DE102011053775A1 - Methods and apparatus for detecting tau protein deposits in the eye - Google Patents

Abstract

Translated fromGerman

Es werden Verfahren und Vorrichtungen zum Nachweis von gepaarten helikalen τ-Filamenten τ-PHF im Auge (100) bereitgestellt, bei welchen beispielsweise mittels einer Kameraeinrichtung (103) ein Übersichtsbild erstellt wird und mit einer Laserscannereinrichtung auf Basis des Übersichtsbildes identifizierte interessierende Bereiche abgerastert werden, um Fluoreszenz von an gepaarten helikalen τ-Filamenten (107) gebundenen Sonden (108) zu detektieren.Methods and apparatus are provided for detecting paired helical δ-filaments τ-PHF in the eye (100) in which, for example, an overview image is created by means of a camera device (103) and scanned areas of interest identified by a laser scanner based on the overview image to detect fluorescence from probes (108) bound to paired helical δ-filaments (107).

Description

Translated fromGerman

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zum Nachweis von Ablagerungen des τ-Proteins im Auge zur Diagnose von Erkrankungen aus dem Formenkreis der sogenannten Tauopathien, beispielsweise an der Retina eines menschlichen Auges.The present invention relates to methods and devices for the detection of deposits of τ protein in the eye for the diagnosis of diseases from the group of so-called tauopathies, for example on the retina of a human eye.

So genannte Tauopathien gehören zu einer Gruppe von neurodegenerativen Krankheiten, denen eine pathologische Ablagerung von τ-Proteinen im Gehirn gemeinsam ist. Zur Gruppe der Tauopathien zählen beispielsweise Morbus Alzheimer, Morbus Pick, kortikobasale Degeneration, frontotemporale Demenz oder auch die progressive supranukleäre Blickparese. Morbus Alzheimer, d. h. Alzheimer-Krankheit, ist dabei bei weitem die häufigste und auch die am intensivsten erforschte Krankheit dieser Gruppe und dient daher im Folgenden als Anwendungsbeispiel.So-called tauopathies belong to a group of neurodegenerative diseases that share a pathological deposit of τ-proteins in the brain. The group of tauopathies include, for example, Alzheimer's disease, Pick's disease, corticobasal degeneration, frontotemporal dementia or progressive supranuclear palsy. Alzheimer's disease, d. H. Alzheimer's disease, is by far the most common and also the most intensively researched disease of this group and therefore serves as an application example below.

Die Alzheimer-Krankheit betrifft als häufigste Form von fortschreitenden neurodegenerativen Erkrankungen bei älteren Menschen ca. 40%–50% in der Altersgruppe der 85–90jährigen 60% der weltweit von Demenz betroffenen Menschen sind an Alzheimer erkrankt. Derzeit kann Alzheimer nur nach dem Tod des Erkrankten mittels Autopsie des Gehirns mit Sicherheit diagnostiziert werden.Alzheimer's disease, the most common form of progressive neurodegenerative disease, affects approximately 40% -50% of the age group 85-90 years old in the elderly. 60% of people with dementia worldwide suffer from Alzheimer's disease. Currently, Alzheimer's can only be diagnosed with certainty after the death of the patient by autopsy of the brain.

Gehirne von an einem Morbus Alzheimer erkrankten Personen enthalten im neuronalen Gewebe neben charakteristischen extrazellulären Ablagerungen, den so genannten Amyloid-Plaques, dystrophierte Neuriten und neurofibrilläre Bündel (engl. „neurofibrillary tangles”, NFT). Diese neurofibrillären Bündel bestehen aus pathologischen Ablagerungen des τ-Proteins, das für eine Stabilisierung von Mikrotubuli vor allem in Axonen eine wichtige Rolle spielt. Eine abnorme Hyperphosphorylierung wird als ursächlich für die Ausbildung von gepaarten helikalen τ-Filamenten (engl. „paired helical filaments”, PHF), welche nicht mehr mit den Mikrotubuli interagieren können, angesehen. Als Folge dieser pathologischen Veränderungen können extrazelluläre τ-PHF-Ablagerungen als neurofibrilläre Läsionen in Gehirnen von Alzheimer-Patienten beobachtet werden.Brains of people suffering from Alzheimer's disease contain neuronal tissue in addition to characteristic extracellular deposits, the so-called amyloid plaques, dystrophized neurites and neurofibrillary tangles (NFT). These neurofibrillary tangles consist of pathological deposits of the τ protein, which plays an important role in stabilizing microtubules, especially in axons. Abnormal hyperphosphorylation is considered to be the cause of the formation of paired helical filaments (π), which can no longer interact with the microtubules. As a result of these pathological changes, extracellular τ-PHF deposits can be observed as neurofibrillary lesions in brains of Alzheimer's patients.

Auf zellulärer Ebene läuft dabei die Bildung von neurofibrillären Bündeln aus τ-Proteinen ungefähr wie folgt ab:
Im Verlauf ihrer Bildung und Anhäufung fügen sich gepaarte helikale Filamente des τ-Proteins zunächst innerhalb des Zytoplasmas zusammen, wahrscheinlich aus τ-Oligomeren, die während oder vor der PHF-Bildung verkürzt werden. Daraus entstehen klassische intrazelluläre neurofibrilläre Bündel. In diesem Zustand bestehen die τ-PHFs aus einem Kern von verkürzten τ-Proteinen und einem ausgefransten äußeren Bereich mit vollständigen τ-Proteinen. Es wird angenommen, dass diese Aggregate zu einer funktionellen Beeinträchtigung der betroffenen Neurone führen.At the cellular level, the formation of neurofibrillary tangles of τ-proteins proceeds approximately as follows:
In the course of their formation and accumulation, paired helical filaments of the τ protein first assemble within the cytoplasm, likely from τ oligomers, which are truncated during or before PHF formation. This results in classic intracellular neurofibrillary tangles. In this state, the τ PHFs consist of a core of truncated τ proteins and a frayed outer region with complete τ proteins. It is believed that these aggregates result in functional impairment of the affected neurons.

Derzeit wird das Ausmaß einer Alzheimer-Erkrankung am lebenden Patienten im Wesentlichen indirekt anhand von kognitiven Tests, Liquor-Untersuchungen oder morphologischen Veränderungen beispielsweise des Gehirnvolumens oder von Stoffwechselstörungen betroffener Gehirnbereiche mittels Magnetresonanztomographie (MRT) oder FDG-PET (Positronenemissionstomographie unter Verwendung von^18F-Fluordesoxyglukose) diagnostiziert. Die Spezifität derartiger indirekter Methoden, welche häufig mit hohen statistischen Schwankungsbreiten der Ergebnisse verbunden sind, sind gegenüber einem direkten Nachweis von τ-PHF im Gehirn als gering einzuschätzen.Currently, the extent of Alzheimer's disease in the living patient is determined substantially indirectly from cognitive tests, cerebrospinal fluid examinations, or morphological changes, for example, in brain volume or metabolic disorders of affected brain areas by magnetic resonance imaging (MRI) or FDG-PET (positron emission tomography using^18F fluorodeoxyglucose ) diagnosed. The specificity of such indirect methods, which are often associated with high statistical variability of results, are considered to be low compared to direct detection of τ-PHF in the brain.

Daher wäre es wünschenswert, τ-PHF-Ablagerungen frühzeitig erfassen zu können oder auch den Verlauf einer τ-Pathie quantitativ bewerten zu können. Dies könnte Therapien erleichtern und frühzeitig ermöglichen.Therefore, it would be desirable to be able to detect τ-PHF deposits at an early stage or to be able to quantitatively evaluate the course of τ-pathy. This could facilitate therapies and enable them early.

Seit einiger Zeit werden hauptsächlich für Studienzwecke Positronenemissionstomogramme (PT) des Gehirns unter Verwendung von Kontrastmitteln (z. B. [¹¹C]PIB, [¹⁸F]FDDNP) durchgeführt, die durch selektive Bindung an Amyloid-Plaques und/oder τ-PHF einen direkten Hinweis auf pathologische Veränderungen des Nervengewebes geben. Aufgrund von sehr hohen Kosten für derartige Untersuchungen und einen hohen apparativen Aufwand sind derartige Untersuchungen jedoch kaum für großflächige Vorsorgeuntersuchungen oder für eine kontinuierliche Überwachung einer Therapie geeignet. Zudem können derartige Untersuchungen aufgrund der Strahlenbelastung an einem Patienten nicht beliebig oft wiederholt werden.For some time now, for purposes of study, positron emission tomograms (PT) of the brain have been performed using contrast agents (e.g., [¹¹ C] PIB, [¹⁸ F] FDDNP) that are selectively linked to amyloid plaques and / or τ-PHF give a direct indication of pathological changes of the nerve tissue. However, due to the very high costs for such examinations and a high expenditure on equipment, such examinations are hardly suitable for large-scale preventive examinations or for continuous monitoring of a therapy. In addition, such examinations can not be repeated as often as desired due to the radiation exposure to a patient.

In derWO 2011/038892 A1 wird vorgeschlagen, τ-PHF in einer Retina eines Auges, welche dem Gehirn zuzurechnen ist, nachzuweisen, wobei hierzu Fluoreszenzmarker verwendet werden können. Hierzu wird die Verwendung verschiedener optischer Geräte wie so genannter Funduskameras, d. h. Kameras zur Aufnahme des Augenhintergrundes, oder hochauflösender Laser Scanning Ophtalmoskope (LSO) vorgeschlagen.In the WO 2011/038892 A1 It is proposed to detect τ-PHF in a retina of an eye, which is attributable to the brain, using fluorescent markers for this purpose. For this purpose, the use of various optical devices such as so-called fundus cameras, ie cameras for recording the fundus, or high-resolution laser scanning ophthalmoscopes (LSO) is proposed.

Ausgehend hiervon ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, effiziente Verfahren und Vorrichtungen zum Nachweis von gepaarten helikalen τ-Filamenten im Auge bereitzustellen.With this in mind, it is an object of the present invention to provide efficient methods and apparatus for detecting paired helical τ filaments in the eye.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren nach Anspruch 1 sowie eine Vorrichtung gemäß Anspruch 15. Die Unteransprüche definieren weitere Ausführungsbeispiele.This object is achieved by a method according to claim 1 and a device according toClaim 15. The subclaims define further embodiments.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Detektion von gepaarten helikalen τ-Filamenten (τ-PHF) im Auge vorgeschlagen, umfassend:
Aufnehmen eines Übersichtsbildes einer Retina des Auges,
Identifizieren von mindestens einem interessierenden Gebiet der Retina auf Basis des Übersichtsbildes,
Abtasten des mindestens einen interessierenden Gebiets mit einem Laserstrahl, und
Detektieren von Lichtemission von für gepaarte helikale τ-Filamente sensitiven Sonden in Antwort auf das Abtasten mit dem Laserstrahl.According to the invention, a method is proposed for the detection of paired helical τ-filaments (τ-PHF) in the eye, comprising:
Taking an overview picture of a retina of the eye,
Identifying at least one area of interest of the retina on the basis of the overview image,
Scanning the at least one region of interest with a laser beam, and
Detecting light emission of paired helical τ-filament sensitive probes in response to scanning with the laser beam.

Indem zunächst ein Übersichtsbild aufgenommen wird und dann mindestens ein interessierendes Gebiet der Retina auf Basis des Übersichtsbildes identifiziert wird, kann eine effiziente Untersuchung durchgeführt werden. Insbesondere können die interessierenden Gebiete mittels des Abtasten mit Laserstrahl exakt untersucht werden, ohne dass eine Gesamtdauer der Untersuchung unnötig lang wird.By first taking an overview image and then identifying at least one area of interest of the retina on the basis of the overview image, an efficient examination can be carried out. In particular, the areas of interest can be accurately examined by means of laser beam scanning, without a total duration of the investigation becoming unnecessarily long.

Die interessierenden Gebiete können dabei insbesondere Gebiete sein, bei welchen auf dem Übersichtsbild Lichtemission von den Sonden identifizierbar ist.The regions of interest may in particular be regions in which light emission from the probes can be identified on the overview image.

Die Lichtemission kann insbesondere eine Fluoreszenzemission oder eine Emission von inelastisch gestreutem Streulicht, z. B. durch Ramanstreuung, umfassen.The light emission may in particular be a fluorescence emission or an emission of inelastically scattered scattered light, for. By Raman scattering.

Das Verfahren umfasst bei einem Ausführungsbeispiel weiterhin eine Durchführung einer ergänzenden Diagnostik wie einer polarisationsbasierten oder einer auf optischer Kohärenztomographie basierten morphologischen Charakterisierung des neuronalen Gewebes der Retina, umfassend z. B. eine Schichtdickenmessung der retinalen Nervenfaserzellschicht bzw. der gesamten Retina.The method, in one embodiment, further comprises performing supplemental diagnostics, such as polarization-based or optical coherence tomography-based morphological characterization of the neural tissue of the retina, comprising e.g. B. a layer thickness measurement of the retinal nerve fiber cell layer or the entire retina.

Auf Basis derartiger Messungen können dann verschiedene Tauopathien, d. h. dem Vorhandensein von τ-PHF, assoziierte Erkrankungen unterschieden werden, beispielsweise Augenerkrankungen wie Glaukom von neurodegenerativen Erkrankungen.On the basis of such measurements, various tauopathies, i. H. the presence of τ-PHF, associated diseases, such as eye diseases such as glaucoma of neurodegenerative diseases.

Bevorzugt umfasst die Detektion eine Lebensdauermessung der Fluoreszenz, wodurch an gepaarte helikale τ-Filamente gebundene Sonden von ungebundenen Sonden unterschieden werden können.Preferably, the detection comprises a lifetime measurement of the fluorescence, whereby probes bound to paired helical τ filaments can be distinguished from unbound probes.

Über eine optische Kohärenztomographie können zudem morphologische Informationen gewonnen werden, welche mit Informationen aus der Detektion der Fluoreszenz gekoppelt werden können, um die Fluoreszenz zellulären Strukturen in verschiedenen Schichten des Auges zu ermöglichen.Morphological information can also be obtained via optical coherence tomography, which can be coupled with information from the detection of the fluorescence in order to enable the fluorescence of cellular structures in different layers of the eye.

Die Auflösung des Abtastens beträgt bevorzugt 20 μm oder darunter, noch bevorzugter 10 μm oder darunter.The resolution of the scanning is preferably 20 μm or below, more preferably 10 μm or below.

Als Sonden werden bevorzugt ein oder mehrere Substanzen ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Arylaminothiazole, 4,6-Divinylpyrimidine, 2,5- und 3,6-Divinylpyrazine, [4-(1,3-Benzothiazol-2-yl)phenyl]hydrazone, Diarylharnstoffe, Tetracyclin, 4,4'-(1E,1'E)-2,2'-(1-aryl-1H-pyrazole-3,5-diyl)bis(ethene-2,1-diyl)bis-2-methoxyphenole, 2,5-Bis(4-hydroxystyryl)benzonitril und 2,5-Bis(4-hydroxystyryl)-N-benzamide. Es können jedoch auch andere für gepaarte helikale τ-Filamente sensitive Sonden verwendet werden.As probes, one or more substances are preferably selected from the group comprising arylaminothiazoles, 4,6-divinylpyrimidines, 2,5- and 3,6-divinylpyrazines, [4- (1,3-benzothiazol-2-yl) phenyl] hydrazones , Diaryl ureas, tetracycline, 4,4 '- (1E, 1'E) -2,2' - (1-aryl-1H-pyrazole-3,5-diyl) bis (ethene-2,1-diyl) bis- 2-methoxyphenols, 2,5-bis (4-hydroxystyryl) benzonitrile and 2,5-bis (4-hydroxystyryl) -N-benzamide. However, other probes sensitive to paired helical τ filaments may also be used.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:The invention will be explained in more detail with reference to the accompanying drawings with reference to embodiments. Show it:

1 ein Blockdiagramm eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, 1 a block diagram of an embodiment of a device according to the invention,

2 ein Diagramm eines weiteren Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, 2 a diagram of another embodiment of a device according to the invention,

3(a) bis (j) verschiedene in Ausführungsbeispielen der Erfindung einsetzbare Sonden, 3 (a) to (j) various probes usable in embodiments of the invention,

4 ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Verfahrens, 4 a flowchart illustrating an embodiment of a method according to the invention,

5 histologische Schnitte einer Retina von Patienten mit Tauopathien, und 5 histological sections of a retina of patients with tauopathies, and

6 in vivo Aufnahmen von τ-PHF in retinalen Ganglienzellen eines Mausmodells der Alzheimer-Erkrankung. 6 In vivo images of τ-PHF in retinal ganglion cells of a mouse model of Alzheimer's disease.

Im Folgenden werden verschiedene Ausführungsbeispiele näher erläutert. Es ist zu bemerken, dass Merkmale verschiedener Ausführungsbeispiele miteinander kombiniert werden können, sofern nichts anderes angegeben ist. Auf der anderen Seite ist eine Beschreibung eines Ausführungsbeispiels mit einer Vielzahl von Merkmalen nicht dahingehend auszulegen, dass alle diese Merkmale zur Ausführung der Erfindung notwendig sind, da andere Ausführungsbeispiele weniger Merkmale oder alternative Merkmale aufweisen können.In the following, various embodiments will be explained in more detail. It should be noted that features of various embodiments may be combined with each other unless otherwise specified. On the other hand, a description of an embodiment having a plurality of features is not to be construed as requiring all of these features for practicing the invention, as other embodiments may have fewer features or alternative features.

In1 ist ein Blockdiagramm einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Detektion von gepaarten helikalen τ-Filamenten (τ-PHT)107 in einem Auge100, beispielsweise einem menschlichen Auge, dargestellt. Zur Detektion der gepaarten helikalen τ-Filamente werden bei dem dargestellten Ausführungsbeispiel Sonden108,109, welche charakteristische Fluoreszenzeigenschaften aufweisen und welche auf gepaarte helikale τ-Filamente sensitiv sind, d. h. an diese binden, verabreicht. Bei dem in1 dargestellten Ausführungsbeispiel sind die Sonden108 bereits an gepaarte helikale τ-Filamente107 gebunden, während eine Sonde109 ungebunden ist. In 1 FIG. 4 is a block diagram of a paired helical τ filament (τ-PHT) detection apparatus according to the present invention. 107 in oneeye 100 , for example, a human eye. For the detection of the paired helical τ-filaments probes are in the illustratedembodiment 108 . 109 which have characteristic fluorescence properties and which are sensitive to, ie bind to, paired helical τ filaments. At the in 1 illustrated embodiment, theprobes 108 already pairedhelical τ filaments 107 tied while aprobe 109 is unbound.

Die Vorrichtung des Ausführungsbeispiels der1 umfasst zur Untersuchung des Auges100 eine Laserscannereinrichtung102 und eine Kameraeinrichtung103, welche bei dem Ausführungsbeispiel der1 über eine gemeinsame Ophthalmoskoplinse101 optisch mit dem Auge100 gekoppelt sind, um insbesondere eine Retina des Auges100, in welcher τ-PHT107 eingelagert ist, beleuchten zu können und von der Retina ausgehende optische Strahlung aufnehmen zu können. Die Laserscannereinrichtung102 und die Kameraeinrichtung103 werden über eine Steuerung104 gesteuert. Die Steuerung104 kann beispielsweise mittels eines Computers implementiert sein und weist bei dem dargestellten Ausführungsbeispiel einen Bildschirm106 und eine Eingabeeinrichtung105 auf, wobei die Eingabeeinrichtung105 beispielsweise eine Tastatur und/oder eine Maus umfassen kann.The device of the embodiment of 1 includes for examination of the eye 100 alaser scanner device 102 and acamera device 103 which in the embodiment of the 1 via acommon ophthalmoscope lens 101 visually with theeye 100 coupled, in particular, a retina of theeye 100 in which τ-PHT 107 is embedded, to be able to illuminate and to be able to absorb optical radiation originating from the retina. Thelaser scanner device 102 and thecamera device 103 be via acontroller 104 controlled. Thecontrol 104 can be implemented, for example, by means of a computer and has a screen in the illustratedembodiment 106 and aninput device 105 on, theinput device 105 For example, a keyboard and / or a mouse may include.

Zur Untersuchung des Auges100 ist die Steuerung104 eingerichtet, die Kameraeinrichtung103 zur Aufnahme eines Übersichtsbildes der Retina des Auges100 anzusteuern. Hierzu kann insbesondere die Kameraeinrichtung103 eine Beleuchtung zum Beleuchten der Retina aufweisen, welche an eine Anregungswellenlänge der Sonden108,109 angepasst ist, um die Sonden108,109 zur Fluoreszenz anzuregen. Zudem kann zur Aufnahme des Übersichtsbildes ein Farbfilter bereitgestellt werden, welcher im Wesentlichen nur Licht mit Wellenlängen entsprechend dem Fluoreszenzlicht der Sonden108,109 nach Anregung durch die Beleuchtung passieren lässt, sodass ein Übersichtsbild über die Fluoreszenz der Retina aufgenommen wird. Bei anderen Ausführungsbeispielen können zudem oder alternativ auch andere Arten von Bildern, beispielsweise mehrfarbige Bilder zur Identifizierung von Strukturen oder Infrarotbilder aufgenommen werden.For examination of theeye 100 is thecontroller 104 set up thecamera setup 103 for taking an overview picture of the retina of theeye 100 head for. For this purpose, in particular thecamera device 103 have illumination for illuminating the retina, which at an excitation wavelength of theprobes 108 . 109 adapted to theprobes 108 . 109 to stimulate fluorescence. In addition, a color filter can be provided for recording the overview image, which is essentially only light with wavelengths corresponding to the fluorescent light of theprobes 108 . 109 after excitation by the illumination, so that an overview of the fluorescence of the retina is taken. In other embodiments, also or alternatively, other types of images, for example, multicolor images for identifying structures or infrared images may be included.

Die Steuerung104 ist weiter eingerichtet, das aufgenommene Übersichtsbild auszuwerten und ein oder mehrere interessierende Gebiete (ROI, vom englischen „region of interest”) zu definieren. Die interessierenden Gebiete können dabei insbesondere Gebiete sein, in welchen auf dem Übersichtsbild Fluoreszenz von den Sonden108,109 vorhanden ist. Eine derartige Auswertung kann vollautomatisch mittels entsprechender automatischer Bildverarbeitung erfolgen. Bei anderen Ausführungsbeispielen kann die Auswahl interessierender Gebiete auch halbautomatisch erfolgen. Beispielsweise kann das Übersichtsbild auf dem Bildschirm106 angezeigt werden, wobei Gebiete mit Fluoreszenz von den Sonden108,109 hervorgehoben oder markiert sein können, und ein Benutzer kann dann mittels der Eingabeeinrichtung105 die interessierenden Gebiete auswählen. Die Steuerung104 steuert dann die Laserscannereinrichtung102 an, die interessierenden Gebiete mit einem Laserstrahl abzurastern und von dem der Retina in Antwort auf den Laserstrahl ausgehendes Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht, zu detektieren. Die Ortsauflösung bei einem derartigen Abtasten der interessierenden Gebiete beträgt bevorzugt weniger als 20 μm, noch bevorzugter weniger als 10 μm. Die Detektion kann dabei insbesondere zeitaufgelöst erfolgen, beispielsweise mittels FLI (Fluorescence Lifetime Imaging), und/oder spektralaufgelöst erfolgen, um auf diese Weise gebundene Sonden108 von ungebundenen Sonden109 unterscheiden zu können, da sich typischerweise durch die Bindung an gepaarte helikale τ-Filamente eine Lebensdauer und/oder ein Spektrum der Fluoreszenz verändert. Die Laserscannereinrichtung kann dabei insbesondere als konfokales Laser Scanning Ophthalmoskop (cSLO, Confocal Scanning Laser Ophthalmoscope) arbeiten.Thecontrol 104 is further set up to evaluate the recorded overview image and to define one or more regions of interest (ROI, from the English "region of interest"). The regions of interest may in particular be regions in which fluorescence from the probes is displayed on theoverview image 108 . 109 is available. Such an evaluation can be carried out fully automatically by means of corresponding automatic image processing. In other embodiments, the selection of areas of interest can also be semi-automatic. For example, the overview picture on thescreen 106 are displayed, with areas of fluorescence from theprobes 108 . 109 can be highlighted or marked, and a user can then use theinput device 105 select the areas of interest. Thecontrol 104 then controls thelaser scanner device 102 scanning the areas of interest with a laser beam and detecting from the retina the light emitted in response to the laser beam, in particular fluorescent light. The spatial resolution in such scanning of the regions of interest is preferably less than 20 μm, more preferably less than 10 μm. The detection can be carried out in particular time-resolved, for example by means of FLI (Fluorescence Lifetime Imaging), and / or carried out spectrally resolved to probes bound in thisway 108 from unboundprobes 109 can differ, since typically changes by the binding to paired helical τ-filaments a lifetime and / or a spectrum of fluorescence. The laser scanner device can work in particular as a confocal laser scanning ophthalmoscope (cSLO, Confocal Scanning Laser Ophthalmoscope).

Neben derartigen Fluoreszenzmessungen können bei manchen Ausführungsbeispielen mit der Laserscannereinrichtung102 auch optische Kohärenztomographiemessungen oder polarisationsabhängige Messungen durchgeführt werden, um zusätzlich zu einer bevorzugt tiefenaufgelösten Fluoreszenzverteilung morphologische Informationen über die Retina zu erhalten. Die morphologischen Informationen und die aus der Fluoreszenz gewonnenen Informationen können dann von der Steuerung104 verknüpft werden und beispielsweise auf dem Bildschirm106 zur Begutachtung beispielsweise durch einen Arzt dargestellt werden.In addition to such fluorescence measurements, in some embodiments the laser scanner device may 102 Optical coherence tomography measurements or polarization-dependent measurements may also be carried out in order to obtain morphological information about the retina in addition to a preferably depth-resolved fluorescence distribution. The morphological information and the information obtained from the fluorescence can then be used by thecontroller 104 be linked and, for example, on thescreen 106 for review, for example, be presented by a doctor.

Insbesondere können auf diese Weise Fluoreszenzsignale von den Sonden zellulären Strukturen in der inneren Körnerschicht (INL, „inner nuclear layer”) oder der Ganglienzellschicht (GCL, „ganglion cell layer”) oder anderen Schichten zugeordnet werden.In particular, fluorescence signals from the probes can be assigned in this way to cellular structures in the inner nuclear layer (INL) or the ganglion cell layer (GCL, or "ganglion cell layer") or other layers.

In2 ist ein detaillierteres Diagramm eines weiteren Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung dargestellt, wobei insbesondere eine Laserscannereinrichtung und eine Kameraeinrichtung detailliert gezeigt sind. In dem Ausführungsbeispiel der2 ist eine Steuerung wie die Steuerung104 der1 nicht explizit dargestellt, kann aber entsprechend der Beschreibung zur1 bereitgestellt sein.In 2 a more detailed diagram of a further embodiment of the present invention is shown, wherein in particular a laser scanner device and a camera device are shown in detail. In the embodiment of 2 is a controller like thecontroller 104 of the 1 not explicitly shown, but can according to the description of 1 be provided.

Als Laserscannereinrichtung umfasst das Ausführungsbeispiel der2 ein konfokales Laser Scanning Ophthalmoskop (cSLO), welches eine oder mehrere Laserlichtquellen1, einen Gehäusekopf41 sowie eine Detektionseinrichtung15 umfasst. Zudem umfasst das Ausführungsbeispiel der2 eine Kameraeinrichtung40. As a laser scanner device, the embodiment of the 2 a Confocal Laser Scanning Ophthalmoscope (cSLO), which contains one or more laser light sources 1 , ahousing head 41 and adetection device 15 includes. In addition, the embodiment includes the 2 acamera device 40 ,

Anzahl und Art der Laserlichtquellen1 können in Abhängigkeit von verwendeten Sonden50, welche in einem Auge10 nachzuweisen sind, gewählt werden, sodass die ein oder mehreren Laserlichtquellen entsprechende Anregungswellenlängen emittieren, um die Sonde50 zur Fluoreszenz anzuregen. Die ein oder mehreren Laserlichtquellen1 sind über Lichtleiter2, bevorzugt singlemodige Fasern, an den Gehäusekopf41 angekoppelt. Das von den Lichtleitern2 emittierte Laserlicht wird mittels Kollimatorlinsen3 kollimiert. Bei mehreren Laserlichtquellen1 wird das Laserlicht der verschiedenen Laserlichtquellen, in dem Beispiel der2 zwei Laserlichtquellen, über einen Umlenkspiegel4 und einen dichroitischen Strahlteiler29 oder eine andere optische Einrichtung zu einem einzigen Beleuchtungsstrahl vereinigt, welcher über einen weiteren Umlenkspiegel4 zu einem weiteren dichroitischen Strahlteiler30 gelenkt wird.Number and type of laser light sources 1 can depend on probes used 50 which in oneeye 10 are selected, so that the one or more laser light sources emit corresponding excitation wavelengths to theprobe 50 to stimulate fluorescence. The one or more laser light sources 1 are over optical fibers 2 , preferably single-mode fibers, to thehousing head 41 coupled. The light guides 2 emitted laser light is usingcollimator lenses 3 collimated. For multiple laser light sources 1 is the laser light of different laser light sources, in the example of 2 two laser light sources, via adeflection mirror 4 and adichroic beam splitter 29 or another optical device combined into a single illumination beam, which via anotherdeflection mirror 4 to anotherdichroic beam splitter 30 is steered.

Der dichroitische Strahlteiler30 dient zur Trennung eines Beleuchtungsstrahlengangs, über welchen das von den Laserlichtquellen1 emittierte Laserlicht letztendlich in das Auge10 gelenkt wird, von einem Detektionsstrahlengang, mit welchem von dem Auge10 ausgehendes Licht zu der Detektoreinrichtung15 gelenkt wird. Von dem dichroitischen Strahlteiler30 gelangt das Laserlicht des Beleuchtungsstrahls zu einem Scannerspiegel5, welcher bevorzugt in einer konjugierten Pupillenebene der optischen Anordnung angeordnet ist. Der Scannerspiegel5 kann beispielsweise einen zweiachsigen Scannerspiegel oder zwei hintereinander geschaltete einachsige Scannerspiegel aufweisen, um durch Bewegung des Scannerspiegels5 eine Fläche im Auge10, insbesondere auf einer Retina des Auges10, abtasten zu können. Die Scanbewegung des Scannerspiegels5 kann dabei beispielsweise durch die Steuerung104 der1 gesteuert werden.Thedichroic beam splitter 30 serves to separate an illumination beam path over which the laser light sources 1 Finally, laser light emitted into theeye 10 is directed, from a detection beam path, with which of theeye 10 outgoing light to thedetector device 15 is steered. From thedichroic beam splitter 30 the laser light of the illumination beam reaches a scanner mirror 5 , which is preferably arranged in a conjugate pupil plane of the optical arrangement. The scanner mirror 5 For example, it may include a biaxial scanner mirror or two monochrome scanner mirrors connected in series to move the scanner mirror 5 an area in theeye 10 , especially on a retina of theeye 10 to be able to feel. The scanning motion of the scanner mirror 5 can, for example, by thecontroller 104 of the 1 to be controlled.

Mittels eines Objektivs6, eines Objektivs7, einem Strahlteiler8 und einer Ophthalmoskoplinse9 wird das Laserlicht dann auf eine gewünschte Schicht, insbesondere die Retina bzw. eine Schicht der Retina, im Auge10 fokussiert. Das Objektiv6 kann auch als Scanobjektiv bezeichnet werden, das Objektiv7 kann auch als Feldobjektiv bezeichnet werden. Der Strahlteiler8 kann beispielsweise ein- und ausschwenkbar sein, um wahlweise die Laserscannereinrichtung oder die Kameraeinrichtung40 nutzen zu können. Bei anderen Ausführungsbeispielen benutzen Laserscannereinrichtung und Kameraeinrichtung unterschiedliche Wellenlängen, und der Strahlteiler8 kann als wellenlängenselektiver, beispielsweise dichroitischer, Strahlteiler ausgestaltet sein.By means of alens 6 , alens 7 , a beam splitter 8th and an ophthalmoscope lens 9 The laser light is then on a desired layer, in particular the retina or a layer of the retina, in theeye 10 focused. Theobjective 6 can also be referred to as a scan lens, thelens 7 can also be referred to as a field objective. The beam splitter 8th For example, it can be swiveled in and out to either the laser scanner device or thecamera device 40 to be able to use. In other embodiments, the laser scanner and camera device use different wavelengths, and the beam splitter 8th can be configured as a wavelength-selective, for example dichroic, beam splitter.

Das in Antwort auf die Beleuchtung mit Laserlicht von der Retina des Auges10 emittierte bzw. gestreute Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht, welches durch Anregung der Sonde50 mit Laserlicht entsteht, wird in umgekehrter Richtung wie das Beleuchtungslicht über Ophthalmoskoplinse9, Strahlteiler8, Objektiv7, Objektiv6 und Scannerspiegel5 zu dem dichroitischen Strahlteiler30 gelenkt, geht durch diesen zumindest teilweise hindurch und wird dann über eine Pinholelinse11 auf ein Pinhole12 fokussiert. Das Pinhole12 weist bevorzugt eine variable Größe auf, sodass Konfokalität und Signalstärke an der Detektionseinrichtung15 anpassbar sind, wobei ein weiter geöffnetes Pinhole eine schlechtere Konfokalität bei gleichzeitig höherer Signalstärke bewirkt. Über eine Linse13 wird dann das das Pinhole12 passierende Licht in einen Lichtleiter14, bevorzugt eine Multimode-Faser, eingekoppelt, welche das Licht zu der Detektionseinrichtung15 leitet. Die Detektionseinrichtung15 ist dabei zur spektral aufgelösten Detektion und/oder zur zeitaufgelösten Detektion bzw. zur Fluoreszenzlebensdauermessung (Fluorescence Lifetime Imaging, FLI) eingerichtet, um wie bereits erläutert gebundene von ungebundenen Sonden unterscheiden zu können.That in response to the illumination with laser light from the retina of theeye 10 emitted or scattered light, in particular fluorescent light, which by excitation of theprobe 50 produced with laser light, is in the opposite direction as the illumination light via ophthalmoscope lens 9 , Beam splitter 8th ,Objective 7 ,Objective 6 and scanner mirror 5 to thedichroic beam splitter 30 steered, passes through this at least partially and is then on a Pinholelinse 11 on apinhole 12 focused. Thepinhole 12 preferably has a variable size, so that confocality and signal strength at thedetection device 15 are adaptable, with a further open pinhole causes a poorer confocality at the same time higher signal strength. About alens 13 then will that be the pinhole 12 passing light into alight guide 14 , preferably a multimode fiber coupled, which couples the light to thedetection device 15 passes. Thedetection device 15 is hereby set up for spectrally resolved detection and / or for time-resolved detection or fluorescence lifetime imaging (FLI) in order to be able to distinguish bound from unbound probes as already explained.

Die Kameraeinrichtung40 des Ausführungsbeispiels der2 weist eine Beleuchtung16 auf, welche ein oder mehrere Lichtquellen, insbesondere breitbandig emittierende Lichtquellen, aufweisen kann, beispielsweise eine Blitzlampe, eine oder mehrere Weisslichtleuchtdioden oder Kombinationen von Leuchtdioden, welche in verschiedenen Spektralbereichen emittieren. Über einen Kollimator17, ein Objektiv18 (Feldobjektiv), ein Objektiv20 (Ringblendenobjektiv) und ein Objektiv22, welches insbesondere als Anti-Reflexpunktobjektiv ausgestaltet sein kann und hierfür entsprechende Beschichtungen aufweisen kann, und einen Strahlteiler23 gelangt das Licht über den bereits beschriebenen Strahlteiler8 zur Ophthalmoskoplinse9 und beleuchtet das Auge10. Zusätzlich sind eine Netzhautblende19 sowie eine Feldblende21 bereitgestellt. Über einen bevorzugt wechselbaren Farbfilter31 kann ein Spektralbereich zur Beleuchtung des Auges10 ausgewählt werden, beispielsweise ein Spektralbereich, in welchem eine Fluoreszenz der Sonde50 angeregt werden kann.Thecamera device 40 of the embodiment of 2 has alighting 16 which can have one or more light sources, in particular broadband emitting light sources, for example a flash lamp, one or more white light LEDs or combinations of light emitting diodes which emit in different spectral ranges. About acollimator 17 , a lens 18 (Field objective), a lens 20 (Ring aperture lens) and alens 22 , which may be configured in particular as an anti-reflection lens and may have corresponding coatings, and abeam splitter 23 the light passes through the beam splitter already described 8th to the ophthalmoscope lens 9 and illuminate theeye 10 , In addition, there is aretina 19 and afield stop 21 provided. About a preferablychangeable color filter 31 can be a spectral range to illuminate theeye 10 be selected, for example, a spectral region in which a fluorescence of theprobe 50 can be stimulated.

Der Strahlteiler23 ist bei dem dargestellten Ausführungsbeispiel als Lochspiegel ausgelegt, so dass bei dem dargestellten Beispiel der Detektionsstrahlengang der Kameraeinrichtung wie dargestellt „innerhalb” des Beleuchtungsstrahlengangs verläuft.Thebeam splitter 23 is designed as a hole mirror in the illustrated embodiment, so that in the illustrated example, the detection beam path of the camera device as shown "inside" the illumination beam path runs.

Das von dem Auge10, insbesondere der Retina des Auges10, in Antwort auf das von der Beleuchtung16 emittierte Licht ausgehende Licht wird über die Ophthalmoskoplinse9 durch die Strahlteiler8 und23 hindurch zu einem Objektiv24 gelenkt, von wo es über einen Strahlteiler28 und ein Kameraobjektiv25 zu einer Kamera27 gelenkt wird, mit welcher ein Bild aufgenommen werden kann. Zudem wird durch den Strahlteiler28 hindurchgehendes Licht über ein Kameraobjektiv25 zu einer weiteren Kamera26 gelenkt. Die weitere Kamera26 kann beispielsweise eine Infrarotkamera sein, während die Kamera27 beispielweise eine Farbbildkamera sein kann. Es können jedoch auch zwei Farbbildkameras oder zwei Infrarotkameras oder auch eine Schwarz-Weiss-Kamera vorgesehen sein. Vor der Kamera27 ist bei dem dargestellten Ausführungsbeispiel ein bevorzugt wechselbarer Farbfilter32 angeordnet, welcher beispielsweise ausgelegt sein kann, nur Licht im Wellenlängenbereich einer Fluoreszenz der Sonde50 platzieren zu lassen, so dass mit der Kamera27 ein Übersichtsbild der Fluoreszenz in dem Auge10 angefertigt werden kann, auf Basis dessen dann wie bereits unter Bezugnahme auf1 erläutert die Laserscannereinrichtung, insbesondere der Scannerspiegel5 angesteuert werden kann, interessierende Bereiche abzurastern. Die weitere Kamera26 kann beispielsweise zur Verfolgung von Bewegungen des Auges10 oder für andere Einstellungen genutzt werden. That of theeye 10 , especially the retina of theeye 10 , in response to that from thelighting 16 emitted light emitted light is transmitted through the ophthalmoscope lens 9 through the beam splitter 8th and 23 through to alens 24 steered from where it has abeam splitter 28 and acamera lens 25 to acamera 27 is directed, with which a picture can be taken. In addition, through thebeam splitter 28 passing light through acamera lens 25 to anothercamera 26 directed. Theother camera 26 For example, an infrared camera may be while the camera is on 27 For example, a color camera can be. However, it can also be provided two color cameras or two infrared cameras or a black and white camera. In front of thecamera 27 is in the illustrated embodiment, a preferablychangeable color filter 32 arranged, which may be designed, for example, only light in the wavelength range of fluorescence of theprobe 50 place it, so with thecamera 27 an overview image of the fluorescence in theeye 10 can be made on the basis of then then as already with reference to 1 explains the laser scanner device, in particular the scanner mirror 5 can be driven to scan areas of interest. Theother camera 26 For example, to track movements of theeye 10 or for other settings.

Bei dem dargestellten Ausführungsbeispiel weisen die Objektive7 und24 einen variablen Fokus auf, so dass mittels auch dieser Objektive auf einen interessierenden Bereich des Auges10, insbesondere die Retina des Auges10, fokussiert werden kann.In the illustrated embodiment, thelenses 7 and 24 a variable focus on, so that by means of these lenses on a region of interest of theeye 10 , especially the retina of theeye 10 , can be focused.

Als Sonden zum Nachweis von gepaarten helikalen τ-Filamenten, insbesondere Aggregaten hiervon, können beispielsweise die in3 dargestellten Stoffe verwendet werden, beispielsweise Arylaminothiazole (3(a)), 4,6-Divinylpyrimidine (3(b)), 2,5-Divinylpyrazine (3(c)), Benzothiazolylphenylhydrazone (z. B. die in3(d) gezeigte Substanz), 3,6-Divinylpyridanzine (3(e)), Diarylharnstoffe (3(f)), Tetracycline (3(g)), Stilbenderivate, 3,5-Divinylpyrazolen oder die in3(h) bis3(j) gezeigten Strukturen, nämlich 4,4'-(1E,1'E)-2,2'-(1-Aryl-1H-pyrazole-3,5-diyl)bis(ethene-2,1-diyl)bis-2-methoxyphenole (3(h)), 2,5-Bis(4-hydroxystyryl)benzonitril (3(i)), oder 2,5-Bis(4-hydroxystyryl)-N-benzamide (3(j)).As probes for the detection of paired helical τ-filaments, in particular aggregates thereof, for example, in 3 used, for example, arylaminothiazoles ( 3 (a) ), 4,6-divinylpyrimidines ( 3 (b) ), 2,5-divinylpyrazines ( 3 (c) ), Benzothiazolylphenylhydrazones (e.g., the in 3 (d) shown substance), 3,6-divinylpyridanzine ( 3 (e) ), Diaryl ureas ( 3 (f) ), Tetracyclines ( 3 (g) ), Stilbene derivatives, 3,5-divinylpyrazoles or the in 3 (h) to 3 (j) structures shown, namely 4,4 '- (1E, 1'E) -2,2' - (1-aryl-1H-pyrazole-3,5-diyl) bis (ethene-2,1-diyl) bis-2 methoxyphenols ( 3 (h) ), 2,5-bis (4-hydroxystyryl) benzonitrile ( 3 (i) ), or 2,5-bis (4-hydroxystyryl) -N-benzamide ( 3 (j) ).

Die dargestellten Reste können beispielsweise C₁-C₆-Alkylreste sein.The radicals shown can be, for example, C₁ -C₆ -alkyl radicals.

Die Auswahl an Sonden ist jedoch nicht auf die dargestellten Beispiele beschränkt.However, the choice of probes is not limited to the illustrated examples.

Die genannten Verbindungen wirken vorzugsweise als fluoreszente Sonden. Sie besitzen eine (vorzugsweise hohe) Affinität für das Aβ-Protein, α-Synuclein und/oder für Tau-PHF-Aggregate und binden – vorzugsweise spezifisch – an diese. Die Bindung der erfindungsgemäßen Verbindungen an eines oder mehrere der oben genannten Zielproteine ist optisch detektierbar.The compounds mentioned preferably act as fluorescent probes. They have a (preferably high) affinity for the Aβ protein, α-synuclein and / or tau-PHF aggregates and bind to them - preferably specifically. The binding of the compounds of the invention to one or more of the above target proteins is optically detectable.

Bevorzugt weisen verwendete Sonden eine hinreichende Löslichkeit, geringe Lipophilie (logP < 5) und eine selektive Bindung an τ-PHF auch in Gegenwart anderer β-Faltblatt-Aggregate wie β-Amyloid auf. Bevorzugt liegt eine Dissoziationskonstante von verwendeten Sonden in einem in-vitro-Verdrängungsassay gegen Thioflavin-S oder Thioflavin-T oder Autoverdrängungsassay gegen radiomarkierte Analoga bei IC/EC₅₀ < 200 nM. Eine Einphotonenfluoreszenzanregung der an τ-PHF gebundenen Sonden liegt bevorzugt zwischen 390 und 550 nm, wobei auch andere Wellenlängen möglich sind, wobei dann die entsprechende Anregungswellenlänge, beispielsweise durch die Laserlichtquellen1 oder die Beleuchtung6, entsprechend anzupassen sind.Preferably, probes used have sufficient solubility, low lipophilicity (logP <5) and selective binding to τ-PHF even in the presence of other β-sheet aggregates such as β-amyloid. Preferably, a dissociation constant of probes used is in an in vitro displacement assay against thioflavin-S or thioflavin-T or auto-displacement assay against radiolabelled analogs at IC / EC₅₀ <200 nM. A one-photon fluorescence excitation of the probes bound to τ-PHF is preferably between 390 and 550 nm, although other wavelengths are possible, in which case the corresponding excitation wavelength, for example by the laser light sources 1 or thelighting 6 to be adjusted accordingly.

Bei manchen der beschriebenen Stoffe, insbesondere der 2,5-Divinylpyramizine und 4,6-Divinylpyrimidine, führen unterschiedliche Geometrien und Quatrupolmomente bei ähnlicher Affinität zu τ-PHF, insbesondere Tau-Aggregaten, und gleichbleibender Selektivität gegenüber anderen β-Faltblatt-Aggregaten zu unterschiedlichen Photoneneinfangquerschnitten bei einer Einphotonenanregung und einer Zweiphotonenanregung.In some of the described materials, especially the 2,5-divinylpyramizines and 4,6-divinylpyrimidines, different geometries and quatrupole moments with similar affinities to τ-PHF, especially tau aggregates, and consistent selectivity towards other β-sheet aggregates result in different Photon capture cross sections for single photon excitation and two photon excitation.

Zusammenfassend weisen als Sonden verwendete Stoffe bevorzugt 3 oder mehr der folgenden Eigenschaften a)–f) auf:

• a) eine größer fünffache, bevorzugt größer zehnfache Extinktionszunahme bei einer Detektionswellenlänge nach Bindung an τ-PHF-Aggregate (oder auch an β-Amyloid) gegenüber einem ungebundenen Zustand,
• b) einen Stokes-Shift von > 10 nm, bevorzugt > 20 nm,
• c) einen Extinktionskoeffizienten E > 5000 L·mol^–1·cm^–1, bevorzugt größer 10000 L·mol^–1·cm^–1
• d) EC50 < 400 nM, bevorzugt < 200 nM in einem Verdrängungsassay gegen fluoreszente Referenzsonde oder im Autoverdrängungsassay gegen die radioisotopenmarkierte Verbindung
• e) eine Löslichkeit/Lipophilie mit logP < 5, bevorzugt zwischen 1 und 2,8, und
• f) eine topologische polare Oberflächenfläche (TPSA, vom Englischen „Topological Polar Surface Area”) < 200 Ų, bevorzugter < 100 Ų, noch bevorzugter < 80 Ų.

In summary, substances used as probes preferably have 3 or more of the following properties a) -f):

• a) a greater than five-fold, preferably greater than ten-fold, increase in absorbance at a detection wavelength after binding to τ-PHF aggregates (or also to β-amyloid) compared to an unbound state,
• b) a Stokes shift of> 10 nm, preferably> 20 nm,
• c) an extinction coefficient E> 5000 L · mol^-1 · cm^-1 , preferably greater than 10000 L · mol^-1 · cm^-1
• d) EC50 <400 nM, preferably <200 nM in a displacement assay against fluorescent reference probe or in the auto-displacement assay against the radiolabeled compound
• e) a solubility / lipophilicity with log P <5, preferably between 1 and 2.8, and
• f) Topological Polar Surface Area Topographic Polar Surface Area (TPSA) <200 Ų , more preferably <100 Ų , even more preferably <80 Ų .

Die oben erwähnte Extinktionszunahme bei Bindung beispielsweise an τ-PHF kennzeichnet insbesondere eine Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses und kann experimentell beispielsweise durch Änderung, beispielsweise Verringerung, eines Hintergrundrauschens bestimmt werden. Die Bestimmung des Extinktionskoeffizienten E kann beispielsweise bei 25°C, einem pH-Wert von 7, bei einem jeweiligen Absorptionsmaximum des jeweiligen Stoffes mit DMSO (Dimethylsulfoxid) als Lösungsmittel gemessen werden.The abovementioned increase in absorbance when binding to, for example, τ-PHF In particular, an improvement of the signal-to-noise ratio and can be determined experimentally, for example by changing, for example reducing, a background noise. The determination of the extinction coefficient E can be measured for example at 25 ° C, a pH of 7, at a respective absorption maximum of the respective substance with DMSO (dimethyl sulfoxide) as a solvent.

Die Stokes-Shift bezeichnet einen Unterschied zwischen Anregungs-(Exzitations-)Maximum und Emissionsmaximum. Eine größere Stokes-Shift erleichtert eine Trennung von Anregungslicht und Fluoreszenz, beispielsweise durch die oben erwähnten dichroitischen Strahlteiler oder Farbfilter.The Stokes shift denotes a difference between excitation (excitation) maximum and emission maximum. A larger Stokes shift facilitates separation of excitation light and fluorescence, for example, by the dichroic beam splitters or color filters mentioned above.

Der oben erwähnte EC50-Wert kennzeichnet die Affinität der jeweiligen Sonde zu dem nachzuweisenden Stoff, beispielsweise τ-PHF, und kann beispielsweise durch die Verdrängung von fluoreszenten oder radioaktiven Referenzliganden indirekt bestimmt werden, beispielsweise eine Verdrängung von Thioflaviri S, Thioflavin T oder 11C-FIB. Ein geeignetes Messverfahren ist beispielsweise inLockhart, et al., The Journal of Biological Chemistry, 280, 7677–7684 vom 4. März 2005 unter Material und Methoden beschrieben.The above-mentioned EC50 value characterizes the affinity of the respective probe for the substance to be detected, for example τ-PHF, and can be indirectly determined, for example, by displacing fluorescent or radioactive reference ligands, for example displacement of thioflaviri S, thioflavin T or 11C-FIB , A suitable measuring method is, for example, in Lockhart, et al., The Journal of Biological Chemistry, 280, 7677-7684, March 4, 2005, under Materials and Methods described.

Bei Ausführungsbeispielen weisen Sonden, beispielsweise die oben erwähnten Arylaminotyazole, 4,6-Divinylpyrimidine, 3,6-Divinylpyridazine, 2,5-Divinylpyrazine, [4-(1,3-Benzothiazol-2-yl)phenyl]hydrazone und/oder Diarylharnstoffe 2, bevorzugt mindestens 3 aromatische Ringe auf, welche direkt, über eine Vinylbrücke oder eine Harnstoffbrücke miteinander verbunden sind. Insbesondere können verwendete Stoffe 3 aromatische Ringe aufweisen, welche über Vinylbrücken miteinander verbunden sind, was zu ausgedehnten p-Elektronensystemen führt.In embodiments, probes, for example the above-mentioned arylaminotyazoles, include 4,6-divinylpyrimidines, 3,6-divinylpyridazines, 2,5-divinylpyrazines, [4- (1,3-benzothiazol-2-yl) phenyl] hydrazones and / or diaryl ureas 2, preferably at least 3 aromatic rings which are bonded together directly via a vinyl bridge or a urea bridge. In particular, materials used may have 3 aromatic rings which are linked together via vinyl bridges, resulting in extended p-electron systems.

Bei Ausführungsbeispielen werden insbesondere Verbindungen der vorgenannten Klassen mit delokalisierten Elektronen, beispielsweise p-Elektronensystemen, über mindestens 15 beteiligte Atome, beispielsweise mindestens 20 Atome, insbesondere 22 oder mehr Atome, verwendet.In embodiments, compounds of the abovementioned classes with delocalized electrons, for example p-electron systems, are used in particular via at least 15 atoms involved, for example at least 20 atoms, in particular 22 or more atoms.

Bevorzugt sind Sonden deren Konformation im angeregten Zustand durch Bindung an das Zielprotein stabilisiert werden. Diese Stabilisierung kann durch Wasserstoffbrückenbindung oder van der Waals-Interaktionen der Aryleinheiten mit dem Zielprotein erfolgen. Dies führt bei bevorzugten Sonden zu einer Stabilisierung des nicht-planaren, angeregten Zustandes. Derartige Verdrillung kann durch 1,3-Allylspannung oder durch 1,4-Butadienspannung alkylierter Vinylaromaten induziert werden.Preferably, probes whose conformation in the excited state are stabilized by binding to the target protein. This stabilization may be by hydrogen bonding or van der Waals interactions of the aryl moieties with the target protein. This leads to stabilization of the non-planar, excited state in preferred probes. Such twisting can be induced by 1,3-allyl stress or by 1,4-butadiene voltage alkylated vinyl aromatic compounds.

Besonders bevorzugt sind weiterhin Verbindungen, die eine Halbwertszeit in vivo von > 60 min besitzen. Hierzu werden in bestimmten Ausführungsformen Verweildauer und Ausscheidungsrate entsprechend markierter Sonden (z. B. 3H, 11C, 18F) bestimmt.Particular preference is furthermore given to compounds which have a half-life in vivo of> 60 min. For this purpose, in certain embodiments, residence time and excretion rate of correspondingly labeled probes (eg 3H, 11C, 18F) are determined.

Bevorzugt sind Verbindungen, die eine erhöhte potentielle Hirngängigkeit bei reduzierter Bindung an weiße Hirnmasse aufweisen sowie eine reduzierte Plasmaprotein-Bindung besitzen. Das Diffusionsvermögen einer Verbindung durch die Endothelien der Blut-Hirn-Schranke wird maßgeblich durch seine Fettlöslichkeit (Lipophilie) und Größe bestimmt. In einer bevorzugten Ausführungsform haben die erfindungsgemäßen Verbindungen eine Molmasse < 500 g/mol.Preference is given to compounds which have an increased potential brain activity with reduced binding to white brain mass and have reduced plasma protein binding. The diffusivity of a compound through the endothelium of the blood-brain barrier is largely determined by its lipid solubility (lipophilicity) and size. In a preferred embodiment, the compounds of the invention have a molecular weight <500 g / mol.

Der log P-Wert und der log D-Wert sind Modellmaße für das Verhältnis zwischen Lipophilie (Fettlöslichkeit) und Hydrophilie (Wasserlöslichkeit) einer Substanz. Die Erwartung ist, mit Hilfe des Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten die Verteilungskoeffizienten dieses Stoffes in anderen Systemen mit einer wässrigen und einer lipophilen Phase abschätzen zu können. Der log P-Wert ist größer als eins, wenn eine Substanz besser in fettähnlichen Lösungsmitteln wie n-Oktanol löslich ist, kleiner als eins wenn sie besser in Wasser löslich ist. Entsprechend ist log P-Wert positiv für lipophile und negativ für hydrophile Substanzen. Bevorzugt sind Verbindungen, die einen log P-Wert von 1 bis 2,8 haben. In weiteren Ausführungsformen sind Verbindungen mit einem log D-Wert < 5 bevorzugt. Die Messung des log P-Werts oder des log D-Werts erfolgt über ein Oktanol/Wasser-Zwei-Phasensystem und UV/VIS-Spektroskopie bei 25°C und pH 7. Da nicht für alle Chemikalien der log P-Wert und/oder der log D-Wert gemessen werden kann, gibt es auch andere Modelle für die Vorhersage, z. B. durch Quantitative Struktur-Aktivitats-Beziehungen (QSAR) oder durch Linear Free Energy Relationships (LFER).The log P value and the log D value are model measures of the relationship between lipophilicity (fat solubility) and hydrophilicity (water solubility) of a substance. The expectation is to be able to estimate the distribution coefficients of this substance in other systems with an aqueous and a lipophilic phase with the help of the octanol-water partition coefficient. The log P value is greater than one if a substance is more soluble in fat-like solvents such as n-octanol, less than one if it is better soluble in water. Accordingly, log P value is positive for lipophilic and negative for hydrophilic substances. Preference is given to compounds which have a log P value of from 1 to 2.8. In further embodiments, compounds with a log D <5 are preferred. The measurement of the log P value or of the log D value takes place via an octanol / water two-phase system and UV / VIS spectroscopy at 25 ° C. andpH 7. Since not all chemicals have the log P value and / or the log D value can be measured, there are other models for the prediction, eg. By Quantitative Structure Activity Relationships (QSAR) or by Linear Free Energy Relationships (LFER).

Die potentielle Hirngängigkeit der Verbindungen kann auch über die topological polar surface area (TPSA) definiert werden. Diese ist definiert als die Summe der Oberflächenbeiträge der polaren Atoms (in der Regel Sauerstoffatome, Stickstoffe und/oder Wasserstoffatome) in einem Molekül. Die Berechnung wurde unter anderem vonErtl, P. et al., Fast calculation of molecular polar surface area as a sum of fragment based contributions and its application to the prediction of drug transport properties, J. Med. Chem., 2000, 43, 3714–3717 beschrieben.The potential brain penetration of the compounds can also be defined via the topological polar surface area (TPSA). This is defined as the sum of the surface contributions of the polar atoms (usually oxygen atoms, nitrogens and / or hydrogen atoms) in a molecule. The calculation was among others by Ertl, P. et al., Molecular Chemistry, 2000, 43, 3714-3717 described.

Ladungsfreiheit bzw. eine schwache Basizität der Verbindungen fördern die gute Penetration durch die Blut-Hirnschranke. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind weiterhin durch eine gute Photostabilität (geringe Photobleichung) und durch eine kurzlebige Singulettanregung gegenüber einer langlebigen Triplettanregung charakterisiert.Freedom of charge or a weak basicity of the compounds promote good penetration through the blood-brain barrier. The compounds of the invention are further characterized by good photostability (low photobleaching) and by a short-lived singlet excitation is characterized by a long-lived triplet stimulus.

In4 ist ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt. Das Verfahren der4 kann insbesondere unter Verwendung der Vorrichtungen der1 oder2 durchgeführt werden, kann jedoch auch unabhängig davon implementiert werden.In 4 a flow chart illustrating an embodiment of a method according to the invention is shown. The procedure of 4 in particular using the devices of the 1 or 2 but can be implemented independently.

Zur Vorbereitung des eigentlichen Verfahrens werden in einem Schritt140 beispielsweise einem menschlichen Patienten oder einem zu untersuchenden Tier τ-PHF sensitive Sonden zugeführt, beispielsweise eine der unter Bezugnahme auf3 erläuterten Sonden. Diese Sonden lagern sich nach einer gewissen Zeit an τ-PHF im Auge an.To prepare the actual procedure will be in onestep 140 For example, to a human patient or an animal to be examined τ-PHF sensitive probes fed, for example one of with reference to 3 explained probes. These probes attach themselves after a certain time to τ-PHF in the eye.

In Schritt141 wird dann ein Übersichtsbild eines Augenhintergrundes mit einer entsprechenden Kameraeinrichtung wie den unter Bezugnahme auf1 und2 erläuterten Kameraeinrichtungen erstellt. Hierbei kann wie unter Bezugnahme auf2 bereits erläutert eine Wellenlänge einer Beleuchtung und eine Detektion mittels einer Kamera beispielsweise mittels Farbfilter wie der Farbfilter31 und32 der2 spektral an die Anregungswellenlänge bzw. Emissionswellenlänge der entsprechenden Sonde angepasst werden.Instep 141 is then an overview image of an eye fundus with a corresponding camera device as with reference to 1 and 2 explained explained camera devices. Here, as with reference to 2 already explained a wavelength of illumination and detection by means of a camera, for example by means of color filters such as thecolor filter 31 and 32 of the 2 be spectrally adjusted to the excitation wavelength or emission wavelength of the corresponding probe.

Beim Erstellen des Übersichtsbildes wird dabei allgemein der Augenhintergrund großflächig zur Fluoreszenz angeregt. Zur Vermeidung des Einflusses von Streulicht oder anderem Fremdlicht, beispielsweise Streulicht an einer dem Augenhintergrund vorgelagerten Schicht, beispielsweise der Augenlinse, können verschiedene Maßnahmen ergriffen werden. Beispielsweise kann der Augenhintergrund strukturiert beleuchtet werden, so dass sich hellere und dunklere Bereiche auf dem Augenhintergrund ergeben. Aus Intensitätsmessungen in den dunkleren Bereichen kann über die Kamera ein ortsaufgelöstes Untergrundsignal als Falschlichtverteilung ermittelt werden, das von einem das Falschlicht enthaltenden später aufgenommenen und gleichmäßig ausgeleuchteten Bild des Augenhintergrundes subtrahiert wird. So kann eine von Falschlicht im Wesentlichen freie Abbildung des Augenhintergrundes erzeugt werden. Die Ortsauflösung entspricht dabei der Auflösung der verwendeten Kamera wie der Kamera27 der2 und hängt unter anderem von der Anzahl von Bildpunkten der Kamera ab.When creating the overview image, the fundus of the eye is generally excited to fluorescence over a large area. In order to avoid the influence of scattered light or other extraneous light, for example scattered light on a layer located in front of the fundus, for example the eye lens, various measures can be taken. For example, the fundus may be illuminated in a structured manner, resulting in lighter and darker areas on the ocular fundus. From intensity measurements in the darker areas, a spatially resolved background signal can be determined as a false light distribution via the camera, which is subtracted from a picture of the fundus taken later and evenly illuminated. Thus, a picture of the fundus essentially free of false light can be generated. The spatial resolution corresponds to the resolution of the camera used as thecamera 27 of the 2 and depends among other things on the number of pixels of the camera.

Bevorzugt werden dabei vor der eigentlichen Aufnahme zwei verschiedene Lichtmuster so erzeugt, dass die hellen Bereiche der beiden Lichtmuster sich zu einem vollständigen lückenlosen Bild (Hellbild) ergänzen und die dunkleren Bereiche der beiden Lichtmuster sich ebenso lückenlos zu einem Bild (Dunkelbild) ergänzen. So können bei der Streulichtverteilung Streuzentren in einem gesamten Querschnitt des Strahlengangs der Kameraeinrichtung berücksichtigt werden. Zudem kann so eine Streulichtverteilung mit hoher Genauigkeit ermittelt werden. Details zu entsprechenden Verfahren der Streulichtbestimmung finden sich beispielsweise in derDE 103 30 716, derDE 103 47 389, derDE 10 2004 053 730 und derDE 10 2006 031 177.In this case, two different light patterns are preferably generated in such a way that the bright areas of the two light patterns complement each other to form a complete gapless image (light image) and the darker areas of the two light patterns also complement each other without gaps to form an image (dark image). Thus scattering centers in an entire cross section of the beam path of the camera device can be taken into account in the scattered light distribution. In addition, such a scattered light distribution can be determined with high accuracy. Details on corresponding methods of scattered light determination can be found, for example, inUS Pat DE 103 30 716 , of theDE 103 47 389 , of theDE 10 2004 053 730 and theDE 10 2006 031 177 ,

In einem Schritt142 werden dann interessierende Bereich definiert, insbesondere Bereiche, in welchen auf dem Übersichtsbild Fluoreszenz erkennbar ist. Dies kann vollautomatisch durch Bildanalyse oder halbautomatisch unter Einbeziehung von Benutzereingaben geschehen.In onestep 142 are then defined area of interest, in particular areas in which fluorescence is visible on the overview image. This can be done fully automatically by image analysis or semi-automatically involving user input.

Bei manchen Ausführungsbeispielen wird bei der Erstellung des Übersichtsbildes und der Definition der interessierenden Bereiche nicht zwischen Fluoreszenz von an τ-PHF gebundenen Sonden und ungebundenen Sonden unterschieden. Bei anderen Ausführungsbeispielen werden bereits bei der Erstellung des Übersichtsbildes eine Fluoreszenzlebensdauer und/oder eine spektrale Fluoreszenzverteilung, beispielsweise durch Verwendung einer Farbkamera, bestimmt, um gebundene von ungebundenen Sonden unterscheiden zu können, da eine Bindung der Sonden an τ-PHF insbesondere eine langsame Komponente eines exponentiellen Abfalls eines Fluoreszenzabklingverhaltens der Fluoreszenz beeinflusst. Eine derartige Lebensdauermessung kann insbesondere dadurch bewerkstelligt werden, dass die Beleuchtung bei mindestens zwei Frequenzen bevorzugt im Megahertzbereich kombiniert wird und als Kamera eine Laufzeitkamera verwendet wird. Durch die Verwendung einer Spektralanalyse, auch als „Spectral Unmixing” bezeichnet, kann zudem Fluoreszenz von den interessierenden Sonden anderen Fluoreszenzquellen, beispielsweise Autofluoreszenz des Augenhintergrundes, unterschieden werden.In some embodiments, when generating the overview image and defining the regions of interest, no distinction is made between fluorescence of probes bound to τ-PHF and unbound probes. In other embodiments, a fluorescence lifetime and / or a spectral fluorescence distribution, for example by using a color camera, determined in order to distinguish bound from unbound probes already in the preparation of the overview image, since a binding of the probes to τ-PHF in particular a slow component of a exponential decay of fluorescence decay behavior of fluorescence. Such a lifetime measurement can be accomplished, in particular, by combining the illumination at at least two frequencies, preferably in the megahertz range, and using a runtime camera as the camera. By using spectral analysis, also referred to as "spectral unmixing", fluorescence from the probes of interest can also be distinguished from other sources of fluorescence, such as autofluorescence of the ocular fundus.

Bei Verwendung derartiger Verfahren können dann die interessierenden Bereiche in Schritt142 nur auf Basis der an τ-PHF gebundenen Fluoreszenz erstellt werden.Using such methods, the regions of interest can then be used instep 142 only based on the fluorescence bound to τ-PHF.

In Schritt143 werden dann die in Schritt142 definierten interessierenden Bereiche mit einem Laser abgerastert und Fluoreszenz detektiert. Hierzu kann insbesondere ein konfokales Laser Scanning Ophthalmoskop wie auch in2 dargestellt verwendet werden. Bei dieser Bildaufnahme kann insbesondere eine pixelweise spektrale Detektion auf mindestens zwei Kanälen erfolgen. Im Darauffolgenden können dann Strukturen segmentiert werden, d. h. identifiziert werden, welche Merkmale aufweisen, welche Merkmalen gepaarter helikaler τ-Filamente ähneln oder entsprechen. Zudem kann eine Lebensdauermessung durchgeführt werden, wobei hierzu eine Anzahl von Datenpunkten bei manchen Ausführungsbeispielen auf eine oder wenige Datenpunkte in den interessierenden Bereichen und angrenzenden Gebieten oder in den oben erwähnten Strukturen mit den den τ-PHF ähnlichen Merkmalen und benachbarten Gebieten beschränkt werden. Anstelle der Lebensdauermessung kann analog durch eine mikrospektroskopische Untersuchung, z. B. Ramanspektroskopie, molekülspezifisch die Anwesenheit und Bindung der Sonde an helikale τ-Filamente nachgewiesen werden. Derartige Messungen von Streulicht einer inelastischen Streuung, z. B. Ramangestreutem Licht, kann bei manchen Ausführungsbeispielen alternativ oder zusätzlich zu Fluoreszenzmessungen zum Nachweis der Sonden verwendet werden.Instep 143 then the ones instep 142 scanned areas of interest with a laser and fluorescence detected. For this purpose, in particular a confocal laser scanning ophthalmoscope as well as in 2 shown used. In particular, pixel-by-pixel spectral detection can take place on at least two channels during this image recording. In the following, structures can then be segmented, ie identified, which have features which resemble or correspond to features of paired helical τ-filaments. In addition, one can For this purpose, a number of data points in some embodiments are limited to one or a few data points in the regions of interest and adjacent regions or in the structures mentioned above with the τ-PHF-like features and adjacent regions. Instead of the lifetime measurement can be analogous by a microspectroscopic examination, z. As Raman spectroscopy, molecule-specific, the presence and binding of the probe to helical τ-filaments are detected. Such measurements of scattered light inelastic scattering, z. B. Ramangestreutem light, can be used in some embodiments, alternatively or in addition to fluorescence measurements to detect the probes.

Zusätzlich oder alternativ zu einer derartigen Lebensdauermessung kann bei manchen Ausführungsbeispielen eine optische Kohärenztomographieaufnahme mit einer entsprechenden Laserscannereinrichtung erfolgen. Durch die Definition von interessierenden Bereichen, welche relativ klein sein können, und durch Beschränkung der Lebensdauer- bzw. spektroskopischen Messungen auf nur wenige Datenpunkte kann dabei insbesondere eine relativ kurze Untersuchungszeit erreicht werden, was für einen Patienten angenehmer ist und bei gleicher Zeit eine genauere Untersuchung der eigentlich interessierenden Bereiche ermöglicht.In addition or as an alternative to such a lifetime measurement, in some embodiments an optical coherence tomography image can be taken with a corresponding laser scanner device. By defining areas of interest, which may be relatively small, and by restricting the lifetime or spectroscopic measurements to only a few data points, a relatively short examination time can be achieved, which is more comfortable for a patient and more accurate at the same time the areas of interest.

Verschiedene Möglichkeiten und Varianten der Implementierung des Schrittes143, insbesondere der oben erwähnten Maßnahmen, werden nun noch etwas genauer erläutert.Different possibilities and variants of the implementation of thestep 143 , in particular the measures mentioned above, will now be explained in more detail.

Generell erfolgt mit Laserscanneranordnungen eine serielle punktförmige Anregung der fluoreszierenden Objekte, wobei das punktförmig angeregte Feld konfokal in eine Feldblende abgebildet wird, welche bevorzugt von vor einem Detektor, bevorzugt einem Einzeldetektor, angeordnet ist. Aus nacheinander von jedem Punkt detektiertem Licht erfolgt nach Durchgang durch ein Sperrfilter ein Aufbau eines zweidimensionalen Bildes des fluoreszierenden Objekts. Durch die Konfokalität, welche bei dem Ausführungsbeispiel der2 beispielsweise durch die Größe des Pinholes12 beeinflusst werden kann, wird der Einfluss von Fluoreszenz- oder Streulicht aus Schichten, die sich nicht in der Fokalebene des Anregungs- oder Abbildungssystems befinden, stark reduziert.In general, with laser scanner arrangements, a serial point-like excitation of the fluorescent objects takes place, wherein the point-shaped excited field is confocally imaged in a field stop, which is preferably arranged in front of a detector, preferably a single detector. From successively detected light from each point, a structure of a two-dimensional image of the fluorescent object takes place after passing through a notch filter. Due to the confocality, which in the embodiment of the 2 for example, by the size of thepinhole 12 can be influenced, the influence of fluorescence or scattered light from layers that are not in the focal plane of the excitation or imaging system, greatly reduced.

Die Laserwellenlänge wird dabei insbesondere passend zu der verwendeten Sonde ausgewählt, d. h. es wird eine Laserwellenlänge ausgewählt, bei welcher die Sonde eine erhöhte Absorption und/oder Streuung und/oder Anregung zur Fluoreszenz bzw. Biolumineszenz aufweist. Die Laserwellenlänge kann dabei im sichtbaren oder infraroten Spektralbereich liegen.The laser wavelength is selected in particular matching the probe used, d. H. a laser wavelength is selected in which the probe has an increased absorption and / or scattering and / or excitation for fluorescence or bioluminescence. The laser wavelength can be in the visible or infrared spectral range.

Eine spektral aufgelöste Detektion, beispielsweise für das oben erwähnte „Spectral Unmixing” zur Unterscheidung gebundener Sonden von ungebundenen Sonden bzw. anderen Fluoreszenzquellen kann beispielsweise eine spektrale Aufspaltung des Lichtes und simultane Detektion in mehreren Kanälen erfolgen, beispielsweise in der Detektionseinrichtung15 der2. Zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer (Fluorescence Lifetime Imaging) kann beispielsweise eine zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung wie beispielsweise in derDE 199 20 158 oder derDE 101 45 823 beschrieben eingesetzt werden.A spectrally resolved detection, for example for the aforementioned "Spectral Unmixing" to distinguish bound probes from unbound probes or other fluorescence sources, for example, a spectral splitting of the light and simultaneous detection in multiple channels, for example in thedetection device 15 of the 2 , To determine the fluorescence lifetime imaging (Fluorescence Lifetime Imaging), for example, a time-correlated single photon counting as in the DE 199 20 158 or theDE 101 45 823 be used described.

In einer verwendeten Detektionseinrichtung wie der Detektionseinrichtung15 kann zu dem Reflexionslicht, d. h. Licht mit der Anregungswellenlänge, von Fluoreszenzlicht getrennt werden, beispielsweise durch entsprechende Farbfilter. So kann gleichzeitig mit Fluoreszenzmessungen ein Reflexionsbild aufgenommen werden, auf dessen Grundlage beispielsweise ein Ausgleich von Augenbewegungen zwischen den Einzelmessungen, beispielsweise Messungen an verschiedenen Punkten oder zwischen spektral aufgelöster Messung und Lebensdauermessung, erfolgen kann.In a used detection device such as thedetection device 15 can be separated from fluorescent light to the reflection light, ie light with the excitation wavelength, for example by appropriate color filter. Thus, a reflection image can be recorded simultaneously with fluorescence measurements, on the basis of which, for example, a compensation of eye movements between the individual measurements, for example measurements at different points or between spectrally resolved measurement and lifetime measurement, can take place.

Optional kann in Schritt144 noch eine ergänzende Diagnostik erfolgen, wobei diese auch parallel zu den vorhergehenden Schritten vorgenommen werden kann. Beispielsweise kann eine Autofluoreszenzdetektion erfolgen, oder es können andere Arten von Messungen wie optische Kohärenztomographiemessungen durchgeführt werden, beispielsweise um zusätzlich Augenerkrankungen, insbesondere mit neurodegenerativen Erkrankungen assoziierte Augenerkrankungen, feststellen zu können.Optionally, instep 144 still a complementary diagnostic done, and this can also be done in parallel to the previous steps. For example, an autofluorescence detection can take place, or other types of measurements can be carried out, such as optical coherence tomography measurements, for example in order to additionally detect eye diseases, especially eye diseases associated with neurodegenerative diseases.

Die durch das erfindungsgemäße Verfahren der4 gewonnenen Informationen können dann zur Diagnose benutzt werden. Hierzu können die Daten beispielsweise mit Daten vorhergehender Untersuchungen am selben Patienten oder Daten einer Datenbank verglichen werden. Dabei können beispielsweise Größe und Struktur von fluoreszierenden Gebieten, spektrale Signaturen und Fluoreszenzlebensdauer in den fluoreszierenden Gebieten im Vergleich zur Umgebung, die Zuordnung von fluoreszierenden Gebieten zu Schichten der Retina, beispielsweise auf Basis von Lebensdauerdaten und/oder im Vergleich zu einer Morphologie der Retina, welche beispielsweise mit optischer Kohärenztomographie aufgenommen wurden, erfolgen, und eine Gesamtverteilung der Gebiete in der Retina berücksichtigt werden.The by the inventive method of 4 The information obtained can then be used for diagnosis. For this purpose, the data can be compared, for example, with data from previous examinations on the same patient or data from a database. For example, the size and structure of fluorescent regions, spectral signatures and fluorescence lifetime in the fluorescent regions compared to the environment, the assignment of fluorescent areas to layers of the retina, for example on the basis of lifetime data and / or compared to a morphology of the retina taken for example with optical coherence tomography, and take into account an overall distribution of the areas in the retina.

Während der Bildgebung, d. h. der Schritte141 und143 der4, kann dabei eine Bewegung des Patienten und somit des zu untersuchenden Auges erfasst werden und berücksichtigt werden, wobei eine derartige Bewegung beispielsweise durch die Infrarotkamera26 der2 erfasst werden kann.During the imaging, ie thesteps 141 and 143 of the 4 , doing a move the patient and thus the eye to be examined are detected and taken into account, wherein such a movement, for example by theinfrared camera 26 of the 2 can be detected.

Durch die dargestellten erfindungsgemäßen Verfahren und Vorrichtungen kann insbesondere eine ante-mortem-Diagnose von Tauopathien erfolgen, ein Krankheitsverlauf überwacht werden und/oder eine entsprechende Therapie kontrolliert werden.In particular, an ante-mortem diagnosis of tauopathies can be carried out by the presented methods and devices according to the invention, a course of the disease can be monitored and / or a corresponding therapy can be controlled.

Zur weiteren Veranschaulichung der Erfindung sind in5 histologische Schnitte der Retina von Patienten gezeigt, die an zwei verschiedenen Tauopathien litten. Links ist eine Retina eines an Morbus Alzheimer (AD) erkrankten Patienten gezeigt, und rechts ist die Retina eines an progressiver Supranukleärer Blickparese (PSP) leidenden Patienten gezeigt. Mit Pfeilen sind τ-PHF-Ablagerungen in der inneren Körnerschicht (INL) gezeigt, welche in diesem Fall durch Färbung mit einem spezifischen Antikörper AT8 sichtbar gemacht wurden.To further illustrate the invention are in 5 histological sections of the retina of patients who suffered from two different tauopathies. On the left is a retina of a patient with Alzheimer's disease (AD), and on the right is the retina of a patient suffering from progressive supranuclear palsy (PSP). Arrows indicate τ-PHF deposits in the inner granule layer (INL), which in this case were visualized by staining with a specific AT8 antibody.

Die6 zeigt in vivo Aufnahmen von τ-PHF in retinalen Ganglienzellen eines Mausmodells der alzheimerschen Erkrankung. Links ist eine Aufnahme bei einer Voruntersuchung dargestellt, rechts ist eine Aufnahme48 Stunden nach Gabe einer spezifischen Sonde (FSB) dargestellt, die dargestellte Laser Scanning Ophthalmoskopaufnahme zeigt hell so markierte τ-PHF-Ablagerungen. Hieraus ist ersichtlich, dass die beschriebenen Vorrichtungen und Verfahren zum Nachweis von τ-PHF in einer Retina geeignet sind.The 6 shows in vivo recordings of τ-PHF in retinal ganglion cells of a mouse model of Alzheimer's disease. On the left is a picture taken during a preliminary examination, on the right is apicture 48 Hours after administration of a specific probe (FSB), the illustrated laser scanning ophthalmoscope image shows lightly marked τ-PHF deposits. From this it can be seen that the described devices and methods are suitable for the detection of τ-PHF in a retina.

Es ist zu bemerken, dass bei anderen Ausführungsbeispielen auch nur eine Kameraeinrichtung oder nur eine Laserscannereinrichtung zum Einsatz kommen kann.It should be noted that in other embodiments, only one camera device or only one laser scanner device can be used.

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

• WO 2011/038892 A1[0009]WO 2011/038892 A1[0009]
• DE 10330716[0068]DE 10330716[0068]
• DE 10347389[0068]DE 10347389[0068]
• DE 102004053730[0068]DE 102004053730[0068]
• DE 102006031177[0068]DE 102006031177[0068]
• DE 19920158[0077]DE 19920158[0077]
• DE 10145823[0077]DE 10145823[0077]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

• Lockhart, et al., The Journal of Biological Chemistry, 280, 7677–7684 vom 4. März 2005 unter Material und Methoden[0055]Lockhart, et al., The Journal of Biological Chemistry, 280, 7677-7684, March 4, 2005, for Material and Methods[0055]
• Ertl, P. et al., Fast calculation of molecular polar surface area as a sum of fragment based contributions and its application to the prediction of drug transport properties, J. Med. Chem., 2000, 43, 3714–3717[0062]Ertl, P. et al., Fasting Molecular Polar Surface Area as a Summary of its Contribution to and Applications to the Prediction of Drug Transport Properties, J. Med. Chem., 2000, 43, 3714-3717[0062]

Claims (17)

Translated fromGerman

Verfahren zum Detektieren von gepaarten helikalen τ-Filamenten (107) im Auge (10;100), umfassend: Aufnehmen eines Übersichtsbildes einer Retina des Auges (10;100), Identifizieren mindestens eines interessierenden Gebietes der Retina auf Basis des Übersichtsbildes, Abtasten des mindestens einen interessierenden Gebietes mit einem Laserstrahl, und Detektieren von Lichtemission von für gepaarte helikale τ-Filamente (107) sensitive Sonden in Antwort auf das Abtasten mit dem Laserstrahl.Method for detecting paired helical τ filaments ( 107 ) in the eye ( 10 ; 100 ), comprising: taking an overview image of a retina of the eye ( 10 ; 100 ), Identifying at least one region of interest of the retina on the basis of the overview image, scanning the at least one region of interest with a laser beam, and detecting light emission from for paired helical τ-filaments ( 107 ) sensitive probes in response to scanning with the laser beam.Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Bestimmen mindestens eines interessierenden Gebietes ein Identifizieren von Lichtemission von den Sonden (108,109) in dem Übersichtsbild und ein Bestimmen des mindestens einen interessierenden Gebietes auf Basis der identifizierten Fluoreszenz umfasst.The method of claim 1, wherein determining at least one region of interest comprises identifying light emission from the probes. 108 . 109 ) in the overview image and determining the at least one region of interest based on the identified fluorescence.Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Identifizieren der Lichtemission ein Unterscheiden von von an gepaarten helikalen τ-Filamenten (107) gebundenen Sonden (108) stammender Lichtemission von von ungebundenen Sonden (109) stammender Lichtemission umfasst.The method of claim 2, wherein identifying the light emission distinguishes from paired helical τ filaments ( 107 ) bound probes ( 108 ) light emission from unbound probes ( 109 ) comprises light emission.Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, wobei das Detektieren von Lichtemission in Antwort auf den Laserstrahl ein Unterscheiden von von an gepaarten helikalen τ-Filamenten (107) gebundenen Sonden (108) stammender Lichtemission von von ungebundenen Sonden (109) stammender Lichtemission umfasst.The method of any one of claims 1-3, wherein detecting light emission in response to the laser beam distinguishing paired helical τ filaments ( 107 ) bound probes ( 108 ) light emission from unbound probes ( 109 ) comprises light emission.Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Unterscheiden auf Basis eines Spektrums der Lichtemission und/oder auf Basis einer Dauer der Lichtemission erfolgt.A method according to claim 3 or 4, wherein the discriminating is based on a spectrum of the light emission and / or on the basis of a duration of the light emission.Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Detektieren von Lichtemission in Antwort auf das Abtasten eine zeitaufgelöste Messung der Lichtemission umfasst, wobei die zeitaufgelöste Messung nur in einem Teil der interessierenden Gebiete durchgeführt wird.The method of claim 5, wherein detecting light emission in response to the scanning comprises a time-resolved measurement of the light emission, wherein the time-resolved measurement is performed only in a part of the regions of interest.Verfahren nach einem der Ansprüche 1–6, wobei das Aufnehmen eines Übersichtsbildes ein Beleuchten der Retina des Auges in einem ersten Wellenbereich, in welchem eine Anregungswellenlänge der Sonden (108,109) liegt, und ein Filtern von der Retina in Antwort auf das Beleuchten ausgehenden Lichtes derart, dass das Übersichtsbild auf Basis von Licht in einem zweiten Wellenlängenbereich, welche eine Lichtemissionswellenlänge der Sonden (108,109) enthält, umfasst, wobei sich der erste Wellenlängenbereich von dem zweiten Wellenlängenbereich unterscheidet.The method of any of claims 1-6, wherein taking an overview image comprises illuminating the retina of the eye in a first waveband in which an excitation wavelength of the probes ( 108 . 109 ), and filtering from the retina in response to illuminating outgoing light such that the overview image is based on light in a second wavelength range which is a light emission wavelength of the probes ( 108 . 109 ), wherein the first wavelength range is different from the second wavelength range.Verfahren nach einem der Ansprüche 1–7, wobei das Abtasten und das Detektieren mit einem Laser Scanning Ophthalmoskop erfolgen.The method of any one of claims 1-7, wherein the scanning and the detecting are done with a laser scanning ophthalmoscope.Verfahren nach einem der Ansprüche 1–8, weiter umfassend Aufnahme einer Morphologie der Retina des Auges, und Korrelieren der detektierten Lichtemission mit der Morphologie des Auges.The method of any of claims 1-8, further comprising taking a morphology of the retina of the eye, and correlating the detected light emission with the morphology of the eye.Verfahren nach einem der Ansprüche 1–9, weiter umfassend Durchführen einer zusätzlichen optischen Messung zur Detektion vor für Augenkrankheiten typischen Merkmalen.The method of any one of claims 1-9, further comprising performing an additional optical measurement for detection of features typical of eye diseases.Verfahren nach einem der Ansprüche 1–10, wobei das Abtasten mit einer Ortsauflösung < 20 μm erfolgt.Method according to one of claims 1-10, wherein the scanning is carried out with a spatial resolution <20 microns.Verfahren nach einem der Ansprüche 1–11, wobei die Sonde ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Arylaminothiazole, 4,6-Divinylpyrimidine, 2,5- und 3,6-Divinylpyrazine, [4-(1,3-Benzothiazol-2-yl)phenyl]hydrazone, Diarylharnstoffe, Tetracyclin, 4,4'-(1E,1'E)-2,2'-(1-aryl-1H-pyrazole-3,5-diyl)bis(ethene-2,1-diyl)bis-2-methoxyphenole, 2,5-Bis(4-hydroxystyryl)benzonitril, 2,5-Bis(4-hydroxystyryl)-N-benzamide.The method of any one of claims 1-11, wherein the probe is selected from the group consisting of arylaminothiazoles, 4,6-divinylpyrimidines, 2,5- and 3,6-divinylpyrazines, [4- (1,3-benzothiazol-2-yl ) phenyl] hydrazones, diaryl ureas, tetracycline, 4,4 '- (1E, 1'E) -2,2' - (1-aryl-1H-pyrazole-3,5-diyl) bis (ethene-2,1- diyl) bis-2-methoxyphenols, 2,5-bis (4-hydroxystyryl) benzonitrile, 2,5-bis (4-hydroxystyryl) -N-benzamides.Verfahren nach einem der Ansprüche 1–12, wobei die Lichtemission eine Fluoreszenz umfasst.The method of any of claims 1-12, wherein the light emission comprises fluorescence.Verfahren nach einem der Ansprüche 1–13, wobei die Lichtemission inelastisch gestreutes Streulicht umfasst.The method of any of claims 1-13, wherein the light emission comprises inelastically scattered scattered light.Vorrichtung zur Detektion von gepaarten helikalen τ-Filamenten (107) in einer Retina eines Auges, umfassend: eine Kameraeinrichtung (103;40) zum Aufnehmen eines Übersichtsbildes einer Retina des Auges (10;100), eine Steuerung (104) zum Bestimmen mindestens eines interessierenden Gebietes des Auges auf Basis des Übersichtsbildes und zum Ansteuern einer Laserscannereinrichtung (102;41,1,2,14,15) derart, dass die Laserscannereinrichtung (102;41,1,2,14,15) das mindestens eine interessierende Gebiet mit einem Laserstrahl abtastet und Lichtemission von für gepaarte τ-Filamente sensitiven Sonden (108,109) in Antwort auf das Abtasten mit dem Laserstrahl detektiert.Device for detecting paired helical τ-filaments ( 107 ) in a retina of an eye, comprising: a camera device ( 103 ; 40 ) for taking an overview image of a retina of the eye ( 10 ; 100 ), a controller ( 104 ) for determining at least one region of interest of the eye on the basis of the overview image and for driving a laser scanner device ( 102 ; 41 . 1 . 2 . 14 . 15 ) such that the laser scanner device ( 102 ; 41 . 1 . 2 . 14 . 15 ) scans the at least one region of interest with a laser beam and light emission from probes sensitive to paired τ-filaments ( 108 . 109 ) is detected in response to the scanning with the laser beam.Vorrichtung nach Anspruch 15, wobei die Kameraeinrichtung (103;40) eine Beleuchtung (16), einen Farbfilter (31) zum Selektieren eines Wellenlängenbereichs umfassend eine Anregungswellenlänge der Sonde (50;108,109) zur Beleuchtung der Retina, eine Kamera (27) und einen zweiten Farbfilter (32) zum Selektieren der Lichtemission von den Sonden (108,109) umfasst.Apparatus according to claim 15, wherein the camera device ( 103 ; 40 ) a lighting ( 16 ), a color filter ( 31 ) for selecting a wavelength range comprising an excitation wavelength of the probe ( 50 ; 108 . 109 ) for illuminating the retina, a camera ( 27 ) and a second color filter ( 32 ) for selecting the light emission from the probes ( 108 . 109 ).Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, wobei die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1–14 ausgestaltet ist. Apparatus according to claim 15 or 16, wherein the apparatus is adapted to carry out the method according to any one of claims 1-14.

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