DieErfindung betrifft ein Verfahren zum automatischen Abtrennen undIsolieren von Gewebezellen einer Gewebeschicht aus einem mehrschichtigen biologischenGewebe des tierischen oder menschlichen Körpers, besonders Epithelzellenaus Hautbiopsaten sowie eine Vorrichtung zur automatischen Durchführung diesesVerfahrens.TheThe invention relates to a method for automatic separation andIsolating tissue cells of a tissue layer from a multilayer biologicalTissues of animal or human body, especially epithelial cellsfrom skin biopsies and a device for automatically performing thisProcess.
Technisches GebietTechnical area
DieErfindung betrifft das technische Gebiet des Tissue Engineering.Das Prinzip des Tissue Engineering besteht im Wesentlichen darin,aus biologischem Gewebe, das in einem separaten Verfahrensablaufaus dem menschlichen oder tierischen Körper in Form von Spendergewebeals sogenanntes Biopsat gewonnen werden kann, vitale Zellen oderZellverbändezu isolieren und daraus neue Gewebe zu konstituieren. Die isoliertenZellen werden vermehrt und im Anschluss zum Aufbau neu konstituierterdreidimensionaler Gewebestrukturen, beispielsweise neu konstituierterHautäquivalente,aufgebracht. Solche neu konstituierten Gewebe können dann als Testsysteme inder Forschung, insbesondere zur Wirkstofferforschung oder als Transplantatein der Medizin eingesetzt werden, um verlorene Organfunktionen zuersetzen. Beispielsweise werden zweischichtige Hautmodelle bevorzugtals Testsysteme fürWirkstoffe, Chemikalien und Kosmetika eingesetzt und stellen eineAlternative zum Tierversuch dar.TheThis invention relates to the technical field of tissue engineering.Essentially, the principle of tissue engineering isfrom biological tissue, in a separate procedurefrom the human or animal body in the form of donor tissuecan be obtained as a so-called biopsy, vital cells orcell aggregatesto isolate and from it to constitute new tissues. The isolated onesCells are multiplied and subsequently reconstituted to buildThree-dimensional tissue structures, such as newly constitutedSkin equivalents,applied. Such newly constituted tissues can then be used as test systems inresearch, in particular for research on active substances or as transplantsused in medicine to help lost organ functionsreplace. For example, bilayer skin models are preferredas test systems forActive ingredients, chemicals and cosmetics are used and provide oneAlternative to animal testing.
Eswird erwartet, dass der hohe Bedarf an Hauttestsystemen aus humanenprimärenZellen und die Anforderungen an deren Reproduzierbarkeit kann letztlichnur durch eine Automatisierung des Herstellungsprozesses gewährleistetwerden. Für denAufbau von Hauttestsystemen werden zwei unterschiedliche primäre Zelltypen,und zwar Fibroblasten und Keratinozyten, benötigt, die bekanntermaßen ausmehrschichtigem Hautgewebe (insbesondere Präputiumbiopsate) isoliert werden.ItThe high demand for skin test systems is expected to be humanprimaryCells and the requirements for their reproducibility can ultimatelyonly guaranteed by automation of the manufacturing processbecome. For theBuilding skin test systems become two distinct primary cell types,namely fibroblasts and keratinocytes, which are known to bemultilayer skin tissue (especially prepuce biopsies) are isolated.
Stand der TechnikState of the art
Besondersim Zusammenhang mit der regenerativen Medizin besteht der Bedarf,biologische Laborprozesse unter Reinraumbedingungen GMP-konformzu automatisieren. Dadurch soll eine höhere Ausbeute, eine höhere Prozesssicherheitsowie eine standardisierbare Prozessoptimierung und Prozesskontrolleerreicht werden.Especiallyin the context of regenerative medicine there is a needbiological laboratory processes under clean room conditions GMP compliantto automate. This should result in a higher yield, higher process reliabilityas well as a standardized process optimization and process controlbe achieved.
EineSchwierigkeit besteht vor allem darin, die Vielzahl an unterschiedlichenvorbekannten manuellen Schritten und Handlungsabläufen derGewebeaufbereitung und Zellisolation in zweckmäßig automatisierten Handhabungenumzusetzen. Eine besondere Herausforderung an die Automatisierung solcherAbläufestellt dabei die Trennung verschiedener Gewebeschichten aus mehrschichtigenGewebeverbändendar, insbesondere die Abtrennung von Epithelschichten von Gewebeverbänden wieHautbiopsaten.AAbove all, the difficulty lies in the variety of different onespreviously known manual steps and actions of theTissue preparation and cell isolation in appropriately automated handlingimplement. A special challenge to the automation of suchproceduresIn doing so, the separation of different tissue layers from multilayeredtissue structuresin particular the separation of epithelial layers of tissue composites such asHautbiopsaten.
ImZusammenhang mit der Isolation von Gewebeschichten verschiedenerZelltypen aus Spendergewebe, insbesondere Hautgewebe sind manuelleVerfahren bekannt, worin zur Trennung von Epidermis und Dermis einesHautbiopsats unmittelbar nach Abtrennung von gegebenenfalls anhaftendem Fettgewebemit einem Skalpell in circa 2 × 2mm2 kleine Stücke geschnitten und in eineEnzymlösung überführt wird.Diese soll die Verbindung zwischen Epidermis und Dermis, besondersdie dazwischen angeordnete Basalmembran auflösen. Das vollständige Zerschneidendes Biopsates ist erforderlich, um dem Enzym eine Angriffsfläche zurBasalmembran zu bieten. Dieses manuelle Verfahren lässt sichnicht automatisieren. In bekannten Verfahren wird davon ausgegangen,dass sich das Biopsat nur durch einen ziehenden Schnitt auf derEpidermisseite zerschneiden lässt.Weiter ist eine füreinen definierten Schnitt erforderliche Ausrichtung des Biopsatsin reproduzierbarer Weise aufgrund der unterschiedlichen Biopsatgrößen und-beschaffenheit nicht realisierbar. Ein wesentliches Problem ergibtsich vor allem daraus, dass das zerschnittene Biopsatgewebe anschließend manuellin die beiden Gewebeschichten getrennt werden muss. Dies findetin den bekannten manuellen Verfahren an den einzelnen Biopsatstücken mittelseiner Pinzette und unter optischer Kontrolle statt, wobei die Epidermisschichtmit der Pinzette von der etwas dickeren Dermisschicht abgezogen wird.Da Hautbiopsate dazu neigen, sich einzurollen, ist die Handhabungzusätzlicherschwert. Aktuell gibt es keine geeignete Technologie, um den qualitativen optischenUnterschied zwischen den beiden Gewebeschichten für ein automatisiertes,robotergestütztesAbziehen der Gewebeschichten voneinander auszuwerten.In connection with the isolation of tissue layers of different cell types from donor tissue, in particular skin tissue, manual methods are known in which for the separation of epidermis and dermis of a Hautbiopsats immediately after removal of any adhering fatty tissue with a scalpel in about 2 × 2 mm2 small pieces cut and in an enzyme solution is transferred. This is intended to dissolve the connection between epidermis and dermis, especially the basal membrane arranged therebetween. Complete cutting of the biopsy is required to provide the enzyme with a target to the basement membrane. This manual procedure can not be automated. In known methods it is assumed that the biopsy can be cut only by a pulling cut on the epidermis side. Furthermore, the orientation of the biopsy material required for a defined cut can not be reproduced in a reproducible manner because of the different biopsy sizes and properties. A major problem arises mainly from the fact that the cut biopsy tissue must then be manually separated into the two tissue layers. This takes place in the known manual method on the individual Biopsatstücken by means of tweezers and under optical control, wherein the epidermis layer is removed with the tweezers of the slightly thicker dermis layer. Since skin biopsies tend to curl up, handling is even more difficult. Currently, there is no suitable technology to evaluate the qualitative visual difference between the two tissue layers for automated, robotic tissue stripping.
Inden manuellen Verfahren muss, um einzelne Epithelzellen aus dermanuell abgetrennten Epithelschicht zu gewinnen, die Epithelschicht zunächst ineinem weiteren Verfahrensschritt homogenisiert werden und im Anschlusseiner Trypsinbehandlung unterzogen werden. Hier ist eine hohe Einwirkzeiterforderlich, um eine großeAnzahl an vereinzelten Epithelzellen zu gewinnen. Die Inkubationszeit beträgt dabeibekanntermaßenzwischen 15 und 20 Minuten, insbesondere etwa 18 Minuten. Nachteilig istdabei, dass das Enzym Trypsin schon nach wenigen Minuten einen schädlichenEinfluss auf die Zellvitalitätder Epithelzellen, insbesondere Keratinozyten, hat.InThe manual procedure needs to remove individual epithelial cells from themanually separated epithelial layer to gain the epithelial layer first inbe homogenized in a further process step and subsequentlybe subjected to a trypsin treatment. Here is a high exposure timerequired a big oneTo gain the number of isolated epithelial cells. The incubation period is therebyknownbetween 15 and 20 minutes, especially about 18 minutes. The disadvantage isdoing that the enzyme trypsin already after a few minutes a harmfulInfluence on cell vitalityepithelial cells, in particular keratinocytes.
Imbekannten Verfahren wird die Enzymreaktion nach Ende der definiertenInkubationsdauer abgestoppt. Die Suspension wird durch ein Zellsieb gegeben,abzentrifugiert, und die Zellen werden in einem spezifischen Nährmediumresuspendiert.In the known method, the enzyme Re stopped after the defined incubation period. The suspension is passed through a cell sieve, spun down, and the cells are resuspended in a specific nutrient medium.
Daneben,findet optional eine Aufbereitung der von der Epithelschicht befreitenweiteren Gewebeschicht, insbesondere der Dermisschicht statt.Besides,optionally finds a treatment of the freed from the epithelial layeranother layer of tissue, especially the dermis layer instead.
BisherigeLösungsansätze zurAutomatisierung im Bereich der Zellkulturtechnik und des Tissue Engineeringbeschränkensich hauptsächlichauf die Kultivierung von Einzelzellen: Automatisierte Robotersystemesind bekannt, die Zellkulturflaschen oder Bioreaktoren, insbesondereim Format standardisierter Multiwellplatten, handhaben können. Allefür die Zellkulturerforderlichen Schritte, Inkubation, Medienwechsel, Passagier- undErnteprozesse werden automatisiert und gegebenenfalls auch unterGMP-konformen Bedingungen durchgeführt. Weder für die Zellextraktionder zu kultivierenden Zellen, noch für die Weiterverarbeitung derkultivierten Zellen stehen bisher automatisierbare Verfahren oderMittel bereit.PreviousSolutions toAutomation in the field of cell culture technology and tissue engineeringrestrictmainlyon the cultivation of single cells: Automated robot systemsare known, the cell culture bottles or bioreactors, in particularin the format of standardized multiwell plates. Allfor cell culturerequired steps, incubation, media change, passenger andHarvest processes are automated and possibly also underGMP compliant conditions performed. Neither for cell extractionthe cells to be cultivated, nor for the further processing ofcultured cells are previously automated methods orReady.
Aufgabenstellungtask
Dervorliegenden Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, einautomatisierbares Verfahren zum Abtrennen und Isolieren einer Gewebeschicht,besonders einer Epithelzellschicht von anderen Gewebeschichten einesGewebeverbands bereitzustellen, der aus einer ersten Gewebeschicht, bevorzugteiner Epithelzellen enthaltenden Epithelschicht und mindestens einerweiteren Gewebeschicht besteht, wobei bevorzugt die Epithelschicht mitder mindestens einer weiteren Gewebeschicht über eine Basalmembran verbundenist, die zwischen der Epithelschicht und der weiteren Gewebeschichtangeordnet ist. Das Verfahren soll vor allem technisch aufwändige undschlecht automatisierbare Handhabungsschritte, wie aus der manuellenBearbeitung von Gewebestückenbekannt, vermeiden und eine einfache technische Realisierung inautomatisierten robotergestütztenSystemen ermöglichen.Die Epidermiszellen sollen abgetrennt und insbesondere isoliertwerden von einem biologischen Gewebestück, wobei das Gewebestück bevorzugt einSpendergewebe ist, besonders bevorzugt menschliches oder tierischesHautgewebe, welches bevorzugt zumindest eine Epidermis und zumindest eineDermisschicht aufweist.Of theThe present invention is based on the technical problemautomatable method for separating and isolating a tissue layer,especially an epithelial cell layer of other tissue layers of aTo provide tissue composites of a first layer of tissue, preferablyan epithelial layer containing epithelial cells and at least onefurther tissue layer, wherein preferably the epithelial layer withthe at least one further tissue layer connected via a basement membraneis that between the epithelial layer and the further tissue layeris arranged. The process is mainly technically complex andpoorly automated handling steps, as from the manualProcessing of pieces of tissueknown, avoid and a simple technical realization inautomated roboticsEnable systems.The epidermis cells are to be separated and in particular isolatedare of a biological tissue piece, wherein the tissue piece is preferredDonor tissue is, more preferably human or animalSkin tissue, which preferably at least one epidermis and at least oneDermis layer has.
Eindamit verbundenes technisches Problem ist die Bereitstellung einerspeziellen Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.Oneassociated technical problem is the provision of aspecial device for carrying out this method.
Dastechnische Problem wird gelöstdurch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Trennung einer erstenGewebeschicht aus einem mehrschichtigen biologischen Gewebeverband,bestehend aus der ersten Gewebeschicht und mindestens einer weiterenmit der ersten Gewebeschicht, insbesondere fest verbundenen Gewebeschicht, wobeidie erste Gewebeschicht im Vergleich zu der weiteren Gewebeschichtmechanisch spröderund somit die weitere Gewebeschicht im Vergleich zu der ersten Gewebeschichtmechanisch zäherist. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass durch Beaufschlagen desGewebeverbandes mit einem oder mehreren abrupten Kraftimpulsen (Hacken)in der ersten Gewebeschicht Sprödbruchausgelöstwird, so dass die dadurch aufgespaltene erste Gewebeschicht vonder weiteren Gewebeschicht ablösbarwird. Insbesondere ermöglichtdas erfindungsgemäße Verfahrenein Eindringen eines die Gewebeschichten an ihren VerbindungsstellenlösendenAgens durch die durch den Sprödbruchder integrierten erste Gewebeschicht, welche ansonsten ein Vordringendes Agens an die Gewebeverbindungsstellen verhindern würde. Außerdem ermöglicht daserfindungsgemäße Verfahren,dass die durch den Sprödbruchdesintegrierte erste Gewebeschicht in „Bruchstücken” von der mindestens einenweiteren Gewebeschicht ablösbar wird,so dass durch einfache nachfolgende Handhabungsschritte ein Trennender Gewebeschichten ermöglichtwird. Besonders liegen die Gewebebruchstücke der ersten Gewebeschichtin Suspension vor, währenddie vom Sprödbruchnicht erfassten weiteren Gewebeschichten als weitgehend zusammenhängendesGewebe intakt bleiben so auf einfache Weise von der Suspension abtrennbarsind.Thetechnical problem is solvedby providing a method for separating a firstTissue layer of a multilayer biological tissue association,consisting of the first fabric layer and at least one otherwith the first tissue layer, in particular firmly connected tissue layer, whereinthe first layer of tissue compared to the other layer of tissuemechanically brittleand thus the further tissue layer in comparison to the first tissue layermechanically tougheris. The method is characterized in that by applying theTissue association with one or more abrupt force pulses (hoes)in the first tissue layer brittle fracturetriggeredis, so that thereby split first tissue layer ofthe other fabric layer removablebecomes. In particular, allowsthe inventive methodpenetration of the tissue layers at their jointsbe solvedAgent by the brittle fracturethe integrated first layer of tissue which otherwise penetratesof the agent to the tissue junctions. In addition, this allowsinventive method,that by the brittle fracturedisintegrated first layer of tissue in "fragments" of the at least onefurther tissue layer is removable,so that by simple subsequent handling steps separatingallows the tissue layersbecomes. The tissue fragments of the first tissue layer are especially locatedin suspension before whilethe brittle fractureunrecognized further tissue layers as largely coherentTissue intact thus remain easily separable from the suspensionare.
Dastechnische Problem wird in bevorzugter Ausgestaltung gelöst durchdie Bereitstellung eines Verfahrens zur Isolierung von Epithelzellenaus einem Gewebeverband, bestehend aus einer die Epithelzellen enthaltendenEpithelzellschicht und mindestens einer mit der Epithelzellschicht über einedazwischen liegende Basalmembran verbundenen weiteren Gewebeschicht,welches gekennzeichnet ist durch die zumindest folgenden Verfahrensschritte:
Bevorzugtfindet das Hacken, das heißtdas Beaufschlagen mit einem abrupten Kraftimpuls des Gewebeverbandesim Schritt a) wiederkehrend statt; die Wiederholfrequenz des Hackensbeträgtin Schritt a) von 1 bis 5 Hz, bevorzugt von 3 bis 5 Hz. Andere Wiederholratensind, je nach den Eigenschaften des zu bearbeitenden Gewebeverbandsdurch den Fachmann in Kenntnis der erfindungsgemäßen Lösung anpassbar, um gegebenenfallsdas Hackergebnis zu verbessern, ohne dass der Erfindungsgedankeverlassen wird.Prefersfinds the hacking, that isthe application of an abrupt force impulse of the tissue associationin step a) recurring instead; the repetition frequency of hackingisin step a) from 1 to 5 Hz, preferably from 3 to 5 Hz. Other repetition ratesare, depending on the properties of the tissue to be processed meshby the skilled person in the knowledge of the solution according to the invention adaptable to optionallyto improve the hack result, without the idea of the inventionwill leave.
DieErfindung sieht also vor, vor einem Auflösen des Gewebeverbands durchein lösendesAgens die Integritätder Epithelzellschicht durch einen abrupten Kraftimpuls auf denGewebeverband (Hacken) zu zerstören.Charakteristisch fürdiese neuartige Desintegrationsmethode ist, dass dabei die mit derEpithelzellschicht verbundene mindestens eine weitere Gewebeschichtnicht oder nicht wesentlich desintegriert wird und daher vollständig oderzumindest im Wesentlichen intakt bleibt. Das heißt, der Gewebeverband bleibtim Anschluss an Schritt a) als solcher mechanisch erhalten, wasdie automatisierte, insbesondere robotergestützte Weiterverarbeitung erleichtert.TheThe invention thus provides, prior to dissolution of the tissue composite bya solventAgent's integritythe epithelial cell layer by an abrupt force pulse on theTissue bandage (hoes) to destroy.Characteristic ofThis novel disintegration method is that with theEpithelial layer associated at least one further layer of tissueis not or not substantially disintegrated and therefore completely orat least essentially intact. That is, the fabric association remainsfollowing step a) as such mechanically obtained whatfacilitates automated, in particular robot-assisted further processing.
DieErfindung macht sich die überraschende Erkenntniszunutze, dass die mechanischen Eigenschaften der Epithelzellschichtsich von den mechanischen Eigenschaften von mit der Epithelzellschicht verbundenenweiteren Gewebeschichten unterscheiden. Insbesondere ist die Epithelzellschichtim Vergleich zu den damit verbundenen weiteren Gewebeschichten vergleichsweisesprödeund die an eine Epithelzellschicht anhaftenden weiteren Gewebeschichtensind vergleichsweise zäh.Ohne an die Theorie gebunden sein zu wollen, verursacht der abrupteHackimpuls auf das Gewebe einen im Wesentlichen verformungslosenSprödbruchin der Epithelzellschicht, währendvergleichsweise zäheGewebeschichten im Wesentlichen intakt bleiben. Der abrupte Hackimpulskann keinen verformungsreichen Zähbruchin einem vergleichsweise zäherenGewebe erzeugen.TheInvention makes the surprising findingtake advantage of the mechanical properties of the epithelial cell layerdifferent from the mechanical properties of the epithelial cell layerdistinguish further tissue layers. In particular, the epithelial cell layerCompared to the associated further tissue layers comparativelybrittleand the further tissue layers adhered to an epithelial cell layerare comparatively tough.Without wanting to be bound by theory, it causes the abruptHack impulse on the tissue a substantially deformation-freebrittle fracturein the epithelial cell layer whilecomparatively toughTissue layers remain essentially intact. The abrupt Hackimpulscan not a deformation-rich Zähbruchin a comparatively tougherCreate tissue.
Durchdie vorliegende Erfindung wird dem Fachmann ermöglicht, die bisher bekanntermaßen nurdurch eine ziehende Schnittführungerreichte Zerteilung des Gewebes durch eine bruchmechanische Be anspruchungzum Auftrennen der Epithelzellschicht im Gewebeverband zu ersetzenund durch die zu erreichbare Desintegration der Epithelzellschichtkann ein Gewebe auflösendesAgens unmittelbar an die der Epithelzellschicht anliegenden Basalmembraneinwirken, wodurch diese aufgelöst werdenkann, um den Gewebeverband aufzulösen und insbesondere die Epithelzellenan der mindestens einen weiteren Gewebeschicht des Gewebeverbandsabzulösen.Bythe present invention is made possible for those skilled in the art, the previously known onlythrough a pulling cutachieved fragmentation of the tissue by a fracture mechanical loadingto replace the epithelial cell layer in tissue associationand by the achievable disintegration of the epithelial cell layercan be a tissue dissolvingAgent directly to the basal membrane adjacent to the epithelial cell layeract, which dissolve themcan dissolve the tissue matrix and in particular the epithelial cellson the at least one further tissue layer of the tissue compositereplace.
DieErfinder fanden weiter überraschend, dassder vorteilhafte Effekt des abrupt wirkenden Kraftimpulses (Hacken)auf die Zerstörungder Integritätder Epithelzellschicht im Gewebeverband tatsächlich im Wesentlichen unabhängig vonder Orientierung des Gewebestücksin Bezug auf die Hackrichtung ist. Es hat sich herausgestellt, dasses nicht, wie zunächstzu erwarten gewesen wäre,erforderlich ist, dass die zu desintegrierende Epithelzellschichtan der der Kraftimpulsrichtung zugewandten Oberfläche desGewebeverbands angeordnet sein muss, um durch den erfindungsgemäßen Kraftimpulsdie Desintegration der Epithelzellschicht zu erwirken. Es hat sich überraschendherausgestellt, dass auch die mit der Epithelzelleschicht im Gewebeverbandverbundenen mindestens eine weitere Gewebeschicht die Kraftimpulswirkungauf die Epithelzellschicht leiten kann, um diese zu desintegrieren.Vorteilhafterweise kann so die Epithelzellschicht im Gewebeverband „aufgeschnitten” werden,ohne dass die konkrete Orientierung des Gewebestücks vorher festgelegt, oder bekanntsein muss. Dies ist ein weiterer entscheidender Vorteil gegenüber derbekannten Maßnahmeder ziehenden Schnittführungauf dem gezielt orientierten und ausgebreiteten Gewebestück.TheInventors found further surprising thatthe beneficial effect of the abruptly acting force pulse (hoes)on the destructionof integritythe epithelial cell layer in tissue association actually substantially independent ofthe orientation of the piece of tissuein terms of the hack direction. It turned out thatnot it, like firstwould have been expectedit is necessary that the epithelial cell layer to be disintegratedat the force pulse direction facing surface of theTissue bandages must be arranged in order by the force pulse according to the inventionto achieve the disintegration of the epithelial cell layer. It's surprisingalso found that with the epithelial cell layer in the tissueconnected at least one further tissue layer, the force pulse effectcan lead to the epithelial cell layer to disintegrate them.Advantageously, the epithelial cell layer can thus be "cut open" in tissue combination,without specifying the concrete orientation of the piece of fabric beforehand, or knownhave to be. This is another crucial advantage over theknown measurethe pulling cuton the purposefully oriented and spread fabric piece.
DieErfindung sieht bevorzugt vor, dass das Hacken des Gewebeverbandesin Schritt a) innerhalb des Verfahrens über die im We sentlichen gesamteOberflächedes Gewebeverbandes verteilt erfolgt, um möglichst die gesamte Epithelzellschichtzu desintegrieren, das heißtin wesentlichen Teilen im Wesentlichen bis zur Basalmembran hinaufzuspalten. In einer bevorzugten Variante der Erfindung wird dieserreicht, indem der Gewebeverband in Schritt a) auf einer Trägerfläche aufliegt,die im Wesentlichen senkrecht zur Hackbewegung, das heißt senkrecht zuder von der Klinge ausgeübtenKraftimpulsrichtung, bevorzugt schrittweise, verfahren, das heißt, verschobenwird. Dies erfolgt bevorzugt durch den Einsatz eines Kreuztisches,woraus die Trägerfläche angeordnetist. Der Kreuztisch weist eine erste horizontale Achse und einezweite, dazu senkrecht stehende horizontale Achse auf. Die Erfindungsieht bevorzugt vor, dass die Trägerfläche, unddamit das darauf aufliegende Gewebestück, zumindest in den Intervallenzwischen den sich wiederholenden Hackbewegungen, vorzugsweise schrittweisein zumindest einer Achsenrichtung verfahren, das heißt verschobenwird, sodass mit jeder Hackbewegung ein anderer Oberflächenabschnittdes auf der Trägerfläche aufliegendenGewebeverbandes mit dem abrupten Kraftimpuls der Klinge beaufschlagtwird.The invention provides preferably that the hacking of the tissue association in step a) takes place within the process on the We sentlichen entire surface of the tissue association in order to disintegrate as possible the entire epithelial cell layer, that is substantially split substantially in the basal membrane out , In a preferred variant of the invention, this is achieved by the tissue assembly rests in step a) on a support surface which is substantially perpendicular to the chopping motion, that is perpendicular to the force exerted by the blade force pulse direction, preferably stepwise, moved, that is, moved , This is preferably done by the use of a cross table, from which the support surface is arranged. The cross table has a first horizontal axis and a second perpendicular horizontal axis. The invention preferably provides that the carrier surface, and thus the tissue piece lying thereon, preferably at least in the intervals between the repetitive chopping movements, preferably stepwise in at least one axial direction, that is shifted, so that with each chopping movement another surface portion of the on the Carrier surface resting tissue association with the abrup th force pulse of the blade is applied.
Ineiner ersten Variante erfolgt das schnittweise Verfahren entlangder mindestens einen horizontalen Achse in Form eines regelmäßigen Musters (Scannen).In einer alternativen Variante erfolgt das Verfahren in zumindesteiner Achsenrichtung nach ungeordneten, insbesondere quasi-stochastischen Verteilungsmustern.Der Vorteil der quasi-stochastischen Verteilung der Kraftimpulseinwirkungauf die Oberflächedes Gewebeverbandes besteht darin, dass unabhängig von der konkreten Lagedes Gewebeverbandes auf der Trägerfläche eineim Mittel gleichgewichtete Desintegrationswirkung erreicht wird.InIn a first variant, the cut-by-length method is carried out alongthe at least one horizontal axis in the form of a regular pattern (scanning).In an alternative variant, the method is carried out in at leastan axis direction after disordered, in particular quasi-stochastic distribution patterns.The advantage of the quasi-stochastic distribution of the force impulse effecton the surfaceThe fabric association is that regardless of the specific situationthe fabric association on the support surface aon average, equally weighted disintegration effect is achieved.
DieErfindung sieht bevorzugt vor, dass als die Basalmembran im Gewebeverbandlösendes Agensein Enzym oder eine Enzymmischung eingesetzt wird, die bevorzugtausgewähltist aus dem Enzym Dispase, Dispase-ähnlichen Enzymen und Mischungendavon. Bevorzugt wird das Inkontaktbringen des Gewebeverbands mitdem die Basalmembran lösendenAgens in Schritt b) durch eine Inkubation des Gewebeverbands mitdiesem Agens realisiert. Bevorzugt erfolgt die Inkubation über einen Zeitraumvon 3 bis 5 Stunden, besonders bevorzugt über einen Zeitraum von 4 Stunden.TheInvention preferably provides that as the basal membrane in the tissue associationsolventan enzyme or enzyme mixture is used which is preferredselectedis from the enzyme dispase, dispase-like enzymes and mixturesfrom that. Preference is given to bringing the tissue composite into contact withthat the basal membrane dissolvesAgent in step b) by incubation of the tissue composite withrealized this agent. The incubation preferably takes place over a period of timefrom 3 to 5 hours, more preferably over a period of 4 hours.
Gegenstanddieser Erfindung ist auch ein um mindestens einen weiteren SchrittergänztesVerfahren, wonach in dem weiteren Schritt d) die in Schritt c) abgetrennteEpithelzellschicht mit einem den Zellverband der EpithelzellschichtlösendenAgens in Kontakt gebracht wird, sodass sich vereinzelte Epithelzellenaus der abgetrennten Epithelzellschicht ablösen.objectThis invention is also an at least one further stepsupplementedA method according to which in the further step d) that separated in step c)Epithelial cell layer with a cell structure of the epithelial cell layerbe solvedAgent is brought into contact, so that isolated epithelial cellsdetach from the separated epithelial cell layer.
Bevorzugtist das den Zellverband der Epithelzellschicht lösende Agens ein Enzym oderEnzymgemisch, welches bevorzugt ausgewählt ist aus dem Enzym Trypsin,Trypsin-ähnlichenEnzymen und Mischungen davon. Vorzugsweise wird das Inkontaktbringender abgetrennten Epithelzellschicht mit dem den Zellverband derEpithelzellschicht lösenden Agensin Schritt d) durch eine Inkubation der Epithelzellschicht mit diesemAgens realisiert. Bevorzugt findet die Inkubation über einenZeitraum von etwa 3 bis etwa 10 Minuten, bevorzugt von 4 bis 6 Minuten,besonders bevorzugt von 5 Minuten statt.Prefersthe agent dissolving the cell structure of the epithelial cell layer is an enzyme orEnzyme mixture, which is preferably selected from the enzyme trypsin,Trypsin-likeEnzymes and mixtures thereof. Preferably, the contacting will occurthe separated epithelial cell layer with which the cell group ofEpithelial cell layer dissolving agentin step d) by incubation of the epithelial cell layer with thisRealized agent. Preferably, the incubation takes place over aTime from about 3 to about 10 minutes, preferably from 4 to 6 minutes,more preferably 5 minutes instead.
Gegenstandder Erfindung ist auch ein um ein mindestens einen weiteren Schritterweitertes erfindungsgemäßes Verfahren,wobei in ei nem nachfolgenden oder alternativen Schritt e) das diemindestens eine weitere Gewebeschicht aufweisende Restgewebe miteinem den Gewebeverband lösenden Agensin Kontakt gebracht wird, sodass sich vereinzelte Gewebezellen dermindestens einen weiteren Gewebeschicht aus dem Restgewebe lösen.objectThe invention is also an at least one further stepextended method according to the invention,wherein in a subsequent or alternative step e) theat least one further tissue layer having residual tissue witha tissue-dissolving agentis brought into contact, so that isolated tissue cells ofdetach at least one further layer of tissue from the remaining tissue.
Vorzugsweisewird das den Zellverband der mindestens einen weiteren Gewebeschichtlösende Agensim Schritt e) ein Enzym oder Enzymgemisch, ausgewählt ausdem Enzym Kollagenase, Kollagenase-ähnlichen Enzymen und Mischungendavon. Bevorzugt wird das Inkontaktbringen der mindestens einenweiteren Gewebeschicht mit dem den Zellverband der GewebeschichtlösendenAgens in Schritt e) durch eine Inkubation der mindestens einen weiterenGewebeschicht in dem Agens realisiert. Die Inkubation findet bevorzugt über einenZeitraum von 1 bis 8 Stunden, besonders bevorzugt über einenZeitraum von 3 bis 5 Stunden statt. Die Ausbeute der aus dem Zellverbandder mindestens einen weiteren Gewebeschicht herausgelösten vereinzeltenGewebezellen hängtvon der Inkubationsdauer ab.Preferablythis becomes the cell structure of the at least one further layer of tissuereleasing agentin step e) an enzyme or enzyme mixture selected fromthe enzyme collagenase, collagenase-like enzymes and mixturesfrom that. The contacting of the at least one is preferredanother layer of tissue with which the cell structure of the tissue layerbe solvedAgent in step e) by incubation of the at least one otherTissue layer realized in the agent. The incubation preferably takes place over onePeriod of 1 to 8 hours, more preferably over onePeriod of 3 to 5 hours instead. The yield of the cell structurethe isolated at least one further layer of tissue isolatedTissue cells hangfrom the incubation period.
DieErfindung stellt somit ein Gesamtverfahren bereit, womit aus einemmindestens zwei Gewebeschichten enthaltenden Gewebeverband, bevorzugtin Form eines Spendergewebes, welches eine Epithelzellschicht undeine übereine Basalmembran verbundene weitere Gewebeschicht aufweist, bereit, umin automatisierbarer, insbesondere robotergestützter Weise eine einfache,schnelle und zuverlässigeIsolation sowohl der Epithelzellen, als auch bevorzugt zusätzlich derGewebezellen der weiteren Gewebeschicht von dem Gewebeverband ermöglicht.Ein solches Verfahren ist reproduzierbar, ge nügt High-Throughput-Erfordernissenund kann die Anforderungen an die GMP-Konformität erfüllen.TheThus, the invention provides an overall method, with which from aat least two tissue layers containing tissue, preferablyin the form of a donor tissue, which has an epithelial cell layer andone overa basement membrane has associated further tissue layer, ready to orderin an automatable, in particular robot-assisted way a simple,fast and reliableIsolation of both the epithelial cells, and preferably additionally theTissue cells of the further tissue layer of the tissue association allows.Such a method is reproducible, meets high-throughput requirementsand can meet the requirements for GMP compliance.
Ineiner bevorzugten Ausführungist der Gewebeverband ein Spendergewebe des menschlichen oder tierischenKörpers;besonders bevorzugt ist der Gewebeverband Hautgewebe, insbesonderein Hautgewebebiopsat. Demgemäß ist dieEpithelzellschicht bevorzugt eine Epidermisschicht und die zu isolierendenEpithelzellen sind bevorzugt Keratinozyten, die als solche aus demSpendergewebe, insbesondere Hautgewebe, isolierbar sind. Ebensoist die mindestens eine weitere Gewebeschicht des Gewebeverbandesbevorzugt eine Dermisschicht und die aus der mindestens einen weiterenGewebeschicht isolierbaren Gewebezellen sind bevorzugt Fibroblasten.Ina preferred embodimentThe tissue association is a donor tissue of the human or animalbody;Particularly preferred is the tissue association skin tissue, in particularin skin tissue biopsy. Accordingly, theEpithelial cell layer prefers an epidermis layer and the one to be isolatedEpithelial cells are preferably keratinocytes, as such from theDonor tissue, especially skin tissue, are isolatable. As wellis the at least one further tissue layer of the tissue associationpreferably a dermis layer and that of the at least one otherTissue layer isolatable tissue cells are preferably fibroblasts.
Einweiterer Gegenstand der Erfindung ist eine zur Durchführung deserfindungsgemäßen Verfahrens,insbesondere zur Durchführungdes erfindungsgemäßen Schrittsa), geeignete Vorrichtung zum Zerstören der Integrität einerEpithelzellschicht in einem Gewebestück eines Gewebeverbandes, bestehendaus einer die Epithelzellen enthaltenen Epithelzellschicht und mindestenseiner mit der Epithelzellschicht über eine dazwischen liegendeBasalmembran verbundenen weiteren Gewebeschicht, durch Beaufschlagendes Gewebeverbandes über eineKlinge mit einem abrupten Kraftimpuls (Hacken), wobei die Vorrichtungzumindest folgende Komponenten aufweist:
Esist bevorzugt vorgesehen, dass in dem Klingenblock mehrere Klingenangeordnet sind. In einer bevorzugten Ausführung sind die eingesetzten KlingenSkalpellmesser. Bevorzugt sind dies auswechselbare Skalpellklingen.ItIt is preferably provided that in the blade block a plurality of bladesare arranged. In a preferred embodiment, the blades used areScalpel knife. Preferably, these are replaceable scalpel blades.
DieVorrichtung ist bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass die mindestenseine Klinge im Wesentlichen senkrecht auf die Trägerfläche absenkbar ist. Dies wirdbewerkstelligt durch entsprechende Anordnungen des schwenkbar ander Basis gelagerten Klingenhebels. Die Schwenkachse des Klingenhebelsliegt bevorzugt oberhalb der Ebene der Trägerfläche.TheDevice is preferably characterized in that the at leasta blade is lowered substantially perpendicular to the support surface. this willaccomplished by appropriate arrangements of the pivotallythe base mounted blade lever. The pivot axis of the blade leveris preferably above the plane of the support surface.
Daszum Antrieb des Klingenhebels vorgesehene Antriebselement ist einKraftantrieb, der bevorzugt ausgewählt ist aus pneumatischen Antrieben,hydraulischen Antrieben und piezoelektrischen Antrieben und elektromagnetischenAntrieben. Dazu analoge Antriebskonzepte sind ebenfalls vom Gegenstandder Erfindung umfasst. Besonders bevorzugt ist der elektromagnetischeAntrieb. Ein bevorzugtes Merkmal des Antriebselements ist die Fähigkeit, über dieKlinge einen abrupten Kraftimpuls auf ein Gewebestück auszuwirken.In einer bevorzugten alternativen Ausführung wird auf die schwenkbare Lagerungdes Klingenhebels verzichtet, um eine direkte Verbindung zwischenKlinge und Antriebselement zu erzeugen. In einer weiteren alternativenbevorzugten Ausführungwird auf den Klingenhebel verzichtet und das Antriebselement unmittelbarmit der Klinge verbunden.Theprovided for driving the blade lever drive element is aPower drive, which is preferably selected from pneumatic drives,hydraulic drives and piezoelectric drives and electromagneticDrives. This analog drive concepts are also the subjectof the invention. Particularly preferred is the electromagneticDrive. A preferred feature of the drive member is the ability to control overBlade an abrupt force impact on a piece of tissue.In a preferred alternative embodiment, the pivotable mountingthe blade lever dispensed to a direct connection betweenCreate blade and drive element. In another alternativepreferred embodimentis dispensed with the blade lever and the drive element immediatelyconnected to the blade.
Einebesonders bevorzugte Ausführungder Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass zumindest an einerStelle der die Klinge überden Klingenhebel mit dem Antriebselement verbindenden Wirkmechanikein Endanschlag vorgesehen ist, der die durch das Absenken der Klingeauf die Trägerfläche ausübbare Hubbewegungzur Trägerfläche hinbegrenzt. Dadurch kann bevorzugt erreicht werden, dass sich dieKlinge bei der Hubbewegung, das heißt beim erfindungsgemäßen Hackennicht oder nicht vollständigauf die Trägerfläche herabsenkt.Diese wird vorteilhafterweise dadurch an ihrer Oberfläche geschontund der Verschleiß vonTrägerfläche und/oderKlinge minimiert. Gleichzeitig erlaubt der bevorzugt vorgeseheneEndanschlag, dass ein vollständigesDurchtrennen des auf der Trägerfläche aufliegendenGewebestücksaufgrund einer durch die Klinge verursachten Messerschneidwirkungvermieden oder verhindert wird. Im Vordergrund dieser Erfindungsteht nicht die durch die herabfahrende Klinge erzeugte Messerschneidwirkunggegen die Trägerfläche, sondernbevorzugt der durch die Klinge im Gewebe erzeugte abrupte Kraftimpuls,welcher zum „Zerspringen” des vergleichsweisesprödenEpithelgewebes im Gewebeverband des Gewebestücks führt. In einer bevorzugten Ausführung istdie Vorrichtung deshalb derart ausgelegt, dass eine messerschneidendeWirkung der Klinge ausgeschlossen ist. In einer bevorzugten Ausführung derVorrichtung ist diese daher auch so ausgestaltet, dass ein sogenannterziehender Schnitt auf dem Gewebestück verhindert wird. Der Fachmannkennt entsprechende geometrische Ausgestaltungen, insbesondere die Anordnungder Schwenkachse des Klingenhebels in Bezug auf die Trägerfläche undden Anstellwinkel der auf die Trägerfläche niederfahrendenKlinge, um entsprechende schneidende Bewegungen, die im Wesentlichenparallel zur Oberflächedes Gewebestücks verlaufen,vermeiden.Aparticularly preferred embodimentthe device is characterized in that at least at onePut the blade overthe blade lever with the drive element connecting action mechanisman end stop is provided by the lowering of the bladeexercisable on the support surface lifting movementtowards the support surfacelimited. This can preferably be achieved that theBlade in the lifting movement, that is when hacking according to the inventionnot or not completelylowered onto the support surface.This is advantageously thereby spared on its surfaceand the wear ofCarrier surface and / orBlade minimized. At the same time allows the preferred providedEnd stop that a completeCutting the resting on the support surfacefabric piecedue to a blade cutting action caused by the bladeavoided or prevented. In the foreground of this inventiondoes not stand the knife cutting action produced by the descending bladeagainst the support surface, butprefers the abrupt momentum generated by the blade in the tissue,which to the "shattering" of the comparativelybrittleEpithelial tissue in the tissue association of the tissue piece leads. In a preferred embodimentthe device therefore designed such that a knife-cuttingEffect of the blade is excluded. In a preferred embodiment ofThis device is therefore designed so that a so-calledpulling section on the fabric piece is prevented. The expertknows appropriate geometrical configurations, in particular the arrangementthe pivot axis of the blade lever with respect to the support surface andthe angle of attack of the descending on the support surfaceBlade to appropriate cutting movements, essentiallyparallel to the surfaceof the fabric piece,avoid.
Gegenstandder Erfindung ist auch eine Vorrichtung, die weiter eine Steuereinheit,insbesondere geeignet zur Steuerung des Verfahrensablauf in Schritta) des erfindungsgemäßen Verfahrensaufweist, die mit dem Antriebselement (
DieSteuereinheit ist vorzugsweise in Abhängigkeit von der verwendetenAntriebseinheit gewählt. Wirdbeispielsweise eine pneumatische Antriebseinheit verwendet, wirddie Steuereinheit aus pneumatischen Steuerelementen, gegebenenfallsin Verbindung mit programmgesteuerten Ventilen, eingesetzt. DieSteuereinheit kann auch durch eine rein mechanische Wirkverbindung,beispielsweise eine mechanische Rastung oder Schrittfolgesteuerung,die über dieHubbewegung der Klinge getaktet wird, ausgeführt werden. Besonders bevorzugtist eine übereinen Rechner realisierte Steuerung, bevorzugt in Verbindung miteinem dazu geeigneten Computerprogramm, das auf dem Steuerrechnerimplementiert ist.The control unit is preferably selected as a function of the drive unit used. For example, if a pneumatic drive unit is used, the control unit is made of pneumatic controls, optionally in conjunction with programmable valves used. The control unit can also by a purely mechanical operative connection, for example a mechanical detent or step sequencer, the over the stroke movement of the blade is clocked to be executed. Particularly preferred is a controller implemented via a computer, preferably in conjunction with a computer program suitable for this purpose, which is implemented on the control computer.
Gegenstandder Erfindung ist daher auch ein Computerprogrammprodukt zur Steuerungder Koordination der Bewegung der Klinge mit der Bewegung der Trägerfläche.objectThe invention is therefore also a computer program product for controlthe coordination of the movement of the blade with the movement of the support surface.
Gegenstandder Erfindung ist daher auch eine Anordnung zur automatischen, insbesondererobotergestütztenIsolierung von Epithelzellen aus einem Gewebeverband, der aus einerdie Epithelzellen enthaltenden Epithelzellschicht und mindestenseiner mit der Epithelzellschicht über eine dazwischen liegendeBasalmembran verbundenen weiteren Gewebeschicht besteht oder dieseenthält,wobei die Vorrichtung zumindest die folgenden Komponenten enthält:
Inbevorzugter Ausführungist das Mittel zum Zerstörender Integritätder Epithelzellschicht des Gewebeverbands die hierin beschriebeneerfindungsgemäße Vorrichtung.Inpreferred embodimentis the means to destroyof integritythe epithelial cell layer of the tissue composite described hereininventive device.
Bevorzugtenthältdie Anordnung weiter:
DieErfindung wird weiter durch die nachfolgenden Figuren sowie dasBeispiel näherbeschrieben, ohne dass diese beschränkend zu verstehen wären.TheInvention is further by the following figures and theExample closerdescribed, without these being limiting.
Beispiel: Vollautomatisierte Isolationvon Fibroblasten und Keratinozyten aus Epidermis- und Dermisschichtenvon Hautbiopsaten.Example: Fully automated isolationof fibroblasts and keratinocytes from epidermis and dermis layersof skin biopsies.
Ineinem gegebenenfalls vorangehenden separaten Verfahrensablauf, derunabhängigvon dem erfindungsgemäßen Verfahrendurchgeführtwird, werden bevorzugt manuell operativ Hautgewebestücke (Biopsate)aus dem menschlichen oder tierischen Körper, bevorzugt aus dem lebendenmenschlichen Körper,entnommen. Bevorzugt, sind dies Präputien.Inan optionally preceding separate procedure, theindependentlyof the method according to the inventioncarried outwill be preferred manually operated skin tissue pieces (biopsies)from the human or animal body, preferably from the livinghuman body,taken. Preferably, these are prepuce.
DieGewebestückebefinden sich zu Prozessbeginn bevorzugt in einem Transportbecherin ca. 20 mL Transportmedium (bevorzugt DMEM + 1% Gentamycin). ImRahmen des erfindungsgemäßen Verfahrenswird das Biopsat zunächstdurch einen Greifer, welcher das Biopsat aus dem Transportbechernimmt und auf eine Verarbeitungsplattform ablegt, erfasst. Um dasBiopsat zum automatisierten Greifen in eine definierte Lage zu bringen,wird der Transportbecher bevorzugt um ca. 40° aus der senkrechten Achse gekippt.Durch die Schwerkraft sinkt das Biopsat in die so entstandene Senkeim Transportbecher ab, und damit in eine reproduzierbar definierteLage. Das Biopsat kann so von einem entsprechend ausgelegten Greifererfasst werden. Das Biopsat wird mit dem Greifer auf einer Verarbeitungsplattformabgelegt und fürdie Trennung der Gewebeschichten vorbereitet.The pieces of tissue are at the beginning of the process preferably in a transport cup in about 20 mL of transport medium (preferably DMEM + 1% gentamycin). In the context of the method according to the invention, the biopsy is first detected by a gripper which takes the biopsy from the transport cup and places it on a processing platform. To bring the biopsy for automated gripping in a defined position, the transport cup is preferably tilted by about 40 ° from the vertical axis. By gravity, the biopsy sinks into the resulting sink in the transport cup, and thus in a reproducible defined position. The biopsy can thus be detected by a suitably designed gripper. The biopsy is done with the gripper on a processing platform filed and prepared for the separation of the tissue layers.
ZurFettreduktion, das heißtzur Abtrennung von am Biopsat anhaftendem Fettgewebe, wird auf diemechanischen Eigenschaften des Fettgewebes gegenüber dem Dermis- und Epidermisgewebe,insbesondere das Elastizitätsmodul,zurückgegriffen. DasBiopsat wird zunächstbevorzugt mittels Unterdruckansaugung automatisch in eine zylinderförmige Hülse überführt, welcheso überdem Boden eines Einweggefäßes (Petrischale)positioniert ist, das zwischen Gefäßboden und Zylinderwand einSpalt von weniger als 1 mm entsteht. Durch einen in der Zylinderhülse laufendenKolben oder Stempel, wird das Biopsat auf den Boden gepresst. Dabeikann der enge Spalt zwischen Zylinder und Boden nur von dem zurSeite gepressten Fettgewebe durchdrungen werden, welches so durchden Spalt nach außengedrücktund vom übrigenGewebe (Epidermis- und Dermisschicht)räumlichgetrennt wird.toFat reduction, that isfor the separation of adipose tissue adhering to the biopsy, is applied to themechanical properties of the fatty tissue against the dermis and epidermis tissue,in particular the modulus of elasticity,resorted. TheBiopsy will be firstpreferably converted by means of vacuum suction automatically into a cylindrical sleeve, whichso overthe bottom of a disposable vessel (Petri dish)is positioned between the bottom of the vessel and the cylinder wallGap of less than 1 mm is formed. By a running in the cylinder sleevePiston or stamp, the biopsy is pressed to the ground. therethe narrow gap between the cylinder and the floor can only be from theSide-pressed fatty tissue are penetrated, which is so throughthe gap to the outsidedepressedand the restTissue (epidermis and dermis layer)spatialis disconnected.
Dasausgetretene Fettgewebe wird durch Abschneiden entfernt. Dazu wirdan der Außenseite derZylinderhülseein Schneidring abgesenkt, der das unter der Zylinderhülse hervorquellendeFettgewebe abschneidet. Der Schneidring rotiert um die Achse derZylinderhülse,um durch den ziehenden Schnitt die Schneidwirkung zu verbessern.TheExcreted fatty tissue is removed by cutting. This will beon the outside of thecylinder sleevelowered a cutting ring, which bulging under the cylinder sleeveCut off fatty tissue. The cutting ring rotates about the axis of theCylinder sleeve,to improve the cutting action by the pulling cut.
DerSchneidring ist mit dem im Inneren der Zylinderhülse verlaufenden Stempel mechanischgekoppelt, sodass zeitlich unmittelbar nach dem Herunterpressendes Biopsats auf den Gefäßboden ineinem Arbeitsgang das Schneiden des nach außen hervorquellenden Fettgewebeserfolgt: Das Quetschen und Schneiden wird innerhalb einer einzigen Hubbewegung über einespeziell ausgelegte Mitnehmerhülse,die mit dem Stempel und dem Schneidring gekoppelt ist, realisiert.Zur Beabstandung der Zylinderhülsevom Gefäßboden sindAbstandshalter oder Stege vorgesehen, welche die Breite des Spaltsbestimmen. Der Spalt hat eine Breite von ca. 0,8 mm.Of theCutting ring is mechanical with the running inside the cylinder sleeve punchcoupled, so in time immediately after the press downof the biopsy on the bottom of the vesselone operation, the cutting of the outwardly swelling fatty tissueThe squeezing and cutting takes place over a single stroke movementspecially designed drive sleeve,which is coupled to the punch and the cutting ring realized.For spacing the cylinder sleevefrom the bottom of the vesselSpacers or webs provided which the width of the gapdetermine. The gap has a width of approx. 0.8 mm.
Zurautomatisierten Aufnahme und Handhabung des Biopsats verfügt der Fettseparator über eineAnsaugleitung zum Anlegen eines Unterdrucks, worüber das Biopsat in der Zylinderhülse festgehaltenwerden kann. Dadurch kann das Biopsat aus einer defilierten Lageangesaugt werden, bearbeitet werden und durch Positionierung desFettseparators wieder an einen definierten Ort abgelegt werden.Es zeigt sich, dass durch die erfindungsgemäße Behandlung neben der Reduktiondes Fettgewebeanteils im Biopsat eine für die weitere Bearbeitung günstige Abflachungund flächigeAusbreitung des Biopsats erreicht wird. Diese hat einen überraschend positivenEinfluss auf die Effizienz der weiteren Bearbeitung, insbesondereder Trennung der Gewebeschichten (Dermisschicht, Epidermisschicht).toautomated capture and handling of the biopsy, the fat separator has aSuction line for applying a negative pressure, about which the biopsy is held in the cylinder sleevecan be. This allows the biopsy from a defiled positionbe sucked, processed and positioned by positioning theFettseparators be put back to a defined location.It turns out that by the treatment according to the invention in addition to the reductionthe fat tissue part in the biopsy a favorable for further processing flatteningand arealSpread of the biopsy is achieved. This has a surprisingly positiveInfluence on the efficiency of further processing, in particularthe separation of the tissue layers (dermis layer, epidermis layer).
Für die getrennteIsolierung der beiden Zelltypen Keratinozyten und Fibroblasten ausdem Hautbiopsat werden die beiden Hautschichten Epidermis und Dermisvoneinander getrennt. Dies geschieht enzymatisch über dasEnzym Dispase oder ein analog wirkendes Enzym, welches eine Auflösung der zwischenEpidermis- und Dermisschicht angeordneten Basalmembran bewirkt.Dazu wird das Biopsat so vorbereitet, dass das Enzym bis zur Basalmembran indas Gewebe eindringen kann. Bevorzugt wird dazu ein Gewebehackereingesetzt, welcher ein Schneiden des flächig ausgebreiteten Biopsatsmit definierter Schnitttiefe ermöglicht.Dabei wird die Oberfläche desBiopsats, welches aus der Epidermis besteht, nur bis zum darunterliegendenDermisgewebe durchtrennt, das heißt, das darunterliegende Dermisgewebebleibt durch das mechanische Schneiden bevorzugt unbeeinflusst.Aufgrund der vergleichsweise höherenSprödigkeitder oben liegenden Epidermisschicht gegenüber der zäheren darunterliegenden Dermisschichtwird durch die Hackbewegung der Klinge von oben auf die Epidermismechanisch mit hohem Impuls eingewirkt, sodass diese quasi „zerspringt” während dietiefer liegende Dermisschicht im Wesentlichen intakt bleibt.For the separatedIsolation of the two cell types keratinocytes and fibroblaststhe skin biopsy, the two layers of skin epidermis and dermisseparated from each other. This happens enzymatically via theEnzyme dispase or an analogous enzyme, which is a resolution of betweenEpidermis and dermis layer arranged basal membrane causes.The biopsy is prepared in such a way that the enzyme reaches the basal membrane inthe tissue can penetrate. Preference is given to a fabric hackerused, which is a cutting of the flat spread biopsywith defined cutting depth.The surface of theBiopsats, which consists of the epidermis, only to the underlyingDermis tissue is severed, that is, the underlying dermis tissueremains preferably unaffected by the mechanical cutting.Due to the comparatively higherbrittlenessthe upper epidermis layer opposite the tougher underlying dermis layeris caused by the clipping motion of the blade from the top of the epidermismechanically acted with a high pulse, so that it "bursts" while thedeeper dermis layer remains essentially intact.
DieGröße der Epidermisstücke wirdinsbesondere durch das Verhältnisaus Hackfrequenz des Messerkopfs und der Bewegungsgeschwindigkeit desMesserkopfs überdem Biopsat sowie durch die Dauer des Hackvorganges bestimmt.TheSize of the epidermis pieces becomesespecially by the ratiofrom the chopping frequency of the cutter head and the speed of movement of the cutterheadCutterhead overthe biopsy as well as the duration of the hacking process.
DieSchneid- oder Hackwirkung des wiederkehrend bevorzugt mit einerFrequenz von ca. 2 bis 5 Hz hackenden Messers wird bevorzugt durchVerschieben des Gewebestücksauf einem Kreuztisch, welcher mit dem Hackmesser gekoppelt betrieben wird,ist auf das gesamte Gewebestückverteilt. Die Schnittführungist damit regelmäßig, bevorzugtaber quasi-stochastisch auf der gesamten Gewebeoberfläche verteilt,sodass eine bevorzugt enge Verteilung der Größen der geschnittenen Epidermisstücke entsteht.TheCutting or Hackwirkung of recurring preferred with aFrequency of about 2 to 5 Hz chopping knife is preferred byMoving the fabric pieceon a cross table, which is operated coupled with the cleaver,is on the entire fabric piecedistributed. The cutis thus regularly, preferredbut distributed virtually stochastically on the entire tissue surface,so that a preferred narrow distribution of the sizes of the cut epidermis pieces arises.
Anschließend wirdfür einenZeitraum von 4 Stunden bei 37°Cin einer Enzymlösung,Dispase (4 U/mL, 20 mL) inkubiert. Das Enzym kann durch die eingeschnitteneEpidermisschicht leicht zur Basalmembran vordringen. Durch die enzymatischeZerstörungder Baselmembran löstsich die eingeschnittene Epidermis in Stücken von der darunterliegenden imWesentlichen intakten zusammenhängendenDermis. Die Epidermisstückeschwimmen bevorzugt auf.Subsequently, willfor onePeriod of 4 hours at 37 ° Cin an enzyme solution,Dispase (4 U / mL, 20 mL). The enzyme can be cut through theEpidermis layer slightly penetrate to the basal membrane. By the enzymaticdestructionthe Basel membrane dissolvesthe incised epidermis is in pieces from the underlyingEssentially intact coherentDermis. The epidermis piecesswim up preferably.
Diein Dispase suspendierten Epidermisstücke werden in dem nachfolgendenSchritt von der als zusammenhängendesGewebestückerhaltenen Dermis abgetrennt. Dazu wird zunächst das Volumen der Dispaselösung durchAuffüllenmit Pufferlösungverdoppelt oder verdreifacht (auf 40 bis 60 ml) und die Dermis ausder Suspension der Epidermisstückemittels eines Gewebegreifers automatisch entnommen und in ein separatesGefäß abgelegt.Epidermisgewebe und Dermisgewebe liegen nun in getrennten Gefäßen vor.The epidermis pieces suspended in Dispase are separated in the subsequent step from the dermis obtained as a coherent piece of tissue. For this purpose, the volume of the Dispaselösung is first doubled by filling with buffer solution or tripled (to 40 to 60 ml) and the Dermis is automatically removed from the suspension of the epidermis pieces by means of a tissue gripper and placed in a separate vessel. Epidermis and dermis tissues are now in separate vessels.
ZurAufbereitung der Epidermisschicht zu vereinzelten Keratinozytenwerden die Epidermisstückemit Hilfe eines Gewebefilters, welcher an der Unterseite eines automatisiertenPipettenkopfs angebracht ist, abgetrennt, indem die Suspension über denGewebefilter durch den Pipettenkopf abgesaugt wird, wobei die Epidermisstücke am Gewebefilter haftenbleiben. Die Erhöhungdes Lösungsvolumens durchdas Auffüllenmit Pufferlösungunmittelbar vor der Filtration verbessert die Ausbeute an Epidermis erheblich.toPreparation of the epidermis layer to isolated keratinocytesbecome the epidermis pieceswith the help of a fabric filter, which at the bottom of an automatedPipette head is attached, separated by placing the suspension over theSuction filter through the pipette head, the epidermis pieces adhere to the fabric filterstay. The increaseof the solution volumethe paddingwith buffer solutionimmediately before filtration significantly improves the yield of epidermis.
Anschließend werdendie am Gewebefilter festgehaltenen Epidermisstücke mittels Puffer (PBS) durchRückspülen desGewebefilters überden Pipettenkopf in ein weiteres Gefäß überführt und dort mit einer weiterenEnzymlösung(Trypsin/EDTA, 1 mL, 0,5%) versetzt. Das Trypsin bewirkt, dass sichdie Einzelzellen aus dem Gewebe verband der Epidermisstücke lösen. NachInkubation liegt (fürcirca 5 Minuten) eine Einzelzellsuspension aus Epidermiszellen vor.Then bethe epidermis pieces held on the tissue filter by means of buffer (PBS)Backwashing theFabric filter overtransferred the pipette head in another vessel and there with anotherenzyme solution(Trypsin / EDTA, 1 mL, 0.5%). The trypsin causes thatthe single cells from the tissue bandaged to release the epidermis pieces. ToIncubation is (forabout 5 minutes) a single cell suspension of epidermal cells.
NachAblauf der Inkubationszeit wird die Enzymreaktion des Trypsins durchZugabe von 10% FCS gestoppt. Da durch den optionalen Hackprozess bedingtschon kleine Epidermisstückevorliegen können,kann der im manuellen Verfahren üblicheSchritt der Homogenisierung der Gewebestücke vor der enzymatischen Behandlungausbleiben. Die dadurch erreichte reduzierte mechanische Belastungder Zellen und die Verkürzungder Inkubationszeit in Trypsin auf circa 5 min führen zu einer gesteigertenZellausbeute und Vitalitätim Vergleich zum konventionellen manuellen Prozess.ToExpiration of the incubation period, the enzyme reaction of trypsin byAddition of 10% FCS stopped. Because of the optional hacking processeven small epidermis piecescan be presentcan be the usual in the manual procedureStep of homogenizing the pieces of tissue prior to enzymatic treatmentfail. The resulting reduced mechanical stressof cells and shorteningincubation time in trypsin at about 5 min lead to an increasedCell yield and vitalitycompared to the conventional manual process.
ZurUnterstützungder Zellisolation wird die erhaltene Suspension in einem nachfolgenden Schrittgegebenenfalls fürca. 20 Sek. mechanisch durchmischt (Vortex). Zur Abtrennung voneventuell vorhandenen Geweberesten wird die Suspension zunächst über demGewebefilter mit 100 μmPorengröße, welchedie Einzelzellen passieren lässt,abgetrennt. Dazu wird an dem automatisierten Pipettenkopf ein zweiterdem Gewebefilter in Saugströmungsrichtungnachgeschalteter Einzelzellenfilter eingesetzt. Die Suspension wirdin den Pipettenkopf gesaugt, wodurch die in der Suspension gegebenenfallsnoch enthaltenen Gewebereste am Gewebefilter zurückgehalten und die Einzelzellenam nachgeschalteten Einzelzellenfilter festgehalten werden. Anschließend wirdder Gewebefilter zusammen mit den daran anhaftenden Geweberestenvon dem automatischen Pipettenkopf abgetrennt und gegebenenfalls verworfen.Die im Einzelzellenfilter im Pipettenkopf verbleibenden Einzelzellenwerden durch Rückspülen desEinzelzellenfilters aus dem Pipettenkopf gespült. Dazu wird auf den Pipettenkopfanstelle des Gewebefilters eine Pipetten spitze gesetzt und die Einzelzellendurch Rückspülen desEinzelzellenfilters in die Pipettenspitze verbracht. Optional wirddie Zellzahl in der Suspension bestimmt. Dazu wird ein Teil derEinzelzellsuspension aus der Pipettenspitze in eine Zellzählkammerdosiert und aus der in diesem Teilvolumen gefundenen Zellzahl aufdie Gesamtzellzahl in der Pipettenspitze geschlossen. Gegebenenfallswird durch Austausch der Suspendierlösung im Pipettenkopf in Abhängigkeitvon der gefundenen Zellzahl neues Medium zudosiert, sodass eineZellsuspension aus Epidermiszellen mit definierter Zellkonzentrationerhalten wird.tosupportthe cell isolation is the suspension obtained in a subsequent stepif necessary formechanically mixed (vortex) for approx. 20 sec. For the separation ofAny existing tissue residues, the suspension is initially above theTissue filter with 100 μmPore size, whichlet the single cells pass,separated. For this purpose, a second is added to the automated pipette headthe fabric filter in Saugströmungsrichtungused downstream single cell filter. The suspension willsucked into the pipette head, causing the suspension in the suspension if necessaryretained tissue remains retained on the tissue filter and the individual cellsbe held on the downstream single cell filter. Subsequently, willthe fabric filter together with the tissue remnants attached to itseparated from the automatic pipette head and optionally discarded.The individual cells remaining in the single-cell filter in the pipette headbe backwashed by theSingle cell filter rinsed from the pipette head. This is done on the pipette headinstead of the tissue filter a pipette tip set and the single cellsby backwashing theSingle cell filter spent in the pipette tip. Optional willdetermines the cell number in the suspension. This will be part ofSingle cell suspension from the pipette tip into a cell counting chamberdosed and from the number of cells found in this partial volumethe total number of cells in the pipette tip is closed. Possiblyis replaced by replacing the suspending solution in the pipette headdosed new medium from the number of cells found, so that aCell suspension of epidermis cells with defined cell concentrationis obtained.
ZurAufbereitung der Dermisschicht zu Fibroblasten wird die Dermisschichtin einer Kollagenaselösung(20 mL) füreinen Zeitraum von 1 bis 8 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellausbeuteist unter anderem abhängigvon der Inkubationsdauer. Mit zunehmender Inkubationsdauer steigtder Grad der Auflösungdes Dermisgewebes. Die Fibroblasten, die sich bei der Enzymbehandlungaus dem Gewebe herauslösen,werden durch analoge Filtrationsschritte mit Gewebefilter und Einzelzellenfilter,die optional mit dem automatisierten Pipettenkopf, wie vorstehendfür dieEpidermiszellen dargestellt, abgetrennt. Alternativ werden nichtaufgelösteDermisgewebeteile bevorzugt mittels eines automatisierten Greifers entnommen.Die Dermiszellen werden anschließend optional mittels des automatisiertenPipettenkopfs auf eine bestimmte Zellkonzentration eingestellt.toPreparation of the dermis layer to fibroblasts becomes the dermis layerin a collagenase solution(20 mL) forincubated for 1 to 8 hours at 37 ° C. The cell yielddepends among other thingsfrom the incubation period. With increasing incubation time increasesthe degree of dissolutionof the dermis tissue. The fibroblasts that are involved in the enzyme treatmentremove from the tissue,are determined by analogous filtration steps with tissue filters and single-cell filters,optional with the automated pipette head as abovefor theEpidermal cells shown, separated. Alternatively, notresolutionDermis tissue parts preferably removed by means of an automated gripper.The dermis cells are then optionally by means of the automatedPipette head set to a specific cell concentration.
Dasautomatisierte Verfahren ist so ausgelegt, dass es GMPkonform betriebenwerden kann. Die Modularitätder Einzelautomatisierungsschritte erlaubt eine hohe Flexibilität bezüglich deseingesetzten Gewebes und der gewünschtenAnwendung, einschließlichder Möglichkeiteinzelne Verarbeitungsschritte manuell auszuführen.Theautomated procedure is designed to operate GMP compliantcan be. The modularityThe individual automation steps allow a high degree of flexibility regarding theinserted tissue and the desiredApplication, includingThe possibilityto execute individual processing steps manually.
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
| R020 | Patent grant now final | Effective date:20110619 | |
| R119 | Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee |