Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von zellularer Onkogen-DNA, bzw. deren Fragmente, nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.The invention relates to a method for the detection of cellular oncogeneDNA, or its fragments, according to the preamble of claim 1.
Verfahren zur Feststellung der zellularen Onkogen-DNA einschließlich Trennung von DNA, Denaturierung und Hybridisierung und dgl. sind auf dem Gebiet der molekularbiologischen Forschung bekannt. Reproduzierbarkeit, Zuverlässigkeit, Spezifizität und extreme Sensitivität der in vitro Hybridisierung zwischen DNA und DNA sowie zwischen RNA und DNA sind aus der Literatur bekannt, die als Standardmethode für spezifische Problemlösungen Anwendung gefunden hat.Methods of detecting cellular oncogene DNA includingSeparation of DNA, denaturation and hybridization and the like are on theKnown in the field of molecular biological research. Reproducibility,Reliability, specificity and extreme sensitivity of in vitroHybridization between DNA and DNA and between RNA and DNA are overknown in the literature as the standard method for specific problem solvingHas found application.
Die Hybridisierung mit DNA unter Verwendung von festem Substrat zur Immobilisierung ist seit 1965 bekannt (J. Mol. Biol. 12: 829-942; 1965). Seitdem wurden mehrere Verbesserungen dieser Methode sowie der Methoden der Trennung der DNA aus Zellen und Geweben veröffentlicht.Hybridization with DNA using solid substrateImmobilization has been known since 1965 (J. Mol. Biol. 12: 829-942; 1965).Since then, several improvements have been made to this method as well as the methodsthe separation of DNA from cells and tissues.
Die erhöhte Aktivität von zwei oder mehreren zellularen Onkogenen durch Mutation, Verstärkung (Amplifikation) oder andere Störungen der Gen-Regulation ist eine wesentliche Ursache der malignen Transformation und der Diversifikation der bösartigen Zellen.The increased activity of two or more cellular oncogenesMutation, amplification (amplification) or other disorders of the geneticRegulation is a major cause of malignant transformation anddiversification of malignant cells.
Amplifikation der zellularen Onkogene auf z. B. das Zweifache bis Hundertfache, kommen als Ursache der malignen Transformation am Anfang in Frage oder treten während der Progression oder der Diversification der bösartigen Zellen in Fällen von 30% bis 50% der bösartigen Krankheiten auf. Nicht alle Sorten von Onkogenen haben die Neigung zu Amplifikation. Interessanterweise haben diejenige Onkogene diese Neigung, die in aktivierter Form am häufigsten in bösartigen Krankheiten vorkommen; drei aus vier in Gruppe A, zwei aus acht in Gruppe B und null aus sechs in Gruppe C, die Gruppen sind auf Seite 17 angegeben.Amplification of the cellular oncogenes on e.g. B. twice to a hundred times,come in as the cause of the malignant transformation in the beginning Question or occur during the progression or diversification of themalignant cells in cases from 30% to 50% of malignant diseaseson. Not all types of oncogenes tend to amplify.Interestingly, those oncogenes have this tendency, those in activatedForm most often occur in malignant diseases; threeout of four in group A, two out of eight in group B and zero out of six inGroup C, the groups are given on page 17.
Durch Punkt-Mutation entstehende, neue, in normalem Zustand nicht vorhandene Onkogene sind in 15% bis 30% der Fälle von bösartigen Krankheiten mit dem Transfektionsverfahren in 3T3 NIH Zellen nachweisbar. Es ist neuerdings bekannt, daß die Mutation in wesentlich höherem Prozentsatz der bösartigen Krankheiten eine bedeutende Rolle spielt.Point mutation creates new, not existing in normal conditionOncogenes are malignant diseases in 15% to 30% of casesdetectable in 3T3 NIH cells with the transfection method. Itis recently known that the mutation in a much higher percentageof malignant diseases plays an important role.
Die folgenden Ursachen und Umstände kann man als maßgebend betrachten, für den erhöhten bzw. qualitativ veränderten DNA-Inhalt des Blutplasmas in bösartigen Krankheiten möglicherweise verantwortlich zu sein:The following causes and circumstances can be considered authoritative,for the increased or qualitatively changed DNA content of the blood plasmamay be responsible in malignant diseases:
Diese Ursachen und Umstände sind in verschiedenen Kombinationen und in verschiedenem Maße in den verschiedenen Sorten von bösartigem Krankheiten und in deren verschiedenen Phasen für den veränderten DNA-Inhalt in der Blutbahn verantwortlich.These causes and circumstances are in different combinations and indifferent degrees in different varieties of malignant diseasesand in their different phases for the changed DNA content inresponsible for the bloodstream.
Da die rechtzeitige Erkennung die wichtigste Voraussetzung für eine Remission bzw. für die Heilung bösartiger Krankheiten ist, ist ein Universal-Malignitätsrest notwendig, der im breiten Spektrum maligner Krankheiten schon kleine Mengen maligner Zellen aufspüren bzw. nachweisen kann.Because timely detection is the most important requirement for aRemission or for the healing of malignant diseases is aUniversal malignancy residue necessary in the broad spectrum malignantDetect or detect diseases even small amounts of malignant cellscan.
Einen derartigen universalen Test gibt es noch nicht. Nur zwei Verfahren haben bis jetzt als Verlaufskontrolltest routinemäßig Anwendung gefunden: Der Alpha-Feto-Proteintest für Leberkrebs und Teratocarzinom und das carcionoembryonale Antigen (CEA) für Krebssorten des digestiven Systems.There is no such universal test yet. Only two procedureshave been used routinely as a follow-up test:The Alpha Feto Protein Test for Liver Cancer and Teratocarcinoma andthe carcionoembryonic antigen (CEA) for cancers of the digestiveSystems.
In 1985 wurde ein Flotationsverfahren nach 16stündigem Ultrazentrifugieren des Serums bekannt, das eine auf Krebs charakteristische Lipoprotein-Fraktion nachweisen kann, die auch RNA mit Poly(A)⁺RNA Komponenten enthält. Dieses Verfahren wurde aber in präkanzerösen Zuständen, in benignen monoklonalen Gammopathien und in vielen anderen Zuständen noch nicht erprobt. Die Sensitivität dieses Flotationsverfahrens ist realtiv gering, 0,2 mikrogramm/ml, im Vergleich zu dem hochgradig sensitiven Hybridisierungsverfahren. Damit kann man vielleicht erklären, daß das Flotationsverfahren in einigen klinisch gesicherten Krebsfällen negativ ausgefallen ist. Es ist wahrscheinlich, daß die RNA in der Lipoprotein Fraktion nur ein Teil der Gesamt-Plasma-RNA ist, die aus den bösartigen Zellen in die Blutbahn gelangt sind (Gesamt-Plasma-RNA bösartigen Ursprungs). Ferner ist die lange Ultrazentrifugation ein großer Nachteil des Flotationsverfahrens.In 1985 a flotation process was started after 16 hours of ultracentrifugationof the serum known to have a lipoproteinFraction can also detect the RNA with poly (A) ⁺RNA componentscontains. However, this procedure was performed in precancerous conditions, inbenign monoclonal gammopathies and in many other conditionsnot tried. The sensitivity of this flotation process is realisticlow, 0.2 micrograms / ml, compared to the highly sensitiveHybridization process. Perhaps this can explain thatFlotation procedures negative in some clinically proven cancer cases has failed. It is likely that the RNA in the lipoproteinFraction is only part of the total plasma RNA that comes from the malignantCells have entered the bloodstream (total plasma RNA malignantOrigin). Long ultracentrifugation is also a major disadvantageof the flotation process.
Jüngstens wurden auch zwei Immuntests als diagnostische Krebs-Test vorgeschlagen. Ein Verfahren für die Isolierung des sogenannten ′′Cancer Associated Protein′′ (CAP) wurde veröffentlicht mit der Absicht der Verwendung als ein Krebstest (Immuntest).Recently, two immunoassays have also been proposed as diagnostic cancer tests.A process for the isolation of the so-called '′ CancerAssociated Protein ′ ′ (CAP) has been published with the intention of using itas a cancer test (immunoassay).
In 1985 wurde als Möglichkeit für Krebstests der Nachweis im Urin von Onkogen-Polypeptiden durch monoklonalen Antikörper mittels Immunoblot gedacht. Mit Polypeptiden von drei Onkogenen durchgeführte Untersuchungen haben gezeigt, daß der Unterschied zwischen normalen und phathologischen Werten nicht sehr goß ist und die Schwangerschaft höhere Werte produziert als eine bösartige Krankheit. Für die vollständige Beurteilung muß jedes Onkogen-Polypeptid für verschiedene Größen untersucht werden, was ein sehr großer Zeit- und Materialaufwand ist. Ferner zeigten die normalen Werte eine große Streuung, und so kann ein bedeutendes Überlappen der normalen und der pathologischen Werte vorkommen. Zum Beispiel Untersuchungen mit monoklonalen Antikörpern gegen nur ein Onkogen-Polypeptid zeigten positive Werte in 25-29% der bösartigen und in 6-9% der nicht-bösartigen Fälle.In 1985, the possibility for cancer tests was the detection in the urine ofOncogene polypeptides by monoclonal antibodies using immunoblotthought. Studies performed with polypeptides from three oncogeneshave shown the difference between normal and phathologicalValues are not very good and pregnancy is higherproduced as a malignant disease. For the full assessmenteach oncogene polypeptide must be examined for different sizesbecome, which is a very large expenditure of time and material. Also showedthe normal values have a large spread, and so can be a significant oneOverlap of normal and pathological values occur. To theExample investigations with monoclonal antibodies against only one oncogenePolypeptide showed positive values in 25-29% of malignant and in 6-9%of non-malignant cases.
Ein sehr wesentlicher Nachteil dieses wie jeder anderen Methode, die auf dem immunologischen Nachweis der Proteine oder Polypeptiden von Krebszellursprung basieren, ist, daß die Anwesenheit von spezifischen Antikörpern, die durch den Wirt gebildet, oder für Therapiezwecke eingeführt werden, unrealistische Ergebnisse verursachen und überhaupt ein bedeutender Störfaktor sein können.A very significant disadvantage of this like any other method based onimmunological detection of proteins or polypeptides from cancer cell originis that the presence of specific antibodies,formed by the host, or introduced for therapeutic purposeswill cause unrealistic results and be significant at allCan be a disruptive factor.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Nachweis der DNA, bzw. deren Fragmente, von zellularen Onkogenen in einer azellularen biologischen Flüssigkeit, wie Blutplasma anzugeben. Da es hierfür notwendig ist, erst die DNA aus dem Blutplasma zu trennen, ist es eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein zuverlässiges Verfahren zur Trennung der DNA aus dem Blutplasma anzugeben.The invention has for its object a method for the detection ofDNA, or its fragments, from cellular oncogenes in an acellularbiological fluid, such as specifying blood plasma. Since it is necessary for thisis to first separate the DNA from the blood plasma, it is one further object of the invention, a reliable method for separationto indicate the DNA from the blood plasma.
Durch die Behandlung des Blutplasmas zur Trennung des DNA-Inhaltes, durch Immobilisierung der DNA in denaturierter Form an einem festen Substrat und durch Kontakt des festen Substrats mit der markierten denaturierten Onkogen-DNA um diese miteinander, wenn die Plasma-DNA und Onkogen-DNA-Probe komplementäre Sequenz(en) haben, zu binden (zu hybridisieren), wird ein zuverlässiges Nachweisverfahren erreicht. Diese Tatsache wird durch den Nachweis der Markierungssubstanz, oder im Falle der radioisotopischen Markierung durch Autoradiographie bestimmt.By treating the blood plasma to separate the DNA content,by immobilizing the DNA in a denatured form on a solidSubstrate and by contact of the solid substrate with the markeddenatured oncogene DNA around these when the plasma DNA andOncogene DNA sample have complementary sequence (s) to bind (hybridize),a reliable detection method is achieved. TheseThe fact is proven by the detection of the labeling substance, or in the casethe radioisotopic labeling determined by autoradiography.
Die in die Blutbahn gelangte DNA, deren Fragmente aus dem Blutplasma extrahiert werden können, kann dessen Onkogen-Inhalt durch in vitro molekulare Hybridisierung nachgewiesen werden. Der Nachweis von Onkogenen bzw. deren Fragmente im Blutplasma in vitro ist um so mehr geeignet für diesen Zweck, weil sie nicht nur äußerst spezifisch sondern auch hochgradig empfindlich ist und so wenig wie 0,5 bis 1 pg DNA/ml spezifisch nachgewiesen werden kann.The DNA that got into the bloodstream, its fragments from the blood plasmacan be extracted, its oncogene content by in vitromolecular hybridization can be detected. Detection of oncogenesor their fragments in blood plasma in vitro is all the more suitablefor this purpose because they are not only extremely specific but alsois highly sensitive and as little as 0.5 to 1 pg DNA / ml specificcan be demonstrated.
Erfindungsgemäß werden die Gesamt-Plasma DNA wie die in die Blutbahn gelangte DNA, bzw. deren Fragmente aus dem Blutplasma von Patienten mit bösartigen Krankheiten isoliert und auf die Anwesenheit der DNA zellularer Onkogene mit in vitro molekularer Hybridisierung untersucht.According to the invention, the total plasma DNA is like that in the bloodstreamDNA, or its fragments from the blood plasma of patientsMalignant diseases are isolated and cellular based on the presence of DNAOncogenes investigated with in vitro molecular hybridization.
Man konnte feststellen, daß Plasma-DNA in nicht-malignen und malignen Zuständen isoliert werden kann. Wenn die isolierte DNA des Blutplasmas auf Onkogen-Inhalt durch molekulare Hybridisierung in vitro mit markierten Onkogen-DNA Proben untersucht wurde, konnten wesentliche Unterschiede (qualitative und quantitative) zwischen bösartigen und nichtbösartigen Krankheiten festgestellt werden.It was found that plasma DNA is non-malignant and malignantConditions can be isolated. If the isolated DNA of the blood plasmalabeled oncogene content by molecular hybridization in vitro withOncogene DNA samples examined could reveal significant differences(qualitative and quantitative) between malignant and non-malignantDiseases are detected.
Die qualitativen und quantitativen Unterschiede ermöglichen, daß erfindungsgemäße Verfahren zur Untersuchung der Onkogen DNA im Blutplasma als Nachweis auf aktive maligne Prozesse angewendet werden kann. Die praktische Anwendbarkeit des Verfahrens zur Feststellung der DNA, bzw. deren Fragmente, von zellularen Onkogenen aus menschlichen Blutplasma ist ein Universal-Malignitätstest für den Nachweis bösartiger Prozesse.The qualitative and quantitative differences allow thatMethod according to the invention for examining the oncogene DNA in blood plasmacan be used as evidence of active malignant processes.The practical applicability of the method for determining the DNA, or their fragments, from cellular oncogenes from human blood plasmais a universal malignancy test for the detection of malignantProcesses.
Der wesentlichste Vorteil dieser Erfindung ist es, daß sie ein Verfahren angibt, das als Universial-Malignitätstest dienen kann: Dieser Test beruht auf den Grundprinzipien der bösartigen Transformation durch die Aktivierung von zellularen Onkogenen und der Besonderheiten der bösartigen Zellen und Tumore.The main advantage of this invention is that it is a processindicates that can serve as a universal malignancy test: This testis based on the basic principles of malicious transformation through theActivation of cellular oncogenes and the peculiarities of the malignantCells and tumors.
Der zweite bedeutende Vorteil dieses Verfahrens ist die große Empfindlichkeit (1 pg/ml).The second significant advantage of this method is the great sensitivity(1 pg / ml).
Ein weiterer wesentlicher Vorteil der Erfindung ist im Gegenteil zu Immuntests, daß die spezifische Antikörper, die sich durch den Wirt gebildet haben, oder für Therapiezwecke in die Blutbahn eingeführt wurden, die Ergebnisse nicht beeinflussen können.Another significant advantage of the invention is on the contraryImmunoassays that indicate the specific antibody that is found by the hosthave formed, or introduced into the bloodstream for therapeutic purposesthat cannot affect the results.
Gegenüber Nachweisverfahren, die auf immunologischem Nachweis der Proteine oder Polypeptiden von Krebszellursprung basieren, hat das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, daß eine Störung des Ergebnisses durch spezifische Antikörper entfällt.Compared to detection methods based on immunological detection of the proteinsor based on cancer cell origin polypeptides has the inventionProcedure has the advantage of disrupting the outcomedue to specific antibodies.
Dieses Verfahren hat Vorteile auch gegenüber dem Nachweis der Onkogen Transkripte aus dem Plasma als Malignitätstest. Die Gefahr des Abbaus der DNA ist wesentlich kleiner als bei den RNA-Transkripten, wo das ubiquitäre RNase-Enzym eine Reihe von Vorsichtsmaßnahmen während des ganzen Prozesses verlangt, die bei dem Onkogen DNA Nachweise nicht notwendig sind.This method also has advantages over the detection of oncogenesPlasma transcripts as a malignancy test. The danger of dismantlingthe DNA is much smaller than that of the RNA transcripts, where theubiquitous RNase enzyme takes a number of precautions during thewhole process, which is not the case with the oncogene DNA evidenceare necessary.
Der größte Vorteil gegenüber dem Malignitätstest durch Nachweis der Onkogen-Transkripte bzw. deren Fragmente ist: Der Nachweis der Onkogen-DNA ist fähig zu beweisen, daß die Aktivierung des Onkogens durch Punkt-Mutation verursacht wurde und zeigt ferner, welcher Punkt des Onkogens durch Mutation verändert wurde. Aus diesem Grund kann man wissen, wie das Onkogen-Produkt (OKP) verändert ist. Die Mutation betrifft besondes das rasKi Onkogen, und zwar in der Position Codon 12. Diese Veränderung führt zu einem Onkogenprodukt, in dem die Aminosäure gly in der Position 12 (p12) mit val (besonders in Kolon und Harnblase-Krebs), arg (besonders in Lungenkrebs) oder mit cys (besonders in Lungenkrebs) verwechselt wird. Oligonukleotid-Proben für diese Onkogene zum Zweck dieser Hybridisierung sind im Handel erhältlich (Oncogene Science Inc., Mineola, NY 11501).The biggest advantage over the malignancy test by detecting the oncogene transcripts or their fragments is: The detection of the oncogene DNA is able to prove that the activation of the oncogene was caused by point mutation and also shows which point of the oncogene by mutation was changed. For this reason, you can know how the oncogene product (OKP) is changed. The mutation particularly affects the rasKi oncogene, in position codon 12. This change leads to an oncogene product in which the amino acid gly in position 12 (p12) with val (especially in colon and bladder cancer) arg ( especially in lung cancer) or with cys (especially in lung cancer). Oligonucleotide samples for these oncogenes for the purpose of this hybridization are commercially available (Oncogene Science Inc., Mineola, NY 11501).
Da dieses Onkogen-Produkt nur in den Tumorzellen vorhanden ist und in den normalen Zellen überhaupt nicht anwesend ist, bietet dieses durch Mutation veränderte Onkogen-Produkt diagnostisch und therapeutisch einen einmaligen ausschließlichen spezifischen Angriffspunkt an den bösartigen Zellen.Since this oncogene product is only present in the tumor cells and inis not present at all in the normal cells, offers this throughMutation changed oncogene product diagnostically and therapeuticallya unique, exclusive point of attack to themalignant cells.
So kann man, zum Beispiel, durch Immunoimaging, intravenöse Verwendung von monoklonalen Anti-Onkogen-Produkt Antikörpern, verbunden mit einem Radioisotop, bösartige Zellen im Körper schon in einem Stadium der bösartigen Krankheit, wenn die üblichen bildgebenden Maßnahmen noch negative Resultaten geben, visualisieren.So you can, for example, by immunoimaging, intravenous useof monoclonal anti-oncogene product antibodies linked to oneRadioisotope, malignant cells in the body at a stage ofmalignant disease if the usual imaging measures stillGive negative results, visualize.
Mit monoklonalen anti-OKP spezifischen Antikörpern, allein oder in Verbindung mit radioaktiven oder chemotherapeutisch wirkenden Substanzen, kann man ausschließlich nur die bösartigen Zellen beeinflussen bzw. vernichten, ohne die normalen Zellen zu beschädigen.With monoclonal anti-OKP specific antibodies, alone or in combinationwith radioactive or chemotherapeutic substances,you can only influence the malignant cells ordestroy without damaging the normal cells.
Der Nachweis zellularer Onkogen-DNA bzw. deren Fragmente aus dem Blutplasma bietet weitere, für die Therapie maßgebende Informationen:The detection of cellular oncogene DNA or its fragments from theBlood plasma offers further information that is relevant for therapy:
Die Veränderung bzw. Beeinträchtigung dieser Funktion durch Angriff auf die bösartigen Zellen immunspezifisch, gezielt auf ihre Onkogenprodukte mit monoklonalen Antikörpern allein oder gebunden mit radioaktiv oder chemotherapeutisch wirkenden Substanzen kann zur heilenden Wirkung führen, bevor die Tumorzellmasse sich verbreiten konnte. Ein Plasma-Onkogenprofil bei Früherkennung zeigt die spezifischen Therapiemöglichkeiten. Die Verlaufskontrolle mit neuen Onkogen-Proben ermöglicht es, neu aufgetretene Onkogen-DNA zu erkennen. Ein quantitativ durchgeführter Malignitätstest bietet während des Krankheitsverlaufs eine Früherfassung einer eventuellen Amplifizierung eines zellularen Onkogens und gibt spezifische Hinweise, wie man diesen neuen Subklon von bösartigen Zellen unterdrücken bzw. vernichten kann, bevor eine größere Progression oder Agressivität verursacht ist.The change or impairment of this function by attackimmune-specific to the malignant cells, targeted to their oncogene productswith monoclonal antibodies alone or bound with radioactiveor chemotherapeutic substances can be used for healing Effect before the tumor cell mass could spread. APlasma oncogene profile for early detection shows the specific therapy options.The follow-up with new oncogene samples enablesto recognize newly emerged oncogene DNA. A quantitativemalignancy test performed during the course of the diseasean early detection of a possible amplification of a cellularOncogene and gives specific guidance on how to use this new subclonesuppress or destroy malignant cells before onegreater progression or aggressiveness.
Im folgenden wird die Erfindung genauer erläutert.The invention is explained in more detail below.
Aus dem frischgewonnenen Blut wird das Plasma schnell separiert. Dann wird das Plasma mit einem Detergens, wie Natriumduodezylsulphat (SDS) und einem proteolytischen Enzym, wie Proteinase K (Boehringer Mannheim) mit einem wäßrigen Medium vermischt und wird dann bei 37 Grad C für 60 min in einer Pufferlösung (pH 7,5) inkubiert. Die viskose Mischung wird durch Vortexing periodisch umgerührt. Nach der Inkubation wird durch organisches Lösungsmittel, wie Phenol, dreimal extrahiert. Das Ergebnis ist eine organische Phase, die den größten Anteil der Proteine, und eine wäßrige Phase, die im wesentlichen die gesamte DNA enthält. Phenol wird nach Zentrifugieren entfernt. Die Interphase wird mit zusätzlichem Phenol und Puffer reextrahiert. Nach der dritten Extraktion wird die DNA in Anwesenheit von 0,25 M Na-azetat bei pH 5,2 mit eiskaltem Äthanol bei -20 Grad C inkubiert, prezipitiert und zentrifugiert. Das DNA-Sediment (das nicht immer sichtbar ist) wird in dem gewünschten Puffer gelöst.The plasma is quickly separated from the freshly obtained blood. Thenthe plasma with a detergent such as sodium duodezyl sulphate (SDS)and a proteolytic enzyme, such as Proteinase K (Boehringer Mannheim)mixed with an aqueous medium and is then at 37 degrees C.incubated for 60 min in a buffer solution (pH 7.5). The viscousMixture is stirred periodically by vortexing. After incubationis extracted three times by organic solvent such as phenol.The result is an organic phase that accounts for the largest shareof the proteins, and an aqueous phase that is essentially allContains DNA. Phenol is removed after centrifugation. The interphaseis re-extracted with additional phenol and buffer. After the thirdExtract the DNA in the presence of 0.25 M Na acetate at pH 5.2incubated with ice-cold ethanol at -20 degrees C, precipitated and centrifuged.The DNA sediment (which is not always visible) is inthe desired buffer.
Die DNA wird einer DNase-Enzym-freien RNase-Behandlung bei 37 Grad C für 1 h unterzogen. Danach wird die DNA zweimal mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Äthanol wie oben prezipitiert und in dem gewünschten Lösungsmittel gelöst.The DNA undergoes DNase enzyme-free RNase treatment at 37 degrees C.subjected for 1 h. Then the DNA is washed twice with phenol / chloroformextracted and precipitated with ethanol as above and in the desiredSolvent dissolved.
Die im Wasser gelöste DNA wird denaturiert durch Erhitzen auf 100 Grad für 10 min und durch Mischen mit gleichem Volumen 1 M NaOH, und bei Zimmertemperatur 20 min inkubiert. Dann wird das Alkali neutralisiert auf einen neutralen Wert (pH 8,0) durch Zumischung von 1 M HCl und die Salzkonzentration wird durch Zugabe von 1 M NaCl, 0,3 M Nazitrat, 0,5 M Tris. CL (pH 8,0) erhöht. Dann wird in Eis gekühlt. Die Erhöhung der Salzkonzentration dient der Erhöhung der Bindefähigkeit der DNA an das feste Substrat (siehe unten).The DNA dissolved in the water is denatured by heating to 100 degreesfor 10 min and by mixing with the same volume of 1 M NaOH, andincubated at room temperature for 20 min. Then the alkali is neutralizedto a neutral value (pH 8.0) by adding 1 M HCl and the salt concentration is determined by adding 1 M NaCl, 0.3 M Nazitrate,0.5 M tris. CL (pH 8.0) increased. Then it is cooled in ice. TheIncreasing the salt concentration serves to increase the binding abilitythe DNA to the solid substrate (see below).
Die resultierende Lösung von denaturierter DNA wird in gewünschter Menge auf einem festen Substrat, wie reine Nitrozellulose, aufgetragen, um eine Immobilisierung der denaturierten DNA an dem festen Substrat zu bewirken. Das resultierende feste Substrat wird einer Wäsche bei Zimmertemperatur mit 50 ml vol 6 × SSC unterzogen und getrocknet, dann in einem Vakuumherd bei 80 Grad C für 2 h gebacken. Das gebackene feste Substrat wird danach behandelt, um ein weiteres Binden von Nukleinsäure an das feste Substrat zu verhindern.The resulting solution of denatured DNA is in the desiredApplied to a solid substrate, such as pure nitrocellulose,to immobilize the denatured DNA on the solidEffect substrate. The resulting solid substrate becomes oneWash at room temperature with 50 ml vol 6 × SSC anddried, then baked in a vacuum oven at 80 degrees C for 2 h.The baked solid substrate is then treated for anotherPrevent binding of nucleic acid to the solid substrate.
Die (radioisotopisch oder nicht-radioisotopisch) markierte Onkogen DNA-Probe wird denaturiert und in einer Lösung mit dem festen Substrat, auf dem die Plasma-DNA schon immobilisiert ist, in Kontakt gebracht, um damit unter ausgewählten thermischen und chemischen Bedingungen zu hybridisieren. So wird bewirkt, daß die markierte Onkogen DNA-Probe durch Wasserstoffbindungen mit der komplementären Sequenz(en) der auf dem festen Substrat imobilisierenden Plasma-DNA, wenn sie diese komplementären Sequenzen haben, verbunden (hybridisiert) ist.The (radioisotopic or non-radioisotopic) labeled oncogeneDNA sample is denatured and in a solution with the solidSubstrate on which the plasma DNA is already immobilizedbrought to use among selected thermal and chemicalHybridize conditions. This causes the markedOncogene DNA sample through hydrogen bonds with the complementarySequence (s) of the plasma DNA immobilizing on the solid substrate,if they have these complementary sequences linked (hybridized)is.
Nach einem vorbestimmten Zeitraum wird das feste Substrat einer Wäsche unterzogen, um die nicht spezifisch gebundene, markierte Onkogen DNA-Probe zu entfernen.After a predetermined period of time, the solid substrate becomes a laundrysubjected to the non-specifically bound, labeled oncogene DNARemove sample.
Das feste Substrat wird anschließend einer Analyse unterzogen, um das Stattfinden der Hybridisierung zwischen der Plasma-DNA und der markierten Onkogen-DNA Probe nachzuweisen. Das wird im Falle der radioisotopischen Markierung durch Autoradiographie, im Falle der nichtradioisotopischen Markierung durch Nachweis der Markierungssubstanz mittels Enzymaffinitätstest durch Farbreaktion bestimmt.The solid substrate is then subjected to analysis to determine theThe hybridization takes place between the plasma DNA and the labeled oneDetect oncogene DNA sample. That will be the case with the radioisotopicMarking by autoradiography, in the case of non-radioisotopicLabeling by detection of the labeling substancedetermined by an enzyme affinity test by color reaction.
Eine Menge von gereinigter molekularisch klonierter DNA, die die Sequenz als Kode für Onkogen enthält, wird entweder radioisotopisch oder nicht-radioisotopisch markiert. Die radioisotopische Markierung wird durch Nick-Translation nach Rigby et al. (J. Mol. Biol. 113: 237-251, 1977) durchgeführt, um hohe spezifische Aktivität zu erreichen. Für diese Verfahrensweise verwendbare Radioisotope sind beispielsweise besonders 32P aber auch I¹²⁵, I¹³¹ und H³.An amount of purified molecularly cloned DNA containing the sequence as a code for oncogene is labeled either radioisotopically or non-radioisotopically. The radioisotopic labeling is carried out by nick translation according to Rigby et al. (J. Mol. Biol. 113: 237-251, 1977) to achieve high specific activity. Radioisotopes that can be used for this procedure are, for example, particularly 32P but also I¹²⁵, I¹³¹ and H³.
Die nicht-radioisotopische Markierung der Onkogen-DNA Proben wird beispielsweise mit Biotin, auch durch Nick-Translation (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6633-6637, 1981) und jüngstens mit Photobiotin (Nucleic Acid Research 13: 745-761, 1985) durchgeführt. Die Markierung mit Photobiotin ist besonders unkompliziert, schnell und preisgünstig. Ein Photobiotin-Markierungs- und Nachweis-Kit wird kommerziell angeboten (BRESA, Adelaide, South Australia). Die Markierung mit Biotin hat einen sehr wichtigen Vorteil: Abgesehen davon, daß sie nicht radioaktiv ist, kann man Ergebnisse innerhalb einiger Stunden durch Farbreaktion sehen. Man muß nicht Tage warten, wie bei der Autoradiographie.The non-radioisotopic labeling of the oncogene DNA samples is donefor example with biotin, also by nick translation (Proc. Natl.Acad. Sci. USA 78: 6633-6637, 1981) and more recently with photobiotin(Nucleic Acid Research 13: 745-761, 1985). The markwith photobiotin is particularly uncomplicated, fast and inexpensive.A photobiotin labeling and detection kit becomes commercialoffered (BRESA, Adelaide, South Australia). The markwith biotin has a very important advantage: apart from the fact that itis not radioactive, you can get results within a few hourssee through color reaction. You don't have to wait days like with theAutoradiography.
Onkogen-DNA Proben, Onkogen-Oligonucleotid-Proben, markiert oder unmarkiert, sind kommerziell erhältlich (ONCOR, Inc. Gaithersburgh, Ma. USA 20877; ONCOGENE SCIENCE Inc. Mineola, NY. 11501 USA).Oncogene DNA samples, oncogene oligonucleotide samples, labeled orunlabeled, are commercially available (ONCOR, Inc. Gaithersburgh,Ma USA 20877; ONCOGENE SCIENCE Inc.Mineola, NY. 11501 USA).
Das folgende Beispiel dient zur weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu beschränken:The following example serves to explain the invention further,without limiting it:
Es wird 20 ml Blut mit 20 IE/ml Heparin entnommen, und das Blutplasma wird so schnell wie möglich separiert. Es wird in zwei Einweg-Plastik-Zentrifugen-Röhrchen je 5 ml Blutplasma pipettiert. Eines wird tiefgekühlt für eventuelle Wiederholung oder für ergänzende Untersuchungen als Reserve aufbewahrt. Das andere wird gleich in Bearbeitung genommen.20 ml of blood with 20 IU / ml of heparin are taken, and the blood plasmawill be separated as soon as possible. It comes in two disposable plasticPipette 5 ml blood plasma into the centrifuge tube. One is frozenfor possible repetition or for additional examinationskept as a reserve. The other is being processed.
Es wird ein Gemisch aus 0,4 M Tris. Cl (pH 7,5); 50 mM Äthylendiaminotetraessigsäure (EDTA); 0,6 M NaCl; 2% (Gew.-/Vol) Natriumduodecylsulfat (SDS) und Proteinase K (Endkonzentration 200 mikrogramm/ml, Boehringer) hinzugefügt und bei 37 Grad C für 60 Min inkubiert mit häufigem Vortexing.It becomes a mixture of 0.4 M Tris. Cl (pH 7.5); 50 mM ethylenediaminotetraacetic acid(EDTA); 0.6 M NaCl; 2% (w / v) sodium duodecyl sulfate(SDS) and Proteinase K (final concentration 200 micrograms / ml, Boehringer)added and incubated at 37 degrees C for 60 min with frequent vortexing.
Anschließend wird gleiches Volumen von Phenol und Chloroform-Isoamylalkohol (24 : 1) eingemischt und durch Schütteln extrahiert, sodann durch Zentrifugieren die organische und die unorganische (wäßrige) Phase getrennt. Die unorganische Phase wird separiert und aufbewahrt. Die Interphase wird mit Phenol-Chloroform wie oben extrahiert. Die wäßrigen Phasen werden gemeinsam wieder mit Phenol und Chloroform noch zweimal extrahiert.Then the same volume of phenol and chloroform-isoamyl alcohol(24: 1) mixed in and extracted by shaking, then byCentrifuge the organic and the inorganic (aqueous) phaseCut. The inorganic phase is separated and saved. TheInterphase is extracted with phenol-chloroform as above. The wateryPhases are still together with phenol and chloroformextracted twice.
Nach der dritten Extraktion wird zu der wäßrigen Phase Natriumazetat von 2,5 M (pH 5,2) zugemischt, um die Endkonzentration von 0,25 M zu erreichen. Zwei Volumina von eiskaltem Äthanol werden zugefügt, gut vermischt und bei -20 Grad C inkubiert und danach zentrifugiert.After the third extraction, the aqueous phase becomes sodium acetateof 2.5 M (pH 5.2) was added to give the final concentration of 0.25 Mto reach. Two volumes of ice cold ethanol are added, wellmixed and incubated at -20 degrees C and then centrifuged.
Das DNA-Sediment (nicht immer sichtbar!) wird in TE (pH 8,0) (10 mM Tris. Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA pH 8,0) gelöst und mit DNase-freier RNase (Endkonzentration 10 mikrogramm/ml) bei Zimmertemperatur für 60 min inkubiert, danach wird mit Phenol-Chloroform zweimal extrahiert und mit Äthanol wie oben präzipitiert.The DNA sediment (not always visible!) Is in TE (pH 8.0) (10 mMTris. Cl, pH 8.0; 1 mM EDTA pH 8.0) dissolved and with DNase-free RNase(Final concentration 10 micrograms / ml) at room temperature for 60 minincubated, then extracted twice with phenol-chloroform and withEthanol precipitated as above.
Die Extrahierung der DNA ist wesentlich erleichtert, und es wird eine serienweise Untersuchung ermöglicht durch die Anwendung des Instruments "Nucleic Acid Extractor" (Analytic System, Foster City, Ca, 94404, USA). Das oben geschriebene Verfahren ist leicht adaptierbar für den "Nucleic Acid Extractor". Hiermit kann eine Person in drei Stunden die DNA aus acht Blutplasmen simultan isolieren.Extracting the DNA is much easier, and it becomes oneserial examination made possible by using the instrument"Nucleic Acid Extractor" (Analytic System, Foster City, Ca, 94404, UNITED STATES). The method written above is easily adaptable for the"Nucleic Acid Extractor". This allows a person to do the in three hoursIsolate DNA from eight blood plasmas simultaneously.
Die DNA gelöst im Wasser in der gewünschten Konzentration wird auf 100 Grad C für 10 min erhitzt, dann schnell in Eis gekühlt, mit gleichem Volumen von 1 M NaOH gemischt und bei Zimmertemperatur für 20 min inkubiert. Damit wurde die Denaturierung der DNA erreicht.The DNA dissolved in water in the desired concentration is reduced to 100Degree C heated for 10 min, then quickly chilled in ice, with the sameVolume of 1 M NaOH mixed and incubated at room temperature for 20 min.The denaturation of the DNA was thus achieved.
Die denaturierte DNA wird mit einer Lösung von 1 M NaCl, 0,3 M Nazitrat, 0,5 M Tris. Cl (pH 8,0) und 1 M HCl gemischt, dann in Eis gekühlt.The denatured DNA is mixed with a solution of 1 M NaCl, 0.3 M Nazitrate,0.5 M tris. Cl (pH 8.0) and 1 M HCl mixed, then cooled in ice.
Ein entsprechendes Volumen von der resultierenden Lösung (10 mikrogramm DNA) wird auf einem festen Substrat wie reines Nitrozellulose aufgetragen, wobei das entsprechende Volumen von der denaturierter DNA Lösung in eine Vertiefung einer "Mikrofilter"-Platte mit 96 Vertiefungen eingebracht (Minifold I Filtration und Inkubations-Platte, Schleicher & Schüll, Keene, New Hampshire, 03431, USA) (Bio-Rad, Richmond, Ca, 94 804, USA) und unter gelindem Vakkum unter Bildung eines Flecks von 3,0 mm Durchmesser, filtriert wird. Der resultierende Filter wird von einer Lösung von 50 ml von 6 × SSC bei Zimmertemperatur gewaschen, getrocknet und bei 80 Grad C für 2 h im Vakuumherd gebacken.A corresponding volume of the resulting solution (10 microgramsDNA) is applied to a solid substrate such as pure nitrocellulose,the corresponding volume from the denatured DNA solutionplaced in a well of a "microfilter" plate with 96 wells(Minifold I filtration and incubation plate, Schleicher &Schull, Keene, New Hampshire, 03431, USA) (Bio-Rad, Richmond, Ca, 94 804,USA) and under a gentle vacuum to form a 3.0 mm spotDiameter, is filtered. The resulting filter is from aSolution of 50 ml of 6 × SSC washed at room temperature, driedand baked at 80 degrees C for 2 h in a vacuum oven.
Nach dem Backen wird der resultierende Filter einer Behandlung, der sogenannten Prehybridisierung in Prehybridisierungslösung unterzogen. Prehybridisierungslösung: Formamid 50% (Vol/Vol); 5 × Denhardt's Lösung; 5 × SSPE; 0,1% SDS; 100 mikrogramm/ml denaturierte DNA aus Heringssperma und 1 mikrogramm/ml Poly A. (Denhardt's Lösung: Ficoll 5 g; Polyvinylpirrololidon 5 g; Rinderserumalbumin (Pentax Fraktion V. 5 g und H₂O zu 500 ml). Der Filter wird in dieser Prehybridisierungslösung bei 42 Grad C für 6-8 h inkubiert. (20 × SSPE: 174 g NaCl; 27,6 g NaH₂PO₄; 7,4 g EDTA ad 1 l H₂O, pH 7,4).After baking, the resulting filter becomes a treatment thatso-called prehybridization in prehybridization solution.Prehybridization solution: formamide 50% (vol / vol); 5 × Denhardt'sSolution; 5 x SSPE; 0.1% SDS; 100 micrograms / ml denatured DNAHerring sperm and 1 microgram / ml poly A. (Denhardt's solution: Ficoll 5 g;Polyvinyl pirrololidone 5 g; Bovine serum albumin (Pentax fraction V. 5 gand H₂O to 500 ml). The filter is in this prehybridization solutionincubated at 42 degrees C for 6-8 h. (20 x SSPE: 174 g NaCl; 27.6 gNaH₂PO₄; 7.4 g EDTA ad 1 l H₂O, pH 7.4).
Die markierte DNA-Onkogen Probe wird durch Erwärmung auf 100 Grad C für 5 min denaturiert und schnell in Eis abgekühlt. In denaturierter Form wird zu die Prehybridisierungslösung, in der der Filter schon inkubiert ist, zugemischt und weiter inkubiert bei 42 Grad C für 12-20 h.The labeled DNA oncogene sample is heated to 100 degrees C forDenatured for 5 min and quickly cooled in ice. In denatured formbecomes the prehybridization solution in which the filter is already incubated is admixed and further incubated at 42 degrees C for 12-20 h.
Nach der Inkubierung wird die Lösung, in der die Inkubation durchgeführt wurde, weggegossen und der Filter 3-4mal für 5-10 min (je Wäsche) einer Wäsche bei Zimmertemperatur im großen Volumen von 2 × SSC und 0,1% SDS unterzogen. Der Filter wird zwei weiteren Wäschen für 1-1,5 h in einer Lösung von 1 × SSC und 0,1% SDS bei 68 Grad C unterworfen. Wenn der Hintergrund noch immer hoch ist, sind weitere Wäschen bei höheren Stringenzien (Schärfen) notwendig: Für 60 min in einer Lösung von 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 60 Grad C.After the incubation, the solution in which the incubation is carried outwas poured away and the filter 3-4 times for 5-10 min (eachLaundry) a laundry at room temperature in a large volume of 2 × SSCand subjected to 0.1% SDS. The filter does two more washes for 1-1.5 hin a solution of 1 × SSC and 0.1% SDS at 68 degrees C.If the background is still high, there are more washesnecessary for higher stringencies (sharpening): for 60 min in oneSolution of 0.2 × SSC and 0.1% SDS at 60 degrees C.
Das folgende, gut bekannte, käufliche 18 molekularisch klonierte menschliche Onkogen wurde als Onkogen-DNA Probe gebraucht, die hier ungefähr nach Häufigkeit ihres Vorkommens mit erhöhter Aktivität in menschlichen Bösartigkeiten gruppiert sind:The following, well known, commercially available 18 molecularly clonedhuman oncogene was used as an oncogene DNA sample, which is hereroughly according to the frequency of their occurrence with increased activity inhuman malignancies are grouped:
Oligonucleotid-Proben: rasKi (codon 12), siehe auch S. 9. Die Proben wurden radioisotopisch mit P³² markiert (spezifische Aktivität: 10⁸ cpm/mikrogramm) durch Nick-Translation nach Rigby et al. (J. Mol. Biol. 133: 237-251, 1977) oder unmarkiert erhalten. Die unmarkierten DNA Proben wurden entweder mit Biotin (nach Leary, Proc. Nat. Acad. Sci. 80 : 4045-4049, 1983) oder mit Photobiotin markiert. Reagenzien für die nicht-radioisotopische Markierung durch Nick-translation nach Rigby et al. (J. Mol. Biol. 133: 237-251, 1977) mit Biotin und für die Visualisierung der Resulate der Hybridisierung mit Enymaffinitätsverfahren durch Farbreaktion werden in Handel angeboten (Amersham, Little Chalfont, England). Markierungen mit Photobiotin erfolgt nach Vorschrift des Herstellers (BRESA, Adelaide, South Australia): Nach kurzer Bestrahlung mit sichtbarem Licht geht Photobiotin eine stabile Bindung mit Nukleinsäuren ein. Die so mit Biotin markierte DNA kann mit 2-Butanol Extraktion mit Äthanol-Precipitation isoliert werden und kann als stabile markierte Probe für ein halbes Jahr in 0,1 mM EDTA bei -15 Grad C stabil aufbewahrt werden.Oligonucleotide samples: rasKi (codon 12), see also p. 9. The samples were radioisotopically labeled with P³² (specific activity: 10⁸ cpm / microgram) by nick translation according to Rigby et al. (J. Mol. Biol. 133: 237-251, 1977) or unlabeled. The unlabeled DNA samples were either labeled with biotin (according to Leary, Proc. Nat. Acad. Sci. 80: 4045-4049, 1983) or with photobiotin. Reagents for non-radioisotopic labeling by nick translation according to Rigby et al. (J. Mol. Biol. 133: 237-251, 1977) with biotin and for the visualization of the results of hybridization with enymaffinity processes by color reaction are commercially available (Amersham, Little Chalfont, England). Labeling with photobiotin is carried out according to the manufacturer's instructions (BRESA, Adelaide, South Australia): After brief exposure to visible light, photobiotin forms a stable bond with nucleic acids. The DNA so labeled with biotin can be isolated with 2-butanol extraction with ethanol precipitation and can be stored as a stable labeled sample for half a year in 0.1 mM EDTA at -15 ° C.
Das Nitrocellulose-Papier im Falle radioisotopischer Markierung wird zwischen klaren Azetatfolien eingesetzt und in die Nähe eines für die Röntgenstrahlen empfindlichen Filmes gebracht. Ein Verstärkerschirm wird an der entgegengesetzten Seite angebracht und lichtdicht verpackt. Nach einer bestimmten Zeit wird der Film entwickelt. Die Anwesenheit der DNA bzw. deren Fragmente, die mit der Onkogen-DNA Probe hybridisieren, wird durch die Anwesenheit eines Flecks auf dem Film bestimmt.The nitrocellulose paper in the case of radioisotopic labeling willinserted between clear acetate foils and close to one for theX-rays brought sensitive film. An intensifying screen willattached on the opposite side and packed light-tight. Tothe film is developed at a certain time. The presence of the DNAor their fragments that hybridize with the oncogene DNA sampledetermined by the presence of a spot on the film.
Im Falle nicht-radioisotopisch markierter Onkogen-DNA Proben, wie im Falle der mit Photobiotin markierten Onkogen-DNA Proben, werden die DNA Proben in 0,1 M EDTA aufgetragen, sonst wird die Prehybridisierung so ausgeführt wie mit radioisotopisch markierten DNA Proben, aber die Dauer der Prehybridisierung ist kürzer: 4-8 h. Die Hybridisierung wird durchgeführt wie mit radioaktiven Proben, aber bei höherer Temperatur (55 Grad C) für 20 h in einer Lösung: 4 Vol Prehybridisierungspuffer; 1 Vol von etwa 0,5 g/ml Natrium Dextransulfat und 20 ng/ml Biotin-markierte DNA Probe (Onkogen-DNA Probe).In the case of non-radioisotopically labeled oncogene DNA samples, as inIn the case of oncogene DNA samples labeled with photobiotin, the DNASamples are applied in 0.1 M EDTA, otherwise the prehybridization will be like thiscarried out as with radioisotopically labeled DNA samples, but the durationprehybridization is shorter: 4-8 h. The hybridization willperformed as with radioactive samples, but at a higher temperature(55 degrees C) for 20 h in a solution: 4 vol prehybridization buffer;1 vol of about 0.5 g / ml sodium dextran sulfate and 20 ng / ml biotin-labeledDNA probe (oncogene DNA probe).
Die getrockneten Nitrocellulose-Papiere werden bei 42 Grad C für 30 min in STMT Puffer (1 M NaCl; 0,1 M Tris. Cl, pH 7,5; 2 mM MgCl₂ 0,05%v/v Triton X-100) mit 30 mg von Bovin Serum Albumin inkubiert. Nachdem das Nitrocellulose-Papier getrocknet ist, wird es bei Zimmertemperatur für 10 min in STMT-Puffer mit 1 mikrogramm/ml Sigma Avidin-alkalische Phosphatase-Komplex inkubiert, dann wird mit häufigem Schütteln in STMT Puffer (3 × 10 min) und STM Puffer (1 m NaCl, Tris. Cl, pH 9,5, 5 mM MgCl₂) für 2 × 5 min inkubiert.The dried nitrocellulose papers are at 42 degrees C for 30 minin STMT buffer (1 M NaCl; 0.1 M Tris. Cl, pH 7.5; 2 mM MgCl₂ 0.05% v / vTriton X-100) incubated with 30 mg of Bovin Serum Albumin. After thatNitrocellulose paper is dried, it is left at room temperature for 10 minin STMT buffer with 1 microgram / ml Sigma avidin-alkaline phosphataseIncubate complex, then shake frequently in STMT buffer(3 × 10 min) and STM buffer (1 M NaCl, Tris. Cl, pH 9.5, 5 mM MgCl₂) forIncubated 2 × 5 min.
Für Farbreaktionen wird das Nitrocellulose Papier bei Zimmertemperatur im Dunkeln mit Substrat-Lösung (STM Puffer aber nur mit 0,1 M NaCl) mit 0,33 mg/ml Nitro-blau-tetrazolium, 0,17 mg/ml 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphat und 0,33% v/v N,N-dimethylformamid vermischt. Die Reaktion wird durch Waschen des Nitrocellulose Papiers mit 10 mM Tris. Cl, pH 7,5; 1 mM EDTA beendet.For color reactions, the nitrocellulose paper is used at room temperaturein the dark with substrate solution (STM buffer but only with 0.1 M NaCl)0.33 mg / ml nitro blue tetrazolium, 0.17 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolylPhosphate and 0.33% v / v N, N-dimethylformamide mixed. The reactionis obtained by washing the nitrocellulose paper with 10 mM Tris. Cl, pH 7.5;1mM EDTA terminated.
Die erfindungsgemäße Arbeitsweise zum Nachweis der DNA-Transkripten, bzw. deren Fragmente, von zellularen Onkogenen im menschlichen Blutplasma umfaßt mehrere günstige Reaktionsweisen und Schritte, um eine hohe Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit zu ergeben.The procedure according to the invention for the detection of DNA transcripts,or their fragments, from cellular oncogenes in human blood plasmaincludes several convenient ways and steps to get onehigh reliability and reproducibility.
Die Verwendung von Proteinase K erleichtert die Entfernung der Proteine, die Guanidinium-Isothiocyanat-Behandlung die Denaturierung der Proteine sowie die Spaltung der DNA-Protein Komplexe. Der Rest der Proteine wird durch organische Extraktion entfernt. Der Abbau und das Entfernen der RNA wird durch RNase-Behandlung erreicht, weil die RNA sonst bei der Hybridisierung interferieren könnte. Das Backen sorgt für die Zuverlässigkeit der festen Bindung der DNA an das Nitrocellulose-Filter. Die Behandlung des Nitrocellulose-Filters nach dem Backen verhindert unspezifische Bindungen und sorgt auch für Zuverlässigkeit. Die Wäsche des Nitrocellulose-Filters nach Hybridisierung entfernt überflüssige, oder unspezifisch gebundene, markierte Onkogen-DNA Proben und trägt auch zur Zuverlässigkeit bei.The use of Proteinase K facilitates the removal of the proteins,the guanidinium isothiocyanate treatment denaturing theProteins and the cleavage of the DNA-protein complexes. The rest ofProteins are removed by organic extraction. The dismantling and thatRemoval of the RNA is achieved through RNase treatment because of the RNAotherwise could interfere with hybridization. Baking ensuresthe reliability of the tight binding of the DNA to the nitrocelluloseFilter. The treatment of the nitrocellulose filter after baking preventsnon-specific bindings and also ensures reliability. TheWashing the nitrocellulose filter after hybridization removes unnecessary,or non-specifically bound, labeled oncogene DNA samples andalso contributes to reliability.
Es sind zahlreiche Modifizierungen möglich.Numerous modifications are possible.
Eine quantitative Auswertung des positiven Tests ist möglich.A quantitative evaluation of the positive test is possible.
Eine semiquantitative Auswertung kann auch durchgeführt werden. In diesem Fall wird die Intensität des schwarzen Flecks am Röntgenfilm durch Densitometrie gemessen und können quantitative Vergleiche gemacht werden (Reflectance Densitometer, Bio-Rad, Richmond CA 94804, USA).A semi-quantitative evaluation can also be carried out. In thisThe intensity of the black spot on the X-ray film is shown byDensitometry is measured and quantitative comparisons can be made(Reflectance Densitometer, Bio-Rad, Richmond CA 94804, USA).
Wenn ein Blutplasma-DNA mit einer Onkogen Probe einen positiven Test gezeigt hat, kann die relative Menge durch das Dilutionsverfahren bestimmt werden. In diesem Fall wird aus der Blutplasma-DNA eine 1 : 2-Serialverdünnung gemacht und wird jede Verdünnung durch Hybridisierung getestet. Die höchste Verdünnung, aus der noch ein positives Signal ausgeht, ist der Titer. So können bei der Verlaufskontrolle eines Patienten, während der Beobachtungszeit, quantitative Vergleiche durchgeführt werden. Auf diese Weise kann man z. B. die Amplifizierung eines der aktivierten Onkogene beobachten: Wenn während der Verlaufskontrolle der Titer eines Onkogens unproportionell erhöht wird im Vergleich zu anderen Onkogenen, bedeutet das die Amplifizierung dieses Onkogens.If a blood plasma DNA with an oncogene sample does a positive test has shown, the relative amount can be determined by the dilution methodwill. In this case, the blood plasma DNA becomes a 1: 2 serial dilutionmade and any dilution is made by hybridizationtested. The highest dilution, from which still a positive signalgoing out is the titer. So during a patient’s follow-up,during the observation period, quantitative comparisons were madewill. In this way you can e.g. B. the amplification of aobserve the activated oncogenes: if during the follow-upthe titer of an oncogene is increased disproportionately compared toother oncogenes, this means the amplification of this oncogene.
Der Test ist positiv:The test is positive:
Die Möglichkeiten 2 oder 3 können aber gelegentlich auch in nichtbösartigen Krankheiten vorkommen, besonders in Zuständen mit Fieber und großem Zellabbau. In diesen Fällen wird der Zeitablauf entscheidend sein: In bösartigen Krankheiten bleibt die Positivität, oder steigt sie sogar, während sie in den nicht-bösartigen Fällen abklingt.However, options 2 or 3 can occasionally also be used in non-malicious onesDiseases occur, especially in conditions with fever andlarge cell degradation. In these cases the timing becomes crucialbe: In malignant diseases, the positivity remains or increaseseven as it subsides in the non-malicious cases.
Im allgemeinen bekommt man einen positiven Test im Fall einer bösartigen Krankheit meistens, wenn die Plasma-DNA erst nur mit der Onkogen-Gruppe A (siehe oben) hybridisierte, weil diese Onkogene in allen bzw. beinahe in allen Sorten von Bösartigkeiten aktiviert sind. Seltener braucht man die Hybridisierung auf die Gruppe B auszuweiten.In general, you get a positive test in the case of a malicious oneDisease mostly when the plasma DNA only with the oncogeneGroup A (see above) hybridized because these oncogenes in all oralmost all types of malignancy are activated. Less commonthe hybridization needs to be extended to group B.
Wenn man die Krebsart kennt (in der Verlaufskontrolle) oder Verdacht hat auf eine Krebsart, kann man solche Onkogene als Proben verwenden, die in dieser Krebsart besonders häufig aktiviert sind. Es werden noch immer neue Onkogene entdeckt. Diese kann man zukünftig gegebenenfalls auch als Probe benutzen.If you know the type of cancer (in the follow-up) or suspectedhas a cancer, you can use such oncogenes as samples, which are particularly often activated in this type of cancer. There will still bealways discovered new oncogenes. This can be done in the future if necessaryalso use as a sample.
Wenn man aber wissen möchte, welche aktivierten Onkogene in der Blutbahn anwesend sind (Plasma-Onkogen-Profil), muß man die Blutplasma-DNA mit allen Onkogenen von Gruppe A und B und seltener von Gruppe C hybridisieren. Dasselbe muß man tun, wenn man das Erscheinen von neuen Onkogenen in der Blutbahn während der Krankheitsablauf erfassen möchte, was aufgrund der prognostischen und therapeutischen Bedeutung sehr wichtig ist.But if you want to know which activated oncogenes in theBloodstream are present (plasma oncogene profile), the blood plasmaDNA with all oncogenes from groups A and B and less often from group Chybridize. You have to do the same when you see the appearance of new onesWant to capture oncogenes in the bloodstream during the course of the disease,which is very important due to its prognostic and therapeutic importanceimportant is.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19736691A1 (en)* | 1997-08-22 | 1999-02-25 | Michael Prof Dr Med Giesing | Characterising and identifying disseminated metastatic cancer cells |
| WO2005017197A3 (en)* | 2003-08-18 | 2005-04-21 | Uksh Schleswig Holstein | Method for early detection and monitoring of diseases by analysis of cell-surface-bound nucleic acids |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6020124A (en)* | 1992-04-27 | 2000-02-01 | Trustees Of Dartmouth College | Detection of soluble gene sequences in biological fluids |
| CA2134552A1 (en)* | 1992-04-27 | 1993-11-11 | George D. Sorenson | Detection of gene sequences in biological fluids |
| AU2324997A (en) | 1996-03-15 | 1997-10-01 | Penn State Research Foundation, The | Detection of extracellular tumor-associated nucleic acid in blood plasma or ser um using nucleic acid amplification assays |
| US8048629B2 (en) | 1996-03-15 | 2011-11-01 | The Penn State Research Foundation | Detection of extracellular tumor-associated nucleic acid in blood plasma or serum |
| US6511805B1 (en) | 1996-03-15 | 2003-01-28 | The Penn State Research Foundation | Methods for detecting papillomavirus DNA in blood plasma and serum |
| US6630301B1 (en) | 1997-03-14 | 2003-10-07 | The Penn State Research Foundation | Detection of extracellular tumor-associated nucleic acid in blood plasma or serum |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3211311A1 (en)* | 1981-03-27 | 1982-10-07 | Bethesda Research Laboratories Inc., 20760 Gaithersburg, Md. | METHOD FOR DETECTING A SUSPECTED VIRAL DESOXYRIBONUCLEIC ACID IN AN AZELLULAR BIOLOGICAL LIQUID |
| US4542096A (en)* | 1983-02-25 | 1985-09-17 | President And Fellows Of Harvard College | Detecting rearranged human c-myc DNA fragments associated with oncogenes |
| WO1987002064A1 (en)* | 1985-10-04 | 1987-04-09 | Institut National De La Sante Et De La Recherche M | Recovery and dosing of dna in an acellular biological liquid |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4483920A (en)* | 1982-05-17 | 1984-11-20 | Hahnemann University | Immobilization of message RNA directly from cells onto filter material |
| US4588682A (en)* | 1982-12-13 | 1986-05-13 | Integrated Genetics, Inc. | Binding nucleic acid to a support |
| JPS6091999A (en)* | 1983-10-25 | 1985-05-23 | Fujirebio Inc | How to measure polynucleotides |
| US4683202A (en)* | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3211311A1 (en)* | 1981-03-27 | 1982-10-07 | Bethesda Research Laboratories Inc., 20760 Gaithersburg, Md. | METHOD FOR DETECTING A SUSPECTED VIRAL DESOXYRIBONUCLEIC ACID IN AN AZELLULAR BIOLOGICAL LIQUID |
| US4542096A (en)* | 1983-02-25 | 1985-09-17 | President And Fellows Of Harvard College | Detecting rearranged human c-myc DNA fragments associated with oncogenes |
| WO1987002064A1 (en)* | 1985-10-04 | 1987-04-09 | Institut National De La Sante Et De La Recherche M | Recovery and dosing of dna in an acellular biological liquid |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19736691A1 (en)* | 1997-08-22 | 1999-02-25 | Michael Prof Dr Med Giesing | Characterising and identifying disseminated metastatic cancer cells |
| WO2005017197A3 (en)* | 2003-08-18 | 2005-04-21 | Uksh Schleswig Holstein | Method for early detection and monitoring of diseases by analysis of cell-surface-bound nucleic acids |
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0370032A1 (en) | 1990-05-30 |
| WO1989000206A1 (en) | 1989-01-12 |
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE60029369T2 (en) | Procedure and probe set for the detection of cancer | |
| US6942970B2 (en) | Identifying subjects suitable for topoisomerase II inhibitor treatment | |
| DE60219652T2 (en) | CHROMOGENIC IN-SITU HYBRIDIZATION PROCESSES, KITS AND COMPOSITIONS | |
| DE2915082C3 (en) | Method and use of a reagent set for the detection and characterization of nucleic acids and their sequences | |
| DE60128908T2 (en) | Method for the detection and localization of genes in situ by hybridization of a branched DNA | |
| DE602004008889T2 (en) | SERUM MACROPHAGE MIGRATION INHIBITORY FACTOR (MIF) AS A MARKER FOR PROSTATE CANCER | |
| DE69329641T2 (en) | METHOD FOR MULTIPLE LIGASE CHAIN REACTION | |
| US20130337446A1 (en) | Method of preparing a standard diagnostic gene transcript pattern | |
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| DE60317315T2 (en) | DETECTION OF DNA BINDING PROTEINS | |
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| DE3721400A1 (en) | METHOD FOR THE EXAMINATION OF A CELLULAR BIOLOGICAL LIQUID ON CELLULAR ONCOGEN DNA OR THEIR FRAGMENTS | |
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| DE112008001164T5 (en) | Gene signature of early hypoxia to predict patient survival | |
| DE69822149T2 (en) | DETECTION OF TMORPECIFIC GENE PRODUCTS | |
| DE69123010T2 (en) | New method for the quantitative determination of extracellular DNA in a biological fluid | |
| JPH0479899A (en) | In vitro methods and probes for detecting the presence of circular particles and malignant tumors in humans and animals | |
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