CN113234661A - 干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法。具体地，本文公开了用于各种不同应用例如细胞疗法的SC‑β细胞和分离的SC‑β细胞群体的产生方法。

Description

干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法

本申请是国际申请日2015年12月18日、国际申请号PCT/US2015/066900于2017年8月18日进入中国国家阶段、申请号201580076485.5、发明名称“干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法”的申请的分案申请。

相关申请

本申请要求2014年12月18日提交的美国临时申请系列号62/093,974的权益，其全部教导内容通过参考并入本文。

背景技术

根据国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation)的报告，糖尿病在全世界影响超过3亿人口。1型糖尿病和2型糖尿病涉及β细胞破坏和/或β细胞功能障碍。糖尿病患者，特别是患有1型糖尿病的患者，有可能通过移植β细胞而治愈。尽管人类尸体胰岛移植可以为患者提供5年或更长时间的胰岛素不依赖性，但由于供体胰岛的不足和质量(Bellin等，2012)，这种方法受到限制。从干细胞产生无限制供应的人类β细胞可以为数百万患者提供疗法，因为可能只需要生产单一的细胞类型即β细胞，并且递送方式已被良好地了解：在免疫保护下移植到身体内的血管化位点。此外，由于有限的胰岛供应和由不同的死因、供体遗传学和它们分离中的其他情况造成的可变性，为了鉴定改善β细胞功能、存活或增殖的新药物而进行的筛选也被延迟。因此，干细胞来源的β细胞的稳定均一的供应将为糖尿病提供有用的药物发现平台。此外，遗传上多样化的干细胞来源的β细胞可用于体外或体内疾病建模。

发明内容

对于产生干细胞来源的β(SC-β)细胞的方法，存在着需求。本发明涉及致力于应对这种需求并具有其他所需特征的解决方案。

根据本发明的实施方式，提供了一种用于产生干细胞来源的β(SC-β)细胞的方法。所述方法包括将细胞群体与引导向SC-β细胞分化的药剂在促进细胞簇集的条件下并与其他药剂相接触，所述其他药剂包含下述一者或多者：a)当所述细胞群体包含i)分化成PDX1+胰腺祖细胞的FOXA2+、SOX2+原始前肠细胞，ii)分化成PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞的PDX1+胰腺祖细胞，和/或iii)分化成嗜铬粒蛋白A、NKX6.1+内分泌祖细胞的PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞时，有效量的降低rho相关蛋白激酶(Rock)的水平和/或活性的药剂；b)当所述细胞群体包含分化成PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞的PDX1+胰腺祖细胞时，有效量的激活素A；以及c)当所述细胞群体包含分化成嗜铬粒蛋白A、NKX6.1+内分泌祖细胞的PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞时，有效量的星孢菌素，由此产生SC-β细胞。

根据本发明的某些方面，所述方法还包括在PDX1+胰腺祖细胞已分化成PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞之后任选地洗涤所述细胞群体，以在将所述细胞群体与星孢菌素接触之前解除激活素A与所述细胞群体的接触。

根据本发明的某些方面，所述药剂包含Y-27632。根据本发明的某些方面，所述药剂的有效量包含10μΜ的浓度。

根据本发明的某些方面，激活素A的有效量包含5ng/ml的浓度。根据本发明的某些方面，星孢菌素的有效量包含3nM的浓度。

根据本发明的某些方面，将包含分化成PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞的PDX1+胰腺祖细胞的细胞群体暴露于所述药剂和激活素A 6天的时间段。

根据本发明的某些方面，至少在75％至80％之间的所述细胞群体在分化成SC-β细胞之前分化成嗜铬粒蛋白A、NKX6.1+内分泌祖细胞。

根据本发明的某些方面，所述药剂i)阻止细胞簇解体或使细胞簇解体最小化，ii)促进细胞存活，iii)增加细胞簇尺寸，及其组合。

根据本发明的实施方式，提供了一种分离的SC-β细胞或其群体，所述分离的SC-β细胞或其群体在体外和体内两种情况下表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)响应。根据本发明的某些方面，所述分离的SC-β细胞或其群体表现出至少在1.0至3.0之间的刺激指数。根据本发明的某些方面，所述分离的SC-β细胞或其群体在高葡萄糖浓度下每30分钟的温育产生大约300uIU至4000uIU。

根据本发明的实施方式，提供了一种微胶囊，所述微胶囊包含包封在其中的所述分离的SC-β细胞或其群体。

根据本发明的实施方式，提供了一种宏包封装置，所述宏包封装置包含包封在其中的所述分离的SC-β细胞或其群体。

根据本发明的实施方式，提供了一种细胞系，其包含稳定地表达胰岛素的分离的SC-β细胞。

根据本发明的实施方式，提供了一种测定法，所述测定法包含所述分离的SC-β细胞或其群体或所述细胞系。所述测定法可用于：i)鉴定一种或多种促进或抑制选自β细胞增殖、β细胞复制、β细胞死亡、β细胞功能、β细胞对免疫攻击的易感性和β细胞对去分化或分化的易感性的β细胞命运的候选药剂；或ii)鉴定一种或多种促进至少一种胰岛素阳性内分泌细胞或其前体细胞分化成至少一种SC-β细胞的候选药剂。

根据本发明的实施方式，公开了一种用于治疗有需要的对象的方法。所述方法包括向有需要的对象给药i)分离的SC-β细胞群体；ii)包含包封在其中的SC-β细胞的微胶囊；和/或iii)包含包封在其中的所述SC-β细胞的宏包封装置。根据本发明的实施方式，分离的SC-β细胞群体、包含所述分离的SC-β细胞群体的微胶囊和/或包含所述分离的SC-β细胞群体的宏包封装置被用于向有需要的对象给药。根据本发明的某些方面，所述对象患有糖尿病或具有发生糖尿病的提高的风险，或患有代谢障碍或具有发生代谢障碍的提高的风险。

根据本发明的实施方式，提供了包含SC-β细胞的人造胰岛或胰腺。

除非另有指明，否则本发明的实践通常使用本领域技术范围之内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组核酸(例如DNA)技术、免疫学和RNA干扰(RNAi)的常规技术。某些这些技术的非限制性描述存在于下述出版物中：Ausubel,F.等主编，《现代分子生物学方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，《现代免疫学方法》(Current Protocols in Immunology)，《现代蛋白质科学方法》(Current Protocolsin Protein Science)和《现代细胞生物学方法》(Current Protocols in Cell Biology)，均由John Wiley&Sons,N.Y.出版，2008年12月的版本；Sambrook,Russell和Sambrook，《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)第3版，Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,2001；Harlow,E.和Lane,D.，《抗体实验指南》(Antibodies-ALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,1988；Freshney,R.I.，《动物细胞培养基本技术手册》(Culture of AnimalCells,A Manual of Basic Technique)第5版，John Wiley&Sons,Hoboken,J,2005。关于治疗性药剂和人类疾病的非限制性信息存在于Goodman和Gilman的《治疗剂的药理基础》(ThePharmacological Basis of Therapeutics)第11版，McGraw Hill,2005；Katzung,B.主编，《基础和临床药理学》(Basic and Clinical Pharmacology)McGraw-Hill/Appleton&Lange，第10版(2006)或第11版(2009年7月)中。关于基因和遗传障碍的非限制性信息存在于McKusick,V.A.《人类中的孟德尔遗传，人类基因和遗传障碍目录》(MendelianInheritance in Man.A Catalog of Human Genes and Genetic Disorders)，Baltimore:Johns Hopkins University Press,1998(第12版)或更新的在线数据库：OnlineMendelian Inheritance in Man，OMIMTM，McKusick-Nathans Institute of GeneticMedicine,Johns Hopkins University(Baltimore,MD)和National Center forBiotechnology Information,National Library of Medicine(Bethesda,MD)，2010年5月1日，World Wide Web URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/，以及Online MendelianInheritance in Animals(OMIA)这个动物物种(除了人和小鼠之外)中的基因、遗传障碍和性状的数据库：http://omia.angis.org.au/contact.shtml中。本文中提到的所有专利、专利申请和其他出版物(例如科学论文、书籍、网址和数据库)整体通过参考并入本文。在本说明书与任何并入的参考文献之间存在冲突的情况下，以本说明书(包括其任何修改，这可能是基于并入的参考文献)为准。除非另有指明，否则在本文中使用术语的本领域内接受的标准含义。在本文中使用各种不同术语的标准缩写。

附图说明

结合附图参考下面的详细描述，本发明的这些和其他特征将被更充分地理解。专利或申请文件含有至少一张彩图。本专利或专利申请出版物的带有彩图的拷贝将在提出请求并支付必需的费用后由专利局提供。

图1A和图1B分别是使用产生SC-β细胞的示例性对照流程获得的细胞和使用本发明的实施方式的产生SC-β细胞的方法获得的细胞的图像，证实了本发明的产生SC-β细胞的方法阻止细胞簇解体或使细胞簇解体最小化，促进细胞存活，并增加细胞簇尺寸和数目。

图2A是FACS图，证实了使用本发明的实施方式的产生SC-β细胞的方法在每个分化阶段(S4、S5和S6)获得的细胞维持标志物表达。

图2B是使用对照(例如DMSO)在步骤6结束时获得的细胞(例如SC-β细胞)(左图)和在本发明的实施方式的产生SC-β细胞的方法的步骤6结束时获得的细胞(例如SC-β细胞)(右图)的FACS图，证实了星孢菌素处理产生了接近纯的内分泌群体。

图2C是使用对照(例如DMSO)在步骤6结束时获得的细胞(例如SC-β细胞)(左图)和在本发明的实施方式的产生SC-β细胞的方法的步骤6结束时获得的细胞(例如SC-β细胞)(右图)的FACS图，证实了星孢菌素处理产生更高百分率的NKX6.1+、C-肽+细胞。

图3A是示出了人类多能干细胞向SC-β细胞分化的六个阶段的示意图。hPSC＝人类多能干细胞，DE＝定形内胚层细胞(definitive endodermcell)，GT＝肠管细胞，PP1＝胰腺祖细胞1，PP2＝胰腺祖细胞2，EN＝内分泌祖细胞，SC-β＝干细胞来源的β细胞。

图3B是示出了用于从多能干细胞产生SC-β细胞的示例性的六步骤分化流程的示意图，所述分化流程进一步描述在Pagliuca等2014和PCT国际申请号PCT/US2014/041992中。

图4A是示出了按照本发明的实施方式产生SC-β细胞的示例性方法的示意图，例如通过在所指示的步骤期间，将被引导以向SC-β细胞分化的细胞群体在促进细胞簇集的条件下与降低rho相关蛋白激酶的水平和/或活性的药剂(Rock抑制剂)、TGF-β超家族成员(例如激活素A)和蛋白激酶抑制剂(例如星孢菌素)相接触。

图4B是示出了按照本发明的实施方式产生SC-β细胞的示例性方法的示意图，例如通过在所指示的步骤期间，将被引导以向SC-β细胞分化的细胞群体在促进细胞簇集的条件下与降低rho相关蛋白激酶的水平和/或活性的药剂(Rock抑制剂)、TGF-β超家族成员(例如激活素A)和蛋白激酶抑制剂(例如星孢菌素)相接触，并且其中与图4A中描绘的方法相比，步骤4被多执行24小时。

发明详述

本发明涉及产生SC-β细胞，特别是在体外和体内表现出功能的SC-β细胞。更具体来说，本文描述的工作证实，根据本发明的实施方式，在步骤3、步骤4和步骤5期间将S2细胞、S3细胞和S4细胞与Rock抑制剂并在步骤4期间与存在的激活素A相接触，与对照相比在得到的细胞群体中阻止细胞簇解体或使细胞簇解体最小化，促进细胞存活并增加细胞簇尺寸和细胞数目，正如图1A(对照)和图1B中所示。此外，本文中描述的工作证实，在步骤5期间将S4细胞与星孢菌素和Rock抑制剂一起并且在不存在激活素A的情况下相接触，产生如图2A中所示维持标志物表达的细胞，并且产生如图2B中所示接近纯的内分泌群体和如图2C中所示更高百分率的NKX6.1+、C-肽+细胞。按照本发明的方法产生的SC-β细胞可用于各种不同测定法中以鉴定改善β细胞功能、存活或增殖的新药物，用于细胞疗法中(例如用于治疗糖尿病和/或代谢障碍)，并用于人造胰岛和/或人造胰腺的构建。

一些定义

“分化”是未特化的(“未定型的”)或特化程度较低的细胞获得特化细胞例如胰腺细胞的特点的过程。分化的细胞是在细胞谱系内已取得更加特化的(“定型的”)位置的细胞。术语“定型的”当用于分化过程时，是指细胞在分化途径中已前进到某一点，在该点处，在正常情况下它将继续分化成特定细胞类型或细胞类型的亚类，并且在正常情况下不能分化成不同的细胞类型或逆转到分化程度较低的细胞类型。当在本文中使用时，细胞谱系定义了所述细胞的遗传，即它来自于何种细胞以及它可以产生何种细胞。细胞谱系将所述细胞置于发育和分化的遗传流程内。谱系特异性标志物是指与目标谱系的细胞的表型特异性相关的特征，并且可用于评估未定型细胞向目标谱系的分化。

当在本文中使用时，“标志物”是在目标细胞中差异表达的核酸或多肽分子。差异表达意味着与未分化的细胞相比正标志物的水平提高和负标志物的水平降低。与其他细胞相比，在目标细胞中核酸或多肽标志物的可检测水平足够更高或更低，使得可以使用本领域中已知的各种不同方法中的任一种来鉴定目标细胞并将所述目标细胞与其他细胞区分开。

当在本文中使用时，当在细胞中足以检测到特定标志物时，所述细胞对所述特定标志物来说是“阳性”或“+”的(例如表达所述标志物)。类似地，当在细胞中不足以检测到特定标志物时，所述细胞对所述特定标志物来说是“阴性”或“-”的。例如，FACS的阳性通常高于2％，而FACS的阴性阈值通常低于1％。

在某些方面，多能干细胞在体外分化成有功能的胰腺内分泌细胞(即SC-β细胞)的过程可以被视为经过6个连续阶段的发展，正如在图3A中描绘的示例性流程中所示。在这个逐步发展中，“阶段1”或“S1”是指所述分化过程中的第一步骤，多能干细胞分化成表达定形内胚层细胞特有的标志物的细胞(“DE”，“阶段1细胞”或“S1细胞”)。“阶段2”是指第二步骤，表达定形内胚层细胞特有的标志物的细胞分化成表达肠管细胞特有的标志物的细胞(“GT”，“阶段2细胞”或“S2细胞”)。“阶段3”是指第三步骤，表达肠管细胞特有的标志物的细胞分化成表达胰腺祖细胞1细胞特有的标志物的细胞(“PP1”，“阶段3细胞”或“S3细胞”)。“阶段4”是指第四步骤，表达胰腺祖细胞1细胞特有的标志物的细胞分化成表达胰腺祖细胞2细胞特有的标志物的细胞(“PP2”，“阶段4细胞”或“S4细胞”)。“阶段5”是指第五步骤，表达胰腺祖细胞2细胞特有的标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层细胞和/或胰腺内分泌祖细胞特有的标志物的细胞(“EN”，“阶段5细胞”或“S5细胞”)。“阶段6”是指表达胰腺内分泌祖细胞特有的标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌β细胞特有的标志物的细胞(“SC-β细胞”，“阶段6细胞”或“S6细胞”)。然而，应该认识到，在特定群体中，不是所有细胞都以相同的速率经过这些阶段发展，即与所述群体中存在的大多数细胞相比，某些细胞可能在所述分化途径上发展得更慢或更快。

现在描述与图3A中示出的阶段相关的各种不同细胞类型的特征。当在本文中使用时，“定形内胚层细胞”是指带有在原肠胚形成期间从外胚层产生的细胞的特征，并且形成胃肠道及其衍生物的细胞。定形内胚层细胞表达下述标志物中的至少一者：FOXA2(也被称为肝细胞核因子3β(“ΗΝΡ3β”))，GATA4，SOX17，CXCR4，Brachyury，Cerberus，OTX2，goosecoid，C-Kit，CD99和MIXL1。定形内胚层细胞特有的标志物包括CXCR4、FOXA2和SOX17。因此，定形内胚层细胞可以通过它们的CXCR4、FOXA2和SOX17的表达来表征。此外，取决于允许细胞停留在阶段1中的时间的长度，可能观察到HNF4α的提高。

当在本文中使用时，“肠管细胞”是指源自于定形内胚层，可以产生所有内胚层器官例如肺、肝、胰腺、胃和肠的细胞。肠管细胞可以通过它们与定形内胚层细胞所表达的HNF4α相比明显提高的HNF4α表达来表征。例如，在阶段2期间可能观察到HNF4α的mRNA表达的10至40倍的提高。

当在本文中使用时，“胰腺祖细胞1细胞”是指产生食道、肺、胃、肝、胰腺、胆囊和一部分十二指肠的内胚层细胞。胰腺祖细胞1细胞表达下述标志物中的至少一者：PDX1，FOXA2，CDX2，SOX2和HNF4α。胰腺祖细胞1细胞可以通过与肠管细胞相比PDX1表达的提高来表征。例如，在阶段3培养物中超过50％的细胞通常表达PDX1。

当在本文中使用时，“胰腺祖细胞2细胞”是指表达下述标志物中的至少一者的细胞：PDX1，NKX6.1，HNF6，NGN3，SOX9，PAX4，PAX6，ISL1，胃泌素，FOXA2，PTF1a，PROX1和HNF4α。胰腺祖细胞2细胞可以被表征为PDX1、NKX6.1和SOX9的表达阳性。

“胰腺内分泌祖细胞”或“内分泌祖细胞”在本文中可互换使用，是指能够变成胰腺激素表达细胞的胰腺内胚层细胞。胰腺内分泌祖细胞表达下述标志物中的至少一者：NGN3，NKX2.2，NeuroD1，ISL1，PAX4，PAX6或ARX。胰腺内分泌祖细胞可以通过它们的NKX2.2和NeuroD1表达来表征。

术语“其前体细胞”在涉及胰腺内分泌祖细胞时，是指当在适合于所述前体细胞分化成胰腺前内分泌细胞(pancreatic pro endocrine cell.)的条件下培养时，能够分化成胰腺内分泌祖细胞的任何细胞，包括例如多能干细胞、定形内胚层细胞、肠管细胞或胰腺祖细胞。

当在本文中使用时，“胰腺内分泌细胞”是指能够表达下述激素中的至少一者的细胞：胰岛素，胰高血糖素，生长抑素，胃饥饿素和胰多肽。除了这些激素之外，胰腺内分泌细胞特有的标志物包括NGN3、NeuroD1、ISL1、PDX1、NKX6.1、PAX4、ARX、NKX2.2和PAX6中的一者或多者。表达β细胞特有的标志物的胰腺内分泌细胞可以通过它们的胰岛素和至少一种下述转录因子的表达来表征：PDX1，NKX2.2，NKX6.1，NeuroD1，ISL1，HNF30，MAFA和PAX6。

术语“干细胞来源的β细胞”和“SC-β细胞”在本文中可互换使用，是指在体外分化的(例如从多能干细胞)的非本源的细胞，其表现出至少一种指示胰腺β细胞的标志物(例如PDX-1或NKX6-1)，表达胰岛素，并在体外和体内两种情况下表现出内源性成熟β细胞特有的GSIS响应。所述SC-β细胞的GSIS响应可以在SC-β细胞移植到宿主(例如人类或动物)中两周之内观察到。应该理解，SC-β细胞不必定源自于(例如直接地)干细胞，因为本公开的方法能够使用任何细胞作为起始点，从表达胰岛素的任何内分泌祖细胞或其前体细胞来衍生SC-β细胞(例如人们可以使用胚胎干细胞、诱导的多能干细胞、祖细胞、部分重编程的体细胞(例如已被部分重编程到介于诱导的多能干细胞与它所源自的体细胞之间的中间状态的体细胞)、多能细胞、全能细胞、任何上述细胞的转分化的形式等，因为本发明不打算以这种方式进行限制)。在某些情况下，排除了从专一地通过需要破坏胚胎的方法获得的人类胚胎干细胞衍生的人类细胞。本领域技术人员非常了解这些方法，并且了解出于按照本发明的方法产生SC-β细胞的目的如何避开它们。

“d1”、“1d”和“第1天”，“d2”、“2d”和“第2天”等在本文中可互换使用。这些数字字母组合是指在本申请的逐步分化流程期间的不同阶段中温育的具体天。

产生SC-β细胞的方法

最近，已报道了两种流程用于引导多能干细胞分化成表达成熟的胰腺β细胞的关键标志物的产胰岛素内分泌细胞(例如SC-β细胞)，每种流程包括将细胞分化成可以被引导以分化成SC-β细胞的内分泌祖细胞，以及用于引导所述胰腺内分泌祖细胞分化成SC-β细胞的流程，其可用于本文中公开的产生SC-β细胞的方法中。首先，正如在图3B中所示，将使用人类多能干细胞(hPSC)，通过在三维细胞培养系统中顺序调制多个信号传导途径，不使用任何转入基因或遗传修饰的用于大规模生产有功能的人类β细胞的6阶段流程，用于产生表现出关键的β细胞标志物和β细胞超结构的葡萄糖响应性、产生单一激素胰岛素的细胞(参见Pagliuca等，2014，和PCT国际申请号PCT/US2014/041992，两者整体通过参考并入本文)。Pagliuca和同事报道了这些细胞在体外和体内模拟人类胰岛的功能，并证实了这些细胞用于体内移植以治疗糖尿病的潜在用途。其次，描述了在体外使用静态温育将人类胚胎干细胞(hESC)转变成表达成熟胰腺β细胞的关键标志物例如AFA并表现出与人类胰岛类似的葡萄糖刺激的胰岛素分泌的产胰岛素细胞的7阶段的流程(Rezania等，2014)。已发现，通过这种流程产生的被称为S7细胞的细胞在小鼠中在略微超过一个月的时间内快速逆转糖尿病。

图4A示出了按照本发明的实施方式产生SC-β细胞的示例性方法，所述方法产生更大的细胞簇，其包含更大数目的表现出更纯的内分泌群体的SC-β细胞和更大数目的表现出NKX6.1和C-肽的共表达的SC-β细胞。

根据本发明的示例性实施方式，用于产生干细胞来源的β(SC-β)细胞的方法包括将被引导以向SC-β细胞分化的细胞群体在促进细胞簇集的条件下与下述药剂相接触：a)当所述细胞群体包含i)分化成PDX1+胰腺祖细胞的FOXA2+、SOX2+原始前肠细胞，ii)分化成PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞的PDX1+胰腺祖细胞，和/或iii)分化成嗜铬粒蛋白A、NKX6.1+内分泌祖细胞的PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞时，有效量的降低rho相关蛋白激酶(Rock)的水平和/或活性的药剂；b)当所述细胞群体包含ii)分化成PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞的PDX1+胰腺祖细胞时，有效量的TGF-β超家族成员；以及c)当所述细胞群体包含iii)分化成嗜铬粒蛋白A、NKX6.1+内分泌祖细胞的PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞时，有效量的蛋白激酶抑制剂，由此产生SC-β细胞。

当在本文中使用时，“接触”、“将细胞接触”及其任何衍生语，是指将药剂(例如核酸、肽、核酶、抗体、小分子等)引入到靶细胞中或细胞所存在的环境(例如细胞培养物)中的任何手段，包括化学和物理手段，不论是直接还是间接的。接触还打算涵盖通过病毒或非病毒载体将细胞暴露于药剂，将药剂递送到细胞，或用药剂“装载”细胞的方法，其中这种药剂在递送后具有生物活性。针对具体药剂和用途选择递送方法。正如在医学领域中已知的，影响递送的参数可以包括尤其是被影响的细胞类型和细胞位置。在某些情况下，接触包括将所述药剂给药到对象。在某些情况下，接触是指将细胞或细胞所处的环境(例如细胞培养基)暴露于至少一种降低Rock的水平和/或活性的药剂(在本文中也被称为“ROCK抑制剂”)。在某些情况下，接触是指将细胞或细胞所处的环境(例如细胞培养基)暴露于TGF-β超家族成员(例如激活素A)。在某些情况下，接触是指将细胞或细胞所处的环境(例如细胞培养基)暴露于蛋白激酶抑制剂(例如星孢菌素)。

根据本发明的某些方面，所述方法包括以下任选的步骤：在所述PDX1+胰腺祖细胞已分化成PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞之后洗涤所述细胞群体，以在将所述细胞群体与星孢菌素接触之前解除激活素A与所述细胞群体的接触。

本发明的方法设想了：i)将细胞或细胞群体(例如包含S2、S3和S4细胞)与有效量的一种或多种Rock抑制剂相接触；ii)将细胞或细胞群体(例如包含S3细胞)与有效量的TGF-β超家族成员(例如激活素A)相接触；以及iii)将细胞或细胞群体(例如包含S4细胞)与有效量的蛋白激酶抑制剂(例如星孢菌素)相接触。药剂(或含有这种药剂的组合物)的“有效量”是指当例如按照所选的给药形式、途径和/或日程安排递送到细胞或对象时，足以实现所需效果的量。正如本领域普通技术人员将会认识到的，有效的特定药剂或组合物的绝对量可能随着多种因素而变，例如所需的生物学或药理学终点、待递送的药剂、靶组织等。本领域普通技术人员还将理解，“有效量”可以在单一药剂中与细胞相接触或给药，或者所需效果可以通过使用多个药剂来实现。组合物的有效量可以是足以减轻障碍(例如糖尿病)的一种或多种症状或征兆的严重性或预防所述一种或多种症状或征兆的量。在某些情况下，所述降低ROCK的水平和/或活性的药剂的有效量包含约0.1μΜ至约110μΜ之间的浓度。在某些情况下，所述药剂(例如ROCK抑制剂)的有效量包含10μΜ。在某些情况下，所述TGF-β超家族成员的有效量包含约1ng/ml至约1000ng/ml之间的浓度。在某些情况下，所述TGF-β超家族成员的有效量包含5ng/ml。在某些情况下，所述蛋白激酶抑制剂的有效量包含约0.1nM至110nM之间的浓度。在某些情况下，所述蛋白激酶抑制剂的有效量包含3nM的浓度。

本发明设想了在产生SC-β细胞的方法中使用任何降低ROCK的水平和/或活性的药剂，例如ROCK抑制剂可以是小的有机或无机分子，糖类，寡糖，多糖，生物大分子例如肽、蛋白质以及肽类似物和衍生物，肽模拟物，核酸及核酸类似物和衍生物(包括但不限于microRNA、siRNA、shRNA、反义RNA、核酶和适体)，从生物材料例如细菌、植物、真菌或动物细胞制造的提取物，动物组织，天然存在或合成的组合物，及其任何组合。

示例性的ROCK抑制剂包括但不限于选自下述的小的有机分子ROCK抑制剂：N-[(1S)-2-羟基-1-苯基乙基]-N’-[4-(4-吡啶基)苯基]-脲(AS1892802)，盐酸法舒地尔(也被称为HA 1077)，-[3-[[2-(4-氨基-1,2,5-

二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧基]苯基]-4-[2-(4-吗琳基)乙氧基]苯甲酰胺(GSK269962)，4-[4-(三氟甲基)苯基]-N-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-2-甲基-6-氧代-1,4,5,6-四氢-3-吡啶甲酰胺(GSK429286)，(S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]-六氢-1H-1,4-二氮杂环庚烷二盐酸盐(Η1152二盐酸盐)，(S)-(+)-4-甘氨酰基-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]-六氢-1H-1,4-二氮杂环庚烷二盐酸盐(甘氨酰基-H1152二盐酸盐)，N-[(3-羟基苯基)甲基]-N’-[4-(4-吡啶基)-2-噻唑基]脲二盐酸盐(RKI 1447二盐酸盐)，(3S)-1-[[2-(4-氨基-1,2,5-

二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-7-基]羰基]-3-吡咯烷胺二盐酸盐(SB772077B二盐酸盐)，N-[2-[2-(二甲基氨基)乙氧基]-4-(1H-吡唑-4-基)苯基-2,3-二氢-1,4-苯并二

英-2-甲酰胺二盐酸盐(SR 3677二盐酸盐)和反式-4-[(1R)-1-氨基乙基]-N-4-吡啶基环己烷甲酰胺二盐酸盐(Y-27632二盐酸盐)，N-苯甲基-[2-(嘧啶-4-基)氨基]噻唑-4-甲酰胺(Thiazovivin)，Rock抑制剂，一种异喹啉磺酰胺化合物(Rho激酶抑制剂)，N-(4-吡啶基)-N’-(2,4,6-三氯苯基)脲(Rho激酶抑制剂II)，3-(4-吡啶基)-1H-吲哚(Rho激酶抑制剂III，Rockout)和4-吡唑硼酸频哪醇酯，可以从Santa Cruz Biotechnology商购的Rock抗体，其选自Rock-1(B1)、Rock-1(C-19)、Rock-1(H-11)、Rock-1(G-6)、Rock-1(H-85)、Rock-1(K-18)、Rock-2(C-20)、Rock-2(D-2)、Rock-2(D-11)、Rock-2(N-19)、Rock-2(H-85)、Rock-2(30-J)，ROCK CRISPR/Cas9敲除质粒，其选自Rock-1 CRISPR/Cas9KO质粒(h)、Rock-2 CRISPR/Cas9 KO质粒(h)、Rock-1 CRISPR/Cas9KO质粒(m)、Rock-2 CRISPR/Cas9 KO质粒(m)，ROCK siRNA、shRNA质粒和/或shRNA慢病毒粒子基因沉默物，其选自Rock-1siRNA(h):sc-29473、Rock-1siRNA(m):sc-36432、Rock-1siRNA(r):sc-72179、Rock-2siRNA(h):sc-29474、Rock-2siRNA(m):sc-36433、Rock-2siRNA(r):sc-108088。

在某些情况下，ROCK抑制剂将接触过的细胞中的ROCK水平和/或活性相对于不存在与ROCK抑制剂的接触的细胞中的ROCK水平或活性降低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。尽管不需要，但ROCK抑制剂可以完全抑制细胞中的ROCK水平和/或活性。应该认识到，ROCK抑制剂可以降低其中S2、S3和/或S4细胞正在分化的群体中的任何细胞(包括群体中的内分泌祖细胞、SC-β细胞及其任何前体细胞)中的ROCK水平和/或活性。

根据本发明的某些方面，所述药剂(例如ROCK抑制剂)包含Y-27632。

在本发明的方法中使用的Y-27632的有效量可以例如在约0.1μΜ至约110μΜ之间。在某些情况下，Y-27632的有效量包含10μΜ。

本发明设想了使用任何TGF-β超家族成员的药剂。示例性的这种成员包括但不限于Nodal、激活素A、激活素B、骨形态发生蛋白-2(BMP2)、骨形态发生蛋白-4(BMP4)及其有功能的片段。根据本发明的某些方面，所述TGF-β超家族成员包含激活素A。

在本发明的方法中使用的激活素A的有效量可以例如在约1ng/ml至约1000ng/ml之间。根据本发明的某些方面，激活素A的有效量包含5ng/ml的浓度。

本发明设想了在用于产生SC-β细胞的方法中使用任何能够产生接近纯的内分泌群体或增加群体中共表达NKX6.1+、C-肽的细胞的数目的蛋白激酶抑制剂。

根据本发明的某些方面，所述蛋白激酶抑制剂包含星孢菌素。在本发明的方法中使用的星孢菌素的有效量可以例如在约0.1nM至约110nM之间。根据本发明的某些方面，星孢菌素的有效量包含3nM的浓度。

根据本发明的某些方面，正如在图4B中所示，将包含ii)分化成PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞的PDX1+胰腺祖细胞的细胞群体暴露于所述药剂和TGF-β超家族成员(例如激活素A)6天的时间段。

优选地，所述群体中最大数目的细胞在分化成SC-β细胞之前分化成嗜铬粒蛋白A、NKX6.1+内分泌祖细胞。所述群体中，在分化成SC-β细胞之前分化成嗜铬粒蛋白A、NKX6.1+内分泌祖细胞的细胞的数目为5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或更多。根据本发明的某些方面，至少在75％至80％之间的所述细胞群体在分化成SC-β细胞之前分化成嗜铬粒蛋白A、NKX6.1+内分泌祖细胞。

通过所述产生SC-β细胞的方法获得的SC-β细胞

根据本发明的实施方式，提供了按照本文中描述的方法产生的分离的SC-β细胞或其群体。所述分离的SC-β细胞或群体在体外和体内两种情况下表现出GSIS响应。所述分离的SC-β细胞或群体还表现出成熟的内源性β细胞的至少一种特征性特点(例如单激素性)。在某些情况下，分离的SC-β细胞或其群体表现出约0.1至约3.0之间的刺激指数。在某些情况下，分离的SC-β细胞或其群体在高葡萄糖浓度下每10⁶个总细胞每30分钟温育产生大约300uIU至约4000uIU。

本文公开的SC-β细胞共有本源β细胞的许多区别性特点，但是在某些方面是不同的(例如基因表达情况)。在某些实施方式中，所述SC-β细胞是非本源的。当在本文中使用时，“非本源的”意味着所述SC-β细胞与自然界中存在的β细胞即本源β细胞在某些方面显著不同。然而，应该认识到，这些显著差异通常涉及结构特点，其可能引起SC-β细胞表现出某些功能差异，例如，尽管SC-β细胞的基因表达模式不同于本源β细胞，SC-β细胞的行为类似于本源β细胞，但与本源β细胞相比某些功能可能改变(例如提高)。例如，与本源β细胞的频率相比，SC-β细胞对20mM葡萄糖做出响应的频率更高。对于本领域技术人员来说，在本文公开的数据的基础上，SC-β细胞与本源β细胞之间的其他差异将是显而易见的。

本公开的SC-β细胞共有β细胞的许多区别性特点，这些特点对正常β细胞功能来说是重要的。例如，按照本文描述的方法产生的SC-β细胞(例如人类)可能进一步表现出内源性成熟胰腺β细胞的至少一种下述特征：i)与内源性胰岛的响应类似的对多次葡萄糖激惹的响应(例如至少一次、至少两次或至少三次或更多次连续的葡萄糖激惹)；ii)形态类似于内源性β细胞的形态；iii)将胰岛素包装在分泌颗粒或包封的结晶胰岛素颗粒中；iv)高于至少1.4的刺激指数；v)对细胞因子做出响应的细胞因子诱导的凋亡；vi)对已知的抗糖尿病药物(例如促分泌素)做出响应的提高的胰岛素分泌；vii)单激素性，即它们不异常地共表达其他激素，例如胰高血糖素、生长抑素或胰多肽；viii)低的复制率；以及ix)对葡萄糖做出响应的提高的细胞内Ca²⁺。

根据本发明的实施方式，提供了一种微胶囊，所述微胶囊含有包封在其中的所述分离的SC-β细胞或其群体。

根据本发明的实施方式，提供了一种宏包封装置，所述宏包封装置包含所述分离的SC-β细胞或其群体。

根据本发明的实施方式，提供了一种细胞系，其包含稳定地表达胰岛素的分离的SC-β细胞。

测定法

根据本发明的实施方式，按照本文中的方法产生的分离的SC-β细胞或其群体或稳定地表达胰岛素的SC-β细胞，可用于各种不同测定法中。在某些情况下，分离的SC-β细胞、其群体或稳定地表达胰岛素的SC-β细胞可用于测定法中，以鉴定一种或多种促进或抑制选自β细胞增殖、β细胞复制、β细胞死亡、β细胞功能、β细胞对免疫攻击的易感性和β细胞对去分化或分化的易感性的β细胞命运的候选药剂。在某些情况下，分离的SC-β细胞、其群体或稳定地表达胰岛素的SC-β细胞可用于测定法中，以鉴定一种或多种促进至少一种胰岛素阳性内分泌细胞或其前体细胞分化成至少一种SC-β细胞的候选药剂。所述测定法通常包括：将所述分离的SC-β细胞、其群体或稳定地表达胰岛素的SC-β细胞与一种或多种待评估其i)促进或抑制选自β细胞增殖、β细胞复制、β细胞死亡、β细胞功能、β细胞对免疫攻击的易感性和β细胞对去分化或分化的易感性的β细胞命运，或ii)促进至少一种胰岛素阳性内分泌细胞或其前体细胞分化成至少一种SC-β细胞的能力的候选药剂相接触；以及评估所述候选药剂是否具有所述i)促进或抑制选自β细胞增殖、β细胞复制、β细胞死亡、β细胞功能、β细胞对免疫攻击的易感性和β细胞对去分化或分化的易感性的β细胞命运，或ii)促进至少一种胰岛素阳性内分泌细胞或其前体细胞分化成至少一种SC-β细胞的能力。

治疗方法

根据本发明的实施方式，提供了用于治疗有需要的对象的方法。所述方法需要向有需要的对象给药分离的SC-β细胞群体或包含包封在其中的SC-β细胞的微胶囊。在某些情况下，所述对象需要额外的β细胞。在某些情况下，所述对象患有糖尿病或具有发生糖尿病的提高的风险。通过本发明的方法产生的SC-β细胞或SC-β细胞的群体(例如分离的群体)可以给药到对象，用于治疗1型或2型糖尿病。在某些情况下，所述对象患有代谢障碍或具有发生代谢障碍的提高的风险。在某些情况下，向所述对象给药包括将SC-β细胞、包含SC-β细胞的微胶囊或包含SC-β细胞的宏包封装置植入到所述对象中。所述对象可以是人类对象或动物对象。在某些情况下，所述细胞可以作为分散的细胞或形成细胞簇植入，其可以输注到肝门静脉中。在某些情况下，细胞可以被提供在生物相容的可降解聚合支持物中、多孔的不可降解的装置中，或者被包封以保护其免于宿主免疫应答。细胞可以被植入到接受者中的适合位点内。植入位点包括例如肝、天然胰腺、肾被膜下空间、网膜、腹膜、浆膜下空间、肠、胃或皮下囊袋。

为了进一步增强植入的细胞在体内的分化、存活或活性，可以在细胞给药之前、同时或之后给药其他因子例如生长因子、抗氧化剂或抗炎剂。这些因子可以由内源性细胞分泌并在原位暴露于给药的细胞，可以通过本领域中已知的内源和外源给药的生长因子的任何组合来诱导植入的细胞分化。

在植入中使用的细胞的量取决于多种不同因素，包括患者的状况和对疗法的响应，并且可以由本领域技术人员确定。

在某些情况下，所述治疗方法还包括在植入之前将所述细胞并入到三维支持物中。在植入到患者中之前，细胞可以在体外维持在该支持物上。或者，可以将含有细胞的支持物直接植入到患者中而不需另外的体外培养。所述支持物可以任选地合并有至少一种促进移植的细胞的存活和功能的药剂。

人造胰岛或胰腺

根据本发明的实施方式，提供了人造胰岛或胰腺。所述人造胰岛或胰腺可以使用按照本文描述的方法产生的SC-β细胞来构建。

人造胰腺是包封并滋养郎格罕氏岛以替换被1型糖尿病破坏的胰岛和β细胞的装置。人造胰腺可以含有一百万或更多的胰岛，并且可以植入到腹膜腔中或皮肤下，在那里它可以通过释放激素例如胰岛素对变化的血糖水平做出响应。人造胰腺可以使用活的(例如葡萄糖感应性和胰岛素分泌性胰岛)和非活的部件(例如防护胰岛免受糖尿病患者的身体及其破坏性免疫机制的影响并在同时允许胰岛茁壮成长)来制造。

本发明设想了在任何人造胰腺中使用β细胞。在某些情况下，所述人造胰腺包含微包封的或包被的胰岛，所述胰岛包含按照本文的方法产生的SC-β细胞。在某些情况下，所述人造胰腺包含宏包封装置，包含按照本文的方法产生的SC-β细胞的胰岛细胞被簇集在一起并包封在所述宏包封装置中。在某些情况下，所述宏包封装置包含用于本发明的人造胰腺的PVA水凝胶片(Qi等，2004)。在某些情况下，所述人造胰岛包含按照本文的方法产生的SC-β细胞以及胰岛片形式的其他胰岛细胞(α、δ等)。所述胰岛片包含人造人类胰岛层，其包含被宏包封在膜(例如超纯藻酸盐膜)内的SC-β细胞。所述片膜用网加固并且可以包被在表面上，以阻止包封在内部的细胞与移植接受者的宿主免疫应答之间的接触或使所述接触最小化。氧、葡萄糖和其他营养物容易通过所述膜扩散到片中滋养胰岛，并且激素例如胰岛素容易扩散出去。被设计用于人造胰岛或胰腺的宏包封/植入的膜的其他实例可以在文献中找到(Isayeva等，2003)。适用于人造胰岛或胰腺的宏包封的植入物的另一个实例可以在文献中找到(Aurelien等，2014)。

术语

当在本文中使用时，单数形式应该被理解为包括复数指称物，除非明确指示不是如此。在一个或多个组成员之间包括“或”的权利要求或描述被认为满足如同一个、超过一个或所有的组成员存在于、使用在给定的产品或方法中或以其它方式与所述给定的产品或方法相关，除非指明不是如此或从上下文明显看出不是如此。应该理解，一般来说，当本发明或本发明的方面被称为包含特定要素、特点等时，本发明或本发明的方面的某些实施方式由或基本上由这些要素、特点等构成。出于简化的目的，那些实施方式不是在每种情况下都在本文中具体阐明。还应该理解，可以从权利要求中明确排除本发明的任何实施方式，例如现有技术中存在的任何实施方式，不论在说明书中是否叙述了所述具体的排除。例如，可以从ROCK抑制剂、TGF-β超家族成员和蛋白激酶抑制剂的属类中排除任何药剂。

当在本文中给出范围时，本发明包括了其中包括所述终点的实施方式，其中排除两个终点的实施方式，以及其中包括一个终点并排除另一个终点的实施方式。除非另有指明，否则应该假定两个终点都被包含。此外，应该理解，除非另有指明或从上下文和本领域技术人员的理解明显看出不是如此，否则表述为范围的值在本发明的不同实施方式中可以采用所陈述的范围内的任何特定的值或子范围，直至所述范围的下限的单位的十分之一，除非上下文明确叙述不是如此。还应该理解，当在本文中陈述一系列数值时，本发明包括了类似地涉及任何中间的值或由所述系列中的任两个值定义的范围的实施方式，以及最低值可以被取为最小值并且最高值可以被取为最大值的实施方式。当在本文中使用时，数值包括表示成百分率的值。对于本发明的其中数值带有先行词“约”或“大约”的任何实施方式来说，本发明包括其中叙述了所述准确值的实施方式。对于本发明的其中数值不带有先行词“约”或“大约”的任何实施方式来说，本发明包括其中所述值带有先行词“约”或“大约”的实施方式。“大约”和“约”通常包括在任一方向上(大于或小于所述数字)落于数字的1％的范围之内或在某些实施方式中5％的范围之内的数字，除非另有陈述或从上下文明显看出不是如此(除了这些数字不允许超过可能值的100％之外)。

此外应该理解，本发明涵盖了其中将来自于一个或多个所列出的权利要求的一个或多个限制、要素、条款、描述性术语等引入到从属于同一基本权利要求的另一个权利要求(或者适合时任何其他权利要求)中的所有变化形式、组合和排列，除非另有指明或除非对于本领域普通技术人员来说明显存在矛盾或不一致。当要素作为列表例如以马库什(Markush)组或类似的格式提出时，应该理解也公开了所述要素的每个亚组，并且可以从所述组中除去任何要素。

出于方便的目的，某些权利要求以从属形式提出，但是任何从属性权利要求可以以独立格式重新书写，以包括所述独立权利要求和这个权利要求所从属的任何其他权利要求的限制，并且这种重新书写的权利要求应该被认为在所有方面等同于以独立格式重新书写之前的所述从属权利要求(修改或未修改的)。还应该理解，除非有明确相反的指示，否则在本文要求保护的包括超过一项行动的任何方法中，所述方法的行动的顺序不必定限于所述方法的行动被叙述的顺序，但本发明包括其中顺序受此限制的实施方式。设想了上面描述的所有方面都适用于本发明的所有不同实施方式。还设想了任何上述实施方式可以在适合时与一个或多个其他这种实施方式自由组合。

参考文献

1.Bellin等，(2012)，在1型糖尿病中，强力诱导免疫疗法促进胰岛移植后的长期胰岛素不依赖性(Potent induction immunotherapy promotes long-term insulinindependence after islet transplantation in type1diabetes)，Am.J.Transplant.12,1576-1583。

2.Pagliuca等，(2014)，有功能的人类胰腺β细胞在体外的产生(Generation ofFunctional Human Pancreaticβcells In Vitro)，Cell.159,428-439。

3.Rezania等，(2014)，使用在体外从人类多能干细胞衍生的产胰岛素细胞逆转糖尿病(Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro fromhuman pluripotent stem cells)，Nat.Biotech.32(11),1121-1133。

4.Isayeva等，(2003)，被设计用于胰岛细胞的宏包封/植入的膜的表征和性能(Characterization and performance of membranes designed formacroencapsulation/implantation of pancreatic islet cells)，Biomaterials 24(20),3483-3491。

5.Motté等，(2014)，宏包封的人类胚胎干细胞来源的植入物的组成和功能：与临床人类胰岛细胞移植物的比较(Composition and function of macroencapsulatedhuman embryonic stem cell-derived implants:comparison with clinical humanislet cell grafts)，American Journal of Physiology-Endocrinology andMetabolism 307(9),E838-E846。

6.Qi等(2004)，生物人造胰腺的PVA水凝胶片宏包封(PVA hydrogel sheetmacroencapsulation of the bioartificial pancreas)，Biomaterials 24(27),5885-5892。

Claims (16)

1.一种组合物，其包含rho相关蛋白激酶抑制剂、星孢菌素以及表达PDX1和NKX6.1的胰腺祖细胞群体，其中所述rho相关蛋白激酶抑制剂选自GSK269962、GSK 429286和thiazovivin。

2.权利要求1的组合物，其中所述rho相关蛋白激酶抑制剂是GSK269962或GSK 429286。

3.权利要求1的组合物，其中所述rho相关蛋白激酶抑制剂是thiazovivin。

4.权利要求1-3任一项的组合物，其中所述rho相关蛋白激酶抑制剂在所述组合物中的浓度为0.1μM至约110μM。

5.权利要求1-4任一项的组合物，其中所述胰腺祖细胞群体未被遗传修饰。

6.权利要求1-5任一项的组合物，其中所述星孢菌素在所述组合物中的浓度为0.1nM至约110nM。

7.权利要求1-6任一项的组合物，其中所述组合物还包含XXI。

8.权利要求1-7任一项的组合物，其中所述组合物还包含SANT1。

9.权利要求1-8任一项的组合物，其中所述组合物还包含视黄酸(RA)。

10.权利要求1-9任一项的组合物，其中所述组合物还包含β纤维素。

11.权利要求1-10任一项的组合物，其中所述组合物还包含T3。

12.一种组合物，其包含rho相关蛋白激酶抑制剂、激活素A和包含不表达NKX6.1的PDX1+胰腺祖细胞的细胞群体，其中所述rho相关蛋白激酶抑制剂选自GSK269962、GSK 429286和thiazovivin。

13.权利要求12的组合物，其中所述rho相关蛋白激酶抑制剂是GSK269962或GSK429286。

14.权利要求12的组合物，其中所述rho相关蛋白激酶抑制剂是thiazovivin。

15.权利要求14的组合物，其中所述组合物包含10μM的Thiazovivin。

16.权利要求12-15任一项的组合物，其中所述组合物包含5ng/ml的激活素A。

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