device (18 ) of the control and also to communicate the evaluation unit (3 ) in which it is stored for the subsequent measurement processes. The next step in the measurement process is the determination of the correction factor for the biosensor system (7 ). For this purpose, 50 µl of a 10-2 normal hydrochloric acid solution are added to the measurement solution after the command has been issued. Immediately after the first potential changes have been detected by the sample detection system (21 ), which is connected to the sensors (15 ) and (16 ) via the analog-digital converter (2 ), the start of the measurement time is determined by the time integrated in the measurement time device (18 ) sequence control (19 ) triggered. After the programmed measuring time has elapsed, the measuring process - also by the time control (19 ) - is aborted. The resulting measurement signals then arrive in the measured value recording system (23 ), from where they are called up by the device for processing measured values and generating results (24 ) to calculate the correction factor. The correction factor determined here is first stored in the buffer (25 ). After determining the correction factor, the measuring cell is automatically emptied with the valve (9 ) and the valve (13 ) closed and filled with measuring solution in order to reach the basic state of the sensors (15 ) and (16 ) again. If the output potentials are not reached after five flushing processes, the "sensor change" command is issued again and the measuring process is repeated from the beginning. When the basic potential conditions are reached, the measuring system (1 ), strictly speaking the measuring cell (5 ) with the biosensor system (7 ), is calibrated with a defined penicillin concentration using the calibration and measuring process control (22 ). For this purpose, after the command has been issued, the calibration concentration of penicillin G is first communicated to the control and evaluation unit (3 ) via the data input unit (4 ), where it is stored in the intermediate store (25 ). The subsequent request for calibration sample dosing is carried out by adding 50 μl of a calibration solution, which is a 1 × 10-2 molar phosphate buffer with a pH of 7.0 with 30 mM penicillin G, to the measurement solution in the measuring cell (5 ). The magnetic stirrer (6 ) mixes the measuring solution now containing penicillin, and the penicillin G penetrates into the enzyme membrane of the sensor (15 ), where due to the biocatalytic reaction the penicillin G is converted within the programmed measuring time and thus a pH Change in the enzyme membrane is caused. The second measuring sensor (16 ) has no function during the calibration process, since it can generally be assumed that the measuring solution and the calibration solution have the same pH. In the same way as described for the determination of the correction factor, immediately after detection of the first potential changes on the sensor (15 ) by the sample detection system (21 ) the start of the measurement is started and the measurement time is also ended. At the end of the measuring time there is a pH value change corresponding to the penicillin concentration or a voltage corresponding to this, which is recorded by the measured value recording system (23 ) and also stored in the buffer (25 ) as a measurement signal for the calibration concentration. As described above, the next automatic measuring sequence steps are again the rinsing processes for obtaining the basic state of the measuring sensor (15 ), including the possibly required command for "sensor change" with subsequent "input of the measuring time" as a new measuring sequence start with a new biosensor system (7 ). The calibration process can simultaneously be combined with the determination of the activity state of the sensor (15 ), which is necessary because of the inevitable loss of activity of the enzyme layer. For this purpose, a minimum value of the voltage to be achieved for the calibration concentration of penicillin G was entered and stored in a detection system (26 ) following the calibration and measurement process control (22 ) for the activity state of the sensor (15 ). If this voltage value is not reached after the calibration solution has been added to the measurement solution, the first step is the command via the measuring device parts (27 ) or (28 ) "doubling the volume of the calibration solution". This means that with 50 µl of a 10-2 normal hydrochloric acid and 100 µl calibration solution volume, the measurement sequence is repeated from "entering the measurement time". If the value for the specified minimum voltage is still not reached, the "sensor change" command is issued again.
Erst nach der beschriebenen Ermittlung des Korrekturfaktors und Kalibrierung des Meßsystems (1) ist die quantitative Bestimmung von Penicillin G in Fermentationslösungen möglich. Dazu werden auf den Befehl "Probendosierung" 50 µl (bei Kalibrierung mit 100 µl Kalibrierlösung 100 µl) Fermentationslösung zur Meßlösung dosiert, wobei bei der weiteren Beschreibung des Meßablaufes davon ausgegangen wird, daß der pH-Wert der Fermentationslösung von dem der Meßlösung abweicht. Durch den Sensor (15) wird nach der Probenzugabe zur gerührten Meßlösung die durch die biokatalytische Reaktion verursachte pH-Wert- bzw. Spannungsänderung und die pH-Wert- bzw. Spannungsdifferenz zwischen Meßlösung und Fermentationslösung in der gleichen Weise gemessen, wie es bei der Bestimmung des Korrekturfaktors und der Darstellung des Kalibriervorganges beschrieben wurde. Der Gesamtspannungswert vom Sensor (15) wird vom Meßwertaufnahmesystem (23) aufgenommen und danach im Zwischenspeicher (25) abgelegt. Gleichzeitig mit der Erfassung der Spannungssignale am Sensor (15) wird am Sensor (16) allein die pH-Wertdifferenz bzw. die ihr entsprechende Spannungsdifferenz zwischen Meßlösung und Fermentationslösung gemessen, die auch im Zwischenspeicher (25) abgelegt wird. Nach Abruf aus dem Zwischenspeicher (25) wird durch die Vorrichtung (24) die Differenz aus den Meßsignalen des Sensors (15) und des Sensors (16) gebildet, und dieser Wert wird ebenfalls im Zwischenspeicher (25) abgelegt.Only after the described determination of the correction factor and calibration of the measuring system (1 ) is the quantitative determination of penicillin G in fermentation solutions possible. For this purpose, 50 µl (with calibration with 100 µl calibration solution, 100 µl) fermentation solution are metered to the measurement solution on the command "sample dosing", whereby it is assumed in the further description of the measurement process that the pH value of the fermentation solution is that of the measurement solution deviates. By the sensor (15 ) after the addition of gas to the stirred measuring solution, the pH or voltage change caused by the biocatalytic reaction and the pH or voltage difference between the measuring solution and fermentation solution are measured in the same way as for the determination of the correction factor and the representation of the calibration process has been described. The total voltage value from the sensor (15 ) is recorded by the measured value recording system (23 ) and then stored in the intermediate store (25 ). Simultaneously with the detection of the voltage signals on the sensor (15 ) on the sensor (16 ) alone the pH value difference or the voltage difference corresponding to it between the measurement solution and the fermentation solution is measured, which is also stored in the buffer (25 ). After retrieval from the buffer store (25 ), the device (24 ) forms the difference between the measurement signals from the sensor (15 ) and the sensor (16 ), and this value is also stored in the buffer store (25 ).
Nach Beendigung des Meßvorganges mit der penicillinhaltigen Fermentationslösungsprobe werden wieder die oben beschriebenen Spülvorgänge zum Erlangen der Grundzustände der Meßsensoren (15) und (16) automatisch ausgeführt, wobei nachfolgend in Abhängigkeit von den angezeigten Befehlen entweder die nächste penicillinhaltige Fermentationsprobe vermessen wird oder wegen zu niedrigem Aktivitätszustand des Sensors (15) infolge Aktivitätsverlustes in der Enzymmembran bei zu langem Meßeinsatz neu kalibriert bzw. ein Sensorwechsel vorgenommen werden muß. Kürzere Meßunterbrechungen von größer als fünf Minuten werden durch die Meßablaufsteuerung (20) der Steuer- und Auswerteeinheit (3) automatisch mit der Überprüfung der Grundzustände der Meßsensoren (15) und (16) beantwortet und solche Meßunterbrechungen von mehr als sechzig Minuten grundsätzlich mit einem neuen Meßbeginn durch den Befehl "Eingabe der Meßzeit" mit den sich anschließenden, beschriebenen Meßabläufen.After the end of the measuring process with the penicillin-containing fermentation solution sample, the rinsing processes described above for achieving the basic states of the measuring sensors (15 ) and (16 ) are automatically carried out again, depending on the commands displayed either the next penicillin-containing fermentation sample being measured or because of low activity state of the sensor (15 ) as a result of loss of activity in the enzyme membrane if the measurement is too long, or a sensor change must be carried out. Shorter interruptions in measurement of more than five minutes are automatically answered by the measurement sequence control (20 ) of the control and evaluation unit (3 ) by checking the basic states of the measurement sensors (15 ) and (16 ), and such measurement interruptions of more than sixty minutes are generally answered with one new start of measurement with the command "Enter the measurement time" with the subsequent described measurement sequences.
Durch die Meßablaufsteuerung (20) wird auch nach einer über die Dateneingabeeinheit (4) programmierten und damit frei wählbaren Zeit, vorteilhafterweise aber nach 60 Minuten, der Befehl zur Neukalibrierung des Meßsystems (1) gegeben. Weiter gehört zum durch die Meßablaufsteuerung (20) gesteuerten Meßablaufprogramm, daß nach jedem über die Dateneingabeeinheit (4) vorzunehmenden Auslösen eines Meßvorganges die Meßzelle zunächst geleert und wieder mit Meßlösung gefüllt wird. Die Berechnung der in der Fermentationslösung enthaltenen Penicillinkonzentration wird durch die in die Steuer- und Auswerteeinheit (4) integrierte Vorrichtung zur Meßwertverarbeitung und Ergebnisbildung (24) übernommen, die dazu die im Zwischenspeicher (25) abgespeicherten Werte des Korrekturfaktors für das Biosensorsystem (7) und die Differenzwerte als Ergebnis der Probenmessungen abruft. Der Wert des Korrekturfaktors und die Differenzwerte werden miteinander multipliziert, so daß Spannungswerte erhalten werden, die den wahren Penicillinkonzentrationen in der Fermentationslösung entsprechen. Gleichzeitig mit der Berechnung wird durch das Meßvorrichtungsteil (24) der Spannungswert für die Kalibrierkonzentration von 30 mM Penicillin G pro Liter Kalibrierpuffer aus dem Zwischenspeicher (25) abgerufen und im letzten Berechnungsschritt das Ergebnis der Konzentrationsbestimmung von Penicillin G in Fermentations lösungen durch einen Vergleich des gemessenen und korrigierten Spannungswertes mit dem Spannungswert für die bekannte Kalibrierkonzentration ermittelt. Dieses durch Vergleich erhaltene Meßergebnis wird zum Abschluß des Meßvorganges über das Anzeigegerät (27) digital oder über das Dokumentationsgerät (28), das ein Drucker oder Monitor sein kann, in Konzentrationseinheiten pro Volumeneinheit - aber auch nach entsprechender Kalibrierung oder Umrechnung ein Aktivitätseinheiten pro Volumeneinheit - angezeigt bzw. ausgegeben. Mit der beschriebenen Meßvorrichtung wurden bei der Penicillinbestimmung folgende Leistungsparameter erreicht:The measuring sequence control (20 ) also gives the command for recalibration of the measuring system (1 ) after a time programmed and thus freely selectable via the data input unit (4 ), but advantageously after 60 minutes. Next to the measuring sequence control (20 ) controlled measuring sequence program that after each data input unit (4 ) to be triggered triggering a measuring process, the measuring cell is first emptied and filled again with measuring solution. The calculation of the penicillin concentration contained in the fermentation solution is carried out by the device for measurement value processing and result generation (24 ) integrated in the control and evaluation unit (4 ), which for this purpose stores the values of the correction factor for the bio sensor system (7 ) stored in the buffer (25 ) ) and retrieves the difference values as a result of the sample measurements. The value of the correction factor and the difference values are multiplied with one another, so that voltage values are obtained which correspond to the true peni cillin concentrations in the fermentation solution. Simultaneously with the calculation, the voltage value for the calibration concentration of 30 mM penicillin G per liter of calibration buffer is called up from the buffer (25 ) by the measuring device part (24 ) and in the last calculation step the result of the concentration determination of penicillin G in fermentation solutions by comparing the measured and corrected voltage value determined with the voltage value for the known calibration concentration. This measurement result obtained by comparison is digitally at the end of the measuring process via the display device (27 ) or via the documentation device (28 ), which can be a printer or monitor, in concentration units per unit volume - but also after appropriate calibration or conversion, one activity unit per Volume unit - displayed or output. With the measuring device described, the following performance parameters were achieved when determining penicillin:
Die erfindungsgemäße Meßvorrichtung wird benutzt zur Bestimmung von Harnstoff in Serum. Meßprinzip und Meßablauf entsprechen den in Beispiel 1 beschriebenen. Die pH-sensitive Oberfläche des Meßsensors (15) des Biosensorsystems (7) wurde mit Urease beschichtet, während der Meßsensor (16) auch in diesem Falle unbeschichtet bleibt. Als Meßlösung wird eine von der Dialyse mit der künstlichen Niere her bekannte Dialyselösung verwendet, deren pH-Wert 7,4 ist. Der Korrekturfaktor für das Biosensorsystem (7) wird mit einer 0,015 n Natronlauge bestimmt. Kalibriert wird das Meßsystem (1) mit einer 10 millimolaren Harnstoffkalibrierlösung. Folgende Leistungsparameter wurden bei der Harnstoffbestimmung erreicht:The measuring device according to the invention is used to determine urea in serum. The measuring principle and measuring sequence correspond to those described in Example 1. The pH-sensitive surface of the measuring sensor (15 ) of the biosensor system (7 ) was coated with urease, while the measuring sensor (16 ) also remains uncoated in this case. A dialysis solution known from dialysis with the artificial kidney is used as the measuring solution, the pH of which is 7.4. The correction factor for the biosensor system (7 ) is determined with a 0.015 N sodium hydroxide solution. The measuring system (1 ) is calibrated with a 10 millimolar urea potassium brine solution. The following performance parameters were achieved when determining urea:
Die analytischen Parameter entsprechen denen des Beispiels 1.The analytical parameters correspond to those of Example 1.
Die erfindungsgemäße Meßvorrichtung wird benutzt zur Bestimmung von Disacchariden in Gegenwart von Glukose. Bei der Saccharosebestimmung in Gegenwart von Glukose sieht das Biosensorsystem (7) wie nachfolgend beschrieben aus.The measuring device according to the invention is used to determine disaccharides in the presence of glucose. When determining sucrose in the presence of glucose, the biosensor system (7 ) looks as described below.
Die Meßsensoren (15) und (16) sind Sauerstoff oder seine Reduktionsprodukte messende Sensoren mit Referenzsensor (17) und mit entsprechenden, die Meßsignale bildenden, kommerziellen Bauteilen. Der Meßsensor (15) ist beschichtet mit einer Enzymmembran, die Saccharose (Invertase), Mutarotase und Glukoseoxidase enthält, der Sensor (16) hingegen ist nur mit einer Glukoseoxidase enthaltenden Membran, die gegebenenfalls noch Mutarotase enthalten kann, beschichtet. Als Meßlösung dient ein Phosphatpuffer (0,1 mol/l) vom pH-Wert im Bereich von 6 bis 7,5. Der Korrekturfaktor für das Biosensorsystem (7) wird mit einer Glukoselösung (10 mM) bestimmt und kalibriert wird mit einer Saccharoselösung (10 mM). Zur Ergebnisbildung wird die 1. Ableitung des Stromes nach der Zeit des Maximalwertes des Meßstromes als Meßsignal herangezogen. Innerhalb von 10 bis 15 Sekunden steht das Meßergebnis zur Verfügung, und die Gesamtmeßzeit für eine Meßprobe beträgt weniger als 30 Sekunden.The measuring sensors (15 ) and (16 ) are oxygen or its reduction products sensors with a reference sensor (17 ) and with corresponding commercial components forming the measuring signals. The measuring sensor (15 ) is coated with an enzyme membrane containing sucrose (invertase), mutarotase and glucose oxidase, the sensor (16 ), on the other hand, is only coated with a glucose oxidase containing the membrane, which may also contain mutarotase. A phosphate buffer (0.1 mol / l) with a pH in the range from 6 to 7.5 is used as the measurement solution. The correction factor for the biosensor system (7 ) is determined with a glucose solution (10 mM) and calibrated with a sucrose solution (10 mM). The first derivative of the current after the time of the maximum value of the measuring current is used as the measuring signal to form the result. The measurement result is available within 10 to 15 seconds and the total measurement time for a measurement sample is less than 30 seconds.
Biosensorsysteme (7) der Meßvorrichtung mit gleichen Leistungsparametern können zur Bestimmung anderer Disaccharide wie Laktose oder Maltose herangezogen werden, wenn die Enzymzusammensetzung des Sensors (15) verändert wird bei unverändertem Sensor (16). Zur Bestimmung von Laktose besteht die Enzymmembran des Meßsensors (15) aus den immobilisierten Enzymenβ-Galaktosidase, Mutarotease und Glukoseoxidase und für die Maltosebestimmung aus den immobilisierten Enzymen Glukoamylase, Mutarotase und Glukoseoxidase, während der Meßsensor (16) wie beim Beispiel der Saccharosebestimmung aufgebaut ist.Biosensor systems (7 ) of the measuring device with the same performance parameters can be used to determine other disaccharides such as lactose or maltose if the enzyme composition of the sensor (15 ) is changed with the sensor (16 ) unchanged. To determine lactose, the enzyme membrane of the measuring sensor (15 ) consists of the immobilized enzymesβ- galactosidase, mutarotease and glucose oxidase and for the determination of maltose from the immobilized enzymes glucoamylase, mutarotase and glucose oxidase, while the measuring sensor (16 ) is constructed as in the example of sucrose determination is.
Verwendete Bezugszeichen zurFig. 1Reference numerals used forFIG. 1
1 = Meßsystem
2 = Analog-Digital-Wandler
3 = Steuer- und Auswerteeinheit
4 = Dateneingabeeinheit
5 = Meßzelle
6 = Rührer
7 = Biosensorsystem
8 = Meßzellenzuflußleitung
9 = Ventil
10 = Dosiervorrichtung
11 = Vorratsbehälter für die Meßlösung
12 = Meßzellenabflußleitung
13 = Ventil
14 = Absaugvorrichtung
15 = Sensor1
16 = Sensor2
17 = Referenzsensor
18 = Meßzeiteinrichtung
19 = Zeitablaufsteuerung
20 = Meßablaufsteuerung
21 = Probenerkennungssystem
22 = Kalibrier- und Meßvorgangssteuerung
23 = Meßwertaufnahmesystem
24 = Vorrichtung zur Meßwertverarbeitung und Ergebnisbildung
25 = Zwischenspeicher
26 = Erkennungssystem für Aktivitätszustand des Biosensorsystems (7)
27 = Anzeigegerät
28 = Dokumentationsgerät
29 = Stromversorgungssystem
30 = Gerätegehäuse
→ = elektrische Leitungen
← = elektrische Leitungen1 = measuring system
2 = analog-digital converter
3 = control and evaluation unit
4 = data entry unit
5 = measuring cell
6 = stirrer
7 = biosensor system
8 = measuring cell inflow line
9 = valve
10 = dosing device
11 = storage container for the measuring solution
12 = measuring cell drain line
13 = valve
14 = suction device
15 = sensor1
16 = sensor2
17 = reference sensor
18 = measuring time device
19 = timing control
20 = measurement sequence control
21 = sample detection system
22 = calibration and measuring process control
23 = measurement recording system
24 = device for processing measured values and generating results
25 = buffer
26 = detection system for the state of activity of the biosensor system (7 )
27 = display device
28 = documentation device
29 = power supply system
30 = device housing
→ = electrical cables
← = electrical cables
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