DE202008013314U1 - lanthanide chelates - Google Patents

Abstract

Translated fromGerman

Chelatder Formel (I), das für Markierung von bioaktiver Substanzin Lösung geeignet ist,

dadurch gekennzeichnet, dass
– Aeine reaktive Gruppe für Bindung an die bioaktive Substanzdarstellt, gewählt aus einer Gruppe bestehend aus Isothiocyanat,Bromoacetamido, Jodoacetamido, Maleimid, 4,6-Dichlor-1,3,5-triazinyl-2-amino,Pyridyldithiol, Thioester, Aminooxy, Azid, Alkyn, Hydrazid, Amino,Carboxylsäure, Ester oder Säurehalid.Chelate of formula (I) suitable for labeling bioactive substance in solution,

characterized in that
A represents a reactive group for binding to the bioactive substance selected from a group consisting of isothiocyanate, bromoacetamido, iodoacetamido, maleimide, 4,6-dichloro-1,3,5-triazinyl-2-amino, pyridyldithiol, thioester, aminooxy , Azide, alkyne, hydrazide, amino, carboxylic acid, ester or acid halide.

Description

Translated fromGerman

GEBIET DER ERFINDUNGFIELD OF THE INVENTION

VorliegendeErfindung betrifft neue Lanthanidchelate, die für die Markierungbioaktiver Substanzen in Lösungsphase geeignet sind.ThisThe invention relates to novel lanthanide chelates useful for labelingbioactive substances in solution phase are suitable.

HINTERGRUND DER ERFINDUNGBACKGROUND OF THE INVENTION

DiePublikationen und das sonstige Material, worauf hier verwiesen wird,werden zur Veranschaulichung des Hintergrundes der Erfindung verwendet,und insbesondere dienen die Fälle, auf die hier Bezug genommenwird, zur Bereitstellung weiterer Details bezüglich derTechnik.ThePublications and other material referred to hereare used to illustrate the background of the invention,and in particular, the cases referred to herein servewill provide further details regarding theTechnology.

Voneinem lumineszierenden Lanthanidchelat werden häufig verschiedenephysikalische und chemische Sondereigenschaften erwartet. Das Molekülsollte sowohl im Grund- als auch im angeregten Zustand thermodynamisch,kinetisch und photochemisch stabil sein. Die Energieübertragungvom Liganden auf das Zentralion sollte schnell und effektiv sein.Das Chelat sollte oft auch wasserlöslich sein. Das Chelatsollte seine positiven Eigenschaften auch noch nach seiner Kopplungan ein bioaktives Molekül beibehalten. Ein gutes Markierungsreagensverändert nicht die Eigenschaften der von ihm gebundenenbioaktiven Substanz.FromA luminescent lanthanide chelate often becomes differentexpected physical and chemical special properties. The moleculeshould be thermodynamically, both in the ground and in the excited state,be kinetically and photochemically stable. The energy transferfrom the ligand to the central ion should be fast and effective.The chelate should often be water-soluble. The chelateshould its positive properties even after its couplingretained on a bioactive molecule. A good labeling reagentdoes not change the properties of his boundbioactive substance.

Beizahlreichen Anwendungen ist eine kovalente Bindung des Markierungsmolekülsan das bioaktive Molekül notwendig. Bei der Markierungder Zielmoleküle, wie Proteine, Oligonukleotide und Oligopeptide,werden oft Isothiocyanat-, N-Hydroxysuccinimid-, Haloacetamid-,Dichlortriazin- oder Maleimidderivate eines Chelats verwendet. Dadann die Markierungsreaktion in Anwesenheit eines Überschussesder aktivierten Markierung durchgeführt wird, könnenarbeitsintensive Reinigungsverfahren nicht vermieden werden. Obwohlsynthetische bioaktive Moleküle auf der Oberflächedes festen Trägers markiert werden können, istdie Markierung in Lösung bei großen bioaktivenSubstanzen, wie Proteinen, unvermeidbar. Dann sollte die Markierungsreaktionmöglichst effektiv und ortsspezifisch sein.atnumerous applications is a covalent binding of the tag moleculenecessary to the bioactive molecule. At the markthe target molecules, such as proteins, oligonucleotides and oligopeptides,often isothiocyanate, N-hydroxysuccinimide, haloacetamide,Dichlortriazin or maleimide derivatives of a chelate used. Therethen the labeling reaction in the presence of an excessthe activated mark can be performedLabor-intensive cleaning procedures can not be avoided. Even thoughsynthetic bioactive molecules on the surfaceof the solid support isthe label in solution for large bioactiveSubstances, such as proteins, unavoidable. Then the labeling reaction should bebe as effective and site specific as possible.

Esist beobachtet worden, dass die Elektronen abgebenden Gruppen einesaromatischen Ringes die lichtphysikalischen Eigenschaften bestimmter,von 4-Phenyl-2,6-bis[N,N-di(carboxyalkyl)aminoalkyl]pyridinen abgeleiteterLanthanid(III)chelaten verbessern (US4 761 481). Später ist beobachtet worden, dassoben genannte Eigenschaften durch Chelatisieren mehrerer aromatischerGruppen an ein Lanthanidion verbessert werden können (USPatentanmeldung 11/004 061). Dies steigert ebenfalls die Stabilitätder Chelatstruktur.It has been observed that the electron-donating groups of an aromatic ring improve the light-physical properties of certain lanthanide (III) chelates derived from 4-phenyl-2,6-bis [N, N-di (carboxyalkyl) aminoalkyl] pyridines ( US 4,761,481 ). Later, it has been observed that the above properties can be improved by chelating a plurality of aromatic groups to a lanthanide ion (US Patent Application 11 / 004,061). This also increases the stability of the chelate structure.

DARSTELLUNG DER ERFINDUNGPRESENTATION OF THE INVENTION

HauptsächlichesZiel vorliegender Erfindung ist es, aus 4-Phenylpyridin abgeleiteteChelate zur Verwendung bereit zu stellen, welche die Markierungbioaktiver Substanzen in Lösungsphase ermöglichen.Die Wasserlöslichkeit hat durch Kopplung von Carboxylsäure-,Phosphorsäure- oder Sulfonsäuregruppen an die Chromophorenverbessert werden können. Die so erhaltenen Biokonjugateeignen sich besonders gut zur Bestimmung basierend auf zeitlichgetrennter Fluoreszenz.CardinalThe aim of the present invention is derived from 4-phenylpyridineTo provide chelates for use, which is the labelallow bioactive substances in solution phase.The water solubility has by coupling of carboxylic acid,Phosphoric or sulfonic acid groups to the chromophorescan be improved. The bioconjugates thus obtainedare particularly good for determining based on timeseparate fluorescence.

Diecharakteristischen Merkmale der Erfindung gehen aus Schutzanspruch1 hervor.TheCharacteristic features of the invention are based on protection claim1 forth.

VorliegendeErfindung betrifft also ein Chelat, das für die Markierungeiner bioaktiven Substanz in Lösungsphase geeignet ist,und das die Strukturformel (I) aufweist

und worin

• – Lnein Lanthanid ist,
• – A eine reaktive Gruppe für Bindung an einebioaktive Substanz darstellt, gewählt aus einer Gruppebestehend aus Isothiocyanat, Bromoacetamido, Jodoacetamido, Maleimid,4,6-Dichlor-1,3,5-triazinyl-2-amino, Aminooxy, Thioester, Pyridyldithiol,Azid, Alkyn, Hydrazid, Amino, Carboxylsäure, Ester oderSäurehalid.

The present invention thus relates to a chelate which is suitable for the labeling of a bioactive substance in solution phase, and which has the structural formula (I)

and in which

• - Ln is a lanthanide,
• A represents a reactive group for binding to a bioactive substance selected from a group consisting of isothiocyanate, bromoacetamido, iodoacetamido, maleimide, 4,6-dichloro-1,3,5-triazinyl-2-amino, aminooxy, thioester, pyridyldithiol , Azide, alkyne, hydrazide, amino, carboxylic acid, ester or acid halide.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNGDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

DasLanthanid Ln ist vorzugsweise Terbium, Dysprosium, Europium oderSamarium. Besonders vorteilhafte Lanthanide sind Terbium und Dysprosium.TheLanthanide Ln is preferably terbium, dysprosium, europium orSamarium. Particularly advantageous lanthanides are terbium and dysprosium.

Diereaktive Gruppe A ist ausgehend von der Etylgruppe an die orto-,para- oder meta-Stellung des Phenylringes angeschlossen.Thereactive group A is derived from the etyl group to the ortho,para or meta position of the phenyl ring connected.

DieAlkoxygruppen sind ausgehend von der Pyridingruppe an die orto-,para- oder meta-Stellung des Phenylringes angeschlossen.TheAlkoxy groups are derived from the pyridine group to the ortho,para or meta position of the phenyl ring connected.

Diezu markierende bioaktive Substanz ist beispielsweise ein Oligopeptid,Oligonukleotid, Polypeptid, Polynukleotid, Protein, Oligosaccharid,Polysaccharid, Phospholipid, PNA, LNA, Antikörper, Hapten,Arzneimittel, Molekül, das an einen Rezeptor bindet, oderLektin.Thebioactive substance to be labeled is, for example, an oligopeptide,Oligonucleotide, polypeptide, polynucleotide, protein, oligosaccharide,Polysaccharide, phospholipid, PNA, LNA, antibodies, hapten,Drug, molecule that binds to a receptor, orLectin.

DieErfindung wird mittels des folgenden, nicht einschränkendenexperimentellen Teils veranschaulicht.TheInvention is by means of the following, non-limitingexperimental part illustrated.

EXPERIMENTELLER TEILEXPERIMENTAL PART

DieErfindung wird mittels folgender Beispiele näher erläutert.TheInvention will be explained in more detail by means of the following examples.

BeispieleExamples

Beispiel 1. Herstellung von Terbium(III)chelatExample 1. Preparation of terbium (III) chelate

Verbindung1 wurde mit dem in der Publikation [US5 055 578] beschriebenen Verfahren hergestellt, jedochmit 2,6-Dimethoxy-4-hydroxybenzaldehyd als Ausgangssubstanz. DieHydroxygruppe der Verbindung 1 wurde mit tert-Butylester der Bromessigsäurein Acetonitril in Anwesenheit von Caliumcarbonat alkylisiert.Compound 1 was compared with that in publication [ US 5 055 578 ], but with 2,6-dimethoxy-4-hydroxybenzaldehyde as the starting material. The hydroxy group of compound 1 was alkylated with tert-butyl ester of bromoacetic acid in acetonitrile in the presence of potassium carbonate.

DasVerfahren ist in der Publikation [US6 080 838] beschrieben. Diester 2 wurde mit Natriumborohydridzu Dimethanol 3 reduziert, wie in der Publikation [ActaChem. Scand. B, 1988, 373] beschrieben. Bromisierung mitPhosphortribromid in trockenem DMF ergab Dibromid 4. Das Verfahrenist in der Publikation [Bioconjugate Chem. 2005, 16, 700]beschrieben.The method is described in the publication [ US Pat. No. 6,080,838 ]. Diester 2 was reduced with sodium borohydride to dimethanol 3 as described in the publication [ Acta Chem. Scand. B, 1988, 373 ]. Bromination with phosphorus tribromide in dry DMF gave dibromide 4. The method is described in the publication [ Bioconjugate Chem. 2005, 16, 700 ].

Terbium(III)chelat8 wurde unter Nutzung des in der Publikation [Helv. Chim.Acta, 79, 1996, 789] beschriebenen Verfahrens hergestellt.Kurz gesagt wurde Verbindung 4 zuerst mit Di-tert-Butylester derIminodiessigsäure und danach mit Aminoethylanilin in Acetonitrilin Anwesenheit von Caliumcarbonat umgesetzt. Die Entfernung derSchutzgruppen mit Trifluoressigsäure und die Behandlungmit Terbiumchlorid ergab Chelat 7, das mit Thiophosgen zu Verbindung8 aktiviert wurde. Das Aktivierungsverfahren ist in der Publikation[Bioconjugate Chem. 1994, 5, 278] beschrieben.Terbium (III) chelate 8 was synthesized using the method described in the publication [ Helv. Chim. Acta, 79, 1996, 789 ] described method. Briefly, compound 4 was reacted first with di-tert-butyl ester of iminodiacetic acid and then with aminoethylaniline in acetonitrile in the presence of potassium carbonate. The Removal of the protecting groups with trifluoroacetic acid and treatment with terbium chloride gave chelate 7, which was activated with thiophosgene to give compound 8. The activation procedure is described in the publication [ Bioconjugate Chem. 1994, 5, 278 ].

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNGQUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

• - US 4761481[0005]- US 4761481[0005]
• - US 5055578[0015]US 5055578[0015]
• - US 6080838[0016]- US 6080838[0016]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

• - Acta Chem.Scand. B, 1988, 373[0016]- Acta Chem. Scand. B, 1988, 373[0016]
• - Bioconjugate Chem. 2005, 16, 700[0016]- Bioconjugate Chem. 2005, 16, 700[0016]
• - Helv. Chim. Acta, 79, 1996, 789[0017]- Helv. Chim. Acta, 79, 1996, 789.[0017]
• - Bioconjugate Chem. 1994, 5, 278[0017]- Bioconjugate Chem. 1994, 5, 278[0017]

Claims (4)

Translated fromGerman

Chelat der Formel (I), das für Markierungvon bioaktiver Substanz in Lösung geeignet ist,

dadurch gekennzeichnet,dass – A eine reaktive Gruppe für Bindungan die bioaktive Substanz darstellt, gewählt aus einerGruppe bestehend aus Isothiocyanat, Bromoacetamido, Jodoacetamido,Maleimid, 4,6-Dichlor-1,3,5-triazinyl-2-amino, Pyridyldithiol, Thioester,Aminooxy, Azid, Alkyn, Hydrazid, Amino, Carboxylsäure,Ester oder Säurehalid.Chelate of formula (I) suitable for labeling bioactive substance in solution,

characterized in that - A represents a reactive group for binding to the bioactive substance selected from a group consisting of isothiocyanate, bromoacetamido, iodoacetamido, maleimide, 4,6-dichloro-1,3,5-triazinyl-2-amino, pyridyldithiol , Thioester, aminooxy, azide, alkyn, hydrazide, amino, carboxylic acid, ester or acid halide.Chelat nach Schutzanspruch 1, dadurch gekennzeichnet,dass das Lanthanid Ln Terbium, Dysprosium, Europium oder Samariumist.Chelate according to protection claim 1, characterizedthat the lanthanide Ln terbium, dysprosium, europium or samariumis.Chelat nach Schutzanspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet,dass das Lanthanid Ln Terbium oder Dysprosium ist.Chelate according to protection claims 1 and 2, characterizedthat the lanthanide Ln is terbium or dysprosium.Chelat nach Schutzanspruch 1–3, dadurchgekennzeichnet, dass die bioaktive Substanz ein Oligopeptid, Oligonukleotid,Polypeptid, Polynukleotid, Protein, Oligosaccharid, Polysaccharid,Phospholipid, PNA, LNA, Antikörper, Hapten, Arzneimittel,Molekül, das an einen Rezeptor bindet, oder Lektin ist.Chelate for protection claim 1-3, byin that the bioactive substance is an oligopeptide, oligonucleotide,Polypeptide, polynucleotide, protein, oligosaccharide, polysaccharide,Phospholipid, PNA, LNA, antibodies, hapten, drugs,Molecule that binds to a receptor or is lectin.