DE19911421A1 - Laser compatible NIR marker dyes - Google Patents

Abstract

Translated fromGerman

Die Erfindung betrifft sogenannte Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe auf der Basis von Polymethinen zur Verwendung in optischen, insbesondere fluoreszenz-optischen, Bestimmungs- und Nachweisverfahren, beispielsweise in der Medizin, in der Pharmazie sowie in der Bio-, Material- und Umweltwissenschaft. DOLLAR A Aufgabe war es, NIR-Marker-Farbstoffe auf Polymethin-Basis mit hoher Photo- und Lagerstabilität sowie hoher Fluoreszenzausbeute zu schaffen, die auf möglichst einfache Weise durch Laserstrahlung im sichtbaren oder NIR-Spektralbereich, insbesondere mit Licht eines Argon-, Helium/Neon- oder Diodenlasers, zur Fluoreszenz angeregt werden können. DOLLAR A Erfindungsgemäß werden Farbstoffe auf der Basis von Polymethinen der allgemeinen Formel DOLLAR F1 eingesetzt.The invention relates to so-called laser-compatible NIR marker dyes based on polymethines for use in optical, in particular fluorescence-optical, determination and detection methods, for example in medicine, in pharmacy and in bio, material and environmental science . DOLLAR A task was to create NIR marker dyes based on polymethine with high photo and storage stability and high fluorescence yield, which are as simple as possible by laser radiation in the visible or NIR spectral range, in particular with light from an argon or helium / Neon or diode laser, can be excited to fluorescence. DOLLAR A According to the invention, dyes based on polymethines of the general formula DOLLAR F1 are used.

Description

Translated fromGerman

Die Erfindung betrifft sogenannte Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe auf der Basis von Polymethinen zur Verwendung in optischen, insbesondere fluoreszenzoptischen, Bestimmungs- und Nachweisverfahren. Typische Verfahrensanwendungen beruhen auf der Reaktion von farbstoffmarkierten Antigenen, Antikörpern oder DNA-Segmenten mit der jeweils komplementären Spezies.The invention relates to so-called laser-compatible NIR marker dyes based onof polymethines for use in optical, in particular fluorescence-optical,Determination and verification procedures. Typical process applications are based onReaction of dye-labeled antigens, antibodies or DNA segments with theeach complementary species.

Einsatzmöglichkeiten ergeben sich beispielsweise in der Medizin und der Pharmazie, in der Bio- und Materialwissenschaft, bei der Umweltkontrolle und dem Nachweis von in Natur oder Technik vorkommenden organischen und anorganischen Mikroproben sowie anderes mehr.Possible applications arise, for example, in medicine and pharmacy, in theBio and materials science, environmental control and the detection of in natureor technology-occurring organic and inorganic micro-samples and othersmore.

Polymethine sind als NIR-Marker seit langem bekannt und zeichnen sich durch intensive, leicht in den NIR-Bereich verschiebbare Absorptionsmaxima aus (Fabian, J.; Nakazumi, H.; Matsuoka, M.: Chem.-Rev. 1992, 92, 1197). Bei geeignetem Substituentenmuster und π-Elektronensystem fluoreszieren sie mit ausreichender Quantenausbeute auch im NIR-Bereich. Entsprechend finden diese Verbindungen breite Anwendung in verschiedenen Bereichen der Technik, als Sensibilisatoren in AgX-Materialien, als Laserfarbstoffe, als Quantenzahler, als Indikator-Farbstoffe in der Sensorik und nicht zuletzt als Biomarker ("Near-Infrared Dyes for High Technology Applications", herausgegeben von Daehne, S.; Resch-Genger, U.; Wolfbeis, O.-S., Kluwer, Academic Publishers - Dordrecht/Boston/­London - 1998).Polymethines have long been known as NIR markers and are characterized by intensive,absorption maxima that can easily be shifted into the NIR range (Fabian, J .; Nakazumi,H.; Matsuoka, M .: Chem.-Rev. 1992, 92, 1197). With a suitable substituent pattern andπ-electron system they fluoresce with sufficient quantum yield even in NIRArea. Accordingly, these compounds are widely used in variousAreas of technology, as sensitizers in AgX materials, as laser dyes, asQuantum payer, as indicator dyes in sensors and not least as a biomarker("Near-Infrared Dyes for High Technology Applications", published by Daehne, S .;Resch-Genger, U .; Wolfbeis, O.-S., Kluwer, Academic Publishers - Dordrecht / Boston /London - 1998).

Die Anzahl der als Biomarker verwendeten Polymethine ist begrenzt. Breite kommerzielle Anwendung haben in diesem Sinne bisher nur das sich vom Astraphloxin (DE 4 15 534) abgeleitete Trimethin Cy3, bzw. das vinyloge Pentamethin Cy5 und das doppelt vinyloge Heptamethin Cy7 mit Absorptionsmaxima bei ca. 550 nm, ca. 650 nm und ca. 750 nm gefunden (US-PS 5 627 027). Darüber hinaus wird das polysulfonierte, vom kommerziellen Heptamethin "Indocyaningreen" bzw. "Cardio Green" abgeleitete Trimethin Cy3.5 und Pentamethin Cy5.5 angeboten (US-PS 5 569 766). In der Polymethinkette aliphatisch verbrückte Heptamethine wurden von Patonay entwickelt (US-PS 5 800 995).The number of polymethines used as biomarkers is limited. Wide commercialIn this sense, only those that differ from astraphloxin have so far been used (DE 4 15 534)derived trimethine Cy3, or the vinylogous pentamethine Cy5 and the double vinylogeHeptamethine Cy7 with absorption maxima at approx. 550 nm, approx. 650 nm and approx. 750 nmfound (U.S. Patent No. 5,627,027). In addition, the polysulfonated, fromcommercial heptamethine "indocyanine green" or "cardio green" derived trimethineCy3.5 and pentamethine Cy5.5 are offered (US Pat. No. 5,569,766). In the polymethine chainAliphatic bridged heptamethines have been developed by Patonay (US Pat. No. 5,800,995). 

Charakteristisch für alle kommerziellen Biomarker sind die sich vom Inden (Fischer-Base) bzw. Heteroinden ableitenden terminalen Heteroaromaten. Werden methylsubstituierte Cycloimonium-Salze dieses Typs als terminale Polymethin-Bausteine verwendet, so ist es notwendig, mindestens fünf aufeinander folgende sp²-hybridisierte Kohlenstoffatome (Pentamethine) zwischen den Heterocyclen anzuordnen um Absorptionsmaxima an der Grenze zum NIR-Bereich zu erzeugen.All commercial biomarkers are characterized by the terminal heteroaromatics derived from the inden (Fischer base) or heteroinden. If methyl-substituted cycloimonium salts of this type are used as terminal polymethine building blocks, it is necessary to arrange at least five consecutive sp² -hybridized carbon atoms (pentamethines) between the heterocycles in order to generate absorption maxima at the border to the NIR region.

Ein wesentlicher Nachteil der als Biomarker technisch genutzten NIR-Polymethine besteht darin, daß mit Verlängerung der Polymethinkette im steigenden Maße nucleopile bzw. elektrophile Angriffsmöglichkeiten auf die Kette gegeben sind, in deren Folge es zur Zerstörung des π-Systems kommt. Neben der ungenügenden thermischen und photochemischen Stabilität besteht ein weiterer wesentlicher Mangel der Polymethine darin, daß sie neben ihren intensiven Absorptionsmaxima keine weiteren Absorptionsban­den im sichtbaren Spektralbereich aufweisen und in diesem Spektrum, insbesondere durch Argon-Laser mit einer Emissonswellenlänge von λ_em = 488 nm oder He/Ne-Laser mit λ_em = 633 nm bzw. entsprechende Laserdioden ab λ_em = 670 nm, nicht unmittelbar angeregt werden können. Speziell die für "multiple color fluorescence assay's" geeigneten Biomarker können aber nur durch diskrete, vom π-System des Polymethins vorgegebene Lichtquellen (wie die vorgenannten) zur Anregung gebracht werden. Um dennoch derartige Anwendungen zu ermöglichen (bei der Nutzung von "multiple color fluorescence assay's" ist es notwendig mit beispielsweise einer dieser Anregungslichtquellen verschiedene Biomarker mit deutlich unterschiedlichen Emissionmaxima anzuregen), erfolgt die Anregung von Cy5 durch einen Argon-Laser, indem beispielsweise mit Hilfe von Energietransfer über die Anregung von Fluorescein → Rhodamin → Texas Red → Cy5 eine Emission über die Anregung von Licht an der Grenze zum NIR-Bereich bewirkt wird (US-PS 5 800 996). Weitere Möglichkeiten zur Anregung von Cy5, beispielsweise durch einen Argon-Laser bestehen darin, Mikropartikel aus intrinsischen Fluorophoren (Phycobiliproteinen) und dem extrinsischen Cy5 zu erzeugen, die über Energiekaskaden die Anregung des bei 650 nm absorbierenden Cy5-Derivates gestatten (Szöllösi, J.; Damjanovich, S.; Matyus, L.: Cytometry 1998, 34, 159).A major disadvantage of the NIR polymethines used technically as biomarkers is that with increasing the polymethine chain there are increasing nucleopile or electrophilic attack possibilities on the chain, as a result of which the π system is destroyed. In addition to the insufficient thermal and photochemical stability, a further major deficiency of the polymethines is that, in addition to their intensive absorption maxima, they have no further absorption bands in the visible spectral range and in this spectrum, in particular by argon lasers with an emission wavelength of λ_em = 488 nm or He / Ne lasers with λ_em = 633 nm or corresponding laser diodes from λ_em = 670 nm, cannot be excited directly. In particular, the biomarkers suitable for "multiple color fluorescence assays" can only be excited by discrete light sources (such as those mentioned above) specified by the π system of the polymethine. In order to enable such applications (when using "multiple color fluorescence assays" it is necessary to excite different biomarkers with significantly different emission maxima using, for example, one of these excitation light sources), Cy5 is excited by an argon laser, for example with the aid of Energy transfer via the excitation of fluorescein → rhodamine → Texas Red → Cy5 causes an emission via the excitation of light at the border to the NIR range (US Pat. No. 5,800,996). Further possibilities for the excitation of Cy5, for example by means of an argon laser, are to generate microparticles from intrinsic fluorophores (phycobiliproteins) and the extrinsic Cy5, which allow the excitation of the Cy5 derivative absorbing at 650 nm via energy cascades (Szöllösi, J .; Damjanovich, S .; Matyus, L .: Cytometry 1998, 34, 159).

Von Gupta (US-PS 5 783 673) werden Farbstoff-Konjukate beschrieben, die durch die Reaktion von Phycobiliprotein mit aktivierten Fluorescein, Texas Red oder Cy5-Farbstoffen (Phycobiliprotein/Amine-Reactive Dye - PARD) dargestellt wurden. Diese so erhaltenen Farbstoff-Konjugate zeigen im sichtbaren Spektralbereich zusätzliche Absorptionsbanden, die zur Anregung genutzt werden können. Nachteilig an diesen Proben sind die hohe Molmasse, die aufwendige Präparation und die geringe Stabilität dieser Marker-Farbstoffe.Gupta (US Pat. No. 5,783,673) describes dye conjugates which are characterized by theReaction of phycobiliprotein with activated fluorescein, Texas Red or Cy5-Dyes (Phycobiliprotein / Amine-Reactive Dye - PARD) were shown. This way Dye conjugates obtained show additional ones in the visible spectral rangeAbsorption bands that can be used for excitation. A disadvantage of these samplesare the high molecular weight, the complex preparation and the low stability of theseMarker dyes.

Ein weiteres Beispiel für die Anregung von an sich bei 488 nm nicht absorbierenden Pentamethinen gibt Glazer (US-PS 5 760 201). Durch die kovalente Verknüpfung mit einem im gewünschten Bereich absorbierenden Monomethin über mehrere ammoniumhaltige optimierte Alkylspacer wird zusätzlich eine starke Affinität zur DNA erreicht (spezifische Ionenbindung). Auch hier ist ein entsprechender Verfahrensaufwand zur Anregung unumgänglich. Weitere Nachteile dieser Marker-Farbstoffe bestehen in einer ungenügenden Photo- oder Lagerstabilität, in aufwendigen Synthese- und Reinigungs­schritten, in geringen Absorptionskoeffizienten bzw. einer unbefriedigenden Fluoreszenzquantenausbeute sowie in unerwünschten Änderungen der optischen Eigenschaften in Gegenwart von Proteinen oder Nucleinsäureoligomeren bzw. nach Bindung an diese.Another example for the excitation of non-absorbing per se at 488 nmGlazer (U.S. Patent 5,760,201) gives pentamethines. Through the covalent link witha monomethine absorbing in the desired range over severalOptimized alkyl spacer containing ammonium also has a strong affinity for DNAreached (specific ion binding). Here, too, there is a corresponding procedural effortindispensable for suggestion. Further disadvantages of these marker dyes are oneinsufficient photo or storage stability, in complex synthesis and cleaningsteps, in low absorption coefficients or an unsatisfactoryFluorescence quantum yield as well as undesirable changes in the opticalProperties in the presence of proteins or nucleic acid oligomers or afterBond to this.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, NIR-Marker-Farbstoffe auf Polymethin-Basis mit hoher Photo- und Lagerstabilität sowie hoher Fluoreszenzausbeute zu schaffen, die auf möglichst einfache Weise durch Laserstrahlung im sichtbaren oder im nahen IR-Spektralbereich, insbesondere mit Licht eines Argon-, Helium/Neon- oder Diodenlasers zur Fluoreszenz angeregt werden können.The invention is based on the object, NIR marker dyes based on polymethineto create with high photo and storage stability as well as high fluorescence yieldas simple as possible by laser radiation in the visible or in the near IRSpectral range, in particular with light from an argon, helium / neon or diode laserFluorescence can be excited.

Erfindungsgemäß werden Marker-Farbstoffe auf der Basis von Polymethinen eingesetzt, die substituierte Benzooxazol-, Benzothiazol-, 2,3,3-Trimethylindolenin-, das 2,3,3-Trimethyl-4,5-benzo- 3H-indolenin-, 2- und 4-Picolin-, Lepidin-, Chinaldin- sowie 9-Methylacridinderivate der allgemeinen Formeln Ia oder Ib oder Ic
According to the invention, marker dyes based on polymethines are used, the substituted benzooxazole, benzothiazole, 2,3,3-trimethylindolenine, 2,3,3-trimethyl-4,5-benzo-3H-indolenine, 2 - And 4-picoline, lepidine, quinaldine and 9-methylacridine derivatives of the general formulas Ia or Ib or Ic

enthalten mit Z als
included with Z as

wobei
in which

• - X bzw. Y für ein Element aus der Gruppe O, S, Se oder das Strukturelement N-alkyl oder C(alkyl)₂ steht,X or Y represents an element from the group O, S, Se or the structural element N-alkyl or C (alkyl)₂ ,
• - n für die Zahlenwerte 1, 2 oder 3 steht,- n stands for the numerical values 1, 2 or 3,
• - R¹-R¹⁵ gleich oder unterschiedlich sind und Wasserstoff, ein oder mehrere Alkyl-, oder Aryl-, Heteroaryl- oder heterocycloaliphatische Reste, eine Hydroxy- oder Alkoxygruppe, eine alkylsubsituierte oder cyclische Aminfunktion sein können und/oder zwei ortho-ständige Reste, z. B. R² und R³, zusammen einen weiteren aromatischen Ring bilden können,- R¹ -R^{15 are the} same or different and can be hydrogen, one or more alkyl, or aryl, heteroaryl or heterocycloaliphatic radicals, a hydroxyl or alkoxy group, an alkyl-substituted or cyclic amine function and / or two ortho radicals , e.g. B. R² and R³ , together can form a further aromatic ring,
• - mindestens einer der Substituenten R¹-R¹⁵ einen ionisierbaren bzw. ionisierten Substituenten, wie SO₃^-, PO₃^-, COO^-, oder NR₃⁺, darstellen kann, der die hydrophilen Eigenschaften dieser Farbstoffe bestimmt,at least one of the substituents R¹ -R^{15 can be} an ionizable or ionized substituent, such as SO₃^- , PO₃^- , COO^- or NR₃⁺ , which determines the hydrophilic properties of these dyes,
• - mindestens einer der Substituenten R¹-R¹⁵ für eine reaktive Gruppe stehen kann, welche eine kovalente Verknüpfung des Farbstoffs mit den oben genannten Trägermolekülen ermöglicht und- At least one of the substituents R¹ -R^{15 can represent} a reactive group which enables the dye to be covalently linked to the abovementioned carrier molecules, and
• - U-V bzw. U'-V' gleich oder unterschiedlich sind und aus Wasserstoff, aus einer gesättigten aliphatischen, heteroaliphatischen oder aus einer Lacton- bzw. Thiolactongruppierung bestehen können.- U-V or U'-V 'are the same or different and made of hydrogen, from onesaturated aliphatic, heteroaliphatic or from a lactone orThiolactone grouping can exist.

In den Unteransprüchen 2-10 sind spezielle Ausführungsformen zu den Marker-Farbstoffen aufgeführt.In subclaims 2-10 are special embodiments of the marker dyeslisted.

Diese substituierten Indol-, Heteroindol-, Pyridin-, Chinolin- oder Acridinderivate der allgemeinen Formel Ia oder Ib oder Ic können als Farbstoffe zur optischen Markierung von organischen oder anorganischen Mikropartikeln, z. B. von Proteinen, Nucleinsäuren, DNA, biologische Zellen, Lipiden, Pharmaka oder organischen bzw. anorganischen polymerer Trägermaterialien verwendet werden.These substituted indole, heteroindole, pyridine, quinoline or acridine derivatives ofgeneral formula Ia or Ib or Ic can be used as dyes for optical markingof organic or inorganic microparticles, e.g. B. of proteins, nucleic acids,DNA, biological cells, lipids, pharmaceuticals or organic or inorganicpolymeric carrier materials are used.

Die Markierung der Partikel kann dabei durch die Ausbildung von ionischen Wechselwirkungen zwischen den Markern der allgemeinen Formeln Ia oder Ib oder Ic und dem zu markierenden Materialien erfolgen.The marking of the particles can be done by the formation of ionicInteractions between the markers of the general formulas Ia or Ib or Ic andthe materials to be marked.

Die gegenüber Nucleophilen aktivierten funktionellen Gruppen dieser Marker vermögen kovalent an eine OH-, NH₂- oder SH-Funktion zu koppeln. Somit entsteht ein System zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von organischen und anorganischen Materialien, wie den besagten Proteinen, Nucleinsäuren, DNA, biologische Zellen, Lipiden, Pharmaka oder organischen bzw. anorganischen Polymeren.The functional groups of these markers activated against nucleophiles are able to covalently couple to an OH, NH₂ or SH function. This creates a system for the qualitative or quantitative determination of organic and inorganic materials, such as said proteins, nucleic acids, DNA, biological cells, lipids, pharmaceuticals or organic or inorganic polymers.

Diese Kopplungsreaktion kann in wäßriger oder überwiegend wäßriger Lösung und vorzugsweise bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Dabei entsteht ein Konjugat mit fluoreszenten Eigenschaften.This coupling reaction can be carried out in aqueous or predominantly aqueous solution andpreferably be carried out at room temperature. This creates a conjugate withfluorescent properties.

Sowohl die Verbindungen der allgemeinen Formeln Ia oder Ib oder Ic und davon abgeleitete Systeme können in optischen, insbesondere fluoreszenzoptischen, qualitativen und quantitativen Bestimmungsverfahren zur Diagnostik von Zelleigenschaften, in Biosensoren (point of care-Messungen), Erforschung des Genoms und in Miniaturisierungstechnologien eingesetzt werden. Typische Anwendungen erfolgen in der Zytometrie und Zellsortierung, der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS), im Ultra-High-Troughput-Screening (UHTS), bei der multicolor Fluoreszenz-in-situ- Hybridisierung (FISH) und in Mikroarrays (Genchips).Both the compounds of the general formulas Ia or Ib or Ic and the likederived systems can be used in optical, especially fluorescence-optical, qualitativeand quantitative determination methods for the diagnosis of cell properties, inBiosensors (point of care measurements), genome research and inMiniaturization technologies are used. Typical applications are in theCytometry and cell sorting, fluorescence correlation spectroscopy (FCS), inUltra-high throughput screening (UHTS), using multicolor fluorescence in situ Hybridization (FISH) and in microarrays (gene chips).

Durch die Darstellung von nichtsymmetrischen Polymethinen, die einerseits als terminale Funktion einen leicht derivatisierbaren Heterocyclus vom Typ der Pyridin-, Chinolin-, Indol-, Heteroindol- bzw. Acridinderivate sowie andererseits einen neuartigen 6-Ringheterocyclus aufweisen, werden insbesondere nachfolgende Vorteile erreicht:
Bereits Trimethine absorbieren im Spektralbereich < 650 nm und zeigen eine gegenüber den bisher bekannten Polymethinen mit Absorptionsmaxima < 650 nm (Penta- und Hepta­methine) eine wesentlich verbesserte photochemische und thermische Stabilität.The representation of non-symmetrical polymethines, which on the one hand have an easily derivatizable heterocycle of the pyridine, quinoline, indole, heteroindole or acridine derivative type and on the other hand a novel 6-ring heterocycle as terminal function, achieves the following advantages in particular:
Even trimethines absorb in the spectral range <650 nm and show a significantly improved photochemical and thermal stability compared to the previously known polymethines with absorption maxima <650 nm (penta- and hepta methines).

Durch "molecular engineering" ist es möglich, Lage und Intensität der Absorptions- und Emissionsmaxima beliebig zu steuern und den Emissionswellenlängen unterschiedlicher Anregungslaser, vor allem NIR-Laserdioden, anzupassen.By "molecular engineering" it is possible to position and intensity of the absorption andControl emission maxima as desired and different emission wavelengthsAdapt excitation lasers, especially NIR laser diodes.

Bedingt durch die Auswahl geeigneter terminaler Heterocyclen zeigen die erfindungsgemäßen Farbstoffe zusätzliche Absorptionsmaxima im sichtbaren bzw. NIR-Spektralbereich, die zur Anregung, beispielsweise mit einem Argon-Laser genutzt werden können. Diese Farbstoffe sind insbesondere zur Anwendung in "multiple color fluorescence assay's" geeignet.Due to the selection of suitable terminal heterocycles, theDyes according to the invention additional absorption maxima in the visible or NIRSpectral range that are used for excitation, for example with an argon lasercan. These dyes are particularly suitable for use in "multiple colorfluorescence assay's ".

Die Marker-Farbstoffe sind durch relativ einfache und in zwei Stufen durchzuführende Synthese herstellbar, mit welcher eine Vielzahl unterschiedlich funktionalisierter Farbstoffe, beispielsweise hinsichtlich der Gesamtladung des Farbstoffes und der Anzahl, Spezifität und Reaktivität der zur Immobilisierung genutzten aktivierten Gruppen, anwendungsspezifisch zur Verfügung gestellt werden kann.The marker dyes are relatively simple and can be carried out in two stagesSynthesis can be produced with which a multitude of differently functionalizedDyes, for example with regard to the total charge of the dye and the number,Specificity and reactivity of the activated groups used for immobilization,can be made available on an application-specific basis.

Die Erfindung soll nachstehend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.The invention will be described below with reference to the drawingEmbodiments are explained in more detail.

Es zeigen:Show it:

Fig. 1 Synthesen gemäß Ausführungsbeispiel 1 und 2Fig. 1 syntheses according to Embodiment 1 and 2

Fig. 2 Synthese gemäß Ausführungsbeispiel 3Fig. 2 Synthesis according to Embodiment 3

Fig. 3 Synthesen gemäß Ausführungsbeispiel 4 bis 6Fig. 3 syntheses according to Embodiment 4 to 6

Fig. 4 Synthesen gemäß Ausführungsbeispiel 7 und 8Fig. 4 syntheses according to Embodiment 7 and 8

Fig. 5 Absorptionsspektrum von C 1601Fig. 5 absorption spectrum of C 1601

Fig. 6 Emissionsspektrum von C 1601 (frei, gebunden, 670 nm Diodenlaser)Fig. 6 emission spectrum of C 1601 (free, bound, diode laser 670 nm)

Fig. 7 Synthesen gemäß Ausführungsbeispiel 11 und 12Fig. 7 syntheses according to Embodiment 11 and 12

Fig. 8 Synthesen gemäß Ausführungsbeispiel 13 und 14Fig. 8 syntheses according to Embodiment 13 and 14

Fig. 9 Absorptionsspektrum von C 1591 - NHS-esterFig. 9 absorption spectrum of C 1591 - NHS ester

Fig. 10 Emissionsspektrum von C 1591 (frei, gebunden, 670 nm Diodenlaser)Fig. 10 emission spectrum of C 1591 (free, combined and 670 nm diode laser)

Fig. 11 Emissionsspektrum von C 1591 (frei, gebunden, 488 nm Ar-Jonenlaser)Fig. 11 emission spectrum of C 1591 (free, combined and 488 nm Ar laser Jonen)

Fig. 12 Synthesen gemäß Ausführungsbeispiel 19 und 20Fig. Syntheses 12 according to Embodiment 19 and 20

Allgemeine Vorschrift zur Darstellung von 3.1-verbrückten 2-(2-Ethoxyethenyl)-7-diethylamino-benzo[b]pyrylium perchloraten C 1595 und L 107, vgl.Fig. 1General instructions for the preparation of 3.1-bridged 2- (2-ethoxyethenyl) -7-diethylamino-benzo [b] pyrylium perchlorates C 1595 and L 107, cf.Fig. 1

0,01 mol von einem 2-Methylen-7-diethylamin-benzo[b]pyrylium perchlorat der Formel 1a oder 1b werden in 40 ml Acetanhydrid gelöst und mit 2,0 g Triethoxymethan kurz erhitzt. Der nach ca. einer Stunde ausfallende Niederschlag wird abgesaugt und aus Eisessig umkristallisiert.0.01 mol of a 2-methylene-7-diethylamine-benzo [b] pyrylium perchlorate of the formula 1aor 1b are dissolved in 40 ml acetic anhydride and briefly heated with 2.0 g triethoxymethane.The precipitate that falls out after about an hour is filtered off and extracted from glacial acetic acidrecrystallized.

1: 6-Diethylamino-4-ethoxymethylen-1.2.3.4-tetrahydro-<dibenzo[b,e]pyrylium< perchlorat C 15951: 6-diethylamino-4-ethoxymethylene-1.2.3.4-tetrahydro- <dibenzo [b, e] pyrylium <perchlorate C 1595

3,58 g (87%) Ausbeute, 178°C Schmelzpunkt. -¹H NMR (CDCl₃): 1.29 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.42 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.78-1.82 (m, 2H), 2.54 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.75 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 3.59 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 4.53 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 6.93 (dd, J = 2.3, J = 9.3 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.84 (s, 1H), 8.52 (s, 1H). -¹³C NMR (CDCl₃): 12.5, 15.6, 20.2, 21.8, 27.8, 45.8, 73.1, 97.1, 108.3, 115.4, 115.8, 120.3, 130.6, 145.6, 154.8, 157.8, 163.0, 167.9. -C₂₀H₂₆ClNO₆ (411.88): ber. C 58.32, H 6.36, Cl 8.61, N 3.40, gef. C 57.75, H 6.58, Cl 8.43, N 3.46.3.58 g (87%) yield, 178 ° C melting point. -¹ H NMR (CDCl₃ ): 1.29 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.42 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.78-1.82 (m, 2H), 2.54 (t, J = 6.0 Hz , 2H), 2.75 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 3.59 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 4.53 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 6.93 (dd, J = 2.3, J = 9.3 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.84 (s, 1H), 8.52 (s, 1H). -¹³ C NMR (CDCl₃ ): 12.5, 15.6, 20.2, 21.8, 27.8, 45.8, 73.1, 97.1, 108.3, 115.4, 115.8, 120.3, 130.6, 145.6, 154.8, 157.8, 163.0, 167.9. -C₂₀ H₂₆ ClNO₆ (411.88): calc. C 58.32, H 6.36, Cl 8.61, N 3.40, found. C 57.75, H 6.58, Cl 8.43, N 3.46.

2: 3-Diethylamino-6-ethoxymethylen-7.8.9.10-tetrahydro-6H-<5-oxonia-cyclohepta[b]-naphthalen< perchlorat L 1072: 3-diethylamino-6-ethoxymethylene-7.8.9.10-tetrahydro-6H- <5-oxonia-cyclohepta [b] -naphthalene <perchlorate L 107

3,96 g (93%) Ausbeute, 158-60°C Schmelzpunkt. -¹H NMR (CDCl₃): 1.27 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.39 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.75-1.77 (m, 2H), 1.85-1.87 (m, 2H), 2.58-2.61 (m, 2H), 2.79-2.83 (m, 2H), 3.58 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 4.56 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 6.99 (dd, J = 2.4, J = 9.3 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 7.60 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 8.00 (s, 1H), 8.18 (s, 1H). -¹³C NMR (CDCl₃): 12.5, 15.5, 21.1, 23.8, 25.1, 29.2, 45.8, 72.4, 96.3, 113.2, 116.1, 116.3, 124.2, 130.8, 149.0, 155.0, 157.9, 162.8, 171.0. -C₂₁H₂₈ClNO₆ (425.91): ber. C 59.22, H 6.63, Cl 8.32, N 3.29, gef. C 58.76, H 6.39, Cl 8.75, N 3.34.3.96 g (93%) yield, 158-60 ° C melting point. -¹ H NMR (CDCl₃ ): 1.27 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.39 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.75-1.77 (m, 2H), 1.85-1.87 (m, 2H) , 2.58-2.61 (m, 2H), 2.79-2.83 (m, 2H), 3.58 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 4.56 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 6.99 (dd, J = 2.4 , J = 9.3 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 8.00 (s, 1H), 8.18 (s, 1H). -¹³ C NMR (CDCl₃ ): 12.5, 15.5, 21.1, 23.8, 25.1, 29.2, 45.8, 72.4, 96.3, 113.2, 116.1, 116.3, 124.2, 130.8, 149.0, 155.0, 157.9, 162.8, 171.0. -C₂₁ H₂₈ ClNO₆ (425.91): calc. C 59.22, H 6.63, Cl 8.32, N 3.29, found. C 58.76, H 6.39, Cl 8.75, N 3.34.

3: 3-Diethylamino-6-[3-(N-acetylanilino)-prop-2 yliden]-7.8.9.10-tetrahydro-6H-<5-oxonia-cyclohepta[b]naphthalen< perchlorat C 1590, vgl.Fig. 23: 3-Diethylamino-6- [3- (N-acetylanilino) prop-2 ylidene] -7.8.9.10-tetrahydro-6H- <5-oxonia-cyclohepta [b] naphthalene <perchlorate C 1590, cf.Fig. 2

2,13 g (0,005 mol) 2-Methylen-7-diethylamin-benzo[b]pyrylium perchlorat der Formel 1b werden in 40 ml Acetanhydrid gelöst und mit 1,29 g (0,005 mol) (3-Anilinopropenyliden)-phenyl-ammoniumchlorid kurz erhitzt. Der nach ca. einer Stunde ausfallende Niederschlag wird abgesaugt, mit Ether gewaschen und aus Eisessig umkristallisiert: 2,00 g (74%) Ausbeute, 216-20°C Schmelzpunkt. -¹H NMR (CD₃NO₂): 1.34 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.64- 1.69 (m, 2H), 1.82-1.87 (m, 2H), 2.00 (s, 3H), 2.49 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.89 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.72 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 5.61 (dd, J = 11.8 Hz, J = 13.5 Hz, 1 H), 7.04 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.32 (dd, J = 2.4 Hz, J = 9.4 Hz, 1H), 7.36-7.39 (m, 2H), 7.54-7.65 (m, 4H), 8.21 (s, 1H), 8.27 (d, J = 13.5 Hz, 1H). -¹³C NMR (CD₃NO₂): 12.8, 23.5, 25.2, 25.8, 25.9, 30.4, 47.2, 96.2, 109.9, 119.0, 119.3, 127.4, 129.9, 130.6, 130.7, 131.7, 132.0, 132.5, 140.1, 142.2, 151.3, 157.2, 160.1, 169.7, 171.2. -C₂₉H₃₃ClN₂O₆ (541.04): ber. C 64.38, H 6.15, Cl 6.55, N 5.18, gef. C 63.73, H 6.15, Cl 6.81, N 5.07.2.13 g (0.005 mol) of 2-methylene-7-diethylamine-benzo [b] pyrylium perchlorate of the formula 1b are dissolved in 40 ml of acetic anhydride and with 1.29 g (0.005 mol) of (3-anilinopropenylidene) - phenylammonium chloride heated briefly. The precipitate which separates out after about one hour is filtered off with suction, washed with ether and recrystallized from glacial acetic acid: 2.00 g (74%) yield, 216-20 ° C. melting point. -¹ H NMR (CD₃ NO₂ ): 1.34 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.64- 1.69 (m, 2H), 1.82-1.87 (m, 2H), 2.00 (s, 3H), 2.49 ( t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.89 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.72 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 5.61 (dd, J = 11.8 Hz, J = 13.5 Hz, 1 H ), 7.04 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.32 (dd, J = 2.4 Hz, J = 9.4 Hz, 1H), 7.36-7.39 (m, 2H), 7.54-7.65 (m, 4H), 8.21 (s, 1H), 8.27 (d, J = 13.5 Hz, 1H). -¹³ C NMR (CD₃ NO₂ ): 12.8, 23.5, 25.2, 25.8, 25.9, 30.4, 47.2, 96.2, 109.9, 119.0, 119.3, 127.4, 129.9, 130.6, 130.7, 131.7, 132.0, 132.5, 140.1, 142.2 , 151.3, 157.2, 160.1, 169.7, 171.2. -C₂₉ H₃₃ ClN₂ O₆ (541.04): calc. C 64.38, H 6.15, Cl 6.55, N 5.18, found. C 63.73, H 6.15, Cl 6.81, N 5.07.

Allgemeine Vorschrift zur Darstellung von 3.1-verbrückten 2-[6-(N acetylanilino)-hexatrien-1.3.5 yliden]-benzo[b]pyrylium und thiopyrylium perchloraten C 1586, C 1573 und C 1574, vgl.Fig. 3General instructions for the preparation of 3.1-bridged 2- [6- (N acetylanilino) hexatriene-1.3.5 ylidene] benzo [b] pyrylium and thiopyrylium perchlorates C 1586, C 1573 and C 1574, cf.Fig. 3

0,005 mol von einem 2-Methylen-7-diethylamin-benzo[b]-pyrylium perchlorat der Formel 1a, 1b oder ein 2-Methylen-4.6-diphenyl-thiopyrylium perchlorat der Formel 1c werden in 40 ml Acetanhydrid gelöst und mit 1,42 g (0,005 mol) (5-Anilinopenta-2.4-dienyliden)-phenyl-ammonium chlorid kurz erhitzt. Der nach ca. einer Stunde ausfallende Niederschlag wird abgesaugt, mit Ether gewaschen und aus Eisessig umkristallisiert.0.005 mol of a 2-methylene-7-diethylamine-benzo [b] pyrylium perchlorate of the formula1a, 1b or a 2-methylene-4,6-diphenyl-thiopyrylium perchlorate of formula 1c are in40 ml acetic anhydride dissolved and with 1.42 g (0.005 mol) (5-anilinopenta-2.4-dienylidene) -phenyl-ammonium chloride heated briefly. Precipitation after about an houris filtered off, washed with ether and recrystallized from glacial acetic acid.

4: 6-Diethylamino-4-[5-(N Acetylanilino)-penta-2.4-dienyliden]-1.2.3.4.-tetrahydro-<dibenzo[b;e]pyrylium<perchlorat C 15864: 6-diethylamino-4- [5- (N acetylanilino) penta-2,4-dienylidene] -1.2.3.4.-tetrahydro-<dibenzo [b; e] pyrylium <perchlorate C 1586

2,65 g (96%) Ausbeute, 246-48°C Schmelzpunkt. -¹H NMR (CD₃NO₂): 1.34 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.84-1.88 (m, 2H), 2.08 (s, 3H), 2.67 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.85 (t, J = 6 Hz, 2H), 3.72 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 5.38 (dd, J = 11.4 Hz, J = 13.8 Hz, 1H), 6.55 (dd, J = 11.9 Hz, J = 14.3 Hz, 1 H), 7.00-7.08 (m, 2H), 7.27-7.33 (m, 3H), 7.56-7.62 (m, 3H), 7.71-7.75 (m, 2H), 8.00 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 8.12 (s, 1H). -C₃₀H₃₃ClN₂O₆ (553.05): ber. C 65.15, H 6.01, Cl 6.41, N 5.07, gef. C 63.57, H 6.08, Cl 6.14, N 4.92.2.65 g (96%) yield, 246-48 ° C melting point. -¹ H NMR (CD₃ NO₂ ): 1.34 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.84-1.88 (m, 2H), 2.08 (s, 3H), 2.67 (t, J = 5.7 Hz, 2H) , 2.85 (t, J = 6 Hz, 2H), 3.72 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 5.38 (dd, J = 11.4 Hz, J = 13.8 Hz, 1H), 6.55 (dd, J = 11.9 Hz , J = 14.3 Hz, 1 H), 7.00-7.08 (m, 2H), 7.27-7.33 (m, 3H), 7.56-7.62 (m, 3H), 7.71-7.75 (m, 2H), 8.00 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 8.12 (s, 1H). -C₃₀ H₃₃ ClN₂ O₆ (553.05): calc. C 65.15, H 6.01, Cl 6.41, N 5.07, found. C 63.57, H 6.08, Cl 6.14, N 4.92.

5: 3-Diethylamino-6-[5-(N-acetylanilino)-penta-2.4-dienylidene]-7.8.9.10-tetrahydro-6H-<5-oxonia-cyclohepta[b]naphthalen< perchlorat C 15735: 3-diethylamino-6- [5- (N-acetylanilino) penta-2.4-dienylidenes] -7.8.9.10-tetrahydro-6H-<5-oxonia-cyclohepta [b] naphthalene <perchlorate C 1573

2,61 g (92%) Ausbeute, 202°C Schmelzpunkt. -¹H NMR (CD₃NO₂): 1.36 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.78-1.82 (m, 2H), 1.90-1.94 (m, 2H), 2.01 (s, 3H), 2.76 (t, J = 6 Hz, 2H), 2.95 (t, J = 6 Hz, 2H), 3.75 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 5.39 (dd, J = 11.3 Hz, J = 13.9 Hz, 1H), 6.57 (dd, J = 11.9 Hz, J = 14.3 Hz, 1H), 6.98-7.06 (m, 2H), 7.32-7.36 (m, 3H), 7.52-7.63 (m, 4H), 7.77 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 8.22 (s, 1H). -¹³C NMR (CD₃NO₂): 12.3, 22.9, 25.2, 25.5, 25.7, 30.2, 46.8, 95.7, 114.5, 118.7, 119.1, 126.0, 127.7, 129.7, 130.1, 131.1, 131.5, 132.1, 137.8, 140.1, 142.1, 144.4, 150.8, 156.9, 159.8, 169.3, 170.3. -C₃₁H₃₅ClN₂O₆ (567.08): ber. C 65.66, H 6.22, Cl 6.25, N 4.94, gef. C 64.42, H 6.27, Cl 6.13, N 4.78.2.61 g (92%) yield, 202 ° C melting point. -¹ H NMR (CD₃ NO₂ ): 1.36 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.78-1.82 (m, 2H), 1.90-1.94 (m, 2H), 2.01 (s, 3H), 2.76 ( t, J = 6 Hz, 2H), 2.95 (t, J = 6 Hz, 2H), 3.75 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 5.39 (dd, J = 11.3 Hz, J = 13.9 Hz, 1H) , 6.57 (dd, J = 11.9 Hz, J = 14.3 Hz, 1H), 6.98-7.06 (m, 2H), 7.32-7.36 (m, 3H), 7.52-7.63 (m, 4H), 7.77 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 8.22 (s, 1H). -¹³ C NMR (CD₃ NO₂ ): 12.3, 22.9, 25.2, 25.5, 25.7, 30.2, 46.8, 95.7, 114.5, 118.7, 119.1, 126.0, 127.7, 129.7, 130.1, 131.1, 131.5, 132.1, 137.8, 140.1 , 142.1, 144.4, 150.8, 156.9, 159.8, 169.3, 170.3. -C₃₁ H₃₅ ClN₂ O₆ (567.08): calc. C 65.66, H 6.22, Cl 6.25, N 4.94, found. C 64.42, H 6.27, Cl 6.13, N 4.78.

6: 8-[5-(N Acetylanilino)-penta-2.4-dienylidene]-2.4-diphenyl-5.6.7.8-tetrahydro-<benzo[b]thiopyrylium< perchlorat C 15746: 8- [5- (N acetylanilino) penta-2,4-dienylidenes] -2,4-diphenyl-5.6.7.8-tetrahydro-<benzo [b] thiopyrylium <perchlorate C 1574

2,37 g (79%) Ausbeute, 216-18°C Schmelzpunkt. -C₃₄H₃₀ClNO₅S (600.13): ber. C 68.05, H 5.04, Cl 5.91, N 2.33, 5 5.34, gef. C 67.34, H 5.03, Cl 5.67, N 2.24, S 5.18.2.37 g (79%) yield, 216-18 ° C melting point. -C₃₄ H₃₀ ClNO₅ S (600.13): calc. C 68.05, H 5.04, Cl 5.91, N 2.33, 5 5.34, found. C 67.34, H 5.03, Cl 5.67, N 2.24, S 5.18.

Allgemeine Vorschrift zur Darstellung von 3.1-verbrückten 7-Diethylamino-2-[3-(1-alkyl-3.3-dimetyl-1.3-dihydro-indol-2-yliden)-propen-1-yl]-benzo[b]pyrylium perchloraten C 1592 und C 1601, vgl.Fig. 4General instructions for the preparation of 3.1-bridged 7-diethylamino-2- [3- (1-alkyl-3,3-dimethyl-1,3-dihydro-indol-2-ylidene) propen-1-yl] benzo [b] pyrylium perchlorates C 1592 and C 1601, cf.Fig. 4

In einer ersten Variante werden 0,005 mol von einem Indolderivat 2a bzw. 2b (Mujumdar, R. T.; Ernst, L. A.; Mujumdar, S. R.; Lewis, C. J.; Waggoner, A. S.: Bioconjugate Chem. 1993, 4, 105) zusammen mit 2,13 g (0,005 mol) L 107 in 30 ml Acetanhydrid und 10 Tropfen Piperidin für ca. zehn Minuten unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wird das Rohprodukt mit Ethylether gefällt und durch Säulenchromatographie (Silicagel, Methanol/Aceton 1 : 1) gereinigt.In a first variant, 0.005 mol of an indole derivative 2a or 2b (Mujumdar,R. T .; Ernst, L. A .; Mujumdar, S. R .; Lewis, C. J .; Waggoner, A. S .: Bioconjugate Chem.1993, 4, 105) together with 2.13 g (0.005 mol) L 107 in 30 ml acetic anhydride and 10Drop of piperidine heated under reflux for about ten minutes. After cooling downthe crude product is precipitated with ethyl ether and by column chromatography (silica gel,Methanol / acetone 1: 1) cleaned.

In einer zweiten Variante kommen (wie inFig. 4 angedeutet) anstelle von L 107 2,13 g (0,005 mol) von einem Perchlorat 3b (Kanitz, A.; Hartmann, H.; Czerney, P.: J. Prakt. Chem. 1998, 340, 34) zur Anwendung. Dabei ist es notwendig, die Reaktionszeit um ca. zehn Minuten zu erhöhen.In a second variant (as indicated inFIG. 4), instead of L 107, 2.13 g (0.005 mol) come from a perchlorate 3b (Kanitz, A .; Hartmann, H .; Czerney, P .: J. Prakt. Chem 1998, 340, 34) for use. It is necessary to increase the response time by about ten minutes.

7: 3-Diethylamino-6-[2-(1-n-butyl-3.3-dimethyl-1.3-dihydro-indol-2-yliden)-ethylidenl]-7.8.9.10-tetrahydro-6H-<5-oxonia-cyclohepta[b]naphthalen< perchlorat C 15927: 3-diethylamino-6- [2- (1-n-butyl-3,3-dimethyl-1,3-dihydro-indol-2-ylidene) ethylidene] -7.8.9.10-tetrahydro-6H- <5-oxonia-cyclohepta [b] naphthalene <perchlorate C 1592

1,87 g (63%) Ausbeute/Variante A, 1,34 g (45%) Ausbeute/Variante B, 216-18°C Schmelz­punkt. -HRMS-FAB (C₃₄H₄₃N₂O): ber. 495.337539; gef. 495.335970; D = 1.569 mmU.1.87 g (63%) yield / variant A, 1.34 g (45%) yield / variant B, 216-18 ° C melting point. -HRMS-FAB (C₃₄ H₄₃ N₂ O): calc. 495.337539; found 495.335970; D = 1,569 mmU.

8: 3-Diethylamino-6-<2-[1-(4-sulfonatobutyl)-3.3-dimethyl-5-sulfonato-1.3-dihydro-indol-2-yliden]-ethylidenl<-7.8.9.10-tetrahydro-6H-<5-oxonia-cyclohepta[b]naphthalen<kali­um C 16018: 3-diethylamino-6- <2- [1- (4-sulfonatobutyl) -3.3-dimethyl-5-sulfonato-1.3-dihydro-indole-2-ylidene] -ethylidenl <-7.8.9.10-tetrahydro-6H- <5-oxonia-cyclohepta [b] naphthalene <kaliaround C 1601

1,25 g (36%) Ausbeute, 216-18°C Schmelzpunkt - HRMS-FAB (C₃₄H₄₂KN₂O₇S₂): ber. 693.207053; gef. 693.203060; D = 3.99 mmU.1.25 g (36%) yield, 216-18 ° C melting point - HRMS-FAB (C₃₄ H₄₂ KN₂ O₇ S₂ ): calc. 693.207053; found 693.203060; D = 3.99 mmU.

9: Absorptionsspektren von C 16019: Absorption spectra of C 1601

Fig. 5 zeigt das Absorptionsspektrum von C 1601 in reinem PBS (Phosphate Buffer Saline) und nach der Zugabe von Albumin aus Humanserun (HSA).Fig. 5 shows the absorption spectrum of C in 1601 in pure PBS (Phosphate Buffer Saline), and after the addition of albumin from Humanserun (HSA).

10: Fluoreszenzspekten von C 160110: Fluorescence spectra of C 1601

Fig. 6 zeigt die Emissionsspektren von C 1601 (angeregt durch einen 670 nm Diodenlaser) in reinem PBS und nach der Zugabe von HSA. Die Intensität der Fluoreszenz hat sich nach der Zugabe von HSA um den Faktor fünf verstärkt.Fig. 6 shows the emission spectra of C 1601 (excited by a 670 nm diode laser) in pure PBS and, after addition of HSA. The intensity of the fluorescence increased by a factor of five after the addition of HSA.

Allgemeine Vorschrift zur Darstellung von 3.1-verbrückten 7-Diethylamino-2-[3-(1-(5-carboxypentyl-3.3-dimetyl-5-sulfonato-1.3-dihydro-indol-2-yliden)-propen-1-yl]-benzo[b]-pyrylium perchloraten C 1602 und C 1591, vgl.Fig. 7General instructions for the preparation of 3.1-bridged 7-diethylamino-2- [3- (1- (5- carboxypentyl-3.3-dimetyl-5-sulfonato-1.3-dihydro-indol-2-ylidene) -propen-1-yl] -benzo [b] - pyrylium perchlorates C 1602 and C 1591, seeFig. 7

1,77 g (0,005 mol) von einem Indolderivat 2c (Mujumdar, R. T.; Ernst, L. A.; Mujumdar, S. R.; Lewis, C. J.; Waggoner, A. S.: Bioconjugate Chem. 1993, 4, 105) und 0,005 mol C 1595 bzw. L 107 werden in 40 ml einer Mischung aus Pyridin/Acetanhydrid (1/1) für ca. zehn Minuten unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wird das Rohprodukt mit Ethylether gefällt und durch Säulenchromatographie (Silicagel, Methanol) gereinigt.1.77 g (0.005 mol) of an indole derivative 2c (Mujumdar, R. T .; Ernst, L. A .; Mujumdar,S. R .; Lewis, C. J .; Waggoner, A. S .: Bioconjugate Chem. 1993, 4, 105) and 0.005 molC 1595 or L 107 are in 40 ml of a mixture of pyridine / acetic anhydride (1/1) for approx.heated under reflux for ten minutes. After cooling, the raw product is withEthyl ether precipitated and purified by column chromatography (silica gel, methanol).

11: 6-Diethylamino-4-<2-[1-(5-carboxypentyl)-3.3-dimethyl-5-sulfonato-1.3-dihydro­indol-2-yliden]-ethylidenl<-1.2.3.4-tetrahydro-<dibenzo[b;e]pyrylium< betain C 160211: 6-Diethylamino-4- <2- [1- (5-carboxypentyl) -3.3-dimethyl-5-sulfonato-1.3-dihydroindol-2-ylidene] -ethylidenl <-1.2.3.4-tetrahydro- <dibenzo [b; e] pyrylium <betaine C 1602

2,20 g (71%) Ausbeute, <310°C Schmelzpunkt. -C₃₅H₄₄KN₂O₇S (657.89.H₂O): ber. C 62.20, H 6.56, N 4.14, S 4.74, gef. C 61.74, H 6.53, N 4.06, S 4.26. - HRMS-FAB (C₃₅H₄₃N₂O₆S): ber. 619.284184; gef. 619.286390; D = -2.205 mmU.2.20 g (71%) yield, <310 ° C melting point. -C₃₅ H₄₄ KN₂ O₇ S (657.89.H₂ O): calc. C 62.20, H 6.56, N 4.14, S 4.74, found. C 61.74, H 6.53, N 4.06, S 4.26. HRMS-FAB (C₃₅ H₄₃ N₂ O₆ S): calc. 619.284184; found 619.286390; D = -2.205 mmU.

12: 3-Diethylamino-6-<2-[1-(5-carboxypentyl)-3.3-dimethyl-5-sulfonato-1.3-dihydro­indol-2-yliden]-ethylidenl<-7.8.9.10-tetrahydro-6H-<5-oxonia-cyclohepta[b]naphthalen< betain C 159112: 3-Diethylamino-6- <2- [1- (5-carboxypentyl) -3,3-dimethyl-5-sulfonato-1,3-dihydroindol-2-ylidene] -ethylidenl <-7.8.9.10-tetrahydro-6H- <5-oxonia-cyclohepta [b] naphthalene <betain C 1591

2,15 g (68%) Ausbeute, <340°C Schmelzpunkt. -C₃₆H₄₆KN₂O₇S (671.91. H₂O): ber. C 62.68, H 6.73, N 4.06, S 4.64, gef. C 62.37, H 6.61, N 4.07, S 4.34. - HRMS-FAB (C₃₆H₄₅N₂O₆S): ber. 633.299834; gef. 633.308710; D = -8.875 mmU.2.15 g (68%) yield, <340 ° C melting point. -C₃₆ H₄₆ KN₂ O₇ S (671.91. H₂ O): calc. C 62.68, H 6.73, N 4.06, S 4.64, found. C 62.37, H 6.61, N 4.07, S 4.34. HRMS-FAB (C₃₆ H₄₅ N₂ O₆ S): calc. 633.299834; found 633.308710; D = -8.875 mmU.

Allgemeine Vorschrift zur Darstellung von NHS-ester mit N-Hydroxysuccinimid (NHS)/N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), vgl.Fig. 8General instructions for the preparation of NHS esters with N-hydroxysuccinimide (NHS) /N.N'- dicyclohexylcarbodiimide (DCC), cf.Fig. 8

15 mg C 1602 bzw. C 1591, 14 mg DCC und 4 mg NHS werden in 1 ml trockenem DMF gelöst und mit 10 µl Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend filtriert. Nach dem Abziehen des Lösungs­mittels wird der Rückstand mit Ether gewaschen und am Ölpumpenvakuum getrocknet.15 mg C 1602 or C 1591, 14 mg DCC and 4 mg NHS are in 1 ml dry DMFdissolved and mixed with 10 ul triethylamine. The reaction mixture is at 24 hoursStirred at room temperature and then filtered. After removing the solutionthe residue is washed with ether and dried in an oil pump vacuum.

13: C 1602 NHS-ester13: C 1602 NHS ester

Die Reaktion verläuft quantitativ.The reaction is quantitative.

14: C 1591 NHS-ester14: C 1591 NHS ester

Die Reaktion verläuft quantitativ.The reaction is quantitative.

15: Kovalente Markierung von Albumin aus Humanserum (HSA) mit C 1591-NHS ester15: Covalent labeling of albumin from human serum (HSA) with C 1591-NHS ester

C 1591-NHS-ester (ca. 0,5 mg) werden in 50 µl DMF und 5 mg HSA in 750 µl Bicarbo­natpuffer (0.1 mol/l, pH = 9.0) gelöst. Beide Lösungen werden langsam vereint und 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das markierte HSA durch Gelchromatographie vom nicht gebundenen Farbstoff getrennt. Als stationäre Phase dient Sephadex G50, als Laufmittel Phosphatpuffer (22 mmol/l, pH 7.2).C 1591-NHS esters (approx. 0.5 mg) are dissolved in 50 µl DMF and 5 mg HSA in 750 µl bicarbonat buffer (0.1 mol / l, pH = 9.0) dissolved. Both solutions are slowly being combined and 20Stirred for hours at room temperature. Then the marked HSA is throughGel chromatography separated from the unbound dye. Serves as a stationary phaseSephadex G50, as eluent phosphate buffer (22 mmol / l, pH 7.2).

16: Absorptionsspektren von C 1591-Derivaten16: Absorption spectra of C 1591 derivatives

Fig. 9 zeigt das Absorptionsspektrum von einem aktivierten C 1591-NHS-ester und C 1591 kovalent gebunden an HSA. Als Lösungsmittel wurde für beide Messungen PBS (Phosphate Buffer Saline) verwendet.Fig. 9 shows the absorption spectrum of an activated C-1591 and C 1591 NHS ester covalently bound to HSA. PBS (phosphate buffer saline) was used as the solvent for both measurements.

17: Fluoreszenzspektren von C 1591 Derivaten17: Fluorescence spectra of C 1591 derivatives

Fig. 10 zeigt das Emissionsspektrum von einem aktivierten C 1591-NHS-ester und C 1591 kovalent gebunden ans HSA. Zur Anregung wurde ein 670 nm Diodenlaser (Spindler & Hoyer, Leistung max. 3 mW) verwendet. Als Lösungsmittel für beide Messungen diente PBS.Fig. 10 shows the emission spectrum of an activated C-1591 and C 1591 NHS ester covalently bound to the HSA. A 670 nm diode laser (Spindler & Hoyer, power max. 3 mW) was used for excitation. PBS was used as the solvent for both measurements.

18: Fluoreszenzspektren von C 1591 Derivaten18: Fluorescence spectra of C 1591 derivatives

Fig. 11 zeigt das Emissionsspektrum von einem aktivierten C 1591-NHS-ester und C 1591 kovalent gebunden an HSA. Zur Anregung wurde ein 488 nm Ar-Ionenlaser (Ion Laser Technology, Leistung max. 100 mW) verwendet. Als Lösungsmittel für beide Messungen diente PBS.Fig. 11 shows the emission spectrum of an activated C-1591 and C 1591 NHS ester covalently bound to HSA. A 488 nm Ar ion laser (Ion Laser Technology, max. Power 100 mW) was used for excitation. PBS was used as the solvent for both measurements.

19: 3-Diethylamino-6-<2-[1-(3-acetoxypropyl)-3.3-dimethyl-1.3-dihydro-indol-2-yliden]-ethylidenl<-7.8.9.10-tetrahydro-6H-<5-oxonia-cyclahepta[b]naphthalen< perchlorat C 1594, vgl.Fig. 1219: 3-Diethylamino-6- <2- [1- (3-acetoxypropyl) -3.3-dimethyl-1.3-dihydro-indol-2-ylidene] -ethylidenl <-7.8.9.10-tetrahydro-6H- <5-oxonia -cyclahepta [b] naphthalene <perchlorate C 1594, cf.Fig. 12

1,94 g (0,005 mol) 1-(1-Acetoxypropyl)-2.3.3-trimethyl-3H-indolinium iodid 2d (Brush et al.,US-PS 5 808 044) und 2,13 g (0,005 mol) L 107 werden in einer Mischung aus jeweils 20 ml Pyridin und 20 ml Acetanhydrid ca. 20 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wird die noch acetylierte Zwischenstufe mit Ether gefällt und im Vakuum getrocknet. Die Reinigung des Produktes erfolgt durch präparative Säulenchromatographie (Silicagel, Methanol). 0,87 g (29%) Ausbeute, 155-62°C Schmelzpunkt. - HRMS-FAB (C₃₅H₄₃N₂O₃): ber. 539.327368; gef. 539.328510; D = -1.142 mmU.1.94 g (0.005 mol) of 1- (1-acetoxypropyl) -2.3.3-trimethyl-3H-indolinium iodide 2d (Brush et al., U.S. Patent 5,808,044) and 2.13 g (0.005 mol) of L 107 are refluxed in a mixture of 20 ml pyridine and 20 ml acetic anhydride for about 20 minutes. After cooling, the still acetylated intermediate is precipitated with ether and dried in vacuo. The product is purified by preparative column chromatography (silica gel, methanol). 0.87 g (29%) yield, 155-62 ° C melting point. HRMS-FAB (C₃₅ H₄₃ N₂ O₃ ): calc. 539.327368; found 539.328510; D = -1,142 mmU.

20: Darstellung vom C 1594 phosphoramidit, vgl.Fig. 1220: Representation of C 1594 phosphoramidite, cf.Fig. 12

Zur Hydrolyse werden 200 mg C 1594 in 10 ml Methanol gelöst und unter Zugabe von 50 mg Natriumcarbonat zwei Stunden gerührt. Im Anschluß daran wird filtriert sowie der entacylierte Farbstoff durch Zugabe von Ether ausgefällt und getrocknet. Das erhaltene Produkt wird in trockenem DMF gelöst und mit 0.15 ml N.N-Diisopropylamin versetzt. Zu dieser Lösung gibt man im Verlauf einer Stunde dreimal je 40 µl 2-Cyanoethyl-N. N-Diisopropylchlorophosphoramidit. Dabei wird der Reaktionsverlauf dünnschichtchromato­graphisch verfolgt und nach quantitativem Ablauf der Reaktion das Produkt direkt zum Markieren von DNA eingesetzt.For the hydrolysis, 200 mg of C 1594 are dissolved in 10 ml of methanol and with the addition of50 mg of sodium carbonate stirred for two hours. Then it is filtered and thedeacylated dye precipitated by adding ether and dried. The receivedThe product is dissolved in dry DMF and 0.15 ml of N.N-diisopropylamine is added. Tothis solution is given three times in each hour 40 µl of 2-cyanoethyl-N. N-Diisopropylchlorophosphoramidite. The course of the reaction becomes thin-layer chromatographically followed and after quantitative reaction the product directly to theLabeling DNA used.

Claims (11)

Translated fromGerman

1. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe auf der Basis von Polymethinen, enthaltend substituierte Benzooxazol-, Benzothiazol-, 2,3,3-Trimethylindolenin-, das 2,3,3-Trimethyl-4,5-benzo-3H indolenin-, 2-und 4-Picolin-, Lepidin-, Chinaldin- sowie 9-Methylacridin­derivate der allgemeinen Formeln Ia oder Ib oder Ic
mit Z als
wobei

• - X bzw. Y für ein Element aus der Gruppe O, S, Se oder das Strukturelement N-alkyl oder C(alkyl)₂ steht,
• - n für die Zahlenwerte 1, 2 oder 3 steht,
• - R¹-R¹⁵ gleich oder unterschiedlich sind und Wasserstoff, ein oder mehrere Alkyl-, oder Aryl-, Heteroaryl- oder heterocycloaliphatische Reste, eine Hydroxy- oder Alkoxygruppe, eine alkylsubsituierte oder cyclische Aminfunktion sein können und/oder zwei ortho-ständige Reste, z. B. R² und R³, zusammen einen weiteren aromatischen Ring bilden können,
• - mindestens einer der Substituenten R¹-R¹⁵ einen ionisierbaren bzw. ionisierten Substituenten, wie SO₃, PO, COO, oder NR₃⁺, darstellen kann, der die hydrophilen Eigenschaften dieser Farbstoffe bestimmt,
• - mindestens einer der Substituenten R¹-R¹⁵ für eine reaktive Gruppe stehen kann, welche eine kovalente Verknüpfung des Farbstoffs mit den oben genannten Trägermolekülen ermöglicht und
• - U-V bzw. U'-V' gleich oder unterschiedlich sind und aus Wasserstoff, aus einer gesättigten aliphatischen, heteroaliphatischen oder aus einer Lacton- bzw. Thiolactongruppierung bestehen können.

1. Laser-compatible NIR marker dyes based on polymethines, containing substituted benzooxazole, benzothiazole, 2,3,3-trimethylindolenine, 2,3,3-trimethyl-4,5-benzo-3H indolenine -, 2- and 4-picoline, lepidine, quinaldine and 9-methylacridine derivatives of the general formulas Ia or Ib or Ic
with Z as
in which

• X or Y represents an element from the group O, S, Se or the structural element N-alkyl or C (alkyl)₂ ,
• - n stands for the numerical values 1, 2 or 3,
• - R¹ -R^{15 are the} same or different and can be hydrogen, one or more alkyl, or aryl, heteroaryl or heterocycloaliphatic radicals, a hydroxyl or alkoxy group, an alkyl-substituted or cyclic amine function and / or two ortho radicals , e.g. B. R² and R³ , together can form a further aromatic ring,
• at least one of the substituents R¹ -R^{15 can be} an ionizable or ionized substituent, such as SO₃ , PO, COO, or NR₃⁺ , which determines the hydrophilic properties of these dyes,
• - At least one of the substituents R¹ -R^{15 can represent} a reactive group which enables the dye to be covalently linked to the abovementioned carrier molecules, and
• - UV or U'-V 'are the same or different and can consist of hydrogen, a saturated aliphatic, heteroaliphatic or a lactone or thiolactone group.

2. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktive Gruppe aus folgenden Funktionalitäten ausgewählt ist: Isothiocyanate, Isocyanate, Monochlortriazine, Dichlortriazine, Aziridine, Sulfonylhalogenide, N-Hydroxysuccinimidester, Imido-Ester, Glyoxal oder Aldehyd für Amin- und Hydroxy-Funktionen bzw. Maleimide oder Iodacetamide für Thiol-Funktionen sowie Phosphoramidite für die Markierung der DNA oder RNA oder deren Bruchstücke.2. Laser-compatible NIR marker dyes according to claim 1, characterized in thatthat the reactive group is selected from the following functionalities: isothiocyanates,Isocyanates, monochlorotriazines, dichlorotriazines, aziridines, sulfonyl halides, N-Hydroxysuccinimide ester, imido ester, glyoxal or aldehyde for amine and hydroxyFunctions or maleimides or iodoacetamides for thiol functions as wellPhosphoramidites for labeling DNA or RNA or their fragments.3. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktive Gruppe über Spacer-Gruppen der allgemeinen Struktur -(CH₂)_m- am eigentlichen Chromophor gebunden ist, wobei m Werte von 1 bis 18 annehmen kann.3. Laser-compatible NIR marker dyes according to claim 1, characterized in that the reactive group via spacer groups of the general structure - (CH₂ )_m - is bound to the actual chromophore, where m can assume values from 1 to 18 .4. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktureinheit =CR₇- auch eine Verbrückung über vier-, fünf und sechsgliedrige Ringsysteme beinhaltet, wobei sich an dieser auch reaktive Gruppen befinden und die Substituenten A-G die gleiche Funktionalität wie die Substituenten R¹-R¹⁵ besitzen können.4. Laser-compatible NIR marker dyes according to claim 1, characterized in that the structural unit = CR₇ - also includes a bridging over four, five and six-membered ring systems, which are also reactive groups and the substituents AG can have the same functionality as the substituents R¹ -R¹⁵ .5. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktureinheit =CR₇-(n = 2) für
steht.5. Laser-compatible NIR marker dyes according to claim 4, characterized in that the structural unit = CR₇ - (n = 2) for
stands.6. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktureinheit =CR₇-(n = 2) für
6. Laser-compatible NIR marker dyes according to claim 4, characterized in that the structural unit = CR₇ - (n = 2) for
steht.stands.7. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktureinheit =CR₇-(n = 3) für
steht.7. Laser-compatible NIR marker dyes according to claim 4, characterized in that the structural unit = CR₇ - (n = 3) for
stands.8. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktureinheit =CR₇-(n = 3) für
steht.8. Laser-compatible NIR marker dyes according to claim 4, characterized in that the structural unit = CR₇ - (n = 3) for
stands.9. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Substituenten A-C für O, S, C(CN)₂ bzw. N-R stehen, wobei R in N-R für einen aliphatischen oder aromatischen bzw. einem reaktiven aliphatischen oder aromatischen Rest, wie (CH₂)_nCOOH oder (CH₂)_nNH₂, stehen kann.9. Laser-compatible NIR marker dyes according to claim 4, characterized in that the substituents AC are O, S, C (CN)₂ or NR, where R in NR is an aliphatic or aromatic or a reactive aliphatic or aromatic radical, such as (CH₂ )_n COOH or (CH₂ )_n NH₂ .10. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Substituent D für Cl oder ein aromatisches bzw. aliphatisches Ringsystem steht, an dem gegebenenfalls reaktive Substituenten entsprechend den R¹ bis R¹⁵ angebracht sind.10. Laser-compatible NIR marker dyes according to claim 4, characterized in that the substituent D is Cl or an aromatic or aliphatic ring system, on which reactive substituents corresponding to R¹ to R^{15 are} attached, if appropriate.