Die Erfindung betrifft Verfahren zur Ermittlung von Primer-Sequenzen, insbesondere Verfahren zur Primer-Auswahl für eine vorgegebene DNA-Sequenz auf der Grundlage einer kontinuierlichen Bewertung charakteristischer Primer-Parameter, Vorrichtungen zur Durchführung der Verfahren und deren Anwendungen.The invention relates to methods for determining primerSequences, in particular methods for the selection of primers for agiven DNA sequence based on a continuousChen evaluation of characteristic primer parameters, Vorrichto carry out the processes and their applications.
Die Sequenzierung, d. h. die Ermittlung der Nukleotidabfolge in Nukleinsäure-Sequenzen, ist das fundamentale Verfahren zur Entschlüsselung des genetischen Codes. Neben der Aufklärung unbekannter Sequenzen dient die Sequenzierung u. a. dazu, individuelle Unterschiede in bekannten Sequenzen zu ermitteln. Zur Sequenzierung von langen DNA-Sequenzen ist es aus technischen Gründen erforderlich, die Sequenzen in handhabbare Unterabschnitte, die PCR-Fragmente, zu unterteilen. Diese Fragmente werden mittels Polymerase-Kettenreaktion mit hochspezifischen Oligonukleotiden, den sogenannten Primern, amplifiziert. Die Fragmente werden durch jeweils ein Primer-Paar begrenzt und bestimmt.Sequencing, i. H. the determination of the nucleotide sequencein nucleic acid sequences, is the fundamental process forDecoding the genetic code. In addition to the enlightenmentunknown sequences are used for sequencing and a. to indetermine individual differences in known sequences.For the sequencing of long DNA sequences it is technireasons necessary, the sequences in manageable UnSub-sections, the PCR fragments. This questionelements are created using a polymerase chain reaction with highly specifish oligonucleotides, the so-called primers, amplifyed. The fragments are each a pair of primersborders and determines.
Für die Eigenschaften eines PCR-Fragments spielt die Auswahl des entsprechenden Primer-Paares eine wesentliche Rolle, insbesondere der Abstand der beiden Primer auf der zu amplifizierenden Sequenz, aus dem sich die Fragmentlänge ergibt. Außerdem müssen multiple Bindungsorte eines oder beider Primer auf der Sequenz berücksichtigt werden, um mögliche Nebenprodukte auszuschließen. Um mögliche Sequenzierungsfehler an den Enden der Fragmente zu eliminieren, können benachbarte Fragmente mit einer Mindestüberlappung von z. B. 100 Basen generiert werden. Primer stellen hochspezifische Reagenzien dar. Ihre Qualität hängt von einer Vielzahl von Parametern ab. Diese Parameter sind teilweise voneinander abhängig: z. B. Länge, Schmelztemperatur, GC-Gehalt, 3'-Pentamerstabilität, Häufigkeit des 3'-Heptamers und Fähigkeit zur Dimer- oder Hairpinbildung.The selection plays a role in the properties of a PCR fragmentof the corresponding primer pair plays an essential role, insin particular the distance between the two primers on which to amplifyend sequence from which the fragment length results. exceptmultiple binding sites of one or both primers must indicate thisthe sequence should be taken into account for possible by-productsexcluded. For possible sequencing errors at the endsTo eliminate the fragments, neighboring fragments can be useda minimum overlap of e.g. B. 100 bases are generated.Primers are highly specific reagents. Their qualitydepends on a variety of parameters. These parametersare partly interdependent: z. B. length, melting temperature, GC content, 3'-pentamer stability, frequency of 3'-Heptamer and ability to form dimers or hairpins.
Es sind zahlreiche Computerprogramme bekannt, mit denen Primer in guter Qualität für einzelne PCR-Fragmente ausgewählt werden können: z. B. "Primer3" (S. Rozen et al. in "Methods Mol. Biol.", 2000, 132, 365-86) oder prime+ (GCG - Genetics Computer Group, (1998), Program Manual for the GCG Package, Version 10, 1998, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711). Diese Programme sind allerdings nicht für die effiziente Generierung überlappender PCR-Fragmente zur Sequenzierung sehr langer Genomabschnitte ausgelegt.Numerous computer programs are known with which primersselected in good quality for individual PCR fragmentscan: e.g. B. "Primer3" (S. Rozen et al. In "Methods Mol.Biol. ", 2000, 132, 365-86) or prime + (GCG - Genetics ComputerGroup, (1998), Program Manual for the GCG Package, Version 10,1998, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711). ThisHowever, programs are not for efficient generationoverlapping PCR fragments for sequencing very long Genom sections.
Bei dem von "Primer3" umgesetzten Verfahren wird eine Vielzahl von Teilabschnitten einer vorgegebenen Sequenz in Bezug auf eine Gruppe vorgegebener charakteristischer Primer-Parameter untersucht. Für jeden Parameter wird ein Wertebereich oder/und ein Optimalwert definiert, innerhalb dessen Teilabschnitte der DNA-Sequenz als Primer geeignet sind. Werte außerhalb des Bereichs/Optimalwerts werden mit einem Punktabzug bestraft. Die Auswahl einer größeren Anzahl von PCR-Primern ist wegen der diskontinuierlichen Bewertung, die einen zu strengen Filter darstellt, uneffektiv.The method implemented by "Primer3" uses a large numberof sections of a given sequence with respect toa group of predetermined characteristic primer parametersexamined. For each parameter there is a range of values or / anddefines an optimal value within which theDNA sequence are suitable as primers. Values outside the BeReichs / Optimalwert are punished with a point deduction. TheChoosing a larger number of PCR primers is because of thatdiscontinuous evaluation, which is too strict a filterrepresents ineffective.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein neues Verfahren zur Ermittlung von Primer-Sequenzen anzugeben, mit dem die oben erläuterten Nachteile der herkömmlichen Verfahren überwunden werden und das eine automatisierte Auswahl von PCR-Primern ermöglicht. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, Vorrichtungen zur Umsetzung der Verfahren und Anwendungen der Verfahren bereitzustellen.The object of the invention is to develop a new methodaveraging primer sequences with which the above heovercome the disadvantages of the conventional methodsan automated selection of PCR primersmade possible. The object of the invention is also devicesto implement the procedures and applications of the proceduresSemi note.
Diese Aufgaben werden mit Verfahren, Computerprogrammprodukten oder Vorrichtungen mit den Merkmalen gemäß den Patentansprüchen 1, 11 und 12 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.These tasks are performed using procedures, computer program productsor devices with the features according to the claims 1, 11 and 12 solved. Advantageous embodiments of theInvention result from the dependent claims.
Die Grundidee der Erfindung ist es, die DNA-Sequenz auf der Grundlage einer kontinuierlichen Bewertung sowie einer gewichteten Gesamtbewertung der Primer-Parameter mit besten Primer-Paaren abzudecken. Als Parameter können neben den gebräuchlichen (s. o.) auch jeder weitere Parameter einbezogen werden. Das erfindungsgemäße Verfahren optimiert die Primerqualität für die automatisierte Sequenzierung durch kontinuierliche Bewertung und Wichtung aller betrachteten Parameter.The basic idea of the invention is to show the DNA sequence on theBasis of a continuous evaluation as well as a weightedOverall evaluation of the primer parameters with the best primerTo cover couples. In addition to the usualChen (see above), each additional parameter can also be included.The method according to the invention optimizes the quality of the primerfor automated sequencing through continuous loadingevaluation and weighting of all considered parameters.
Die Erfindung besitzt den Vorteil, dass die Eignung eines Teilabschnitts als Primer objektiver bzw. realistischer bewertet wird als bei den herkömmlichen Techniken und dass die Analyse von langen DNA-Sequenzen in Form überlappender Sequenzabschnitte als Analyseeinheiten in rationeller Weise ermöglicht wird. Damit wird ein hoher Analysedurchsatz bei einer geringen Ausfallquote erzielt, woraus sich eine Einsparung an Material, Arbeit und Zeit ergibt.The invention has the advantage that the suitability of aSection as a primer objective or realistic valuethan with the conventional techniques and that the Analysis of long DNA sequences in the form of overlapping sequencescuts as analysis units in a rational waybecomes. This results in a high analysis throughput with a low oneFailure rate achieved, which results in a saving in material,Work and time results.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Computerprogramm zur Umsetzung des genannten Verfahrens.The invention also relates to a computer program forImplementation of the above procedure.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Vorrichtung zur Ermittlung von Primer-Sequenzen mit einer Einrichtung zur Erfassung einer Vielzahl von Teilabschnitten einer gegebenen Sequenz und zur Bewertung der charakteristischen Primer-Parameter, einer ersten Auswahleinrichtung, die dazu ausgelegt ist, als Primer-Sequenzen ungeeignete Teilabschnitte der Sequenz zu verwerfen, einer zweiten Auswahleinrichtung, die dazu ausgelegt ist, die Summe der gewichteten Einzelbewertungen der übrigen Teilabschnitte mit einem vorbestimmten Auswahlkriterium, z. B. einem Absolutschwellwert und/oder einer Maximalwertbildung, zu vergleichen, und einer dritten Auswahleinrichtung, die dazu ausgelegt ist, die besten Primer-Paare zu ermitteln. Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst auch Einrichtungen zur Speicherung, Ausgabe und/oder Anzeige der ermittelten Primer-Sequenzen und Primer-Paare.The invention also relates to a device for determiningDevelopment of primer sequences with a device for detectiona plurality of sections of a given sequence andto evaluate the characteristic primer parameters, onefirst selection device, which is designed as a primerDiscard unsuitable sections of the sequence,a second selection device, which is designed toSum of the weighted individual evaluations of the remaining partscuts with a predetermined selection criterion, e.g. B. oneAbsolute threshold and / or maximum value formation, versame, and a third selection device designed for this is to find the best primer pairs. The inventdevice according to the invention also includes devices for storagesave, output and / or display the determined primerSequences and primer pairs.
Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt vorteilhafterweise zahlreiche Anwendungen in der Biologie, Biotechnologie, Human- und Veterinärmedizin, Agrarwirtschaft, Ökologie sowie alle anderen Gebieten, in denen die Sequenzierung von Nukleinsäuren eine Rolle spielt.The method according to the invention advantageously hasnumerous applications in biology, biotechnology, humanand veterinary medicine, agriculture, ecology and alltheir areas where the sequencing of nucleic acidsmatters.
Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung des Verfahrensablaufes, der Erläuterung eines Beispiels und der beigefügten Zeichnung ersichtlich.Fig. 1 zeigt ein Beispiel für eine erfindungsgemäß verwendete kontinuierliche Übergangsfunktion zur Bewertung eines Primer-Parameters (x-Achse: Parameterwerte, y-Achse: Bewertung der Parameterwerte).Further advantages and details of the invention will become apparent from the following description of the process sequence, the explanation of an example and the accompanying drawing.Fig. 1 shows an example used in the invention continuous transition function for evaluating a primer parameter (x-axis: parameter values, y-axis: Evaluation of the parameter values).
Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass auf Basis einer beliebig langen, bekannten Sequenz (der Sequenz, die z. B. aus der EMBL (European Molecular Biology Laboratories)-Datenbank stammt) und anhand festgelegter Parameter PCR-Primer automatisch mit einer kontinuierlichen Bewertung der Parameter ausgewählt werden. Dazu wird die Sequenz zunächst über ihre gesamte Länge oder ein entsprechendes Teilstück für alle möglichen Teilabschnitte auf dieser Länge in Bezug auf die interessierenden Primer-Parameter charakterisiert. Die charakteristischen Parameter umfassen bestimmte Eigenschaften des Primers (z. B. Primerlänge, GC-Gehalt, Primer-Schmelztemperatur usw.) und Parameter, die festgelegte Kriterien charakterisieren (z. B. 3'-Pentamerstabilität, Häufigkeit des 3'-Heptamers oder das Vorkommen von repetitiven Sequenzen ("repeats")).According to the invention, it is in particular provided thatan arbitrarily long known sequence (the sequence thatz. B. from EMBL (European Molecular Biology Laboratories) -Database comes from) and based on defined parameters PCR primerautomatically with a continuous evaluation of the parametersto be selected. To do this, the sequence is first of allentire length or a corresponding section for everyone possiblesections on this length in relation to the intecharacterizing primer parameters. The characterRistic parameters include certain characteristics of the primers (e.g. primer length, GC content, primer melting temperatureetc.) and parameters that characterize the defined criteriaren (e.g. 3'-pentamer stability, frequency of the 3'-heptameror the occurrence of repetitive sequences ("repeats")).
In Abhängigkeit von anderen Faktoren, z. B. der Sequenziermethode, den verwendeten Reagenzien und der Länge des zu sequenzierenden DNA-Abschnitts werden die Fragmentlängen und der Mindestüberlappungsbereich der einzelnen Fragmente vorgegeben. Außerdem können Bereiche der zu sequenzierenden DNA "maskiert" werden, wenn aus diesen keine PCR-Primer ausgewählt werden sollen. Dies können Sequenzbereiche sein, die im Genom häufig vorkommen (sogenannte "repeats") oder bekannte Polymorphismen sowie andere für die Primer-Auswahl ungeeignete Orte (z. B. innerhalb eines Exons). Auf der Grundlage aller festgelegten Vorgaben werden die optimalen Primer ermittelt.Depending on other factors, e.g. B. the sequencermethod, the reagents used and the length of the sequencing DNA section are the fragment lengths and theMinimum overlap area of the individual fragments specified.In addition, areas of the DNA to be sequenced can be "masked"if no PCR primers are selected from themshould. These can be sequence regions that are common in the genomeoccur (so-called "repeats") or known polymorphismsas well as other unsuitable locations for the primer selection (e.g.within an exon). Based on all setThe optimal primers are determined.
In einem ersten Schritt wird die komplette Sequenz hinsichtlich der einbezogenen Parameter für alle potentiellen Primerpositionen und -längen untersucht. Es werden u. a. repeat-Regionen, bekannte Polymorphismen sowie weitere für die Primer-Auswahl ungeeignete Sequenzbereiche maskiert. Für alle vorgegebenen Primerlängen werden in einem zweiten Schritt die Werte der einbezogenen Parameter bestimmt (z. B. GC-Gehalt, Schmelztemperatur, 3'-Pentamerstabilität u. a.). Anschließend wird jedem Parameter auf der Grundlage einer parameterspezifischen kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Übergangsfunktion eine Bewertung zwischen 0 und 1 zugeordnet.In a first step, the complete sequence is consideredLich the parameters involved for all potential primerspositions and lengths examined. There will be a. including repeatRegions, known polymorphisms and others for the Priunsuitable sequence areas are masked. For allIn a second step, the specified primer lengths are theDetermines the values of the parameters involved (e.g. GC content,Melting temperature, 3'-pentamer stability u. a.). Subsequentlyeach parameter is based on a parameter specificcontinuous or discontinuous transitional radiotion assigned a rating between 0 and 1.
Die Übergangsfunktionen können erfindungsgemäß einen zwischen 0 und 1 kontinuierlichen Werteverlauf besitzen. "1" und "0" können auch als "beste Eignung" bzw. "keine Eignung" als Primer hinsichtlich der konkreten Eigenschaft beschrieben werden. Ein Beispiel hierfür ist inFig. 1 für den Primer-GC-Gehalt (Guanosin-Cytosin-Gehalt) illustriert. Für Werte oberhalb und unterhalb vorbestimmter oberer und unterer Grenzwerte A bzw. D erfolgt die Bewertung mit 0. Primer mit einem mit 0 bewerteten Parameter dürfen nicht ausgewählt werden. Innerhalb des durch die Grenzwerte A und D aufgespannten Intervalls sind zwei weitere Grenzwerte (B, C) vorgesehen. Im abgeschlossenen Intervall von B bis C erfolgt die Bewertung mit 1, d. h. der Parameter ist im Wertebereich von B bis C optimal geeignet. Das Optimum für einen jeden Parameter darf einen relativ großen Wertebereich umfassen. Das Optimum wird von Bereichen flankiert (Bereich zwischen A und B sowie zwischen C und D), in denen die Qualität des möglichen Primers für den betrachteten Parameter abfällt. In diesen Bereichen wird eine kontinuierliche Bewertung durch mindestens eine Übergangsfunktion gebildet. Dieser Abfall kann durch unterschiedlichste Funktionen, auch verschieden für unterschiedliche Parameter, charakterisiert werden.According to the invention, the transition functions can have a continuous value curve between 0 and 1. "1" and "0" can also be described as "best suitability" and "no suitability" as primers with regard to the specific property. An example of this is illustrated inFIG. 1 for the primer GC content (guanosine cytosine content). For values above and below predetermined upper and lower limit values A and D, the evaluation is made with 0. Primers with a parameter evaluated with 0 must not be selected. Two further limit values (B, C) are provided within the interval spanned by limit values A and D. In the closed interval from B to C, the rating is 1, ie the parameter in the value range from B to C is optimally suitable. The optimum for each parameter can encompass a relatively large range of values. The optimum is flanked by areas (area between A and B and between C and D) in which the quality of the possible primer for the parameter under consideration drops. In these areas, a continuous assessment is formed by at least one transition function. This drop can be characterized by different functions, also different for different parameters.
Zur mathematischen Beschreibung der Bewertung eines Parameters in diesen beiden Bereichen eignen sich u. a. lineare Funktionen und Winkelfunktionen, wie inFig. 1 dargestellt. Dadurch ist eine kontinuierliche Bewertung aller bzw. ausgewählter Parameter, die einen Primer charakterisieren, möglich. Im Gegensatz zu den bereits verfügbaren Verfahren zum Primer-Design erfolgt die Bewertung der Parameter nicht sprunghaft.Linear functions and angular functions, as shown inFIG. 1, are suitable for the mathematical description of the evaluation of a parameter in these two areas. This enables a continuous evaluation of all or selected parameters that characterize a primer. In contrast to the methods for primer design already available, the parameters are not evaluated in leaps and bounds.
Anhand der so gewonnenen Einzelbewertungen aller Parameter eines Primers wird eine Gesamtbewertung durchgeführt. Ist ein einbezogener Parameter eines Primers mit 0 bewertet worden, so wird dieser Primer von der Auswahl ausgeschlossen. Für alle übrigen möglichen Primer erfolgt die Gesamtbewertung durch Summation der Bewertungen aller einbezogenen Parameter, wobei auch eine Wichtung jedes einzelnen Parameters frei gewählt werden kann. Zur Bestimmung der am besten geeigneten Primer-Paare wird neben der Gesamtbewertung der beiden einzelnen Primer zusätzlich eine gewichtete kontinuierliche Bewertung der Fragmentlänge (die aus den Positionen von Vorwärts- und Rückwärtsprimer auf der Sequenz resultiert) und der beiden Primer-Schmelztemperaturen vorgenommen. Dazu erfolgt eine kontinuierliche Bewertung der Schmelztemperatur-Differenz zwischen Vorwärts- und Rückwärtsprimer.Based on the individual evaluations of all parameters obtained in this wayAn overall evaluation is carried out for the primer. Is aincluded parameters of a primer were rated 0, see abovethis primer is excluded from the selection. For allother possible primers, the overall evaluation is carried out bySummation of the evaluations of all parameters involved, wherebyweighting of each individual parameter can also be freely selectedcan be. To determine the most suitable primerIn addition to the overall rating of the two individual pria weighted continuous evaluation of the Fragment length (from the positions of forward and backwarddownward primer results on the sequence) and the two primersMelting temperatures made. This is done continuouslyevaluation of the melting temperature difference between preforward and reverse primer.
Das Primer-Paar mit der höchsten Summe der gewichteten Bewertungen wird ausgewählt. Ausgangspunkte zur Auswahl von Primer-Paaren können neben dem 5'-Ende der Sequenz auch kritische, z. B. maskierte Bereiche sein.The pair of primers with the highest sum of weighted judgesis selected. Starting points for the selection of primerIn addition to the 5 'end of the sequence, pairs can also be critical, e.g. B.masked areas.
Es sind Primer für die Sequenz mit der Accession Number "D26607" aus der EMBL-Datenbank ("http:/ / www.ebi.ac.uk/cgi-bin/emblfetch?D26607") zu ermitteln. Die Sequenz hat eine Länge von 23142 bp (Basenpaaren). Es sollen Primer für den Bereich zwischen dem Basenpaar 1 und 4000 exemplarisch ausgewählt werden. Die PCR-Fragmente sollen eine Länge von 1050 bp haben. Die Überlappung der Fragmente soll mindestens 100 bp betragen. Die Primer sollen eine Länge von 18 bis 27 Nukleotiden haben. Wenn keine Fragmente generiert werden können, deren Länge höchstens um 120 bp von der vorgegebenen Fragmentlänge abweicht, soll die vorgegebene Fragmentlänge um 350 bp erhöht bzw. verringert werden. Als charakteristische Parameter der Primer werden die folgenden einbezogen:
Primers for the sequence with the accession number "D26607" from the EMBL database ("http: / / www.ebi.ac.uk/cgi-bin/emblfetch?D26607") must be determined. The sequence is 23142 bp in length (base pairs). Primers for the range between base pair 1 and 4000 should be selected as examples. The PCR fragments are said to have a length of 1050 bp. The overlap of the fragments should be at least 100 bp. The primers should have a length of 18 to 27 nucleotides. If no fragments can be generated, the length of which deviates by a maximum of 120 bp from the predetermined fragment length, the predetermined fragment length should be increased or decreased by 350 bp. The following are included as characteristic parameters of the primers:
Die letzten drei Parameter können nur die Werte 0 oder 1 annehmen. Alle übrigen Parameter werden kontinuierlich bewertet. Primer, für die wenigstens ein Parameter mit 0 bewertet wurde, werden von den weiteren Berechnungen ausgeschlossen.The last three parameters can only have the values 0 or 1to take. All other parameters are evaluated continuously.Primers for which at least one parameter was rated 0,are excluded from further calculations.
Für die Bewertung der Parameterwerte zwischen den Punkten A und B sowie C und D werden zwei Funktionen ausgewählt (sieheFig. 1):
Two functions are selected for evaluating the parameter values between points A and B as well as C and D (seeFIG. 1):
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|---|---|---|---|
| DE10062566ADE10062566A1 (en) | 2000-12-15 | 2000-12-15 | Identifying optimal primers for amplification, useful e.g. in medicine, to generate many overlapping or adjacent fragments |
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| US6898531B2 (en) | 2001-09-05 | 2005-05-24 | Perlegen Sciences, Inc. | Algorithms for selection of primer pairs |
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| 8127 | New person/name/address of the applicant | Owner name:HUMMEL, OLIVER, 13189 BERLIN, DE | |
| 8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |