CN111036154A - 基于双水相体系的海藻酸钠-壳聚糖复合微囊制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于双水相体系的海藻酸钠‑壳聚糖复合微囊制备方法。该方法包括微流控芯片的制备、双水相溶液的准备、微流体的操控、海藻酸钠‑壳聚糖复合微囊的形成和表征等。本发明以集成了气动泵阀的微流控芯片为技术平台，以双水相体系为成型模板，通过一步法将分子表面具有相反电荷的海藻酸钠和壳聚糖精准可控地制备为复合微囊。该微囊可用于生物活性物质的负载与运输，如蛋白类药物、益生菌和细胞等，在疾病治疗、生物工程和再生医学等领域发挥巨大作用。

Description

基于双水相体系的海藻酸钠-壳聚糖复合微囊制备方法

技术领域

本发明属于微流控技术、材料化学等领域，具体涉及一种基于双水相体系的海藻酸钠-壳聚糖复合微囊制备方法。

背景技术

海藻酸钠和壳聚糖作为两种天然水凝胶类物质，由于其高含水性、良好的生物相容性和较为温和的成胶条件而被广泛应用于生物、医学、药学、食品等领域。这两种物质的分子表面均具有大量的剩余电荷(海藻酸钠带负电，壳聚糖带正电)，因此可以还看作是两种天然的聚电解质，两者之间也可直接在水溶液中发生反应，得到复合聚合物。该类聚合物的形貌可以是薄膜、微球和微囊等，由于其良好的生物相容性和机械强度被广泛应用于食品工程、药物载体、组织工程等领域。

在海藻酸钠-壳聚糖复合材料形成的多种形貌中，微囊被认为是一种很好的微型载体，可以用于药物、细菌、细胞等的负载和递送，在生物、医学、药学等领域具有广阔的应用前景。但传统的微囊成型法往往涉及多步操作，首先需制备实心的海藻酸钠微球，然后在微球表面层层组装壳聚糖和海藻酸钠，最后再将内部的海藻酸钠溶解得到空心微囊。这样的制备过程复杂、耗时，且对被负载物的损伤大、负载效率低，不利于微囊的广泛应用。

近年来，微流控液滴技术得到了长足的发展，可以精确制备出多种不同形貌的功能化微球和微囊，在材料学、生物学和药学等领域做出了很大的贡献。而双水相体系向微流控液滴领域的引进，使得制备更复杂形貌的微球和微囊成为了可能。并且得益于微流控技术精确可控和高通量等优势，这些制备的产物产业化的可能性大大增加。本发明利用集成了气动泵阀的微流控芯片和双水相体系，在芯片内通过一步法制得了形貌可控、产量较高的海藻酸钠-壳聚糖复合微囊。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于双水相体系的海藻酸钠-壳聚糖复合微囊制备方法，致力于为药学、再生医学和食品工程等的发展提供前期技术支持。

本发明的技术解决方案是：一种基于双水相体系的海藻酸钠-壳聚糖复合微囊制备方法，包括下列步骤：

(1)微流控芯片的制备：利用常规软光刻的方法，制备集成了气动泵阀的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片；该芯片用于生成液滴模板和制备海藻酸钠-壳聚糖复合微囊，

所述芯片包括含壳聚糖的连续相入口，连续相入口,气体入口，含海藻酸钠的分散相入口，微囊出口，含壳聚糖的连续相通道，连续相通道，气体通道，含海藻酸钠的分散相通道，液滴模板形成通道和微囊形成通道,气动微阀，交叉口1和交叉口2组成；

含壳聚糖的连续相入口通过含壳聚糖的连续相通道、交叉口2和微囊形成通道与微囊出口相连；连续相入口和含海藻酸钠的分散相入口分别通过连续相通道和含海藻酸钠的分散相通道与交叉口1相连，再通过液滴模板形成通道交叉口2和微囊形成通道与微囊出口相连；气体入口通过气体通道与气动微阀相连；

(2)双水相溶液的准备：将海藻酸钠溶于葡聚糖水溶液作为含海藻酸钠的分散相，以聚乙二醇(PEG)水溶液为连续相，将壳聚糖溶于PEG水溶液作为含壳聚糖的连续相。含海藻酸钠的分散相中可以混合水溶性药物、益生菌或细胞实现相应物质的负载；

(3)微流体的操控：含壳聚糖的连续相通过入口进入微流控芯片中，然后沿着含壳聚糖的连续相通道到达交叉口2；连续相，压缩空气和含海藻酸钠的分散相依次通过连续相入口，气体入口和含海藻酸钠的分散相入口进入微流控芯片中，然后依次沿着连续相通道，气体通道和含海藻酸钠的分散相通道到达交叉口1，其中的压缩空气将驱动气动泵阀发生周期性的膨胀，从而挤压含海藻酸钠的分散相通道，促进含海藻酸钠的分散相液滴的形成；

(4)海藻酸钠-壳聚糖复合微囊的形成和表征：步骤(3)中形成的含海藻酸钠的分散相液滴将经由液滴模板形成通道到达交叉口2，并在此处与含壳聚糖的连续相接触，液滴表面带有负电荷的海藻酸钠分子与液滴外带有正电荷的壳聚糖在液滴表面发生交联反应，形成以含海藻酸钠的分散相液滴为模板的海藻酸钠-壳聚糖复合微囊。该复合微囊可藉由光学显微镜和电子显微镜等手段进行表征，以观察其形貌和尺寸等。

所述泵阀与分散相通道间距40-60μm，泵阀间的分散相通道宽40-60μm，所有通道宽度及高度均为100-400μm。

所使用的PEG分子量范围：4000-20000Da、浓度范围：5-50％(g/ml)；葡聚糖分子量范围：70k-500kDa、浓度范围：5-20％(g/ml)；海藻酸钠粘度范围：55-850cps、浓度范围：0.5-2％(g/ml)；壳聚糖粘度范围：100-400cps、浓度范围：0.5-3％(g/ml)。

所施加的含壳聚糖的连续相流速范围：2-6ul/min；连续相流速范围：1-4ul/min；气体气压范围：10-60kPa；含海藻酸钠的分散相流速范围：0.1-0.4ul/min；气动泵阀运行周期范围：0.1-0.8s。

本发明以集成了气动泵阀的微流控芯片为技术平台，以双水相体系为成型模板，通过一步法将分子表面具有相反电荷的海藻酸钠和壳聚糖精准可控地制备为复合微囊。该微囊可用于生物活性物质的负载与运输，如蛋白类药物、益生菌和细胞等，在疾病治疗、生物工程和再生医学等领域发挥巨大作用。

附图说明

图1是微流控芯片结构示意图。

图2是实施例1中复合微囊光学显微镜表征图(标尺：200μm)。

图3是实施例2中复合微囊表征图，其中：a光学显微镜表征图(标尺：100μm)；b扫描电子显微镜(SEM)表征图(标尺：100μm)。

图4是实施例3中复合微囊负载胰岛细胞的表征图，其中：a光学显微镜表征图；b荧光显微镜表征图(标尺：50μm)。

具体实施方式

在利用微加工技术制得的微流控芯片中，依次通入双水相体系的几个流体，并通过对气动泵阀的操控实现海藻酸钠-壳聚糖复合微囊的可控一步制备。制得的微囊可以利用光学显微镜和电子显微镜等进行表征。下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

一种基于双水相体系的海藻酸钠-壳聚糖复合微囊制备法，包括下列步骤：

(1)微流控芯片的制备：利用常规软光刻的方法，制备集成了气动泵阀的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片；该芯片用于生成液滴模板和制备海藻酸钠-壳聚糖复合微囊，

所述芯片包括含壳聚糖的连续相入口1，连续相入口2,气体入口3，含海藻酸钠的分散相入口4，微囊出口5，含壳聚糖的连续相通道6，连续相通道7，气体通道8，含海藻酸钠的分散相通道9，液滴模板形成通道10和微囊形成通道11,气动微阀12，交叉口1(13)和交叉口2(14)组成；

含壳聚糖的连续相入口1通过含壳聚糖的连续相通道6、交叉口2(14)和微囊形成通道11与微囊出口5相连；连续相入口2和含海藻酸钠的分散相入口4分别通过连续相通道7和含海藻酸钠的分散相通道9与交叉口1(13)相连，再通过液滴模板形成通道10交叉口2(14)和微囊形成通道11与微囊出口5相连；气体入口3通过气体通道8与气动微阀12相连；如图1所示。其中，泵阀与分散相通道间距40μm，泵阀间的分散相通道宽40μm，所有通道宽度及高度均为150μm。

含壳聚糖的连续相入口1通过含壳聚糖的连续相通道6、交叉口2(14)和微囊形成通道11与微囊出口5相连；连续相入口2和含海藻酸钠的分散相入口4分别通过连续相通道7和含海藻酸钠的分散相通道9与交叉口1(13)相连，再通过液滴模板形成通道10交叉口2(14)和微囊形成通道11与微囊出口5相连；气体入口3通过气体通道8与气动微阀12相连；

(2)双水相溶液的准备：将海藻酸钠溶于葡聚糖水溶液作为含海藻酸钠的分散相，以聚乙二醇(PEG)水溶液为连续相，将壳聚糖溶于PEG水溶液作为含壳聚糖的连续相。所使用的PEG分子量：6000Da、浓度：10％(g/ml)；葡聚糖分子量：70kDa、浓度：5％(g/ml)；海藻酸钠粘度：55cps、浓度：0.5％(g/ml)；壳聚糖粘度：100cps、浓度：0.5％(g/ml)。

(3)微流体的操控：含壳聚糖的连续相通过入口1进入微流控芯片中，然后沿着含壳聚糖的连续相通道6到达交叉口2(14)；连续相，压缩空气和含海藻酸钠的分散相依次通过连续相入口2，气体入口3和含海藻酸钠的分散相入口4进入微流控芯片中，然后依次沿着连续相通道7，气体通道8和含海藻酸钠的分散相通道9到达交叉口1(13)，其中的压缩空气将驱动气动泵阀发生周期性的膨胀，从而挤压含海藻酸钠的分散相通道9，促进含海藻酸钠的分散相液滴的形成。其中，含壳聚糖的连续相流速：2ul/min；连续相流速：2ul/min；气体气压：10kPa；含海藻酸钠的分散相流速：0.1ul/min；气动泵阀运行周期：0.2s。

(4)海藻酸钠-壳聚糖复合微囊的形成和表征：步骤(3)中形成的含海藻酸钠的分散相液滴将经由液滴模板形成通道10到达交叉口2(14)，并在此处与含壳聚糖的连续相接触，液滴表面带有负电荷的海藻酸钠分子与液滴外带有正电荷的壳聚糖在液滴表面发生交联反应，形成以含海藻酸钠的分散相液滴为模板的海藻酸钠-壳聚糖复合微囊。该复合微囊可藉由光学显微镜来进行表征，以观察其形貌和尺寸等，如图2所示。

实施例2

一种基于双水相体系的海藻酸钠-壳聚糖复合微囊制备法，包括下列步骤：

(1)微流控芯片的制备：利用常规软光刻的方法，制备集成了气动泵阀的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片；该芯片用于生成液滴模板和制备海藻酸钠-壳聚糖复合微囊，

所述芯片包括含壳聚糖的连续相入口1，连续相入口2,气体入口3，含海藻酸钠的分散相入口4，微囊出口5，含壳聚糖的连续相通道6，连续相通道7，气体通道8，含海藻酸钠的分散相通道9，液滴模板形成通道10和微囊形成通道11,气动微阀12，交叉口1(13)和交叉口2(14)组成；

含壳聚糖的连续相入口1通过含壳聚糖的连续相通道6、交叉口214和微囊形成通道11与微囊出口5相连；连续相入口2和含海藻酸钠的分散相入口4分别通过连续相通道7和含海藻酸钠的分散相通道9与交叉口1(13)相连，再通过液滴模板形成通道10交叉口2(14)和微囊形成通道11与微囊出口5相连；气体入口3通过气体通道8与气动微阀12相连；如图1所示。其中，泵阀与分散相通道间距60μm，泵阀间的分散相通道宽60μm，所有通道宽度及高度均为400μm。

(2)双水相溶液的准备：将海藻酸钠溶于葡聚糖水溶液作为含海藻酸钠的分散相，以聚乙二醇(PEG)水溶液为连续相，将壳聚糖溶于PEG水溶液作为含壳聚糖的连续相。所使用的PEG分子量：20000Da、浓度：40％(g/ml)；葡聚糖分子量：500kDa、浓度：20％(g/ml)；海藻酸钠粘度：850cps、浓度：2％(g/ml)；壳聚糖粘度：400cps、浓度：3％(g/ml)。

(3)微流体的操控：含壳聚糖的连续相通过入口1进入微流控芯片中，然后沿着含壳聚糖的连续相通道6到达交叉口2(14)；连续相，压缩空气和含海藻酸钠的分散相依次通过连续相入口2，气体入口3和含海藻酸钠的分散相入口4进入微流控芯片中，然后依次沿着连续相通道7，气体通道8和含海藻酸钠的分散相通道9到达交叉口1(13)，其中的压缩空气将驱动气动泵阀发生周期性的膨胀，从而挤压含海藻酸钠的分散相通道9，促进含海藻酸钠的分散相液滴的形成。其中，含壳聚糖的连续相流速：6ul/min；连续相流速：4ul/min；气体气压：60kPa；含海藻酸钠的分散相流速：0.4ul/min；气动泵阀运行周期：0.8s。

(4)海藻酸钠-壳聚糖复合微囊的形成和表征：步骤(3)中形成的含海藻酸钠的分散相液滴将经由液滴模板形成通道10到达交叉口2(14)，并在此处与含壳聚糖的连续相接触，液滴表面带有负电荷的海藻酸钠分子与液滴外带有正电荷的壳聚糖在液滴表面发生交联反应，形成以含海藻酸钠的分散相液滴为模板的海藻酸钠-壳聚糖复合微囊。该复合微囊可藉由光学显微镜和电子显微镜来进行表征，以观察其形貌和尺寸等，如图3所示。

实施例3

一种基于双水相体系的海藻酸钠-壳聚糖复合微囊制备法，包括下列步骤：

(1)微流控芯片的制备：利用常规软光刻的方法，制备集成了气动泵阀的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片；该芯片用于生成液滴模板和制备海藻酸钠-壳聚糖复合微囊，

所述芯片包括含壳聚糖的连续相入口1，连续相入口2,气体入口3，含海藻酸钠的分散相入口4，微囊出口5，含壳聚糖的连续相通道6，连续相通道7，气体通道8，含海藻酸钠的分散相通道9，液滴模板形成通道10和微囊形成通道11,气动微阀12，交叉口1(13)和交叉口2(14)组成；

含壳聚糖的连续相入口1通过含壳聚糖的连续相通道6、交叉口2(14)和微囊形成通道11与微囊出口5相连；连续相入口2和含海藻酸钠的分散相入口4分别通过连续相通道7和含海藻酸钠的分散相通道9与交叉口1(13)相连，再通过液滴模板形成通道10交叉口2(14)和微囊形成通道11与微囊出口5相连；气体入口3通过气体通道8与气动微阀12相连；如图1所示。其中，泵阀与分散相通道间距60μm，泵阀间的分散相通道宽50μm，所有通道宽度及高度均为350μm。

(2)双水相溶液的准备：将海藻酸钠溶于葡聚糖水溶液作为含海藻酸钠的分散相，以聚乙二醇(PEG)水溶液为连续相，将壳聚糖溶于PEG水溶液作为含壳聚糖的连续相。在含海藻酸钠的分散相中混入浓度约为10⁷/ml的胰岛细胞(β-TC6)进行负载。所使用的PEG分子量：20000Da、浓度：17％(g/ml)；葡聚糖分子量：500kDa、浓度：15％(g/ml)；海藻酸钠粘度：55cps、浓度：1％(g/ml)；壳聚糖粘度：200cps、浓度：1％(g/ml)。

(3)微流体的操控：含壳聚糖的连续相通过入口1进入微流控芯片中，然后沿着含壳聚糖的连续相通道6到达交叉口2(14)；连续相，压缩空气和含海藻酸钠的分散相依次通过连续相入口2，气体入口3和含海藻酸钠的分散相入口4进入微流控芯片中，然后依次沿着连续相通道7，气体通道8和含海藻酸钠的分散相通道9到达交叉口1(13)，其中的压缩空气将驱动气动泵阀发生周期性的膨胀，从而挤压含海藻酸钠的分散相通道9，促进含海藻酸钠的分散相液滴的形成。其中，含壳聚糖的连续相流速：4ul/min；连续相流速：2ul/min；气体气压：20kPa；含海藻酸钠的分散相流速：0.2ul/min；气动泵阀运行周期：0.4s。

(4)海藻酸钠-壳聚糖复合微囊的形成和表征：步骤(3)中形成的含海藻酸钠的分散相液滴将经由液滴模板形成通道10到达交叉口2(14)，并在此处与含壳聚糖的连续相接触，液滴表面带有负电荷的海藻酸钠分子与液滴外带有正电荷的壳聚糖在液滴表面发生交联反应，形成以含海藻酸钠的分散相液滴为模板的海藻酸钠-壳聚糖复合微囊。该复合微囊可藉由光学显微镜和荧光显微镜来进行表征，以观察其形貌和尺寸等，如图4所示。

Claims (4)

1.一种基于双水相体系的海藻酸钠-壳聚糖复合微囊制备方法，其特征在于：包括下列步骤：

(1)微流控芯片的制备：利用常规软光刻的方法，制备集成了气动泵阀的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片；该芯片用于生成液滴模板和制备海藻酸钠-壳聚糖复合微囊，

所述芯片包括含壳聚糖的连续相入口(1)，连续相入口(2)，气体入口(3)，含海藻酸钠的分散相入口(4)，微囊出口(5)，含壳聚糖的连续相通道(6)，连续相通道(7)，气体通道(8)，含海藻酸钠的分散相通道(9)，液滴模板形成通道(10)，微囊形成通道(11)，气动微阀(12)，交叉口1(13)和交叉口2(14)组成；

含壳聚糖的连续相入口(1)通过含壳聚糖的连续相通道(6)、交叉口2(14)和微囊形成通道(11)与微囊出口(5)相连；连续相入口(2)和含海藻酸钠的分散相入口(4)分别通过连续相通道(7)和含海藻酸钠的分散相通道(9)与交叉口1(13)相连，再通过液滴模板形成通道(10)交叉口2(14)和微囊形成通道(11)与微囊出口(5)相连；气体入口(3)通过气体通道(8)与气动微阀(12)相连；

(2)双水相溶液的准备：将海藻酸钠溶于葡聚糖水溶液作为含海藻酸钠的分散相，以聚乙二醇(PEG)水溶液为连续相，将壳聚糖溶于PEG水溶液作为含壳聚糖的连续相；

含海藻酸钠的分散相中可以混合水溶性药物、益生菌或细胞实现相应物质的负载；

(3)微流体的操控：含壳聚糖的连续相通过入口(1)进入微流控芯片中，然后沿着含壳聚糖的连续相通道(6)到达交叉口2(14)；连续相，压缩空气和含海藻酸钠的分散相依次通过连续相入口(2)，气体入口(3)和含海藻酸钠的分散相入口(4)进入微流控芯片中，然后依次沿着连续相通道(7)，气体通道(8)和含海藻酸钠的分散相通道(9)到达交叉口1(13)，其中的压缩空气将驱动气动泵阀发生周期性的膨胀，从而挤压含海藻酸钠的分散相通道(9)，促进含海藻酸钠的分散相液滴的形成；

(4)海藻酸钠-壳聚糖复合微囊的形成和表征：步骤(3)中形成的含海藻酸钠的分散相液滴将经由液滴模板形成通道(10)到达交叉口2(14)，并在此处与含壳聚糖的连续相接触，液滴表面带有负电荷的海藻酸钠分子与液滴外带有正电荷的壳聚糖在液滴表面发生交联反应，形成以含海藻酸钠的分散相液滴为模板的海藻酸钠-壳聚糖复合微囊。

2.根据权利要求1所述的一种基于双水相体系的海藻酸钠-壳聚糖复合微囊制备方法，其特征在于：泵阀与分散相通道间距40-60μm，泵阀间的分散相通道宽40-60μm，所有通道宽度及高度均为100-400μm。

3.根据权利要求1所述的一种基于双水相体系的海藻酸钠-壳聚糖复合微囊制备方法，其特征在于：使用的PEG分子量范围：4000-20000Da、浓度范围：5-50％g/ml；葡聚糖分子量范围：70k-500kDa、浓度范围：5-20％g/ml；海藻酸钠粘度范围：55-850cps、浓度范围：0.5-2％g/ml；壳聚糖粘度范围：100-400cps、浓度范围：0.5-3％g/ml。

4.根据权利要求1所述的一种基于双水相体系的海藻酸钠-壳聚糖复合微囊制备方法，其特征在于：含壳聚糖的连续相流速范围：2-6ul/min；连续相流速范围：1-4ul/min；气体气压范围：10-60kPa；含海藻酸钠的分散相流速范围：0.1-0.4ul/min；气动泵阀运行周期范围：0.1-0.8s。

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