Gebiet derErfindungTerritory ofinvention
Dievorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur schnellen, quantitativenDetektion mindestens eines Moleküls,insbesondere eines Biomoleküls,in Lösung,wobei das Molekülmit mindestens zwei weiteren modifizierten Substanzen in Kontakt gebrachtwird und der sich daraus bildende Komplex durch Anreicherung aufZellen oder Beads nachgewiesen wird.TheThe present invention relates to a method for rapid, quantitativeDetection of at least one molecule,in particular a biomolecule,in solution,being the moleculebrought into contact with at least two other modified substancesand the resulting complex is formed by enrichmentCells or beads is detected.
ZumNachweis bestimmter Antigene oder Antikörper wird hauptsächlich derELISA (Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay) eingesetzt. Hierbei wirdim allgemeinen ein Fängermolekül (Antigen oderAntikörper)unspezifisch am Boden einer Mikrotiterplatte immobilisiert (meistAdsorption auf Glassoberflächen).Nach Zugabe der zu untersuchenden Probe (Inkubationszeit bis zuStunden) wird die Oberflächemindestens einmal gewaschen um unspezifisch adsorbierte Moleküle zu entfernen.Im nächsten Schrittfolgt die Inkubation mit einem sogenannten „Detektormolekül" (üblicherweiseSekundärantikörper, diemit einem Enzym, z. B. Meerrettichperoxidase, markiert sind), dasebenso spezifisch an das gesuchte Molekül in einer Sandwich-Konfigurationbindet. Nach weiteren Waschschritten wird die Probe mit einer farbgebendenSubstanz inkubiert. Diese Substanz wird durch das Enzym am Detektormolekül z. B.durch Oxidation in eine farbige Verbindung überführt. Letztendlich wird dieFarbigkeit im Überstand derProbe gemessen, die direkt mit der Gegenwart der nachzuweisendenSubstanz korreliert ist. Aufgrund des Amplifizierungsschrittes (jedesEnzym bildet viele farbige Moleküle)erreichen ELISA'seine hohe Empfindlichkeit im Bereich von 10-9 bis10-11 M Zielmolekül. Nachteile sind die vielenWaschschritte, die lange Dauer (mehrere Stunden) und die unspezifischeAdsorption an den Glassoberflächen.For the detection of certain antigens or antibodies, mainly the ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) is used. In general, a capture molecule (antigen or antibody) is immobilized unspecifically on the bottom of a microtiter plate (usually adsorption on glass surfaces). After addition of the sample to be examined (incubation time up to hours), the surface is washed at least once to remove unspecifically adsorbed molecules. In the next step, the incubation is followed by a so-called "detector molecule" (usually secondary antibodies labeled with an enzyme, eg horseradish peroxidase) which also binds specifically to the molecule of interest in a sandwich configuration This substance is converted by the enzyme on the detector molecule, eg by oxidation, into a colored compound Finally, the colouration in the supernatant of the sample is measured, which is directly correlated with the presence of the substance to be detected Amplification step (each enzyme forms many colored molecules) ELISA's achieve high sensitivity in the range of 10-9 to 10-11 M target molecule Disadvantages are the many washing steps, the long duration (several hours) and the unspecific adsorption on the glass surfaces.
ZumNachweis spezifischer DNA-Sequenzen gibt es verschiedene Standardverfahren,die alle auf der Hybridisierung eines komplementären, farbstoffmarkierten Oligonukleotidsberuhen. Bei DNA-Chips wird die Probe in der Regel ebenfalls mehrmalsgewaschen, um unspezifisch adsorbierte Nukleinsäuren und den Überschussan farbstoffmarkiertem Oligonukleotid zu entfernen.To theDetection of specific DNA sequences there are various standard methodsall on the hybridization of a complementary, dye-labeled oligonucleotidebased. For DNA chips, the sample is usually also several timeswashed to nonspecifically adsorbed nucleic acids and the excessto remove dye-labeled oligonucleotide.
Diebisher eingesetzten Verfahren sind somit nicht für einen Einsatz bspw. in einemMikrofluidik-Chip geeignet, bei dem Waschschritte nur schwer zurealisieren sind.Thehitherto used methods are therefore not for use, for example, in oneMicrofluidic chip suitable in the washing steps difficult toare realizing.
DieErfindung stellt sich daher die Aufgabe, ein Verfahren zur Detektionvon mindestens einem Molekülbereitzustellen, was spezifisch und sensitiv genug ist, einen schnellen,quantitati ven Nachweis des Molekülsauf unterschiedlichsten Trägerflächen zugewährleisten.TheThe invention therefore has as its object, a method for detectionof at least one moleculeto provide what is specific and sensitive enough, a fast,Quantitative detection of the moleculeon a variety of support surfaces tooguarantee.
Lösungsolution
DieseAufgabe wird durch die Erfindungen mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. VorteilhafteWeiterbildungen der Erfindungen sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.Der Wortlaut sämtlicherAnsprüchewird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht.TheseThe object is achieved by the inventions having the features of the independent claims. advantageousFurther developments of the inventions are characterized in the subclaims.The wording of allclaimsis hereby incorporated by reference into the content of this specification.
Diespezifische Erkennung und Aktivität von Biomolekülen (Nukleinsäuren, Antikörpern, Enzyme etc.)kann gekoppelt werden mit der Aufkonzentrierung der nachzuweisendenMoleküleauf z. B. Kügelchenin einem Beobachtungsvolumen, und dass diese Koppelung eine schnelle,quantitative Analyse eines z. B. positiven Fluoreszenzsignals ermöglicht.Thespecific recognition and activity of biomolecules (nucleic acids, antibodies, enzymes etc.)can be coupled with the concentration of the detectedmoleculeson z. B. beadsin an observation volume, and that this coupling is a fast,quantitative analysis of a z. B. allows positive fluorescence signal.
Imfolgenden werden einzelne Verfahrensschritte näher beschrieben. Die Schrittemüssen nichtnotwendigerweise in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt werden,und das zu schildernde Verfahren kann auch weitere, nicht genannteSchritte aufweisen.in theThe following individual process steps are described in more detail. The stepsdo not have tonecessarily be performed in the order given,and the method to be described can also other, not mentionedSteps have.
Eswird ein Verfahren zur Detektion mindestens eines Moleküls in einerLösungin einem Gefäß mit einemBoden vorgeschlagen. Dazu wird das zu detektierende Molekül mit mindestenseiner modifizierten ersten Substanz und mindestens einer farbstoffmarkiertenzweiten Substanz in Kontakt gebracht. Das zu detektierende Molekül bindetan der modifizierten ersten Substanz und der farbstoffmarkiertenzweiten Substanz. Dadurch entsteht ein Komplex aus zu detektierendemMolekül,modifizierter erster Substanz und farbstoffmarkierter zweiter Substanz.Dieser Kom plex sedimentiert mindestens zum Teil und kann am Bodennachgewiesen werden.Itis a method for detecting at least one molecule in onesolutionin a jar with oneSoil proposed. For this purpose, the molecule to be detected with at leasta modified first substance and at least one dye-labeledsecond substance brought into contact. The molecule to be detected bindson the modified first substance and the dye-labeledsecond substance. This creates a complex of detectableMolecule,modified first substance and dye-labeled second substance.This complex sediments at least in part and can settle on the groundbe detected.
DiesesVerfahren eignet sich beispielsweise für den Einsatz in einem Mikrofluidik-Chip,der die zu analysierende Lösung(z. B. Blutserum, Sekret, etc.) mittels Kapillarkräften aufsaugtund in eine variable Anzahl von Reaktionsgefäße bzw. Reaktionsreservoirs(z. B. 96), in denen die spezifischen Nachweisreaktionen ablaufen, überführt. Inden Reaktionsreservoirs befinden sich bereits vor dem Eintritt derzu analysierenden Lösungdie modifizierte erste Substanz und die farbstoffmarkierte zweiteSubstanz, die das Vorhandensein des zu detektierenden Moleküls durchbeispielsweise einen deutlichen Fluoreszenzanstieg anzeigen. DieseSubstanzen liegen in der Regel getrocknet am Boden der Reaktionsreservoirs.Durch der Eintritt der zu untersuchenden Lösung werden sie von Boden gelöst.This method is suitable, for example, for use in a microfluidic chip which absorbs the solution to be analyzed (eg blood serum, secretion, etc.) by means of capillary forces and into a variable number of reaction vessels or reaction reservoirs (eg 96 ), in which the specific detection reactions take place. The modified first substance and the dye-labeled second substance, which indicate the presence of the molecule to be detected by, for example, a marked increase in fluorescence, are already present in the reaction reservoirs prior to the entry of the solution to be analyzed. These substances are in usually dried at the bottom of the reaction reservoir. By entering the solution to be examined they are released from the ground.
ImGegensatz zu den meisten bisher eingesetzten Mikrotiterplatten findendie spezifischen Nachweisreaktionen in Lösung, ohne Einsatz jeglicherWaschschritte, statt. Die Nachweisempfindlichkeiten des Verfahrensliegen in Abhängigkeitvom jeweiligen Assay im mikro- (10-6 M)bis pikomolaren (10-12 M) Bereich.In contrast to most microtiter plates used so far, the specific detection reactions take place in solution, without the use of any washing steps. The detection sensitivities of the method are in the micro (10-6 M) to picomolar (10-12 M) range, depending on the particular assay.
Gemäß einerbevorzugten Ausführungsform derErfindungen handelt es sich bei dem zu detektierenden Molekül um einBiomolekül,insbesondere um eine Nukleinsäure,ein Antigen, einen Antikörper und/oderein Enzym. Weitere Biomoleküle,die unter Inanspruchnahme des erfindungsgemäßen Verfahrens nachgewiesenwerden können,sind dem Fachmann geläufig,und sie könnenbeispielsweise die Gruppe der Peptide, Proteine, Kohlenhydrate etc., aberauch komplexere Strukturen wie Viren, Viroide, Prionen etc. umfassen.According to onepreferred embodiment ofInventions, the molecule to be detected is abiomoleculeespecially a nucleic acid,an antigen, an antibody and / oran enzyme. Other biomolecules,which detected using the method according to the inventioncan beare familiar to the expert,and you canFor example, the group of peptides, proteins, carbohydrates, etc., butalso include more complex structures such as viruses, viroids, prions, etc.
Ineiner weiteren bevorzugten Ausführungsformhandelt es sich bei der modifizierten ersten Substanz um Kügelchenmit einem Durchmesser von ca. 50 nm bis 50 μm, vorzugsweise ca. 1 bis 10 μm, insbesondereca. 2 bis 3 μm.Diese Kügelchenkönnen aussämtlichen,für denEinsatz des erfindungsgemäßen Verfahrensvorteilhaften Materialien bestehen, sofern sie sich gemäß Ihremgeplanten Einsatzgebiet modifizieren lassen. Als besonders vorteilhafthaben sich Kügelchenaus Polystyrol erwiesen, die zusätzlichauch einen Eisenkern aufweisen können.Durch Einsatz solcher Kügelchenmit einem z. B. Eisenoxidkern könnenzusätzlicheAufkonzentriereffekte am Boden des Reservoirs vorgenommen werden,beispielsweise durch Zuhilfenahme eines Magneten.Ina further preferred embodimentthe modified first substance is a beadwith a diameter of about 50 nm to 50 microns, preferably about 1 to 10 microns, in particularapprox. 2 to 3 μm.These beadscan outall,for theUse of the method according to the inventionadvantageous materials, provided they comply with yourhave their planned application modified. As a particularly advantageoushave beadsmade of polystyrene, in additionmay also have an iron core.By using such beadswith a z. B. iron oxide core canadditionalConcentration effects are made at the bottom of the reservoir,for example, by using a magnet.
Ineiner weiteren bevorzugten Ausführungsformwird die Oberflächeder modifizierten ersten Substanz mit spezifischen Ankermolekülen modifiziertdurch Beschichtung. Bei den spezifischen Ankermolekülen handeltes sich gemäß einerweiteren bevorzugten Ausführungsformum Antikörper,Antigene, Peptide, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren und/oder Zellen. Diesstellt keine abschließendeAuflistung der möglichenAnkermoleküledar und weitere, dem erfindungsgemäßen Verfahren zugängliche Ankermoleküle (z. B.Viren, Viroide, Prionen etc.) sind dem Fachmann geläufig undwerden ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst.Ina further preferred embodimentbecomes the surfacethe modified first substance modified with specific anchor moleculesby coating. The specific anchor molecules areit according to oneanother preferred embodimentto antibodies,Antigens, peptides, carbohydrates, nucleic acids and / or cells. Thisdoes not provide a finalList of possibleanchor moleculesand further anchor molecules accessible to the method according to the invention (eg.Viruses, viroids, prions, etc.) are familiar to the expert andare also encompassed by the present invention.
Ineiner besonders bevorzugten Ausführungsformhandelt es sich bei der farbstoffmarkierten zweiten Substanz umfarbstoffmarkierte Sekundärantikörper, Substanzen,die durch die Bindung an das zu detektierende Molekül fluoreszenzfähig werden,z. B. konformaktiv flexible smart probes, und/oder komplementäre Oligonukleotide.Die konformativ flexiblen, sogenannten „Smart Probes" (siehe z. B. WO01/36668 A1) erhöhendas Signal zu Hintergrund Verhältnisund könnenbeispielsweise als fluoreszenzmarkierte Sonden eingesetzt werden, diedurch Anbinden an das Zielmolekülihre Fluoreszenzintensitätdrastisch erhöhen.Damit lassen sich höhereSonden-Konzentrationen, ohne Erhöhung derHintergrundfluoreszenz, erzielen. Die bisher erfolgreich entwickelten „SmartProbes" erlaubendie Detektion bestimmter DNA-Zielsequenzenund bestimmter tumorassoziierter Antikörper direkt in beispielsweiseBlutproben von Patienten.Ina particularly preferred embodimentis the dye-labeled second substance todye-labeled secondary antibodies, substances,which become fluorescent by binding to the molecule to be detected,z. B. conformable flexible smart probes, and / or complementary oligonucleotides.The conformationally flexible, so-called "smart probes" (see, for example, WO01/36668 A1)the signal to background ratioand canFor example, be used as fluorescence-labeled probes, theby attachment to the target moleculetheir fluorescence intensityincrease dramatically.This can be higherProbe concentrations, without increasing theBackground fluorescence, achieve. The so far successfully developed "SmartProbes "allowthe detection of certain DNA target sequencesand certain tumor-associated antibodies directly in, for exampleBlood samples from patients.
Dabeikönnengemäß einerweiteren bevorzugten Ausführungsformverschiedene zu detektierende Moleküle mit verschiedenen farbstoffmarkiertenSubstanzen interagieren, vorzugsweise spezifisch mit diesen binden.Diese spezifische Interaktion kann dann zu mindestens zwei, vorzugsweisemehrerer Farbreaktionen führen,wobei diese dann nach Art der Farbe getrennt erfasst und ausgewertetwerden können.therecanaccording to aanother preferred embodimentdifferent molecules to be detected with different dye-labeledSubstances interact, preferably bind specifically with them.This specific interaction may then be at least two, preferablycause several color reactions,where these are then recorded and evaluated separately by type of colorcan be.
Eskönnenfür dieDetektion unterschiedlicher zu detektierender Moleküle auchunterschiedliche, jeweils spezifisch bindende Substanzen verwendetwerden, wobei die Substanzen jeweils mit spektroskopisch unterscheidbarenFarbstoffen markierten werden. Vorteilhafterweise handelt es sichbei den Farbstoffen um Fluoreszenzfarbstoffe, die spektroskopischunterscheidbar sind. Spektroskopisch unterschieden werden können Farbstoffebeispielsweise aufgrund des Absorptionsspektrums, des Emissionsspektrums,der Fluoreszenz-Lebensdauer, der Triplett-Lebensdauer, etc.Itcanfor theDetection of different molecules to be detected alsoused different, each specific binding substancesbe, the substances each with spectroscopically distinguishableDyes are marked. Advantageously, it isin the dyes to fluorescent dyes, which are spectroscopicallyare distinguishable. Spectroscopically, dyes can be distinguishedfor example, due to the absorption spectrum, the emission spectrum,fluorescence lifetime, triplet lifetime, etc.
DieEffizienz dieser Technik kann durch die Optimierung der verwendetenFluoreszenzfarbstoffe noch weiter gesteigert werden. So ist es zumBeispiel möglich,mit Hilfe von verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen beispielsweisePrionen und Viren auf oder in Zellen nachzuweisen. Man kann fernerbei dieser Möglichkeitauch durch Nutzung von Fluoreszenzfarbstoffen mit unterschiedlichenAbsorptionswellenlängenMehrfachmarkierungen durchführen.Zur Lösungdes gestellten Problems kann ein gemischt homogen/heterogen basiertesVerfahren eingesetzt werden.TheEfficiency of this technique can be used by optimizing theFluorescent dyes are further increased. That's the way it isExample possible,with the help of different fluorescent dyes, for exampleDetect prions and viruses on or in cells. One can furtherat this possibilityalso by using fluorescent dyes with differentAbsorption wavelengthsCarry out multiple markings.To the solutionof the problem posed can be a mixed homogeneous / heterogeneous basedProcedures are used.
Für den Nachweisbestimmter proteolytischer Enzyme (Proteasen) können mit einem Tryptophanrestmodifizierte und farbstoffmarkierte Protease-Substrate (kurze Peptide)auf den Kügelchenimmobilisiert werden. Hierbei wird die Farbstofffluoreszenz durchdie räumlicheNähe zumTryptophanrestes effizient gelöscht.In Gegenwart der Protease wird die Aminosäurensequenz zwischen Farbstoffund Tryptophanrest hydrolisiert (geschnitten), wodurch die räumlicheNähe aufgehobenist und ein starker Fluoreszenzanstieg resultiert. Bleibt derjenigeTeil des Protease-Substrats,der den Farbstoff trägt,nach der Hydrolyse auf dem Kügelchenimmobilisiert, so kann durch quantitatives Auslesen der Fluoreszenz aufder Kugeloberflächedie Proteasekonzentration bestimmt werden.For the detection of certain proteolytic enzymes (proteases), tryptophan residue-modified and dye-labeled protease substrates (short peptides) can be immobilized on the beads. The dye fluorescence is efficiently quenched by the proximity to the Tryptophanrestes. In the presence of the protease, the amino acid sequence between the dye and the tryptophan moiety is hydrolyzed (cut), whereby the spatial proximity is abolished and a strong Fluorescence increase results. If the part of the protease substrate which carries the dye remains immobilized on the bead after the hydrolysis, the protease concentration can be determined by quantitatively reading the fluorescence on the spherical surface.
Ähnlichefarbstoffmarkierte Peptide können ebensofür denspezifischen Nachweis bestimmter Antikörper direkt im Blutserum eingesetztwerden. Hierbei wird der fluoreszenzlöschende Einfluss des Tryptophanrestes,der durch Kontaktbildung zum Farbstoff ausgelöst wird, durch das Binden desPeptids an den Antikörperund der damit verbunden Konformationsänderung im Peptid verhindert,wodurch es zu einem Fluoreszenzanstieg kommt (siehe z. B WO 1003/014742A2). Durch Bindung des geeigneten, farbstoffmarkierten Peptids aufder Oberfläche derKügelchenkann der Antikörperdurch einen Anstieg des Fluoreszenzsignals auf dem Kügelchen nachgewiesenwerden.SimilarDye-labeled peptides may as wellfor thespecific detection of certain antibodies used directly in the blood serumbecome. This is the fluorescence-quenching influence of Tryptophanrestes,which is triggered by contact formation to the dye, by the binding of thePeptids to the antibodyand the associated conformational change in the peptide preventscausing a fluorescence increase (see for example WO 1003/014742A2). By binding the appropriate, dye-labeled peptide onthe surface of theglobulecan the antibodydetected by an increase in the fluorescence signal on the beadbecome.
BestimmteNukleinsäureabschnitte(die spezifisch füreine Antibiotikaresistenz oder eine virale Erkrankung sind) können imgleichen Assay-Format durch den Einsatz von DNA-Hairpins („SmartProbes", siehe z.B. WO 01/36668 A1) nachgewiesen wer den. Hierbei wird die zu untersuchendeProbe mit Hilfe der PCR und einem biotinylierten Primer amplifiziert.Im Reaktionsreservoir befinden sich mit Streptavidin gecoatete Kügelchenund fürdie jeweilige DNA-Sequenz spezifische DNA-Hairpins. DNA-Hairpins sind einzelsträngige Oligonukleotide,die aufgrund der Komplementaritätder DNA-Bausteine an beiden Enden eine Stamm/Schleife-Struktur einnehmen.Bei den zur Verwendung kommenden DNA-Hairpins wird ein geeigneterFluoreszenzfarbstoff an einem Ende des Oligonukleotids angebracht, derdurch Guanosin im komplementärenanderen Ende im geschlossenen Zustand des DNA-Hairpins gelöscht wird.Findet der DNA-Hairpin die seiner Schleife komplementäre DNA-Sequenzauf dem Kügelchen,hybridisiert er spontan unter Ausbildung des thermodynamisch günstigerenDoppelstranges. Hierdurch wird die Stamm/Schleife-Struktur zerstört und gleichzeitigdie durch den Kontakt mit dem Guanosinrest induzierte Fluoreszenzlöschung desFarbstoffs aufgehoben.Certainnucleic acid segments(specific forare an antibiotic resistance or a viral disease) in thesame assay format through the use of DNA hairpins ("SmartProbes ", see z.B. WO 01/36668 A1) who demonstrated the. Here, the to be examinedSample amplified using PCR and a biotinylated primer.In the reaction reservoir are streptavidin coated beadsand forthe respective DNA sequence specific DNA hairpins. DNA hairpins are single-stranded oligonucleotides,because of the complementaritythe DNA building blocks occupy a stem / loop structure at both ends.In the coming to use DNA hairpins is a suitableFluorescent dye attached to one end of the oligonucleotide, theby guanosine in the complementaryother end in the closed state of the DNA hairpin is deleted.The DNA hairpin finds the DNA sequence complementary to its loopon the bead,it spontaneously hybridizes to form the thermodynamically more favorableDouble strand. This destroys the trunk / loop structure and simultaneouslythe fluorescence quenching induced by contact with the guanosine residueDye lifted.
Gemäß einerweiteren bevorzugten Ausführungsformzeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahrendadurch aus, dass fürden Nachweis des zu detektierenden Moleküls der Fluoreszenzfarbstoff mittelsLaser und/oder Leuchtdioden mindestens einer geeigneten Wellenlänge angeregtwird. Das quantitative Auslesen der Fluoreszenzsignale kann dabeinach homogener Anregung der einzelnen Reaktionsgefäße erfolgen.Dabei kann eine räumlich begrenzteAnregungen des Fluoreszenzfarbstoffes in z-Richtung erfolgen, alsoin einer Richtung senkrecht zum Boden des Gefäßes, auf dem die Bindungskomplexesedimentieren. Durch die zusätzlicheräumlich begrenzteAnregung der Reaktionsgefäße in z-Richtungkann spezifisch nur die Fluoreszenz am Boden der Reaktionsreservoirsausgelesen und damit eine noch bessere Diskriminierung erreichtwerden.According to oneanother preferred embodimentthe process of the invention is characterizedcharacterized by that forthe detection of the molecule to be detected, the fluorescent dye by means ofLaser and / or light-emitting diodes excited at least one suitable wavelengthbecomes. The quantitative readout of the fluorescence signals can therebycarried out after homogeneous excitation of the individual reaction vessels.It can be a spatially limitedExcitations of the fluorescent dye take place in the z direction, iein a direction perpendicular to the bottom of the vessel, on which the binding complexessediment. By the additionalspatially limitedExcitation of the reaction vessels in the z-directionspecifically, only the fluorescence at the bottom of the reaction reservoir can be specificread out and thus achieve even better discriminationbecome.
Ineiner bevorzugten Ausführungsformwird der Nachweis des zu detektierenden Moleküls unter Einsatz einer CCD-Kameraund/oder einer optischen Pinzette erbracht. Dabei kann es sich beider optischen Pinzette um einen gepulsten Infrarot-Laser handeln.Es ist möglich,die Kügelchenmit einer optischen Pinzette aufgrund des Strahlungsdrucks im Laserfokuszu fangen und selektiv nur die Fluoreszenz auf der Kugeloberfläche auszulesen.Dies kann durch die Verwendung eines gepulsten Infrarot-Lasers (miteiner Wellenlängezwischen ca. 800 und ca. 1100 nm) realisiert werden, der einerseitsdie Kügelchenfängt undgleichzeitig die Fluoreszenz der Farbstoffe durch Zwei-Photonen-Anregunggeneriert. Die verwendete Optik wird durch die komplementäre Einsatzmöglichkeitder Ein- und Zwei-Photonen-Mikroskopie nicht beeinträchtigt.Ina preferred embodimentis the detection of the molecule to be detected using a CCD cameraand / or optical tweezers. This can happenthe optical tweezers act around a pulsed infrared laser.It is possible,the beadswith optical tweezers due to the radiation pressure in the laser focusto capture and selectively read only the fluorescence on the spherical surface.This can be achieved by using a pulsed infrared laser (witha wavelengthbetween about 800 and about 1100 nm), on the one handthe beadsbegins andsimultaneously the fluorescence of the dyes by two-photon excitationgenerated. The optics used is due to the complementary applicationunaffected by single- and two-photon microscopy.
ZurParallelisierung der Technik können neueMultistrahlsysteme mit bspw. 8 × 8Laserstrahlen vorteilhaft eingesetzt werden. Hierbei wird der Anregungslaserstrahldurch eine Kombination von Strahlteilern und Spiegeln in 64 Strahlenzerlegt. Die Strahlen könnendann entweder mit Hilfe eines Piezo-Scanner-Spiegels schnell (d. h. im Bereich von Millisekunden) über denBoden des Reservoirs gescannt und ein fluoreszenzmikroskopischesBild auf dem CCD-Chip erzeugt, oder stationär zum Einfangen von Kügelchenmit gleichzeitiger Auslesung der Fluoreszenz verwendet werden.toParallelization of technology can be newMulti-jet systems with, for example, 8 × 8Laser beams are used advantageously. Here, the excitation laser beamthrough a combination of beam splitters and mirrors in 64 beamsdisassembled. The rays canthen either using a piezo scanner mirror quickly (i.e., in the range of milliseconds) over theBottom of the reservoir was scanned and a fluorescence microscopeImage generated on the CCD chip or stationary for trapping globuleswith simultaneous reading of fluorescence can be used.
DasDetektionsprinzip erlaubt ebenso den Einsatz verschiedener Anregungswellenlängen zur simultanenBestimmung verschiedener Zielmoleküle pro Reservoir („Multiplexing"). Hierbei können beispielhaftdie Sonden mit zwei spektral unterschiedlichen Farbstoffen und dieKügelchenmit verschiedenen Fängermolekülen modifiziertwerden. Bei gleichzeitiger Anregung mit zwei Laserwellenlängen für den Fallder Ein-Photonen-Anregung könnendie Signale der beiden Farbstoffe spektral separiert durch einendichroitischen Strahlteiler gleichzeitig auf verschiedenen Bereichendes CCD-Chips ausgelesen werden. Für den Fall der Zwei-Photonen-Anregung können Farbstoffeselektiert werden, die mit der gleichen Laserwellenlänge effizientangeregt werden können,sich aber in ihrem Emissionsspektrum eindeutig unterscheiden. DerEinsatz der Ein- oder Zwei-Photonen-Anregung wird letztendlich durchdie Anzahl der parallel nachzuweisenden Zielmoleküle und diedafür zurVerfügungstehenden Kosten kontrolliert.TheDetection principle also allows the use of different excitation wavelengths for simultaneousDetermination of different target molecules per reservoir ("multiplexing")the probes with two spectrally different dyes and theglobulemodified with different catcher moleculesbecome. With simultaneous excitation with two laser wavelengths for the casethe one-photon excitation canthe signals of the two dyes spectrally separated by adichroic beam splitters simultaneously on different areasof the CCD chip are read out. In the case of two-photon excitation can dyesbe selected with the same laser wavelength efficientcan be stimulatedbut clearly different in their emission spectrum. Of theUse of one- or two-photon excitation is ultimately throughthe number of parallel to be detected target molecules and thefor thatdisposalcontrolled costs.
Ineiner besonders bevorzugten Ausführungsformerfolgt der Nachweis des zu detektierenden Moleküls im roten Spektralbereich.Im roten Spektralbereich gibt es kaum natürliche Stoffe oder Moleküle, dieLicht noch effizient absorbieren und auch noch fluoreszieren, sodass zur Reduzierung der Autofluoreszenz in biologischen Probendie Fluoreszenzanregung der Probe vorzugsweise im diesem Spektralbereicherfolgt.Ina particularly preferred embodimentthe detection of the molecule to be detected takes place in the red spectral range.In the red spectral range, there are hardly any natural substances or molecules thatTo absorb light efficiently and to fluoresce it, sothat to reduce autofluorescence in biological samplesthe fluorescence excitation of the sample preferably in this spectral rangehe follows.
Dasgeschilderte Verfahren lässtsich wie folgt charakterisieren:
Für die Detektionmindestens eines Moleküls ineiner Lösungeignet sich ein Kit mit Kügelchenmit einem Durchmesser von ca. 50 nm bis 50 μm, vorzugsweise ca. 1 bis 10 μm, insbesondereca. 2 bis 3 μm,deren Oberflächemit spezifischen Ankermolekülenfür daszu detektierende Molekülmodifiziert wurde. Ferner enthältder Kit
Für die Detektionkann ein Mikrofluidik-Chip mit Reaktionsreservoirs verwendet werden,die folgendes enthalten: Kügelchenmit einem Durchmesser von ca. 50 nm bis 50 μm, vorzugsweise ca. 1 bis 10 μm, insbesondereca. 2 bis 3 μm,deren Oberflächemit spezifischen Ankermolekülenfür daszu detektierende Molekülmodifiziert wurde. Ferner enthalten die Reaktionsreservoirs
PotentielleAnwendungsfelder sind z. B.:
WeitereEinzelheiten und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgendenBeschreibung der Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens und von bevorzugtenAusführungsformen inVerbindung mit den Unteransprüchen.Hierbei könnendie je weiligen Merkmale fürsich alleine oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein.FurtherDetails and features of the invention will become apparent from the followingDescription of the representation of the method according to the invention and of preferredEmbodiments inConnection with the subclaims.Here you canthe respective characteristics forbe realized alone or in combination with each other.
Inden Abbildungen zeigt:Inthe pictures shows:
Beispiel 1example 1
Dasgrundlegende Prinzip des Nachweisverfahrens ist in der
Inden Reaktionsreservoirs
DieMikrofluidik-Chips
BeimBefüllender Reaktionsreservoirs
DieKügelchen
DasVerfahren nutzt
DerSekundärantikörper unddie modifizierten Kügelchenwurden anschließendmit verschiedenen Blutseren gemischt und schließlich ein Tropfen der Mischungauf ein Mikroskop-Abdeckgläschengegeben und mit Hilfe eines Standard-Fluoreszenzmikroskops – mit einerQuecksilber-Lampe als Anregungsquelle – mit einem geeigneten Filtersatzund einer CCD-Kamera die Fluoreszenz am Boden des Abdeckgläschens ohneWaschschritte ausgelesen. In
Beispiel 2Example 2
Unterden 20 natürlichvorkommenden Aminosäurengibt es ähnlichwie bei den DNA-Basen nur eine Aminosäure, nämlich Tryptophan, die die FluoreszenzausgewählterFarbstoffe selektiv löscht.Dieses Löschprinzipkann ebenso zur Entwicklung von Sonden auf Peptidbasis zur Detektionvon Antikörpernausgenutzt werden.Underthe 20 of courseoccurring amino acidsthere are similaras with the DNA bases only one amino acid, namely tryptophan, which fluorescesselectedDyes are selectively deleted.This extinguishing principlemay also be used to develop peptide-based probes for detectionof antibodiesbe exploited.
Imfolgenden wird auf
Bedingtdurch die konformative Flexibilität des Peptides
Wenndie Aminosäurensequenzzwischen Farbstoff und Tryptophanrest ein Epitop für einenAntikörperdarstellt, wird durch Anbindung des Antikörpers die konformative Flexibilität des Peptids
Beispiel 3Example 3
Dieselektive Fluoreszenzlöschungeiniger Farbstoffe in tryptophanhaltigen Peptiden
Experimentein homogener Lösung(siehe z. B. WO 02/081509 A2) erlauben die sichere Detektion geringsterProteasekonzentrationen (10-12 – 10-15 M) durch einfaches Auslesen der Fluoreszenzintensität.Experiments in homogeneous solution (see, for example, WO 02/081509 A2) allow reliable detection of very low protease concentrations (10-12 -10-15 M) by simply reading out the fluorescence intensity.
Inder fürdas hier vorgestellte Verfahren relevanten Variante werden die Peptide
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| DE200410038163DE102004038163A1 (en) | 2004-08-06 | 2004-08-06 | Fluorescence-based assays for the rapid, quantitative analysis of biomolecules (proteins and nucleic acids) by enrichment on cells or beads |
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