DE102007025275A1 - Butenedioic acid or its derivatives for the treatment of a biological sample - Google Patents

Abstract

Translated fromGerman

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung einer biologischen Probe, umfassend das Bereitstellen einer biologischen Probe, und das Inkontaktbringen der biolgischen Probe mit Butendisäure oder mit einem Derivat der Butendisäure. Die Erfindung betrifft auch die durch dieses Verfahren erhältliche behandelte biologische Probe, die Verwendung von Butendisäure oder deren Derivaten, eine behandelte biologische Probe sowie ein Kit.The present invention relates to a method of treating a biological sample, comprising providing a biological sample, and contacting the biological sample with butenedioic acid or with a derivative of butenedioic acid. The invention also relates to the treated biological sample obtainable by this method, the use of butenedioic acid or its derivatives, a treated biological sample and a kit.

Description

Translated fromGerman

Gebiet der ErfindungField of the invention

Dievorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung einerbiologischen Probe, die durch dieses Verfahren erhältlichebehandelte biologische Probe, die Verwendung von Butendisäureoder von deren Derivaten, eine behandelte biologische Probe sowieein Kit.TheThe present invention relates to a method for treating abiological sample obtainable by this methodtreated biological sample, the use of butenedioic acidor their derivatives, a treated biological sample, as well asa kit.

Technischer HintergrundTechnical background

Esist seit langem bekannt, dass die genetische Herkunft und die funktionelleAktivität einer Zelle durch Studien ihrer Nukleinsäurenbestimmt und untersucht werden kann. Die Analysen der Nukleinsäurenund der Proteine ermöglichen direkte Rückschlüsseauf die Ursache der Aktivitäten von Zellen. Sie sind somitindirekten, konventionellen Methoden, wie zum Beispiel dem Nachweisvon Stoffwechselprodukten, potentiell überlegen. Daherist für die Zukunft mit einer noch starken Verbreitungvon Nukleinsäure- und Proteinanalysen zu rechnen. So werdenmolekularbiologische Analysen bereits in vielen Bereichen eingesetzt,zum Beispiel in der medizinischen und klinischen Diagnostik, inder Pharmazie, bei der Entwicklung und Evaluierung von Arzneimitteln,in der Lebensmittelanalytik sowie bei der Überwachung derLebensmittelherstellung, in der Agrarwirtschaft bei der Züchtungvon Nutzpflanzen und Nutztieren, in der Forensik, in der Umweltanalytiksowie in vielen anderen Forschungsgebieten.Ithas long been known that the genetic origin and the functionalActivity of a cell by studies of its nucleic acidscan be determined and investigated. The analyzes of nucleic acidsand the proteins allow direct conclusionson the cause of the activities of cells. They are thusindirect, conventional methods, such as detectionof metabolites, potentially superior. Thereforeis for the future with a still wide spreadto expect nucleic acid and protein analyzes. So bemolecular biological analyzes already used in many areas,for example in medical and clinical diagnostics, inpharmacy, in the development and evaluation of medicines,in food analysis and in the monitoring ofFood production, in agriculture in breedingof crops and livestock, in forensics, in environmental analysisas well as in many other research areas.

Durchdie Analyse der RNA, speziell der mRNA in Zellen, lassen sich dieAktivitäten von Genen direkt bestimmen. Die quantitativeAnalyse von Transkriptions mustern (mRNA-Mustern) in Zellen durchmoderne molekularbiologische Methoden, wie zum Beispiel Echtzeit-Reverse-Transkriptase-PCR(„Real time RT PCR") oder Genexpressions-Chip-Analysenermöglichen zum Beispiel die Erkennung fehlerhaft exprimierterGene, wodurch zum Beispiel Stoffwechselkrankheiten, Infektionenoder die Entstehung von Krebs erkannt werden können. DieAnalyse der DNA aus Zellen durch molekularbiologische Methoden wiezum Beispiel PCR, RFLP, AFLP oder durch Sequenzierung ermöglichtzum Beispiel den Nachweis genetischer Defekte oder die Bestimmungdes HLA-Typs sowie anderer genetischer Marker. Die Analyse genomischerDNA und RNA wird auch zum direkten Nachweis von infektiösenErregern, wie zum Beispiel Viren, Bakterien usw. eingesetzt.ByThe analysis of RNA, especially of mRNA in cells, can be theDetermine activities of genes directly. The quantitativeAnalysis of transcription patterns (mRNA patterns) in cellsmodern molecular biology methods, such as real-time reverse transcriptase PCR(Real time RT PCR) or gene expression chip analyzesallow, for example, the detection of incorrectly expressedGenes, causing, for example, metabolic diseases, infectionsor the emergence of cancer can be detected. TheAnalysis of DNA from cells by molecular biological methods such asfor example PCR, RFLP, AFLP or by sequencingfor example, the detection of genetic defects or the determinationof the HLA type as well as other genetic markers. The analysis of genomicDNA and RNA also become the direct detection of infectiousPathogens, such as viruses, bacteria, etc. used.

UnbedingteVoraussetzung für die Analyse von Biomolekülen,insbesondere von Nukleinsäuren und Proteinen, in biologischenProben ist jedoch die sofortige Stabilisierung der biologischenProbe, da sich gerade der Status (Genexpressionsprofil oder Proteinmuster)der für die molekularbiologische Untersuchung wichtigenBestandteile der frischen Proben bereits direkt nach der Entnahmeder Probe aus ihrer natürlichen Umgebung rapide verändernkann. Eine längere Lagerung der Proben in einem unbehandeltenZustand, z. B. bedingt durch einen ungewollt verzögertenTransport in ein Labor, kann eine molekularbiologische Analyse verfälschenoder diese gar gänzlich unmöglich machen. Auchweitere Biomoleküle wie z. B. Metabolite sowie die Morphologieeiner Probe können durch Lagerung in unbehandeltem Zustandnachteilig beeinflusst werden.unconditionalPrerequisite for the analysis of biomolecules,in particular of nucleic acids and proteins, in biologicalSamples, however, is the immediate stabilization of the biologicalSample because of the status (gene expression profile or protein pattern)the important for the molecular biological examinationComponents of the fresh samples already directly after removalto rapidly change the sample from its natural environmentcan. A longer storage of the samples in an untreatedState, z. B. due to an unintentionally delayedTransport to a laboratory can falsify molecular biological analysisor make them completely impossible. Alsoother biomolecules such. B. metabolites and morphologya sample can be stored by storage in the untreated statebe adversely affected.

Geradeder Nukleinsäure-Status einer biologischen Probe verändertsich umso stärker, je mehr Zeit zwischen der Entnahme derProbe und ihrer Analyse verstreicht. Besonders schnell erfolgt hierbeider Abbau der Ribonukleinsäuren (RNA) durch allgegenwärtigeRNasen. Ebenso kommt es neben dem Abbau von Nukleinsäurenauch zur Induktion von beispielsweise Stressgenen und damit zur Syntheseneuer mRNA-Moleküle, die das Transkriptmuster der Probeebenfalls stark verändern. Daher ist es erforderlich, zumErhalt des zu untersuchenden Genexpressionsprofils eine sofortigeStabilisierung der Probe durchzuführen. Das Gleiche gilt, wenneine tiefgefrorene biologische Probe zum Zwecke ihrer Untersuchungaufgetaut wird. Auch hier kommt es nach dem Auftauen zu einer raschenVeränderung des Nukleinsäure-Status, insbesonderedurch Abbau von Biomolekülen.Justthe nucleic acid status of a biological sample is changedThe more time between the removal of theProbe and its analysis elapses. Particularly fast happens herethe degradation of ribonucleic acids (RNA) by ubiquitousRNases. It also happens next to the degradation of nucleic acidsalso for the induction of, for example, stress genes and thus for synthesisnew mRNA molecules representing the transcript pattern of the samplealso change a lot. Therefore, it is necessary toObtaining the gene expression profile to be examined an immediateStabilization of the sample to perform. Same thing, thougha frozen biological sample for the purpose of its examinationthawed. Again, there is a rapid after thawingChange in nucleic acid status, in particularby degradation of biomolecules.

Nichtnur für die Analyse von Nukleinsäuren, sondernauch für detaillierte Untersuchungen des Proteoms einerbiologischen Probe ist eine sofortige Stabilisierung der Probe notwendig,da auch das Proteinmuster unmittelbar nach Entnahme der Probe verändertwird. Dies erfolgt zum einen durch Degradation bzw. Neusynthese,zum anderen aber besonders rasch durch Veränderungen derProteinmodifikationen, wie z. B. Phosphorylierung/Dephosphorylierung.Notonly for the analysis of nucleic acids, butalso for detailed investigations of the proteome of abiological sample requires immediate stabilization of the sample,since also the protein pattern changes immediately after taking the samplebecomes. This is done on the one hand by degradation or new synthesis,on the other hand, especially fast due to changes in theProtein modifications, such. B. phosphorylation / dephosphorylation.

Uminsbesondere das Expressionsmuster in der biologischen Probe zumZeitpunkt der Entnahme vollständig zu konservieren, mussdie Stabilisierung möglichst sofort nach der Zugabe derLösung einsetzen, ohne vorherige Vorbehandlungen der Probe.Für die Stabilisierung von Nukleinsäuren in kompaktenGewebeproben ergibt sich im Vergleich zu anderen biologischen Probeneine besondere Schwierigkeit. Gewebe sind, bezüglich ihrerZusammensetzung, ihrer Inhaltsstoffe sowie dem Aufbau vielschichtigund heterogen. Für die Stabilisierung von Nukleinsäurenin kompakten Gewebeproben muss sich die Wirkung des stabilisierendenReagenzes nicht nur an der Oberfläche der Zellen bzw. innerhalbeiner Zellschicht entfalten, sondern auch tief innerhalb des vielschichtigenProbenmaterials wirken. Zudem müssen häufig innerhalbein und derselben biologischen Probe sehr verschiedene Gewebe- und/oderZelltypen adressiert werden können, die sich beispielsweisein der Zellstruktur, dem Membranaufbau, den Kompartimentierungen undden Biomolekülen, beispielsweise hinsichtlich der Proteine,der Kohlenhydrate und/oder dem Fettgehalt, unterscheiden.In particular, in order to completely preserve the expression pattern in the biological sample at the time of sampling, the stabilization must begin as soon as possible after the addition of the solution, without prior pretreatment of the sample. For the stabilization of nucleic acids in compact tissue samples results in comparison to other biological samples a particular difficulty. Tissues are, bezüg their composition, their constituents and the structure complex and heterogeneous. For the stabilization of nucleic acids in compact tissue samples, the effect of the stabilizing reagent must not only unfold on the surface of the cells or within a cell layer, but also act deep within the multilayered sample material. In addition, very different tissue and / or cell types frequently have to be addressed within one and the same biological sample, for example in the cell structure, the membrane structure, the compartmentalizations and the biomolecules, for example with regard to the proteins, the carbohydrates and / or the fat content, differ.

ImLaufe der Jahre wurden eine Vielzahl von unterschiedlichsten Fixierungs-oder Stabilisierungsreagenzien bzw. Methoden zur Fixierung bzw.Stabilisierung entwickelt, um einen großen Bereich an verschiedenartigenbiologischen Proben zu fixieren bzw. stabilisieren.in theOver the years, a variety of different fixationor stabilizing reagents or methods for fixation orStabilization developed to a wide range of diverseto fix or stabilize biological samples.

Soist als eine Methode der Stabilisierung das Einfrieren biologischerProben seit langem bekannt. Dabei wird die Probe direkt nach derEntnahme aus ihrer natürlichen Umgebung bei –80°Cund tiefer, z. B in flüssigem Stickstoff, tiefgefroren.Die so behandelte Probe kann dann ohne Integritätsveränderungenbei etwa –70°C nahezu unbegrenzt gelagert werden.SoAs a method of stabilization, freezing is biologicalSamples have long been known. The sample is taken directly after theWithdrawal from its natural environment at -80 ° Cand deeper, z. B in liquid nitrogen, deep-frozen.The sample thus treated can then undergo no changes in integritybe stored almost indefinitely at about -70 ° C.

Beihistologischen Analysen müssen Gewebestrukturen sowie zelluläreund subzelluläre Strukturen in ihrem morphologischen Erscheinungsbildwährend der Lagerung erhalten bleiben. Bei Gewebeprobenist dabei die Fixierung mittels Formalin und gegebenenfalls dasanschließende Einbetten der fixierten Proben in Paraffinseit langem bekannt.athistological analyzes must include tissue structures as well as cellularand subcellular structures in their morphological appearancepreserved during storage. For tissue samplesis the fixation using formalin and optionally thesubsequent embedding of the fixed samples in paraffinknown for a long time.

Weiterebekannte Stabilisierungsverfahren umfassen den Einsatz bestimmterStabilisierungsreagenzien. Diese Stabilisierungsreagenzien umfassenbeispielsweise kationische Detergentien (US 5.010,184,US 5.300,545,WO-A-02/00599 undWO-A-02/00600),oder hochkonzentrierte Ammoniumsulfatlösungen (US 6,204,375).Other known stabilization methods include the use of certain stabilizing reagents. These stabilizing reagents include, for example, cationic detergents ( US 5,010,184 . US 5,300,545 . WO-A-02/00599 and WO-A-02/00600 ), or highly concentrated ammonium sulfate solutions ( US 6,204,375 ).

DerNachteil der aus dem Stand der Technik bekannten Stabilisierungsverfahrenbesteht jedoch darin, dass entweder die Stabilisierung von Biomolekülenwie etwa Nukleinsäuren in den biologischen Proben nur unbefriedigendund insbesondere die Ausbeute an diesen Biomolekülen ausden herkömmlich stabilisierten Proben häufig nurgering ist und/oder dass die Morphologie der Proben nicht in ausreichendemMaße erhalten bleibt.Of theDisadvantage of the known from the prior art stabilization methodhowever, is that either the stabilization of biomoleculessuch as nucleic acids in the biological samples only unsatisfactoryand in particular the yield of these biomoleculesThe commonly stabilized samples often onlyis low and / or that the morphology of the samples is insufficientDimensions are retained.

ImFalle der Stabilisierung durch Einfrieren kommt noch der Nachteilhinzu, dass dieses Stabilisierungsverfahren durchweg sehr aufwendige,logistische Voraussetzungen erfordert, da ein Auftauen der Probenwährend des Transports, der Lagerung oder währendder unterschiedlichsten An- bzw. Verwendungsprozesse verhindertwerden muss. Neben den zusätzlichen Kosten fürspezielle Probenaufnahmegefäße sowie fürdie permanente Kühlung der Proben, ist zudem der Einsatzvon flüssigem Stickstoff nicht nur sehr umständlich,sondern auch nur unter besonderen Vorsichtsmaßnahmen durchführbar.Darüber hinaus gestaltet sich eine nachfolgende Analysedes gefrorenen Probenmaterials, insbesondere einzelner Bestandteileder Probe, zumeist sehr schwierig. Zur Verringerung der Nachteilebeim Verarbeiten von gefrorenen Proben sind aus dem Stand der Techniksogenannte Transitionslösungen bekannt. Dabei wird zunächstdas gefrorene Gewebe in eine auf –70°C bis –80°Cvorgekühlte Lösungen überführtund anschließend darin für einige Stunden (mindestens16 Std.) bei etwa –20°C gelagert wird. Nachfolgendkann dann die mit der Transitionslösung durchtränkte Probenur für einen kurzen Zeitraum, beispielsweise maximal zumZerteilen der Probe, auf Arbeitstemperaturen von –4°Cbis zu Raumtemperatur erwärmt werden, ohne dass sich derNukleinsäurestatus der Probe verändert. Derartige,beispielsweise aus derWO-A-2004/72270 bekannteTransitionslösungen bestehen vornehmlich aus einwertigenAlkoholen.In the case of stabilization by freezing, there is the additional disadvantage that this stabilization method requires very complicated, logistical conditions, since thawing of the samples during transport, storage or during a wide variety of application or use processes must be prevented. In addition to the additional costs for special sample receptacles and for the permanent cooling of the samples, the use of liquid nitrogen is not only very cumbersome, but only under special precautions feasible. In addition, a subsequent analysis of the frozen sample material, in particular individual components of the sample, usually very difficult. To reduce the disadvantages of processing frozen samples, so-called transition solutions are known from the prior art. First, the frozen tissue is transferred into a pre-cooled to -70 ° C to -80 ° C solutions and then stored therein for a few hours (at least 16 hours) at about -20 ° C. Subsequently, the sample impregnated with the transition solution can then be heated to working temperatures of -4 ° C. up to room temperature for only a short period of time, for example at most for dividing the sample, without the nucleic acid status of the sample changing. Such, for example from the WO-A-2004/72270 known transition solutions consist primarily of monohydric alcohols.

Dervorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die sich aus demStand der Technik ergebenden Nachteile zu überwinden.Of thePresent invention was based on the object resulting from theOvercome prior art disadvantages.

Insbesonderelag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahrenzur Behandlung einer biologischen Probe, vorzugsweise zur Stabilisierungeiner biologischen Probe, anzugeben, mit dem Biomoleküle,insbesondere Nukleinsäuren, Proteine und Metaboliten, inder biologischen Probe besser stabilisiert werden können.Dabei sollte im Vergleich zu den herkömmlichen Stabilisierungsverfahrendie Menge an isolierbaren Biomolekülen erhöhtund/oder die Qualität der Biomoleküle, welcheim Falle von Nukleinsäuren beispielsweise durch Gel-Analyseoder durch die Anzahl der PCR-Zyklen bis zum Erreichen einer bestimmtenNukleinsäuremenge bestimmt werden kann, verbessert werden.Auch die Morphologie der biologischen Probe sollte durch das Stabilisierungsverfahrengut erhalten bleiben.Especiallythe present invention was based on the object, a methodfor the treatment of a biological sample, preferably for stabilizationa biological sample, indicate with the biomolecules,in particular nucleic acids, proteins and metabolites, inthe biological sample can be stabilized better.This should be compared to the conventional stabilization methodincreases the amount of isolatable biomoleculesand / or the quality of the biomolecules whichin the case of nucleic acids, for example by gel analysisor by the number of PCR cycles until reaching a certainNucleic acid amount can be determined to be improved.Also, the morphology of the biological sample should be confirmed by the stabilization methodto be well preserved.

Darüberhinaus lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, einVerfahren zur Stabilisierung einer biologischen Probe anzugeben,mit dem sowohl gefrorene als auch frische biologische Proben beimöglichst moderaten Temperaturbedingungen, beispielsweiseauch bei Raumtemperatur, ohne Beeinträchtigung des Expressionsprofilsoder des Proteoms der biologischen Probe stabilisiert werden können.About thatIn addition, the present invention was the object of aSpecify method for stabilizing a biological samplewith both frozen and fresh biological samplesas moderate temperature conditions, for exampleeven at room temperature, without affecting the expression profileor the proteome of the biological sample can be stabilized.

Weiterhinsollte das Verfahren zur Behandlung, vorzugsweise zur Stabilisierungeiner biologischen Probe zu einer behandelten, vorzugsweise stabilisiertenbiologischen Probe führen, die nicht nur bei moderatenTemperaturen, beispielsweise bei Raumtemperatur, analysiert werdenkann, sondern gegebenenfalls vor oder nach einer solchen Analysefür möglichst lange Zeit bei solchen moderatenTemperaturbedingungen gelagert werden kann.FartherThe method should be for treatment, preferably for stabilizationa biological sample to a treated, preferably stabilizedlead to a biological sample that is not only moderateTemperatures, for example, at room temperature, to be analyzedbut, if necessary, before or after such an analysisfor as long as possible at such moderateTemperature conditions can be stored.

ImFalle von Biomolekülen soll dabei unter dem Begriff „Stabilisierung"vorzugsweise die Hemmung des Abbaus, der Modifikation, der Induktionoder der Änderung der Aktivität von Biomolekülenverstanden werden. Im Falle von histo logischen Analysen der biologischenProben soll unter dem Begriff „Stabilisierung" vorzugsweisedas Verhindern einer wesentlichen Änderung der Morphologieder Proben verstanden werden.in theCase of biomolecules is to be understood by the term "stabilization"Preferably inhibition of degradation, modification, inductionor altering the activity of biomoleculesbe understood. In the case of histo logical analyzes of biologicalSamples should preferably under the term "stabilization"preventing a significant change in morphologythe samples are understood.

EinenBeitrag zur Lösung der Eingangs genannten Aufgaben leistetein Verfahren zur Behandlung einer biologischen Probe, umfassenddie Verfahrensschritte

• i) Bereitstellen einerbiologischen Probe, und
• ii) in Kontakt bringen der biologischen Probe mit Butendisäureoder mit einem Derivat der Butendisäure.

A contribution to the solution of the abovementioned objects is provided by a method for the treatment of a biological sample, comprising the method steps

• i) providing a biological sample, and
• ii) contacting the biological sample with butenedioic acid or with a derivative of butenedioic acid.

Butendisäureliegt in zwei verschiedenen sterischen Konformationen vor, nämlichals trans-Butendisäure, die auch als Fumarsäurebezeichnet wird, und als cis-Buteindisäure, die auch alsMaleinsäure bezeichnet wird. Die Strukturformeln der beidenKonformationen sehen wie folgt aus.butenedioicexists in two different steric conformations, vizas trans-butenedioic acid, also called fumaric acidand as cis-butenedioic acid, also known asMaleic acid is called. The structural formulas of the twoConformations look like this.

Überraschendwurde festgestellt, dass sich durch das in Kontakt bringen einerbiologischen Probe mit Butendisäure oder mit deren Derivaten,insbesondere mit Fumarsäure, Maleinsäure sowiederen Derivaten, insbesondere den Maleimiden, Biomolekülewie etwa Nukleinsäuren in der biologischen Probe besserstabilisie ren lassen. Dabei können die Butendisäureoder deren Derivate als Additiv auch herkömmlichen Stabilisierungs-bzw. Fixierungszusammensetzungen zugesetzt werden. Die Zusammensetzungenmit diesem Additiv zeichnen sich im Vergleich zu den Zusammensetzungenohne das Additiv durch ein besseres Stabilisierungsvermögenvon Biomolekülen in einer biologischen Probe, insbesonderedurch ein verbessertes Stabilisierungsvermögen fürNukleinsäuren, aus.SurprisedIt was found that by contacting abiological sample with butenedioic acid or its derivatives,especially with fumaric acid, maleic acid as welltheir derivatives, in particular the maleimides, biomoleculessuch as nucleic acids in the biological sample betterstabilize. In this case, the butenedioic acidor their derivatives as an additive also conventional stabilizationor fixative compositions. The compositionswith this additive are distinguished in comparison to the compositionswithout the additive due to a better stabilizing powerof biomolecules in a biological sample, in particularby an improved stabilizing power forNucleic acids, from.

DieDerivate der Maleinsäure weisen vorzugsweise die Struktur(III)

auf, in der X

• a) ein Sauerstoffatom,
• b) eine Gruppe der Struktur (IV)
  
• c) oder eine Gruppe NR¹ ist, wobeiR¹
• – ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierterAlkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis4 Kohlenstoffatomen und besonderes bevorzugt mit 1 bis 3 Koh lenstoffatomen,beispielsweise mit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen,
• – ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierterAryl-Rest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 6,7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Kohlenstoffatomen,
• – ein COOR³-Rest, in dem R³ ein Wasserstoffatome oder ein Alkyl-Restmit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomenund besonderes bevorzugt mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielsweisemit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen ist,
• – ein Wasserstoffatom oder
• – ein NR⁴R⁵-Restist, in dem R⁴ und R⁵ einWasserstoffatom, ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierterAlkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis4 Kohlenstoffatomen und besonderes bevorzugt mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen,beispielsweise mit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen oder eingegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter Aryl-Restmit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 6, 7, 8, 9, 10,11 oder 12 Kohlenstoffatomen ist, und wobei R²
• – ein Wasserstoffatom,
• – ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierterAlkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis4 Kohlenstoffatomen und besonderes bevorzugt mit 1 bis 3 Koh lenstoffatomen,beispielsweise mit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, oder
• – ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierterAryl-Rest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 6,7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Kohlenstoffatomen, ist.

The derivatives of maleic acid preferably have the structure (III)

on, in the X

• a) an oxygen atom,
• b) a group of structure (IV)
  
• c) or a group NR¹ , where R¹
• An optionally nitrogen or halogen-substituted alkyl radical having 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms and more preferably 1 to 3 carbon atoms, for example 1, 2, 3, 4, 5 or 6 carbon atoms,
• An optionally nitrogen or halogen-substituted aryl radical having 6 to 12 carbon atoms, for example having 6, 7, 8, 9, 10, 11 or 12 carbon atoms,
• A COOR³ radical in which R^{3 is} a hydrogen atom or an alkyl radical having 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms and more preferably 1 to 3 carbon atoms, for example 1, 2, 3, 4, 5 or 6 carbon atoms,
• A hydrogen atom or
• An NR⁴ R⁵ radical in which R⁴ and R^{5 are} a hydrogen atom, an optionally nitrogen or halogen-substituted alkyl radical having 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms and more preferably 1 to 3 carbon atoms, for example, with 1, 2, 3, 4, 5 or 6 carbon atoms or an optionally nitrogen or halogen-substituted aryl radical having 6 to 12 carbon atoms, for example with 6, 7, 8, 9, 10, 11 or 12 carbon atoms, and wherein R²
• A hydrogen atom,
• An optionally nitrogen or halogen-substituted alkyl radical having 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms, and more preferably 1 to 3 carbon atoms, for example 1, 2, 3, 4, 5 or 6 carbon atoms, or
• - An optionally substituted nitrogen or halogen aryl radical having 6 to 12 carbon atoms, for example, with 6, 7, 8, 9, 10, 11 or 12 carbon atoms, is.

BevorzugteVerbindungen der Struktur (III) sind insbesondere Verbindungen ausgewähltaus den nachfolgenden Strukturen (V), (VI) und (VII):

Preferred compounds of structure (III) are, in particular, compounds selected from the following structures (V), (VI) and (VII):

Beidiesen Verbindungen handelt es sich vorzugsweise um Maleinsäureanhydride(III), Maleimide (IV) und Ester der Maleinsäure (VII).Hinzu kommt, als ebenfalls unter die erste Definition fallendesAgens, Fumarsäure (I).atthese compounds are preferably maleic anhydrides(III), maleimides (IV) and esters of maleic acid (VII).In addition, as also falling under the first definitionAgent, fumaric acid (I).

Beider im Verfahrensschritt i) bereitgestellten biologischen Probekann es sich um eine gefrorene oder um eine nicht gefrorene biologischeProbe handeln, wobei als biologische Probe alle dem Fachmann bekanntenbiologischen Proben eingesetzt werden können. Bevorzugtebiologische Proben sind ausgewählt aus der Gruppe umfassendBiomoleküle, beispielsweise natürliche, vorzugsweiseisolierte lineare, verzweigte oder zirkuläre Nukleinsäurenwie RNA, insbesondere mRNA, siRNA, miRNA, snRNA, tRNA, hnRNA oderRibozyme, DNA und dergleichen, synthetische oder modifizierte Nukleinsäuren,beispielsweise Oligonukleotide, insbesondere für die PCRverwendete Primer, Sonden oder Standards, mit Digoxigenin, Biotinoder Fluoreszensfarbstoffen markierte Nukleinsäuren odersogenannte PNAs („peptide nucleic acids"), natürliche,vorzugsweise isolierte Proteine oder Oligopeptide, synthetischeoder modifizierte Proteine oder Oligopeptide, beispielsweise mitFluoreszenzmarkern oder Enzymen gekoppelte Antikörper,Hormone, Stoffwechselprodukte und Metaboliten, Wachstumsfaktoren,Lipide, Oligosaccharide, Polysaccharide, Proteoglukane, Körperflüssigkeitenwie Blut, Sperma, Cerebrospinalflüssigkeit, Speichel, Sputum,Crusta Phlogistica oder Urin, Flüssigkeiten, welche beimAufarbeiten von Blut erhalten werden, wie etwa Serum oder Plasma,Leukozyten-Fraktionen oder „buffy coat", Blutegelspeichel(Saliva), Fäkalien, Abstriche, Punktate, Schuppen, Haare,Hautfragmente, forensische Proben, Lebensmittel- oder Umweltproben,die freie oder gebundene Biomoleküle, insbesondere freieoder gebundene Nukleinsäuren enthalten, Stoffwechselprodukte,ganze Organismen, vorzugsweise ganze nicht lebende Organismen, Gewebevon Mehrzellern, vorzugsweise von Insekten und Säugetieren,insbesondere vom Menschen, beispielsweise in Form von Gewebeschnittenoder -fragmenten oder Organen, isolierte Zellen, beispielsweisein Form adhärenter oder suspendierter Zellkulturen, Organellen,beispielsweise Chloroplasten oder Mitochondrien, Vesikel, Zellkerneoder Chromosomen, Pflanzen, Pflanzenteile, Pflanzengewebe oder Pflanzenzellen,Bakterien, Viren, Viroide, Prionen, Hefen und Pilze.The biological sample provided in method step i) can be a frozen or non-frozen biological sample, it being possible to use as biological sample all biological samples known to the person skilled in the art. Preferred biological samples are selected from the group comprising biomolecules, for example natural, preferably isolated, linear, branched or circular nucleic acids such as RNA, in particular mRNA, siRNA, miRNA, snRNA, tRNA, hnRNA or ribozymes, DNA and the like, synthetic or modified nucleic acids, for example Oligonucleotides, in particular primers, probes or standards used for the PCR, nucleic acids labeled with digoxigenin, biotin or fluorescent dyes or so-called peptide nucleic acids, natural, preferably isolated proteins or oligopeptides, synthetic or modified proteins or oligopeptides, for example with fluorescent markers or enzymes coupled antibodies, hormones, metabolites and metabolites, growth factors, lipids, oligosaccharides, polysaccharides, proteoglucans, body fluids such as blood, sperm, cerebrospinal fluid, saliva, sputum, Crusta phlogistica or urine, liquid which ones in the reprocessing of blood, such as serum or plasma, leukocyte fractions or "buffy coat", leech saliva, feces, smears, punctates, dandruff, hair, skin fragments, forensic samples, food or environmental samples, the free or bound biomolecules, in particular free or bound nucleic acids, metabolites, whole organisms, preferably whole non-living organisms, tissues of multicellulars, preferably of insects and mammals, in particular of humans, for example in the form of tissue sections or fragments or organs, isolated cells, for example in the form of adherent or suspended cell cultures, organelles, for example chloroplasts or mitochondria, vesicles, cell nuclei or chromosomes, plants, plant parts, plant tissues or plant cells, bacteria, viruses, viroids, prions, yeasts and fungi.

Alseine nichtgefrorene biologische Probe wird im Verfahrensschritti) des erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweiseeine frisch hergestellte biologische Probe eingesetzt, beispielsweiseeine frische Gewebeprobe oder frisch isolierte Blut zellen aus einemlebendigen oder toten Organismus oder, im Falle synthetischer Biomoleküleals biologische Probe, frisch synthetisierte Nukleinsäurenoder Proteine. Unter einer „frischen" biologischen Probewird dabei erfindungsgemäß vorzugsweise eine Probeverstanden, die, bevor sie mit der Butendisäure oder mitderen Derivat im Verfahrensschritt ii) in Kontakt gebracht wird,vor nicht mehr als 96 Stunden, vorzugsweise vor nicht mehr als 48Stunden, besonders bevorzugt vor nicht mehr als 24 Stunden, darüber hinausbevorzugt vor nicht mehr als 10 Stunden, darüber hinausnoch mehr bevorzugt vor nicht mehr als 60 Minuten und am meistenbevorzugt vor nicht mehr als 10 Minuten entnommen oder, im Falleeines synthetischen Biomoleküls, synthetisiert worden ist.Die Bezeichnung „frische" biologische Probe umfasst jedochauch solche Proben, die innerhalb der vorstehend genannten Zeiträumeentnommen worden sind, die jedoch vor dem in Kontakt bringen mitder Butendisäure oder mit deren Derivat noch vorbehandeltworden sind, beispielsweise mit herkömmlichen Fixativen,wie etwa Formalin, mit Farbstoffen, wie etwa Eosin, mit Antikörpernund dergleichen. Die Herstellung frischer Zell- oder Gewebeprobenkann dabei durch alle dem Fachmann zu diesem Zweck bekannten Präparationsverfahrenerfolgen, im Falle einer Gewebeprobe beispielsweise mittels einesSkalpells, etwa bei einer Operation oder einer Autopsie, im Falleeiner Blutzellprobe durch Zentrifugation von frisch entnommenemBlut und dergleichen. Im Falle eines Einsatzes einer frischen biologischenProbe dient die Butendisäure oder deren Derivat, bzw. eineZusammensetzung, welche diese Verbindung als Additiv umfasst, inerster Linie als Stabilisierungsreagenz bzw. als Stabilisierungszusammensetzung.Whena non-frozen biological sample is in the process stepi) of the process according to the invention preferablya freshly prepared biological sample used, for examplea fresh tissue sample or freshly isolated blood cells from oneliving or dead organism or, in the case of synthetic biomoleculesas a biological sample, freshly synthesized nucleic acidsor proteins. Under a "fresh" biological sampleis inventively preferably a sampleunderstood that before using the butenedioic acid or withwhose derivative is brought into contact in process step ii),not more than 96 hours, preferably not more than 48Hours, more preferably not more than 24 hours, beyondpreferably not more than 10 hours ago, beyondeven more preferably not more than 60 minutes and mostpreferably removed not more than 10 minutes ago or, in the casea synthetic biomolecule, has been synthesized.However, the term "fresh" biological sample includesalso such samples within the aforementioned periodstaken, however, before contacting withthe butenedioic acid or with their derivative pretreatedhave been used, for example, with conventional fixatives,such as formalin, with dyes, such as eosin, with antibodiesand the same. The production of fresh cell or tissue samplescan by all known to the expert for this purpose preparation methodtake place, in the case of a tissue sample, for example by means of aScalpels, such as during surgery or autopsy, in the casea blood cell sample by centrifugation of freshly removedBlood and the like. In case of use of a fresh biologicalProbe serves the butenedioic acid or its derivative, or aComposition comprising this compound as an additive, inprimarily as a stabilizing reagent or as a stabilizing composition.

Alseine gefrorene biologische Probe wird im Verfahrensschritt i) deserfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise einebiologische Probe eingesetzt, die, nachdem sie beispielsweise aufdie zuvor beschriebene Art und Weise isoliert worden ist, vor demin Kontakt bringen mit der Butendisäure oder mit derenDerivat im Verfahrensschritt ii) zunächst auf Temperaturenvon 0°C oder weniger, vorzugs weise auf Temperaturen von –20°Coder weniger und am meisten bevorzugt auf Temperaturen von –70°Coder weniger, etwa durch das in Kontakt bringen mit flüssigemStickstoff, abgekühlt worden ist. Wird eine auf diese Weiseeingefrorene biologische Probe im erfindungsgemäßenVerfahren eingesetzt, so dient die Butendisäure oder derenDerivat bzw. eine Zusammensetzung, welche diese Verbindung als Additivumfasst, in erster Linie als Transitionsreagenz bzw. als Transitionszusammensetzung.Whena frozen biological sample is added in step i) of theinventive method preferably oneused biological sample, which, for example, afterthe previously described manner has been isolated beforein contact with the butenedioic acid or with itsDerivative in process step ii) initially to temperaturesof 0 ° C or less, preferably at temperatures of -20 ° Cor less, and most preferably to temperatures of -70 ° Cor less, such as by contacting it with liquidNitrogen, has been cooled. Will one be that wayfrozen biological sample in the inventionUsed method, so the butenedioic acid or itsDerivative or a composition containing this compound as an additivecomprises, primarily as a transition reagent or as a transition composition.

ImVerfahrensschritt i) wird die biologische Probe mit Butendisäureoder mit deren Derivat, vorzugsweise mit einer Verbindung der StrukturIII, in Kontakt gebracht.in theProcess step i) is the biological sample with butenedioic acidor with their derivative, preferably with a compound of the structureIII, brought into contact.

Wennes sich bei der Gruppe -X- um eine NR¹-Gruppehandelt, so kann es sich bei dem Rest R¹ dieser Verbindungder Struktur III, neben einem Wasserstoffatom, um einen gegebenenfallsStickstoff oder Halogen substituierter Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomenhandeln. Die Formulierung „Stickstoff substituierter Alkyl-Rest"soll erfindungsgemäß diejenigen Alkyl-Reste umfassen,in denen ein oder mehrere Wasserstoffatome durch NH₂-Rest,NHR-Reste oder NR₂-Reste, in denen R vorzugsweiseein Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugtein Methyl-Rest oder ein Ethyl-Rest ist, substituiert ist. Die Formulierung „Halogensubstituierter Alkyl-Rest" soll demnach erfindungsgemäß diejenigenAlkyl-Reste umfassen, in denen ein oder mehrere Wasserstoffatomedurch ein Halogenatom, vorzugsweise durch Fluor, Chlor, Brom oderIod, besonders bevorzugt durch Fluor oder Chlor, substituiert ist/sind.If the group -X- is an NR¹ group, the radical R^{1 of} this compound of structure III, in addition to a hydrogen atom, may be an optionally nitrogen or halogen-substituted alkyl radical having 1 to 6 Carbon atoms act. The term "nitrogen-substituted alkyl radical" is intended according to the invention to include those alkyl radicals in which one or more hydrogen atoms by NH₂ radical, NHR radicals or NR₂ radicals, in which R is preferably an alkyl radical having 1 to 6 According to the invention, the term "halogen-substituted alkyl radical" is intended to include those alkyl radicals in which one or more hydrogen atoms are substituted by a halogen atom, preferably by fluorine, Chloro, bromo or iodo, more preferably substituted by fluorine or chlorine, is / are.

Besondersbevorzugte Alkyl-Reste Reste R¹ sind ausgewähltaus der Gruppe umfassend
-CH₃,
-CH₂CH₃,
-CH₂CH₂CH₃,
-CH(CH₃)₂,
-CH₂Cl, -CHCl₂,
-CCl₃,
-CH₂CH₂Cl,
-CHClCH₃,
-CH₂NH₂ und
-CH₂CH₂NH₂,
wobei-CH₃ und -CH₂CH₃ am meisten bevorzugt sind.Particularly preferred alkyl radicals radicals R¹ are selected from the group comprising
-CH₃ ,
-CH₂ CH₃ ,
-CH₂ CH₂ CH₃ ,
-CH (CH₃ )₂ ,
-CH₂ Cl, -CHCl₂ ,
CCI₃ ,
-CH₂ CH₂ Cl,
-CHClCH₃ ,
-CH₂ NH₂ and
-CH₂ CH₂ NH₂ ,
wherein -CH₃ and -CH₂ CH_{3 are} most preferred.

Weiterhinkann es sich bei dem Rest R¹ um einen gegebenenfallsStickstoff oder Halogen substituierter Aryl-Rest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomenhandeln. Auch hier hat die Formulierung „Stickstoff oderHalogen substituierter Aryl-Rest" die vorstehend im Zusammenhangmit dem Alkylrest beschriebene Bedeutung.Furthermore, the radical R^{1 may} be an optionally nitrogen or halogen-substituted aryl radical having 6 to 12 carbon atoms. Again, the phrase "nitrogen or halogen substituted aryl radical" has the meaning described above in connection with the alkyl radical.

Besondersbevorzugte Aryl-Reste sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend
-C₆H₅ (Phenyl-Rest),
-C₆H₄Cl,
-CH₂-C₆H₅ (Benzyl-Rest),
-CH₂-C₆H₄Cl,
-C₁₀H₇ (Naphthyl-Rest)und
-C₁₀H₆Cl,
wobeider Phenyl-Rest am meisten bevorzugt ist.Particularly preferred aryl radicals are selected from the group comprising
-C₆ H₅ (phenyl radical),
-C₆ H₄ Cl,
-CH₂ -C₆ H₅ (benzyl radical),
-CH₂ -C₆ H₄ Cl,
-C₁₀ H₇ (naphthyl radical) and
-C₁₀ H₆ Cl,
the phenyl radical being most preferred.

Auchkann es sich bei dem R¹ um einen COOR³-Rest handeln, wobei R³ einWasserstoffatom oder ein Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und besonderes bevorzugtmit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 1, 2, 3, 4, 5oder 6 Kohlenstoffatomen ist.Also, R^{1 may} be a COOR³ radical, where R^{3 is} a hydrogen atom or an alkyl radical having 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms and more preferably 1 to 3 carbon atoms, for example 1 , 2, 3, 4, 5 or 6 carbon atoms.

Besondersbevorzugte COOR₃-Reste sind ausgewähltaus der Gruppe umfassend
-COOH,
-COOCH₃,und
-COOCH₂H₃,
wobeider Rest -COOH am meisten bevorzugt ist.Particularly preferred COOR₃ radicals are selected from the group comprising
COOH,
-COOCH₃ , and
-COOCH₂ H₃ ,
wherein the radical -COOH is most preferred.

Schließlichkann es sich bei dem Rest R¹ auch um einen-NR⁴R⁵-Rest handeln,in dem R⁴ und R⁵ ein Wasserstoffatom,ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter Alkyl-Restmit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder ein gegebenenfalls Stickstoffoder Halogen substituierter Aryl-Rest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomenist, wobei die Formulierung „Stickstoff oder Kohlenstoffsubstituierter Alkyl-Rest" bzw. „Stickstoff oder Halogensubstituierter Aryl-Rest" die vorstehend genannte Bedeutung hat.Finally, the radical R^{1 can} also be a -NR⁴ R⁵ radical in which R⁴ and R^{5 are} a hydrogen atom, an optionally nitrogen or halogen-substituted alkyl radical having 1 to 6 carbon atoms or an optionally nitrogen or Is halogen-substituted aryl radical having 6 to 12 carbon atoms, wherein the formulation "nitrogen or carbon-substituted alkyl radical" or "nitrogen or halogen-substituted aryl radical" has the abovementioned meaning.

Besondersbevorzugte -NR⁴R⁵-Rest-Restesind ausgewählt aus der Gruppe umfassend
-NH₂,
-HCH₃,
-N(CH₃)₂,
-NH(CH₂CH₃), und
-N(CH₂CH₃)₂,
wobeider Rest NH₂ am meisten bevorzugt ist.Particularly preferred -NR⁴ R⁵ radical radicals are selected from the group comprising
-NH₂ ,
-HCH₃ ,
-N (CH₃ )₂ ,
-NH (CH₂ CH₃ ), and
-N (CH₂ CH₃ )₂ ,
wherein the radical NH_{2 is} most preferred.

Beidem Rest R² in der Struktur III sowie inden Strukturen IV, V, VI und VII kann es sich, neben einem Wasserstoffatom,um einen gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierten Alkyl-Restmit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen handeln, wobei die Formulierung „Stickstoffoder Halogen substituierten Alkyl-Rest" die vorstehend genannteBedeutung hat und bevorzugte Alkyl-Reste R² diejenigenAlkyl-Reste sind, die bereits im Zusammenhang mit dem Rest R¹ als bevorzugte Alkyl-Reste genannt wurden.Auch kann es sich bei dem Rest R² in derStruktur III sowie in den Strukturen IV, V, VI und VII um einengegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter Aryl-Restmit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 6, 7, 8, 9, 10,11 oder 12 Kohlenstoffatomen, handeln. Grundsätzlich könnendie Reste R² in den Strukturen III bis VIIgleich oder verschieden sein.The radical R² in the structure III as well as in the structures IV, V, VI and VII may, in addition to a hydrogen atom, be an optionally nitrogen or halogen-substituted alkyl radical having 1 to 6 carbon atoms, wherein the formulation "nitrogen or halogen-substituted alkyl radical "has the abovementioned meaning and preferred alkyl radicals R^{2 are} those alkyl radicals which have already been mentioned as preferred alkyl radicals in connection with the radical R^1. The radical R may also be mentioned² in the structure III and in the structures IV, V, VI and VII to an optionally nitrogen or halogen-substituted aryl radical having 6 to 12 carbon atoms, for example with 6, 7, 8, 9, 10, 11 or 12 carbon atoms act In principle, the radicals R² in the structures III to VII may be identical or different.

Erfindungsgemäß ammeisten bevorzugte Verbindungen der Struktur III sind ausgewähltaus der Gruppe umfassend Maleinsäureanhydrid, Maleimid,Methylmaleimid und Ethylmaleimid, wobei Methylmaleimid und Ethylmaleimidam meisten bevorzugte Derivate der Maleinsäure sind.According to the inventionMost preferred compounds of structure III are selectedfrom the group comprising maleic anhydride, maleimide,Methylmaleimide and ethylmaleimide, wherein methylmaleimide and ethylmaleimidemost preferred derivatives of maleic acid.

Gemäß einerbesonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßenVerfahrens wird die Butendisäure oder wird deren Derivatals solche bzw. als solches, also ohne weitere feste oder flüssigeBestandteile, mit der biologischen Probe in Kontakt gebracht. DieseVorgehensweise kann insbesondere dann vorteilhaft sein, wenn eineflüssige biologische Probe behandelt werden soll. In diesemFall kann die Butendisäure oder deren Derivat in geeigneterMenge in der biologischen Probe gelöst oder dispergiert,vorzugsweise gelöst sein, wobei die Konzentration der Butendisäureoder des Derivates der Butendisäure in der flüssigenbiologischen Probe nach dem in Kontakt bringen mit derselben biszur Sättigungskonzentration der Butendisäure oderdes Derivates der Butendisäure in der jeweiligen Zusammensetzungreichen kann, vorzugsweise jedoch in einem Bereich von 0,1 mMolbis 10 Mol/l, besonders bevorzugt von 10 mMol/l bis 5 Mol/l undam meisten bevorzugt von 100 mMol/l bis 1 Mol/l liegt. Im Falleeiner festen biologischen Probe kann die feste Probe auch in derfesten Butendisäure oder deren Derivat eingelegt werden.According to a particular embodiment of the process according to the invention, the butenedioic acid or its derivative as such or as such, ie without further solid or liquid constituents, is brought into contact with the biological sample. This procedure can be particularly advantageous when a liquid biological sample is to be treated. In this case, the butenedioic acid or its derivative may be dissolved or dispersed in a suitable amount in the biological sample, preferably dissolved, wherein the concentration of the butenedioic acid or the derivative of the butenedioic acid in the liquid biological sample after contacting with it to the saturation concentration of Butenedioic acid or the derivative of butenedioic acid in the respective composition, but preferably in a range of from 0.1 mmol to 10 mol / l, more preferably from 10 mmol / l to 5 mol / l, and most preferably from 100 mmol / l to 1 mol / l. In the case of a solid biological sample, the solid sample may also be loaded in the solid butenedioic acid or its derivative.

Gemäß eineranderen besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßenVerfahrens wird jedoch die Butendisäure oder deren Derivatnicht alleine, sondern in Form eines in einer Zusammensetzung enthaltenenAdditivs mit der biologischen Probe in Kontakt gebracht.According to oneanother particular embodiment of the inventionHowever, the method is the butenedioic acid or its derivativenot alone, but in the form of one contained in a compositionAdditive brought into contact with the biological sample.

Indiesem Zusammenhang ist es bevorzugt, dass die Zusammensetzung nebender Butendisäure oder deren Derivat mindestens eine weitereKomponente ausgewählt aus einem Lösungsmittel,einem Zusatzstoff oder einer Mischung hieraus umfasst.InIn this context, it is preferred that the composition is adjacentthe butenedioic acid or its derivative at least one moreComponent selected from a solvent,an additive or a mixture thereof.

Beidem Lösungsmittel, welches gegebenenfalls in der Zusammensetzungenthalten sein kann, kann es sich um jedes Lösungsmittelhandeln, einschließlich Lösemittel welche üblicherweisein Zusammensetzungen zur Behandlung, insbesondere zur Stabilisierungbiologischer Proben enthalten sind. Vorzugsweise handelt es sichbei dem Lösungsmittel um ein Lösungsmittel ausgewähltaus der Gruppe umfassend Wasser, einwertige Alkohole (Monoole),mehrwertige Alkohole, Aldehyde, Ketone, Dimethylsulfoxid, aromatischeKohlenwasserstoffe, halogenierte Kohlenwasserstoffe, Etter, Carbonsäuren,Carbonsäureamide, Nitrile, Nitroalkane, Ester oder Mischungenaus mindestens zwei dieser Lösungsmittel.atthe solvent optionally in the compositioncan be contained, it can be any solventAct, including solvents which usuallyin compositions for treatment, in particular for stabilizationbiological samples are included. It is preferablethe solvent is a solventfrom the group comprising water, monohydric alcohols (monools),polyhydric alcohols, aldehydes, ketones, dimethyl sulfoxide, aromaticHydrocarbons, halogenated hydrocarbons, ethers, carboxylic acids,Carboxylic acid amides, nitriles, nitroalkanes, esters or mixturesfrom at least two of these solvents.

Unterdiesen Lösungsmitteln besonders bevorzugt sind insbesondereLösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe umfassendWasser, Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, 1,2-Propandiol,1,3-Propandiol, 1,2-Butandiol, 1,3-Butandiol, 1,4-Butandiol, 1,5-Pentandiol,2,4-Pentandiol, Ethylenglykol, Propylenglykol, Diethylenglykol,Dipropylenglykol, Triethylenglykol, Tripropylenglykol, 1,2,3-Propantriol,1,2,6-Hexantriol, 3-Methyl-1,3,5-Pentan-triol, 1,2,4-Butantriol,Acetonitril, Aceton, Anisol, Benzonitril, Benzylalkohol, 1-Methoxy-2-Propanol,Quinolin, Cyclohexanon, Diacetin, Dichloromethan, Chloroform, Diethylether,Dimethylether, Toluol, Dimethylketon, Diethylketon, Dimethyladipat,Dimethylcarbonat, Dimethylsulfit, Dioxan, Dimethylsulfoxid, Methylacetat,Ethylacetat, Benzoesäure, Methylbenzoat, Ethylbenzoat,Ethylbenzol, Formamid, Glycerintriacetat, Ethylacetoacetat, Methylacetoacetat,N,N-Diethylacetamid, N-Methyl-N-ethylacetamid, N,N-Dimethylacetamid,N,N-Dimethylformamid, N-Methyl-N-ethylformamid, N,N-Diethylformamid,N,N-Dimethylthioformamid, N,N-Diethylthioformamid, N-Methyl-N-ethylthioform-amid,N,N-Dimethylacetamid, N-Methyl-N-Ethylacetamid, N,N-Diethylacetamid,Nitroethan, Nitromethyltoluol, Triethylphosphat oder Mischungen ausmindestens zwei dieser Lösungsmittel.UnderThese solvents are particularly preferred in particularSolvent selected from the group comprisingWater, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1,2-propanediol,1,3-propanediol, 1,2-butanediol, 1,3-butanediol, 1,4-butanediol, 1,5-pentanediol,2,4-pentanediol, ethylene glycol, propylene glycol, diethylene glycol,Dipropylene glycol, triethylene glycol, tripropylene glycol, 1,2,3-propanetriol,1,2,6-hexanetriol, 3-methyl-1,3,5-pentane-triol, 1,2,4-butanetriol,Acetonitrile, acetone, anisole, benzonitrile, benzyl alcohol, 1-methoxy-2-propanol,Quinoline, cyclohexanone, diacetin, dichloromethane, chloroform, diethyl ether,Dimethyl ether, toluene, dimethyl ketone, diethyl ketone, dimethyl adipate,Dimethyl carbonate, dimethyl sulfite, dioxane, dimethyl sulfoxide, methyl acetate,Ethyl acetate, benzoic acid, methyl benzoate, ethyl benzoate,Ethylbenzene, formamide, glycerol triacetate, ethyl acetoacetate, methyl acetoacetate,N, N-diethylacetamide, N-methyl-N-ethylacetamide, N, N-dimethylacetamide,N, N-dimethylformamide, N-methyl-N-ethylformamide, N, N-diethylformamide,N, N-dimethylthioformamide, N, N-diethylthioformamide, N-methyl-N-ethylthioformamide,N, N-dimethylacetamide, N-methyl-N-ethylacetamide, N, N-diethylacetamide,Nitroethane, nitromethyltoluene, triethyl phosphate or mixtures ofat least two of these solvents.

Beidem Zusatzstoff, der gegebenenfalls in der Zusammensetzung enthaltensein kann, kann es sich um jeden Zusatzstoff handeln, der üblicherweisein Zusammensetzungen zur Behandlung, insbesondere zur Stabilisierungbiologischer Proben enthalten ist. Bevorzugte Zusatzstoffe sinddabei ausgewählt aus der Gruppe umfassend Salze, wie beispielsweiseAmmoniumsulfit, Ammoniumsulfat, Caesiumsulfat, weitere Ammoniumsalze,weitere Sulfatsalze, Litiumnitrat, Natriumacetat, Kaliumacetat,Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder Calciumchlorid, osmotisch aktiveSubstanzen, wie etwa Mannitol, Detergentien, Inhibitoren, welcheden Abbau von Nukleinsäuren oder Proteinen hemmen, wiebeispielsweise der Protease-Inihibor PMSF oder die kommerziell erhältlichenProdukte ANTI-RNase (Ambion, St. Austin, USA), RNAsecure^® (Ambion) oder DEPC, Alkylierungsmittel,Acetylierungsmittel, Halogenierungsmittel, Nukleotide, Nukleotid-analoge-Verbindungen,Aminosäuren, Aminosäure-analoge Verbindungen,Betain, Visko sitätsregulierer, Farbstoffe, insbesondereFarbstoffe zum spezifischen Anfärben bestimmter Zellstrukturen,Pufferverbindungen, beispielsweise MES, HEPES, MOPS oder IRIS, Konservierungsstoffe,Komplexbildner, wie beispielsweise EDTA oder EGTA, Reduktionsmittel,wie beispielsweise 2-Mercaptoethanol, Dithiothreitol (DTT), Hydrogensulfid,Ascorbinsäure, NADPH, Tricarboxyethylphosphin (TCEP) undHexamethylphosphorsäuretriamid (Me2N)3P, Oxidationsmittelwie 5,5'-Dithio-bis(2-Nitrobenzesäure) (DTNB), Substanzen,welche die Permeabilität von Zellen verbessern, beispielsweiseDMSO oder DOPE, chaotrope Substanzen, wie beispielsweise Guanidiniumisothiocyanatoder Guanidinium-Hydrochlorid, Fixative, kreuzvernetzende Agentien,wie beispielsweise Formaldehyd oder Glutardialdehyd, Essigsäureoder Trichloressigsäure, Zucker, trocknungsmittel wie etwaSilikagel, Phenol und Phenolderivate sowie Mischungen aus mindestenszwei, mindestens drei, mindestens vier, mindestens fünf odermindestens sechs dieser Zusatzstoffe.The additive, which may optionally be included in the composition, may be any additive commonly included in compositions for the treatment, in particular for the stabilization of biological samples. Preferred additives are selected from the group comprising salts, such as, for example, ammonium sulfite, ammonium sulfate, cesium sulfate, further ammonium salts, further sulfate salts, lithium nitrate, sodium acetate, potassium acetate, sodium chloride, potassium chloride or calcium chloride, osmotically active substances, such as mannitol, detergents, inhibitors inhibit the degradation of nucleic acids or proteins, such as the protease Inihibor PMSF or the commercially available products ANTI-RNase (Ambion, St. Austin, USA), RNAsecure^® (Ambion) or DEPC, alkylating agents, acetylating halogenating agent, nucleotides, nucleotide analogues, amino acids, amino acid-analogous compounds, betaine, viscosity regulators, dyes, especially dyes for the specific staining of certain cell structures, buffer compounds, for example MES, HEPES, MOPS or IRIS, preservatives, complexing agents, such as EDTA or EGTA, Reduktio such as 2-mercaptoethanol, dithiothreitol (DTT), hydrogensulfide, ascorbic acid, NADPH, tricarboxyethylphosphine (TCEP) and hexamethylphosphoric triamide (Me2N) 3P, oxidizing agents such as 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzenoic acid) (DTNB), substances which improve the permeability of cells, for example DMSO or DOPE, chaotropic substances, such as guanidinium isothiocyanate or guanidinium hydrochloride, fixatives, cross-linking agents, such as formaldehyde or glutaric dialdehyde, acetic acid or trichloroacetic acid, sugars, drying agents such as silica gel, phenol and phenol derivatives, and Mixtures of at least two, at least three, at least four, at least five or at least six of these additives.

Wennes sich bei der vorstehend beschriebenen Zusammensetzung um eineflüssige Zusammensetzung handelt, so kann die Butendisäureoder deren Derivat in dieser flüssigen Zusammensetzungin einer Konzentration bis hin zur Sättigungskonzentrationin der jeweiligen Zusammensetzung vorliegen, wobei sie jedoch vorzugsweisein einer Konzentration in einem Bereich von Bereich von 0,01 mMolbis 10 Mol/l, besonders bevorzugt von 1 mMol/l bis 5 Mol/l und ammeisten bevorzugt von 10 mMol/l bis 4 Mol/l vorliegt.Ifit is in the composition described above to aliquid composition, so can the butenedioic acidor their derivative in this liquid compositionin a concentration up to the saturation concentrationin the particular composition, but preferablyat a concentration in the range of 0.01 mmolto 10 mol / l, more preferably from 1 mmol / l to 5 mol / l and onmost preferably from 10 mmol / l to 4 mol / l.

Weiterhinist es im Falle eines Einsatzes der Butendisäure oder einesDerivates der Butendisäure in Form der vorstehend beschriebenenZusammensetzung bevorzugt, wenn die Zusammensetzung

• – 0 bis 99,99 Gew.-%, besonders bevorzugt 25 bis 99Gew.-% und am meisten bevorzugt 50 bis 90 Gew.-% des Lösungsmittels,
• – 0 bis 99,99 Gew.-%, besonders bevorzugt 22 bis 99Gew.-% und am meisten bevorzugt 40 bis 80 Gew.-% des Zusatzstoffes,sowie
• – im Falle einer flüssigen Zusammensetzungdie Butendisäure oder deren Derivat in den vorstehend beschriebenenKonzentrationsbereichen und im Falle einer festen Zusammensetzungdie Butendisäure oder deren Derivat in einer Menge in einemBereich von 0,001 bis 99,9 Gew.-%, besonders bevorzugt in einem Bereichvon 0,01 bis 90 Gew.-% und am meisten bevorzugt in einer Menge ineinem Bereich von 0,1 bis 80 Gew.-%,

wobei die Gesamtmengeaus Lösungsmittel, Zusatzstoff und Verbindung Butendisäurebzw. Derivat der Butendisäure 100 Gew.-% beträgt.Furthermore, in the case of using the butenedioic acid or a derivative of the butenedioic acid in the form of the above-described composition, it is preferred that the composition

• 0 to 99.99% by weight, more preferably 25 to 99% by weight and most preferably 50 to 90% by weight of the solvent,
• From 0 to 99.99% by weight, more preferably from 22 to 99% by weight and most preferably from 40 to 80% by weight of the additive, and
• In the case of a liquid composition, the butenedioic acid or its derivative in the concentration ranges described above, and in the case of a solid composition, the butenedioic acid or its derivative in an amount ranging from 0.001 to 99.9% by weight, more preferably in the range of 0.01 to 90% by weight, and most preferably in an amount in the range of 0.1 to 80% by weight,

wherein the total amount of solvent, additive and compound butenedioic acid or derivative of butenedioic acid is 100 wt .-%.

DieHerstellung der Zusammensetzung aus dem Lösungsmittel,dem Zusatzstoff und der Butendisäure bzw. dem Derivat derButendisäure erfolgt vorzugsweise durch einfaches Vermischender Komponenten. Sollte eine der Komponenten einen Schmelzpunktoberhalb der Raumtemperatur haben, so kann es bevorzugt sein, dieseKomponente bis zum Schmelzpunkt zu erhitzen und dann mit den übrigenKomponenten zu vermischen. Denkbar ist aber auch, dass, wenn eineder Komponenten bei der Herstellung der Zusammensetzung in festerund eine andere Komponente in flüssiger Form vorliegt,die feste Komponente in der flüssigen Komponente zu lösen.So kann beispielsweise eine feste Verbindung der Struktur III ineinem flüssigen Zusatzstoff oder Lösemittel gelöstwerden.ThePreparation of the composition from the solvent,the additive and the butenedioic acid or the derivative ofButenedioic acid is preferably carried out by simple mixingof the components. Should one of the components have a melting pointabove room temperature, it may be preferable to thisHeat the component to the melting point and then mix with the restComponents to mix. It is also conceivable that, if onethe components in the preparation of the composition in solidand another component is in liquid form,to dissolve the solid component in the liquid component.Thus, for example, a solid compound of structure III indissolved in a liquid additive or solventbecome.

Dasin Kontakt bringen der Zusammensetzung mit der biologischen Probeim Verfahrensschritt ii) erfolgt im Falle einer flüssigenZusammensetzung vorzugsweise dadurch, dass die biologische Probein die Zusammensetzung eingetaucht wird, so dass die gesamte Probevon der Zusammensetzung durchtränkt werden kann. Wird alsbiologische Probe ein Fluid oder isolierte Zellen oder z. B. einegranuläre Probe eingesetzt, so erfolgt das in Kontakt bringendurch Vermischen der biologischen Probe mit der Zusammensetzungoder durch Suspendieren der biologischen Probe in der Zusammensetzung.Alternativ können bei der gewählten Temperaturfeste Zusammensetzungen direkt in einer flüssigen biologischenProbe (z. B. Blut, Plasma, Urin, Speichel) gelöst werden.Im Falle einer festen biologischen Probe und einer festen Zusammensetzungkann die feste Probe auch in der festen Zusammensetzung eingelegtwerden.Thecontacting the composition with the biological samplein process step ii) takes place in the case of a liquidComposition preferably in that the biological sampleis immersed in the composition, leaving the entire samplecan be impregnated with the composition. Is used asbiological sample a fluid or isolated cells or z. Legsused granular sample, it is brought into contactby mixing the biological sample with the compositionor by suspending the biological sample in the composition.Alternatively, at the selected temperaturesolid compositions directly in a liquid biologicalSample (eg, blood, plasma, urine, saliva).In the case of a solid biological sample and a solid compositionThe solid sample can also be inserted in the solid compositionbecome.

Esist weiterhin erfindungsgemäß bevorzugt, dassdas in Kontakt bringen der biologischen Probe mit der Butendisäureoder mit deren Derivat bzw. mit der Zusammensetzung beinhaltenddie Butendisäure oder deren Derivat bei einer Temperaturin einem Bereich von –80°C bis +80°C,bevorzugt in einem Bereich von 0°C bis +80°C,noch mehr bevorzugt in einem Bereich von 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8°Cbis +80°C und darüber hinaus bevorzugt in einemBereich von 18°C bis +80°C erfolgt, beispielsweisebei einer Temperatur von mindestens –20°C, –19°C, –18°C, –17°C, –16°C, –15°C, –14°C, –13°C, –12°C, –11°C, –10°C, –9°C, –8°C, –7°C, –6°C, –5°C, –4°C, –3°C, –2°C, –1°C,0°C, 1°C, 2°C, 3°C, 4°C,5°C, 6°C, 7°C, 8°C, 9°C,10°C, 11°C, 12°C, 13°C, 14°C,15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C,20°C, 21°C, 22°C, Raumtemperatur, 23°C,24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C,29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C,34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C,39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C,45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C,50°C, 51°C, 52°C, 53°C, 54°C,55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°Coder 60°C erfolgt.Itis further preferred according to the invention, thatbringing the biological sample into contact with the butenedioic acidor with their derivative or with the compositionthe butenedioic acid or its derivative at a temperaturein a range from -80 ° C to + 80 ° C,preferably in a range from 0 ° C to + 80 ° C,even more preferably in a range of 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8 ° Cto + 80 ° C and moreover preferably in oneRange of 18 ° C to + 80 ° C, for exampleat a temperature of at least -20 ° C, -19 ° C, -18 ° C, -17 ° C, -16 ° C, -15 ° C, -14 ° C, -13 ° C, -12 ° C, -11 ° C, -10 ° C, -9 ° C, -8 ° C, -7 ° C, -6 ° C, -5 ° C, -4 ° C, -3 ° C, -2 ° C, -1 ° C,0 ° C, 1 ° C, 2 ° C, 3 ° C, 4 ° C,5 ° C, 6 ° C, 7 ° C, 8 ° C, 9 ° C,10 ° C, 11 ° C, 12 ° C, 13 ° C, 14 ° C,15 ° C, 16 ° C, 17 ° C, 18 ° C, 19 ° C,20 ° C, 21 ° C, 22 ° C, room temperature, 23 ° C,24 ° C, 25 ° C, 26 ° C, 27 ° C, 28 ° C,29 ° C, 30 ° C, 31 ° C, 32 ° C, 33 ° C,34 ° C, 35 ° C, 36 ° C, 37 ° C, 38 ° C,39 ° C, 40 ° C, 41 ° C, 42 ° C, 43 ° C, 44 ° C,45 ° C, 46 ° C, 47 ° C, 48 ° C, 49 ° C,50 ° C, 51 ° C, 52 ° C, 53 ° C, 54 ° C,55 ° C, 56 ° C, 57 ° C, 58 ° C, 59 ° Cor 60 ° C.

Dabeibedeutet die Formulierung, dass das „in Kontakt bringender biologischen Probe mit der Butendisäure oder mit derenDerivat bzw. mit der Zusammensetzung beinhaltend die Butendisäureoder deren Derivat bei einer Temperatur in einem Bereich von –80°Cbis +80°C" oder bei einer der anderen, vorstehend genanntenTemperaturen erfolgt, dass nach dem in Kontakt bringen der biologischen Probemit der Butendisäure oder mit deren Derivat bzw. der Zusammensetzungdie Temperatur der auf diese Weise erhaltenen Mischung innerhalbder vorstehend genannten Temperaturen liegt. So kann es beispielsweisesein, dass als biologisches Material eine auf Temperaturen von wenigerals –20°C tiefgefrorene Probe, beispielsweiseeine in flüssigem Stickstoff gelagerte Probe eingesetztwird, wobei in diesem Falle eine solche Menge an Maleinsäureoder an Derivat bzw. an Zusammensetzung mit einer solchen Temperatureingesetzt wird, dass nach dem in Kontakt bringen der tiefgefrorenenbiologischen Probe mit der Butendisäure oder mit derenDerivat bzw. mit der Zusammensetzung die Temperatur der Mischung(und somit auch die Temperatur der biologische Probe) im vorstehendgenannten Temperaturbereich liegt.In this case, the formulation means that "contacting the biological sample with the butenedioic acid or with its derivative or with the composition comprising the butenedioic acid or its derivative at a temperature in a range of -80 ° C to + 80 ° C" or at one of the other temperatures mentioned above, after contacting the biological sample with the butenedioic acid or its derivative or composition, the temperature of the mixture thus obtained is within the above-mentioned temperatures in that a sample frozen at temperatures below -20 ° C, for example a sample stored in liquid nitrogen, is used as the biological material, in which case such an amount of maleic acid or Derivative or composition is used at such a temperature that after contacting the frozen biological sample with the butenedioic acid or with its derivative or with the composition, the temperature of the mixture (and thus the temperature of the biological sample) in the above mentioned temperature range is.

Weiterhinkann es gemäß einer besonderen Ausführungsformdes erfindungsgemäßen Verfahrens auch bevorzugtsein, dass die biologische Probe nach dem in Kontakt bringen mitder Butendisäure oder mit deren Derivat bzw. mit der Zusammensetzungbeinhaltend die Butendisäure oder deren Derivat im Verfahrensschrittii), vorzugsweise unter den vorstehend genannten Temperaturbedingungen,noch in einem sich an den Verfahrensschritt ii) anschließendenVerfahrensschritt iii) bei einer Temperatur in einem Bereich von –80°Cbis +80°C, bevorzugt in einem Bereich von 0°Cbis +80°C, noch mehr bevorzugt in einem Bereich von 2,3, 4, 5, 6, 7 oder 8°C bis +80°C und darüberhinaus bevorzugt in einem Bereich von 18°C bis +80°Cerfolgt, beispielsweise bei einer Temperatur von mindestens –20°C, –19°C, –18°C, –17°C, –16°C, –15°C, –14°C, –13°C, –12°C, –11°C, –10°C, –9°C, –8°C, –7°C, –6°C, –5°C, –4°C, –3°C, –2°C, –1°C,0°C, 1°C, 2°C, 3°C, 4°C,5°C, 6°C, 7°C, 8°C, 9°C,10°C, 11°C, 12°C, 13°C, 14°C,15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C,20°C, 21°C, 22°C, Raumtemperatur, 23°C,24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C,29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C,34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C,39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C,44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C,49°C, 50°C, 51°C, 52°C, 53°C,54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C,59°C oder 60°C gelagert wird, wobei diese Lagerunggegebenenfalls über einen Zeitraum von mindestens einemTag, mindestens 2 Tagen, mindestens 3 Tagen, mindestens einer Woche,von mindestens zwei Wochen, von mindestens einem Monat, von mindestensdrei Monaten, von mindestens sechs Monaten oder auch von mindestens12 Monaten erfolgen kann.FartherIt may according to a particular embodimentthe method according to the invention also preferredbe that the biological sample after contact withthe butenedioic acid or with its derivative or with the compositioncontaining the butenedioic acid or its derivative in the process stepii), preferably under the abovementioned temperature conditions,still in a subsequent process step ii)Process step iii) at a temperature in the range of -80 ° Cto + 80 ° C, preferably in a range of 0 ° C.to + 80 ° C, even more preferably in a range of 2,3, 4, 5, 6, 7 or 8 ° C to + 80 ° C and abovemore preferably in a range of 18 ° C to + 80 ° Cat a temperature of at least -20 ° C, -19 ° C, -18 ° C, -17 ° C, -16 ° C, -15 ° C, -14 ° C, -13 ° C, -12 ° ° C, -11 ° C, -10 ° C, -9 ° C, -8 ° C, -7 ° C, -6 ° C, -5 ° C, -4 ° C, -3 ° C, -2 ° C, -1 ° C,0 ° C, 1 ° C, 2 ° C, 3 ° C, 4 ° C,5 ° C, 6 ° C, 7 ° C, 8 ° C, 9 ° C,10 ° C, 11 ° C, 12 ° C, 13 ° C, 14 ° C,15 ° C, 16 ° C, 17 ° C, 18 ° C, 19 ° C,20 ° C, 21 ° C, 22 ° C, room temperature, 23 ° C,24 ° C, 25 ° C, 26 ° C, 27 ° C, 28 ° C,29 ° C, 30 ° C, 31 ° C, 32 ° C, 33 ° C,34 ° C, 35 ° C, 36 ° C, 37 ° C, 38 ° C,39 ° C, 40 ° C, 41 ° C, 42 ° C, 43 ° C,44 ° C, 45 ° C, 46 ° C, 47 ° C, 48 ° C,49 ° C, 50 ° C, 51 ° C, 52 ° C, 53 ° C,54 ° C, 55 ° C, 56 ° C, 57 ° C, 58 ° C,59 ° C or 60 ° C, this storageif necessary over a period of at least oneDay, at least 2 days, at least 3 days, at least one week,of at least two weeks, of at least one month, of at leastthree months, of at least six months or even at least12 months can be done.

DasVerfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglichtdie Lagerung einer behandelten biologischen Probe bei Kühlschranktemperaturen,bei Raumtemperatur oder bei noch höheren Temperaturen,ohne dass es zu einem erkennbaren Abbau von Biomolekülenwie Nukleinsäuren oder Proteinen in der biologische Probekommt. Dieses stellt einen signifikanten Vorteil gegenüberherkömmlichen Stabilisierungsverfahren dar, da das Verfahrenohne den Einsatz von flüssigem Stickstoff oder von Tiefkühlvorrichtungendurchgeführt und die stabilisierte Probe auch ohne denEinsatz von flüssigem Stickstoff oder von Tiefkühlvorrichtungengelagert werden kann. Insbesondere zum Zwecke einer längerfristigenArchivierung können die Proben natürlich, wie allgemein üblich,auch bei niedrigen Temperaturen, etwa bei –20°Coder –80°C, gelagert werden, wobei dieses jedochnicht zwingend ist.TheMethod according to the present invention allowsthe storage of a treated biological sample at refrigerator temperatures,at room temperature or at even higher temperatures,without causing any recognizable degradation of biomoleculessuch as nucleic acids or proteins in the biological samplecomes. This contrasts with a significant advantageconventional stabilization method, since the methodwithout the use of liquid nitrogen or freezersperformed and the stabilized sample without theUse of liquid nitrogen or freezerscan be stored. Especially for the purpose of a longer-termArchiving, the samples can, of course, as usual,even at low temperatures, about -20 ° Cor -80 ° C, but this isis not mandatory.

Nachder erfindungsgemäßen Behandlung und gegebenenfallsvor oder auch nach einem möglichen Lagerungsschritt iii)kann die behandelte biologische Probe auch in geeignete Einbettungsmitteleingebettet werden, beispielsweise in Paraffin oder dergleichen,um dann aus der biologischen Probe für histologische Untersuchungengeeignete Gewebeschnitte einfacher anfertigen zu können.Tothe treatment according to the invention and optionallybefore or even after a possible storage step iii)The treated biological sample may also be incorporated into suitable embedding meansembedded, for example in paraffin or the like,then from the biological sample for histological examinationsmake suitable tissue sections easier.

Weiterhinkann es gemäß einer besonderen Ausführungsformdes erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt sein,dass sich an den Verfahrensschritt i) und ii) noch ein Verfahrensschritt
iv)Analyse von Biomolekülen in der oder aus der mit der Butendisäureoder mit deren Derivat (bzw. mit einer Zusammensetzung beinhaltenddie Butendisäure oder deren Derivat) in Kontakt gebrachtenbiologischen Probe und/oder histologische Analyse der mit der Butendisäureoder mit deren Derivat (bzw. mit einer Zusammensetzung beinhaltenddie Butendisäure oder deren Derivat) in Kontakt gebrachtenbiologischen Probe, besonders bevorzugt jedoch die Analyse von Biomolekülenin der oder aus der mit der Butendisäure oder mit deren Derivat(bzw. mit einer Zusammensetzung beinhaltend die Butendisäureoder deren Derivat) in Kontakt gebrachten biologischen Probe,
anschließt,wobei dieser Verfahrensschritt iv) gegebenenfalls auch vor odernach einer Lagerung gemäß dem vorstehend beschriebenenVerfahrensschritt iii) durchgeführt werden kann.Furthermore, according to a particular embodiment of the method according to the invention, it may be preferable for the process step i) and ii) to contain one more process step
iv) analysis of biomolecules in or from the biological sample contacted with the butenedioic acid or its derivative (or with a composition containing the butenedioic acid or its derivative) and / or histological analysis of the butenedioic acid or its derivative (or containing a composition comprising the butenedioic acid or its derivative), more preferably, however, the analysis of biomolecules in or from the butenedioic acid or its derivative (or with a composition containing the butenedioic acid or its derivative) Contacted biological sample,
if appropriate, this process step iv) can also be carried out before or after storage in accordance with method step iii) described above.

Untereiner histologischen Untersuchung wird vorzugsweise jedes Untersuchungsverfahrenverstanden, welches geeignet ist, den morphologischen Zustand einesGewebes, eines Gewebeschnittes, einer Zelle oder von subzellulärenStrukturen zu analysieren, beispielsweise mittels Mikroskopie undgegebenenfalls unter Einsatz von dem Fachmann bekannten Färbe-oder Markierungstechniken.Undera histological examination is preferably any examination procedurewhich is suitable, the morphological state of aTissue, a tissue section, a cell or subcellularTo analyze structures, for example by means of microscopy andoptionally with the use of dyeing methods known to the person skilled in the art.or marking techniques.

AlsBiomoleküle, die analysiert werden können, kommenalle dem Fachmann bekannten Biomoleküle in Betracht, insbesonderenatürliche, modifizierte oder synthetische Nukleinsäuren,natürliche, modifizierte oder synthetische Proteine oderOligopeptide, Hormone, Wachstumsfaktoren, Substrate des Stoffwechsels, Metabolite,Lipide, Oligosaccharide oder Proteoglukane. Als Nukleinsäurenkommen alle dem Fachmann bekannten Nukleinsäuren in Betracht,insbesondere Ribonukleinsäuren (RNA), beispielsweise mRNA,siRNA, miRNA, snRNA, t-RNA, hnRNA oder Ribozyme, oder Deoxyribonukleinsäuren(DNA). Grundsätzlich kann es sich um jeden Typ von Polynukleotidhandeln, der ein N-Glykosid oder C-Glykosid einer Purin- oder Pyrimidinbasedarstellt. Die Nukleinsäure kann einzel-, doppel- odermehrsträngig, linear, verzweigt oder zirkulärsein. Sie kann einem in einer Zelle vorkommenden Molekülentsprechen, wie etwa genomische DNA oder Boten-RNA (mRNA), oderin vitro erzeugt werden wie Komplementär-DNA (cDNA), Gegenstrang-RNA(aRNA), oder synthetische Nukleinsäuren. Die Nukleinsäurekann aus wenigen Untereinheiten, mindestens zwei Untereinheiten,bevorzugt acht oder mehr Untereinheiten bestehen, wie etwa Oligonukleotide,mehreren hundert Untereinheiten bis hin zu mehreren tausend Untereinheiten,wie etwa bestimmte Expressionsvektoren, oder bedeutend mehr Untereinheiten,wie genomische DNA. Bevorzugt enthält die Nukleinsäuredie kodierende Information für ein Polypeptid in funktionellemZusammenhang mit regulatorischen Sequenzen, die die Expression desPolypeptids in der Zelle erlauben, in die die Nukleinsäureeingebracht wird oder natürlich vorliegt. So ist die Nukleinsäurein einer bevorzugten Ausführungsform ein Expressionsvektor.In einer anderen Ausführungsform ist sie eine pDNA (Plasmid-DNA),eine siRNA, eine siRNA-Duplizes oder eine siRNA-hetero-Duplizes,wobei unter dem Begriff „siRNA" Ribonukleinsäurenmit einer Länge von etwa 22 Nukleotiden verstanden werden,die durch Spaltung einer doppelsträngigen RNA (dsRNA) durchdas Enzym „Dicer" entstehen und in den Enzymkomplex „RISC"(RNA-induced silencing complex) eingebaut werden.Suitable biomolecules which can be analyzed are all biomolecules known to the skilled worker, in particular natural, modified or synthetic nucleic acids, natural, modified or synthetic proteins or oligopeptides, hormones, growth factors, substrates of metabolism, metabolites, lipids, oligosaccharides or proteoglucans. Suitable nucleic acids are all nucleic acids known to the person skilled in the art, in particular ribonucleic acids (RNA), for example mRNA, siRNA, miRNA, snRNA, t-RNA, hnRNA or ribozymes, or deoxyribonucleic acids (DNA). Basically it can is any type of polynucleotide that is an N-glycoside or C-glycoside of a purine or pyrimidine base. The nucleic acid may be single, double or multi-stranded, linear, branched or circular. It may correspond to a molecule occurring in a cell, such as genomic DNA or messenger RNA (mRNA), or generated in vitro, such as Complementary DNA (cDNA), counterstrand RNA (aRNA), or synthetic nucleic acids. The nucleic acid may consist of a few subunits, at least two subunits, preferably eight or more subunits, such as oligonucleotides, several hundred subunits to several thousand subunits, such as certain expression vectors, or significantly more subunits, such as genomic DNA. Preferably, the nucleic acid contains the coding information for a polypeptide in functional association with regulatory sequences that allow expression of the polypeptide in the cell into which the nucleic acid is introduced or naturally present. Thus, in a preferred embodiment, the nucleic acid is an expression vector. In another embodiment, it is a pDNA (plasmid DNA), siRNA, siRNA duplexes or siRNA hetero-duplexes, the term "siRNA" being understood to mean ribonucleic acids of about 22 nucleotides in length, which may be cleaved a double-stranded RNA (dsRNA) by the enzyme "Dicer" are created and incorporated into the enzyme complex "RISC" (RNA-induced silencing complex).

Ammeisten bevorzugt als Biomoleküle sind jedoch Proteineund Nukleinsäuren, wobei Nukleinsäuren besondersbevorzugt und RNAs am meisten bevorzugt sind.At theHowever, most preferred as biomolecules are proteinsand nucleic acids, with nucleic acids being particularlypreferred and RNAs are most preferred.

DieFormulierung „Analyse von Biomolekülen in deroder aus der mit der Butendisäure oder mit deren Derivatbzw. mit einer Zusammensetzung beinhaltend die Butendisäureoder deren Derivat in Kontakt gebrachten biologischen Probe" bedeutetdabei, dass die Analyse sowohl in situ als auch ex situ, also beispielsweise nachIsolierung der Biomoleküle aus der biologischen Probe erfolgenkann. Sollen Biomoleküle aus einer biologischen Probe zumZwecke der Analyse isoliert werden, so kann es vorteilhaft sein,insbesondere im Falle von Zellen, Geweben oder anderen komplexenoder kompakten Proben die Proben zunächst zu homogenisieren,wobei dieses Homogenisieren auf mechanischem Weg, beispielsweisemittels Kanülen, Mörsern, Rotor-Stator-Homogenisatoren,einer Kugelmühle oder dergleichen, auf chemischem Weg durchden Einsatz geeigneter Lysepuffer, welche üblicherweiseDetergenzien und/oder chaotrope Substanzen und/oder Phenol beinhalten,auf enzymatischem Weg, beispielsweise unter Einsatz von Proteasen,oder durch eine Kombination dieser Maßnahmen, durchgeführtwerden kann.TheFormulation "Analysis of biomolecules in theor from the butenedioic acid or its derivativeor with a composition comprising the butenedioic acidor their derivative is in contact with a biological sample "that the analysis both in situ and ex situ, so for example afterIsolation of biomolecules from the biological sample donecan. Should biomolecules from a biological sample forBe isolated for analysis purposes, it may be advantageousespecially in the case of cells, tissues or other complexor compact samples to homogenize the samples first,this homogenization by mechanical means, for exampleusing cannulas, mortars, rotor-stator homogenizers,a ball mill or the like, by chemical meansthe use of suitable lysis buffer, which is usuallyDetergents and / or chaotropic substances and / or phenol include,enzymatically, for example using proteases,or by a combination of these measurescan be.

Zurhistologischen Analyse oder zur Analyse von Biomolekülenin der oder aus der biologischen Probe können dabei alledem Fachmann bekannten und geeignet erscheinenden Analyseverfahreneingesetzt werden, vorzugsweise Verfahren ausgewählt ausder Gruppe umfassend die Lichtmikroskopie, die Elektronenmikroskopie,die konfokale Laserscanningmikroskopie, die Laser-Micro-Dissection,Scanningelektronenmikroskopie, das Western-Blotting, das Southern-Blotting,das Northern-Blotting, den Enzyme-linked Immonosorbent-Assay (ELISA),die Immunpräzipitation, die Affinitätschromatographie,die Mutationsanalyse, die Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE),insbesondere die zweidimensionale PAGE, die HPLC, die Polymerasekettenreaktion(PCR), die RFLP-Analyse (Restriction Fragment Length Polymorphism-Analyse),die SAGE-Analyse (Serial Analysis of Gen Expression), die FPLC-Analyse(Fast Protein Liquid Chromatography), die Massenspektrometrie, beispielsweisedie MALDI-TOFF-Massenspektrometrie oder die SELDI-Massenspektrometrie,die Microarray-Analyse, die LiquiChip-Analyse, die Analyse der Aktivitätvon Enzymen, HLA-Typing, Sequenzierung, WGA („Whole GenomeAmplification"), WTA ("Whole Transcriptome Amplification"), RT-PCR, Real-Time-PCRbzw -RT-PCR, RNase-Protection-Analyse oder Primer-Extension-Analyse.tohistological analysis or analysis of biomoleculesin or out of the biological sample can be allknown to the expert and appear appropriate analysis methodare used, preferably selected fromthe group comprising light microscopy, electron microscopy,confocal laser scanning microscopy, laser micro-dissection,Scanning electron microscopy, Western blotting, Southern blotting,Northern blotting, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA),immunoprecipitation, affinity chromatography,mutational analysis, polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE),in particular the two-dimensional PAGE, the HPLC, the polymerase chain reaction(PCR), the RFLP analysis (Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis),the SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) analysis, the FPLC analysis(Fast Protein Liquid Chromatography), mass spectrometry, for exampleMALDI-TOFF mass spectrometry or SELDI mass spectrometry,the microarray analysis, the LiquiChip analysis, the analysis of the activityof enzymes, HLA typing, sequencing, WGA ("Whole GenomeAmplification "), Whole Transcriptome Amplification (WTA), RT-PCR, Real-Time PCRor RT PCR, RNase protection analysis or primer extension analysis.

Gemäß einerbesonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßenVerfahrens umfasst der Verfahrensschritt iv) eine Analyse von Nukleinsäurenin der oder aus der biologischen Probe und/oder eine Analyse vonProteinen in der oder aus der biologischen Probe.According to oneparticular embodiment of the inventionMethod, the method step iv) comprises an analysis of nucleic acidsin or out of the biological sample and / or an analysis ofProteins in or out of the biological sample.

EinenBeitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistetauch die durch das erfindungsgemäße Verfahrenbehandelte biologische Probe.aContribute to the solution of the above-mentioned tasksalso by the method according to the inventiontreated biological sample.

Einenweiteren Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgabenleistet auch die Verwendung von Butendisäure oder einemDerivat der Butendisäure, vorzugsweise von einer Verbindungder Struktur III

in der X und R² wievorstehend im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßenVerfahren definiert sind, zur Behandlung einer biologischen Probe,insbesondere zur Stabilisierung von Biomolekulen, besonders bevorzugtvon Nukleinsäuren oder Proteinen, darüber hinausbevorzugt von Nukleinsäuren und am meisten bevorzugt vonRNAs, wie etwa mRNAs, in einer oder aus einer biologischen Probeund/oder zur histologischen Analyse einer biologischen Probe, wobeials Verbindungen der Struktur III, als Biomoleküle undals biologische Probe diejenigen Verbindungen der Struktur III,Biomoleküle und biologischen Proben bevorzugt sind, diebereits eingangs im Zusammenhang mit dem erfindungsgenannten Verfahrenals bevorzugte Ausführungsformen beschrieben wurden.The use of butenedioic acid or a derivative of butenedioic acid, preferably of a compound of structure III, also makes a further contribution to achieving the abovementioned objects

in which X and R^{2 are} as defined above in connection with the method according to the invention, for the treatment of a biological sample, in particular for the stabilization of biomolecules, more preferably of nucleic acids or proteins, furthermore preferably of nucleic acids and most preferably of RNAs, such as mRNAs, in or from a biological sample and / or for the histological analysis of a biological sample, wherein as compounds of the structure III, as biomolecules and as a biological sample those compounds of the structure III, biomolecules and biological samples are preferred, which are already mentioned in the beginning have been described with the inventive method as preferred embodiments.

EinenBeitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistetauch ein Kit, umfassend

• (a) Maleinsäureoder ein Derivat der Maleinsäure, vorzugsweise die vorstehendbeschriebene Verbindung der Struktur III, sowie
• (b) Reagenzien zur Analyse von Biomolekülen in oderaus einer biologischen Probe und/oder zur Analyse der Morphologieeiner biologischen Probe.

A contribution to the solution of the objects mentioned at the outset is also provided by a kit comprising

• (a) maleic acid or a derivative of maleic acid, preferably the above-described compound of structure III, as well as
• (b) reagents for analyzing biomolecules in or from a biological sample and / or analyzing the morphology of a biological sample.

DieButendisäure oder deren Derivat kann dabei in dem erfindungsgemäßenKit als Einzelkomponente vorliegen, denkbar ist jedoch auch, dassdas Kit als Additiv in einer Zusammensetzung, wie im Zusammenhang mitdem erfindungsgemäßen Verfahren beschrieben, vorliegt.TheButenedioic acid or its derivative may be in the inventiveKit are available as a single component, but it is also conceivable thatthe kit as an additive in a composition, as related todescribed the process of the invention is present.

Beiden Reagenzien zur Analyse von Biomolekülen in oder auseiner biologischen Probe oder zur Analyse der Morphologie einerbiologischen Probe kann es sich grundsätzlich um alle demFachmann bekannten Reagenzien handeln, die zur oder bei der morphologischenAnalyse einer biologischen Probe oder zur oder bei der Analyse vonBiomolekülen in einer oder aus einer biologischen Probeverwendet werden können. Diese Reagenzien umfassen insbesondereFarbstoffe zum Färben von Zellen oder Zellbestandteilen,Antikörper, gegebenenfalls markiert mit Fluoreszenzfarbstoffenoder Enzymen, eine Absorptionsmatrix, wie etwa DEAE-Zellulose odereine Silica-Membran, Substrate für Enzyme, Agarose-Gele,Polyacrylamid-Gele, Lösungsmittel wie Ethanol, chaotropeReagenzien oder Phenol, wässrige Pufferlösungen,RNase-freies Wasser, Lyse-Reagenzien, alkoholische Lösungenund dergleichen.atthe reagents for analyzing biomolecules in or outa biological sample or to analyze the morphology of abiological sample can basically be all thatProfessional known reagents that are used for or in the morphologicalAnalysis of a biological sample or for or in the analysis ofBiomolecules in or out of a biological samplecan be used. These reagents include in particularDyes for staining cells or cell components,Antibody, optionally labeled with fluorescent dyesor enzymes, an absorption matrix, such as DEAE cellulose ora silica membrane, substrates for enzymes, agarose gels,Polyacrylamide gels, solvents such as ethanol, chaotropicReagents or phenol, aqueous buffer solutions,RNase-free water, lysis reagents, alcoholic solutionsand the same.

Weiterhinkann ein erfindungsgemäßes Kit als Komponentebeispielsweise mindestens eine Vorrichtung (c), beispielsweise inForm eines verschließbaren Gefäßes, zurSammlung oder Aufnahme einer festen oder flüssigen biologischenProbe enthalten. Dabei kann die Vorrichtung gegebenenfalls vor Sammlungoder Aufnahme der biologischen Probe Butendisäure oderderen Derivate bzw. eine Zusammensetzung beinhaltend Butendisäureoder deren Derivate enthalten. Bei der Vorrichtung (c) kann es sichum jedes dem Fachmann bekannte Gefäß zur Sammlungoder Aufnahme einer festen oder flüssigen biologien Probehandeln. Bevorzugte Gefäße sind beispielsweiseFalcon-Tubes, Eppendorf-Gefäße, Greiner-Röhrchen,oder eines der in den DruckschriftenUS6,602,718,US2004/0043505 A1,US 2005/0160701 A1,US 2003/0086830 A1,US 2003/0087423 A1 oderWO 2005/014173 A1 beschriebenenGefäße.Furthermore, a kit according to the invention as a component, for example, at least one device (c), for example in the form of a sealable vessel, for collecting or receiving a solid or liquid biological sample. The device may optionally contain butenedioic acid or its derivatives or a composition comprising butenedioic acid or derivatives thereof prior to collection or uptake of the biological sample. Device (c) may be any vessel known to those skilled in the art for collecting or receiving a solid or liquid biology sample. Preferred vessels are, for example, Falcon tubes, Eppendorf tubes, Greiner tubes, or one of the publications US 6,602,718 . US 2004/0043505 A1 . US 2005/0160701 A1 . US 2003/0086830 A1 . US 2003/0087423 A1 or WO 2005/014173 A1 described vessels.

Einerfindungsgemäßes Kit kann dabei

• (a) Butendisäure oder ein Derivat der Butendisäure,vorzugsweise die vorstehend beschriebene Verbindung der StrukturIII, sowie
• (b) eine Vorrichtung zur Sammlung oder Aufnahme einer festenoder flüssigen biologischen Probe, wobei die Vorrichtunggegebenenfalls vor Sammlung oder Aufnahme der biologischen Probemindestens eine der unter (a) genannten Verbindungen oder eine Zusammensetzungbeinhaltend mindestens eine unter (a) genannten Verbindungen enthaltenkann.

An inventive kit can thereby

• (a) butenedioic acid or a derivative of butenedioic acid, preferably the above-described compound of structure III, as well as
• (B) a device for collecting or receiving a solid or liquid biological sample, wherein the device may optionally contain at least one of the compounds mentioned under (a) or a composition comprising at least one compound mentioned under (a) prior to collection or uptake of the biological sample ,

Alternativkann ein weiteres erfindungsgemäßes Kit die obenbeschriebenen Komponenten enthalten.alternativeFor example, another kit according to the invention may be the one abovecontain described components.

EinenBeitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistetauch die Verwendung des Kits zur Analyse von Biomolekülenin oder aus einer biologischen Probe und/oder zur histologischenAnalyse einer biologischen Probe.aContribute to the solution of the above-mentioned tasksalso the use of the biomolecule analysis kitin or from a biological sample and / or for histologicalAnalysis of a biological sample.

Einenweiteren Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgabenleistet auch ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit, umfassenddie Verfahrensschritte:

• (a) Diagnose der Krankheitdurch ein Diagnoseverfahren, welches die Analyse einer biologischenProbe durch vorstehend beschriebene Verfahren umfassend die Verfahrensschritti), ii) und iv), gegebenenfalls auch iii), umfasst, sowie
• (b) therapeutische Behandlung der diagnostizierten Krankheit.

A further contribution to the solution of the abovementioned objects is also provided by a method for the treatment of a disease, comprising the method steps:

• (a) diagnosis of the disease by a diagnostic method which comprises the analysis of a biological sample by methods described above comprising the method steps i), ii) and iv), optionally also iii), as well as
• (b) therapeutic treatment of the diagnosed disease.

DieErfindung wird nun anhand nichtlimitierender Figuren und Beispielenäher erläutert.TheThe invention will now be described by way of nonlimiting figures and examplesexplained in more detail.

Eszeigt die1 den im Beispiel 3 hergestelltenWestern-Blot.It shows the 1 the Western blot prepared in Example 3.

Eszeigt die2 das im Beispiel 6 erhalteneAgarose-Gel.It shows the 2 the agarose gel obtained in Example 6.

Eszeigt die3 das im Beispiel 8 erhalteneAgarose-Gel.It shows the 3 the agarose gel obtained in Example 8.

BeispieleExamples

1. Stabilisierung von RNA in biologischenProben in Gegenwart von N-Ethylmaleimid1. Stabilization of RNA in biologicalSamples in the presence of N-ethylmaleimide

Nierengewebeder Ratte wurde unverzüglich nach Organentnahme mit 500 μleiner Zusammensetzung bestehend aus DMSO und 50 mM N-Ethylmaleimidbzw. 30% Phenol in DMSO und 50 mM N-Ethylmaleimid versetzt und beiverschiedenen Temperaturen gelagert (siehe Tabelle 1). N-Ethylmaleimidweist die folgende Strukturformel (VIII) auf:

Renal tissue of the rat was immediately after organ removal with 500 .mu.l of a composition consisting of DMSO and 50 mM N-ethylmaleimide or 30% phenol in DMSO and 50 mM N-ethylmaleimide and stored at different temperatures (see Table 1). N-ethylmaleimide has the following structural formula (VIII):

ImAnschluss an die Lagerung wird die RNA aus den gelagerten Probenisoliert.in theFollowing storage, the RNA is removed from the stored samplesisolated.

Dazuwird das Gewebe nach Lagerung aus den Lösungen entferntund je 5 mg Gewebe 500 μl eines handelsüblichenGuanidinium-Isothiocyanat-Puffers, wie z. B. RLT-Puffer der FirmaQIAGEN zugeben. Die Probe wird mit Hilfe einer Kugelmühle,wie z. B. TissueLyzer der Firma QIAGEN, über einen Zeitraumvon 2 × 5 min bei 25 Hz mit einer 5 mm Stahlkugel homogenisiert,wobei der Guanidinium-Isothiocyanat-Puffer auf aus dem Stand derTechnik bekannte Weise die Zellen lysiert und die freigesetztenProteine denaturiert. Anschließend werden die Lysate bei14000 UpM für 3 min zentrifugiert. Vom Überstandwerden 500 μl, die 5 mg Gewebe repräsentieren,abgenommen. Zu diesen Proben wird 1 Volumen (500 μl) 70%-igesEthanol zugefügt und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettierenoder durch Vortexen über einen Zeitraum von ca. 5 s gemischt.Das Lysat wird anschließend in eine handelsüblicheSilicamembran enthaltene 96well-Platte, wie z. B. Rneasy 96-plateder Firma QIAGEN, aufgetragen und durch Zentrifugation (4 min bei6000 UpM) durch die Membran hindurchgeführt. Die RNA bleibtan der Membran gebunden und wird anschließend mit einemersten handelsüblichen Guanidinium-Isothiocyanat-haltigenWaschpuffer, beispielsweise mit dem Puffer RW1 der Firma QIAGEN,gewaschen. Anschließend wird zur enzymatichen Entfernungetwaig gebundener gesamt-DNA DNAseI in einem geeigneten Puffer aufdie Säule aufgeben und für 15 min bei Raumtemperaturzwecks Abbau der gebundenen DNA inkubiert. Im Anschluss wird erneutmit einem ersten handelsüblichen Guanidinium-Isothiocyanat-haltigenWaschpuffer, beispielsweise mit dem Puffer RW1 der Firma QIAGEN,und danach mit einem zweiten Tris-haltigen bzw. Tris- und alkoholhaltigenWaschpuffer, z. B. Puffer RPE der Firma QIAGEN, gewaschen. Dabeiwerden die Waschpuffer jeweils durch Zentrifugation (4 min bei 6000UpM) durch die Membran hindurchgeführt. Die Waschung mitdem zweiten Tris-haltigen bzw. Tris- und alkoholhaltigen Waschpufferwird wiederholt, wobei gleichzeitig die Membran durch die Zentrifugation(10 min 6000 UpM) getrocknet wird. Zur Elution werden 50 μlRNase-freies Wasser auf die Membran pipettiert, um die gereinigteRNA von der Membran abzulösen. Nach einer Inkubation von1 min bei einer Temperatur im Bereich von 10–30°Cwird das Eluat durch Zentrifugation (1 min bei 10000 × g)durch die Membran hindurchgeführt und der Elutionsschrittwird zum Zwecke einer vollständigen Elution noch einmalwiederholt.For this purpose, the tissue is removed after storage from the solutions and each 5 mg tissue 500 ul of a commercial guanidinium isothiocyanate buffer such. B. RLT buffer the company QIAGEN admit. The sample is removed by means of a ball mill, such. B. Tissue Lyzer of QIAGEN, homogenized over a period of 2 × 5 min at 25 Hz with a 5 mm steel ball, the guanidinium isothiocyanate buffer on known from the prior art, the cells lysiert and denature the released proteins. Subsequently, the lysates are centrifuged at 14000 rpm for 3 min. From the supernatant, 500 μl, representing 5 mg tissue, are taken. To these samples, 1 volume (500 μl) of 70% ethanol is added and mixed by repeated pipetting up or down or by vortexing for a period of about 5 seconds. The lysate is then in a commercially available silica membrane contained 96well plate such. B. Rneasy 96-plate from QIAGEN, applied and passed through the membrane by centrifugation (4 min at 6000 rpm). The RNA remains bound to the membrane and is subsequently washed with a first commercially available guanidinium isothiocyanate-containing washing buffer, for example with the buffer RW1 from QIAGEN. Subsequently, the enzymatic removal of any bound total DNA DNAseI in a suitable buffer is applied to the column and incubated for 15 min at room temperature for the purpose of degrading the bound DNA. Following is again with a first commercially available guanidinium isothiocyanate-containing wash buffer, for example with the buffer RW1 from QIAGEN, and then with a second Tris-containing or tris and alcohol-containing wash buffer, z. B. Buffer RPE from QIAGEN, washed. The wash buffers are in each case passed through the membrane by centrifugation (4 min at 6000 rpm). The washing with the second Tris-containing or Tris- and alcohol-containing wash buffer is repeated, at the same time the membrane by the centrifugation (10 min 6000 rpm) is dried. For elution, 50 μl of RNase-free water is pipetted onto the membrane to recover the purified RNA from the Memb ran off. After incubation for 1 minute at a temperature in the range of 10-30 ° C, the eluate is passed through the membrane by centrifugation (10000 x g for 1 min.) And the elution step is repeated once more for complete elution.

DieMenge an isolierter Gesamt-RNA wird nach Verdünnung inWasser durch photometrische Messung der Lichtabsorption bei einerWellenlänge von 260 nm ermittelt. Die Qualitätder so gewonnenen RNA wird durch die photometrische Bestimmung desVerhältnisses der Lichtabsorption bei 260 nm zu derjenigen bei280 nm bestimmt. Die Ergebnisse der Isolierungen sind in Tabelle1 dargestellt. Tabelle 1BehandlungszusammensetzungLagerung260nm/280 nmRNA-Ausbeute[μg]DMSO +50 mM N-Ethylmaleimid1d37°C2,086,03dRT2,015,17dRT2,023,73d4°C2,033,030% Phenolin DMSO + 50 mM N-Ethylmaleimid1d37°C2,0110,77dRT2,0812,13d4°C2,107,27d4°C2,0712,1The amount of isolated total RNA is determined after dilution in water by photometric measurement of light absorption at a wavelength of 260 nm. The quality of the RNA thus obtained is determined by the photometric determination of the ratio of light absorption at 260 nm to that at 280 nm. The results of the insulations are shown in Table 1. Table 1 treatment composition storage 260 nm / 280 nm RNA yield [μg] DMSO + 50 mM N-ethylmaleimide 1d 37 ° C 2.08 6.0 3d RT 2.01 5.1 7d RT 2.02 3.7 3d 4 ° C 2.03 3.0 30% phenol in DMSO + 50 mM N-ethylmaleimide 1d 37 ° C 2.01 10.7 7d RT 2.08 12.1 3d 4 ° C 2.10 7.2 7d 4 ° C 2.07 12.1

Wieder Tabelle 1 zu entnehmen ist, können durch den Zusatzvon N-Ethylmaleimid als Additiv in Stabilisierungszusammensetzungenbiologische Proben für lange Zeiträume bei moderatenTemperaturen gelagert und trotzdem noch ausreichende Mengen an RNAin guter Qualität aus den Proben isoliert werden.AsTable 1 can be found by the additionof N-ethylmaleimide as an additive in stabilizing compositionsbiological samples for long periods at moderateTemperatures stored and still sufficient amounts of RNAbe isolated from the samples in good quality.

2. Stabilisierung von DNAin biologischen Proben in Gegenwart von N-Ethylmaleimid2. Stabilization of DNAin biological samples in the presence of N-ethylmaleimide

Nierengewebeder Ratte wurde unverzüglich nach Organentnahme mit 500 μlDMSO + 50 mM N-Ethylmaleimid bzw. 30% Phenol in DMSO + 50 mM N-Ethylmaleimidversetzt und bei verschiedenen Temperaturen gelagert (siehe Tabelle2). Im Anschluss an die Lagerung wird die DNA aus den gelagertenProben isoliert.kidney tissuethe rat was immediately after organ removal with 500 .mu.lDMSO + 50 mM N-ethylmaleimide or 30% phenol in DMSO + 50 mM N-ethylmaleimideand stored at different temperatures (see table2). Following storage, the DNA is stored off theSamples isolated.

ZurDNA-Isolierung wird das Gewebe nach Lagerung aus den Lösungenentfernt und je 10 mg Gewebe in 180 μl des Puffers ALTdes Herstellers QIAGEN zugeben. Die Probe wird mit Hilfe einer Kugelmühle,wie z. B. TissueLyzer der Firma QIAGEN, über einen Zeitraumvon 30 s bei 25 Hz mit einer 5 mm Stahlkugel homogenisiert und anschließendfür 15 s bei 14000 × g zentrifugiert. Nach Zugabevon 120 μl der Protease K-Lösung (Hersteller QIAGEN)werden die Lysate für 2 Stunden bei 55°C unterSchütteln inkubiert. Nach der Inkubation werden 4 μlRNAse A (100 mg/ml) zugeben, gemischt und die Mischung für2 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wird 300 μleines handelsüblichen Guanidinium-HydrochloridhaltigenLysepuffers, wie der Puffer AL des Herstellers QIAGEN, zugegebenund die Proben mittels Vortexen durchmischt. Es erfolgt eine Inkubationbei 70°C für 10 min. Nach Mischung mit 300 μl100% Ethanol werden die Proben auf eine Silicamembran enthaltende96 well-Platte (DNeasy 96-plate der Firma QIAGEN) aufgetragen unddas Lysat mittels Zentrifugation für 10 min bei 6000 UpMdurch die Membran geführt. Die DNA bleibt an der Membran gebundenund wird zunächst mit einem ersten handelsüblichenGuanidinium-Hydrochlorid-haltigen Waschpuffer, beispielsweise mitdem Puffer AW1 der Firma QIAGEN, und danach mit einem zweiten alkoholhaltigen Waschpuffer,z. B. Puffer AW2 der Firma QIAGEN, gewaschen. Dabei werden die Waschpufferjeweils durch Zentrifugation (5 min bei 6000 UpM) durch die Membranhindurchgeführt. Im Anschluss wird die Platte für10 min bei 70°C inkubiert. Die Elution der DNA erfolgtdurch Auftrag von 200 μl des auf 70°C vorgewärmtenElutionspuffers AE (QIAGEN). Nach einminütiger Inkubationwird der Elutionspuffer durch Zentrifugation durch die Membran hindurchgeführt(5 min bei 6000 UpM) und die Elution wiederholt.toDNA isolation is the tissue after storage from the solutionsand 10 mg tissue in 180 μl buffer ALTof the manufacturer QIAGEN. The sample is made using a ball mill,such as Tissue Lyzer from QIAGEN, over a period of timeof 30 s at 25 Hz homogenized with a 5 mm steel ball and thencentrifuged for 15 s at 14,000 × g. After addingof 120 μl of the protease K solution (manufacturer QIAGEN)the lysates are kept at 55 ° C for 2 hoursShaking incubated. After incubation, 4 μlAdd RNAse A (100 mg / ml), mix and mix forIncubated for 2 min at room temperature. After incubation, 300 μla commercially available guanidinium hydrochloride-containingLysis buffer, such as the buffer AL of the manufacturer QIAGEN addedand mixing the samples by vortexing. There is an incubationat 70 ° C for 10 min. After mixing with 300 μl100% ethanol samples are placed on a silica membrane96 well plate (DNeasy 96-plate from QIAGEN) and appliedthe lysate by centrifugation for 10 min at 6000 rpmpassed through the membrane. The DNA remains bound to the membraneand is first with a first commercialGuanidinium hydrochloride-containing wash buffer, for example withbuffer AW1 from QIAGEN, and then with a second alcohol-containing washing buffer,z. B. buffer AW2 from QIAGEN, washed. This will be the wash buffereach by centrifugation (5 min at 6000 rpm) through the membranepassed. Following is the plate forIncubated at 70 ° C for 10 min. The elution of the DNA takes placeby application of 200 .mu.l of the preheated to 70 ° C.Elution buffer AE (QIAGEN). After a one-minute incubationThe elution buffer is passed through the membrane by centrifugation(5 min at 6000 rpm) and the elution repeated.

DieMenge an isolierter Gesamt-DNA wird nach Verdünnung inWasser durch photometrische Messung der Lichtabsorption bei einerWellenlänge von 260 nm ermittelt. Die Qualitätder so gewonnenen DNA wird durch die photometrische Bestimmung desVerhältnisses der Lichtabsorption bei 260 nm zu derjenigen bei280 nm bestimmt. Die Ergebnisse der Isolierungen sind in Tabelle2 dargestellt. Tabelle 2BehandlungszusammensetzungLagerung260nm/280 nmDNA-Ausbeute[μg]DMSO +50 mM N-Ethylmaleimid1d37°C1,8714,63dRT1,9718,37dRT2,0121,53d4°C2,0227,230% Phenol in DMSO + 50 mM N-Ethylmaleimid3d25°C1,9714,07d25°C1,9819,53d4°C1,9919,37d4°C1,9919,9The amount of isolated total DNA is determined after dilution in water by photometric measurement of light absorption at a wavelength of 260 nm. The quality of the DNA thus obtained is determined by the photometric determination of the ratio of light absorption at 260 nm to that at 280 nm. The results of the insulations are shown in Table 2. Table 2 treatment composition storage 260 nm / 280 nm DNA yield [μg] DMSO + 50 mM N-ethylmaleimide 1d 37 ° C 1.87 14.6 3d RT 1.97 18.3 7d RT 2.01 21.5 3d 4 ° C 2.02 27.2 30% phenol in DMSO + 50 mM N-ethylmaleimide 3d 25 ° C 1.97 14.0 7d 25 ° C 1.98 19.5 3d 4 ° C 1.99 19.3 7d 4 ° C 1.99 19.9

Wieder Tabelle 2 zu entnehmen ist, können durch den Zusatzvon N-Ethylmaleimid als Additiv in Stabilisierungszusammensetzungenbiologische Proben für lange Zeiträume bei moderatenTemperaturen gelagert und trotzdem auch noch ausreichende Mengenan DNA in guter Qualität aus den Proben isoliert werden.AsTable 2 can be found by the additionof N-ethylmaleimide as an additive in stabilizing compositionsbiological samples for long periods at moderateTemperatures stored and still sufficient quantitiesto isolate DNA from the samples in good quality.

3. Stabilisierung von Proteinen in biologischenProben in Gegenwart von N- Ethylmaleimid3. Stabilization of proteins in biologicalSamples in the presence of N-ethylmaleimide

Lebergewebeder Ratte wurde unverzüglich nach Organentnahme mit je1 ml 30% Phenol in DMSO + 50 mM N-Ethylmaleimid (Probe 1), DMSO+ 50 mM N-Ethylmaleimid (Probe 2) und 100% DMSO (als Negativkontrolle,Probe 3) für 3 Tage bei Raumtemperatur gelagert. Im Anschlussan die Lagerung wird ein Proteinextrakt aus den gelagerten Probenhergestellt.liver tissuethe rat was immediately after organ removal with ever1 ml of 30% phenol in DMSO + 50 mM N-ethylmaleimide (Sample 1), DMSO+ 50 mM N-ethylmaleimide (Sample 2) and 100% DMSO (as a negative control,Sample 3) stored for 3 days at room temperature. In connectionThe storage is a protein extract from the stored samplesproduced.

ZurHerstellung des Proteinextraktes wird das Gewebe nach Lagerung ausden Lösungen entfernt und je 10 mg Gewebe 400 μleines üblichen Extraktionspuffers, hier in einer Zusammensetzungvon 8 M Harnstoff, 100 mM Natriumdihydrogenphosphat und 10 mM Tris,pH 8,0, zugeben und die Probe mit Hilfe einer Kugelmühle,z. B. dem TissueLyzer der Firma QIAGEN, homogenisiert. Das so entstandeneLysat wird für 15 s bei möglichst hoher Drehzahl(z. B. ca. 20000 × g) zentrifugiert um ungelösteBestandteile zu pelletieren. Der proteinhaltige Überstandwird abgenommen und die Proteinkonzentration mittels eines Bradford-Testesbestimmt. Je 1,5 μg Protein wird auf einem SDS-Polyacrylamidgelnach üblichem Verfahren aufgetrennt und mittels einer Semidry-Blotting-Apperaturnach Angaben des Herstellers auf eine Nitrozellulosemembran geblottet. DieMembran wird nach dem Stand der Technik mit Milchpulver abgesättigtund mit einem ERK2-spezifischen Antikörper sowie einemTubulin-spezifischen Antikörper nach Angaben des Herstellershybridisiert, und eine Immunodetektion durchgeführt. DieErgebnisse sind in1 gezeigt.To prepare the protein extract, the tissue is removed from the solutions after storage and 10 mg of tissue, 400 .mu.l of a conventional extraction buffer, here in a composition of 8 M urea, 100 mM sodium dihydrogen phosphate and 10 mM Tris, pH 8.0, and the sample with the help of a ball mill, z. B. the Tissue Lyzer QIAGEN, homogenized. The resulting lysate is centrifuged for 15 s at the highest possible speed (eg about 20,000 × g) to pellet undissolved constituents. The protein-containing supernatant is removed and the protein concentration is determined by means of a Bradford test. Each 1.5 μg of protein is separated on an SDS-polyacrylamide gel according to the usual method and blotted by means of a semidry blotting apparatus according to the manufacturer on a nitrocellulose membrane. The membrane is saturated with milk powder according to the prior art and hybridized with an ERK2-specific antibody and a tubulin-specific antibody according to the manufacturer, and performed an immunodetection. The results are in 1 shown.

DerNachweis spezifischer Proteine belegt, dass die Proteine durch dieN-Ethylmaleimidhaltige Zusammensetzung bei Raumtemperatur in Gewebenstabilisiert werden, während ohne Zusatz dieses Additivs (Bahn3) keinerlei Protein nachweisbar ist.Of theDetection of specific proteins proves that the proteins through theN-ethylmaleimide-containing composition at room temperature in tissuesstabilized while without addition of this additive (lane3) no protein is detectable.

4. Transition gefrorener biologischerProben in Gegenwart von N-Ethylmaleimid4. Transition of frozen biologicalSamples in the presence of N-ethylmaleimide

Lebergewebeaus Ratte, welches nach Entnahme in flüssigem Stickstoffeingefroren und bei –70°C gelagert wurde, wirdfür diesen Versuch verwendet. Für jedes Transitionssexperimentwerden 20 bis 50 mg Gewebe abgewogen und gefroren mit verschiedenen,nicht-gekühlten (Raumtemperatur) Transistionssreagenzien(DMSO bzw. Mischungen aus DMSO und Phenol) versetzt und für3 Tage bei Raumtemperatur gelagert. Für die Transitionwerden zum einen je 1 ml der Lösung direkt verwendet undzum anderen je 950 μl der Lösung mit 50 μl1 M N-Ethylmaleimid gemischt zu einer Endkonzentration von 50 mMNEM (verwendete Lösungen siehe Tabelle 3). Im Anschlussan die Transition wird die RNA aus den gelagerten Proben isoliert.liver tissuefrom rat, which after removal in liquid nitrogenfrozen and stored at -70 ° C isused for this experiment. For every transition experiment20 to 50 mg of tissue are weighed and frozen with different,non-cooled (room temperature) transit reagents(DMSO or mixtures of DMSO and phenol) and forStored for 3 days at room temperature. For the transitionFor one, 1 ml of the solution is used directly andon the other 950 μl each of the solution with 50 μl1 M N-ethylmaleimide mixed to a final concentration of 50 mMNEM (solutions used see Table 3). In connectionto the transition, the RNA is isolated from the stored samples.

Dazuwird das Gewebe nach Lagerung aus den Behandlungslösungenentfernt und zu je 10 mg Gewebe 350 μl eines handelsüblichenGuanidinium-Isothiocyanat-Puffers, wie z. B. RLT-Puffer der FirmaQIAGEN zugeben. Die Probe wird mit Hilfe einer Kugelmühle,wie z. B. MM300 der Firma QIAGEN, über einen Zeitraum von2 × 2 min bei 20 Hz mit einer 5 mm Stahlkugel homogenisiert,wobei der Guanidinium-Isothiocyanat-Puffer auf aus dem Stand derTechnik bekannte Weise die Zellen lysiert und die freigesetztenProteine denaturiert. Anschließend werden die Lysate bei14000 UpM für 3 min zentrifugiert. Vom Überstandwerden zwei Portionen von je 350 μl, die entsprechend 10mg Gewebe repräsentieren, abgenommen. Zu diesen Probenwird 1 Volumen (350 μl) 70%-iger Ethanol zugefügtund durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren oder durch Vortexen übereinen Zeitraum von ca. 5 s gemischt. Das Lysat wird anschließendin eine handelsübliche Silicamembran enthaltene sein-Säule,wie z. B. RNeasy-Säulen der Firma QIAGEN, aufgetragen unddurch Zentrifugation (1 min bei 10.000 × g) durch die Membranhindurchgeführt. Die RNA bleibt an der Membran gebunden undwird anschließend mit einem ersten handelsüblichenGuanidinium-Isothiocyanat-haltigen Waschpuffer, beispielsweise mitdem Puffer RW1 der Firma QIAGEN, und danach mit einem zweiten Tris-haltigen bzw.Tris- und alkoholhaltigen Waschpuffer, z. B. Puffer RPE der FirmaQIAGEN, gewaschen. Dabei werden die Waschpuffer jeweils durch Zentrifugation(1 min bei 10.000 × g) durch die Membran hindurchgeführt.Die Waschung mit dem zweiten Tris-haltigen bzw. Tris- und alkoholhaltigenWaschpuffer wird mit einem geringeren Volumen wiederholt, wobeigleichzeitig die Membran durch die Zentrifugation (2 min bei 20.000 × g)getrocknet wird. Zur Elution werden 40 μl RNase-freiesWasser auf die Membran pipettiert, um die gereinigte RNA von derMembran abzulösen. Nach einer Inkubation von 1 min. beieiner Temperatur im Bereich von 10–30°C wird dasEluat durch Zentrifugation (1 min bei 10.000 × g) durchdie Membran hindurchgeführt und der Elutionsschritt wirdzum Zwecke einer vollständigen Elution noch einmal wiederholt.For this purpose, the tissue is removed after storage from the treatment solutions and to each 10 mg tissue 350 ul of a commercial guanidinium isothiocyanate buffer such. B. RLT buffer the company QIAGEN admit. The sample is removed by means of a ball mill, such. B. MM300 QIAGEN, homogenized over a period of 2 × 2 min at 20 Hz with a 5 mm steel ball, wherein the guanidinium isothiocyanate buffer on known from the prior art, the cells lysiert and denature the released proteins. Subsequently, the lysates are centrifuged at 14000 rpm for 3 min. From the supernatant, two portions of 350 μl each, corresponding to 10 mg of tissue, are removed. To this Pro 1 volume (350 ul) of 70% ethanol is added and mixed by repeated pipetting up or down or by vortexing over a period of about 5 s. The lysate is then in a commercially available silica membrane be column such. B. RNeasy columns from QIAGEN, applied and passed through the membrane by centrifugation (1 min at 10,000 × g). The RNA remains bound to the membrane and is then washed with a first commercially available guanidinium isothiocyanate-containing wash buffer, for example with the buffer RW1 from QIAGEN, and then with a second Tris-containing or tris and alcohol-containing wash buffer, z. B. Buffer RPE from QIAGEN, washed. The washing buffers are in each case passed through the membrane by centrifugation (1 min at 10,000 × g). The washing with the second Tris-containing or alcoholic wash buffer is repeated with a smaller volume, while the membrane is dried by centrifugation (2 min at 20,000 × g). For elution, 40 μl of RNase-free water are pipetted onto the membrane to detach the purified RNA from the membrane. After incubation for 1 min. at a temperature in the range of 10-30 ° C, the eluate is passed through the membrane by centrifugation (1 min at 10,000 x g) and the elution step is repeated once more for the purpose of complete elution.

ImAnschluss werden die Menge und Qualität an isolierter Gesamt-RNAbestimmt, wie unter Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse sindebenfalls in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3Behandlungszusammensetzung260nm/280 nmRNA-Ausbeute[μg]100%DMSO1,7918,7100%DMSO + 50 μl 1 M N-Ethylmaleimid1,8341,55,4ml DMSO + 0,27 g Phenol1,7518,55,4ml DMSO + 0,27 g Phenol + 50 μl 1 M N-Ethylmaleimid1,8354,24,97ml DMSO + 0,497 g Phenol1,7931,94,97ml DMSO + 0,497 g Phenol + 50 μl 1 M N-Ethylmaleimid1,8352,35,32ml DMSO + 1,33 g Phenol1,7735,05,32ml DMSO + 1,33 g Phenol + 50 μl 1 M N-Ethylmaleimid1,7956,04,28ml DMSO + 1,71 g Phenol + 50 μl 1 M N-Ethylmaleimid1,7831,34,28ml DMSO + 1,71 g Phenol + 50 μl 1 M N-Ethylmaleimid1,8245,2Subsequently, the amount and quality of isolated total RNA are determined, as described in Example 1. The results are also shown in Table 3. Table 3 treatment composition 260 nm / 280 nm RNA yield [μg] 100% DMSO 1.79 18.7 100% DMSO + 50 μl 1 M N-ethylmaleimide 1.83 41.5 5.4 ml of DMSO + 0.27 g of phenol 1.75 18.5 5.4 ml DMSO + 0.27 g phenol + 50 μl 1 M N-ethylmaleimide 1.83 54.2 4.97 ml of DMSO + 0.497 g of phenol 1.79 31.9 4.97 ml DMSO + 0.497 g phenol + 50 μl 1 M N-ethylmaleimide 1.83 52.3 5.32 ml DMSO + 1.33 g phenol 1.77 35.0 5.32 ml DMSO + 1.33 g phenol + 50 μl 1 M N-ethylmaleimide 1.79 56.0 4.28 ml DMSO + 1.71 g phenol + 50 μl 1 M N-ethylmaleimide 1.78 31.3 4.28 ml DMSO + 1.71 g phenol + 50 μl 1 M N-ethylmaleimide 1.82 45.2

DerTabelle 3 ist zu entnehmen, dass N-Ethylmaleimid auch in Transitionslösungeneinen positiven Einfluss auf die Stabilisierung von RNA in biologischenProben aufweist.Of theTable 3 shows that N-ethylmaleimide also in transition solutionsa positive influence on the stabilization of RNA in biologicalHaving samples.

5. Transition gefrorener biologischerProben in Gegenwart von N-Ethylmaleimid5. Transition of frozen biologicalSamples in the presence of N-ethylmaleimide

Lebergewebeaus Ratte, welches nach Entnahme in flüssigem Stickstoffeingefroren und bei –70°C gelagert wurde, wirdfür diesen Versuch verwendet. Für jedes Transitionssexperimentwerden 20 bis 50 mg Gewebe abgewogen und gefroren mit verschiedenen,nicht-gekühlten (Raumtemperatur) Transitionsreagenzienversetzt und für 3 Tage bei 4°C gelagert. Fürdie Transition werden zum einen je 1 ml der Lösung direkt verwendetund zum anderen je 950 μl der Lösung mit 100 μl1 M N-Ethylmaleimid gemischt (verwendete Lösungen sieheTabelle 4). Im Anschluss an die Transition wird die RNA aus dengelagerten Proben isoliert und die Menge und Qualität derRNA bestimmt, wie unter Beispiel 4 beschrieben. Die Ergebnisse sindebenfalls der Tabelle 4 zu entnehmen. Tabelle 4Behandlungszusammensetzung260nm/280 nmRNA-Ausbeute[μg]35%Ammoniumsulfit2,1635%Ammoniumsulfit + 100 μl 1 M N-Ethylmaleimid1,9421,512,4MLithiumnitrat1,993,312,4M Lithiumnitrat + 100 μl 1 M N-Ethylmaleimid2,0714,710,5M Kaliumacetat1,97610,5M Kaliumacetat + 100 μl 1 MN-Ethylmaleimid2,18,6100%Ethylenglycol2,0318,9100%Ethylenglycol + 100 μl 1 M N-Ethylmaleimid1,929,3Rat liver tissue, which was frozen in liquid nitrogen after collection and stored at -70 ° C, is used for this experiment. For each transition experiment, 20 to 50 mg of tissue are weighed and frozen with various non-cooled (room temperature) transition reagents and stored for 3 days at 4 ° C. On the one hand, 1 ml of the solution is used directly for the transition and, on the other hand, 950 μl of the solution are mixed with 100 μl of 1 M N-ethylmaleimide (solutions used, see Table 4). Following the transition, the RNA is isolated from the stored samples and the amount and quality of the RNA determined as described in Example 4. The results are also shown in Table 4. Table 4 treatment composition 260 nm / 280 nm RNA yield [μg] 35% ammonium sulfite 2.1 6 35% ammonium sulfite + 100 μl 1 M N-ethylmaleimide 1.94 21.5 12.4M lithium nitrate 1.99 3.3 12.4 M lithium nitrate + 100 μl 1 M N-ethylmaleimide 2.07 14.7 10.5 M potassium acetate 1.97 6 10.5 M potassium acetate + 100 μl 1 MN-ethylmaleimide 2.1 8.6 100% ethylene glycol 2.03 18.9 100% ethylene glycol + 100 μl 1 M N-ethylmaleimide 1.9 29.3

Auchder Tabelle 4 ist zu entnehmen, dass N-Ethylmaleimid in Transitionslösungeneinen positiven Einfluss auf die Stabilisierung von RNA in biologischenProben aufweist.AlsoTable 4 shows that N-ethylmaleimide in transition solutionsa positive influence on the stabilization of RNA in biologicalHaving samples.

6. Transition biologischer Proben in Gegenwartvon N-Ethylmaleimid6. Transition of biological samples in the presenceof N-ethylmaleimide

Nierengewebeaus Ratte, welches nach Entnahme in flüssigem Stickstoffeingefroren und bei –70°C gelagert wurde, wirdfür diesen Versuch verwendet. Für jedes Transitionssexperimentwerden 10 bis 30 mg Gewebe abgewogen und gefroren mit verschiedenen,nicht-gekühlten (Raumtemperatur) Transistionssreagenzienversetzt und für 5 Tage bei Raumtemperatur gelagert. Fürdie Transition werden zum einen je 1 ml der Lösung mit50 μl 1 M N-Ethylmaleimid gemischt (verwendete Lösungensiehe Tabelle 5). Im Anschluss an die Transition wird die RNA ausden gelagerten Proben isoliert und die Menge und Qualitätder RNA bestimmt, wie unter Beispiel 4 beschrieben. Die Ergebnissesind ebenfalls der Tabelle 5 zu entnehmen. Tabelle 5Behandlungszusammensetzung260nm/280 nmRNA-Ausbeute[μg]75%DMSO1,916,975%DMSO + 50 μl 1 M N-Ethylmaleimid1,8724,650%Ethanol + 50% Aceton + 10 μl Trichloressigsäure2,005,750%Ethanol + 50% Aceton + 10 μl Trichloressigsäure+ 50 μl 1 M N-Ethylmaleimid19,228,350%Ethanol + 50% Aceton + 10 μl Essigsäure1,919,850%Ethanol + 50% Aceton + 10 μl Essigsäure + 50 μl1 M N-Ethylmaleimid1,981,45Rat kidney tissue, which was frozen in liquid nitrogen after collection and stored at -70 ° C, is used for this experiment. For each transition experiment, 10 to 30 mg of tissue are weighed and frozen with various non-cooled (room temperature) transient reagents and stored for 5 days at room temperature. For the transition, firstly 1 ml of the solution is mixed with 50 μl of 1 M N-ethylmaleimide (solutions used, see Table 5). Following the transition, the RNA is isolated from the stored samples and the amount and quality of the RNA determined as described in Example 4. The results are also shown in Table 5. Table 5 treatment composition 260 nm / 280 nm RNA yield [μg] 75% DMSO 1.91 6.9 75% DMSO + 50 μl 1 M N-ethylmaleimide 1.87 24.6 50% ethanol + 50% acetone + 10 μl trichloroacetic acid 2.00 5.7 50% ethanol + 50% acetone + 10 μl trichloroacetic acid + 50 μl 1 M N-ethylmaleimide 19.2 28.3 50% ethanol + 50% acetone + 10 μl acetic acid 1.91 9.8 50% ethanol + 50% acetone + 10 μl acetic acid + 50 μl 1 M N-ethylmaleimide 1.98 1.45

Auchder Tabelle 5 ist zu entnehmen, dass durch den Zusatz von N-Ethylmaleimidin den hier beschriebenen Transitionslösungen die Stabilisierungvon RNA in biologischen Proben verbessert wird.AlsoTable 5 shows that by the addition of N-ethylmaleimidestabilization in the transition solutions described hereof RNA in biological samples is improved.

Dieisolierte RNA wird auf Agarosegelen, die mit Ethidiumbromid angefärbtsind, analysiert. Hierzu werden beispielsweise 1,0%ige Formaldehyd-Agarose-MOPS-Geleangefertigt. Es werden jeweils 5 μl des Eluates eingesetzt.Das Ergebnis ist in der2 gezeigt. Aus dieser2 istersichtlich, dass N-Ethylmaleimid auch einen positiven Einflussauf die Qualität der RNA aufweist.The isolated RNA is analyzed on agarose gels stained with ethidium bromide. For this example, 1.0% formaldehyde-agarose MOPS gels are made. In each case 5 .mu.l of the eluate are used. The result is in the 2 shown. From this 2 It can be seen that N-ethylmaleimide also has a positive influence on the quality of the RNA.

7. Transition biologischerProben in Gegenwart von verschiedenen Maleimid-Derivaten7. Transition biologicalSamples in the presence of various maleimide derivatives

Lebergewebeaus Ratte, welches nach Entnahme in flüssigem Stickstoffeingefroren und bei –70°C gelagert wurde, wirdfür diesen Versuch verwendet. Für jedes Transitionsexperimentwerden 10 bis 30 mg Gewebe abgewogen und gefroren mit verschiedenen,nicht vorgekühlten (Raumtemperatur) Transitionsreagenzienversetzt und für 3 Tage bei Raumtemperatur gelagert. Fürdie Stabilisierung werden zum einen 0,5 ml 100% DMSO als Kontrolleverwendet. Zum anderen werden je 0,5 ml einer Lösung ausDMSO und den verschiedenen, in A. dest gelösten Additivenhergestellt (verwendete Lösungen siehe Tabelle 6). Im Anschlussan die Lagerung wird die RNA aus den gelagerten Proben isoliertund die Menge und die Qualität der isolierten RNA bestimmt,wie im Beispiel 4 beschrieben. Die Ergebnisse sind ebenfalls derTabelle 6 zu entnehmen. Tabelle 6Behandlungszusammensetzung260nm/280 nmRNA-Ausbeute[μg]500 μl100% DMSO1,9216,6450 μl100% DMSO + 50 μl 1 M N-Ethylmaleimid2,0854,2375 μl100% DMSO + 125 μl 1 M N-Methylmaleimid2,065,25487 μl100% DMSO + 13 μl 3,75 M Maleinsäure2,0730,0375 μl100% DMSO + 125 μl in Wasser gesättigter Fumarsäurelösung20,042,57Rat liver tissue, which was frozen in liquid nitrogen after collection and stored at -70 ° C, is used for this experiment. For each transition experiment, 10 to 30 mg of tissue are weighed and frozen with various non-precooled (room temperature) transition reagents and stored for 3 days at room temperature. For stabilization, 0.5 ml of 100% DMSO is used as a control. On the other hand, each 0.5 ml of a solution of DMSO and ver different, in A. least dissolved additives prepared (solutions used see Table 6). Following storage, the RNA is isolated from the stored samples and the amount and quality of the isolated RNA determined as described in Example 4. The results are also shown in Table 6. Table 6 treatment composition 260 nm / 280 nm RNA yield [μg] 500 μl 100% DMSO 1.92 16.6 450 μl 100% DMSO + 50 μl 1 M N-ethylmaleimide 2.08 54.2 375 μl 100% DMSO + 125 μl 1 M N-methylmaleimide 2.06 5.25 487 μl 100% DMSO + 13 μl 3.75 M maleic acid 2.07 30.0 375 μl 100% DMSO + 125 μl fumaric acid solution saturated in water 20,04 2.57

DerTabelle 6 ist zu entnehmen, dass neben N-Ethylmaleimid auch N-Methylmaleimid,Maleinsäure und Fumarsäure in Transitionslösungeneinen positiven Einfluss auf die Stabilisierung von RNA in biologischen Probenaufweisen.Of theTable 6 shows that in addition to N-ethylmaleimide also N-methylmaleimide,Maleic acid and fumaric acid in transition solutionsa positive influence on the stabilization of RNA in biological samplesexhibit.

N-Methylmaleimidweist folgende Strukturformel (IX) auf:

N-methylmaleimide has the following structural formula (IX):

8. Lagerung biologischer Proben außerhalbder Behandlungs-Zusammensetzungen8. Storage of biological samples outsidethe treatment compositions

Lebergewebeder Ratte, welches nach Entnahme in flüssigem Stickstoffeingefroren und bei –70°C gelagert wurde, wirdfür diesen Versuch verwendet. Als Transitionszusammensetzungwird eine Lösung aus 30% Phenol gelöst in DMSOangesetzt und 1.350 μl dieser Lösung mit 150 μl1 M NEM vermischt, so dass die Endkonzentration an NEM 100 mM beträgt.Für das Transitionsexperiment wird ca. 150 mg Gewebe abgewogen undgefroren mit der im Kühlschrank auf 2 bis 8°Cvorgekühlten Lösung versetzt. Die Probe wird überNacht bei 2 bis 8°C im Kühlschrank gelagert.liver tissuethe rat, which after removal in liquid nitrogenfrozen and stored at -70 ° C isused for this experiment. As transition compositionis a solution of 30% phenol dissolved in DMSOand added 1,350 μl of this solution with 150 μl1 M NEM mixed so that the final concentration of NEM is 100 mM.For the transition experiment approx. 150 mg tissue is weighed andfrozen in the refrigerator at 2 to 8 ° Cpre-cooled solution. The sample is overStore overnight at 2 to 8 ° C in the refrigerator.

Nachder Transition werden die Proben aus der Transitionszusammensetzungentnommen, zerteilt und in Teile (ca. 10–30 mg) trockenbei Raumtemperatur für 30 min, 45 min, 60 min, 90 min,2 h 30 min und 4 h 30 min gelagert. Anschließend wird dieRNA, wie unter Beispiel 4 beschrieben, isoliert und, wie im Beispiel 6beschrieben, auf ein Agarose-Gel aufgetragen. Das Ergebnis ist in3 gezeigt.After the transition, the samples are removed from the transition composition, dissected and stored in parts (about 10-30 mg) dry at room temperature for 30 minutes, 45 minutes, 60 minutes, 90 minutes, 2 hours 30 minutes and 4 hours 30 minutes. Subsequently, the RNA, as described in Example 4, isolated and, as described in Example 6, applied to an agarose gel. The result is in 3 shown.

Ausder3 wird ersichtlich, dass die erfindungsgemäß stabilisiertenProben auch außerhalb der Behandlungszusammensetzungenfür lange Zeit gelagert werden können, ohne dassdie Qualität der aus diesen Proben isolierten RNA erkennbarverschlechtert wird.From the 3 It can be seen that the samples stabilized according to the invention can also be stored outside of the treatment compositions for a long time, without the quality of the RNA isolated from these samples being noticeably worsened.

9. Transition biologischerProben in Gegenwart von verschiedenen Maleimid-Derivaten9. Transition biologicalSamples in the presence of various maleimide derivatives

Lebergewebeder Ratte, welches nach Entnahme in flüssigem Stickstoffeingefroren und bei –70°C gelagert wurde, wirdfür diesen Versuch verwendet. Für die Transitionsexperimentewerden 15 bis 50 mg Gewebe abgewogen und gefroren mit 1 M N-Ethylmaleimidbzw. mit 0,2 M N-Methylmaleimid, jeweils gelöst in Wasser, versetztund bei 4°C oder Raumtemperatur gelagert. Die Transitionslösungenwerden dabei vor dem Einsatz nicht vorgekühlt, dass heißtsie werden bei Raumtemperatur verwendet. Im Anschluss an die Lagerungwird die RNA aus den gelagerten Proben isoliert und die Menge unddie Qualität der isolierten RNA bestimmt, wie im Beispiel4 beschrieben. Die Ergebnisse sind der Tabelle 7 zu entnehmen. Tabelle 7:BehandlungszusammensetzungLagerung260nm/280 nmRNA-Ausbeute[μg]1 M N-Ethylmaleimid1d4°C1,7531,11dRT1,8021,43dRT1,7920,00,2M N-Methylmaleimid3dRT1,9624,9Rat liver tissue, which was frozen in liquid nitrogen after collection and stored at -70 ° C, is used for this experiment. For the transition experiments, 15 to 50 mg of tissue are weighed and frozen with 1 M N-ethylmaleimide or with 0.2 M N-methylmaleimide, in each case dissolved in water, and stored at 4 ° C or room temperature. The transition solutions are not precooled before use, ie they are used at room temperature. Following storage, the RNA is isolated from the stored samples and the amount and quality of the isolated RNA determined as described in Example 4. The results are shown in Table 7. Table 7: treatment composition storage 260 nm / 280 nm RNA yield [μg] 1 M N-ethylmaleimide 1d 4 ° C 1.75 31.1 1d RT 1.80 21.4 3d RT 1.79 20.0 0.2 M N-methylmaleimide 3d RT 1.96 24.9

DerTabelle 7 ist zu entnehmen, dass N-Ethylmaleimid und N-Methylmaleimidauch in Wasser, das selber keine Stabilisierungseigenschaften aufweist,als Transitionslösungen die Stabilisierung von RNA beimoderaten Temperaturen in biologischen Proben ermöglichen.Of theTable 7 shows that N-ethylmaleimide and N-methylmaleimidealso in water, which itself has no stabilizing properties,as transition solutions the stabilization of RNAallow moderate temperatures in biological samples.

10. Stabilisierung biologischerProben in Gegenwart von Fumarsäuren10. Stabilization of biologicalSamples in the presence of fumaric acids

Lebergewebeder Ratte wurde unverzüglich nach Organentnahme in Mischungenaus Polyolen und Fumarsäure (siehe Tabelle 8) versetztund 3 Tage bei Raumtemperatur gelagert. Die Fumarsäurewurde 10%ig in Ethanol gelöst und mit den in den in derTabelle 8 aufgeführten Polyolzusammensetzungen vermischt.Im Anschluss an die Lagerung wird die RNA aus den gelagerten Probenisoliert und die Menge und die Qualität der isoliertenRNA bestimmt, wie im Beispiel 4 beschrieben. Die Ergebnisse sindder Tabelle 8 zu entnehmen. Tabelle 8:BehandlungszusammensetzungRNA-Ausbeute[μg]10vol% Fumarsäurelösung + 90 vol% einer Mischungaus 25% 1,2,3-Propantriol + 75% 3-Methyl-1,3,5-Propantriol42,625vol% Fumarsäurelösung + 75 vol% einer Mischungaus 25% 1,2,3-Propantriol + 75% 3-Methyl-1,3,5-Propantriol41,610vol% Fumarsäurelösung + 90 vol% einer Mischungaus 75% 1,2,6-Hexantriol + 75% 3-Methyl-1,3,5-Propantriol21,825vol% Fumarsäurelösung + 75 vol% einer Mischungaus 75% 1,2,6-Hexantriol + 75% 3-Methyl-1,3,5-Propantriol39,9Rat liver tissue was immediately after organ removal in mixtures of polyols and fumaric acid (see Table 8) and stored for 3 days at room temperature. The fumaric acid was dissolved in ethanol at 10% and mixed with the polyol compositions listed in Table 8. Following storage, the RNA is isolated from the stored samples and the amount and quality of the isolated RNA determined as described in Example 4. The results are shown in Table 8. Table 8: treatment composition RNA yield [μg] 10% by volume fumaric acid solution + 90% by volume of a mixture of 25% 1,2,3-propanetriol + 75% 3-methyl-1,3,5-propanetriol 42.6 25% by volume of fumaric acid solution + 75% by volume of a mixture of 25% 1,2,3-propanetriol + 75% 3-methyl-1,3,5-propanetriol 41.6 10% by volume of fumaric acid solution + 90% by volume of a mixture of 75% 1,2,6-hexanetriol + 75% 3-methyl-1,3,5-propanetriol 21.8 25% by volume of fumaric acid solution + 75% by volume of a mixture of 75% 1,2,6-hexanetriol + 75% 3-methyl-1,3,5-propanetriol 39.9

Dievorstehend beschriebenen Beispiele zeigen, dass Fumarsäure,Maleinsäure, Maleinsäurederivate und Maleimidewie N-Ethylmaleimid oder N-Methylmaleimid in unterschiedlichstenZusammensetzungen einen positiven Einfluss auf die Stabilisierungvon Biomolekülen, insbesondere von Nukleinsäurenoder Proteinen, sowohl bei der Behandlung frischer, nicht-geforenerbiologischer Proben als auch bei der Behandlung gefrorner biologischerProben hat.TheExamples described above show that fumaric acid,Maleic acid, maleic acid derivatives and maleimidessuch as N-ethylmaleimide or N-methylmaleimide in a wide varietyCompositions have a positive influence on the stabilizationof biomolecules, in particular of nucleic acidsor proteins, both in the treatment of fresh, non-frozenbiological samples as well as in the treatment of frozen biologicalHas samples.

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Claims (13)

Translated fromGerman

Ein Verfahren zur Behandlung einer biologischenProbe, umfassend die Verfahrensschritte i) Bereitstellen einerbiologischen Probe, und ii) in Kontakt bringen der biologischenProbe mit Butendisäure oder mit einem Derivat der Butendisäure.A method of treating a biologicalSample comprising the method stepsi) provide abiological sample, andii) contacting the biologicalSample with butenedioic acid or with a derivative of butenedioic acid.Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Derivat derButendisäure ein Maleinsäurederivat ist, welchesdie Struktur (III)

aufweist, in der inder X a) ein Sauerstoffatom, b) eine Gruppe der Struktur(IV)

c) oder eine Gruppe NR¹ ist, wobei R¹ – eingegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter Alkyl-Restmit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomenund besonderes bevorzugt mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, – ein gegebenenfallsStickstoff oder Halogen substituierter Aryl-Rest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen,beispielsweise mit 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Kohlenstoffatomen, – einCOOR³-Rest, in dem R³ einWasserstoffatome oder ein Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und besonderes bevorzugtmit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 1, 2, 3, 4, 5oder 6 Kohlenstoffatomen ist, – ein Wasserstoffatomoder – ein -NR⁴R⁵-Restist, in dem R⁴ und R⁵ einWasserstoffatom, ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierterAlkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis4 Kohlenstoffatomen und besonderes bevorzugt mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen,beispielsweise mit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen oder ein gegebenenfallsStickstoff oder Halogen substituierter Aryl-Rest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen,beispielsweise mit 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Kohlenstoffatomenist, und wobei R² – einWasserstoffatom, – ein gegebenenfalls Stickstoff oderHalogen substituierter Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und besonderes bevorzugtmit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 1, 2, 3, 4, 5oder 6 Kohlenstoffatomen, oder – ein gegebenenfallsStickstoff oder Halogen substituierter Aryl-Rest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen,beispielsweise mit 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Kohlenstoffatomen, ist.Process according to claim 1, wherein the derivative of the butenedioic acid is a maleic acid derivative having the structure (III)

in which in the X a) an oxygen atom, b) a group of the structure (IV)

c) or a group NR¹ , wherein R¹ - is an optionally nitrogen or halogen-substituted alkyl radical having 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms and more preferably 1 to 3 carbon atoms, for example 1, 2, 3 , 4, 5 or 6 carbon atoms, - an optionally nitrogen or halogen-substituted aryl radical having 6 to 12 carbon atoms, for example with 6, 7, 8, 9, 10, 11 or 12 carbon atoms, - a COOR³ radical in which R^{3 is} a hydrogen atom or an alkyl radical having 1 to 6 carbon atoms, preferably having 1 to 4 carbon atoms and more preferably having 1 to 3 carbon atoms, for example having 1, 2, 3, 4, 5 or 6 carbon atoms, - a hydrogen atom or - is an -NR⁴ R⁵ radical in which R⁴ and R^{5 is} a hydrogen atom, an optionally nitrogen or halogen-substituted alkyl radical having 1 to 6 carbon atoms, preferably having 1 to 4 carbon atoms and particularly preferably with 1 to 3 carbon atoms, for example with 1, 2, 3, 4, 5 or 6 carbon atoms or an optionally nitrogen or halogen-substituted aryl radical having 6 to 12 carbon atoms, for example 6, 7, 8, 9, 10, 11 or 12 carbon atoms, and wherein R^{2 is} a hydrogen atom, an optionally nitrogen or halogen-substituted alkyl radical having 1 to 6 carbon atoms, preferably having 1 to 4 carbon atoms and particularly preferably having 1 to 3 carbon atoms, for example 1, 2, 3, 4, 5 or 6 carbon atoms, or - an optionally nitrogen or halogen substituted aryl radical having 6 to 12 carbon atoms, for example with 6, 7, 8, 9, 10, 11 or 12 carbon atoms.Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich beider biologischen Probe um eine gefrorene oder eine nicht-gefrorenebiologische Probe handelt.The method of claim 1 or 2, wherein it is atthe biological sample around a frozen or a non-frozen onebiological sample.Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,wobei die Butendisäure oder deren Derivat in Form einerZusammensetzung umfassend die Butendisäure oder deren Derivatsowie mindestens eine weitere Komponente ausgewählt auseinem Lösungsmittel, einem Zusatzstoff oder einer Mischunghieraus vorliegt.Method according to one of the preceding claims,wherein the butenedioic acid or its derivative in the form of aA composition comprising the butenedioic acid or its derivativeand at least one further component selected froma solvent, an additive or a mixturethis is the case.Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich bei demLösungsmittel um ein Lösungsmittel ausgewähltaus der Gruppe beinhaltend Wasser, ein- oder mehrwertige Alkohole,Aldehyde, Ketone, Dimethylsulfoxid, aromatische Kohlenwasserstoffe,halogenierte Kohlenwasserstoffe, Ether, Carbonsäuren, Carbonsäureamide,Nitrile, Nitroalkane, Ester oder Mischungen aus mindestens zweidieser Lösungsmittel handelt.The process of claim 4 wherein the solvent is a solvent selected from the group consisting of water, mono- or polyhydric alcohols, aldehydes, ketones, dimethylsulfoxide, aromatic hydrocarbons, halogenated hydrocarbons, ethers, carboxylic acids, carboxylic acid amides, nitrite le, nitroalkanes, esters or mixtures of at least two of these solvents.Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,wobei die Zusammensetzung eine flüssige Zusammensetzungist, welche die Butendisäure oder deren Derivat in einerKonzentration in einem Bereich von 0,01 mMol/l bis 10 Mol/l, bishin zur Sättigungskonzentration beinhaltet.Method according to one of the preceding claims,wherein the composition is a liquid compositionwhich is the butenedioic acid or its derivative in oneConcentration in a range of 0.01 mmol / l to 10 mol / l, totowards the saturation concentration.Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis6, wobei der Zusatzstoff ausgewählt ist aus der Gruppebeinhaltend Salze, Detergentien, osmotische aktive Substanzen, Inhibitoren,welche den Abbau von Nukleinsäuren oder Proteinen hemmen,Viskositätsregulierer, Farbstoffe, Pufferverbindungen,Konservierungsstoffe, Komplexbildner, Reduktionsmittel, Substanzen,welche die Permeabilität von Zellen verbessern, chaotrope Substanzen,Zucker, Phenol bzw. Phenolderivate, Trocknungsmittel, Fixative sowieMischungen aus mindestens zwei dieser Additive.Method according to one of claims 4 to6, wherein the additive is selected from the groupcontaining salts, detergents, osmotic active substances, inhibitors,which inhibit the degradation of nucleic acids or proteins,Viscosity regulators, dyes, buffer compounds,Preservatives, complexing agents, reducing agents, substances,which improve the permeability of cells, chaotropic substances,Sugar, phenol or phenol derivatives, drying agents, fixatives andMixtures of at least two of these additives.Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,wobei es sich bei dem Derivat der Butendisäure um Fumarsäure,Maleinsäureanhydrid, Maleimid, N-Ethylmaleimid, N-Methylmaleimidoder um Mischungen aus mindestens zwei dieser Verbindungen handelt.Method according to one of the preceding claims,wherein the derivative of butenedioic acid is fumaric acid,Maleic anhydride, maleimide, N-ethylmaleimide, N-methylmaleimideor mixtures of at least two of these compounds.Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,wobei das in Kontakt bringen der biologischen Probe mit der Butendisäureoder deren Derivat bei einer Temperatur in einem Bereich von –80°Cbis +80°C erfolgt.Method according to one of the preceding claims,wherein contacting the biological sample with the butenedioic acidor its derivative at a temperature in the range of -80 ° Cto + 80 ° C takes place.Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,wobei das Verfahren zusätzlich zu den Verfahrensschritteni und ii) noch den Verfahrensschritt iii) Lagerung der mitder Butendisäure oder mit deren Derivat in Kontakt gebrachtenbiologischen Probe bei einer Temperatur in einem Bereich von –80°Cbis +80°C und/oder den Verfahrensschritt: vi)Analyse von Biomolekülen in der oder aus der Butendisäureoder mit deren Derivat in Kontakt gebrachten biologischen Probeund/oder histologische Analyse der mit der Butendisäureoder mit deren Derivat in Kontakt gebrachten biologischen Probe umfasst.Method according to one of the preceding claims,the method being in addition to the method stepsi and ii) nor the process stepiii) storage of withthe butenedioic acid or contacted with its derivativebiological sample at a temperature in the range of -80 ° Cup to + 80 ° Cand / or the method step:vi)Analysis of biomolecules in or from butenedioic acidor biological sample contacted with its derivativeand / or histological analysis of the butenedioic acidor biological sample contacted with its derivativeincludes.Eine behandelte biologische Probe, erhältlichdurch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10.A treated biological sample, availableby the method according to any one of claims 1 to 10.Verwendung von Butendisäure oder einemDerivat der Butendisäure, vorzugsweise einer Verbindung derStruktur (III)

in der X d) ein Sauerstoffatom, e)eine Gruppe der Struktur (IV)

f) oder eine GruppeNR¹ ist, wobei R¹ – eingegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter Alkyl-Restmit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomenund besonderes bevorzugt mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, – ein gegebenenfallsStickstoff oder Halogen substituierter Aryl-Rest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen,beispielsweise mit 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Kohlenstoffatomen, – einCOOR³-Rest, in dem R³ einWasserstoffatome oder ein Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und besonderes bevorzugtmit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 1, 2, 3, 4, 5oder 6 Kohlenstoffatomen ist, – ein Wasserstoffatomoder – ein NR⁴R⁵-Restist, in dem R⁴ und R⁵ einWasserstoffatom, ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierterAlkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis4 Kohlenstoffatomen und besonderes bevorzugt mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen,beispielsweise mit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen oder ein gegebenenfallsStickstoff oder Halogen substituierter Aryl-Rest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen,beispielsweise mit 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Kohlenstoffatomenist, und – wobei R² – einWasserstoffatom, – ein gegebenenfalls Stickstoff oderHalogen substituierter Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und besonderes bevorzugtmit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 1, 2, 3, 4, 5oder 6 Kohlenstoffatomen, oder – ein gegebenenfallsStickstoff oder Halogen substituierter Aryl-Rest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen,beispielsweise mit 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Kohlenstoffatomen, ist, zurBehandlung einer biologischen Probe, insbesondere zur Stabilisierungvon Biomolekülen in einer biologischen Probe.Use of butenedioic acid or a derivative of butenedioic acid, preferably a compound of structure (III)

in the X d) an oxygen atom, e) a group of the structure (IV)

f) or a group NR¹ , wherein R¹ - is an optionally nitrogen or halogen-substituted alkyl radical having 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms and more preferably 1 to 3 carbon atoms, for example 1, 2, 3 , 4, 5 or 6 carbon atoms, - an optionally nitrogen or halogen-substituted aryl radical having 6 to 12 carbon atoms, for example having 6, 7, 8, 9, 10, 11 or 12 carbon atoms, A COOR³ radical in which R^{3 is} a hydrogen atom or an alkyl radical having 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms and more preferably 1 to 3 carbon atoms, for example 1, 2, 3, 4, 5 or 6 carbon atoms, - is a hydrogen atom or - an NR⁴ R⁵ radical in which R⁴ and R^{5 is} a hydrogen atom, an optionally nitrogen or halogen-substituted alkyl radical having 1 to 6 carbon atoms, preferably having 1 to 4 carbon atoms and particularly preferably having 1 to 3 carbon atoms, for example having 1, 2, 3, 4, 5 or 6 carbon atoms or an optionally nitrogen or halogen-substituted aryl radical having 6 to 12 carbon atoms, for example 6, 7, 8, 9, 10 , 11 or 12 carbon atoms, and - wherein R² - is a hydrogen atom, - an optionally nitrogen or halogen-substituted alkyl radical having 1 to 6 carbon atoms, preferably having 1 to 4 carbon atoms, and especially preferably having 1 to 3 carbon atoms, for example having 1, 2, 3, 4, 5 or 6 carbon atoms, or - an optionally nitrogen or halogen-substituted aryl radical having 6 to 12 carbon atoms, for example 6, 7, 8, 9, 10 , 11 or 12 carbon atoms, is for treating a biological sample, in particular for stabilizing biomolecules in a biological sample.Ein Kit, umfassend (a) eine Zusammensetzungbeinhaltend Butendisäure oder ein Derivat der Butendisäure,wie in einem der Ansprüche 2, 8 und 12 definiert, sowieoptional (b) mindestens ein Reagenz zur Analyse von Biomolekülenin oder aus einer biologischen Probe und/oder zur Analyse der Morphologieeiner biologischen Probe, und/oder (c) mindestens eine ggf.verschließbare Vorrichtung zur Sammlung oder Aufnahme einerbiologischen Probe, wobei gegebenenfalls die Zu sammensetzung (a)vor Sammlung oder Aufnahme der biologischen Probe enthalten seinkann.A kit comprising(a) a compositionincluding butenedioic acid or a derivative of butenedioic acid,as defined in any of claims 2, 8 and 12, as well asoptional(B) at least one reagent for the analysis of biomoleculesin or out of a biological sample and / or for analysis of the morphologya biological sample, and / or(c) at least one optionallyLockable device for collecting or receiving abiological sample, where appropriate the composition (a)be included before collection or uptake of the biological samplecan.