DE3717695A1 - Human manganese superoxide dismutase (hMn-SOD) - Google Patents

Abstract

The present invention relates to a genetic engineering process for the preparation of human Mn superoxide dismutase (hMn-SOD), to the DNA sequences which code for this enzyme, to suitable vectors which contain these DNA sequences, and to host cells which are able to express these DNA sequences, and to the enzyme hMn-SOD itself. Proposed uses of this enzyme are also described.

Description

Translated fromGerman

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gentechnologisches Verfahren zur Herstellung von Human Mn-Superoxiddismutase (hMn-SOD), die DNA-Sequenzen, die für dieses Enzym codieren, geeignete Vektoren, die diese DNA-Sequenzen enthalten und Wirtszellen, die diese DNA-Sequenzen exprimieren können, sowie das Enzym hMn-SOD selbst. Vorschläge zur Verwendung dieses Enzyms werden außerdem beschrieben.The present invention relates to agenetic engineering process for the production of humanMn superoxide dismutase (hMn-SOD), the DNA sequences thatsuitable vectors for this enzyme, whichthese contain DNA sequences and host cells thatcan express these DNA sequences, as well as the enzymehMn-SOD itself. Suggestions for using this enzymeare also described.

Als Folge verschiedener biochemischer Prozesse in biologischen Systemen (z. B. Redoxprozesse in der Atmungskette, Oxydationen im Cytoplasma) werden bekannterweise laufend O₂^--Radikale gebildet, die hochcytotoxisch sind und zu Gewebezerstörungen führen können. Bei pathologischen Situationen, z. B. im Verlauf rheumatisch bedingter Erkrankungen, werden Degradationen von Collagen und Synovialflüssigkeit durch solche Radikale diskutiert (Pasquier, C. et al., Inflammation 8, 27-32, 1984). Eukaryotische Zellen enthalten zwei Formen von Superoxiddismutasen, von denen die eine vornehmlich in Cytosol (Cu/Zn-SOD) und die andere hauptsächlich in den Mitochondrien (Mn-SOD) vorliegen. In Lebermitochondrien wurde gefunden, daß Mn-Enzym in der Matrix einschließlich der inneren Membran lokalisiert ist, obwohl die Mn-SOD auch im Cytosol der Leberzellen nachgewiesen wurde (Mc Cord J. M. et al., In: Superoxide and Superoxide Dismutases (A. M. Michelson, J. M. Mc Cord, I. Fridovich, eds.) Academic Press, N. Y., 129-138, 1977).As a result of various biochemical processes in biological systems (. Eg redox processes in the respiratory chain, oxidations in the cytoplasm) are known to be constantly O₂^- formed radicals that are highly cytotoxic and can lead to tissue damage. In pathological situations, e.g. B. in the course of rheumatic diseases, degradations of collagen and synovial fluid by such radicals are discussed (Pasquier, C. et al., Inflammation 8, 27-32, 1984). Eukaryotic cells contain two forms of superoxide dismutases, one of which is predominantly in cytosol (Cu / Zn-SOD) and the other mainly in mitochondria (Mn-SOD). In liver mitochondria it was found that Mn enzyme is localized in the matrix including the inner membrane, although the Mn-SOD was also detected in the cytosol of the liver cells (Mc Cord JM et al., In: Superoxide and Superoxide Dismutases (AM Michelson, JM Mc Cord, I. Fridovich, eds.) Academic Press, NY, 129-138, 1977).

In Prokaryoten existiert neben einer Mn-SOD noch eine Fe-SOD. Letztere wurde auch in Algen und Protozoen sowie in einigen Pflanzenspezies nachgewiesen (Bridges, S. M., Salin, M. L., Plant Physiol. 68, 275-278, 1981). Diese hochaktiven Enzyme katalysieren die Disproportionierung O₂^-+O₂^-+2 H⁺₄H₂O₂+O₂ und verhindern durch diese Dismutation der Superoxidradikale deren Anreicherung und somit deren zellschädigende Wirkung. Neben dem endoplasmatischen Retikulum der Leber können die mitochondrialen Membranen als einer der wichtigsten Orte der O₂^- Entstehung in tierischen Zellen angesehen werden, so daß es nicht verwundert, daß Mitochondrien ihre eigene, spezielle SOD(Mn-SOD) zur Verfügung haben.In addition to Mn SOD, there is also Fe SOD in prokaryotes. The latter has also been detected in algae and protozoa and in some plant species (Bridges, SM, Salin, ML, Plant Physiol. 68, 275-278, 1981). These highly active enzymes catalyze the disproportionation of O₂^- + O₂^- +2 H⁺₄H₂O₂ + O₂ and prevent the superoxide radicals from accumulating and thus damaging the cells by this dismutation. In addition to the endoplasmic reticulum of the liver, the mitochondrial membranes can be one of the most important places of O₂^- formation are considered in animal cells, so it is not surprising that mitochondria have their own special SOD (Mn-SOD) is available.

Das Strukturgen einer prokaryotischen Mn-SOD (E. coli) wurde cloniert und das chromosomale sodA-Gen lokalisiert (Tuoati, D., J. Bact. 155, 1078-1087, 1983).The structural gene of a prokaryotic Mn-SOD (E. coli)was cloned and the chromosomal sodA genelocalized (Tuoati, D., J. Bact. 155, 1078-1087, 1983).

Die 699bp lange Nukleotidsequenz einer mitochondrialen Hefe Mn-SOD konnte aufgeklärt und die Primärstruktur sowohl des Precursors als auch des maturen Proteins davon abgeleitet werden - mit Molekulargewichten von 26 123 Da für den Precursor und 23 059 Da für das mature Protein (Marres, C. A. M. et al., Eur. J. Biochem. 147, 153-161 (1985). Somit unterscheiden sich die Mn- und Cu/Zn-SOD (MG=14 893, EP-A 1 38 111) in ihren Molekulargewichten deutlich.The 699bp long nucleotide sequence of a mitochondrialYeast Mn-SOD was able to elucidate the primary structureboth the precursor and the mature proteinderived from it - with molecular weights of26 123 Da for the precursor and 23 059 Da for the matureProtein (Marres, C.A. M. et al., Eur. J. Biochem. 147,153-161 (1985). The Mn andCu / Zn-SOD (MW = 14 893, EP-A 1 38 111) in theirMolecular weights clearly. 

Die vollständige Aminosäuresequenz der Mn-SOD aus Menschenleber wurde von Barra, D. publiziert, wonach die hMn-SOD aus 196 Aminosäuren zusammengesetzt sein soll (Barra, D. et al., J. Biol. Chem. 259, 12 595-12 601, 1984). Die Human Cu/Zn-Sod aus Erythrocyten besteht demgegenüber aus 153 Aminosäuren (Jabusch, J. R., et al. Biochemistry 19, 2310-2316, 1980) und zeigt keine Sequenzhomologien zur hMn-SOD) (Barra. D. et al., siehe oben).The complete amino acid sequence of the Mn-SODHuman liver was published by Barra, D., according tothe hMn-SOD can be composed of 196 amino acidsshould (Barra, D. et al., J. Biol. Chem. 259, 12 595-12 601,1984). The human Cu / Zn sod consists of erythrocytesin contrast, from 153 amino acids (Jabusch, J.R., et al.Biochemistry 19, 2310-2316, 1980) and shows noneSequence homologies to hMn-SOD) (Barra. D. et al., Seeabove).

Generell wird den Superoxiddismutasen eine Schutzfunktion gegenüber bestimmten Endzündungsprozessen zugesprochen. Insbesondere soll eine Defiziens an Mn-SOD bei der Entwicklung der rheumatoiden Arthritis eine Bedeutung zukommen (Pasquier, C. et al., siehe oben). Ein protektiver Effekt der SOD gegen alkoholinduzierte Leberschädigungen wird ebenfalls angenommen (Del Villano B. C. et al., Science 207, 991-993, 1980).Generally, superoxide dismutases become oneProtective function against certainInflammatory processes awarded. In particular, shoulda deficiency in Mn-SOD in the development of therheumatoid arthritis is of importance(Pasquier, C. et al., See above). A protectiveEffect of SOD against alcohol-inducedLiver damage is also assumed (DelVillano B.C. et al., Science 207, 991-993, 1980). 

Die Klonierung und Expression einer Human-SOD ist nur für die Human Cu/Zn-SOD aus Menschenleber bekannt (EP-A 1 38 111).The cloning and expression of a human SOD is onlyknown for human Cu / Zn-SOD from human liver (EP-A1 38 111).

Anhand der vorgenannten essentiellen Eigenschaften der Superoxiddismutasen, insbesondere der hMn-SOD, ist ein Bedarf für den therapeutischen und/oder diagnostischen Einsatz zu erwarten. Dabei ist es vorteilhaft, zu diesem Zweck specieseigene, d. h. humane Mn-SOD in homogener Form und in ausreichenden Mengen zur Verfügung zu haben. Die sich daraus ableitende Zielvorstellung ist, zu erwartende immunologische Reaktionen z. B. nach therapeutischem Einsatz, zu minimieren oder zu verhindern.Based on the essential properties ofSuperoxide dismutases, especially hMn SOD, is aNeed for therapeutic and / or diagnosticExpected use. It is advantageous tofor this purpose, its own, d. H. human Mn-SOD inhomogeneous form and in sufficient quantities forTo have available. The derived from itThe goal is to be expected immunologicalReactions e.g. B. after therapeutic useminimize or prevent.

Erst die Entwicklung von Technologien zur Rekombination von Fremd-DNA mit Vektor-DNA mit der Möglichkeit, auch erstere in Mikroorganismen stabil zu etablieren und zu exprimieren, gestattet es, homogene Proteine tierischer oder humaner Herkunft in großen Mengen bereitzustellen. Hierbei soll ein anderes Ziel erreicht werden, nämlich, daß das damit hergestellte Enzym - die hMn-SOD - ein gegenüber der authentischen genuinen hMn-SOD charakteristisches biologisches Aktivitätsspektrum zeigt.Only the development of recombination technologiesof foreign DNA with vector DNA with the possibility, tooto establish and stabilize the former in microorganismsexpress, allows homogeneous proteins of animalor human origin in large quantities.Another goal is to be achieved, namelythat the enzyme produced with it - the hMn-SOD - acompared to the authentic genuine hMn-SODcharacteristic biological activity spectrumshows.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand daher darin, mit Hilfe gentechnologischer Verfahren erstmals die für dieses Enzym codierende DNA-Sequenz zu finden bzw. darzustellen und erstmals aufzuzeigen, nach welchen Methoden diese Sequenz erhalten werden kann.An object of the present invention was thereforetherein, using genetic engineering for the first timeto find the DNA sequence coding for this enzymeor to represent and show for the first time, according towhat methods this sequence can be obtained. 

Erfindungsgemäß wurde diese Aufgabe dadurch gelöst, daß eine aus Humanzellen plazentalen Ursprungs gewonnene cDNA-Genbank mit synthetisch hergestellten DNA-Sondenmolekülen durchsucht wurde und dadurch das für hMn-SOD codierende Gen isoliert werden konnte. Um das Gen für hMn-SOD zu erhalten, kann nach bekannten Methoden die mRNA aus solchen Zellen isoliert werden, die das gewünschte Enzym produzieren. Als Ausgangsmaterial sind verschiedene, z. B. metabolisch aktive drüsige Gewebe wie z. B. Leber oder Plazenta geeignet. Nach Herstellung der cDNA, die nach bekannten Methoden durch geprimte Synthese mit reverser Transkriptase anhand der isolierten mRNA erhalten werden kann, nachfolgendem Einbau in einen geeigneten Vektor und Amplifikation zu einer vollständigen cDNA-Genbank, kann diese mit einer definierten radioaktiv markierten DNA-Sonde oder einer Mischung aus verschiedenen solcher Sonden durchsucht werden. Um die Degeneration des genetischen Codes zu berücksichtigen, werden vorzugsweise definierte DNA-Sondenmischungen verwendet, die alle möglichen Nukleotidvariationen für ein und dieselbe Aminosäure repräsentieren bzw. die derart ausgewählt werden, daß die Anzahl der zu synthetisierenden DNA-Sonden einer Mischung möglichst gering und die Homologie zur gesuchten hMn-SOD DNA-Sequenz möglichst hoch ausfällt. Ein weiteres Auswahlkriterium für die Synthese von DNA-Sonden kann darin bestehen, daß diese komplementär sind zu mindestens zwei unabhängigen Regionen, beispielsweise nahe dem 3′- und 5′-Ende der putativen Gensequenz.According to the invention, this object has been achieved in thatone obtained from human cells of placental origincDNA library with synthetically producedDNA probe molecules was searched and thereby thegene coding for hMn-SOD could be isolated. AroundObtaining the gene for hMn-SOD can be done according to knownMethods that isolate mRNA from such cellsthat produce the desired enzyme. AsStarting material are different, e.g. B. metabolicallyactive glandular tissues such as B. liver or placentasuitable. After preparation of the cDNA, the knownMethods by primed synthesis with reverserObtained transcriptase from the isolated mRNAsubsequent installation in a suitableVector and amplification to a completecDNA library, can this with a definedradiolabelled DNA probe or a mixture ofvarious such probes can be searched. To theTaking into account degeneration of the genetic codeare preferably defined DNA probe mixturesused all possible nucleotide variations forrepresent the same amino acid or thebe selected such that the number of tosynthesizing DNA probes of a mixture if possiblelow and the homology to the searched hMn-SODDNA sequence is as high as possible. Another oneSelection criterion for the synthesis of DNA probes canconsist in that these are complementary toat least two independent regions, for examplenear the 3'- and 5'-end of the putative gene sequence. 

Dadurch können anhand von mindestens zwei getrennten Hybridisierungen Klone identifiziert werden, die gegen beispielsweise beide unabhängige DNA-Sonden positive Signale zeigen. Diese Klone können dann vorzugsweise für die Isolierung des hMn-SOD Gens benutzt werden, da von ihnen zu erwarten ist, daß sie entweder einen wesentlichen Teil oder das komplette Gen für hMn-SOD enthalten.This allows you to use at least two separate onesHybridizations are identified against clonesfor example, both independent DNA probes are positiveShow signals. These clones can then preferablybe used for the isolation of the hMn-SOD gene sinceyou can expect them to eitheressential part or the complete gene for hMn-SODcontain.

Die besonderen DNA-Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen DNA-Sonden verwendet wurden, wurden anhand der von Barra, D. et al. publizierten Aminosäuresequenz der Human Mn-SOD aus Lebergeweben (Barra, D. et al., Oxy Radicals and their scavenger Systems, Vol. 1, 336-339, 1983) abgeleitet. Insbesondere können vorzugsweise zwei Regionen der putativen hMn-SOD DNA-Sequenz verwendet werden, die für mindestens fünf Aminosäurereste, vorzugsweise für 8 Aminosäurereste codieren, wobei eine DNA-Sondenlänge von mindestens 14, vorzugweise 23 Basen vorteilhaft ist. Besonders vorteilhaft ist es, wenn eine DNA-Sonde komplementär ist zu jener, abgeleiteten hMn-SOD DNA-Sequenz, deren genetische Information kolinear ist mit den Aminosäureresten 39 bis 46 und eine zweite DNA-Sonde komplementär ist zu der entsprechenden DNA-Region, die für die Aminosäurereste 200 bis 207 der bekannten Aminosäuresequenz codiert. Ebenso können natürlich auch DNA-Sequenzen als Sonden eingesetzt werden, die anhand anderer Mn-Superoxiddismutasen abgeleitet werden können.The special DNA sequences for theDNA probes according to the invention were usedbased on the method described by Barra, D. et al. publishedAmino acid sequence of human Mn-SOD from liver tissues(Barra, D. et al., Oxy Radicals and their scavengerSystems, Vol. 1, 336-339, 1983).In particular, two regions of theputative hMn-SOD DNA sequence used forat least five amino acid residues, preferably forEncode 8 amino acid residues, one being a DNA probe lengthof at least 14, preferably 23 bases advantageousis. It is particularly advantageous if a DNA probeis complementary to that derived hMn-SODDNA sequence whose genetic information is colinearwith amino acid residues 39 to 46 and a secondDNA probe is complementary to the corresponding oneDNA region responsible for the amino acid residues 200 to 207 of theknown amino acid sequence encoded. You can alsoof course, DNA sequences are also used as probesthat are based on other Mn superoxide dismutasescan be derived. 

Mit Hilfe einer solchen DNA-Sonde können positive Klone erhalten werden, aus denen eine cDNA-Sequenz nach folgender Formel Ia, isoliert werden kann, die einen großen Anteil einer für hMn-SOD codierenden Region enthält:With the help of such a DNA probe, positive clones canare obtained from which a cDNA sequence according tofollowing formula Ia, which can be isolatedlarge portion of a region coding for hMn-SODcontains:

Formel Ia Formula Ia

Überraschenderweise wurde gefunden, daß die gefundene cDNA für eine Aminosäuresequenz codiert, die sich von der publizierten Aminosäuresequenz (Barra, D. et al., J. Biol. Chem. 259, 12 595-12 601, 1984) in einigen Resten und in ihrer Länge voneinander unterscheidet. Die gefundenen Unterschiede dieser Sequenz zur "Barra-Sequenz" betreffen die Aminosäure-Positionen, 42, 88, 109 und 131 (jeweils Glu anstatt Gln) sowie zwei zusätzliche Aminosäuren Gly und Trp zwischen Position 123 und 124, so daß die erfindungsgemäße DNA-Sequenz einer hMn-SOD von 198 Aminosäuren entspricht.Surprisingly, it was found that the foundcDNA encodes an amino acid sequence that differs fromthe published amino acid sequence (Barra, D. et al.,J. Biol. Chem. 259, 12 595-12 601, 1984) in some residues and different in length. Thefound differences of this sequence to"Barra sequence" concern the amino acid positions,42, 88, 109 and 131 (each Glu instead of Gln) andtwo additional amino acids Gly and Trp betweenItem 123 and 124, so that the inventionDNA sequence of a hMn-SOD of 198 amino acidscorresponds.

Völlig unerwartet war auch, daß andererseits eine für hMn-SOD codierende cDNA isoliert werden konnte, die eine Aminosäuresubstitution an Position 29 bedeutet (Codon für Gln anstatt für Lys) und somit in diesem Punkt einen weiteren Unterschied "zur Barra-Sequenz" und zur Formel Ia aufweist, entsprechend Formel Ib:It was also completely unexpected that, on the other hand, one forcDNA encoding hMn-SOD could be isolatedmeans an amino acid substitution at position 29(Codon for Gln instead of Lys) and thus in thisPoint another difference "to the Barra sequence"and to formula Ia, corresponding to formula Ib:

Formel Ib Formula Ib

Geht man davon aus, daß die Barra-Sequenz richtig analysiert worden ist, kann anhand der erfindungsgemäßen Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenz die Möglichkeit eingeräumt werden, daß hiermit erstmals und überraschend die mögliche Existenz verschiedener Gene oder deren allele Ausprägungsformen oder Isoenzyme für hMn-SOD aufgezeigt wird.Assuming that the Barra sequence is correcthas been analyzed using thenucleotide or amino acid sequence according to the inventionPossibility to be granted that hereby for the first time andsurprising the possible existence of different genesor their allelic forms or isoenzymes forhMn-SOD is shown.

Da cDNA tragende Klone erhalten werden können, denen das für das komplette hMn-SOD Gen notwendige Ende fehlt, war eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung des kompletten Gens für hMn-SOD.Since cDNA-bearing clones can be obtained, thosethe end necessary for the complete hMn-SOD genewas another task of the presentInvention to provide the complete gene forhMn SOD.

Die Lösung dieser Aufgabe kann nach verschiedenen, bekannten Strategien erfolgen. Beispielsweise kann die erhaltene Sequenz selbst als DNA-Sonde eingesetzt und damit die cDNA-Bank nochmals durchsucht werden, um ein komplettes Gen bzw. eine cDNA mit dem jeweils fehlenden Ende zu finden, oder die erhaltene DNA-Sequenz kann als Hybridisierungssonde gegen eine genomische Bank verwendet werden, um nach Identifizierung das komplette hMn-SOD Gen zu isolieren.This problem can be solved according to differentknown strategies. For example, theobtained sequence itself used as a DNA probe andso the cDNA bank can be searched again to find acomplete gene or a cDNA with the missing oneFind end, or the DNA sequence obtained can be asHybridization probe against a genomic bankused to identify the complete after identificationto isolate hMn-SOD gene.

Oder man bedient sich der Möglichkeit, Oligonukleotide zu synthetisieren, deren Nukleotidsequenz dem fehlenden Ende der hMn-SOD entspricht und mit Hilfe dieser, nach geeigneter Linker-Ligation, die vollständige cDNA für hMn-SOD zu erhalten. Diese Methode besitzt den Vorteil, daß beispielsweise eine für hMn-SOD codierende DNA erhalten werden kann, deren 5′-Ende direkt mit dem Startcodon (ATG) beginnt.Or you use the possibility of oligonucleotidesto synthesize the nucleotide sequence of the missingEnd of the hMn-SOD and with the help of this, aftersuitable linker ligation, the complete cDNA forto get hMn-SOD. This method has the advantagethat, for example, a DNA coding for hMn-SODcan be obtained, the 5'-end directly with theStart codon (ATG) begins. 

Als besonders geeignet, diese Aufgabe zu lösen, erwies sich für die Komplettierung der beispielsweise ab Aminosäure 22 oder 26 codierenden, erfindungsgemäßen cDNAs die DNA-Sequenz der Formel II, beginnend mit dem 5′-Startcodon ATG und endend mit dem Codon für Aminosäure 31 (His, wobei AAG [Lys]=1) unter Zugrundelegung der bekannten Codonpräferenzen wie sie beispielsweise für die Hefe Gültigkeit besitzen (Sharp, P. M. et al., Nucl. Acids. Res. 14 (13), 5125-5143, 1986)It proved to be particularly suitable for solving this taskopting for completing the exampleAmino acid 22 or 26 coding according to the inventioncDNAs the DNA sequence of formula II, starting with the5′-start codon ATG and ending with the codon forAmino acid 31 (His, where AAG [Lys] = 1) belowBased on the known codon preferences like themare valid for yeast (Sharp,P.M. et al., Nucl. Acids. Res. 14 (13), 5125-5143, 1986)

Formel II Formula II

Ebenso können andere bekannte synonyme Codons für die Komplettierung des hMn-SOD Gens oder zur in vitro Synthese des gesamten Gens verwendet werden, z. B. solche, die eine optimale Codon-Anticodon Wechselwirkung in Bakterien, z. B. E. coli, erleichtern und dort die Effizienz der Translation erhöhen (Grosjean, H. Fiers, W., Gene 18, 199-209, 1982; Ikemura, T., J. Mol. Biol. 151, 389-409, 1981) oder solche Codons, die den genuinen Verhältnissen in Säugetierzellen entsprechen (Grantham, R. et al., Nucleic Acid Research 9, 43-47, 1981). Letztere können vorzugsweise zur Transformation und nachfolgend zur Expression in Säugetierzellen eingesetzt werden.Likewise, other known synonymous codons for theCompletion of the hMn-SOD gene or for in vitroSynthesis of the entire gene can be used, e.g. B.those that have an optimal codon anticodonInteraction in bacteria, e.g. B. E. coli, facilitateand increase the efficiency of translation there(Grosjean, H. Fiers, W., Gene 18, 199-209, 1982;Ikemura, T., J. Mol. Biol. 151, 389-409, 1981) orsuch codons, which correspond to the real conditions inCorrespond to mammalian cells (Grantham, R. et al.,Nucleic Acid Research 9, 43-47, 1981).The latter can preferably be used for transformation andsubsequently used for expression in mammalian cellswill. 

Es ist prinzipiell möglich, den Methioninrest, der durch das Startcodon ATG kodiert wird und dem reifen hMn-SOD, beginnend mit der ersten Aminosäure Lysin, vorangestellt ist, nach an sich bekannten Verfahren, beispielsweise mit CNBr oder CNCl, abzuspalten. Da aber im reifen Enzym hMn-SOD weitere interne Methioninreste vorkommen können - z. B. an Positionen 23 oder 192 - kann eine solche Vorgehensweise nicht durchführbar sein, so daß in diesem Fall der zusätzliche N-terminale Methioninrest erhalten bleibt, ohne Einfluß auf die biologische Aktivität der hMn-SOD.In principle it is possible to get the methionine residue throughthe start codon ATG is encoded and the mature hMn-SOD,beginning with the first amino acid lysineis, according to known methods, for examplewith CNBr or CNCl. But since in the mature enzymehMn-SOD further internal methionine residues can occur -e.g. B. at positions 23 or 192 - suchProcedure cannot be carried out, so in thisIn case the additional N-terminal methionine residue is obtainedremains without influence on the biological activity of thehMn SOD.

Es können jedoch auch enzymatische Spaltungen vorgesehen werden, wobei bekannterweise geeignete synthetische Linker eingesetzt werden können, da zu erwarten ist, daß sich Codons für entsprechende, spezifische Aminosäuren an den gewünschten Positionen auf dem Vektor, der die hMn-SOD cDNA enthält, befindet. Z. B. sind Arg- oder Lys-Reste für eine tryptische Spaltung zu nennen bzw. man bedient sich allgemein Codons, die für Protease-empfindliche Aminosäuren codieren. Diese können vor oder hinter dem Start-Codon positioniert werden oder innerhalb der codierenden Region.However, enzymatic cleavages can also be providedare, known to be suitable syntheticLinkers can be used since it is expected thatthemselves codons for corresponding, specific amino acidsat the desired positions on the vector that thecontains hMn-SOD cDNA. For example, Arg- orTo name Lys residues for tryptic cleavage orone generally uses codons forEncode protease sensitive amino acids. these canbe positioned before or after the start codon orwithin the coding region.

Eine zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, mit Hilfe gentechnologischer Verfahren die für hMn-SOD codierende Sequenz in geeigneten Wirtszellen erstmals zur Expression zu bringen, das homogene Enzym hMn-SOD nach solchen Verfahren erstmalig herzustellen, zu isolieren und in reiner Form bereitzustellen und die dafür erforderliche Vorgehensweise erstmals zu beschreiben.An additional object of the present invention wasit, with the help of genetic engineering methods, the forSequence encoding hMn-SOD in suitable host cellsto express for the first time, the homogeneous enzymeto produce hMn-SOD for the first time using such processes, to isolate and provide in pure form and thenecessary procedure for the first timedescribe.

Erfindungsgemäß wurde diese Aufgabe dadurch gelöst, indem die für hMn-SOD codierenden DNA-Sequenzen, beispielsweise der Formeln IIIa, oder IIIbAccording to the invention, this object was achieved byby the DNA sequences coding for hMn-SOD,for example of the formulas IIIa or IIIb

Formel IIIa Formula IIIa

Formel IIIb Formula IIIb

gegebenenfalls mit entsprechenden Signal- oder Kontrollsequenzen versehen, in geeignete Vektoren inseriert und damit geeignete Wirtszellen transformiert wurden. Nach Kultivierung der transformierten Wirtszellen werden die gebildeten Polypeptide nach an sich bekannten Verfahren isoliert und gereinigt. Die erhaltenen Polypeptide entsprechen den nachfolgenden Formeln IVa und IVb.if necessary with appropriate signal orProvide control sequences in suitable vectorsinserted and thus transformed suitable host cellswere. After cultivating the transformedThe polypeptides formed become host cells afterknown processes isolated and cleaned. Thepolypeptides obtained correspond to the followingFormulas IVa and IVb. 

Formel IVa Formula IVa

Formel IVb Formula IVb

Die Sequenz gemäß Formeln IIIa und IIIb eignen sich besonders zur Herstellung von nicht-glykolisierter hMn-SOD der Formeln IVa und IVb in Mikroorganismen, insbesondere in E. coli oder S. cerevisiae. Das Problem der Glykosylierung beispielsweise in Hefe kann dadurch umgangen werden, daß man sich Mutanten bedient, die Defizient sind in der Glykosylierung von Proteinen (alg Mutanten) (z. B. Huffaker, T. C., Robbins P. W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7466-7470, 1983).The sequences according to formulas IIIa and IIIb are suitableespecially for the production of non-glycosylatedhMn-SOD of the formulas IVa and IVb in microorganisms,especially in E. coli or S. cerevisiae. The problemglycosylation in yeast, for examplebe avoided that mutants are used thatThe glycosylation of proteins (algMutants) (e.g. Huffaker, T.C., Robbins P.W. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 80, 7466-7470, 1983).

Falls es notwendig oder sinnvoll erscheint, kann dem kompletten hMn-SOD Gen, beispielsweise gemäß Formeln IIIa oder IIIb eine Leader- bzw. Signalsequenz direkt dem ersten Codon der ersten N-terminalen Aminosäure der reifen hMn-SOD bzw. vor dem Startcodon ATG vorangestellt werden. Hiermit kann erreicht werden, daß die hMn-SOD aus der Wirtszelle transportiert und leicht aus dem Kulturmedium isoliert werden kann.If it appears necessary or sensible, thecomplete hMn-SOD gene, for example according to formulasIIIa or IIIb a leader or signal sequence directlythe first codon of the first N-terminal amino acid ofmature HMn-SOD or in front of the start codon ATGwill. This can be achieved that the hMn-SODtransported out of the host cell and easily out of theCulture medium can be isolated.

Derartige Signalsequenzen sind beschrieben worden; sie codieren für einen meist hydrophoben Proteinanteil, der durch posttranslationale Modifikationsprozesse in der Wirtszelle abgespalten wird (Davis, D. B., Tai. P.-C., Nature 283, 433-438, 1980; Perlman, D., Halvorson, H. O., J. Mol. Biol. 167, 391-409, 1983). Wenn vor die erste Aminosäure der hMn-SOD ein ATG-Codon konstruiert worden ist, kann ein Genprodukt erhalten werden, das vor dem Lysin ein N-terminales Methionin enthält. Daß Signalsequenzen von Prokaryoten verwendet werden, um Proteine in das Periplasma zu sekretieren und korrekt zu prozessieren, ist bekannt (z. B. Davis, B. D., Tai, P.-C., 1980).Such signal sequences have been described; theycode for a mostly hydrophobic portion of protein, thethrough post-translational modification processes in theHost cell is split off (Davis, D.B., Tai. P.-C.,Nature 283, 433-438, 1980; Perlman, D., Halvorson, H.O.,J. Mol. Biol. 167, 391-409, 1983). If before the firstAmino acid of the hMn-SOD has been constructed as an ATG codonis a gene product can be obtained that beforeLysine contains an N-terminal methionine. ThatSignal sequences from prokaryotes are used toTo secrete proteins into the periplasm and correct themprocess is known (e.g. Davis, B.D., Tai,P.-C., 1980). 

Selbstverständlich ist es nach Isolierung und Klonierung der hMn-SOD DNA-Sequenz möglich, das durch diese Sequenz codierte Enzym spezifisch zu modifizieren. Enzymmodifikationen können beispielsweise über gezielte in vitro Mutationen mit synthetischen Oligonukleotiden erfolgen, wodurch die katalytischen Eigenschaften der hMn-SOD beeinflußt und neuartige enzymatische Aktivitäten geschaffen werden können. Die grundlegenden methodischen Schritte zur Durchführung derartiger Proteinmanipulationen sind bekannt (z. B. Winter, G. et al., Nature 299, 756-758, 1982; Dalbadie - Mc Farland, G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409-6413, 1982).Of course it is after isolation and cloningthe hMn-SOD DNA sequence possible through this sequenceto specifically modify the encoded enzyme.Enzyme modifications can be targeted, for examplein vitro mutations with synthetic oligonucleotidestake place, whereby the catalytic properties of thehMn-SOD affects and novel enzymaticActivities can be created. The basicmethodological steps to carry out suchProtein manipulations are known (e.g. Winter, G. etal., Nature 299, 756-758, 1982; Dalbadie - Mc Farland,G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409-6413,1982).

Für die Klonierung, d. h. Amplifikation und Präparation, des hMn-SOD Gens kann E. coli verwendet werden, vorzugsweise E. coli C600 (Nelson et al., Virology 108, 338-350, 1981) oder JM 101, bzw. E. coli-Stämme mit mindestens einem der bekannten sup-Genotypen. Die Klonierung kann aber auch in gram-positiven Bakterien wie z. B. B. subtilis erfolgen. Derartige Systeme sind vielfach beschrieben.For cloning, i.e. H. Amplification and preparation,of the hMn-SOD gene, E. coli can be usedpreferably E. coli C600 (Nelson et al., Virology108, 338-350, 1981) or JM 101, or E. coli strainsat least one of the known sup genotypes. TheCloning can also occur in gram-positive bacteriasuch as B. B. subtilis. Such systems aredescribed many times.

Als geeignete Wirte für die Expression des erfindungsgemäßen hMn-SOD-Gens kommen sowohl Mikroorganismen als auch Kulturen multizellulärer Organismen in Frage.As suitable hosts for the expression of thehMn-SOD gene according to the invention both comeMicroorganisms as well as cultures of multicellularOrganisms in question.

Unter Mikroorganismen sind Prokaryoten, d. h. gram-negative oder gram-positive Bakterien, und Eukaryoten, wie Protozoen, Algen, Pilze bzw. höhere Protisten, zu verstehen. Von den gram-negativen Bakterien sind besonders die Enterobacteriaceae, z. B. E. coli, von den gram-positiven die Bacillaceae und apathogenen Micrococcaceae, z. B. B. subtilis und Staph. carnosus, von den Eukaryoten die Ascomyceten insbesondere die Hefen, z. B. Saccharomyces cerevisiae, bevorzugte Wirte.Among microorganisms are prokaryotes, i.e. H.gram-negative or gram-positive bacteria, andEukaryotes such as protozoa, algae, fungi or higher Protists to understand. From the grief-negativeBacteria are especially the Enterobacteriaceae, e.g. B. E.coli, from the gram-positive the Bacillaceae andnon-pathogenic Micrococcaceae, e.g. B. B. subtilis and Staph.carnosus, from the eukaryotes the Ascomycetes in particularthe yeasts, e.g. B. Saccharomyces cerevisiaeLandlords.

Für einzellige Mikroorganismen stehen eine Vielzahl an Ausgangsvektoren zur Verfügung, die sowohl plasmidischen als auch viralen Ursprungs sein können. Diese Vektoren können in einfacher Kopienzahl oder als Multicopy-Vektoren vorliegen. Derartige Vektoren, die zur Klonierung und Expression der erfindungsgemäßen hMn-SOD wie allgemein für eukaryotische DNA-Sequenzen geeignet sind, werden in vielen Publikationen und Manuals beschrieben (z. B. Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Glover, D. M. (ed.) DNA Cloning Vol. I, II, 1985) und sind kommerziell erhältlich.There are a large number of unicellular microorganismsOutput vectors are available that are both plasmidas well as being of viral origin. These vectorscan be in simple number of copies or asMulticopy vectors are available. Such vectors, thefor cloning and expression of the inventionhMn-SOD as general for eukaryotic DNA sequencesare suitable in many publications andManuals described (e.g. Maniatis, T. et al., MolecularCloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Glover,D. M. (ed.) DNA Cloning Vol. I, II, 1985) and arecommercially available.

Im allgemeinen können Plasmid-Vektoren, die in der Regel einen Replikationsursprung und Kontrollsequenzen für die Transkription, Translation und Expression enthalten, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet werden. Diese Sequenzen sollten aus Spezies stammen, die kompatibel mit den Wirtszellen sind. Der Vektor trägt üblicherweise neben einer Replikationsstelle zusätzlich Erkennungssequenzen, die es ermöglichen, in transformierten Zellen phänotypisch zu selektionieren. Die Selektion kann entweder durch Komplementation, Suppression oder durch Inaktivierung eines Markers erfolgen. Hinsichtlich der beiden erstgenannten Verfahren sind auxotrophe Mutanten von Bakterien und Hefen, die defizient sind für ein essentielles Stoffwechselprodukt, oder Nonsense-Mutanten, in denen es bei der Translation des betroffenen Gens zum Kettenabbruch kommt. Verschiedene Suppressor-Gene, z. B. supD, E, F (supprimieren UAG), supC, G (supprimieren UAG oder UAA) sind bekannt. Beim dritten Verfahren trägt der Vektor ein Resistenz-Gen gegen ein oder mehrere cytotoxische Agenzien, wie z. B. Antibiotika, Schwermetalle. Durch Insertion einer fremden DNA in solch ein Marker-Gen wird dieses inaktiviert, so daß der neu entstandene Phänotyp vom ursprünglichen Phänotyp unterschieden werden kann.In general, plasmid vectors, which are usuallyan origin of replication and control sequences for theContain transcription, translation and expression, inConnection with these hosts can be used. TheseSequences should come from species that are compatiblewith the host cells. The vector usually carriesin addition to a replication siteRecognition sequences that allow into selectively select transformed cells.The selection can be made either by complementation,Suppression or by inactivating a markerrespectively. Regarding the two first-mentioned methods are auxotrophic mutants ofBacteria and yeast that are deficient for oneessential metabolite, orNonsense mutants in which the translation of theaffected gene comes to chain termination. VariousSuppressor genes, e.g. B. supD, E, F (suppress UAG),supC, G (suppress UAG or UAA) are known.In the third method, the vector is enteredResistance gene against one or more cytotoxicAgents such as B. antibiotics, heavy metals. ByInsertion of a foreign DNA into such a marker genethis inactivated so that the newly created phenotypecan be distinguished from the original phenotype.

Zum Beispiel kann E. coli mit pBR322 transformiert werden, ein Plasmid das aus E. coli Species stammt (Bolivar, et al., Gene 2, 95 (1977). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und liefert damit einfache Mittel, transformierte Zellen zu identifizieren, indem durch Klonieren in beispielsweise die PstI-Stelle imβ-Lactamase-Gen der Phänotyp Ap^r, Tc^r zu Ap^s, Tc^r konvertiert wird. Andere Verfahren sind gleichsam anwendbar, wofür beispielsweise die lacZ-Geninaktivierung beiλ- und M 13-Vektoren sowie bei verschiedenen Plasmiden (z. B. pUC, pUR) bedeutend ist. Diese sehr vielfältigen Selektionssysteme sind altbekannt und entsprechend liegt darüber eine Fülle an Literatur vor.For example, E. coli can be transformed with pBR322, a plasmid derived from E. coli species (Bolivar, et al., Gene 2, 95 (1977). PBR322 contains genes for ampicillin and tetracycline resistance and thus provides simple means to identify transformed cells by converting the phenotype Ap^r , Tc^r to Ap^s , Tc^r by cloning into, for example, the PstI site in theβ- lactamase gene Other methods are equally applicable, for which, for example, the lacZ gene inactivationλ and M 13 vectors and various plasmids (eg pUC, pUR) are significant, these very diverse selection systems are well known and there is a wealth of literature on them.

Neben solchen Selektionsmarkern müssen derartige Vektoren, insbesondere Expressionsvektoren, Signalsequenzen aufweisen, die die korrekte Initiation und Termination der Transkription gewährleisten. Für die korrekte Transkription des hMn-SOD Gens können daher diese Vektoren eine bakterielle oder eukaryotische Transkriptionseinheit enthalten, bestehend aus einem Promotor, der kodierenden Region mit dem hMn-SOD Gen und des sich daran anschließenden Terminators. Entsprechend der Natur der Transkriptionseinheiten können diese konservierte Prototyp-Sequenzen wie z. B. Pribnow-Box oder TTG-Sequenz oder aber CAAT-Box, TATA-Box, die bekannten Terminationssignale (z. B. AATAAA, TATGT), sowie mindestens ein Stop-Codon enthalten, wobei vorzugsweise hinsichtlich des Wirtes homologe Promotoren und Terminatoren verwendet werden. Die gebildete mRNA enthält üblicherweise eine 3′-poly(A)-Sequenz und/oder eine 5′-cap-Struktur. Für die Translation des hMn-SOD Gens bedarf es einer ribosomalen Bindungsstelle (RBS), bestehend aus Shine/Dalgarno (S/D)-Sequenz und einem dazu in definiertem Abstand von allgemein 3 bis 12 Nukleotiden stehendem Initiationscodon sowie mindestens einem Stop-Codon. Alternativ können RBSs synthetisch hergestellt werden, wodurch die Homologie mit dem 3′-Ende der 16S rRNA erhöht werden kann (Jay, E. et al., Nucleic Acids Res. 10, 6319-6329, 1982).In addition to such selection markers, suchVectors, especially expression vectors,Signal sequences that have the correct initiationand ensure termination of the transcription. For thecorrect transcription of the hMn-SOD gene can thereforethese vectors are bacterial or eukaryoticContained transcription unit consisting of aPromoter, the coding region with the hMn-SOD gene andof the adjoining terminator. Correspondingthe nature of the transcription units can affect theseconserved prototype sequences such as B. Pribnow boxor TTG sequence or CAAT box, TATA box thatknown termination signals (e.g. AATAAA, TATGT),and contain at least one stop codon, wherepreferably promoters homologous to the hostand terminators can be used. The mRNA formedusually contains a 3'-poly (A) sequence and / ora 5'-cap structure. For the translation of the hMn-SODGene requires a ribosomal binding site (RBS),consisting of Shine / Dalgarno (S / D) sequence and ain addition at a defined distance of generally 3 to 12Nucleotide standing initiation codon and at leasta stop codon. Alternatively, RBSs can be syntheticbe produced, which creates homology with the3 ′ end of the 16S rRNA can be increased (Jay, E. et al.,Nucleic Acids Res. 10, 6319-6329, 1982).

Insbesondere bei eukaryotischen Expressionssystemen (z. B. S. cerevisiae) sollten vorzugsweise Regulationssysteme für die Translation wirtseigenem Ursprungs benutzt werden, da in Hefen keine den Prokaryoten analogen Verhältnisse (Homologie der S/D-Sequenz mit dem 3′-Ende der 16S rRNA) vorliegen und die Signale bzw. die RBS für die Initiation der Translation auf eine etwas andere Weise als bei Prokaryoten definiert sind (z. B. Kozak, M., Nucleic Acids Res. 9, 5233-5252, 1981; Kozak, M. J. Mol., Biol. 156, 807-820, 1982).Especially in eukaryotic expression systems(e.g. S. cerevisiae) should be preferredRegulation systems for translation hostOf origin, because none of the yeasts Prokaryotic analogous relationships (homology ofS / D sequence with the 3'-end of the 16S rRNA) andthe signals or the RBS for the initiation of theTranslation in a slightly different way than inProkaryotes are defined (e.g. Kozak, M., NucleicAcids Res. 9, 5233-5252, 1981; Kozak, M.J. Mol., Biol.156, 807-820, 1982).

Vorzugsweise besitzt der Klonierungs- oder Expressionsvektor nur eine Restriktionsendonuklease-Erkennungsstelle, die entweder im Ausgangsvektor a priori vorliegt oder nachträglich über entsprechende Linker eingeführt werden kann. Linker können entweder chemisch leicht synthetisiert werden oder sind kommerziell erhältlich.Preferably, the cloning orExpression vector only oneRestriction endonuclease recognition site, eitheris present in the output vector a priori or latercan be introduced via appropriate linkers. Leftcan be easily synthesized either chemicallyor are commercially available.

Häufig benutzte Hefe-Promotoren bei der Herstellung von entsprechenden Expressionsplasmiden beinhalten solche Promotoren, die im Hefesystem die Expression besonders effizient steuern, wie z. B. PGK Promotor (Tuite, M. F. et al., The EMBO Journal 1, 603-608, 1982; Hitzeman, R. A. et al., Science 219, 620-625, 1983), PH05 Promotor (Hinnen, A., & Meyhack, B., Current Topics in Microbiology and Immunology 96, 101-117, 1982; Kramer, R. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 367-370, 1984), GAPDH Promotor (Urdea, M. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7461-7465, 1983), GAL10 Promotor (Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression 83-117, 1983), Enolase (ENO)-Promotor (Holland, M. J. et al., J. Biol. Chem. 256, 1385-1395, 1981),α-Faktor Promotor (Bitter, G.-A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5330-5334; Yakota, T. et al., Miami Winter Symp. 17. Meet. Adv. Gene Technol. 2, 49-52, 1985) oder der ADHI Promotor (Ammerer, G., Methods in Enzymology 101, 192-201, 1983; Hitzeman, R. A. et al., Nature 293, 717-722, 1981).Frequently used yeast promoters in the production of corresponding expression plasmids include those promoters which control expression particularly efficiently in the yeast system, such as, for. B. PGK promoter (Tuite, MF et al., The EMBO Journal 1, 603-608, 1982; Hitzeman, RA et al., Science 219, 620-625, 1983), PH05 promoter (Hinnen, A., & Meyhack , B., Current Topics in Microbiology and Immunology 96, 101-117, 1982; Kramer, RA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 367-370, 1984), GAPDH promoter (Urdea, MS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7461-7465, 1983), GAL10 promoter (Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression 83-117, 1983), Enolase (ENO) promoter (Holland, MJ et al., J. Biol. Chem. 256, 1385-1395, 1981),α factor promoter (Bitter, G.-A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5330-5334 ; Yakota, T. et al., Miami Winter Symp. 17. Meet. Adv. Gene Technol. 2, 49-52, 1985) or the ADHI promoter (Ammerer, G., Methods in Enzymology 101, 192-201, 1983 ; Hitzeman, RA et al., Nature 293, 717-722, 1981).

Auch sind Promotoren anderer glykolytischer Enzyme (Kawasaki und Fraenkel, Biochem. Biophys. Res. Comm. 108, 1107-1112, 1982) geeignet, wie Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-Phosphat Isomerase, Phosphoglucose Isomerase und Glucokinase. Bei der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide können die mit diesen Genen assoziierten Terminationssequenzen ebenfalls in den Expressions-Vektor am 3′-Ende der zu exprimierenden Sequenz eingesetzt werden, um Polyadenylierung und Termination der mRNA vorzusehen. Andere Promotoren, die zudem noch den Vorteil der durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription besitzen, sind die Promotor-Regionen der Alkohol-Dehydrogenase-2, des Isocytochrom C, der abbauenden Enzyme, die mit dem Stickstoff-Metabolismus gekoppelt sind, die oben erwähnte Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase (GAPDH) und der Enzyme, die für die Metabolisierung von Maltose und Galaktose verantwortlich sind. Promotoren, die durch den Hefe Mating Typ Locus reguliert werden, beispielsweise Promotoren der Gene BARI, MECI, STE2, STE3, STE5 können bei temperaturregulierten Systemen durch die Verwendung von temperaturabhängigen sir Mutationen eingesetzt werden. (Rhine, Ph. D. Thesis, University of Oregon, Eugene, Oregon (1979), Herskowitz and Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, part I, 181-209 (1981), Cold Spring Harbor Laboratory). Diese Mutationen beeinflussen die Expression der ruhenden Mating Typ Kassetten von Hefen und dadurch indirekt die Mating Typ abhängigen Promotoren. Generell ist jedoch jeder Plasmid-Vektor, der einen Hefe-kompatiblen Promotor, originäre Replikations- und Terminationssequenzen enthält, geeignet.They are also promoters of other glycolytic enzymes(Kawasaki and Fraenkel, Biochem. Biophys. Res. Comm.108, 1107-1112, 1982), such as hexokinase,Pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase,Glucose-6-phosphate isomerase, phosphoglucose isomeraseand glucokinase. In the construction more suitableExpression plasmids can be those with these genesassociated termination sequences also in theExpression vector at the 3'-end of the to be expressedUsed to sequence and polyadenylationProvision of termination of the mRNA. Other promoters thatalso the advantage of growing conditionscontrolled transcription are thePromoter regions of alcohol dehydrogenase-2, desIsocytochrome C, the degrading enzyme that works with theNitrogen metabolism are linked to the abovementioned glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) and the enzymes responsible for the metabolism ofMaltose and galactose are responsible. Promoters,which are regulated by the yeast mating type locus,for example promoters of the BARI, MECI, STE2 genes,STE3, STE5 can be used in temperature-regulated systemsthrough the use of temperature dependent sirMutations are used. (Rhine, Ph.D. thesis,University of Oregon, Eugene, Oregon (1979), Herskowitzand Oshima, The Molecular Biology of the YeastSaccharomyces, part I, 181-209 (1981), Cold Spring Harbor Laboratory).These mutations influence the expression of theresting mating type cartridges of yeast and therebyindirectly the mating type dependent promoters. As a general rulehowever, each plasmid vector is oneYeast-compatible promoter, original replication andContains termination sequences, suitable.

Für den Fall, daß die Expression von hMn-SOD in Bakterien erfolgen soll, sind vorzugsweise solche Promotoren einzusetzen, die eine hohe Syntheserate an mRNA bedingen und die darüber hinaus induzierbar sind. Bekannte und verwendete Promotoren beinhalten die Beta-Lactamase-(Penicillinase) und Lactose-Promotor-Systeme (Chang et al., Nature 275, 615 (1987); Itakura et al., Science 198, 1056 (1977); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979) inclusive des UV5-Promotors (Silverstone, A. E et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66, 773-779, 1970) und Tryptophan (trp) Promotor-Systeme (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8 4057 (1980); Europa-Anmeldung, Offenlegungs-Nr. 00 36 776). Darüber hinaus sind auch andere mikrobielle Promotoren entwickelt und benutzt worden. Die Gen-Sequenz für hMn-SOD kann beispielsweise unter der Kontrolle des Lambda-P_L Promotors transkribiert werden. Dieser Promotor ist bekannt als einer der besonders starken, steuerbaren Promotoren. Die Steuerung wird möglich durch einen thermolabilen Repressor cI (z. B. cI857), von dem benachbarte Restriktionsschnittstellen bekannt sind. Daneben können auch der Promotor der alkalischen Phosphatase aus E. coli (Ohsuye, K. et al., Nucleic Acids Res. 11, 1283-1294, 1983) und hybride Promotoren, wie z. B. den tac-Promotor (Amann, E. et al., Gene 25, 167-178, 1983; De Boer, H. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25, 1983). Über die Anwendung solcher tragbaren Promotoren (lacuv5, lacZ SD, tac) bzw. über Vektoren zur Herstellung fusionierter und nicht-fusionierter eukaryotischer Proteine in E. coli, kann auch in T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, insbesondere S. 412f nachgelesen werden. Die Expression und Translation einer hMn-SOD Sequenz in Bakterien kann auch unter Kontrolle anderer Regulationssysteme, die als "homolog" zu dem Organismus in seiner untransformierten Form gelten können, ablaufen. Beispielsweise können auch Promotor-Operator-Systeme wie Arabinose-Operator, Colicin El-Operator, Galactose-Operator, alkalische Phosphatase-Operator, trp-Operator, Xylose A Operator, u. ä. oder Teile davon verwendet werden.In the event that the expression of hMn-SOD is to take place in bacteria, it is preferable to use promoters which require a high synthesis rate of mRNA and which are also inducible. Known and used promoters include the beta-lactamase (penicillinase) and lactose promoter systems (Chang et al., Nature 275, 615 (1987); Itakura et al., Science 198, 1056 (1977); Goeddel et al. , Nature 281, 544 (1979) including the UV5 promoter (Silverstone, A.E et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66, 773-779, 1970) and tryptophan (trp) promoter systems (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8 4057 (1980); European Application, Laid-Open No. 00 36 776. Other microbial promoters have also been developed and used. The gene sequence for hMn-SOD can be found, for example, at The control of the lambda P_L promoter can be transcribed This promoter is known as one of the particularly strong, controllable promoters The control is made possible by a thermolabile repressor cI (eg cI857), of which neighboring restriction sites are known also the promoter of the alkaline phosphatase from E. coli (Ohsuye, K. et al., Nucleic Acid s Res. 11, 1283-1294, 1983) and hybrid promoters such as e.g. B. the tac promoter (Amann, E. et al., Gene 25, 167-178, 1983; De Boer, HA, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25, 1983) . The use of such portable promoters (lacuv5, lacZ SD, tac) or vectors for the production of fused and unfused eukaryotic proteins in E. coli can also be found in T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, in particular p. 412f. The expression and translation of an hMn-SOD sequence in bacteria can also take place under the control of other regulatory systems which can be considered "homologous" to the organism in its untransformed form. For example, promoter-operator systems such as arabinose operator, colicin EI operator, galactose operator, alkaline phosphatase operator, trp operator, xylose A operator, etc. Ä. or parts thereof are used.

Zur Klonierung oder Expression von hMn-SOD in Bakterien, beispielsweise in E. coli, oder in Hefen, beispielsweise in S. cerevisiae, stehen gutbekannte Vektoren zur Verfügung, von denen für die erstgenannten Wirtssysteme vorteilhaft die pBR-(Bolivar, F. et al., Gene 2, 95-113, 1977), pUC-(Vieira, I., Messing. I., Gene 19, 259-268, 1982) pOP- (Fuller, F., Gene 19, 43-54, 1982), pAT- (Windass, J. D. et al., Nucleic Acids Res. 10, 6639-6657, 1982) pHV-Plasmide (Ehrlich, S. D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1433-1436, 1977), Lambda-Vektoren inclusive Phasmide (Brenner, S. et al., Gene 17, 27-44, 1982), Cosmide (Collins, J., Hohn. B., Proc. Natl, Acad. Sci. USA 75, 4242-4246, 1979) und die anderen literaturbekannten Vektoren (z. B. Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Habor Laboratory, 1982), insbesondere pBR- und pUC-Derivate, beispielsweise pBR322, pUC18 verwendet werden können.For cloning or expression of hMn-SOD inBacteria, for example in E. coli, or in yeast,for example in S. cerevisiae, are well knownVectors are available, of which for the formerHost systems advantageous the pBR- (Bolivar, F. et al.,Gene 2, 95-113, 1977), pUC- (Vieira, I., Messing. I., Gene19, 259-268, 1982) pOP- (Fuller, F., Gene 19, 43-54,1982), pAT- (Windass, J.D. et al., Nucleic Acids Res. 10,6639-6657, 1982) pHV plasmids (Ehrlich, S.D., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 75, 1433-1436, 1977),Lambda vectors including phasmids (Brenner, S. et al.,Gene 17, 27-44, 1982), Cosmide (Collins, J., Hohn. B., Proc. Natl, Acad. Sci. USA 75, 4242-4246, 1979) and theother known vectors (e.g. Maniatis, T.et al., Molecular Cloning, Cold Spring Habor Laboratory,1982), in particular pBR and pUC derivatives,for example pBR322, pUC18 can be used.

Als Expressionsvektoren in Hefen bieten sich integrierende (YIp), replizierende (YRp) und episomale (YEp) Vektoren (Struhl, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1035-1039, 1979; Stinchcomb, D. T. et al., Nature 282, 39-43, 1979; Hollenberg, C. P., Current Topics in Microbiology and Immunology 96, 119-144, 1982) an, vorzugsweise YEp13 (Broach, J. R. et al., Gene 8, 121-133, 1979), YIp5 (Struhl, K. et al., 1979 s. o., ATCC 37061) sowie pJDB207 (DSM 3181) oder pEAS102. Der Vektor pEAS102 kann erhalten werden, indem YIp5 mit PstI teilweise und mit BamHI vollständig verdaut und das isolierte 4,3 kb Fragment (enthält das URA3 Gen) mit dem 4,4 kb BamHI/PstI-fragment von pJDB207 ligiert werden.Expression vectors in yeasts are suitableintegrating (YIp), replicating (YRp) and episomal(YEp) vectors (Struhl, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 76: 1035-1039, 1979; Stinchcomb, D.T. et al., Nature282, 39-43, 1979; Hollenberg, C.P., Current Topics inMicrobiology and Immunology 96, 119-144, 1982),preferably YEp13 (Broach, J.R. et al., Gene 8, 121-133,1979), YIp5 (Struhl, K. et al., 1979 see above, ATCC 37061)as well as pJDB207 (DSM 3181) or pEAS102. The vectorpEAS102 can be obtained by YIp5 with PstIpartially and completely digested with BamHI and thatisolated 4.3 kb fragment (contains the URA3 gene) with the4.4 kb BamHI / PstI fragment from pJDB207.

Zusätzlich zu Mikroorganismen sind Kulturen multizellulärer Organismen ebenfalls geeignete Wirte für die Expression von hMn-SOD. Im Prinzip ist jede dieser Kulturen einsetzbar, ob von Wirbeltier- oder wirbellosen Tierzellkulturen. Größtes Interesse besteht jedoch an Wirbeltier-Zellen, so daß die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebe-Kultur) in den letzten Jahren zu einer routinemäßigen Methode wurde (Tissue, Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, Editors, 1973). Beispiele solcher nützlichen Wirtszellinien sind VERO- und HeLa-Zellen, Goldhamster-Eierstock (CHO)-Zellen und W138, BHK, COS-7 und MDCK-Zellinien. Expressionvektoren für diese Zellen enthalten üblicherweise einen Replikationsursprung, einen Promotor, der vor der zu exprimierenden hMn-SOD lokalisiert ist, eine notwendige Ribosomenbindungsstelle, RNA-Spleißstelle, Polyadenylierungsstelle und transkriptionelle Terminations-Sequenzen.In addition to microorganisms are culturesmulticellular organisms also suitable hosts forthe expression of hMn-SOD. In principle, each is thisCultures can be used, whether from vertebrate or invertebrateAnimal cell cultures. However, there is greatest interestVertebrate cells, so that the multiplication ofVertebrate cells in culture (tissue culture) in recentYears has become a routine method (tissue,Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, Editors,1973). Examples of such useful host cell lines areVERO and HeLa cells, golden hamster ovary (CHO) cells and W138, BHK, COS-7 and MDCK cell lines.Contain expression vectors for these cellsusually an origin of replication, onePromoter that precedes the hMn-SOD to be expressedis localized, a necessaryRibosome binding site, RNA splice site,Polyadenylation site and transcriptionalTermination sequences.

Bei der Verwendung von Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen auf den Expressions-Vektoren oftmals aus viralem Material vorgesehen. Beispielsweise stammen die üblicherweise verwendeten Promotoren aus Papovaviren wie Polyoma-, Papilloma Viren, Simian Virus 40 (SV 40) und aus Retroviren, Adenovirus Typ 2. Die frühen und späten Promotoren des SV 40 und deren Anwendungen sind vielfältig beschrieben. Außerdem ist es möglich und oft empfehlenswert, Promotor- oder Kontroll-Sequenzen oder Spleißsignale zu verwenden, die mit den gewünschten Gensequenzen ursprünglich verknüpft sind, vorausgesetzt, diese Kontrollsequenzen sind kompatibel zu den Wirtszellsystemen. So sind SV40-Vektoren bekannt, in denen eine exogene eukaryotische DNA mit ihren eigenen Promotorsequenzen und Spleißsignalen neben dem späten SV40-Promotor ein stabiles Transkript liefern.When using mammalian cells, theControl functions on the expression vectors oftenmade of viral material. For example, come fromthe commonly used promoters from papovavirussuch as polyoma, papilloma viruses, Simian virus 40 (SV40) and from retroviruses, adenovirus type 2. The early andare late promoters of SV 40 and their applicationsdescribed in many ways. It is also possible and oftenrecommended, promoter or control sequences orUse splice signals that match the ones you wantGene sequences are originally linked, providedthese control sequences are compatible with theHost cell systems. SV40 vectors are known inwhich exogenous eukaryotic DNA with their ownPromoter sequences and splice signals in addition to the lateSV40 promoter deliver a stable transcript.

Ein Replikationsursprung kann entweder durch eine entsprechende Vektorkonstruktion erhalten werden, so daß diese einen exogenen Startpunkt, beispielsweise aus SV40 oder anderen viralen Quellen (z. B. Polyoma, Adeno, VSV, PBV, etc.) enthält, oder dieser durch die chromosomalen Replikationsmechanismen der Wirtszelle geliefert werden. Wird der Vektor in das Wirtszellenchromosom integriert, reicht die zuletztgenannte Maßnahme meistens aus.An origin of replication can be identified either by acorresponding vector construction can be obtained so thatthis is an exogenous starting point, for example from SV40or other viral sources (e.g. Polyoma, Adeno,VSV, PBV, etc.) contains, or this through the chromosomal replication mechanisms of the host cellto be delivered. If the vector is in thatHost cell chromosome integrated, that's enoughthe latter measure mostly.

Die Transformation der Zellen mit den Vehikeln kann durch eine Vielzahl an Verfahren erreicht werden. Beispielsweise kann sie durch Kalzium erfolgen, wobei entweder die Zellen in Magnesium gewaschen und die DNA den in Kalzium suspendierten Zellen zugegeben wird, oder die Zellen werden einem Kopräzipitat von DNA und Kalziumphosphat ausgesetzt. Bei nachfolgender Genexpression werden die Zellen auf Medien übertragen, die für transformierte Zellen selektieren.The transformation of the cells with the vehicles cancan be achieved through a variety of processes.For example, it can be done by calcium, wherebyeither the cells are washed in magnesium and the DNAis added to the cells suspended in calcium, orthe cells become a co-precipitate of DNA andExposed to calcium phosphate. In the followingGene expression, the cells are transferred to media,which select for transformed cells.

Bei intrazellulärer Produktion von hMn-SOD kann das Enzym dadurch isoliert werden, daß die Zellen nach Erreichen einer entsprechend hohen Zelldichte abzentrifugiert und danach enzymatisch oder mechanisch aufgeschlossen werden. Die Reinigung der erfindungsgemäßen hMn-SOD kann über bekannte biochemische Verfahren zur Protein- bzw. Enzymreinigung wie z. B. Dialyse, Elektrophorese, Präzipitation, Chromatographie oder Kombinationen davon erfolgen. Wenn das Enzym aus der Zelle sekretiert wird, werden analoge Verfahren zur Proteinreinigung durchgeführt, um hMn-SOD aus dem Kulturmedium in reiner Form zu erhalten.With intracellular production of hMn-SOD this canEnzyme can be isolated by following the cellsAchieve a correspondingly high cell densitycentrifuged and then enzymatically or mechanicallybe unlocked. The cleaning of thehMn-SOD according to the invention can be obtained via knownbiochemical processes for protein or enzyme purificationsuch as B. dialysis, electrophoresis, precipitation,Chromatography or combinations thereof. Ifthe enzyme secreted from the cell will be analogProtein purification procedures performed to hMn-SODto get from the culture medium in pure form.

Das mit diesen Methoden gereinigte, erfindungsgemäße hMn-SOD zeigt ein dem genuinem Enzym identisches biologisches Aktivitätspektrum in vivo und in vitro.The invention cleaned with these methodshMn-SOD shows an identical one to the real enzymebiological activity spectrum in vivo and in vitro. 

Unter diesen Aktivitäten sind sowohl immunologische Eigenschaften (z. B. Kreuzreaktion mit Antikörpern von genuiner hMn-SOD gegen die erfindungsgemäße hMn-SOD) als auch biochemische und enzymatische Aktivitäten zu verstehen. Für die biochemische und enzymatische Charakterisierung der hMn-SOD kann z. B. der Lehre von Marklund, S. (Marklund, S. & Marklund, G., Eur J. Biochem. 47, 469-474, 1974) gefolgt werden, wonach auch eine strikte Unterscheidung zwischen den Cu/Zn und Mn enthaltenden Enzymen, z. B. durch Zusatz von KCN (inhibiert Cu/Zn-SOD nicht aber Mn-SOD) oder anhand der unterschiedlichen pH-Abhängigkeit ihrer Aktivitäten gegeben ist (siehe insbesondere: Ysebaert-Vanneste, M., Vanneste, W. H., Anal. Biochem. 107, 86-95, 1980).Among these activities are both immunologicalProperties (e.g. cross reaction with antibodies fromgenuine hMn-SOD against the hMn-SOD according to the invention)also biochemical and enzymatic activities toounderstand. For the biochemical and enzymaticCharacterization of the hMn-SOD can e.g. B. the teaching ofMarklund, S. (Marklund, S. & Marklund, G., Eur J.Biochem. 47, 469-474, 1974), followed bya strict distinction between the Cu / Zn and Mncontaining enzymes, e.g. B. by adding KCN(inhibits Cu / Zn-SOD but not Mn-SOD) or using thedifferent pH dependency of their activitiesis given (see in particular: Ysebaert-Vanneste, M.,Vanneste, W.H., Anal. Biochem. 107, 86-95, 1980).

Bei dem erfindungsgemäßen Polypeptid handelt es sich nicht ausschließlich nur um das reife hMn-SOD, das im einzelnen beschrieben ist, sondern ebenfalls um jedwede Modifikation dieses Enzyms. Diese Modifikationen beinhalten z. B. Verkürzung des Moleküls am N- oder C-terminalen Ende, Austausch von Aminosäuren durch andere Reste, wodurch die Enzymaktivität nicht wesentlich verändert wird. Gegenstand der Erfindung sind nicht nur Gensequenzen, die spezifisch für die beschriebene und beispielhaft belegte hMn-SOD codieren, sondern ebenfalls Modifikationen, die leicht und routinemäßig über Mutation, Abbau, Transposition oder Addition erhalten werden können. Jede Sequenz, die für die erfindungsgemäße hMn-SOD codiert (d. h. die das entsprechende und bekannte biologische Aktivitätsspektrum aufweist) und im Vergleich mit der gezeigten degeneriert ist, ist ebenfalls eingeschlossen; Fachleute auf diesem Gebiet sind in der Lage, DNA-Sequenzen insbesondere der codierenden Regionen zu degenerieren. Ebenso ist jede Sequenz, die für ein Polypeptid mit dem Aktivitätsspektrum der authentischen hMn-SOD codiert, und die mit den gezeigten Sequenzen (oder Teilen davon) unter stringenten Bedingungen hybridisiert beinhaltet.The polypeptide according to the invention isnot only for the mature HMn SOD, whichindividual is described, but also to anyModification of this enzyme. These modificationsinclude e.g. B. shortening of the molecule at the N- orC-terminal end, exchange of amino acids throughother residues, causing the enzyme activity notis changed significantly.The invention not only relates to gene sequences,the specific to the described and exemplarycode occupied HMn-SOD, but alsoModifications that are easy and routine aboutObtain mutation, degradation, transposition or additioncan be. Any sequence for thathMn-SOD according to the invention encodes (i.e. thecorresponding and known biological Activity spectrum) and in comparison with thedegenerate is also included;Experts in the field are able toDNA sequences especially of the coding regionsdegenerate. Likewise, each sequence is for onePolypeptide with the activity spectrum of the authentichMn-SOD coded, and with the sequences shown(or parts thereof) under stringent conditionshybridized includes.

Es gehört zum Stand der Technik, unter welchen definierten Bedingungen eine Hybridisierung (inclusive Vorwaschen, Prähybridisierung, Hybridisierung, Waschen) durchzuführen ist, um stringente Bedingungen zu erreichen. Für die Hybridisierung von Oligonukleotiden gegen eine Genbank ("gene bank screening") ist vorzugsweise unter den Bedingungen nach Wood, I. M. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1582-1588, 1985) zu verfahren. Um zu testen, ob eine bestimmte DNA-Sequenz mit einer der erfindungsgemäßen, für hMn-SOD codierenden DNA-Sequenzen hybridisiert - entweder via in situ Hybridisierung gegen Plaques oder Bakterienkolonien oder via Southern-Blotting - sind die von Maniatis, T. et al. detailliert beschriebenen Methoden und Bedingungen zu übernehmen (Maniatis. T. et al., Molecular Cloning, Cold Sping Harber Laboratory, 1982, insbesondere S. 326-328 und S. 387-389). Alle vom Hintergrund sich deutlich abhebenden Signale zeigen demgemäß ein positives Hybridisierungssignal an.It belongs to the state of the art, among whichdefined hybridization conditions (inclusivePre-washing, prehybridization, hybridization, washing)is to perform stringent conditionsto reach. For the hybridization of oligonucleotidesagainst a gene bank ("gene bank screening")preferably under the conditions according to Wood, I. M. etal. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1582-1588, 1985)method. To test for a specific DNA sequencewith one of the inventive coding for hMn-SODDNA sequences hybridize - either via in situHybridization against plaques or bacterial colonies orvia Southern blotting - are those of Maniatis, T. et al.methods and conditions described in detail(Maniatis. T. et al., Molecular Cloning, ColdSping Harber Laboratory, 1982, particularly pp. 326-328and pp. 387-389). All clear from the backgroundlifting signals accordingly show a positiveHybridization signal on. 

Spezifischer werden die oben näher bezeichneten Aufgaben dadurch gelöst, daß aus Menschengewebe, vorzugsweise aus Gewebe der Plazenta des Menschen, die RNA präpariert wird. Während der Aufschluß von Gewebekulturzellen direkt mit heißem Phenol erfolgen kann, müssen Gewebe für diese Art der Extraktion erst in tiefgefrorenem Zustand, vorteilhafterweise in Gegenwart von pulverisiertem oder körnigen Trockeneis oder in flüssigem Stickstoff, zerkleinert werden (z. B. Starmix). Durch Phenol gebildete Aggregate zwischen mRNA und anderen RNAs können durch Formamid oder durch Erwärmen (z. B. 65°C) wieder aufgelöst werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur RNA-Isolierung ist dasjenige nach Chirgwin (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry 18, 5294-5299, 1979). Die poly(A)⁺ RNA kann aus dem von Protein und DNA gereinigtem Präparat zweckmäßigerweise durch Affinitätschromatographie, z. B. Poly(U)-Sepharose oder Oligo(dT)-Cellulose isoliert werden, da in der Regel eukaryotische mRNA-Populationen einen Poly(A)-Schwanz an ihrem 3′-Ende aufweisen (Aviv, H., Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1409-1412, 1972; Lindberg, U., Persson, T., Europ. J. Biochem. 31, 246-254, 1972). Zur Isolierung der poly(A)⁺-RNA kann bevorzugt nach Auffray (Auuffray, C., Rougeon, F., Eur. J. Biochem. 107, 303-314, 1980) vorgegangen werden.The tasks specified above become more specificsolved in that from human tissue, preferably fromHuman placenta tissue that prepares RNAbecomes. During the disruption of tissue culture cellsTissue can be made directly with hot phenolfor this type of extraction only in frozenState, advantageously in the presence ofpowdered or granular dry ice or inliquid nitrogen, can be crushed (e.g. Starmix).Aggregates between mRNA andother RNAs can be generated by formamide or by heating(e.g. 65 ° C) can be dissolved again. A preferred oneThe RNA isolation method is that of Chirgwin(Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry 18, 5294-5299,1979). The poly (A) ⁺ RNA can be derived from that of protein andDNA purified preparation conveniently byAffinity chromatography, e.g. B. Poly (U) -Sepharose orOligo (dT) cellulose can be isolated as a ruleeukaryotic mRNA populations on a poly (A) tailhave their 3'-end (Aviv, H., Leder, P.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1409-1412, 1972;Lindberg, U., Persson, T., Europ. J. Biochem. 31, 246-254, 1972).The poly (A) ⁺-RNA can be isolatedpreferred according to Auffray (Auuffray, C., Rougeon, F., Eur.J. Biochem. 107, 303-314, 1980).

Eine Anreicherung der gereinigten mRNA kann dadurch erfolgen, daß die gesamte mRNA-Fraktion nach ihrer Größe aufgetrennt wird, z. B. durch Zentrifugieren in einem Saccharosegradient. Die gewünschte mRNA kann z. B. über bekannte in-vitro-Proteinbiosynthese-Systeme (Retikulotyten, Oozyten von Xenopus laevis) nachgewiesen werden.This can enrich the purified mRNAdone that the entire mRNA fraction according to their sizeis separated, e.g. B. by centrifugation in oneSucrose gradient. The desired mRNA can e.g. B. aboutknown in vitro protein biosynthesis systems(Reticulotytes, oocytes from Xenopus laevis)will. 

Die gereinigte mRNA oder die angereicherte Fraktion dient als Template für die Synthese des ersten Stranges der cDNA, die mit Hilfe der reversen Transkriptase und einem Primer erfolgt. Als Primer sind entweder Oligo (dT) oder synthetische Primer einsetzbar, letztere können anhand der bekannten Aminosäuresequenz der hMn-SOD abgeleitet werden und gestatten das wiederholte Primen der reversen Transkription (Uhlen, M. et al., EMBO Journal 1, 249-254, 1982).The purified mRNA or the enriched fractionserves as a template for the synthesis of the first strandthe cDNA, which is generated with the help of the reverse transcriptase anda primer. The primers are either oligo(dT) or synthetic primers can be used, the lattercan based on the known amino acid sequencehMn-SOD can be derived and allow the repeatedReverse transcription priming (Uhlen, M. et al., EMBOJournal 1, 249-254, 1982).

Bei der vorliegenden Erfindung wurde die Synthese des ersten Stranges der cDNA mit Oligo(dT)12-18 als Primer in Gegenwart von dNTPs gestartet. Für die Synthese des zweiten Stranges der cDNA können verschiedene bekannte Methoden angewendet werden, von denen auswahlweise das Primen mit einem komplementären Primer (Rougeon, F., Mach, B., J. Biol. Chem. 252, 2209-2217, 1977) das Selbstprimen anhand einer am 3′-Ende der cDNA liegenden "hairpin"-Struktur (Efstratiadis, A. et al., Cell 7, 279, 1976) oder mit einem durch RNaseH gebildeten Okazaki Fragment-ähnlichen Primer (Gubler, U., Hoffmann, B. J., Gene 25, 263, 1982) genannt sein sollen. In der vorliegenden Erfindung wurde die Methode bevorzugt, wie sie von Huynh, T. V. beschrieben wird (Huynh, T. V. et al., in DNA Cloning Vol I, (D. M. Glover ed.), chap. 2, S. 49-78, 1985). Die danach erhaltene doppelsträngige cDNA kann direkt in einem geeigneten Vektor, beispielsweise in einem Cosmid, Insertions- oder Substitionsvektor, insbesondere in einem Lambda-Vektor, vorzugsweise inggt10 (Huynh, T. V. et al., 1985) kloniert bzw. verpackt werden. Für die Klonierung in Lambda stehen mehrere bekannte Methoden zur Verfügung, von denen beispielsweise das "Homopolymertailing über dA-dT bzw. dC-dG oder die Linker-Methode mit synthetischen Linkern genannt sein sollen (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Huynh, T. V. et al., DNA cloning Vol. I (D. M., Glover ed.) 1985, 1980; Watson, C. J., Jackson, F. dto, 1985, chapter 3). Im Falle des Klonierens der erfindungsgemäßen cDNA wurde diese in die EcoRI-Stelle vonλgt10 inseriert. Die in-vitro-Verpackung und Klonierung der erfindungsgemäßen cDNA bzw. die Konstruktion der cDNA Genbank erfolgte nach Huynh, T. V. et al., 1985, S. 49-78. Mit der erhaltenen, eine cDNA-Genbank aus Plazentagewebe repräsentierenden Phagenpopulation wurde die Amplifikation und Plaque-Reinigung durch Infektion eines geeigneten Wirts, insbesondere von E. coli, vorzugsweise von E. coli C 600, bzw. unter Sicherstellung des lytischen Vermehrungszyklus von Lambda, durchgeführt.In the present invention, the synthesis of the first strand of the cDNA was started with oligo (dT) 12-18 as a primer in the presence of dNTPs. Various known methods can be used for the synthesis of the second strand of the cDNA, one of which is priming with a complementary primer (Rougeon, F., Mach, B., J. Biol. Chem. 252, 2209-2217, 1977) Self priming using a "hairpin" structure located at the 3'-end of the cDNA (Efstratiadis, A. et al., Cell 7, 279, 1976) or with an Okazaki fragment-like primer formed by RNaseH (Gubler, U., Hoffmann , BJ, Gene 25, 263, 1982). In the present invention, the method as described by Huynh, TV (Huynh, TV et al., In DNA Cloning Vol I, (DM Glover ed.), Chap. 2, pp. 49-78, 1985) was preferred. . The double-stranded cDNA obtained after this can be cloned or packaged directly in a suitable vector, for example in a cosmid, insertion or substitution vector, in particular in a lambda vector, preferably ing gt10 (Huynh, TV et al., 1985). Several known methods are available for cloning in Lambda, of which, for example, the "homopolymer tailing via dA-dT or dC-dG or the linker method with synthetic linkers should be mentioned (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Huynh, TV et al., DNA cloning Vol. I (DM, Glover ed.) 1985, 1980; Watson, CJ, Jackson, F. dto, 1985, chapter 3). In the case of cloning the cDNA according to the invention was inserted into the EcoRI site ofλ gt 10. The in vitro packaging and cloning of the cDNA according to the invention or the construction of the cDNA gene bank was carried out according to Huynh, TV et al., 1985, pp. 49-78. With the resulting phage population representing a cDNA gene bank from placental tissue, the amplification and plaque purification were carried out by infection of a suitable host, in particular E. coli, preferably E. coli C 600, or by ensuring the lytic multiplication cycle of lambda .

Die cDNA-Genbank wurde mit radioaktiv markierten, synthetischen Oligonukleotiden, die anhand der publizierten Aminosäuresequenz (Barra, D. et al., Oxy Radicals and their scavenger Systems, Vol. 1, 336-339, 1983) abgeleitet wurde, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen durchsucht. Bei der vorliegenden Erfindung wurde das in situ Hybridisierungsverfahren nach Benton und Davis (Benton, W. D., Davis, R. W., Science 196, 180-182, 1977) angewendet. Bevorzugt wurden zwei Gemische aus je acht synthetischen 23-mer Oligonukleotiden der Formel Va und Vb, die kolinear sind mit den Aminosäuren 39 bis 46 bzw. 200-207 der von Barra, D. et al., (s. o.) publizierten Aminosäuresequenz und die die Degeneration des genetischen Codes berücksichtigen. Der jeweils letzten Base am 5′-Ende dieser DNA-Sonden fehlt die Wobble-Base für das vollständige Codon für Gln (Aminosäure 46) bzw. Glu (Aminosäure 207).The cDNA library was radioactively labeled,synthetic oligonucleotides based on thepublished amino acid sequence (Barra, D. et al., OxyRadicals and their scavenger Systems, Vol. 1, 336-339,1983) was derived under stringentHybridization conditions searched. In theThe present invention was made in situHybridization methods according to Benton and Davis (Benton,W. D., Davis, R. W., Science 196, 180-182, 1977)applied. Two mixtures of eight each were preferred synthetic 23-mer oligonucleotides of the formula Va andVb, which are colinear with amino acids 39 to 46 or200-207 of those published by Barra, D. et al., (See above)Amino acid sequence and the degeneration of theconsider genetic codes. The last oneBase at the 5 'end of these DNA probes lacks the wobble basefor the complete codon for Gln (amino acid 46) orGlu (amino acid 207).

A, G, C und T stehen für die entsprechenden Nukleotide, I für Inosin.A, G, C and T stand for the corresponding nucleotides,I for inosine.

Formel Va Formula Va

Formel Vb Formula Vb

Die Oligonukleotid-Sonden können nach an sich bekannten chemischen Syntheseverfahren hergestellt werden. Für die vorliegende Erfindung wurde ein DNA-Synthesizer Modell 381A (Applied Biosystems) verwendet.The oligonucleotide probes can be made according to known methodschemical synthesis processes are produced. For theThe present invention became a DNA synthesizer model381A (Applied Biosystems) is used. 

Die Synthese aller möglichen Kombinationen dieser beiden DNA-Sonden sichert, daß mindestens eines der vorhandenen Oligonukleotide optimal mit der für die Sonde komplementären einzelsträngigen DNA-Region des gesuchten hMn-SOD Gens paart. Der Einsatz zweier unabhängiger Pools von 23-mer Oligonukleotiden vermindert die Möglichkeit, daß die "falschen" Positiven ausgewählt werden.The synthesis of all possible combinations of these twoDNA probes ensure that at least one of the availableOligonucleotides optimal with that for the probecomplementary single-stranded DNA region of the soughthMn-SOD genes mate. The use of two independentPools of 23-mer oligonucleotides decreasedPossibility that the "wrong" positives are selectedwill.

Nach der Isolierung in sich homogener Plaques, die anhand positiver Signale nach Hybridisierung mit den beiden 23-mer DNA-Sonden identifiziert wurden, konnten sieben rekombinante Phagen isoliert und von deren DNA 500 bis 1000 bp lange EcoRI-Fragmente sequenziert werden. Nach Sequenzanalyse dieser EcoRI-Fragmente nach der Methode von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467, 1977; Sanger F. et al., FEBS Letters 87, 107-111, 1978) und nach Subklonierung in die EcoRI-Stelle des M13-Vektors (Bluescribe, Vector Cloning Systems) und Transformation in E. coli, beispielsweise E. coli JM101, konnte gefunden werden, daß die EcoRI-Fragmente cDNA-Inserts enthalten, die für hMn-SOD ab Aminosäure 22 (Klone BS5, BS8, BS9, BS13, BSXIII) bzw. ab Aminosäure 26 (Klone BS3, BS12) codieren.After isolation of homogeneous plaques, thebased on positive signals after hybridization with thetwo 23-mer DNA probes were identifiedseven recombinant phages isolated and from their DNA500 to 1000 bp EcoRI fragments sequencedwill. After sequence analysis of these EcoRI fragments afterthe Sanger method (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 74, 5463-5467, 1977; Sanger F. et al., FEBSLetters 87, 107-111, 1978) and after subcloning inthe EcoRI site of the M13 vector (Bluescribe, VectorCloning Systems) and transformation in E. coli,for example E. coli JM101, could be found thatthe EcoRI fragments contain cDNA inserts which are suitable forhMn-SOD from amino acid 22 (clones BS5, BS8, BS9, BS13,BSXIII) or code from amino acid 26 (clones BS3, BS12).

Es wurde jedoch überraschenderweise auch gefunden, daß sich aus den ermittelten DNA-Sequenzen einige Abweichungen zu der Aminosäuresequenz von Barra, D. et al. (1984, s. o.) ergeben:Surprisingly, however, it was also found thatsome of the DNA sequences foundDeviations from the amino acid sequence of Barra, D. etal. (1984, see above) show: 

Die DNA-Sequenz eines 617 bp langen EcoRI-Fragments, welches aus einem der erhaltenen Klonen, z. B. BS8 isoliert werden konnte, ist inFig. 1 dargestellt. Das EcoRI-Fragment enthält eine 532 bp lange für hMn-SOD codierende Sequenz sowie eine 51 bp lange nicht-translatierte Region, inclusive eines poly(A)₃₀ Schwanzes. Anteile von Linker-Sequenzen sind bis zu den (vollständigen) EcoRI-Stellen ebenfalls dargestellt.The DNA sequence of a 617 bp EcoRI fragment which is obtained from one of the clones obtained, e.g. B. BS8 could be isolated is shown inFig. 1. The EcoRI fragment contains a 532 bp long sequence coding for hMn-SOD and a 51 bp long non-translated region, including a poly (A) ₃₀ tail. Portions of linker sequences are also shown up to the (complete) EcoRI sites.

Die Positionen 30 bis 33 zeigen eine ThaI-Schnittstelle, an Position 367 bis 372 ist eine BamHI-Stelle zu erkennen. Überraschenderweise finden sich Codons an Positionen 53 bis 61, 155 bis 163, 176 bis 184 sowie 500 bis 508, die kolinear sind für potentielle N-Glykosylierungsstellen der entsprechenden Aminosäuren gemäß der dafür charakteristischen allgemeinen Aminosäureanordnungen Asn-X-Thr bzw. Asn-X-Ser, wobei X beispielsweise für Valin, Histidin oder Leucin steht, wohingegen die Cu/Zn-SOD des Cytosols nur eine solche Aminosäurekombination aufweist.Positions 30 to 33 indicate a ThaI interfacePosition 367 to 372 shows a BamHI site.Surprisingly, codons can be found at position 53to 61, 155 to 163, 176 to 184 and 500 to 508, theare colinear for potential N-glycosylation sitescorresponding amino acids according to the correspondingcharacteristic general amino acid arrangementsAsn-X-Thr or Asn-X-Ser, where X is for valine,Histidine or leucine stands, whereas the Cu / Zn-SOD desCytosols has only one such amino acid combination.

Auf die Aminosäureunterschiede gegenüber der Aminosäure-Sequenz von Barra, D. et al. (Barra, D. et al., J. Biol. Chem. 259, 12 595-12 601, 1984), die von dem erhaltenen EcoRI-Fragment abgeleitet wurden, wurde schon an früherer Stelle eingegangen.On the amino acid differences compared to theAmino acid sequence from Barra, D. et al. (Barra, D. et al.,J. Biol. Chem. 259, 12 595-12 601, 1984) by theobtained EcoRI fragment have been derivedreceived earlier.

Um die fehlenden Basen an den 3′- und/oder 5′-Termini der hMn-SOD DNA-Teilsequenz aus der cDNA-Genbank zur Herstellung eines vollständigen hMn-SOD Gens zu erhalten, können verschiedene Strategien verfolgt werden. Beispielsweise kann die erhaltene cDNA als Hybridisierungssonde gegen eine genomische Genbank eingesetzt werden, um die für das ganze Enzym kodierende Sequenz zu erhalten, oder man verfährt z. B. nach Kakidani, H. unter Verwendung synthetischer, zur mRNA komplementärer Oligonukleotide als spezifische Primer für die reverse Transkription (Kakidani, H. et al., Nature 298, 245-249, 1982). Es ist jedoch auch möglich, das fehlende Ende der cDNA-Sequenz anhand der bekannten Aminosäuresequenz (Barra, D. et al., J. Biol. Chem. 259, 12 595-12 601, 1984) chemisch zu synthetisieren und mit der gefundenen cDNA zu verbinden, wobei ein definiertes Ende erhalten wird.To the missing bases at the 3′- and / or 5′-terminihMn-SOD DNA partial sequence from the cDNA libraryTo obtain a complete hMn-SOD gene,different strategies can be followed.For example, the cDNA obtained can be used asHybridization probe against a genomic libraryused to encode the whole enzymeObtain sequence, or proceed z. B. according to Kakidani,H. using synthetic complementary to mRNAOligonucleotides as specific primers for the reverseTranscription (Kakidani, H. et al., Nature 298, 245-249,1982). However, it is also possible to find the missing end of thecDNA sequence based on the known amino acid sequence (Barra,D. et al., J. Biol. Chem. 259, 12 595-12 601, 1984)chemically synthesize and with the found cDNAconnect, whereby a defined end is obtained. 

Für den zuletzt genannten Weg wurde zur Herstellung der vollständigen, erfindungsgemäßen DNA-Sequenz für hMn-SOD das 5′-Ende durch zwei Oligonukleotide der Formeln VIa und VIb komplettiert, die vorteilhafterweise XhoI/XbaI - bzw. XbaI/NcoI - überstehende Enden aufweisen. Erfindungsgemäß ist am 5′-Ende des kodierenden Stranges das 3′-Ende des ADHI-Promotors berücksichtigt worden (Formel VIa)For the last mentioned way, thecomplete DNA sequence according to the invention for hMn-SODthe 5'-end by two oligonucleotides of the formulas VIa andVIb completed, which advantageously XhoI / XbaI - orXbaI / NcoI - have protruding ends. According to the inventionis at the 5'-end of the coding strand, the 3'-end ofADHI promoter has been taken into account (Formula VIa)

Formel VIa Formula VIa

Formel VIb Formula VIb

Nach Kombination beider synthetischer Oligonukleotide der Formeln VIa und VIb, Klonierung in einen geeigneten Vektor, beispielsweise in ein entsprechend verändertes pCU18-Derivat und Hinzufügen des ThaI/EcoRI-Fragments der erfindungsgemäßen cDNA aus einem der erhaltenen Klone, dessen 5′-Ende mindestens die ThaI-Stelle aufweist, kann ein Plasmid erhalten werden, das eine vollständige cDNA des hMn-SOD Gens im richtigen Leserahmen entsprechend Formeln VIIa und VIIb enthält, ohne die ThaI-Stellen.After combining both synthetic oligonucleotidesFormulas VIa and VIb, cloning into a suitable oneVector, for example into a correspondingly modified onepCU18 derivative and adding the ThaI / EcoRI fragment of thecDNA according to the invention from one of the clones obtained,whose 5'-end has at least the ThaI site, cana plasmid can be obtained which is a complete cDNAof the hMn-SOD gene in the correct reading frame accordinglyContains formulas VIIa and VIIb without the ThaI positions.

Formel VIIa Formula VIIa

Formel VIIb Formula VIIb

Die Durchsequenzierung der Klone BS5, BS9, BS13, BSXIII sowie der Klone BS3 und BS12 ergab, daß die Sequenzen der Klone BS5, BS9, BS13 und BSXIII identisch mit Klon BS8 sind. Die Klone BS3 und BS12 zeigen, wie bereits angegeben, gegenüber Klon BS8, einen Unterschied in Aminosäure 29 (CAG statt AAG bzw. Gln stann Lys, Formeln Ib, IIIb und IVb). Ansonsten besteht 100% Homologie zu Klon BS8 bis zur Base 573 des inFig. 1 dargestellten EcoRI-Fragments (. . . TA*A ACC ACG ATC GTT ATG CTG⁵⁷³). Ab dieser Base sind beide Klone BS3 und BS12 hinsichtlich der in Formel VIIIa angegebenen 5-ut-Region identisch.Sequencing of clones BS5, BS9, BS13, BSXIII and clones BS3 and BS12 showed that the sequences of clones BS5, BS9, BS13 and BSXIII are identical to clone BS8. As already stated, clones BS3 and BS12 show a difference in amino acid 29 compared to clone BS8 (CAG instead of AAG or Gln standard Lys, formulas Ib, IIIb and IVb). Otherwise there is 100% homology to clone BS8 to base 573 of the EcoRI fragment shown inFIG. 1 (... TA * A ACC ACG ATC GTT ATG CTG⁵⁷³). From this base on, both clones BS3 and BS12 are identical with regard to the 5-ut region indicated in formula VIIIa.

Formel VIII Formula VIII

Weiterhin wurden mehrere cDNA-Klone aus einer cDNA-Genbank (Plazenta) überggt11 isoliert. Die Herstellung dieser cDNA-Genbank erfolgte in gleicher Weise zu der in den Beispielen beschriebenen Herstellung der cDNA-Genbank aus Placenta-DNA inλgt10. Einer dieser ausλgt11 isolierten Klone, Klon 4, wurde ebenfalls wie beschrieben, in Bluescribe M13+ subkloniert. Die Sequenzierung erfolgte durch wiederholtes Priming mit den synthetischen 17mer OligonukleotidenFurthermore, several cDNA clones were isolated from a cDNA library (placenta) viag gt11. This cDNA library was produced in the same way as the cDNA library described in the examples from placenta DNA inλ gt10. One of these clones isolated fromλ gt11, clone 4, was also subcloned into Bluescribe M13 + as described. Sequencing was carried out by repeated priming with the synthetic 17mer oligonucleotides

Klon 4 ist bis auf Aminosäure 29 (AAG bzw. Lys) und einer . . . TCTA . . .-Sequenz am 3′-Ende im Anschluß an die Multiklonierungsstelle mit den Klonen BS3 und BS12 ausggt10 identisch. Obwohl die analysierte DNA-Sequenz der verbliebenen 61 Basen des 5′-Endes (vor Formel Ia, Klon BS8, entsprechend Codons +1 bis +21 entsprechend Lys bis Glu) einige Basenänderungen gegenüber der abgeleiteten DNA-Sequenz (Formel II, enthalten in Formel IIIb) aufweist, ergibt die Übersetzung dieses DNA-Abschnittes keine Unterschiede zu Barra et al., 1984. Eine Leader-Sequenz vor dem ATG konnte ebenfalls analysiert werden. Die Formel IX zeigt die gefundene Sequenz von Klon 4.Clone 4 is except for amino acid 29 (AAG or Lys) and one. . . TCTA. . Sequence at the 3 'end following the multicloning site with the clones BS3 and BS12 fromg gt10 identical. Although the analyzed DNA sequence of the remaining 61 bases of the 5'-end (before formula Ia, clone BS8, corresponding to codons +1 to +21 corresponding to Lys to Glu) contains some base changes compared to the derived DNA sequence (formula II, contained in formula IIIb), the translation of this DNA section shows no differences from Barra et al., 1984. A leader sequence in front of the ATG could also be analyzed. Formula IX shows the found sequence of clone 4.

Formel IX Formula IX

Andere Klone haben unterschiedlich lange 5′-ut-Regionen.Other clones have 5′-ut regions of different lengths.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können in verschiedenen Expressionsvektoren eingebaut und mit Hilfe der beschriebenen Kontrollelemente exprimiert werden, vorzugsweise in pES103 mit dem ADHI-Promotor (DSM 4013). pES103 wird dadurch erhalten, daß in das pUC18-Derivat pES102, welches in der HincII-Schnittstelle einen Xho-Linker enthält, das 1500 bp lange BamHI/XhoI-Fragment des ADHI-Promotors (z. B. Ammerer, G., Methods in Enzymology 101, 192-201, 1983) eingebaut wird.The DNA sequences according to the invention can be found indifferent expression vectors built in and with the helpthe control elements described are expressed,preferably in pES103 with the ADHI promoter (DSM 4013).pES103 is obtained in that in the pUC18 derivativepES102, which in the HincII interfaceXho linker contains the 1500 bp BamHI / XhoI fragmentthe ADHI promoter (e.g. Ammerer, G., Methods inEnzymology 101, 192-201, 1983).

Anstelle dieser ADHI-Promotor-Sequenz von ursprünglich 1500 bp kann auch ein auf ca. 400 bp Länge verkürzter ADHI-Promotor als BamHI/XhoI-Fragment verwendet werden. Den verkürzten ADHI-Promotor (ADHIk) erhält man dadurch, daß Plasmid pWS323E (DSM 4016) mit BamHI/XhoI verdaut und der ADHIk Promotor isoliert wird.Instead of this ADHI promoter sequence from originally1500 bp can also be shortened to a length of approx. 400 bpADHI promoter can be used as a BamHI / XhoI fragment.The shortened ADHI promoter (ADHIk) is obtained bythat plasmid pWS323E (DSM 4016) digested with BamHI / XhoI andthe ADHIK promoter is isolated. 

Für die korrekte Termination wird eine geeignete Terminatorsequenz, zweckmäßigerweise ein ADH-Terminator, vorzugsweise der ADHII-Terminator hinter dem hMn-SOD ligiert. Der ADHII-Terminator (Beier, D. R., Young, E. T., Nature 300, 724-728, 1982) kann über SphI-Verdauung von pMW5-ADHII (Washington Research Fundation) als 1530 bp langes Fragment und nachfolgender HincII-Verdauung als endgültiger ADHII-Terminator (329 bp) erhalten werden, oder aus Plasmid pGD2 (DSM 4014) als 336 bp langes HindIII/XbaI-Fragment.A suitable one is used for the correct terminationTerminator sequence, suitably an ADH terminator,preferably the ADHII terminator behind the hMn SODligated. The ADHII terminator (Beier, D.R., Young, E.T.,Nature 300, 724-728, 1982) can be digested by SphIpMW5-ADHII (Washington Research Fundation) as 1530 bplong fragment and subsequent HincII digestion asfinal ADHII terminator (329 bp) can be obtained,or from plasmid pGD2 (DSM 4014) as 336 bp longHindIII / XbaI fragment.

Für die Expression in Hefe stehen verschiedene Hefevektoren zur Verfügung, in die die Expressionskassetten mit dem erfindungsgemäßen hMn-SOD-Gen eingebaut werden können, vorzugsweise YEp13 (Broach, J. R. et al., Gene 8, 121-133, 1979; ATCC 37 115), pJDB 207 (DSM 3181, hinterlegt am 28. 12. 1984), YIp5 (Struhl, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1035-1039, 1979; ATCC 37 061), pEAS102 (pEAS102 kann dadurch erhalten werden, daß YIp5 mit PstI teilweise und mit BamHI vollständig verdaut wird und das das URA3 Gen enthaltende, isolierte 4,3 kb Fragment mit dem 4,4 kb BamHI/PstI-Fragment von pJDB207 ligiert wird).Various are available for expression in yeastYeast vectors are available in which theExpression cassettes with the hMn-SOD gene according to the inventioncan be installed, preferably YEp13 (Broach, J. R.et al., Gene 8, 121-133, 1979; ATCC 37 115), pJDB 207(DSM 3181, deposited on December 28, 1984), YIp5 (Struhl, K. etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1035-1039, 1979; ATCC37 061), pEAS102 (pEAS102 can be obtained byYIp5 partially digested with PstI and completely digested with BamHIand the isolated 4.3 kb containing the URA3 geneFragment with the 4.4 kb BamHI / PstI fragment from pJDB207is ligated).

Mit diesen, eine Expressionskassette mit dem erfindungsgemäßen hMn-SOD Gen tragenden Hefevektoren können geeignete Hefezellen nach bekannten Verfahren transformiert werden. Als geeignete Hefezellen für die Expression können vorzugsweise alle diejenigen angesehen werden, die defizient sind für ihre eigene, hefespezifische Mn-SOD und die ein selektierbares Hefe-Gen, wie z. B. HIS3, URA3, LEU2, SUP, um nur einige zu nennen, enthalten. Derartige Mutanten, die beispielsweise durch in vitro oder in vivo konstruierte mutierte Gene und diese über ein "Transplacement" enthalten, sind über integrative Transformation zu erhalten (z. B. Winston, F. et al., Methods in Enzymology 101, 211-228, 1983). Das zu mutierende Mn-SOD Gen der Hefe ist beispielsweise in Plasmid pL41 als BamHI-Fragment enthalten (van Loon et al., Gene 26, 261-272, 1983). Da die vollständige Sequenz dieses BamHI-Fragments bekannt ist (Marres, C. A. M. et al., Eur. J. Biochem. 147, 153-161, 1985), ist das Mn-SOD Gen der Hefe auch ohne pL41 zugänglich.With these, an expression cassette with thehMn-SOD gene-bearing yeast vectors according to the inventionsuitable yeast cells according to known methodsbe transformed. As suitable yeast cells for theExpression can be viewed preferably all of thosewho are deficient for their own,yeast-specific Mn-SOD and a selectable oneYeast gene such as B. HIS3, URA3, LEU2, SUP, to name a fewname, contain. Such mutants, for exampleby mutated genes constructed in vitro or in vivo andthese contained via a "transplacement" are aboutmaintain integrative transformation (e.g. Winston, F.et al., Methods in Enzymology 101, 211-228, 1983). That toomutant Mn-SOD gene of the yeast is for example in Contain plasmid pL41 as BamHI fragment (van Loon et al.,Gene 26, 261-272, 1983). Because the full sequence of thisBamHI fragment is known (Marres, C.A.M. et al., Eur. J.Biochem. 147, 153-161, 1985) is the Mn-SOD gene of yeastalso accessible without pL41.

Die durch solche Transformanten produzierte hMn-SOD kann nach bekannten Methoden der Proteinisolierung und Proteinreinigung gewonnen werden. Der Zellaufschluß kann z. B. nach van Loon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 3820-3824, 1986) erfolgen.The hMn-SOD produced by such transformants canaccording to known methods of protein isolation andProtein purification can be obtained. Cell disruption cane.g. B. after van Loon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83,3820-3824, 1986).

Für die Expression von hMn-SOD in Bakterien, vorzugsweise E. coli, beispielsweise E. coli HB101, C600, JM101, stehen die schon erwähnten und etablierten Expressionssysteme zur Verfügung. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen müssen zu diesem Zweck unter Kontrolle eines starken E. coli Promotors (s. o.), nicht unter einen eukaryotischen Promotor gebracht werden. Beispiele solcher bekannten Promotoren sind lac, lacuv5, trp, tac, trp-lacuv5,λP_L, ompF, bla. Die obligate Anwendung einer ribosomalen Bindungsstelle, um eine effiziente Translation in E. coli zu gewährleisten, wurde schon an früherer Stelle ausführlich beschrieben.The expression systems already mentioned and established are available for the expression of hMn-SOD in bacteria, preferably E. coli, for example E. coli HB101, C600, JM101. For this purpose, the DNA sequences according to the invention have to be brought under the control of a strong E. coli promoter (see above), not under a eukaryotic promoter. Examples of such known promoters are lac, lacuv5, trp, tac, trp-lacuv5,λ P_L , ompF, bla. The obligatory use of a ribosomal binding site to ensure efficient translation in E. coli has already been described in detail earlier.

Zum Nachweis der Expression der hMn-SOD-Aktivität durch E. coli werden die Bakterien nach der Inkubation in einem geeigneten, herkömmlichen Kulturmedium aufgeschlossen und der Überstand auf hMn-SOD Aktivität, wie beschrieben (z. B. Marklund, S., Marklund, G., 1974; Ch. Beauchamp und I. Fridovich, Anal. Biochem. 44, 276-287, 1971; H. P. Misra und I. Fridovich, Arch. Biochem. Biophys. 183, 511-515, 1977; B. J. Davis, Annals of the NY Academy of Sciences 121, 404-427, 1964; M. Ysebaert-Vanneste and W. H. Vanneste, Anal. Biochem. 107, 86-95, 1980) getestet.To detect expression of hMn-SOD activity byE. coli are the bacteria after incubation in onesuitable, conventional culture medium andthe supernatant for hMn-SOD activity as described (e.g.Marklund, S., Marklund, G., 1974; Ch. Beauchamp and I.Fridovich, Anal. Biochem. 44, 276-287, 1971; H. P. Misraand I. Fridovich, Arch. Biochem. Biophys. 183, 511-515,1977; B. J. Davis, Annals of the NY Academy of Sciences 121,404-427, 1964; M. Ysebaert-Vanneste and W. H. Vanneste,Anal. Biochem. 107, 86-95, 1980). 

Der Nachweis des exprimierten hMn-SOD-Gens kann auch durch Markierung der Proteine in Maxizellen erbracht werden. Plasmidcodierte Proteine können durch Verwendung der Maxizelltechnik (Sancar, A. et al., J. Bacteriol, 137, 692-693, 1979) selektiv in vivo markiert werden. Der E. coli Stamm CSR603 (CGSC 5830) besitzt keine DNA-Repair-Mechanismen. Durch eine geeignete UV-Strahlendosis wird das bakterielle Chromosom zerstört, einige der wesentlich kleineren und in mehreren Kopien pro Zelle vorhandene Plasmid-DNAs bleiben dagegen funktionell erhalten. Nach Abtöten aller nicht geschädigten, sich vermehrenden Zellen durch das Antibiotikum D-Cycloserin und Aufbrauchen der endogenen mRNA werden in den verbleibenden Zellen nur noch Plasmid-codierte Gene transkribiert und translatiert. Die gebildeten Proteine können durch Einbau von ³⁵S-Methionin radioaktiv markiert und nachgewiesen werden. E. coli CSR603 wird nach üblichen Verfahren mit den Expressionsplasmiden transformiert und auf ampicillinhaltigen Agarplatten auf transformierte Bakterien selektioniert. Die Präparation der Maxizellen und das Markieren der Proteine erfolgt nach der Vorschrift von A. Sancar (1979, s. o.). Als Molekulargewichtsstandard wird ein ¹⁴C-methyliertes Proteingemisch (Amersham) verwendet. Als Kontrolle wird das Plasmid, das nur den Promotor ohne das hMn-SOD-Gen enthält, eingesetzt.The detection of the expressed hMn-SOD gene can also be done byLabeling of the proteins in maxi cells are performed.Plasmid-encoded proteins can be obtained using theMaxi cell technique (Sancar, A. et al., J. Bacteriol, 137, 692-693,1979) can be selectively labeled in vivo. The E. coliStrain CSR603 (CGSC 5830) has noneDNA repair mechanisms. By a suitable oneUV radiation dose will destroy the bacterial chromosome,some of the much smaller ones and in multiple copies perIn contrast, cell-present plasmid DNAs remain functionalreceive. After killing everyone not harmed themselvesmultiplying cells by the antibiotic D-cycloserine andThe endogenous mRNA will be used up in the remainingCells only transcribed and plasmid-encoded genestranslated. The proteins formed can be built inradioactively labeled and detected by ³⁵S-methioninewill. E. coli CSR603 is prepared using the usual methodsExpression plasmids transformed and onagar plates containing ampicillin on transformed bacteriaselected. The preparation of the maxi cells and thatThe proteins are labeled according to the instructions of A.Sancar (1979, see above). A is used as the molecular weight standard¹⁴C-methylated protein mixture (Amersham) used. AsThe plasmid that controls only the promoter without thecontains hMn-SOD gene.

Nach erfolgter Transformation des Wirtes, Expression des Gens und Fermentation oder Zellkultivierung unter Bedingungen, bei denen die erfindungsgemäßen Proteine exprimiert werden, kann das Produkt üblicherweise durch bekannte chromatographische Trennmethoden extrahiert werden, um so ein Material zu erhalten, das die Proteine mit oder ohne Leader und Tailing-Sequenzen enthält. Die erfindungsgemäße hMn-SOD kann mit einer Leader-Sequenz am N-Terminus exprimiert werden, die wie schon beschrieben, von einigen Wirtszellen entfernt werden kann. Wenn nicht, so ist, wie ebenfalls schon beschrieben, eine Abspaltung des Leader-Polypeptids (wenn vorhanden) erforderlich, um reifes hMn-SOD zu erhalten. Alternativ kann die Sequenz so modifiziert werden, daß das reife Enzym im Mikroorganismus direkt produziert wird. Für diesen Fall kann die Precursor-Sequenz des Hefe-Mating-Pheromons MF-alpha-1 verwendet werden, um eine korrekte "Reifung" des fusionierten Proteins und die Ausscheidung der Produkte in das Wachstumsmedium oder den periplasmischen Raum zu gewährleisten. Die "Sezernierung" der hMn-SOD in Hefemitochondrien kann dadurch erfolgen, indem direkt vor das hMn-SOD Gen die Leadersequenz für das Hefe-Mn.SOD Gen gestellt wird.After transformation of the host, expression of theGene and fermentation or cell cultivation underConditions under which the proteins of the inventioncan be expressed, the product can usually byknown chromatographic separation methods extractedin order to obtain a material that contains the proteinswith or without leader and tailing sequences. ThehMn-SOD according to the invention can with a leader sequence onN-terminus are expressed which, as already described,can be removed from some host cells. Unless,as already described, this is a split off of the leader polypeptide (if any) required toto obtain mature hMn SOD. Alternatively, the sequence can be like thisbe modified that the mature enzyme in the microorganismis produced directly. In this case, thePrecursor sequence of the yeast mating pheromone MF-alpha-1used to correct "maturation" of thefused protein and the excretion of the products inthe growth medium or the periplasmic spaceguarantee. The "secretion" of the hMn-SOD inYeast mitochondria can be done by just beforethe hMn-SOD gene is the leader sequence for the yeast Mn.SOD geneis provided.

Die Reinigung der hMn-SOD aus Zellen kann nach bekannten Verfahren erfolgen.The purification of hMn-SOD from cells can be done according to knownProcedure.

Die gentechnisch hergestellten, erfindungsgemäßen hMn-SOD sind aufgrund des biologisch-enzymatischen Wirkungsspektrums einerseits und wegen der jetzt verfügbaren Menge an hochreinem Enzym mit höchstmöglicher immunologischer Identität gegenüber der genuinen hMn-SOD andererseits für jede Art der Prävention, Behandlung und/oder Diagnostik im Bereich von entzündlichen, degenerativen, neoplastischen oder rheumatischen Erkrankungen zur Wundheilung, bei Autoimmunkrankheiten und bei Transplantationen geeignet - bzw. zur Prävention und Therapie von Krankheiten, die mit einer Defizienz an hMn-SOD einhergehen oder kausal damit verbunden sind. Beispielsweise umfassen die klinischen Anwendungsmöglichkeiten jene, wie sie aus Bannister W. H. und Bannister J. V. (Biological and Clinical Aspects of Superoxide and Superoxide Dismutase, Vol. 11B, Elsevier/North-Holland, 1980) und aus Michelson, A. M., McCord, J. M., Fridovich (Superoxide and Superoxiddismutases, Academic Press, 1977) zu entnehmen sind. Ferner sind folgende klinische Anwendungsmöglichkeiten in Betracht zu ziehen: bei Perfusionswunden, Schlaganfall, alkoholgeschädigter Leber, Frühgeborenen, evtl. Pankreatitis, akuten Atemwegserkrankungen (ARDs), Emphysem, dialysegeschädigten Nieren, Osteoarthritis, rheumatoider Arthritis, strahleninduzierten Schäden, Sichelzellanämie.The genetically engineered hMn-SOD according to the inventionare due to the biological-enzymaticSpectrum of action on the one hand and because of nowAvailable amount of high purity enzyme with the highest possibleimmunological identity to the genuine hMn-SODon the other hand for every kind of prevention, treatmentand / or diagnostics in the area of inflammatory,degenerative, neoplastic or rheumaticDiseases for wound healing, autoimmune diseases andsuitable for transplants - or for prevention andTherapy of diseases with a deficiencyhMn-SOD go hand in hand or are causally connected with it.For example, the clinicalPossible uses are those from Bannister W. H.and Bannister J.V. (Biological and Clinical Aspects ofSuperoxide and Superoxide Dismutase, Vol. 11B,Elsevier / North Holland, 1980) and from Michelson, A. M.,McCord, J.M., Fridovich (Superoxide and Superoxide dismutases, Academic Press, 1977)are. Furthermore, the following are clinicalConsider possible uses: atPerfusion wounds, stroke, alcohol-damaged liver,Premature babies, possibly pancreatitis, acuteRespiratory diseases (ARDs), emphysema, dialysis-impairedKidneys, osteoarthritis, rheumatoid arthritis,radiation-induced damage, sickle cell anemia.

Ebenso sind die erfindungsgemäßen hMn-SODs zur Erhöhung der Haltbarkeit von festen oder flüssigen Nahrungsmitteln geeignet. Die erfindungsgemäßen hMn-SODs können entweder systemisch oder topisch verabreicht werden, wobei sich im ersten Fall herkömmliche parenterale Applikationsrouten (z. B. i. v., i. m. s. c., i. a.) und für den zweiten Fall die entsprechend bekannten Darreichungsformen (z. B. Pasten, Salben, Gele, Lutsch- oder Kautabletten, Pulver, und andere die lokale Resorption des hMn-SOD-Präparates ermöglichende galenische Formulierungen und pharmazeutisch akzeptable Trägerstoffe) eignen. Als therapeutisch wirksamer Dosisbereich können nach individuellen Kriterien (z. B. Patienten, Krankheitsschwere etc.) beispielsweise ca. 4 mg täglich eingesetzt werden.The hMn SODs according to the invention are also used to increase theShelf life of solid or liquid foodsuitable.The hMn SODs according to the invention can either be systemicor administered topically, in the first caseconventional parenteral application routes (e.g. i.v.,i. m. s. c., i. a.) and in the second case the correspondingknown dosage forms (e.g. pastes, ointments, gels,Lozenges or chewable tablets, powder, and others the localAbsorption of the hMn-SOD preparation enables galenicFormulations and pharmaceutically acceptable carriers)own. Can be used as a therapeutically effective dose rangeaccording to individual criteria (e.g. patients,Disease severity etc.) for example approx. 4 mg dailybe used.

Legenden zu den Abbildungen:Legends for the pictures:

Abb. 1 EcoRI-Fragment aus Klon BS8 mit der 532 bp langen codierenden Region ab Aminosäure 22 der reifen hMn-SOD, der 51 bp 3′-ut-Region und den Sequenzanteilen des Linkers. Die potentiellen N-Glykosylierungsstellen (überstrichen), die einzige ThaI-Stelle und die BamHI-Stelle (unterstrichen) sind angegeben,Fig. 1 EcoRI fragment from clone BS8 with the 532 bp coding region from amino acid 22 of the mature hMn-SOD, the 51 bp 3′-ut region and the sequence parts of the linker. The potential N-glycosylation sites (underlined), the only ThaI site and the BamHI site (underlined) are indicated,

Abb. 2 schematische Strategie zur Konstruktion von Plasmid HSOD4, welches das synthetische 5′-Ende des hMn-SOD Gens als XhoI/NcoI-Fragment enthält.Fig. 2 schematic strategy for the construction of plasmid HSOD4, which contains the synthetic 5'-end of the hMn-SOD gene as XhoI / NcoI fragment.

Abb. 3 Restriktionskarten der Plasmide HSOD2 und HSOD3, sowie von dem daraus konstruierten Plasmid HSOD4,Fig. 3 restriction maps of the plasmids HSOD2 and HSOD3, and of the plasmid HSOD4 constructed from them,

Abb. 4 Konstruktion eines Plasmid (HSOD6) mit der vollständigen cDNA für hMn-SOD, als XhoI/EcoRI-Fragment,Fig. 4 Construction of a plasmid (HSOD6) with the complete cDNA for hMn-SOD, as XhoI / EcoRI fragment,

Abb. 5 Präparation des ThaI/EcoRI Fragments der hMn-SOD cDNA aus Klon BS8,Fig. 5 Preparation of the ThaI / EcoRI fragment of the hMn-SOD cDNA from clone BS8,

Abb. 6 Konstruktion von Plasmid p154/2, das den ADHI-Promotor als 1500 bp BamHI/XhoI-Fragment enthält,Fig. 6 Construction of plasmid p154 / 2, which contains the ADHI promoter as a 1500 bp BamHI / XhoI fragment,

Abb. 7 Konstruktion von Plasmid p150/2 mit den zur Expression von hMn-SOD notwendigen Einheiten ADHI-Promotor und ADHII-Terminator (336 bp XbaI/HindIII-Fragment),FIG. 7 construction of plasmid p150 / 2 with the ADHI promoter and ADHII terminator (336 bp XbaI / HindIII fragment) necessary for the expression of hMn-SOD,

Abb. 8 Fertigstellung der endgültigen Plasmide (pKH1 und pKH2) mit dem ADHI-Promotor bzw. dem ADHIk-Promotor und dem ADHII-Terminator, zur weiteren Insertion der hMn-SOD cDNA über die XhoI/EcoRI-Stelle. Das Plasmid pKH2 entspricht pKH1, außer, daß pKH2 anstelle des ADHI-Promotors den ADHIk-Promotor enthält,Fig. 8 Completion of the final plasmids (pKH1 and pKH2) with the ADHI promoter or the ADHIk promoter and the ADHII terminator, for further insertion of the hMn-SOD cDNA via the XhoI / EcoRI site. The plasmid pKH2 corresponds to pKH1, except that pKH2 contains the ADHIk promoter instead of the ADHI promoter,

Abb. 9 Konstruktion der Expressionskassette HSOD7 mit dem verkürzten ca. 400 bp langen ADHI-Promotor (ADHIk). Die Konstruktion mit dem ADHI-Promotor der ursprünglichen Länge erfolgt ausgehend von pKH1 in analoger Weise,Fig. 9 Construction of the expression cassette HSOD7 with the shortened approx. 400 bp long ADHI promoter (ADHIk). The construction with the ADHI promoter of the original length is carried out analogously starting from pKH1,

Abb. 10 Konstruktion von Plasmiden mit dem innerhalb des Hefe Mn-SOD Gens liegenden URA3-Gens als Marker in unterschiedlichen Orientierungen zum Mn-SOD Gen (SODY7, SODY8), zur Herstellung einer für die Expression geeigneten Hefe Mn-SOD Mutante. Das Gen-Transplacement im entsprechenden Hefe-Stamm (DBY747) wurde mit SODY7 und SODY8 durchgeführt.Fig. 10 Construction of plasmids with the URA3 gene located within the yeast Mn-SOD gene as a marker in different orientations to the Mn-SOD gene (SODY7, SODY8), for producing a yeast Mn-SOD mutant suitable for expression. The gene transplacement in the corresponding yeast strain (DBY747) was carried out with SODY7 and SODY8.

Die folgenden Beispiele, die die Erfindung nicht eingrenzen sollen, veranschaulichen die Erfindung im Detail.The following examples, which do not limit the inventionare intended to illustrate the invention in detail.

Verwendete Materialienused material

Wenn in den folgenden Beispielen nicht besonders angegeben, wurden folgende Materialien, Lösungen, Plasmide, Vektoren und Mikroorganismen benutzt:Unless specifically stated in the following examples,were the following materials, solutions, plasmids, vectorsand microorganisms used:

ADHI-Promotor:
(1500 bp BamHI/XhoI)DSM 4013 (pES103), hinterlegt am 27. 2. 87ADHI promoter:
(1500 bp BamHI / XhoI) DSM 4013 (pES103), deposited on February 27, 87

ADHI-Promotor, verkürzt:
(400 bp BamHI/XhoI)DSM 4016 (pWS323E), hinterlegt am 27. 2. 87ADHI promoter, shortened:
(400 bp BamHI / XhoI) DSM 4016 (pWS323E), deposited on February 27, 87

ADHII-Terminator:
(336 bp XbaI/HindIII)DSM 4014 (pGD2), hinterlegt am 27. 2. 87ADHII terminator:
(336 bp XbaI / HindIII) DSM 4014 (pGD2), deposited on February 27, 87

BamHI-Puffer:150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl pH 7,9, 6 mM MgCl₂, 100 µg/ml BSABamHI buffer: 150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl pH 7.9,6 mM MgCl₂, 100 µg / ml BSA

Core-Puffer:50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaClCore buffer: 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mMMgCl₂, 50 mM NaCl

Denaturierlösung:0,5 M NaOH, 1,5 M NaClDenaturing solution: 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl

Denhardt-Lösung (50x):1 g Polyvinylpyrrolidon MG 360 000, 1 g Ficoll, 1 g Rinderserumalbumin (BSA) ad 100 ml H₂ODenhardt's solution (50x): 1 g of polyvinylpyrrolidoneMG 360 000, 1 g Ficoll, 1 gBovine serum albumin (BSA) ad100 ml H₂O

E. coli C600:F^-, supE44, thil, thrl, leuB6, lacY1, tonA21,λ^- (ATCC 23 724)E. coli C600: F^- , supE44, thil, thrl, leuB6, lacY1, tonA21,λ^- (ATCC 23 724)

E. coli JM101:supE, thi,Δ(lac-pro AB), [F′, traD36, proAB, lacI^qZ,ΔM15]E. coli JM101: supE, thi,Δ (lac-pro AB), [F ′, traD36, proAB, lacI^q Z,Δ M15]

High-Puffer:100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol (DTT)High buffer: 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH7.5, 10 mM MgCl₂, 1 mMDithiothreitol (DTT)

HincII-Puffer:10 mM Tris-HCl pH 7,5, 60 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM 2-Merkaptoäthanol, 100 µg/ml BSAHincII buffer: 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 60 mM NaCl,10 mM MgCl₂, 1 mM2-mercaptoethanol, 100 µg / ml BSA

Hybridisierlösung:wie Prähybridisierlösung, ohne Lachssperma-DNAHybridization solution: like prehybridization solution, withoutSalmon sperm DNA

Klenow-Reaktionslösung:22 µl DNA/H₂O, 2,5 µl 10× NTR-Puffer (0,5 M Tris-HCl pH 7,2, 0,1 M MgSO₄, 1 mM DTT, 500 µg/ml BSA) je 1 µl 2 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 2,5 U Klenow-Fragment (0,5 µl)Klenow reaction solution: 22 µl DNA / H₂O, 2.5 µl 10 ×NTR buffer (0.5 M Tris-HCl pH7.2, 0.1 M MgSO₄, 1 mM DTT,500 µg / ml BSA) 1 µl 2 mM eachdATP, dGTP, dCTP, dTTP, 2.5 UKlenow fragment (0.5 µl)

Lambda-Puffer:100 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM EDTALambda buffer: 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mMMgCl₂, 1 mM EDTA

LB-Agar:Lb-Flüssigmedium, 15 g/l Bacto-Agar (Difco)LB agar: Lb liquid medium, 15 g / lBacto agar (Difco)

LB-Flüssigmedium:10 g/l Bacto-Trypton (Difco), 5 g/l Hefe-Extrakt (Difco), 5 g/l NaCl, 10 M NaOH ad pH 7,4LB liquid medium: 10 g / l Bacto-Trypton (Difco),5 g / l yeast extract (Difco), 5 g / lNaCl, 10 M NaOH ad pH 7.4

Ligationslösung:66 mM Tris-HCl pH 7,6, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 1 mM ATP, 1 U T4-DNA LigaseLigation solution: 66 mM Tris-HCl pH 7.6, 10 mMMgCl₂, 5mM DTT, 1mM ATP, 1UT4 DNA ligase

Neutralisationslösung:0,5 M Tris-HCl pH 7,5, 1,5 M NaClNeutralization solution: 0.5 M Tris-HCl pH 7.5, 1.5 M NaCl

Nitrozellulosefilter:Schleicher & Schuell, Membranfilter BA 85Nitrocellulose filter: Schleicher & Schuell,Membrane filter BA 85

NruI-Puffer:50 mM KCl, 50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl₂NruI buffer: 50mM KCl, 50mM NaCl, 50mMTris-HCl pH 8.0, 10 mM MgCl₂

Prähybridisierlösung:5×SSC, 5×Denhardtlösung, 50 mM Na-Phosphatpuffer pH 6,8, 1 mM Ma₂P₄O₇, 100 µM ATP, 0,1% SDS, 30-100 (50) µg/ml denaturierte, ultraschall­behandelte Lachssperma-DNAPrehybridization solution: 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution,50 mM Na phosphate buffer pH 6.81 mM Ma₂P₄O₇, 100 µM ATP,0.1% SDS, 30-100 (50) µg / mldenatured, ultrasoundtreated salmon sperm DNA

puC18:PharmaciapuC18: Pharmacia

pURA3:DSM 4015, hinterlegt am 27. 2. 87pURA3: DSM 4015, deposited on27. 2. 87

S. cerevisiae DBY747:a, leu2, his3, trp1, ura3 (Yeast Genetic Stock Centre, Berkeley)S. cerevisiae DBY747: a, leu2, his3, trp1, ura3 (YeastGenetic Stock Center, Berkeley)

SC-URA-Medium:0,67% BYNB (Difco), 2% Glukose, 2% 50×AS-Mix (pro Liter: 1 g Histidin, 6 g Leucin, 2,5 g Tryptophan, 4 g Lysin, 1,2 g Adenin, 2 g Arginin, 1 g Methionin, 6 g Phenylalanin, 5 g Threonin, 6 g Isoleucin)SC-URA medium: 0.67% BYNB (Difco), 2% glucose,2% 50 × AS mix (per liter: 1 gHistidine, 6 g leucine, 2.5 gTryptophan, 4 g lysine, 1.2 gAdenine, 2 g arginine, 1 gMethionine, 6 g phenylalanine,5 g threonine, 6 g isoleucine)

SmaI-Puffer:10 mM Tris-HCl pH 8,0, 20 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-Merkaptoäthanol, 100 µg/ml BSASmaI buffer: 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 20 mM KCl,10 mM MgCl₂, 10 mM2-mercaptoethanol, 100 µg / mlBSA

SphI-Puffer:10 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-Merkaptoäthanol, 100 µg/ml BSASphI buffer: 10mM Tris-HCl pH 7.5, 100mMNaCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM2-mercaptoethanol, 100 µg / ml BSA

SSC (20×):3,0 M NaCl, 0,3 M Na₃-Citrat, pH 7,0SSC (20 ×): 3.0 M NaCl, 0.3 M Na₃ citrate, pH7.0

SSPE (20×):3,6 M NaCl, 0,2 M Na₂HPO₄, 20 mM EDTA, mit NaOH (10N) ad pH 7,4SSPE (20 ×): 3.6 M NaCl, 0.2 M Na₂HPO₄,20 mM EDTA, with NaOH (10N) ad pH7.4

TE-Puffer:10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTATE buffer: 10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA

ThaI-Puffer:50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl₂ThaI buffer: 50mM Tris-HCl pH 8.0, 10mMMgCl₂

Top-Agarose:LB-Flüssigmedium, 0,7% Agarose (Seaken FM-Agarose)Top agarose: LB liquid medium, 0.7% agarose(Seaken FM agarose)

Vorwaschlösung:1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,1% SDSPre-wash solution: 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0,1mM EDTA, 0.1% SDS 

1. Konstruktion einer cDNA-Genbank1. Construction of a cDNA library

Aus einer frischen Human-Placenta wurden würfelgroße Gewebestücke in flüssigem Stickstoff schockgefroren und das Gewebe bei unter -80°C pulverisiert. Aus dem pulverisiertem Gewebematerial wurde anschließend die RNA nach der von Chirgwin, J. M. et al. beschriebenen Prozedur extrahiert und präpariert (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry 18, 5294-5299, 1979).A fresh human placenta became cubesPieces of tissue in liquid nitrogen snap frozen andthe tissue is pulverized at below -80 ° C.The pulverized tissue material becamethen the RNA according to the Chirgwin, J.M. et al.described procedure extracted and prepared(Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry 18, 5294-5299,1979).

Aus der danach erhaltenen RNA wurde die poly(A)⁺RNA nach Aviv, H. und Leder, P. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1409-1412, 1972) präpariert. Die Synthese der cDNA wurde mit "cDNA synthesis system" (Amersham RPN 1256) durchgeführt.The RNA obtained after that became the poly (A) ⁺RNAafter Aviv, H. and Leder, P. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA69, 1409-1412, 1972).The synthesis of the cDNA was carried out using the "cDNA synthesis system"(Amersham RPN 1256).

Das Packaging erfolgte mit Gigapack (Vector cloning systems). Alle weiteren methodischen Schritte zur Klonierung in die EcoRI-Stelle vonλgt10 wurden nach der Vorschrift von Huynh T. V. et al. (DNA Cloning Vol. 1, D. M. Glover ed., IRL Press, Chapter 2, 1985) durchgeführt, außer daß als "plating bacteria" E. coli C600 verwendet wurde. Der Titer der die cDNA-Genbank repräsentierendenλgt10 Phagen betrug 1,2×10¹⁰ pfu/ml, die Zahl der unabhängigen Klone 1×10⁶.The packaging was done with Gigapack (Vector cloning systems). All further methodical steps for cloning into the EcoRI site ofλ gt10 were carried out according to the instructions from Huynh TV et al. (DNA Cloning Vol. 1, DM Glover ed., IRL Press, Chapter 2, 1985), except that E. coli C600 was used as the "plating bacteria". The titer of theλ gt10 phage representing the cDNA library was 1.2 × 10¹⁰ pfu / ml, the number of independent clones was 1 × 10⁶.

2. Amplifikation der ggt10-Genbank2. Amplification of the ggt10 library

Ein geeigneter E. coli Wirtstamm (C600, Genotyp F-, supE44, thil, thr1 leuB6 lacY1 tonA21 lambda- (M. A. Hoyt et al., 1982, Cell 31, 5656) wurde über Nacht in LB-Medium, supplementiert mit 0,2% Maltose, bei 37° vorgezüchtet.A suitable E. coli host strain (C600, genotype F-,supE44, thil, thr1 leuB6 lacY1 tonA21 lambda- (M. A.Hoyt et al., 1982, Cell 31, 5656) was overnight inLB medium supplemented with 0.2% maltose at 37 °pre-bred. 

Diese Übernachtkultur wurde 5 min bei 3000 upm abzentrifugiert und in eiskalter 10 mM MgSO₄-Lösung suspendiert, so daß die OD600nm 4,0 betrug. Die so bereiteten Mg-Zellen wurden bei 4°C gelagert und konnten eine Woche verwendet werden.This overnight culture was 5 min at 3000 rpmcentrifuged and in ice-cold 10 mM MgSO₄ solutionsuspended so that the OD600nm was 4.0. The soprepared Mg cells were stored at 4 ° C andcould be used for a week.

12×200 µl Mg-Zellen wurden in sterilen Röhrchen mit einer Phagensuspension (je 50 000 pfu der cDNA-Genbank/Platte) gemischt und 20 min bei 37°C inkubiert.12 × 200 µl Mg cells were placed in sterile tubesa phage suspension (50,000 pfu eachcDNA library / plate) mixed and 20 min at 37 ° C.incubated.

Anschließend wurden zu jedem Röhrchen 6-7 ml geschmolzene, auf 42°C temperierte Top-Agarose (enthält 10 mM MgSO₄, Endkonzentration) pipettiert, gemischt und auf 12 bei 37°C vorgewärmte LB-Agarplatten (13,5 cm Durchmesser) mit 10 mM MgSO₄ ausgegossen und 6-12 Stunden bei 37°C inkubiert.Then 6-7 ml was added to each tubemelted top agarose (tempered at 42 ° C)10 mM MgSO₄, final concentration) pipetted, mixedand on 12 LB agar plates preheated at 37 ° C (13.5 cmDiameter) poured out with 10 mM MgSO₄ and 6-12Incubated at 37 ° C for hours.

3. Primärscreening zur Identifikation rekombinanterλ-Phagen3. Primary screening to identify recombinantλ phagesa. Präparation der Nitrozellulosefiltera. Preparation of the nitrocellulose filter

Die so bereiteten Platten wurden nach erfolgter Inkubation auf 4°C abgekühlt. Mit Bleistift numerierte Nitrozellulosefilter wurden auf die Plattenoberfläche gelegt und die Positionen auf den Platten durch Nadelstiche markiert. Etwa 1 min, nachdem sie vollkommen durchfeuchtet waren, wurden die Filter wieder vorsichtig abgezogen, in Denaturierlösung gelegt und 1 min bei Raumtempertur (RT) inkubiert. Anschließend erfolgte die Neutralisation in Neutralisationslösung für 5 min bei RT und eine Inkubation für 30 sec in 2×SSPE ebenfalls bei RT.The plates prepared in this way were finishedIncubation cooled to 4 ° C. Numbered in pencilNitrocellulose filters were on the plate surfaceplaced and the positions on the plates throughMarked pinpricks. About 1 min after shethe filters were completely wetcarefully removed again, placed in denaturing solutionand incubated for 1 min at room temperature (RT).The neutralization then took place inNeutralization solution for 5 min at RT and oneIncubation for 30 sec in 2 × SSPE also at RT.

Bis zu 3 weitere Abzüge wurden von jeder Platte angefertigt, wobei die Filter jeweils 30 sec länger auf der Platte belassen wurden. Die Positionen der Nadelstiche wurden auf die folgenden Filter genau übertragen.Up to 3 additional prints were made from each platemade, the filters on each 30 sec longerleft on the plate. The positions of thePinpricks were accurate on the following filterstransfer. 

Die Filter wurden auf Filterpapier liegend an der Luft getrocknet und die DNA durch zweistündiges Backen bei 80°C fixiert. Die Platten bewahrte man bis zum Ergebnis der nachfolgenden Hybridisierung auf.The filters were lying on filter paper in the open airdried and the DNA by baking for two hoursFixed at 80 ° C. The plates were kept until the resultthe subsequent hybridization.

b. Präparation der ³²P-markierten DNA-Sondenb. Preparation of the 32 P-labeled DNA probes

Die synthetischen Oligonukleotidgemische wurden am 381A DNA-Synthesizer (Applied Biosystems) hergestellt, durch Polyacrylamidgelelektrophorese (20% in 8 M Harnstoff, T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, p173ff) gereinigt und über Sephadex G50 (Pharmacia) entsalzt.The synthetic oligonucleotide mixtures were on 381ADNA synthesizer (Applied Biosystems) manufactured byPolyacrylamide gel electrophoresis (20% in 8 M urea,T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold SpringHarbor Laboratory, 1982, p173ff) cleaned and overDesalinated Sephadex G50 (Pharmacia).

Die so synthetisierten DNA-Sonden sind komplementär zu RNA-Basensequenzen, die a) für die Aminosäuren 39-46 bzw. b) 200-207 kodieren (D. Barra et al., Oxy Radicals and their scavenger Systems, Vol. 1, 336-339, 1983) und haben folgende Basensequenzen:The DNA probes synthesized in this way are complementary toRNA base sequences that a) for amino acids 39-46or b) encode 200-207 (D. Barra et al., Oxy Radicalsand their scavenger Systems, vol. 1, 336-339, 1983) andhave the following base sequences:

wobei A, G, C und T für die entsprechenden Nukleotide, I für Inosin steht.where A, G, C and T for the corresponding nucleotides,I stands for inosine.

Die chemisch synthetisierten DNA-Probengemische wurden je in einer Konzentration von 20 pM/ul in Wasser gelöst.The chemically synthesized DNA sample mixtures wereeach dissolved in water at a concentration of 20 pM / ul.

ReaktionssatzReaction set

20-100 pM gamma³²-PATP (<3000Ci/mmol, Amersham), lyophilisiert aus äthanolischer Lösung, 20-100 pmol Oligonukleotid, 1 µl 10×Kinasepuffer (0,7 M Tris-HCl pH 7,6, 0,1 m MgCl₂, 50 mM Dithiothreit, 10 Einheiten T4 Polynukleotidkinase (BRL), Wasser ad 10 µl.20-100 pM gamma³²-PATP (<3000Ci / mmol, Amersham),lyophilized from ethanolic solution, 20-100 pmolOligonucleotide, 1 µl 10 × kinase buffer (0.7 M Tris-HCl pH7.6, 0.1 m MgCl₂, 50 mM dithiothreitol, 10 units T4Polynucleotide kinase (BRL), water ad 10 µl. 

Die Reaktion erfolgte 60 min bei 37°C und wurde durch Zugabe von 25 mM EDTA gestoppt. Nicht eingebaute Radioaktivität entfernte man durch Ausschlußchromatographie über eine 1 ml Biogel P6-DG (Biorad) Säule, hergestellt in einer 1 ml Einwegspritze. Als Elutionsmittel wurde TE-Puffer verwendet.The reaction took place at 37 ° C for 60 min and was followed byAddition of 25 mM EDTA stopped. Not built inRadioactivity was removed byExclusion chromatography on a 1 ml Biogel P6-DG(Biorad) column, made in a 1 mlDisposable syringe. TE buffer was used as eluentused.

c. In situ Hybridisierungc. In situ hybridization

Um Reste von Agarose und Bakterien von der Nitrozellulose zu entfernen, die bei der Hybridisierung zu starker Hintergrundstrahlung führen, wurden die Filter in einem nicht zu kleinen Volumen Vorwaschlösung einige Stunden bis zu über Nacht unter Schwenken bei 65°C inkubiert. Um unspezifische Bindungsstellen für DNA auf den Nitrozellulosefiltern abzusättigen, wurden diese 1-12 Stunden bei 37°C in der zuvor im Vakuum entgasten Prähybridisierlösung inkubiert.To remove remains of agarose and bacteria from theRemove nitrocellulose during hybridizationlead to strong background radiationFilters in a not too small volume pre-wash solutiona few hours up to overnight with panningIncubated at 65 ° C. To nonspecific binding sites forSaturate DNA on the nitrocellulose filtersthis 1-12 hours at 37 ° C in the previously in a vacuumdegassed prehybridization solution incubated.

Die zum Hybridisieren eingesetzten, radioaktiv markierten DNAs (ca. 1×10⁹ cpm/µg) wurden zur erforderlichen Menge an auf 37°C vorgewärmter und entgaster Hybridisierlösung zugegeben. Um die Konzentration der jeweiligen DNA-Probe in der Hybridisierlösung möglichst hoch zu halten, wurde nur so viel Hybridisierflüssigkeit verwendet, daß die Filter gerade von Flüssigkeit bedeckt waren. Die Hybridisierung erfolgte 12-18 Stunden bei 37°C.The radioactive used for hybridizationlabeled DNAs (approx. 1 × 10⁹ cpm / µg) were usedrequired amount of preheated to 37 ° C anddegassed hybridization solution added. To theConcentration of the respective DNA sample in theIt was only to keep the hybridization solution as high as possibleused so much hybridizing liquid that theFilters were just covered with liquid. TheHybridization took place at 37 ° C for 12-18 hours.

Die Nitrozellulosefilter wurden anschließend entsprechend der Methode von Wood et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 82, 1585-1588, 1985) 3mal in 6×SSC und 0,05% SDS gespült (4°C) und 2×30 min bei 4°C ebenso gewaschen. Anschließend wurden die Filter in einer frisch bereiteten Lösung, die 3 M Tetramethylammoniumchlorid (Me4NCl), 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM EDTA und 0,05% SDS enthält, 3mal bei Raumtemperatur (RT) gespült, 2×30 min (RT) gewaschen und schließlich 3×30 min bei 49°C (Oligonukleotidgemisch a)) bzw. bei 52°C (Oligonukleotidgemisch b)) gewaschen, an der Luft getrocknet (Oligonukleotidgemisch b) und auf Papier geklebt. Röntgenfilme wurden 2-8 Tage bei -70°C unter Verwendung eines "intensifiying-screen" exponiert.The nitrocellulose filters were thenaccording to the method of Wood et al.(Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 82, 1585-1588, 1985) 3 times in6 × SSC and 0.05% SDS rinsed (4 ° C) and 2 × 30 min at 4 ° Cwashed as well. Then the filters were in a freshly prepared solution, the 3 MTetramethylammonium chloride (Me4NCl), 50 mM Tris-HClpH 8, 2 mM EDTA and 0.05% SDS contains, 3 timesRinsed room temperature (RT), washed 2 × 30 min (RT)and finally 3 × 30 min at 49 ° C(Oligonucleotide mixture a)) or at 52 ° C.(Oligonucleotide mixture b)) washed in airdried (oligonucleotide mixture b) and on paperglued. X-ray films were kept at -70 ° C for 2-8 daysExposed using an "intensifying screen".

4. Plaquereinigung4. Plaque cleaning

Da bei der angewandten hohen Dichte der Plaques im ersten Suchvorgang keine einzelnen Plaques isoliert werden konnten, wurden die rekombinanten Lambda-Phagen durch mehrere aufeinanderfolgende Suchvorgänge bei gleichzeitig verringerter Plaquedichte gereinigt. Nach Entwicklung der Autoradiogramme wurden Regionen von der Agarplatte isoliert (von drei durchgeführten Primärscreenings waren von 28 Regionen 2, von 35 Regionen 1 und von 15 Regionen 5 positiv), die auf beiden im Duplikat hybridisierten Nitrozellulosefiltern ein positives Hybridisiersignal ergaben. Dazu wurde die gewünschte Stelle mit dem engen Ende einer sterilen Pasteurpipette aus dem Agar gestochen und in 0,3-0,6 ml Lambda-Puffer (100 mM Tris HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂ und 1 mM EDTA) überführt. Es kann aber auch SM-Puffer (Maniatis T., Molekular-Cloning, 1982, S. 70) genommen werden. Nach Zugabe von einem Tropfen Chloroform ließ man die Phagen über Nacht bei 4°C aus dem Agar herausdiffundieren und plattierte jede einzelne Phagensuspension in mehreren Verdünnungen erneut aus. Von Platten, die 300-1000 Plaques aufwiesen, wurde erneut ein Nitrozellulosefilterabzug hergestellt und jeweils gegen beide DNA-Sonden hybridisiert. Dieser Vorgang wurde wiederholt, wobei Einzelplaques weiterverfolgt wurden, bis alle Plaques einer Platte ein positives Hybridisiersignal ergaben.Since the high density of the plaques used in theno single plaques isolatedcould be, the recombinant lambda phagesthrough multiple successive searchesat the same time reduced plaque density.After the autoradiograms were developed, regions becameisolated from the agar plate (from three performedPrimary screenings were 2 out of 28 regions, out of 35Regions 1 and out of 15 regions 5 positive) ontwo nitrocellulose filters hybridized in duplicategave a positive hybridization signal. This was thedesired place with the narrow end of a sterilePasteur pipette is pricked out of the agar and in 0.3-0.6ml lambda buffer (100 mM Tris HCl pH 7.5, 10 mM MgCl₂and 1 mM EDTA). But it can also use SM buffers(Maniatis T., Molecular Cloning, 1982, p. 70)will. After adding a drop of chloroform, letthe phages from the agar overnight at 4 ° Cdiffuse out and plated each onePhage suspension again in several dilutions.From plates that had 300-1000 plaquesagain a nitrocellulose filter deduction andhybridized against both DNA probes. ThisThe process was repeated, with single plaqueswere followed up until all plaques on a plategave a positive hybridization signal. 

5. Analyse der erhaltenen Phagenklone5. Analysis of the phage clones obtaineda. Titration derλ-Phagena. Titration of theλ phage

Die Phagensuspensionen wurden in Verdünnungsschritten von 1 : 10 mit Lambda-Puffer verdünnt, durch mehrmaliges Umschwenken gemischt und ausplattiert. Nach Inkubation bei 37°C konnten die auf dem Bakterienrasen entstandenen Plaques gezählt und der Titer (plaque forming units (pfu)) bestimmt werden. Der Titer betrug für die gereinigten Phagensuspensionen 2,2-8,6×10¹⁰ pfu/ml.The phage suspensions were diluteddiluted 1:10 with lambda buffer, byrepeated swirling mixed and plated. ToIncubation at 37 ° C was possible on the bacterial lawnthe resulting plaques are counted and the titer (plaqueforming units (pfu)) can be determined.The titer was for the purified phage suspensions2.2-8.6 x 10¹⁰ pfu / ml.

b) Präparation der Lambdaphagen-DNAb) Preparation of the Lambdaphagen DNA

Nach Isolation und Titration der in sich homogenen Phagenklone wurden diese in einer Dichte von 2×10⁶ pfu/13,5 cm Petrischale (mit dem Kulturmedien der Zusammensetzung: 1,5% Agarose, 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 10 mM MgSO₄ und 0,2% Glukose) mit 200 µl C600 Mg-Zellen (4 OD₆₀₀) plattiert, 5 Stunden bei 37°C inkubiert und anschließend auf 4°C abgekühlt. Die Elution der Phagen erfolgte durch Überschichten der Platten mit je 8 ml Lambdapuffer und einigen Tropfen Chloroform und leichtes Schwenken bei 4°C über Nacht. Der durch Zentrifugation (15 000 upm, 15 min, 4°C) gereinigte Überstand wurde schließlich abgenommen und die Phagen durch Zentrifugation bei 50 000 upm (Beckman Ti50 Rotor) 30 min bei RT pelletiert. Nach Zugabe von je 500 µl Lambdapuffer und Inkubation mit Ribonuklease A (RNase A, 10 µg/ml) und Desoxiribonuklease (DNase, 1 µg/ml), 30 min bei 37°C, wurde die Salzkonzentration durch Zugabe von je 25 µl 0,5 M EDTA, 12 µl 1 M Tris-HCl pH 8,0 und 6,5 µl 20% SDS erhöht und die vorhandenen Enzyme durch Inkubation bei 70°C für 15 min inaktiviert. Nach einer Extraktion mit Phenol und zweimaliger Extraktion mit Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1) zu jeweils gleichen Volumina wurde die DNA durch Zugabe von 0,1 Vol. 3 M Natriumazetat pH 5,2 und 2 Vol. Alkohol ausgefällt, abzentrifugiert, mit 70% Alkohol gewaschen, getrocknet und in 50 µl TE-Puffer aufgenommen.After isolation and titration of the homogeneousPhage clones were these in a density of 2 × 10⁶pfu / 13.5 cm petri dish (with the culture media of theComposition: 1.5% agarose, 10 g / l trypton, 5 g / lYeast extract, 5 g / l NaCl, 10 mM MgSO₄ and 0.2%Glucose) with 200 µl C600 Mg cells (4 OD₆₀₀)plated, incubated for 5 hours at 37 ° C andthen cooled to 4 ° C. Elution of the phageswas done by overlaying the plates with 8 ml eachLambda buffer and a few drops of chloroform andslight swiveling at 4 ° C overnight. The throughCentrifugation (15,000 rpm, 15 min, 4 ° C) cleanedThe supernatant was finally removed and the phagesby centrifugation at 50,000 rpm (Beckman Ti50 rotor)Pelleted at RT for 30 min. After adding 500 µl eachLambda buffer and incubation with ribonuclease A (RNaseA, 10 µg / ml) and deoxiribonuclease (DNase, 1 µg / ml),30 min at 37 ° C, the salt concentrationby adding 25 µl 0.5 M EDTA, 12 µl 1 M eachTris-HCl pH 8.0 and 6.5 µl 20% SDS increased and theexisting enzymes by incubation at 70 ° C for 15 mindeactivated. After extraction with phenol and extraction twice with chloroform / isoamyl alcohol(24: 1) the DNA was run at equal volumesAdd 0.1 vol. 3 M sodium acetate pH 5.2 and 2 vol.Alcohol precipitated, centrifuged, with 70% alcoholwashed, dried and in 50 µl TE bufferadded.

c. Restriktionsanalysec. Restriction analysis

Je 2 µl DNA-Lösung wurden mit 5 Einheiten EcoRI in HIGH-Puffer 2 Stunden bei 37°C inkubiert, die erhaltenen Fragmente auf einem 1% Agarosegel (T. Maniatis et al., 1982, p149ff) unter einer Spannung von 1-5 Volt/cm aufgetrennt, die Fragmente mit Längen zwischen 500 und 1000 Basenpaaren vom Gel eluiert (G. M. Dretzen et al., Anal. Biochem. 112, 295-298, 1981) und schließlich einer Sequenzanalyse unterworfen.2 µl DNA solution were mixed with 5 units of EcoRI inHIGH buffer incubated for 2 hours at 37 ° C, thefragments obtained on a 1% agarose gel (T.Maniatis et al., 1982, p149ff) under a voltage of1-5 volts / cm separated, the fragments with lengthsbetween 500 and 1000 base pairs eluted from the gel (G. M.Dretzen et al., Anal. Biochem. 112, 295-298, 1981) andfinally subjected to a sequence analysis.

d. Sequenzanalysed. Sequence analysis

Die Subklonierung der Restriktionsfragmente in einen für die Sequenzbestimmung nach Sanger (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463-5467, 1977; F. Sanger et al., FEBS-Letters 87, 107-111, 1978) geeigneten Vektor (Bluescribe M13+ bzw. M13-, Vektor Cloning Systems (C. Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103-119, 1985)) erfolgte nach den üblichen Methoden zur Durchführung von Restriktion und Ligation von DNA-Fragmenten und Transformation von E. coli Wirtszellen (T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, p104, 146ff, 396; DNA-Cloning, IRL-Press 1985, Vol. 1, chapter 6). So wurden 100 ng isolierte EcoRI-cDNA-Fragmente über EcoRI-Stellen in die entsprechend vorbereitete dsDNA-Form (replikative Form, 50 ng) des Vektors insertiert (durch Inkubation von 2-12 Stunden bei 14°C in 10 µl Ligationslösung) und mit dieser rekombinanten Konstruktion (mit den Bezeichnungen BS3, BS5, BS8, BS9, BS12, BS13, BSXIII) kompetente E. coli (Stamm JM 101) Zellen transformiert.The subcloning of the restriction fragments into onefor sequence determination according to Sanger (F. Sanger etal., Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463-5467, 1977; F.Sanger et al., FEBS-Letters 87, 107-111, 1978)suitable vector (Bluescribe M13 + or M13-, vectorCloning Systems (C. Yanisch-Perron et al., Gene 33,103-119, 1985)) was carried out according to the usual methodsImplementation of restriction and ligation ofDNA fragments and transformation of E. coliHost cells (T. Maniatis et al., 1982, MolecularCloning, Cold Spring Harbor Press, p104, 146ff, 396;DNA cloning, IRL-Press 1985, Vol. 1, chapter 6). So100 ng isolated EcoRI cDNA fragmentsEcoRI sites in the correspondingly prepareddsDNA form (replicative form, 50 ng) of the vectorinserted (by incubation for 2-12 hours at 14 ° C in 10 µl ligation solution) and with this recombinantConstruction (with the designations BS3, BS5, BS8, BS9,BS12, BS13, BSXIII) competent E. coli (strain JM 101)Cells transformed.

Es wurde die Einzelstrang-DNA der rekombinanten Phagen isoliert und nach Sanger sequenziert. Die gelesenen Sequenzen wurden mittels geeigneter Computerprogramme (R. Staden, Nucl. Acid. Res. 10, 4731-4751, 1982) verarbeitet.It became the single-stranded DNA of the recombinant phagesisolated and sequenced according to Sanger. The readSequences were created using suitable computer programs(R. Staden, Nucl. Acid. Res. 10, 4731-4751, 1982)processed.

Der isolierte Klon 8 (BS8) enthält die kodierende Sequenz ab Aminosäure 22 des reifen Enzyms (Abb. 1)The isolated clone 8 (BS8) contains the coding sequence from amino acid 22 of the mature enzyme (Fig . 1)

6. Konstruktion einer Expressionskassette6. Construction of an expression cassette

Zur Expression der hMn-SOD in Hefe sind Vervollständigung der isolierten cDNA, sowie die Konstruktion einer Expressionskassette notwendig, wobei der ADHI-Promotor in seiner ursprünglichen Länge (ca. 1500 bp, Methods in Enzymology, Vol. 101, Part C, 192-201, 1983), derselbe in verkürzter Form (ADHIK ca. 400 bp) und der ADHII-Terminator (Dr. R. Beier and E. T. Young, Nature 300, 724-728, 1982) zur Anwendung kommt.To express the hMn-SOD in yeastCompletion of the isolated cDNA, as well as theConstruction of an expression cassette necessary, wherebythe ADHI promoter in its original length (approx.1500 bp, Methods in Enzymology, Vol. 101, Part C,192-201, 1983), the same in abbreviated form (ADHIK approx.400 bp) and the ADHII terminator (Dr. R. Beier and E. T.Young, Nature 300, 724-728, 1982) is used.

a. Vervollständigung des Gensa. Completion of the gene

Da dem isolierten cDNA-Klon 8 am N-Terminus die den 21 Aminosäuren (AS) entsprechende Basenanzahl fehlt, wurden zur Vervollständigung des Gens entsprechend der berichteten Aminosäure-Sequenz (D. Barra et al., J. Biol. Chem. 259, 12 595-12 601, 1984) unter Berücksichtigung der Hefe-Codon-Auswahl (P. M. Sharp et al., Nucl. Acids. Res. 14, 5125-5143, 1986) 2 Oligonukleotidpaare als XhoI-XbaI-Fragment (OP1, entsprechend Formel VIa) bzw. XbaI-NcoI-Fragment (OP2, entsprechend Formel VIb) konstruiert und synthetisiert (381A DNA-Synthesizer, Applied Biosystems). OP1 wurde über XhoI/XbaI in das Plasmid V 17 (entstanden aus pUC18 (J. Vieira and J. Messing, Gene 19, 259, 1982) nach HincII Restriktion und Insertierung von XhoI-Linkern (New England Biolabs, d(CCTCGAGG) und SmaI-Restriktion des entstandenen Plasmids pES102 mit nachfolgender Insertierung von NcoI-Linkern (New England Biolabs, d(CCCATGGG)), insertiert (Abb. 2), OP2 über XbaI/NcoI: Dazu wurden je 4 µg V 17-DNA mit je 10 Einheiten XbaI und NcoI bzw. XhoI und XbaI in 40 µl CORE-Puffer 2 Stunden bei 37°C verdaut und durch Gelelektrophorese (0,7% Agarose, s. o.) gereinigt. Je 5 µl der synthetisierten Einzelstränge von OP1 bzw. von OP2 (jeweils 10 pM/µl) wurden gemischt, 10 min bei 65°C inkubiert und langsam auf RT abgekühlt. Jeweils ¹/₁₀ davon wurden mit je 50 ng doppelt geschnittenem Vektor (XhoI/XbaI für OP1 und XbaI/NcoI für OP2) unter oben beschriebenen Bedingungen ligiert (Plasmide HSOD2 und HSOD3,Abb. 2). Schließlich wurden HSOD2 und HSOD3 über ScaI/XbaI (also nach doppelter Verdauung mit ScaI und XbaI in CORE-Puffer 2 Stunden bei 37°C) nach Reinigung und Isolierung der geschnittenen Vektoren durch Gelelektrophorese und Ligation unter oben beschriebenen Bedingungen (Klonieren der Oligopaare OP1 und OP2) zu Plasmid HSOD4 kombiniert (Abb. 2, 3), dieses durch NcoI-Restriktion, darauffolgendem Klenow-Fil1-in und EcoRI-Restriktion für die Aufnahme des ThaI/EcoRI-cDNA-Fragments vorbereitet: 5 µg DNA wurden in 50 µl High-Puffer mit 18 Einheiten NcoI bei 37°C mehrere Stunden inkubiert, die geschnittene DNA durch Gelelektrophorese gereinigt, isoliert und die Hälfte davon in 30 µl Klenow-Reaktionslösung 1 Stunde bei RT inkubiert.Since the isolated cDNA clone 8 at the N-terminus lacks the number of bases corresponding to the 21 amino acids (AA), the gene was completed according to the reported amino acid sequence (D. Barra et al., J. Biol. Chem. 259, 12 595-12 601, 1984) taking into account the yeast codon selection (PM Sharp et al., Nucl. Acids. Res. 14, 5125-5143, 1986) 2 pairs of oligonucleotides as XhoI-XbaI fragment (OP1, according to formula VIa ) or XbaI-NcoI fragment (OP2, according to formula VIb) constructed and synthesized (381A DNA synthesizer, Applied Biosystems). OP1 was converted into plasmid V 17 (originated from pUC18 (J. Vieira and J. Messing, Gene 19, 259, 1982) via XhoI / XbaI after HincII restriction and insertion of XhoI linkers (New England Biolabs, d (CCTCGAGG) and SmaI restriction of the resulting plasmid pES102 with subsequent insertion of NcoI linkers (New England Biolabs, d (CCCATGGG)), inserted (Fig. 2), OP2 via XbaI / NcoI: 4 µg of V 17 DNA with 10 each were used for this Units XbaI and NcoI or XhoI and XbaI in 40 µl CORE buffer digested for 2 hours at 37 ° C and purified by gel electrophoresis (0.7% agarose, see above). 5 µl each of the synthesized single strands of OP1 and OP2 (each 10 pM / µl) were mixed, incubated for 10 min at 65 ° C. and slowly cooled to RT, each ½ of which were with 50 ng double-cut vector (XhoI / XbaI for OP1 and XbaI / NcoI for OP2) described above Conditions ligated (plasmids HSOD2 and HSOD3,Fig. 2). Finally, HSOD2 and HSOD3 were scaI / xbaI (ie after double digestion combined with ScaI and XbaI in CORE buffer at 37 ° C. for 2 hours) after purification and isolation of the cut vectors by gel electrophoresis and ligation under the conditions described above (cloning of the oligopair OP1 and OP2) to form plasmid HSOD4 (FIGS. 2, 3), This was prepared for the uptake of the ThaI / EcoRI cDNA fragment by NcoI restriction, followed by Klenow Fil1-in and EcoRI restriction: 5 µg DNA were incubated in 50 µl high buffer with 18 units NcoI at 37 ° C for several hours , the cut DNA was purified by gel electrophoresis, isolated and half of it was incubated in 30 μl Klenow reaction solution for 1 hour at RT.

Nach Beendigung der Reaktion durch Zugabe von 2 µl 0,5 M EDTA und Inkubation der Reaktionslösung bei 70°C (10 min) wurde die DNA durch Gelelektrophorese gereinigt, isoliert und mit 7,5 Einheiten EcoRI in 20 µl HIGH-Puffer nachgeschnitten, nochmals gereinigt und isoliert (Abb. 5).After the reaction had ended by adding 2 μl of 0.5 M EDTA and incubating the reaction solution at 70 ° C. (10 min), the DNA was purified by gel electrophoresis, isolated and cut again with 7.5 units of EcoRI in 20 μl of HIGH buffer, again cleaned and insulated (Fig. 5).

Das ThaI/EcoRI-cDNA-Fragment wurde wie folgt präpariert:
Mit dem Plasmid BS8, das den isolierten cDNA-Klon 8 (S. o.) enthält, wurden kompetente E. coli (Stamm JM 101) Wirtszellen transformiert, und das Plasmid unter geeigneten Bedingungen präpariert (T. Maniatis et al., 1982, p368).The ThaI / EcoRI cDNA fragment was prepared as follows:
Competent E. coli (strain JM 101) host cells were transformed with the plasmid BS8, which contains the isolated cDNA clone 8 (see above), and the plasmid was prepared under suitable conditions (T. Maniatis et al., 1982, p368).

Nach Restriktion mit ThaI (10 µg Plasmid wurden in 40 µl ThaI-Puffer mit 25 Einheiten ThaI 8 Stunden bei 60°C verdaut), Nachschneiden des 759 bp ThaI Fragments mit EcoRI (S. o.), mit jeweils nachfolgender gelelektrophoretischer Reinigung und Isolation des entsprechenden Fragments, wurde das so erhaltene ThaI/EcoRI-Fragment (Abb. 4) mit dem entsprechend vorbereitetem Plasmid HSOD4 (ca. 100 ng Fragment wurden mit 50 ng geschnittenem Vektor in 10 µl Ligationslösung ligiert. (s. o.)) zu HSOD6 (Abb. 5) kombiniert. Plasmid HSOD6 enthält somit die vollständige c-DNA für hMn-SOD inklusive Met. Der Leserahmen bleibt dabei erhalten.After restriction with ThaI (10 μg plasmid was digested in 40 μl ThaI buffer with 25 units of ThaI for 8 hours at 60 ° C.), the 759 bp ThaI fragment was cut with EcoRI (see above), with subsequent gel electrophoretic purification and isolation of the corresponding fragment, the ThaI / EcoRI fragment thus obtained (Fig. 4) was prepared with the correspondingly prepared plasmid HSOD4 (approx. 100 ng fragment was ligated with 50 ng cut vector in 10 µl ligation solution. (see above)) to HSOD6 (Fig . 5) combined. Plasmid HSOD6 thus contains the complete c-DNA for hMn-SOD including Met. The reading frame is retained.

b. Konstruktion der Expressionskassetteb. Construction of the expression cassette

Plasmid HSOD6 wurde mit Xho und EcoRI (je 5 Einheiten/µg DNA) in CORE-Puffer doppelt verdaut, das XhoI-Fragment (Gen) isoliert und in das Plasmid PKH1 bzw. PKH2 über XhoI/EcoRI insertiert. Die Plasmide PKH1 bzw. PKH2 wurden wie folgt präpariert (Abb. 6, 7, 8): In Plasmid PES 103, das den ADHI-Promotor als 1500 bp BamHI-XhoI-Fragment in PES 102 (PES 102 ist ein pUC18 Derivat, welches in der HincII-Schnittstelle einen XhoI-Linker enthält, die Konstruktion des BamHI-XhoI-Fragments ist in Methods in Enzymology 101, 192-201 beschrieben) enthält, wurden nach SmaI-Restriktion (1 µg Plasmid wurde mit 5 Einheiten SmaI in SmaI-Puffer für 2 Stunden bei 37°C verdaut), Reinigung und Isolation BgIII-Linker insertiert (T. Maniatis et al., 1982, p 396). Das so entstandene Plasmid (P154/1,Abb. 6) wurde durch EcoRI-Restriktion (s. o.), Klenow-Fil1-in (s. o.) und Religation (lug DNA) wurde in 40 µl Ligationslösung (s. o.) über Nacht bei 14°C inkubiert) zu Plasmid 154/2 verändert (Abb. 6).Plasmid HSOD6 was digested twice with Xho and EcoRI (5 units / µg DNA each) in CORE buffer, the XhoI fragment (gene) was isolated and inserted into the plasmid PKH1 and PKH2 via XhoI / EcoRI. The plasmids PKH1 and PKH2 were prepared as follows (Figs. 6, 7, 8): In plasmid PES 103, which uses the ADHI promoter as a 1500 bp BamHI-XhoI fragment in PES 102 (PES 102 is a pUC18 derivative which contains an XhoI linker in the HincII interface, the construction of the BamHI-XhoI fragment is described in Methods in Enzymology 101, 192-201), after SmaI restriction (1 µg plasmid was mixed with 5 units of SmaI in SmaI- Buffer digested for 2 hours at 37 ° C), purification and isolation BglII linker inserted (T. Maniatis et al., 1982, p 396). The resulting plasmid (P154 / 1,Fig. 6) was by EcoRI restriction (see above), Klenow-Fil1-in (see above) and religation (lug DNA) was in 40 ul ligation solution (see above) overnight at 14 ° C. incubated) changed to plasmid 154/2 (Fig. 6).

Ebenfalls ausgehend von Plasmid pES103 wurde nach doppelter Verdauung mit XhoI und HindIII in CORE-Puffer der Linker - XhoI · EcoRI · XbaI · HindIII - (Abb. 7, synthetisiert am 381A DNA-Synthesizer) insertiert. Dieser Linker enthält die SequenzAlso starting from plasmid pES103, after double digestion with XhoI and HindIII in CORE buffer, the linker - XhoI · EcoRI · XbaI · HindIII - (Fig. 7, synthesized on the 381A DNA synthesizer) was inserted. This linker contains the sequence

In das so erhaltene Plasmid 150/1 wurde über XbaI/HindIII (doppelte Verdauung in CORE-Puffer) der ADHII Terminator insertiert (Plasmid 150/2 (Abb. 7)). Der ADHII-Terminator wurde wie folgt erhalten: Plasmid pMW5 ADHII (Washington Research Fundation) wurde mit HindIII (Core-Puffer), danach mit SphI (in SphI-Puffer) verdaut und das isolierte 605 bp Fragment in den Vektor V18 kloniert und in die HincII-Schnittstelle ein XbaI-Linker (Biolabs, CTCTAGAG) eingebaut (Ligation s. o.). Ein 335 bp langes XbaI/SphI Fragment wurde in pUC18 (XbaI/SphI) einligiert (pGD2).The ADHII terminator was inserted into the plasmid 150/1 thus obtained via XbaI / HindIII (double digestion in CORE buffer) (plasmid 150/2 (FIG. 7)). The ADHII terminator was obtained as follows: Plasmid pMW5 ADHII (Washington Research Fundation) was digested with HindIII (core buffer), then with SphI (in SphI buffer) and the isolated 605 bp fragment was cloned into the vector V18 and into HincII interface an XbaI linker (Biolabs, CTCTAGAG) installed (ligation see above). A 335 bp XbaI / SphI fragment was ligated into pUC18 (XbaI / SphI) (pGD2).

Der Vektor V18 wurde dadurch erhalten, daß in pUC18 in die SmaI-Stelle ein HindIII-Linker eingebaut wurde und die HindIII-Stelle am ursprünglichen Ort fehlt, so daß die Multiklonierstelle in V18 EcoRI · SstI · KpnI · HindIII · BamHI · XbaI · SalI · PstI · SphI lautet.The vector V18 was obtained in that in pUC18 inthe Hindi linker was inserted in the SmaI site andthe HindIII position at the original location is missing, so thatthe multicloning station in V18EcoRI · SstI · KpnI · HindIII · BamHI · XbaI · SalI · PstI · SphIreads.

Der ADHII-Terminator wurde schließlich nach doppelter Verdauung mit XbaI/HindIII in CORE-Puffer nach den üblichen Methoden (s. o.) isoliert. Plasmid 150/2 enthält somit bis auf das über XhoI/EcoRI zu insertierende Gen die für eine Genexpression notwendigen Einheiten von ca. 1500 bp (Promotor), 7 bp (XhoI-Linker), 6 bp (EcoRI-Linker), 7 bp (XbaI-Linker), 329 bp (Terminator). Diese Einheiten wurden nun über BamHI/HindIII (doppelte Verdauung in CORE-Puffer) in den Vektor 154/2 (Abb. 8) insertiert. In dem so erhaltenen Plasmid PKH1 (Abb. 8) wurde in analoger Weise der ADHI-Promotor durch den verkürzten Promotor ADHIk als BamHI/XhoI-Fragment (412 bp) ersetzt (pKH2,Abb. 9).The ADHII terminator was finally isolated after double digestion with XbaI / HindIII in CORE buffer according to the usual methods (see above). With the exception of the gene to be inserted via XhoI / EcoRI, plasmid 150/2 thus contains the units of approximately 1500 bp (promoter), 7 bp (XhoI linker), 6 bp (EcoRI linker), 7 bp ( XbaI linker), 329 bp (terminator). These units were now inserted into vector 154/2 (Fig. 8) via BamHI / HindIII (double digestion in CORE buffer). In the plasmid PKH1 (Fig. 8) thus obtained, the ADHI promoter was replaced in an analogous manner by the shortened promoter ADHIk as a BamHI / XhoI fragment (412 bp) (pKH2,Fig. 9).

In beide Plasmide wurde schließlich über XhoI/EcoRI (s. o.) das aus HSOD6 herausgeschnittene vollständige cDNA-Gen (s. o.) insertiert. Die so erhaltenen Plasmide HSOD7/1 bzw. HSOD7/2 (Abb. 9) unterscheiden sich voneinander nur durch die verschiedenen Promotoren ADHI und ADHIk (s. o.). Die so fertiggestellte Expressionskassetten wurden über BglII/HindIII (nach doppelter Verdauung der Plasmide in CORE-Puffer und Isolation der herausgeschnittenen Expressionskassetten) in die entsprechend vorbereiteten Hefetransformationsvektoren YEp13 (J. R. Broach et al., Gene 8, 121-133, 1979), pJDB207 (DSM 3181, hinterlegt am 28. 12. 84), pEAS102, YIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA 76, 1035-1039, 1979, ATCC 37 061) über die Schnittstellen BamHI und HindIII insertiert.The complete cDNA gene excised from HSOD6 (see above) was finally inserted into both plasmids via XhoI / EcoRI (see above). The resulting plasmids HSOD7 / 1 and HSOD7 / 2 (Fig. 9) differ from each other only in the different promoters ADHI and ADHIk (see above). The expression cassettes thus prepared were converted into the correspondingly prepared yeast transformation vectors YEp13 (JR Broach et al., Gene 8, 121-133, 1979), via BglII / HindIII (after double digestion of the plasmids in CORE buffer and isolation of the cut-out expression cassettes), pJDB207 ( DSM 3181, deposited on December 28, 84), pEAS102, YIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA 76, 1035-1039, 1979, ATCC 37 061) via the interfaces BamHI and Hind III inserted.

7. Herstellung einer für die Expression geeigneten Hefe Mn-SOD-Mutante7. Preparation of a yeast suitable for expressionMn SOD mutant

Das Gen für Hefe-Mn-SOD (A. P. G. M. van Loon et al., Gene 26, 261-272, 1983) ist als BamHI-Fragment im Vektor PL 41 (Abb. 10) enthalten und die Sequenz vollständig publiziert (C. A. M. Marres et al., Eur. J. Biochem. 147, 153-161, 1985). Nach Restriktion mit BamHI (2 µg Plasmid wurden mit 5 Einheiten in 150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl pH 7,9, 6 mM MgCl₂, 100 µg/µl Rinderserumalbumin 2 Stunden bei 36°C verdaut) wurde das 2045 bp lange BamHI-Fragment, das das Gen enthält, wie üblich durch Gelelektrophorese gereinigt und isoliert und über BamHI in den Vektor V0 (pUC18, jedoch ohne HindIII-Schnittstelle) subkloniert.The gene for yeast Mn-SOD (APGM van Loon et al., Gene 26, 261-272, 1983) is contained as a BamHI fragment in vector PL 41 (Fig. 10) and the sequence has been completely published (CAM Marres et al ., Eur. J. Biochem. 147, 153-161, 1985). After restriction with BamHI (2 µg plasmid were digested with 5 units in 150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl pH 7.9, 6 mM MgCl₂, 100 µg / µl bovine serum albumin at 36 ° C), the 2045 bp BamHI Fragment containing the gene, purified as usual by gel electrophoresis and isolated and subcloned via BamHI into vector V0 (pUC18, but without HindIII cleavage site).

Der Vektor V0 wurde dadurch erhalten, indem 1 µg pUC18 mit HindIII geschnitten wurde (CORE-Puffer), das linearisierte Fragment aus dem Gel nach bekannten Methoden isoliert, die überstehenden Enden mit 2 U Klenow-Polymerase (Ligasepuffer+0,2 mM dNTP) aufgefüllt und nach 30 min bei RT durch Zugabe von 2 U T4-DNA-Ligase über Nacht bei 14°C regligiert wurde.The vector V0 was obtained by adding 1 µgpUC18 was cut with HindIII (CORE buffer)linearized fragment from the gel according to knownMethods isolated, the protruding ends with 2 UKlenow polymerase (ligase buffer + 0.2 mM dNTP)filled and after 30 min at RT by adding 2 UT4 DNA ligase was regulated overnight at 14 ° C.

Das entstandene Plasmid SODY1 (Abb. 10) wurde durch NruI-Restriktion (1 µg Plasmid wurde mit 5 Einheiten NurI in NurI-Puffer 2 Stunden bei 36°C verdaut) durch Gelelektrophorese gereinigt und durch Insertieren eines HindIII-Linkers (CAAGCTTG) zu SODY3 (Abb. 10) verändert. Schließlich wurde in die HindIII-Schnittstelle das URA3-Gen (erhalten aus pURA3) insertiert: 4 µg SODY3 wurden mit 20 Einheiten HindIII 2 Stunden bei 37°C in CORE-Puffer verdaut und dephosphoryliert: Zu 40 µl Verdauungsansatz wurden 40 µl H₂O, 10 µl 1 mM EDTA, 5 µl 1M Tris-HCl pH 9,5, 1 µl 100 mM Spermidin 1 µl Calf Intestinal Alkaline Phophatase (CIAP, 1 mg/ml H₂O) zugegeben und bei 36°C inkubiert. Nach 15 min wurde nochmals 1 µl CIAP zugegeben und weitere 15 min inkubiert. Der dephosphorylierte Vektor wurde ebenfalls durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. 2 µg Plasmid pURA3 wurden mit HindIII geschnitten (siehe oben) und ein 1,2 kb Fragment, welches das Hefegen URA3 enthält, ebenfalls isoliert und in den vorbereiteten Vektor insertiert (s. o.).The resulting plasmid SODY1 (FIG. 10) was purified by NruI restriction (1 μg plasmid was digested with 5 units of NurI in NurI buffer for 2 hours at 36 ° C.) by gel electrophoresis and by inserting a HindIII linker (CAAGCTTG) into SODY3 (Fig. 10) changed. Finally, the URA3 gene (obtained from pURA3) was inserted into the HindIII site: 4 μg SODY3 were digested with 20 units of HindIII in CORE buffer at 37 ° C. for 2 hours and dephosphorylated: 40 μl H₂O, 10 µl 1 mM EDTA, 5 µl 1M Tris-HCl pH 9.5, 1 µl 100 mM spermidine 1 µl Calf Intestinal Alkaline Phophatase (CIAP, 1 mg / ml H₂O) added and incubated at 36 ° C. After 15 min, 1 μl of CIAP was again added and incubated for a further 15 min. The dephosphorylated vector was also purified by agarose gel electrophoresis. 2 µg of plasmid pURA3 were cut with HindIII (see above) and a 1.2 kb fragment which contains the yeast gene URA3 was also isolated and inserted into the prepared vector (see above).

Die so entstandenen Plasmide SODY7 und SODY8 enthalten das URA3-Gen innerhalb des Hefe-Mn-Gens und unterscheiden sich in der Orientierung des URA-Gens relativ zum Mn-SOD-Gen (Abb. 10).The resulting plasmids SODY7 and SODY8 contain the URA3 gene within the yeast Mn gene and differ in the orientation of the URA gene relative to the Mn SOD gene (Fig. 10).

Die Orientierung des URA3-Gens relativ zum Mn-SOD-Gen ist feststellbar, da das URA3-Gen eine asymetrische PstI-Stelle enthält.The orientation of the URA3 gene relative to the Mn SOD geneis detectable because the URA3 gene is asymmetricalPstI position contains.

Mit dem Plasmid SODY7 und SODY8 wurden im Stamm DBY 747 (Genotyp a, leu2, his3, trp1, ura3, Yeast Genetic Stock Centre, Berkeley) ein "Gen-Transplacement" durchgeführt (Methods in Enzymology 101, 202-211 und 211-228). Der Stamm DBY 747 wurde mit dem BamHI-Fragment aus SODY7 und SODY8 transformiert (J. D. Beggs, Nature 275, 104, 1978). Dazu wurden 20 µg SODY7 bzw. SODY8 mit 50 U BamHI in 200 µl BamHI-Puffer (150 mM NaCl, 6 mM TrisHCl pH 7,9, 6 mM MgCl₂, 1 mM DTT) geschnitten und die gesamte Verdauungsmischung (ohne den pUC-Anteil abzutrennen) mit Phenol extrahiert (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, 1982, S. 458f) und durch Äthanolfällung konzentriert (Zusatz von 20 µl 3 M Natriumacetat pH 5,5, 500 µl Äthanol). Die DNA wurde in 10 µl Wasser aufgenommen und direkt zur Transformation von Hefe eingesetzt.The plasmid SODY7 and SODY8 were used in strain DBY 747(Genotype a, leu2, his3, trp1, ura3, Yeast Genetic StockCenter, Berkeley) carried out a "gene transplacement"(Methods in Enzymology 101, 202-211 and 211-228). TheStrain DBY 747 was made with the BamHI fragment from SODY7and SODY8 (J.D. Beggs, Nature 275, 104,1978). For this purpose, 20 µg SODY7 or SODY8 with 50 UBamHI in 200 µl BamHI buffer (150 mM NaCl, 6 mM TrisHClpH 7.9, 6 mM MgCl₂, 1 mM DTT) cut and thetotal digestive mix (without the pUC portionto separate) extracted with phenol (Maniatis, T. etal., Molecular Cloning, 1982, pp. 458f) and byEthanol precipitation concentrated (addition of 20 µl 3 MSodium acetate pH 5.5, 500 ul ethanol). The DNA was in10 µl of water taken up and directly for transformationused by yeast.

Die Transformanten wurden auf Uracilprototrophie selektioniert.The transformants were based on uracil prototrophyselected.

Einzelne Transformanten wurden über Nacht in 5 ml SC-URA-Medium bei 28°C gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, nach van Loon et al. aufgeschlossen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 3820-3824, 1986) und auf ihren Gehalt an Mn-SOD untersucht. Zur gelelektrophoretischen Erfassung von Mn-SOD einerseits und Cu/ZN-SOD andererseits wurden bereits bestehende Arbeitsvorschriften (Ch. Beauchamp und I. Fridovich, Anal. Biochem. 44, 276-287, 1971; H. P. Misra und I. Fridovich, Arch. Biochem. Biophys. 183, 511-515, 1977; B. J. Davis, Annals of the NY Academy of Sciences, Vol. 121, 404-427, 1964) zur Anwendung gebracht.Individual transformants were placed in 5 ml overnightSC-URA medium grown at 28 ° C. The cells wereharvested by centrifugation, according to van Loon et al.open-minded (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 3820-3824,1986) and examined for their content of Mn-SOD.For gel electrophoretic detection of Mn-SODon the one hand and Cu / ZN-SOD on the other hand have already beenexisting work regulations (Ch. Beauchamp and I.Fridovich, Anal. Biochem. 44, 276-287, 1971; H. P. Misraand I. Fridovich, Arch. Biochem. Biophys. 183, 511-515,1977; B. J. Davis, Annals of the NY Academy of Sciences,Vol. 121, 404-427, 1964) applied. 

Bestens bewährt hat sich dabei die Auftrennung der Proteine mit anschließender Negativ-Färbung mit Nitroblautetrazolium (B. J. Davis, 1964; Ch. Beauchamp und I. Fridovich, 1971). Eine Erhöhung der Empfindlichkeit ist durch die Anfärbung mit Dianisidin möglich (H. P. Misra und I. Fridovich, 1977). Zur weiteren Charakterisierung wurde ein spektrophotometrischer Assay (Hyland, K. et al., Anal. Biochem. 135, 280-287, 1983) mit alkalischem Dimethylsulfoxid als O₂^--erzeugendes System und mit Cytochrom c als "scavenger" eingesetzt.The separation of the proteins with subsequent negative staining with nitroblue tetrazolium (BJ Davis, 1964; Ch. Beauchamp and I. Fridovich, 1971) has proven to be best. Staining with dianisidine can increase sensitivity (HP Misra and I. Fridovich, 1977). For further characterization, a spectrophotometric assay (Hyland, K. et al., Anal. Biochem. 135, 280-287, 1983) with alkaline dimethyl sulfoxide as O₂^- -generating system and with cytochrome c as "scavenger" was used.

Die Unterscheidung zwischen Mn-SOD einerseits und Cu/Zn-SOD andererseits erfolgt durch Zusatz von KCN (s. o. und M. Ysebaert-Vanneste and W. H. Vanneste, Anal. Biochem. 107, 86-95, 1980). Die Stämme SODY7/2, SODY7/6, SODY7/8 und SODY10 enthielten keine Mn-SOD Aktivität.The distinction between Mn-SOD on the one hand andCu / Zn-SOD, on the other hand, is made by adding KCN(see above and M. Ysebaert-Vanneste and W. H. Vanneste,Anal. Biochem. 107, 86-95, 1980). The SODY7 / 2 tribes,SODY7 / 6, SODY7 / 8 and SODY10 did not contain Mn-SODActivity.

Claims (36)

Translated fromGerman

1. DNA-Sequenzen, die die gesamte oder partielle genetische Information für ein Enzym tragen, das die enzymatischen, biochemischen und immunologischen Eigenschaften der human Mn-Superoxiddimutase (hMn-SOD) aufweist.1. DNA sequences that are all or partialcarry genetic information for an enzyme that theenzymatic, biochemical and immunologicalProperties of human Mn superoxide dimutase (hMn-SOD)having.2. DNA-Sequenzen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie die genetische Information für eine hMn-SOD mit einer aminoterminalen Leader- oder Signalsequenz enthalten.2. DNA sequences according to claim 1, characterized in thatthat they have the genetic information for an hMn SODan amino terminal leader or signal sequencecontain.3. DNA-Sequenzen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie für das mature Enzym hMn-SOD kodieren.3. DNA sequences according to claim 1, characterized in thatthat they code for the mature enzyme hMn-SOD.4. DNA-Sequenzen nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß diesen dem ersten Codon für die erste Aminosäure der maturen hMn-SOD ein Translationsstartcodon vorangestellt ist.4. DNA sequences according to claim 1 to 3, characterized inthat this is the first codon for thefirst amino acid of the mature HMn-SODTranslation start codon is prepended.5. DNA-Sequenzen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß dem letzten Codon für die letzte Aminosäure der hMn-SOD ein Stopcodon folgt.5. DNA sequences according to claim 4, characterized inthat the last codon for the last amino acid of thehMn-SOD is followed by a stop codon.6. DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie den Nukleotidsequenzen gemäß Formeln Ia, Ib, II, IIIa, IIIb, Va, Vb, VIa, VIb, VIIa, VIIb, VIII, IX entsprechen.6. DNA sequences according to one of claims 1 to 5, characterizedcharacterized in that they correspond to the nucleotide sequencesFormulas Ia, Ib, II, IIIa, IIIb, Va, Vb, VIa, VIb, VIIa,VIIb, VIII, IX correspond. 7. DNA-Sequenzen, die mit einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 unter stringenten Bedingungen hybridisieren, wobei diese DNA-Sequenzen synthetischen, halbsynthetischen oder natürlichen Ursprungs sein können und mit den DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 6 sowie deren Mutationen jedweder Art verwandt sein können und für ein Enzym mit den enzymatischen, biochemischen und immunologischen Eigenschaften der hMn-SOD codieren.7. DNA sequences with a DNA sequence according to one of theClaims 1 to 6 under stringent conditionshybridize, these DNA sequences being synthetic,be semi-synthetic or natural in origincan and with the DNA sequences according to one of theClaims 1 to 6 and their mutations of any kindcan be related and for an enzyme with theenzymatic, biochemical and immunologicalCoding properties of the hMn-SOD.8. Replizierende Vektoren mit mindestens einem Selektionsmarker, vorzugsweise mit einer Erkennungsstelle für mindestens ein Restriktionsenzym außerhalb des Replikationsursprungs und anderer essentieller Genbereiche, aber innerhalb eines Selektionsmarkers, dadurch gekennzeichnet, daß diese eine der DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 enthalten.8. Replicating vectors with at least oneSelection marker, preferably with aDetection site for at least one restriction enzymeoutside the origin of replication and othersessential gene areas, but within oneSelection marker, characterized in that thisone of the DNA sequences according to one of claims 1 to 7contain.9. Replizierende Vektoren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie viralen Ursprungs sind, vorzugsweise Lambda-Phagen, insbesondereλgt10 oder M13-Phagen.9. Replicating vectors according to claim 8, characterized in that they are of viral origin, preferably lambda phages, in particularλ gt10 or M13 phages.10. Replizierende Vektoren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie plasmidischen Ursprungs sind, vorzugsweise pUC18.10. Replicating vectors according to claim 9, characterizedcharacterized as being of plasmid origin,preferably pUC18.11. Plasmide, eine der DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 enthaltend, dadurch gekennzeichnet, daß diese Plasmide eine diese besagten DNA-Sequenzen enthaltende Expressionskassette tragen, prokaryotische und eukaryotische Wirtszellen stabil transformieren können, in einer dieser Wirtszellen replizierbar sind und die darin enthaltende genetische Information für hMn-SOD korrekt transkribiert und translatiert wird.11. Plasmids, one of the DNA sequences according to one of theContaining claims 1 to 7, characterized in thatthat these plasmids are one of said DNA sequencescarry the expression cassette containing, prokaryoticand stably transform eukaryotic host cellscan be replicable in one of these host cellsand the genetic information it contains forhMn-SOD is correctly transcribed and translated. 12. Plasmide nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie YEp13, pJDB207, pEAS102, YIp5 sind.12. Plasmids according to claim 11, characterized in thatthey are YEp13, pJDB207, pEAS102, YIp5.13. Plasmide nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie pUC Plasmide sind, vorzugsweise pUC18.13. Plasmids according to claim 11, characterized in thatthey are pUC plasmids, preferably pUC18.14. Plasmide nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die sie tragende Expressionskassette die Elemente Promotor, hMn-SOD Strukturgen mit Initiations- und Stopcodon, Terminator oder Promotor, alle in korrekter Leserichtung enthält.14. Plasmids according to one of claims 11 to 13, characterizedcharacterized that the one bearing themExpression cassette the elements promoter, hMn-SODStructural gene with initiation and stop codon, terminatoror promoter, all in the correct reading direction.15. Plasmide nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor der vollständige ca. 1500bp lange ADHI Promotor oder der verkürzte ca. 400bp lange ADHIk-Promotor und der Terminator der ADHII Terminator sind.15. Plasmids according to claim 14, characterized in thatthe promoter of the full approximately 1500 bp long ADHIPromoter or the shortened approx. 400bp longADHIk promoter and the terminator of the ADHII terminatorare.16. Transformierte Wirtszellen, die für hMn-SOD codierende genetische Information enthaltend.16. Transformed host cells coding for hMn-SODcontaining genetic information.17. Transformierte Wirtszellen nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie replizierende Vektoren nach einem der Ansprüche 8 bis 10 oder Plasmide nach einem der Ansprüche 11 bis 15 enthalten, diese replizieren und exprimieren und das synthetisierte hMn-SOD intrazellulär akkumulieren, in das Periplasma oder extrazellulär transportieren.17. Transformed host cells according to claim 16, characterizedcharacterized as having replicating vectorsone of claims 8 to 10 or plasmids according to oneof claims 11 to 15 contain replicate themand express and synthesize the hMn SODaccumulate intracellularly, into the periplasm ortransport extracellularly.18. Transfomierte Wirtszellen nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß diese Prokaryoten sind, besonders Enterobacteriaceae, Bacillaceae, apathogene Micrococcaceae, vorzugsweise E.coli, insbesondere E.coli C600, E.coli JM 101.18. Transformed host cells according to claim 17, characterizedcharacterized that these are prokaryotes, especiallyEnterobacteriaceae, Bacillaceae, apathogenicMicrococcaceae, preferably E. coli, in particularE.coli C600, E.coli JM 101. 19. Transformierte Wirtszellen nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß diese Eukaryoten sind, vorzugsweise S. cerevisiae.19. Transformed host cells according to claim 17, characterizedcharacterized that these are eukaryotes, preferablyS. cerevisiae.20. Transformierte Wirtszellen nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß diese Säugetierzellen sind.20. Transformed host cells according to claim 17, characterizedcharacterized as being mammalian cells.21. Verfahren zur Herstellung von hMn-SOD, dadurch gekennzeichnet, daß

• a. die mRNA aus menschlichen Gewebe, vorzugsweise Plazentagewebe, isoliert und die poly(A)⁺RNA präpariert,
• b. von dieser poly(A)⁺RNA die doppelsträngige cDNA synthetisiert und davon eine cDNA-Genbank konstruiert
• c. eine für hMn-SOD codierende DNA, Gesamt- oder Teilsequenz aus besagter cDNA-Bank mittels DNA-Sonden, vorzugsweise solchen entsprechend Formeln Va und Vb, isoliert,
• d. diese DNA-Sequenz gegebenenfalls bis zum Start- oder Stopcodon komplettiert und gegebenenfalls mit einer Leader- oder Signalsequenz vor dem Startcodon versehen und in einen Vektor oder Plasmid kloniert
• e. mit dieser kompletten, für hMn-SOD codierenden DNA-Sequenz eine je nach Wirtszelle geeignete Expressionskassette konstruiert,
• f. mit einem diese Expressionskassette tragenden Vektor oder Plasmid eine geeignete Wirtszelle transformiert,
• g. das durch diesen transformierten Wirt synthetisierte hMn-SOD isoliert und gereinigt wird.

21. A process for the preparation of hMn-SOD, characterized in that

• a. the mRNA is isolated from human tissue, preferably placental tissue, and the poly (A) ⁺RNA is prepared,
• b. The double-stranded cDNA was synthesized from this poly (A) ⁺RNA and a cDNA library was constructed from it
• c. a DNA coding for hMn-SOD, whole or partial sequence from said cDNA bank is isolated by means of DNA probes, preferably those corresponding to formulas Va and Vb,
• d. this DNA sequence is optionally completed up to the start or stop codon and optionally provided with a leader or signal sequence in front of the start codon and cloned into a vector or plasmid
• e. with this complete DNA sequence coding for hMn-SOD, an expression cassette suitable for the host cell is constructed,
• f. transforms a suitable host cell with a vector or plasmid carrying this expression cassette,
• G. the hMn-SOD synthesized by this transformed host is isolated and purified.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 definiert sind.22. The method according to claim 21, characterized in thatthe DNA sequences according to claims 1 to 7are defined.23. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Vektoren und Plasmide gemäß Ansprüchen 8 bis 10 sowie 11 bis 15 definiert sind.23. The method according to claim 21, characterized in thatthe vectors and plasmids according to claims 8 to 10and 11 to 15 are defined.24. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen, die nach Ansprüchen 16 bis 20 definierten Eigenschaften aufweisen.24. The method according to claim 21, characterized in thatthe host cells according to claims 16 to 20have defined properties.25. Verfahren nach Ansprüchen 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß danach eine hMn-SOD herstellbar ist, welche die enzymatischen, biochemischen und immunologischen Eigenschaften der authentischen hMn-SOD aufweist.25. The method according to claims 21 to 24, characterizedcharacterized in that an HMn SOD can then be producedwhich is the enzymatic, biochemical andimmunological properties of the authentic hMn-SODhaving.26. Verfahren nach Ansprüchen 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß danach eine hMn-SOD herstellbar ist, vorzugsweise mit den Aminosäuresequenzen gemäß Formeln IVa oder IVb.26. The method according to claims 21 to 25, characterizedcharacterized in that an HMn SOD can then be producedis, preferably with the amino acid sequences according toFormulas IVa or IVb.27. Polypeptid mit den enzymatischen, biochemischen und immunologischen Eigenschaften der hMn-SOD in im wesentlichen reiner Form.27. Polypeptide with the enzymatic, biochemical andimmunological properties of hMn-SOD in imessentially pure form. 28. Polypeptid nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß es frei von nativer Glykolisierung vorliegt.28. Polypeptide according to claim 27, characterized in thatthat it is free from native glycolization.29. Polypeptid nach Ansprüchen 27 und 28, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäure Methionin vor der 1. Aminosäure des N-Terminus aufweist.29. Polypeptide according to claims 27 and 28, characterizedcharacterized in that it contains the amino acid methionine before1. has amino acid of the N-terminus.30. Polypeptid nach einem der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Leader-Peptid enthält.30. Polypeptide according to one of claims 27 to 29, characterizedcharacterized in that it contains a leader peptide.31. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenzen gemäß Formeln IVa oder IVb aufweist.31. Polypeptide, characterized in that it is theHas amino acid sequences according to formulas IVa or IVb.32. Polypeptid nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäure Methionin vor der 1. Aminosäure des N-Terminus der maturen hMn-SOD aufweist.32. Polypeptide according to claim 31, characterized in thatthat it's the amino acid methionine before the 1st amino acidof the N-terminus of the mature HMn-SOD.33. Polypeptid nach Anspruch 31 und 32, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Leader-Peptid enthält.33. Polypeptide according to claim 31 and 32, characterizedcharacterized in that it contains a leader peptide.34. Polypeptid, herstellbar nach einem der Ansprüche 21 bis 26.34. Polypeptide, producible according to one of claims 21 to26.35. Verwendung eines Polypeptides nach einem der Ansprüche 27 bis 34 zur therapeutischen Behandlung.35. Use of a polypeptide according to one of claims 27up to 34 for therapeutic treatment.36. Mittel für die therapeutische Behandlung des Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß es neben pharmazeutisch inerten Trägerstoffen eine wirksame Menge eines Polypeptides gemäß einem der Ansprüche 27 bis 34 enthält.36. agents for therapeutic treatment of humans,characterized in that it is pharmaceuticalinert carriers an effective amount ofPolypeptides according to any one of claims 27 to 34contains.