CN102698265A - 用于提高对ErbB 拮抗剂癌症治疗的有效应答可能性的基因检测试验 - Google Patents

Abstract

本发明涉及：用于提高对ErbB拮抗剂癌症治疗的有效应答可能性的基因检测试验。本发明提供了一种用ErbB拮抗剂更有效治疗患者的方法，所述患者通过用基因扩增分析被确定为易患或已患过度表达ErbB的肿瘤。这样的方法包括对受试者给予癌症治疗剂量的ErbB拮抗剂，优选还给予化疗制剂，所述受试者经诸如荧光原位杂交等发现，其肿瘤细胞的ErbB有扩增。所述ErbB拮抗剂包括抗HER2抗体。本发明还提供了能为所述治疗提供成分的药物包。

Description

用于提高对ErbB 拮抗剂癌症治疗的有效应答可能性的基因检测试验

本申请是申请日为2001年05月18日、申请号为01812162.4（国际申请号为PCT/US01/16193）、发明名称为“用于提高对ErbB拮抗剂癌症治疗的有效应答可能性的基因检测试验”的发明申请的分案申请。 

生物材料的保藏

以下杂交瘤细胞系保藏在位于美国马里兰州罗克韦尔市的美国典型培养物保藏中心(12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,USA)(ATCC)： 

本申请要求按照35U.S.C.119(e)的规定于2000年5月19日提交的临时申请60/205,754的优先权，该申请已经全文引入本文作参考。 

发明领域

本发明涉及对癌症的治疗，所述癌症的特征在于肿瘤抗原(如ErbB受体，特别是HER2)的过度表达。更具体地，本发明涉及用ErbB拮抗剂，如抗-ErbB抗体，对癌症易感者或癌症患者进行更有效地治疗，所述患者的肿瘤细胞经过基因扩增试验确定为过度表达ErbB。本发明还提供了用于此类治疗的药物包。 

技术背景

对遗传和发育的技术和流行病学的进一步认识，使得有可能将遗传异常与某些恶性疾病以及个体发生特定恶性疾病的危险性的评价联系起来。然而，绝大多数现有用于评估组织中与个体发生恶性疾病相关或有这种倾向性的方法有着众所周知的缺点。例如，需要使组织解集的方法，如Southern, Northern,或Western印迹分析，都由于恶性细胞与来自相同组织的正常或非-恶性细胞混合在一起，而精确性降低。此外，组织结构的破坏导致无法将恶性细胞与遗传异常的存在从形态学特异性的角度来进行联系。这种情况在已知为异质性的组织类型中尤其是个问题，如人的乳腺癌中，在任一个区域都可能存在大量非-恶性细胞。 

her2/neu基因编码一种蛋白产物，常被称为p185HER2。天然p185HER2蛋白是一种膜受体-样的分子，它与表皮生长因子受体(EGFR)具有同源性。对人的乳腺癌中HER2的扩增和过度表达，在某些研究中与较短的无疾病间隔期和较短的总存活率有关(van de Vijer等New Eng.J.Med.317:1239(1988);Walker等Br.J.Cancer 60:426(1989);Tandon等J.Clin.Invest.7:1120(1989);Wright等Cancer Res.49:2087(1989);McCann等Cancer Res51:3296(1991);Paterson等Cancer Res.51:556(1991);and Winstanleyetal.Br.J.Cancer 63:447(1991))而在其它研究中却不是这样(Zhou等Oncogene4:105(1989);Heintz等Arch Path Lab Med 114:160(1990);Kury等Eur.J.Cancer 26:946(1990);Clark等Cancer Res.51:944(1991);and Ravdin等J.Clin.Oncol.12:467-74(1994))。 

在早期对103例乳腺癌患者的评估中，那些有三处以上肿瘤细胞阳性腋下淋巴结(结阳性)的患者，比有不到三处阳性淋巴结的患者，更倾向于过度表达HER2蛋白(Slamon等Science 235:177(1987))。在随后对86例结-阳性乳腺癌患者的评估中，基因扩增、早期复发、以及存活期短之间有显著相关性。HER2的过度表达可以用Southern和Northern印迹确定，它与通过Western印迹和免疫组化(IHC)评测的HER2癌蛋白的表达相关(Slamon等Science 235:177(1987);Slamon等Science 244:707(1989))。结果发现，携带5个以上拷贝的her2基因的患者比未发生基因扩增的患者，中期存活率缩短近5倍。这种相关性甚至在多变量分析中纠正了结的状态和其它预后因素之后仍然存在。在另外187例结-阳性患者中也进行了这些研究，结果表明，基因扩增、mRNA的量增加(通过Northern印迹检测)、以及蛋白的表达增加(通过免疫组化方法检测)也与存活期的缩短有关(Slamon等Science 244:707(1989));(也参见美国专利4,968,603)。Nelson 等用FISH和免疫组化方法测定了乳腺癌中的过度表达，从而比较了her2/neu基因的扩增(Nelson等Modern Pathology 9(1)21A(1996))。 

组织切片的免疫组化染色是一种可靠的评估异质性组织中蛋白变化的方法。免疫组化(IHC)技术利用抗体来原位探测并观察细胞的抗原，主要通过显色反应或荧光方法来进行。该项技术因避免了组织解集的意外后果并允许从形态学角度评估单个细胞而具有优势。此外，在冰冻过程中，靶蛋白不会被改变。 

但是，在临床试验分析(CTA)中，对甲醛固定且石蜡包埋的组织样品进行IHC，相对于冰冻的IHC样品仅有50％-80％的敏感性(Press,Cancer Research 54:2771(1994))。因此，IHC可以导致假阴性结果，使有些能从治疗中受益的患者被排除在治疗之外。 

原位荧光杂交(FISH)是最近开发的一种直接评估完整细胞中基因的存在的方法。FISH是一种很有吸引力的评估石蜡包埋组织中恶性状态的存在的方法，因为它具有细胞特异性，而且克服了交联的问题以及其它由福尔马林固定所导致的蛋白改变的影响。FISH曾经与经典染色方法联合用于寻找遗传异常与细胞形态学的联系(参见，例如，Anastasi等,Blood 77:2456-2462(1991);Anastasi等,Blood 79:1796-1801(1992);Anastasi等,Blood 81:1580-1585(1993);van Lom等,Blood 82:884-888(1992);Wolman等,Diagnostic Molecular Pathology 1(3):192-199(1992);Zitzelberger,Journal of Pathology 172:325-335(1994))。 

到目前为止，未发现her2基因扩增与抗-HER2抗体治疗后果有关，仅与疾病预后有关。标准的分析是对福尔马林固定且石蜡包埋的样品进行IHC。当这些样品的评分为3+或2+时，将患者鉴定为很可能从抗-HER2抗体(如 

)治疗中受益的患者。3+和2+的评分与her2基因扩增有关，可以通过例如FISH来检验。但是，仍然需要更有效的鉴定ErbB拮抗剂成功治疗，如 

成功治疗的候选者。 

发明内容

本发明有利地提供了一种增加ErbB拮抗剂癌症治疗有效性的可能性的方法。该方法包括给予下述受试者癌症治疗剂量的ErbB拮抗剂，该受试者组织样品的肿瘤细胞中的erbB基因被扩增。优选ErbB是HER2。在一 个具体的实施方案中，所述方法还包括给予癌症治疗剂量的化疗药物，特别是紫杉醇(taxol)。 

在如本文举例描述的一个具体优选实施方案中，本发明提供了一种增加抗-HER2抗体治疗癌症之有效性的可能性的方法。该方法包括给予下述受试者癌症治疗剂量的抗-HER2抗体，所述受试者组织样品的肿瘤细胞中，her2基因已经扩增。 

本发明证实，基因扩增比通过免疫组化进行的蛋白检测更有效地指示基于抗体的肿瘤治疗，这一意外的临床结果导致总体上扩展了肿瘤抗原。因此，任何基于抗肿瘤特异性抗原的抗体治疗可以提高那些编码该肿瘤抗原的基因已得到基因扩增的患者被成功治疗的可能性。 

本发明特别有利在于，它允许不根据免疫组化标准而选择需要进行治疗的患者。因此，在一个具体实施方案中，受试者的经甲醛固定的组织样品经免疫组化得出的抗原水平评分值为0或1+。 

本发明还提供了一种药物包，它包含用于治疗癌症的ErbB拮抗剂，向发现其组织样品的肿瘤细胞中erbB基因已扩增的患者给予ErbB拮抗剂的说明。优选所述ErbB拮抗剂是抗-ErbB抗体，如抗-HER2抗体。另一方面，上述说明还指示对癌症治疗剂量的化疗药物，如紫杉醇的给药。可以为特异性针对肿瘤特异性抗原的任何基于抗体的治疗提供这种药物包，包括使用说明。 

本发明还涉及： 

1.一种增加ErbB拮抗剂癌症治疗有效性的可能性的方法，该方法包括给予受试者癌症治疗剂量的ErbB拮抗剂，所述受试者是已发现其组织样品的肿瘤细胞中erbB基因被扩增的那些受试者。 

2.项1的方法，其中所述ErbB是HER2蛋白。 

3.项2的方法，其中所述癌症是乳腺癌。 

4.项3的方法，其中所述受试者，经过其被甲醛固定的组织样品的免疫组化分析，被评分为0或1+。 

5.项1的方法，其中所述ErbB拮抗剂是抗-ErbB抗体。 

6.项5的方法，其中所述ErbB是HER2，所述抗体是重组人单克隆抗体(rhuMAb)4D5。 

7.项1的方法，其中所述erbB基因的扩增通过检测与该基因杂交的荧光标记型核酸探针的荧光来进行检测。 

8.项7的方法，其中所述erbB基因是her2基因。 

9.项1的方法，其还包括给予癌症治疗剂量的化疗药物。 

10.项9的方法，其中所述ErbB是HER2，所述化疗药物是紫杉醇。 

11.项1的方法，其中所述有效性的可能性增加了约30％。 

12.一种增加抗-HER2抗体有效治疗癌症的可能性的方法，该方法包括给予受试者癌症治疗剂量的抗-HER2抗体，所述受试者是已发现其组织样品的肿瘤细胞中her2基因被扩增的那些受试者。 

13.项12的方法，其中所述受试者，经过其被甲醛固定的组织样品的免疫组化分析，被评分为0或1+。 

14.项12的方法，其还包括给予癌症治疗剂量的紫杉醇。 

15.一种药物包，包括： 

(a)一容器，含有用于治疗癌症的ErbB拮抗剂；和 

(b)向那些在其组织样品的肿瘤细胞中erbB基因已扩增的患者给予ErbB拮抗剂的说明。 

16.项15的药物包，其中所述ErbB拮抗剂是一种抗体。 

17.项16的药物包，其中所述抗体是抗-HER2抗体。 

18.项17的药物包，其中所述抗-HER2抗体是rhuMAb 4D5 

19.项15的药物包，其中所述说明还包括与ErbB拮抗剂联合而给予化疗药物的给药指导。 

20.项19的药物包，其中所述化疗药物是紫杉醇。 

21.一种鉴定下述患者的方法，所述患者经处置能优先应答用于治疗癌症的ErbB拮抗剂，所述方法包括检测该患者组织样品的肿瘤细胞中erbB基因的扩增。 

22.项21的方法，其中所述受试者，经过其被甲醛固定的组织样品的免疫组化分析，被评分为0或1+。 

23.项21的方法，其中所述erbB是her2。 

发明详述 

本发明优点在于，能通过给予治疗药物，即抗肿瘤抗原的治疗性抗体或ErbB受体拮抗剂，而有效治疗对上述给药有较大可能发生应答的患者，所述患者是被发现编码上述肿瘤抗原或ErbB受体蛋白的基因被扩增的那些。本发明有一部分是基于下述意外发现：通过例如原位荧光杂交(FISH)检测出的her2基因扩增，尽管与通过免疫组化(IHC)检测出的HER2表达相关，但能更精确地选择接受治疗的患者，因为意外发现，FISH状态与针对治疗的应答更相关。该结果从某种意义上说很意外，因为FISH与临床试验分析(CTA)IHC分析的相关程度与另一种IHC分析(HercepTest)相同。根据这一发现，预计FISH与针对治疗的应答性有类似的相关性。该结果令人意外的另一个原因是，预计对蛋白的直接测定(通过免疫分析)比针对表达的间接测定(如基因扩增)能更精确地评估靶向该蛋白的癌症治疗。 

对不同组和亚组的患者进行的评估证实，基因扩增分析能够选出那些很可能对治疗有反应的患者。IHC可用于对肿瘤细胞上HER2的表达进行评分：0(无表达)至3+(很高水平的表达)。临床选择标准排除了评分为0和1+的患者，而选择了评分为2+和3+的患者。数据显示，评分为2+/3+的患者有14％可以应答 

FISH+(扩增的her2基因)患者有20％可以应答 

评分为3+的亚组有17％的应答率，这与FISH+患者的应答率非常接近。但是，评分为2+的亚组的应答率不到FISH+患者的一半。因此，基因扩增清楚地在2+亚组中区分出了主要亚群，从而能更有效地治疗FISH+的那些，并很快鉴定出适合并急需其它治疗形式的患者。 

基因扩增分析还能鉴定出，原本不必被排除，但由于IHC分析中，尤其是在福尔马林固定且石蜡包埋的样品上进行检验时(这种样品处理方式可破坏HER2蛋白上的抗体表位，但对基因扩增分析的影响要小得多)的异常而被排除的患者。如实施例中所述，有一组评分为0和1+的患者为FISH+。这些患者倾向于应答抗-HER2抗体治疗，例如，用 

进行的治疗，但根据IHC标准，它们将被排除在接受该治疗的范围之外。 

因此，本发明优势在于，能将那些很有可能受益于治疗、但根据常规的IHC标准判断将被排除在治疗之外的患者包括在治疗范围内。同时，本发明还能将那些由于抗-肿瘤抗原治疗(即，ErbB拮抗剂或肿瘤-特异性治疗性抗体)不太可能成功而应该迅速寻求其它治疗模式的患者排除。 

简言之，本发明在根据靶蛋白的表达水平选择患者方面是IHC分析的有效辅助手段。它还能单独，即在无IHC的情况下，对患者进行初步筛查和选择。本发明显著改进了对接受癌症治疗剂量的抗肿瘤抗原治疗性抗体治疗、ErbB受体拮抗剂治疗、及其它靶向过度表达之肿瘤抗原(或肿瘤特异性抗原)的治疗的患者进行的筛查和选择，从而提高这些患者从这样的治疗中获益的可能性。 

本发明另一方面涉及一种制品或制品包(package)，它包含一个容器并可选择在该容器上包含一种标签和一种包裹插页，在该容器内含有一种组合物，该组合物包含ErbB拮抗剂，例如抗-ErbB抗体(或其它抗-肿瘤-特异性抗原的抗体)，所述标签说明上述组合物可以用于治疗以过度表达ErbB受体的情况，所述包裹插页含有对已经发现带有扩增的erbB基因的患者给药所述拮抗剂的使用说明。 

定义 

本文中“ErbB受体”是受体蛋白酪氨酸激酶，属于ErbB受体家族，包括EGFR、HER2、ErbB3和ErbB4受体，以及TEGFR (美国专利5,708,156)和在将来被鉴定的此家族其它成员。ErbB受体通常包括可结合ErbB配体的细胞外结构域；亲脂性跨膜结构域；保守的细胞内酪氨酸激酶结构域；和含数个可被磷酸化的酪氨酸残基的羧基末端信号结构域。ErbB受体可以是天然序列ErbB受体或其氨基酸序列变体。优选ErbB受体是天然序列人ErbB受体。 

ErbB受体是肿瘤-特异性抗原或肿瘤抗原的一种。术语“肿瘤抗原”在本文中指，肿瘤细胞中表达水平高于正常细胞中表达水平的蛋白。一般用于进行比较的正常细胞是与肿瘤、或与产生该肿瘤的原始组织细胞具有相同组织类型(特别是表型)的细胞。“肿瘤特异性抗原”是指在肿瘤细胞上优势表达或仅在肿瘤细胞上表达的抗原。肿瘤-特异性抗原的实例除了ErbB受体外，还包括MARTl/MelanA，gp-100，和酪氨酸酶(在黑素瘤中)；MAGE-1和MAGE-3(在膀胱癌、头颈部癌、非小细胞癌中)；HPV EG和E7蛋白(在宫颈癌中)；粘蛋白/MUC-1(在乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和前列腺癌)；前列腺特异性抗原/PSA(在前列腺癌中)；和癌胚抗原/CEA(在结肠癌、乳腺癌和胃肠道癌症中)。 

“扩增”是指在一套染色体中erbB或其它编码肿瘤抗原的基因有一或多个额外的基因拷贝。基因扩增可导致蛋白(如ErbB受体蛋白)的过度表达。来自组织样品的细胞中的基因扩增可通过多种技术测定，所述技术尤其是原位荧光杂交(FISH)，但还包括但不限于定量PCR，定量Southern杂交等等。 

“组织样品”是指从受试者或患者组织中获取的相似细胞的集合，优选包括带有染色体物质的有核细胞。4种主要的人体组织是：(1)上皮组织；(2)结缔组织，包括血管、骨骼和软骨；(3)肌肉组织；和(4)神经组织。组织样品的来源可以是实体组织，例如新鲜的、经冷冻处理和/或防腐处理的器官或组织样品或活检样品或吸出物；血液或任何血液成分；体液如脑脊液、羊水、腹膜内体液、或间质液；来自受试者妊娠或发育的任何阶段的细胞。组织样品还可以是原代细胞或培养细胞或细胞系。组织样品可以包含天然状态下并未与该组织混合的化合物，如防腐剂、抗凝剂、缓冲液、固定剂、营养物、抗生素等等。在本发明一个实施方案中，组织样品是“非-血液学组织”(即，不是血液或骨髓组织)。 

本文中组织样品的“切片”是指组织样品的单个部分或片，例如，从组织样品中切出的组织或细胞薄片。应理解，可以根据本发明取组织样品的多个切片并对其进行分析，只要理解到本发明包含以下方法，所述方法对组织样品的相同切片既可以进行形态又可以进行分子水平的分析，或者既可以进行蛋白质又可以进行核酸的分析。 

“相关”是指，第一种分析的性能和/或结果与第二种分析的性能和/或结果，以任何方式发生联系。例如，可以用第一种分析的结果来进行第二种分析，和/或用第一种分析的结果确定是否需要进行第二种分析，和/或将第一种分析的结果与第二种分析的结果进行比较。在IHC与FISH的关系中，可以用IHC结果确定是否需要进行FISH，和/或将蛋白表达水平与基因扩增进行比较，从而进一步鉴定肿瘤活检标本(如，比较HER2蛋白的表达与her2基因的扩增)。本发明的一个优点是能鉴定出下列患者，IHC显示他们的抗原水平很低，但根据FISH判定他们很可能受益于治疗。 

“核酸”包括组织样品中出现的任何DNA或RNA，例如，染色体来源的，线粒体来源的，病毒来源的和/或细菌来源的。术语“核酸”包括双 链核酸分子的其中一条链或全部两条链，还包括完整核酸分子的任何片段或部分。 

“基因”是指能编码或转录为RNA(rRNA,tRNA,或mRNA，后者能翻译为蛋白质)或调节其它基因的表达的任何核酸序列或其部分。基因可以由负责编码功能性蛋白的所有核酸组成，或仅仅由负责编码或表达蛋白质的核酸部分组成。核酸序列可以在外显子、内含子、起始或终止区域、启动子序列、其它调节序列或与该基因邻接的特有区域包含遗传异常。 

“ErbB配体”是指能结合和/或活化ErbB受体的多肽。本文中有特别兴趣的ErbB配体是天然序列人类ErbB配体，如表皮生长因子(EGF)(Savage等,J.Bio.Chem.247:7612-7621(1972))；转化生长因子α(TGF-α)(Marquardt等,Science 223:1079-1082(1984))；双调节素，也称作许旺氏细胞(schwanoma)或角质细胞自分泌生长因子(Shoyab等Science 243:1074-1076(1989);Kimura等Nature 348:257-260(1990);和Cook等Mol.Cell.Biol.11:2547-2557(1991))；β细胞调节素(Shing等,Science 259:1604-1607(1993);Sasada等Biochem.Biophys.Res.Commun.190:1173(1993));肝素-结合型表皮生长因子(HB-EGF)(Higashiyama等,Science 251:936-939(1991));表皮调节素(Toyoda等,J.Biol.Chem.270:7495-7500(1995);和Komurasaki等Oncogene 15:2841-2848(1997)),遗传调节蛋白(下述);神经调节蛋白-2(NRG-2)(Carraway等,Nature 387:512-516(1997));神经调节蛋白-3(NRG-3)(Zhang等,Proc.Natl.Acad.Sci.94:9562-9567(1997));或cripto(CR-1)(Kannan等J.Biol.Chem.272(6):3330-3335(1997))。结合EGFR的ErbB配体包括EGF、TGF-α、双调节素、β细胞调节素、HB-EGF和表皮调节素。结合HER3的ErbB配体包括遗传调节蛋白。能够结合HER4的ErbB配体包括β细胞调节素、表皮调节素、HB-EGF、NRG-2、NRG-3和遗传调节蛋白。 

本文中“遗传调节蛋白(Heregulin)”，是指如美国专利5,641,869或Marchionni等,Nature,362:312-318(1993)公开的那样,含有由遗传调节蛋白基因产物编码的氨基酸序列的多肽及所述多肽的生物活性变体。遗传调节蛋白的实例包括遗传调节蛋白-α、遗传调节蛋白-β1、遗传调节蛋白-β2和遗传调节蛋白-β3(Holmes等,Science,256:1205-1210(1992);和美国专 利5,641,869);neu分化因子(NDF)(Peles等Cell 69:205-216(1992));乙酰胆碱受体-诱导活性(ARIA)(Falls等Cell 72:801-815(1993));神经胶质生长因子(GGF)(Marchionni等,Nature,362:312-318(1993));感觉和运动神经元衍生因子(SMDF)(Ho等J.Biol.Chem.270:14523-14532(1995));γ-遗传调节蛋白(Schaefer等Oncogene 15:1385-1394(1997))。天然序列HRG多肽的生物活性片段/氨基酸序列变体的实例，是EGF-样结构域片段(如HRGβ177-244)。 

本文中“ErbB异-寡聚体”是指非共价结合的寡聚体，包括至少2个不同的ErbB受体。这种复合物可以在表达2个或更多个ErbB受体的细胞暴露于ErbB配体时形成，它们可通过免疫沉淀来分离，通过SDS-PAGE来分析，如Sliwkowski等J.Biol.Chem.,269(20):14661-14665(1994)所述。此类ErbB异-寡聚体的实例包括EGFR-HER2、HER2-HER3和HER3-HER4复合物。而且，ErbB异-寡聚体可包含2个或更多个与不同ErbB受体(如HER3、HER4或EGFR)结合的HER2受体。其它蛋白,如细胞因子受体亚单位(如gp130),可包括在异-寡聚体中。 

术语“ErbB1”、“表皮生长因子受体”和“EGFR”在本文中可互换应用，是指如Carpenter等(Ann.Rev.Biochem.56：881-914(1987))公开的天然序列EGFR，包括其变体(例如Humphrey等(PNAS(USA)87：4207-4211(1990))所述缺失突变型EGFR)。ErbB1是指编码EGFR蛋白产物的基因。与EGFR结合的抗体实例包括Mab 579(ATCC CRL HB8506)、MAb 455(ATCC CRL HB 8507)、Mab 225(ATCC CRL 8508)、Mab 528(ATCC CRL 8509)(见美国专利4943533)及其变体，例如嵌合型225(C225)和重塑型人225(H225)(见WO96/40210)。 

术语“ErbB2”和“HER2”可互换应用，是指天然序列人类HER2蛋白，例如在Semba等(PNAS(USA)82:6497-6501(1985))和Yamamoto等(自然319：230-234(1986))中所述(Genebank登记号X03363)，及其变体。术语erbB2是指编码人类HER2的基因，neu是指编码大鼠pl85neu的基因。优选HER2天然序列人类HER2。能结合HER2的抗体的实例包括MAbs 4D5(ATCC CRL 10463),2C4(ATCC HB-12697),7F3(ATCC HB-12216),和7C2(ATCC HB12215)(参见，美国专利5,772,997；WO 98/77797；美国专利5,840,525,它 们引入本文作参考)。人源化抗-HER2抗体包括huMAb4D5-1,huMAb4D5-2,huMAb4D5-3,huMAb4D5-4,huMAb4D5-5,huMAb4D5-6,huMAb4D5-7,和huMAb4D5-8 

如引入本文作参考的美国专利5,821,337中表3所述；人源化520C9(WO 93/21319)。人类抗-HER2抗体参见美国专利5,772,997和WO 97/00271。 

“ErbB3”和“HER3”是指如美国专利5183884和5480968以及Kraus等(PNAS(USA)86：9193-9197(1989))公开的受体多肽，包括其变体。与HER3结合的抗体的实例见美国专利5968511，例如8B8抗体(ATCC HB 12070)或其人源化变体。术语“ErbB4”和“HER4”是指在下述文献中公开的受体多肽，如欧洲专利申请599274；Plowman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:1746-1750(1993)；和Plowman等，Nature，366：473-475(1993)，包括其变体，如WO99/19488中所述的HER4同种型。 

“ErbB拮抗剂”是能结合ErbB受体并阻断ErbB受体的配体活化的任何分子。这类拮抗剂包括，但不限于修饰的配体、配体肽(即，配体片段)，可溶性ErbB受体，优选抗ErbB抗体。 

“治疗”是指治疗和预防措施。那些需要治疗的对象是已经患有疾病以及有待预防疾病的个体。 

需要治疗的“哺乳动物”是指哺乳类任何动物，包括人、家禽、农用动物，和动物园、运动项目用的动物或宠物，如犬、马、猫、牛等。优选哺乳动物是人。 

“疾病”是将受益于ErbB拮抗剂(如抗ErbB2抗体)治疗的任何病症，更主要是指通过给予针对过度表达的抗原的抗体可以进行治疗的任何癌症。这包括慢性和急性疾病，或者那些使哺乳动物易患所述疾病的病理状况。可根据本文治疗的疾病的非限定实例包括良性和恶性肿瘤；白血病和淋巴样恶性肿瘤；神经元、神经胶质细胞、星形交质细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮细胞、间质和囊胚腔的疾病；炎性、血管原性和免疫性疾病。 

术语“治疗有效量”是指具有抗增生效果的量。优选地，治疗有效量激发抗体介导的细胞毒作用，活化补体，具有细胞凋亡(apoptotic)活性，或者能够诱导细胞死亡，并且优选使良性或恶性肿瘤细胞(尤其癌细胞)死亡。 根据所治病症的情况，可用常规方法测定治疗效力。对于癌症治疗来说，可通过例如评估疾病进展时间(TTP)，存活期，肿瘤大小，或测定应答率(RR)来测定其效力(见下述实施例)。 

术语“癌症”和“癌性的”是指或描述哺乳动物中以细胞生长失控为典型特点的病理状态。癌症的实例包括但不限定于癌(carcinoma)，淋巴瘤，胚细胞瘤，肉瘤，黑素瘤和白血病。更具体而言，这些癌包括鳞状细胞癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌，肺鳞癌，腹膜癌，肝细胞癌(hepatocellular cancer)，胃肠癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌(liver cancer)，膀胱癌，肝细胞瘤(hepatoma)，乳腺癌，结肠癌，结直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌(hepatic crcinoma)，以及各种头、颈部癌。 

“表达ErbB的癌”是指包括表面带有ErbB蛋白的细胞，使得抗-ErbB抗体能与此癌结合的癌。 

本文所用术语“细胞毒制剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意在包括放射性同位素(例如I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰和Re¹⁸⁶)，化疗剂，毒素如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段。 

“化疗剂”是在癌症治疗中使用的化学化合物。化疗剂实例包括烷化剂，如噻替哌(thiotepa)和环磷酰胺(CYTOXAN^TM)；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)如苯并多巴(benzodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亚胺(uredopa)；氮丙啶(ethylenimine)和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine)，三亚胺嗪(triethylenemelamine)，三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥(chlorambucil)，萘氮芥(chlornaphazine)，胆磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，盐酸氧氮芥，左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan)，新氮芥(novembichin)，胆甾醇苯乙酸氮芥(phenesterine)，松龙苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosureas)如亚硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素如阿克拉 霉素，放线菌素，authramycin，重氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C(cactinomycin)，加利车霉素(calicheamicin)，carabicin，嗜癌素(carzinophilin)，色霉素(chromomycin)，放线菌素D，柔红菌素(daunorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin)，表阿霉素(epirubicin)，丝裂霉素，霉酚酸，诺加霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素，链黑菌素，链脲霉素(streptozocin)，杀结核菌素，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)，氨甲蝶呤，蝶罗呤，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物氟达拉滨(fludarabine)，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，去氟氧尿苷(doxifluridine)，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷，5-FU；雄激素类如二甲睾酮(calusterone)，丙酸甲雄烷酮(dromostanolone propionate)，环硫雄醇(epitiostanol)，美雄氨(mepitiostane)，睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类如氨鲁米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂如frolinic acid；醋葡内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；硝呋旦(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼树酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)； 

雷佐生(razoxane)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2″-三氯三乙胺(trichlorotriethylamine)；乌拉坦(urethan)；长春碱酰胺；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；三胺硫磷(thiotepa)；taxoid，如紫杉醇 

Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和紫杉萜(Taxotere， 

Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨 (gemcitabine)；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊甙(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾(vinorelbine)；新霉酰胺(navelbine)；novantrone；替尼泊甙(teniposide)；柔红霉素；洋红霉素(carminocycin)；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸；esperamicins；capecitabine；以及上述任何物质的可药用盐，酸或衍生物。此定义还包括能调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素制剂，如抗雌激素制剂包括他莫昔芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制剂4(5)-咪唑，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，onapristone；和抗雄激素制剂如氟他氨(flutamide)，尼鲁米特(nilutamide)；和上述任何物质的可药用盐、酸或衍生物。 

本文中“生长抑制剂”是指在体内或体外抑制细胞生长，尤其抑制过度表达ErbB的癌症细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低S期中ErbB过表达细胞百分比的药物。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期(在除S期以外的某个阶段)进展的药物，例如诱导G1停滞和M期停滞的药物。经典的M期阻断剂包括长春花类(长春新碱和长春花碱)， 

和topo II抑制剂如阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、依托泊甙(etoposide)和博来霉素等。那些使G1期停滞的药物还连带(spill over)使S期停滞，例如DNA烷化剂象他莫昔芬(tamoxifen)、强的松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、氮芥(mechlorethamine)、顺铂、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷等。详见The Molecular Basis of Cancer,Mendelsohn and Israel,eds.,Chapter 1,entitled“Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs”Murakami等(WB Saunders:Philadelphia,1995)，尤其见13页。4D5抗体(和其功能等效物)也可用于此目的。 

ErbB受体酪氨酸激酶 

ErbB受体酪氨酸激酶是细胞生长、分化和存活的重要介质。该受体家族包括至少四个不同的成员，包括表皮生长因子受体(EGFR或ErbB1)、HER2(ErbB2或p185^neu)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。 

EGFR，由erbB1基因编码,被推断为与导致人类恶性肿瘤有关。具体而言,已经观察到EGFR在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、头颈部癌和胃癌以及神经胶质瘤的表达增加。EGFR受体表达增加常常与同一肿瘤细胞EGFR配体—转化生长因子α(TGF-α)产生增加有关,导致受体由自分泌刺激通路活化。Baselga和Mendelsohn Pharmac.Ther.64:127-154(1994)。在治疗此类恶性肿瘤中，已经评价了抗EGFR或其配体TGF-α和EGF的单克隆抗体,作为治疗剂的价值。参见例如，Baselga和Mendelsohn.,出处同上;Masui等Cancer Research 44:1002-1007(1984);及Wu等J.Clin.Invest.95:1897-1905(1995)。 

ErbB家族的第二个成员,p185neu,最初被认定为化学处理过的大鼠的成神经细胞瘤的转化基因产物。neu原癌基因的活化形式，源自所编码蛋白跨膜区的点突变(缬氨酸变为谷氨酸)。观察到乳腺癌和卵巢癌中人neu同系物扩增，并且与预后差相关(Slamon等,Science,235:177-182(1987);Slamon等,Science,244:707-712(1989);和美国专利4,968,603)。迄今,尚未有关于人肿瘤的类似于neu原癌基因的点突变的报道。已观察到HER2过度表达(经常但不是一律归咎于基因扩增)与其他癌症有关，其中包括胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、胰腺癌和膀胱癌。 

抗大鼠p185neu和人HER2蛋白产物的抗体已有描述。Drebin及其同事已经生产了抗大鼠neu基因产物－P185neu的抗体。参见例如，Drebin等,Cell 41:695-706(1985);Myers等,Meth.Enzym.198:277-290(1991);和WO94/22478。Drebin等Oncogene 2:273-277(1988)报道，与p185neu两个不同区反应的抗体混合物对植入裸鼠的neu-转化的NIH-3T3细胞产生协同抗-肿瘤效应。也参见1998年10月20日发布的美国专利5,824,311。 

Hudziak等,Mol.Cell.BioL 9(3):1165-1172(1989)描述一系列抗HER2抗体的产生，其特征是使用人乳腺肿瘤细胞系SKBR3。SKBR3细胞暴露于抗体后72小时，对单层细胞进行结晶紫染色测定相对细胞增生。利用该分析测定,得到的结果是：称作4D5的抗体抑制细胞增生的最大抑制为56%。在此分析测定中，一系列抗体中的其他抗体较小程度减少细胞增生。进一步发现，抗体4D5使HER2-过度表达性乳腺肿瘤细胞系对TNF-α的细 胞毒性作用敏感。也参见，1997年10月14日发布的美国专利5,677,171。在Hudziak等中讨论的抗-HER2抗体，在下述文献中做了进一步描述：Fendly等Cancer Research 50：1550-1558(1990)；Kotts等In Vitro 26(3)：59A(1990)；Sarup等Growth Regulation 1：72-82(1991)；Shepard等J.Clin.Immunol.11(3)：117-127(1991)；Kumar等Mol.Cell.Biol.11(2)：979-986(1991)；Lewis等Cancer Immunol.Immunother.37：255-263(1993)；Pietras等Oncogene 9：1829-1838(1994)；Vitetta等Cancer Research 54：5301-5309(1994)；Sliwkowski等J.Biol.Chem.269(20)：14661-14665(1994)；Scott等J.Biol.Chem.266：14300-5(1991)；D′souza等Proc.Natl.Acad.Sci.91：7202-7206(1994)；Lewis等Cancer Research 56：1457-1465(1996)；及Schaefer等Oncogene 15：1385-1394(1997)。 

重组人源化IgG1版本的小鼠抗-HER2抗体4D5(rhuMAb HER2或 

购自Genentech，Inc.，South San Francisco)，对在前已经接受过抗癌治疗的患HER2-过度表达性转移性乳腺癌的患者具有临床疗效(Baselga等，J.Clin.Oncol.14：737-744(1996))。 

于1998年9月25日得到食品药品管理局的上市许可，用于治疗患有过度表达HER2蛋白的肿瘤的转移性乳腺癌患者。现有治疗方案是应用IHC来确定HER2蛋白的过度表达。 

其他具有不同特性的抗-HER2抗体，描述在下列文献中：Tagliabue等Int.J.Cancer 47：933-937(1991)；McKenzie等Oncogene 4：543-548(1989)；Maier等Cancer Res.51：5361-5369(1991)；Bacus等Molecular Carcinogenesis 3：350-362(1990)；Stancovski等PNAS(USA)88：8691-8695(1991)；Bacus等Cancer Research 52：2580-2589(1992)；Xu等Int.J.Cancer53：401-408(1993)；WO94/00136；Kasprzyk等Cancer Research 52：2771-2776(1992)；Hancock等Cancer Res.51：4575-4580(1991)；Shawver等Cancer Res.54：1367-1373(1994)；Arteaga等Cancer Res.54：3758-3765(1994)；Harwerth等J.Biol.Chem.267：15160-15167(1992)；美国专利5,783,186；Klapper等Oncogene 14：2099-2109(1997)；WO 98/77797。 

同源筛选导致发现了另外2个ErbB受体家族成员；HER3(美国专利5,183,884和5,480,968，以及Kraus等PNAS(USA)86：9193-9197(1989)) 和HER4(欧洲专利申请599,274;Plowman等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:1746-1750(1993);和Plowman等,Nature,366:473-475(1993))。这两种受体均显示至少在某些乳腺癌细胞系中表达增加。 

通常发现ErbB受体在细胞中呈各种结合形式，而异源二聚化被认为增加对各种ErbB配体的细胞应答的多样性(Earp等Breast Cancer Research and Treatment 35:115-132(1995))。EGFR被6种不同的配体结合：表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGF-α)、双调节素(amphiregulin)、肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)、β细胞调节素(betacellulin)和表皮调节素(epiregulin)(Groenen等Growth factors 11:235-257(1994))。由单基因选择性(alternative)剪接产生的遗传调节蛋白(heregulin)蛋白家族是HER3和HER4的配体。遗传调节蛋白家族包括α、β和γ遗传调节蛋白(Holmes等,Science,256:1205-1210(1992);美国专利5,641,869;和Schaefer等Oncogene 15:1385-1394(1997));neu分化因子(NDFs),神经胶质生长因子(GGFs);乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA);及感觉和运动神经元衍生因子(SMDF)。评述见Groenen等Growth factors 11:235-257(1994);Lemke,G.Molec.& Cell.Neurosci.7:247-262(1996)和Lee等Pharm.Rev.47:51-85(1995)。近日，鉴定了另外两种ErbB配体：神经调节蛋白-2(NRG-2)和神经调节蛋白-3，据报道，神经调节蛋白-2结合HER3或HER4(Chang等Nature 387 509-512(1997);和Carraway等Nature 387:512-516(1997))，而神经调节蛋白-3结合HER4(Zhang等PNAS(USA)94(18):9562-7(1997))。HB-EGF、β细胞调节素和表皮调节素也与HER4结合。 

尽管EGF和TGF-α不结合HER2,但是，EGF刺激EGFR和HER2形成异二聚体,后者激活EGFR并导致异二聚体中HER2的磷酸根转移。二聚作用和/或磷酸根转移似乎激活HER2酪氨酸激酶。见Earp等,出处同上。同样地,当HER3与HER2共表达时,形成一活性信号复合物，抗HER2的抗体能够干扰此复合物(Sliwkowski等,J.Biol.Chem.,269(20):14661-14665(1994))。此外,在与HER2共表达时，HER3与遗传调节蛋白(HRG)的亲和力升高到更高亲和力水平。有关HER2-HER3蛋白复合物，也参见,Levi等,Journal of Neuroscience 15:1329-1340(1995);Morrissey等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:1431-1435(1995);和Lewis等,Cancer Res.,56: 1457-1465(1996)。HER4,象HER3一样,与HER2形成一活性信号复合物(Carraway and Cantley,Cell 78:5-8(1994))。 

检测基因扩增 

本发明涉及用任何技术检测基因扩增(参见，Boxer,J.Clin.Pathol.53:19-21(2000))。这些技术包括利用放射性同位素或荧光标记的探针进行的原位杂交(Stoler,Clin.Lab.Med.12:215-36(1990)；聚合酶链式反应(PCR)；定量Southern印迹，以及其它用于定量单个基因的技术。优选被选为基因扩增进行评估的探针或引物具有高特异性，以避免检测密切相关的同源基因。 

本文中所用“标记”一词，是指直接或间接与诸如核酸探针或抗体等试剂偶联或融合以便有利于检测该与之偶联或融合的试剂的化合物或组合物。标记可以是其本身可被测得(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者如果是酶标记时，可以是可测得的催化底物化合物或组合物发生的化学变化。与抗体发生免疫学特异性结合的半抗原或表位也可以作为标记。 

术语“荧光标记的核酸探针”是指以下探针，它包含：(1)具有能与靶核酸序列杂交的序列的核酸；和(2)荧光标记。优选地，所述杂交为特异性杂交，即它能在高度严格条件下发生。 

样品的制备 

来自受试者的任何组织样品都可以使用。可以使用的组织样品的实例包括，但不限于，乳腺、前列腺、卵巢、结肠、肺、子宫内膜、胃、唾液腺或胰腺。组织样品可通过多种方法获得，包括但不限于外科切出、吸出、活检。组织可以是新鲜的或冰冻的。在一个实施方案中，组织样品是固定并包埋在石蜡等中。 

组织样品可用常规方法固定(即，进行防腐处理)(参见例如，Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology,3rd Edition Lee G.Luna,HT(ASCP)Editor,The Blakston Division McGraw-Hill Book Company:New York;(1960);The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology(1994)Ulreka V.Mikel,Editor,Armed Forces Institute of Pathology,American Registry of Pathology,Washington,D.C.)。本领域技术人员可以理解，对固定剂的选择取决于对组织是进行组织学染色还是进行其它分析。本领域技术人员将理 解，固定所用时间的长短取决于组织样品的大小和所用的固定剂。例如，中性缓冲的福尔马林，Bouin’s或多聚甲醛可以用于固定组织样品。 

通常，先将组织样品固定，再通过一组递增系列的乙醇来脱水，浸润，用石蜡或其它切片基质包埋，使组织样品得以切片。或者，可以对组织进行切片并将所得切片固定。例如，可通过常规方法在石蜡中包埋并处理组织样品。可以使用的石蜡的实例包括，但不限于，Paraplast，Broloid和Tissuemay。一旦将组织样品包埋后，可以用切片机等对组织进行切片。例如，切片厚度可以是3－5μm不等。一旦切好，可以用数种标准方法将切片贴在载玻片上。载玻片粘合剂的实例包括，但不限于，硅烷，明胶，聚-L-赖氨酸等。例如，石蜡包埋的切片可以粘附在带正电或包被了聚-L-赖氨酸的载玻片上。 

如果用石蜡作为包埋的材料，通常将组织切片脱蜡，然后在水中重新水合。组织切片可以通过多种常规方法脱蜡。例如，可以用二甲苯和逐渐递减系列的乙醇。或者，可以使用市售非-有机脱蜡剂如Hemo-De7(CMS,Houston,Texas)。 

原位荧光杂交(FISH) 

原位荧光杂交通常在固定于载玻片上的细胞或组织切片上进行。原位杂交可以用多种常规方法实现(参见，例如，Leitch等,In Situ Hybridization:A Practical Guide,Oxford BIOS Scientific Publishers,Micropscopy Handbooks v.27(1994))。在一种原位杂交方法中，使用荧光染料(如异硫氰酸荧光素(FITC)，在氩离子激光器激发下发出绿色荧光)对与细胞中靶核苷酸序列互补的核酸序列探针进行标记。含有该靶核苷酸序列的每一细胞将与标记的探针结合，通过将细胞暴露于具有适合激发所用特定荧光染料的波长的光源之下，产生荧光信号。“靶核苷酸序列”是过度表达的肿瘤抗原，如ErbB的特异性序列。FISH分析可以与其它分析联合使用，所述其它分析包括，但不限于，形态学染色(针对一系列切片或相同切片；参见WO 00/20641，特别引入本文作为参考)。 

可以利用不同的杂交严格度。杂交条件越严格，探针与靶形成并维持稳定双链体所需的互补程度越高。严格度可以通过提高温度、降低浓度或提高甲酰胺浓度来增强。添加葡聚糖或提高取浓度也可以增加标记探针的 有效浓度，从而提高杂交率并增加极限信号强度。杂交后，洗涤载玻片所用溶液通常含有类似于杂交溶液中成分的试剂，洗涤时间从数分钟至数小时不等，这取决于所需严格度。较长时间或较严格的洗涤通常降低非特异性本底，但有降低总体敏感性的危险。 

FISH分析中使用的探针可以是RNA或DNA寡核苷酸或多核苷酸，而且它不仅可以包含天然核苷酸，还可以包含它们的类似物如地高辛配基dCTP，生物素dcTP 7-氮鸟苷，叠氮胸苷，肌苷，或尿苷。其它有效探针包括肽探针及其类似物，分支基因DNA，peptidometics,肽核酸(PNA),和/或抗体。 

探针应与靶核酸序列有足够的互补性，使靶核酸序列与该探针能够稳定而特异性地结合。稳定杂交所需的同源性程度因杂交基质和/或洗涤基质的严格度不同而不同。本发明优选应用完全同源的探针，但本领域技术人员将认识到，本发明也可以使用表现出较小但足够的同源性的探针(参见，例如，Sambrook,J.,等,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,(1989))。 

本领域技术人员将认识到，对探针的选择取决于靶基因的特性。扩增的实例包括，但不限于，乳腺癌和卵巢癌中的her2/neu，神经母细胞瘤中的n-myc，小细胞肺癌中的c-myc。例如，评估her2/neu扩增，可以使用下述探针，它跨越了含有her2/neu基因的17号染色体长臂上一段140kb的区域(17q 11.2-17ql2)。针对17号染色体着丝粒区域中-卫星序列(D1721)的探针可以用于评估17号染色体作为her2/neu扩增的发源地或起因的aneusomy。例如，可以从Vysis,Inc.获得这些探针的混合物，其中每种探针直接用容易区别的荧光染料标记，如SPECTRUM ORANGE7和SPECTRUM GREEN7。 

也可以通过如下多种方式制备并选择探针，它们包括，但不限于，颈原位杂交而作图，体细胞杂合体分组(panel)，对分选的染色体进行斑点印迹；染色体连锁分析；或者从来自人类细胞系或带有人类染色体之体细胞杂合体的分选的染色体库克隆并分离，对体细胞杂合体进行放射处理，对染色体区域进行显微解剖，或者用特异于唯一染色体座位的PCR引物从酵母人工染色体(YAC)中鉴定出，或者利用其它合适的方式如邻接的YAC克隆。探针可以是克隆在质粒、噬菌体、粘粒、YAC、细菌人工染色体(BAC)、 病毒载体或任何其它合适的载体上的基因组DNA，cDNA，或RNA。也可以通过常规方法克隆或化学合成探针。克隆后，通常将分离的探针核酸片段插入载体，如λ噬菌体、pBR322、M13、或者含有SP6或T7启动子的载体中，并作为文库克隆在细菌宿主中(参见，例如，Sambrook,同上)。 

优选将探针用荧光团标记。荧光团的实例包括，但不限于，稀土金属螯合物(铕螯合物)，Texas Red，罗丹明，荧光素，丹磺酰，丽丝胺，伞形酮，藻红蛋白(phycocrytherin)，藻蓝蛋白，或市售荧光团如SPECTRUM ORANGE7和SPECTRUM GREEN7，和/或上述一或多种的衍生物。试验中使用的多种探针可以用一种以上不同的荧光色或色素色标记。这些色彩差异为鉴定特异性探针的杂交位置提供了一种方式。此外，空间上未被分隔的探针可以用一种不同的彩色光或色素来鉴别，或者用一组滤光器来鉴别，所述彩色光或色素来自另外两种色彩(如红光+绿光=黄光)，色素(如蓝+黄=绿)，所述一组滤光器一次仅允许一种色彩通过。 

探针可以通过常规方法用荧光团进行直接或间接标记。可以添加其它探针和色彩，使这一通用方法更精细化，并扩展至包括更多的遗传异常或作为内部对照。例如，her2/neu基因位于第17号染色体上，可以使用特异于17号染色体的卫星序列(D17Z1)的探针(Vysis,Inc.)作为内部对照，以便在非-恶性细胞的区域中提供双链体，和/或确定在her2/neu扩增区域中是否存在第17号染色体的同体异数。 

为了进行FISH，载玻片经加工后，可以通过荧光显微镜的标准技术进行分析(参见，例如，Ploem and Tanke,Introduction to Fluorescence Microscopy,Oxford University Press:New York(1987))。简言之，用配备有相应激发滤光器、双色和吸收滤光器(barrier filters)的显微镜观察每一载玻片。根据所用荧光染料的激发光谱和发射光谱来选择滤光器。根据所用的荧光标记、信号强度以及所选的滤光器而选择曝光一定时间，对载玻片拍照。为了进行FISH分析，对在形态学分析中确定的目标细胞的物理位置进行记录(recall)，并目测证实其为适于FISH定量的区域。 

为了将IHC与FISH联系起来，可以使用计算机控制的驱动平台，它存储组合坐标(co-ordinates)的位置。这可以用于通过两种不同的分析技术来评估相同区域。例如，可以用配备了计算机的冷色CCD照相机来捕捉形态 学染色区域的彩色图像并储存。同样的切片然后经历FISH过程，记录存储的位置，对指定区域评分以判定是否存在荧光核信号。还考虑了一种类似的IHC过程，其后为FISH。 

通常，对组织样品中成百的细胞进行扫描，确定特异性靶核酸序列的量，它们表现为相对于细胞数的荧光斑点计数。细胞只斑点数相对于正常值(norm)的偏差(如，探测正常细胞中的her2/neu基因将得到两个拷贝，异常情况则比两个还多)指示，从肿瘤抗原特异性抗体治疗，如ErbB拮抗剂治疗受益的可能性较高。如下文所述，her2基因扩增能更有效地指示抗-HER2抗体治疗有效的可能性。 

药物制剂 

根据本发明使用的拮抗剂(抗体)的药用制剂通过将具有所需纯度的抗体与任选的药用载体、赋形剂或稳定剂(雷氏药学(Remington’sPharmaceutical Sciences)第16版，Osol,A.编(1980))混合而制备，然后以冻干剂或含水溶液的形式保存。可用的载体、赋形剂、稳定剂在所用剂量及浓度下对受者无毒性，包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；氯化苄烷铵(benzalkonium chloride)，苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量多肽(少于约10个残基)；蛋白质，如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，如钠；金属复合物(例如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如吐温^TM，PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。WO97/04801叙述了优选的冻干型抗ErbB2抗体剂型，在此引入本文作为参考。 

所述制剂还可根据所治疗的具体情况而包含一种以上活性化合物，优选具有互补活性但相互无负面影响的那些。例如，可能需要在一种制剂中进一步提供与EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4或血管内皮生长因子(VEGF)结合的抗体，或者结合ErbB上不同表位的抗体。或者(或另外)，所述组合 物可进一步包括细胞毒制剂、化疗剂、细胞因子、生长抑制剂和/或心脏保护剂。这些分子以对所需目的有效的总量在组合中适当地存在。 

活性成分也可容纳在通过凝聚技术或界面聚合作用制备的微胶囊中，如分别在胶体性质的药物运送系统(如脂质体，白蛋白微珠，微乳剂，纳米颗粒及纳米胶囊)或大乳剂(macroemulsions)的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(异丁烯酸甲酯)微胶囊。这些技术见雷氏药学，第16版Osol,A.编(l980)。 

用于体内给药的制剂优选是无菌的，用于人体则必须是无菌的。这可以通过除菌滤膜过滤而轻易实现。 

也可制备控释制剂。控释制剂的适当实例包括含有所述抗体的固态疏水聚合物的半通透性基质，所述基质为具有一定形状的制品，如膜或微胶囊。控释制剂实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)，聚交酯(美国专利3,773,919)，L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙酯，可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯组成的可注射的微球体)，以及聚D-(-)-3-羟丁酸。尽管聚合物如乙烯-乙酸乙酯和乳酸-羟基乙酸能持续释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白的时间却较短。当胶囊化的抗体长时间停留在体内时，它们会由于暴露在37℃潮湿环境下而变性或凝聚，从而导致生物活性损失，且免疫原性可能会改变。可以根据有关机理来设计稳定化的合理策略。例如，如果发现凝聚的机理是通过硫代二硫键互换而形成了分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制湿度、采用合适的添加剂和开发特殊的聚合物基质组合物来达到稳定化。 

用抗ErbB拮抗剂进行的治疗 

根据本发明，抗ErbB抗体或其它拮抗剂可用于治疗，那些被发现有扩增的erbB基因的患者中，以ErbB受体过度表达和/或活化为特征的各种病症。病症的实例包括良性或恶性肿瘤(如肾(renal)癌、肝癌、肾(kidney)癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)；肉瘤；恶性胶质瘤和各种类型的头颈部癌症)；白血病和淋巴的恶性疾病；其它疾病，如神经细胞、神 经胶质细胞、星形胶质细胞、下丘脑、腺体、巨噬细胞、上皮、基质和囊胚腔的病症，炎症性、血管生成性和免疫性的病症。 

可根据已知的方法将本发明的抗体、化疗及和任何其它活性制剂施用于病人，所述方法例如，经快速灌注或一定期间的持续输注方式的静脉给药，经肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜腔内、鞘内、口服、局部或吸入途径给药。优选静脉或皮下施用抗体。 

在一个实施方案中，本发明的治疗涉及将抗ErbB抗体与化疗剂(如taxoid)联合给药。本发明涉及不同化疗剂的混合物的给药。联合给药包括共同给药(使用分离的制剂或单一药物制剂)和以任何次序联贯给药，其中优选有一段时间为两种(或所有)活性制剂同时发挥它们的生物活性。这些化疗剂的制剂和剂量方案，可根据生产商的说明书来使用，或者根据专业医师的实践经验来确定。这类化疗的制剂和给药分案亦参见Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams和Wilkins，Baltimore，MD(1992)。化疗剂可在给予抗体之前、之后或同时给予。抗体可以与抗雌激素化合物(如他莫昔芬)或抗黄体酮(如onapristone)按照这些分子的已知剂量联合用药(见EP 616812)。 

除了上述治疗方案外，患者可以接受癌症细胞的手术切除(肿瘤切除术)和/或放射治疗。 

进行疾病的预防或治疗时，拮抗剂(如抗体)的适当剂量取决于所治疾病的类型(如上所述)，疾病的严重程度和进程，抗体给药的目的是预防还是治疗，先前的治疗，患者的临床病史和对抗体的应答，以及主治医生的判断。抗体适宜一次性地或在一系列治疗中施用于患者。 

根据受治疾病的类型和严重程度，施用于患者的抗体的起始候选剂量是约1μg/kg~15mg/kg(如0.1-20mg/kg)，无论是例如通过一次或分多次给药，还是通过连续输注给药都是如此。依据上述因素，典型的每日剂量为约1μg/kg～100mg/kg或更多。关于重复给药数天或更长时间，应视具体情况而将治疗持续至出现对疾病症状的所需抑制为止。但也可以应用其它剂量方案。治疗的进展很容易通过常规技术和试验来监测。 

药物包；制品 

本发明的相关方面提供了含用于治疗上述疾病的物质的制品。所述制品包括一个容器，任选带有标签和包装插页。适当的容器包括，例如，瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。该容器可内含一种能有效治疗所述疾病的组合物，并优选具有无菌存取口(例如该容器可以是静脉溶液袋或带有能通过皮下注射针穿刺的塞子的小瓶)。组合物中至少一种活性试剂是抗肿瘤抗原的治疗性抗体或ErbB拮抗剂，例如抗-ErbB抗体。位于或附着于该容器上的标签说明所述组合物可用于治疗指定的疾病。而且，所述制品还包括第二个容器，它含有可药用缓冲液，如磷酸盐缓冲液，Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。所述第二种缓冲液可以用于重建冻干形式或干粉形式的活性试剂，或者用于稀释活性试剂的浓缩制品。它还可以包括其它有商业需要或有利于用户的物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤膜、针和注射器。 

此外，所述制品包含包装插页或插页，可以指导如何在经FISH检验有erbB基因扩增的患者中使用。这样的患者可以是，经IHC检验被排除在ErbB拮抗剂治疗范围以外的受试者，例如，用抗-HER2抗体评分为0或1+的患者。 

本发明的更详细情况参照以下非限制性实施例举例说明。 

实施例1:临床试验(Trial)分析(CTA)与原位荧光杂交(FISH)在 

关键性试验(Pivotal Trial)中的一致性 

通过免疫组化(IHC)的测定，HER2的过度表达能达到2+或3+水平，这是被纳入关键性 

转移性乳腺癌试验中的必要条件。临床测试分析(CTA)包括用单克隆抗体4D5(在用蛋白酶对福尔马林固定的样品进行消化后)或CB 11(在对福尔马林固定的样品加热处理后)进行的两种IHC分析。如果受试者在任一项分析中的评分为2+或3+，则为合格。如果进行了上述两项试验，则最终评分要高于这两个结果。 

CTA与另一种IHC,HercepTest(HT)，的一致性是79％。这是FDA批准HT用于辅助挑选接受Herceptin治疗的患者的基础。 

本实施例描述了一项类似的利用临床材料进行的一致性研究，这些材料是送交筛选以备进行 

关键性试验的,该项研究比较了CTA与通过PathVysion FISH分析测定的her2/neu基因的扩增。在这些关键性试验 中，筛选了5998例受试者的HER2表达；1915例(32％)为CTA阳性，4083例(68％)为阴性。随机取623份标本(阳性：阴性为1:1)进行该项分析，317例为CTA+，306例为CTA-。标本并非从组织块新鲜切除的。它们是载玻片上4-6μ的切片，已经保存了2－4年。用PathVysion的包装插页中明示的方案分析每一切片her2/neu的扩增。将扩增限定为大于或等于2的信号比。结果见表1。 

表1-FISH/CTA一致性 

FISH+=HER2:CEP17信号比≥2    一致性=82％(79-85％) 

在所检测的总共623份标本中，有529例获得了FISH信号。有19.9％的CTA-标本和10.4％的CTA+标本的分析失败。0，1+，2，和3+评分组的扩增分别为4.2％,6.7％,23.9％,和89.3％。样品的一致性为81.3％，类似于79％的CTA/HT一致性。单拷贝过度表达为31％，在2+评分组中占主导地位。扩增在CTA-组中很少见(4.6％)。CTA-组较高的试验失败率可以是由于与试验无关的因素，如组织固定。这有可能导致IHC的假阴性结果。 

这些数据很有可能提示：her2/neu扩增状态，对于鉴别更有可能受益于Herceptin治疗的患者，有意外的、优于HercepTest的预示价值。仅24％的2+患者为FISH+，这一发现提示：该亚组仅通过IHC筛选较难预测治疗后果。对评分为1+和0的亚组中FISH+患者的鉴定，有可能鉴定出那些不能按照IHC标准而接受 

治疗、但很有可能受益于 

治疗的患者。基于FISH评分(与IHC评分比较)的 

受益情况的直接分析见实施例2。 

实施例2:FISH/临床后果研究 

本实施例将三项 

试验的结果与FISH状态联系起来。在该项研究中，从所有三项试验中随机选出805例受试者。其中167例缺少切片。另有78例分析失败(9.7％)。因此，540例经福尔马林固定并保存了2.5－4.5 年的切片就构成了本项研究的所有样品。这些样品中不存在人口统计学指标或预后指标的不平衡。不同处理组都有结果。 

针对那些接受Herceptin作为第二或第三线治疗的患者，评估FISH状态与应答的相关性。表2中的这些数据都是评分为2+和3+(通过CTA)的患者。 

表2-FISH/针对单一制剂 

的应答，第二或第三线治疗，2+/3+混合组 

FISH+受试者20％的应答率意外地超过了本研究中2+和3+患者15％的应答率，也超过了在关键性试验期间通过CTA和2+或3+免疫组化选出的患者的14％应答率。尽管FISH与IHC非常相关，达到与实施例1所示另一项IHC试验，Hercep Test中相同的相关程度，但它意外地更有利于鉴定那些更有可能受益于Herceptin治疗的患者。 

将这些数据分至3+和2+患者组中，观察到FISH+患者有相同的20％应答率(表3和4)。 

表3-FISH/针对单一制剂 

的应答，第二或第三线治疗，3+亚组 

表4-FISH/针对单一制剂 

的应答，第二或第三线治疗，2+亚组 

在3+亚组中，FISH+应答率(20％)非常接近但仍然超过了3+受试者的应答率17％。2+亚组有较大差别，仅有9％的应答率，而通过FlSH+选出的受试者为20％。这些数据表明，FISH+状态(her2基因扩增)极大地增加了应答 

的可能性。 

另外还评估了患者应答作为第一线治疗的Herceptin的数据(表5)。 

表5-FISH/针对单一制剂 的应答，第一线治疗，2+/3+混合组 

FISH+受试者41％的应答率显著高于3+，2+受试者27％的应答率。 

基于FISH分析而意外增加的有利应答的可能性，延展至对化疗加 

的应答，见表6。FISH+受试者显示出对化疗和Herceptin的应答(54％)远强于对FISH的应答(41％)。表7-9包含更多的详细数据，根据 

与化疗联合治疗时的不同化疗制剂(adrinomycin和环磷酰胺AC；Paditaxol，P)和不同终点(应答率，进展时间，和存活)将数据分散。 

表6-FISH/针对单一制剂 

的应答，第一线治疗，2+/3+混合组 

表7-新鉴定的人群的应答率 

*p<0.05 

表8-新限定的人群进展的时间(月) 

*p<0.05 

表9-新限定的人群的存活(月) 

*p<0.05 

这些数据一致表明，FISH+分析尽管与IHC十分相关，但能更精确地指示用Herceptin治疗成功的可能性。在所有情况中，FISH+选择比2+/3+IHC-选择的应答率高出大约1/3(30％)。在2+患者中，FISH状态提供了更有效的选择患者的工具。FISH状态还鉴定了由于被IHC鉴定为0或1+状态而被排除在治疗之外的患者。 

这些发现总体上拓宽了基于ErbB受体拮抗剂的癌症治疗和抗-肿瘤抗原癌症治疗的范围。因此将erbB拮抗剂，例如，抗-erbB受体的抗体(如 )给予通过诸如FISH判定erbB基因扩增为阳性的患者时，有效的可能性增加。根据这些资料，使用 

时确是如此。 

本发明不限于本文所述特定实施方案的范围。事实上，本领域技术人员根据以上说明，可以对本发明进行除本文所述以外的各种改动。这些改动都落在所附权利要求的范围内。 

还应理解，所述值都是近似值，而且都是用于进行说明。 

本申请全文多处引用了专利、专利申请、公开出版物、产品说明书和实施方案(protocols)，它们都全文引入作为参考。 

Claims (10)

1.一种增加ErbB拮抗剂癌症治疗有效性的可能性的方法，该方法包括给予受试者癌症治疗剂量的ErbB拮抗剂，所述受试者是已发现其组织样品的肿瘤细胞中erbB基因被扩增的那些受试者。

2.权利要求1的方法，其中所述ErbB是HER2蛋白。

3.权利要求2的方法，其中所述癌症是乳腺癌。

4.一种增加抗-HER2抗体有效治疗癌症的可能性的方法，该方法包括给予受试者癌症治疗剂量的抗-HER2抗体，所述受试者是已发现其组织样品的肿瘤细胞中her2基因被扩增的那些受试者。

5.权利要求4的方法，其中所述受试者，经过其被甲醛固定的组织样品的免疫组化分析，被评分为0或1+。

6.权利要求4的方法，其还包括给予癌症治疗剂量的紫杉醇。

7.一种药物包，包括：

(a)一容器，含有用于治疗癌症的ErbB拮抗剂；和

(b)向那些在其组织样品的肿瘤细胞中erbB基因已扩增的患者给予ErbB拮抗剂的说明。

8.权利要求7的药物包，其中所述ErbB拮抗剂是一种抗体。

9.一种鉴定下述患者的方法，所述患者经处置能优先应答用于治疗癌症的ErbB拮抗剂，所述方法包括检测该患者组织样品的肿瘤细胞中erbB基因的扩增。

10.权利要求9的方法，其中所述受试者，经过其被甲醛固定的组织样品的免疫组化分析，被评分为0或1+。