DE10136985A1 - Nucleotide sequences encoding the gap2 gene - Google Patents

Abstract

The invention relates to an isolated polynucleotide comprising a polynucleotide sequence chosen from the group consisting of a) polynucleotide which is identical to the extent of at least 70% to a polynucleotide which codes for a polypeptide which comprises the amino acid sequence of SEQ ID No. 2, b) polynucleotide which codes for a polypeptide which comprises an amino acid sequence which is identical to the extent of at least 70% to the amino acid sequence of SEQ ID No. 2, c) polynucleotide which is complementary to the polynucleotides of a) or b), and d) polynucleotide comprising at least 15 successive nucleotides of the polynucleotide sequence of a), b) or c), and a process for the fermentative preparation of L-amino acids using coryneform bacteria in which at least the gap2 gene is present in enhanced form, and the use of polynucleotides which comprise the sequences according to the invention as hybridization probes.

Description

Translated fromGerman

Gegenstand der Erfindung sind für das gap2-Gen kodierende Nukleotidsequenzen aus coryneformen Bakterien und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren unter Verwendung von Bakterien, in denen das endogene gap2-Gen verstärkt wird.The invention relates to coding for the gap2 geneNucleotide sequences from coryneform bacteria and aProcess for the fermentative production of amino acidsusing bacteria in which the endogenous gap2-Gene is amplified.

Stand der TechnikState of the art

L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung, Anwendung.L-amino acids, in particular L-lysine, can be found in US PatHuman medicine and in the pharmaceutical industry, in theFood industry and especially in theAnimal nutrition, application.

Es ist bekannt, daß Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.It is known that amino acids by fermentation ofStrains coryneformer bacteria, in particularCorynebacterium glutamicum. Because of theGreat importance is constantly attached to the improvement ofManufacturing process worked. process improvementscan fermentation measures such asStirring and supply of oxygen, or theComposition of nutrient media such as theSugar concentration during fermentation, or theWork-up to the product form by, for exampleIon exchange chromatography or the intrinsicPerformance characteristics of the microorganism itselfaffect.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und Aminosäuren produzieren.To improve the performance characteristics of thisMicroorganisms become methods of mutagenesis, selectionand mutant selection applied. In this way you getStrains that are resistant to antimetabolites or auxotrophsfor regulatory metabolites are andProduce amino acids.

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L-Aminosäuren produzierenden Stämmen von Corynebacterium eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosytithesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäure-Produktion untersucht.For some years now also methods ofrecombinant DNA technology for strain improvement of L-Amino acid producing strains of Corynebacterium Used by single amino acid biosynthesis genesamplified and the effect on the amino acidProduction examined.

Aufgabe der ErfindungObject of the invention

Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von Aminosäuren bereitzustellen.The inventors have set themselves the task of newMeasures for the improved fermentative production ofTo provide amino acids.

Beschreibung der ErfindungDescription of the invention

Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin gemeint. Besonders bevorzugt ist L-Lysin.Are mentioned in the following L-amino acids or amino acids,are thus including one or more amino acidstheir salts selected from the group L-asparagine, L-Threonine, L-serine, L-glutamate, L-glycine, L-alanine, L-Cysteine, L-valine, L-methionine, L-isoleucine, L-leucine, L-Tyrosine, L-phenylalanine, L-histidine, L-lysine, L-tryptophanand L-arginine. Particularly preferred is L-lysine.

Wenn im folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind damit nicht nur die Basen, sondern auch die Salze wie z. B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.If in the following L-lysine or lysine are mentioned, areso that not only the bases, but also the salts such. B.Lysine monohydrochloride or lysine sulfate.

Gegenstand der Erfindung ist ein isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine für das gap2-Gen kodierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe
The invention provides an isolated polynucleotide from coryneform bacteria containing a polynucleotide sequence coding for the gap2 gene selected from the group

• a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,a) polynucleotide that is at least 70% identical toa polynucleotide encoding a polypeptide,the amino acid sequence of SEQ ID no. 2 contains
• b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No.2,b) polynucleotide encoding a polypeptide having aContains at least 70% of the amino acid sequenceis identical to the amino acid sequence ofSEQ ID No.2,
• c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b), undc) polynucleotide that is complementary toPolynucleotides of a) or b), and 
• d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c),d) polynucleotide containing at least 15successive nucleotides of the polynucleotide sequencefrom a), b) or c),

wobei das Polypeptid bevorzugt die Aktivität der Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase 2 aufweist.wherein the polypeptide preferably the activity ofGlyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 2 has.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls das oben genannte Polynukleotid, wobei es sich bevorzugt um eine replizierbare DNA handelt, enthaltend:
The invention likewise provides the abovementioned polynucleotide, which is preferably a replicable DNA comprising:

• a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, odera) the nucleotide sequence shown in SEQ ID no. 1, or
• b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Kodes entspricht, oderb) at least one sequence corresponding to the sequence (i)within the range of degeneration of thecorresponds to genetic codes, or
• c) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfallsc) at least one sequence identical to that for the sequence(i) or (ii) complementary sequence hybridizes,and optionally
• d) funktionsneutralen Sinnmutationen in (i).d) functionally neutral sense mutations in (i).

Weitere Gegenstände sind
Ein replizierbares Polynukleotid, insbesondere DNA, enthaltend die Nukleotidsequenz wie in SEQ ID No. 1 dargestellt;
ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID No. 2 dargestellt, enthält;
ein Vektor, enthaltend das erfindungsgemäße Polynukleotid, insbesondere Pendelvektor oder Plasmidvektor, und
coryneforme Bakterien, die den Vektor enthalten oder in denen das endogene gap2-Gen verstärkt ist.Other items are
A replicable polynucleotide, in particular DNA, containing the nucleotide sequence as in SEQ ID no. 1 shown;
a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence as set forth in SEQ. ID. 2, contains;
a vector containing the polynucleotide according to the invention, in particular pendulum vector or plasmid vector, and
coryneform bacteria containing the vector or in which the endogenous gap2 gene is enhanced.

Gegenstand der Erfindung sind ebenso Polynukleotide, die im wesentlichen aus einer Polynukleotidsequenz bestehen, die erhältlich sind durch Screening mittels Hybridisierung einer entsprechenden Genbank eines coryneformen Bakteriums, die das vollständige Gen oder Teile davon enthält, mit einer Sonde, die die Sequenz der erfindungsgemäßen Polynukleotide gemäß SEQ ID No. 1 oder ein Fragment davon enthält und Isolierung der genannten Polynukleotidsequenz.The invention also relates to polynucleotides which are inconsist essentially of a polynucleotide sequence, the are available by screening by hybridizationa corresponding gene bank of a coryneform bacterium,which contains the complete gene or parts thereof, witha probe containing the sequence of the inventionPolynucleotides according to SEQ ID no. 1 or a fragment thereofcontains and isolation of said polynucleotide sequence.

Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Erfindung enthalten, sind als Hybridisierungs-Sonden für RNA, cDNA und DNA geeignet, um Nukleinsäuren beziehungsweise Polynukleotide oder Gene in voller Länge zu isolieren, die für die Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydorgenase 2 kodieren, oder um solche Nukleinsäuren beziehungsweise Polynukleotide oder Gene zu isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit der Sequenz mit der des gap2-Gens aufweisen. Sie sind ebenso zum Einbau in sogenannte "arrays", "micro arrays" oder "DNA chips" geeignet, um die entsprechenden Polynukleotide zu detektieren und zu bestimmen.Polynucleotides containing the sequences according to the inventionare included as hybridization probes for RNA, cDNAand DNA suitable for nucleic acids, respectivelyIsolate polynucleotides or full length genesencode the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 2,or to such nucleic acids or polynucleotidesor to isolate genes that have a high degree of similaritySequence with the gap2 gene have. They are the samefor installation in so-called "arrays", "micro arrays" or "DNAchips "suitable to the appropriate polynucleotidesdetect and determine.

Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Erfindung enthalten, sind weiterhin als Primer geeignet, mit deren Hilfe mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) DNA von Genen hergestellt werden kann, die für die Glyceraldehyd 3-Phosphat-Dehydrogenase 2 kodieren.Polynucleotides containing the sequences according to the inventionare still suitable as primers, with theirHelp with the polymerase chain reaction (PCR) DNA of genescan be prepared for the glyceraldehyde 3Encode phosphate dehydrogenase 2.

Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide, enthalten mindestens 25, 26, 27, 28, 29 oder 30, bevorzugt mindestens 20, 21, 22, 23 oder 24, ganz besonders bevorzugt mindestens 15, 16, 17, 18 oder 19 aufeinanderfolgende Nukleotide. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 oder 40, oder mindestens 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Nukleotiden. Gegebenenfalls sind auch Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 100, 150, 200, 250 oder 300 Nukleotiden geeignet.Such as probes or primers oligonucleotides,contain at least 25, 26, 27, 28, 29 or 30, preferablyat least 20, 21, 22, 23 or 24, most preferablyat least 15, 16, 17, 18 or 19 consecutiveNucleotides. Also suitable are oligonucleotides witha length of at least 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,39 or 40, or at least 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,49 or 50 nucleotides. If necessary, tooOligonucleotides with a length of at least 100, 150,200, 250 or 300 nucleotides suitable.

"Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld herausgetrennt."Isolated" means from its natural environmentseparated out. 

"Polynukleotid" bezieht sich im allgemeinen auf Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide, wobei es sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA und DNA handeln kann."Polynucleotide" generally refers toPolyribonucleotides and polydeoxyribonucleotides, wherein itunmodified RNA or DNA or modifiedRNA and DNA can act.

Die Polynukleotide gemäß Erfindung schließen ein Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1 oder ein daraus hergestelltes Fragment und auch solche ein, die zu wenigstens besonders 70% bis 80%, bevorzugt zu wenigstens 81% bis 85%, besonders bevorzugt zu wenigstens 86% bis 90%, und ganz besonders bevorzugt zu wenigstens 91%, 93%, 95%, 97% oder 99% identisch sind mit dem Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1 oder eines daraus hergestellten Fragmentes.The polynucleotides according to the invention includePolynucleotide according to SEQ ID no. 1 or one of themproduced fragment and also those that belong toat least especially 70% to 80%, preferably at least81% to 85%, more preferably at least 86% to 90%,and most preferably at least 91%, 93%, 95%,97% or 99% are identical to the polynucleotide according to SEQID No. 1 or a fragment made therefrom.

Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide oder Proteine, die über zwei oder mehr Peptidbindungen verbundene Aminosäuren enthalten.By "polypeptides" is meant peptides or proteins,those linked by two or more peptide bondsContain amino acids.

Die Polypeptide gemäß Erfindung schließen ein Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2, insbesondere solche mit der biologischen Aktivität der Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase 2 und auch solche ein, die zu wenigstens 70% bis 80%, bevorzugt zu wenigstens 81% bis 85%, besonders bevorzugt zu wenigstens 86% bis 90%, und ganz besonders bevorzugt zu wenigstens 91%, 93%, 95%, 97% oder 99% identisch sind mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2 und die genannte Aktivität aufweisen.The polypeptides of the invention include a polypeptideaccording to SEQ ID no. 2, in particular those with thebiological activity of the glyceraldehyde-3-phosphateDehydrogenase 2 and also those which account for at least 70%to 80%, preferably to at least 81% to 85%, especiallypreferably at least 86% to 90%, and especiallypreferably at least 91%, 93%, 95%, 97% or 99%are identical to the polypeptide according to SEQ ID no. 2 andhave the said activity.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, die insbesondere bereits Aminosäuren produzieren und in denen die für das gap2-Gen kodierenden Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.The invention further relates to a method forfermentative production of amino acids selected fromL-asparagine, L-threonine, L-serine, L-glutamate, L-Glycine, L-alanine, L-cysteine, L-valine, L-methionine, L-Isoleucine, L-Leucine, L-Tyrosine, L-Phenylalanine, L-Histidine,L-lysine, L-tryptophan and L-arginine, usingcoryneform bacteria, in particular alreadyProducing amino acids and those responsible for the gap2 geneamplified nucleotide sequences, in particularbe overexpressed. 

Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.The term "reinforcement" describes in this contextthe increase in intracellular activity of one orof several enzymes in a microorganism that are caused by thecorresponding DNA are encoded by, for examplethe copy number of the gene (s) increases, a strongPromoter used or used for a genecorresponding enzyme with a high activity and codedif necessary, combine these measures.

Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp-Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.By the measures of reinforcement, in particularOverexpression, is the activity or concentration of thecorresponding protein generally by at least10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% or 500%,up to 1000% or 2000% of the wild-typeProtein or activity or concentrationof the protein in the initial microorganism increases.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.The microorganisms that are the subject of the presentInvention, L-amino acids can be made from glucose,Sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch,Cellulose or from glycerol and ethanol. It canitself to representative coryneformer bacteria in particular theGenus Corynebacterium act. In the genusCorynebacterium is especially the species Corynebacteriumto call glutamicum, which in the professional world for theirAbility is known to produce L-amino acids.

Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacteriurw acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten bzw. Stämme.Suitable strains of the genus Corynebacterium, in particular the species Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), are especially the known wild-type strains
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacteriurw acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium molassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 and
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
and L-amino acid producing mutants or strains thereof.

Das neue, für das Enzym Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase 2 (EC 1.2.1.12) kodierende gap2-Gen von C. glutamicum wurde isoliert.The new, for the enzyme glyceraldehyde-3-phosphateDehydrogenase 2 (EC 1.2.1.12) coding gap2 gene of C.glutamicum was isolated.

Zur Isolierung des gap2-Gens oder auch anderer Gene von C. glutamicum wird zunächst eine Genbank dieses Mikroorganismus in Escherichia coli (E. coli) angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern niedergeschrieben. Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990), oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Eine sehr bekannte Genbank ist die des E. coli K-12 Stammes W3110, die von Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)) in λ-Vektoren angelegt wurde. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996) beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84: 2160-2164) im E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575) angelegt wurde.For isolation of the gap2 gene or other genes of C.glutamicum will initially be a gene bank of thisMicroorganism in Escherichia coli (E. coli) created. TheCreating gene libraries is well knownTextbooks and manuals written down. As an an examplebe the textbook of Winnacker: Genes and Clones, OneIntroduction to genetic engineering (Verlag Chemie, Weinheim,Germany, 1990), or the Handbook of Sambrook et al .:Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989). A well-known gene bankis that of E. coli K-12 strain W3110, available from Kohara etal. (Cell 50, 495-508 (1987)) in λ vectors.Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255-265,1996) describe a gene bank of C. glutamicum ATCC13032,using the cosmid vector SuperCos I (Wahl et al.,1987, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA,84: 2160-2164) in the E. coli K-12 strain NM554 (Raleigh et al.,1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575).

Börmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326 (1992)) wiederum beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032 unter Verwendung des Cosmids pHC79 (Hohn und Collins, Gene 11, 291-298 (1980)).Börmann et al. (Molecular Microbiology 6 (3), 317-326(1992)) again describe a gene bank of C. glutamicumATCC13032 using the cosmid pHC79 (scab andCollins, Gene 11, 291-298 (1980)).

Zur Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli können auch Plasmide wie pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)) oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259-268) verwendet werden. Als Wirte eignen sich besonders solche E. coli Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefekt sind. Ein Beispiel hierfür ist der Stamm DH5αmcr, der von Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649) beschrieben wurde. Die mit Hilfe von Cosmiden klonierten langen DNA-Fragmente können anschließend wiederum in gängige, für die Sequenzierung geeignete Vektoren subkloniert und anschließend sequenziert werden, so wie es z. B. bei Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463-5467, 1977) beschrieben ist.For the preparation of a gene bank of C. glutamicum in E. coliFor example, plasmids such as pBR322 (Bolivar, Life Sciences,25, 807-818 (1979)) or pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, Vol.19: 259-268). As hosts are suitable especially those E. coli strains, the restriction andare recombination defect. An example of this is theStrain DH5αmcr, which was described by Grant et al. (Proceedings of theNational Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649)has been described. The cloned with the help of cosmidslong DNA fragments can subsequently turn intocommon vectors suitable for sequencingsubcloned and then sequenced, as isz. In Sanger et al. (Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America, 74: 5463-5467,1977).

Die neue, für das Gen gap2 kodierende DNA-Sequenz von C. glutamicum wurde gefunden, die als SEQ ID No. 1 Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist. Weiterhin wurde aus der vorliegenden DNA-Sequenz mit den oben beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz des entsprechenden Proteins abgeleitet. In SEQ ID No. 2 ist die sich ergebende Aminosäuresequenz des gap2-Genproduktes dargestellt. Es ist bekannt, daß wirtseigene Enzyme die N-terminale Aminosäure Methionin bzw. Formylmethionin des gebildeten Proteins abspalten können.The new, for the gene gap2 encoding DNA sequence of C.glutamicum was found, which is described as SEQ ID no. 1 componentof the present invention. Furthermore, from thepresent DNA sequence with those described aboveMethods the amino acid sequence of the corresponding proteinderived. In SEQ ID no. 2 is the resultingAmino acid sequence of the gap2 gene product shown. It isIt is known that our own enzymes are the N-terminal amino acidMethionine or formylmethionine of the protein formedcan split off.

Kodierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID No. 1 durch die Degeneriertheit des genetischen Kodes ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung. In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID No. 1 hybridisieren, Bestandteil der Erfindung. In der Fachwelt sind weiterhin konservative Aminosäureaustausche wie z. B. Austausch von Glycin gegen Alanin oder von Asparaginsäure gegen Glutaminsäure in Proteinen als "Sinnmutationen" (sense mutations) bekannt, die zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen, d. h. funktionsneutral sind. Derartige Mutationen werden unter anderem auch als neutrale Substitutionen bezeichnet. Weiterhin ist bekannt, daß Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen oder sogar stabilisieren können. Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751-757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene 77: 237-251 (1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3: 240-247 (1994)), bei Hochuli et al. (Bio/Technology 6: 1321-1325 (1988)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik Molekularbiologie. Aminosäuresequenzen, die sich in entsprechender Weise aus SEQ ID No. 2 ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung.Coding DNA sequences consisting of SEQ ID no. 1 throughthe degeneracy of the genetic code arealso part of the invention. In the same wayDNA sequences identified by SEQ ID NO. 1 or parts of SEQ IDNo. 1 hybridize, part of the invention. In theExperts are still conservative amino acid exchangessuch as B. Exchange of glycine for alanine or ofAspartic acid against glutamic acid in proteins as"Sense mutations" known to nonefundamental change in the activity of the proteinlead, d. H. are functionally neutral. Such mutationsAmong other things, they are also considered as neutral substitutionsdesignated. Furthermore, it is known that changes to the Nand / or C-terminus of a protein whose function is not significantly affect or even stabilize.Information about this can be found in theBassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751-757 (1987)),in O'Regan et al. (Gene 77: 237-251 (1989)), Sahin-Tothet al. (Protein Sciences 3: 240-247 (1994)), in Hochuli etal. (Bio / Technology 6: 1321-1325 (1988)) and in knownTextbooks of Genetics Molecular Biology.Amino acid sequences that are in a similar mannerSEQ ID no. 2, are also part ofInvention.

In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID No. 1 hybridisieren Bestandteil der Erfindung. Schließlich sind DNA-Sequenzen Bestandteil der Erfindung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich aus SEQ ID No. 1 ergeben. Derartige Oligonukleotide haben typischerweise eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden.Similarly, DNA sequences SEQ ID NO. 1or parts of SEQ ID no. 1 hybridize part of theInvention. Finally, DNA sequences are part ofInvention produced by the polymerase chain reaction (PCR)be made using primers that arefrom SEQ ID no. 1 result. Have such oligonucleotidestypically at least 15 nucleotides in length.

Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260). Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das heisst, es werden nur Hybride gebildet, bei denen Sonde und Zielsequenzen, d. h. die mit der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 70% identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflußt bzw. bestimmt wird. Die Hybridisierungsreaktion wird vorzugsweise bei relativ niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).Instructions for the identification of DNA sequences by means ofHybridization is found among others in the artManual "The DIG System Users Guide for FiltersHybridization "the company Boehringer Mannheim GmbH(Mannheim, Germany, 1993) and Liebl et al.(International Journal of Systematic Bacteriology (1991)41: 255-260). The hybridization takes place under stringentConditions, that is, only hybridsformed in which probe and target sequences, d. H. withprobe treated polynucleotides, at least 70%are identical. It is known that the stringency ofHybridization including washing steps byVarying the buffer composition, the temperature and theSalt concentration is influenced or determined. TheHybridization reaction is preferably carried out at relativelow stringency compared to the washing steps(Hybaid Hybridization Guide, Hybaid Limited,Teddington, UK, 1996). 

Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein 5x SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 50-68°C eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70% Identität zur Sequenz der Sonde aufweisen. Solche Hybride sind weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf 2x SSC und gegebenenfalls nachfolgend 0,5x SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine Temperatur von ca. 50-68°C eingestellt wird. Es ist gegebenenfalls möglich die Salzkonzentration bis auf 0,1x SSC zu senken. Durch schrittweise Erhöhung der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1-2°C von 50 auf 68°C können Polynukleotidfragmente isoliert werden, die beispielsweise mindestens 70% oder mindestens 80% oder mindestens 90% bis 95% Identität zur Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z. B. DIG Easy Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No. 1603558).For the hybridization reaction, for example, a 5xSSC buffer at a temperature of about 50-68 ° Cbe used. It can also probe withHybridize to polynucleotides that are less than 70%Identity to the sequence of the probe. Such hybridsare less stable and are underwent by washingstringent conditions removed. This can be, for exampleby lowering the salt concentration to 2x SSC andoptionally followed by 0.5x SSC (The DIG System User'sGuide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim,Mannheim, Germany, 1995) can be achieved, with aTemperature of about 50-68 ° C is set. It isif necessary, the salt concentration up to 0.1xLower SSC. By gradually increasing theHybridization temperature in steps of about 1-2 ° C of50 to 68 ° C polynucleotide fragments can be isolatedfor example, at least 70% or at least 80% orat least 90% to 95% identity to the sequence ofown used probe. Further instructions for theHybridization are in the form of so-called kits on the marketavailable (eg DIG Easy Hyb from RocheDiagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Catalog No.1603558).

Anleitung zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).Instructions for the amplification of DNA sequences using thePolymerase chain reaction (PCR) is the expert underin the Gait Handbook: Oligonucleotide Synthesis: APractical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984)Newton and Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg, Germany, 1994).

Es wurde gefunden, daß coryneforme Bakterien nach Überexpression des gap2-Gens in verbesserter Weise Aminosäuren produzieren.It was found that coryneform bacteria afterOverexpression of the gap2 gene in an improved mannerProduce amino acids.

Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen Aminosäure-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.To achieve overexpression, the copy number of thecorresponding genes are increased, or it may be thePromoter and regulatory region or the Ribosome binding site located upstream of theStructural gene is mutated. In the same wayact expression cassettes upstream of theStructural gene to be installed. By induciblePromoters it is additionally possible to express in theFollow the fermentative amino acid productionincrease. By measures to extend the lifethe m-RNA is also improved expression.Furthermore, by preventing the degradation of theEnzyme protein also enhances the enzyme activity. TheGenes or gene constructs can be either in plasmids withdifferent copy number or in the chromosomeintegrated and amplified. Alternatively, continuean overexpression of the genes in question by alterationmedia composition and cultural leadershipbecome.

Anleitung hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift 0 472 869, im US-Patent 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), in der japanischen Offenlegungsschrift JP-A-10-229891, bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), bei Makrides (Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.Guide to this is the expert, among othersMartin et al. (Bio / Technology 5, 137-146 (1987))Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya andMorinaga (Bio / Technology 6, 428-430 (1988)), to Eikmannset al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in the EuropeanPatent 0 472 869, U.S. Patent 4,601,893Schwarzer and Pühler (Bio / Technology 9, 84-87 (1991))Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology60, 126-132 (1994)), LaBarre et al. (Journal ofBacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in the patent applicationWO 96/15246 to Malumbres et al. (Gene 134, 15-24(1993)), Japanese Patent Laid-Open Publication JP-A-10-229891,Jensen and Hammer (Biotechnology andBioengineering 58, 191-195 (1998)), to Makrides(Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)) and inwell-known textbooks of genetics and molecular biology.

Zur Verstärkung wurde das erfindungsgemäße gap2-Gen beispielhaft mit Hilfe von episomalen Plasmiden überexprimiert. Als Plasmide eignen sich solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren wie z. B. pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren wie z. B. solche, die auf pCG4 (US-A 4,489,160), oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), oder pAG1 (US-A 5,158,891) beruhen, können in gleicher Weise verwendet werden.For amplification, the gap2 gene according to the inventionby way of example with the aid of episomal plasmidsoverexpressed. Suitable plasmids are those which are known in coryneform bacteria are replicated. numerousknown plasmid vectors such. PZ1 (Menkel et al.,Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554),pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) or pHS2-1(Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)) are based on thecryptic plasmids pHM1519, pBL1 or pGA1. OtherPlasmid vectors such. For example, those based on pCG4(US-A 4,489,160), or pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMSMicrobiology Letters 66, 119-124 (1990)), or pAG1(US-A 5,158,891) can be used in the same waybecome.

Weiterhin eignen sich auch solche Plasmidvektoren mit Hilfe derer man das Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es beispielsweise von Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; US-A 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) oder pBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene 41: 337-342) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross over"-Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens. Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, neben dem gap2-Gen eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat-Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren.Furthermore, such plasmid vectors are also suitable with the aid ofone of the procedure of gene amplification byIntegration into the chromosome can apply, just like itfor example, Remscheid et al. (Applied andEnvironmental Microbiology 60, 126-132 (1994))Duplication or amplification of the hom-thrB operonhas been described. This method becomes the complete oneGene is cloned into a plasmid vector which is in a host(typically E. coli), but not in C. glutamicumcan replicate. As vectors come, for examplepSUP301 (Simon et al., Bio / technology 1, 784-791 (1983)),pK18mob or pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73(1994)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA),pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry269: 32678-84; US-A 5,487,993), pCR® Blunt (CompanyInvitrogen, Groningen, The Netherlands; Bernard et al., Journalof Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEM1 (shrinket al., 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) orpBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene 41: 337-342). ThePlasmid vector containing the gene to be amplified issubsequently by conjugation or transformation into thedesired strain of C. glutamicum transferred. The methodthe conjugation is described by Schäfer et al.(Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994))described. Methods for transformation are for example, in Thierbach et al. (Applied Microbiologyand Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican and Shivnan(Bio / Technology 7, 1067-1070 (1989)) and Tauch et al. (FEMSMicrobiological Letters 123, 343-347 (1994)).After homologous recombination by means of a cross overEventually, the resulting root contains at least twoCopies of the gene in question. In addition, it may be for theProduction of L-amino acids be beneficial, in addition togap2 gene of one or more enzymes of eachBiosynthesis pathway, glycolysis, anaplerotic,Citric acid cycle, the pentose phosphate cycle, theAmino acid exports and optionally regulatoryTo amplify proteins, in particular overexpress.

So kann beispielsweise für die Herstellung von L-Aminosäuren zusätzlich zur Verstärkung des gap2-Gens eines oder mehrere endogene Gene, ausgewählt aus der Gruppe
For example, for the production of L-amino acids, in addition to amplifying the gap2 gene, one or more endogenous genes selected from the group

• - das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP-B 0 197 335),The gene coding for the dihydrodipicolinate synthasedapA (EP-B 0 197 335),
• - das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),- that for the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenasecoding gene gap (Eikmanns (1992), Journal ofBacteriology 174: 6076-6086),
• - das für die Triosephosphat-Isomerase kodierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-­6086),The gene tpi coding for the triosephosphate isomerase(Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
• - das für die 3-Phosphoglycerat-Kinase kodierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),- The gene coding for the 3-phosphoglycerate kinase gene pgk(Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
• - das für die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodierende Gen zwf (JP-A-09224661),- The coding for the glucose-6-phosphate dehydrogenaseGen zwf (JP-A-09224661),
• - das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende Gen pyc (DE-A 198 31 609),- The gene coding for the pyruvate carboxylase gene pyc(DE-A 198 31 609), 
• - das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodierende Gen mqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),The gene coding for malate quinone oxidoreductasemqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry254, 395-403 (1998)),
• - das für eine feed back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (Accession No. P26512; EP-B-0387527; EP-A-0699759),- that for a feed back resistant aspartate kinasecoding gene lysC (Accession No. P26512; EP-B-0387527;EP-A-0699759),
• - das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE (DE-A-195 48 222),- the gene encoding lysine export, lysE(DE-A-195 48 222),
• - das für die Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom (EP-A 0131171),Homoserine dehydrogenase-encoding gene hom(EP-A 0131171),
• - das für die Threonin-Dehydratase kodierende Gen ilvA (Möckel et al., Journal of Bacteriology (1992) 8065-­8072) oder das für eine "feed back resistente" Threonin-Dehydratase kodierende Allel ilvA(Fbr) (Möckel et al., (1994) Molecular Microbiology 13: 833-842),- The gene encoding ilvA for the threonine dehydratase(Möckel et al., Journal of Bacteriology (1992) 8065-8072) or the "feed back resistant" threonineDehydratase-encoding allele ilvA (Fbr) (Möckel et al.,(1994) Molecular Microbiology 13: 833-842),
• - das für die Acetohydroxysäure-Synthase kodierenden Gen ilvBN (EP-B 0356739),- The gene coding for the acetohydroxy acid synthase geneilvBN (EP-B 0356739),
• - das für die Dihydroxysäuredehydratase kodierende Gen ilvD (Sahm und Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 1973-1979),- The gene coding for the Dihydroxysäuredehydratase geneilvD (Sahm and Eggeling (1999) Applied and EnvironmentalMicrobiology 65: 1973-1979),
• - das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 DE 199 59 328.0, DSM 13115)The gene coding for the Zwa1 protein zwa1DE 199 59 328.0, DSM 13115)

verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.amplified, in particular overexpressed.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung des gap2-Gens eines oder mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe
Furthermore, it may be advantageous for the production of L-amino acids, in addition to the amplification of the gap2 gene, one or more genes selected from the group

• - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck (DE 199 50 409.1; DSM 13047),- The coding for the phosphoenolpyruvate carboxykinaseGene pck (DE 199 50 409.1, DSM 13047), 
• - das für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodierende Gen pgi (US 09/396,478; DSM 12969),- The gene coding for the glucose-6-phosphate isomerase genepgi (US 09 / 396,478; DSM 12969),
• - das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (DE 199 51 975.7; DSM 13114);- The gene encoding the pyruvate oxidase poxB(DE 199 51 975.7, DSM 13114);
• - das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 (DE 199 59 327.2, DSM 13113)- the zwa2 protein encoding gene zwa2(DE 199 59 327.2, DSM 13113)

abzuschwächen, insbesondere die Expression zu verringern.attenuate, in particular to reduce expression.

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.The term "weakening" describes in thisRelated to the reduction or elimination of theintracellular activity of one or more enzymes(Proteins) in a microorganism produced by thecorresponding DNA are encoded by, for exampleused a weak promoter or a gene or alleleused for a corresponding enzyme with alow activity encodes or the corresponding gene orInactivated enzyme (protein) and optionally thisMeasures combined.

Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.By the measures of weakening becomes the activityor concentration of the corresponding protein in thegeneral to 0 to 75%, 0 to 50%, 0 to 25%, 0 to 10%or 0 to 5% of the activity or concentration of the wild-typeProtein, or activity or concentrationof the protein in the initial microorganism, lowered.

Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren vorteilhaft sein, neben der Überexpression des gap2-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Aminoacid Producing Micro-organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).Furthermore it can be used for the production of amino acidsbe advantageous, in addition to the overexpression of the gap2 geneto eliminate unwanted side reactions (Nakayama:"Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", in:Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta,Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von Aminosäuren kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1984)) beschrieben.The microorganisms produced according to the invention arealso the subject of the invention and cancontinuous or discontinuous in the batch process (Batch cultivation) or in the fed batch (feed method) orrepeated fed batch process (repetitive feed process)cultured for the purpose of producing amino acidsbecome. A summary of knownCultivation methods is in the textbook of Chmiel(Bioprocess Engineering 1. Introduction to Bioprocess Engineering(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbookStorhas (bioreactors and peripheral facilities(Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1984)).

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten.The culture medium to be used must suitablyClaims of the respective strains suffice. descriptionsof culture media of various microorganisms are inManual of Methods for General BacteriologyAmerican Society for Bacteriology (Washington D.C., USA,1981).

Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.As a carbon source, sugars and carbohydrates canz. Glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose,Molasses, starch and cellulose, oils and fats such. B.Soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut oil, fatty acidssuch as Palmitic acid, stearic acid and linoleic acid,Alcohols such. As glycerol and ethanol and organicAcids such. As acetic acid can be used. These substancescan be used singly or as a mixture.

Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.As nitrogen source organic nitrogen-containingCompounds such as peptones, yeast extract, meat extract,Malt extract, corn steep liquor, soybean meal and ureaor inorganic compounds such as ammonium sulfate,Ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate andAmmonium nitrate can be used. The nitrogen sourcescan be used singly or as a mixture.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogen­phosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.As a phosphorus source can phosphoric acid, potassium dihydrogenphosphate or dipotassium hydrogen phosphate or thecorresponding sodium-containing salts are used. TheCulture medium must continue to contain salts of metals such as z. As magnesium sulfate or iron sulfate, for growthnecessary. After all, essential growth substances canlike amino acids and vitamins in addition to the abovebe used. The culture mediumIn addition, suitable precursors may be added. Thementioned feedstocks can be used to culture in the form of aadded one-off approach or appropriatelybe fed during cultivation.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.For pH control of the culture basic compoundssuch as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia orAmmonia water or acidic compounds such as phosphoric acidor sulfuric acid used in a suitable manner. toFoam processing control can use anti-foaming agentsz. B. fatty acid polyglycol esters are used. toMaintaining the stability of plasmids can theMedium suitable selective substances such. B.Antibiotics are added. To aerobic conditionsmaintain, become oxygen or oxygencontaining gas mixtures such. B. air into the cultureentered. The temperature of the culture is usuallyat 20 ° C to 45 ° C, and preferably at 25 ° C to 40 ° C. TheCulture is continued until a maximum ofdesired product has formed. This goal will beusually within 10 hours to 160 hoursreached.

Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Ionenaustausch-Chromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.Methods for the determination of L-amino acids are known from theKnown in the art. The analysis can be like this for exampleas in Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958),1190) described by ion exchange chromatographyfollowed by ninhydrin derivatization, or theycan be done by reversed phase HPLC, as inLindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174)described.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren.The inventive method is used for fermentativeProduction of amino acids. 

Folgender Mikroorganismus wurde als Reinkultur am 18. Juli 2001 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:
The following microorganism was deposited as a pure culture on 18 July 2001 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany) under the Budapest Treaty:

• - Escherichia coli DH5αmcr/pEC-K18mob2gap2exp als DSM 14407.Escherichia coli DH5αmcr / pEC-K18mob2gap2exp as DSM14,407th

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.The present invention will be described below with reference toEmbodiments explained in more detail.

Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalische Phosphatasebehandlung wurden nach Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA) durchgeführt. Methoden zur Transformation von Escherichia coli sind ebenfalls in diesem Handbuch beschrieben.The isolation of plasmid DNA from Escherichia coli as wellall techniques for restriction, Klenow and alkalinePhosphatase treatment was performed according to Sambrook et al.(Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA)carried out. Methods for the transformation of Escherichiacoli are also described in this manual.

Die Zusammensetzung gängiger Nährmedien wie LB- oder TY-Medium kann ebenfalls dem Handbuch von Sambrook et al. entnommen werden.The composition of common nutrient media such as LB or TYMedium can also be found in the manual of Sambrook et al.be removed.

Beispiel 1example 1Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032Preparation of a Genomic Cosmid Gene BankCorynebacterium glutamicum ATCC 13032

Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wurde wie bei Tauch et al. (1995), Plasmid 33: 168-179) beschrieben, isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code no. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code No. 1758250) dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1 (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160-2164), bezogen von der Firma Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301) wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code no. 27-0948-02) gespalten und ebenfalls mit shrimp alkalischer Phosphatase dephosphoryliert.Chromosomal DNA from Corynebacterium glutamicum ATCC 13032was as in Tauch et al. (1995), Plasmid 33: 168-179)described, isolated and with the restriction enzyme Sau3AI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany,Product description Sau3AI, Code no. 27-0913-02) partialsplit. The DNA fragments were shrimp with alkalinePhosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany,Product description SAP, code no. 1758250)dephosphorylated. The DNA of the cosmid vector SuperCos1(Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy ofSciences USA 84: 2160-2164), obtained from the company Stratagene (La Jolla, USA, Product description SuperCos1Cosmid Vector Kit, code no. 251301) was used with theRestriction enzyme XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg,Germany, Product Description XbaI, Code no. 27-0948-02)cleaved and also with shrimp alkaline phosphatasedephosphorylated.

Abschließend wurde die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868-04) gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der behandelten ATCC13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code no. 27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschließend mit Hilfe des Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217) in Phagen verpackt.Finally, the cosmid DNA with the restriction enzymeBamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany,Product Description BamHI, Code no. 27-0868-04).The cosmid DNA treated in this way was labeled with thetreated ATCC13032 DNA and the mixture with T4DNA ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany,Product Description T4 DNA Ligase, Code no. 27-0870-04)treated. The ligation mixture was then washed withHelp with the Gigapack II XL Packing Extract (Stratagene, LaJolla, USA, Product description Gigapack II XL PackingExtract, Code no. 200217) in phages.

Zur Infektion des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Research 16: 1563-1575) wurden die Zellen in 10 mM MgSO₄ aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der Cosmidbank wurden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1 : 190) mit 100 mg/l Ampicillin ausplattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden rekombinante Einzelklone selektioniert.To infect the E. coli strain NM554 (Raleigh et al 1988, Nucleic Acid Research 16: 1563-1575), the cells were taken up in 10 mM MgSO₄ and mixed with an aliquot of the phage suspension. Infection and titering of the cosmidbank were performed as described by Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), where the cells were plated on LB agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) with 100 mg / L ampicillin. After incubation overnight at 37 ° C, recombinant single clones were selected.

Beispiel 2Example 2Isolierung und Sequenzierung des gap2-GensIsolation and sequencing of the gap2 gene

Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product-No. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgte die Isolierung der Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany).The cosmid DNA of a single colony was treated with the QiaprepSpin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden,Germany) isolated according to the manufacturer and with theRestriction enzyme Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, product description Sau3AI, Product-No. 27-0913-02) partially split. The DNA fragments were withshrimp alkaline phosphatase (Roche Diagnostics GmbH,Mannheim, Germany, Product Description SAP, Product no.1758250) dephosphorylated. After gel electrophoresisSeparation was the isolation of the cosmid fragments inSize range from 1500 to 2000 bp with the QiaExII gelExtraction Kit (Product No. 20021, Qiagen, Hilden,Germany).

Die DNA des Sequenziervektors pZero-1 bezogen von der Firma Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Product No. K2500-01), wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI No. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den Sequenziervektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg Deutschland) über Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde anschließend in den E. coli Stamm DH5αMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645-4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7) und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology 1 : 190) mit 50 mg/l Zeocin ausplattiert.The DNA of the sequencing vector pZero-1 obtained from the companyInvitrogen (Groningen, Netherlands, product descriptionZero Background Cloning Kit, Product No. K2500-01)with the restriction enzyme BamHI (Amersham Pharmacia,Freiburg, Germany, Product Description BamHI No. 27-0868-04). The Ligation of Cosmidfragmente in theSequencing vector pZero-1 was prepared as described by Sambrook et al.(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor) described, wherein the DNA mixture withT4 ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg Germany)Was incubated overnight. This ligation mixture wasinto the E. coli strain DH5αMCR (Grant, 1990,Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A.,87: 4645-4649) (Tauch et al., 1994, FEMSMicrobiol Letters, 123: 343-7) and on LB agar (Lennox,1955, Virology 1: 190) with 50 mg / l zeocin plated.

Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgte mit dem Biorobot 9600 (Product No. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte nach der Dideoxy-Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A., 74: 5463-5467) mit Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). Es wurde der "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems (Product No. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die gelelektrophoretische Auftrennung und Analyse der Sequenzierreaktion erfolgte in einem "Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid" Gel (29 : 1) (Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany) mit dem "ABI Prism 377" Sequenziergerät von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland).The plasmid preparation of the recombinant clones was carried out withthe Biorobot 9600 (Product No. 900200, Qiagen, Hilden,Germany). The sequencing was carried out after the dideoxyChain termination method of Sanger et al. (1977, Proceedingsof the National Academy of Sciences U.S.A., 74: 5463-5467)with modifications according to Zimmermann et al. (1990, NucleicAcids Research, 18: 1067). It became the "RR dRhodaminTerminator Cycle Sequencing Kit "by PE Applied Biosystems(Product No. 403044, Weiterstadt, Germany).Gel electrophoretic separation and analysis of the Sequencing reaction was carried out in a "rotiphoresis NFAcrylamide / Bisacrylamide "Gel (29: 1) (Product No. A124.1,Roth, Karlsruhe, Germany) with the "ABI Prism 377"Sequencer from PE Applied Biosystems (Weiterstadt,Germany).

Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten wurden anschließend unter Anwendung des Staden-Programmpakets (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) Version 97-0 prozessiert. Die Einzelsequenzen der pZero1-Derivate wurden zu einem zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützte Kodierbereichsanalyse wurde mit dem Programm XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) angefertigt.The obtained crude sequence data were then underApplication of the Staden program package (1986, Nucleic AcidsResearch, 14: 217-231), version 97-0. TheSingle sequences of pZero1 derivatives became onecoherent contig assembled. The computer-aidedCoding area analysis was carried out with the program XNIP (Staden,1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231).

Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 1 dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenz ergab ein offenes Leseraster von 1440 Basenpaaren, welches als gap2-Gen bezeichnet wurde. Das gap2-Gen kodiert für ein Protein von 480 Aminosäuren.The nucleotide sequence obtained is shown in SEQ ID no. 1shown. Analysis of the nucleotide sequence revealedopen reading frame of 1440 base pairs, which is called gap2-Gene was designated. The gap2 gene encodes a proteinof 480 amino acids.

Beispiel 3Example 3Herstellung eines Shuttlevektors pEC-K18mob2gap2exp zur Verstärkung des gap2-Gens in C. glutamicumPreparation of a shuttle vector pEC-K18mob2gap2exp forReinforcement of the gap2 gene in C. glutamicum3.1 Klonierung des gap2-Gens in den Vektor pCR®Blunt II3.1 Cloning of the gap2 Gene into the Vector pCR®Blunt II

Aus dem Stamm ATCC 13032 wurde nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) chromosomale DNA isoliert. Aufgrund der aus Beispiel 2 für C. glutamicum bekannten Sequenz des gap2-Gens wurden die folgenden Oligonukleotide für die Polymerase Kettenreaktion ausgewählt (siehe auch SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 4):
gap2expl:
5'-TTG AAG TGG AGC CGG ACG AG-3'
gap2exp2:
5'-CCT ATA GTA CGG CTG GCT GC-3'From strain ATCC 13032, the method of Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) isolated chromosomal DNA. Because of the sequence of the gap2 gene known from Example 2 for C. glutamicum, the following oligonucleotides were selected for the polymerase chain reaction (see also SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 4):
gap2expl:
5'-TTG AAG TGG AGC CGG ACG AG-3 '
gap2exp2:
5'-CCT ATA GTA CGG CTG GCT GC-3 '

Die dargestellten Primer wurden von der Firma ARK Scientific GmbH Biosystems (Darmstadt, Deutschland) synthetisiert und nach der Standard-PCR-Methode von Innis et al. (PCR protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) mit Pwo-Polymerase der Firma Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Deutschland) die PCR Reaktion durchgeführt. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion ermöglichen die Primer die Amplifikation eines 2022 bp großen DNA-Fragmentes, welches das gap2-Gen mit der potentiellen Promotor-Region trägt. Die DNA Sequenz des amplifizierten DNA Fragmentes wurde durch Sequenzierung überprüft.The primers shown were from the company ARKScientific GmbH Biosystems (Darmstadt, Germany)synthesized and according to the standard PCR method of Inniset al. (PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications,1990, Academic Press) with Pwo polymerase from RocheDiagnostics GmbH (Mannheim, Germany) the PCR reactioncarried out. With the help of the polymerase chain reactionallow the primers to amplify a 2022 bplarge DNA fragment containing the gap2 gene with thecarries potential promoter region. The DNA sequence of theamplified DNA fragment was by sequencingchecked.

Das amplifizierte DNA Fragment wurde mit dem Zero Blunt^TM Kit der Firma Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Katalog Nummer K2700-20) in den Vektor pCR®Blunt II (Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) ligiert.The amplified DNA fragment was amplified with the Zero Blunt^™ kit from Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA, catalog number K2700-20) into the vector pCR® Blunt II (Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534- 541 (1993)).

Anschließend wurde der E. coli Stamm TOP10 mit dem Ligationsansatz (Hanahan, In: DNA cloning. A Practical Approach. Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985) elektroporiert. Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert worden war. Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen isoliert und durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und anschließender Agarosegel-Elektrophorese (0,8%) überprüft. Das Plasmid wurde pCRB1-gap2exp genannt.Subsequently, the E. coli strain TOP10 was electroporated with the ligation batch (Hanahan, In: DNA cloning, A Practical Approach, Vol I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985). The selection of plasmid-carrying cells was made by plating out the transformation batch on LB agar (Sambrook et al, Molecular Cloning:... A Laboratory Manual 2^nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) coupled to 25 mg / l kanamycin had been supplemented. Plasmid DNA was isolated from a transformant using the QIAprep Spin Miniprep Kit from Qiagen and checked by restriction with the restriction enzyme EcoRI and subsequent agarose gel electrophoresis (0.8%). The plasmid was named pCRB1-gap2exp.

3.2 Herstellung des E. coli - C. glutamicum Shuttle Vektors pEC-K18mob23.2 Preparation of the E. coli - C. glutamicum shuttleVector pEC-K18mob2

Nach dem Stand der Technik wurde der E. coli - C. glutamicum Shuttle-Vektor konstruiert. Der Vektor enthält die Replikationsregion rep des Plasmids pGA1 einschließlich des Replikationseffectors per (US-A- 5,175,108; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525-1532 (1997)), das Kanamycinresistenz vermittelnde aph(3')-IIa-Gen des Transposons Tn5 (Beck et al., Gene 19, 327-336 (1982)), die Replikationsregion oriV des Plasmids pMB1 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77-90 (1979)), das lacZα Genfragment einschließlich des lac-Promotors und einer Mehrfachklonierschnittstelle (multiple cloning site, mcs) (Norrander, J.M, et al., Gene 26, 101-­106 (1983)) und die mob-Region des Plasmids RP4 (Simon et al., Bio/Technology 1: 784-791 (1983)).In the prior art, the E. coli - C.glutamicum shuttle vector constructed. The vector containsthe replication region rep of the plasmid pGA1 inclusiveof the replication effector per (US-A-5,175,108; Nesvera etal., Journal of Bacteriology 179, 1525-1532 (1997)), theKanamycin resistance mediating aph (3 ') - IIa gene ofTransposons Tn5 (Beck et al., Gene 19, 327-336 (1982))Replication region oriV of the plasmid pMB1 (Sutcliffe, ColdSpring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77-90(1979)), the lacZα gene fragment including the lacPromoter and a multiple cloning interface (multiplecloning site, mcs) (Norrander, J.M., et al., Gene 26, 101-106 (1983)) and the mob region of plasmid RP4 (Simon etal., Bio / Technology 1: 784-791 (1983)).

Der konstruierte Vektor pEC-K18mob2 wurde mittels Elektroporation (Liebl et al., 1989, FEMS Microbiology Letters, 53: 299-303) in C. glutamicum DSM5715 transferiert. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf LBHTS Agar bestehend aus 18,5 g/l Brain-Heart Infusion Boullion, 0,5 M Sorbitol, 5 g/l Bacto-Trypton, 2,5 g/l Bacto-Yeast-Extract, 5 g/l NaCl und 18 g/l Bacto-Agar, der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert worden war. Die Inkubation erfolgte für 2 Tage bei 33°C.The constructed vector pEC-K18mob2 was analyzed by means ofElectroporation (Liebl et al., 1989, FEMS MicrobiologyLetters, 53: 299-303) in C. glutamicum DSM5715.The selection of the transformants was carried out on LBHTS agarconsisting of 18.5 g / l Brain-Heart Infusion Boullion, 0.5 MSorbitol, 5 g / l bacto-tryptone, 2.5 g / l bacto-yeast extract,5 g / L NaCl and 18 g / L Bacto agar supplemented with 25 mg / L kanamycinhad been supplemented. The incubation took place for 2Days at 33 ° C.

Plasmid DNA wurde aus einer Transformante nach den üblichen Methoden isoliert (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927), mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und HindIII geschnitten und das Plasmid durch anschließende Agarosegel-Elektrophorese überprüft.Plasmid DNA was made from a transformant according to the usualIsolated methods (Peters-Wendisch et al., 1998,Microbiology, 144, 915-927), with theRestriction endonucleases EcoRI and HindIII cut andthe plasmid by subsequent agarose gel electrophoresischecked.

Das so erhaltene Plasmidkonstrukt wurde als pEC-K18mob2 bezeichnet und ist inFig. 1 dargestellt. Der durch Elektroporation des Plasmides pEC-K18mob2 in den C. glutamicum-Stamm DSM5715 erhaltene Stamm wurde DSM5715/pEC-K18mob2 genannt und am 20. Januar 2000 als DSM 13245 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt.The resulting plasmid construct was named pEC-K18mob2 and is shown inFIG . The strain obtained by electroporation of the plasmid pEC-K18mob2 into the C. glutamicum strain DSM5715 was named DSM5715 / pEC-K18mob2 and reported on January 20, 2000 as DSM 13245 to the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany) Budapest Treaty deposited.

3.3 Klonierung von gap2 in den E. coli - C. glutamicum Shuttle Vektor pEC-K18mob23.3 Cloning of gap2 into E. coli - C. glutamicumShuttle vector pEC-K18mob2

Für die Klonierung des gap2-Gens in den in Beispiel 3.2 beschriebenen E. coli - C. glutamicum Shuttle-Vektor pEC-K18mob2 wurde Plasmid-DNA von pEC-K18mob2 mit den Restriktionsendonukleasen Ec1136II und XbaT vollständig geschnitten und mit alkalischer Phosphatase (Alkaline Phosphatase, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) behandelt.For the cloning of the gap2 gene in the in Example 3.2described E. coli - C. glutamicum shuttle vector pEC-K18mob2 was transformed into plasmid DNA of pEC-K18mob2 with theRestriction endonucleases Ec1136II and XbaT completecut and with alkaline phosphatase (AlkalinePhosphatase, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)treated.

Der Vektor pCRBl-gap2exp wurde aus Escherichia coli Top10 isoliert und mit den Restriktionsendonukleasen Ec1136II und XbaI vollständig geschnitten und das ca. 2120 bp große Fragment mit dem gap2-Gen aus einem 0,8%-igen Agarosegel aufgereinigt (QIAquick Gel Extraction Kit der Firma Qiagen, Hilden, Deutschland). Anschließend wurde das Fragment mit dem gap2-Gen mit dem Vektor pEC-K18mob2 ligiert (T4-Ligase, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim; Deutschland). Der Ligationsansatz wurde in den E. coli Stamm DH5alphamcr (Hanahan, In: DNA cloning. A Practical Approach. Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA) transformiert. Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert worden war. Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) isoliert und durch Behandlung mit dem Restriktionsenzym EcoRI mit anschließender Agarosegel-Elektrophorese überprüft. Das Plasmid wurde pEC-K18mob2gap2exp genannt und ist inAbb. 2 dargestellt.The vector pCRB1-gap2exp was isolated from Escherichia coli Top10 and completely cut with the restriction endonucleases Ec1136II and XbaI, and the approximately 2120 bp fragment was purified with the gap2 gene from a 0.8% agarose gel (QIAquick Gel Extraction Kit from the company Qiagen, Hilden, Germany). Subsequently, the fragment with the gap2 gene was ligated with the vector pEC-K18mob2 (T4 ligase, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). The ligation mixture was transformed into E. coli strain DH5alphamcr (Hanahan, In: DNA cloning, A Practical Approach, Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA). The selection of plasmid-carrying cells was made by plating out the transformation batch on LB agar (Sambrook et al, Molecular Cloning:... A Laboratory Manual 2^nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) coupled to 25 mg / l kanamycin had been supplemented. Plasmid DNA was isolated from a transformant using the QIAprep Spin Miniprep Kit from Qiagen (Hilden, Germany) and checked by treatment with the restriction enzyme EcoRI followed by agarose gel electrophoresis. The plasmid was named pEC-K18mob2gap2exp and is shown inFIG .

Beispiel 4Example 4Transformation des Stammes DSM5715 mit dem Plasmid pEC-K18mob2gap2expTransformation of the strain DSM5715 with the plasmid pEC-K18mob2gap2exp

Der Stamm DSM5715 wurde mit dem Plasmid pEC-K18mob2gap2exp unter Anwendung der von Liebl et al., (FEMS Microbiology Letters, 53: 299-303 (1989)) beschriebenen Elektroporationsmethode transformiert. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf LBHIS Agar bestehend aus 18,5 g/l Brain-Heart Infusion Boullion, 0,5 M Sorbitol, 5 g/l Bacto-Trypton, 2,5 g/l Bacto-Yeast-Extract, 5 g/l NaCl und 18 g/l Bacto-Agar, der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert worden war. Die Inkubation erfolgte für 2 Tage bei 33°C.The strain DSM5715 was amplified with the plasmid pEC-K18mob2gap2expusing the method described by Liebl et al., (FEMS MicrobiologyLetters, 53: 299-303 (1989))Transformed electroporation method. The selection ofTransformants were made on LBHIS agar consisting of18.5 g / L Brain-Heart Infusion Boullion, 0.5 M Sorbitol, 5 g / LBacto-Tryptone, 2.5 g / L Bacto-Yeast extract, 5 g / L NaCl and18 g / l Bacto agar supplemented with 25 mg / l kanamycinhad been. Incubation was for 2 days at 33 ° C.

Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante nach den üblichen Methoden isoliert (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927), mit der Restriktionsendonuklease EcoRI geschnitten und das Plasmid durch anschließende Agarosegel-Elektrophorese überprüft. Der so erhaltene Stamm wurde DSM5715/pEC-K18mob2gap2exp genannt.Plasmid DNA was made from a transformant according to the usualIsolated methods (Peters-Wendisch et al., 1998,Microbiology, 144, 915-927), with theRestriction endonuclease EcoRI cut and the plasmidchecked by subsequent agarose gel electrophoresis.The strain thus obtained became DSM5715 / pEC-K18mob2gap2expcalled.

Beispiel 5Example 5Herstellung von LysinProduction of lysine

Der in Beispiel 4 erhaltene C. glutamicum Stamm DSM5715/pEC-K18mob2gap2exp wurde in einem zur Produktion von Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der Lysingehalt im Kulturüberstand bestimmt.The C. glutamicum strain obtained in Example 4DSM5715 / pEC-K18mob2gap2exp was in production for onecultured by lysine suitable nutrient medium and theLysine content determined in the culture supernatant.

Dazu wurde der Stamm zunächst auf Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar mit Kanamycin (25 mg/l)) für 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für die Vorkultur wurde das Vollmedium CgIII verwendet.For this, the strain was first on agar plate with thecorresponding antibiotic (brain-heart agar with kanamycin(25 mg / l)) for 24 hours at 33 ° C incubated. Starting fromThis agar plate culture was inoculated into a preculture(10 ml of medium in 100 ml Erlenmeyer flask). As a medium for thePreculture, the complete medium CgIII was used. 

Medium Cg IIIMedium Cg III

NaClNaCl2,5 g/l2.5 g / lBacto-PeptonBacto-peptone10 g/l10 g / lBacto-Yeast-ExtraktBacto-yeast extract10 g/l10 g / lGlucose (getrennt autoklaviert)Glucose (separately autoclaved)2% (w/v)2% (w / v)AL=L<Der pH-Wert wurde auf pH 7.4 eingestelltAL = L <The pH was adjusted to pH 7.4

Diesem wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Vorkultur wurde 16 Stunden bei 33°C bei 240 rpm auf dem Schüttler inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft, so daß die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,05 betrug. Für die Hauptkultur wurde das Medium MM verwendet.To this was added kanamycin (25 mg / L). The preculturewas 16 hours at 33 ° C at 240 rpm on the shakerincubated. From this Vorkultur became a main cultureseeded so that the initial OD (660 nm) of the major culture0.05. For the main culture, the medium MMused. 

Medium MMMedium MM

CSL (Corn Steep Liquor)CSL (Corn Steep Liquor)5 g/l5 g / lMOPS (Morpholinopropansulfonsäure)MOPS (morpholinopropanesulfonic acid)20 g/l20 g / lGlucose (getrennt autoklaviert)Glucose (separately autoclaved)100 g/l100 g / l(NH₄)₂SO₄(NH₄ )₂ SO₄25 g/l25 g / lKH₂PO₄KH₂ PO₄0,1 g/l0.1 g / lMgSO₄.7 H₂OMgSO₄ .7H₂ O1,0 g/l1.0 g / lCaCl₂.2 H₂OCaCl₂ .2H₂ O10 mg/l10 mg / lFeSO₄.7 H₂OFeSO₄ .7H₂ O10 mg/l10 mg / lMnSO₄.H₂OMnSO₄ .H₂ O5,0 mg/l5.0 mg / lBiotin (sterilfiltriert)Biotin (sterile filtered)0,3 mg/l0.3 mg / lThiamin.HCl (sterilfiltriert)Thiamine.HCl (sterile filtered)0,2 mg/l0.2 mg / lL-Leucin (sterilfiltriert)L-leucine (sterile filtered)0,1 g/l0.1 g / lCaCO₃CaCO₃25 g/l25 g / l

CSL, MOPS und die Salzlösung wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend wurden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen zugesetzt, sowie das trocken autoklavierte CaCO₃.CSL, MOPS and saline were adjusted to pH 7 with ammonia water and autoclaved. Subsequently, the sterile substrate and vitamin solutions were added, as well as the dry autoclaved CaCO₃ .

Die Kultivierung erfolgt in 10 ml Volumen in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei 33°C und 80% Luftfeuchte.The cultivation is carried out in 10 ml volume in a 100 mlErlenmeyer flask with harassment. It was kanamycin (25mg / l). The cultivation took place at 33 ° C and 80%Humidity.

Nach 72 Stunden wurde die OD bei einer Messwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) ermittelt. Die gebildete Lysinmenge wurde mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion bestimmt.After 72 hours, the OD became at a measuring wavelength of660 nm with the Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich). The amount of lysine formed was withan amino acid analyzer from Eppendorf-BioTronik(Hamburg, Germany) by ion exchange chromatographyand post-column derivatization with ninhydrin detectioncertainly.

In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt.Table 1 shows the result of the experiment.

Tabelle 1 Table 1

Kurze Beschreibung der Figuren:Brief description of the figures:

Fig. 1: Karte des Plasmids pEC-K18mob2Fig. 1: Map of the plasmid pEC-K18mob2

Fig. 2: Karte des Plasmids pEC-K18mob2gap2expFig. 2: Map of the plasmid pEC-K18mob2gap2exp

Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung:
Kan: Resistenzgen für Kanamycin
per: Gen zur Kontrolle der Kopienzahl aus pGA1
oriV: ColE1-ähnlicher Origin aus pMB1
rep: Plasmidkodierte Replikationsregion aus C. glutamicum Plasmid pGA1
RP4mob: RP4-Mobilisierungs-Site
gap2: gap2-Gen aus C. glutamicum
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyns EcoRI
HindIII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindIII
Ecl13II: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Ecl136II
XbaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms XbaIThe abbreviations and designations used have the following meaning:
Kan: resistance gene for kanamycin
by: gene for controlling the copy number from pGA1
oriV: ColE1-like origin from pMB1
rep: Plasmid-encoded replication region from C. glutamicum plasmid pGA1
RP4mob: RP4 Mobilization Site
gap2: gap2 gene from C. glutamicum
EcoRI: restriction enzyme EcoRI site
HindIII: restriction enzyme HindIII site
Ecl13II: Site of the restriction enzyme Ecl136II
XbaI: Restriction enzyme XbaI site

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LISTING

Claims (22)

Translated fromGerman

1. Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine für das gap2-Gen kodierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe

• a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
• b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
• c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b), und
• d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c),

wobei das Polypeptid bevorzugt die Aktivität der Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase 2 aufweist.An isolated polynucleotide of coryneform bacteria containing a polynucleotide sequence encoding the gap2 gene selected from the group

• a) polynucleotide that is at least 70% identical to a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO. 2 contains
• b) polynucleotide which codes for a polypeptide which contains an amino acid sequence which is at least 70% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO. 2,
• c) polynucleotide which is complementary to the polynucleotides of a) or b), and
• d) polynucleotide containing at least 15 consecutive nucleotides of the polynucleotide sequence of a), b) or c),

wherein the polypeptide preferably has the activity of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 2.2. Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid eine in coryneformen Bakterien replizierbare, bevorzugt rekombinante DNA ist.2. Polynucleotide according to claim 1, wherein the polynucleotidea replicable in coryneform bacteria, preferredrecombinant DNA.3. Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid eine RNA ist.3. Polynucleotide according to claim 1, wherein the polynucleotideis an RNA.4. Polynukleotid gemäß Anspruch 2, enthaltend die Nukleinsäuresequenz wie SEQ ID No. 1 dargestellt.4. Polynucleotide according to claim 2, containing theNucleic acid sequence as SEQ ID no. 1 shown.5. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 2, enthaltend

• a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder
• b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Kodes entspricht, oder
• c) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
• d) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i).

5. A replicatable DNA according to claim 2, comprising

• a) the nucleotide sequence shown in SEQ ID no. 1, or
• b) at least one sequence corresponding to the sequence (i) within the range of the degeneracy of the genetic code, or
• c) at least one sequence that hybridizes with the sequence complementary to sequence (i) or (ii), and optionally
• d) functionally neutral sense mutations in (i).

6. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierung von Sequenz (iii) unter einer Stringenz entsprechend höchstens 2x SSC durchgeführt wird.6. A replicable DNA according to claim 5, characterizedcharacterized in that the hybridization ofSequence (iii) corresponding to a stringencyat most 2x SSC is performed.7. Polynukleotidsequenz gemäß Anspruch 2, die für ein Polypeptid kodiert, das die in SEQ ID No. 2 dargestellte Aminosäuresequenz enthält.7. polynucleotide sequence according to claim 2, which is for aPolypeptide encoded that in SEQ ID. 2contains shown amino acid sequence.8. Coryneforme Bakterien, in denen das gap2-Gen verstärkt, insbesondere überexprimiert wird.8. Coryneform bacteria in which the gap2 gene amplifies,in particular overexpressed.9. Escherichia coli Stamm DH5αmcr/pEC-K18mob2gap2exp als DSM 14407 hinterlegt bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland.9. Escherichia coli strain DH5αmcr / pEC-K18mob2gap2exp asDSM 14407 deposited with the German collection forMicroorganisms and cell cultures, Braunschweig,Germany.10. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:

• a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen man zumindest das endogene gap2-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert;
• b) Anreicherung der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und
• c) Isolierung der L-Aminosäure.

10. A process for the fermentative production of L-amino acids, in particular L-lysine, characterized in that one carries out the following steps:

• a) fermentation of the desired L-amino acid-producing coryneform bacteria, in which at least the endogenous gap2 gene or nucleotide sequences encoding it are amplified, in particular overexpressed;
• b) accumulation of the L-amino acid in the medium or in the cells of the bacteria, and
• c) Isolation of the L-amino acid.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure verstärkt.11. The method according to claim 10, characterizedcharacterized in that you have bacteriaused, in which additional genes of theBiosynthesis path of the desiredL-amino acid amplified.12. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure verringern.12. The method according to claim 10, characterizedcharacterized in that you have bacteriain which the metabolic pathways at leastare partially switched off, which is the formation of thereduce the desired L-amino acid.13. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man einen mit einem Plasmidvektor transformierten Stamm einsetzt, und der Plasmidvektor die für das gap2-Gen kodierende Nukleotidsequenz trägt.13. The method according to claim 10, characterizedcharacterized in that one with aPlasmid vector transformed strain used, and thePlasmid vector coding for the gap2 geneCarries nucleotide sequence.14. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression des (der) Polynukleotides (e), das (die) für das gap2-Gen kodiert (kodieren) verstärkt, insbesondere überexprimiert.14. The method according to claim 10, characterizedcharacterized in that the expression of thethe polynucleotide (s) that bind to the gap2 genecoded (coded) amplified, in particularoverexpressed.15. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die katalytischen Eigenschaften des Polypetids (Enzymprotein) erhöht, für das das Polynukleotid gap2 kodiert.15. The method according to claim 10, characterizedcharacterized in that the catalyticProperties of the polypeptide (enzyme protein) increased, forthat encodes the polynucleotide gap2.16. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Aminosäuren coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• 1. 16.1 das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA,
• 2.  das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase kodierende Gen gap,
• 3. 16.3 das für die Triosephosphat-Isomerase kodierende Gen tpi,
• 4. 16.4 das für die 3-Phosphoglycerat-Kinase kodierende Gen pgk,
• 5. 16.5 das für die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodierende Gen zwf,
• 6. 16.6 das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende Gen pyc,
• 7. 16.7 das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodierende Gen mqo,
• 8. 16.8 das für eine feed back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC,
• 9. 16.9 das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE,
• 10. 16.10 das für die Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom,
• 11. 16.11 das für die Threonin-Dehydratase kodierende Gen ilvA oder das für eine feed back resistente Threonin-Dehydratase kodierende Allel ilvA (Fbr),
• 12. 16.12 das für die Acetohydroxysäure-Synthase kodierende Gen ilvBN,
• 13. 16.13 das für die Dihydroxysäuredehydratase kodierende Gen ilvD,
• 14. 16.14 das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1,

verstärkt bzw. überexprimiert.16. The method according to claim 10, characterized in that fermented for the production of L-amino acids coryneform microorganisms, in which one or more of the genes selected from the group

• 1. 16.1 the gene dapA coding for the dihydrodipicolinate synthase,
• 2. the gene gap coding for the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,
• 3. 16.3 the gene tpi coding for the triosephosphate isomerase,
• 4. 16.4 the gene pgk coding for the 3-phosphoglycerate kinase,
• 5. 16.5 the gene coding for the glucose-6-phosphate dehydrogenase zwf,
• 6. 16.6 the pyruvate carboxylase-encoding gene pyc,
• 7. 16.7 the malate-quinone oxidoreductase-encoding gene mqo,
• 8. 16.8 the lysC gene coding for a feedback-resistant aspartate kinase,
• 9. 16.9 the lysine export-encoding gene lysE,
• 10. 16.10 the homoserine dehydrogenase-encoding gene hom,
• 11. 16.11 the ilvA gene coding for the threonine dehydratase or the allele ilvA coding for a feed-back-resistant threonine dehydratase (Fbr),
• 12. 16.12 the gene ilvBN coding for the acetohydroxy acid synthase,
• 13. 16.13 the gene ilvD coding for the dihydroxy acid dehydratase,
• 14. 16.14 the Zwa1 protein coding gene zwa1,

strengthened or overexpressed.17. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Aminosäuren coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• 1. 17.1 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck,
• 2. 17.2 das für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodierende Gen pgi,
• 3. 17.3 das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB,
• 4. 17.4 das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2,

abschwächt.17. The method according to claim 10, characterized in that fermented to produce L-amino acids coryneform microorganisms, in which one or more of the genes selected from the group

• 1. 17.1 the gene coding for the phosphoenolpyruvate carboxykinase pck,
• 2. 17.2 the gene coding for the glucose-6-phosphate isomerase gene pgi,
• 3. 17.3 the gene poxB coding for the pyruvate oxidase,
• 4. 17.4 the Zwa2 protein encoding gene zwa2,

weakens.18. Coryneforme Bakterien, die einen Vektor enthalten, der ein Polynukleotid gemäß Anspruch 1 trägt.18. Coryneform bacteria containing a vector, thea polynucleotide according to claim 1 carries.19. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 10-17, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Art Corynebacterium glutamicum einsetzt.19. The method according to one or more of the claims10-17, characterized in thatone microorganisms of the species Corynebacterium glutamicumstarts.20. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man den Corynebacterium glutamicum Stamm DSM5715/pEC-K18mob2gap2exp einsetzt.20. The method according to claim 19, characterizedcharacterized in that theCorynebacterium glutamicum strainDSM5715 / pEC-K18mob2gap2exp.21. Verfahren zum Auffinden von RNA, cDNA und DNA, um Nukleinsäuren, beziehungsweise Polynukleotide oder Gene zu isolieren, die für die Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase 2 kodieren oder eine hohe Ähnlichkeit mit der Sequenz des gap2-Gens aufweisen dadurch gekennzeichnet, daß man das Polynukleotid, enthaltend die Polynukleotidsequenzen gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4 als Hybridisierungssonden einsetzt.21. Method for Finding RNA, cDNA and DNA toNucleic acids, or polynucleotides or genesisolate for the glyceraldehyde-3-phosphateDehydrogenase 2 encode or closely resemblehave the sequence of the gap2 gene therebycharacterized in that the polynucleotide,containing the polynucleotide sequences according to claim 1,2, 3 or 4 used as hybridization probes. 22. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man arrays, micro arrays oder DNA-chips einsetzt.22. The method according to claim 19, characterizedcharacterized in that arrays, microarrays or DNA chips.