Oblast techniky
Tento vynález se týká použití benzotriazinoxidové sloučeniny k přípravě léčiva ke zvýšení cytotoxického účinku chemoterapeutického činidla při léčení rakovinových nádorů a kitu pro ošetřování nádorů savců.
Dosavadní stav techniky
Nejběžnější používané protirakovinové léčivé látky jsou cytotoxictější ve vztahu k normálně oxidovaným nádorovým buňkám než ve vztahu k hypoxickým nádorovým buňkám. Hypoxické buňky rezistentní k ozařování jsou také dostatečně dobře známé. Následkem toho nádorová hypoxie a výsledná rezistence se podílejí na účinku terapeutik pro ošetřování rakoviny.
Tuhé rakovinové nádory obsahují jak přiměřeně oxidovatelné buňky, tak nepřiměřeně oxidovatelné neboli hypoxické buňky v měnícím se poměru. Hypoxie se obvykle vyskytuje, pokud jsou nádorové buňky v co největší míře vzdáleny od krevních cév. Takové buňky mají také sklon mít pomalejší intenzitu proliferace. Třebaže tyto pochody nejsou zcela objasněny, rezistence hypoxických buněk k protirakovinovým léčivým látkám se obecně pokládá za důsledek nepřiměřené absorpce léčivé látky hypoxickými buňkami buď proto, že mají sklon k pomalému růstu, nebo pro jejich velkou vzdálenost od krevních cév přinášející léčivou látku. Tak relativní poměr hypoxických buněk v nádoru může mít velkou důležitost pro výsledky ošetřování. Rezistentní hypoxické buňky, které přižijí ozařování nebo ošetření léčivými látkami, se mohou stát reoxidovatelnými, což obnovuje citlivost nádoru k dalšímu léčení. Přesto místo spoléhání na neurčité okolnosti je žádoucí vyvinout ošetřování rakoviny, při které rakovinové nádorové buňky včetně hypoxických nádorových buněk budou usmrcovány nebo se stanou neaktivnímu v době, kdy se dá spoléhat na prováděné léčení.
V patentu US 5 175 287 se popisuje použití 1,2,4-benzotriazinoxidů ve spojení s ozařováním pro léčení rakovinových nádorů. Tyto 1,2,4-benzotriazinoxidy zvyšují citlivost nádorových buněk na ozařování a způsobují, že jsou přístupnější pro tento způsob léčení.
Holden a kol. v publikaci “Enhancement of Alkylating Agent Activity by SR-4233 in the FSalIC Murine Fibrosarcoma“, JNCI84,187-193 (1992), popisuje použití SR-4233, známého také jako tirapazamin, v kombinaci s protinádorově působícím alkylačním prostředkem. Čtyři protinádorově působící alkylační prostředky, cis-platina, cyklofosfamid, karmustin a melfalan, byly testovány na schopnost tirapazaminu překonat rezistenci hypoxických nádorových buněk k protinádorově působícím alkylačním prostředkům. Tirapazamin byl testován samotný a v kombinaci s měnícím se množstvím každého z protinádorově působících alkylačních prostředků, pokud se tirapazamin podává těsně před jedinou dávkou s cyklofosfamidem, karmustinem nebo melfalanem ve výrazné dávce, na nádorových buňkách se pozoruje zvýšení citlivosti vedoucí k synergických cytotoxickým účinkům. Jestliže se podává tiparazamin právě před jedinou dávkou cisplatiny k ošetření, zvýšená dávka vede k aditivnímu účinku, s výjimkou nej vyšší dávky cisplatiny.
Hypoxické cytotoxické prostředky na bázi nitroimidazolu se kombinovaly s různými protinádorovými léčivými látkami, přičemž bylo nalezeno, že terapeutického zesílení účinku se může dosáhnout, pokud se tyto prostředky kombinují s různými protirakovinovými léčivými látkami, zvláště s alkylačními prostředky, cyklofosfamidem, melfalanem a nitromočovinami, BCNU a CCNU. Avšak u těchto čtyř posledně jmenovaných látek bylo nalezeno, že produkovaný terapeutický zesilující účinek není důsledkem selektivního ničení hypoxických buněk nitroimidazoly, ale ukazuje se, že existuje mechanizmus vyvolávající potenciaci alkylačního prostředku
-1 CZ 289742 B6 indukovanou DNA příčnými vazbami metabolity nitroimidazolů (Murray a kol., Br. J. Cancer 47, 195-203 (1983)).
Podstata vynálezu
Vynález se týká použití benzotriazinoxidové sloučeniny obecného vzorce I:
Ο» (I) io ve kterém:
X znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku substituovanou hydroxyskupinou, aminoskupinou, skupinou vzorce NHR nebo NRR, alkoxyskupinou obsahující 1 až 4 atomy uhlíku nebo atomem halogenu, dále 15 znamená atom halogenu, hydroxyskupinu, alkoxyskupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, aminoskupinu, skupinu vzorce HNR nebo NRR, kde každý ze substituentů R je nezávisle zvolen ze skupiny zahrnující nižší alkylové skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, nižší acylové skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, nižší 20 alkylové skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku a nižší acylové skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku substituované hydroxyskupinou, aminoskupinou, sekundární aminoskupinou obsahující alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, terciální aminoskupinou obsahující dvě alkylové skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupinou obsahující 1 až 4 atomy uhlíku nebo atomem halogenu, a pokud X znamená NRR, oba substituenty R mohou být dohromady vázány přímo nebo přes kyslíkový můstek za vzniku morfolinového, pyrrolidinového nebo piperidinového kruhu, n znamená 0 nebo číslo 1 a
Y1 a Y2 znamenají nezávisle na sobě buď atom vodíku, nitroskupinu, atom halogenu, alkylovou skupinu obsahující 1 až 14 atomů uhlíku, včetně cyklického, acyklického a nenasyceného alkylového zbytku, který je popřípadě substituován 1 nebo 2 substituenty zvolenými ze souboru zahrnujícího atomy halogenů, hydroxyskupiny, epoxyskupiny, alkoxyskupiny obsahující 1 až 35 4 atomy uhlíku, alkylthioskupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, primární aminoskupiny, sekundární aminoskupiny obsahující alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, terciální aminoskupiny obsahující dvě alkylové skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, nebo terciální aminoskupiny obsahující dvě alkylové skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, kde obě alkylové skupiny jsou vázány dohromady za vzniku morfolinového, pyrrolidinového nebo piperidinového 40 kruhu, acyloxyskupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, acylamidoskupiny obsahující 1 až atomy uhlíku a jejich thioanalogů, acetylaminoalkylové skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, karboxyskupiny, alkoxykarbonylové skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxylové části, karbamoylové skupiny, alkylkarbamoylové skupiny obsahující 1 až 4 atomy
-2CZ 289742 B6 uhlíku v alkylové části, alkylsulfonylové skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku nebo alkylfosfonylové skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, kde alkylový zbytek je popřípadě přerušen jedinou etherovou vazbou (—O—) nebo
Y1 a Y2 znamenají nezávisle na sobě buď morfolinoskupinu, pyrrolidinoskupinu, piperidinoskupinu, aminoskupinu, skupinu vzorce NHR', NR'R', O(CO)R', NH(CO)R', O(SO)R' nebo O(POR')R', kde R' znamená alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, která může být substituována hydroxyskupinou, aminoskupinou, sekundární aminoskupinou obsahující alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, terciální aminoskupinou obsahující dvě alkylové skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, morfolinoskupinou, parrolidinoskupinou, piperidinoskupinou, alkoxyskupinou obsahující 1 až 4 atomy uhlíku nebo atomem halogenu, nebo farmakologicky přijatelné soli této sloučeniny, k přípravě léčiva ke zvýšení cytotoxického účinku chemoterapeutického činidla při léčení nádorových onemocnění.
Ve výhodném provedení podle vynálezu je použitou benzotriazinoxidovou sloučeninou sloučenina obecného vzorce I, ve kterém:
X znamená atom vodíku, primární aminoskupinu (NH2), nesubstituovanou rozvětvenou nebo přímou alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku nebo substituovanou rozvětvenou nebo přímou alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, n znamená číslo 1 a
Y1 a Y2 představují nezávisle na sobě atom vodíku, nitroskupinu, karboxyskupinu, alkoxykarbonylovou skupinu nebo alkylsulfonylovou skupinu.
Konkrétně jsou použité benzitriazinoxidové sloučeniny obecného vzorce I vybrané ze souboru zahrnujícího:
1,2,4-benzotriazin-l ,4-dioxid,
3-amino-l ,2,4-benzotriazin-l ,4-dioxid,
3—ethyl—1,2,4-benzotriazin-l ,4-dioxid,
3-propyl-l ,2,4-benzotriazin-l ,4-dioxid a 3-( l-hydroxyethyl)-l ,2,4-benzotriazin-l ,4-dioxid.
Nejvýhodněji je použitou benzotriazinoxidovou sloučeninou obecného vzorce I 3-amino-l,2,4benzotriazin-1,4-dioxid.
Podle předmětného vynálezu je výhodné použití, při kterém je chemoterapeutickým prostředkem DNA alkylační chemoterapeutický prostředek, přičemž nejvýhodněji je tímto DNA alkylačním chemoterapeutickým prostředkem cis-latina.
Podle dalšího výhodného provedení je při tomto použití uvedeným chemoterapeutickým činidlem chemoterapeutické činidlo na bázi přírodního produktu, nejvýhodněji je tímto chemoterapeutickým činidlem na bázi přírodního produktu vinca alkaloid.
Do rozsahu předmětného vynálezu náleží rovněž kit pro ošetřování nádorů savců, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje chemoterapeutický prostředek a benzotriazinoxidovou sloučeninu, která je v množství zvyšujícím cytotoxicitu, výše uvedeného obecného vzorce I nebo farmakologicky přijatelné soli této sloučeniny.
-3CZ 289742 B6
Ve výhodném provedení tohoto kitu pro ošetřování nádorů savců se jako sloučenina, která je přítomna v množství zvyšujícím cytotoxicitu, použita benzotriazinoxidová sloučenina výše uvedeného obecného vzorce I, ve kterém:
X znamená atom vodíku, primární aminoskupinu (NH2), nesubstituovanou rozvětvenou nebo přímou alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku nebo substituovanou rozvětvenou nebo přímou alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, n znamená číslo 1 a
Y1 a Y2 představují nezávisle na sobě atom vodíku, nitroskupinu, karboxyskupinu, alkoxykarbonylovou skupinu nebo alkylsulfonylovou skupinu.
Výhodný je podle vynálezu kit pro ošetřování nádorů savců, ve kterém použitou benzotriazinoxidovou sloučeninou je sloučenina vybraná ze souboru zahrnujícího:
1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid,
3-amino-l ,2,4-benzotriazin-l ,4-dioxid,
3-ethy 1-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid,
3-propyl-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid a 3-( 1 -hydroxyethyl)-l ,2,4-benzotriazin-l ,4-dioxid.
Nejvýhodněji je použitou benzotriazinoxidovou sloučeninou v uvedeném kitu 3-amino-l,2,4benzotriazin-1,4-dioxid.
Při provádění léčení se savci potřebujícímu léčení rakovinového nádoru podává uvedená sloučenina obecného vzorce (I) nebo farmakologicky přijatelná sůl této sloučeniny v účinném množství a po přibližně po 30 minutách až zhruba 24 hodinách po podání sloučeniny obecného vzorce I definované výše, se podává účinné množství chemoterapeutického prostředku, ke kterému je nádor citlivý.
Podle předmětného vynálezu se dosahuje zvýšení cytotoxicity chemoterapeutického prostředku vůči tuhým nádorům, které jsou citlivé k ošetření tímto chemoterapeutickým prostředkem a spočívá vtom, že se sloučenina obecného vzorce I vymezené výše, v množství zvyšujícím cytotoxicitu, podává savci majícímu takový nádor, přibližně 30 minut až zhruba 24 hodin před podáním tohoto chemoterapeutického prostředku nebo od přibližně jedné hodiny do zhruba 2 hodin po podání tohoto chemoterapeutického prostředku.
Podle jiného postupu se léčení rakovinových nádorů u savců provádí tak, že se savci podává sloučenina obecného vzorce I jednu až 2 hodiny po podání chemoterapeutického prostředku.
Podle vynálezu bylo nalezeno, že podáním sloučeniny obecného vzorce I definované výše, buď před, nebo po podání chemoterapeutického prostředku překvapivě a neočekávaně usmrcuje nádorové buňky v mnohem větším rozsahu než v případě podání buď tohoto prostředku samotného, nebo v případě podání tohoto prostředku a sloučeniny ve stejné době. Například pokud se podá tirapazamin až 24 hodiny před podáním cis-latiny, bylo shledáno, že se desetkrát až tisícinásobně zvýší u nádorových buněk usmrcení nad množství nádorových buněk usmrcených, pokud se tirapazamin a cis-platina podají současně. Největší synergický účinek s touto kombinací prostředků byl zjištěn v případě, kdy se tirapazamin podává přibližně 2,5 hodiny před podáním cis-platiny.
Použití uvedené benzotriazinoxidové sloučeniny podle vynálezu představuje mimořádné zvýšení protinádorové účinnosti chemoterapeutického prostředku (to znamená jeho cytotoxických účinků na nádorové buňky). Kromě toho při testech systemické účinnosti cis-platiny (sérum BUN
-4CZ 289742 B6 (močovinový dusík v krvi) a akutní toxicita) kombinace s optimálním oddělením ve vztahu k nádorové účinnosti projevuje menší zvýšení systemické toxicity nebo nevede k žádnému zvýšení takové toxicity, v porovnání se samotnou cis-platinou. Tímto způsobem většina, pokud ne všechny, dodatečně usmrcené buňky z nádorových buněk přináší terapeutické zesílení v této kombinaci. Synergická interakce mezi tirapazanem a cis-platinou je také signifikantní, protože velké zvýšení usmrcených nádorových buněk se dosahuje při relativně nízké dávce cis-platiny.
Podle předmětného vynálezu se tedy použije sloučenina obecného vzorce I, definovaná výše, nebo její farmakologicky přijatelná sůl, které jsou schopny uplatnit účinek zvyšující cytotoxicitu na rakovinový nádor, k výrobě léčiva pro terapeutické podávání savci, který má takový nádor, od přibližně 30 minut do zhruba 24 hodin před ošetřením uvedeného nádoru chemoterapeutickým prostředkem.
Tento vynález je zvlášť popsán v souvislosti s dále uvedenými výhodnými provedeními v další části popisu, která ale žádným způsobem neomezují rozsah předmětného vynálezu.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 ukazuje graf odpovídajících klonogenních buněk na nádor, přítomných v experimentálních nádorech RIF-1, v závislosti na čase (od -3 do +2 hodin), vzhledem k podání tirapazaminu a/nebo cis-platiny.
Obr. 2 ukazuje graf odpovídajících klonogenních buněk na nádor, přítomných v experimentálních nádorech RIF-1, v závislosti na čase (od -24 do 0 hodin), vzhledem k podání tirapazaminu a/nebo cis-platiny.
Při ošetřování rakovinového nádoru savců včetně rakovinového nádoru lidí, zvláště tuhých nádorů, se výraz citlivost nádoru na chemoterapeutický prostředek vztahuje k chemoterapeutickému prostředku, který je schopen vyvolat terapeutický účinek na nádor libovolným mechanizmem, jako usmrcením nádorových buněk, snížením buněčné proliferace nebo snížením velikosti nádoru. Termín účinné množství sloučeniny obecného vzorce I, která byla výše definována, se vztahuje k množství schopnému usmrtit nádorové buňky nebo schopnému usmrtit nádorové buňky ve spojení s chemoterapeutickým prostředkem. Účinné množství chemoterapeutického prostředku se vztahuje k množství chemoterapeutického prostředku, které je schopno usmrtit rakovinové buňky nebo jinak způsobit terapeutický účinek, jako snížením velikosti nádoru nebo zpomalením růstu buněk a proliferace.
Při postupu zvyšování cytotoxicity chemoterapeutického prostředku vůči tuhému nádoru citlivému na ošetření chemoterapeutickým prostředkem, se termín množství zvyšující cytotoxicitu vztahuje k množství sloučeniny obecného vzorce I, která je definována výše, které je schopno zvýšit cytotoxické účinky chemoterapeutického prostředku na buňky. Výhodně množství zvyšující cytotoxicitu dostačuje k vytvoření synergického účinku, to znamená, že je větší než součet účinků chemoterapeutického prostředku a sloučeniny obecného vzorce I, pokud se podávají současně. Množství sloučeniny obecného vzorce I zvyšující cytotoxicitu se může stanovit testováním takových sloučenin s chemoterapeutickým prostředkem nebo chemoterapeutickými prostředky in vivo a/nebo in vitro na experimentálních modelech nádorů, které jsou zde uvedeny, nebo na libovolných jiných modelech nádorů, které jsou známy v tomto oboru. Množství zvyšující cytotoxicitu stanovené na experimentálních modelech nádorů in vivo a/nebo in vitro se potom používá jako vodítko pro stanovení množství obou prostředků, které se bude podávat savci pro léčení nádoru.
Aniž by bylo úmyslem předkládat nějaká teoretická zdůvodnění nebo způsob dosahování účinku podle vynálezu, v současné době existuje domněnka, že kombinace benzotriazinového chemoterapeutického prostředku obecného vzorce I, který je definován výše, a který je specificky
-5CZ 289742 B6 cytotoxický pro hypoxické rakovinové buňky, a chemoterapeutického prostředku, který má největší aktivitu na normálně oxidovatelné rakovinové buňky, poskytuje zvýšené nebo synergické usmrcování nádorových buněk. Benzotriazinoxidy obecného vzorce I, které jsou zde definovány, specificky vyžadují nižší než normální koncentrace kyslíku k tomu, aby se projevil jejich účinek. Tento požadavek na hypoxii je hlavní výhodou, protože poskytuje základ pro zvláštní interakci mezi oběma léčivými látkami. V obecně normálních tkáních jsou koncentrace kyslíku okolo 1330 až 1995 Pa. Při tomto a vyšším parciálním tlaku kyslíku, cytotoxicita produkovaná tirapazaminem je velmi nízká. Naproti tomu řada nádorů má signifikantní počet buněk při koncentraci pod 1330 Pa, přičemž při tomto parciálním tlaku se metabolizmus tirapazaminu ajiných benzotriazinů obecného vzorce I na cytotoxické druhy velmi zvyšuje. Pokud se zde používá výraz hypoxické nádorové buňky, potom se tento termín vztahuje na nádorové buňky při parciálním tlaku kyslíku menším než přibližně 1330 Pa.
Všechny druhy použití podle předmětného vynálezu jsou vhodné pro ošetřování rakovinových nádorů savců včetně rakovinových nádorů člověka, zvláště tuhých nádorů, které mají hypoxické oblasti. Mezi příklady takovýchto nádorů je možno zahrnout následující druhy nádorů, které ale žádným způsobem neomezují rozsah použitelnosti vynálezu: adenokarcinomy, glioblastomy (a jiné mozkové nádory), nádory prsu, cervikální, kolorektální, endometriální, žaludeční, jatemí, plicní (malé buňky a větší buňky) nádory, lymfomy (včetně ne-Hodgkinových, Burttových, difúsních velkých buněk, folikulámích a difusních Hodgkinových buněk), melanom (metastatický), neuroblastom, osteogenní sarkom, nádor dělohy, retinoblastom, sarkomy měkkých tkání, testikulámí a jiné nádory, které reagují na chemoterapii. Použití a kit podle vynálezu jsou tedy zaměřeny na ošetřování rakovinových nádorů včetně experimentálně vyvolaných rakovinových nádorů, při libovolném typu nádorů včetně nádorů člověka, obecně používaných laboratorních zvířat, jako krys, myší, králíků a psů, primátů, jako opic, a koní, koček ajiných zvířat.
Použití a kit podle vynálezu je možno aplikovat s libovolným typem chemoterapeutického prostředku. Ve zvláštním provedení podle tohoto vynálezu se chemoterapeutický prostředek vybere podle takových charakteristik, jako je například typ rakovinového nádoru, přičemž zahrnuje také účinnost chemoterapeutického prostředku při ošetřování rakovinového nádoru. Chemoterapeutický prostředek se může vybrat ze skupiny zahrnující alkylační prostředky, antimetabolity, přírodní látky, hormony, antagonisty a jiné typy sloučenin.
Jako příklad alkylačních prostředků je možno uvést dusíkaté yperity (to znamená 2-chlorethylaminy), jako je například chlormethin, chlorambucil, melfalan, uramustin, mannomustin, extramustin, fosfát, mechlorthaminoxid, cyklofosfamid, ifosamid a trifosfamid, alkylační prostředky obsahující substituovanou aziridinovou skupinu, jako je například tretamin, thiotepa, triazichon amitomycin, alkylační prostředky alkylsulfonátového typu, jako je například busulfan a piposulfan, alkylační N-alkyl-N-nitrosomočovinové deriváty, jako je například karmustin, lomustin, semustin nebo streptozotocin, alkylační prostředky mitobronitolového, dakarbazinového a prokarbazinového typu a komplexy platiny, jako je například cis-platina a karboplatina.
Jako příklad antimetabolitů je možno uvést deriváty kyseliny listové, jako je například methotrexát, aminopterin a 3'-dichlormethotrexát, pyrimidinové deriváty, jako je například 5-fluoruracil, floxuridin, tegafúr, cytarabin, idoxuridin a flucytosin, purinové deriváty, jako je například merkaptopurin, thioguanin, azathioprin, tiamiprin, vidarabin, pentostatin a puromycin.
Jako příklad přírodních látek je možno uvést alkaloidy z rostlin druhu vinca, jako je například vinblastin a vinkristin, epipodofylotoxiny, jako je například etoposid a teniposid, antibiotika, jako je například adrimycin, daunomycin, dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, mithramycin, bleomycin a mitomycin, enzymy, jako je například L-asparagináza, modifikátory způsobující biologickou odezvu, jako je například α-interferon, kamptothecin, taxol a retinoidy, jako je například kyselina retinová.
-6CZ 289742 B6
Mezi příklady hormonů a antagonistů je možno zařadit adrenokortikoidy, jako je například prednison, progestiny, jako je například hydroxyprogesteronacetát, medroxyprogesteronacetát a megestrolacetát, estrogeny, jako je například diethylstilbestrol a ethinylestradiol, antiestrogeny, jako je například tamoxifen, androgeny, jako je například testosteronpropionát a fluxymestron, antiandrogeny, jako je například flutamid a gonadotropin uvolňující hormonové analogy, jako je například leuprolid.
Jako příklad smíšených prostředků je možno uvést anthracendiony, jako je například mitoxantron, substituované močoviny, jako jsou například hydroxymočoviny a adrenokortikoidní látky snižující tlak, jako je například mitotan a aminoglutethimid.
Kromě toho chemoterapeutickým prostředkem mohou být imunosupresivní léčivé látky, jako je například cyklosporin, azathioprin, sulfasalazin, methozsalen a thalidomid.
Chemoterapeutickými prostředky, které jsou vhodné pro použití v souvislosti s předmětným vynálezem, jsou prostředky běžně obchodně dostupné nebo se jedná o prostředky, které je možno vyrobit běžně známými postupy v tomto oboru. Chemoterapeutický prostředek se může používat samotný nebo v kombinaci s jedním nebo větším počtem jiných chemoterapeutických prostředků. K léčení rakovinového nádoru se může používat například kombinace tří rozdílných chemoterapeutických prostředků a jedné nebo většího počtu sloučenin obecného vzorce I, které jsou definovány v tomto popisu, přičemž aplikaci je možno provádět metodami zde popsanými.
Ve výše uvedené sloučenině obecného vzorce I, obecně může X znamenat atom vodíku, nesubstituovaný uhlovodíkový zbytek s 1 až 4 atomy uhlíku s rozvětveným nebo přímým řetězcem, jako je například methylová skupina, ethylová skupina, sek.-butylová skupina a isopropylová skupina, atom halogenu, hydroxyskupinu, alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, jako je methoxyskupina, ethoxyskupina, propoxyskupina a terc.butoxyskupiny, primární aminoskupin (NH2), sekundární aminoskupina (NHR), kde R značí alkylovou nebo acylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, jako je například methylaminoskupina a ethylaminoskupina, terciární aminioskupinu (NRR), kde každá ze skupin R znamená alkylovou nebo acylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, například diethylaminoskupinu a podobně, nebo dvě skupiny R jsou spojeny ve formě morfolinového, pyrrolidinového nebo piperidinového kruhu, přičemž v případě různých alkylových a acylových skupin R mohou tyto skupiny být dále substituovány hydroxyskupinou, aminoskupinou, sekundární nižší alkylaminoskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku a terciární dialkylaminoskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku v každé alkylové části, morfolinoskupinou, pyrrolidinoskupinou, piperidinoskupinou, alkoxyskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku nebo atomem halogenu (atomem fluoru, chloru, bromu nebo jodu).
Uhlovodíkové skupiny X mohou být dále substituovány hydroxyskupinou, aminoskupinou, sekundární alkylaminoskupinou, terciární dialkylaminoskupinou, alkoxyskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku nebo atomem halogenu (atomem fluoru, chloru, bromu nebo jodu).
Výhodněji X znamená atom vodíku, primární aminoskupinu (NH2), nesubstituovanou uhlovodíkovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo substituovanou uhlovodíkovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku s přímým nebo rozvětveným řetězcem.
V obecném vzorci I dále n značí 0 nebo 1, výhodně 1, Y1 a Y2 znamenají nezávisle na sobě atom vodíku, nitroskupinu, atom halogenu (například atom fluoru, chloru, bromu nebo jodu) nebo uhlovodíkovou skupinu s 1 až 14 atomy uhlíku, přičemž pokud jde o uhlovodíkové skupiny Y1nebo Y2, mohou být nasycené nebo nenasycené, cyklické nebo acyklické a mohou být popřípadě přerušené jedinou etherovou vazbou, takže nesubstituovanými uhlovodíkovými skupinami Y1nebo Y2 mohou být například methylová skupina, ethylová skupina, n-propylová skupina, sek-butylová skupina, n-hexylová skupina, 2-methyl-n-pentylová skupina, 2-ethoxyethylová skupina, 3-(n-propoxy)-n-propylová skupina, 4-methoxybutylová skupina, cyklohexylová
-7CZ 289742 B6 skupina, tetrahydrofurfurylová skupina, furfurylová skupina, cyklohexenylová skupina, 3-(ndecyloxy)-n-propylová skupina, 4-methyloktylová skupina a 4,7-dimethyloktylová skupina.
Uhlovodíkové skupiny Y1 nebo Y2 mohou být popřípadě substituovány 1 nebo 2 substituenty, zvolenými ze skupiny zahrnující atomy halogenu, jako je například fluor, chlor, brom nebo jod, hydroxyskupiny, epoxyskupiny, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, jako je například methoxyskupina, n-propoxyskupina a terc.-butoxyskupina, alkylthioskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, aminoskupiny, primární alkylaminoskupiny (NH2), morfolinoskupiny, pyrrolidinoskupiny, piperidinoskupiny, sekundární alkylaminoskupiny (NHR'), kde R' znamená alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, jako je methylaminoskupina, propylaminoskupina a podobně, terciární aminoskupiny (NR'R'), acyloxyskupiny a acylamidoskupiny, které jsou představovány vzorci R'COO- a R'CONH- a jejich thiolových analogů, které jsou představovány vzorci R'CSO- a R'CSNH-, karboxyskupiny [-C(O)OH], alyklkarbonylové skupiny [-C-(O)OR'], karbamoylové skupiny [-C(O)NH2], alkylkarbamoylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části [-C(O)NHR'J, alkylsulfonylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku (R'SO2-) a lakylfosfonylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku [R'P(OR')O-J.
Kromě toho Y1 a Y2 mohou být nezávisle na sobě skupiny vzorce -NH2, -NHR', -NR'R', -OCOR', -NH(CO)R', -O(SO)R' nebo -O(POR')R', ve kterých různé skupiny R' znamenají nižší alkylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, které samy mohou být substituovány hydroxyskupinou, aminoskupinou, sekundární alkylaminoskupinou, terciární dialkylaminoskupinou, pyrrolidinoskupinou, piperidinoskupinou, alkoxyskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku nebo atomem halogenu.
Výhodněji Y1 a Y2 znamenají nezávisle na sobě atom vodíku, nitroskupinu, karboxyskupinu, alkoxykarbonylovou nebo alkylsulfonylovou skupinu.
Zvláště výhodně sloučeniny obecného vzorce I, vhodné k použití podle tohoto vynálezu jsou:
l,2,4-benzotriazin-l,4-dioxid (sloučenina obecného vzorce I, ve kterém X znamená atom vodíku, Y1 a Y2 znamenají vždy atom vodíku a n značí 1),
3-amino-l,2,4-benzotriazin-l,4~dioxid (to znamená tirapazamin, ve kterém X znamená aminoskupinu, Y1 a Y2 znamenají vždy atom vodíku a n značí 1),
3-ethyl-l,2,4-benzotriazin-l,4-dioxid (sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém X znamená ethylovou skupinu, Y1 a Y2 znamenají vždy atom vodíku a n značí 1),
3-propyl-l,2,4-benzotriazin-l,4-dioxid (sloučenina obecného vzorce I, ve kterém X znamená propylovou skupinu, Y1 a Y2 znamenají vždy atom vodíku a n značí 1), a 3-(l-hydroxyethyl)-l,2,4-benzotriazin-l,4-dioxid (sloučenina obecného vzorce I, ve kterém X znamená hydroxyethylovou skupinu, Y1 a Y2 znamenají vždy atom vodíku a n značí 1), zvláště 3-amino-l ,2,4-benzotriazin-l ,4-dioxid.
Jako příklad farmaceuticky přijatelných solí sloučenin obecného vzorce I, definovaném výše, je možno uvést soli získané s použitím anorganických kyselin, jako je kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková nebo kyselina fosforečná, a organických kyselin, jako je kyselina octová, kyselina pyrohroznová, kyselina jantarová, kyselina mandlová a kyselina p-toluensulfonová, jakož i soli vzniklé z anorganických bází, jako je hydroxid sodný, hydroxid draselný nebo hydroxid vápenatý nebo z organických bází, jako je kofein, ethylamin nebo lysin.
Sloučeniny obecného vzorce I, které byly definovány výše, se mohou podávat pacientovi orálně nebo parentálně (intravenózně, subkutánně, intramuskulámě, intraspinálně, intraperitoneálně
-8CZ 289742 B6 nebo podobným způsobem). Pokud se podávání provádí parenterálně, sloučeniny se obvykle zpracovávají do jednotkové dávkové formy pro injekce (roztok, suspenzi nebo emulzi) s farmaceuticky přijatelnou pomocnou látkou (vehikulem). Vhodné pomocné látky jsou běžně látky netoxické a neterapeuticky účinné. Jako příklad takovýchto pomocných látek je možno uvést vodu, vodné pomocné prostředky, jako je fyziologický roztok, Ringerův roztok, roztok dextrózy a Hankův roztok, a dále nevodné pomocné prostředky, jako jsou netuhnoucí oleje (jako kukuřičný, z bavlníkových semen, podzemnicový a sezamový olej), ethyloleját a isopropylmyristát. Sterilní fyziologický roztok je výhodnou pomocnou látkou. Pomocná látka může obsahovat malá množství přísad, jako jsou látky zvyšující rozpustnost, isotonicitu a chemickou stabilitu, například antioxidační přípravky, pufry a konzervační prostředky, pro orální (nebo rektální) podání se sloučeniny budou obvykle zpracovávat na formu dávkové jednotky, jako je tableta, kapsle, čípek nebo kašeta. Takové prostředky obvykle obsahují tuhé, polotuhé nebo kapalné nosné látky nebo ředidla. Jako příklad ředidel a pomocných látek je možno uvést laktózu, dextrózu, sacharózu, sorbitol, mannitol, škroby, arabskou gumu, fosforečnan vápenatý, minerální oleje, kakaové máslo, theobromový olej, algináty, tragant, želatinu, methylcelulózu, polyoxyethylen, sorbitan monolaurát, methylhydroxybenzoát, propylhydroxybenzoát, mastek a stearát hořečnatý.
Chemoterapeutický prostředek se podává savci obvyklými cestami, které jsou vhodné pro zvláštní chemoterapeutický prostředek. Chemoterapeutický prostředek a sloučenina obecného vzorce I, která byla definována výše, se mohou podávat stejnou cestou nebo různými cestami, v závislosti na specifické použité sloučenině obecného vzorce I, definované výše, a chemoterapeutickém prostředku. Sloučenina obecného vzorce I, která byla definována výše, se může podávat savci jako taková samotná nebo v kombinaci s jednou nebo větším počtem jiných sloučenin obecného vzorce I.
Výše definovaná sloučenina obecného vzorce I se podává savci v množstvích, která jsou účinná pro usmrcení nebo vyvolání cytotoxických účinků na hypoxických nádorových buňkách. Množství podané sloučeniny bude záviset na takových okolnostech, jako je typ rakovinového nádoru, věk a zdravotní stav pacienta, maximální a/nebo lethální dávka chemoterapeutického prostředku a sloučeniny obecného vzorce I a intrakce sloučeniny obecného vzorce I s chemoterapeutickým prostředkem. Ve výhodném provedení podle tohoto vynálezu, se tirapazamin podává v množstvích od přibližně 10 do zhruba 450 mg/m2, výhodněji od přibližně 20 do zhruba 350mg/m2a nejvýhodněji od přibližně 30 do zhruba 250 mg/m2. Pokud se sloučenina obecného vzorce I podává savci v rozdělených dávkách, nižší dávkové rozmezí může být výhodné v závislosti na maximálně tolerovatelné dávce sloučeniny obecného vzorce I a interakci této sloučeniny s chemoterapeutickým prostředkem.
Chemoterapeutický prostředek se podává savci v množstvích, která jsou účinná pro léčení citlivých nádorů. Taková množství jsou v tomto oboru dobře známa a je možno je zjistit pro dané látky v literatuře opatřené u dodavatele chemoterapeutického prostředku nebo ve vědecké literatuře. Ve výhodném provedení podle tohoto vynálezu, chemoterapeutický prostředek a sloučenina obecného vzorce I vykazují synergickou interakci na nádor, přičemž je možné podávat chemoterapeutický prostředek v dávkách, které jsou nižší než dávky nalezené jako účinné, pokud se chemoterapeutický prostředek podává samotný. Takové nižší dávky mohou být žádoucí, pokud chemoterapeutický prostředek způsobuje těžké vedlejší účinky u savce, kterému se podává. Pokud se chemoterapeutický prostředek má podávat savci v rozdělených dávkách, potom se dostatečná množství sloučeniny obecného vzorce I podávají savci tak, aby se dosáhlo synergického účinku kombinace obou těchto prostředků, buď před počáteční dávkou chemoterapeutického prostředku, nebo před každou jednotlivou dávkou chemoterapeutického prostředku. Výše uvedený postup ošetřování je možno rovněž používat v souvislosti s jinými typy ošetřování rakoviny, jako s radiační terapií a chirurgickým odstraněním nádoru.
Sloučenina obecného vzorce I se výhodně podává savci přibližně 30 minut až zhruba 24 hodiny před podáním chemoterapeutického prostředku. Podle jiného provedení se sloučenina obecného vzorce I může podávat savci od přibližně 1 do zhruba 2 hodin po podání chemoterapeutického
-9CZ 289742 B6 prostředku. Pro některé kombinace chemoterapeutického prostředku a sloučeniny obecného vzorce I může být vhodné podávat sloučeninu obecného vzorce I více než 24 hodin před podáním chemoterapeutického prostředku, přičemž se stále udrží výhody vyplývající z použití tohoto vynálezu. Časový rozdíl skýtající nejvýhodnější zvýšení toxicity pro buňky se může určit testováním kombinace sloučeniny obecného vzorce I a chemoterapeutického prostředku in vivo a/nebo in vitro na experimentálních modelech nádorů, jako například typy, které byly uvedeny, nebo na libovolných jiných modelech nádorů. Stanovený časový rozdíl na takových modelech se potom použije jako vodítko pro léčení nádorů u savců, s úpravou během léčení, pokud je to zapotřebí. Podle předmětného vynálezu bylo zjištěno, že pro kombinaci tirapazaminu a cis-platiny byla největší interakce mezi oběma prostředky pozorována v případech, kdy se tirapazamin podává od přibližně 1 do zhruba 18 hodin, výhodně od 1 do 3 hodin a nejvýhodněji od 2 do 3 hodin před podáním cis-platiny, s největším nárůstem usmrcení buněk, k němuž dochází, pokud se tirapazamin podává přibližně od 2 hodin do zhruba 30 minut před podáním cis platiny. Pokud se tirapazamin podá v době od 1 do 2 hodin po podání cis-platiny, pozoruje se zvýšený cytotoxický účinek, avšak zvýšení není veliké. V případě určitých sloučenin obecného vzorce I může být žádoucí podávat tyto sloučeniny ve stejné době jako chemoterapeutický prostředek.
Rozsah předmětného vynálezu rovněž zahrnuje, jak již bylo uvedeno, kit pro ošetřování nádorů savců, který obsahuje alespoň jeden chemoterapeutický prostředek a nejméně jednu sloučeninu obecného vzorce I, definovanou výše. Sloučenina obecného vzorce I je výhodně přítomna v tomto kitu v množství nebo dávce, které zvyšují cytotoxicitu. Vhodné dávkové formy výše definované sloučeniny obecného vzorce I jsou v tomto popisu uvedeny. Zvláštní dávková forma chemoterapeutického prostředku a sloučeniny obecného vzorce I bude určena typem rakovinového nádoru určeného k léčení, výhodnou cestou podání a typem chemoterapeutického prostředku. Chemoterapeutický prostředek a výše definovaná sloučenina obecného vzorce I se výhodně dodávají v oddělených dávkováních, aby se usnadnilo podávání chemoterapeutického prostředku a sloučeniny obecného vzorce I v rozdílené době podle metod aplikace podle tohoto vynálezu.
Sloučeniny obecného vzorce I, vhodné k použití podle tohoto vynálezu, se mohou vyrobit způsoby popsanými v US 5 175 287. Obecné způsoby pro výrobu určitých 3-aminoderivátů je možno najít v US 3 980 779, jehož autorem je Ley a kol.
Tyto sloučeniny je možno připravit z výchozích benzofuroxanu vzorce:
„O reakcí s kyanamidovou solí a následujícím okyselením reakční směsi. Výchozí látka, benzofuroxan, není symetrická s ohledem na vlastní polohy 5 a 6 (které jsou polohami 6 a 7 výsledného 3-aminiobenzotriazinoxidu). Proto výsledkem reakce může být směs 6-substituované a Ίsubstituované látky. Pokud je to žádoucí, může se tato směs rozdělit za použití obvyklých způsobů na jednotlivé složky, které mají substituent buď v poloze 6, nebo v poloze 7.
Dioxid je možno rovněž vyrobit ze základního monooxidu nebo 1,2,4-benzotriazolu oxidací peroxykyselinou (viz Robbins a kol., J. Chem. Soc., 3 186 (1957) a Mason a kol., J. Chem. Soc.
B, 911 (1970)).
Kromě toho je možno monooxid vyrobit následujícími postupy:
-10CZ 289742 B6 (1) cyklizací l-nitro-2-aminobenzenové sloučeniny za použití dihydrochloridu kyanamidu vzorce H2NCN.2HC1, (2) oxidací základní sloučeniny obecného vzorce
NH2 nebo řízenou redukcí odpovídajícího dioxidu (viz Mason, citováno výše a Wolf a kol., J. Am. Chem. Soc., 76, 355 (1954)).
1,2,4-Benzotriaziny je možno vyrobit cyklizací prekurzoru formazanu, za použití fluoridu boritého a kyseliny octové (BF3/AcOH, viz schéma I a Atallah a Nažer, Tetrahedron 38, 1793 (1982)).
3-Amino-l,2,4-benzotriaziny je možno připravit buď cyklizací základní sloučeniny (viz schéma Π aArndt, Chem. Ber. 3 522 (1913)), nebo redukcí monooxidu nebo dioxidu jak je popsáno výše.
3-Hydroxy-l,2,4-benzotriazindioxidy se mohou vyrobit za použití peroxidu a wolframanu sodného (viz schéma III). Syntetický způsob pro výrobu monooxidu je založen na použití peroxidu vodíku nebo koncentrované kyseliny sírové a dusitanu sodného (viz schéma IV).
-11CZ 289742 B6
Schéma I
Schéma II
Schéma III
Schéma IV
-12CZ 289742 B6
1,2,4-Benzotriazinoxidy nesubstituované v poloze 3 (někdy se zde označují jako „3-desaminosloučeniny“) se mohou vyrobit způsobem, který zahrnuje zpracování 1,2,4-benzotriazinoxidu obecného vzorce I, ve kterém X znamená aminoskupinu, s nižším alkylnitritem za podmínek pro redukční deaminaci. Výrazem „podmínky pro redukční deaminaci“ se míní reakční podmínky, které poskytnou alespoň 10 %, výhodně alespoň zhruba 50 %, požadovaného 3-nesubstituovaného reakčního produktu. Výhodný nižší alkylnitrit používaný při tomto způsobu je terc.-butylnitrit. Příklady podmínek pro redukční deaminaci zahrnují reakci ve výhodném rozpouštědle, například dimethylformamidu (DMF), za teploty alespoň přibližně 60 °C, obvykle za teploty v rozmezí od 60 do 65 °C. tato reakce je ilustrována obecně na schématu V.
Schéma V
I-BuNOi \
DMF7
60-65 °C
Příklady provedení vynálezu
Způsoby podle tohoto vynálezu jsou doloženy příklady, které žádným způsobem neomezují jeho rozsah. Příklady 1 až 18 se týkají syntézy sloučenin obecného vzorce I, jak jsou zde vymezeny. Příklad 19 se týká testů tirapazaminu a cis-platiny, prováděných in vitro a in vivo.
Příklad 1
Způsob výroby 3-hydroxy-l,2,4-benzotriazin-l,4-dioxidu
Míchaná směs 1,50 g (9,25 mmol) 3-amino-l,2,4-benzotriazin-l-oxidu, 100,0 ml kyseliny a 30,0 ml 30 % peroxidu vodíku se zpracuje s 3,05 g (9,25 mmol) dihydrátu wolframanu
-13CZ 289742 B6 sodného. Směs se míchá na olejové lázni za teploty 60 °C po dobu 4 dnů. Oranžová směs s odstínem do žlutá se ochladí na teplotu přibližně 30 °C a filtruje k odstranění světle žluté tuhé látky, která neabsorbuje ultrafialové záření. Oranžový roztok peroxidu vodíku v kyselině octové se odpaří na polotuhou látku a pečlivě promyje při několikanásobném přidání vody a kyseliny octové, k odstranění peroxidu. Odpařený roztok se nechá stát za teploty místnosti, aby se dostaly čtyři podíly oranžové tuhé látky o hmotnosti 0,87 g. Výtěžek odpovídá 42 % teorie, sodné soli požadované konečné sloučeniny.
UV: lambdamax (20 % vodný methanol): 262,2 (ε = 39 460), 477 (ε = 7 030).
IČ (čistý): 3 530 m, 3 150 m, 2 650 m, 2 180 m a 1 635 m.
Analýzy pro C7H4N3O3Na . 1,25 H2O (233,64): vypočteno: 37,6 % C, 2,93 % H, 18,79 % N, nalezeno: 37,8 % C, 2,75 % Η, 18,65 % N.
O
Příklad 2
Způsob výroby 3-amino-7-trifluormethyl-l,2,4-benzotriazin-I-oxidu
O
Směs 2,70 g (12,9 mmol) 4-chlor-3-nitrobenzotrifluoridu (Aldrich) a 2,75 g (24 mmol) dihydrochloridu kyanaminu (předem vyrobeného zpracováním etherového roztoku kyanamidu s plynným chlorovodíkem a zachycením vysrážené tuhé látky) se zahřívá na teplotu 140 °C po dobu 1 hodiny. Reakční produkt se zpracuje se 45 ml 2N roztoku hydroxidu sodného,, zahřívá dalších 5 minut a poté nechá vychladnout. Sraženina se zachytí, promyje vodou, vysuší a trituruje směsí acetonu a toluenu. Získá se 1,32 g požadované konečné sloučeniny, jako světle žluté tuhé látky, která má teplotu tání 301 až 302 °C. Výtěžek odpovídá 45 % teorie.
TLC = Rf 0,60 (směs methylenchloridu a methanolu v poměru 9:1, silikagelové desky). MS: m/z (relativní intenzita): 230 (100, M’).
-14CZ 289742 B6
Příklad 3
Způsob výroby 3-amino-7-decyl-l,2,4-benzotriazinu
O
Způsob výroby 4-(l-decyl}-2-nitroamlinu
400 ml acetanhydridu se vnese během doby 30 minut do míchaného roztoku 80 g (0,34 mol)
4-decylanilinu (Aldrich) v 2,4 litrech hexanů. Vše se míchá po dobu 1 hodiny, směs se ochladí a zpracuje s 34 ml 70 % kyseliny dusičné během 30 minut za teploty 5 až 10 °C. V míchání se pokračuje za teploty 5 až 10 °C po dobu 1 hodiny a za teploty 25 °C po dobu 16 hodin. Směs se zředí 1 litrem vody, míchá po dobu 5 hodin, vylije na otevřenou misku a nechá stát po dobu 16 hodin. Po dalším zředění 1,5 litru vody se tuhé látky zachytí a rekrystalují z 85 % vodného ethanolu. Dostane se 92 g meziproduktu, jako oranžové tuhé látky, která má teplotu tání 64 °C. Výtěžek odpovídá 84 % teorie.
100 ml roztoku 19 g (0,288 mol) 85% hydroxidu draselného ve vodě se uvede do styku se suspenzí 89 g (0,28 mol) 4-(l-decyl)-2-nitroanilinu, vyrobeného výše, v 900 ml methanolu. Směs se míchá po dobu 6 hodin, neutralizuje na hodnotu pH 7 až 8 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou a odpaří za sníženého tlaku takřka dosucha. Po zředění 400 ml vody, se tuhé látky zachytí a vysušením na vzduchu se dostane 77 g meziproduktu jako oranžové tuhé látky, která má teplotu tání 59 °C. Výtěžek odpovídá 100 % teorie.
1,0 g (8,7 mmol) dihydrochloridu kyanamidu (předtím připraveného k použití zpracováním etherového roztoku kyanamidu s plynným chlorovodíkem a zachycením vysrážené tuhé látky) se přidá po částech během 10 minut k předehřáté tavenině (o teplotě 190 °C) 500 mg (1,8 mmol) 4-(l-decyl)-2-nitroanilinu, vyrobeného v předcházejícím stupni. Reakční směs se zahřívá na teploty 190 °C po dobu 5 minut, ochladí na teplotu 25 °C, zpracuje s 10 ml 6N roztoku hydroxidu draselného a zahřívá na teplotu 90 až 95 °C po dobu 1 hodiny. Po ochlazení na teplotu 25 °C se tuhá látka zachytí, promyje vodou a ethanolem a vysuší na vzduchu. Dostane se 0,25 g požadované konečné sloučeniny, jako světle žluté tuhé látky, která má teplotu tání 177 °C (za rozkladu). Výtěžek odpovídá 46 % teorie.
MS: m/z (relativní intenzita): 285 (100, M+), 302 (13).
-15CZ 289742 B6
Příklad 4
Způsob výroby 3-amino-7-karbamoyl-l,2,4-benzotriazin-l-oxidu
O
Způsob výroby 4-chlor-3-nitrobenzamidu
20,2 g (0,1 mol) kyseliny 4-chlor-3-nitrobenzoové (Aldrich) a 20 ml thionylchloridu se uvedou do vzájemného styku, nechají stát po dobu 16 hodin a vaří pod zpětným chladičem po dobu 4 hodin. Dostane se čirý roztok, který se odpaří za sníženého tlaku a azeotropicky zpracuje s benzenem. Odparek se rozpustí ve 20 ml acetonitrilu a během 30 minut se přidá 100 ml koncentrovaného roztoku hydroxidu amonného, který je ochlazen na teplotu -10 °C. Po 3 hodinách za teploty -10 °C a 16 hodinách za teploty 25 °C se směs vylije na otevřenou misku a nechá odpařit dosucha. Odparek se suspenduje ve vodě, tuhá látka se zachytí a vysuší na vzduchu. Dostane se 19,8 g meziproduktu jako světle žluté tuhé látky, která má teplotu tání 153 °C. Výtěžek odpovídá 98 % teorie.
Roztok 3,45 g (0,15 mol) sodíku v 75 ml ethanolu se přidá k roztoku 15,8 g (0,165 mol) hydrochloridu guanidinu v 75 ml ethanolu. Po 1 hodině se směs filtruje a filtrát se spojí se suspenzí 10 g (0,05 mol) 4-chlor-3-nitrobenzamidu, vyrobeného výše, v 50 ml ethanolu. Směs se vaří pod zpětným chladičem za míchání po dobu 16 hodin, ochladí na teplotu 0 až -5 °C a okyselí 8 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Zachycená tuhá látka se uvede do styku s 28 g (0,2 mol) uhličitanu draselného ve 40 ml vody a směs se zahřívá na teplotu 100 °C po dobu 8 hodin za míchání. Po ochlazení na teplotu 25 °C se tuhá látka zachytí, promyje vodou a vysuší na vzduchu. Tuhá látka se suspenduje ve vroucím ethylacetátu, zachytí a promyje horkým ethylacetátem. Získaná tuhá látka se opakovaně suspenduje ve vroucím dioxanu a šestkrát se jímá objem vždy 100 ml. Spojené filtráty se odpaří za sníženého tlaku na tuhou látku. Odparek se suspenduje v 95 % ethanolu, zachytí a vysuší na vzduchu. Dostane se 0,44 g požadované konečné sloučeniny jako světle žluté látky, která má teplotu tání 300 °C. Výtěžek odpovídá 4,3 % teorie.
TLC: Rf = 0,23 (směs methylenchloridu a acetonu v poměru 2:1, silikagelové desky). MS: m/z (relativní intenzita): 205 (100, M+).
-16CZ 289742 B6
Příklad 5
Způsob výroby oximu 7-acetyl-3-amino-l,2,4-benzotriazin-l-oxidu
OH h3c
N
Kombinovaná směs 50 mg (0,25 mmol) 7-acetyl-3-amino-l,2,4-benzotriazin-l-oxidu, 200 mg (2,88 mmol) hydrochloridu hydroxylaminu, 1 ml pyridinu a 1 ml ethanolu se zahřívá na teplotu 90 až 95 °C po dobu 1 hodiny a potom se ochladí na teplotu 25 °C. Směs se zředí 5 ml 95 % ethanolu a tuhá látka se zachytí a vysuší na vzduchu. Dostane se 30 mg požadované konečné sloučeniny jako světle žluté tuhé látky, která má teplotu tání 278 °C (za rozkladu). Výtěžek odpovídá 56 % teorie.
TLC: Rf = 0,60 (směs methylenchloridu a methanolu v poměru 9:1).
MS: m/z (relativní intenzita): 219 (100, M+).
Příklad 6
Způsob výroby 3-amino-6(7)-decyl-l,2,4-benzotriazin-l,4-dioxidu
O
Způsob výroby 5-(l-decyl)benzofuroxanu
Kombinovaná směs 77 g (0,28 mol) 4-(l-decyl)-2-nitroanilinu, 476 g (0,34 mol) 5,25 % vodného roztoku chlornanu sodného, 20,3 g (0,31 mol) 85 % vodného roztoku hydroxidu draselného, 4,7 g (0,014 mol) nBu4NHSO4 a 2,28 litrů methylenchloridu se rychle míchá po dobu 6 hodin, poté se zředí 500 ml vody a 1 litrem methylenchloridu. oddělená organická fáze se postupně promyje 1 litrem IN kyseliny chlorovodíkové a dvakrát vždy 1 litrem vodného roztoku chloridu sodného, vysuší síranem sodným a odpaří za sníženého tlaku. Získá se 70 g červeného oleje. Výtěžek činí 92 % teorie.
Roztok 10 g (0,036 mol) 5-(l-decyl)benzofuroxanu, který byl vyroben výše, a 0,36 g (0,0016 mol) benzyltriethylamoniumchloridu ve 180 ml dimethylsulfoxidu se zpracuje postupně během několika hodin s 13,0 g (0,31 mol) kyanamidu a 36,8 g (0,27 mol) uhličitanu draselného.
-17CZ 289742 B6
Směs se míchá po dobu 48 hodin a potom filtruje. Filtrát se zředí 6 litry vody a 40 ml ledové kyseliny octové a čtyřikrát extrahuje vždy 500 ml methylenchloridu. Spojený organický roztok se postupně promyje jednou 500 ml 5 % roztoku hydrogenuhličitanu sodného, dvakrát vždy 500 ml vodného roztoku chloridu sodného, vysuší síranem sodným a odpaří za sníženého tlaku dosucha. Surová látka se čistí chromatografií na silikagelu za použití směsi methylenchloridu a methanolu v poměru 98 : 2. Dostane se 1,8 g konečné sloučeniny jako červené tuhé látky, která má teplotu tání 155 °C (za rozkladu). Výtěžek odpovídá 16 % teorie.
MS: m/z (relativní intenzita): 318 (4, M+), 285 (100).
Příklad 7
Způsob výroby 1,2,4-benzotriazinoxidu
O (8) 1,2,4-benzotriazin (9) 1,2,4-benzotriazin-l ,4-dioxid
Směs 1,80 g (13,73 mmol) výchozí sloučeniny, 9 ml 90 % peroxidu vodíku, 13,5 ml anhydridu kyseliny trifluoroctové a 12,50 g (38 mmol) dihydrátu wolframanu sodného ve 170 ml chloroformu se míchá za teploty místnosti po dobu 5 dnů. Reakční směs se zředí 100 ml vody a extrahuje 100 ml chloroformu. Organická vrstva se promyje 50 ml vody, vysuší síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku. Odparek se chromatografuje na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a methylenchloridu v poměru 1 : 1 jako elučního činidla. Dostane se 0,30 g sloučeniny vzorce 9 jako žluté tuhé látky, která má teplotu tání 204 až 205 °C. Výtěžek odpovídá 13,4 % teorie.
Analýza pro C7H5N3O2 (163,13):
vypočteno: 51,5 % C, 3,09 % H, 25,76 % N, nalezeno: 51,6 % C, 3,36 % H, 26,01 % N.
MS: m/z (relativní intenzita): 163 (100, M+), 147 (50).
TLC: Rf = 0,27 (směs ethylacetátu a methylenchloridu v poměru 1 : 1, silikagelové desky). IČ (nujol): 1600 μ, 1460 μ, 1300 μ.
UV: lambdamax (H2O): 227 (ε = 22 900), 252 (ε = 12 950), 392 (ε = 4080).
-18CZ 289742 B6
Příklad 8
Způsob výroby 7-chlor-3-hydroxy-l,2,4-benzotriazin-l,4-dioxidu
H2O2
(10)
7-chlor-3-amino-l,2,4-benzotriazin-l-oxid
(11)
7-chlor-3-hydroxy-l,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid (12)
7-chlor-3-amino-l,2,4-benzotriaz in-1,4-dioxid
Směs 1,50 g (7,63 mmol) sloučeniny vzorce 10 ve 100 ml kyseliny octové se zpracuje s 2,52 g (7,63 mmol) dihydrátu wolframanu sodného a 30 ml 30 % peroxidu vodíku. Směs se zahřívá na teplotu 50°C za míchání po dobu 6 dnů a potom se pomalu odpaří dosucha, k odstranění peroxidu vodíku. Odparek se vaří ve 250 ml vody a poté filtruje, aby se odstranilo přibližně 25 mg výchozí sloučeniny vzorce 10. Vodný roztok se potom dvakrát extrahuje vždy 250 ml ethylacetátu. Tmavě červená krystalická látka, která je charakterizována jako sloučenina vzorce 12 podle chromatografie na tenké vrstvě (TLC) a hmotnostního spektra, vzniklá v směsi popsané výše a zachycuje se filtrací. Dostane se 60,0 mg oranžové tuhé látky s odstínem do žlutá, která je charakterizována jako sloučenina vzorce 12, co ukazuje dobrá rozpustnost ve směsi horkého isopropylalkoholu a vody. Výtěžek odpovídá 3,7 % teorie.
Hmotnostní spektrum: M4- = 212 (q = 100) (sloučenina vzorce 10).
TLC: Rf = 0,34 (aceton, silikagelové desky).
Ethylacetátový roztok uvedený svrchu, oddělený od vodné vrstvy po odfiltrování sloučeniny vzorce 12, se odpaří dosucha. Odparek se potom zpracuje s isopropylalkoholem za teploty místnosti. Dostane se tmavě oranžová tuhá látka, kterou je 0,41 g sloučeniny vzorce 11. Výtěžek odpovídá 25 % teorie.
-19CZ 289742 B6
Hmotnostní spektrum (MS): M* = 213 (q = 70).
TLC: Rf = 0,22 (aceton, silikagelové desky).
Sloučenina vzorce 11 je charakteristizována jako amoniová sůl, C7H4CIN3O3NH3 (molekulová 5 hmotnost 230,61) takto:
Vodná kyselina vzorce 11 se rozpustí v koncentrovaném roztoku hydroxidu amonného, poté prudce ochladí ledem a filtruje, k odstranění stop nerozpustné látky vzorce 12. Červený filtrát a promývací kapalina se odpaří dosucha, a tím poskytnout oranžově zbarvenou tuhou látku 10 s odstínem do červena. Odparek se zpracuje s 50 ml vroucího 1,2-dimethyletheru. Tuhá látka se suší oxidem fosforečným za teploty 56 °C a tlaku 133 Pa. Dostane se 0,244 g sloučeniny vzorce 13. Výtěžek odpovídá 87 % teorie.
Analýza pro C7H4CIN3O3NH3 (230,61): vypočteno: 36,5 % C, 3,06 % H, 24,30 % N, nalezeno: 36,5 % C, 3,07 % H, 23,94 % N.
UV: lambdainM (H20): 219 (ε = 12 580), 265,4 (ε = 40 000), 4830486 (ε = 6640).
-20CZ 289742 B6
Příklad 9
Způsob výroby 7-nitro-3-amino-l,2,4-benzotriazin-l,4-dioxidu
O
Způsob výroby 7-nitro-3-trifluoracetamido-l,2,4-benzotriazin-l-oxidu vzorce 15
Roztok 4,00 g (19,3 mmol) 7-nitro-3-amino-l,2,4-benzotriazin-l-oxidu vzorce 14 (Parish Chemical Co.), 125 ml chloroformu a 12,0 ml (85,0 mmol) anhydridu kyseliny trifluoroctové se míchá za teploty místnosti po dobu 44 hodin. Výsledná světle žlutá tuhá látka se odfiltruje, promyje 50 ml chloroformu a vysuší. Dostane se 5,35 g připravované sloučeniny jako žluté tuhé látky. Výtěžek odpovídá 91 % teorie.
Analýza pro C9H4F3N5O4: vypočteno: 35,7 % C, 1,33 % H, 23,10 % N, nalezeno: 35,7 % C, 1,23 % H, 23,06 % N.
-21 CZ 289742 B6
Způsob výroby 7-nitro-3-amino-l,2,4--benzotriazin-l,4-oxidu vzorce 16
K míchanému roztoku 2,50 g (8,25 mmol) 7-nitro-3-trifluoracetamido-l,2,4-benzotriazin-loxidu vzorce 15, vyrobenému výše, v 200 ml chloroformu se přidá 90 mg (0,273 mmol) dihydrá5 tu wolframanu sodného a poté 10 ml 70 % peroxidu vodíku. Po 15 minutách se roztok zpracuje s 8,0 ml (56,7 mmol) anhydridu kyseliny trifluoroctové a v míchání se pokračuje po dobu 64 hodin. Reakční směs se chromatografuje (ethylacetát, 20 % methanol v acetonu a nakonec 20 % dimethylformamid v acetonu), poté rekrystaluje z acetonu a dostane se 1,20 g sloučeniny vzorce 16 jako oranžové tuhé látky, která má teplotu tání 286 až 288 °C (za rozkladu). Výtěžek 10 odpovídá 65 % teorie.
UV: lambdamax 259,300, 345, 387, 472.
Analýza pro C7H5N5O4:
vypočteno: 37,70 % C, 2,26 % H, 31,39 % N, nalezeno: 3 7,70 % C, 2,13 % H, 30,94 % N.
Příklad 10
Způsob výroby 3-(3-N,N-diethylaminopropylamino)-l ,2,4-benzotriazin-l ,4-dioxidu
-22CZ 289742 B6
Způsob výroby 3-(3-N,N-diethylaminopropylamino)-l,2,4-benzotriazin-l,4-dioxidu vzorce 18
Roztok 3,0 g (16,5 mmol) 3-chlor-l,2,4-benzotriazin-l-oxidu vzorce 17 (vyrobeného způsobem, kteiý popsal Sasse a kol. v US 4 289 771) ve 100 ml methylenchloridu se zpracuje s 9,5 ml (88,3 mmol) Ν,Ν-diethylpropylendiaminu se zpracuje s 9,5 ml (88,3 mmol) N,N-diethylpropylendiaminu. Reakční směs se nechá stát za teploty místnosti po dobu 20 hodin, poté se zředí 50 ml 1,2-dichlorethanu a nato promyje postupně roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodou. Žlutý roztok se vysuší síranem sodným, filtruje a odpaří za sníženého tlaku. Dostane se 3,93 g požadované sloučeniny ve formě žluté tuhé látky. Výtěžek odpovídá 87 % teorie. Rekrystalizací ze směsi etheru a petroletheru se dostane čistá sloučenina, která má teplotu tání 47 až 48 °C.
Analýza pro C14H21N5O (sloučenina vzorce 18): vypočteno: 61,10 % C, 7,69 % H, 25,44 % N, nalezeno: 61,30 % C, 7,80 %H, 25,61 % N.
K míchané roztoku 1,60 g (6,10 mmol) 3-(3-N,N-diethylaminopropylamino)-l,2,4-benzotriazin-l-oxidu vzorce 18, vyrobenému jak je uvedeno výše, v 50 ml chloroformu se přidá 22,0 ml anhydridů kyseliny trifluoroctové. Po 15 minutách se směs ochladí na teplotu -10 °C, přidá se kní 10 ml 70 % peroxidu vodíku a vše se potom míchá za teploty místnosti po dobu 20 dnů. Reakční smě se vysuší síranem sodným, filtruje a odpaří dosucha. odparek se rozpustí v 50 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a třikrát extrahuje vždy 150 ml methylenchloridu. Organická vrstva se vysuší síranem sodným, filtruje a odpaří. Dostane se 0,51 g sloučeniny vzorce 18a jako červené tuhé látky, která má teplotu tání 92 až 94 °C. Výtěžek odpovídá 29 % teorie.
NMR (400 Mhz, CDC13): δ 1,11 (6H, t, J = 7,1 Hz, CH3), 1,84-1,90 (2H, m, H-2'), 2,48-2,64 (4H, m, NCH2CH3 a H-3'), 3,68 (2H, široký t, J = 5,5Hz, Η-Γ), 7,46 (1H, ddd, J = 7,1, 7,0 a 1,2 Hz, H-6), 7,84 (ddd, J = 7,0, 6,9 a 1,2 Hz, H-7), 8,31 (2H, m, H-5 a H-8), 8,80 (1H, široký s, NH) ppm.
UV: lambda^ 220, 270,476.
Analýza pro C14H2]N5O . (1/3 H2O): vypočteno: 56,50 % C, 7,34 % H, 23,55 % N, nalezeno: 56,90 % C, 7,15 % H, 23,40 % N.
-23 CZ 289742 B6
Příklad 11
Způsob výroby 7-nitro-3-(2-N,N-diethylaminoethylamino)-l ,2,4-benzotriazin-l ,4-dioxidu ΐ
ΐ
-24CZ 289742 B6
Způsob výroby hydrochloridu 7-nitro-3-(2-N,N-diethylaminoethylamino)-l,2,4-benzotriazin-
1-oxidu vzorce 20
Roztok 1,60 g (7,06 mmol) 7-nitro-3-chlor-l,2,4-benzotriazin-l-oxidu vzorce 19 [vyrobeného jak obecně uvedl Sasse a kol. v US 4 289 771 sa) dusitanam sodným a kyselinou sírovou za teploty 40 °C, s následující b) chlorací oxychloridem fosforitým za teploty 106 °C] v 50 ml methylenchloridu se zpracuje s 6,0 ml (42,7 mmol) Ν,Ν-diethylethylendiaminu. Po 6 hodinách za teploty místnosti se reakční směs odpaří dosucha za teploty 60 °C při vysokém vakuu. Žlutá tuhá látka se míchá ve 150 ml 20 % isopropylalkoholu v etheru po dobu 5 hodin, filtruje, promyje isopropylalkoholem a potom petroletherem a nato vysuší za teploty 80 °C a tlaku 133 Pa. Tak se dostane 1,80 g sloučeniny vzorce 20 jako žlutých krystalů tvaru jehliček. Výtěžek odpovídá 74 % teorie.
NMR (90 Mhz, d6-DMSO/d4-MeOH) δ: 1,25 (6H, t, J = 6,0Hz, CH3), 3,25 (6H, m, NCH2), 3,82 (2H, m, Η-Γ), 7,74 (1H, d, J = 7,0Hz, H-5), 8,52 (1H, dd, J = 7,0 a 2,0 Hz, H-6), 8,91 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2, H-8) ppm.
Způsob výroby hydrochloridu 7-nitro-3-(2-N,N-diethylaminoethylamino)-l,2,4-benzotriazin-
1,4-dioxidu vzorce 21
K míchanému roztoku 0,50 g (1,46 mmol) 7-nitro-3-(2-N,N-diethylaminoethylamino)-l,2,4benzotriazin-l-oxidu vzorce 20 (vyrobenému jak je popsáno výše) v 50 ml chloroformu se za teploty 0 °C přidá 9,0 ml anhydridu kyseliny trifluoroctové. Po 30 minutách se k reakční směsi přidá 4,0 ml 70 % peroxidu vodíku a směs se míchá za teploty místnosti po dobu 3 dnů, poté vysuší síranem sodným, filtruje a odpaří za sníženého tlaku dosucha. Dostane se 0,67 g soli, trifluoracetátu. Výtěžek odpovídá 45 % teorie. Tato látka se rozpustí ve 30 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a třikrát extrahuje vždy 30 ml methylenchloridu. Methylenchloridová fáze se promyje vodou, vysuší síranem sodným, filtruje, nasytí plynným chlorovodíkem a odpaří dosucha. Získá se 0,35 g požadované sloučeniny jako červené tuhé látky, která má teplotu tání 194 až 195 °C. Výtěžek odpovídá 63 % teorie, celkový výtěžek je 28 % teorie.
UV: larnbdamax 260,306,388,479.
Analýza pro C]3Hi8N6O4 . HC1: vypočteno: 43,50 % C, 5,34 % H, 23,43 % N, nalezeno: 43,20 % C, 5,37 % H, 23,11 % N.
Dále uvedené příklady 12 až 15 jsou zaměřeny na redukční deaminaci, pro výrobu sloučenin obecného vzorce I, které jsou nesubstituované v poloze 3, to znamená ve kterých substituentem X je vodík.
-25CZ 289742 B6
Příklad 12
Způsob výroby l,2,4-benzotriazin-l,4-dioxidu redukční deaminaci 3-amino-l,2,4-benzotriazin-1,4-dioxidu
(22)
K rychle míchanému roztoku 867 mg (1,0 ml, 8,41 mmol) terc.-butylnitritu ve 20 ml dimethylformamidu za teploty 60 až 65 °C se přidá 500 mg (2,81 mmol) 3-amino-l,2,4-benzotriazinu-
1,4-dioxidu (vyrobeného způsobem, který popsal Seng a kol. v Anqew. Chem. Internát. Edit., 11 /1972/) po malých částech během 5 minut. Poté co je přidávání ukončeno a průvodní bouřlivý vývoj plynu ustane (za přibližně 5 minut), roztok se zachytí a redukuje za vysokého vakua na tmavou voskovitou tuhou látku. Velmi rychlou chromatografií, s 30 % ethylacetátem v methylenchloridu jako elučním činidle, se dostane žlutá tuhá látka, která má teplotu tání 188 až 189,5 °C (za rozkladu). Tato látka se rekrystaluje z ethanolu a dostane se 195 mg sloučeniny vzorce 9 jako světle žlutých destiček, které mají teplotu tání 192 až 194 °C (za rozkladu). Výtěžek odpovídá 43 % teorie.
NMR (400 Mhz, d6-aceton): δ: 8,04 (1H, ddd, J = 8,5, 7,1,5 Hz), 8,15 (1H, ddd, J = 8,5,7, 1,5 Hz), 8,42 (1H, dd, J = 8,5,1,5 Hz), 8,43 (1H, dd, J = 8,5,1,5 Hz), 9,05 (1H, s, H-3) ppm.
UV: larnbdamax 405, 300,225.
MS: m/z (relativní intenzita): 147 (13), 136 (19), (intenzita), 164(9), 163(100, M+), 147(13), 136(19), 90(7), 78(27), 76(26), 75(8), 64(9), 63 (10), 52 (12), 51 (48), 50 (28), 38 (8), 37 (5), 30 (18), 28 (6), 27 (7).
Analýza pro C7H5N3O2:
vypočteno: 51,54 % C, 3,09 % H, 25,76 % N, nalezeno: 51,42 % C, 3,02 % H, 25,66 % N.
-26CZ 289742 B6
Příklad 13
Způsob výroby 7-allyloxy-l,2,4-benzotriazin-l,4-dioxidu redukční deaminací
O
A
(24)
K míchanému roztoku 271 mg (0,312 ml, 2,63 mmol) terc.-butylnitritu v 15 ml dimethylformamidu za teploty 60 až 65 °C se přidá 205 mg (0,875 mmol) 7-allyloxy-3-amino-l,2,4benzotriazin-l,4-dioxidu vzorce 23 po malých částech během 5 minut. Po 30 minutách se přidá dalších 271 mg (0,312 ml, 2,63 mmol) terc.-butylnitritu a krátce nato v tmavě červeném roztoku nastane bouřlivý vývoj plynu a barva přejde do znatelně světlého odstínu během období několika minut. Po dalších 30 minutách se výsledný oranžový roztok redukuje za sníženého tlaku na hnědou tuhou látku, která se postupně podrobí velmi rychlé chromatografíi s 10 % ethylacetátem v methylenchloridu a krystalizaci ze směsi methylenchloridu v petroletheru. Dostane se 72 mg sloučeniny vzorce 24 ve formě světle oranžových krystalů, které mají teplotu tání 147 až 148 °C. Výtěžek odpovídá 38 % teorie.
NMR (400 Mhz, d6-aceton) δ: 4,89 (2H, ddd, H-l', Jr2· = 5,5, Ji'.3trans = 1,5 Hz), 5,36 (1H, ddd, H-3', J3-.2cis = 10,5, J3·,3 = 1,5 Hz), 5,52 (1H, ddd, H-3', J3-2trans = 17,5, J3-3- = 3, J3T = 1,5 Hz), 6,14 (1H, ddd, H-2', J2·3cis = 10,5, J2·r = 5,5Hz), 7,70 (1H, d, H-8, Jg6 = 2,5Hz), 7,47 (1H, dd, H-6, J6>5 = 9,5, J6,g = 2,5 Hz), 8,33 (1H, d, H-5, J5.6 = 9,5 Hz), 8,93 (1H, s, H-3) ppm.
UV: larnbdamax 425,410, 365, 355, 320,245, 200.
MS: m/z (relativní intenzita): 220(4), 219(34, M+), 103(4), 77(4), 75(4), 63(13), 62(4), 42 (3),41 (100),39(16).
-27CZ 289742 B6
Analýza pro CioH9N303:
vypočteno: 54,79 % C, 4,14 % Η, 19,17 % N, nalezeno: 54,73 % C, 4,16 % H, 19,15 % N.
Příklad 14
Způsob výroby 7-(3-N-ethylacetamido-2-acetoxypropoxy)-l ,2,4-benzotriazin-l ,4-dioxidu redukční aminací
K míchanému roztoku 9 185 mg (1,79 mmol) terc.-butylnitritu v 5 ml dimethylformamid za teploty 60 °C se přidá injekční stříkačkou roztok 125 mg (0,329 mmol) 7-(3-N-ethylacetamido-
2-acetoxypropoxy)-3-amino-l,2,4—benzotiazin-l,4-dioxidu vzorce 25 v 5 ml dimethylformamidu v průběhu 1 minuty. Po 5 minutách se přidá dalších 217 mg (2,10 mmol) terc.-butylnitritu a proběhne bezprostředně reakce, jak je zřejmé z uvolňování plynu a změny barvy roztoku z červené na světle oranžovou. Po dalších 10 minutách se roztok stripuje na žluto hnědou tuhou látku a eluduje přes silikagel s 5 % methanolem v methylenchloridu až směsí methylenchloridu a benzínu. Získá se 90 mg žluté tuhé látky, která má teplotu tání 179 až 180,5 °C. Výtěžek odpovídá 75 % teorie.
NMR (400 Mhz, d4-methanol, směs rotamerů, poměr přibližně 2 : 1) δ: 1,12,1,22 (t, 1 : 2,3 H celkově J = 7Hz), 2,0-2,07 (s, 2:1,3H celkově), 2,11,4,34-4,48 (m, 2H), 5,48-5,58 (m, 1H), 7,76 - 7,86 (m, 2H), 8,36 - 8,42 (m, 1H), 9,04,9,06 (s, 2 : 1,1 H celkově) ppm.
UV: lambdamax 420,405, 365,350,315,240,200.
MS: m/z (relativní intenzita): 365 (0,5), 364 (1,4, M+), 349 (0,5), 348 (1,1), 347 (0,5), 332 (1,2), 331 (3,6), 187 (7), 186 (66), 102 (6), 100 (21), 84 (30), 63 (6), 58 (100), 56 (8), 43 (65), 42 (9), 41 (9),41 (5),30(14),29 (5),28(8).
-28CZ 289742 B6
Příklad 15
Způsob výroby 7-nitro-l,2,4-benzotriazin-l,4-dioxidu redukční deaminací
K míchanému roztoku 988 mg (0,85 mmol) terc.-butylnitritu v 5 ml dimethylformamidu za teploty 60 °C se přidá 38 mg (0,17 mmol) 7-nitro-3-amino-l,2,4-benzotriazin-l,4-dioxidu vzorce 14. K tmavě červené suspenzi se po 30 minutách přidá dalších 175 mg (1,70 mmol) terc.butylnitritu a bezprostředně nato suspenze změní své zbarvení a nastane bouřlivý vývoj plynu. Po dalších 10 minutách se oranžový roztok redukuje na tuhou látku za sníženého tlaku a chromatografuje se 1 % kyselinou octovou v methylenchloridu. Získají se 3 mg sloučeniny vzorce 27, kterou tvoří žlutá tuhá látka. Výtěžek odpovídá 10 % teorie.
NMR (90 Mhz, d6-dimethylsulfoxid) δ: 7,68 (d, 1H, J = 9,2 Hz), 7,92 (dd, 1H, J = 9,2,2,2 Hz), 8,10 (d, 1H, J = 2,2 Hz), 8,65 (s, 1H) ppm.
UV: lambda^ 420,310,240,205.
MS: m/z (relativní intenzita): 209(9), 208(100, M*), 192(54), 181 (14), 162(16), 105(9), 77 (28), 75 (52), 74 (27), 63 (21), 62 (16), 30 (77), 18 (26).
-29CZ 289742 B6
Příklad 16
Způsob výroby 3-ethyl-l,2,4-benzotriazin-l,4-<lioxidu
(a) NaNOa, HO, AcOH; (b) BF3-AcOH, 90 až 95 °C (c) 70% H2O2, TFAA, NaOAc.
O
Hydrazon vzorce 28, vyrobený kondenzací propionaldehydu a fenylhydrazinu, se nechá reagovat s benzendiazoniumchloridem ve směsi kyseliny octové, dusitanu sodného a kyseliny chlorovodíkové, za vzniku formazanu vzorce 29. cyklizací s BF3-AcOH (fluoridem boritým a kyselinou octovou) při teplotě 90 až 95 °C se dostane 3-ethyl-l,2,4-benzotriazin vzorce 30, ve formě oleje, který se čistí destilací. Oxidací 70 % peroxidem vodíku a anhydridem kyseliny trifluoroctové (TFAA) v methylenchloridu se dostane 3-ethyl-l,2,4-benzotrizin-l,4-dioxid vzorce 31. Sloučenina pojmenovaná v nadpise, která má vzorec 31, se čistí za použití sloupcové chromatografle s normální fází a rekrystalizace z vodného ethanolu. Dostane se sloučenina o čistotě 99,8 %, která má teplotu tání 141 až 142 °C.
Příklad 17
Způsob výroby 3-propyl-l,2,4~benzotriazin-l,4-dioxidu
Výše jmenovaná látka vzorce 32 se vyrobí a čistí způsobem z příkladu 16 (vyrobeno z 3-ethyl- l,2,4-benzotriazin-l,4-dioxidu) stím rozdílem, že se hydrazon, vzniklý kondenzací butylaldehydu a fenylhydrazinu, použije při reakci s benzendiazoniovou solí na místo hydrazonu, vzniklého kondenzací propionaldehydu a fenylhydrazinu. Teplota tání sloučeniny vzorce 32 činí 114ažll6°C.
-30CZ 289742 B6
Příklad 18
Způsob výroby 3-(l-hydroxyethyl)-l,2,4-benzotriazin-l-oxidu
(a) tri-N-butylvinyleíh, Pd(OAc)2, (Tol)3P, Et3N, CH3CN, 100 °C (b) 9-BBN; (c) NaOH, H2O2
3-Chlor-l,2,4-benzotriazin-l-oxid se zpracuje se slabým přebytkem tri-N-butylvinylcínu ve směsi acetonitrilu, tritoluylfosgenu a triethylaminu, za použití katalyzátoru na bázi dvojmocného palladia (octanu palladnatého) v uzavřené trubici za teploty 100 °C během 48 hodin. Odpařením rozpouštědla a čištěním sloupcovou chromatografií se dostane 3-vinyl-l,2,4-benzotriazin-loxid vzorce 33. Redukcí 9-borabicyklo[3,3,l]nonanem (9-BBN) s následující oxidací hydroxidem sodným a peroxidem vodíku se dostane sloučenina pojmenovaná v nadpise, vzorce 34.
Příklad 19
Tirapazamin a cis-platina se testují na nádorovém modelu s RIF-1 in vivo. Tirapazamin a cisplatina se také testují při zkoušce in vitro za použití buněk RIF-1 za hypoxických a aerobních podmínek.
Zvířata a nádory
RIF-1 fibroserkom (vyvíjen a udržován v laboratoři Dr. Martina Browna, Department ofRadiation Oncology, Stanford University, Stanford, Kalifornie, USA, Twentyman a kol., J. Naťl. Cancer Inst. 64, 595-604) u C3H/Km myší (rozmnožovány a pěstovány vRadiation Biology Division při Stanford University Medical School) umístěný za definovaných podmínek pro floru, se udržuje střídavé in vivo a in vitro, podle již dříve publikovaného pracovního návodu (Twentyman, viz výše). Monovrstva nádorových buněk, rostoucí na Waymounthově prostředí doplněném 15 % fetálním telecím sérem, se získá s 0,05 % trypsinu. Z této suspenze se hned naočkuje 2xl05 buněk v 0,05 ml prostředí do zad každé myši v místě přibližně 2 cm nad ocasem. Experimenty začnou o dva týdny později, když střední objem nádoru je přibližně 200 mm3.
-31 CZ 289742 B6
Léčivé látky
Tirapazamin (SR 4233) dodává firma Sterling Drug lne., New York (New York, USA). Pro studie na zvířatech se léčivá látka rozpustí v normálním fyziologickém roztoku v koncentraci přibližně 1 mg/ml a intraperitoneálně (i.p.) zavede injekcí v množství mmol/kg báze. Cis-platina (c-DDP) od firmy Bristol Laboratories (Princeton, New Jersey, USA) se rozpustí ve sterilní vodě a zavede jako intraperitoneální injekce v množství 0,01 ml na gram tělesné hmotnosti.
Přežívání buněk
Pro studie na zvířatech se přežívající buňky RIF-1 hodnotí podle testu excize in vivo/in vitro. Před koncem testu se myši usmrtí, 24 hodin po ošetření cis-platinou, nádory se vyjmou, rozkrájí, rozpustí s enzymovým koktejlem (Twentyman, viz výše) a buňky se použijí ke klonogenovému testu. Výsledné kolonie nádorových buněk se obarví krystalovou violetí a spočítají po dvoutýdenní inkubaci za teploty 37 °C ve vlhké atmosféře obsahující 5 % oxidu uhličitého. Poměr klonogenních buněk na nádor se vypočítá jako produkt z účinnosti při výše uvedeném použití k testu a dosažených nádorových buněk pro ošetřené nádory vzhledem k hodnotám pro neošetřené nádory, testované paralelně.
Pro studii na buňkách in vitro se buňky RIF-1 nasadí ve skleněných Petriho miskách o průměru 60 mm do Waymouthova prostředí doplněného 15% fetálním telecím sérem při koncentraci 2xl04 buněk na misku. Experimenty se provedou o 4 až 5 dnů později, když je přítomno přibližně 106 buněk na misku v době ošetření. Růstové prostředí se potom nahradí 2 ml prostředí bez séra, které obsahuje tirapazamin v koncentraci buď 2, nebo 4 pg/ml. Při každém experimentu se pracuje s naočkovanými skupinami, u kterých ošetřování tirapazaminem a cis-platinou se provádí jak současně, tak s časovým intervalem mezi oběma ošetřeními. V těch skupinách, ve kterých časový interval uplyne hned po působení tirapazaminu, buňky se propláchnou dvakrát a prostředí se nahradí plným růstovým prostředím až do doby druhého ošetření (cis-platinou), které se také provádí v prostředí bez séra. Oboje působení, tirapazaminem a cis-platinou, probíhá jednu hodinu za hypoxického stavu. K. dosažení hypoxie se misky umístí do zvláštním způsobem vyrobených, předem zahřátých plynových komor z hliníku, které jsou umístěny na vibračním stole a připojeny k plynovému násobně rozvětvenému potrubí, které obsahuje trubici k připojení vakua a přívodní potrubí pro vzduch nebo dusík (s obsahem 5 % oxidu uhličitého). Hypoxie se dosahuje v komoře z hliníku po řadě pěti střídajících se evakuací, které trvají 2 až 3 minuty na tlak 10 kPa, s následujícím zavedením dusíku (s obsahem 5 % oxidu uhličitého). Po zavedení plynu se komory uzavřou a provádí se inkubace za teploty 37 °C po dobu 1 hodiny. Měření hladiny kyslíku v prostředí za použití Clarkeovy elektrody ukazuje, že hypoxie se dosahuje rychle (přibližně za 10 minut s průměrnou hodnotou pO2 během 1 hodiny vystavení prostředí s obsahem méně než 200 dílů kyslíku na milion dílů). Bezprostředně po ošetření cis-platinou se buňky trypsinizují, spočítají a umístí do Petriho misek z plastické hmoty obsahujících Waymouthovo prostředí a inkubují za teploty 37 °C po dobu 14 dnů ve vlhké atmosféře s obsahem 5 % oxidu uhličitého, poté se kolonie obarví krystalickou violetí a spočítají.
Normální tkáň
Odezva normální tkáně na tirapazamin a cis-platinu se hodnotí při ledvinových testech kostní dřeně podle obsahu močovinového dusíku v krvi (BUN) a počtu periferních bílých buněk. Vzorky krve se odebírají z ocasní žíly nebo srdeční punkcí. Přitom se nepoužívají žádné antikoagulanty. Počet periferních bílých buněk pro jednotlivé myši se stanoví z 20 μΐ celé krve, zředěné 0,280 ml 3 % kyseliny octové. Pro sérové testování obsahu močovinového dusíku v krvi se krev od dvou myší spojí, koaguluje, promíchá a odstřeďuje při přetížení 830 g po dobu 15 minut. Poté co se sérum odsaje, stanoví se hodnoty obsahu močovinového dusíku v komerční klinické veterinární laboratoři. Při jiném experimentu se také zaznamenává přežívání po dobu 30 dnů.
-32CZ 289742 B6
Výsledky
a) Výsledky na nádorech in vivo
Obr. 1 ukazuje spojené výsledky ze dvou experimentů, při kterých se podalo 0,35 mmol/kg tirapazaminu (63 mg/kg) myším trpícím nádorem, v různých časových intervalech od 3 hodin před do 2 hodin po podání 8 mg/kg cis-platiny a testovalo se klonogenní přežití při 24 hodinách. Na ose y je uveden relativní počet klonogenních buněk na nádor a na ose x je uvedena doba podání tirapazaminu ve vztahu k podání cis-platiny (-2 hodiny představuje hodnotu dosaženou u myší, které dostaly injekci tirapazaminu 2 hodiny po injekci cis-platiny). Kolečky je označen samotný tirapazamin, čtverečky představují samotnou cis-platinu a trojúhelníčky představují tirapazamin a cis-platinu. Jak je ukázáno na obr. 1, pokud se podává tirapazamin v časovém období mezi třemi hodinami před a jednou až dvěma hodinami po podání cis-platiny, relativní počet klonogenních buněk na nádor poklesne z přibližně 10“4 na zhruba 10-7. To představuje desetinásobný až tisícinásobný pokles počtu klonogenních buněk na nádor, v porovnání s počtem klonogenních buněk na nádor, pokud se tirapazamin podává současně jako cis-platina. Synergický účinek tirapazaminu a cis-platiny je zřetelnější, pokud tirapazamin se podává přibližně od 3 do 1 hodiny před podáním cis-platiny, s největším interakčním účinkem zřejmým 2 hodiny 30 minut před podáním cis-platiny.
Protože se pozoruje velké množství usmrcených buněk při vrcholu na obr. 1 (to znamená při mezní hodnotě limitu klonogenní zkoušky), dávka tirapazaminu při experimentu se sníží z 0,35 mmol na 0,27 mmol/kg (48,6 mg/kg) a experimenty se opakují, při tomto novém experimentu časová prodleva mezi podáním cis-platiny a tirapazaminu se prodlouží k 24 hodinám. Výsledky tohoto experimentu jsou uvedeny na obr. 2. Osy x a y a symboly jsou stejné jako pro obr. 1. Jak je ukázáno na obr. 2, zvýšení interakce mezi tirapazaminem a cis-platinou se dosahuje, pokud tirapazamin se podává až 24 hodiny před podáním cis-platiny.
Navzdory snížení množství tirapazaminu, podávaného v druhé sadě experimentů, údaje z třetího experimentu ukazují stejné výsledky: dochází k podstatné přídavné toxicitě, pokud se léčivé látky podávají dohromady, a velké cytotoxické interakci, pokud se léčivé látky podávají v odlišném čase, s maximálním snížením počtu klonogenních buněk na nádor, když ošetření tirapazaminem předchází ošetření cis-platinou přibližně o 2,5 hodiny.
Další experimenty se provádějí s měnícími se dávkami tirapazaminu podávaného 2,5 hodiny před podáním buď 4, nebo 8 mg/kg cis-platiny. Dostává se přibližně exponenciální snížení přežívajících nádorových buněk při obou dávkách cis-platiny se vzrůstající dávkou tirapazaminu.
b) Výsledky na normální tkáni
Předcházející studie za použití myší C3H ukazuje, že počet bílých buněk dosahuje vrcholu třetího dne po ošetření tirapazaminem a cis-platinou a potom vzrůstá opět k takřka ke kontrolním úrovním v den 5. Při studii odezvy na dávku se proto podá v den 3 cis-platina samotná a tirapazamin s cis-platinou, s dávkou 0,35 mmol/kg tirapazaminu podanou 2 hodiny 30 minut před podáním cis-platiny. Cis-platina se podává ve třech rozdílných úrovních dávky: 10,14 a 18 mg/kg. Jak tirapazamin, tak cis-platina způsobují střední průběh leukemie a kombinace má vliv, který odpovídá předpokládanému vlivu z odezev na jednotlivé léčivé látky.
Testy séra, za použití způsobu stanovení močovinového dusíku v krvi, se provádějí šestého dne po injekci tirapazaminu a cis-platiny, vztaženo na předchozí údaje o času, pro maximální vzrůst močovinového dusíku po vysokých dávkách cis-platiny. Stanoví se močovinový dusík v krvi umyší C3H 6 dnů po jediné injekci tirapazaminu (0,27 mmol/kg), cis-platiny (10,14 nebo 18 mg/kg) nebo obou léčivých látek podávaných dohromady (s tirapazaminem zavedeným injekcí 2 hodiny 30 minut před injekcí cis-platiny). Hladiny močovinového dusíku pro dávky 10 a 14 mg/kg cis-platiny samotné jsou podobné jako hladiny močovinového dusíku v krvi pro
-33CZ 289742 B6 neošetřené myši (přibližně 30mg/dl). Avšak 18 mg/kg samotné cis-platiny způsobuje hladinu močovinového dusíku přibližně 80 mg/dl. Naopak při každé dávce kombinace léčivých látek hladina močovinového dusíku ošetřených myší je menší než jsou hladiny močovinového dusíku u neošetřených myší. Tyto výsledky ukazují, že tirapazamin v kombinaci s cis-platinou dále nezvyšuje toxicitu pro ledviny a může případně chránit při nejvyšší testované dávce.
Při dalším testu se stanovuje, zde tirapazamin zvyšuje systemickou toxicitu cis-platiny. Experiment pro stanovení LD50 se provádí se samotnou cis-platinou a cis-platinou podávanou 2 hodiny 30 minut před injekcí tirapazaminu. LD50 pro myši ošetřené 0,35 mmol/kg tirapazaminu a cisplatinou jsou 17,7 mg/kg (95 % interval spolehlivosti: 16,8 až 18,7 mg/kg), v protikladu k samotné cis-platině, kde tato hodnota odpovídá 17,8 (17,1 až 18,5 mg/kg).
c) Výsledky experimentů in vitro
Buňky se vystaví na dobu 1 hodiny působení tirapazaminu (2 nebo 4 pg/ml) za hypoxických podmínek a také se vystaví působení cis-platiny (2 pg/ml) na dobu 1 hodiny, v provedení odpovídajícím funkci času. Koncentrace každého prostředku se volí tak, že vytváří podobnou hladinu usmrcených hypoxických buněk, jako se vyskytuje u nádorů RIF-1 in vivo: pro tirapazamin (0,3 a 0,009 a při 1 a 4 pg/ml) a pro cis-platinu (3,5 x 10-3). Každý experiment obsahuje skupiny, které nejsou podrobeny oddělenému působení dvou prostředků (to znamená, že tirapazamin a cis-platina se podávají současně na dobu 1 hodiny za hypoxických podmínek), stejně jako skupinu, která se vystaví vlivu obou látek oddělené, během doby 1 až 4 hodin. Dosažené výsledky pro léčivé látky podávané současně nejsou signifikantně odlišné od výsledku přežití u obou prostředků podaných odděleně (to znamená, že je vhodné dosáhnout aditivity), zatímco pokud se léčivé látky podávají odděleně, nastává větší usmrcení buněk s koeficientem až 10 . Je zde podobná kinetika zvyšujícího se usmrcování buněk, jako se pozoruje u výsledků in vivo, ačkoliv absolutní násobek účinnosti při rozštěpení dvou dávek je menší než se pozoruje in vivo. K přezkoumání, zda interakce mezi oběma prostředky je závislá na přítomnosti hypoxie, se experimenty opakují s intervalem 3 hodiny mezi vystavením buněk tirapazaminu za aerobních podmínek a vystavením buněk cis-platině za hypoxických podmínek. Při těchto experimentech nenastává žádná cytotoxicita v důsledku tirapazaminu a nepozoruje se potenciace usmrcení buněk v porovnání s výsledky samotné cis-platiny při stejných experimentech.