DE19637230A1 - Exendin analogues, process for their preparation and medicaments containing them - Google Patents

Abstract

Peptides (I) and (II), their salts and esters, and derivatives with residues 1, 2, 28, 29 and/or 30 deleted, are new: R1R2N-HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGX-COR3 (I) R1R2N-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGX-COR3 (II) R1 = hydrogen, acetyl, trifluoroacetyl, adamantyl, fluorenyloxymethyl, benzyloxymethyl, butoxycarbonyl, Alloc (not defined), 1-6C alkyl, 2-8C alkenyl or 7-9C aralkyl R2 = R1 except that 1-6C alkyl is replaced by 4-6C alkyl R3 = OR4 or NR4R5 R4 = H or 1-6C alkyl R5 = H or 1-6C alkyl. Also new are derivatives of (I) and (II), with up to 11 specific modifications in the peptide chain.

Description

Translated fromGerman

Diese Erfindung betrifft neue Exendin-Analoga, welche bei der Therapie des Diabetes mellitus eingesetzt werden können, Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel.This invention relates to novel exendin analogs useful in the therapy of diabetesmellitus can be used, process for their preparation and containing themDrug.

Hintergrund der ErfindungBackground of the invention

Eine funktionelle Verbindung zwischen Dünndarm und exokrinem Pankreas wurde in den sechziger Jahren bewiesen, nachdem die exakte Bestimmung von Insulin im Plasma möglich wurde. Die Insulinantwort nach oraler Glukosegabe ist wesentlich kräftiger als die nach intravenöser Glukoseapplikation, auch wenn identische Glukoseplasmaspiegel erreicht werden. Diesen "Inkretin-Effekt" erklärt man im funktionellen Verbund der entero-insulären Achse. Verantwortlich für diesen Effekt sind Darmhormone, die nach Mahlzeiten vom Dünndarm freigesetzt, erhöht meßbar im Plasma zirkulieren und die Glukose-induzierte Insulinfreisetzung verstärken. Neben dem klassischen Inkretinhormon "Gastric inhibitory polypeptide I" (GIP), ist heute "Glucagon-like peptide-1" (GLP-1) in den Vordergrund des Interesses gerückt. In relativ kurzer Zeit ist GLP-1 vom physiologisch interessantesten Inkretinhormon-Kandidaten zur potentiellen Alternative zur Behandlung des Diabetes mellitus Typ II gereift. Die vorliegende Erfindung beschreibt neue Substanzen, die dem natürlich vorkommenden GLP-1 Molekül in der Wirkung nachempfunden sind. Die neuen Substanzen zeichnen sich durch erhöhte Stabilität bei erhaltener Wirksamkeit aus.A functional connection between small intestine and exocrine pancreas has been reported in theSixties proved after the accurate determination of insulin in the plasmabecame possible. The insulin response after oral glucose administration is much stronger thanthose after intravenous glucose administration, even if identical glucose plasma levelsbe achieved. This "incretin effect" is explained in the functional combination ofentero-insular axis. This effect is caused by intestinal hormones, which afterMeals released from the small intestine, increased measurably circulate in the plasma and theEnhance glucose-induced insulin release. In addition to the classic incretin hormone"Gastric inhibitory polypeptide I" (GIP), is today "glucagon-like peptide-1" (GLP-1) inthe foreground of interest. In a relatively short time GLP-1 is fromphysiologically most interesting incretin hormone candidates as a potential alternativeFor the treatment of diabetes mellitus type II matured. The present inventiondescribes new substances that bind to the naturally occurring GLP-1 molecule in theEffect are modeled. The new substances are characterized by increasedStability while maintaining efficacy.

Antidiabetogene WirkungAntidiabetogenic effect

Infusion und subkutane Injektion von GLP-1 bewirken bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ II eine deutliche Steigerung der Insulinsekretion sowie eine Hemmung der Glukagonfreisetzung (Gutniak, M. (1992); Kreymann, B. (1987); Nathan, D.M. (1992); Nauck, M.A. (1993a & b)). Beides ist aus therapeutischer Sicht von Interesse und an der blutzuckersenkenden Wirkung von GLP-1 beteiligt: Insulin fördert an seinen Zielgeweben die Glukoseaufnahme sowie eine Hemmung der Glukoneogenese. Desweiteren ist bei GLP-1-Analogen eine Verstärkung der Glukoseaufnahme in der Peripherie zu erwarten. Die Hemmung der Glukagonsekretion muß als indirekte GLP-1-Wirkung angesehen werden, da Glukagon-produzierende A-Zellen keine GLP-1 Rezeptoren exprimieren (Komatsu, R. (1989)). Vielmehr scheint dafür die erhöhte Insulin- und Somatostatinfreisetzung ausschlaggebend zu sein. Beide Hormone sind als Hemmstoffe der Glukagonfreisetzung bekannt.Infusion and subcutaneous injection of GLP-1 cause in patients with diabetesType II mellitus a significant increase in insulin secretion and inhibition of insulin secretionGlucagon release (Gutniak, M. (1992); Kreymann, B. (1987); Nathan, D.M. (1992); Nauck, M.A. (1993a & b)). Both are from a therapeutic point of interest and at thehypoglycemic effect of GLP-1 involved: insulin promotes itsTarget tissues the glucose uptake and an inhibition of gluconeogenesis.Furthermore, in GLP-1 analogues an increase in glucose uptake in thePeriphery expected. The inhibition of glucagon secretion must be as indirect GLP-1Effect, since glucagon-producing A cells are not GLP-1Express receptors (Komatsu, R. (1989)). Rather, it seems the increasedInsulin and somatostatin release to be crucial. Both hormones are asInhibitors of glucagon release known.

Sicherlich tragen zwei molekulare Mechanismen zur GLP-1-induzierten Insulinfreisetzung bei Diabetes mellitus Typ II bei. Neben der direkten Verstärkung der Glukose-induzierten Insulinfreisetzung sensibilisiert GLP-1 eine Subgruppe von B-Zellen gegenüber dem Schlüsselreiz "Glukose" (Fehmann, H.C. (1991)) und möglicherweise auch gegenüber weiteren Stimuli, so daß insgesamt mehr B-Zellen Insulin sezernieren. Diese "Priming"-Wirkung erklärt am ehesten die Tatsache, daß GLP-1 trotz seiner relativ kurzen Plasma-Halbwertszeit zu einer langanhaltenden Insulinfreisetzung führt.Certainly, two molecular mechanisms contribute to GLP-1-inducedInsulin release in diabetes mellitus type II at. In addition to the direct reinforcement ofGlucose-induced insulin release sensitizes GLP-1 to a subset of B cellsto the key stimulus "glucose" (Fehmann, H.C. (1991)) and possiblyalso against other stimuli, so that a total of more B cells secrete insulin.This "priming" effect most likely explains the fact that GLP-1, despite its relativeshort plasma half-life leads to a prolonged insulin release.

Diese Wirkung ist abhängig von erhöhten Glukose-Spiegeln (< 108 mg/dl) (Göke, R. (1993a)). Sie unterscheidet GLP-1 grundsätzlich von den Sulfonylharnstoffen, die die Insulinsekretion unabhängig vom Glukose-Plasmaspiegel beeinflussen. Sinkt der Glukosewert unter 108 mg/dl, so versiegt die Insulinsekretion selbst bei intravenöser Infusion von GLP-1. Daher sind beim therapeutischen Einsatz von GLP-1 kaum Hypoglykämien zu erwarten. Tatsächlich wurden sie in den bisherigen klinischen Studien auch nicht beschrieben. Problematisch sind allerdings die pharmakokinetischen Eigenschaften von GLP-1. Aufgrund seiner sehr kurzen Halbwertszeit ist die Wirkdauer nur begrenzt.This effect is dependent on increased glucose levels (<108 mg / dl) (Göke, R.(1993a)). It distinguishes GLP-1 in principle from the sulfonylureas, which are theInfluencing Insulin Secretion Regardless of Glucose Plasma Levels. Is that sinking?Glucose value below 108 mg / dl, the insulin secretion will dry up even with intravenousInfusion of GLP-1. Therefore, the therapeutic use of GLP-1 hardlyTo expect hypoglycemia. In fact, they have been in previous clinical trialsalso not described. However, the pharmacokinetic problems are problematicProperties of GLP-1. Due to its very short half-life, the duration of action isonly limited.

Aus therapeutischer Sicht ist in jedem Fall die Synthese stabiler und wirkungsstarker GLP-1 analoger Peptide wünschenswert. Es wurden nun auf der Basis des ursprünglich aus dem Gift von Echsen isolierten Moleküls Exendin Peptidanaloga synthetisiert, mit dem Ziel verbesserte abbaustabilisierte Therapeutika mit verlängerter Wirkdauer zur Behandlung des Diabetes mellitus zu entwickeln. Diese Peptide haben die gleiche pharmakologische Wirkung wie GLP-1, weisen aber überraschenderweise eine deutlich längere Halbwertszeit auf.From a therapeutic point of view, in every case the synthesis is more stable and more effectiveGLP-1 analog peptides desirable. It has now been based on the originalsynthesized from the venom of lizard isolated molecule exendin peptide analogues, with to the goal of improved degradation-stabilized therapeutics with extended duration of actionDevelop diabetes mellitus treatment. These peptides have the samepharmacological action such as GLP-1, but surprisingly have a clearlonger half-life.

Die als Gegenstand der Erfindung beschriebenen neuen Peptidsequenzen zeigen Wirkung auf Insulinsynthese und -abgabe sowie Wirkung auf den Insulineffekt insbesondere die Glucoseaufnahme in den Zielgeweben Muskel- und Fettgewebe, sowie der Magenentleerung.The novel peptide sequences described as the subject of the invention show activityon insulin synthesis and delivery as well as effect on the insulin effect in particular theGlucose uptake in the target tissues muscle and adipose tissue, as well as theGastric emptying.

Gegenstand der ErfindungSubject of the invention

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Sequenz von Exendin-3 und Exendin-t, Peptiden, welche aus dem Sekret von Heloderma horridum bzw. Heloderma suspectum isoliert wurden (Eng, J. et al. (1990, 1992)). Die Aminosäuren-Sequenz und Wirkung der beiden Peptide am Pankreas wurde bereits von mehreren Autoren publiziert (Eng, J. et al. (1990); Raufman, J. P. (1992); Göke, R. (1993b); Thorens, B. (1993)). Gegenstand dieser Erfindung sind neue verkürzte Exendin-Fragmente, welche die Aminosäuresequenzen von Exendin-3-(1-30), oder Exendin-4-(1-30) umfassen, wobei das C-terminale Ende dieser Sequenzen um bis zu 3 Aminosäuren verkürzt, vorzugsweise um höchstens 1 Aminosäure, und das N-terminale Ende um bis zu 2, vorzugsweise höchstens 1 Aminosäure, verkürzt sein kann. Besonders bevorzugt sind also Peptidfragmente mit den folgenden Sequenzen; insbesondere sind die Peptidfragmente, die auf Exendendin-3-(1-30) (Seq. ID No. 1) beruhen:The present invention is based on the sequence of exendin-3 and exendin-t,Peptides derived from the secretions of Heloderma horridum and Heloderma suspectum, respectively(Eng, J. et al. (1990, 1992)). The amino acid sequence and effect ofBoth peptides at the pancreas have already been published by several authors (Eng, J. etal. (1990); Raufman, J.P. (1992); Göke, R. (1993b); Thorens, B. (1993)). objectof this invention are new truncated exendin fragments containing theAmino acid sequences of exendin-3- (1-30), or exendin-4- (1-30), whereinshortened the C-terminal end of these sequences by up to 3 amino acids,preferably at most 1 amino acid, and the N-terminal end by up to 2,preferably at most 1 amino acid, may be shortened. Particularly preferredthat is, peptide fragments having the following sequences; in particular, thePeptide Fragments Based on Exendendin-3- (1-30) (SEQ ID NO: 1):

wobei die Aminosäuren an Position 1, 2, 28, 29 oder 30 je nach gewünschter Kettenlänge Teil der Sequenz sein können. Die Peptide sind vom N-Terminus zum C-Terininus durchnumeriert. X₁ bedeutet eine proteogene oder nichtproteogene Aminosäure außer Glycin.the amino acids being in position 1, 2, 28, 29 or 30 depending on the desiredChain length can be part of the sequence. The peptides are from the N-terminus toNumbered C-terininus. X₁ represents a proteogenic or nonproteogenicAmino acid except glycine.

Die Carboxylgruppe COR₃ der Aminosäure am C-terminalen Ende kann in freier Form (R₃ = OH) oder in Form eines physiologisch verträglichen Alkali- oder Erdalkalisalzes, wie z. B. des Natrium-, Kalium- oder Calciumsalzes vorliegen. Die Carboxylgruppe kann auch mit primären, sekundären oder tertiären Alkoholen verestert sein, wie z. B. Methanol, verzweigten oder unverzweigten C₁-C₆-Alkylalkoholen, insbesondere Ethylalkohol oder tert.-Butanol. Die Carboxylgruppe kann aber auch mit primären oder sekundären Aminen amidiert sein, wie z. B. Ammoniak, verzweigten oder unverzweigten C₁-C₆-Alkylaminen oder C₁-C₆-Di-Alkylaminen, insbesondere Methylamin oder Dimethylamin.The carboxyl group COR₃ of the amino acid at the C-terminal end can be in free form(R₃ = OH) or in the form of a physiologically acceptable alkali metal or alkaline earth metal salt,such as As the sodium, potassium or calcium salt. The carboxyl group canalso be esterified with primary, secondary or tertiary alcohols, such as. B.Methanol, branched or unbranched C₁-C₆-alkyl alcohols, in particularEthyl alcohol or tert-butanol. The carboxyl group can also be used with primary orbe amidated secondary amines, such as. As ammonia, branched or unbranchedC₁-C₆-alkylamines or C₁-C₆-di-alkylamines, in particular methylamine orDimethylamine.

Die Aminogruppe der Aminosäure NR₁R₂ am N-terminalen Ende kann in freier Form (R₁, R₂ = H) oder in Form eines physiologisch verträglichen Salzes, wie z. B. des Chlorides oder Acetats vorliegen. Die Aminogruppe kann auch mit Säuren acetyliert sein, so daß R₁ = H und R₂ = Acetyl-, Trifluoracetyl-, Adamantyl-, oder durch die gängigen Aminoschutzgruppen der Peptidchemie, wie z. B. Fmoc, Z, Boc, Alloc geschützt vorliegen, oder N-alkyliert sein mit R₁ und/oder R₂ = C₁-C₆-Alkyl oder C₂-C₈-Alkenyl oder C₇-C₉-Aralkyl.The amino group of the amino acid NR₁R₂ at the N-terminal end can be in free form(R₁, R₂ = H) or in the form of a physiologically acceptable salt, such as. B. ofChlorides or acetate are present. The amino group can also be acetylated with acidsbe such that R₁ = H and R₂ = acetyl, trifluoroacetyl, adamantyl, or by the common amino protecting groups of peptide chemistry, such as. Fmoc, Z, Boc, Allocbe protected, or N-alkylated with R₁ and / or R₂ = C₁-C₆-alkyl or C₂-C₈-Alkenyl or C₇-C₉-aralkyl.

Unter Alkylresten werden geradkettige, verzweigte oder gegebenenfalls ringförmige Alkylreste verstanden, vorzugsweise Methyl, Ethyl, Isopropyl und Cyclohexyl.Alkyl radicals are straight-chain, branched or optionally cyclicAlkyl radicals understood, preferably methyl, ethyl, isopropyl and cyclohexyl.

Alle Exendin-Fragmente können als voll oder partiell geschützte Derivate vorliegen.All exendin fragments can be present as fully or partially protected derivatives.

Gegenstand dieser Erfindung sind außerdem Exendin-Fragmente mit den oben genannten Eigenschaften und Sequenzlängen, bei denen zusätzlich mindestens eine aber maximal elf der unter (a) bis (p) aufgeführten Modifikationen durchgeführt wurden. Bevorzugt sind solche Exendin-Fragmente, die maximal 9, besonders bevorzugt sind solche, die maximal 5 der unter (a) bis (p) aufgeführten Modifikationen aufweisen.The invention also relates to exendin fragments with the abovementionedProperties and sequence lengths, in which additionally at least one but a maximum of eleventhe modifications listed under (a) to (p) were carried out. Preferred arethose exendin fragments which are maximally 9, more preferred are those which are maximal5 have the modifications listed under (a) to (p).

• (a) Die α-Aminosäure in Position 1 ist D-His, Ala, D-Ala, Gly, Lys oder D-Lys, wobei Ala, Gly oder Lys besonders bevorzugt werden; oder(a) The α-amino acid in position 1 is D-His, Ala, D-Ala, Gly, Lys or D-Lys, whereinAla, Gly or Lys are particularly preferred; or
• (b) Die α-Aminosaure in Position 2 ist Ser, D-Ser, Thr, D-Thr, Gly, Ala, D-Ala, Ile, D-Ile, Val, D-Val, Leu oder D-Leu, bevorzugt Ser, Thr, Gly, Ala, Val, Ile oder Leu; oder(b) The α-amino acid in position 2 is Ser, D-Ser, Thr, D-Thr, Gly, Ala, D-Ala, Ile,D-Ile, Val, D-Val, Leu or D-Leu, preferably Ser, Thr, Gly, Ala, Val, Ile or Leu;or
• (c) Die α-Aminosäure in Position 3 ist Glu, D-Glu, Asp, D-Asp, Ala oder D-Ala, bevorzugt Glu, Asp oder Ala; oder(c) The α-amino acid in position 3 is Glu, D-Glu, Asp, D-Asp, Ala or D-Ala,preferably Glu, Asp or Ala; or
• (d) Die Aminosäure in Position 4 ist Ala, D-Ala oder β-Ala, bevorzugt Ala; oder(d) The amino acid in position 4 is Ala, D-Ala or β-Ala, preferably Ala; or
• (e) Die α-Aminosäure in Position 5 ist Ser, Tyr oder Ala; oder(e) The α-amino acid in position 5 is Ser, Tyr or Ala; or
• (f) Die α-Aminosaure in Position 6 ist Ala, Ile, Val, Leu, Cha oder Tyr, bevorzugt Ala, Ile, Val, Leu oder Tyr; oder(f) The α-amino acid in position 6 is Ala, Ile, Val, Leu, Cha or TyrAla, Ile, Val, Leu or Tyr; or
• (g) Die α-Aminosäure in Position 7 ist Ala, D-Ala, Tyr, D-Tyr, Ser, D-Ser oder D-Thr, bevorzugt Ala, Tyr oder Ser; oder(g) The α-amino acid in position 7 is Ala, D-Ala, Tyr, D-Tyr, Ser, D-Ser or D-Thr,preferably Ala, Tyr or Ser; or
• (h) Die α-Aminosäure in Position 8 ist Ala, Tyr oder Thr; oder(h) The α-amino acid in position 8 is Ala, Tyr or Thr; or
• (i) Die α-Aminosäure in Position 9 ist Ala, D-Ala, Glu, D-Glu oder D-Asp, bevorzugt Ala oder Glu; oder(i) The α-amino acid in position 9 is Ala, D-Ala, Glu, D-Glu or D-Asp,preferably Ala or Glu; or 
• (j) Die Aminosäuren in Position 10, 11, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 28, 29 sind unabhängig voneinander eine proteinogene oder nicht-proteinogene D- oder L-Aminosäure, bevorzugt eine proteinogene L-Aminosäure; oder(j) The amino acids at positions 10, 11, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 28, 29are independently a proteinogenic or non-proteinogenic D- orL-amino acid, preferably a proteinogenic L-amino acid; or
• (k) Die α-Aminosäure in Position 13 ist eine neutrale L-Aminosäure, bevorzugt eine neutrale proteinogene L-Aminosäure; oder(k) The α-amino acid in position 13 is a neutral L-amino acid, preferably oneneutral proteinogenic L-amino acid; or
• (l) Die α-Aminosäure in Position 14 wird zur Stabilisierung ersetzt durch eine neutrale L- oder D-Aminosäure, außer L-Leucin, bevorzugt durch Nle, D-Nle, Ala, D-Ala, Ile, D-Ile, Val oder D-Val, besonders bevorzugt sind Ile, Val oder Ala; oder(l) The α-amino acid in position 14 is replaced by a neutral one for stabilizationL- or D-amino acid, except L-leucine, preferably by Nle, D-Nle, Ala,D-Ala, Ile, D-Ile, Val or D-Val, particularly preferred are Ile, Val or Ala; or
• (m) Die α-Aminosäure in Position 22 ist D-Phe, Tyr, D-Tyr, Leu, D-Leu, Val, D-Val, L-Cha, D-Cha, β-1-Nal, β-2-Nal oder β-1-D-Nal, bevorzugt sind Tyr, Leu oder Val; oder(m) The α-amino acid in position 22 is D-Phe, Tyr, D-Tyr, Leu, D-Leu, Val, D-Val,L-Cha, D-Cha, β-1-Nal, β-2-Nal or β-1-D-Nal, preferably Tyr, Leu orVal; or
• (n) Die α-Aminosäure in Position 23 ist Leu, D-Leu, D-Ile, Val, D-Val, L-Cha, D-Cha, Tyr, D-Tyr, Phe oder D-Phe, bevorzugt sind Leu, Val, Tyr oder Phe; oder(n) The α-amino acid in position 23 is Leu, D-Leu, D-Ile, Val, D-Val, L-Cha,D-Cha, Tyr, D-Tyr, Phe or D-Phe, preferred are Leu, Val, Tyr or Phe; or
• (o) Die α-Aminosäure in Position 25, 26 oder 27 ist eine neutrale L- oder D-Aminosäure, bevorzugt eine neutrale, proteinogene L-Aminosäure; oder(o) The α-amino acid in position 25, 26 or 27 is a neutral L orD-amino acid, preferably a neutral, proteinogenic L-amino acid; or
• (p) Die α-Aminosäure in Position 30 ist eine proteinogene oder nicht-proteinogene D- oder L-Aminosäure außer Glycin, bevorzugt Arg, D-Arg, Tyr oder D-Tyr, besonders bevorzugt sind Arg oder Tyr.(p) The α-amino acid at position 30 is a proteinogenic or non-proteinogenic D-or L-amino acid except glycine, preferably Arg, D-Arg, Tyr or D-Tyr, especiallypreferred are Arg or Tyr.

Unter den neuen Exendin-Fragmenten sind solche besonders bevorzugt, welche neben den schon genannten Eigenschaften und Sequenzlängen, an Position 10 die Aminosäure Leucin und/oder an Position 19 die Aminosäure Valin, an Position 14 anstelle von Methionin die Aminosäure Isoleucin oder Alanin und an Position 30 Arginin enthalten. Besonders bevorzugt sind auch diejenigen Modifikationen von Exendin-Fragmenten, bei denen sich, zusätzlich zu den erwähnten besonders bevorzugten Aminosäuren an den Positionen 10, 14, 19 und 30, an der Position 2 eine der 20 bekannten proteinogenen L-Aminosäuren befindet.Among the new exendin fragments, those which are particularly preferred are those which are adjacentthe already mentioned properties and sequence lengths, at position 10 the amino acidLeucine and / or at position 19 the amino acid valine, at position 14 instead ofMethionine contain the amino acid isoleucine or alanine and at position 30 arginine.Also particularly preferred are those modifications of exendin fragmentswhich, in addition to the mentioned particularly preferred amino acids to thePositions 10, 14, 19 and 30, at position 2 one of the 20 known proteinogenicL-amino acids is located.

Gegenstand der Erfindung sind neben neuen verkürzten und stabilisierten Exendin-3 und Exendin-4 Analoga auch Verfahren zur Herstellung dieser Analoga, bei denen man die Analoga in Festphasensynthese aus geschützten, in den Analoga enthaltenen Aminosäuren, herstellt, die in der Reihenfolge aneinander gekoppelt werden, welche den Aminosäuresequenzen in den Analoga entsprechen und welche gegebenenfalls durch entsprechende nicht in den natürlichen Exendin-Peptiden vorkommende Aminosäuren ergänzt wurden.The invention, in addition to new truncated and stabilized exendin-3 andExendin-4 analogues also methods for preparing these analogs, which include theAnalogs in solid-phase synthesis from protected, contained in the analogues Amino acids, which are coupled together in the order which theAmino acid sequences correspond in the analogues and which optionally bycorresponding amino acids not found in the natural exendin peptideswere supplemented.

Das Glycin in Position 30, der Exendin-3 oder Exendin-4-Sequenz wurde gegen eine andere proteogene oder nicht-proteogene Aminosäure ausgetauscht, um bei der Synthese nach der Abspaltung der aminoterminalen Schutzgruppe, keine Diketopiperazinbildung vorliegen zu haben.The glycine at position 30, the exendin-3 or exendin-4 sequence was raised against aother proteogenic or non-proteogenic amino acid exchanged to aid in the synthesisafter cleavage of the amino-terminal protecting group, no diketopiperazine formationto have available.

Die Exendin-(1-30)-Analoga und Fragmente sind gegenüber den Exendinen-1(1-39) vorteilhaft, da durch die kürzeren Sequenzen diese Analoga einfacher und in höheren Ausbeuten synthetisiert werden können.The exendin (1-30) analogs and fragments are opposite to the exendins-1 (1-39)advantageous because the shorter sequences make these analogues easier and higherYields can be synthesized.

Die verwendeten Abkürzungen und Definitionen der Aminosäuren wurden in Pure Appl. Chem. 31, 639-45 (1972) und ibid. 40, 277-90 (1974) empfohlen und stimmen mit den PCT-Regeln (WIPO Standard St. 23: Recommendation for the Presentation of Nucleotide and Amino Acid Sequences in Patent Applications and in Published Patent Documents) überein. Die Ein- bzw. Drei-Buchstabencodes sind wie folgt:The abbreviations and definitions of the amino acids used were described in Pure Appl.Chem. 31, 639-45 (1972) and ibid. 40, 277-90 (1974) and agree with thePCT Rules (WIPO Standard St. 23: Recommendation for the Presentation ofNucleotide and Amino Acid Sequences in Patent Applications and Published PatentDocuments). The one- or three-letter codes are as follows:

Die Abkürzungen stehen für L-Aminosäuren, falls keine weiteren Spezifikationen wie D- oder D,L- angegeben sind. D-Aminosäuren werden im Ein-Buchstabencode mit kleinen Buchstaben geschrieben. Bestimmte Aminosäuren, natürliche wie nichtnatürliche sind achiral, z. B. Glycin. Bei der Darstellung aller Peptide befindet sich das N-terminale Ende links und das C-terminale Ende rechts.The abbreviations stand for L-amino acids, if no other specifications such as D-or D, L- are indicated. D-Amino acids are in single-letter code with smallLetters written. Certain amino acids are natural and unnaturalachiral, z. B. glycine. In the representation of all peptides is the N-terminal endon the left and the C-terminal end on the right.

Beispiele für nichtproteinogene Aminosäuren sind in folgender Auflistung mit ihren Abkürzungen angegeben:Examples of nonproteinogenic amino acids are listed below with theirAbbreviations indicated:

β-Alaninβ-alanineβ-Alaβ-Alao-Aminobenzoesäureo-amino benzoic acidOaboabm-Aminobenzoesäurem-aminobenzoic acidMabMabp-Aminobenzoesäurep-aminobenzoic acidPabPabm-Aminomethylbenzoesäurem-aminomethylbenzoic acidAmbAmbω-Aminohexansäureω-aminohexanoic acidAhxAhxω-Aminoheptansäureω-aminoheptanoicAhpahpω-Aminooctansäureω-aminooctanoic acidAocAOC ω-Aminodecansäureω-aminodecanoicAdeAdeω-Aminotetradecansäureω-AminotetradecansäureAtdAtdCitruilinCitruilinCitCitCyclohexylalanincyclohexylalanineChaChaα,γ-Diaminobuttersäureα, γ-diaminobutyric acidDabDabα,β-Diaminoprnpionsäureα, β-DiaminoprnpionsäureDapDapMethionin-SulfoxidMethionine sulfoxideMet(O)Met (O)C^α-Methyl-AlaninC^α -methyl-alanineAibAibN-Methyl-Glycin (Sarkosin)N-methyl-glycine (sarcosine)SarSarNaphtylalaninnaphthylalanineNaN / ANorleucinnorleucineNieNeverOrnithinornithineOrnOrn1,2,3,4-Tetrahydroisochinoiin-3-carbonsäure1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acidTicTic

Alle Aminosäuren lassen sich nach ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften in die folgenden drei Hauptklassen unterteilen:
Sauer: Die Aminosäure gibt in wäßriger Lösung und bei physiologischem pH ein Proton ab und trägt infolgedessen eine negative Ladung.All amino acids can be subdivided into the following three main classes according to their physicochemical properties:
Sauer: The amino acid releases a proton in aqueous solution and at physiological pH and consequently carries a negative charge.

Basisch: Die Aminosäure nimmt in wäßriger Lösung und bei physiologischem pH ein Proton auf und trägt infolgedessen eine positive Ladung.Basic: The amino acid is absorbed in aqueous solution and at physiological pHProton and consequently carries a positive charge.

Neutral: Die Aminosäure ist in wäßriger Lösung und bei physiologischem pH in einem ungeladenen Zustand.Neutral: The amino acid is in aqueous solution and at physiological pH in oneuncharged condition.

Die Definition "trägt eine positive/negative Ladung" oder "ist im ungeladenen Zustand" trifft dabei dann zu, wenn im statistischen Mittel eine signifikante Anzahl von Aminosäuren einer Klasse (mindestens 25%) sich im genannten Zustand befindet.The definition "carries a positive / negative charge" or "is uncharged"applies in this case if, statistically, a significant number ofAmino acids of a class (at least 25%) is in the stated state.

Neben den 20 sogenannten proteinogenen Aminosäuren, deren Einbau in Proteine durch die Information des genetischen Codes geregelt ist, lassen sich auch nicht proteinogene über die beschriebenen Syntheseverfahren in Peptidsequenzen einbauen. Eine Aufzählung der proteinogenen Aminosäuren und deren Einteilung in die oben genannten drei Klassen ist in Tabelle 1 gegeben. Nicht-proteinogene Aminosäuren sind nicht genetisch codiert. Beispiele für nicht-proteinogene Aminosäuren und deren Einteilung in saure, basische oder neutrale Aminosäuren sind in Tabelle 1 gegeben.In addition to the 20 so-called proteinogenic amino acids, their incorporation into proteins byThe information of the genetic code is regulated, can not be proteinogenicincorporate into peptide sequences via the synthetic methods described. An enumeration of proteinogenic amino acids and their classification into the above three classesis given in Table 1. Non-proteinogenic amino acids are not genetically encoded.Examples of non-proteinogenic amino acids and their classification into acidic, basicor neutral amino acids are given in Table 1.

Tabelle 1 Table 1

Die Exendin Analoga, welche Gegenstand dieser Erfindung sind, besitzen vorteilhafte therapeutische Eigenschaften. So führen sie zu einer Stimulation der Insulinfreisetzung aus dem endokrinen Pankreas, zu einer Erhöhung der Insulinbiosynthese sowie zu einer vermehrten peripheren Glukose-Utilisation. Da diese Effekte nur bei gleichzeitig erhöhten Blutzuckerspiegeln zu beobachten sind, ist nach ihrer Verabreichung nicht mit dem Auftreten einer Hypoglykämie zu rechnen. Weiterhin hemmen die Exendin-Analoga die Glukagonfreisetzung aus dem endokrinen Pankreas und führen so zu einer Absenkung der Glukoneogenese. Die Exendin-Analoga führen beim nicht-insulinabhängigen Diabetes mellitus (NIDDM) zu einer deutlichen Verbesserung der Stoffwechselsituation. Insbesondere wird unabhängig von der Insulin-sekretorischen Wirkung die Glukoseaufnahme in Muskel- und Fettgewebe gesteigert. Aufgrund der inhibitorischen Wirkung auf die Glukagonfreisetzung ist auch die Verabreichung der Exendin-Analoga beim insulinabhängigen Diabetes mellitus sinnvoll. Gegenüber Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) und den bekannten Exendin-3 und Exendin-4 Sequenzen besitzen die erfindungsgemäßen Exendin-Analoga eine überraschend höhere Wirksamkeit in den verschiedenen Testsystemen, so daß sie für eine therapeutische Anwendung besser geeignet sind als GLP-1, Exendin-3 oder Exendin-4. Die Vorteile der neuen Exendin-Analoga sind insbesondere die folgenden: höhere Stabilität gegenüber Abbau und Metabolisierung, längere Wirkdauer, Wirksamkeit bei niedrigeren Dosen. Besondere bevorzugt sind Analoga auf Basis von Exendin-3, die besonders lange Wirkdauern oder Wirksamkeit bei besonders niedriger Dosis zeigen.The exendin analogs which are the subject of this invention have advantageoustherapeutic properties. So they lead to a stimulation of insulin releasefrom the endocrine pancreas, to an increase in Insulinbiosynthese as well as to aincreased peripheral glucose utilization. Because these effects only at the same timehigh blood sugar levels are not observed after their administrationthe occurrence of hypoglycaemia. Furthermore, the exendin analogs inhibitthe glucagon release from the endocrine pancreas and thus lead to aLowering gluconeogenesis. The exendin analogues give rise to non-Insulin-dependent diabetes mellitus (NIDDM) significantly improvedMetabolic condition. In particular, regardless of the insulin secretoryEffect increased the glucose uptake in muscle and fat tissues. Due to theThe inhibitory effect on glucagon release is also the administration of theExendin analogues in insulin-dependent diabetes mellitus makes sense. Across fromGlucagon-like peptide-1 (GLP-1) and the known exendin-3 and exendin-4Sequences possess the novel exendin analogues a surprisingly higherEffectiveness in the various test systems, making them suitable for a therapeuticApplication are more suitable than GLP-1, exendin-3 or exendin-4. The advantages of new exendin analogs are in particular the following: higher stabilityDegradation and metabolism, longer duration of action, efficacy at lower doses.Particular preference is given to analogs based on exendin-3, which are particularly longShow efficacy or efficacy at a particularly low dose.

Die Festphasen- und Flüssigphasensynthese ist ein übliches Verfahren zur Herstellung von Peptiden. Um das Verfahren für die Herstellung eines bestimmten Produktes im Hinblick auf die Reinheit des Rohproduktes und die Ausbeute zu optimieren, ist es erforderlich, die Prozeßparameter und die verwendeten Materialien, beispielsweise das Trägermaterial, die Reagenzien, welche Gruppen zur Reaktion bringen sollen, die Materialien für das Blockieren der Gruppen, welche nicht reagieren sollen, oder die Reagenzien, welche blocklerende Materialien abspalten, an das herzustellende Produkt, an die herzustellenden Zwischenprodukte bzw. Ausgangsmaterialien anzupassen. Diese Anpassung ist angesichts der Interpendenz der vielen Verfahrensparameter nicht einfach.Solid phase and liquid phase synthesis is a common method of preparationof peptides. To the process for the production of a certain product in theIt is to optimize the purity of the crude product and the yieldrequired, the process parameters and the materials used, for example theCarrier material, the reagents which are to bring the groups to react, theMaterials for blocking the groups that should not react, or theReagents which split off blocking materials to the product to be prepared,adapt to the intermediates or starting materials to be prepared. TheseAdaptation is not easy given the interpendency of the many process parameters.

Arzneimittel, welche die erfindungsgemäßen Peptide einzeln oder zusammen als aktiven Wirkstoff neben üblichen Hilfs-und Zusatzstoffen enthalten, werden vorzugsweise parenteral (subcutan, intramuskulär oder intravenös) verabreicht. In Frage kommen aber auch alle sonst üblichen Applikationsverfahren wie oral, rectal, buccal (einschließlich sublingual), pulmonal, transdermal, iontophoretisch, vaginal und intranasal. Das Arzneimittel hat eine insulinregulierende Wirkung und fördert dabei in vorteilhafter Weise den Ausgleich des Blutzuckerspiegels. Vorteilhaft für die Anwendung des Arzneimittels ist es, wenn Blutspiegel zwischen 20 und 50 pmol/l erreicht werden. Dazu sind Infusionsraten von 0,4-1,2 pmol/kg/Min. erforderlich. Bei subcutaner bzw. buccaler Applikation sind je nach galenischer Form und angestrebter Wirkdauer Substanzmengen von 5-500 nmol erforderlich.Medicaments containing the peptides of the invention individually or together as activeActive ingredient in addition to usual auxiliaries and additives are preferablyadministered parenterally (subcutaneously, intramuscularly or intravenously). In question but comealso all usual application methods such as oral, rectal, buccal (includingsublingual), pulmonary, transdermal, iontophoretic, vaginal and intranasal. TheMedicines have an insulin-regulating effect and thereby promotes beneficialWay the balance of blood sugar. Advantageous for the application ofDrug is when blood levels between 20 and 50 pmol / l are achieved. Toare infusion rates of 0.4-1.2 pmol / kg / min. required. In subcutaneous or buccalDepending on the galenic form and the desired duration of action, the application amount of substanceof 5-500 nmol required.

Die erfindungsgemäßen Exendin-Analoga oder pharmakologisch verträglichen Salze hiervon werden vorzugsweise als sterile Lyophilisate gelagert und vor der Applikation mit einer geeigneten isotonischen Lösung vermischt. In dieser Form können die Analoga dann injiziert, infundiert oder gegebenenfalls auch durch die Schleimhäute absorbiert werden. Als Lösungsmittel können die üblichen, für die Injektion oder Infusion geeigneten isotonischen, wäßrigen Systeme, die die bei Injektionslösungen üblichen Zusätze wie Stabilisierungsmittel und Lösungsvermittler enthalten, verwendet werden. Physiologische Kochsalzlösung oder gegebenenfalls durch Puffer isotonisch gestellte Lösungen werden in diesem Fall bevorzugt.The exendin analogs according to the invention or pharmacologically acceptable saltsthereof are preferably stored as sterile lyophilisates and before the applicationmixed with a suitable isotonic solution. In this form the analogues canthen injected, infused or possibly also absorbed through the mucous membranes become. As solvents may be the usual, for injection or infusionsuitable isotonic, aqueous systems, the usual in injection solutionsAdditives such as stabilizers and solubilizers are used.Physiological saline or optionally isotonic bufferedSolutions are preferred in this case.

Zusätze sind z. B. Tartrat- oder Citratpuffer, Ethanol, Komplexbildner (wie Ethylendianmintetraessigsäure und deren nichttoxischen Salze), hochmolekulare Polymere (wie flüssiges Polyethylenoxid) zur Viskositätsregelung. Flüssige Trägerstoffe für Injektionslösungen müssen steril sein und werden vorzugsweise in Ampullen abgefüllt. Feste Trägerstoffe sind z B. Stärke, Lactose, Mannit, Methylcellulose, Talkum, hochdisperse Kieselsäuren, höhermolekulare Fettsäuren (wie Stearinsäure), Gelantine, Agar-Agar, Calciumphosphat, Magnesiumstearat, tierische und pflanzliche Fette, feste hochmolekulare Polymere (wie Polyethylenglykol); für orale Applikation geeignete Zubereiteungen können falls gewünscht Geschmacks- und Süßstoffe enthalten. Für die nasale Applikation können Surfactants zur Verbesserung der Absorption durch die nasale Schleimhaut zugesetzt werden, z. B. Cholsäure, Taurocholsäure, Chenodeoxycholsäure, Glykolsäure, Dehydrocholsäure, Deoxycholsäure und Cyclodextrine.Additives are z. B. tartrate or citrate buffer, ethanol, complexing agents (suchEthylenedianmintetraessigsäure and their non-toxic salts), high molecular weightPolymers (such as liquid polyethylene oxide) for viscosity control. Liquid carriersfor injection solutions must be sterile and are preferably in ampoulesbottled. Solid carriers are, for example, starch, lactose, mannitol, methylcellulose,Talc, highly dispersed silicic acids, higher molecular weight fatty acids (such as stearic acid),Gelantine, agar-agar, calcium phosphate, magnesium stearate, animal and vegetableFat, solid high molecular weight polymers (such as polyethylene glycol); for oral administrationsuitable preparations may, if desired, contain flavorings and sweeteners.For nasal application, surfactants may improve absorptionthe nasal mucosa may be added, e.g. B. cholic acid, taurocholic acid,Chenodeoxycholic acid, glycolic acid, dehydrocholic acid, deoxycholic acid andCyclodextrins.

Die zu verabreichende Tagesdosis liegt im Bereich von 150-500 nmol. Die Bestimmung der biologischen Aktivität basiert auf Messungen gegen internationale Referenzpräparationen für Glucagon-like peptide-1, Exendin-3 oder Exendin-4 in einem gebräuchlichen Testverfahren für Glucagon-like peptide-1.The daily dose to be administered is in the range of 150-500 nmol. The determinationthe biological activity is based on measurements against internationalReference preparations for glucagon-like peptide-1, exendin-3 or exendin-4 in onecommon test procedure for glucagon-like peptide-1.

Die erfindungsgemäßen Exendin-Analoga können nach den in der Peptidsynthese üblichen Verfahren hergestellt werden, wie sie z. B. in J. M. Steward und J. D. Young "Solid Phase Peptide Synthesis", 2nd ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois (1984) und J. Meienhofer "Hormonal Proteins and Peptides", Vol. 2, Academic Press, New York, (1973) für die Festphasensynthese und in E. Schroder und K. Lubke "The Peptides", Vol. 1, Academic Press, New York, (1965) für die Flüssigphasensynthese beschrieben worden sind.The exendin analogues according to the invention can be synthesized according to the methods described in the Peptide Synthesiscustomary processes are prepared, as z. In J. M. Steward and J. D. Young"Solid Phase Peptide Synthesis", 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois (1984)and J. Meienhofer "Hormonal Proteins and Peptides", Vol. 2, Academic Press, NewYork, (1973) for solid-phase synthesis and in E. Schroder and K. Lubke "The Peptides, Vol. 1, Academic Press, New York, (1965) for liquid phase synthesishave been described.

Allgemeine Verfahren zur PeptidsyntheseGeneral Methods for Peptide Synthesis

Im allgemeinen werden bei der Synthese von Peptiden geschützte Aminosäuren zu einer wachsenden Peptidkette addiert. Die erste Aminosäure ist entweder an der Aminogruppe oder der Carboxylgruppe sowie an jeglicher reaktiver Gruppe in der Seitenkette geschützt. Diese geschützte Aminosäure wird entweder an einen inerten Träger gekoppelt oder kann auch in Lösung eingesetzt werden. Die nächste Aminosäure in der Peptidsequenz wird passend geschützt unter Bedingungen, welche die Ausbildung einer Amidbindung begünstigen, zu der ersten gegeben. Nachdem alle gewünschten Aminosäuren in der richtigen sequentiellen Abfolge gekuppelt wurden, werden die Schutzgruppen und gegebenenfalls die Trägerphase abgespalten. Das erhaltene rohe Polypeptid wird umgefällt und vorzugsweise chromatographisch zum Endprodukt gereinigt.In general, in the synthesis of peptides protected amino acids to agrowing peptide chain added. The first amino acid is either on the amino groupor the carboxyl group as well as any reactive group in the side chainprotected. This protected amino acid becomes either an inert carriercoupled or can also be used in solution. The next amino acid in thePeptide sequence is suitably protected under conditions involving the formation of aFavor amide bond, given to the first. After all the desiredAmino acids are coupled in the proper sequential order, theCleaved protective groups and optionally the carrier phase. The obtained rawPolypeptide is reprecipitated and preferably chromatographically to the final productcleaned.

Eine bevorzugte Methode zur Darstellung von Analoga physiologisch aktiver Polypeptide, mit weniger als etwa vierzig Aminosäuren, beinhaltet die Festphasenpeptidsynthese. Bei dieser Methode werden die α-Aminofunktionen (N^α) und jegliche reaktive Seitenketten mit säure- oder basenlabilen Gruppen geschützt. Die verwendeten Schutzgruppen sollten unter den Bedingungen der Knüpfung von Amidbindungen stabil sein, aber sich leicht abspalten lassen ohne die entstandene Polypeptidkette zu beeinträchtigen. Zu den geeigneten Schutzgruppen für die α-Aminofunktion gehören die folgenden Gruppen, sind aber nicht auf diese limitiert: t-Butyloxycarbonyl (Boc), Benzyloxycarbonyl (Z), o-Chlorbenzyloxycarbonyl, Bi­phenylisopropyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl (Amoc), α,α-Dimetyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, o-Nitrosulfenyl, 2-Cyano-t-butoxycarbonyl, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), 1-(4,4-dimethyl-2,6.dioxocylohex-1-yliden)ethyl (Dde) und ähnliche. Vorzugsweise wird 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) als N^α-Schutzgruppen eingesetzt.A preferred method for displaying analogs of physiologically active polypeptides, having less than about forty amino acids, involves solid phase peptide synthesis. In this method, the α-amino functions (N^α ) and any reactive side chains are protected with acid- or base-labile groups. The protecting groups used should be stable under the conditions of amide bond formation, but readily split off without adversely affecting the resulting polypeptide chain. Suitable protecting groups for the α-amino function include, but are not limited to, the following groups: t-butyloxycarbonyl (Boc), benzyloxycarbonyl (Z), o-chlorobenzyloxycarbonyl, bi-phenylisopropyloxycarbonyl, tert-amyloxycarbonyl (Amoc), α, α-Dimetyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, o-nitrosulfenyl, 2-cyano-t-butoxycarbonyl, 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), 1- (4,4-dimethyl-2,6-dioxy-cylohex-1-ylidene) -ethyl ( Dde) and similar. Preferably, 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) is used as N^α -protecting groups.

Zu den geeigneten Seitenkettenschutzgruppen gehören die folgenden, sind aber nicht auf diese limitiert: Acetyl, Allyl (All), Allyloxycarbonyl (Alloc), Benzyl (Bzl), Benzyloxycarbonyl (Z), t-Butyloxycarbonyl (Boc), Benzyloxymethyl (Bom), o-Brombenzyloxycarbonyl, t-Butyl (tBu), t-Butyldimethylsilyl, 2-Chlorbenzyl, 2-Chlorbenzyloxycarbonyl (2-ClZ), 2,6-Dichlorbenzyl, Cyclohexyl, Cyclopentyl, 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocylohex-1-yliden)ethyl (Dde), Isopropyl, 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzyl-sulfonyl (Mtr), 2,2,5,7,8 Pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc), Pivalyl, Tetrahydropyran-2-yl, Tosyl (Tos), 2,4,6-Trimethoxybenzyl, Trimethylsilyl und Trityl (Trt).Suitable side chain protecting groups include, but are not limited to, the followingthese are limited to: acetyl, allyl (all), allyloxycarbonyl (alloc), benzyl (bzl),Benzyloxycarbonyl (Z), t-butyloxycarbonyl (Boc), benzyloxymethyl (Bom), o-Bromobenzyloxycarbonyl, t-butyl (tBu), t-butyldimethylsilyl, 2-chlorobenzyl, 2-Chlorobenzyloxycarbonyl (2-ClZ), 2,6-dichlorobenzyl, cyclohexyl, cyclopentyl, 1- (4,4-dimethyl-2,6-dioxo-cyclohex-1-ylidene) ethyl (Dde), isopropyl, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzylsulfonyl (Mtr), 2,2,5,7,8 pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc), pivalyl,Tetrahydropyran-2-yl, tosyl (Tos), 2,4,6-trimethoxybenzyl, trimethylsilyl and trityl(Trt).

Bei der Festphasensynthese wird die C-terminale Amionosäure als erste an ein geeignetes Trägermaterial gekuppelt. Geeignete Trägermaterialien sind solche, die inert gegen die Reagenzien und die Reaktionsbedingungen der schrittweisen Kondensations- und Abspaltungsraktionen sind, und welche sich nicht in den benützten Reaktionsmedien lösen. Beispiele für kommerziell erhältliche Trägermaterialien beinhalten Styrol/Divinylbenzol Copolymerisate, welche mit reaktiven Gruppen und/oder Polyethylenglykol modifiziert wurden, so auch chlormethyliertes Styrol/Divinylbenzol Copolymer, hydroxy- oder aminomethyliertes Styrol/Divinylbenzol Copolymer und ähnliche. Mit 4-Benzyloxybenzylalkohol (Wang-Anker (Wang, S. S. 1973)) oder 2-Chlortritylchlorid (Barlos, K. et. al. 1989) derivatisiertes Polystyrol(1%)divinylbenzol oder TentaGel® (Rapp Polymere, Tübingen) wird bevorzugt eingesetzt, falls die Peptidsäure dargestellt werden soll. Handelt es sich um das Peptidamid, so wird das mit 5-(4′-aminomethyl)-3′,5′-dimethoxy-phenoxy)valeriansäure (PAL-Anker) (Albericio, F. et. al. 1987) oder der p-(2,4-Dimethoxyphenyl-aminomethyl)-phenoxy-Gruppe (Rink-Amid-Anker (Rink, H. 1987)) derivatisiertes Polystyrol(1%)divinylbenzol oder TentaGel® bevorzugt.In solid-phase synthesis, the C-terminal amino acid becomes the first to be suitableCarrier material coupled. Suitable carrier materials are those which are inert to theReagents and the reaction conditions of the stepwise condensation andAbspaltungsraktionen are, and which are not in the reaction media usedto solve. Examples of commercially available carrier materials includeStyrene / divinylbenzene copolymers which react with reactive groups and / orPolyethylene glycol were modified, as well as chloromethylated styrene / divinylbenzeneCopolymer, hydroxy or aminomethylated styrene / divinylbenzene copolymer andsimilar. With 4-benzyloxybenzyl alcohol (Wang anchor (Wang, S. S. 1973)) or 2-Chlorotrityl chloride (Barlos, K. et al., 1989) derivatized polystyrene (1%) divinylbenzeneor TentaGel® (Rapp Polymere, Tübingen) is preferably used, if thePeptide acid should be displayed. If it is the peptide amide, so that is with5- (4'-aminomethyl) -3 ', 5'-dimethoxyphenoxy) valeric acid (PAL anchor) (Albericio, F.et. al. 1987) or the p- (2,4-dimethoxyphenylaminomethyl) phenoxy group (RinkAmide anchor (Rink, H. 1987)) derivatized polystyrene (1%) divinylbenzene orTentaGel® preferred.

Die Anknüpfung an die polymeren Träger kann durch Reaktion der C-terminalen Fmoc­geschützten Aminosäure, unter Zusatz eines Aktivierungsreagenzes, in Ethanol, Acetonitril, N,N-Dimethylformamid (DMF), Dichlormethan, Tetrahydrofuran, N- Methylpyrrolidon oder ähnlichen Solventien, vorzugsweise in DMF, mit dem Trägermaterial bei Raumtemperatur oder erhöhten Temperaturen, z. B. zwischen 40°C und 60°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, und Reaktionszeiten von 2 bis 72 Stunden, vorzugsweise etwa 2 × 2 Stunden, erreicht werden.The attachment to the polymeric supports can be achieved by reaction of the C-terminal Fmocprotected amino acid, with the addition of an activating reagent, in ethanol,Acetonitrile, N, N-dimethylformamide (DMF), dichloromethane, tetrahydrofuran, N- Methylpyrrolidone or similar solvents, preferably in DMF, with theCarrier material at room temperature or elevated temperatures, eg. B. between 40 ° C.and 60 ° C, preferably at room temperature, and reaction times from 2 to 72Hours, preferably about 2 × 2 hours.

Die Kupplung der N^α-geschützten Aminosäure, vorzugsweise der Fmoc-Aminosäure, an das PAL-, Wang- oder Rink-Anker kann beispielsweise mit Hilfe von Kupplungsreagenzien wie N,N′-Dicyclohexylcarbodlimid (DCC), N,N′-Diisopropylcarbodiimid (DIC) oder anderen Carbodiimiden, 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborat (TBTU) oder anderen Uronium-Salzen, O-Acyl-Harnstoffen, Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphat (PyBOP) oder anderen Phosphonium-Salzen, N-hydroxysuccinimiden, anderen N-Hydroxyimiden, oder Oximen, in Gegenwart oder auch in Abwesenheit von 1-Hydroxybenzotriazol oder 1-Hydroxy-7-azabenzotriazol, vorzugsweise mit Hilfe von TBTU unter Zusatz von HOBt, mit oder ohne Zusatz einer Base wie beispielsweise Diisopropylethylamin (DIEA), Triethylamin oder N-Methylmorpholin, vorzugsweise Diisopropylethylamin, bei Reaktionszeiten von 2 bis 72 Stunden, vorzugsweise 3 Stunden, in einem 1,5 bis 3-fachem Überschuß der Aminosäure und der Kupplungsreagenzien, vorzugsweise in einem 2-fachen Überschuß und Temperaturen zwischen etwa 10°C und 50°C, vorzugsweise bei 25°C, in einem Lösungsmittel wie Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon oder Dichlormethan, vorzugsweise Dimethylformamid, durchgeführt werden. Anstelle der Kupplungsreagenzien kann auch der Aktivester (z. B. Pentafluorphenyl, p-Nitrophenyl oder ähnliche), das symmetrische Anhydrid der N^α-Fmoc-Aminosäure, deren Säurechlorid oder -fluorid unter den oben beschriebenen Bedingungen eingesetzt werden.The coupling of the N^α -protected amino acid, preferably the Fmoc amino acid, to the PAL, Wang or Rink anchors can be achieved, for example, with the aid of coupling reagents such as N, N'-dicyclohexylcarbodlimide (DCC), N, N'-diisopropylcarbodiimide ( DIC) or other carbodiimides, 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) or other uronium salts, O-acyl ureas, benzotriazol-1-yl-oxy tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) or other phosphonium salts, N-hydroxysuccinimides, other N-hydroxyimides, or oximes, in the presence or absence of 1-hydroxybenzotriazole or 1-hydroxy-7-azabenzotriazole, preferably with the aid of of TBTU with the addition of HOBt, with or without the addition of a base such as diisopropylethylamine (DIEA), triethylamine or N-methylmorpholine, preferably diisopropylethylamine, at reaction times of 2 to 72 hours, preferably 3 hours, in a 1.5 to 3-fold Excess of aminos and the coupling reagents, preferably in a 2-fold excess and temperatures between about 10 ° C and 50 ° C, preferably at 25 ° C, in a solvent such as dimethylformamide, N-methylpyrrolidone or dichloromethane, preferably dimethylformamide. Instead of the coupling reagents, the active ester (eg pentafluorophenyl, p-nitrophenyl or the like), the symmetrical anhydride of the N^α -Fmoc-amino acid, its acid chloride or fluoride can also be used under the conditions described above.

Die Kupplung der N^α-geschützten Aminosäure, vorzugsweise der Fmoc-Aminosäure, an das 2-Chlortrityl-Harz wird bevorzugt in Dichlormethan unter Zusatz von DIEA, bei Reaktionszeiten von 10 bis 120 Minuten, vorzugsweise 20 Minuten, durchgeführt, ist aber nicht auf die Verwendung dieses Lösungsmittels und dieser Base beschränkt.The coupling of the N^α -protected amino acid, preferably the Fmoc amino acid, to the 2-chlorotrityl resin is preferably carried out in dichloromethane with the addition of DIEA at reaction times of 10 to 120 minutes, preferably 20 minutes, but is not limited to Limited use of this solvent and this base.

Die sukzessive Kupplung der geschützten Aminosäuren kann nach den in der Peptidsynthese üblichen Verfahren typischerweise in einem Peptidsyntheseautomaten durchgeführt werden. Nach Abspaltung der N^α-Fmoc-Schutzgruppe der gekuppelten Aminosäure auf der Festphase durch Behandlung mit Piperidin (10% bis 50%) in Dimethylformamid für 5 bis 20 Minuten, vorzugsweise 2 × 2 Minuten mit 50% Piperidin in DMF und 1 × 15 Minuten mit 20% Piperidin in DMF, wird die nächste geschützte Aminosäure in einem 3 bis 10-fachem Überschuß, vorzugsweise in einem 10-fachen Überschuß, in einem inerten, nichtwäßrigen, polaren Lösungsmittel, wie Dichlormethan, DMF oder Mischungen aus beiden, vorzugsweise DMF, und Temperaturen zwischen etwa 10°C und 50°C, vorzugsweise bei 25°C, an die vorhergehende gekoppelt. Als Kupplungsreagenzien kommen die bei der Kupplung der ersten N^α-Fmoc-Aminosäure an den PAL-, Wang- bzw. Rink-Anker bereits erwähnten Reagenzien in Frage. Wiederum können alternativ auch Aktivester der geschützten Aminosäure deren Chloride oder Fluoride oder deren symmetrische Anhydride verwendet werden.The successive coupling of the protected amino acids can be carried out by the methods customary in peptide synthesis, typically in a peptide synthesizer. After cleavage of the N^α -Fmoc protecting group of the coupled amino acid on the solid phase by treatment with piperidine (10% to 50%) in dimethylformamide for 5 to 20 minutes, preferably 2 x 2 minutes with 50% piperidine in DMF and 1 x 15 minutes with 20% piperidine in DMF, the next protected amino acid is in a 3 to 10-fold excess, preferably in a 10-fold excess, in an inert, nonaqueous, polar solvent such as dichloromethane, DMF or mixtures of both, preferably DMF, and temperatures between about 10 ° C and 50 ° C, preferably at 25 ° C, coupled to the previous one. Suitable coupling reagents are the reagents already mentioned in the coupling of the first N^α -Fmoc amino acid to the PAL, Wang or Rink anchors. Again, alternatively, active esters of the protected amino acid, their chlorides or fluorides or their symmetrical anhydrides can be used.

Am Ende der Festphasensynthese wird das Peptid vom Trägermaterial abgespalten unter gleichzeitiger Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen. Die Abspaltung kann mit Trifluoressigsäure oder anderen stark sauren Medien unter Zusatz von 5%-20% v/v Scavengern wie Dimethylsulfid, Ethylmethylsulfid, Thioanisol, Thiokresol, m-Kresol, Anisol, Ethandithiol, Phenol oder Wasser, vorzugsweise 15% v/v Dimethylsulfid/ Ethandithiol/m-Kresol 1. 1 : 1, innerhalb von 0,5 bis 3 Stunden, vorzugsweise 2 Stunden, erfolgen. In den Seitenketten vollgeschützte Peptide werden durch Spaltung des 2-Chlortritylankers mit Eis-essig/Trifluorethanol/Dichlormethan 2 : 2 : 6 erhalten. Das geschützte Peptid kann durch Chromatographie über Silicagel gereinigt werden. Ist das Peptid über den Wang-Anker mit der Festphase verbunden, und soll ein Peptid mit C-terminaler Alkylamidierung erhalten werden, so kann die Abspaltung über eine Aminolyse mit einem Alkylamin oder Fluoroalkylamin durchgeführt werden. Die Aminolyse wird bei Temperaturen zwischen etwa -10°C und 50°C, vorzugsweise etwa 25°C, und Reaktionszeiten zwischen etwa 12 und 24 Stunden, vorzugsweise etwa 18 Stunden, durchgeführt. Weiterhin kann das Peptid auch durch Umesterung, z. B. mit Methanol, vom Träger gespalten werden.At the end of the solid phase synthesis, the peptide is cleaved off from the carrier materialsimultaneous cleavage of side chain protecting groups. The splitting can withTrifluoroacetic acid or other strongly acidic media with the addition of 5% -20% v / vScavengers such as dimethyl sulfide, ethyl methyl sulfide, thioanisole, thiocresol, m-cresol,Anisole, ethanedithiol, phenol or water, preferably 15% v / v dimethyl sulfide /Ethanedithiol / m-cresol 1. 1: 1, within 0.5 to 3 hours, preferably 2 hours,respectively. Fully protected peptides in the side chains are prepared by cleavage of the 2-Chlortritylankers with glacial acetic acid / trifluoroethanol / dichloromethane 2: 2: 6. TheProtected peptide can be purified by chromatography on silica gel. Is thisPeptide linked to the solid phase via the Wang anchor, and is said to be a peptide with CTerminal amination can be obtained, so the cleavage on aAminolysis be carried out with an alkylamine or Fluoroalkylamin. TheAminolysis is carried out at temperatures between about -10 ° C and 50 ° C, preferably about 25 ° C, and reaction times between about 12 and 24 hours, preferably about 18Hours, performed. Furthermore, the peptide can also by transesterification, for. B. withMethanol, are split by the carrier.

Die erhaltene saure Lösung wird mit der 3-20-fachen Menge an kaltem Ether oder n-Hexan, vorzugsweise einem 10-fachen Überschuß Diethylether versetzt, um das Peptid auszufallen und damit von den im Ether verbleibenden Scavengern und abgespaltenen Schutzgruppen abzutrennen. Eine weitere Reinigung kann durch mehrfaches Umfällen des Peptides aus Eis-essig erfolgen. Das erhaltene Precipitat wird in Wasser oder tert.Butanol oder Mischungen der beiden Lösungsmittel, vorzugsweise einer 1 : 1 Mischung von tert.Butanol/Wasser, aufgenommen und gefriergetrocknet.The acid solution obtained is mixed with 3-20 times the amount of cold ether or n-Hexane, preferably a 10-fold excess of diethyl ether to the peptideto precipitate and thus from the scavengers remaining in the ether and split offSeparate protective groups. Another cleaning can be done by multiple reprecipitationof the peptide from ice-vinegar. The resulting Precipitat is in water ortert-butanol or mixtures of the two solvents, preferably 1: 1Mixture of tert-butanol / water, taken up and freeze-dried.

Das erhaltene Peptid kann durch einzelne oder alle der folgenden chromatographischen Methoden gereinigt werden: Ionenaustausch über ein schwach basisches Harz in der Acetat Form; hydrophobe Adsorptionschromatographie an nicht derivatisierten Polysty­rol/Divinylbenzol-Copolymeren (z. B. Amberlite® XAD); Adsorptionschromatographie an Silicagel; Ionenaustauschchromatographie an Carboxymethylcellulose; Verteilungschromatographie, z. B. an Sephadex® G-25; Gegenstromverteilungschromatographie; oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC), insbesondere "reversed-phase" HPLC an Octyl- oder Octadecylsilylsilica (ODS)-Phasen.The resulting peptide may be purified by any or all of the following chromatographicMethods are: ion exchange over a weakly basic resin in theAcetate form; hydrophobic adsorption chromatography on underivatized polystyrol / divinylbenzene copolymers (eg Amberlite® XAD); adsorptionon silica gel; Ion exchange chromatography on carboxymethylcellulose;Partition chromatography, e.g. To Sephadex® G-25;countercurrent distribution; or high pressure liquid chromatography(HPLC), in particular "reversed-phase" HPLC on octyl or Octadecylsilylsilica(ODS) phases.

Zusammenfassend beinhaltet ein Teil der vorliegenden Erfindung Verfahren zur Darstellung von Polypeptiden, und deren pharmazeutisch verwendbaren Salzen. Diese Verfahren, welche zu physiologisch aktiven verkürzten Homologen und Analogen von Exendin-3 oder Exendin-4, mit den oben erwähnten bevorzugten Kettenlängen und Modifikationen fuhren, setzen sich aus Verfahren zur sequentiellen Kondensation geschützter Aminosäuren auf einem geeigneten Trägermaterial, zur Abspaltung des Trägers und der Schutzgruppen, und zur Reinigung der erhaltenen Rohpeptide zusammen.In summary, a part of the present invention includes methods forPreparation of polypeptides and their pharmaceutically acceptable salts. TheseMethods which result in physiologically active truncated homologues and analogues ofExendin-3 or Exendin-4, with the preferred chain lengths mentioned above andModifications result from sequential condensation processesProtected amino acids on a suitable carrier material, to cleave theCarrier and the protective groups, and for purification of the obtained crude peptidestogether. 

Die Aminosäurenanalyse wurde mit einem Aminosäurenanalysator 420A der Firma Applied Biosystems (Weiterstadt) durchgeführt. 50 bis 1000 pmol der zu analysierenden Probe wurden in 10 bis 40 µl Lösung auf den Probenträger aufgetragen und anschließend vollautomatisch in der Gasphase bei 160°C mit 6N Salzsäure 90 Minuten hydrolysiert, mit Phenylisothiocyanat derivatisiert und on-line über eine Microbore-HPLC analysiert. Massenspektroskopische Untersuchungen wurden wurden an einem API III Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (SCIEX, Thornhill, Kanada) ausgerüstet mit Ionenspray Ionenquelle durchgeführt.The amino acid analysis was carried out with an amino acid analyzer 420A from the companyApplied Biosystems (Weiterstadt). 50 to 1000 pmol of the to be analyzedSample was applied to the sample carrier in 10 to 40 μl solution and thenfully automatically hydrolyzed in the gas phase at 160 ° C with 6N hydrochloric acid for 90 minutes,derivatized with phenylisothiocyanate and analyzed on-line via a Microbore-HPLC.Mass spectroscopic studies were performed on an API III tripleQuadrupole mass spectrometer (SCIEX, Thornhill, Canada) equipped with ion sprayIon source performed.

Die geschützten Aminosäurenderivate können z. B. von der Novabiochem. GmbH (Bad Soden) bezogen werden.The protected amino acid derivatives may, for. B. from the Novabiochem. GmbH (BadSoden).

Die folgenden Beispiele stellen nur eine illustrierende Auswahl des Erfindungsgedanken dar und keine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes.The following examples are only an illustrative selection of the inventive ideaand no limitation of the subject invention. 

Beispiel 1example 1HGEGTFTSDLSKQ-Nle-EEEAVRLFIEWLKNGR-NH₂ (SEQ ID Nr. 3)HGEGTFTSDLSKQ-Nle-EEEAVRLFIEWLKNGR-NH₂ (SEQ ID NO: 3)[Nle¹⁴, Arg³⁰]-Exendin-4-(1-30)-NH₂[Nle¹⁴, Arg³⁰] -Exendin-4- (1-30) -NH₂

Beispiel 1 wurde in einem 0,02 mmol Ansatz nach der Festphasenmethode auf 5-(4′-aminomethyl)-3′,5′-dimethoxyphenoxy)valerianyl-alanyl-aminomethyl/polystyrol(1%)divinylbenzol (Beladung: 0,5 mmol/g) auf einem Multiplen Peptidsyntheseautomaten SyRo II der Firma MultiSynTech (Bochum) synthetisiert. Die α-Aminofunktionen der Aminosäuren waren 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) geschützt. Als Seitenkettenschutzgruppen wurden t-Butyl (tBu) für Asp, Glu, Ser und Thr, Trityl (Trt) für Asn, Gln und His, t-Butyloxycarbonyl (Boc) für Lys und Trp und 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc) für Arg eingesetzt. Die sequentielle Kupplung der geschützten Aminosäuren erfolgte in 10-fachem Überschuß mit Doppelkupplungen von 2 mal 40 Minuten Dauer und mit N,N-Diisopropylcarbodiimid/1-Hydroxybenzotriazol als Aktivierungsreagenzien. Die Abspaltung des Peptides vom polymeren Träger unter gleichzeitiger Abspaltung der Schutzgruppen erfolgte in Trifluoressigsäure (85%) in Gegenwart von 15% Ethandithiol/Dimethylsulfid/m-Kresol (1 : 1 : 1 v/v/v) für 120 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend wurde das Peptid mit wasserfreiem Diethylether gefällt und zur vollständigen Entfernung der Thiole noch mehrfach mit wasserfreiem Diethyl-ether gewaschen. Gefriertrocknung des Precipitats aus Wasser/tert.-Butanol (1 : 1) ergab 62 mg des Rohpeptides. Das Rohpeptid wurde über reversed-phase HPLC mit einem Gradienten von 37% auf 42% Acetonitril/0,9% TFA in 30 Minuten gereinigt. Das Eluat wurde eingeengt, lyophilisiert und ergab eine Ausbeute von 29 mg eines weißen Feststoffes mit einer Reinheit von 97%.
Aminosäurenanalyse: Ala 1,08 (1); Asx 1,91(2); Glx 6,10 (6); Phe 1,78 (2); Gly 3,10 (3); His 1,00 (1); Ile 0,88 (1); Lys 2,02 (2); Leu 3,24 (3); Nle 1,10 (1); Arg 1,98 (2); Ser 2,04 (2); Thr 1,99 (2); Val 0,91(1); Trp 0,87 (1).
ESI-MS: 3488,2.Example 1 was carried out in a 0.02 mmol batch by the solid phase method on 5- (4'-aminomethyl) -3 ', 5'-dimethoxyphenoxy) valerianyl-alanyl-aminomethyl / polystyrene (1%) divinylbenzene (loading: 0.5 mmol / g) were synthesized on a multiple peptide synthesizer SyRo II from MultiSynTech (Bochum). The α-amino functions of the amino acids were protected 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc). As side-chain protecting groups, t-butyl (tBu) for Asp, Glu, Ser and Thr, trityl (Trt) for Asn, Gln and His, t-butyloxycarbonyl (Boc) for Lys and Trp, and 2,2,5,7,8- Pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc) used for Arg. The sequential coupling of the protected amino acids was carried out in 10-fold excess with double couplings of 2 times 40 minutes duration and with N, N-diisopropylcarbodiimide / 1-hydroxybenzotriazole as activating reagents. The cleavage of the peptide from the polymeric support with simultaneous deprotection was carried out in trifluoroacetic acid (85%) in the presence of 15% ethanedithiol / dimethylsulfide / m-cresol (1: 1: 1 v / v / v) for 120 minutes at room temperature. Subsequently, the peptide was precipitated with anhydrous diethyl ether and washed to complete removal of the thiols several times with anhydrous diethyl ether. Freeze-drying of the precipitate from water / tert-butanol (1: 1) gave 62 mg of the crude peptide. The crude peptide was purified by reversed-phase HPLC with a gradient of 37% to 42% acetonitrile / 0.9% TFA in 30 minutes. The eluate was concentrated, lyophilized to give a yield of 29 mg of a white solid with a purity of 97%.
Amino Acid Analysis: Ala 1.08 (1); Asx 1.91 (2); Glx 6,10 (6); Phe 1,78 (2); Gly 3.10 (3); His 1.00 (1); Ile 0.88 (1); Lys 2.02 (2); Lei 3.24 (3); Nile 1.10 (1); Arg 1.98 (2); Ser 2.04 (2); Thr 1.99 (2); Val 0.91 (1); Trp 0.87 (1).
ESI MS: 3488.2.

Beispiel 2Example 2HGEGTFTSDLSKQ-Nle-EEEAVRLFIEWLKNGY-NH₂ (SEQ ID Nr. 4)HGEGTFTSDLSKQ-Nle-EEEAVRLFIEWLKNGY-NH₂ (SEQ ID NO: 4)[Nle¹⁴, Tyr³⁰]-Exendin-4-(1-30)-NH₂[Nle¹⁴, Tyr³⁰] -Exendin-4- (1-30) -NH₂

Beispiel 2 wurde in einem 0,0076 mmol Ansatz nach der Festphasenmethode auf TentaGel® (Rapp Polymere, Tübingen) synthetisiert, welches mit dem Rink-Amid-Anker (4-(2′,4′-Dimethoxyphenyl-aminomethyl)-phenoxy-Gruppe) derivatisiert war (Beladung: 0,18 mmol/g) auf einem Multiplen Peptidsyntheseautomaten SyRo II der Firma MultiSynTech (Bochum) synthestisiert. Die eingesetzten geschützten Aminosäuren waren analog zu Beispiel 1. Die sequentielle Kupplung der geschützten Aminosäuren erfolgte in 8-fachem Überschuß mit Einfachkupplungen von 40 Minuten Dauer, bei 40°C und unter Rühren. Als Aktivierungsreagenzien wurden 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborat (TBTU)/1-Hydroxybenzotriazol unter Zusatz von Diisopropylethylamin verwendet. Die Abspaltung und Aufreinigung des Peptides erfolgte analog zu Beispiel 1. Es wurden 18,1 mg eines weißen Feststoffes mit einer Reinheit von 95% erhalten.
Aminosäurenanalyse: Ala 1,03 (1); Asx 1,90 (2); Glx 6,24 (6); Phe 1,94 (2); Gly 3,12 20 (3); His 1,02 (1); Ile 1,09 (1); Lys 2,01 (2); Leu 3,06 (3); Nle 1,08 (1); Arg 0,97 (1); Ser 1,98 (2); Thr 1,80 (2); Val 0,93 (1); Trp 1,01(1); Tyr 0,90 (1).
ESI-MS: 3494,8.Example 2 was synthesized in a 0.0076 mmol batch by the solid phase method on TentaGel® (Rapp Polymere, Tübingen), which was reacted with the Rink amide anchor (4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl-aminomethyl) phenoxy group ) was derivatized (loading: 0.18 mmol / g) on a multiple peptide synthesizer SyRo II of the company MultiSynTech (Bochum) synthesized. The protected amino acids used were analogous to Example 1. The sequential coupling of the protected amino acids was carried out in 8-fold excess with single couplings of 40 minutes duration, at 40 ° C and with stirring. Activation reagents used were 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) / 1-hydroxybenzotriazole with the addition of diisopropylethylamine. The cleavage and purification of the peptide was carried out analogously to Example 1. There were obtained 18.1 mg of a white solid with a purity of 95%.
Amino Acid Analysis: Ala 1.03 (1); Asx 1.90 (2); Glx 6,24 (6); Phe 1.94 (2); Gly 3,12 20 (3); His 1.02 (1); Ile 1.09 (1); Lys 2.01 (2); Leu 3.06 (3); Nle 1.08 (1); Arg 0.97 (1); Ser 1.98 (2); Thr 1,80 (2); Val 0.93 (1); Trp 1.01 (1); Tyr 0.90 (1).
ESI MS: 3494.8.

Beispiel 3Example 3HSDGTFTSDLSKQ-Nle-EEEAVRLFIEWLKNGR-NH₂ (SEQ II) Nr. 5)HSDGTFTSDLSKQ-NLE-EEEAVRLFIEWLKNGR-NH₂ (SEQ ID NO. 5)Nle¹⁴, Arg³⁰]-Exendin-3-(1-30)-NH₂Nle¹⁴, Arg³⁰] -Exendin-3- (1-30) -NH₂

Beispiel 3 wurde analog nach der für Beispiel 2 beschriebenen Methode synthetisiert. Es wurden 17,6 mg eines weißen Feststoffes mit einer Reinheit von 99% erhalten.
Aminosäurenanalyse: Ala 0,99 (1); Asx 2,98 (3); Glx 5,16 (5); Phe 2,08 (2); Gly 2,16 (2); His 0,95 (1); Ile 1,03 (1); Lys 2,04 (2); Leu 2,91(3); Nle 1,05 (1); Arg 1,04 (1); Ser 3,00 (3); Thr 2,05 (2); Val 1,01 (1); Trp 1,18 (1); Tyr 0,98 (1).
ESI-MS: 3504,4.Example 3 was synthesized analogously according to the method described for Example 2. There was obtained 17.6 mg of a white solid with a purity of 99%.
Amino acid analysis: Ala 0.99 (1); Asx 2.98 (3); Glx 5,16 (5); Phe 2.08 (2); Gly 2,16 (2); His 0.95 (1); Ile 1.03 (1); Lys 2.04 (2); Leu 2.91 (3); Nle 1.05 (1); Arg 1.04 (1); Ser 3.00 (3); Thr 2.05 (2); Val 1.01 (1); Trp 1.18 (1); Tyr 0.98 (1).
ESI MS: 3504.4.

Beispiel 4Example 4HGEGTFTSDLSKOMEEEAVRLFIEWLKNGR-NH₂ (SEQ ID Nr. 6)HGEGTFTSDLSKOMEEEAVRLFIEWLKNGR-NH₂ (SEQ ID NO: 6)[Arg³⁰]-Exendin-4-(1-30)-NH₂[Arg³⁰] -Exendin-4 (1-30) -NH₂

Beispiel 4 wurde analog nach der für Beispiel 1 beschriebenen Methode synthetisiert. Es wurden 17,9 mg eines weißen Feststoffes mit einer Reinheit von 96% erhalten.
Aminosäurenanalyse: Ala 0,96 (1); Asx 2,01 (2); Glx 6,00 (6); Phe 1,80 (2); Gly 3,21 (3); His 0,96 (1); Ile 1,07 (1); Lys 1,92 (2); Leu 2,98 (3); Met 1,06 (1); Arg 1,90 (2); Ser 1,91 (2); Thr 2,09 (2); Val 0,97 (1); Trp 0,84 (1).
ESI-MS: 3508,4.Example 4 was synthesized analogously according to the method described for Example 1. There was obtained 17.9 mg of a white solid with a purity of 96%.
Amino Acid Analysis: Ala 0.96 (1); Asx 2.01 (2); Glx 6.00 (6); Phe 1.80 (2); Gly 3.21 (3); His 0.96 (1); Ile 1.07 (1); Lys 1.92 (2); Leu 2,98 (3); Met 1.06 (1); Arg 1.90 (2); Ser 1.91 (2); Thr 2.09 (2); Val 0.97 (1); Trp 0.84 (1).
ESI MS: 3508.4.

Beispiel 5Example 5GEGTFTSDLSKQ-Nle-EEEAVRLFIEWLKNGR-NH₂ (SEQ ID Nr. 7)GEGTFTSDLSKQ-Nle-EEEAVRLFIEWLKNGR-NH₂ (SEQ ID NO: 7)[Nle¹⁴, Arg³⁰]-Exendin-4-(2-30)-NH₂[Nle¹⁴, Arg³⁰] -Exendin-4- (2-30) -NH₂

Beispiel 5 wurde analog nach der für Beispiel 2 beschriebenen Methode synthetisiert. Es wurden 13,2 mg eines weißen Feststoffes mit einer Reinheit von 97% erhalten.
Aminosäurenanalyse: Ala 1,04 (1); Asx 1,98 (2); Glx 6,08 (6); Phe 1,86 (2); Gly 2,91 (3); Ile 0,96 (1); Lys 1,84 (2); Leu 2,98 (3); Nle 1,04 (1); Arg 1,90 (2); Ser 1,94 (2); Thr 1,92 (2); Val 0,96 (1); Trp 0,85 (1).
ESI-MS: 3350,8.Example 5 was synthesized analogously according to the method described for Example 2. There was obtained 13.2 mg of a white solid with a purity of 97%.
Amino Acid Analysis: Ala 1.04 (1); Asx 1.98 (2); Glx 6.08 (6); Phe 1.86 (2); Gly 2.91 (3); Ile 0.96 (1); Lys 1.84 (2); Leu 2,98 (3); Nle 1.04 (1); Arg 1.90 (2); Ser 1.94 (2); Thr 1.92 (2); Val 0.96 (1); Trp 0.85 (1).
ESI-MS: 3350.8.

Beispiel 6Example 6HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRAFIEWLKNGR-NH₂ (SEQ ID Nr. 8)HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRAFIEWLKNGR-NH₂ (SEQ ID NO: 8)[Ala²¹, Arg³⁰]-Exendin-4-(1-30)-NH₂[Ala²¹, Arg³⁰] -Exendin-4- (1-30) -NH₂

Beispiel 6 wurde analog nach der für Beispiel 1 beschriebenen Methode synthetisiert. Es wurden 11,1 mg eines weißen Feststoffes mit einer Reinheit von 95% erhalten.
Aminosäurenanalyse: Ala 2,08 (2); Asx 1,93 (2); Glx 6,07 (6); Phe 1,74 (2); Gly 2,97 (3); His 0,98 (1); Ile 0,87 (1); Lys 2,15 (2); Leu 2,02 (2); Met 0,96 (1); Arg 2,13 (2); Ser 1,87 (2); Thr 2,07 (2); Val 1,04 (1); Trp 0,87 (1).
ESI-MS: 3466,3.Example 6 was synthesized analogously according to the method described for Example 1. There were obtained 11.1 mg of a white solid having a purity of 95%.
Amino Acid Analysis: Ala 2.08 (2); Asx 1.93 (2); Glx 6.07 (6); Phe 1.74 (2); Gly 2.97 (3); His 0.98 (1); Ile 0.87 (1); Lys 2:15 (2); Leu 2.02 (2); Met 0.96 (1); Arg 2,13 (2); Ser 1.87 (2); Thr 2.07 (2); Val 1.04 (1); Trp 0.87 (1).
ESI MS: 3466.3.

Beispiel 7Example 7HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKAGR-NH₂ (SEQ ID Nr. 9)HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKAGR-NH₂ (SEQ ID NO: 9)[Ala²⁸, Arg³⁰]-Exendin-4-(1-30)-NH₂[Ala²⁸, Arg³⁰] -Exendin-4- (1-30) -NH₂

Beispiel 7 wurde analog nach der für Beispiel 1 beschriebenen Methode synthetisiert. Es wurden 15,0 mg eines weißen Feststoffes mit einer Reinheit von 97% erhalten.
Aminosäurenanalyse: Ala 1,98 (2); Asx 0,98 (1); Glx 6,22 (6); Phe 1,92 (2); Gly 3,03 (3); His 0,99 (1); Ile 1,03 (1); Lys 2,05 (2); Leu 3,03 (3); Met 0,96 (1); Arg 1,84 (2); Ser 1,98 (2); Thr 2,09 (2); Val 1,01(1); Trp 0,72 (1).
ESI-MS: 3465,4.Example 7 was synthesized analogously according to the method described for Example 1. There was obtained 15.0 mg of a white solid having a purity of 97%.
Amino acid analysis: Ala 1.98 (2); Asx 0.98 (1); Glx 6,22 (6); Phe 1.92 (2); Gly 3.03 (3); His 0.99 (1); Ile 1.03 (1); Lys 2.05 (2); Leu 3.03 (3); Met 0.96 (1); Arg 1.84 (2); Ser 1.98 (2); Thr 2.09 (2); Val 1.01 (1); Trp 0.72 (1).
ESI MS: 3465.4.

Beispiel 8Example 8HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRAFIEWLKAGR-NH₂ (SEQ ID Nr. 10)HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRAFIEWLKAGR-NH₂ (SEQ ID NO: 10)[Ala^21,28, Arg³⁰]-Exendin-4-(1-30)-NH₂[Ala^21,28, Arg³⁰] -Exendin-4 (1-30) -NH₂

Beispiel 8 wurde analog nach der für Beispiel 1 beschriebenen Methode synthetisiert. Es wurden 18,4 mg eines weißen Feststoffes mit einer Reinheit von < 95% erhalten.
Aminosäurenanalyse: Ala 3,12 (3); Asx 0,99 (1); Glx 6,04 (6); Phe 1,80 (2); Gly 3,00 (3); His 0,96 (1); Ile 1,02 (1); Lys 1,84 (2); Leu 1,97 (2); Met 0,98 (1); Arg 2,03 (2); Ser 1,91 (2); Thr 1,88 (2); Val 0,99 (1); Trp 0,99 (1).
ESI-MS: 3423,3.Example 8 was synthesized analogously according to the method described for Example 1. There were obtained 18.4 mg of a white solid with a purity of <95%.
Amino Acid Analysis: Ala 3,12 (3); Asx 0.99 (1); Glx 6,04 (6); Phe 1.80 (2); Gly 3.00 (3); His 0.96 (1); Ile 1.02 (1); Lys 1.84 (2); Lei 1.97 (2); Met 0.98 (1); Arg 2.03 (2); Ser 1.91 (2); Thr 1,88 (2); Val 0.99 (1); Trp 0.99 (1).
ESI MS: 3423.3.

Beispiel 9Example 9

In analoger Weise wurden die folgenden Exendinderivate in hoher Reinheit hergestellt. (Ex-4 = Exendin-4, Ex-3 = Exendin-3)In an analogous manner, the following exendin derivatives were prepared in high purity.(Ex-4 = exendin-4, ex-3 = exendin-3)

Biologische DatenBiological dataPeptidmetabolismus in Ektopeptidase-Preparationen oder an Nieren-Microvilli MembranpräparationenPeptide metabolism in ectopeptidase preparations or on kidney microvilli membrane preparationsPräparation von Bürstensaum MicrovillimembranenPreparation of brush border microvilli membranes

Mittels subzellulärer Fraktionierung unter Verwendung der Differentialzentrifugationsmethode (Booth and Kenny (1975)) werden Microvillimembranen des Ratten- und Schweinenierencortex isoliert. Zur Beurteilung des Reinheitsgrades und der Ausbeute der Membranen werden 4 Bürstensaum-Ektopeptidasen fluorimetrisch und andere Markerenzyme kolorimetrisch gemessen.By subcellular fractionation using theDifferential centrifugation method (Booth and Kenny (1975))Isolated microvillimembrans of the rat and Schweierenierencortex. To judge thePurity and the yield of the membranes are 4 brush borderEctopeptidases measured by fluorimetry and other marker enzymes by colorimetry.

Ektopeptidase PräparationenEctopeptidase preparations

Gereinigte humane Neutrale Endopeptidase 24.11 wurde in der rekombinanten Form von Genentech (San Francisco, USA), Dipeptidyl Peptidase IV wurde als Isolat aus humaner Placenta von Calbiochem (Bad Soden) bezogen.Purified human neutral endopeptidase 24.11 was used in the recombinant form ofGenentech (San Francisco, U.S.A.), dipeptidyl peptidase IV, was isolated as an isolate from humanPlacenta purchased from Calbiochem (Bad Soden).

Inkubations-ProtokollIncubation protocol

Microvilli Membranen (0,5-1 µg Protein) oder die jeweilige Ectopeptidase Präparation (60-300 ng) wurden mit 10 µg Peptid (etwa 3 nmol) in 100 µl HEPES Puffer (50 mM, pH 7,4), welcher 50 mM NaCl enthielt, inkubiert. An vorher bestimmten Zeitpunkten (Dauer bis zu 1 Stunde) wurden die Reaktionen durch Kochen abgebrochen. Anschließend wurden die Proben zentrifugiert (10 000 × g), mit 150 µl 0,1% TFA verdünnt und mittels "reversed phase" (RP) HPLC analysiert. Jede Probe wurde doppelt bestimmt.Microvilli membranes (0.5-1 μg protein) or the respective ectopeptidase preparation(60-300 ng) were incubated with 10 μg of peptide (about 3 nmol) in 100 μl of HEPES buffer (50 mM,pH 7.4) containing 50 mM NaCl. At predetermined times(Duration up to 1 hour), the reactions were stopped by boiling.Subsequently, the samples were centrifuged (10,000 × g) with 150 μl of 0.1% TFAdiluted and analyzed by reversed phase (RP) HPLC. Each sample was duplicatedcertainly.

HPLC AnalyseHPLC analysis

Für die IIPLC Analyse wurde ein System mit den folgenden Komponenten verwendet:
Eine "2248" Niederdruckpumpe (Pharmacia-LKB, Freiburg), ein WISP 10B Autoinjector (Millipore-Waters, Eschborn), ein UV-Detektor SP-4 (Gynkotec, Berlin), ein Niederdruck-Mischsystem (Pharmacia-LKB, Freiburg) und einer "Program Manager" Software-Steuerung (Pharmacia-LKB, Freiburg). Die Trennungen erfolgten über Lichrospher C-8, 5 µ, 4 × 124 mm (Merck, Darmstadt) mit einem binären Gradienten mit den Laufmitteln A: 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) und B: Acetonitril:Wasser:TFA (70 : 29,9 : 0,1). Nach der Injektion von 244 µl der Probenlösung auf die mit Laufmittel A equilibrierte Säule, wurden die Inkubationsprodukte mit einem linearen Gradienten von 0% auf 80% B in 80 min eluiert und bei 215 nm UV-Absorption detektiert.For the IIPLC analysis, a system with the following components was used:
A "2248" low-pressure pump (Pharmacia-LKB, Freiburg), a WISP 10B autoinjector (Millipore-Waters, Eschborn), a UV detector SP-4 (Gynkotec, Berlin), a low-pressure mixing system (Pharmacia-LKB, Freiburg) and a "Program Manager" software control (Pharmacia-LKB, Freiburg). The separations were carried out via Lichrospher C-8, 5 μ, 4 × 124 mm (Merck, Darmstadt) with a binary gradient with the eluents A: 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) and B: acetonitrile: water: TFA (70: 29 , 9: 0.1). After injection of 244 μl of the sample solution onto the column equilibrated with mobile phase A, the incubation products were eluted with a linear gradient from 0% to 80% B in 80 min and detected at 215 nm UV absorption.

Berechnung der Proteolyse-RatenCalculation of proteolysis rates

Für jede Inkubationszeit eines jeden Peptides wurden zwei Messungen durchgeführt und die mittlere Peak-Höhe des Substrat-Peaks gegen die Zeit aufgetragen. Am Beispiel von GLP-1 konnte gezeigt werden, daß die Peakhöhe linear proportional zur Quantität des Peptides in der Probenlösung ist. Innerhalb der ersten Stunde der Inkubation mit den Microvilli-Membranen oder den Peptidasen konnte außerdem eine lineare Abnahme der Peakhöhe mit der Zeit beobachtet werden. Die Proteolyse-Rate wird also durch die Abnahme der Höhe des Substratpeaks bestimmt und in [µmol Substrat/mg Protein/Minute] angegeben.For each incubation period of each peptide, two measurements were taken andplotted the mean peak height of the substrate peak versus time. On the example ofGLP-1 showed that the peak height was linearly proportional to the quantity of thePeptides in the sample solution is. Within the first hour of incubation with theMicrovilli membranes or the peptidases also showed a linear decrease in thePeak height can be observed over time. The proteolysis rate is thus determined by theDetermination of the height of the substrate peak and in [μmol substrate / mgProtein / minute].

Abbaustabilität von Exendin-AnalogaDegradation stability of exendin analogues

[Nle¹⁴,Arg³⁰]-Exendin-4-(1-30)-NH₂ (Seq. ID Nr. 3) wurde mit der Neutralen Endopeptidase 24.11 wie oben beschrieben inkubiert und die Abbaurate wurde bestimmt. Als Kontrolle diente GLP1-(7-36)-NH2. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.[Nle¹⁴, Arg³⁰] -Exendin-4- (1-30) -NH₂ (SEQ ID NO: 3) was neutralizedEndopeptidase 24.11 was incubated as described above and the rate of degradation was determined.The control was GLP1- (7-36) -NH2. The results are shown in Table 1.

Abbaurate [mM/100 ng/mlDegradation rate [mM / 100 ng / mlNEP24.11/min]NEP24.11 / min]GLP1-(7-36)-NH₂GLP1- (7-36) -NH₂0,05860.0586[Nle¹⁴, Arg³⁰]-Ex-4-1-30)-NH₂ Bsp. 1[Nle¹⁴, Arg³⁰] -Ex-4-1-30) -NH₂ Ex. 10,00830.0083

Messung der Erhöhung der cytosolischen Calciumkonzentration in B-Zellen des endokrinen Pankreas (klonale B-Zellinie INS-1)Measurement of the increase of cytosolic calcium concentration in B-cells of the endocrine pancreas (clonal B-cell line INS-1)Zucht von INS-1-Zellen (Asfari, M., 1992)Breeding of INS-1 cells (Asfari, M., 1992)

INS-1-Zellen werden in RPMI 1640 Medium mit 10% FKS, 10 mM HEPES-Puffer (pH 7,4), 2 mM L-Glutamin, 100 i.U. Penicillin/ml, 100 µg Streptomycin/ml, 1 mM Pyruvat (Natriumsalz) und 50 µM 2-Mercaptoethanol kultiviert, bei 37°C, in einer Atmosphäre von 95% Luft und 5% CO₂. Nach 6 bis 8 Tagen Wachstum auf Kunststoff-Zell­kulturplatten werden die subkonfluenten Zellen nach einmaligem Spülen mit PBS (phosphate-buffered saline) durch vierminütige Inkubation bei 37°C mit 0,025% Trypsin und 0,27 mM EDTA in isoosmotischer Salzlösung von der Unterlage abgelöst.INS-1 cells are incubated in RPMI 1640 medium with 10% FCS, 10 mM HEPES buffer (pH7.4), 2 mM L-glutamine, 100 i.U. Penicillin / ml, 100 μg streptomycin / ml, 1 mM pyruvate(Sodium salt) and 50 μM 2-mercaptoethanol, at 37 ° C, in an atmosphereof 95% air and 5% CO₂. After 6 to 8 days of growth on plastic cellculture plates are the subconfluent cells after a single rinse with PBS(phosphate-buffered saline) by incubation for four minutes at 37 ° C. with 0.025%Trypsin and 0.27 mM EDTA in isoosmotic saline solution detached from the pad.

Präparation der Zellen für CalciummessungenPreparation of the cells for calcium measurements

Die abgelösten Zellen werden in Spinnermedium (Kulturmedium wie oben, jedoch mit 5% FKS sowie 25 mM HEPES) resuspendiert und bei 37°C zweieinhalb Stunden in einer Spinnerflasche mit Rührstab inkubiert. Danach Entfernung des Mediums durch Zentrifugation und Resuspension der Zellen in Spinnermedium. Dann für 30 Minuten Inkubation bei 37°C mit 2 µM Fura-2/Acetoxymethylester, unter denselben Bedingungen wie zuvor. Die Fura-Beladung der Zellen wird durch einmaliges Waschen der Zellen in Spinnermedium (Raumtemperatur) beendet. Danach werden die Zellen in Spinnermedium mit Raumtemperatur resuspendiert (2 × 10⁷ Zellen/ml). Aus dieser Suspension werden die Zellen für Calciummessungen entnommen.The detached cells are in spinning medium (culture medium as above, but with5% FCS and 25 mM HEPES) and incubated at 37 ° C for two and a half hours ina spinner bottle with stirring bar incubated. Then remove the medium byCentrifugation and resuspension of cells in spinner medium. Then for 30 minutesIncubation at 37 ° C with 2 μM fura-2 / acetoxymethyl ester, under the sameConditions as before. The fura loading of the cells is done by washing oncethe cells in spinning medium (room temperature) ended. After that, the cells are inSpinning medium resuspended at room temperature (2 x 10⁷ cells / ml). From thisSuspension, the cells are removed for calcium measurements.

Messungen der cytosolischen CalciumkonzentrationMeasurements of cytosolic calcium concentration

Die Messungen erfolgen bei 37°C in einem modifizierten Krebs-Ringer Puffer (KRBH) mit 136 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1,2 mM MgSO₄, 1,2 mM KH₂PO₄, 5 mM NaHCO₃, 10 mM Glukose, 250 µM Sulfinpyrazon (zur Hemmung von Fura-2 Efflux in das Medium) und 25 mM HEPES-Puffer (mit NaOH auf pH 7,4). Die Zellkonzentration beträgt 1-2 × 10⁶/ml. Die Messungen werden in einer mittels Rührstab gerührten Küvette in einem Spektralfluorimeter bei 37°C durchgeführt, mit 1,5 ml Zellsuspension. Exzitationswellenlänge ist 340 nm, Emissionswellenlänge 505 nm. Am Ende der Messungen werden 50 µM MnCl₂ und darauf 100 µM DTPA (Dieethylentriaminpentaacetat) zugegeben, um durch eine vorübergehende Löschung ("Quenching") der Fluoreszenz von extrazellulärem Fura den Anteil des extrazellulären Fluoreszenzindikators an der gemessenen Fluoreszenz bestimmen zu können. Nach der Zugabe von DTPA folgt die Überführung des gesamten Furas zunächst in einen calciumgesättigten und dann in einen calciumfreien Zustand, zur Ermittlung der Eichwerte F_max (calciumgesättigt) und F_min (calciumfrei) für die jeweilige Messung. Dazu werden die Zellen durch Zugabe von 0.1% Triton X-100 lysiert. Durch den Kontakt mit der hohen extrazellulären Calciumkonzentration wird der Farbstoff mit Calcium gesättigt. Danach werden 5 mM EGTA (Ethylenbis(oxyethylennitrilo)tetraacetat) und 20 mM Tris-Lösung zugegeben, um den Farbstoff vollständig in die calciumfreie Form zu überführen.The measurements are carried out at 37 ° C in a modified Krebs-Ringer buffer (KRBH) with 136 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1.2 mM MgSO₄, 1.2 mM KH₂PO₄, 5 mM NaHCO₃, 10 mM Glucose, 250 μM sulfinpyrazone (to inhibit fura-2 efflux in the medium) and 25 mM HEPES buffer (with NaOH to pH 7.4). The cell concentration is 1-2 × 10⁶ / ml. The measurements are carried out in a stirred cuvette in a spectrofluorimeter at 37 ° C, with 1.5 ml of cell suspension. The excitation wavelength is 340 nm, emission wavelength 505 nm. At the end of the measurements, 50 μM MnCl₂ and then 100 μM DTPA (dieethylenetriamine pentaacetate) are added to quench the fluorescence from extracellular fura to measure the extracellular fluorescence indicator To be able to determine fluorescence. After the addition of DTPA, the conversion of the entire furas is first to a calcium-saturated and then a calcium-free state, to determine the calibration values F_max (calcium-saturated) and F_min (calcium-free) for the respective measurement. For this purpose, the cells are lysed by addition of 0.1% Triton X-100. Contact with the high extracellular calcium concentration saturates the dye with calcium. Thereafter, 5 mM EGTA (ethylenebis (oxyethylenenitrilo) tetraacetate) and 20 mM Tris solution are added to completely convert the dye into the calcium free form.

Die Berechnung der cytosolischen Calciumionenkonzentration erfolgt nach dem von R. Tsien und Mitarbeitern eingeführten Algorhythmus (Grynkiewicz, G., 1985):The cytosolic calcium ion concentration is calculated according to the method of R.Algorhythm introduced by Tsien and co-workers (Grynkiewicz, G., 1985):

[Ca²⁺]_cyt = ((F-F_min)/(F_max-F)) × K_D[Ca²⁺]_cyt = ((FF_min ) / (F_max -F)) × K_D

(F: Fluoreszenz des jeweiligen Meßpunkts;
K_D: Dissoziationskonstante des Calciumkomplexes des Fura-2, 225 nM (Grynkiewicz, G., 1985)).(F: fluorescence of the respective measuring point;
K_D : dissociation constant of calcium complex of fura-2, 225 nM (Grynkiewicz, G., 1985)).

(Vor dieser Berechnung wird eine Kompensation für die Anwesenheit von extrazellulärem Fura durchgeführt. Dazu wird zunächst der durch Manganzugabe ermittelte Fluoreszenzbetrag (extrazelluläres Fura) von den Fluoreszenzwerten der Meßpunkte subtrahiert. Dann wird F_max durch die Subtraktion desselben Betrags korrigiert. Schließlich wurde der Korrekturbetrag für F_min ermittelt. Dazu wird der durch Manganzugabe bestimmte Fluoreszenzbetrag durch den Wert 2,24 dividiert. Der Wert 2,24 war als geräteeigener Proportionalitätsfaktor zwischen der Fluoreszenz von calciumgesättigtem und calciumfreiem Fura-2 bei einer Exzitationswellenlänge von 340 nm bestimmt worden (gemessen mit unverestertem, freiem Fura-2). Der so erhaltene Korrekturbetrag wurde von F_min subtrahiert).(Prior to this calculation, compensation for the presence of extracellular fura is performed by first subtracting the amount of fluorescence (extracellular fura) determined by manganese addition from the fluorescence values of the measurement points, then correcting F_max by subtracting the same amount F_min is determined. for this purpose, the particular by addition of manganese fluorescence amount is divided by the value 2.24. the value of 2.24 was determined as the device's own proportionality between the fluorescence of calciumgesättigtem and calcium free Fura-2 at an excitation wavelength of 340 nm (measured with unesterified , free fura-2) The correction amount thus obtained was subtracted from F_min ).

Die untersuchten Peptide wurden aus tausendfach konzentrierten Lösungen (10^-5 M) in KRBH ohne CaCl₂ und Glukose zugegeben.The peptides investigated were added from thousandfold concentrated solutions (10^-5 M) in KRBH without CaCl₂ and glucose.

Aktivität der Exendin-AnalogaActivity of the exendin analogues

Einige Exendin-Analoga wurden im oben beschriebenen Calcium-Assay an INS-1 Zellen auf ihre biologische Aktivität getestet. Die Daten sind beispielhaft in Abbildung 1 als auch in Tabelle 2 gezeigt.Several exendin analogs were used in the above-described calcium assay on INS-1 cellstested for their biological activity. The data are exemplary in Figure 1 asalso shown in Table 2. 

Tabelle 2 Table 2

Literaturliterature

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Claims (5)

Translated fromGerman

1. Peptid,dadurch gekennzeichnet, daß es die Sequenz 1 oder 2 aufweistwobei X eine proteogene oder nichtproteogene Aminosäure außer Glycin bedeutet, die Aminosäuren in Position 1, 2, 28, 29 oder 30 unabhängig voneinander einzeln oder zusammen Teil der Sequenz sein können und der N-Terminus durch NR₁R₂ dargestellt wird, wobei
R₁ Wasserstoff, Acetyl, Trifluoracetyl, Adamantyl, Fmoc, Z, Boc, Alloc, C₁-C₆-Alkyl, C₂-C₈ Alkenyl oder C₇-C₉ Aralkyl,
R₂ Wasserstoff, Acetyl, Trifluoracetyl, Adamantyl, Fmoc, Z, Boc, Alloc, C₄-C₆-Alkyl, C₂-C₈ Alkenyl oder C₇-C₉ Aralkyl, bedeuten und der C-Terminus durch COR₃ dargestellt wird, wobei
R₃ gleich OR₄ oder NR₄R₅
mit R₄ gleich Wasserstoff oder C₁-C₆-Alkyl
mit R₅ gleich Wasserstoff oder C₁-C₆-Alkyl
bedeutet, sowie deren physiologisch verträglichen Salze und Ester.1. peptide,characterized in that it has the sequence 1 or 2 wherein X represents a proteogenic or non-proteogenic amino acid other than glycine, the amino acids in position 1, 2, 28, 29 or 30 may independently or separately be part of the sequence and the N-terminus represented by NR₁R₂, wherein
R₁ is hydrogen, acetyl, trifluoroacetyl, adamantyl, Fmoc, Z, Boc, Alloc, C₁-C₆-alkyl, C₂-C₈ alkenyl or C₇-C₉ aralkyl,
R₂ is hydrogen, acetyl, trifluoroacetyl, adamantyl, Fmoc, Z, Boc, Alloc, C₄-C₆ alkyl, C₂-C₈ alkenyl or C₇-C₉ aralkyl, and the C-terminus is represented by COR₃, wherein
R₃ is equal to OR₄ or NR₄R₅
with R₄ is hydrogen or C₁-C₆-alkyl
where R₅ is hydrogen or C₁-C₆-alkyl
means, and their physiologically acceptable salts and esters.2. Peptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine aber höchstens 11 der folgenden Modifikationen an der Aminosäurekette erfolgt sind

• (a) Die α-Aminosäure in Position 1 ist D-His, Ala, D-Ala, Gly, Lys oder D-Lys, wobei Ala, Gly oder Lys besonders bevorzugt werden; oder
• (b) Die α-Aminosäure in Position 2 ist Ser, D-Ser, Thr, D-Thr, Gly, Ala, D-Ala, Ile, D-Ile, Val, D-Val, Leu oder D-Leu, bevorzugt Ser, Thr, Gly, Ala, Val, Ile oder Leu; oder
• (c) Die α-Aminosäure in Position 3 ist Glu, D-Glu, Asp, D-Asp, Ala oder D-Ala, bevorzugt Glu, Asp oder Ala; oder
• (d) Die Aminosäure in Position 4 ist Ala, D-Ala oder β-Ala, bevorzugt Ala; oder
• (e) Die α-Aminosäure in Position 5 ist Ser, Tyr oder Ala; oder
• (f) Die α-Aminosäure in Position 6 ist Ala, Ile, Val, Leu, Cha oder Tyr, bevorzugt Ala, Ile, Val, Leu oder Tyr; oder
• (g) Die α-Aminosäure in Position 7 ist Ala, D-Ala, Tyr, D-Tyr, Ser, D-Ser oder D-Thr, bevorzugt Ala, Tyr oder Ser; oder
• (h) Die α-Aminosäure in Position 8 ist Ala, Tyr oder Thr; oder
• (i) Die α-Aminosäure in Position 9 ist Ala, D-Ala, Glu, D-Glu oder D-Asp, bevorzugt Ala oder Glu; oder
• (j) Die Aminosäuren in Position 10, 11, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 28, 29, sind unabhängig voneinander eine proteinogene oder nicht-proteinogene D-oder L-Aminosäure, bevorzugt eine proteinogene L-Aminosäure; oder
• (k) Die α-Aminosäure in Position 13 ist eine neutrale L-Aminosäure, bevorzugt eine neutrale proteinogene L-Aminosäure; oder
• (l) Die α-Aminosäure in Position 14 wird ersetzt durch eine neutrale L- oder D-Aminosäure außer L-Leucin, bevorzugt durch Nle, D-Nle, Ala, D-Ala, Ile, D-Ile, Val oder D-Val, besonders bevorzugt sind Ile, Val oder Ala; oder
• (m) Die α-Aminosäure in Position 22 ist D-Phe, Tyr, D-Tyr, Leu, D-Leu, Val, D-Val, L-Cha, D-Cha, β-1-Nal, β-2-Nal oder β-1-D-Nal, bevorzugt sind Tyr, Leu oder Val; oder
• (n) Die α-Aminosäure in Position 23 ist Leu, D-Leu, D-Ile, Val, D-Val, L-Cha, D-Cha, Tyr, D-Tyr, Phe oder D-Phe, bevorzugt sind Leu, Val, Tyr oder Phe; oder
• (o) Die α-Aminosäure in Position 25, 26 oder 27 ist eine neutrale L- oder D-Aminosäure, bevorzugt eine neutrale, proteinogene L-Aminosäure; oder
• (p) Die α-Aminosäure in Position 30 ist eine proteinogene oder nicht-proteinogene D- oder L-Aminosäure außer Glycin, bevorzugt Arg, D-Arg, Tyr oder D-Tyr, besonders bevorzugt sind Arg oder Tyr.

2. Peptides according to claim 1, characterized in that at least one but at most 11 of the following modifications to the amino acid chain are carried out

• (a) The α-amino acid in position 1 is D-His, Ala, D-Ala, Gly, Lys or D-Lys, with Ala, Gly or Lys being particularly preferred; or
• (b) The α-amino acid in position 2 is Ser, D-Ser, Thr, D-Thr, Gly, Ala, D-Ala, Ile, D-Ile, Val, D-Val, Leu or D-Leu Ser, Thr, Gly, Ala, Val, Ile or Leu; or
• (c) The α-amino acid in position 3 is Glu, D-Glu, Asp, D-Asp, Ala or D-Ala, preferably Glu, Asp or Ala; or
• (d) The amino acid in position 4 is Ala, D-Ala or β-Ala, preferably Ala; or
• (e) The α-amino acid in position 5 is Ser, Tyr or Ala; or
• (f) The α-amino acid in position 6 is Ala, Ile, Val, Leu, Cha or Tyr, preferably Ala, Ile, Val, Leu or Tyr; or
• (g) The α-amino acid in position 7 is Ala, D-Ala, Tyr, D-Tyr, Ser, D-Ser or D-Thr, preferably Ala, Tyr or Ser; or
• (h) The α-amino acid in position 8 is Ala, Tyr or Thr; or
• (i) The α-amino acid in position 9 is Ala, D-Ala, Glu, D-Glu or D-Asp, preferably Ala or Glu; or
• (j) The amino acids at position 10, 11, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 28, 29 are independently a proteinogenic or non-proteinogenic D or L amino acid a proteinogenic L-amino acid; or
• (k) The α-amino acid in position 13 is a neutral L-amino acid, preferably a neutral proteinogenic L-amino acid; or
• (l) The α-amino acid in position 14 is replaced by a neutral L or D amino acid except L-leucine, preferably by Nle, D-Nle, Ala, D-Ala, Ile, D-Ile, Val or D- Val, especially preferred are Ile, Val or Ala; or
• (m) The α-amino acid at position 22 is D-Phe, Tyr, D-Tyr, Leu, D-Leu, Val, D-Val, L-Cha, D-Cha, β-1-Nal, β-2 -Nal or β-1-D-Nal, preferred are Tyr, Leu or Val; or
• (n) The α-amino acid in position 23 is Leu, D-Leu, D-Ile, Val, D-Val, L-Cha, D-Cha, Tyr, D-Tyr, Phe or D-Phe, preferably Leu , Val, Tyr or Phe; or
• (o) The α-amino acid at position 25, 26 or 27 is a neutral L or D amino acid, preferably a neutral, proteinogenic L-amino acid; or
• (p) The α-amino acid in position 30 is a proteinogenic or non-proteinogenic D- or L-amino acid other than glycine, preferably Arg, D-Arg, Tyr or D-Tyr, more preferably Arg or Tyr.

3. Peptid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es die Insulinfreisetzung stimuliert.3. Peptide according to claim 1 or 2, characterized in that it is theStimulates insulin release.4. Arzneimittel enthaltend neben üblichen Trägern und Hilfsstoffen mindestens ein Peptid nach Anspruch 1, 2 oder 3.4. Medicaments containing in addition to conventional carriers and excipients at least oneA peptide according to claim 1, 2 or 3.5. Verwendung von Peptiden nach Anspruch 1, 2 oder 3 zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung von Diabetes.5. Use of peptides according to claim 1, 2 or 3 for the preparation ofpharmaceutical compositions for the treatment of diabetes.