Die Erfindung betrifft neue, vom Neuropeptid Y (NPY) abgeleitete Peptide, deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel.The invention relates to novel peptides derived from neuropeptide Y (NPY),their preparation and their use as medicaments.
NPY wurde 1982 aus Schweinehirn isoliert (Nature 296 (1982) 659) und ist inzwischen in einer ganzen Reihe von Säugerspezies nachgewiesen worden. Humanes NPY besitzt die folgende Sequenz:NPY was isolated from porcine brain in 1982 (Nature 296 (1982) 659) and ishave now been detected in a number of mammalian species.Human NPY has the following sequence:
H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Me-t-Ala
Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg--Tyr-NH₂H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Ala-Me-t
Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg - Tyr-NH₂
Das im peripheren und zentralen Nervensystem weit verbreitete Peptid ist einer der potentesten bekannten Vasokonstriktoren. Es verstärkt zudem die blutdrucksteigernde Wirkung von Noradrenalin und ist in der Lage, kardiale und cerebrale Vasospasmen hervorzurufen. Alle diese Beobachtungen weisen darauf hin, daß NPY maßgeblich an der neuronalen Regulation des Blutdrucks beteiligt ist.The peptide is widespread in the peripheral and central nervous systemone of the most potent known vasoconstrictors. It also reinforces thehypertensive effect of norepinephrine and is able to cardiacand cerebral vasospasm. All these observations pointsuggest that NPY is instrumental in the neural regulation of blood pressureis involved.
Es wurden nun Peptide gefunden, mit denen man NPY antagnonisieren kann.Peptides have now been found that can be used to antagonize NPY.
Gegenstand der Erfindung sind Peptide der FormelThe invention relates to peptides of the formula
Z-Ak-Bl-Cm-Dn-Eo-Fp-Gq-H-Thr-I-Gln-J-K-NH₂ZAk -Bl -Cm -Dn -Eo -Fp -Gq -H-Thr-I-Gln-JK-NH₂
worin
A Phe oder Tyr,
B Pro, Ser, Abu, Gly, Ala, Cys, Pro-Ser, Cys-Ser, Abu-Ser, Gly-Ser, Ala-Ser oder Pro-Ala,
C eine Aminosäure mit basischer Seitenkette,
D Pro oder Cys,
E die Gruppierung -NH-(C₂)t-CO- (mit t in der Bedeutung einer ganzen Zahl von 0 bis 10),
F Cys, Abu, Gly oder Ala,
G Ile-Asn, Leu-Asn, Val-Asn oder Asn,
H ein aus lipophilen Aminosäuren zusammengesetzter Dipeptidrest,
I eine Aminosäure mit basischer Seitenkette,
J eine Aminosäure mit basischer Seitenkette,
K Phe oder Tyr und
Z ein Wasserstoffatom, eine Aminoschutzgruppe, einen Benzylrest, einen C2-10-Acylrest oder einen C1-5-Alkylrest
darstellen,
k, l, m, n, o, p und q die Zahlen 0 oder 1 bedeuten, wobei jedoch k+l+ m+n+o+p+q1 sein muß,
und zwei gegebenenfalls vorhandene Cys-Reste über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sein können, sowie deren Salze mit physiologisch verträglichen Säuren.wherein
A Phe or Tyr,
B Pro, Ser, Abu, Gly, Ala, Cys, Pro-Ser, Cys-Ser, Abu-Ser, Gly-Ser, Ala-Ser or Pro-Ala,
C is an amino acid with a basic side chain,
D pro or cys,
E is the grouping -NH- (C₂)t -CO- (with t meaning an integer from 0 to 10),
F Cys, Abu, Gly or Ala,
G Ile-Asn, Leu-Asn, Val-Asn or Asn,
H is a dipeptide residue composed of lipophilic amino acids,
I an amino acid with basic side chain,
J is an amino acid with a basic side chain,
K Phe or Tyr and
Z is a hydrogen atom, an amino-protecting group, a benzyl radical, a C2-10 -acyl radical or a C1-5 -alkyl radical
represent
k, l, m, n, o, p and q are the numbers 0 or 1, but where k + l + m + n + o + p + q1,
and two optionally present Cys residues may be linked together via a disulfide bridge, as well as their salts with physiologically acceptable acids.
In den neuen Peptiden sind die teilweise strukturell modifizierten N- und C-terminalen Fragmente des NPY über einen den mittleren Sequenzabschnitt des NPY ersetzenden Spacer (E) miteinander verbunden. Die Längen der N- und C-terminalen Enden und des Spacers sind variabel.In the new peptides are the partially structurally modified N- andC-terminal fragments of the NPY via a middle sequence sectionof the NPY replacing spacer (E) connected together. The lengths of theN- and C-terminal ends and the spacer are variable.
Als basische Aminosäuren für C, I und J kommen Arg, hArg, His, Lys und Orn in Betracht. Als lipophile Aminosäuren (vgl. H) sind Ile, Leu, Val, Phe, Trp, Nle, Pro zu nennen. Geeignete Schutzgruppen (vgl. Z) sind folgende: t-Butyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Fluorenylmethyloxycarbonyl.The basic amino acids for C, I and J are Arg, hArg, His, Lys and Orninto consideration. Lipophilic amino acids (see H) are Ile, Leu, Val, Phe,Trp, Nle, Pro name. Suitable protecting groups (see Z) are the following:t-butyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, fluorenylmethyloxycarbonyl.
Als physiologisch verträgliche Säuren sind insbesondere zu nennen: Salzsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Milchsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure, Malonsäure, Schwefelsäure, L-Glutaminsäure, L-Asparaginsäure, Brenztraubensäure, Schleimsäure, Benzoesäure, Glucuronsäure, Oxalsäure, Ascorbinsäure, Acetylglycin.As physiologically acceptable acids are in particular:Hydrochloric acid, citric acid, tartaric acid, lactic acid, phosphoric acid, methanesulfonic acid,Acetic acid, formic acid, maleic acid, fumaric acid, malic acid,Succinic acid, malonic acid, sulfuric acid, L-glutamic acid,L-aspartic acid, pyruvic acid, mucic acid, benzoic acid, glucuronic acid,Oxalic acid, ascorbic acid, acetylglycine.
Von den neuen Peptiden sind diejenigen bevorzugt, in denen C Lys, Orn, Arg oder hArg, G Ile-Asn, Leu-Asn, Val-Asn oder Asn, H Leu-Ile, Leu-Val, Leu-Leu, Val-Leu, Val-Val, Val-Ile, Ile-Ile, Ile-Leu oder Ile-Val, I Orn, Lys, Arg oder hArg, J Orn, Lys, Arg oder hArg und Z ein Wasserstoffatom, eine Aminoschutzgruppe, einen Acetyl-, p-Hydroxybenzoyl-, p-Hydroxyphenylacetat- oder p-Hydroxyphenylpropionylrest bedeuten.Of the new peptides, those are preferred in which C Lys, Orn, Argor hArg, G Ile-Asn, Leu-Asn, Val-Asn or Asn, H Leu-Ile, Leu-Val,Leu-Leu, Val-Leu, Val-Val, Val-Ile, Ile-Ile, Ile-Leu or Ile-Val, I Orn,Lys, Arg or hArg, J Orn, Lys, Arg or hArg and Z is a hydrogen atom,an amino protecting group, an acetyl, p-hydroxybenzoyl,p-Hydroxyphenylacetat- or p-Hydroxyphenylpropionylrest mean.
Besonders bevorzugt sind die Peptide, in den
C Lys oder Arg,
E die Gruppierung -NH-(CH₂)t-CO- (mit t in der Bedeutung einer ganzen Zahl von 1 bis 7)
F Cys oder Abu,
G Ile-Asn oder Asn
H Leu-Ile
I Arg
J Arg
Z ein Wasserstoffatom, einen Acetyl-, p-Hydroxybenzoyl-, p-Hydroxyphenylacetyl-, p-Hydroxyphenylpropionylrest
bedeuten und A, B, D, K sowie k-q die angegebenen Bedeutungen haben.Particularly preferred are the peptides in the
C Lys or Arg,
E is the grouping -NH- (CH₂)t -CO- (with t meaning an integer from 1 to 7)
F Cys or Abu,
G Ile-Asn or Asn
H Leu-Ile
I arg
J Arg
Z is a hydrogen atom, an acetyl, p-hydroxybenzoyl, p-hydroxyphenylacetyl, p-hydroxyphenylpropionyl radical
and A, B, D, K and kq have the meanings indicated.
Die neuen Verbindungen lassen sich nach in der Peptidchemie bekannten Methoden herstellen.The new compounds can be known in peptide chemistryEstablish methods.
So kann man die Peptide sequentiell aus Aminosäuren oder durch Fragmentverknüpfung geeigneter kleiner Peptide aufbauen. Beim sequentiellen Aufbau wird die Peptidkette beginnend am C-Terminus stufenweise um jeweils eine Aminosäure verlängert. Bei der Fragmentkupplung können Fragmente unterschiedlicher Länge miteinander verknüpft werden, wobei die Fragmente wiederum durch sequentiellen Aufbau aus Aminosäuren oder ihrerseits durch Fragmentkupplung gewonnen werden können. Die cyclischen Peptide werden nach Synthese der offenkettigen Peptide durch eine in hoher Verdünnung durchgeführt Cyclisierungsreaktion erhalten.Thus, the peptides can be sequenced from amino acids or by fragment linkagebuild up suitable small peptides. In the sequential structureThe peptide chain, starting at the C-terminus, becomes one step at a timeExtended amino acid. In the fragment coupling, fragments of differentLength are linked together, with the fragments in turnby sequential construction of amino acids or by themselvesFragment coupling can be obtained. The cyclic peptides becomeafter synthesis of the open-chain peptides by high dilutioncarried out cyclization reaction.
Sowohl beim sequentiellen Aufbau, als auch bei der Fragmentkupplung müssen die Bausteine durch Bildung einer Amidbindung verknüpft werden. Hierzu eignen sich enzymatische und chemische Methoden.Both the sequential structure, as well as the fragment coupling mustthe building blocks are linked by formation of an amide bond. For thisEnzymatic and chemical methods are suitable.
Chemische Methoden zur Amidbindungsbildung sind ausführlich behandelt bei Müller, Methoden der Organischen Chemie Vol XV/2, pp 1-364, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974; Stewart, Young, Solid Phase Peptide Synthesis, pp 31-34, 71-82, Pierce Chemical Company, Rockford, 1984; Bodanszky, Klausner, Ondetti, Peptide Synthesis, pp 85-128, John Wiley & Sons, New York, 1976 und anderen Standardwerken der Peptidchemie. Besonders bevorzugt sind die Azidmethode, die symmetrische und gemischte Anhydridmethode, in situ erzeugte oder präformierte Aktivester und die Amidbindungsbildung mit Hilfe von Kupplungsreagenzien (Aktivatoren), insbesondere Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Diisopropylcarbodiimid (DIC), 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin (EEDQ), 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid (EDCI), n-Propanphosphonsäureanhydrid (PPA), N,N-Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)amindophosphorsäurechlorid (BOP-Cl), Diphenyl-phosphorylazid (DPPA), Castro's Reagenz (BOP), O-Benzotriazolyl-N,N,N′,N′-tetramethyluronium-Salz (HBTU), 2,5-Diphenyl-2,3-dihydro-3-oxo-4-hydroxythiophendioxid (Stegliches Reagenz; HOTDO) und 1,1′-Carbonyl-diimidazol (CDI). Die Kupplungsreagenzien können allein oder in Kombination mit Additiven wie N,N′-Dimethyl-4-aminopyridin (DMAP), N-Hydroxybenzotriazol (HOBt), N-Hydroxybenzotriazin (HOOBt), N-Hydroxysuccinimid (HOSu) oder 2-Hydroxypyridin eingesetzt werden.Chemical methods for amide bond formation are discussed in detailMüller, Methods of Organic Chemistry Vol XV / 2, pp 1-364, Thieme Verlag,Stuttgart, 1974; Stewart, Young, Solid Phase Peptide Synthesis,pp 31-34, 71-82, Pierce Chemical Company, Rockford, 1984; Bodanszky,Klausner, Ondetti, Peptide Synthesis, pp 85-128, John Wiley & Sons, NewYork, 1976 and other standard works of peptide chemistry. Especially preferredare the azide method, the symmetric and mixed anhydride method,in situ generated or preformed active esters and amide bond formationwith the aid of coupling reagents (activators), in particular dicyclohexylcarbodiimide(DCC), diisopropylcarbodiimide (DIC), 1-ethoxycarbonyl2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline (EEDQ), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride (EDCI), n-propanephosphonic anhydride (PPA), N, N-Bis (2-oxo-3-oxazolidinyl) aminophosphoric acid chloride (BOP-Cl), diphenylphosphoryl azide (DPPA), Castro's reagent (BOP), O-benzotriazolyl-N, N, N ', N'-tetramethyluronium salt (HBTU), 2,5-diphenyl-2,3-dihydro-3-oxo-4-hydroxythiophene dioxide(Strept reagent, HOTDO) and 1,1'-carbonyl-diimidazole(CDI). The coupling reagents may be used alone or in combination withAdditives such as N, N'-dimethyl-4-aminopyridine (DMAP), N-hydroxybenzotriazole(HOBt), N-hydroxybenzotriazine (HOOBt), N-hydroxysuccinimide (HOSu) or2-hydroxypyridine can be used.
Während bei der enzymatischen Peptidsynthese normalerweise auf Schutzgruppen verzichtet werden kann, ist für die chemische Synthese ein reversibler Schutz der an der Bildung der Amidbindung nicht beteiligten reaktiven funktionellen Gruppen der beiden Reaktionspartner erforderlich. Bei den chemischen Peptidsynthese werden drei literaturbekannte Schutzgruppentechniken bevorzugt: Die Benzyloxycarbonyl(Z)-, die t-Butyloxycarbonyl(Boc)- und die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl(Fmoc)-Schutzgruppentechnik. Bezeichnet ist jeweils die Schutzgruppe der α-Aminofunktion des kettenverlängernden Bausteines. Die Seitenkettenschutzgruppen der trifunktionellen Aminosäuren werden so gewählt, daß sie nicht notwendigerweise zusammen mit der α-Aminoschutzgruppe abgespalten werden. Eine ausführliche Übersicht über Aminosäureschutzgruppen gibt Müller, Methoden der Organischen Chemie Vol XV/1, pp 20-906, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974.While in enzymatic peptide synthesis normally protective groupscan be omitted is a reversible for chemical synthesisProtection of reactive non-involved in the formation of the amide bondfunctional groups of the two reactants required. atThe chemical peptide synthesis are three known protection group techniquespreferred: the benzyloxycarbonyl (Z) -, the t-butyloxycarbonyl(Boc) - and the 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) protection group technique.In each case, the protective group of the α-amino function of thechain-extending building block. The side chain protecting groups of trifunctionalAmino acids are chosen so that they are not necessarilybe cleaved together with the α-amino protecting group. A detailedOverview of amino acid protecting groups are Müller, methods ofOrganic Chemistry Vol XV / 1, pp 20-906, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974.
Die Bausteine, die dem Aufbau der Peptidkette dienen, können in Lösung, in Suspension oder nach einem ähnlichen Verfahren, wie es von Merrifield in J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149, 1963 beschrieben ist, zur Reaktion gebracht werden. Besonders bevorzugt sind Verfahren, bei denen Peptide sequentiell oder durch Fragmentkupplung unter Verwendung der Z-, Boc- oder Fmoc-Schutzgruppentechnik aufgebaut werden, wobei die Reaktionspartner in Lösung zur Reaktion gebracht werden, sowie Verfahren, bei denen, ähnlich der genannten Merrifield-Technik, ein Reaktionspartner an einen unlöslichen polymeren Träger (im folgenden auch Harz genannt) gebunden zur Reaktion gebracht wird. Dabei wird das Peptid typischerweise unter Verwendung der Boc- oder Fmoc-Schutzgruppentechnik sequentiell am polymeren Träger aufgebaut, wobei die wachsende Peptidkette am C-Terminus kovalent mit den unlöslichen Harzteilchen verbunden ist (vgl. Abb. 1 und 2). Diese Arbeitsweise erlaubt es, Reagentien und Nebenprodukte durch Filtration zu entfernen, die Umkristallisation von Zwischenprodukten wird somit überflüssig.The building blocks that serve to build the peptide chain can be dissolved in solution, inSuspension or by a similar method as described by Merrifield inJ. Amer. Chem. Soc. 85, 2149, 1963, reactedbecome. Particularly preferred are methods in which peptides are sequential or by fragment coupling using the Z, Boc or FmocProtective group technology are constructed, the reaction partners inSolution to be reacted, as well as methods in which, similarthe aforementioned Merrifield technique, a reaction partner to an insolublepolymeric carrier (hereinafter also called resin) bound toReaction is brought. The peptide is typically usedBoc or Fmoc protective group technique sequentially on the polymericCarrier constructed with the growing peptide chain at the C-terminus covalentis associated with the insoluble resin particles (see Fig. 1 and 2). TheseOperation allows reagents and by-products by filtration toremove, the recrystallization of intermediates is thus unnecessary.
Die geschützten Aminosäuren können an beliebige geeeignete Polymerisate gebunden werden, die lediglich in den verwendeten Lösungsmitteln unlöslich sein und eine beständige physikalische Form, die leichte Filtration ermöglicht, aufweisen müssen. Das Polymerisat muß eine funktionelle Gruppe enthalten, an die die erste geschützte Aminosäure durch eine kovalente Bindung fest gebunden werden kann. Für diesen Zweck eignen sich die verschiedensten Polymerisate, z. B. Cellulose, Polyvinylalkohol, Polymethacrylat, sulfoniertes Polystyrol, chlormethyliertes Copolymerisat von Styrol und Divinylbenzol (Merrifield-Harz), 4-Methylbenzhydrylamin-Harz (MBHA-Harz), Phenylacetamidomethyl-Harz (Pam-Harz), p-Benzyloxybenzylalkohol-Harz, Benzhydrylamin-Harz (BHA-Harz), 4-(Hydroxymethyl)-benzoyloxymethyl-Harz, Harz nach Breipohl et al. (Tetrahedron Lett. 28, 565, 1987; Fa. BACHEM), HYCRAM-Harz (Fa. ORPEGEN) oder SASRIN-Harz (Fa. BACHEM).The protected amino acids can be used on any suitable polymerswhich are insoluble only in the solvents usedand a stable physical form that allows for easy filtrationmust have. The polymer must be a functional groupcontain, to which the first protected amino acid by a covalentBinding can be tied tightly. For this purpose, the most diversePolymers, e.g. Cellulose, polyvinyl alcohol, polymethacrylate,sulfonated polystyrene, chloromethylated copolymer ofStyrene and divinylbenzene (Merrifield resin), 4-methylbenzhydrylamine resin(MBHA resin), phenyl acetamidomethyl resin (Pam resin), p-benzyloxybenzyl alcoholResin, benzhydrylamine resin (BHA resin), 4- (hydroxymethyl) -benzoyloxymethylResin, resin according to Breipohl et al. (Tetrahedron Lett. 28, 565,, 1987; BACHEM), HYCRAM resin (ORPEGEN) or SASRIN resin(BACHEM company).
Für die Peptidsynthese in Lösung eignen sich alle Lösungsmittel, die sich unter den Reaktionsbedingungen als inert erweisen, insbesondere Wasser, N,N′-Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Acetonitril, Di-chlormethan (DCM), 1,4-Dioxan, Tetrahydrofuran (THF), N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) sowie Gemische der genannten Lösungsmittel. Die Peptidsynthese am polymeren Träger kann in allen inerten organischen Lösungsmitteln, in denen die verwendeten Aminosäurederivate löslich sind, durchgeführt werden; bevorzugt sind jedoch Lösungsmittel, die zusätzlich harzquellende Eigenschaft besitzen, wie DMF, DCM, NMP, Acetonitril und DMSO, sowie Gemische dieser Lösungsmittel.For the peptide synthesis in solution, all solvents are suitableprove to be inert under the reaction conditions, especially water,N, N'-dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), acetonitrile, di-chloromethane (DCM), 1,4-dioxane, tetrahydrofuran (THF), N-methyl-2-pyrrolidone(NMP) and mixtures of the solvents mentioned. The peptide synthesisThe polymeric carrier can be dissolved in all inert organic solvents, inwhere the amino acid derivatives used are soluble;However, preferred are solvents which additionally resin-swellingOwn property, such as DMF, DCM, NMP, acetonitrile and DMSO, as wellMixtures of these solvents.
Nach erfolgreicher Synthese wird das Peptid vom polymeren Träger abgespalten. Die Bedingungen, unter denen sich die verschiedenen Harztypen abspalten lassen, sind literaturbekannt. Am häufigsten finden saure und Palladium-katalysierte Spaltreaktionen Anwendung, insbesondere die Spaltung in flüssigem wasserfreiem Fluorwasserstoff, in wasserfreier Trifluormethansulfonsäure, in verdünnter oder konzentrierter Trifluoressigsäure oder die Palladium-katalysierte Spaltung in THF oder THF-DCM-Gemischen in Anwesenheit einer schwachen Base wie z. B. Morpholin. Je nach Wahl der Schutzgruppen können diese unter den Spaltbedingungen erhalten bleiben oder ebenfalls abgespalten werden. Auch eine teilweise Entschützung des Peptids kann sinnvoll sein, wenn bestimmte Derivatisierungsreaktionen oder eine Cyclisierung durchgeführt werden sollen.After successful synthesis, the peptide is cleaved from the polymeric support.The conditions under which the different resin typescan be split off, are known from the literature. Most commonly find acid andPalladium-catalyzed cleavage reactions, especially cleavage in liquid anhydrous hydrogen fluoride, in anhydrous trifluoromethanesulfonic acid,in dilute or concentrated trifluoroacetic acidor the palladium-catalyzed cleavage in THF or THF-DCM mixtures inPresence of a weak base such. B. morpholine. Depending on the choice ofProtecting groups can be retained under the cracking conditionsor split off as well. Also a partial deprotection of thePeptides may be useful if certain derivatization reactions ora cyclization should be carried out.
Die neuen Peptide binden mit hoher Affinität an NPY-Rezeptoren, ohne aber die physiologische Wirkung des NPY auszulösen, sind also kompetitive Antagonisten und unterdrücken die Wirkung des endogenen NPY. Die neuen Peptide besitzen blutdrucksenkende Eigenschaften und sind wertvolle Arzneimittel, die sich zur Behandlung von Kreislauferkrankungen, insbesondere des Bluthochdrucks, und von Gefäßspasmen eignen. Sie können dabei mit ACE-Hemmern, Ca-Antagonisten oder Diuretika kombiniert werden.The new peptides bind with high affinity to NPY receptors, but withoutThe physiological effects of NPY are therefore competitive antagonistsand suppress the effects of endogenous NPY. The new peptideshave hypotensive properties and are valuable drugs,which is used to treat circulatory diseases, in particular hypertension,and vasospasm. You can do this with ACE inhibitors,Ca antagonists or diuretics can be combined.
Die neuen Peptide sind außerdem wertvolle diagnostische und analytische Reagentien für die biochemische und medizinische Forschung, für die Erforschung des Bluthochdrucks und besonders für die Untersuchung der Biochemie und Pathophysiologie von NPY.The new peptides are also valuable diagnostic and analyticalReagents for biochemical and medical research, for researchof hypertension and especially for the study of biochemistryand pathophysiology of NPY.
Die biologische Charakterisierung der neuen Peptide wurden in folgenden Testsystemen durchgeführt:The biological characterization of the new peptides were in the followingTest systems performed:
Nierenrinde von Kaninchen wurde sofort nach Entnahme der Niere präpariert und in 0,32 M Saccharoselösung (4°C) homogenisiert. Das Homogenat wurde filtriert und anschließend bei 480 g zentrifugiert (5 min, 4°C), der Überstand gesammelt und bei 45 000 g zentrifugiert (10 min, 4°C). Der resultierende Rückstand wurde durch Resuspension und Rezentrifugation 2× mit Inkubationspuffer (25 mM Tris, 5 mM MgCl₂, 0,5% Rinderserumalbumin und 0,1% Bacitracin, pH 7,4) gewaschen und in Inkubationspuffer aufgenommen.Rabbit kidney bark was prepared immediately after removal of the kidneyand homogenized in 0.32 M sucrose solution (4 ° C). The homogenatewas filtered and then centrifuged at 480 g (5 min,4 ° C), the supernatant collected and centrifuged at 45,000 g (10 min,4 ° C). The resulting residue was re-suspended and recentrifuged2 × with incubation buffer (25 mM Tris, 5 mM MgCl₂, 0.5%Bovine serum albumin and 0.1% bacitracin, pH 7.4) and washed inIncubation buffer added.
Die Testansätze (1 ml) setzten sich zusammen aus : 100 µg Membranprotein (BCA Protein Assay, Pierce, Rockford, Illinois, USA), 0,5 nM ³H-NPY (Amersham, Braunschweig, spez. Radioaktivität 3 TBq/mmol) in Inkubationspuffer (totale Bindung) oder a) mit zusätzlich 0,3 µM NPY (unspezifische Bindung) oder b) mit Prüfsubstanz. Die Ansätze wurden als Triplikate hergestellt.The test mixtures (1 ml) were composed of: 100 μg membrane protein(BCA Protein Assay, Pierce, Rockford, Ill., USA), 0.5 nM3 H-NPY (Amersham, Braunschweig, specific radioactivity 3 TBq / mmol) inIncubation buffer (total binding) or a) with an additional 0.3 μM NPY(unspecific binding) or b) with test substance. The approaches wereprepared as triplicates.
Nach beendeter Inkubation (60 min, 30°C) wurden die Ansätze über Glasfaserfilter (Whatman GF/B) filtriert und mit eiskaltem Waschpuffer (50 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 0,2% Rinderserumalbumin, pH 7,4) gewaschen. Die auf den Filtern zurückgehaltene Radioaktivität wurde mittels Flüssigkeitsszintillationsmessung bestimmt. Die unspezifische Bindung betrug bei 0,5 nM ³H-NPY ca. 20 bis 30% der totalen Bindung.After completion of incubation (60 min, 30 ° C) the batches were passed over glass fiber filters(Whatman GF / B) and filtered with ice-cold wash buffer(50 mM Tris, 0.5 mM EDTA, 0.2% bovine serum albumin, pH 7.4).The radioactivity retained on the filters was monitored by means ofLiquid scintillation measurement determined. The non-specific bindingat 0.5 nM ³H-NPY was about 20 to 30% of total binding.
Die Auswertung der Kompetitionskurven erfolge über iterative nichtlineare Regressionsanalyse in Anlehnung an das Programm "Ligand" (Munson und Rodbard: Anal. Biochem. 107, 220, 1980).The evaluation of the competition curves is carried out via iterative nonlinearRegression analysis based on the "Ligand" program(Munson and Rodbard: Anal Biochem 107, 220, 1980).
Für die Versuche wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten von 250 bis 300 g Körpergewicht verwendet. Die Fütterung wurde 16 bis 24 h vor Versuchsbeginn ausgesetzt, Wasser war ad libitum verfügbar. Die Tiere wurden 30 bis 40 min vor Versuchsbeginn mit Amobarbital 120 mg/kg i. p. narkotisiert. Die Beatmung erfolgte künstlich über eine Atempumpe mit einem Atemvolumen von 3 ml/Hub und 50 Atomhüben/min. Die Substanzapplikation erfolgte i. v. über die Vena jugularis mit einem Injektionsvolumen von 1 ml/kg und einer Injektionsdauer von 20 sec.For the experiments, male Sprague-Dawley rats of 250used up to 300 g body weight. The feeding was 16 toExposed 24 h before the start of the experiment, water was available ad libitum.The animals were 30 to 40 minutes before the start of the experimentAmobarbital 120 mg / kg i. p. anesthetized. The respiration took placeartificially via a breathing pump with a breathing volume of 3 ml / strokeand 50 atomic minutes / min. The substance application was carried out i. v. overthe jugular vein with an injection volume of 1 ml / kg andan injection time of 20 sec.
10 min nach Narkoseeinleitung wurden die Trachea, Arteria carotis und Vena jugularis präpariert und anschließend die Despinalisierung und Vagotomie durchgeführt. NPY-Injektionen (3 µg/kg i. v.) erfolgten 15 min vor sowie 5 min nach Substanzapplikation. Der Blutdruck in der Arteria carotis wurde mit Statham-Druckaufnehmern gemessen, die Verstärker und Registriergeräte waren von der Firma Hellige. Gemessen wurde die relative Hemmung (Δ %) der durch NPY ausgelösten Blutdrucksteigerung (Δ mmHg).Ten minutes after induction of anesthesia, the trachea, carotid arteryand the jugular vein, and then the despinalizationand vagotomy performed. NPY injections (3 μg / kgi. v.) were performed 15 min before and 5 min after substance administration.The blood pressure in the carotid artery was measured using Statham pressure transducersmeasured, the amplifiers and recorders were fromthe company Hellige. The relative inhibition (Δ%) of theNPY induced blood pressure increase (Δ mmHg).
Für die Versuche wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten von 250 bis 300 g Körpergewicht verwendet. Die Fütterung wurde 16 bis 24 h vor Versuchsbeginn ausgesetzt, Wasser war ad libitum verfügbar. Die Tiere wurden 30 bis 40 min vor Vesuchsbeginn mit Urethan 1,7 g/kg i. p. narkotisiert. Die Atmung erfolgte spontan über Trachealkanüle.For the experiments, male Sprague-Dawley rats of 250used up to 300 g body weight. The feeding was 16 to Exposed 24 h before the start of the experiment, water was available ad libitum.The animals were 30 to 40 minutes before Vesuchsbeginn withUrethane 1.7 g / kg i. p. anesthetized. Breathing was spontaneousvia tracheostomy tube.
20 min nach Narkoseeinleitung erfolgte die Präparation der Trachea, Arteria carotis und Vena jugularis. Subkutane Elektrodennadeln zur Ableitung des EKGs wurden angelegt. Der mittlere Carotis-Druck MAP (mmHg) wurde über Statham-Transducer p23Db gemessen. Die Herzfrequenz HR (min-1) wurde aus der Blutdruckamplitude bestimmt. Beide Meßgrößen wurden mit Hellige-Schreibern registriert.20 minutes after induction of anesthesia, the preparation of the trachea, carotid artery and jugular vein was performed. Subcutaneous electrode needles for deriving the ECG were applied. The mean carotid pressure MAP (mmHg) was measured by Statham transducer p23Db. Heart rate HR (min-1 ) was determined from blood pressure amplitude. Both measured variables were registered with Hellige recorders.
Die Dosiswirkungsbeziehung wurde beschrieben durch eine lineare Regressionsanalyse zwischen log-Dosis (mg/kg) und der relativen Blutdruckänderung (y=a+b · log x). Tiere, bei denen EKG-Veränderungen auftraten, wurden registriert.The dose-response relationship was described by a linearRegression analysis between log dose (mg / kg) and relativeBlood pressure change (y = a + b · log x). Animals undergoing ECG changesoccurred, were registered.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. Die proteogenen Aminosäuren sind in den Beispielen mit dem Dreibuchstabencode abgekürzt (gemäß Eur. J. Biochem. 138, 1984, 9-37). Darüberhinaus bedeuten: Abs=4-Aminobuttersäure, Abu=2-Aminobuttersäure, Ac=Essigsäure, Ahx=Aminohexansäure, Aoc=8-Aminooktansäure, Ape=5-Aminopentansäure, HBz=p-Hydroxybenzoesäure, Hpac=p-Hydroxyphenylessigsäure, Hpp=p-Hydroxyphenylpropionsäure.The following examples are intended to explain the invention in more detail. The proteogenicAmino acids are abbreviated in the examples by the three-letter code(according to Eur. J. Biochem 138, 1984, 9-37). In addition, mean:Abs = 4-aminobutyric acid, Abu = 2-aminobutyric acid, Ac = acetic acid,Ahx = aminohexanoic acid, Aoc = 8-aminooctanoic acid, Ape = 5-aminopentanoic acid,HBz = p-hydroxybenzoic acid, Hpac = p-hydroxyphenylacetic acid,Hpp = p-hydroxyphenyl propionic acid.
Die Synthese der Peptide gemäß Anspruch 1 erfolgte mit Hilfe der Standardmethoden der Festphasenpeptidsynthese an einem vollautomatischen Gerät Modell 430 A der Firma APPLIED BIOSYSTEMS.The synthesis of the peptides according to claim 1 was carried out with the aid ofStandard methods of solid-phase peptide synthesis on a fully automatedModel 430 A device from APPLIED BIOSYSTEMS.
Folgender Synthesezyklus für die Boc-Schutzgruppentechnik wurde verwendet:The following synthesis cycle for the Boc protective group technique was used:
0,5 g Boc-Tyr(Br-Z)-p-Methylbenzhydrylaminharz mit einer Substitution von 0,49 mmol/g, entsprechend einer Ansatzgröße von 0,25 mmol, wurden gemäß A mit je 1 mmol0.5 g of Boc-Tyr (Br-Z) -p-methylbenzhydrylamine resin with a substitutionof 0.49 mmol / g, corresponding to a batch size of 0.25 mmolaccording to A with 1 mmol each
umgesetzt. Nach Beendigung der Synthese wurde das Harz N-terminal entschützt. (Ausführung der Schritte 1-3 gemäß A).implemented. After completion of the synthesis, the resin was deprotected N-terminal.(Execution of steps 1-3 according to A).
Das erhaltene Peptidharz (1,06 g) wurde einer HF-Spaltung unterworfen (10 ml HF, 1 ml Anisol); 0°C, 45 min). HF und der größte Teil des Anisols wurde im Vakuum abgezogen, das Harz mit Essigester gewaschen, und das Peptid mit 10% Essigsäure extrahiert. Der Extrakt wurde lyophilisiert. Die Reinigung des Rohpeptides erfolgte durch Mitteldruckchromatographie (HD-SIL®-Reversed-Phase-C₁₈-Material, 100Å, 25-45 µ Korngröße) mit einem Gradienten von 50-70% B in 80 min (A=0,1% TFA in H₂O; B=0,1% TFA in MeOH). Ausbeute: 93 mg. Analyt. HPLC: Retentionszeit 14,3 min (VYDACR 218TP54-C₁₈-RP-Säule; Fluß 2 ml/min; T₀=1,8 min; linearer Gradient von 0%-50% B in 50 min; A=0,1% TFA in H₂O; B=0,1% TFA in Acetonitril).The resulting peptide resin (1.06 g) was subjected to HF cleavage (10 ml HF, 1 ml anisole); 0 ° C, 45 min). HF and most of the anisole were removed in vacuo, the resin washed with ethyl acetate, and the peptide extracted with 10% acetic acid. The extract was lyophilized. The purification of the crude peptide was carried out by medium-pressure chromatography (HD-SIL® reversed-phase C₁₈ material, 100 Å, 25-45 μ grain size) with a gradient of 50-70% B in 80 min (A = 0.1% TFA in H₂O, B = 0.1% TFA in MeOH). Yield: 93 mg. Analyte. HPLC: retention time 14.3 min (VYDACR 218TP54-C₁₈ RP column; flow 2 ml / min; T₀ = 1.8 min; linear gradient of 0% -50% B in 50 min; A = 0.1% TFA in H₂O, B = 0.1% TFA in acetonitrile).
FAB-MS:M=1864,2; berechnete monoisotopische Molekülmasse:1864,1.FAB-MS: M = 1864.2; calculated monoisotopic molecular mass: 1864.1.
Analog Beispiel 1 wurden hergestellt (bei den N-terminal acetylierten Peptiden wurden nach beendeter Synthese die Schritte 1-6 und 14-16 gemäß A ausgeführt):Analogously to Example 1 were prepared (in the N-terminal acetylatedPeptides became steps 1-6 and 14-16 upon completion of the synthesiscarried out according to A):
2. H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
3. H-Tyr-Pro-Ser-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
4. H-Tyr-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
5. H-Tyr-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
6. H-Tyr-Pro-Lys-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
7. H-Tyr-Lys-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
8. H-Tyr-Pro-Arg-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
9. H-Gly-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
10. H-Tyr-Arg-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
11. H-Phe-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
12. H-Phe-Pro-Ser-Lys-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
13. H-Tyr-Pro-Ser-Arg-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
14. H-Phe-Pro-Ser-Arg-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
15. H-Tyr-Pro-Ahx-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
16. H-Tyr-Pro-Abs-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-MH₂
17. Ac-Tyr-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
18. Hpp-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
19. Hpac-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
20. Hbz-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
21. H-Tyr-Aoc-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
22. H-Tyr-Lys-Aoc-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
23. Ac-Tyr-Aoc-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
24. Hpp-Pro-Ser-Lys-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
25. H-Tyr-Lys-Ahx-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
26. H-Tyr-Lys-Abs-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
27. H-Tyr-Lys-Aoc-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
28. H-Tyr-Lys-Ahx-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
29. H-Tyr-Lys-Abs-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
30. H-Tyr-Lys-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
31. H-Tyr-Pro-Aoc-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
32. H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Aoc-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
33. Ac-Phe-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
34. H-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
35. Ac-Tyr-Lys-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂2. H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
3. H-Tyr-Pro-Ser-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
4. H-Tyr-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
5. H-Tyr-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
6. H-Tyr-Pro-Lys-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
7. H-Tyr-Lys-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
8. H-Tyr-Pro-Arg-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
9. H-Gly-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
10. H-Tyr-Arg-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
11. H-Phe-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
12. H-Phe-Pro-Ser-Lys-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
13. H-Tyr-Pro-Ser-Arg-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
14. H-Phe-Pro-Ser-Arg-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
15. H-Tyr-Pro-Ahx-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
16. H-Tyr-Pro-Abs-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-MH₂
17. Ac-Tyr-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
18. Hpp-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
19. Hpac-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
20. Hbz-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
21. H-Tyr-Aoc-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
22. H-Tyr-Lys-Aoc-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
23. Ac-Tyr-Aoc-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
24. Hpp-Pro-Ser-Lys-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
25. H-Tyr-Lys-Ahx-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
26. H-Tyr-Lys-Abs-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
27. H-Tyr-Lys-Aoc-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
28. H-Tyr-Lys-Ahx-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
29. H-Tyr-Lys-Abs-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
30. H-Tyr-Lys-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
31. H-Tyr-Pro-Aoc-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
32. H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Aoc-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
33. Ac-Phe-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
34. H-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
35. Ac-Tyr-Lys-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂
0,5 g Boc-Tyr(Br-Z)-p-Methylbenzhydrylaminharz mit einer Substitution von 0,49 mmol/g, entsprechend einer Ansatzgröße von 0,25 mmol wurden gemäß A mit je 1 mmol0.5 g of Boc-Tyr (Br-Z) -p-methylbenzhydrylamine resin with a substitutionof 0.49 mmol / g, corresponding to a batch size of 0.25 mmolaccording to A with 1 mmol each
umgesetzt.implemented.
Das erhaltene Peptidharz (1,01 g) wurde einer HF-Spaltung unterworfen (10 ml HF, 1 ml m-Kresol; 0°C, 45 min). Der HF wurde im Vakuum abgezogen, das Harz mit Essigester gewaschen, und das Peptid mit 10% Essigsäure extrahiert. Das lyophilisierte Rohpeptid wurde in 1 l entgastem Wasser gelöst und der pH der Lösung mit wäßrigem Ammoniak auf 8,4 eingestellt. 0,01 n wäßrige K₃Fe(CN)₆-Lösung wurde langsam zugetropft, bis die gelbe Farbe bestehen blieb. Es wurde 1 h nachgerührt und mit Eisessig auf pH 4,5 angesäuert. Nach Zugabe von BIORAD® AG3-X4A-Anionenaustauscherharz wurde 2 h gerührt, filtriert und das Filtrat lyophilisiert.The obtained peptide resin (1.01 g) was subjected to HF cleavage(10 ml HF, 1 ml of m-cresol, 0 ° C, 45 min). The HF was in vacuostripped, the resin washed with ethyl acetate, and the peptide at 10%Extracted acetic acid. The lyophilized crude peptide was in 1 ldissolved degassed water and the pH of the solution with aqueous ammoniaset to 8.4. 0.01 N aqueous K₃Fe (CN) ₆ solution became slowdropped until the yellow color persisted. It was 1 hstirred and acidified with glacial acetic acid to pH 4.5. After addingBIORAD® AG3-X4A anion exchange resin was stirred for 2 h, filteredand the filtrate is lyophilized.
Die Reinigung des Rohpeptides erfolgte durch Gelchromatographie (SEPHADEX® G-25, 10% HOAc) und anschließende Mitteldruckchromatographie (HD-SIL®-Reversed-Phase-C₁₈-Material, 100 A, 25-45 µ Korngröße) mit einem Gradienten von 50-70% B in 40 min (A=0,1% TFA in H₂O; B=0,1% TFA in MeOH). Ausbeute: 87 mg. Analyt. HPLC: Retentionszeit: 13,9 min (VYDAC® 218TP54-C₁₈-RP-Säule; Fluß 2 ml/min; T₀=1,8 min; linearer Gradient von 0%-50% B in 50 min; A=0,1% TFA in H₂O; B=0,1% TFA in Acetonitril).
FAB-MS:M=1882,9; berechnete monoisotopische Molekülmasse: 1883,0.The crude peptide was purified by gel chromatography (SEPHADEX® G-25, 10% HOAc) followed by medium pressure chromatography (HD-SIL® reversed phase C₁₈ material, 100 Å, 25-45 μ grain size) with a gradient of 50%. 70% B in 40 minutes (A = 0.1% TFA in H₂O, B = 0.1% TFA in MeOH). Yield: 87 mg. Analyte. HPLC: retention time: 13.9 min (VYDAC® 218TP54 C₁₈ RP column; flow 2 ml / min; T₀ = 1.8 min; linear gradient of 0% -50% B in 50 min; A = 0.1 % TFA in H₂O, B = 0.1% TFA in acetonitrile).
FAB-MS: M = 1882.9; calculated monoisotopic molecular weight: 1883.0.
Analog Beispiel 36 wurden hergestellt:Analogously to Example 36 were prepared:
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