Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Influenza A-Viren, die sowohl in ihrem Genom die entsprechenden (Fusions-)Gene, als auch in der Hülle ihrer Virionen vollständige Membran-verankerte fremde Glykoproteine oder auch Membran-verankerte beliebige Proteine zusätzlich zu ihren normalen Genen und Oberflächenproteinen enthalten. Die fremden Typ I-Glykoproteine können viralen, animalen oder humanen Ursprungs sein und werden unter Verwendung ihres eigenen Membransegments oder desjenigen vom Influenza-Hämagglutinin in die Virionhülle inkorporiert. Die gleiche Transmembrandomäne kann auch an den C-Terminus von anderen Proteine angekoppelt werden, die sich damit z. T. als artefizielle Membranproteine in der Virushülle verankern lassen. Technische Elemente dieser dem Bereich der Gentechnik zugehörigen Erfindung sind ferner ein indirekt wirkendes Selektionsverfahren (in zwei Ausführungen), mit dem rekombinante Viren stark angereichert werden können, welche ein beliebiges Fremdgen tragen (unabhängig von dessen Eigenschaften), sowie die Verwendung von Promotor-verstärkenden Mutanten und die Erzeugung von (rekombinanten) Influenza vRNA-Molekülen in vivo durch die zelluläre RNA-Polymerase I (beides Gegenstand der Patent-Anmeldung PCT 95/03663, G. Hobom et al. und Fa. Bayer AG).The invention relates to a method for producing recombinant influenza A viruses,the corresponding (fusion) genes in their genome, as well as in the shelltheir virions complete membrane-anchored foreign glycoproteins or membrane-veranchored any protein in addition to their normal genes and surface proteinscontain. The foreign type I glycoproteins can be viral, animal or humanBe of origin and will use their own membrane segment orthat of influenza hemagglutinin incorporated into the virion envelope. The sameThe transmembrane domain can also be coupled to the C-terminus of other proteinsbe the z. Let T. anchor as artificial membrane proteins in the virus envelope.Technical elements of this invention belonging to the field of genetic engineering are also aIndirect selection process (in two versions) with which recombinant virusescan be strongly enriched, which carry any foreign gene (regardless ofits properties), and the use of promoter-enhancing mutants and theGeneration of (recombinant) influenza vRNA molecules in vivo by the cellular RNA polymerase I (both the subject of patent application PCT 95/03663, G. Hobom et al. andBayer AG).
Präparationen rekombinanter Influenzaviren der beschriebenen Zusammensetzung (auch im Gemisch mehrerer Konstrukte) erfüllen die Kriterien von Lebendvakzinen für Influenza bei Mensch oder Tier, bzw. von Doppelvakzinen z. B. für Influenza-Viren und für Schweinepest-Viren bei gleichzeitiger Immunisierung beim Schwein usw. Andere Virus-Konstrukte mit fremden, besonders zellulären Glykoproteinen und ggf. einem weiteren zytotoxisch wirkenden Gen sind geeignet als Vektorsysteme in der Genetik und der somatischen Gentherapie.Preparations of recombinant influenza viruses of the described composition (also in theMixture of several constructs) meet the criteria of live vaccines for influenzaHuman or animal, or of double vaccines z. B. for influenza viruses and swine fever viruseswith simultaneous immunization in pigs etc. Other virus constructs withforeign, especially cellular glycoproteins and possibly another cytotoxicGenes are suitable as vector systems in genetics and somatic gene therapy.
1. Eine Reihe gut untersuchter Viren konnten bereits durch gezielte Eingriffe in Virus-Vektorsysteme für den Transfer von Fremdgenen verwandelt werden. Durch Deletion einiger jedenfalls unter Laborbedingungen entbehrlicher Gene hat man Platz für die Aufnahme der Fremdgene geschaffen, die während der Infektion (meist unter der Kontrolle von virusentlehnten Signalsequenzen) zusammen mit den Virus-eigenen Genen exprimiert werden. Neben den Verfahren zur rekombinanten Proteingewinnung wie z. B. durch Baculovirus-Vektoren (in Insekten bzw. Insektenzellen) dienen verschiedene Vektorsysteme abgeleitet von den Vaccinia, Herpes, Adeno- oder den Adeno-assoziierten Viren zum heterologen Gentransfer in die Zellen eines infizierten Organismus, bzw. in den letzteren Fällen auch zur in-vivo Gentherapie. Das Fremd-Gen ist in allen diesen Fällen jedoch im Virion nur als Gensequenz vorhanden und trifft erst nach der Infektion in den infizierten Zellen als Protein in Erscheinung. Neben den genannten DNA-Viren ist dieses Prinzip auch auf Retroviren (besonders abgeleitet vom murinen Moloney Leukämievirus MoLV) und auf RNA-Viren wie das Rabies-Virus (Schnell et al., 1994) oder das Masern Virus (Sidhu et al., 1995) oder übertragen worden. Während auch hier in aller Regel das heterologe Genprodukt nur in der infizierten Zelle in Erscheinung tritt, ist in einigen Fällen das Virus-eigene Glykoprotein durch das eines anderen Virus ersetzt worden, besonders im Falle von MoLV-Vektorsystemen deren env-Protein durch das Glykoprotein des Vesiculär-Stomatitis-Virus (VSV; Burns et al., 1993), was dann für das rekombinante Virus zu einem VSV-spezifischen Infektionsprozeß führt.1. A number of well-examined viruses have already been able to target the virus vectorsystems for the transfer of foreign genes are transformed. By deleting someat least under laboratory conditions of unnecessary genes there is room for the inclusion of theForeign genes created during infection (mostly under the control of virusborrowed signal sequences) are expressed together with the virus's own genes.In addition to the methods for recombinant protein production such. B. by Baculovirus Vekgates (in insects or insect cells) serve different vector systems derived fromthe vaccinia, herpes, adeno or adeno-associated viruses to the heterologousGene transfer into the cells of an infected organism, or in the latter case also for in vivo gene therapy. In all of these cases, however, the foreign gene is only present in the virionGene sequence is present and does not appear as a protein in the infected cells until after infectionAppearance. In addition to the DNA viruses mentioned, this principle is also applicable to retroviruses(especially derived from the murine Moloney leukemia virus MoLV) and on RNA viruses such asthe Rabies virus (Schnell et al., 1994) or the measles virus (Sidhu et al., 1995) orHave been transferred. While here too the heterologous gene product is usually only found in theinfected cell appears, in some cases the virus-inherent glycoproteinthat of another virus has been replaced, especially in the case of MoLV vector systems thereofenv protein by the glycoprotein of the vesicular stomatitis virus (VSV; Burns et al., 1993),which then leads to a VSV-specific infection process for the recombinant virus.
Dieses Prinzip der Vektor-Abwandlung von Virus-Grundstrukturen ist in der vorliegenden Erfindung übertragen worden auf Influenza A-Viren, und hier besonders auf die Expression von fremden Glykoproteinen, die nicht nur als Fremdgene in das Genom, sondern auch als heterologe Proteine zusätzlich zu den eigenen Proteinen Hämagglutinin und Neuraminidase in die Hülle (envelope) dieser Viren integriert werden können. Anders als bei den meisten Viren handelt es sich dabei um eine zusätzliche Aufnahme dieser fremden Gene und Proteine in den Virusverband, d. h. verbunden mit einer Ausweitung des Genoms und einer Veränderung ihrer Oberflächenstruktur. Damit sind rekombinante Viren dieses Aufbaus grundsätzlich als Doppel-(oder Mehrfach-)Vakzine geeignet - auch für eine nasale/orale Applikation - vorausgesetzt, sie lassen sich zuverlässig attenuieren (s. u.). Ein besonderer Vorteil liegt bei der Verwendung rekombinanter Influenzaviren darin, daß die hinzugefügten Fremdgene mit einer besonders starken Promotorvariante (1104; Neumann und Hobom, 1995) verknüpft werden können, die zu hohen Expressionsraten der Fremdproteine führt.This principle of vector modification of basic virus structures is in the presentInvention has been applied to influenza A viruses, and particularly expressionof foreign glycoproteins that not only enter the genome as foreign genes, but also asheterologous proteins in addition to its own proteins hemagglutinin and neuraminidase inthe envelope of these viruses can be integrated. Unlike most virusesis an additional inclusion of these foreign genes and proteins in theVirus association, d. H. associated with an expansion of the genome and a change in itsSurface structure. Recombinant viruses of this structure are therefore basically double(or multiple) vaccine suitable - also for nasal / oral application - provided that itcan be reliably attenuated (see below). A particular advantage is the userecombinant influenza viruses in that the added foreign genes with a particularstrong promoter variant (1104; Neumann and Hobom, 1995) can be linked to theleads to high expression rates of the foreign proteins.
2. Die Vakzinierung gegen Influenza A-Viren ist bisher auf inaktivierte bzw. durch Detergentien desintegrierte Viren (d. h. auf Proteingemische) abgestellt. Nach einer Injektion stimulieren diese Präparate eine B-Zell-Antwort mit Antikörperproduktion, jedoch (so gut wie) keine Reaktion der CD8-T Zellen, wie das bei einer normalen Infektion bzw. bei einer Lebend-Vakzinierung zusätzlich der Fall wäre. Auch ist bei der hierfür unphysiologischen Injektionsmethode zwar die Synthese von spezifischen IgG-Antikörpern im Serum, nicht jedoch die von sekretierten IgA-Molekülen im respiratorischen Trakt merklich erhöht, die auf der Oberfläche der Mucosa die erste Schutzfunktion ausüben. Und schließlich können die gegen ein "fixiertes" Hämagglutinin (auch wenn als Gemisch eingesetzt) gebildeten Antikörper die spätere Abwandlung der Virusstrukturen in ihrem "genetischen Drift" nicht vorwegnehmen, sie werden dadurch auch ihre Schutzwirkung im Serum gegen die stärkere Ausbreitung der Influenza-Infektion im Körper später wieder verlieren.2. The vaccination against influenza A viruses has so far been inactivated or throughDetergents disintegrated viruses (i.e. on protein mixtures) turned off. After an injectionthese preparations stimulate a B cell response with antibody production, however (as good as)no reaction of the CD8-T cells, like that with a normal infection or with a live vaccinationwould also be the case. It is also unphysiological for thisInjection method, the synthesis of specific IgG antibodies in the serum, nothowever, that of secreted IgA molecules in the respiratory tract increased markedlyperform the first protective function on the surface of the mucosa. And finally they canantibodies raised against a "fixed" hemagglutinin (even when used as a mixture)do not anticipate the later modification of the virus structures in their "genetic drift", they also become their protective effect in the serum against the greater spread ofLose influenza infection in the body again later.
Die gegenwärtig eingeführte Influenza-Vakzine ist damit anderen Virusvakzinen prinzipiell unterlegen, bei denen ein attenuiertes, lebendes Virus verwendet wird (z. B. bei der Polio-Vakzine), und bei denen durch eine (limitierte) virale Replikation und Proteinsynthese in den infizierten Zellen neben einer B-Zellen-Stimulation in MHC I-vermitteltem Kontakt auch die spezifischen T-Zellen-Reaktionen (CD4 und CD8) initiiert werden. Auch erfolgt die übliche Influenza-Immunisierung in einer unphysiologischen Weise, nämlich durch Injektionen, womit gegenüber der natürlichen Infektion in den Rachenschleimhaut-Zellen Gruppen von Lymphozyten in abweichender Lokalisation im Körper erreicht werden, was - nicht völlig verstanden - zu einer andersartigen B-Zellen-Antwort (z. B. im Verhältnis IgG zu IgA, s. o.) führt. Auch in anderen Fällen hat sich ein Immunisierungs-Modus möglichst nahe an der natürlichen Infektion bewährt, was im Falle der Influenza-Viren wie bei anderen Aerosol-Atemwegs-Infektionen auf eine nasal/orale Lebend-Vakzinierung verweist. Dieser Weg soll mit der vorliegenden Erfindung beschritten werden, und zwar auch als Doppel-Immunisierungs-Strategie, wenn z. B. beim Schwein zugleich gegen das Schweine-Influenzavirus und gegen das Schweine-Pestvirus, die beide auf aerogenem Wege übertragen werden, immunisiert wird. Hierzu werden erstmals fremd-virale Glykoproteine wie das Schweinepestvirus-Protein E2 in das Influenza-Virion vollständig und in (weitgehend) authentischer Konformation integriert, was für die Ausbildung der an den Oberflächen dieser Glykoproteine gelegenen (nicht-linearen) antigenen B-Zell-Epitope von Bedeutung ist. Zugleich sorgt die genetische Verankerung im Influenza-Genom dafür, daß diese Proteine in den abortiv infizierten Zellen nachgebildet werden und auf deren Oberfläche in gleicher Konformation erscheinen, was die B-Zellen-Reaktion weiter stimuliert, ergänzt ferner durch eine Stimulation der CD4-Helferzellen auf der Basis MHC I-präsentierter T-Zell-Epitope. - Bisher konnten genetisch-verankert nur kurzkettige Segmente fremder Proteine auf der Oberfläche von Influenza-Virionen präsentiert werden, und zwar integriert in Influenza-eigene Glykoproteine, besonders in den Stiel der Neuraminidase (Percy et al., 1995). Möglich war außerdem die für Immunisierungen jedoch ungeeignete Form der transienten Integration fremd-viraler Glykoproteine nach Virus-Doppelinfektionen bei dem sogenannten "phenotypic mixing".The currently introduced influenza vaccine is in principle other viral vaccinesinferred using an attenuated, live virus (e.g. polio vaccine),and in which a (limited) viral replication and protein synthesis in theinfected cells in addition to B-cell stimulation in MHC I-mediated contactspecific T cell reactions (CD4 and CD8) can be initiated. The usual is also doneInfluenza immunization in an unphysiological way, namely by injections, with whatagainst the natural infection in the pharynx mucosal cells groups ofLymphocytes in different locations can be reached in the body, which - not completelyunderstood - to a different B cell response (e.g. in the ratio IgG to IgA, see above)leads. In other cases too, an immunization mode has come as close as possible to thatproven natural infection, which in the case of influenza viruses as with other aerosolRespiratory tract infections indicate live nasal / oral vaccination. This way is supposed toof the present invention, also as a double immunization strastrategy if e.g. B. in pigs at the same time against the swine influenza virus and againstSwine plague virus, both of which are transmitted by an aerogenic route, is immunized.For the first time, foreign viral glycoproteins such as swine fever virus protein E2 inthe influenza virion completely and integrated in (largely) authentic conformation,what the formation of the (non-linear) on the surfaces of these glycoproteinsantigenic B cell epitopes is important. At the same time, the genetic anchoring in theInfluenza genome that these proteins reproduced in the abortively infected cellsand appear on their surface in the same conformation, which is the B cell reactionstimulated further, supplemented by stimulation of the CD4 helper cells on theBased on MHC I-presented T cell epitopes. - So far, only genetically-anchoredpresented short-chain segments of foreign proteins on the surface of influenza virionsare integrated into influenza-specific glycoproteins, especially in the stalk ofNeuraminidase (Percy et al., 1995). However, that for immunizations was also possibleunsuitable form of transient integration of foreign viral glycoproteins after virus duplicationinfections with the so-called "phenotypic mixing".
3. In der Vergangenheit sind attenuierte Varianten von Viren oft durch serielle Passagen unter marginalen Wachstumsbedingungen oder in unnatürlichen Wirtszellen, d. h. durch zufallsbedingte Mutations-, und unter unklaren Selektionsbedingungen erzeugt worden. Erst mit der reversen Genetik und jetzt durch gezielte gesetzte Mutationen können attenuierte Virus-Varianten in kontrollierter Weise aufgebaut werden, die dann jedoch wie früher auch auf die Auswirkung dieser Mutationen untersucht werden müssen, und zwar zunächst in der Zellkultur und im Tierversuch. Als attenuierte Influenza-Varianten für Impfstoffe sind bisher vor allem verschiedene (mehrfach) temperatursensitive Mutanten vorgeschlagen worden, deren Nukleotidsubstitutionen jedoch prinzipiell bei jeder Vermehrung einer Reversion unterliegen können. In dieser Erfindung werden statt dessen zwei davon verschiedene Prinzipien eingesetzt. Als erstes wird ein überstarker viraler Promotor in Verbindung mit dem Fremdgen in nur einem der dann insgesamt neun verschiedenen Influenza-vRNA-Moleküle verwendet, zur Überexpression und Überreplikation dieser einen vRNA im Vergleich zu den acht übrigen, die dem Helfervirus entstammen und allesamt für die Virusvermehrung erforderlich sind. Bei statistischer Verpackung aller neun vRNA-Moleküle entsprechend ihrer individuellen Konzentration und bei einer begrenzten Aufnahmekapazität der Virionen von ca. 15 solcher Moleküle werden dann durch die vermehrte Anzahl der Kopien von Fremd-RNA einzelne der acht Influenza-vRNAs aus den sich bildenden Virionen verdrängt, was bei diesen zum Verlust der Vermehrungsfähigkeit und insgesamt zum Abfall der Plaquebildungsrate für die sich bildenden Partikel führt, und zwar typischerweise in einer Passage um drei bis vier Zehnerpotenzen. Als zweites Attenuationsprinzip werden Ribozyme verwendet, die in sequenzspezifischer Reaktion gegen einzelne der Helfer-vRNA-Segmente gerichtet sind. Dadurch wird die jeweilige Gen-Sequenz in hoher Ausbeute zerstört und kann auch nicht beim Verpackungsvorgang in die sich bildenden Impf-Viren aufgenommen werden. Der Ausfall des zugehörigen Genproduktes wird hierbei durch DNA-Transfektion mit den entsprechenden Konstrukten bzw. durch Vermehrung in Zellinien mit chromosonaler Expression des fehlenden Proteins ausgeglichen.3. In the past, attenuated variants of viruses are often under through serial passagesmarginal growth conditions or in unnatural host cells, d. H. byrandom mutation, and generated under unclear selection conditions. Firstwith the reverse genetics and now through targeted mutations can attenuate Virus variants are built up in a controlled manner, but then as beforethe impact of these mutations must be examined, first in theCell culture and animal experiments. So far there are attenuated influenza variants for vaccinesin particular, various (multiple) temperature-sensitive mutants have been proposed, theIn principle, however, nucleotide substitutions are subject to reversion each time they multiplycan. Instead, two different principles are used in this invention.First, an over-potent viral promoter in conjunction with the foreign gene is in only onewho then uses a total of nine different influenza vRNA molecules toOverexpression and overreplication of this one vRNA compared to the eight remaining onesare from the helper virus and are all required for virus replication. Atstatistical packaging of all nine vRNA molecules according to their individualConcentration and with a limited capacity of about 15 virionsThe molecules are then separated by the increased number of copies of foreign RNAeight influenza vRNAs are displaced from the virions that form, resulting in loss of thesethe ability to reproduce and overall to decrease the rate of plaque formationforming particles, typically in a passage around three to fourPowers of ten. Ribozymes are used as the second attenuation principlesequence-specific response against individual of the helper vRNA segments are directed.As a result, the respective gene sequence is destroyed in high yield and cannot be used in thePackaging process in the vaccine viruses that are formed. The failure of theassociated gene product is hereby by DNA transfection with the correspondingConstructs or by multiplication in cell lines with chromosonal expression of the missingProtein balanced.
Damit beschreibt und enthüllt diese Erfindung die Konstruktion von rekombinanten Influenzaviren mit Hochexpression fremder Genprodukte einschließlich fremder Glykoproteine, die durch statistische Verdrängung wie vor allem durch kontrollierte Zerstörung einzelner Gene in ihrer Virulenz attenuiert sind, und daher als Vakzine eingesetzt werden können.Thus, this invention describes and discloses the construction of recombinantInfluenza viruses with high expression of foreign gene products including foreign glycoproteins,through statistical repression, especially through controlled destruction of individualsGenes are attenuated in their virulence and can therefore be used as vaccines.
Der Aufbau rekombinanter Influenzaviren auf der Bals entsprechender Plasmidkonstrukte in E.coli K12 verwendet die in diesem Labor entwickelte Methode der intrazellulären Erzeugung von rekombinanten vRNA-Molekülen durch das Enzym RNA-Polymerase I nach Plasmid-DNA-Transfektion der entsprechenden cDNA-Konstrukte (Zobel et al., 1994; Neumann et al., 1994), niedergelegt in Patentanmeldung PCT 95/03663 (Hobom et al. sowie Bayer AG). In Erweiterung zu der dort genannten Methode wird entweder der murine RNA-Polymerase I-Promotor (in Maus-Zellinien) oder der humane RNA-Polymerase I-Promotor (in humanen oder in Affen-Zellinien, besonders in COS-7) verwendet, während die Terminator-Sequenz austauschbar in allen Zellinien aus der einen oder anderen rDNA stammend aktiv ist.The structure of recombinant influenza viruses on the Bals correspondingPlasmid constructs in E.coli K12 uses the method of developed in this laboratoryintracellular generation of recombinant vRNA molecules by the enzyme RNA-Polymerase I after plasmid DNA transfection of the corresponding cDNA constructs (Zobel et al., 1994; Neumann et al., 1994), laid down in patent application PCT 95/03663 (Hobomet al. and Bayer AG). In addition to the method mentioned there, either themurine RNA polymerase I promoter (in mouse cell lines) or the human RNA polymerase I-Promotor (in human or in monkey cell lines, especially in COS-7) used while theTerminator sequence interchangeable in all cell lines from one or the other rDNAis active.
Alternativ zur vorgenannten Standard-Methode können RNA-Moleküle mit Influenza-vRNA-tpyischen Endsequenzen in zwei Schritten statt einem auch durch das normale zelluläre Transkriptionsverfahren mit RNA-Polymerase II, hier jedoch in Minus-Strang-Orientierung erzeugt werden. Dafür wird das 3'-Ende der vRNA aus dem Primärtranskript heraus durch ein spezifisch konstruiertes cis-Ribozym gebildet (das primär gebildete 3'-Ende der mRNA einschließlich der Hepatitis δ-Ribozymsequenz selbst wird damit nukleolytisch entfernt; Menke und Hobom, 1997). Das über die virale 5'-vRNA-Promotorsequenz hinausreichende 5'-Ende des Primärtranskriptes (z. B. 12 Nukleotide mit 5'-Cap-Struktur) geht anschließend im Zuge der vRNA-Amplifikationsreaktion verloren, die auch bei einer solcherart verlängerten Matrize an der normalen 5'-Position die Synthese der Influenza mRNA sowie cRNA startet. In zwei Schritten entsteht damit ein vermehrungs- und verpackungsfähiges vRNA-Molekül auch aus einem mRNA-Vorläufer heraus, wie er beispielsweise unter der Kontrolle eines pCMV-Promotors gebildet wird.As an alternative to the above-mentioned standard method, RNA molecules with influenza vRNA-typical end sequences can be generated in two steps instead of one by the normal cellular transcription method with RNA polymerase II, but here in a minus-strand orientation. For this purpose, the 3 'end of the vRNA is formed from the primary transcript by a specifically constructed cis-ribozyme (the 3'-end of the mRNA that is formed, including the hepatitis δ-ribozyme sequence itself, is thus removed by nucleolysis; Menke and Hobom, 1997). The 5 'end of the primary transcript which extends beyond the viral 5'-vRNA promoter sequence (for example 12 nucleotides with a 5'-cap structure) is subsequently lost in the course of the vRNA amplification reaction, which also occurs in the case of a template which has been extended in this way the synthesis of the influenza mRNA and cRNA starts in the normal 5 'position. In two steps, a vRNA molecule that can be reproduced and packaged is also created from an mRNA precursor, such as is formed under the control of a pCMV promoter.
Verstärkende Mutationen der viralen Promotorsequenz in verschiedener Abstufung, besonders aber die deutlich wirksamen Mutationen 1104 und 1102 (Neumann und Hobom 1995; in der bereits genannten Patentschrift) werden durchweg als Endsequenzen in den rekombinanten vRNA-Molekülen, d. h. in Verbindung mit den Fremdgenen verwendet. Sie orientieren sich an der "Korkenzieher"-Sekundarstrukturinterpretion für die aktivierte Form dieser Promotorsequenzen (Flick et al., 1996).Reinforcing mutations of the viral promoter sequence in different gradations, especiallybut the clearly effective mutations 1104 and 1102 (Neumann and Hobom 1995; in thealready mentioned patent) are consistently used as end sequences in the recombinantvRNA molecules, d. H. used in conjunction with the foreign genes. They are based onthe "corkscrew" secondary structure interpretation for the activated form of thisPromoter sequences (Flick et al., 1996).
Die Gene verschiedener fremder Glykoproteine vom allgemeinen Typ I, d. h. mit einer C-Terminus-nahen hydrophoben Membrananker-Sequenz werden wie zur Expression anderer Gene auch zum Aufbau entsprechender cDNA-Konstrukte verwendet, so daß entsprechende artefizielle vRNA-Moleküle gebildet werden können, und zwar in Minusstrang-Orientierung bzw. Gegenstrang-Richtung. Die Fremdgene nehmen dabei den Platz der kodierenden Sequenz von Influenza-Genen ein, flankiert von authentischen oder leicht abgewandelten nichtkodierenden Bereichen, wie sie in den Influenza vRNA-Molekülen vorliegen. Neben einem eigenen oder aber vom Hämagglutinin (HA) entlehnten Signalpeptid umfaßt die Glykoprotein-Sequenz dann die vollständige eigene, also HA-fremde Ekto-Domäne und anschließend entweder die eigene oder häufiger die Hämagglutinin-Transmembran-Domäne einschließlich einer C-terminalen "cytoplasmatischen" Endsequenz (bei HA: 26 + 11 Aminosäuren). Das gleiche Konstruktionsprinzip gilt auch für Nicht-Glykoproteine, die erst durch die Verbindung mit den beiden flankierenden Signal- und Membransegmenten des Hämagglutinins zu artefiziellen Oberflächenproteinen auf dem Virion umgestaltet werden, z. B. für das grün-fluoreszierende Protein aus Aequoria victoria (GFP). Mit den Hämagglutinin-Sequenzen in der Membran verankert handelt es sich im Ergebnis zwar um Fusionsproteine, deren gesamte unveränderte Ektodomäne gleichwohl davon unbeeinflußt sich in der Normalkonformation ausbilden kann, erkennbar im genannten Fall an der GFP-Fluoreszenz.The genes of various foreign glycoproteins of general type I, i.e. H. WithA hydrophobic membrane anchor sequence close to the C-terminus are used for expressionother genes also used to construct corresponding cDNA constructs, so that Appropriate artificial vRNA molecules can be formed, in minus-strand oriention or counter-strand direction. The foreign genes take the place ofcoding sequence of influenza genes, flanked by authentic or lightmodified non-coding areas as found in the influenza vRNA moleculesavailable. In addition to its own signal peptide or one derived from hemagglutinin (HA)The glycoprotein sequence then comprises the complete own, ie HA-foreign ecto domainand then either your own or more often the hemagglutinin transmembrane domainincluding a C-terminal "cytoplasmic" end sequence (for HA: 26 + 11Amino acids). The same design principle also applies to non-glycoproteins that firstthrough the connection with the two flanking signal and membrane segments of theHemagglutinins are transformed into artificial surface proteins on the Virion, e.g. B.for the green fluorescent protein from Aequoria victoria (GFP). With the Haemagglutinin Sesequences anchored in the membrane are indeed fusion proteins,whose entire unchanged ectodomain is nevertheless unaffected by this in theCan form normal conformation, recognizable in the case mentioned by the GFP fluorescence.
Die durch RNA-Polymerase I (oder RNA-Polymerase II) in den cDNA-transfizierten Zellen gebildeten rekombinanten vRNA-Moleküle benötigen für ihre Konversion in pseudo-virale mRNAs und für die anschließende Amplifikation über cRNAs wieder zu VRNAs die virale RNA-Polymerase der Helferviren, zur schließlich folgenden Verpackung zusammen mit dem Helfervirus-vRNAs dann auch alle übrigen Genprodukte einschließlich der Strukturproteine. Die gleichzeitig gebildeten unveränderten Helferviren dominieren der Zahl nach im Gemisch der Tochterviren.The by RNA polymerase I (or RNA polymerase II) in the cDNA-transfected cellsformed recombinant vRNA molecules need for their conversion into pseudo-viralmRNAs and for the subsequent amplification via cRNAs back to VRNAs the viralRNA polymerase of the helper viruses, for the subsequent packaging together with theHelper virus vRNAs then also all other gene products including the structural proteins.The unchanged helper viruses formed at the same time dominate in number in the mixtureof the daughter viruses.
Die Selektion der rekombinant transfizierten bzw. rekombinant infizierten Zellen (nach "Viruspassage" des primär gebildeten Zell-Überstandes mit den Tochterviren darin auf frische Zellen) gegenüber den nicht infizierten bzw. den nicht rekombinant-infizierten Zellen gelingt mit Hilfe der Expression von GFP und dessen Fluoreszenz-Emission von 590 nm bei Anregung durch 483 nm (Chalfie et al., 1994; Cubitt et al. 1995; Siemering et al., 1996). Das GFP-Gen ist für diesen Zweck eingebracht worden in bicistronische vRNA-Segmente, und zwar als erstes Cistron am 5'-Ende dieser mRNAs, während das eigentlich interessierende beliebige Fremdgen den distalen Platz auf den viralen mRNAs einnimmt. Auf dem vRNA-Gegenstrang liegt mithin die Reihenfolge invertiert vor. Vor und hinter der inversen GFP-Sequenz sind hier Spleiß-Donor und Spleiß-Akzeptor Signale mit partieller Wirksamkeit angeordnet, die in den infizierten Zellen (während der "Viruspassage") bei einem Teil der vRNA-Moleküle das GFP-Gen durch eine Spleiß-Reaktion entfernen. Die in der nächsten Passage infizierten Zellen haben dann die GFP-Fluoreszenz verloren und exprimieren jetzt statt dessen das vorher distale Genprodukt der bicistonischen RNA-Segmente. In der zweiten (oder dritten) FACS-Sortierung werden jetzt daraufhin die nicht-fluoreszierenden "dunklen" Zellen aussortiert und deren Virus-Überstand dann für die weitere Vermehrung verwendet. - Das Verfahren beschreibt erstmalig eine Spleißreaktion auf der Ebene einer genomischen vRNA, und damit zugleich an einer Minusstrang-RNA.The selection of the recombinantly transfected or recombinantly infected cells (after"Virus passage" of the primarily formed cell supernatant with the daughter viruses therein to fresh onesCells) compared to the non-infected or non-recombinantly infected cellswith the help of the expression of GFP and its fluorescence emission of 590 nm when excitedby 483 nm (Chalfie et al., 1994; Cubitt et al. 1995; Siemering et al., 1996). The GFP genehas been introduced into bicistronic vRNA segments for this purpose asfirst cistron at the 5 'end of these mRNAs, while the one that is actually interestingForeign gene takes the distal place on the viral mRNAs. On the vRNA counter strandthe sequence is therefore inverted. Before and after the inverse GFP sequence are hereSplice donor and splice acceptor signals with partial effectiveness arranged in the infected cells (during the "virus passage") the GFP gene in some of the vRNA moleculesremove by a splice reaction. Have the cells infected in the next passagethen the GFP fluorescence is lost and now instead express the previously distal oneGene product of the bicistonic RNA segments. In the second (or third) FACS sortthe non-fluorescent "dark" cells and their virus over are then sorted outwas then used for further propagation. - The procedure describes for the first timea splice reaction at the level of a genomic vRNA, and thus at oneNegative strand RNA.
Eine zweite indirekte Selektionsmethode für Fremdgene beruht ebenfalls auf der Fluoreszenz eines vorgeschalteten GFP-Gens, das hier jedoch durch ein alternativ wirkendes Replikationssignal abgegliedert ist von dem nachfolgenden, indirekt zu selektierenden Gen. Bicistronische vRNA-Segmente dieser Art tragen zusätzlich zu deren Lokalisation am 3'-Ende eine weitere 3'-Promotorsequenz in der Mitte zwischen den beiden Cistrons, so daß die Gesamt-Promotorstruktur gebildet aus den 5'- und 3'-Anteilen sich hier alternativ einerseits über beide Cistrons hinweg ausbilden kann, oder aber andererseits nur über das Fremdgen hinweg, was zum replikativen Verlust des nicht einbezogenen GFP-Gens führt. Die zweistufige Selektion durch FACS-Sortierung führt hier in gleicher Weise wie oben zur Isolierung bzw. Anreicherung von Influenzaviren mit beliebigen fremden Genen.A second indirect selection method for foreign genes is also based on fluorescenceof an upstream GFP gene, which, however, here is caused by an alternative oneReplication signal is separated from the subsequent, indirectly selectable gene.Bicistronic vRNA segments of this type contribute to their localization at the 3 'endanother 3 'promoter sequence in the middle between the two cistrons, so that theThe entire promoter structure formed from the 5 'and 3' portions alternatively on the one handcan train across both cistrons, or on the other hand only via the foreign geneaway, which leads to replicative loss of the non-included GFP gene. The two-stageSelection by FACS sorting leads here to isolation orEnrichment of influenza viruses with any foreign genes.
Die Inkorporation fremder Gene in rekombinante Influenzaviren ist wegen des damit verbundenen neuen Phänotyps leichter zu detektieren und zu isolieren als es die gezielt konstruierten Varianten virus-eigener Gene sind, - verborgen in einer Überzahl von unveränderten Helferviren. Für deren Selektion muß ein Umweg beschritten werden, der in der Konstruktion einer Serie von spezifisch veränderten Helferviren besteht, die alle eine Ribozym-Schnittstelle in jeweils einem ihrer vRNA-Segmente tragen, und zwar in dem Bereich der nichtkodierenden 5'- oder/und 3'-Flankensequenzen. Sie wurden zu diesem Zweck selbst gezielt verändert und über mehrfache Plaque-Reinigung isoliert. Im Gemisch mit "seinem" spezifischen Helfervirus läßt sich das analoge, im kodierenden Bereich gezielt veränderte, jedoch in den Außenflanken die unberührte Wildtypsequenz aufweisende vRNA-Segment aus der RNA-Polymerase I-Transkription durch Ribozym-Einwirkung herausisolieren. Zu dem Zweck werden die entsprechenden Wirtszellen zuvor mit einem cDNA-Konstrukt transient transfiziert, welches ein spezifisch wirkendes Ribozym (vom hammerhead-Typ) exprimiert, gerichtet gegen die Schnittstelle in der einen vRNA-Flankensequenz im ausgewählten Helfervirus. Die so vorbehandelten Zellen werden anschließend mit dem Virus-Gemisch infiziert (in einer "Passage"), wobei der Großteil eines der acht Helfervirus-Segmente durch Spaltung zerstört wird, während das mutierte Ersatz-Segment überdauert und sogar amplifiziert wird. Diese Behandlung kann in einem zweiten Durchlauf wiederholt werden und liefert die gezielt veränderten Virus-Mutanten in einheitlicher Population. Für eine höhere Reaktionsausbeute und auch zur Absicherung gegen eine mögliche Mutation im Zuge des genetischen Drifts in der Ribozym-Erkennungsstelle auf der vRNA sind diese ebenso wie die zugehörigen Ribozyme in der Form von Tandem-Dimeren ausgebildet (Menke und Hobom, 1997).The incorporation of foreign genes into recombinant influenza viruses is because of thisassociated new phenotype easier to detect and isolate than the targetedconstructed variants of virus genes are - hidden in a majority ofunchanged helper viruses. To select them, a detour must be made, which is in theThere is construction of a series of specifically modified helper viruses, all of which have a ribozyme cutplace in each of their vRNA segments, in the area of5 'and / or 3' non-coding edge sequences. You became yourself for this purposespecifically changed and isolated by multiple plaque cleaning. Mixed with "his"specific helper virus, the analog, specifically modified in the coding area,however, in the outer flanks, the untouched wild-type sequence has vRNA segmentisolate the RNA polymerase I transcription by exposure to ribozyme. To thatFor this purpose, the corresponding host cells are previously transient with a cDNA constructtransfected, which expresses a specific acting ribozyme (of the hammerhead type),directed against the interface in the one vRNA flank sequence in the selected one Helper virus. The cells pretreated in this way are then mixed with the virus mixtureinfected (in a "passage"), with the majority of one of the eight helper virus segments being infectedCleavage is destroyed while the mutant replacement segment survives and evenis amplified. This treatment can be repeated in a second pass anddelivers the specifically modified virus mutants in a uniform population. For a higher oneReaction yield and also to protect against a possible mutation in the course ofgenetic drifts in the ribozyme recognition site on the vRNA are just like thatassociated ribozymes in the form of tandem dimers (Menke and Hobom,1997).
Die schon beschriebene Ribozymspaltung der vRNA eines Helfervirus-Segments führt bei fehlender Kompensation durch ein neugebildetes Segment gleicher Funktion zu einer nur abortiven Infektion, es werden keine oder höchstens sehr wenige Tochterviren gebildet. Die Komplementation der fehlenden Genfunktion kann jedoch statt durch eine vRNA auch durch das zugehörige Protein erfolgen, d. h. durch die Proteinexpression auf der Basis einer RNA-Polymerase II-Expression, die jedoch dabei keine verpackungsfähigen RNA-Moleküle entstehen läßt. In den zuvor transient doppelt DNA-transfizierten Zellen - (Ribozym-Konstrukt; Expressionskonstrukt für ein virales Protein) werden als Ergebnis einer anschließenden Virus-Infektion zwar Tochterviren gebildet, die jedoch bei fehlendem Gensegment nur noch einstufig (abortiv) infektionsfähig, nicht aber in den neu infizierten Zellen vermehrungsfähig sind. Damit eignen sich die so attenuiert gebildeten Viren als Impfviren; zusätzlich zu der teilweisen Expression der eigenen Gene in den abortiv infizierten Zellen ist bei ihnen die Expression fremder Proteine und Glykoproteine zum Zwecke der Steigerung bzw. der Ausweitung der Immunantwort möglich.The previously described ribozyme cleavage of the vRNA of a helper virus segmentperforms the same if there is no compensation through a newly formed segmentFunction to an only abortive infection, there will be no or at most very fewDaughter viruses formed. However, the missing gene function can be complementedby a vRNA also by the associated protein, d. H. through protein expressionon the basis of an RNA polymerase II expression, which however cannot be packagedRNA molecules are created. In the previously transient double DNA transfected cells -(Ribozyme construct; expression construct for a viral protein) are the result of asubsequent virus infection formed daughter viruses, but in the absence ofGene segment only one-stage (abortive) capable of infection, but not in the newly infectedCells are capable of reproduction. The viruses thus attenuated are therefore suitable asVaccine viruses; in addition to the partial expression of the own genes in the abortively infectedFor them, the expression of foreign proteins and glycoproteins is for the purpose ofIncreasing or expanding the immune response possible.
Als Standard-Helferviren werden verschiedene Hühner-Influenzaviren (KP- bzw. FPV-Viren) verwendet (H7-HA): FPV-Bratislava, FPV-Rostock oder FPV-Giessen. Außerdem wurden dafür mehrere Virus-Reassortanten eingesetzt, gebildet in Doppel-Infektionen aus einem H7- und einem H2-Virus (Scholtissek et al., 1979), sowie schließlich für Einzelversuche die unter (6) genannten speziellen Helfervirus-Stämme. Die späteren Viruspassagen wurden routinemäßig auf den Standard-Zellinien MDCK und MDBK durchgeführt, während der erste Schritt zur Synthese rekombinanter Viren über die RNA-Polymerase I-Expression von cDNA-Konstrukten entweder auf Mäusezellinien angewiesen ist (u. a. B 82; Konstrukte enthalten den rDNA-Promotor der Maus) oder auf humane bzw. Affenzellinien (z. B. COS-7; Konstrukte enthalten den humanen rDNA-Promotor).As standard helper viruses are differentChicken influenza viruses (KP or FPV viruses) used (H7-HA): FPV-Bratislava, FPV-Rostockor FPV casting. In addition, several virus reassortants were used for this,formed in double infections from an H7 and an H2 virus (Scholtissek et al., 1979),and finally, for individual experiments, the special helper virus strains mentioned under (6).The later virus passages were routinely carried out on the standard MDCK and cell linesMDBK performed during the first step towards the synthesis of recombinant viruses via theRNA polymerase I expression of cDNA constructs either on mouse cell lines (e.g. B 82; constructs contain the mouse rDNA promoter) or onhuman or monkey cell lines (e.g. COS-7; constructs contain the human rDNA-Proengine).
Das Schweinepestvirus (CSFV = contagious swine fever virus) ist auch gegenwärtig eine bedeutende Bedrohung der Schweinezucht in Deutschland und Europa. Bei stärkerem Verkehr und Handelsaustausch mit den osteuropäischen Ländern könnte die Infektionsgefahr weiter zunehmen und der Bedarf an einer wirksamen Vakzine z. B. zur Eindämmung einer Epidemie weiter zunehmen, - auch in den östlichen Ländern selbst. CSFV besitzt als Pestivirus ein RNA-Plusstrang-Genom mit einem langen Leseraster, der in ein alsbald proteolytisch zerlegtes Polyprotein übertragen wird. Von den Spaltprodukten werden drei als Envelope-Proteine auf der Oberfläche der Virionen gefunden: Glykoproteine Eo (=Ems), E1 und E2, von denen das E2-Protein die Rezeptor-Bindungsstelle enthält (Rümenapf et al., 1993). Die Morphogenese der CSFV-Virionen findet im Bereich des Trans-Golgi-Netzwerks statt, also nicht an der Plasmamembran der Zelloberfläche, die auch von keinem der einzelnen Glykoproteine erreicht wird. Die intrazellulären Transportabläufe sind damit völlig verschieden von denen des Influenzavirus und seiner Glykoproteine.The swine fever virus (CSFV = contagious swine fever virus) is still a significant threat to pig breeding in Germany and Europe. With increased traffic and trade with the Eastern European countries, the risk of infection could increase further and the need for an effective vaccine e.g. B. to curb an epidemic, - even in the Eastern countries themselves. As a pestivirus, CSFV has an RNA-plus-strand genome with a long reading frame, which is soon converted into a proteolytically broken down polyprotein. Three of the cleavage products are found as envelope proteins on the surface of the virions: glycoproteins Eo (= Ems ), E1 and E2, of which the E2 protein contains the receptor binding site (Rümenapf et al., 1993). The morphogenesis of the CSFV virions takes place in the area of the Trans-Golgi network, i.e. not on the plasma membrane of the cell surface, which is also not reached by any of the individual glycoproteins. The intracellular transport processes are therefore completely different from those of the influenza virus and its glycoproteins.
Das cDNA-Segment mit der kodierenden Sequenz für die CSFV-Glykoprotein E2-Ektodomäne samt einer vorangehenden Region entsprechend einem 23 Aminosäuren langen Signalpeptid (Signalase-sensitiv), insgesamt 364 Codons überdeckend, von Nukleotidposition (Meyer et al., 1989): 2362 (ATA = Isoleucin, hier jedoch verwandelt in ATG = Methionin) bis 3454 (TTT = Phenylalanin, hier jedoch verwandelt in TGG = Tryptophan) ist im Austausch einkloniert worden in ein vRNA-Expressionskonstrukt für das Hämagglutinin. Dabei sind von der Sequenz des Influenza-Segments 4 erhalten die flankierenden 5'- und 3'-Enden, vor dem Startcodon des Fusionsproteins jedoch entsprechend der Kozak-Sequenz (Kozak, 1991) verändert, sowie der gesamte Abschnitt entsprechend der HA-Transmembran-Domäne und dem C-Terminus (Nukleotide 1-29 und 1623 bis 1768 in der cRNA-Numerierung). Die im Konstrukt pHL1959 (Abb. 1) verwendete Promotor-Mutante 1104 enthält dabei noch Nukleotidaustausche an den Positionen 3, 5 und 8 (Neumann und Hobom, 1995). Die Fusionsgrenze des Proteins zwischen der E2-Ektodomäne und der HA-Transmembrandomäne wird auf der cDNA-Ebene durch eine BamHI-Schnittstelle markiert. Der beschriebene zentrale cDNA-Abschnitt des Konstrukts ist zur Expression als vRNA-Minusstrang in pHL1959 nukleotidgenau umrahmt von dem murinen rDNA-Promotor und -Terminator, d. h. von den Segmenten -254 bis -1 (bezogen auf den Transkriptionsstart der Vorläufer-rRNA) und +571 bis +745 (bezogen auf das 3'-Ende der reifen 285 rRNA). Die Replikation in E.coli K12 und die Ampicillin-Selektion werden getragen von dem umschließenden Basisvektor pBluescript SK (vgl.Abb. 1).The cDNA segment with the coding sequence for the CSFV glycoprotein E2 ectomain domain including a preceding region corresponding to a 23 amino acid signal peptide (signalase sensitive), covering a total of 364 codons, from nucleotide position (Meyer et al., 1989): 2362 (ATA = isoleucine, but here transformed into ATG = methionine) to 3454 (TTT = phenylalanine, here transformed into TGG = tryptophan) has been cloned in exchange into a vRNA expression construct for hemagglutinin. The flanking 5 'and 3' ends of the sequence of the influenza segment 4 are obtained, however, before the start codon of the fusion protein is changed in accordance with the Kozak sequence (Kozak, 1991), and the entire section in accordance with the HA transmembrane Domain and the C-terminus (nucleotides 1-29 and 1623 to 1768 in the cRNA numbering). The promoter mutant 1104 used in construct pHL1959 (Fig. 1) also contains nucleotide exchanges at positions 3, 5 and 8 (Neumann and Hobom, 1995). The fusion limit of the protein between the E2 ectodomain and the HA transmembrane domain is marked at the cDNA level by a BamHI site. The described central cDNA section of the construct is framed by the murine rDNA promoter and terminator, ie from segments -254 to -1 (based on the start of transcription of the precursor rRNA) and +, for nucleotide expression in pHL1959 for expression as a vRNA minus strand 571 to +745 (based on the 3 'end of the mature 285 rRNA). The replication in E.coli K12 and the ampicillin selection are carried by the surrounding base vector pBluescript SK (seeFig. 1).
Nach Lipofectamin-vermittelter DNA-Transfektion von pHL1959 DNA in murine B82 Zellen, gefolgt nach 24 Stunden (2-30 Stunden) von der FPV-Bratislava Helfervirus-Infektion (moi:2-5) werden in den Nukleoli der transfizierten und infizierten Zellen durch die zelluläre RNA-Polymerase I pseudo-vRNA-Moleküle erzeugt, und anschließend im Kern durch die virale RNA-Polymerase in virale mRNA-Moleküle überführt (nach dem "Cap-Snatching"-Prinzip; Krug et al., 1989). In der späteren Phase der Virus-Infektion werden dann auch cPNA-Moleküle, und in erneuter Umschreibung schließlich Tochter-vRNA-Moleküle gebildet. Die viralen mRNA-Moleküle führen zur Synthese des E2-HA-Fusionsproteins, das an der Oberfläche der Zellen erscheint und dort in indirekter Immunfluoreszenz nachgewiesen werden kann (Abb. 2). Dort wird es weiter in die sich bildenden Influenza-Virionen inkorporiert (Abb. 3 und 4), als drittes Glykoprotein in der Virion-Hülle ("envelope"), neben den Glykoproteinen HA und NA des Helfer-Influenzavirus. Der Transport zur Zelloberfläche und die Inkorporation in die (fremden) Virionen ist abhängig von der HA-Transmembrandomäne (Abb. 5), und Kontrollklone mit dem E2-Transmembransegment werden auch unter den Bedingungen einer Influenza-Infektion nicht an die Oberfläche transportiert oder in die Influenza-Virionen inkorporiert (Spur6 inAbb. 3). Die C-terminale Sequenz von 11 Aminosäuren kann dabei abgewandelt werden, ohne daß das Transportverhalten in der Zelle und der Einbau des Fusionsproteins in die Virionen davon entscheidend berührt wurden. (Spuren3 bis5 inAbb. 3). Der Transport des Fusionsproteins an die Zelloberfläche ist unabhängig von anderen viralen Proteinen und erfolgt auch bei einer Expression durch RNA-Polymerase II in Abwesenheit der Influenza-Infektion (nicht gezeigt).After lipofectamine-mediated DNA transfection of pHL1959 DNA in murine B82 cells, followed after 24 hours (2-30 hours) by the FPV-Bratislava helper virus infection (moi: 2-5) are in the nucleoli of the transfected and infected cells the cellular RNA polymerase I pseudo-vRNA molecules generated, and then converted into viral mRNA molecules by the viral RNA polymerase (according to the "cap snatching"principle; Krug et al., 1989). In the later phase of the virus infection, cPNA molecules are then also formed, and daughter vRNA molecules are finally rewritten. The viral mRNA molecules lead to the synthesis of the E2-HA fusion protein, which appears on the surface of the cells and can be detected there by indirect immunofluorescence (Fig. 2). There it is incorporated further into the influenza virions that are forming (Figs. 3 and 4), as the third glycoprotein in the virion envelope ("envelope"), next to the glycoproteins HA and NA of the helper influenza virus. Transport to the cell surface and incorporation into the (foreign) virions is dependent on the HA transmembrane domain (Fig. 5), and control clones with the E2 transmembrane segment are not transported to or into the surface even under the conditions of an influenza infection Influenza virions incorporated (lane6 inFig. 3). The C-terminal sequence of 11 amino acids can be modified without having a decisive effect on the transport behavior in the cell and the incorporation of the fusion protein into the virions. (Lanes3 to5 inFig. 3). The transport of the fusion protein to the cell surface is independent of other viral proteins and is also carried out when expressed by RNA polymerase II in the absence of the influenza infection (not shown).
Neben der Inkorporation des Fusionsproteins in die Virionen wird auch die zugehörige vRNA in die Viren verpackt und kann nach (mehrfacher) Viruspassage auf der Oberfläche der neuinfizierten Zellen ebenso wie in den dort gebildeten Virionen nachgewiesen werden, wegen der Verbindung mit einem verstärkten Promotor in ansteigender Konzentration (bis zu 1 : 1 relativ zum HA). Die Infektiosität der Viren ist davon nicht beeinträchtigt, was die voneinander unabhängige Inkorporation und Oligomerisierung der verschiedenen Glykoproteine in den Virionen belegt, da die Homo-Trimerisierung von HA ebenso wie die Homo-Tetramerisierung von NA Voraussetzung für ihre Funktion im Zuge der Infektion ist.In addition to incorporating the fusion protein into the virions, the associated vRNA is also usedpacked into the viruses and can be (multiple) virus passage on the surface of the newinfected cells as well as in the virions formed there, because of theConnection with an enhanced promoter in increasing concentration (up to 1: 1 relativeto the HA). The infectivity of the viruses is not affected by what is different from each otherindependent incorporation and oligomerization of the different glycoproteins in theVirions prove that the homo-trimerization of HA as well as the homo-tetramerizationof NA is a prerequisite for their function in the course of the infection.
Die cDNA für die Sequenz des grün-fluoreszierenden Proteins (GFP) aus Aequoria victoria ist in pHL1972 (Abb. 6) bzw. in weiteren solchen Konstrukten einschließlich pHL2251 in aktivitätssteigernd mutierter Form (Chalfie et al. 1994, Cubitt et al. 1995 Siemering et al., 1996) in RNA-Polymerase I-Expressionsvektoren integriert worden. Dabei ersetzen die 246 Codons der GFP-Sequenz plus sechs Codons einer Histidinfolge am C-Terminus die kodierende Sequenz des NP-Gens im Segment 5, erhalten sind dann nur die flankierenden nicht-translatierten Sequenzen am 5'- und 3'-Ende dieses Segmentes, abgeändert allerdings gemäß der 1104-Promotorvariante (Neumann und Hobom, 1995) und für eine Optimierung des Translationsstarts nach Kozak (1991). Umrahmt wird der zentrale Teil des Konstruktes in diesem Falle durch den RNA-Polymerase I-Promotor aus der humanen rDNA (-407 bis -1, bezogen auf den Startpunkt der Vorläufer-rRNA) und den RNA-Polymerase I-Terminator aus der murinen rDNA (in den gleichen Grenzen wie im Beispiel 1), während die E.coli K12-Kassette gleichfalls dem Konstrukt pHL1959 in Beispiel 1 entspricht.The cDNA for the sequence of the green fluorescent protein (GFP) from Aequoria victoria is in pHL1972 (Fig. 6) or in other such constructs including pHL2251 in an activity-increasing mutated form (Chalfie et al. 1994, Cubitt et al. 1995 Siemering et al., 1996) have been integrated into RNA polymerase I expression vectors. The 246 codons of the GFP sequence plus six codons of a histidine sequence at the C-terminus replace the coding sequence of the NP gene in segment 5; only the flanking non-translated sequences at the 5 'and 3' ends of this segment are then obtained , modified however according to the 1104 promoter variant (Neumann and Hobom, 1995) and for an optimization of the translation start according to Kozak (1991). In this case, the central part of the construct is framed by the RNA polymerase I promoter from the human rDNA (-407 to -1, based on the starting point of the precursor rRNA) and the RNA polymerase I terminator from the murine rDNA (within the same limits as in Example 1), while the E.coli K12 cassette also corresponds to the construct pHL1959 in Example 1.
Die Zellspezifität des humanen Promotors bedingt, daß hier die Lipofectamin-DNA-Transfektion in COS-7-Zellen ausgeführt wird. Die Superinfektion mit FPVBratislava als Helferviren (moi: 1-5) nach 20-24 Stunden führt bei pHL1972 nach drei bis vier Stunden, bei pHL2251 nach 2 bis 3 Stunden zur GFP-Fluoreszenz in den sowohl transfizierten wie infizierten Zellen, typischerweise in einem Anteil an der Zellpopulation von 15%-25% (Abb. 7), in der Ausbeute abhängig besonders von dem Erfolg der Lipofectamin-Behandlung. Die gemischte Zellpopulation läßt sich in einem Fluoreszenz-aktivierten Zell-Sortierer (FACS; Becton-Dickinson) in fluoreszierende und in nicht-fluoreszierende Zellen (nicht transfiziert, oder nur durch Helferviren infiziert) aufspalten, in ihrer Extinktion stark unterschieden, s.Abb. 8. Die fluoreszierenden Zellen werden durch Zentrifugation rekonzentriert und in Gewebekultur-Medium aufgenommen. Die von ihnen in der weiteren Inkubation freigesetzten Viren sind stark angereichert für rekombinante Viren, wie sich bei deren weiterer Passage zeigt: die von ihnen infizierten Zellen sind in hoher Ausbeute rekombinant infiziert, d. h. sie zeigen die durch das GFP-Segment bewirkte Fluoreszenz. Die FACS-Selektion kann auch nach der ersten Passage, d. h. an den mit einem Gemisch von rekombinanten und Helferviren infizierten Zellen ausgeführt werden, und trennt dann die rekombinant infizierten Zellen von den übrigen Zellen ab, die entweder nur durch Helferviren oder gar nicht infiziert sind.The cell specificity of the human promoter means that lipofectamine DNA trans fection is carried out in COS-7 cells. Superinfection with FPVBratislava as helper viruses (moi: 1-5) after 20-24 hours leads to GFP fluorescence in both transfected and infected cells, typically in one, in pHL1972 after three to four hours, in pHL2251 after 2 to 3 hours Share in the cell population of 15% -25% (Fig. 7), the yield depending on the success of the lipofectamine treatment. The mixed cell population can be split into fluorescent and non-fluorescent cells (not transfected, or only infected by helper viruses) in a fluorescence-activated cell sorter (FACS; Becton-Dickinson), their extinction greatly differentiated, see.Fig. 8. The fluorescent cells are re-concentrated by centrifugation and taken up in tissue culture medium. The viruses released by them in the further incubation are highly enriched for recombinant viruses, as can be seen in their further passage: the cells infected by them are recombinantly infected in high yield, ie they show the fluorescence caused by the GFP segment. The FACS selection can also be carried out after the first passage, ie on the cells infected with a mixture of recombinant and helper viruses, and then separates the recombinantly infected cells from the other cells which are either only infected by helper viruses or not at all.
Burns JC, Friedmann T, Driever W, Burrascano M, Yee JK. 1993. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: Concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033-8037.Burns JC, Friedmann T, Driever W, Burrascano M, Yee JK. 1993. Vesicular stomatitis virus Gglycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient genetransfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033-8037.
Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC. 1994. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263, 802-805.Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC. 1994. Green fluorescent protein as amarker for gene expression. Science 263, 802-805.
Cubitt AB, Heim R, Adams, SR, Boyd, AE, Gross LA, Tsien RY. 1995. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. TIBS 20, 448-455.Cubitt AB, Heim R, Adams, SR, Boyd, AE, Gross LA, Tsien RY. 1995. Understanding,improving and using green fluorescent proteins. TIBS 20, 448-455.
Flick R, Neumann G, Hoffmann E, Hobom G. 1996. Promoter elements in the influenza vRNA terminal structure. RNA 2 1046-1057.Flick R, Neumann G, Hoffmann E, Hobom G. 1996. Promoter elements in the influenza vRNAterminal structure. RNA 2 1046-1057.
Kozak M. 1991. An analysis of vertebrate mRNA sequences: intimations of translational control. J. Cell. Biol. 115, 887-903.Kozak M. 1991. An analysis of vertebrate mRNA sequences: intimations of translationalcontrol. J. Cell. Biol. 115, 887-903.
Krug RM, Alonso-Caplan FV, Julkunen I, Katz MG. 1989. Expression and replication of the influenza Virus genome. In: The influenza viruses (RM Krug, ed.) Plenum Press, NY, p. 89-152.Krug RM, Alonso-Caplan FV, Julkunen I, Katz MG. 1989. Expression and replication of theinfluenza virus genome. In: The influenza viruses (RM Krug, ed.) Plenum Press, NY, p.89-152.
Menke A, Hobom G. 1997. Anliviral ribozymes - new jobs for ancient molecules. In Molecular Biotechnology (Walker JM, ed) in press.Menke A, Hobom G. 1997. Anliviral ribozymes - new jobs for ancient molecules. In MolecularBiotechnology (Walker JM, ed) in press.
Meyers G, Rümenapf T, Thier HJ. 1989. Molecular cloning and nucleotide sequence of the genome of hog cholera virus. Virology 171, 555-567.Meyers G, Rümenapf T, Thier HJ. 1989. Molecular cloning and nucleotide sequence of thegenome of hog cholera virus. Virology 171, 555-567.
Neumann G, Zobel A, Hobom G. 1994. RNA polymerase I-mediated expression of influenza viral RNA moldecules. Virology 202, 477-479.Neumann G, Zobel A, Hobom G. 1994. RNA polymerase I-mediated expression of influenzaviral RNA moldecules. Virology 202, 477-479.
Neumann G, Hobom G. 1995. Mutational analysis of influenza virus promoter elements in vivo. J. Gen. Virol. 76, 1709-1717.Neumann G, Hobom G. 1995. Mutational analysis of influenza virus promoter elements invivo. J. Gen. Virol. 76, 1709-1717.
Percy N, Barclay WS, Garcia-Sastre A, Palese P. 1995. Expression of a foreign protein by influenza A virus. J. Virol 68, 4486-4492.Percy N, Barclay WS, Garcia-Sastre A, Palese P. 1995. Expression of a foreign protein byinfluenza A virus. J. Virol 68, 4486-4492.
Rümenapf T, Unger G, Strauss JH, Thiel HJ. 1993. Processing of the envelope glycoproteins of pestiviruses. J. Virol. 67, 3288-3295.Rümenapf T, Unger G, Strauss JH, Thiel HJ. 1993. Processing of the envelope glycoproteinsof pestiviruses. J. Virol. 67, 3288-3295.
Schnell M, Mebatsion T, Conzelmann KK. 1994. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J. 13, 4195-4203.Schnell M, Mebatsion T, Conzelmann KK. 1994. Infectious rabies viruses from cloned cDNA.EMBO J. 13, 4195-4203.
Scholtissek C, Vallbracht A, Flehmig B, Rott R. 1979. Corrrelation of pathogenicity and gene constellation of influenza A virus. II. Highly neurovirulent recombinants derived from nonneurovirulent or weakly neurovirulent parent virus strains. Virology 95, 492-500.Scholtissek C, Vallbracht A, Flehmig B, Rott R. 1979. Correlation of pathogenicity and geneconstellation of influenza A virus. II. Highly neurovirulent recombinants derived from nonneurovirulent or weakly neurovirulent parent virus strains. Virology 95, 492-500.
Sidhu MS, Chan J, Kaelin K, Spielhofer P, Radecke F, Schneider H, Masurekar M, Dowling, PC, Billeter MA, Udem SA. 1995. Rescue of synthetic measles virus minireplicons: Measles genomic termini direct efficient expression and propagation of a reporter gene. Virologv 208, 800-807.Sidhu MS, Chan J, Kaelin K, Spielhofer P, Radecke F, Schneider H, Masurekar M, Dowling,PC, Billeter MA, Udem SA. 1995. Rescue of synthetic measles virus minireplicons: Measlesgenomic terms direct efficient expression and propagation of a reporter gene. Virologv 208,800-807.
Siemering KR, Golbick R, Sever R, Haseloff J. 1996. Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein. Curr. Biol. 6 1653-1633.Siemering KR, Golbick R, Sever R, Haseloff J. 1996. Mutations that suppress thethermosensitivity of green fluorescent protein. Curr. Biol. 6 1653-1633.
Zobel A, Neumann G, Hobom G. 1993. RNA polymerase I catalysed transcription of insert viral cDNA. Nucleic Acids Res. 21, 3607-3614.Zobel A, Neumann G, Hobom G. 1993. RNA polymerase I catalysed transcription of insertviral cDNA. Nucleic Acids Res. 21, 3607-3614.
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| DE60033284T3 (en) | IN VITRO RECONSTITUTION OF SEGMENTED NEGATIVE RADIATION RNA VIRUSES | |
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| DE69633581T2 (en) | ALPHAVIRUS RNA REPLICON SYSTEMS | |
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