Relatório Descritivo da Patente de invenção para “MÉTODOS BASEADOS EM ANTICORPO PARA DETECTAR E TRATAR DOENÇA DE ALZHEIMER”.Descriptive Report of the Patent for “ANTIBODY-BASED METHODS TO DETECT AND TREAT ALZHEIMER'S DISEASE”.
[001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido U.S. No. 62/649.208 depositado em 28 de março de 2018, Pedido U.S. No. 62/664.662 depositado em 30 de abril de 2018 e Pedido U.S. nº 62/703.299 depositado em 25 de julho de 2018, cada um dos que é incorporado no presente documento por referência em sua totalidade.[001] This order claims priority to US Order No. 62 / 649,208 filed on March 28, 2018, US Order No. 62 / 664,662 filed on April 30, 2018 and US Order No. 62 / 703,299 filed on July 25, 2018, each of which is incorporated into this document by reference in its entirety.
[002] Descritos no presente documento, são anticorpos, composições, kits e métodos para a detecção, monitoramento, prevenção e/ou tratamento da doença de Alzheimer e outras tauopatias.[002] Described in this document, are antibodies, compositions, kits and methods for the detection, monitoring, prevention and / or treatment of Alzheimer's disease and other tauopathies.
[003] A doença de Alzheimer (AD) é um distúrbio neurodegenerativo progressivo que está associado à destruição de estruturas cerebrais superiores, como aquelas envolvidas na memória e cognição. A doença leva a déficits na função cognitiva e declínios na memória, aprendizagem, linguagem e na capacidade de realizar movimentos intencionais e propositados. AD também é acompanhada por deterioração concomitante de comportamento, emocional, interpessoal e social. Esses déficits cognitivos e comportamentais tornam a vida difícil (Burns et al., Alzheimer’s desease, The Lancet, vol. 360, 13 de julho de 2002). Pacientes em estágio avançado de AD geralmente são incapazes de falar, compreender a linguagem e cuidar de seus próprios cuidados pessoais básicos, eventualmente exigindo cuidados e supervisão em tempo integral, e muitas vezes dependem de familiares e casas de repouso. DA é a principal causa de demência senil, e prevê-se que aumente a prevalência à medida que a proporção de idosos na população aumenta. Prevê-se que o número total de pessoas com DA aumentará pelo menos três vezes entre 2000 e 2050, tornando a DA um problema de saúde pública mundial (Sloane et al., The Public Health Impact of Alzheimer's Disease, 2000-2050: Potential Implication of Treatment Advances, Annu. Rev. Public Health, 23: 213 a 31, 2002). A detecção clínica, o manuseio e o tratamento da DA permanecem amplamente inadequados. Ainda existe uma necessidade não atendida de métodos eficazes para detectar e tratar a DA.[003] Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder that is associated with the destruction of upper brain structures, such as those involved in memory and cognition. The disease leads to deficits in cognitive function and declines in memory, learning, language and the ability to perform intentional and purposeful movements. AD is also accompanied by concomitant deterioration in behavior, emotional, interpersonal and social. These cognitive and behavioral deficits make life difficult (Burns et al., Alzheimer’s desease, The Lancet, vol. 360, July 13, 2002). Advanced AD patients are often unable to speak, understand language and take care of their own basic personal care, eventually requiring full-time care and supervision, and often rely on family members and nursing homes. AD is the leading cause of senile dementia, and prevalence is expected to increase as the proportion of elderly people in the population increases. The total number of people with AD is expected to increase at least three times between 2000 and 2050, making AD a worldwide public health problem (Sloane et al., The Public Health Impact of Alzheimer's Disease, 2000-2050: Potential Implication of Treatment Advances, Annu. Rev. Public Health, 23: 213 to 31, 2002). The clinical detection, handling and treatment of AD remain largely inadequate. There is still an unmet need for effective methods to detect and treat AD.
[004] DA foi histologicamente caracterizada patologicamente pela análise de seções do cérebro para identificar a presença de placas extraneuronais e emaranhados neurofibrilares intracelulares e extracelulares no cérebro. As placas são compostas principalmente por β amiloide (Aβ), enquanto os emaranhados compreendem formas patológicas de tau, como conformadores de tau e seus agregados. A relação entre placas e emaranhados e o processo da doença permanece obscura, embora estudos sugiram uma ligação entre a patogênese da amiloide e da tau (Hardy et al., Genetic dissection of Alzheimer’s disease and related dementias: amyloid and its relationship to tau, Nature Neuroscience, vol 1, No. 5, 1998; Oddo et al., Aβ Immunotherapy Leads to Clearance of Early, but Not Late, Hyperphosphorylated Tau Aggregates via the Proteasome, Neuron, 43: 321 a 332, 2004; Rapoport et al., 2002; Roberson, et al., Reducing Endogenous Tau Ameliorates Amyloid β-Induced Deficits in an Alzheimer’s Disease Mouse Model, Science, 316:750, 2007; Shipton et al., Tau Protein Is Required for Amyloid β-Induced Impairment of Hippocampal Long-Term Potentiation, J. Neuroscience, 31(5):1688- 1692, 2011). Um papel central para Aβ na patologia de AD foi inicialmente proposto em uma hipótese chamada "cascata Aβ", em que a deposição de Aβ é seguida por fosforilação de tau e formação de emaranhado e, em seguida, morte neuronal (Hardy and Allsop,[004] AD was histologically characterized pathologically by analyzing sections of the brain to identify the presence of extraneuronal plaques and intracellular and extracellular neurofibrillary tangles in the brain. The plates are composed mainly of β amyloid (Aβ), while the tangles comprise pathological forms of tau, such as tau shapers and their aggregates. The relationship between plaques and tangles and the disease process remains unclear, although studies suggest a link between the pathogenesis of amyloid and tau (Hardy et al., Genetic dissection of Alzheimer's disease and related dementias: amyloid and its relationship to tau, Nature Neuroscience, vol 1, No. 5, 1998; Oddo et al., Aβ Immunotherapy Leads to Clearance of Early, but Not Late, Hyperphosphorylated Tau Aggregates via the Proteasome, Neuron, 43: 321 to 332, 2004; Rapoport et al., 2002; Roberson, et al., Reducing Endogenous Tau Ameliorates Amyloid β-Induced Deficits in an Alzheimer's Disease Mouse Model, Science, 316: 750, 2007; Shipton et al., Tau Protein Is Required for Amyloid β-Induced Impairment of Hippocampal Long -Term Potentiation, J. Neuroscience, 31 (5): 1688-1692, 2011). A central role for Aβ in AD pathology was initially proposed in a hypothesis called "Aβ cascade", in which Aβ deposition is followed by tau phosphorylation and tangle formation and then neuronal death (Hardy and Allsop,
Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer’s disease, TiPS, vol 12, 1991; Hardy and Selkoe, The Amyloid Hypothesis of Alzheimer’s Disease: Progress and Problems on the Road to Therapeutics, Science, vol 297, 2002; para uma revisão vide, Walsh and Selkoe, Deciphering the Molecular Basis of Memory Failure in Alzheimer’s Disease, Neuron, 44:181 a 193, 2004; também vide Seabrook et al., Beyond Amyloid the Next Generation of Alzheimer’s Disease Therapeutics, Molecular Intervention, 7(5), 2007).Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer’s disease, TiPS, vol 12, 1991; Hardy and Selkoe, The Amyloid Hypothesis of Alzheimer’s Disease: Progress and Problems on the Road to Therapeutics, Science, vol 297, 2002; for a review see, Walsh and Selkoe, Deciphering the Molecular Basis of Memory Failure in Alzheimer’s Disease, Neuron, 44: 181 to 193, 2004; see also Seabrook et al., Beyond Amyloid the Next Generation of Alzheimer’s Disease Therapeutics, Molecular Intervention, 7 (5), 2007).
[005] Consequentemente, as abordagens terapêuticas para AD geralmente se concentram em direcionamento em Aβ e tau, e muitos estudos sobre esses alvos continuam hoje. As terapias mais avançadas direcionadas à doença submetidas a ensaios clínicos em pacientes com AD incluem imunoterapias passivas, como BAN2401, ADUCANUMAB, GANTENERUMAB e CRENEZUMAB para remoção de Aβ; C2N 8E12, RO 7105705 e BIIB092 visando à proteína tau; e vacina ativa, tal como CAD106, Lu AF20513, ABvac 40, para terapia Aβ ou ACI-35 e AADvac1 para direcionar tau modificada por doença.[005] Consequently, therapeutic approaches to AD generally focus on targeting Aβ and tau, and many studies on these targets continue today. The most advanced therapies targeting the disease undergoing clinical trials in patients with AD include passive immunotherapies, such as BAN2401, ADUCANUMAB, GANTENERUMAB and CRENEZUMAB for removal of Aβ; C2N 8E12, RO 7105705 and BIIB092 for tau protein; and active vaccine, such as CAD106, Lu AF20513, ABvac 40, for Aβ or ACI-35 therapy and AADvac1 to target disease-modified tau.
[006] Trabalhos recentes levaram a uma série de abordagens terapêuticas que visam direta ou indiretamente à cascata de tau em particular (para artigos de revisão, vide, por exemplo, Dickey e Petrucelli, Pharmacologic reductions of total tau levels; implications for the role of microtubule dynamics in regulating tau expression, Molecular Neurodegeneration, 1:6, 2006; Schneider e Mandelkow, Tau-Based Treatment Strategies in Neurodegenerative Disease, Neurotherapeutics, 5:443-457, 2008; Zilka et al., Chaperone-like Antibodies Targeting Misfolded Tau Protein: New Vistas in the Immunotherapy of Neurodegenerative Foldopathies, Journal of Alzheimer’s Disease, 15:169-177, 2008), incluindo compostos que previnem ou revertem agressão de tau (Wischik et al., Selective inhibition of Alzheimer’s disease-like tau aggregation by phenothiazines, Proc.[006] Recent work has led to a series of therapeutic approaches that directly or indirectly target the tau cascade (for review articles, see, for example, Dickey and Petrucelli, Pharmacologic reductions of total tau levels; implications for the role of microtubule dynamics in regulating tau expression, Molecular Neurodegeneration, 1: 6, 2006; Schneider and Mandelkow, Tau-Based Treatment Strategies in Neurodegenerative Disease, Neurotherapeutics, 5: 443-457, 2008; Zilka et al., Chaperone-like Antibodies Targeting Misfolded Tau Protein: New Vistas in the Immunotherapy of Neurodegenerative Foldopathies, Journal of Alzheimer's Disease, 15: 169-177, 2008), including compounds that prevent or reverse tau aggression (Wischik et al., Selective inhibition of Alzheimer's disease-like tau aggregation by phenothiazines, Proc.
Natl.Natl.
Acad.Acad.
Sci.Sci.
USA, 93:11213 a 11218, 1996; Necula et al., Cyanine Dye N744 Inhibits Tau Fibrillization by Blocking Filament Extension: Implications for the Treatment of Tauopathic Neurodegenerative Diseases, Biochemistry, 44:10227-10237, 2005; Pickhardt et al., Screening for Inhibitors of Tau Polymerization, Current Alzheimer Research, 2:219-226, 2005; Taniguchi et al., Inhibition of Heparin-induced Tau Filament Formation by Phenothiazines, Polyphenols, and Porphyrins, The Journal of Biological Chemistry, 280:9, 7614-7623, 2005; Larbig et al., Screening for Inhibitors of Tau Protein Aggregation into Alzheimer Paired Helical Filaments: A Ligand Based Approach Results in Successful Scaffold Hopping, Current Alzheimer Research, 4:315-323, 2007) drogas do tipo molécula pequena que inibem tau quinases ou ativam tau fosfatases (Iqbal and Grundke-Iqbal, Inhibition of Neurofibrillary Degeneration: A Promising Approach to Alzheimer’s Disease and Other Tauopathies, Current Drug Targets, 5:495-502, 2004; Noble et al., Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo, PNAS, 102:19, 6990-6995, 2005; Iqbal and Grundke-Iqbal, Developing pharmacological therapies for Alzheimer disease, Cell.USA, 93: 11213 to 11218, 1996; Necula et al., Cyanine Dye N744 Inhibits Tau Fibrillization by Blocking Filament Extension: Implications for the Treatment of Tauopathic Neurodegenerative Diseases, Biochemistry, 44: 10227-10237, 2005; Pickhardt et al., Screening for Inhibitors of Tau Polymerization, Current Alzheimer Research, 2: 219-226, 2005; Taniguchi et al., Inhibition of Heparin-induced Tau Filament Formation by Phenothiazines, Polyphenols, and Porphyrins, The Journal of Biological Chemistry, 280: 9, 7614-7623, 2005; Larbig et al., Screening for Inhibitors of Tau Protein Aggregation into Alzheimer Paired Helical Filaments: A Ligand Based Approach Results in Successful Scaffold Hopping, Current Alzheimer Research, 4: 315-323, 2007) small molecule-type drugs that inhibit tau kinases or activate tau phosphatases (Iqbal and Grundke-Iqbal, Inhibition of Neurofibrillary Degeneration: A Promising Approach to Alzheimer's Disease and Other Tauopathies, Current Drug Targets, 5: 495-502, 2004; Noble et al., Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo, PNAS, 102: 19, 6990-6995, 2005; Iqbal and Grundke-Iqbal, Developing pharmacological therapies for Alzheimer disease, Cell.
Mol.Mol.
Life Sci., 64:2234-2244, 2007), drogas estabilizadoras de microtúbulo (Zhang et al., Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model, PNAS, 102(1): 227-231, 2005), drogas que facilitam a degradação proteolítica de proteína tau desdobradas (Dickey et al., Development of a High Throughput Drug Screening Assay for the Detection of Changes in Tau Levels-Proof of Concept with HSP90 inhibitors, Current Alzheimer Research, 2:231 a 238, 2005, Dickey et al., Pharmacologic reductions of total tau levels; implications for the role of microtubule dynamics in regulating tau expression, Molecular Neurodegeneration, 1:6, 2006), e drogas imunossupressoras (Zilka et al., Chaperon-like Antibodies Targeting Misfolded Tau Protein: New Vistas in the Immunotherapy of Neurodegenerative Foldopathies, Journal of Alzheimer’s Disease, 15:169-177, 2008), bem como estratégias imunoterapêuticas incluindo imunização ativa e passiva (Schneider e Mandelkow et al., Tau-Based Treatment Strategies in Neurodegenerative Diseases, Neurotherapeutics, 5:443-457, 2008; Zilka et al., Chaperon-like Antibodies Targeting Misfolded Tau Protein: New Vistas in the Immunotherapy of Neurodegenerative Foldopathies, Journal of Alzheimer’s Disease, 15:169-177, 2008, Tabira, T. Immunization Therapy for Alzheimer disease: A Comprehensive Review of Active Immunization Strategies. Tohoku J. Exp. Med., 220: 95-106 (2010)). Em adição, pesquisadores focaram em terapias de novos anticorpos monoclonais (mAbs) para tratar AD. Vide, por exemplo, Citron et al., Alzheimer’s disease: strategies for disease modification, Nature Reviews, 9:397, 2010, e Asuni et al., Immunotherapy Targeting Pathological Tau Conformers In a Tangle Mouse Model Reduces Brain Pathology with Associated Functional Improvements, The Journal of Neuroscience, 27(34):9115-9129, 2007, para revisão. Os anticorpos terapêuticos direcionados às formas de doença de tau representam uma abordagem promissora para o tratamento e/ou diagnóstico de AD e outras tauopatias (WO 2004/007547, US2008/0050383).Life Sci., 64: 2234-2244, 2007), microtubule stabilizing drugs (Zhang et al., Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model, PNAS, 102 (1) : 227-231, 2005), drugs that facilitate proteolytic degradation of unfolded tau protein (Dickey et al., Development of a High Throughput Drug Screening Assay for the Detection of Changes in Tau Levels-Proof of Concept with HSP90 inhibitors, Current Alzheimer Research, 2: 231 to 238, 2005, Dickey et al., Pharmacologic reductions of total tau levels; implications for the role of microtubule dynamics in regulating tau expression, Molecular Neurodegeneration, 1: 6, 2006), and immunosuppressive drugs (Zilka et al., Chaperon-like Antibodies Targeting Misfolded Tau Protein: New Vistas in the Immunotherapy of Neurodegenerative Foldopathies, Journal of Alzheimer's Disease, 15: 169-177, 2008), as well as immunotherapeutic strategies including active immunization a and passive (Schneider and Mandelkow et al., Tau-Based Treatment Strategies in Neurodegenerative Diseases, Neurotherapeutics, 5: 443-457, 2008; Zilka et al., Chaperon-like Antibodies Targeting Misfolded Tau Protein: New Vistas in the Immunotherapy of Neurodegenerative Foldopathies, Journal of Alzheimer's Disease, 15: 169-177, 2008, Tabira, T. Immunization Therapy for Alzheimer disease: A Comprehensive Review of Active Immunization Strategies. Tohoku J. Exp. Med., 220: 95-106 (2010)). In addition, researchers focused on therapies for new monoclonal antibodies (mAbs) to treat AD. See, for example, Citron et al., Alzheimer's disease: strategies for disease modification, Nature Reviews, 9: 397, 2010, and Asuni et al., Immunotherapy Targeting Pathological Tau Conformers In a Tangle Mouse Model Reduces Brain Pathology with Associated Functional Improvements , The Journal of Neuroscience, 27 (34): 9115-9129, 2007, for review. Therapeutic antibodies targeting forms of tau disease represent a promising approach for the treatment and / or diagnosis of AD and other tauopathies (WO 2004/007547, US2008 / 0050383).
[007] Apesar deste crescente corpo de pesquisas sobre estratégias terapêuticas para o tratamento de AD e outras tauopatias, permanece uma necessidade não atendida por ferramentas de diagnóstico que possam detectar e distinguir com precisão a AD e outras tauopatias de outras patologias cerebrais em pacientes que apresentam demência, a fim de garantir decisões de tratamento apropriadamente direcionadas, particularmente nos estágios iniciais dos processos da doença Blennow e Hampel, CSF markers for incipient Alzheimer’s disease, Lancet Neurol., 2:605-613, 2003; Blennow, CSF markers for incipient Alzheimer’s disease, Lancet Neurol., 2:605-613, 2005). Esforços significativos foram feitos nas últimas duas décadas para identificar indicadores cerebrais in vivo e biomarcadores baseados em amostras para AD pré-clínica, todos sem muito sucesso. A pesquisa se concentrou principalmente no líquido cefalorraquidiano (CSF) e no sangue, mas nenhum marcador definitivo foi encontrado para detectar e distinguir com precisão os diferentes tipos de demência. Vários biomarcadores no CSF e no sangue, por exemplo, foram amplamente estudados sem melhorias adequadas na precisão da detecção. Estes incluem biomarcadores de neurodegeneração (t-tau, NFL, NSE, VLP-1), metabolismo de APP (Aβ42, Aβ40, Aβ38, sAPPα e sAPPβ), patologia de emaranhado (p- tau), e ativação glial (YKL-40, MCP-1 e GFAP) (Olsson et al., CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer’s disease: a systematic review and meta-analysis, Lancet Neurol., 7:673-84, 2016). Três biomarcadores de CSF foram relatados para uso em comprometimento cognitivo leve prodrômico (LCC e demência AD: CSF Aβ1 a 42 (Aβ1 a 42), também expresso como relação Aβ1 a 42 : Aβ1 a 40, proteínas Thr181 e Thr231 t-tau e p-tau (Cavedo et al., The Road Ahead to Cure Alzheimer’s Disease: Development of Biological Markers and Neuroimaging Methods for Prevention Trials Across all Stages and Target Populations, J. Prev. Alzheimer’s Dis., 3:181 a 202, 2014). No entanto, a detecção precisa de AD em estágio inicial e métodos para distinguir a AD de outras tauopatias ou outras causas de demência em pacientes continua a ser um desafio, particularmente para ensaios baseados no CSF.[007] Despite this growing body of research on therapeutic strategies for the treatment of AD and other tauopathies, there remains an unmet need for diagnostic tools that can accurately detect and distinguish AD and other tauopathies from other brain pathologies in patients who present dementia, in order to ensure appropriately targeted treatment decisions, particularly in the early stages of Blennow and Hampel disease processes, CSF markers for incipient Alzheimer's disease, Lancet Neurol., 2: 605-613, 2003; Blennow, CSF markers for incipient Alzheimer’s disease, Lancet Neurol., 2: 605-613, 2005). Significant efforts have been made in the past two decades to identify in vivo brain indicators and sample-based biomarkers for preclinical AD, all without much success. The research focused mainly on cerebrospinal fluid (CSF) and blood, but no definitive marker was found to accurately detect and distinguish different types of dementia. Several biomarkers in CSF and blood, for example, have been extensively studied without adequate improvements in detection accuracy. These include biomarkers of neurodegeneration (t-tau, NFL, NSE, VLP-1), APP metabolism (Aβ42, Aβ40, Aβ38, sAPPα and sAPPβ), tangle pathology (p-tau), and glial activation (YKL-40 , MCP-1 and GFAP) (Olsson et al., CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis, Lancet Neurol., 7: 673-84, 2016). Three CSF biomarkers have been reported for use in mild prodromal cognitive impairment (CCL and AD dementia: CSF Aβ1 to 42 (Aβ1 to 42), also expressed as Aβ1 to 42: Aβ1 to 40, Thr181 and Thr231 t-tau and p proteins -tau (Cavedo et al., The Road Ahead to Cure Alzheimer's Disease: Development of Biological Markers and Neuroimaging Methods for Prevention Trials Across all Stages and Target Populations, J. Prev. Alzheimer's Dis., 3: 181 to 202, 2014). However, accurate detection of early-stage AD and methods to distinguish AD from other tauopathies or other causes of dementia in patients remains a challenge, particularly for CSF-based trials.
[008] A pesquisa sugeriu que diferentes epítopos fosforilados de tau, incluindo treonina 181, treonina 181 e 231, treonina 231, treonina 231 e 235, serina 199, serina 396 e 404, podem se correlacionar com[008] Research has suggested that different phosphorylated epitopes of tau, including threonine 181, threonine 181 and 231, threonine 231, threonine 231 and 235, serine 199, serine 396 and 404, may correlate with
AD, embora com alguns relatórios contraditórios. (Andreasen et al., Cerebrospinal fluid levels of total-tau, phospho-tau and A beta 42 predicts development of Alzheimer's disease in patients with mild cognitive impairment, Acta Neurol.AD, although with some contradictory reports. (Andreasen et al., Cerebrospinal fluid levels of total-tau, phospho-tau and A beta 42 predicts development of Alzheimer's disease in patients with mild cognitive impairment, Acta Neurol.
Scand.Scand.
Suppl., 179:47-51, 2003; Formichi et al., Cerebrospinal fluid tau, A beta, and phosphorylated tau protein for the diagnosis of Alzheimer's disease, J.Suppl., 179: 47-51, 2003; Formichi et al., Cerebrospinal fluid tau, A beta, and phosphorylated tau protein for the diagnosis of Alzheimer's disease, J.
Cell Physiol., 208:39-46, 2006; Blennow e Hampel, CSF markers for incipient Alzheimer's disease, Lancet Neurol., 2:605-613, 2003). Por exemplo, foi sugerido que a avaliação repetida de p-tau181 em CSF não forneceu um biomarcador clínico útil porque era insensível à progressão da doença ao longo de um período de 2 anos (Bouwman et al., Longtitudinal changes of CSF biomarkers in memory clinic patients, Neurology, 69:1006-1011, 2007). O poder preditivo dos biomarcadores tau e Aβ no CSF e sua dinâmica ao longo do tempo, portanto, permanece controverso.Cell Physiol., 208: 39-46, 2006; Blennow and Hampel, CSF markers for incipient Alzheimer's disease, Lancet Neurol., 2: 605-613, 2003). For example, it has been suggested that repeated assessment of p-tau181 in CSF did not provide a useful clinical biomarker because it was insensitive to disease progression over a 2-year period (Bouwman et al., Longtitudinal changes of CSF biomarkers in memory clinic patients, Neurology, 69: 1006-1011, 2007). The predictive power of the tau and Aβ biomarkers in CSF and their dynamics over time, therefore, remains controversial.
A capacidade limitada de até mesmo detectar esses biomarcadores no CSF aumenta ainda mais os desafios no diagnóstico de AD.The limited ability to even detect these biomarkers in CSF further increases the challenges in diagnosing AD.
Vários estudos, por exemplo, descreveram alterações longitudinais dos níveis de Aβ42, t-tau e p-tau em CSF em pacientes com AD (Andersson et al., Neurobiol Aging, 29:1466-1473, 2008; Blomberg et al., Neurosci.Several studies, for example, have described longitudinal changes in Aβ42, t-tau and p-tau levels in CSF in patients with AD (Andersson et al., Neurobiol Aging, 29: 1466-1473, 2008; Blomberg et al., Neurosci .
Lett., 214:163-166, 1996; Arai et al., JAGS, 45:1228-31, 1997; Kanai et al., Ann.Lett., 214: 163-166, 1996; Arai et al., JAGS, 45: 1228-31, 1997; Kanai et al., Ann.
Neurol., 44:17 a 26; Kanai et al., Neurosci.Neurol., 44:17 to 26; Kanai et al., Neurosci.
Lett., 267: 65-68, 1999; Hampel et al., Ann Neurol., 49:545 a 546, 2001; Hoglund et al., Dement.Lett., 267: 65-68, 1999; Hampel et al., Ann Neurol., 49: 545 to 546, 2001; Hoglund et al., Dement.
Geriatr.Geriatr.
Cogn.Cogn.
Disord., 19:256-265, 2005), enquanto outros não relataram mudanças significativas nestes biomarcadores de CSF ao longo do tempo (Nishimura et al., Methods Find.Disord., 19: 256-265, 2005), while others have reported no significant changes in these CSF biomarkers over time (Nishimura et al., Methods Find.
Exp.Exp.
Clin.Clin.
Pharmacol., 20:227- 235, 1998; Andreasen et al., Arch.Pharmacol., 20: 227- 235, 1998; Andreasen et al., Arch.
Neurol., 56:673-680, 1999; Sunderland et al., Biol.Neurol., 56: 673-680, 1999; Sunderland et al., Biol.
Psychiatry, 46:750 a 755, 1999; Tapiola et al., Neurosci.Psychiatry, 46: 750 to 755, 1999; Tapiola et al., Neurosci.
Lett., 280:119-122, 2000; deLeon et al., Neurobiol.Lett., 280: 119-122, 2000; deLeon et al., Neurobiol.
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Neural.Neural.
Transm., 112:933-948,Transm., 112: 933-948,
2005; Zetterberg et al., Alzheimers Res. Ther., 5(2):9, 2007; Mattsson et al., J. Alzheimers Dis., 30(4):767-778, 2012; Toledo et al., Acta Neuropathol. 125(5):659-70, 2013). A razão pela qual os biomarcadores de CSF não parecem refletir a progressão da doença em alguns pacientes ao longo do tempo não é conhecida. Uma possibilidade é que as proteínas derivadas do cérebro sejam diluídas no compartimento do CSF (deLeon et al., Longitudinal cerebrospinal fluid tau load increases in mild cognitive impairment, Neurosci Lett., 333:183-186, 2004). Outra explicação potencial é que os indivíduos mais velhos sem demência (acima de 65 anos) tendem a ter níveis de p-tau mais altos do que os mais jovens e, portanto, a elevação do biomarcador com a progressão da doença é mascarada nos indivíduos mais velhos sem demência (Bouwman et al., CSF biomarker levels in early and late onset alzheimer’s disease, Neurobiol Aging, 30:1895- 1901, 2008). Esses e outros fatores contribuem para a falta de um ensaio eficaz baseado em CSF.2005; Zetterberg et al., Alzheimers Res. Ther., 5 (2): 9, 2007; Mattsson et al., J. Alzheimers Dis., 30 (4): 767-778, 2012; Toledo et al., Acta Neuropathol. 125 (5): 659-70, 2013). The reason why CSF biomarkers do not appear to reflect disease progression in some patients over time is not known. One possibility is that proteins derived from the brain are diluted in the CSF compartment (deLeon et al., Longitudinal cerebrospinal fluid tau load increases in mild cognitive impairment, Neurosci Lett., 333: 183-186, 2004). Another potential explanation is that older individuals without dementia (over 65 years of age) tend to have higher levels of p-tau than younger ones, and therefore the elevation of the biomarker with disease progression is masked in older individuals. old people without dementia (Bouwman et al., CSF biomarker levels in early and late onset alzheimer's disease, Neurobiol Aging, 30: 1895-191, 2008). These and other factors contribute to the lack of an effective CSF-based assay.
[009] Os ensaios disponíveis usados para detectar biomarcadores de CSF se concentram quase exclusivamente em imunoensaios envolvendo um formato clássico de ELISA, e entre eles estão INNOTEST hTAU, INNOTEST fosfo-Tau (que reconhece fosfo- treonina 181) e INNOTEST Aβ42. A especificidade e a sensibilidade desses ensaios, no entanto, geralmente não são suficientes para prever a doença de Alzheimer, especialmente em seus estágios pré- clínicos (Wennström et al., The Inflammatory Marker YKL-40 Is Elevated in Cerebrospinal Fluid from Patients with Alzheimer's but Not Parkinson's Disease or Dementia with Lewy Bodies, 10(8): e0135458, PlosOne, 2015; Wang et al., Analysis of Cerebrospinal Fluid and [11C]PIB PET Biomarkers for Alzheimer's Disease with Updated Protocols, 52(4):1403-13, JAD 2016).[009] The available assays used to detect CSF biomarkers focus almost exclusively on immunoassays involving a classic ELISA format, and among them are INNOTEST hTAU, INNOTEST phospho-Tau (which recognizes phosphoronone 181) and INNOTEST Aβ42. The specificity and sensitivity of these trials, however, are generally not sufficient to predict Alzheimer's disease, especially in its preclinical stages (Wennström et al., The Inflammatory Marker YKL-40 Is Elevated in Cerebrospinal Fluid from Patients with Alzheimer's but Not Parkinson's Disease or Dementia with Lewy Bodies, 10 (8): e0135458, PlosOne, 2015; Wang et al., Analysis of Cerebrospinal Fluid and [11C] PIB PET Biomarkers for Alzheimer's Disease with Updated Protocols, 52 (4): 1403 -13, JAD 2016).
[010] Além dos ensaios de diagnóstico baseados em amostra, os avanços na imagem molecular nos últimos anos levaram ao trabalho em potenciais traçadores específicos de tau para tomografia por emissão de pósitrons (PET). Três famílias de radiotraçadores foram desenvolvidas como traçadores tau PET: os derivados de ariquinolina THK5117 e THK5351, o derivado de pirido-indol AV-1451 (também conhecido como T807 e Flortaucipir) e o derivado de fenil/piridinil- butadienil benzotiazol/benzotiazólio PBB3 (Saint-Aubert et al., Tau PET imaging: present and future directions, Mol. Neurodegener., 12:19, 2017). Uma vez que os traçadores de tau PET exibiram ligação fora do alvo, reconhecendo principalmente a enzima MAO B ou neuromelanina (Barrio et al., The Irony of PET Tau Probe Specificity, J. Nucl. Med., 59(1):115-116, 2018; Lemoine et al., Comparative binding properties of the tau PET tracers THK5117, THK5351, PBB3, and T807 in postmortem Alzheimer brains, Alzheimers Res. Ther., 9(1):96, 18 2017; Ng et al., Monoamine oxidase B inhibitor, selegiline, reduces F- THK5351 uptake in the human brain, Alzheimers Res. Ther., 9(1):25, 2017), 2ª geração de traçadores tau PET foram desenvolvidos: PI- 2620, MK-6240, GTP1 e RO6958948 (www.alzforum.org). No entanto, a ligação inespecífica a múltiplos alvos de tecido ainda está presente em alguns traçadores recentemente desenvolvidos, sugerindo espaço para técnicas aprimoradas (The 12th Human Amyloid Imaging, Miami, Flórida, EUA 2018).[010] In addition to sample-based diagnostic tests, advances in molecular imaging in recent years have led to work on potential specific tau tracers for positron emission tomography (PET). Three families of radiotracers were developed as PET tau tracers: the ariquinoline derivatives THK5117 and THK5351, the pyrido-indole derivative AV-1451 (also known as T807 and Flortaucipir) and the phenyl / pyridinyl-butadienyl benzothiazole / benzothiazolium PBB3 ( Saint-Aubert et al., Tau PET imaging: present and future directions, Mol. Neurodegener., 12:19, 2017). Since PET tau tracers exhibited off-target binding, mainly recognizing the MAO B enzyme or neuromelanin (Barrio et al., The Irony of PET Tau Probe Specificity, J. Nucl. Med., 59 (1): 115- 116, 2018; Lemoine et al., Comparative binding properties of the tau PET tracers THK5117, THK5351, PBB3, and T807 in postmortem Alzheimer brains, Alzheimers Res. Ther., 9 (1): 96, 18 2017; Ng et al. , Monoamine oxidase B inhibitor, selegiline, reduces F- THK5351 uptake in the human brain, Alzheimers Res. Ther., 9 (1): 25, 2017), 2nd generation of PET tau tracers were developed: PI- 2620, MK-6240 , GTP1 and RO6958948 (www.alzforum.org). However, nonspecific binding to multiple tissue targets is still present in some recently developed tracers, suggesting space for improved techniques (The 12th Human Amyloid Imaging, Miami, Florida, USA 2018).
[011] Os resultados de vários estudos neuropatológicos mostraram que a quantidade de patologia tau no cérebro dos pacientes está fortemente correlacionada com a progressão da AD. O padrão de localização anatômica das lesões tau pode corresponder aos domínios da cognição afetados ao longo do curso da doença de Alzheimer e ao padrão e grau de atrofia cerebral (Braak e Braak, Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes, Acta Neuropathol, 82:239-59, 1991; Murray et al., Neuropathologically defined subtypes of Alzheimer's disease with distinct clinical characteristics: a retrospective study, Lancet Neurol., (9):785-96, 2011; Nelson et al., Correlation of Alzheimer disease neuropathologic changes with cognitive status: a review of the literature, J. Neuropathol. Exp. Neurol., 71:362-81, 2012). Da mesma forma, vários estudos de imagem independentes revelaram que a distribuição do sinal de tau PET pode estar correlacionada com declínio cognitivo (Ossenkoppele et al., Tau PET patterns mirror clinical and neuroanatomical variability in Alzheimer's disease, Brain, 139:1551 a 67, 2016; Bejanin et al., Tau pathology and neurodegeneration contribute to cognitive impairment in Alzheimer's disease, Brain, 140(12):3286-3300, 2017; Mattsson et al., AV-1451 and CSF T-tau and P-tau as biomarkers in Alzheimer's disease, EMBO Mol. Med., 9:1212-1223, 2017; Mattsson et al., Comparing 18F-AV-1451 with CSF t-tau and p-tau for diagnosis of Alzheimer disease, Neurology, 5:e388-e395, 2018). Consequentemente, o desenvolvimento de reagentes e métodos melhorados para imagiologia PET de tau no cérebro podem ajudar a melhorar a precisão do diagnóstico e o monitoramento de pacientes com DA ao longo do tempo. Embora os biomarcadores de tau de CSF sejam principalmente úteis como biomarcador de estado de doença, a imagiologia de tau PET também pode ser útil no monitoramento da progressão de AD, como a transição do estágio prodrômico para demência (Mattsson et al., Comparing 18F-AV-1451 with CSF t-tau and p-tau for diagnosis of Alzheimer disease, Neurology, 5:e388-e395, 2018). Mas, dada a natureza invasiva e radioativa dos agentes de imagiologia cerebral, um ensaio não invasivo baseado em CSF com maior precisão e especificidade para AD seria benéfico.[011] The results of several neuropathological studies have shown that the amount of tau pathology in the brain of patients is strongly correlated with the progression of AD. The pattern of anatomical location of the tau lesions may correspond to the domains of cognition affected throughout the course of Alzheimer's disease and to the pattern and degree of cerebral atrophy (Braak and Braak, Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes, Acta Neuropathol, 82: 239 -59, 1991; Murray et al., Neuropathologically defined subtypes of Alzheimer's disease with distinct clinical characteristics: a retrospective study, Lancet Neurol., (9): 785-96, 2011; Nelson et al., Correlation of Alzheimer disease neuropathologic changes with cognitive status: a review of the literature, J. Neuropathol. Exp. Neurol., 71: 362-81, 2012). Likewise, several independent imaging studies have revealed that the distribution of the PET tau signal may be correlated with cognitive decline (Ossenkoppele et al., Tau PET patterns mirror clinical and neuroanatomical variability in Alzheimer's disease, Brain, 139: 1551 to 67, 2016; Bejanin et al., Tau pathology and neurodegeneration contribute to cognitive impairment in Alzheimer's disease, Brain, 140 (12): 3286-3300, 2017; Mattsson et al., AV-1451 and CSF T-tau and P-tau as biomarkers in Alzheimer's disease, EMBO Mol. Med., 9: 1212-1223, 2017; Mattsson et al., Comparing 18F-AV-1451 with CSF t-tau and p-tau for diagnosis of Alzheimer disease, Neurology, 5: e388 -e395, 2018). Consequently, the development of improved reagents and methods for PET imaging of tau in the brain can help improve the accuracy of diagnosis and the monitoring of AD patients over time. Although CSF tau biomarkers are primarily useful as a disease state biomarker, PET tau imaging can also be useful in monitoring AD progression, such as the transition from prodromal stage to dementia (Mattsson et al., Comparing 18F- AV-1451 with CSF t-tau and p-tau for diagnosis of Alzheimer disease, Neurology, 5: e388-e395, 2018). But, given the invasive and radioactive nature of brain imaging agents, a non-invasive CSF-based assay with greater precision and specificity for AD would be beneficial.
[012] Os biomarcadores atualmente disponíveis, no entanto, exibem várias limitações no uso clínico. Foi demonstrado que os níveis de tau total, p-tau e Aβ42 no CSF se sobrepõem consideravelmente entre os casos de doença e controle (Hulstaert et al., Improved discrimination of AD patients using beta-amyloid(1–42) and tau levels in CSF, Neurology, 52:1555-1562, 1999; Hu et al., Levels of nonphosphorylated and phosphorylated tau in cerebrospinal fluid Alzheimer's disease patients: an ultrasensitive bienzyme-substrate- recycle enzyme-linked immunosorbent assay, Am. J. Pathol., 160:1269-1278, 2002). A heterogeneidade da doença é considerada a principal causa da sobreposição nos biomarcadores do CSF (Iqbal et al., Subgroups of Alzheimer's disease based on cerebrospinal fluid molecular markers, 58:748-757, 2005). Na imagem de tau PET, o desafio crítico para o desenvolvimento de novos radiotraçadores direcionados a tau é superar a ligação não específica (Barrio et al., The Irony of PET Tau Probe Specificity, J. Nucl. Med., 59:115-116, 2018; Lemoine et al. Comparative binding properties of the tau PET tracers THK5117, THK5351, PBB3, and T807 in postmortem Alzheimer brains, Alzheimers Res. Ther., 9(1):96 , 2017; Ng et al., Monoamine 18 oxidase B inhibitor, selegiline, reduces F-THK5351 uptake in the human brain, Alzheimers Res. Ther., 9(1):25. 2017). Além disso, relatórios recentes mostraram que as conformações tau patológicas são diversas, dependendo de várias tauopatias humanas, e os ligandos de tau têm afinidade de ligação diferencial para as várias entidades patológicas de tau (Choi et al., Development of tau PET Imaging Ligands and their Utility in Preclinical and Clinical Studies, 52(1):24-30, 2018). Assim, outro desafio é melhorar a potência de ligação a várias lesões patológicas de tau, a fim de utilizá-las para o diagnóstico de múltiplas tauopatias humanas.[012] The biomarkers currently available, however, exhibit several limitations in clinical use. CSF levels of total tau, p-tau and Aβ42 have been shown to overlap considerably between cases of disease and control (Hulstaert et al., Improved discrimination of AD patients using beta-amyloid (1–42) and tau levels in CSF, Neurology, 52: 1555-1562, 1999; Hu et al., Levels of nonphosphorylated and phosphorylated tau in cerebrospinal fluid Alzheimer's disease patients: an ultrasensitive bienzyme-substrate- recycle enzyme-linked immunosorbent assay, Am. J. Pathol., 160: 1269-1278, 2002). The heterogeneity of the disease is considered the main cause of overlap in the CSF biomarkers (Iqbal et al., Subgroups of Alzheimer's disease based on cerebrospinal fluid molecular markers, 58: 748-757, 2005). In the image of tau PET, the critical challenge for the development of new radiotracers targeting tau is to overcome non-specific binding (Barrio et al., The Irony of PET Tau Probe Specificity, J. Nucl. Med., 59: 115-116 , 2018; Lemoine et al. Comparative binding properties of the tau PET tracers THK5117, THK5351, PBB3, and T807 in postmortem Alzheimer brains, Alzheimers Res. Ther., 9 (1): 96, 2017; Ng et al., Monoamine 18 oxidase B inhibitor, selegiline, reduces F-THK5351 uptake in the human brain, Alzheimers Res. Ther., 9 (1): 25. 2017). In addition, recent reports have shown that pathological tau conformations are diverse, depending on various human tauopathies, and tau ligands have differential binding affinity for the various pathological tau entities (Choi et al., Development of tau PET Imaging Ligands and their Utility in Preclinical and Clinical Studies, 52 (1): 24-30, 2018). Thus, another challenge is to improve the binding power to various pathological lesions of tau, in order to use them for the diagnosis of multiple human tauopathies.
[013] O recente desenvolvimento de tratamentos mais poderosos visando à AD enfatiza a necessidade de detectar com precisão a AD em um estágio inicial e distingui-la de outras formas de demência em pacientes. Biomarcadores eficazes, se disponíveis, também seriam úteis para estratificação do paciente e monitoramento longitudinal da progressão da doença, uma vez que a quantidade relativa de placas e emaranhados pode mostrar uma diferença marcante entre os pacientes com AD em diferentes estágios da doença. A estratificação de pacientes com base em dados de biomarcadores também pode ser uma forma de identificar subgrupos de pacientes mais propensos a responder à terapia. (Hampel et al., Perspective on future role of biological markers in clinical therapy trials of Alzheimer's disease: a long-range point of view beyond 2020, Biochem. Pharmacol., 88(4):426-46, 2014).[013] The recent development of more powerful treatments aimed at AD emphasizes the need to accurately detect AD at an early stage and distinguish it from other forms of dementia in patients. Effective biomarkers, if available, would also be useful for patient stratification and longitudinal monitoring of disease progression, since the relative amount of plaques and tangles can show a marked difference between AD patients at different stages of the disease. Stratification of patients based on biomarker data can also be a way of identifying subgroups of patients most likely to respond to therapy. (Hampel et al., Perspective on future role of biological markers in clinical therapy trials of Alzheimer's disease: a long-range point of view beyond 2020, Biochem. Pharmacol., 88 (4): 426-46, 2014).
[014] Por conseguinte, são descritos no presente documento anticorpos, composições, kits e métodos que fornecem detecção, monitoramento, prevenção e/ou tratamento melhorados da doença de Alzheimer e outras tauopatias.[014] Therefore, antibodies, compositions, kits and methods that provide improved detection, monitoring, prevention and / or treatment of Alzheimer's disease and other tauopathies are described in this document.
[015] Em várias modalidades, a presente invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a tau. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode se ligar a um epítopo fosforilado em tau. Em algumas modalidades, as espécies de tau com esse epítopo fosforilado estão presentes em uma amostra (por exemplo, sangue ou CSF) de um paciente com AD em uma concentração maior do que em um paciente com outra tauopatia ou em um objeto saudável.[015] In various embodiments, the present invention provides an antibody or antigen binding fragment capable of binding to tau. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof can bind to a tau phosphorylated epitope. In some embodiments, species of tau with this phosphorylated epitope are present in a sample (for example, blood or CSF) from a patient with AD at a higher concentration than in a patient with another tauopathy or a healthy object.
[016] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO 8.[016] In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises three determinants of heavy chain complementarity (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and where LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In certain embodiments, the variable region of The heavy chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and the variable region of the light chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO 8.
[017] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo no presente documento descrito pode se ligar a um epítopo na proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9), em que o epítopo é fosforilado. O epítopo pode compreender um ou mais dos resíduos 188-227 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, o epítopo compreende um ou mais dos resíduos 210- 221 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 11). Em certas modalidades, o epítopo compreende pelo menos um resíduo fosforilado. Em certas modalidades, o epítopo compreende mais de um resíduo fosforilado. O resíduo (s) fosforilado pode compreender uma fosfo-treonina na posição 217 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9). Em algumas modalidades, o epítopo também compreende uma serina fosforilada na posição 210, treonina na posição 212, serina na posição 214 ou treonina na posição 220 da proteína tau 2N4R ou qualquer combinação das mesmas. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode se ligar a um epítopo compreendendo ou consistindo em SRTPSLPpTPPTR (SEQ ID NO: 12).[017] In several embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof in this document described can bind to an epitope on the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 9), in which the epitope is phosphorylated. The epitope may comprise one or more of residues 188-227 of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 10). In some embodiments, the epitope comprises one or more of residues 210-221 of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 11). In certain embodiments, the epitope comprises at least one phosphorylated residue. In certain embodiments, the epitope comprises more than one phosphorylated residue. The phosphorylated residue (s) may comprise a phospho-threonine at position 217 of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 9). In some embodiments, the epitope also comprises a phosphorylated serine at position 210, threonine at position 212, serine at position 214 or threonine at position 220 of the 2N4R tau protein or any combination thereof. The antibody or antigen-binding fragment thereof can bind to an epitope comprising or consisting of SRTPSLPpTPPTR (SEQ ID NO: 12).
[018] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo no presente documento descrito pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 188-227 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, o epítopo compreende um ou mais dos resíduos 210- 221 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 11). Em certas modalidades, o epítopo compreende pelo menos um resíduo fosforilado, em que pelo menos um resíduo fosforilado pode ser uma fosfo-treonina na posição 217 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9). Em algumas modalidades, o epítopo também compreende uma serina fosforilada na posição 210, treonina na posição 212, serina na posição 214 ou treonina na posição 220 da proteína tau 2N4R ou qualquer combinação das mesmas. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode se ligar a um epítopo compreendendo ou consistindo em SRTPSLPpTPPTR (SEQ ID NO: 12).[018] In various embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof in this document described can bind to a tau epitope comprising one or more of residues 188-227 of the tau 2N4R protein (SEQ ID NO: 10). In some embodiments, the epitope comprises one or more of residues 210-221 of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 11). In certain embodiments, the epitope comprises at least one phosphorylated residue, wherein at least one phosphorylated residue may be a phosphorthreonine at position 217 of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 9). In some embodiments, the epitope also comprises a phosphorylated serine at position 210, threonine at position 212, serine at position 214 or threonine at position 220 of the 2N4R tau protein or any combination thereof. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof may bind to an epitope comprising or consisting of SRTPSLPpTPPTR (SEQ ID NO: 12).
[019] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo no presente documento descrito pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 151 a 188 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 13). Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode se ligar a um epítopo compreendendo um ou mais dos resíduos 163-172 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 14). O epítopo pode compreender KGQANATRIP (sequência de SEQ ID NO: 14). Em outra modalidade, o anticorpo é DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que DC2E7 é um anticorpo produzido por um hibridoma depositado sob o Depósito de Patentes do Catálogo de Culturas do Tipo Americanas No. PTA-124992.[019] In various embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof in this document described can bind to a tau epitope comprising one or more of residues 151 to 188 of the tau 2N4R protein (SEQ ID NO: 13). In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof can bind to an epitope comprising one or more of residues 163-172 of the tau 2N4R protein (SEQ ID NO: 14). The epitope can comprise KGQANATRIP (sequence of SEQ ID NO: 14). In another embodiment, the antibody is DC2E7 or an antigen-binding fragment thereof, where DC2E7 is an antibody produced by a hybridoma deposited under the Patent Deposit of the American Type Cultures Catalog No. PTA-124992.
[020] Em outra modalidade, é descrito no presente documento o anticorpo DC2E2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que DC2E2 é um anticorpo produzido por um hibridoma depositado sob o Depósito de Patentes do Catálogo de Culturas do Tipo Americanas No. PTA-124991.[020] In another embodiment, the DC2E2 antibody or an antigen-binding fragment thereof is described herein, where DC2E2 is an antibody produced by a hybridoma deposited under the Patent Deposit of the American Type Cultures Catalog No. PTA-124991.
[021] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento é conjugado a um segundo agente. Em algumas modalidades, o agente é pelo menos um marcador detectável ou pelo menos um agente terapêutico para AD ou outra tauopatia. Em certas modalidades, o agente é um radiomarcador.[021] In several embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described in this document is conjugated to a second agent. In some embodiments, the agent is at least a detectable marker or at least a therapeutic agent for AD or another tauopathy. In certain embodiments, the agent is a radiolabel.
[022] Também são descritos no presente documento métodos de tratamento, retardamento da progressão ou prevenção da progressão da AD ou outra tauopatia em um objeto. Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao objeto uma quantidade eficaz de pelo menos um anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades descritas precedentemente. Em algumas modalidades, o método compreende a detecção de DA usando um ou mais dos anticorpos descritos ou fragmentos de ligação ao antígeno antes de administrar ou recomendar a administração de um tratamento de AD adequado. Em algumas modalidades, o método compreende administrar um tratamento de AD a um paciente que foi diagnosticado como portador de AD usando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento.[022] Methods of treatment, progression delay or prevention of progression of AD or other tauopathy in an object are also described in this document. In some embodiments, the method comprises administering to the object an effective amount of at least one antibody according to any of the embodiments described above. In some embodiments, the method comprises detecting AD using one or more of the described antibodies or antigen-binding fragments before administering or recommending administration of an appropriate AD treatment. In some embodiments, the method comprises administering an AD treatment to a patient who has been diagnosed as having AD using an antibody or antigen-binding fragment described herein.
[023] Em várias modalidades, um método para detectar uma tauopatia em um objeto compreende: obter uma amostra biológica do objeto; contatar a amostra do objeto com uma quantidade eficaz de uma molécula que é capaz de formar um complexo com tau (por exemplo, usando pelo menos um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento que é capaz de se ligar a tau para formar um complexo tau-anticorpo); detectar a presença e/ou quantidade do complexo tau-molécula usando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descrito, em que a presença e/ou quantidade do complexo tau-molécula indica uma tauopatia no objeto. Em algumas modalidades, a molécula que forma um complexo tau-molécula é um primeiro anticorpo que pode se ligar a tau para formar um complexo tau-anticorpo e em que a presença do complexo tau-anticorpo é detectada usando um segundo anticorpo anti-tau ou fragmento de ligação ao antígeno, que pode ligar um epítopo diferente em tau do que o primeiro anticorpo. Em certas modalidades, o primeiro ou segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno está ligado (por exemplo, revestido covalentemente ou não covalentemente) a uma superfície sólida ou partícula. Em algumas modalidades, o primeiro ou o segundo anticorpo é conjugado a um marcador detectável. O método descrito pode compreender um ELISA clássico, ensaio ELISA digital ou outros formatos de ensaio ELISA, por exemplo, usando qualquer um ou mais dos anticorpos ou fragmentos no presente documento descritos que se ligam a tau fosforilada e podem detectar a presença e/ou quantidade de tau fosforilada na amostra, em que um nível aumentado de tau fosforilada na amostra indica que o objeto tem a doença de Alzheimer em vez de outra tauopatia. Em certas modalidades, a amostra biológica é fluido cerebroespinhal. Em certas modalidades, a amostra biológica é soro e/ou plasma.[023] In several modalities, a method for detecting tauopathy in an object comprises: obtaining a biological sample from the object; contacting the object sample with an effective amount of a molecule that is capable of forming a complex with tau (for example, using at least one antibody or antigen-binding fragment described in this document that is capable of binding to tau to form a tau-antibody complex); detecting the presence and / or quantity of the tau-molecule complex using an antibody or antigen-binding fragment in the present document described, wherein the presence and / or quantity of the tau-molecule complex indicates a tauopathy in the object. In some embodiments, the molecule that forms a tau-molecule complex is a first antibody that can bind tau to form a tau-antibody complex and where the presence of the tau-antibody complex is detected using a second anti-tau antibody or antigen-binding fragment, which can bind a different epitope in tau than the first antibody. In certain embodiments, the first or second antibody or antigen-binding fragment is attached (for example, coated covalently or non-covalently) to a solid surface or particle. In some embodiments, the first or second antibody is conjugated to a detectable marker. The described method can comprise a classic ELISA, digital ELISA assay or other ELISA assay formats, for example, using any one or more of the antibodies or fragments described herein that bind to phosphorylated tau and can detect the presence and / or amount phosphorylated tau in the sample, where an increased level of phosphorylated tau in the sample indicates that the object has Alzheimer's disease instead of another tauopathy. In certain embodiments, the biological sample is cerebrospinal fluid. In certain embodiments, the biological sample is serum and / or plasma.
[024] Em várias modalidades, um método para distinguir a doença de Alzheimer de outra tauopatia ou outra causa de demência em um objeto compreende: obter um fluido cerebroespinhal ou amostra de sangue de um objeto, contatar a amostra com um anticorpo anti-tau ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo no presente documento descrito, e detectar a presença e/ou quantidade de tau fosforilada complexada com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno na mesma amostra, em que a presença e/ou um nível elevado de tau fosforilada na amostra em relação ao nível em uma amostra de um objeto de controle saudável ou em que um nível elevado de tau fosforilada acima de um limite indica que o objeto tem doença de Alzheimer em vez de outra tauopatia ou uma causa alternativa (ou seja, outra forma de) demência ou outro distúrbio neurodegenerativo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-tau ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 que é capaz de se ligar a tau fosforilada para formar um complexo tau fosforilada-anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.[024] In several modalities, a method to distinguish Alzheimer's disease from another tauopathy or another cause of dementia in an object comprises: obtaining a cerebrospinal fluid or blood sample from an object, contacting the sample with an anti-tau antibody or antigen-binding fragment thereof in this document described, and detecting the presence and / or amount of phosphorylated tau complexed with the antibody or antigen-binding fragment in the same sample, where the presence and / or a high level of phosphorylated tau in the sample relative to the level in a sample of a healthy control object or where a high level of phosphorylated tau above a limit indicates that the object has Alzheimer's disease instead of another tauopathy or an alternative cause (ie, another form of) dementia or other neurodegenerative disorder. In some embodiments, the anti-tau antibody or antigen binding fragment comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises three heavy chain complementarity determining regions (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 which is capable of binding to phosphorylated tau to form a phosphorylated tau-antibody complex. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and the variable region light chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
[025] Em várias modalidades, um método para detectar doença de Alzheimer (AD) ou comprometimento cognitivo leve (LCC) em um objeto compreende: contatar uma amostra biológica do objeto com uma quantidade eficaz de uma molécula que é capaz de formar um complexo com tau (por exemplo, usando pelo menos um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descrito que é capaz de se ligar a tau para formar um complexo tau-anticorpo); detectar a presença e/ou quantidade do complexo tau-anticorpo; e comparar a presença/quantidade de tau ligada ao anticorpo na amostra com a quantidade em uma amostra de controle ou um limite, em que a presença e/ou uma quantidade aumentada de tau complexada com o anticorpo em relação à amostra de controle ou limite indica AD ou LCC no objeto. Em algumas modalidades, LCC é um precursor de AD em um paciente. Em algumas modalidades, o método distingue LCC e/ou AD de outras doenças neurológicas. Em algumas modalidades, as outras doenças neurológicas são selecionadas a partir de doença de Parkinson, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica e/ou demência frontotemporal. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende líquido cefalorraquidiano (CSF). Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende sangue. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende frações de plasma e/ou soro. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 9,3 pg/ml de tau ou cerca de 5,3 pg/ml de tau. Em algumas modalidades, o limite é entre cerca de 100- 600 pg/ml. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 300 pg/ml.[025] In several modalities, a method to detect Alzheimer's disease (AD) or mild cognitive impairment (LCC) in an object comprises: contacting a biological sample of the object with an effective amount of a molecule that is capable of forming a complex with tau (for example, using at least one antibody or antigen-binding fragment in the present document that is capable of binding to tau to form a tau-antibody complex); detecting the presence and / or amount of the tau-antibody complex; and comparing the presence / amount of tau bound to the antibody in the sample with the amount in a control sample or a limit, where the presence and / or an increased amount of tau complexed with the antibody relative to the control sample or limit indicates AD or LCC on the object. In some embodiments, LCC is a precursor to AD in a patient. In some modalities, the method distinguishes LCC and / or AD from other neurological diseases. In some modalities, the other neurological diseases are selected from Parkinson's disease, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis and / or frontotemporal dementia. In some modalities, the biological sample comprises cerebrospinal fluid (CSF). In some embodiments, the biological sample comprises blood. In some embodiments, the biological sample comprises fractions of plasma and / or serum. In some embodiments, the limit is about 9.3 pg / ml of tau or about 5.3 pg / ml of tau. In some embodiments, the limit is between about 100- 600 pg / ml. In some embodiments, the limit is around 300 pg / ml.
[026] Em várias modalidades, um método para detectar doença de Alzheimer (AD) ou comprometimento cognitivo leve (LCC) em um objeto compreende: obter uma amostra biológica; detectar a presença e/ou quantidade de proteína tau 2N4R fosforilada pelo menos na posição treonina 217 na amostra biológica; e comparar a presença/quantidade de proteína tau 2N4R fosforilada na treonina 217 com a quantidade em uma amostra de controle ou um limite, em que a presença e/ou uma quantidade aumentada de proteína tau 2N4R fosforilada na treonina 217 em relação à amostra de controle ou limite indica AD ou LCC no objeto. Em várias modalidades, o LCC é um precursor de AD em um paciente. Em algumas modalidades, o método distingue LCC e/ou AD de outras doenças neurológicas. Em algumas modalidades, a outra doença neurológica é selecionada a partir de doença de Parkinson, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica e/ou demência frontotemporal. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende líquido cefalorraquidiano (CSF). Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende sangue. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende frações de plasma e/ou soro. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 9,3 pg/ml de tau. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 9,3 pg/ml de tau ou cerca de 5,3 pg/ml de tau. Em algumas modalidades, o limite é entre cerca de 100-600 pg/ml. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 300 pg/ml.[026] In several modalities, a method for detecting Alzheimer's disease (AD) or mild cognitive impairment (LCC) in an object comprises: obtaining a biological sample; detecting the presence and / or amount of phosphorylated 2N4R tau protein at least at the threonine position 217 in the biological sample; and compare the presence / amount of phosphorylated 2N4R tau protein in threonine 217 with the amount in a control sample or a limit, where the presence and / or an increased amount of phosphorylated 2N4R tau protein in threonine 217 compared to the control sample or limit indicates AD or LCC on the object. In several modalities, LCC is a precursor to AD in a patient. In some modalities, the method distinguishes LCC and / or AD from other neurological diseases. In some modalities, the other neurological disease is selected from Parkinson's disease, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis and / or frontotemporal dementia. In some modalities, the biological sample comprises cerebrospinal fluid (CSF). In some embodiments, the biological sample comprises blood. In some embodiments, the biological sample comprises fractions of plasma and / or serum. In some embodiments, the limit is about 9.3 pg / ml of tau. In some embodiments, the limit is about 9.3 pg / ml of tau or about 5.3 pg / ml of tau. In some embodiments, the limit is between about 100-600 pg / ml. In some embodiments, the limit is around 300 pg / ml.
[027] Em várias modalidades, um método para distinguir a doença de Alzheimer e/ou comprometimento cognitivo leve da doença de Parkinson, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica e/ou demência frontotemporal em um objeto compreende: contatar uma amostra biológica do objeto com uma quantidade eficaz de uma molécula que é capaz de formar um complexo com tau (por exemplo, usando pelo menos um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno no presente documento descrito que é capaz de se ligar a tau para formar um complexo tau-anticorpo); e detectar a presença e/ou quantidade de tau complexada com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno na mesma amostra; e comparar a presença/quantidade de tau ligada ao anticorpo na amostra com a quantidade em uma amostra de controle ou um limite, em que a presença e/ou uma quantidade aumentada de tau complexada com o anticorpo em relação à amostra de controle ou limite indica doença de Alzheimer e/ou comprometimento cognitivo leve (LCC) no objeto. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende líquido cefalorraquidiano (CSF). Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende sangue. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende frações de plasma e/ou soro. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 9,3 pg/ml de tau. Em algumas modalidades, o limite é entre cerca de 100-600 pg/ml. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 300 pg/ml.[027] In several modalities, a method to distinguish Alzheimer's disease and / or mild cognitive impairment from Parkinson's disease, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis and / or frontotemporal dementia in an object comprises: contacting a biological sample of the object with a effective amount of a molecule that is capable of forming a complex with tau (for example, using at least one antibody or antigen-binding fragment in the present document that is capable of binding to tau to form a tau-antibody complex); and detecting the presence and / or amount of tau complexed with the antibody or antigen-binding fragment in the same sample; and comparing the presence / amount of tau bound to the antibody in the sample with the amount in a control sample or a limit, where the presence and / or an increased amount of tau complexed with the antibody relative to the control sample or limit indicates Alzheimer's disease and / or mild cognitive impairment (CCL) in the object. In some modalities, the biological sample comprises cerebrospinal fluid (CSF). In some embodiments, the biological sample comprises blood. In some embodiments, the biological sample comprises fractions of plasma and / or serum. In some embodiments, the limit is about 9.3 pg / ml of tau. In some embodiments, the limit is between about 100-600 pg / ml. In some embodiments, the limit is around 300 pg / ml.
[028] Em várias modalidades, um método para distinguir a doença de Alzheimer e/ou comprometimento cognitivo leve da doença de Parkinson, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica e/ou demência frontotemporal em um objeto compreende: obter uma amostra biológica do objeto; detectar a presença e/ou quantidade de proteína tau 2N4R fosforilada pelo menos na posição treonina 217 na amostra biológica; comparar a presença/quantidade de proteína tau 2N4R fosforilada na treonina 217 com a quantidade em uma amostra de controle ou um limite, em que a presença e/ou uma quantidade aumentada de proteína tau 2N4R fosforilada na treonina 217 em relação à amostra de controle ou limite indica doença de Alzheimer ou comprometimento cognitivo leve no objeto. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende líquido cefalorraquidiano (CSF). Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende sangue. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende frações de plasma e/ou soro. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 9,3 pg/ml de tau. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 9,3 pg/ml de tau ou cerca de 5,3 pg/ml. Em algumas modalidades, o limite é entre cerca de 100-600 pg/ml. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 300 pg/ml.[028] In several modalities, a method to distinguish Alzheimer's disease and / or mild cognitive impairment from Parkinson's disease, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis and / or frontotemporal dementia in an object comprises: obtaining a biological sample from the object; detecting the presence and / or amount of phosphorylated 2N4R tau protein at least at the threonine position 217 in the biological sample; compare the presence / amount of phosphorylated 2N4R tau protein in threonine 217 with the amount in a control sample or a limit, where the presence and / or an increased amount of phosphorylated 2N4R tau protein in threonine 217 compared to the control sample or limit indicates Alzheimer's disease or mild cognitive impairment in the object. In some modalities, the biological sample comprises cerebrospinal fluid (CSF). In some embodiments, the biological sample comprises blood. In some embodiments, the biological sample comprises fractions of plasma and / or serum. In some embodiments, the limit is about 9.3 pg / ml of tau. In some embodiments, the limit is about 9.3 pg / ml of tau or about 5.3 pg / ml. In some embodiments, the limit is between about 100-600 pg / ml. In some embodiments, the limit is around 300 pg / ml.
[029] Em várias modalidades, um método para prever a probabilidade de um paciente com deficiência cognitiva leve desenvolver a doença de Alzheimer compreende: contatar uma amostra biológica do objeto com uma quantidade eficaz de uma molécula que é capaz de formar um complexo com tau (por exemplo, usando pelo menos um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descrito que é capaz de se ligar a tau para formar um complexo tau-anticorpo); e detectar a presença e/ou quantidade de tau complexada com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno na mesma amostra; e comparar a presença/quantidade de tau ligada ao anticorpo na amostra com a quantidade em uma amostra de controle ou limite, em que a presença e/ou uma quantidade aumentada de tau complexada com o anticorpo em relação à amostra de controle ou limite indica um aumento da probabilidade do paciente desenvolver a doença de Alzheimer. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende líquido cefalorraquidiano (CSF). Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende sangue. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende frações de plasma e/ou soro. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 9,3 pg/ml de tau. Em algumas modalidades, o limite é entre cerca de 100-600 pg/ml. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 300 pg/ml.[029] In several modalities, a method to predict the probability of a patient with mild cognitive impairment to develop Alzheimer's disease comprises: contacting a biological sample of the object with an effective amount of a molecule that is capable of forming a complex with tau ( for example, using at least one antibody or antigen-binding fragment in the present document that is capable of binding to tau to form a tau-antibody complex); and detecting the presence and / or amount of tau complexed with the antibody or antigen-binding fragment in the same sample; and comparing the presence / amount of tau bound to the antibody in the sample with the amount in a control or limit sample, where the presence and / or an increased amount of tau complexed with the antibody relative to the control or limit sample indicates a increased likelihood of the patient developing Alzheimer's disease. In some modalities, the biological sample comprises cerebrospinal fluid (CSF). In some embodiments, the biological sample comprises blood. In some embodiments, the biological sample comprises fractions of plasma and / or serum. In some embodiments, the limit is about 9.3 pg / ml of tau. In some embodiments, the limit is between about 100-600 pg / ml. In some embodiments, the limit is around 300 pg / ml.
[030] Em várias modalidades, um método para prever a probabilidade de um paciente com deficiência cognitiva leve desenvolver a doença de Alzheimer compreende: obter uma amostra biológica do objeto; detectar a presença e/ou quantidade de proteína tau 2N4R fosforilada pelo menos na posição treonina 217 na amostra biológica; comparar a presença/quantidade de proteína tau 2N4R fosforilada na treonina 217 com a quantidade em uma amostra de controle ou um limite, em que a presença e/ou uma quantidade aumentada de proteína tau 2N4R fosforilada na treonina 217 em relação à amostra de controle ou limite indica uma probabilidade aumentada de o paciente desenvolver a doença de Alzheimer. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende líquido cefalorraquidiano (CSF). Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende sangue. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende frações de plasma e/ou soro. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 9,3 pg/ml de tau. Em algumas modalidades, o limite é entre cerca de 100-600 pg/ml. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 300 pg/ml.[030] In several modalities, a method to predict the likelihood that a patient with mild cognitive impairment will develop Alzheimer's disease comprises: obtaining a biological sample from the object; detecting the presence and / or amount of phosphorylated 2N4R tau protein at least at the threonine position 217 in the biological sample; compare the presence / amount of phosphorylated 2N4R tau protein in threonine 217 with the amount in a control sample or a limit, where the presence and / or an increased amount of phosphorylated 2N4R tau protein in threonine 217 compared to the control sample or threshold indicates an increased likelihood that the patient will develop Alzheimer's disease. In some modalities, the biological sample comprises cerebrospinal fluid (CSF). In some embodiments, the biological sample comprises blood. In some embodiments, the biological sample comprises fractions of plasma and / or serum. In some embodiments, the limit is about 9.3 pg / ml of tau. In some embodiments, the limit is between about 100-600 pg / ml. In some embodiments, the limit is around 300 pg / ml.
[031] Os desenhos anexos, que são incorporados e constituem uma parte desta especificação, ilustram várias modalidades não limitativas da invenção e, juntamente com a descrição, servem para explicar os princípios da invenção.[031] The attached drawings, which are incorporated and constitute a part of this specification, illustrate several non-limiting modalities of the invention and, together with the description, serve to explain the principles of the invention.
[032] Fig. 1. Determinação do isótipo para o anticorpo monoclonal DC2E2 usando ELISA.[032] Fig. 1. Isotype determination for monoclonal antibody DC2E2 using ELISA.
[033] Figs. 2A-2D. Mapeamento de epítopos do anticorpo DC2E2 usando mutantes de deleção tau e peptídeos tau em ELISA. (Fig. 2A), Ilustração esquemática de mutantes de deleção de tau e peptídeos usados para avaliar o sítio de ligação de DC2E2 na proteína tau. (Fig. 2B) Imunorreatividade de DC2E2 para seis isoformas humanas por ELISA. (Fig. 2C), Determinação do sítio de ligação de DC2E2 usando mutantes de deleção de tau por ELISA. (Fig. 2D), Determinação do sítio de ligação de DC2E2 usando peptídeos derivados de tau por ELISA competitivo.[033] Figs. 2A-2D. Epitope mapping of the DC2E2 antibody using tau deletion mutants and tau peptides in ELISA. (Fig. 2A), Schematic illustration of tau deletion mutants and peptides used to assess the DC2E2 binding site in the tau protein. (Fig. 2B) DC2E2 immunoreactivity for six human isoforms by ELISA. (Fig. 2C), Determination of the DC2E2 binding site using ELISA tau deletion mutants. (Fig. 2D), Determination of the DC2E2 binding site using tau-derived peptides by competitive ELISA.
[034] Fig. 3. Imunorreatividade de DC2E2 a diferentes proteínas tau. Pista 1: tau insolúvel em sarcosila isolada de tecido cerebral com doença de Alzheimer humana; pista 2: tau151 a 391; pista 3: tau151 a 391 fosforilada; pista 4: tau 2N4R; pista 5: tau 2N4R fosforilada.[034] Fig. 3. Immunoreactivity of DC2E2 to different tau proteins. Lane 1: tau insoluble in sarcosyl isolated from brain tissue with human Alzheimer's disease; lane 2: tau151 to 391; lane 3: phosphorylated tau151 to 391; lane 4: 2N4R tau; lane 5: phosphorylated 2N4R tau.
[035] Fig. 4. Determinação do isótipo de anticorpo monoclonal DC2E7 usando ELISA.[035] Fig. 4. Isotype determination of monoclonal antibody DC2E7 using ELISA.
[036] Fig. 5A-D. As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos das regiões variáveis no anticorpo DC2E2. Fig. 5A mostra a sequência de nucleotídeos que codifica a região variável de cadeia leve. Fig. 5B mostra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve, com as sequências CDR apresentadas em negrito e sublinhado. Fig. 5C mostra a sequência de nucleotídeos que codifica a região variável de cadeia pesada. Fig. 5D mostra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada, com as sequências CDR em negrito e sublinhado. As regiões determinantes de complementaridade (CDRs) foram identificadas de acordo com o sistema de numeração IMGT.[036] Fig. 5A-D. The nucleotide and amino acid sequences of the variable regions in the DC2E2 antibody. Fig. 5A shows the nucleotide sequence encoding the light chain variable region. Fig. 5B shows the amino acid sequence of the light chain variable region, with the CDR sequences shown in bold and underlined. Fig. 5C shows the nucleotide sequence that encodes the variable region of the heavy chain. Fig. 5D shows the amino acid sequence of the heavy chain variable region, with the CDR sequences in bold and underlined. The complementarity determining regions (CDRs) were identified according to the IMGT numbering system.
[037] Fig. 6A-D: As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos das regiões variáveis no anticorpo DC2E7. Fig. 6A mostra a sequência de nucleotídeos que codifica a região variável de cadeia leve. Fig. 6B mostra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve, com sequências de CDR em negrito e sublinhado. Fig. 6C mostra a sequência de nucleotídeos que codifica a região variável de cadeia pesada. Fig. 6D mostra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada, com as sequências CDR em negrito e sublinhado. As regiões determinantes de complementaridade (CDRs) foram identificadas de acordo com o sistema de numeração IMGT.[037] Fig. 6A-D: The nucleotide and amino acid sequences of the variable regions in the DC2E7 antibody. Fig. 6A shows the nucleotide sequence encoding the light chain variable region. Fig. 6B shows the amino acid sequence of the light chain variable region, with CDR sequences in bold and underlined. Fig. 6C shows the nucleotide sequence that encodes the variable region of the heavy chain. Fig. 6D shows the amino acid sequence of the heavy chain variable region, with the CDR sequences in bold and underlined. The complementarity determining regions (CDRs) were identified according to the IMGT numbering system.
[038] Fig. 7. Imunorreatividade de DC2E7 a diferentes proteínas tau. Pista 1: tau 2N4R; pista 2: 2N4R fosforilada in vitro; pista 3: tau fetal; pista 4: tau insolúvel em sarcosila isolada do tecido cerebral com doença de Alzheimer humana. DC25, um anticorpo monoclonal pan tau que reconhece todas as formas de proteínas tau, foi usado como controle.[038] Fig. 7. Immunoreactivity of DC2E7 to different tau proteins. Lane 1: 2N4R tau; lane 2: phosphorylated 2N4R in vitro; lane 3: fetal tau; lane 4: tau insoluble in sarcosyl isolated from brain tissue with human Alzheimer's disease. DC25, a pan tau monoclonal antibody that recognizes all forms of tau proteins, was used as a control.
[039] Fig. 8. Ilustração esquemática de mutantes de deleção de tau usados para avaliar o sítio de ligação de DC2E7 na proteína tau.[039] Fig. 8. Schematic illustration of tau deletion mutants used to evaluate the DC2E7 binding site in the tau protein.
[040] Fig. 9. Determinação do sítio de ligação de DC2E7 na proteína tau por imunoblotting usando mutantes de deleção de tau.[040] Fig. 9. Determination of the DC2E7 binding site in the tau protein by immunoblotting using tau deletion mutants.
[041] Fig. 10. Ilustração esquemática de sítios de fosforilação potenciais em tau na região 188-227.[041] Fig. 10. Schematic illustration of potential phosphorylation sites in tau in region 188-227.
[042] Fig. 11. Determinação do sítio de ligação de DC2E7 na proteína tau por imunotransferência usando mutantes pontuais de tau. Mab DC25 foi usado como um controle para medir a extensão da fosforilação de mutações pontuais.[042] Fig. 11. Determination of the DC2E7 binding site on the tau protein by immunoblotting using tau point mutants. Mab DC25 was used as a control to measure the extent of phosphorylation of point mutations.
[043] Fig. 12. Determinação do epítopo DC2E7 na proteína tau por ELISA competitiva usando peptídeos derivados de tau.[043] Fig. 12. Determination of the DC2E7 epitope on tau protein by competitive ELISA using peptides derived from tau.
[044] Fig. 13. Ligação de anticorpos DC2E7 e DC2E2 na doença de Alzheimer (hipocampo CA1), FTD - doença de Pick (giro dentado, hipocampo), CBD (núcleo caudado) e PSP (putâmen/núcleo caudato) seções cerebrais. O anticorpo monoclonal AT8 foi usado como controle. Barra de ferramentas de 100 µm.[044] Fig. 13. Binding of antibodies DC2E7 and DC2E2 in Alzheimer's disease (hippocampus CA1), FTD - Pick's disease (toothed gyrus, hippocampus), CBD (caudate nucleus) and PSP (putamen / caudate nucleus) brain sections. The monoclonal antibody AT8 was used as a control. 100 µm toolbar.
[045] Fig. 14. Ligação dos anticorpos DC2E7 e DC2E2 em seções cerebrais de Braak estágio 1, Braak estágio 3 e Braak estágio[045] Fig. 14. Binding of antibodies DC2E7 and DC2E2 in brain sections of stage 1 Braak, stage 3 Braak and stage Braak
6. Barra de ferramentas de 100 µm.6. 100 µm toolbar.
[046] Fig. 15. Ligação de anticorpos DC2E7 e DC2E2 em seções cerebrais da doença de Alzheimer (hipocampo CA1), corpos de Pick em FTD - doença de Pick (giro dentado, hipocampo) e corpos enrolados e patologia astrocítica em CBD (núcleo caudatus). Barra de ferramentas de 20 µm.[046] Fig. 15. Binding of DC2E7 and DC2E2 antibodies in brain sections of Alzheimer's disease (hippocampus CA1), Pick bodies in FTD - Pick's disease (toothed gyrus, hippocampus) and rolled bodies and astrocytic pathology in CBD (nucleus caudatus). 20 µm toolbar.
[047] Fig. 16. Curva de calibração exemplar para o ensaio ELISA digital DC2E7.[047] Fig. 16. Exemplary calibration curve for the digital ELISA assay DC2E7.
[048] Fig. 17A-B. Experimento de recuperação de pico usando três CSFs humanos de objetos saudáveis. (Fig. 17A), Concentrações estimadas do calibrador DC2E7 incrementado no CSF humano. (Fig. 17B), Recuperação em % do calibrador DC2E7 incrementado em CSF humano.[048] Fig. 17A-B. Peak recovery experiment using three human CSFs from healthy objects. (Fig. 17A), Estimated concentrations of the DC2E7 calibrator incremented in the human CSF. (Fig. 17B), Recovery in% of the calibrator DC2E7 increased in human CSF.
[049] Fig. 18. Resultados do ELISA digital DC2E7 de amostras de controle e AD.[049] Fig. 18. Results of the digital ELISA DC2E7 of control and AD samples.
[050] Fig. 19. Resultados do ELISA digital DC2E7 de amostras de AD e outras tauopatias.[050] Fig. 19. Results of the digital ELISA DC2E7 from AD samples and other tauopathies.
[051] Fig. 20: ligação de DC2E7 a espécies de tau insolúveis em[051] Fig. 20: binding of DC2E7 to tau species insoluble in
AD e outras tauopatias humanas.AD and other human tauopathies.
[052] Fig. 21: Uma comparação de amostras de CSF de indivíduos com AD e FTD usando ensaios de tau pT217 e tau pT181.[052] Fig. 21: A comparison of CSF samples from individuals with AD and FTD using tau pT217 and tau pT181 assays.
[053] Fig. 22: Uma comparação de amostras de CSF de indivíduos com AD e controles usando os ensaios de tau pT217 e tau pT181.[053] Fig. 22: A comparison of CSF samples from individuals with AD and controls using the tau pT217 and tau pT181 assays.
[054] Fig. 23A-B: Uma comparação de amostras de CSF de objetos de controle, LCC e AD usando ensaios de tau pT217 (Fig. 23A). Uma comparação de amostras de CSF de indivíduos de controle, AD, PD, MS, ALS e FTD usando ensaios de tau pT217 (Fig. 23B).[054] Fig. 23A-B: A comparison of CSF samples from control objects, LCC and AD using pT217 tau assays (Fig. 23A). A comparison of CSF samples from control subjects, AD, PD, MS, ALS and FTD using pT217 tau assays (Fig. 23B).
[055] Fig. 24: Absorção de fragmentos de anticorpo scFV isolados derivados de DC2E7.[055] Fig. 24: Absorption of isolated scFV antibody fragments derived from DC2E7.
[056] Fig. 25A-D: Alinhamento de sequências de aminoácidos de fragmentos de anticorpo scFV derivados de DC2E7. Fig. 25A mostra os domínios variáveis de cadeia leve do anticorpo scFV em comparação com a sequência DC2E7. Fig. 25B mostra os domínios variáveis de cadeia pesada do anticorpo scFV em comparação com a sequência DC2E7. Fig. 25C mostra os domínios variáveis de cadeia leve dos fragmentos de anticorpo scFV que exibiram maior afinidade em comparação com DC2E7. Fig. 25D mostra os domínios variáveis de cadeia pesada dos fragmentos de anticorpo scFV que exibiram maior afinidade em comparação com DC2E7. Os resíduos idênticos à sequência de DC2E7 são representados por pontos. As CDRs foram identificadas de acordo com o sistema de numeração IMGT.[056] Fig. 25A-D: Alignment of amino acid sequences of scFV antibody fragments derived from DC2E7. Fig. 25A shows the light chain variable domains of the scFV antibody compared to the DC2E7 sequence. Fig. 25B shows the heavy chain variable domains of the scFV antibody compared to the DC2E7 sequence. Fig. 25C shows the light chain variable domains of the scFV antibody fragments that exhibited greater affinity compared to DC2E7. Fig. 25D shows the heavy chain variable domains of the scFV antibody fragments that exhibited greater affinity compared to DC2E7. Residues identical to the DC2E7 sequence are represented by dots. CDRs were identified according to the IMGT numbering system.
[057] Fig. 26: Comparação da afinidade dos anticorpos DC2E7 e DC149 para o peptídeo 2E7pep derivado de tau.[057] Fig. 26: Comparison of the affinity of the antibodies DC2E7 and DC149 for the peptide 2E7pep derived from tau.
[058] Fig. 27A-B: Alinhamento de sequências de aminoácidos de DC2E7 e DC149. Fig. 27A mostra o domínio de cadeia leve variável DC149 em comparação com a sequência de cadeia leve DC2E7. Fig.[058] Fig. 27A-B: Alignment of DC2E7 and DC149 amino acid sequences. Fig. 27A shows the DC149 variable light chain domain compared to the DC2E7 light chain sequence. Fig.
27B mostra o domínio variável de cadeia pesada DC149 em comparação com a sequência da cadeia pesada DC2E7. Os resíduos idênticos à sequência de DC2E7 são representados por pontos. As CDRs foram identificadas de acordo com o sistema de numeração IMGT.27B shows the DC149 heavy chain variable domain compared to the DC2E7 heavy chain sequence. Residues identical to the DC2E7 sequence are represented by dots. CDRs were identified according to the IMGT numbering system.
[059] Fig. 28A-B: Alinhamento das sequências de aminoácidos de DC2E7 e DC807. Fig. 28A mostra o domínio de cadeia leve variável de DC807 em comparação com a sequência de cadeia leve de DC2E7. Fig. 28B mostra o domínio de cadeia pesada variável DC807 em comparação com a sequência da cadeia pesada DC2E7. Os resíduos idênticos à sequência de DC2E7 são representados por pontos. As CDRs foram identificadas de acordo com o sistema de numeração IMGT.[059] Fig. 28A-B: Alignment of the amino acid sequences of DC2E7 and DC807. Fig. 28A shows the DC807 variable light chain domain compared to the DC2E7 light chain sequence. Fig. 28B shows the DC807 variable heavy chain domain compared to the DC2E7 heavy chain sequence. Residues identical to the DC2E7 sequence are represented by dots. CDRs were identified according to the IMGT numbering system.
[060] Fig. 29: A distribuição de pT217 tau medida por um ensaio ELISA digital de tau pT217 em amostras da doença de Alzheimer, outras tauopatias e indivíduos de controle usando um calibrador de tau fosforilada (painel esquerdo) e calibrador de peptídeo 2E7 (2E7pep) (painel direito).[060] Fig. 29: The distribution of pT217 tau measured by a pT217 digital tau ELISA assay in Alzheimer's disease samples, other tauopathies and control subjects using a phosphorylated tau calibrator (left panel) and 2E7 peptide calibrator ( 2E7pep) (right panel).
DESCRIÇÃO DETALHADA DefiniçõesDETAILED DESCRIPTION Definitions
[061] A fim de entender melhor a invenção, certas definições são fornecidas primeiro.[061] In order to better understand the invention, certain definitions are provided first.
[062] O termo "afinidade" se refere à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A afinidade de uma molécula X por seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação de equilíbrio (KD) (ou sua constante de associação de equilíbrio inversa, KA). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles no presente documento descritos. Vide, por exemplo, Pope M.E., Soste M.V., Eyford B.A., Anderson N.L., Pearson T.W., (2009) J. Immunol. Methods. 341(1 a 2):86-96 e métodos no presente documento descritos.[062] The term "affinity" refers to the strength of the sum total of non-covalent interactions between a single binding site of a molecule (for example, an antibody) and its binding partner (for example, an antigen). The affinity of a molecule X for its partner Y can generally be represented by the equilibrium dissociation constant (KD) (or its inverse equilibrium association constant, KA). Affinity can be measured by common methods known in the art, including those described herein. See, for example, Pope M.E., Soste M.V., Eyford B.A., Anderson N.L., Pearson T.W., (2009) J. Immunol. Methods. 341 (1 to 2): 86-96 and methods described herein.
[063] O termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos de ocorrência natural, modificados e sintéticos, bem como análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam de maneira similar aos aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, bem como aqueles aminoácidos que são posteriormente modificados, por exemplo, hidroxiprolina, gama-carboxiglutamato e O-fosfoserina. Os análogos de aminoácidos referem-se a compostos que têm a mesma estrutura química básica de um aminoácido de ocorrência natural, ou seja, um carbono alfa que está ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R, por exemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônio. Esses análogos têm grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou estruturas peptídicas modificadas, mas mantêm a mesma estrutura química básica de um aminoácido de ocorrência natural. Miméticos de aminoácidos referem-se a compostos químicos que possuem uma estrutura diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funcionam de maneira similar a um aminoácido de ocorrência natural. Os aminoácidos adequados incluem, sem limitação, ambos os isômeros D e L dos 20 aminoácidos comuns de ocorrência natural encontrados em peptídeos, bem como os aminoácidos de ocorrência natural e não natural preparados por síntese orgânica ou outras vias metabólicas. Exemplos de tais aminoácidos de ocorrência não natural incluem, mas não estão limitados a, N-acetilglucosaminil-L-serina, N- acetilglucosaminil-L-treonina e O-fosfotirosina. Os aminoácidos modificados incluem, mas não estão limitados a, hidroxiprolina,[063] The term "amino acid" refers to naturally occurring, modified and synthetic amino acids, as well as amino acid analogues and amino acid mimetics that work similarly to naturally occurring amino acids. Naturally occurring amino acids are those encoded by the genetic code, as well as those amino acids that are subsequently modified, for example, hydroxyproline, gamma-carboxyglutamate and O-phosphoserine. Amino acid analogs refer to compounds that have the same basic chemical structure as a naturally occurring amino acid, that is, an alpha carbon that is linked to a hydrogen, a carboxyl group, an amino group and an R group, for example , homoserine, norleucine, methionine sulfoxide, methionine methyl sulfonium. These analogs have modified R groups (for example, norleukin) or modified peptide structures, but maintain the same basic chemical structure as a naturally occurring amino acid. Amino acid mimetics refer to chemical compounds that have a different structure from the general chemical structure of an amino acid, but that work in a similar way to a naturally occurring amino acid. Suitable amino acids include, without limitation, both the D and L isomers of the 20 naturally occurring common amino acids found in peptides, as well as the naturally occurring and non-naturally occurring amino acids prepared by organic synthesis or other metabolic pathways. Examples of such non-naturally occurring amino acids include, but are not limited to, N-acetylglucosaminyl-L-serine, N-acetylglucosaminyl-L-threonine and O-phosphotyrosine. The modified amino acids include, but are not limited to, hydroxyproline,
piroglutamato, gama-carboxiglutamato, O-fosfoserina, ácido azetidinocarboxílico, ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, beta-alanina, ácido aminopropriônico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4- aminobutírico, ácido 6-aminocapróico, ácido 2-aminoheptanóico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, butilglicina terciária, ácido 2,4-diaminoisobutírico, desmosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropriônico, N-etilglicina, N- metilglicina, N-etilasparagina, homoprolina, hidroxilisina, alo- hidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo- isoleucina, N-metilalanina, N-metilglicina, metilisoleucina, N- metilpentilglicina, N-metilvalina, naftalanina, norvalina, norleucina, ornitina, pentilglicina, ácido pipecólico e tioprolina. O termo aminoácido também inclui aminoácidos de ocorrência natural que são metabólitos em certos organismos, mas não são codificados pelo código genético para incorporação em proteínas. Esses aminoácidos incluem, mas não estão limitados a, ornitina, D-ornitina e D-arginina.pyroglutamate, gamma-carboxyglutamate, O-phosphoserine, azetidinecarboxylic acid, 2-aminoadipic acid, 3-aminoadipic acid, beta-alanine, aminoproprionic acid, 2-aminobutyric acid, 4-aminobutyric acid, 6-aminocaproic acid, 2-amino acid 2-aminoisobutyric acid, 3-aminoisobutyric acid, 2-aminopimelic acid, tertiary butylglycine, 2,4-diaminoisobutyric acid, desmosine, 2,2'-diaminopimelic acid, 2,3-diaminoproprionic acid, N-ethylglycine, N-methylglycine, N-ethylparagine, homoproline, hydroxylysine, allohydroxyproline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline, isodesmosine, allo-isoleucine, N-methylalanine, N-methylglycine, methylisoleucine, N-methylpentylglycine, N-methylvaline, norftalan, norftal ornithine, pentylglycine, pipecolic acid and thioproline. The term amino acid also includes naturally occurring amino acids that are metabolites in certain organisms, but are not encoded by the genetic code for incorporation into proteins. These amino acids include, but are not limited to, ornithine, D-ornithine and D-arginine.
[064] O termo "anticorpo" refere-se a uma imunoglobulina, seja ela geneticamente modificada, natural ou produzida total ou parcialmente sintética ou recombinantemente. Os anticorpos intactos tipicamente compreendem uma cadeia pesada e uma cadeia leve, cada uma composta por um domínio variável formando a bolsa de ligação para um antígeno e um domínio constante que contribui para a função efetora. O anticorpo, em virtude de sua cadeia pesada escolhida, pode ser um membro de qualquer classe e subclasse de imunoglobulina, incluindo qualquer uma das classes humanas: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, ou um derivado ou fragmento dos mesmos. Da mesma forma, a cadeia leve do anticorpo pode derivar de qualquer espécie, tal como uma cadeia leve kapa (κ) ou lambda (λ) humana, determinada com base nas sequências de aminoácidos do domínio constante.[064] The term "antibody" refers to an immunoglobulin, whether it is genetically modified, natural or produced wholly or partially synthetic or recombinantly. Intact antibodies typically comprise a heavy chain and a light chain, each composed of a variable domain forming the binding pocket for an antigen and a constant domain that contributes to the effector function. The antibody, by virtue of its chosen heavy chain, can be a member of any immunoglobulin class and subclass, including any of the human classes: IgG, IgM, IgA, IgD and IgE, or a derivative or fragment thereof. Likewise, the antibody light chain can be derived from any species, such as a human kappa (κ) or lambda (λ) light chain, determined based on the amino acid sequences of the constant domain.
[065] A unidade estrutural básica do anticorpo compreende tipicamente um tetrâmero.[065] The basic structural unit of the antibody typically comprises a tetramer.
Em várias modalidades, o tetrâmero compreende dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 KDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50 a 70 KDa). A porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento do antígeno.In various embodiments, the tetramer comprises two identical pairs of polypeptide chains, each pair having a "light" chain (about 25 KDa) and a "heavy" chain (about 50 to 70 KDa). The amino-terminal portion of each chain includes a variable region of about 100 to 110 or more amino acids primarily responsible for antigen recognition.
A porção carbóxi-terminal de cada cadeia define uma região constante principalmente responsável pela função efetora.The carboxy-terminal portion of each chain defines a constant region primarily responsible for the effector function.
As cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves kapa e lambda.Human light chains are classified as kappa and lambda light chains.
As cadeias pesadas são classificadas como mu, delta, gama, alfa ou épsilon e definem o isótipo do anticorpo como IgM, IgD, IgA e IgE, respectivamente.Heavy chains are classified as mu, delta, gamma, alpha or epsilon and define the antibody isotype as IgM, IgD, IgA and IgE, respectively.
Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região "D" de cerca de 10 ou mais aminoácidos.Within the light and heavy chains, the variable and constant regions are joined by a "J" region of about 12 or more amino acids, with the heavy chain also including a "D" region of about 10 or more amino acids.
Vide genericamente, Fundamental Immunology Cap. 7. (Paul, W., 2ª ed.See generally, Fundamental Immunology Cap. 7. (Paul, W., 2nd ed.
Raven Press, N.Y. (1989)) (incorporado por referência na sua totalidade para todos os efeitos). As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada formam o sítio de ligação do anticorpo.Raven Press, N.Y. (1989)) (incorporated by reference in its entirety for all purposes). The variable regions of each light / heavy chain pair form the antibody binding site.
Assim, um anticorpo intacto normalmente tem dois sítios de ligação.Thus, an intact antibody usually has two binding sites.
Exceto em anticorpos bifuncionais ou biespecíficos, os dois sítios de ligação são iguais.Except for bifunctional or bispecific antibodies, the two binding sites are the same.
Todas as cadeias exibem a mesma estrutura geral de regiões estruturais relativamente conservadas (FR) unidas por três regiões hipervariáveis, também chamadas de regiões determinantes de complementaridade ou CDRs.All chains exhibit the same general structure as relatively conserved structural regions (FR) joined by three hypervariable regions, also called complementarity determining regions or CDRs.
As CDRs das duas cadeias de cada par são alinhadas pelas regiões estruturais, permitindo a ligação a um epítopo específico.The CDRs of the two chains of each pair are aligned by the structural regions, allowing the connection to a specific epitope.
Do terminal N ao terminal C, ambas as cadeias leve e pesada compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A atribuição de aminoácidos a cada domínio pode ser feita de acordo com o sistema de numeração IMGT. As definições alternativas também são conhecidas pelos versados na técnica. Vide, por exemplo, Sequências de Kabat de Proteínas de Interesse Immunológico (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991)), ou Clothia & Lesk J. Mol. Biol. 196: 901 a 917 (1987); Clothia et al. Nature 342: 878-883 (1989).From terminal N to terminal C, both light and heavy chains comprise the FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4 domains. The assignment of amino acids to each domain can be done according to the IMGT numbering system. Alternative definitions are also known to those skilled in the art. See, for example, Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), or Clothia & Lesk J. Mol. Biol. 196: 901 to 917 (1987); Clothia et al. Nature 342: 878-883 (1989).
[066] "Fragmento de anticorpo" ou "fragmento de ligação ao antígeno" compreende uma porção de um anticorpo de comprimento total, geralmente pelo menos a porção/domínio de ligação ao antígeno ou a região variável do mesmo. O termo fragmento de anticorpo é um subconjunto do termo anticorpo discutido acima. Exemplos de fragmentos de anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno incluem: Fab, Fab', F(ab')2, Fd, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, fragmento Fv, diacorpos, moléculas de anticorpo de cadeia simples, imunotoxinas e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. Além disso, os fragmentos de anticorpo compreendem polipeptídeos de cadeia simples com as características de uma cadeia VH que se liga a tau patológica, nomeadamente sendo capaz de se montar junto com uma cadeia VL ou de uma cadeia VL que se liga a tau patológica, nomeadamente sendo capaz de se montar junto com uma cadeia VH para formar uma bolsa de ligação ao antígeno funcional e, assim, fornecer a propriedade de ligação a tau. Os termos também compreendem fragmentos que per se não são capazes de fornecer funções efetoras (por exemplo, citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos ("ADCC") ou citotoxicidade dependente de complemento ("CDC"), mas fornecem esta função após serem combinados com o anticorpo apropriado domínio (s) constante (s).[066] "Antibody fragment" or "antigen binding fragment" comprises a portion of a full length antibody, generally at least the antigen binding portion / domain or variable region thereof. The term antibody fragment is a subset of the term antibody discussed above. Examples of antibody fragments or antigen binding fragments include: Fab, Fab ', F (ab') 2, Fd, scFv, (scFv) 2, scFv-Fc, Fv fragment, diabody, single chain antibody molecules, immunotoxins and multispecific antibodies formed from antibody fragments. In addition, the antibody fragments comprise single chain polypeptides with the characteristics of a VH chain that binds pathological tau, namely being able to assemble together with a VL chain or a VL chain that binds pathological tau, namely being able to assemble together with a VH chain to form a functional antigen binding pouch and thus providing the tau binding property. The terms also comprise fragments that per se are unable to provide effector functions (for example, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity ("ADCC") or complement-dependent cytotoxicity ("CDC"), but provide this function after being combined with the appropriate antibody constant domain (s).
[067] Um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo "capaz de se ligar a tau", tal como no presente documento utilizado, refere-se a um anticorpo ou fragmento de ligação que se liga preferivelmente a tau em relação a outros alvos de antígeno. O termo é intercambiável com um anticorpo "anti-tau" ou um "anticorpo que se liga a tau". Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação capaz de se ligar a tau pode fazê-lo com maior afinidade para aquele antígeno do que outros. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação capaz de se ligar a tau pode se ligar a esse antígeno com um KD de pelo menos cerca de 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-11, 10-12 ou maior (ou qualquer valor entre), por exemplo, como medido por ressonância plasmônica de superfície ou outros métodos conhecidos do especialista na técnica.[067] An antibody or binding fragment thereof "capable of binding tau", as used herein, refers to an antibody or binding fragment that binds preferentially to tau over other antigen targets . The term is interchangeable with an "anti-tau" antibody or an "antibody that binds tau". In some embodiments, the antibody or binding fragment capable of binding to tau may do so with greater affinity for that antigen than others. In some embodiments, the antibody or binding fragment capable of binding to tau can bind to that antigen with a KD of at least about 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-11, 10-12 or greater (or any value in between), for example, as measured by surface plasmon resonance or other methods known to the person skilled in the art .
[068] O termo anticorpos "quiméricos" refere-se a anticorpos nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencente a uma classe ou subclasse de anticorpo particular (por exemplo, anticorpos quiméricos humanizados, de classe trocada), enquanto o restante da cadeia (s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (Patente U.S. No. 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 a 6855 (1984)).[068] The term "chimeric" antibodies refers to antibodies in which a portion of the heavy and / or light chain is identical or homologous to the corresponding sequences in antibodies derived from a particular species or belonging to a particular antibody class or subclass ( for example, humanized chimeric antibodies, of switched class), while the rest of the chain (s) is identical or homologous to the corresponding sequences in antibodies derived from another species or belonging to another class or subclass of antibodies, as well as fragments of such antibodies, provided they exhibit the desired biological activity (US Patent No. 4,816,567; and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 to 6855 (1984)).
[069] Em uma modalidade, o termo "anticorpo quimérico" refere- se a um anticorpo monoclonal que compreende uma região variável de uma fonte ou espécie e pelo menos uma porção de uma região constante derivada de uma fonte ou espécie diferente, geralmente preparada por técnicas de DNA recombinante. Em algumas modalidades, os anticorpos quiméricos compreendem uma região variável murina e uma região constante humana. Tais anticorpos quiméricos murinos/humanos podem ser produzidos expressando genes de imunoglobulina compreendendo segmentos de DNA que codificam regiões variáveis de imunoglobulina murina e segmentos de DNA que codificam regiões constantes de imunoglobulina humana. Outras formas de "anticorpos quiméricos" podem ser aquelas em que a classe ou subclasse foi modificada ou alterada daquela do anticorpo original. Esses anticorpos "quiméricos" também são referidos como "anticorpos de troca de classe". Os métodos para a produção de anticorpos quiméricos envolvem técnicas convencionais de DNA recombinante e de transfecção de genes agora conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Morrison, S. L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851 a 6855; Patente U.S. Nos. 5.202.238 e 5.204.244.[069] In one embodiment, the term "chimeric antibody" refers to a monoclonal antibody that comprises a variable region from one source or species and at least a portion of a constant region derived from a different source or species, usually prepared by recombinant DNA techniques. In some embodiments, chimeric antibodies comprise a murine variable region and a human constant region. Such chimeric / human chimeric antibodies can be produced by expressing immunoglobulin genes comprising segments of DNA that encode variable regions of murine immunoglobulin and DNA segments that encode constant regions of human immunoglobulin. Other forms of "chimeric antibodies" may be those in which the class or subclass has been modified or altered from that of the original antibody. These "chimeric" antibodies are also referred to as "class-switching antibodies". Methods for producing chimeric antibodies involve conventional recombinant DNA and gene transfection techniques now known in the art. See, for example, Morrison, S. L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851 to 6855; U.S. Patent Nos. 5,202,238 and 5,204,244.
[070] "Ligação competitiva" pode ser determinada em um ensaio no qual a imunoglobulina/anticorpo/fragmento de ligação em teste inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum, tal como tau (por exemplo, tau SEQ ID No 12). Numerosos tipos de ensaios de ligação competitiva são conhecidos, por exemplo: radioimunoensaio direto ou indireto em fase sólida (RIA), imunoensaio enzimático direto ou indireto em fase sólida (EIA), ensaio de competição em sanduíche (vide Stahli et al., Methods in Enzymology 9: 242 (1983)); EIA direto de biotina-avidina em fase sólida (vide Kirkland et al., J. Immunol 137: 3614 (1986)); ensaio de marcação direta em fase sólida, ensaio em sanduíche de marcação direta em fase sólida (vide Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA de marcador direto em fase sólida usando marcador I125 (vide Morel et al., Mol. Immunol. 25 (1): 7 (1988): EIA biotina-avidina de fase sólida (Cheung et al., Virology 176: 546 (1990)); e RIA marcado direto. (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)). Em algumas modalidades, tal ensaio envolve o uso de antígeno purificado ligado a uma superfície sólida ou células contendo qualquer um destes, uma imunoglobulina de teste não marcada e uma imunoglobulina de referência marcada. A inibição competitiva pode ser medida determinando a quantidade de marcador ligada à superfície sólida ou células na presença da imunoglobulina de teste. Em algumas modalidades, a imunoglobulina de teste está presente em excesso. Normalmente, quando um anticorpo competidor está presente em excesso, ele inibirá a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum em pelo menos 50 a 55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% ou Mais.[070] "Competitive binding" can be determined in an assay in which the immunoglobulin / antibody / binding fragment under test inhibits specific binding of a reference antibody to a common antigen, such as tau (eg tau SEQ ID No 12). Numerous types of competitive binding assays are known, for example: direct or indirect solid phase radioimmunoassay (RIA), direct or indirect solid phase enzyme immunoassay (EIA), sandwich competition assay (see Stahli et al., Methods in Enzymology 9: 242 (1983)); Direct EIA of biotin-avidin in solid phase (see Kirkland et al., J. Immunol 137: 3614 (1986)); direct solid-phase marking assay, solid-phase direct-marking sandwich assay (see Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); Direct solid-phase marker RIA using marker I125 (see Morel et al., Mol. Immunol. 25 (1): 7 (1988): solid-phase biotin-avidin EIA (Cheung et al., Virology 176: 546 (1990 )); and direct labeled RIA. (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)). In some embodiments, such an assay involves the use of purified antigen attached to a solid surface or cells containing any of these, an unlabeled test immunoglobulin and a labeled reference immunoglobulin. Competitive inhibition can be measured by determining the amount of marker bound to the solid surface or cells in the presence of the test immunoglobulin. In some embodiments, the test immunoglobulin is present in Normally, when a competing antibody is present in excess, it will inhibit specific binding of a reference antibody to a common antigen by at least 50 to 55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% or more.
[071] O termo "conjugado", tal como no presente documento utilizado, refere-se a uma ligação ou porção química formada a partir de uma reação química entre um grupo funcional de uma primeira molécula (por exemplo, um anticorpo) com um grupo funcional de uma segunda molécula (por exemplo, um sinal detectável ou agente terapêutico ou droga). Tais ligações incluem, mas não estão limitadas a, ligações covalentes e ligações não covalentes, enquanto tais porções químicas incluem, mas não estão limitadas a, ésteres, carbonatos, ésteres de fosfato de iminas, hidrazonas, acetais, ortoésteres, ligações peptídicas e ligações oligonucleotídicas.[071] The term "conjugate", as used herein, refers to a chemical bond or moiety formed from a chemical reaction between a functional group of a first molecule (for example, an antibody) with a group of a second molecule (for example, a detectable signal or therapeutic agent or drug). Such bonds include, but are not limited to, covalent bonds and non-covalent bonds, while such chemical moieties include, but are not limited to, esters, carbonates, imine phosphate esters, hydrazones, acetals, orthoesters, peptide bonds and oligonucleotide bonds .
[072] "Atrasar a progressão" e "prevenir a progressão" refere-se à administração de um agente terapêutico a um paciente suscetível a, ou de outra forma em risco de, uma doença específica, como a AD. A prevenção abrange a administração profilática a um objeto em risco de AD. Qualquer pessoa na população em geral está em risco de AD. Alguns indivíduos apresentam um risco aumentado de AD. Alguns indivíduos apresentam um risco genético aumentado de AD. Atrasar a progressão e prevenir a progressão pode eliminar ou reduzir o risco ou retardar o início da doença. O atraso no início ou progressão da AD pode ser medido comparando-se aos cronogramas padrão de progressão da doença em populações ou indivíduos similares. Vide Ostrowitzki et al., Alzherimers Res Ther., 9 (1): 95, 2017. Modalidades ilustrativas e exemplares específicas para atrasar a progressão são descritas abaixo.[072] "Delaying progression" and "preventing progression" refers to the administration of a therapeutic agent to a patient susceptible to, or otherwise at risk for, a specific disease, such as AD. Prevention includes prophylactic administration to an object at risk for AD. Anyone in the general population is at risk for AD. Some individuals have an increased risk of AD. Some individuals have an increased genetic risk of AD. Delaying progression and preventing progression can eliminate or reduce the risk or delay the onset of the disease. The delay in the onset or progression of AD can be measured by comparing to the standard schedules of disease progression in populations or similar individuals. See Ostrowitzki et al., Alzherimers Res Ther., 9 (1): 95, 2017. Specific illustrative and exemplary modalities to delay progression are described below.
[073] O termo "epítopo" refere-se a um sítio em um antígeno ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo (ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) pode se ligar especificamente. Assim, um epítopo em tau é o sítio em tau onde uma imunoglobulina ou anticorpo (ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) pode se ligar especificamente. A ligação específica se refere, em algumas modalidades, à ligação que é mensuravelmente diferente de uma interação não específica. A ligação específica pode ser medida, por exemplo, determinando a ligação de uma molécula em comparação com a ligação de uma molécula de controle, que geralmente é uma molécula de estrutura similar que não tem atividade de ligação, ou por ensaio de competição com uma molécula de controle que compartilha ligação similar afinidade, mas não está rotulada. Neste caso, a ligação específica é indicada se a ligação do alvo marcado a uma sonda for inibida competitivamente por excesso de alvo não marcado. O termo pode ser exibido, por exemplo, por uma molécula com um KD para o alvo de pelo menos cerca de 10-4 M, alternativamente pelo menos cerca de 10-5 M, alternativamente pelo menos cerca de 10-6 M, alternativamente pelo menos cerca de 10−7 M, alternativamente pelo menos cerca de 10−8 M, alternativamente pelo menos cerca de 10−9 M, alternativamente pelo menos cerca de 10−10 M, alternativamente pelo menos cerca de 10−11 M, alternativamente pelo menos cerca de 10 −12 M ou mais. Em uma modalidade, o termo "ligação específica" refere-se à ligação onde uma molécula se liga a um polipeptídeo ou epítopo particular em um polipeptídeo particular sem se ligar substancialmente a qualquer outro polipeptídeo ou epítopo.[073] The term "epitope" refers to a site on an antigen to which an immunoglobulin or antibody (or antigen-binding fragment thereof) can specifically bind. Thus, a tau epitope is the site in tau where an immunoglobulin or antibody (or antigen-binding fragment thereof) can specifically bind. The specific connection refers, in some modalities, to the connection that is measurably different from a non-specific interaction. Specific binding can be measured, for example, by determining the binding of a molecule compared to the binding of a control molecule, which is generally a molecule of similar structure that has no binding activity, or by competition testing with a molecule control that shares similar affinity binding, but is not labeled. In this case, specific binding is indicated if the binding of the labeled target to a probe is competitively inhibited by excess of unlabeled target. The term can be displayed, for example, by a molecule with a KD for the target of at least about 10-4 M, alternatively at least about 10-5 M, alternatively at least about 10-6 M, alternatively at least about 10−7 M, alternatively at least about 10−8 M, alternatively at least about 10−9 M, alternatively at least about 10−10 M, alternatively at least about 10−11 M, alternatively at least about 10 −12 M or more. In one embodiment, the term "specific binding" refers to the binding where a molecule binds to a particular polypeptide or epitope on a particular polypeptide without substantially binding to any other polypeptide or epitope.
[074] Um epítopo, como o termo é usado no presente documento, pode ser formado a partir de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos por dobramento terciário de uma proteína. Um epítopo pode incluir extensões adicionais de aminoácidos em torno de uma região central ligada por um anticorpo, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 ou mais aminoácidos no terminal N e/ou C de um peptídeo de epítopo central. Epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são normalmente retidos na exposição a solventes desnaturantes, enquanto os epítopos formados por dobramento terciário são normalmente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo inclui tipicamente pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos, muitas vezes em uma conformação espacial única. Os métodos para determinar a conformação espacial de epítopos incluem, por exemplo, varredura de alanina, cristalografia de raios-X e ressonância magnética nuclear bidimensional. Vide, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996). Métodos exemplares são discutidos e usados no presente documento para os anticorpos descritos. Um "epítopo conformacional" é um epítopo ao qual o anticorpo ou fragmento de ligação a tau se liga de uma maneira específica conformacional. No caso de epítopos baseados em proteínas, a ligação pode depender da estrutura secundária, terciária ou quaternária da proteína portadora do epítopo. Por outras palavras, o anticorpo liga-se de uma forma específica de estrutura ou de uma forma específica de estrutura quaternária.[074] An epitope, as the term is used in this document, can be formed from contiguous amino acids or non-contiguous amino acids juxtaposed by tertiary folding of a protein. An epitope can include additional extensions of amino acids around a central region linked by an antibody, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 or more amino acids at the N and / or C terminus of a peptide central epitope. Epitopes formed from contiguous amino acids are normally retained on exposure to denaturing solvents, while epitopes formed by tertiary folding are usually lost in treatment with denaturing solvents. An epitope typically includes at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 amino acids, often in a single spatial conformation. Methods for determining the spatial conformation of epitopes include, for example, alanine scanning, X-ray crystallography and two-dimensional nuclear magnetic resonance. See, for example, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996). Exemplary methods are discussed and used in the present document for the described antibodies. A "conformational epitope" is an epitope to which the tau-binding antibody or fragment binds in a specific conformational manner. In the case of protein-based epitopes, the binding may depend on the secondary, tertiary or quaternary structure of the protein carrying the epitope. In other words, the antibody binds to a specific form of structure or to a specific form of quaternary structure.
[075] Um epítopo em tau, conforme discutido no presente documento, é identificado com referência aos resíduos de aminoácidos na proteína tau 2N4R. Um especialista na técnica poderia identificar prontamente os resíduos de aminoácidos correspondentes em outras isoformas e fragmentos de tau, por exemplo, por meio de programas de alinhamento, como BLAST®. Salvo indicação em contrário, uma referência a um resíduo de aminoácido particular em tau refere-se à proteína tau 2N4R e deve ser entendida como abrangendo as posições correspondentes em outras isoformas e fragmentos de tau.[075] An epitope in tau, as discussed in this document, is identified with reference to the amino acid residues in the 2N4R tau protein. A person skilled in the art could readily identify the corresponding amino acid residues in other isoforms and fragments of tau, for example, by means of alignment programs such as BLAST®. Unless otherwise indicated, a reference to a particular amino acid residue in tau refers to the 2N4R tau protein and is to be understood as covering the corresponding positions in other tau isoforms and fragments.
[076] Os fragmentos "Fab" podem ser produzidos por digestão de anticorpos com papaína, cada um com um único sítio de ligação ao antígeno e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflete sua capacidade de cristalizar prontamente (fragmento cristalizável). O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab’)2 que tem dois sítios de ligação ao antígeno e ainda é capaz de reticular o antígeno. “Fv” é a porção da região variável de cadeia pesada que está incluída no fragmento Fab. Qualquer um desses fragmentos também pode ser produzido de forma recombinante. A porção Fc de um anticorpo está associada às funções efetoras do anticorpo, incluindo citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento ou fagocitose. Alterações (por exemplo, mutações ou alterações de glicosilação) na região Fc de um anticorpo podem ser usadas para modular qualquer uma de suas funções efetoras, bem como aumentar sua meia-vida sérica e outras propriedades farmacocinéticas.[076] "Fab" fragments can be produced by digesting antibodies with papain, each with a single antigen-binding site and a residual "Fc" fragment, whose name reflects its ability to readily crystallize (crystallizable fragment). Treatment with pepsin produces an F (ab ') 2 fragment that has two antigen-binding sites and is still capable of cross-linking the antigen. "Fv" is the portion of the heavy chain variable region that is included in the Fab fragment. Any of these fragments can also be produced recombinantly. The Fc portion of an antibody is associated with the effector functions of the antibody, including antibody-dependent cell cytotoxicity (ADCC) and complement-dependent cytotoxicity or phagocytosis. Changes (for example, mutations or changes in glycosylation) in the Fc region of an antibody can be used to modulate any of its effector functions, as well as increase its serum half-life and other pharmacokinetic properties.
[077] O fragmento Fab também contém o domínio constante de cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' tipicamente diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carbóxi do domínio CH1 da cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação no presente documento para Fab' em que o resíduo (s) de cisteína dos domínios constantes possuem pelo menos um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab’)2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas de dobradiça entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.[077] The Fab fragment also contains the light chain constant domain and the first heavy chain constant domain (CH1). Fab 'fragments typically differ from Fab fragments by adding some residues at the carboxy terminus of the CH1 domain of the heavy chain, including one or more cysteines from the antibody hinge region. Fab'-SH is the designation herein for Fab 'where the cysteine residue (s) of the constant domains have at least one free thiol group. The F (ab ') 2 antibody fragments were originally produced as pairs of Fab' fragments that have hinge cysteines between them. Other chemical couplings of antibody fragments are also known.
[078] O termo "Fc", conforme usado no presente documento, inclui o polipeptídeo que compreende a região constante de um anticorpo, excluindo o primeiro domínio de imunoglobulina de região constante.[078] The term "Fc", as used herein, includes the polypeptide that comprises the antibody constant region, excluding the first constant region immunoglobulin domain.
Assim, Fc refere-se aos dois últimos domínios de imunoglobulina de região constante de IgA, IgD e IgG, e os últimos três domínios de imunoglobulina de região constante de IgE e IgM, e o terminal N de dobradiça flexível para esses domínios.Thus, Fc refers to the last two domains of IgA constant region immunoglobulin, IgD and IgG, and the last three domains of immunoglobulin constant region IgE and IgM, and the flexible hinge N-terminal for these domains.
Para IgA e IgM, Fc pode incluir a cadeia J.For IgA and IgM, Fc can include the J chain.
Para IgG, Fc compreende domínios de imunoglobulina C gama 2 e C gama 3 (Cgama2 e Cgama3) e a dobradiça entre C gama 1 (Cgama1) e C gama 2 (Cgama2). Embora os limites da região Fc possam variar, a região Fc de cadeia pesada de IgG humana é geralmente definida para compreender os resíduos C226 ou P230 até o seu terminal carboxila, em que a numeração é de acordo com o sistema de numeração EU (Edelman GM et al., (1969) Proc.For IgG, Fc comprises domains of immunoglobulin C gamma 2 and C gamma 3 (Cgama2 and Cgama3) and the hinge between C gamma 1 (Cgama1) and C gamma 2 (Cgama2). Although the limits of the Fc region may vary, the human IgG heavy chain Fc region is generally defined to comprise residues C226 or P230 up to its carboxyl terminus, where the numbering is in accordance with the EU numbering system (Edelman GM et al., (1969) Proc.
Natl.Natl.
Acad.Acad.
Sci.Sci.
USA, 63 (1); 78-85). A lisina de terminal C (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a produção ou purificação do anticorpo, ou por engenharia recombinante do ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada do anticorpo.USA, 63 (1); 78-85). The C-terminal lysine (residue 447 according to the EU numbering system) from the Fc region can be removed, for example, during production or purification of the antibody, or by recombinant engineering of the nucleic acid encoding an antibody heavy chain.
Consequentemente, uma composição de anticorpos intactos pode compreender populações de anticorpos com todos os resíduos K447 removidos, populações de anticorpos sem resíduos K447 removidos e populações de anticorpos tendo uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo K447. Fc pode referir-se a esta região isolada ou a esta região no contexto de um polipeptídeo Fc, por exemplo, um anticorpo.Consequently, an intact antibody composition can comprise antibody populations with all K447 residues removed, antibody populations without K447 residues removed and antibody populations having a mixture of antibodies with and without the K447 residue. Fc can refer to this isolated region or to this region in the context of an Fc polypeptide, for example, an antibody.
O Fc pode ser um Fc de sequência nativa ou um Fc variante.The Fc can be a native sequence Fc or a variant Fc.
As substituições de resíduos de aminoácidos na porção Fc para alterar a função efetora do anticorpo são conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Winter et al., Patentes U.S.Substitutions for amino acid residues in the Fc portion to alter the effector function of the antibody are known in the art (see, for example, Winter et al., U.S. Patents
Nos. 5.648.260 e 5.624.821). Um Fc adequado, descrito no pedido PCT WO 93/10151 (no presente documento incorporado por referência), é um polipeptídeo de cadeia única se estendendo da região de dobradiça terminal N para o terminal C nativo da região Fc de um anticorpo IgG1 humano. Outro polipeptídeo Fc útil é a muteína Fc descrita na Pat. No. 5.457.035 e em Baum et al., 1994, EMBO J. 13: 3992-4001. A sequência de aminoácidos desta muteína é idêntica à da sequência Fc nativa apresentada em WO 93/10151, exceto que o aminoácido 19 foi alterado de Leu para Ala, o aminoácido 20 foi alterado de Leu para Glu e o aminoácido 22 foi alterado de Gly para Ala. A muteína pode exibir afinidade reduzida para os receptores Fc.U.S. 5,648,260 and 5,624,821). A suitable Fc, described in PCT application WO 93/10151 (hereby incorporated by reference), is a single chain polypeptide extending from the N-terminal hinge region to the C-terminal native to the Fc region of a human IgG1 antibody. Another useful Fc polypeptide is the Fc mutein described in U.S. Pat. No. 5,457,035 and in Baum et al., 1994, EMBO J. 13: 3992-4001. The amino acid sequence of this mutein is identical to that of the native Fc sequence presented in WO 93/10151, except that amino acid 19 has been changed from Leu to Ala, amino acid 20 has been changed from Leu to Glu and amino acid 22 has been changed from Gly to Allah. Mutein may exhibit reduced affinity for Fc receptors.
[079] "Fv" refere-se ao fragmento mínimo de anticorpo que contém um reconhecimento de antígeno completo e sítio de ligação ao antígeno. Esta região consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em forte associação não covalente. É nesta configuração que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação ao antígeno na superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação ao antígeno para o anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três regiões hipervariáveis específicas para um antígeno) pode ter a capacidade de reconhecer e ligar um antígeno, embora com uma afinidade mais baixa do que todo o sítio de ligação.[079] "Fv" refers to the minimum antibody fragment that contains a complete antigen recognition and antigen binding site. This region consists of a dimer of a heavy chain variable domain and a light chain variable domain in strong non-covalent association. It is in this configuration that the three hypervariable regions of each variable domain interact to define an antigen-binding site on the surface of the VH-VL dimer. Collectively, the six hypervariable regions confer antigen-binding specificity to the antibody. However, even a single variable domain (or half of an Fv comprising only three hypervariable regions specific for an antigen) may have the ability to recognize and bind an antigen, albeit with a lower affinity than the entire binding site.
[080] Tal como no presente documento utilizado, um anticorpo humanizado que compreende uma "região estrutural" variável de cadeia pesada ou leve a partir de uma sequência de imunoglobulina de linhagem germinativa humana particular pode conter diferenças de aminoácidos em comparação com a região estrutural variável de cadeia pesada ou leve da sequência de linhagem germinativa particular, devido a, por exemplo, mutações somáticas de ocorrência natural ou introdução intencional de mutação direcionada ao sítio. Em várias modalidades, um anticorpo humanizado selecionado pode ser pelo menos 90% idêntico na sequência de aminoácidos da região estrutural variável de cadeia pesada ou leve com uma sequência de aminoácidos codificada pela região estrutural variável de cadeia pesada ou leve de um gene de imunoglobulina de linhagem germinativa humana e contém resíduos de aminoácidos que identificam o anticorpo humanizado como sendo derivado do humano quando comparado com as sequências de aminoácidos da imunoglobulina da linhagem germinativa de outras espécies (por exemplo, sequências da linhagem germinativa murina). Em certos casos, um anticorpo humanizado pode compartilhar pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência de aminoácidos com a região estrutural variável de cadeia pesada ou leve codificada pelo gene da imunoglobulina da linhagem germinativa. Em algumas modalidades, a região estrutural variável de cadeia pesada ou leve de um anticorpo humanizado derivado de uma sequência de linhagem germinativa humana particular exibirá não mais do que 11 aminoácidos, preferivelmente não mais do que 5, ou ainda mais preferivelmente não mais do que 4, 3, 2, ou 1 diferenças da sequência de aminoácidos da região estrutural variável de cadeia pesada ou leve codificada pelo gene da imunoglobulina da linhagem germinativa humana.[080] As used herein, a humanized antibody comprising a variable heavy or light chain "framework region" from a particular human germline immunoglobulin sequence may contain amino acid differences compared to the variable framework region heavy or light chain of the particular germline sequence, due to, for example, naturally occurring somatic mutations or intentional introduction of site-directed mutation. In several embodiments, a selected humanized antibody can be at least 90% identical in the amino acid sequence of the heavy or light chain variable structural region with an amino acid sequence encoded by the heavy or light heavy chain variable region of a lineage immunoglobulin gene. human germline and contains amino acid residues that identify the humanized antibody as being derived from the human when compared to the germline immunoglobulin amino acid sequences of other species (eg murine germline sequences). In certain cases, a humanized antibody may share at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more amino acid sequence identity with the heavy or light chain variable structural region encoded by the immunoglobulin gene of the germ line. In some embodiments, the heavy or light chain variable structural region of a humanized antibody derived from a particular human germline sequence will exhibit no more than 11 amino acids, preferably no more than 5, or even more preferably no more than 4 , 3, 2, or 1 amino acid sequence differences from the heavy or light chain variable structural region encoded by the human germline immunoglobulin gene.
[081] Resíduos de "região estrutural" ou "FR" são aqueles resíduos de domínio variável que não os resíduos da região hipervariável, conforme definido no presente documento. Eles agrupam as regiões hipervariáveis no domínio variável. Os resíduos de FR podem ser identificados de acordo com um sistema de numeração padrão, por exemplo, os esquemas de numeração Kabat, Chothia ou Chotia modificado. No sistema de numeração único IMGT, os aminoácidos conservados sempre têm a mesma posição, por exemplo,[081] "Structural region" or "FR" wastes are wastes from the variable domain other than wastes from the hypervariable region, as defined in this document. They group the hypervariable regions in the variable domain. RF residues can be identified according to a standard numbering system, for example, the modified Kabat, Chothia or Chotia numbering schemes. In the IMGT unique numbering system, conserved amino acids always have the same position, for example,
cisteína 23 (1º-CYS), triptofano 41 (CONSERVED-TRP), aminoácido hidrofóbico 89, cisteína 104 (2º-CYS), fenilalanina ou triptofano 118 (J- PHE ou J-TRP). Vide, por exemplo, Lefranc M. P., Immunology Today 18, 509 (1997); Lefranc M. P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M. P., Pommié, C., Ruiz, M., Guidicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. e Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003). Em outra modalidade, a numeração única IMGT fornece uma delimitação padronizada das regiões estruturais (FR1 a IMGT: posições 1 a 26, FR2-IMGT: 39-55, FR3-IMGT: 66-104 e FR4-IMGT: 118 a 128) e das regiões determinantes de complementaridade: CDR1 a IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 e CDR3-IMGT: 105 a 117. A numeração única IMGT pode ser usada em representações gráficas 2D, designadas como IMGT Colliers de Peries. Vide, por exemplo, Ruiz, M. e Lefranc, M. P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002); Kaas, Q. e Lefranc, M. P., Current Bioinformatics, 2, 21 a 30 (2007). Também pode ser usada para representar estruturas 3D. Vide, por exemplo, IMGT/3Dstructure-DB Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M. P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004).cysteine 23 (1st-CYS), tryptophan 41 (CONSERVED-TRP), hydrophobic amino acid 89, cysteine 104 (2nd-CYS), phenylalanine or tryptophan 118 (J-PHE or J-TRP). See, for example, Lefranc M. P., Immunology Today 18, 509 (1997); Lefranc M. P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M. P., Pommié, C., Ruiz, M., Guidicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003). In another modality, the unique IMGT numbering provides a standardized delimitation of the structural regions (FR1 to IMGT: positions 1 to 26, FR2-IMGT: 39-55, FR3-IMGT: 66-104 and FR4-IMGT: 118 to 128) and of the complementarity determining regions: CDR1 to IMGT: 27 to 38, CDR2-IMGT: 56 to 65 and CDR3-IMGT: 105 to 117. The unique IMGT numbering can be used in 2D graphic representations, designated as IMGT Colliers de Peries. See, for example, Ruiz, M. and Lefranc, M. P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002); Kaas, Q. and Lefranc, M. P., Current Bioinformatics, 2, 21 to 30 (2007). It can also be used to represent 3D structures. See, for example, IMGT / 3Dstructure-DB Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M. P., T cell receiver and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004).
[082] O termo "dobradiça" ou "região de dobradiça" ou "região de dobradiça do anticorpo" no presente documento inclui o polipeptídeo flexível que compreende os aminoácidos entre o primeiro e o segundo domínios constantes de um anticorpo ou fragmento de ligação a tau do mesmo. A "região de dobradiça", conforme referido no presente documento, pode ser uma sequência de 6-62 aminoácidos de comprimento, apenas presente em IgA, IgD e IgG, que engloba os resíduos de cisteína que ligam as duas cadeias pesadas.[082] The term "hinge" or "hinge region" or "antibody hinge region" herein includes the flexible polypeptide comprising the amino acids between the first and the second constant domains of an antibody or tau-binding fragment the same. The "hinge region", as referred to in this document, can be a sequence of 6-62 amino acids in length, only present in IgA, IgD and IgG, which encompasses the cysteine residues that link the two heavy chains.
[083] O termo "anticorpo humano", conforme usado no presente documento, pretende incluir anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana e podem ser, por exemplo, isolados de um ser humano ou produzidos de forma recombinante. As regiões constantes do anticorpo podem ser, por exemplo, as regiões constantes de um anticorpo do tipo IgG1 humano. Tais regiões podem ser alotípicas e são descritas por, por exemplo, Johnson, G. e Wu, T. T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218 e os bancos de dados nele referenciados.[083] The term "human antibody", as used herein, is intended to include antibodies with variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences and can, for example, be isolated from a human or produced recombinantly. . The antibody constant regions can be, for example, the constant regions of a human IgG1 type antibody. Such regions can be allotypical and are described by, for example, Johnson, G. and Wu, T. T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218 and the databases referenced therein.
[084] O termo "anticorpo humanizado" refere-se a anticorpos nos quais as regiões estruturais (FR) e/ou as regiões determinantes de complementaridade (CDR) foram modificadas para compreender resíduos de aminoácidos de uma imunoglobulina de um humano em comparação com aqueles da imunoglobulina parental (por exemplo, resíduos de imunoglobulina parental de camundongo). Em uma modalidade, uma CDR murina é enxertada na região estrutural de um anticorpo humano para preparar o "anticorpo humanizado". Em outra modalidade, estruturas humanas são “enxertadas” ou unidas em anticorpos de camundongo, preservando as CDRs de anticorpo de camundongo e substituindo suas estruturas por estruturas de origem humana. O enxerto e a emenda podem ser feitos por várias tecnologias de DNA recombinante, incluindo PCR e mutagênese. Vários métodos de humanização existem na técnica (por exemplo, enxerto de CDR, remodelagem, animais transgênicos, bibliotecas combinatórias). Vide, por exemplo, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270; Sastry L, Alting-Mess M, Huse WD, Short JM, Sorge JA, Hay BN, Janda KD, Benkoviv SJ, Lerner RA (1989) Cloning of the immunological repertoire for generation of monoclonal catalytic antibodies: construction of a heavy chain variável region-specific cDNA library. Proc Natl Acad Sci USA 86, 5728-5732; e Huse WD, Sastry S, Iverson SA, Kang AS, Alting-Mees M, Burton DR, Benkoviv SJ, Lerner RA (1989) Generation of a large combinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phage lambda.[084] The term "humanized antibody" refers to antibodies in which the structural regions (FR) and / or the complementarity determining regions (CDR) have been modified to comprise amino acid residues from a human's immunoglobulin compared to those of parental immunoglobulin (for example, mouse parental immunoglobulin residues). In one embodiment, a murine CDR is grafted into the structural region of a human antibody to prepare the "humanized antibody". In another embodiment, human structures are "grafted" or joined in mouse antibodies, preserving the mouse antibody CDRs and replacing their structures with structures of human origin. The grafting and splicing can be done by several recombinant DNA technologies, including PCR and mutagenesis. Various humanization methods exist in the art (for example, CDR grafting, remodeling, transgenic animals, combinatorial libraries). See, for example, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270; Sastry L, Alting-Mess M, Huse WD, Short JM, Sorge JA, Hay BN, Janda KD, Benkoviv SJ, Lerner RA (1989) Cloning of the immunological repertoire for generation of monoclonal catalytic antibodies: construction of a heavy chain variable region -specific cDNA library. Proc Natl Acad Sci USA 86, 5728-5732; and Huse WD, Sastry S, Iverson SA, Kang AS, Alting-Mees M, Burton DR, Benkoviv SJ, Lerner RA (1989) Generation of a large combinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phage lambda.
Science 246, 1275-1281. Em algumas modalidades, os anticorpos humanizados são mais similares aos humanos, embora mantenham suas propriedades de ligação ao antígeno originais.Science 246, 1275-1281. In some embodiments, humanized antibodies are more similar to humans, although they retain their original antigen-binding properties.
Presta, L.G.Presta, L.G.
Engineering of therapeutic antibodies to minimize immunogenicity and optimize function.Engineering of therapeutic antibodies to minimize immunogenicity and optimize function.
Advanced Drug Delivery Reviews, Volume 58, Questões 5-6: 640-656 (2006). Em algumas modalidades, a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é rastreada contra uma biblioteca de sequências de domínio variável humanas conhecidas ou uma biblioteca de sequências de linhagem germinativa humanas.Advanced Drug Delivery Reviews, Volume 58, Questions 5-6: 640-656 (2006). In some embodiments, the variable domain sequence of a rodent antibody is screened against a library of known human variable domain sequences or a library of human germline sequences.
A sequência humana que está mais próxima daquela do roedor pode então ser aceita como a região estrutural humana para o anticorpo humanizado (Sims et al., J.The human sequence that is closest to that of the rodent can then be accepted as the human framework region for the humanized antibody (Sims et al., J.
Immunol. 1993; 151:2296 et seq.; Chothia et al, Chothia and Lesk, J.Immunol. 1993; 151: 2296 et seq .; Chothia et al, Chothia and Lesk, J.
Mol.Mol.
Biol. 1987; 196901 a 917). Em outra modalidade, a humanização envolve o uso de uma região estrutural particular derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas.Biol. 1987; 196901 to 917). In another embodiment, humanization involves the use of a particular structural region derived from the consensus sequence of all human antibodies in a particular subgroup of light or heavy chains.
A mesma estrutura pode ser usada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., PNAS USA, 1992; 89:4285 et seq.; Presta et al., J Immunol 1993; 151:2623 et seq.). Outros métodos concebidos para reduzir a imunogenicidade da molécula de anticorpo em um paciente humano incluem anticorpos folheados (vide, por exemplo, Patente U.S. 6.797.492 e publicações de pedido de Patente U.S. 20020034765 e 20040253645) e anticorpos que foram modificados por análise de epítopo de células T e remoção (vide, por exemplo, publicações de pedido de Patente U.S. 20030153043 e Patente U.S.The same structure can be used for several different humanized antibodies (Carter et al., PNAS USA, 1992; 89: 4285 et seq .; Presta et al., J Immunol 1993; 151: 2623 et seq.). Other methods designed to reduce the immunogenicity of the antibody molecule in a human patient include clad antibodies (see, for example, US Patent 6,797,492 and US Patent Application Publications 20020034765 and 20040253645) and antibodies that have been modified by epitope analysis from T cells and removal (see, for example, US Patent Application Publications 20030153043 and US Patent
No. 5,712,120). Em várias modalidades, as CDRs dos anticorpos humanizados no presente documento descritos correspondem às sequências de CDR do anticorpo DC2E7 monoclonal de camundongo, nomeadamente SEQ ID Nos. 1 a 6.No. 5,712,120). In various embodiments, the CDRs of the humanized antibodies described herein correspond to the CDR sequences of the mouse monoclonal antibody DC2E7, namely SEQ ID Nos. 1 to 6.
[085] O termo "região hipervariável", quando usado no presente documento, refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que contribuem mais diretamente para a ligação ao antígeno. O termo é sinônimo do termo "região determinante de complementaridade" (ou "CDR"). Em uma modalidade, de acordo com IMGT, a região hipervariável geralmente compreende aminoácidos em três trechos em cada um dos domínios variáveis da cadeia pesada e leve (por exemplo, resíduos 27-32 (LCDR1), 49-51 (LCDR2) e 88-96 (LCDR3) no domínio variável de cadeia leve e 26-33 (HCDR1), 51 a 58 (HCDR2) e 97-102 (HCDR3) no domínio variável de cadeia pesada).[085] The term "hypervariable region", when used in this document, refers to the amino acid residues of an antibody that contribute most directly to antigen binding. The term is synonymous with the term "complementarity determining region" (or "CDR"). In one embodiment, according to IMGT, the hypervariable region generally comprises amino acids in three stretches in each of the variable domains of the heavy and light chain (for example, residues 27-32 (LCDR1), 49-51 (LCDR2) and 88- 96 (LCDR3) in the light chain variable domain and 26-33 (HCDR1), 51 to 58 (HCDR2) and 97-102 (HCDR3) in the heavy chain variable domain).
[086] O termo "tau insolúvel" refere-se a agregados de tau (como emaranhados neurofibrilares, fios de neurópilos, corpos de Pick, corpos em espiral, etc.), que podem ser identificados, por exemplo, por seu padrão característico no cérebro ou em solução. Por exemplo, os agregados de tau podem ser separados por centrifugação de amostras cerebrais homogeneizadas e avaliadas por, por exemplo, Western blot ou ensaios ELISA. Vide, por exemplo, Lasagna-Reeves et al., FASEB J. 26: 1946-59 (2012). Os agregados de tau podem ser compostos de monômeros de tau, dímeros de tau, trímeros ou oligômeros, tais como oligômeros de tau granulares (GTO) e vários tipos de filamentos, incluindo filamentos helicoidais pareados (PHF) e filamentos retos (SF), entre outros. Cowan, C.M. e Mudher, A., Are tau aggregates toxic or protection in tauopathies?, Frontiers in Neurology, 4: 114 (2013).[086] The term "insoluble tau" refers to aggregates of tau (such as neurofibrillary tangles, neuropile threads, Pick bodies, spiral bodies, etc.), which can be identified, for example, by their characteristic pattern in the brain or in solution. For example, tau aggregates can be separated by centrifuging homogenized brain samples and evaluated by, for example, Western blot or ELISA assays. See, for example, Lasagna-Reeves et al., FASEB J. 26: 1946-59 (2012). Tau aggregates can be composed of tau monomers, tau dimers, trimers or oligomers, such as granular tau oligomers (GTO) and various types of filaments, including paired helical filaments (PHF) and straight filaments (SF), between others. Cowan, C.M. and Mudher, A., Are tau aggregates toxic or protection in tauopathies ?, Frontiers in Neurology, 4: 114 (2013).
[087] O termo "ácido nucleico isolado", tal como no presente documento utilizado, significa um polinucleotídeo de origem genômica, cDNA ou sintética ou alguma combinação dos mesmos, que em virtude de sua origem (1) não está associado com a totalidade ou uma porção de um polinucleotídeo em que o "ácido nucleico isolado" é encontrado na natureza, (2) está operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que não é apreciado na natureza, ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior.[087] The term "isolated nucleic acid", as used herein, means a polynucleotide of genomic, cDNA or synthetic origin or some combination thereof, which by virtue of its origin (1) is not associated with all or a portion of a polynucleotide in which the "isolated nucleic acid" is found in nature, (2) is operably linked to a polynucleotide that is not appreciated in nature, or (3) does not occur in nature as part of a larger sequence.
[088] "Ligado" refere-se à ligação de uma porção a um peptídeo, anticorpo, composto ou partícula sólida. O termo abrange casos em que uma porção é acoplada, ou complexada, ou covalentemente ou não covalentemente ligada a um peptídeo, anticorpo, composto ou partícula sólida. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento pode ser revestido covalentemente ou não covalentemente em uma esfera ou outra partícula vendida. A porção pode ser reticulada quimicamente ou expressa ou sintetizada como uma fusão com o peptídeo ou anticorpo.[088] "Bound" refers to the attachment of a moiety to a peptide, antibody, compound or solid particle. The term encompasses cases where a moiety is coupled, or complexed, or covalently or non-covalently attached to a peptide, antibody, compound or solid particle. For example, an antibody or antigen binding fragment described herein can be coated covalently or non-covalently on a sphere or other sold particle. The portion can be chemically cross-linked or expressed or synthesized as a fusion with the peptide or antibody.
[089] Conforme usado no presente documento, uma "molécula que é capaz de formar um complexo tau-molécula" é qualquer agente que preferivelmente pode se ligar a uma espécie de tau para formar um complexo. O termo abrange anticorpos, por exemplo, os anticorpos anti-tau no presente documento descritos, bem como receptores de antígeno, receptores conjugados com Fc, fragmentos de receptor, fatores de complemento e quaisquer outras porções de ligação adequadas capazes de formar um complexo com tau.[089] As used herein, a "molecule that is capable of forming a tau-molecule complex" is any agent that can preferably bind to a species of tau to form a complex. The term encompasses antibodies, for example, the anti-tau antibodies described herein, as well as antigen receptors, Fc-conjugated receptors, receptor fragments, complement factors and any other suitable binding moieties capable of forming a complex with tau .
[090] O termo "ácido nucleico", conforme usado no presente documento, destina-se a incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de filamento simples ou de filamento duplo.[090] The term "nucleic acid", as used herein, is intended to include DNA molecules and RNA molecules. A nucleic acid molecule can be single-stranded or double-stranded.
[091] "Tau patológica" inclui conformadores e estruturas de tau patológica e abrange todos os seguintes: tau modificada por doença (por exemplo, tau hiperfosforilada, tau truncada, etc.), tau perturbada, tau desordenada, tau solúvel desordenada, tau insolúvel, oligômeros e filamentos de tau, agregados de tau extracelulares e intracelulares, como emaranhados neurofibrilares, fios de neurópilos, placas neuríticas, emaranhados fantasmas e esferóides axonais, corpos de Pick, corpos enrolados, astrócitos em forma de tufo, placas astrocíticas ou qualquer outra forma de tau associada com AD ou outra tauopatia.[091] "Pathological tau" includes shapers and structures of pathological tau and covers all of the following: disease-modified tau (eg, hyperphosphorylated tau, truncated tau, etc.), disturbed tau, disordered tau, disorderly soluble tau, insoluble tau , oligomers and tau filaments, extracellular and intracellular tau aggregates, such as neurofibrillary tangles, neuropile threads, neuritic plaques, phantom tangles and axonal spheroids, Pick bodies, coiled bodies, tuff-shaped astrocytes, astrocytic plaques or any other form of tau associated with AD or other tauopathy.
[092] Uma "amostra" ou "amostra biológica", conforme usado no presente documento, refere-se a qualquer porção de tecido ou fluido corporal (por exemplo, sangue, CSF, etc.) obtida de um objeto para fins de teste. A amostra pode ser isolada diretamente do objeto ou posteriormente processada antes do teste (por exemplo, por diluição, fixação, desnaturação, divisão, separação, centrifugação, dissociação de complexos imunes e similares). Partes da amostra usadas para fins de diagnóstico ou monitoramento também são abrangidas pelos termos. A amostra também pode ser processada durante ou após o teste (por exemplo, por imunoprecipitação, purificação, partição, etc.). Os termos "amostra" e "amostra biológica" se aplicam igualmente ao tecido ou fluido corporal antes, durante e/ou após essas etapas de processamento. O termo "amostra de controle", conforme usado no presente documento, refere-se a uma amostra obtida de um paciente saudável ou um paciente com outra tauopatia diagnosticada ou um paciente com um nível conhecido de uma espécie de tau em um fluido biológico, por exemplo, CSF.[092] A "sample" or "biological sample", as used herein, refers to any portion of tissue or body fluid (eg, blood, CSF, etc.) obtained from an object for testing purposes. The sample can be isolated directly from the object or later processed before testing (for example, by dilution, fixation, denaturation, division, separation, centrifugation, dissociation of immune complexes and the like). Parts of the sample used for diagnostic or monitoring purposes are also covered by the terms. The sample can also be processed during or after the test (for example, by immunoprecipitation, purification, partition, etc.). The terms "sample" and "biological sample" apply equally to tissue or body fluid before, during and / or after these processing steps. The term "control sample", as used herein, refers to a sample obtained from a healthy patient or a patient with another diagnosed tauopathy or a patient with a known level of a species of tau in a biological fluid, for example example, CSF.
[093] Vários tipos de tau (ou seja, espécies da proteína tau) podem existir em um objeto, por exemplo, em tecido cerebral ou em amostras, como CSF ou sangue. Os detalhes sobre estes tipos de tau são conhecidos e foram descritos, por exemplo, em WO2004/007547 A2 e U.S. 9.518.101, que são incorporados no presente documento por referência na sua totalidade. O termo "tau", quando usado sem especificação de isoforma adicional (por exemplo, tau 2N4R), abrange todas as formas de tau, bem como fragmentos de tau, a menos que especificado de outra forma.[093] Various types of tau (ie, species of the tau protein) can exist in an object, for example, in brain tissue or in samples, such as CSF or blood. Details on these types of tau are known and have been described, for example, in WO2004 / 007547 A2 and U.S. 9,518,101, which are incorporated herein by reference in their entirety. The term "tau", when used without specifying an additional isoform (for example, 2N4R tau), encompasses all forms of tau, as well as fragments of tau, unless otherwise specified.
[094] O termo "farmaceuticamente aceitável" significa biológica ou farmacologicamente compatível para uso in vivo em animais ou humanos, e preferivelmente significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listado na Farmacopeia dos EUA ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais, e mais particularmente em humanos.[094] The term "pharmaceutically acceptable" means biologically or pharmacologically compatible for in vivo use in animals or humans, and preferably means approved by a federal or state government regulatory agency or listed in the US Pharmacopoeia or other pharmacopoeia generally recognized for use in animals, and more particularly in humans.
[095] O termo "tau fosforilada" refere-se a qualquer isoforma de tau compreendendo um ou mais aminoácidos fosforilados. A forma mais longa de tau cerebral humana adulta tem 80 resíduos de serina ou treonina e 5 resíduos de tirosina; portanto, quase 80% da molécula tem potencial para ser fosforilada. Vide Goedert, M. et al, Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer’s disease. Neuron 3, 519-526 (1989). O termo tau fosforilada também se refere a qualquer combinação de aminoácidos de tau fosforilada. Tau desempenha um papel fundamental na regulação da dinâmica dos microtúbulos, transporte axonal e crescimento de neurites. Todas essas funções de tau podem ser moduladas por fosforilação específica de sítio e alteração de eventos de fosforilação normais (por exemplo, hiperfosforilação, fosforilação anormal) podem contribuir para doenças neurodegenerativas, tal como a AD. Johnson GV et al., Tau phosphorylation in neuronal cell function and dysfunction. J. Cell Sci. 15 de nov. de 2004;117(Pt 24): 5721 a 9.[095] The term "phosphorylated tau" refers to any isoform of tau comprising one or more phosphorylated amino acids. The longest form of adult human brain tau has 80 residues of serine or threonine and 5 residues of tyrosine; therefore, almost 80% of the molecule has the potential to be phosphorylated. See Goedert, M. et al, Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer’s disease. Neuron 3, 519-526 (1989). The term phosphorylated tau also refers to any combination of phosphorylated tau amino acids. Tau plays a key role in regulating microtubule dynamics, axonal transport and neurite growth. All of these tau functions can be modulated by site-specific phosphorylation and alteration of normal phosphorylation events (eg, hyperphosphorylation, abnormal phosphorylation) can contribute to neurodegenerative diseases, such as AD. Johnson GV et al., Tau phosphorylation in neuronal cell function and dysfunction. J. Cell Sci. Nov. 15 2004; 117 (Pt 24): 5721 to 9.
[096] Em algumas modalidades, tau fosforilada refere-se a uma proteína tau com qualquer combinação de um ou mais resíduos fosforilados entre os aminoácidos 188 e 227 (conforme numerado na proteína tau 2N4R ou os resíduos equivalentes em outro fragmento de tau ou isoforma). Em outra modalidade, tau fosforilada refere-se a tau fosforilada pelo menos na treonina 217 (conforme numerada na proteína tau 2N4R ou nos resíduos equivalentes em outro fragmento de tau ou isoforma). Em algumas modalidades, a proteína tau é fosforilada como nas proteínas tau fosforiladas detectadas nos Exemplos.[096] In some embodiments, phosphorylated tau refers to a tau protein with any combination of one or more phosphorylated residues between amino acids 188 and 227 (as numbered in the 2N4R tau protein or equivalent residues in another tau fragment or isoform) . In another embodiment, phosphorylated tau refers to phosphorylated tau at least in threonine 217 (as numbered in the 2N4R tau protein or equivalent residues in another tau fragment or isoform). In some embodiments, the tau protein is phosphorylated as in the phosphorylated tau proteins detected in the Examples.
[097] "Tau fisiológica" refere-se a uma proteína tau nativa desdobrada encontrada no cérebro de objetos saudáveis, que pode ser de comprimento variável. Essas proteínas tau são tipicamente altamente solúveis e geralmente mostram menos tendência para agregação. Vide Wang et al., Tau in physiology and pathology, Nature Reviews, 17: 22-35, 2016.[097] "Physiological Tau" refers to a native unfolded tau protein found in the brain of healthy objects, which can be of variable length. These tau proteins are typically highly soluble and generally show less tendency to aggregate. See Wang et al., Tau in physiology and pathology, Nature Reviews, 17: 22-35, 2016.
[098] O termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira"), tal como no presente documento utilizado, destina-se a referir-se a uma célula na qual um vetor de expressão recombinante foi introduzido. Deve ser entendido que tais termos se destinam a referir-se não apenas à célula em questão em particular, mas à descendência de tal célula. Como certas modificações podem ocorrer nas gerações seguintes devido a mutações ou influências ambientais, tal progênie pode não ser, de fato, idêntica à célula-mãe, mas ainda está incluída no escopo do termo "célula hospedeira", conforme usado no presente documento.[098] The term "recombinant host cell" (or simply "host cell"), as used herein, is intended to refer to a cell into which a recombinant expression vector has been introduced. It should be understood that such terms are intended to refer not only to the particular cell in question, but to the progeny of that cell. As certain modifications may occur in subsequent generations due to mutations or environmental influences, such a progeny may not, in fact, be identical to the parent cell, but is still included in the scope of the term "host cell", as used herein.
[099] Tal como no presente documento utilizado, "liga-se especificamente" em referência a um anticorpo significa que o anticorpo se liga ao seu antígeno ou epítopo alvo com maior afinidade do que a um antígeno (s) ou epítopo estruturalmente diferente.[099] As used herein, "specifically binds" in reference to an antibody means that the antibody binds to its target antigen or epitope with greater affinity than to a structurally different antigen (s) or epitope.
[100] Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "scFv" compreendem os domínios VH e VL de um anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. De preferência, o polipeptídeo Fv adicionalmente compreende um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação ao antígeno. Para uma revisão de scFv, vide Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315 (1994).[100] "Single chain Fv" or "scFv" antibody fragments comprise the VH and VL domains of an antibody, where these domains are present on a single polypeptide chain. Preferably, the Fv polypeptide additionally comprises a polypeptide linker between the VH and VL domains that allows the scFv to form the desired structure for binding to the antigen. For a review of scFv, see Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
[101] O termo "tratamento", tal como no presente documento utilizado, é definido como a aplicação ou administração de um agente terapêutico a um objeto que tem uma doença, um sintoma de doença ou uma predisposição para uma doença, com o objetivo de curar, sarar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, amenizar, melhorar ou afetar a doença, um ou mais sintomas da doença ou a predisposição para a doença. Além disso, desde que as composições da invenção, isoladamente ou em combinação com outro agente terapêutico, curem, sarem, aliviem, mitiguem, alterem, remediem, amenizem, melhorem ou afetem pelo menos um sintoma da Doença de Alzheimer ou outra tauopatia sendo tratada, como em comparação com esse sintoma na ausência de tratamento, o resultado deve ser considerado um tratamento do distúrbio subjacente, independentemente de todos os sintomas do distúrbio terem sido curados, sarados, aliviados, mitigados, alterados, remediados, amenizados, melhorados ou afetados ou não. O tratamento pode ser alcançado usando uma "quantidade eficaz" de um agente terapêutico, que deve ser entendido como abrangendo o tratamento parcial e completo, por exemplo, curar, sarar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, amenizar, melhorar ou afetar parcial ou completamente, a doença, um ou mais sintomas da doença ou a predisposição para a doença. Uma “quantidade eficaz” pode ser determinada empiricamente. Da mesma forma, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma concentração ou que é eficaz para alcançar um efeito terapêutico declarado.[101] The term "treatment", as used herein, is defined as the application or administration of a therapeutic agent to an object that has a disease, a symptom of a disease or a predisposition to a disease, for the purpose of cure, heal, relieve, mitigate, alter, remedy, alleviate, improve or affect the disease, one or more symptoms of the disease or the predisposition to the disease. In addition, provided that the compositions of the invention, alone or in combination with another therapeutic agent, cure, heal, relieve, mitigate, alter, remedy, ameliorate, ameliorate or affect at least one symptom of Alzheimer's Disease or other tauopathy being treated, as compared to this symptom in the absence of treatment, the result should be considered a treatment of the underlying disorder, regardless of whether all symptoms of the disorder have been healed, healed, relieved, mitigated, altered, remedied, alleviated, improved or affected or not . Treatment can be achieved using an "effective amount" of a therapeutic agent, which should be understood as encompassing partial and complete treatment, for example, to cure, heal, relieve, mitigate, alter, remedy, ameliorate, ameliorate or partially or completely, the disease, one or more symptoms of the disease or the predisposition to the disease. An "effective amount" can be determined empirically. Likewise, a "therapeutically effective amount" is a concentration or that is effective in achieving a stated therapeutic effect.
[102] "Tauopatia" refere-se a uma doença associada à formação de tau patológica. A tauopatia engloba todas as doenças neurológicas que são acompanhadas pelo aparecimento de formas anormais de proteína tau associada a microtúbulos nos cérebros dos pacientes. O termo inclui, mas não está limitado às seguintes doenças: doença de Alzheimer, doença de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, demência britânica, demência dinamarquesa, doença de Pick, paralisia supranuclear progressiva, degeneração corticobasal, doença por grãos argirofílicos, complexo de Guam Parkinsonismo-demência, demência somente de emaranhados, tauopatia da substância branca com inclusões gliais globulares, demência frontotemporal (por exemplo, FTDP-17), parkinsonismo ligado à encefalopatia traumática crônica do cromossomo 17, e doença nodular. Vide, por exemplo, Goedert M, Clavaguera F e Tolnay M. A propagação de inclusões de proteínas similares a príons em doenças neurodegenerativas. Trends Neurol. Sci. Em algumas modalidades, um objeto com Demência Frontotemporal (FTD) pode ter Afasia Progressiva Primária Agramática/Não Fluente (nfPPA), Afasia Progressiva Primária de Variante Semântica (svPPA), Demência Frontotemporal de Variante Comportamental (bvFTD) ou Esclerose Lateral Amiotemporal (ALSclerose Frontotemporal/FTD). Em uma modalidade, uma ou mais daquelas formas anormais de tau é reconhecida por um dos anticorpos ou fragmentos de ligação no presente documento descritos em pelo menos um ensaio. Em algumas modalidades, o ensaio é IHC. Em outras modalidades, o ensaio é ELISA. O termo "outra tauopatia" abrange todas as doenças neurológicas (por exemplo, causas baseadas em tau de demência), exceto AD que são acompanhadas pelo aparecimento de tau patológica, por exemplo, qualquer uma das outras taupatias listadas acima. Em contraste, a demência também pode surgir de etiologias não baseadas em tau, e isso não se enquadra no termo tauopatia.[102] "Tauopathy" refers to a disease associated with the formation of pathological tau. Tauopathy encompasses all neurological diseases that are accompanied by the appearance of abnormal forms of tau protein associated with microtubules in the brains of patients. The term includes, but is not limited to, the following diseases: Alzheimer's disease, Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease, British dementia, Danish dementia, Pick's disease, progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, argyrophilic grain disease, Guam Parkinsonism complex -dementia, tangle-only dementia, white matter tauopathy with globular glial inclusions, frontotemporal dementia (eg, FTDP-17), parkinsonism linked to chronic traumatic encephalopathy of chromosome 17, and nodular disease. See, for example, Goedert M, Clavaguera F and Tolnay M. The spread of prion-like protein inclusions in neurodegenerative diseases. Trends Neurol. Sci. In some modalities, an object with Frontotemporal Dementia (FTD) may have Agrammatic / Non-Fluent Primary Progressive Aphasia (nfPPA), Semantic Variant Primary Progressive Aphasia (svPPA), Frontotemporal Behavioral Variant Dementia (bvFTD) or Amiotemporal Lateral Sclerosis ( Frontotemporal ALSclerosis / FTD). In one embodiment, one or more of those abnormal forms of tau is recognized by one of the antibodies or binding fragments herein described in at least one assay. In some modalities, the test is IHC. In other modalities, the assay is ELISA. The term "other tauopathy" encompasses all neurological diseases (for example, causes based on tau dementia), except AD that are accompanied by the appearance of pathological tau, for example, any of the other taupathies listed above. In contrast, dementia can also arise from etiologies not based on tau, and this does not fall under the term tauopathy.
[103] O termo "domínio variável" refere-se ao fato de que certas porções de uma imunoglobulina diferem extensivamente na sequência entre os anticorpos e são usadas na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para seu antígeno particular. No entanto, a variabilidade geralmente não é distribuída uniformemente pelos domínios variáveis de anticorpos. Está concentrado em três segmentos denominados regiões hipervariáveis, tanto nos domínios variáveis de cadeia leve como nos domínios variáveis de cadeia pesada. As porções mais conservadas dos domínios variáveis são chamadas de regiões estruturais (FRs). Os domínios variáveis de cadeias pesadas e leves nativas compreendem, cada um, quatro FRs, que muitas vezes adotam uma configuração de folha beta, conectada por três regiões hipervariáveis, que muitas vezes formam loops de conexão e, em alguns casos, formando parte da estrutura da folha beta. As regiões hipervariáveis (HVR) em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao antígeno de anticorpos (vide Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Os "domínios constantes" de um anticorpo, em contraste, não estão tipicamente envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas contribuem para a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).[103] The term "variable domain" refers to the fact that certain portions of an immunoglobulin differ extensively in sequence between antibodies and are used in the binding and specificity of each particular antibody to its particular antigen. However, variability is generally not evenly distributed across antibody variable domains. It is concentrated in three segments called hypervariable regions, both in the variable domains of light chain and in the variable domains of heavy chain. The most conserved portions of the variable domains are called structural regions (FRs). The variable domains of native heavy and light chains each comprise four FRs, which often adopt a beta-leaf configuration, connected by three hypervariable regions, which often form connection loops and, in some cases, form part of the structure of the beta sheet. The hypervariable regions (HVR) in each chain are held together in close proximity by the FRs and, with the hypervariable regions in the other chain, contribute to the formation of the antibody antigen binding site (see Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th to Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). An antibody's "constant domains", in contrast, are typically not directly involved in binding an antibody to an antigen, but contribute to antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC).
[104] O termo "vetor", tal como no presente documento utilizado, destina-se a referir-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma loop de DNA de filamento duplo circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos com uma origem de replicação bacteriana e vetores epissomais de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira e, assim, são replicados junto com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão operativamente ligados. Esses vetores são no presente documento referidos como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente, "vetores de expressão"). Em geral, os vetores de expressão úteis em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados indistintamente, pois o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente usada. No entanto, a invenção pretende incluir outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus defeituosos de replicação, adenovírus e vírus adenoassociados), que servem funções equivalentes.[104] The term "vector", as used herein, is intended to refer to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it has been attached. One type of vector is a "plasmid", which refers to a circular double-stranded DNA loop into which additional DNA segments can be linked. Another type of vector is a viral vector, in which additional DNA segments can be linked to the viral genome. Certain vectors are capable of autonomous replication in a host cell in which they are introduced (for example, bacterial vectors with a bacterial origin of replication and episomal mammalian vectors). Other vectors (for example, non-episomal mammalian vectors) can be integrated into the genome of a host cell after introduction into the host cell and are thus replicated along with the host's genome. In addition, certain vectors are capable of directing the expression of genes to which they are operatively linked. These vectors are referred to herein as "recombinant expression vectors" (or simply, "expression vectors"). In general, expression vectors useful in recombinant DNA techniques are often in the form of plasmids. In this specification, "plasmid" and "vector" can be used interchangeably, since the plasmid is the most commonly used form of vector. However, the invention is intended to include other forms of expression vectors, such as viral vectors (for example, replication defective retroviruses, adenoviruses and adeno-associated viruses), which serve equivalent functions.
[105] Conforme usado no presente documento, as formas singulares "um/uma" e "o/a" destinam-se a incluir as formas plurais também, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Além disso, na medida em que os termos "incluindo", "inclui", "tendo", "tem", "com" ou variantes dos mesmos são usados na descrição detalhada e/ou nas reivindicações, tais termos se destinam a ser inclusivos de uma maneira similar ao termo "compreendendo". Tal como no presente documento utilizado, os termos "cerca de" e "aproximadamente" significam dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor particular, conforme determinado por alguém versado na técnica, que dependerá em parte de como o valor é medido ou determinado, ou seja, as limitações do sistema de medição. Por exemplo, "cerca de" pode significar de 1 a 1,5 desvio (s) padrão ou de 1 a 2 desvios padrão, de acordo com a prática da técnica. Alternativamente, "cerca de" pode significar uma faixa de até e incluindo 20%, 10%, 5% ou 1% de um determinado valor. Alternativamente, particularmente com respeito a sistemas ou processos biológicos, o termo pode significar até e incluindo uma ordem de magnitude, até e incluindo 5 vezes, e até e incluindo 2 vezes, de um valor. Onde valores particulares são descritos no pedido e nas reivindicações, a menos que indicado de outra forma, o termo "cerca de" significando dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor particular deve ser assumido. Além disso, todos os intervalos descritos no presente documento incluem os pontos finais, bem como todos os pontos intermediários. O termo "ou" será entendido como significando "e/ou", a menos que o contexto indique claramente o contrário. Todas as referências citadas no presente documento são incorporadas por referência na sua totalidade. Na medida em que qualquer coisa em uma referência incorporada contradiga ou seja inconsistente com o material fornecido no presente documento, a presente invenção deve prevalecer. Anticorpos[105] As used in this document, the singular forms "one / one" and "o / a" are intended to include plural forms as well, unless the context clearly indicates otherwise. In addition, insofar as the terms "including", "includes", "having", "has", "with" or variants thereof are used in the detailed description and / or in the claims, such terms are intended to be inclusive in a similar way to the term "comprising". As used herein, the terms "about" and "approximately" mean within an acceptable error range for the particular value, as determined by someone skilled in the art, which will depend in part on how the value is measured or determined , that is, the limitations of the measurement system. For example, "about" can mean 1 to 1.5 standard deviations (s) or 1 to 2 standard deviations, according to the practice of the technique. Alternatively, "about" can mean a range of up to and including 20%, 10%, 5% or 1% of a given value. Alternatively, particularly with respect to biological systems or processes, the term can mean up to and including an order of magnitude, up to and including 5 times, and up to and including 2 times, of a value. Where particular values are described in the application and in the claims, unless otherwise stated, the term "about" meaning within an acceptable error range for the particular value must be assumed. In addition, all intervals described in this document include the end points, as well as all the intermediate points. The term "or" will be understood as meaning "and / or", unless the context clearly indicates otherwise. All references cited in this document are incorporated by reference in their entirety. To the extent that anything in an embedded reference contradicts or is inconsistent with the material provided in this document, the present invention must prevail. Antibodies.
[106] São descritos no presente documento novos anticorpos anti-tau úteis para detectar, monitorar, tratar e prevenir AD. Em algumas modalidades, os anticorpos são capazes de se ligar a uma tau fosforilada. Em algumas modalidades, os anticorpos são capazes de se ligar a tau fosforilada em uma amostra biológica (por exemplo, CSF ou sangue), tornando-os úteis para distinguir AD de outras tauopatias de forma não invasiva. Em algumas modalidades, os anticorpos podem ser conjugados a segundos agentes (por exemplo, agentes que não sejam anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno descritos no presente documento, tais como radiotraçadores ou agentes terapêuticos). Em algumas modalidades, um ou mais dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno no presente documento descritos são conjugados entre si. Em algumas modalidades, os anticorpos e/ou anticorpos conjugados cruzam a barreira hematoencefálica para se ligarem a tau no cérebro, tornando-[106] New anti-tau antibodies useful for detecting, monitoring, treating and preventing AD are described in this document. In some embodiments, antibodies are able to bind to phosphorylated tau. In some embodiments, antibodies are able to bind to phosphorylated tau in a biological sample (for example, CSF or blood), making them useful for distinguishing AD from other tauopathies noninvasively. In some embodiments, antibodies can be conjugated to second agents (for example, agents other than antibodies or antigen-binding fragments described herein, such as radiotracers or therapeutic agents). In some embodiments, one or more of the antibodies or antigen-binding fragments described herein are conjugated to each other. In some embodiments, antibodies and / or conjugated antibodies cross the blood-brain barrier to bind to tau in the brain, becoming
os úteis para a detecção ou tratamento in vivo de AD e outras tauopatias no cérebro.those useful for the in vivo detection or treatment of AD and other brain tauopathies.
[107] As sequências de CDRs de anticorpos e domínios variáveis, bem como a proteína tau 2N4R de comprimento total e suas porções, são mostradas na Tabela 1 abaixo. Em várias modalidades, os anticorpos e fragmentos de ligação descritos no presente documento compreendem uma ou mais das CDR e/ou sequências de domínio variável descritos na tabela e/ou se ligam a uma ou mais porções da proteína tau 2N4R descrita na tabela. Tabela 1[107] The CDR sequences of antibodies and variable domains, as well as the full-length 2N4R tau protein and its portions, are shown in Table 1 below. In various embodiments, the antibodies and binding fragments described herein comprise one or more of the CDR and / or variable domain sequences described in the table and / or bind to one or more portions of the 2N4R tau protein described in the table. Table 1
SEQ Polipeptídeo SequênciaSEQ Polypeptide Sequence
ID NO 1 HCDR1 (E7) GFTFSSFG 2 HCDR2 (E7) ISGDSNTI 3 HCDR3 (E7) ARTLAY 4 LCDR1 (E7) EDIYNR 5 LCDR2 (E7) GAS 6 LCDR3 (E7) LQYWSIPWTID NO 1 HCDR1 (E7) GFTFSSFG 2 HCDR2 (E7) ISGDSNTI 3 HCDR3 (E7) ARTLAY 4 LCDR1 (E7) EDIYNR 5 LCDR2 (E7) GAS 6 LCDR3 (E7) LQYWSIPWT
DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS H variável (E7) SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY 7DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS H variable (E7) SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY 7
LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS 8 L variável (E7)LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS 8 L variable (E7)
SEQ Polipeptídeo SequênciaSEQ Polypeptide Sequence
SGDRSGYSSP GSPGTPGSRS 9 tau 2N4R RTPSLPTPPT REPKKVAVVRSGDRSGYSSP GSPGTPGSRS 9 tau 2N4R RTPSLPTPPT REPKKVAVVR
GGGKVQIINK KLDLSNVQSK CGSKDNIKHV PGGGSVQlVYGGGKVQIINK KLDLSNVQSK CGSKDNIKHV PGGGSVQlVY
EVSASLAKQG L 10 PPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPT tau 188-227EVSASLAKQG L 10 PPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPT tau 188-227
PPTREPKKVA 11 tau 210-221 SRTPSLPTPPTR tau 210-221 12 SRTPSLPpTPPTR (pT217)PPTREPKKVA 11 tau 210-221 SRTPSLPTPPTR tau 210-221 12 SRTPSLPpTPPTR (pT217)
IATPRGAAPP GQKGQANATR 13 tau 151 a 188IATPRGAAPP GQKGQANATR 13 tau 151 to 188
SEQ Polipeptídeo SequênciaSEQ Polypeptide Sequence
ID NO 14 tau 163-172 KGQANATRIP 15 HCDR1 (E2) GFNIKDYY 16 HCDR2 (E2) LDPENDHT 17 HCDR3 (E2) SYYKYDDY 18 LCDR1 (E2) QSLLDSDGKTY 19 LCDR2 (E2) LVS 20 LCDR3 (E2) WQGTHFPLTID NO 14 tau 163-172 KGQANATRIP 15 HCDR1 (E2) GFNIKDYY 16 HCDR2 (E2) LDPENDHT 17 HCDR3 (E2) SYYKYDDY 18 LCDR1 (E2) QSLLDSDGKTY 19 LCDR2 (E2) LVS 20 LCDR3TH (E2) WL
YYMHWVRQRPDQGLEWIGWLDPENDHTIYD 21 H variável (E2) PRFQDRANLTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAYYMHWVRQRPDQGLEWIGWLDPENDHTIYD 21 H variable (E2) PRFQDRANLTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTA
DGKTYLNWLVQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGV 22 L variável (E2) PDRFTGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYYCWDGKTYLNWLVQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGV 22 L variable (E2) PDRFTGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYYCW
QGTHFPLTFGAGTKLELKR 23 HCDR1 (149) GFTLSSFG 24 HCDR2 (149) ISSGSSTI 25 HCDR3 (149) SRRLDY 26 LCDR1 (149) KSLLYKDGKTY 27 LCDR2 (149) LMS 28 LCDR3 (149) QQFVEYPLTQGTHFPLTFGAGTKLELKR 23 HCDR1 (149) GFTLSSFG 24 HCDR2 (149) ISSGSSTI 25 HCDR3 (149) SRRLDY 26 LCDR1 (149) KSLLYKDGKTY 27 LCDR2 (149) LMS 28 LCDR3 (149) QQFVEYPLT
DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTLS 29 H variável (149)DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTLS 29 H variable (149)
SEQ Polipeptídeo SequênciaSEQ Polypeptide Sequence
DGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGV 30 L variável (149)DGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGV 30 L variable (149)
QFVEYPLTFGTGTKLELQR tau 210-221 31 SRpTPSLPpTPPTR (pT212, pT217) HCDR1 32 GFTFSGFG (E7cl07) HCDR1 33 GFTFGSFG (E7cl18) HCDR2 34 VSGDSNTI (E7cl06) HCDR2 35 ISGASSTI (E7cl13) HCDR2 (E7 36 ISGDGNTI cl17) HCDR2 37 ISGDSNTV (E7cl18) HCDR2 38 ISGDSSTI (E7cl29) LCDR1 39 ENIYNR (E7cl21PD) 40 LCDR2 (E7cl14) GAG 41 LCDR3 (E7cl03) LQYWSTPWT 42 LCDR3 (E7cl29) LQYRSIPWTQFVEYPLTFGTGTKLELQR tau 210-221 31 SRpTPSLPpTPPTR (pT212, pT217) HCDR1 32 GFTFSGFG (E7cl07) HCDR1 33 GFTFGSFG (E7cl18) HCDR2 34 VSGDSNTI (E7cl06) HCD (E7cl06) HCD (E7cl06) HCD 38 ISGDSSTI (E7cl29) LCDR1 39 ENIYNR (E7cl21PD) 40 LCDR2 (E7cl14) GAG 41 LCDR3 (E7cl03) LQYWSTPWT 42 LCDR3 (E7cl29) LQYRSIPWT
SEQ Polipeptídeo SequênciaSEQ Polypeptide Sequence
SFGMRWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 43 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl01)SFGMRWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variable 43 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl01)
LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 44 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl01)LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variable 44 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl01)
DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS H variável SFGMHWVRQAPEKGLEWVTYISGDSNTIYY 45 (E7cl02) ADTVKGRFTISRDNPKNTMFLQMTSLRSEDTDVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS H variable SFGMHWVRQAPEKGLEWVTYISGDSNTIYY 45 (E7cl02) ADTVKGRFTISRDNPKNTMFLQMTSLRSEDT
LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 46 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl02)LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variable 46 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl02)
SFGMHWVRQAPEMGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 47 ADTVEGRFTISRDNPKNTLSLQMTSLRSEDT (E7cl03)SFGMHWVRQAPEMGLEWVAYISGDSNTIYY H variable 47 ADTVEGRFTISRDNPKNTLSLQMTSLRSEDT (E7cl03)
LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLEPGVPSRFS L variável 48 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWST (E7cl03)LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLEPGVPSRFS L variable 48 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWST (E7cl03)
SEQ Polipeptídeo SequênciaSEQ Polypeptide Sequence
SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 49 ADTEKGRFTISRDNPKNALFLQMTSLRSEDT (E7cl04)SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variable 49 ADTEKGRFTISRDNPKNALFLQMTSLRSEDT (E7cl04)
RLAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRF L variável 50 SGSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWS (E7cl04)RLAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRF L variable 50 SGSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWS (E7cl04)
SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 51 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLREDTAI (E7cl05)SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variable 51 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLREDTAI (E7cl05)
LAWYQQTPGDAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 52 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl05)LAWYQQTPGDAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variable 52 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl05)
SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYVSGDSNTIYY H variável 53 ADTVKDRFTISRDNPKNTLFLQMASLRSEDT (E7cl06)SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYVSGDSNTIYY H variable 53 ADTVKDRFTISRDNPKNTLFLQMASLRSEDT (E7cl06)
LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 54 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl06)LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variable 54 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl06)
SEQ Polipeptídeo SequênciaSEQ Polypeptide Sequence
GFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 55 ADTVKGRFTISRDNPKNTLSLQMTSLRSEDT (E7cl07)GFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variable 55 ADTVKGRFTISRDNPKNTLSLQMTSLRSEDT (E7cl07)
LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 56 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl07)LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variable 56 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl07)
DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS H variável SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY 57 (E7cl07PD) ADTVKGRLTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTDVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS H variable SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY 57 (E7cl07PD) ADTVKGRLTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTT
LAWYQQIPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 58 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl07PD)LAWYQQIPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variable 58 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl07PD)
SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 59 ADTVKGRFTISRNNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl08)SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variable 59 ADTVKGRFTISRNNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl08)
LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 60 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl08)LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variable 60 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl08)
SEQ Polipeptídeo SequênciaSEQ Polypeptide Sequence
SFGMHWARQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 61 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl10)SFGMHWARQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variable 61 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl10)
LAWYQQTPGSAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 62 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl10)LAWYQQTPGSAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variable 62 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl10)
SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 63 ADTVKGRFTISRDNPKNTLLLQMTSLRSEDT (E7cl11)SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variable 63 ADTVKGRFTISRDNPKNTLLLQMTSLRSEDT (E7cl11)
LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 64 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl11)LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variable 64 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl11)
SFGMHWVRQAPEKGLEWIAYISGDSNTIYYA H variável 65 DTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAI (E7cl12)SFGMHWVRQAPEKGLEWIAYISGDSNTIYYA H variable 65 DTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAI (E7cl12)
LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 66 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl12)LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variable 66 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl12)
SEQ Polipeptídeo SequênciaSEQ Polypeptide Sequence
SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGASSTIYYA H variável 67 DTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAI (E7cl13)SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGASSTIYYA H variable 67 DTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAI (E7cl13)
LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 68 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl13)LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variable 68 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl13)
SFGMHWARQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 69 ADTVKGRLTISRDNPKNTLFLQTTSLRSEDTA (E7cl14)SFGMHWARQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variable 69 ADTVKGRLTISRDNPKNTLFLQTTSLRSEDTA (E7cl14)
LAWYQQTPGNAPSLLIPGAGGLETGVPSRFS L variável 70 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl14)LAWYQQTPGNAPSLLIPGAGGLETGVPSRFS L variable 70 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl14)
SFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 71 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl15)SFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISGDSNTIYY H variable 71 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl15)
LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 72 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl15)LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variable 72 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl15)
SEQ Polipeptídeo SequênciaSEQ Polypeptide Sequence
SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 73 ADTVKGRFTISRDNPKNTLLLQMTSLRSEDT (E7cl16)SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variable 73 ADTVKGRFTISRDNPKNTLLLQMTSLRSEDT (E7cl16)
LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 74 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl16)LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variable 74 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl16)
SFGMHWARQAPEKGLEWVAYISGDGNTIYY H variável 75 ADTVKGRFTTSRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl17)SFGMHWARQAPEKGLEWVAYISGDGNTIYY H variable 75 ADTVKGRFTTSRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl17)
LAWYQQTPGSAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 76 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl17)LAWYQQTPGSAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variable 76 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl17)
SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTVYY H variável 77 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl18)SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTVYY H variable 77 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl18)
LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 78 GSGSGGDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl18)LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variable 78 GSGSGGDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl18)
SEQ Polipeptídeo SequênciaSEQ Polypeptide Sequence
SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 79 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl19)SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variable 79 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl19)
LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 80 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl19)LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variable 80 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl19)
SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 81 ADTAKGRFAISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl20)SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variable 81 ADTAKGRFAISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl20)
LAWYQQTPGSAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 82 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl20)LAWYQQTPGSAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variable 82 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl20)
SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 83 ADTVKGRFTISRDNPKSTLFLQMTSLRSEDT (E7cl21PD)SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variable 83 ADTVKGRFTISRDNPKSTLFLQMTSLRSEDT (E7cl21PD)
LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 84 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl21PD)LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variable 84 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl21PD)
SEQ Polipeptídeo SequênciaSEQ Polypeptide Sequence
SFGMHWARQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 85 ADAVKGRFTISRDNPKNTLSLQMTSLRSEDT (E7cl22)SFGMHWARQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variable 85 ADAVKGRFTISRDNPKNTLSLQMTSLRSEDT (E7cl22)
LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 86 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl22)LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variable 86 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl22)
SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 87 AGTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl23)SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variable 87 AGTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl23)
LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 88 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl23)LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variable 88 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl23)
SFGMHWARQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 89 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl26)SFGMHWARQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variable 89 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl26)
DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNR L variável LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS 90 (E7cl26) GSGSGRDYTLSVTSLQTEDVATYYCLQYWSIDIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNR L variable LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS 90 (E7cl26) GSGSGRDYTLSVTSLQTEDVATYYCLQYWSI
SEQ Polipeptídeo SequênciaSEQ Polypeptide Sequence
GVRLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS H variável SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY 91 (E7cl27) ADTVKGRFTISRDNPESTLFLQMTSLRSEDTGVRLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS H variable SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY 91 (E7cl27) ADTVKGRFTISRDNPESTLFLQMTSLRSEDT
LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 92 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl27)LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variable 92 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl27)
SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 93 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl28)SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variable 93 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl28)
LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 94 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl28)LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variable 94 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl28)
SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSSTIYY H variável 95 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRPEDT (E7cl29)SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSSTIYY H variable 95 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRPEDT (E7cl29)
LAWYQQTPGDAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 96 GSGSGRDHTLSITSLQTEDVATYYCLQYRSIP (E7cl29)LAWYQQTPGDAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variable 96 GSGSGRDHTLSITSLQTEDVATYYCLQYRSIP (E7cl29)
SEQ Polipeptídeo SequênciaSEQ Polypeptide Sequence
SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 97 ADTVKGRFTISRDNPKNTLHLQMTSLRSEDT (E7cl30)SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variable 97 ADTVKGRFTISRDNPKNTLHLQMTSLRSEDT (E7cl30)
LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 98 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl30)LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variable 98 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl30)
DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTLS H variável SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYA 99 (DC149) DTVKGRFTISRDNPKNILFLQMTSLRSEDTAIDVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTLS H variable SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYA 99 (DC149) DTVKGRFTISRDNPKNILFLQMTSLRSEDTAI
DIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYK L variável DGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGV 100 (DC149) SDRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCQDIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYK L variable DGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGV 100 (DC149) SDRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCQ
QFVEYPLTFGTGTKLELQR HCDR1 101 GFTFSNYA (DC807) HCDR2 102 ISSGGTI (DC807) HCDR3 103 ARVNYDYGYAMDY (DC807) 104 LCDR1 (DC807) QSLENSNGNTY 105 LCDR2 (DC807) RVS 106 LCDR3 (DC807) LQVTHVPWTQFVEYPLTFGTGTKLELQR HCDR1 101 GFTFSNYA (DC807) HCDR2 102 ISSGGTI (DC807) HCDR3 103 ARVNYDYGYAMDY (DC807) 104 LCDR1 (DC807) QSLENSNGNTY 105 LCDR2 (DC807) RVS 106
SEQ Polipeptídeo SequênciaSEQ Polypeptide Sequence
YAMSWVRQNPEKRLEWVASISSGGTIYSPD H variável 107 SVKGRFTISRDNGRNILYLQMSSLRSEDTAM (DC807)YAMSWVRQNPEKRLEWVASISSGGTIYSPD H variable 107 SVKGRFTISRDNGRNILYLQMSSLRSEDTAM (DC807)
SNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFS L variável 108 GVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYF (DC807)SNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFS L variable 108 GVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYF (DC807)
[108] Em várias modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos capazes de se ligar a tau no presente documento descrita compreendem uma ou mais das sequências de aminoácidos descritas na Tabela 1 acima. Em algumas modalidades, os anticorpos descritos no presente documento compreendem variantes de uma ou mais sequências descritas na Tabela 1, enquanto retêm a capacidade de se ligar a tau, por exemplo, tau fosforilada na posição 217.[108] In various embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof capable of binding tau in this document described comprise one or more of the amino acid sequences described in Table 1 above. In some embodiments, the antibodies described herein comprise variants of one or more sequences described in Table 1, while retaining the ability to bind tau, for example, phosphorylated tau at position 217.
[109] Por exemplo, em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a tau compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou SEQ ID NO: 1 com uma substituição em uma ou mais das posições 5 e 6, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de[109] For example, in some embodiments, an antibody or antigen binding fragment capable of binding tau comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises three heavy chain complementarity determining regions (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the SEQ amino acid sequence ID NO: 1, or SEQ ID NO: 1 with a substitution at one or more of positions 5 and 6, HCDR2 comprises the amino acid sequence of
SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 2 com uma substituição em uma ou mais das posições 1, 4, 5, 6 e 8, HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e/ou em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 4 com uma substituição na posição 2, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 5 com uma substituição na pos ition 3 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, ou SEQ ID NO: 6 com uma substituição em uma ou mais das posições 4 e 6.SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 2 with a substitution at one or more of positions 1, 4, 5, 6 and 8, HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and / or where LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 4 with a substitution in position 2, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 5 with a substitution in position 3 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 6 with a substitution at one or more of positions 4 and 6.
[110] Uma substituição em uma posição particular pode ser determinada contando da esquerda para a direita (amino ao terminal carbóxi) em uma sequência de aminoácidos, por exemplo, uma sequência listada na Tabela 1 começando na extremidade do terminal amino da sequência de peptídeo (ou extremidade esquerda da tabela).[110] A substitution at a particular position can be determined by counting from left to right (amino to the carboxy terminus) in an amino acid sequence, for example, a sequence listed in Table 1 starting at the amino terminal end of the peptide sequence ( or left end of the table).
[111] Em várias modalidades, a substituição na posição 5 em HCDR1 é glicina, a substituição na posição 6 em HCDR1 é glicina. Em algumas modalidades, a substituição na posição 1 em HCDR2 é valina, a substituição na posição 4 em HCDR2 é alanina, a substituição na posição 5 em HCDR2 é glicina, a substituição na posição 6 em HCDR2 é serina e/ou a substituição em a posição 8 em HCDR2 é valina. Em algumas modalidades, a substituição na posição 2 em LCDR1 é asparagina. Em algumas modalidades, a substituição na posição 3 em LCDR2 é glicina. Em algumas modalidades, a substituição na posição 4 de LCDR3 é arginina e/ou a substituição na posição 6 em LCDR3 é treonina.[111] In several embodiments, the substitution at position 5 in HCDR1 is glycine, the substitution at position 6 in HCDR1 is glycine. In some embodiments, the substitution in position 1 in HCDR2 is valine, the substitution in position 4 in HCDR2 is alanine, the substitution in position 5 in HCDR2 is glycine, the substitution in position 6 in HCDR2 is serine and / or the substitution in a position 8 in HCDR2 is valine. In some embodiments, the replacement in position 2 on LCDR1 is asparagine. In some embodiments, the replacement in position 3 on LCDR2 is glycine. In some embodiments, the replacement in position 4 of LCDR3 is arginine and / or the replacement in position 6 in LCDR3 is threonine.
[112] Em várias modalidades, HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 com uma substituição na posição 5, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 com uma substituição na posição 8 8 e/ou HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e/ou em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 com um substituto n na posição 2, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e/ou LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.[112] In several embodiments, HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with a substitution at position 5, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 with a substitution at position 8 8 and / or HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and / or where LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 with a n substitute in position 2, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and / or LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
[113] Em várias modalidades, a substituição na posição 5 em HCDR1 é glicina e a substituição na posição 8 em HCDR2 é valina, e a substituição na posição 2 em LCDR1 é asparagina.[113] In several embodiments, the substitution at position 5 in HCDR1 is glycine and the substitution at position 8 in HCDR2 is valine, and substitution at position 2 in LCDR1 is asparagine.
[114] Em várias modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende sequências variantes daquelas descritas na Tabela 1 compreende qualquer uma das CDRs de anticorpo (por exemplo, todas as seis CDRs) e/ou sequências de domínio variável de cadeia pesada e/ou leve completas (por exemplo, conjuntos emparelhados de sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve de um clone de anticorpo particular) selecionados daqueles mostrados nas Figuras 24-27B.[114] In various embodiments, the antibody or antigen-binding fragment comprising variant sequences from those described in Table 1 comprises any of the antibody CDRs (for example, all six CDRs) and / or heavy chain variable domain sequences and / or complete light (e.g., paired sets of heavy and light chain variable domain sequences from a particular antibody clone) selected from those shown in Figures 24-27B.
[115] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de ligar tau é descrito, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3). Em várias modalidades, as CDRs e/ou sequências de domínio variável são selecionadas daquelas listadas na Tabela 1. Em algumas modalidades, HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.[115] In various embodiments, an antibody or antigen binding fragment capable of binding tau is described, comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises three regions determinants of heavy chain complementarity (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3). In various embodiments, CDRs and / or variable domain sequences are selected from those listed in Table 1. In some embodiments, HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 , and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
[116] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a tau é descrito, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 7 com uma substituição em um ou mais da posição 1, 2, 3, 9, 12, 19, 30, 31, 35, 37, 42, 43, 48, 49, 51, 54, 55, 56, 58, 62, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 73, 76, 77, 78, 79, 80, 83, 84, 88, 94, 96, 107, 108 e 112, e/ou a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 8 com uma substituição em uma ou mais das posições 3, 7, 11, 14, 17, 19, 20, 21, 24, 25, 28, 39, 42, 49, 52, 56, 69, 71, 75, 92, 94, 99, 105 e 106.[116] In various embodiments, an antibody or antigen-binding fragment capable of binding tau is described, wherein the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 7 with a substitution in one or more of position 1, 2, 3, 9, 12, 19, 30, 31, 35, 37, 42, 43, 48, 49, 51, 54, 55, 56, 58, 62, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 73, 76, 77, 78, 79, 80, 83, 84, 88, 94, 96, 107, 108 and 112, and / or the variable chain region light comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 8 with a substitution in one or more of positions 3, 7, 11, 14, 17, 19, 20, 21, 24, 25, 28, 39 , 42, 49, 52, 56, 69, 71, 75, 92, 94, 99, 105 and 106.
[117] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 com uma substituição em uma ou mais das posições 1, 2, 3, 9, 12, 19, 30, 31, 35, 37, 42, 43, 48, 49, 51, 54, 55, 56, 58, 62, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 73, 76, 77, 78, 79, 80, 83, 84, 88, 94, 96, 107, 108 e 112, em que a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 1 é glicina, na posição 2 é alanina, na posição 3 é arginina, na posição 9 é arginina, na posição 12 é alanina, na posição 19 é arginina, na posição 30 é glicina, na posição 31 é glicina, na posição 35 é arginina, na posição 37 é alanina, na posição 42 é glicina, na posição 43 é metionina, na posição 48 é isoleucina, na posição 49 é treonina, na posição 51 é valina, na posição 54 alanina, na posição 55 é glicina, na posição 56 é serina, na posição 58 é valina, na posição 62 é glicina, na posição 63 é alanina, em posição 64 é selecionada a partir de alanina e ácido glutâmico, na posição 65 é ácido glutâmico, na posição 66 é ácido aspártico, na posição 68 é leucina, na posição 69 é alanina, na posição 70 é treonina, na posição 73 é asparagina, na posição 76 é ácido glutâmico, na posição 77 é serina, na posição 78 é alanina, na posição 79 é metionina, na posição 80 é selecionada a partir de serina, leucina e histidina, na posição 83 é treonina, na posição 84 é alanina, na posição 88 é prolina, na posição 94 é cisteína, na posição 95 é glicina, na posição 107 é alanina, na posição 108 é prolina e/ou na posição 112 é prolina.[117] In some embodiments, the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 with a substitution at one or more of positions 1, 2, 3, 9, 12, 19, 30, 31, 35 , 37, 42, 43, 48, 49, 51, 54, 55, 56, 58, 62, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 73, 76, 77, 78, 79, 80, 83 , 84, 88, 94, 96, 107, 108 and 112, where the substitution in the variable region of heavy chain in position 1 is glycine, in position 2 is alanine, in position 3 is arginine, in position 9 is arginine, in position 12 is alanine, position 19 is arginine, position 30 is glycine, position 31 is glycine, position 35 is arginine, position 37 is alanine, position 42 is glycine, position 43 is methionine, position 48 is isoleucine, in position 49 is threonine, in position 51 is valine, in position 54 is alanine, in position 55 is glycine, in position 56 is serine, in position 58 is valine, in position 62 is glycine, in position 63 is alanine, in position 64 it is selected from alanine and glutamic acid, in position 65 it is glutamic acid, position 66 is aspartic acid, position 68 is leucine, position 69 is alanine, position 70 is threonine, position 73 is asparagine, position 76 is glutamic acid, position 77 is serine, position 78 is alanine, in position 79 is methionine, in position 80 is selected from serine, leucine and histidine, in position 83 is threonine, in position 84 is alanine, in position 88 is proline, in position 94 is cysteine, in position 95 is glycine, in position 107 is alanine, in position 108 is proline and / or in position 112 is proline.
[118] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 com uma substituição em uma ou mais das posições 3, 7, 11, 14, 17, 19, 20, 21, 24, 25, 28, 39, 42, 49, 52, 56, 69, 71, 75, 92, 94, 99, 105 e 106, em que a substituição na região variável de cadeia leve na posição 3 é arginina, na posição 7 é prolina, na posição 11 é selecionada a partir de serina ou leucina, na posição 14 é prolina, na posição 17 é valina, na posição 19 é alanina, na posição 20 é alanina, na posição 21 é valina, na posição 24 é ácido glutâmico, na a posição 25 é treonina, na posição 28 asparagina, na posição 39 isoleucina, na posição 42 é selecionada a partir de serina e ácido aspártico, na posição 49 é prolina, na posição 52 é glicina, na posição 56 é prolina, na posição 69 é glicina, na posição 71 é histidina, na posição 75 é valina, na posição 92 é arginina, na posição 94 é treonina, na posição 99 é serina, na posição 105 é glicina, e/ou na posição 106 é valina.[118] In some embodiments, the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 with a substitution at one or more of positions 3, 7, 11, 14, 17, 19, 20, 21, 24 , 25, 28, 39, 42, 49, 52, 56, 69, 71, 75, 92, 94, 99, 105 and 106, where the substitution in the light chain variable region in position 3 is arginine, in position 7 is proline, in position 11 is selected from serine or leucine, in position 14 is proline, in position 17 is valine, in position 19 is alanine, in position 20 is alanine, in position 21 is valine, in position 24 is acid glutamic, position 25 is threonine, position 28 is asparagine, position 39 isoleucine, position 42 is selected from serine and aspartic acid, position 49 is proline, position 52 is glycine, position 56 is proline, position 69 is glycine, position 71 is histidine, position 75 is valine, position 92 is arginine, position 94 is threonine, position 99 is serine, position 105 is glycine, and / or position 10 6 is valine.
[119] Em várias modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 com uma substituição em uma ou mais das posições 1, 3, 30, 37, 48, 58, 63, 68, 76, 77 e 80, e/ou a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID SEQ ID NO: 8 com uma substituição em uma ou mais das posições 7, 11, 20, 28, 39 e 69.[119] In various embodiments, the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 with a substitution at one or more of positions 1, 3, 30, 37, 48, 58, 63, 68, 76 , 77 and 80, and / or the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID SEQ ID NO: 8 with a substitution at one or more of positions 7, 11, 20, 28, 39 and 69.
[120] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 2 é alanina e/ou a substituição na posição 35 é arginina.[120] In some embodiments, the substitution in the heavy chain variable region at position 2 is alanine and / or the substitution at position 35 is arginine.
[121] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 49 é treonina e/ou na posição 79 metionina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 19 é alanina.[121] In some embodiments, the substitution in the heavy chain variable region at position 49 is threonine and / or at position 79 methionine and / or the substitution in the light chain variable region at position 19 is alanine.
[122] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 43 é metionina, na posição 65 é ácido glutâmico e/ou na posição 80 é serina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 56 é prolina e na posição 94 é treonina.[122] In some embodiments, the substitution in the variable region of heavy chain at position 43 is methionine, at position 65 is glutamic acid and / or at position 80 is serine and / or the substitution in the variable region of light chain at position 56 is proline and at position 94 is threonine.
[123] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 12 é alanina, na posição 64 é ácido glutâmico e na posição 78 é alanina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 21 é valina.[123] In some embodiments, the substitution in the variable region of heavy chain at position 12 is alanine, in position 64 is glutamic acid and in position 78 is alanine and / or the substitution in the variable region of light chain at position 21 is valine.
[124] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 107 é alanina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 42 é ácido aspártico.[124] In some embodiments, the substitution in the variable region of heavy chain at position 107 is alanine and / or the substitution in the variable region of light chain at position 42 is aspartic acid.
[125] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 19 é arginina, na posição 51 é valina, na posição 66 é ácido aspártico e na posição 84 é alanina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 99 é serina.[125] In some embodiments, substitution in the variable region of heavy chain at position 19 is arginine, at position 51 is valine, at position 66 is aspartic acid and at position 84 is alanine and / or substitution in the variable region of light chain in position 99 it is serine.
[126] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 31 é glicina e/ou na posição 80 é serina.[126] In some embodiments, substitution in the heavy chain variable region at position 31 is glycine and / or at position 80 is serine.
[127] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 73 é asparagina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina.[127] In some embodiments, the substitution in the variable region of heavy chain at position 73 is asparagine and / or the substitution in the variable region of light chain at position 11 is leucine.
[128] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 37 é alanina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 42 é serina.[128] In some embodiments, the substitution in the variable region of heavy chain at position 37 is alanine and / or the substitution in the variable region of light chain at position 42 is serine.
[129] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 80 é leucina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina e na posição 105 é glicina.[129] In some embodiments, the substitution in the variable region of heavy chain at position 80 is leucine and / or the substitution in the variable region of light chain at position 11 is leucine and at position 105 is glycine.
[130] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 54 é alanina e/ou na posição 56 é serina.[130] In some embodiments, substitution in the heavy chain variable region at position 54 is alanine and / or at position 56 is serine.
[131] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 37 é alanina, na posição 68 é leucina, na posição 83 é treonina, na posição 99 é cisteína, a subestação na região variável de cadeia leve na posição 25 é treonina, na posição 49 é prolina e/ou na posição 52 é glicina.[131] In some embodiments, the substitution in the variable region of heavy chain in position 37 is alanine, in position 68 is leucine, in position 83 is threonine, in position 99 is cysteine, the substation in the variable region of light chain in position 25 is threonine, at position 49 is proline and / or at position 52 is glycine.
[132] Em algumas modalidades, a substituição na posição na região variável de cadeia pesada na posição 19 é arginina, na posição 42 é glicina e/ou na posição 112 é prolina.[132] In some embodiments, the substitution at the position in the variable region of the heavy chain at position 19 is arginine, at position 42 is glycine and / or at position 112 is proline.
[133] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 80 é leucina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 3 é arginina e/ou na posição 17 é valina.[133] In some embodiments, substitution in the variable region of heavy chain at position 80 is leucine, and substitution in the variable region of light chain at position 3 is arginine and / or at position 17 is valine.
[134] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 19 é arginina, na posição 37 é alanina, na posição 55 é glicina, na posição 70 é treonina, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina e/ou na posição 42 é serina.[134] In some embodiments, the substitution in the variable region of heavy chain in position 19 is arginine, in position 37 is alanine, in position 55 is glycine, in position 70 is threonine, the substitution in the variable region of light chain in position 11 is leucine and / or in position 42 is serine.
[135] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 64 é alanina, a substituição na posição 69 é alanina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 42 é serina.[135] In some embodiments, substitution in the variable region of heavy chain at position 64 is alanine, substitution in position 69 is alanine and / or substitution in the variable region of light chain at position 42 is serine.
[136] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 9 é arginina e/ou na posição 62 é glicina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é serina e/ou na posição 14 é prolina.[136] In some embodiments, the substitution in the variable region of heavy chain at position 9 is arginine and / or at position 62 is glycine and / or the substitution in the variable region of light chain at position 11 is serine and / or at position 14 is proline.
[137] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 37 é alanina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 75 é valina.[137] In some embodiments, the substitution in the variable region of heavy chain at position 37 is alanine and / or the substitution in the variable region of light chain at position 75 is valine.
[138] Em algumas modalidades, a substituição na posição na região variável de cadeia pesada na posição 56 é serina, na posição 88 é prolina e/ou na posição 96 é glicina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve em a posição 11 é leucina, na posição 24 é ácido glutâmico, na posição 42 é ácido aspártico, na posição 71 é histidina, na posição 92 é arginina e/ou na posição 106 é valina.[138] In some embodiments, the substitution at the position in the variable region of the heavy chain at position 56 is serine, at position 88 is proline and / or at position 96 is glycine and / or the substitution in the variable region of light chain at position 11 is leucine, in position 24 is glutamic acid, in position 42 is aspartic acid, in position 71 is histidine, in position 92 is arginine and / or in position 106 is valine.
[139] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 80 é histidina e/ou na posição 108 é prolina.[139] In some embodiments, substitution in the heavy chain variable region at position 80 is histidine and / or at position 108 is proline.
[140] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a tau, compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 com uma substituição em uma ou mais das posições 1, 3, 30, 37, 48, 58, 63, 68, 76, 77 e 80, e uma região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID SEQ ID NO: 8 com uma substituição em uma ou mais das posições 7, 11, 20, 28, 39 e 69. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 1 é glicina, na posição 3 é arginina, na posição 30 é glicina, na posição 37 é alanina, na posição 48 é isoleucina, na posição 58 é valina, na posição 63 é alanina, na posição 68 é leucina, na posição 76 é ácido glutâmico, na posição 77 é serina e/ou na posição 80 é serina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 7 é prolina, na posição 11 é selecionado de leucina e serina, na posição 20 é alanina, na posição 28 é asparagina, na posição 39 é isoleucina e/ou na posição 69 é glicina.[140] In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment capable of binding tau comprises a variable heavy chain region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 with a substitution in one or more of the positions 1, 3, 30, 37, 48, 58, 63, 68, 76, 77 and 80, and a light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID SEQ ID NO: 8 with a substitution in one or more of positions 7, 11, 20, 28, 39 and 69. In several modalities, the substitution in the variable region of heavy chain in position 1 is glycine, in position 3 is arginine, in position 30 is glycine, in position 37 is alanine, in position 48 is isoleucine, in position 58 is valine, in position 63 is alanine, in position 68 is leucine, in position 76 is glutamic acid, in position 77 is serine and / or in position 80 is serine, and substitution in the region light chain variable in position 7 is proline, in position 11 is selected from leucine and serine, in position 20 is alanine, in position 28 is asparagine, at position 39 is isoleucine and / or at position 69 is glycine.
[141] Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 68 é leucina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 39 é isoleucina.[141] In several embodiments, the substitution in the variable region of heavy chain at position 68 is leucine and / or the substitution in the variable region of light chain at position 39 is isoleucine.
[142] Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 48 é isoleucina.[142] In several embodiments, substitution in the heavy chain variable region at position 48 is isoleucine.
[143] Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 30 é glicina e/ou na posição 58 é valina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 7 é prolina e/ou na posição 69 é glicina.[143] In several embodiments, substitution in the variable region of heavy chain at position 30 is glycine and / or at position 58 is valine, and substitution in the variable region of light chain at position 7 is proline and / or at position 69 is glycine.
[144] Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é serina.[144] In several embodiments, the substitution in the 11-position light chain variable region is serine.
[145] Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 77 é serina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina, na posição 20 é alanina e/ou na posição 28 é asparagina.[145] In several embodiments, substitution in the variable region of heavy chain at position 77 is serine and / or substitution in the variable region of light chain at position 11 is leucine, at position 20 is alanine and / or at position 28 is asparagine .
[146] Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 37 é alanina, na posição 63 é alanina e/ou a posição 80 é serina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina.[146] In several embodiments, the substitution in the variable region of heavy chain at position 37 is alanine, in position 63 is alanine and / or position 80 is serine and / or the substitution in the variable region of light chain at position 11 is leucine .
[147] Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 1 é glicina, na posição 3 é arginina, na posição 76 é ácido glutâmico e/ou na posição 77 é serina.[147] In several embodiments, the substitution in the heavy chain variable region at position 1 is glycine, at position 3 is arginine, at position 76 is glutamic acid and / or at position 77 is serine.
[148] Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina.[148] In several embodiments, the substitution in the light chain variable region at position 11 is leucine.
[149] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.[149] In some embodiments, the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and the light chain variable region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
[150] Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a tau, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2, e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.[150] In some embodiments, an antibody or antigen binding fragment capable of binding to tau, comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises three regions determinants of heavy chain complementarity (HCDR1, HCDR2, and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determinants (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; and where LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28. In some embodiments, the variable region of The heavy chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 29 and the variable region of the light chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.
[151] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de ligar tau é descrito, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou SEQ ID NO: 1 com um substituição em uma ou mais das posições 5 e 6, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 2 com uma substituição em uma ou mais das posições 1, 4, 5, 6 e 8, HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 4 com uma substituição na posição 2, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de[151] In various embodiments, an antibody or antigen binding fragment capable of binding tau is described, comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises three regions heavy chain complementarity determinants (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determinants (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO : 1, or SEQ ID NO: 1 with a substitution in one or more of positions 5 and 6, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 2 with a substitution in one or more of positions 1 , 4, 5, 6 and 8, HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 4 with a substitution in position 2, LCDR2 comprises the amino acid sequence of
SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 5 com uma substituição na posição 3, um d LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 6 com uma substituição em um ou mais da posição 4 e 6. Em várias modalidades, a substituição na posição 5 em HCDR1 é glicina, a substituição em posição 6 em HCDR1 é glicina, th A substituição na posição 1 em HCDR2 é valina, a substituição na posição 4 em HCDR2 é alanina, a substituição na posição 5 em HCDR2 é glicina, a substituição na posição 6 em HCDR2 é serina, a substituição na posição 8 em HCDR2 é valina, a substituição na posição 2 em LCDR1 é asparagina, a substituição na posição 3 em LCDR2 é glicina e/ou a substituição na posição 4 de LCDR3 é arginina e/ou a substituição na posição 6 em LCDR3 é treonina.SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 5 with a substitution in position 3, a d LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 6 with a substitution in one or more of positions 4 and 6 In several modalities, the substitution in position 5 in HCDR1 is glycine, the substitution in position 6 in HCDR1 is glycine, th The substitution in position 1 in HCDR2 is valine, the substitution in position 4 in HCDR2 is alanine, the substitution in position 5 in HCDR2 is glycine, the substitution in position 6 in HCDR2 is serine, the substitution in position 8 in HCDR2 is valine, the substitution in position 2 in LCDR1 is asparagine, the substitution in position 3 in LCDR2 is glycine and / or the substitution in position 4 of LCDR3 is arginine and / or the replacement in position 6 in LCDR3 is threonine.
[152] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a tau, em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 com uma substituição na posição 5, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 com uma substituição na posição 8, HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 com uma substituição na posição 2, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e/ou LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.[152] In various embodiments, an antibody or antigen-binding fragment capable of binding tau, where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with a substitution at position 5, HCDR2 comprises the sequence of amino acids of SEQ ID NO: 2 with a substitution in position 8, HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 with a substitution in position 2, LCDR2 comprises the sequence amino acid of SEQ ID NO: 5 and / or LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
[153] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a tau, em que a substituição na posição 5 em HCDR1 é glicina, a substituição na posição 8 em HCDR2 é valina e/ou a substituição na posição 2 em LCDR1 é asparagina.[153] In several embodiments, an antibody or antigen binding fragment capable of binding to tau, where the substitution at position 5 in HCDR1 is glycine, substitution at position 8 in HCDR2 is valine and / or the substitution in position 2 on LCDR1 is asparagine.
[154] Em várias modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a tau compreende uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID[154] In various embodiments, the antibody or antigen-binding fragment capable of binding tau comprises an HCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID
NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; ouNO: 1, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41; or
[155] uma HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO 34 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO 6; ou[155] an HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO 34 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO 6; or
[156] uma HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou[156] an HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; or
[157] uma HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou[157] an HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; or
[158] uma HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de[158] an HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of
SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ouSEQ ID NO: 3; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; or
[159] uma HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou[159] an HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; or
[160] uma HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou[160] an HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; or
[161] uma HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou[161] an HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; or
[162] uma HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; ou[162] an HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42; or
[163] uma HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou[163] an HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; or
[164] uma HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.[164] an HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
[165] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a tau compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; ou[165] In various embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof capable of binding to tau comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises the sequence of amino acids of SEQ ID NO: 43 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52; or
[166] a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; ou[166] the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 55 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 57 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 59 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62; or
[167] a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 81 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 82; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 87 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 88; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 92; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 96; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 98; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94.[167] the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 63 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 64; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 65 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 68; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 73 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 76; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 78; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 79 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 80; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 81 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 83 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 84; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 87 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 88; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 89 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 95 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 96; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 97 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 98; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 57 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 65 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 78; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 79 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 80; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 83 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 84; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94.
[168] Também são descritos no presente documento, em várias modalidades, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno que podem competir pela ligação com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo definido pela sequência, conforme descrito neste parágrafo. Em outra modalidade, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste no presente documento descrito pode se ligar ao mesmo epítopo na proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) como aquele de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo definido pela sequência, conforme descrito neste parágrafo.[168] Antibody-binding antibodies or fragments that can compete for binding to an antibody or antigen-binding fragment of the same are also described in this document in various modalities, as described in this paragraph. In another embodiment, an antibody or antigen-binding fragment thereof in this document described can bind to the same epitope on the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 9) as that of an antibody or antigen-binding fragment defined by the sequence , as described in this paragraph.
[169] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que é descrito no presente documento pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 188-227 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, o epítopo compreende um ou mais dos resíduos 210- 221 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 11). Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que é descrito no presente documento pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo os resíduos 188-227 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, o epítopo compreende os resíduos 210-221 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 11). O epítopo pode conter pelo menos um ou mais de um resíduo fosforilado, que pode incluir uma fosfo-treonina na posição 217 da proteína tau 2N4R (SEQ[169] In various embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof that is described herein can bind to a tau epitope comprising one or more of the 188-227 residues of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 10 ). In some embodiments, the epitope comprises one or more of residues 210-221 of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 11). In various embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof that is described herein can bind to a tau epitope comprising residues 188-227 of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 10). In some embodiments, the epitope comprises residues 210-221 of the tau 2N4R protein (SEQ ID NO: 11). The epitope may contain at least one or more of a phosphorylated residue, which may include a phospho-threonine at position 217 of the 2N4R tau protein (SEQ
ID NO: 9). Em algumas modalidades, o epítopo também compreende uma serina fosforilada na posição 210, treonina na posição 212, serina na posição 214 ou treonina na posição 220 da proteína tau 2N4R ou qualquer combinação das mesmas.ID NO: 9). In some embodiments, the epitope also comprises a phosphorylated serine at position 210, threonine at position 212, serine at position 214 or threonine at position 220 of the 2N4R tau protein or any combination thereof.
Em certas modalidades, o epítopo compreende ou consiste em SRTPSLPpTPPTR (sequência de SEQ ID NO: 12). Em certas modalidades, o epítopo compreende ou consiste em uma região que compreende mais de um resíduo fosforilado, por exemplo, SRpTPSLPpTPPTR (sequência de SEQ ID NO: 31). Em algumas modalidades, o epítopo é determinado por qualquer método conhecido pelo versado na técnica.In certain embodiments, the epitope comprises or consists of SRTPSLPpTPPTR (sequence of SEQ ID NO: 12). In certain embodiments, the epitope comprises or consists of a region comprising more than one phosphorylated residue, for example, SRpTPSLPpTPPTR (sequence of SEQ ID NO: 31). In some embodiments, the epitope is determined by any method known to the person skilled in the art.
Em algumas modalidades, a varredura de alanina ou estudos de deleção/mutagênese são usados para determinar o epítopo.In some modalities, alanine scanning or deletion / mutagenesis studies are used to determine the epitope.
Em algumas modalidades, a espectrometria de massa é usada para determinar o epítopo.In some embodiments, mass spectrometry is used to determine the epitope.
Em certas modalidades, o epítopo é determinado por uma estrutura cristalina do complexo anticorpo-tau, onde o epítopo é definido como qualquer resíduo de contato em tau dentro de 5 angstroms da bolsa de ligação do anticorpo.In certain embodiments, the epitope is determined by a crystal structure of the antibody-tau complex, where the epitope is defined as any contact residue in tau within 5 angstroms of the antibody binding pouch.
Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 7 e uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o anticorpo ou ligação ao antígeno fragmento compreende uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 29 e uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 com uma substituição em uma ou mais das posições 1, 3, 30, 37, 48, 58, 63, 68, 76, 77 e 80, e/ou a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID SEQ ID NO: 8 com uma substituição em um ou mais da posição 7, 11, 20, 28, 39 e 69. Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 68 é leucina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 39 é isoleucina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 48 é isoleucina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 30 é glicina e na posição 58 é valina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 7 é prolina e na posição 69 é glicina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é serina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 77 é serina e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina, na posição 20 é alanina e na posição 28 é asparagina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 37 é alanina, na posição 63 é alanina e a posição 80 é serina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 1 é glicina, na posição 3 é arginina, na posição 76 é ácido glutâmico e na posição 77 é serina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina.In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment comprises an amino acid sequence from the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 7 and an amino acid sequence from the light chain variable region of SEQ ID NO: 8. In some embodiments , the antibody or antigen binding fragment comprises an amino acid sequence of the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 29 and an amino acid sequence of the light chain variable region of SEQ ID NO: 30. In some embodiments, the antibody or The antigen-binding fragment comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 with a substitution at one or more of positions 1, 3, 30, 37, 48, 58, 63, 68, 76, 77 and 80, and / or the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID SEQ ID NO: 8 with a substitution in one or more of position 7, 11, 20, 28, 39 and 69. In some embodiments , substitution in the variable region of heavy chain at position 68 it is leucine, and the substitution in the light chain variable region at position 39 is isoleucine. In several embodiments, substitution in the heavy chain variable region at position 48 is isoleucine. In several embodiments, substitution in the variable region of heavy chain at position 30 is glycine and at position 58 is valine, and substitution in the variable region of light chain at position 7 is proline and at position 69 is glycine. In several modalities, the substitution in the variable region of the light chain at position 11 is serine. In several embodiments, substitution in the variable region of heavy chain at position 77 is serine and substitution in the variable region of light chain at position 11 is leucine, at position 20 is alanine and at position 28 is asparagine. In several embodiments, the substitution in the variable region of heavy chain at position 37 is alanine, in position 63 is alanine and position 80 is serine, and the substitution in the variable region of light chain at position 11 is leucine. In several embodiments, the substitution in the variable region of heavy chain at position 1 is glycine, at position 3 is arginine, at position 76 is glutamic acid and at position 77 is serine. In several embodiments, substitution in the variable region of the light chain at position 11 is leucine.
[170] Em outros aspectos, são no presente documento descritos anticorpos que podem competir pela ligação à proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) com um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 29 e uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 com uma substituição em um ou mais da posição 1, 3, 30, 37, 48, 58, 63, 68, 76, 77 e 80, e/ou a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID SEQ ID NO: 8 com um substituição em um ou mais das posições 7, 11, 20, 28, 3 9 e 69. Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 68 é leucina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 39 é isoleucina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 48 é isoleucina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 30 é glicina e na posição 58 é valina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 7 é prolina e na posição 69 é glicina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é serina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 77 é serina e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina, na posição 20 é alanina e na posição 28 é asparagina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 37 é alanina, na posição 63 é alanina e a posição 80 é serina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 1 é glicina, na posição 3 é arginina, na posição 76 é ácido glutâmico e na posição 77 é serina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina.[170] In other respects, antibodies that can compete for binding to the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 9) are described in this document with an antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and the light chain variable region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment comprises a amino acid sequence of the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 29 and an amino acid sequence of the light chain variable region of SEQ ID NO: 30. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment comprises a variable region of The heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 with a substitution at one or more of position 1, 3, 30, 37, 48, 58, 63, 68, 76, 77 and 80, and / or the variable region light chain comprises the amino acid equation of SEQ ID SEQ ID NO: 8 with a substitution in one or more of positions 7, 11, 20, 28, 3 9 and 69. In some embodiments, the substitution in the heavy chain variable region at position 68 is leucine , and substitution in the light chain variable region at position 39 is isoleucine. In several embodiments, substitution in the heavy chain variable region at position 48 is isoleucine. In several embodiments, substitution in the variable region of heavy chain at position 30 is glycine and at position 58 is valine, and substitution in the variable region of light chain at position 7 is proline and at position 69 is glycine. In several modalities, the substitution in the variable region of the light chain at position 11 is serine. In several embodiments, substitution in the variable region of heavy chain at position 77 is serine and substitution in the variable region of light chain at position 11 is leucine, at position 20 is alanine and at position 28 is asparagine. In several embodiments, the substitution in the variable region of heavy chain at position 37 is alanine, in position 63 is alanine and position 80 is serine, and the substitution in the variable region of light chain at position 11 is leucine. In several embodiments, the substitution in the variable region of heavy chain at position 1 is glycine, at position 3 is arginine, at position 76 is glutamic acid and at position 77 is serine. In several embodiments, substitution in the variable region of the light chain at position 11 is leucine.
[171] Em várias modalidades, a competição é medida por citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência, ELISA, HTRF e/ou SPR.[171] In several modalities, competition is measured by flow cytometry or fluorescence microscopy, ELISA, HTRF and / or SPR.
Em uma modalidade, ELISA de competição é usado para medir a ligação competitiva.In one modality, competition ELISA is used to measure the competitive bond.
Em outra modalidade, um ensaio BIACORE é usado.In another embodiment, a BIACORE assay is used.
Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno com o qual o anticorpo descrito compete compreende uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 7 e uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno com o qual o anticorpo descrito compete compreende uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 29 e uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno com o qual o anticorpo descrito compete compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 com uma substituição em uma ou mais das posições 1, 3, 30, 37, 48, 58, 63, 68, 76, 77 e 80, e/ou a região variável de cadeia leve compreende o aminoácido se sequência de SEQ ID SEQ ID NO: 8 com uma substituição em uma ou mais das posições 7, 11, 20, 28, 39 e 69. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo com o qual o anticorpo descrito compete, compreende uma substituição na região variável de cadeia pesada na posição 68 é leucina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 39 é isoleucina.In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment with which the described antibody competes comprises an amino acid sequence of the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 7 and an amino acid sequence of the light chain variable region of SEQ ID NO: 8. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment with which the antibody described competes comprises an amino acid sequence from the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 29 and an amino acid sequence from the variable chain region light of SEQ ID NO: 30. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment with which the described antibody competes comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 with a substitution in one or more of positions 1, 3, 30, 37, 48, 58, 63, 68, 76, 77 and 80, and / or the light chain variable region comprises the amino acid and sequence of SEQ ID SEQ ID NO: 8 with a replacement in one or more of positions 7, 11, 20, 28, 39 and 69. In some embodiments, the antibody or antibody fragment with which the described antibody competes, comprises a substitution in the variable region of heavy chain at position 68 is leucine, and the substitution in the light chain variable region at position 39 is isoleucine.
Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 48 é isoleucina.In several embodiments, substitution in the heavy chain variable region at position 48 is isoleucine.
Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 30 é glicina e na posição 58 é valina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 7 é prolina e na posição 69 é glicina.In several embodiments, substitution in the variable region of heavy chain at position 30 is glycine and at position 58 is valine, and substitution in the variable region of light chain at position 7 is proline and at position 69 is glycine.
Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é serina.In several modalities, the substitution in the variable region of the light chain at position 11 is serine.
Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 77 é serina e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina, na posição 20 é alanina e na posição 28 é asparagina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 37 é alanina, na posição 63 é alanina e a posição 80 é serina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 1 é glicina, na posição 3 é arginina, na posição 76 é ácido glutâmico e na posição 77 é serina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode se ligar ao mesmo um ou mais aminoácidos na proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) como um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.In several embodiments, substitution in the variable region of heavy chain at position 77 is serine and substitution in the variable region of light chain at position 11 is leucine, at position 20 is alanine and at position 28 is asparagine. In several embodiments, the substitution in the variable region of heavy chain at position 37 is alanine, in position 63 is alanine and position 80 is serine, and the substitution in the variable region of light chain at position 11 is leucine. In several embodiments, the substitution in the variable region of heavy chain at position 1 is glycine, at position 3 is arginine, at position 76 is glutamic acid and at position 77 is serine. In several embodiments, substitution in the variable region of the light chain at position 11 is leucine. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment may bind to it one or more amino acids in the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 9) as an antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the variable chain region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and the light chain variable region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
[172] Em várias modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno com o qual o anticorpo descrito compete pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 188-227 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 10). Em certas modalidades, o epítopo compreende um ou mais dos resíduos 210- 221 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 11). Em outras modalidades, o epítopo compreende pelo menos um resíduo fosforilado. Em outra modalidade, o pelo menos um resíduo fosforilado compreende uma fosfo-treonina na posição 217 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) e, opcionalmente, também compreende uma serina fosforilada na posição 210, treonina na posição 212, serina na posição 214, ou treonina na posição 220 da proteína tau 2N4R ou qualquer combinação das mesmas. Em outra modalidade, o epítopo compreende ou consiste em SRTPSLPpTPPTR (sequência de SEQ ID NO: 12). Em certas modalidades, o epítopo compreende ou consiste em SRpTPSLPpTPPTR (sequência de SEQ ID NO: 31).[172] In several embodiments, the antibody or antigen-binding fragment with which the described antibody competes can bind to a tau epitope comprising one or more of the 188-227 residues of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 10) . In certain embodiments, the epitope comprises one or more of residues 210-221 of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 11). In other embodiments, the epitope comprises at least one phosphorylated residue. In another embodiment, the at least one phosphorylated residue comprises a phospho-threonine at position 217 of the tau protein 2N4R (SEQ ID NO: 9) and optionally also comprises a phosphorylated serine at position 210, threonine at position 212, serine at position 214, or threonine at position 220 of the 2N4R tau protein or any combination thereof. In another embodiment, the epitope comprises or consists of SRTPSLPpTPPTR (sequence of SEQ ID NO: 12). In certain embodiments, the epitope comprises or consists of SRpTPSLPpTPPTR (sequence of SEQ ID NO: 31).
[173] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que pode se ligar a uma região ou fragmento da proteína tau 2N4R compreendendo ou consistindo nos resíduos 188-227 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 10), em que a região ou fragmento é fosforilado. Em várias modalidades, a região ou fragmento compreende ou consiste nos resíduos 210-221 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 11). Em várias modalidades, a região ou fragmento é fosforilado em uma posição correspondente ao resíduo 217 da proteína tau 2N4R e, opcionalmente, também em uma ou mais das posições correspondentes a serina 210, treonina 212, serina 214 e treonina 220 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9). Em várias modalidades, a região ou fragmento da proteína tau 2N4R compreende ou consiste em SRTPSLPpTPPTR (sequência de SEQ ID NO. 12). Em certas modalidades, o epítopo compreende ou consiste em SRpTPSLPpTPPTR (sequência de SEQ ID NO: 31).[173] In various embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof that can bind to a region or fragment of the 2N4R tau protein comprising or consisting of residues 188-227 of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 10), where the region or fragment is phosphorylated. In various embodiments, the region or fragment comprises or consists of residues 210-221 of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 11). In various embodiments, the region or fragment is phosphorylated in a position corresponding to residue 217 of the tau 2N4R protein and, optionally, also in one or more of the positions corresponding to serine 210, threonine 212, serine 214 and threonine 220 of the tau 2N4R protein ( SEQ ID NO: 9). In various embodiments, the 2N4R tau protein region or fragment comprises or consists of SRTPSLPpTPPTR (sequence of SEQ ID NO. 12). In certain embodiments, the epitope comprises or consists of SRpTPSLPpTPPTR (sequence of SEQ ID NO: 31).
[174] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento pode se ligar a um epítopo fosforilado em tau, por exemplo, conforme medido por citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência, ELISA, HTRF e/ou SPR. Em uma modalidade, o ELISA é usado para medir ou verificar a ligação a tau fosforilada e desfosforilada. Em outra modalidade, um ensaio BIACORE é usado.[174] In several embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described in this document can bind to a tau phosphorylated epitope, for example, as measured by flow cytometry or fluorescence microscopy, ELISA, HTRF and / or SPR . In one embodiment, the ELISA is used to measure or verify the binding to phosphorylated and dephosphorylated tau. In another embodiment, a BIACORE assay is used.
[175] Em várias modalidades, é descrito no presente documento um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 151 a 188 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 13). Em algumas modalidades, o epítopo em tau compreende um ou mais dos resíduos 163-172 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 14). Em várias modalidades, é descrito no presente documento um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo os resíduos 151 a 188 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 13). Em algumas modalidades, o epítopo em tau compreende os resíduos 163-172 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 14). Em certas modalidades, o epítopo compreende ou consiste em KGQANATRIP (sequência de SEQ ID NO. 14). Em certas modalidades, um ou mais dos resíduos no epítopo são fosforilados, por exemplo, uma treonina fosforilada na posição 169 da proteína tau 2N4R.[175] In various embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof that can bind to a tau epitope comprising one or more of residues 151 to 188 of the tau 2N4R protein (SEQ ID NO: 13) is described in this document. ). In some embodiments, the tau epitope comprises one or more of residues 163-172 of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 14). In various embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof that can bind to a tau epitope comprising residues 151 to 188 of the tau 2N4R protein (SEQ ID NO: 13) is described in this document. In some embodiments, the tau epitope comprises residues 163-172 of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 14). In certain embodiments, the epitope comprises or consists of KGQANATRIP (sequence of SEQ ID NO. 14). In certain embodiments, one or more of the residues in the epitope are phosphorylated, for example, a phosphorylated threonine at position 169 of the 2N4R tau protein.
[176] Em várias modalidades, é descrito no presente documento um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que pode se ligar a uma porção ou fragmento de tau compreendendo os resíduos 151 a 188 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 13). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que pode se ligar a uma porção ou fragmento de tau compreendendo os resíduos 163-172 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 14).[176] In various embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof that can bind to a portion or fragment of tau comprising residues 151 to 188 of the tau 2N4R protein is described in this document (SEQ ID NO: 13) . In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof can bind to a portion or fragment of tau comprising residues 163-172 of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 14).
[177] Em algumas modalidades, o epítopo de um anticorpo no presente documento descrito é determinado por qualquer método conhecido pelo versado na técnica. Em algumas modalidades, a varredura de alanina ou estudos de deleção/mutagênese são usados para determinar o epítopo. Em algumas modalidades, a espectrometria de massa é usada para determinar o epítopo. Em certas modalidades, o epítopo é determinado por uma estrutura cristalina do complexo anticorpo-tau, onde o epítopo é definido como qualquer resíduo de contato em tau dentro de 5 angstroms da bolsa de ligação do anticorpo.[177] In some embodiments, the epitope of an antibody herein described is determined by any method known to the person skilled in the art. In some modalities, alanine scanning or deletion / mutagenesis studies are used to determine the epitope. In some embodiments, mass spectrometry is used to determine the epitope. In certain embodiments, the epitope is determined by a crystal structure of the antibody-tau complex, where the epitope is defined as any contact residue in tau within 5 angstroms of the antibody binding pouch.
[178] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de ligar tau é descrito, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Em certas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno podem competir pela ligação a um ou mais aminoácidos ácidos na proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) com o anticorpo precedentemente descrito ou fragmento de ligação ao antígeno deste. Em outra modalidade, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ligar o mesmo epítopo na proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) ligada ao anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno previamente descritos neste parágrafo. Em uma modalidade, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ligar o fragmento ou região da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) ligada pelo anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno previamente descritos neste parágrafo.[178] In various embodiments, an antibody or antigen binding fragment capable of binding tau is described, comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises three regions heavy chain complementarity determinants (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO : 15, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. In certain embodiments, the variable region of The heavy chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and the variable region of the light chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. In several embodiments, an antibody or antigen-binding fragments can compete for binding to a or more acidic amino acids in the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 9) with the previously described antibody or antigen-binding fragment thereof. In another embodiment, an antibody or antigen-binding fragment thereof can bind the same epitope to the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 9) bound to the antibody or antigen-binding fragments previously described in this paragraph. In one embodiment, an antibody or antigen-binding fragment thereof can bind the 2N4R tau protein fragment or region (SEQ ID NO: 9) bound by the antibody or antigen-binding fragments previously described in this paragraph.
[179] Em várias modalidades, qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno no presente documento descritos pode compreender uma região constante de cadeia pesada e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia pesada pode ser um isótipo IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, ou um derivado ou fragmento deste que retém pelo menos uma função efetora da cadeia pesada intacta. A região constante de cadeia pesada pode ser um isótipo IgG humano. A região constante de cadeia pesada pode ser um isótipos de IgG1 humana ou IgG4 humana. A região constante de cadeia pesada pode ser um isótipo IgG1 humano. A região constante de cadeia leve pode ser uma cadeia leve kapa humana ou cadeia leve lambda ou um derivado ou fragmento desta que retém pelo menos uma função efetora da cadeia leve intacta. A região constante de cadeia leve pode ser uma cadeia leve kapa humana.[179] In various embodiments, any of the antibodies or antigen-binding fragments described herein may comprise a heavy chain constant region and a light chain constant region. The heavy chain constant region can be an IgG, IgM, IgA, IgD and IgE isotype, or a derivative or fragment thereof that retains at least one intact heavy chain effector function. The heavy chain constant region can be a human IgG isotype. The heavy chain constant region can be an isotype of human IgG1 or human IgG4. The heavy chain constant region can be a human IgG1 isotype. The light chain constant region can be a human kappa light chain or lambda light chain or a derivative or fragment thereof that retains at least one effector function of the intact light chain. The light chain constant region can be a human kappa light chain.
[180] Em várias modalidades, qualquer um dos anticorpos descritos ou fragmentos de ligação ao antígeno podem ser um anticorpo de roedor ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo quimérico ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo enxertado com CDR ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou um anticorpo humanizado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em outra modalidade, qualquer um dos anticorpos descritos ou fragmentos de ligação ao antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve humanas ou derivadas de humanos, incluindo estruturas humanas, ou estruturas humanas com uma ou mais mutações reversas. Vide, por exemplo, as estratégias de retromutação delineadas na Patente U.S. No. 7.566.771, cuja invenção é no presente documento incorporada por referência. Em várias modalidades, qualquer um dos anticorpos descritos ou fragmentos de ligação ao antígeno podem ser um fragmento Fab, Fab', F(ab')2, Fd, scFv, (scFv)2, scFv-Fc ou Fv.[180] In various embodiments, any of the described antibodies or antigen-binding fragments can be a rodent antibody or antigen-binding fragment, a chimeric antibody or an antigen-binding fragment, an antibody grafted with CDR or an antigen-binding fragment thereof, or a humanized antibody or an antigen-binding fragment thereof. In another embodiment, any of the described antibodies or antigen-binding fragments comprise variable regions of human or human-derived heavy and light chain, including human structures, or human structures with one or more reverse mutations. See, for example, the retromutation strategies outlined in U.S. Patent No. 7,566,771, the invention of which is hereby incorporated by reference. In various embodiments, any of the described antibodies or antigen-binding fragments can be a Fab, Fab ', F (ab') 2, Fd, scFv, (scFv) 2, scFv-Fc or Fv fragment.
[181] Em várias modalidades, o anticorpo DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno funcional do mesmo é descrito, em que DC2E7 é um anticorpo produzido por um hibridoma depositado sob o Depósito de Patentes do Catálogo de Culturas do Tipo Americanas No. PTA-124992. Em várias modalidades, o anticorpo DC2E2 ou um fragmento de ligação ao antígeno funcional do mesmo é descrito, em que DC2E2 é um anticorpo produzido por um hibridoma depositado sob o Depósito de Patentes do Catálogo de Culturas do Tipo Americanas No. PTA-124991. Também são descritos anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que podem se ligar ao mesmo epítopo na proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) ou podem competir pela ligação à proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) com o anticorpo DC2E7 ou o anticorpo DC2E2.[181] In several embodiments, the DC2E7 antibody or a functional antigen binding fragment thereof is described, where DC2E7 is an antibody produced by a hybridoma deposited under the Patent Deposit of the American Type Cultures Catalog No. PTA- 124992. In various embodiments, the DC2E2 antibody or a functional antigen-binding fragment thereof is described, wherein DC2E2 is an antibody produced by a hybridoma deposited under the Patent Deposit of the American Type Cultures Catalog No. PTA-124991. Also described are antibodies and antigen-binding fragments that can bind to the same epitope on the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 9) or can compete for binding to the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 9) with the DC2E7 antibody or the DC2E2 antibody.
[182] Em várias modalidades, qualquer um dos anticorpos descritos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser conjugados a um segundo agente. O segundo agente pode ser, por exemplo, pelo menos um agente detectável, incluindo, mas não se limitando a, uma enzima, um radioisótopo, um fluoróforo, um marcador de ressonância magnética nuclear ou um metal pesado. Em uma modalidade, o pelo menos um marcador detectável é um radioisótopo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conjugado a um marcador detectável (por exemplo, um radiomarcador) compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.[182] In several embodiments, any of the described antibodies or antigen-binding fragments thereof can be conjugated to a second agent. The second agent can be, for example, at least one detectable agent, including, but not limited to, an enzyme, a radioisotope, a fluorophore, a nuclear magnetic resonance marker or a heavy metal. In one embodiment, the at least one detectable marker is a radioisotope. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment conjugated to a detectable marker (for example, a radiolabel) comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises three regions heavy chain complementarity determinants (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determinants (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO : 1, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and where LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In some embodiments, the variable region of The heavy chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and the variable region of the light chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
[183] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conjugado a um marcador detectável (por exemplo, um radiomarcador) compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28. Em algumas modalidades, em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conjugado com um marcador detectável compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conjugado com um marcador detectável (por exemplo, um radiomarcador) compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 81 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 82; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 87 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 88; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 96; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 98; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94.[183] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment conjugated to a detectable marker (for example, a radiolabel) comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises three heavy chain complementarity determining regions (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; and where LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28. In some embodiments, in some embodiments, the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 29 and the light chain variable region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 30. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof conjugated to a detectable marker comprises a variable region of heavy chain and a variable region of light chain, in which the variable region of heavy chain comprises three determining regions of complementarity of heavy chain (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), in some modalities, the antibody or antigen-binding fragment conjugated to a detectable marker (for example, a radiolabel) comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region , wherein the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 55 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 57 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 59 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 63 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 64; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 65 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 68; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 73 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 76; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 78; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 79 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 80; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 81 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 83 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 84; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 87 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 88; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 89 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 95 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 96; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 97 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 98; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 57 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 65 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 78; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 79 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 80; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 83 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 84; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94.
[184] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conjugado a um marcador detectável (por exemplo, um radiomarcador) pode competir pela ligação ou ligar o mesmo epítopo que este anticorpo definido pela sequência.[184] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment conjugated to a detectable marker (for example, a radiolabel) may compete for binding or bind the same epitope as this antibody defined by the sequence.
[185] Exemplos de tipos adequados de marcadores detectáveis consistentes com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, enzimas, radioisótopos e radionuclídeos, metais coloidais,[185] Examples of suitable types of detectable markers consistent with the present invention include, but are not limited to, enzymes, radioisotopes and radionuclides, colloidal metals,
compostos fluorescentes, compostos quimioluminescentes, grupos biotinila, epítopos polipeptídicos predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de pares de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, etiquetas de epítopo) e compostos químicos/eletroquímicos/bioluminescentes. As enzimas incluem, mas não estão limitadas a, peroxidase (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre), luciferase, fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicose oxidase, glicose amilase, anidrase carbônica, acetilcolinesterase, lisozima, malato desidrogenase ou glicose-6 fosfato desidrogenase. Alternativamente, o marcador pode ser biotina, digoxina-genina ou 5- bromo-desoxiuridina. Os marcadores fluorescentes também podem ser combinados com os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, incluindo rodamina, fósforos de lantanídeos, fluoresceína e seus derivados, fluorocromos, rodamina e seus derivados, proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente vermelha (RFP), dansila, umbeliferona, e outros. Esses conjugados podem ser preparados por métodos conhecidos por um especialista na técnica. Eles podem ser ligados diretamente a marcadores; através de um grupo espaçador ou grupo de ligação tal como polialdeído, glutaraldeído, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ou ácido dietilenotriaminopentaacético (DPTA); ou na presença de outros agentes de ligação, tais como aqueles rotineiramente conhecidos na técnica.fluorescent compounds, chemiluminescent compounds, biotinyl groups, predetermined polypeptide epitopes recognized by a secondary reporter (e.g., leucine zipper pair sequences, binding sites for secondary antibodies, metal binding domains, epitope tags) and chemical compounds / electrochemical / bioluminescent. Enzymes include, but are not limited to, peroxidase (eg, horseradish peroxidase), luciferase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, glucose oxidase, glucose amylase, carbonic anhydrase, acetylcholinesterase, lysozyme, dehydrogenase malate or glucose-6 dehydrogenase. Alternatively, the marker can be biotin, digoxin-genin or 5-bromo-deoxyuridine. Fluorescent markers can also be combined with antibodies and antigen-binding fragments thereof, including rhodamine, lanthanide matches, fluorescein and its derivatives, fluorochromes, rhodamine and its derivatives, green fluorescent protein (GFP), red fluorescent protein (RFP ), dansila, umbeliferona, and others. Such conjugates can be prepared by methods known to a person skilled in the art. They can be linked directly to bookmarks; through a spacer group or linking group such as polyaldehyde, glutaraldehyde, ethylene diaminetetraacetic acid (EDTA) or diethylene triaminopentaacetic acid (DPTA); or in the presence of other binding agents, such as those routinely known in the art.
[186] Outros marcadores detectáveis podem incluir marcadores radioativos, como iodo-123, iodo-125, iodo-126, iodo-133, iodo-131, bromo-77, tecnécio-99m, índio-113m, gálio-67, gálio- 68, rutênio-95, rutênio-97, rutênio-103, rutênio-106, mercúrio-203, escândio-47, telúrio-121m, telúrio-128, túlio-165, túlio-167, túlio-168, flúor-18, ítrio- 99 e zircônio-89. Métodos existentes conhecidos de um versado na técnica para marcar anticorpos com radioisótipos, seja direta ou indiretamente, por exemplo, através de um agente quelante como EDTA ou DTPA podem ser usados.[186] Other detectable markers may include radioactive markers, such as iodine-123, iodine-125, iodine-126, iodine-133, iodine-131, bromine-77, technetium-99m, indium-113m, gallium-67, gallium- 68, ruthenium-95, ruthenium-97, ruthenium-103, ruthenium-106, mercury-203, scandium-47, tellurium-121m, tellurium-128, túlio-165, túlio-167, túlio-168, fluoro-18, yttrium-99 and zirconium-89. Existing methods known to one skilled in the art for labeling antibodies with radioisotypes, either directly or indirectly, for example, through a chelating agent such as EDTA or DTPA can be used.
[187] Em várias modalidades, qualquer um dos anticorpos descritos ou fragmentos de ligação ao antígeno podem ser conjugados a um segundo agente, onde o segundo agente pode ser pelo menos um agente terapêutico para a doença de Alzheimer ou outra tauopatia. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conjugado a um agente terapêutico para a doença de Alzheimer compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende qualquer um ou mais (por exemplo, todas as seis CDRs e/ou uma sequência de domínio variável de cadeia pesada e/ou leve) selecionada daqueles mostrados na Tabela 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 81 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 82; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 87 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 88; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 96; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 98; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94.[187] In various embodiments, any of the described antibodies or antigen-binding fragments can be conjugated to a second agent, where the second agent can be at least one therapeutic agent for Alzheimer's disease or other tauopathy. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment conjugated to a therapeutic agent for Alzheimer's disease comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises three determining regions of heavy chain complementarity (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 , HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and where LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In some embodiments, the variable region of the heavy chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and the variable region of the light chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment comprises any one or more ( for example, all six CDRs and / or a heavy and / or light chain variable domain sequence selected from those shown in Table 1. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 55 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 57 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 59 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 63 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 64; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 65 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 68; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 73 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 76; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 78; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 79 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 80; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 81 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 83 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 84; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 87 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 88; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 89 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 95 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 96; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 97 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 98; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 57 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 65 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 78; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 79 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 80; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 83 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 84; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92; or the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94.
[188] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende SEQ ID NOS: 29 e 30. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conjugado a um agente terapêutico pode competir pela ligação ou ligar o mesmo epítopo que este anticorpo definido por sequência.[188] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment comprises SEQ ID NOS: 29 and 30. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment conjugated to a therapeutic agent may compete for binding or binding the same epitope that this antibody is defined by sequence.
[189] Em algumas modalidades, o agente terapêutico pode ser uma imunoterapia passiva contra beta amiloide ou tau, ou um inibidor da acetilcolinestarase. Em algumas modalidades, o agente terapêutico pode ser selecionado a partir de um ou mais dentre: CAD106, Gantenerumab, Crenezumab, IVIG, AADvac1, ACI-35, NIC5-15, CHF-[189] In some embodiments, the therapeutic agent may be a passive immunotherapy against amyloid beta or tau, or an acetylcholinesterase inhibitor. In some modalities, the therapeutic agent can be selected from one or more of: CAD106, Gantenerumab, Crenezumab, IVIG, AADvac1, ACI-35, NIC5-15, CHF-
5074, MK-8931, AZD 3293, LY33 14814, Elenbecestat, Tideglusib, Intranasal Humulin R, Intransal glulisine, SB742457 com donepezil, Azeliragon, Nivaldipine. Vide Godyn et al., Pharmacological Reports, 68: 127-138, 2016. Em algumas modalidades, o agente terapêutico pode ser selecionado a partir de:, Aducanumab, ALZT-OP1a + ALZT- OP1b, Aripiprazol, AVP-786, AZD3293 (LY3314814), Brexprprazol (OPC-34712), CAD106, CNP520, Elenbecestat, Insulina (humulina), Lumateperona, JNJ-54861911, Metilfenidato, MK-4305 (suvorexante), Nabilona, Nilvadipina, Pioglitazona, RVTigo-101 (intepiridina), oligo- manurarato de sódio (GV-971), TRx0237, TTp488 (azeliragon), AADvac1, ABBV-8E12, células AD-SVF, ANAVEX 2-73, Atomoxetina, AVP-786, AZD0530 (saracatinib), BAC, BAN2401, Benfotiamina, BI409306, Briostatina 1, Candesartan, CB-AC-02, Cilostazol, CPC- 201, CT1812, DAOIB, Dronabinol, E2609, Formoterol, hUCB-MSCs, JNJ-54861991, Levetiracetam, Liraglutida, LY3202626, NewGam 10% IVIG, Nilotinib, ORM-12741, Pimavanserina, Piromelatina, Posifeno, PQ912, Probucol, Rasagilina, Riluzol, RVT-101, S47445, Sargramostim, Sinvastatina + L-Arginina + Tetraidrobiopterina (SLAT), STA-1, SUVN-502, T-817 MA, Temisartan, UB-311, Valaciclovir, VX- 745, Xanamema. Vide Cummings et al., Alzheimer’s disease drug development pipeline: 2017, Alzheimer’s & Dementia, 3:367-384, 2017. Em algumas modalidades, a terapia anti-tau compreende uma molécula pequena ou terapia de vacina de peptídeo, ou uma terapia de anticorpo anti-tau. Vide Patente U.S. No. 9.518.101, que é incorporada por referência na sua totalidade.5074, MK-8931, AZD 3293, LY33 14814, Elenbecestat, Tideglusib, Intranasal Humulin R, Intransal glulisine, SB742457 with donepezil, Azeliragon, Nivaldipine. See Godyn et al., Pharmacological Reports, 68: 127-138, 2016. In some embodiments, the therapeutic agent can be selected from :, Aducanumab, ALZT-OP1a + ALZT-OP1b, Aripiprazole, AVP-786, AZD3293 ( LY3314814), Brexprprazole (OPC-34712), CAD106, CNP520, Elenbecestat, Insulin (humulin), Lumateperone, JNJ-54861911, Methylphenidate, MK-4305 (suvorexante), Nabilona, Nilvadipine, Pioglitazigo, Pioglitazigo - sodium manurarate (GV-971), TRx0237, TTp488 (azeliragon), AADvac1, ABBV-8E12, AD-SVF cells, ANAVEX 2-73, Atomoxetine, AVP-786, AZD0530 (saracatinib), BAC, BAN2401, Benfotiamina, BI409306, Briostatin 1, Candesartan, CB-AC-02, Cilostazol, CPC-201, CT1812, DAOIB, Dronabinol, E2609, Formoterol, hUCB-MSCs, JNJ-54861991, Levetiracetam, Liraglutida, LY3202626, NewGam ORM-12741, Pimavanserin, Pyromelatine, Posifene, PQ912, Probucol, Rasagiline, Riluzole, RVT-101, S47445, Sargramostim, Simvastatin + L-Arginine + Tetrahydrobiopterine (SLAT), STA-1, SUVN-502, T-817 MA, Temisartan, UB-311, Valacyclovir, VX-745, Xanamema. See Cummings et al., Alzheimer's disease drug development pipeline: 2017, Alzheimer's & Dementia, 3: 367-384, 2017. In some embodiments, anti-tau therapy comprises a small molecule or peptide vaccine therapy, or a therapy of anti-tau antibody. See U.S. Patent No. 9,518,101, which is incorporated by reference in its entirety.
[190] Em outras modalidades, um imunoconjugado é fornecido tendo a fórmula (A)-(L)-(C), em que: (A) é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descrito; (L) é um ligante opcional; e (C) é um segundo agente (por exemplo, um marcador detectável ou um agente terapêutico para o tratamento de[190] In other embodiments, an immunoconjugate is provided having the formula (A) - (L) - (C), where: (A) is an antibody or antigen-binding fragment in this document described; (L) is an optional binder; and (C) is a second agent (for example, a detectable marker or a therapeutic agent for the treatment of
AD ou outra tauopatia); em que o ligante (L) une (A) a (C). Em algumas modalidades, (C) é um agente terapêutico, um agente de imagem, um agente detectável ou um agente de diagnóstico. Em algumas modalidades, esses conjugados são referidos no presente documento como conjugados anticorpo-droga (ADCs).AD or other tauopathy); wherein the linker (L) joins (A) to (C). In some embodiments, (C) is a therapeutic agent, an imaging agent, a detectable agent or a diagnostic agent. In some embodiments, such conjugates are referred to herein as antibody-drug conjugates (ADCs).
[191] O ligante opcional (L), conforme usado no presente documento, pode estar presente ou ausente. Quando presente, (L) é uma molécula que é usada para unir (A) a (C). Em algumas modalidades, o ligante é capaz de formar ligações covalentes ao anticorpo e ao segundo agente. Os ligantes adequados são bem conhecidos dos versados na técnica e incluem, mas não estão limitados a, ligantes de carbono de cadeia linear ou ramificada, ligantes de carbono heterocíclicos ou ligantes de peptídeo. Quando o anticorpo e o segundo agente são polipeptídeos, os ligantes podem ser unidos aos aminoácidos constituintes por meio de seus grupos laterais (por exemplo, através de uma ligação dissulfeto à cisteína). No entanto, em outra modalidade, os ligantes podem ser unidos aos grupos amino e carboxila alfa carbono dos aminoácidos terminais.[191] The optional binder (L), as used in this document, may be present or absent. When present, (L) is a molecule that is used to join (A) to (C). In some embodiments, the linker is able to form covalent bonds to the antibody and the second agent. Suitable linkers are well known to those skilled in the art and include, but are not limited to, straight or branched chain carbon linkers, heterocyclic carbon linkers or peptide linkers. When the antibody and the second agent are polypeptides, the linkers can be joined to the constituent amino acids through their side groups (for example, through a disulfide bond to cysteine). However, in another embodiment, the linkers can be joined to the amino and carboxyl alpha carbon groups of the terminal amino acids.
[192] Em algumas circunstâncias, é desejável liberar o segundo agente do anticorpo quando o imunoconjugado atingir seu sítio alvo. Portanto, nessas circunstâncias, os imunoconjugados podem compreender ligações que são cliváveis na vizinhança do sítio alvo. A clivagem do ligante para liberar o segundo agente do anticorpo pode ser induzida pela atividade enzimática ou condições às quais o imunoconjugado é submetido tanto dentro da célula alvo quanto na vizinhança do sítio alvo. Em ainda outras modalidades, a unidade de ligação não é clivável e a droga não é liberada ou é liberada, por exemplo, por degradação do anticorpo.[192] In some circumstances, it is desirable to release the second antibody agent when the immunoconjugate reaches its target site. Therefore, in these circumstances, immunoconjugates can comprise bonds that are cleavable in the vicinity of the target site. Cleavage of the ligand to release the second antibody agent can be induced by enzymatic activity or conditions to which the immunoconjugate is subjected both within the target cell and in the vicinity of the target site. In still other embodiments, the binding unit is not cleavable and the drug is not released or is released, for example, by degradation of the antibody.
[193] Uma série de reações diferentes está disponível para ligação covalente de drogas e/ou ligantes a anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos. Isso é frequentemente realizado pela reação dos resíduos de aminoácidos da molécula de anticorpo, incluindo os grupos amina de lisina, os grupos de ácido carboxílico livre de ácido glutâmico e aspártico, os grupos sulfidrila de cisteína e várias porções dos aminoácidos aromáticos. Um dos métodos não específicos mais comumente usados de fixação covalente é a reação de carbodiimida para ligar um grupo carbóxi (ou amino) de um composto a grupos amino (ou carbóxi) do anticorpo. Além disso, agentes bifuncionais, tais como dialdeídos ou imidoésteres, têm sido usados para ligar o grupo amino de um composto a grupos amino de uma molécula de anticorpo. Também disponível para ligação de drogas a anticorpos está a reação de base de Schiff. Este método envolve a oxidação de periodato de uma droga que contém grupos glicol ou hidroxila, formando assim um aldeído que é então reagido com o agente de ligação. A ligação ocorre através da formação de uma base de Schiff com grupos amino do agente de ligação. Os isotiocianatos também podem ser usados como agentes de acoplamento para ligar covalentemente drogas a agentes de ligação.[193] A number of different reactions are available for covalent binding of drugs and / or ligands to antibodies or antigen-binding fragments thereof. This is often accomplished by reacting the amino acid residues of the antibody molecule, including the lysine amine groups, the glutamic and aspartic acid-free carboxylic acid groups, the cysteine sulfhydryl groups, and various portions of the aromatic amino acids. One of the most commonly used non-specific methods of covalent attachment is the carbodiimide reaction to link a carboxy (or amino) group of a compound to amino (or carboxy) groups of the antibody. In addition, bifunctional agents, such as dialdehydes or imidoesters, have been used to link the amino group of a compound to the amino groups of an antibody molecule. Also available for binding drugs to antibodies is the Schiff base reaction. This method involves the oxidation of periodate from a drug that contains glycol or hydroxyl groups, thus forming an aldehyde which is then reacted with the binding agent. Bonding occurs through the formation of a Schiff base with amino groups of the linker. Isothiocyanates can also be used as coupling agents to covalently link drugs to binding agents.
[194] Em algumas modalidades, o ligante é clivável por um agente de clivagem que está presente no ambiente intracelular (por exemplo, dentro de um lisossoma ou endossoma ou caveolea). O ligante pode ser, por exemplo, um ligante peptidila que é clivado por uma peptidase intracelular ou enzima protease, incluindo, mas não se limitando a, uma protease lisossomal ou endossômica. Vide, por exemplo, Dubowchik e Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123. Outros exemplos de tais ligantes são descritos, por exemplo, na Patente U.S. No. 6.214.345. Em outras modalidades, o ligante clivável é sensível ao pH, isto é, sensível à hidrólise em certos valores de pH. Normalmente, o ligante sensível ao pH é hidrolisável em condições ácidas. Por exemplo, um ligante lábil em ácido que é hidrolisável no lisossoma (por exemplo, uma hidrozona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal ou similares) pode ser usado. (Vide, por exemplo, Patentes US Nos.[194] In some embodiments, the ligand is cleavable by a cleavage agent that is present in the intracellular environment (for example, within a lysosome or endosome or caveolea). The linker can be, for example, a peptidyl linker that is cleaved by an intracellular peptidase or protease enzyme, including, but not limited to, a lysosomal or endosomal protease. See, for example, Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123. Other examples of such binders are described, for example, in U.S. Patent No. 6,214,345. In other embodiments, the cleavable binder is sensitive to pH, that is, sensitive to hydrolysis at certain pH values. Normally, the pH-sensitive binder is hydrolyzable under acidic conditions. For example, an acid labile binder that is hydrolyzable in the lysosome (for example, a hydrozone, semicarbazone, thiosemicarbazone, cis-aconitic amide, orthoester, acetal, ketal or the like). (See, for example, US Patent Nos.
5.122.368; 5.824.805; 5.622.929; Dubowchik e Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264: 14653 a5,122,368; 5,824,805; 5,622,929; Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264: 14653 a
14661.). Em ainda em outras modalidades, o ligante é clivável sob condições de redução (por exemplo, um ligante dissulfeto). Uma variedade de ligantes dissulfeto é conhecida na técnica, incluindo, por exemplo, aqueles que podem ser formados usando SATA (N- succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP (N succinimidil-3-(2- piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato) e SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa(2piridil-ditio)tolueno)-, SPDB e SMPT. (Vide, por exemplo, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47: 5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radiolmagery and Therapy of Cancer (C.W. Vogel ed., Univ. de Oxford. Press, 1987. Vide também a Patente U.S.14661.). In still other embodiments, the linker is cleavable under conditions of reduction (for example, a disulfide linker). A variety of disulfide binders are known in the art, including, for example, those that can be formed using SATA (N-succinimidyl-S-acetylthioacetate), SPDP (N succinimidyl-3- (2-pyridylditium) propionate), SPDB (N -succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) butyrate) and SMPT (N-succinimidyl-oxycarbonyl-alpha-methyl-alpha (2-pyridyl-dithio) toluene) -, SPDB and SMPT. (See, for example, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47: 5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radiolmagery and Therapy of Cancer (CW Vogel ed., Univ. Of Oxford. Press , 1987. See also US Patent
4.880.935.). Em outra modalidade, o ligante é um ligante malonato (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15: 1387-93), um ligante maleimidobenzoil (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3 (10): 1299- 1304), ou um análogo 3'-N-amida (Laur et al., 1995, Bioorg-Med- Chem. 3 (10): 1305-12).4,880,935.). In another embodiment, the linker is a malonate linker (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15: 1387-93), a maleimidobenzoyl linker (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3 (10): 1299-1304), or a 3'-N-amide analog (Laur et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3 (10): 1305-12).
[195] Em outra modalidade, a unidade de ligação não é clivável e a droga é liberada por degradação do anticorpo. (vide Publicação U.S. No. 2005/0238649). Em uma modalidade, o ligante não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular. Tal como no presente documento utilizado, "não substancialmente sensível ao ambiente extracelular", no contexto de um ligante, significa que não mais do que cerca de 20%, cerca de 15%, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 3% ou não mais do que 1% dos ligantes, em uma amostra de composto conjugado anticorpo-droga, são clivados quando o composto conjugado anticorpo-droga se apresenta em um ambiente extracelular (por exemplo, no plasma). Se um ligante não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular pode ser determinado, por exemplo, incubando com plasma o composto conjugado anticorpo-droga por um período de tempo predeterminado (por exemplo, 2, 4, 8, 16 ou 24 horas) e quantificando a quantidade de droga livre presente no plasma.[195] In another embodiment, the binding unit is not cleavable and the drug is released by degradation of the antibody. (see U.S. Publication No. 2005/0238649). In one embodiment, the ligand is not substantially sensitive to the extracellular environment. As in this document used, "not substantially sensitive to the extracellular environment", in the context of a ligand, means that no more than about 20%, about 15%, about 10%, about 5%, about 3% or not more than 1% of the ligands, in a sample of antibody-drug conjugate compound, are cleaved when the antibody-drug conjugate compound appears in an extracellular environment (for example, in plasma). If a ligand is not substantially sensitive to the extracellular environment, it can be determined, for example, by incubating the antibody-drug conjugate compound with plasma for a predetermined period of time (for example, 2, 4, 8, 16 or 24 hours) and quantifying the amount of free drug present in the plasma.
[196] Em algumas modalidades, (L) também pode compreender um grupo espaçador ou um grupo de ligação, como polialdeído, glutaraldeído, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ou ácido dietilenotriaminopentacético (DPTA).[196] In some embodiments, (L) may also comprise a spacer group or a linking group, such as polyaldehyde, glutaraldehyde, ethylene diaminetetraacetic acid (EDTA) or diethylene triaminopentacetic acid (DPTA).
[197] Em algumas modalidades, mais de um segundo agente pode ser anexado, diretamente ou por um ligante, a um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento. Em certas modalidades, a razão do segundo agente para o anticorpo pode variar em média de cerca de 1:1 a cerca de 1:8. Vide Patente U.S. No.[197] In some embodiments, more than one second agent can be attached, directly or by a linker, to an antibody or antigen-binding fragment described in this document. In certain embodiments, the ratio of the second agent to the antibody can vary on average from about 1: 1 to about 1: 8. See U.S. Patent No.
7.498.298. A carga (razão droga/anticorpo) de um ADC pode ser controlada de diferentes maneiras. Vide W02006/034488. Ácidos Nucleicos, Vetores, Células Hospedeiras7,498,298. The load (drug / antibody ratio) of an ADC can be controlled in different ways. See W02006 / 034488. Nucleic Acids, Vectors, Host Cells
[198] Também são descritos ácido nucleico (s) isolado que codifica pelo menos uma região variável de uma cadeia de imunoglobulina de qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno no presente documento descritos. Em certas modalidades, um ácido nucleico isolado codifica o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno descritos precedentemente. Outras modalidades fornecem um vetor isolado compreendendo os ácidos nucleicos. Outra modalidade inclui uma célula hospedeira isolada compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos ou vetores.[198] Isolated nucleic acid (s) encoding at least one variable region of an immunoglobulin chain of any of the antibodies or antigen binding fragments are also described herein. In certain embodiments, an isolated nucleic acid encodes the antibody or antigen-binding fragment of any of the antibodies or antigen-binding fragments described above. Other embodiments provide an isolated vector comprising nucleic acids. Another embodiment includes an isolated host cell comprising any of the nucleic acids or vectors.
[199] Os polinucleotídeos ou ácidos nucleicos que codificam os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno no presente documento descritos podem ser, por exemplo, DNA, cDNA, RNA ou DNA ou RNA produzido sinteticamente ou uma molécula de ácido nucleico quimérico produzida de forma recombinante compreendendo qualquer um desses polinucleotídeos isoladamente ou em combinação. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é parte de um vetor. Tais vetores podem compreender outros genes, tais como genes marcadores e/ou elementos de controle, permitindo a seleção e/ou expressão do vetor em uma célula hospedeira adequada e sob condições adequadas.[199] The polynucleotides or nucleic acids encoding the antibodies or antigen-binding fragments described herein can be, for example, synthetically produced DNA, cDNA, RNA or DNA or RNA or a recombinantly produced chimeric nucleic acid molecule comprising any of these polynucleotides alone or in combination. In some embodiments, the polynucleotide is part of a vector. Such vectors can comprise other genes, such as marker genes and / or control elements, allowing the selection and / or expression of the vector in a suitable host cell and under suitable conditions.
[200] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo está operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle de expressão, permitindo a expressão em células procarióticas ou eucarióticas. A expressão do polinucleotídeo pode compreender a transcrição do polinucleotídeo em mRNA traduzível. Elementos reguladores que garantem a expressão em células eucarióticas, para exemplo de células de mamífero, são conhecidas dos especialistas na técnica. Eles geralmente compreendem sequências regulatórias que garantem o início da transcrição e, opcionalmente, sinais poli-A garantindo o término da transcrição e estabilização do transcrito. Elementos reguladores adicionais podem incluir intensificadores da transcrição, bem como da tradução e/ou regiões promotoras naturalmente associadas ou heterólogas.[200] In some embodiments, the polynucleotide is operationally linked to one or more expression control sequences, allowing expression in prokaryotic or eukaryotic cells. Polynucleotide expression can comprise transcription of the polynucleotide into translatable mRNA. Regulatory elements that guarantee expression in eukaryotic cells, for example mammalian cells, are known to those skilled in the art. They generally comprise regulatory sequences that guarantee the start of transcription and, optionally, poly-A signals guaranteeing the end of transcription and stabilization of the transcript. Additional regulatory elements may include enhancers of transcription, as well as translation and / or naturally associated or heterologous promoter regions.
[201] A este respeito, o versado na técnica apreciará que os polinucleotídeos que codificam pelo menos as CDRs e/ou domínio variável de cadeia leve e/ou pesada podem codificar os domínios variáveis de ambas as cadeias de imunoglobulina ou apenas uma. Da mesma forma, os polinucleotídeos podem estar sob o controle do mesmo promotor ou podem ser controlados separadamente para expressão. Os possíveis elementos reguladores que permitem a expressão em células hospedeiras procarióticas compreendem, por exemplo, o promotor PL, lac, trp ou tac em E. coli, e exemplos de elementos reguladores que permitem a expressão em células hospedeiras eucarióticas são o promotor AOXI de GAL1 em levedura ou o promotor de CMV, SV40, RSV, intensificador de CMV, intensificador de SV40 ou um íntron de globina em células de mamíferos e outras células animais.[201] In this regard, the person skilled in the art will appreciate that polynucleotides that encode at least CDRs and / or light and / or heavy chain variable domains can encode the variable domains of both immunoglobulin chains or just one. Likewise, polynucleotides can be under the control of the same promoter or can be controlled separately for expression. Possible regulatory elements that allow expression in prokaryotic host cells include, for example, the PL, lac, trp or tac promoter in E. coli, and examples of regulatory elements that allow expression in eukaryotic host cells are the GAL1 AOXI promoter. in yeast or the CMV promoter, SV40, RSV, CMV enhancer, SV40 enhancer or a globin intron in mammalian cells and other animal cells.
[202] Além dos elementos que são responsáveis pela iniciação da transcrição, tais elementos reguladores também podem compreender sinais de terminação da transcrição, como o sítio SV40- poli-A ou o sítio tk-poli-A, a jusante do polinucleotídeo. Além disso, dependendo do sistema de expressão utilizado, as sequências líder capazes de direcionar o polipeptídeo para um compartimento celular ou secretá-lo no meio podem ser adicionadas à sequência de codificação dos polinucleotídeos e são conhecidas na técnica. Quando usado, a (s) sequência (s) líder pode (m) ser montada (s) na fase apropriada com as sequências de tradução, iniciação e terminação e, opcionalmente, uma sequência líder capaz de direcionar a secreção da proteína traduzida, ou uma porção dela, no espaço periplasmático ou meio extracelular. Em algumas modalidades, a sequência heteróloga pode codificar uma proteína de fusão incluindo um peptídeo de identificação de terminal C ou N que confere as características desejadas, por exemplo, estabilização ou purificação simplificada do produto recombinante expresso. Neste contexto, os vetores de expressão adequados são conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, o vetor de expressão de cDNA de Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, PcDNA1, PcDNA3 (Invitrogen) e pSPORT1 (GIBCO BRL).[202] In addition to the elements that are responsible for initiating transcription, such regulatory elements may also comprise transcription termination signals, such as the SV40-poly-A site or the tk-poly-A site, downstream of the polynucleotide. In addition, depending on the expression system used, leader sequences capable of directing the polypeptide into a cell compartment or secreting it in the medium can be added to the polynucleotide coding sequence and are known in the art. When used, the leader sequence (s) can be assembled at the appropriate stage with the translation, initiation and termination sequences and, optionally, a leader sequence capable of directing the secretion of the translated protein, or a portion of it, in the periplasmic space or extracellular medium. In some embodiments, the heterologous sequence may encode a fusion protein including a C or N-terminal identification peptide that imparts the desired characteristics, for example, stabilization or simplified purification of the expressed recombinant product. In this context, suitable expression vectors are known in the art and include, without limitation, the Okayama-Berg cDNA expression vector pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc / CMV, PcDNA1, PcDNA3 (Invitrogen) and pSPORT1 (GIBCO BRL ).
[203] Em algumas modalidades, as sequências de controle de expressão podem ser sistemas promotores eucarióticos em vetores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarióticas, mas também podem ser utilizadas sequências de controle para hospedeiros procarióticos. Uma vez que o vetor tenha sido incorporado no hospedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido sob condições adequadas para alto nível de expressão de sequências de nucleotídeos e, conforme desejado, a coleta e purificação das cadeias leves de imunoglobulina, cadeias pesadas, dímeros leves/pesados ou anticorpos intactos, fragmentos de ligação ou outras formas de imunoglobulina podem seguir-se. Vide, por exemplo, Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y., (1979).[203] In some embodiments, expression control sequences can be eukaryotic promoter systems in vectors capable of transforming or transfecting eukaryotic host cells, but control sequences for prokaryotic hosts can also be used. Once the vector has been incorporated into the appropriate host, the host is maintained under conditions suitable for high level expression of nucleotide sequences and, as desired, the collection and purification of immunoglobulin light chains, heavy chains, light / heavy dimers or intact antibodies, binding fragments or other forms of immunoglobulin may follow. See, for example, Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y., (1979).
[204] Em várias modalidades, vetores, particularmente plasmídeos, cosmídeos, vírus e bacteriófagos podem ser usados que compreendem um polinucleotídeo que codifica um domínio variável de uma cadeia de imunoglobulina de um anticorpo da presente invenção; opcionalmente em combinação com outro polinucleotídeo que codifica o domínio variável da outra cadeia de imunoglobulina de um anticorpo da presente invenção. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de expressão e/ou transferência de gene ou vetor de direcionamento. Os vetores de expressão derivados de vírus, tais como retrovírus, vírus vacina, vírus adeno-associado, vírus do herpes ou vírus do papiloma bovino, podem ser usados para a entrega dos polinucleotídeos ou vetor da presente invenção em populações de células alvo. Quaisquer métodos que são conhecidos pelos versados na técnica podem ser usados para construir vetores virais recombinantes. Alternativamente, os polinucleotídeos e vetores fornecidos pela invenção podem ser reconstituídos em lipossomas para distribuição às células alvo. O (s) vetor (es) contendo os polinucleotídeos da presente invenção (por exemplo, o (s) domínio (s) variável (s) pesado (s) e/ou leve (s) das sequências de codificação das cadeias de imunoglobulina) podem ser transferidos para uma célula hospedeira por métodos conhecidos, que variam dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, a transfecção de cloreto de cálcio é comumente utilizada para células procarióticas, enquanto o tratamento com fosfato de cálcio ou eletroporação pode ser usado para outros hospedeiros celulares.[204] In various embodiments, vectors, particularly plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages can be used which comprise a polynucleotide that encodes a variable domain of an immunoglobulin chain of an antibody of the present invention; optionally in combination with another polynucleotide encoding the variable domain of the other immunoglobulin chain of an antibody of the present invention. In some embodiments, the vector is an expression and / or gene transfer vector or targeting vector. Expression vectors derived from viruses, such as retrovirus, vaccine virus, adeno-associated virus, herpes virus or bovine papilloma virus, can be used for the delivery of the polynucleotides or vector of the present invention to target cell populations. Any methods that are known to those skilled in the art can be used to construct recombinant viral vectors. Alternatively, the polynucleotides and vectors provided by the invention can be reconstituted into liposomes for delivery to target cells. The vector (s) containing the polynucleotides of the present invention (e.g., the heavy and / or light variable domain (s) of the immunoglobulin chain coding sequences) they can be transferred to a host cell by known methods, which vary depending on the type of cellular host. For example, calcium chloride transfection is commonly used for prokaryotic cells, while treatment with calcium phosphate or electroporation can be used for other cell hosts.
[205] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira é transformada com um polinucleotídeo ou vetor no presente documento descrito. A célula hospedeira pode ser uma célula procariótica ou eucariótica. O polinucleotídeo ou vetor que está presente na célula hospedeira pode ser integrado no genoma da célula hospedeira ou pode ser mantido extracromossomicamente. A célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica, como uma célula bacteriana, de inseto, fúngica, vegetal, animal ou humana. As células fúngicas preferidas são, por exemplo, aquelas do gênero Saccharomyces, como S. cerevisiae. Dependendo do hospedeiro usado em um procedimento de produção recombinante, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos codificados pelo polinucleotídeo podem ser glicosilados. Certos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos consistentes com a presente invenção também podem incluir um resíduo de aminoácido de metionina inicial. Um polinucleotídeo no presente documento descrito pode ser usado para transformar ou transfectar o hospedeiro usando qualquer uma das técnicas comumente conhecidas por aqueles versados na técnica. Além disso, os métodos para preparar genes fundidos, operacionalmente ligados e expressá-los em, por exemplo, células de mamíferos e bactérias são bem conhecidos na técnica. Em geral, os vetores de expressão contendo sequências promotoras que facilitam a transcrição eficiente do polinucleotídeo inserido são usados em conexão com um hospedeiro. O vetor de expressão contém tipicamente uma origem de replicação, um promotor e um terminador, bem como genes específicos que são capazes de fornecer seleção fenotípica das células transformadas. Células fonte adequadas para sequências de DNA e células hospedeiras para expressão e secreção de imunoglobulinas podem ser obtidas a partir de uma série de fontes, tais como Catálogo de Cultura do Tipo Americana ("Catalog of Cell Lines and Hybridomas," Quinta Edição (1985) Manassas, Va., EUA e outra versão disponível, incorporada no presente documento por referência). Além disso, os animais transgênicos, por exemplo, mamíferos, compreendendo células da invenção podem ser usados para a produção em grande escala dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno no presente documento descritos.[205] In some embodiments, a host cell is transformed with a polynucleotide or vector in this document. The host cell can be a prokaryotic or eukaryotic cell. The polynucleotide or vector that is present in the host cell can be integrated into the genome of the host cell or can be maintained extrachromosomally. The host cell can be any prokaryotic or eukaryotic cell, such as a bacterial, insect, fungal, vegetable, animal or human cell. The preferred fungal cells are, for example, those of the genus Saccharomyces, such as S. cerevisiae. Depending on the host used in a recombinant production procedure, antibodies or antigen-binding fragments encoded by the polynucleotide may be glycosylated. Certain antibodies or antigen-binding fragments thereof consistent with the present invention may also include an initial methionine amino acid residue. A polynucleotide in the present document described can be used to transform or transfect the host using any of the techniques commonly known to those skilled in the art. In addition, methods for preparing fused, operably linked genes and expressing them in, for example, mammalian and bacterial cells are well known in the art. In general, expression vectors containing promoter sequences that facilitate efficient transcription of the inserted polynucleotide are used in connection with a host. The expression vector typically contains an origin of replication, a promoter and a terminator, as well as specific genes that are capable of providing phenotypic selection of the transformed cells. Source cells suitable for DNA sequences and host cells for expression and secretion of immunoglobulins can be obtained from a number of sources, such as the Catalog of Cell Lines and Hybridomas, "Fifth Edition (1985) Manassas, Va., USA and another available version, incorporated herein by reference). In addition, transgenic animals, for example, mammals, comprising cells of the invention can be used for the large-scale production of the antibodies or antigen-binding fragments described herein.
[206] Em outra modalidade, é descrito um hibridoma que produz o anticorpo DC2E7. O hibridoma foi depositado no Catálogo de Cultura do Tipo Americana no Depósito de Patentes No. PTA-124992.[206] In another embodiment, a hybridoma that produces the DC2E7 antibody is described. The hybridoma was deposited in the American Type Culture Catalog in Patent Deposit No. PTA-124992.
[207] Em outra modalidade, é descrito um hibridoma que produz o anticorpo DC2E2. O hibridoma foi depositado no Catálogo de Cultura do Tipo Americana no Depósito de Patentes No. PTA-124991. Composições, Formulações e Combinações[207] In another embodiment, a hybridoma that produces the DC2E2 antibody is described. The hybridoma was deposited in the American Type Culture Catalog in Patent Deposit No. PTA-124991. Compositions, Formulations and Combinations
[208] Em algumas modalidades exemplares, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste no presente documento descrito pode ser coformulado e/ou coadministrado com um ou mais compostos adicionais que também são úteis na detecção, prevenção e/ou tratamento de AD ou outra tauopatia.[208] In some exemplary embodiments, an antibody or antigen-binding fragment herein can be co-formulated and / or co-administered with one or more additional compounds that are also useful in the detection, prevention and / or treatment of AD or other tauopathy.
[209] Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo no presente documento descrito é formulado para uso em um ensaio para detectar tau fosforilada em uma amostra biológica de um objeto humano (por exemplo, CSF ou sangue). Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é conjugado a um marcador detectável, por exemplo, uma enzima, um radioisótopo, um fluoróforo, um marcador de ressonância magnética nuclear ou um metal pesado. Em algumas modalidades, dois ou mais (por exemplo, 3, 4, 5, etc.) anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno no presente documento descritos são formulados adequadamente para uso no ensaio. Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno compreendem clones de anticorpo DC2E7 ou DC2E2 e/ou anticorpos ou fragmentos compreendendo as CDRs ou domínios variáveis desses clones, sozinhos ou conjugados com marcadores detectáveis adequados. Em algumas modalidades, as formulações compreendem ainda elementos e reagentes adicionais (por exemplo, suportes sólidos ou partículas, como esferas magnéticas) adequados para uso em ensaios de diagnóstico, como os ensaios de ELISA clássicos e digitais descritos abaixo.[209] In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof in this document described is formulated for use in an assay to detect phosphorylated tau in a biological sample of a human object (eg, CSF or blood). In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is conjugated to a detectable marker, for example, an enzyme, a radioisotope, a fluorophore, a nuclear magnetic resonance marker or a heavy metal. In some embodiments, two or more (e.g., 3, 4, 5, etc.) antibodies or antigen-binding fragments described herein are formulated suitably for use in the assay. In certain embodiments, antibodies or antigen-binding fragments comprise DC2E7 or DC2E2 antibody clones and / or antibodies or fragments comprising the CDRs or variable domains of those clones, alone or conjugated to suitable detectable markers. In some embodiments, the formulations further comprise additional elements and reagents (for example, solid supports or particles, such as magnetic spheres) suitable for use in diagnostic assays, such as the classic and digital ELISA assays described below.
[210] Em algumas modalidades, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno no presente documento descritos são preparados para uso em métodos de detecção de tau fosforilada em uma amostra biológica. Por exemplo, os anticorpos podem ser preparados e formulados conforme discutido no Exemplo 3 abaixo. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, por exemplo, DC2E7, DC149, DC807 e/ou DC2E2 ou fragmentos de ligação ao antígeno ou variantes dos mesmos, podem ser purificados a partir do sobrenadante de hibridoma sem soro, por exemplo, usando uma coluna de afinidade de Proteína G. O sobrenadante purificado pode então ser eluído, por exemplo, com 0,1 M de Glicina-HCl, pH 2,7 e neutralizado com 1 M de Tris-HCl pH 9,0. As frações agrupadas podem ser dialisadas em uma solução tampão, como solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em algumas modalidades, a solução de anticorpo tamponada pode ser concentrada, por exemplo, por ultrafiltração. Em algumas modalidades, a concentração do anticorpo é determinada medindo a absorbância a 280 nm, usando a fórmula c (mg/ml) = A280nm/1,43.[210] In some embodiments, the antibodies and antigen-binding fragments described herein are prepared for use in methods of detecting phosphorylated tau in a biological sample. For example, antibodies can be prepared and formulated as discussed in Example 3 below. In some embodiments, antibodies or antigen-binding fragments, for example, DC2E7, DC149, DC807 and / or DC2E2 or antigen-binding fragments or variants thereof, can be purified from the hybridoma supernatant without serum, for example , using a Protein G affinity column. The purified supernatant can then be eluted, for example, with 0.1 M Glycine-HCl, pH 2.7 and neutralized with 1 M Tris-HCl pH 9.0. The grouped fractions can be dialyzed in a buffer solution, such as phosphate buffered saline (PBS). In some embodiments, the buffered antibody solution can be concentrated, for example, by ultrafiltration. In some embodiments, the concentration of the antibody is determined by measuring the absorbance at 280 nm, using the formula c (mg / ml) = A280nm / 1.43.
[211] DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno, quando usado como o anticorpo de captura no ELISA digital, pode ser preparado em uma solução tampão adequada. Em algumas modalidades, DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno é imobilizado em um suporte sólido (por exemplo, uma superfície sólida ou esfera de captura ELISA). Em algumas modalidades, o DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno é unido a uma superfície sólida, por exemplo, conforme descrito de acordo com o Exemplo 10 abaixo. Resumidamente, DC2E7 pode ser acoplado a uma esfera, por exemplo, uma esfera magnética (Quanterix). Em algumas modalidades, o DC2E7 é acoplado à esfera a uma concentração de cerca de 0,1 a 5,0 mg/mL (por exemplo, cerca de 1,0 mg/mL). Em algumas modalidades, o DC2E2 ou um fragmento de ligação ao antígeno é usado como um anticorpo detector e pode ser conjugado a um marcador detectável. Por exemplo, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser biotinilado para fins de detecção, por exemplo, por exposição a 1 a 200 vezes (por exemplo, cerca de 120 vezes) em excesso de biotina em relação à concentração de anticorpo.[211] DC2E7 or an antigen-binding fragment, when used as the capture antibody in the digital ELISA, can be prepared in a suitable buffer solution. In some embodiments, DC2E7 or an antigen-binding fragment is immobilized on a solid support (for example, a solid surface or ELISA capture sphere). In some embodiments, DC2E7 or an antigen-binding fragment is attached to a solid surface, for example, as described according to Example 10 below. Briefly, DC2E7 can be coupled to a sphere, for example, a magnetic sphere (Quanterix). In some embodiments, DC2E7 is coupled to the sphere at a concentration of about 0.1 to 5.0 mg / ml (for example, about 1.0 mg / ml). In some embodiments, DC2E2 or an antigen-binding fragment is used as a detector antibody and can be conjugated to a detectable marker. For example, the antibody or antigen binding fragment can be biotinylated for detection purposes, for example, by exposure to 1 to 200 times (for example, about 120 times) in excess of biotin in relation to the antibody concentration.
[212] Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo no presente documento descrito pode ser coformulado e/ou coadministrado com um marcador detectável. Em algumas modalidades, o marcador detectável é uma enzima, um radioisótopo, um fluoróforo, um marcador de ressonância magnética nuclear ou um metal pesado. Em algumas modalidades, o marcador detectável está em associação (por exemplo, covalente ou não covalente) com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno. Aditivos adequados e condições de formulação para administração de anticorpos podem ser usados, por exemplo, aqueles conhecidos na técnica para formular anticorpos para administração parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular), ou injeção intravenosa, intramuscular ou subcutânea.[212] In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof in this described document can be co-formulated and / or co-administered with a detectable marker. In some embodiments, the detectable marker is an enzyme, a radioisotope, a fluorophore, a nuclear magnetic resonance marker or a heavy metal. In some embodiments, the detectable marker is in association (for example, covalent or non-covalent) with the antibody or antigen-binding fragment. Suitable additives and formulation conditions for administration of antibodies can be used, for example, those known in the art to formulate antibodies for parenteral administration (e.g., intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular), or intravenous, intramuscular or subcutaneous injection.
[213] Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é formulado em combinação com compostos adicionais que também são úteis na prevenção e/ou tratamento de AD ou outra tauopatia. Estes incluem, sem limitação, compostos que são úteis em imunoterapias ativas e passivas para AD, tais como peptídeos beta-amiloides (por exemplo, peptídeos beta amiloides N-terminais) e peptídeos tau que podem ou não ser conjugados a outros compostos, como toxina da difteria mutada, KLH ou outros veículos. Outras opções incluem anticorpos contra beta- amiloide, como bapineuzumab, solaneuzumab, gantenerumab, crenezumab, ponezumab e imunoglobulina IVIG, outras terapias de imunização direcionadas a oligômeros Abeta, outros anticorpos tau, compostos que impedem a hiperfosforilação de tau e outras terapias de imunização ativa e passiva segmentação de agregados de tau.[213] In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof is formulated in combination with additional compounds that are also useful in the prevention and / or treatment of AD or other tauopathy. These include, without limitation, compounds that are useful in active and passive immunotherapies for AD, such as beta-amyloid peptides (eg, N-terminal beta amyloid peptides) and tau peptides that may or may not be conjugated to other compounds, such as toxin mutated diphtheria, KLH or other vehicles. Other options include antibodies against beta-amyloid such as bapineuzumab, solaneuzumab, gantenerumab, crenezumab, ponezumab and IVIG immunoglobulin, other immunization therapies targeting Abeta oligomers, other tau antibodies, compounds that prevent tau hyperphosphorylation and other active immunization therapies and passive segmentation of tau aggregates.
[214] Outras drogas que podem ser úteis na terapia de combinação com os anticorpos e fragmentos de ligação de tau descritos no presente documento incluem inibidores da agregação de beta-amiloide (por exemplo, Tramiprosato), inibidores da gama- secretase (por exemplo, semagacestat) e moduladores da gama- secretase (tarenflurbil). Além disso, um ou mais dos novos anticorpos descritos no presente documento podem ser usados ou formulados em combinação com dois ou mais dos agentes terapêuticos precedentes. Nos estágios iniciais da doença, as terapias combinadas podem ser vantajosas. As terapias de combinação também são vantajosas em estágios posteriores da doença, como a combinação de hAb e fatores de crescimento e outras moléculas biologicamente ativas que induzem plasticidade neuronal e regeneração.[214] Other drugs that may be useful in combination therapy with the antibodies and fragments of tau binding described herein include inhibitors of beta-amyloid aggregation (eg, Tramiprosate), gamma-secretase inhibitors (eg, semagacestat) and gamma-secretase modulators (tarenflurbil). In addition, one or more of the new antibodies described in this document can be used or formulated in combination with two or more of the foregoing therapeutic agents. In the early stages of the disease, combination therapies can be advantageous. Combination therapies are also beneficial in later stages of the disease, such as the combination of hAb and growth factors and other biologically active molecules that induce neuronal plasticity and regeneration.
Essas terapias de combinação podem utilizar vantajosamente dosagens mais baixas dos agentes terapêuticos administrados, evitando assim possíveis toxicidades ou complicações associadas às várias monoterapias.Such combination therapies can advantageously use lower dosages of the therapeutic agents administered, thus avoiding possible toxicities or complications associated with the various monotherapies.
De acordo com uma modalidade relacionada, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste no presente documento descrito pode ser usado em combinação com pelo menos um agente de combinação escolhido a partir de inibidores da acetilcolinesterase (por exemplo, donepezil, rivastigmina, galantamina, tacrina, suplementos nutricionais), antagonistas do receptor de N-Metil-D-aspartato (NMDA) (por exemplo, memantina), inibidores de reparo de DNA (por exemplo, pirenzepina ou um metabólito do mesmo), quelantes de metais de transição, fatores de crescimento, hormônios, ant-iinflamatórios não esteroidais (NSAID), antioxidantes, agentes redutores de lipídios, inibidores seletivos da fosfodiesterase, inibidores da agregação de tau, inibidores de proteínas quinases, inibidores de drogas antidisfunção mitocondrial, neurotrofinas, inibidores de proteínas de choque térmico, inibidores de fosfolipase A2 associada à lipoproteína e quaisquer sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.According to a related embodiment, an antibody or antigen-binding fragment thereof herein described can be used in combination with at least one combination agent chosen from acetylcholinesterase inhibitors (e.g., donepezil, rivastigmine, galantamine, tacrine , nutritional supplements), N-Methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antagonists (eg, memantine), DNA repair inhibitors (eg, pirenzepine or a metabolite thereof), transition metal chelators, growth hormones, non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), antioxidants, lipid-lowering agents, selective phosphodiesterase inhibitors, tau aggregation inhibitors, protein kinase inhibitors, mitochondrial anti-dysfunction drug inhibitors, neurotrophins, shock protein inhibitors lipoprotein-associated phospholipase A2 inhibitors and any pharmaceutically acceptable salts thereof.
Em uma modalidade, um anticorpo descrito e/ou fragmento de ligação a tau do mesmo é combinado com um inibidor de colinesterase (ChEI) e/ou memantina.In one embodiment, a described antibody and / or tau-binding fragment thereof is combined with a cholinesterase inhibitor (ChEI) and / or memantine.
Em uma modalidade, o agente de combinação é selecionado a partir do grupo que consiste em um composto antiapoptótico, um quelante de metal, um inibidor de reparo de DNA, ácido 3-amino-1 a propanossulfônico (3APS), 1,3-propanodissulfonato (1,3PDS), um ativador de secretase, um inibidor de beta-secretase, um inibidor de gama-secretase, um peptídeo beta-amiloide, um anticorpo beta- amiloide, um neurotransmissor, um quebrador de folha beta, uma molécula anti-inflamatória e um inibidor de colinesterase.In one embodiment, the combining agent is selected from the group consisting of an anti-apoptotic compound, a metal chelator, a DNA repair inhibitor, 3-amino-1 to propanesulfonic acid (3APS), 1,3-propanedisulfonate (1,3PDS), a secretase activator, a beta-secretase inhibitor, a gamma-secretase inhibitor, a beta-amyloid peptide, a beta-amyloid antibody, a neurotransmitter, a beta leaf breaker, an anti- inflammatory and a cholinesterase inhibitor.
Em uma modalidade, o inibidor da colinesterase é rivastigmina, donepezil,In one embodiment, the cholinesterase inhibitor is rivastigmine, donepezil,
galantamina ou um suplemento nutritivo. Em outra modalidade, o agente adicional é selecionado a partir de inibidores BACE; antagonistas muscarínicos; inibidores da colinesterase; inibidores da gama secretase; moduladores de gama secretase; inibidores de HMG- CoA redutase; agentes anti-inflamatórios não esteroides; antagonistas do receptor N-metil-D-aspartato; anticorpos antiamiloide; vitamina E; agonistas do receptor de acetilcolina nicotínico; agonistas inversos do receptor CB1 ou antagonistas do receptor CB1; um antibiótico ic; secretagogos do hormônio do crescimento; antagonistas de histamina H3; Agonistas de AMPA; inibidores de PDE4; agonistas inversos de GABAA; inibidores da agregação amiloide; inibidores de glicogênio sintase quinase beta; promotores da atividade da alfa secretase; inibidores de PDE-10 e inibidores de absorção do colesterol.galantamine or a nutritional supplement. In another embodiment, the additional agent is selected from BACE inhibitors; muscarinic antagonists; cholinesterase inhibitors; gamma secretase inhibitors; gamma secretase modulators; HMG-CoA reductase inhibitors; non-steroidal anti-inflammatory agents; N-methyl-D-aspartate receptor antagonists; anti-amyloid antibodies; vitamin E; nicotinic acetylcholine receptor agonists; inverse CB1 receptor agonists or CB1 receptor antagonists; an ic antibiotic; growth hormone secretagogues; histamine H3 antagonists; AMPA agonists; PDE4 inhibitors; inverse GABAA agonists; amyloid aggregation inhibitors; glycogen synthase kinase beta inhibitors; promoters of alpha secretase activity; PDE-10 inhibitors and cholesterol absorption inhibitors.
[215] Outros compostos que podem ser usados em combinação com o anticorpo e o fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descritos incluem os anticorpos e peptídeos terapêuticos descritos na U.S. 9.518.101, que é incorporado no presente documento por referência em sua totalidade. Também são úteis os compostos descritos em WO 2004/058258, que é incorporado no presente documento por referência na sua totalidade (vide especialmente as páginas 16 e 17), incluindo alvos terapêuticos de drogas (páginas 36-39), ácidos alcanossulfônicos e ácidos alcanolsulfúricos (páginas 39-51), inibidores da colinesterase (páginas 51 a 56), antagonistas do receptor NMDA (páginas 56-58), estrogênios (páginas 58-59), drogas anti-inflamatórias não esteroides (páginas 60- 61), antioxidantes (páginas 61 a 62), agonistas do receptor ativado por proliferadores de peroxissoma (PPAR) (páginas 63-67), agentes de redução do colesterol (páginas 68-75); inibidores de amiloide (páginas 75-77), inibidores de formação de amiloide (páginas 77-78), quelantes de metal (páginas 78-79), antipsicóticos e antidepressivos (páginas 80-[215] Other compounds that can be used in combination with the antibody and antigen-binding fragment described herein include the therapeutic antibodies and peptides described in U.S. 9,518,101, which is incorporated herein by reference in its entirety. Also useful are the compounds described in WO 2004/058258, which is incorporated by reference in their entirety by reference in their entirety (see especially pages 16 and 17), including therapeutic drug targets (pages 36-39), alkanesulfonic acids and alkanolsulfuric acids (pages 39-51), cholinesterase inhibitors (pages 51 to 56), NMDA receptor antagonists (pages 56-58), estrogens (pages 58-59), non-steroidal anti-inflammatory drugs (pages 60-61), antioxidants (pages 61 to 62), peroxisome proliferator activated receptor (PPAR) agonists (pages 63-67), cholesterol-lowering agents (pages 68-75); amyloid inhibitors (pages 75-77), amyloid formation inhibitors (pages 77-78), metal chelators (pages 78-79), antipsychotics and antidepressants (pages 80-
82), suplementos nutricionais (páginas 83-89) e compostos que aumentam a disponibilidade de substâncias biologicamente ativas no cérebro (vide páginas 89-93) e pró-drogas (páginas 93 e 94). Outros compostos que podem ser usados em combinações incluem aqueles descritos em Cummings et al., Alzheimer’s disease drug development pipeline: 2017, Alzheimer’s & Dementia: Translational Research & Clinical Interventions 3 (2017) 367-384.82), nutritional supplements (pages 83-89) and compounds that increase the availability of biologically active substances in the brain (see pages 89-93) and pro-drugs (pages 93 and 94). Other compounds that can be used in combinations include those described in Cummings et al., Alzheimer’s disease drug development pipeline: 2017, Alzheimer’s & Dementia: Translational Research & Clinical Interventions 3 (2017) 367-384.
[216] Também são fornecidas no presente documento composições compreendendo um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito no presente documento, e outro componente, como um veículo. Também são fornecidas composições/formulações compreendendo um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito no presente documento, e um veículo, por exemplo, um veículo adequado para usos diagnósticos ou terapêuticos.[216] Compositions comprising an antibody or an antigen-binding fragment thereof, as described herein, and another component, such as a vehicle, are also provided herein. Also provided are compositions / formulations comprising a humanized antibody or antigen-binding fragment thereof, as described herein, and a vehicle, for example, a vehicle suitable for diagnostic or therapeutic uses.
[217] Em uma modalidade, as formulações e composições dos anticorpos usados de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenamento e/ou administração por mistura de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tendo o grau de pureza desejado com veículos opcionais, por exemplo, veículos, diluentes, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences 21ª edição, Mohr, M. Ed. (2006)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Em uma modalidade, os veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis não são tóxicos para os destinatários nas dosagens e concentrações utilizadas e incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbezilamônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, fenol, butil ou benilalcolol; alquilparabenos tais como metil ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m- cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons formadores de sal, tais como sódio, complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou surfactantes não iônicos, tais como TWEEN, PLURONICS ou polietilenoglicol (PEG). Exemplos de formulações de anticorpos liofilizados são descritos em WO 97/04801, expressamente incorporado no presente documento por referência.[217] In one embodiment, the formulations and compositions of the antibodies used in accordance with the present invention are prepared for storage and / or administration by mixing an antibody or antigen-binding fragment thereof having the desired degree of purity with optional vehicles , for example, pharmaceutically acceptable vehicles, diluents, excipients or stabilizers (Remington's Pharmaceutical Sciences 21st edition, Mohr, M. Ed. (2006)), in the form of lyophilized formulations or aqueous solutions. In one embodiment, acceptable vehicles, excipients or stabilizers are non-toxic to recipients at the dosages and concentrations used and include buffers, such as phosphate, citrate and other organic acids; antioxidants including ascorbic acid and methionine; preservatives (such as octadecyldimethylbezylammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride, benzethonium chloride, phenol, butyl or benzylcolol; alkyl parabens such as methyl or propylparaben; catechol; resorcinol; cyclohexanol; 3-pentanol; and m-cresol; low molecular weight polypeptides (less than about 10 residues); proteins, such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins; hydrophilic polymers like polyvinylpyrrolidone; amino acids, such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine or lysine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates, including glucose, mannose or dextrins; chelating agents such as EDTA; sugars like sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; salt-forming counterions, such as sodium, metal complexes (for example, Zn-protein complexes); and / or non-ionic surfactants, such as TWEEN, PLURONICS or polyethylene glycol (PEG). Examples of lyophilized antibody formulations are described in WO 97/04801, expressly incorporated herein by reference.
[218] Em uma modalidade, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser incorporados em composições farmacêuticas adequadas para administração a um objeto. Em certas modalidades, a composição farmacêutica compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito no presente documento, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento de absorção e similares que são fisiologicamente compatíveis. Exemplos adicionais de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem um ou mais de água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e similares, bem como suas combinações. Em muitos casos, a composição incluirá agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis podem compreender ainda pequenas quantidades de substâncias auxiliares, como agentes umectantes ou emulsificantes, conservantes ou tampões, que aumentam a vida útil ou a eficácia do anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo.[218] In one embodiment, antibodies and antigen-binding fragments thereof can be incorporated into pharmaceutical compositions suitable for administration to an object. In certain embodiments, the pharmaceutical composition comprises an antibody or antigen-binding fragment thereof, as described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier. In one embodiment, "pharmaceutically acceptable carrier" includes any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption retarding agents and the like that are physiologically compatible. Additional examples of pharmaceutically acceptable carriers include one or more of water, saline, phosphate buffered saline, dextrose, glycerol, ethanol and the like, and combinations thereof. In many cases, the composition will include isotonic agents, for example, sugars, polyalcohols, such as mannitol, sorbitol or sodium chloride. Pharmaceutically acceptable vehicles can also comprise small amounts of auxiliary substances, such as wetting or emulsifying agents, preservatives or buffers, which increase the useful life or the effectiveness of the antibody or antigen-binding fragments thereof.
[219] As composições no presente documento descritas, compreendendo os anticorpos descritos ou fragmentos de ligação ao antígeno, podem estar em uma variedade de formas. Estes incluem, por exemplo, formas de dosagem líquidas, semilíquidas, semissólidas e sólidas, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, lipossomas e supositórios. Em algumas modalidades, tais composições também podem compreender tampões (por exemplo, solução salina tamponada neutra ou solução salina tamponada com fosfato), carboidratos (por exemplo, glicose, manose, sacarose ou dextranos), manitol, proteínas, polipeptídeos ou aminoácidos, tais como glicina, antioxidantes, quelantes agentes como EDTA ou glutationa, adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio) e/ou conservantes. Alternativamente, as composições da presente invenção podem ser formuladas como um liofilizado. Os anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno também podem ser encapsulados em lipossomas.[219] The compositions described herein, comprising the described antibodies or antigen-binding fragments, can be in a variety of forms. These include, for example, liquid, semi-liquid, semi-solid and solid dosage forms, such as liquid solutions (for example, injectable and infusible solutions), dispersions or suspensions, tablets, pills, powders, liposomes and suppositories. In some embodiments, such compositions may also comprise buffers (for example, neutral buffered saline or phosphate-buffered saline), carbohydrates (for example, glucose, mannose, sucrose or dextrans), mannitol, proteins, polypeptides or amino acids, such as glycine, antioxidants, chelating agents such as EDTA or glutathione, adjuvants (eg aluminum hydroxide) and / or preservatives. Alternatively, the compositions of the present invention can be formulated as a lyophilizate. Antibodies and their antigen-binding fragments can also be encapsulated in liposomes.
[220] As formas de dosagem adequadas para uso em ensaios de diagnóstico ou para administração interna geralmente contêm de cerca de 0,1 miligrama a cerca de 500 miligramas de anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo por unidade ou recipiente. Nessas composições, o ingrediente ativo estará normalmente presente em uma quantidade de cerca de 0,5-99,999% em peso com base no peso total da composição. A forma de dosagem preferida depende do uso pretendido e/ou modo de administração.[220] Dosage forms suitable for use in diagnostic assays or for internal administration generally contain from about 0.1 milligram to about 500 milligrams of antibody or antigen-binding fragment thereof per unit or container. In these compositions, the active ingredient will normally be present in an amount of about 0.5-99.999% by weight based on the total weight of the composition. The preferred dosage form depends on the intended use and / or mode of administration.
[221] Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno no presente documento descritos podem atravessar a barreira hematoencefálica ou são formulados para atravessar a barreira hematoencefálica. Certas doenças neurodegenerativas, incluindo AD e tauopatias relacionadas, estão associadas a um aumento na permeabilidade da barreira hematoencefálica, de modo que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo possa ser facilmente introduzido no cérebro. Quando a barreira hematoencefálica permanece intacta, existem várias abordagens conhecidas na técnica para transportar moléculas através dela, incluindo, mas não se limitando a, métodos físicos, métodos baseados em lipídios e métodos baseados em receptores e canais. Os métodos para contornar a barreira hematoencefálica incluem, mas não estão limitados a, injeção direta no cérebro (vide, por exemplo, Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)) e implantar um dispositivo de distribuição no cérebro (vide, por exemplo, Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003): e Gliadel Wafers, T.M., Guildford Pharmaceutical). Os métodos de criação de aberturas na barreira incluem, mas não estão limitados a, ultrassom (vide, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No. 2002/0038086), pressão osmótica (por exemplo, por administração de manitol hipertônico ((Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989))), permeabilização por, por exemplo, bradicinina ou permeabilizador A-7 (vide, por exemplo, Patentes U.S. 5.112.596, 5.268.164, 5.506.206, e[221] In certain embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments described herein may cross the blood-brain barrier or are formulated to cross the blood-brain barrier. Certain neurodegenerative diseases, including AD and related tauopathies, are associated with an increase in the permeability of the blood-brain barrier, so that the antibody or antigen-binding fragment can easily be introduced into the brain. When the blood-brain barrier remains intact, there are several approaches known in the art for transporting molecules through it, including, but not limited to, physical methods, lipid-based methods and methods based on receptors and channels. Methods to bypass the blood-brain barrier include, but are not limited to, direct injection into the brain (see, for example, Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)) and implanting a delivery device in the brain ( see, for example, Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003): and Gliadel Wafers, TM, Guildford Pharmaceutical). Methods of creating barrier openings include, but are not limited to, ultrasound (see, for example, US Patent Publication No. 2002/0038086), osmotic pressure (for example, by administration of hypertonic mannitol ((Neuwelt, EA , Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, NY (1989))), permeabilization by, for example, bradykinin or permeabilizer A-7 (see, for example, US Patents 5,112,596 , 5,268,164, 5,506,206, and
5.686.416), e transfecção de neurônios que se estendem pela barreira hematoencefálica com vetores contendo genes que codificam o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (vide, por exemplo, Publicação de Patente U.S. 2003/0083299). Métodos baseados em lipídios para transportar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo através da barreira hematoencefálica incluem, mas não estão limitados a, encapsular o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo em lipossomas que são acoplados a fragmentos ativos do mesmo que se ligam a receptores no endotélio vascular da barreira hematoencefálica (vide, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 20020025313), e revestir o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo em partículas de lipoproteína de baixa densidade (vide, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 20040204354) ou apolipoproteína E (vide, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 20040131692).5,686,416), and transfection of neurons that extend across the blood-brain barrier with vectors containing genes encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof (see, for example, U.S. Patent Publication 2003/0083299). Lipid-based methods for transporting the antibody or antigen-binding fragment thereof through the blood-brain barrier include, but are not limited to, encapsulating the antibody or antigen-binding fragment thereof in liposomes that are coupled to active fragments thereof bind to receptors in the blood-brain barrier vascular endothelium (see, for example, US Patent Application Publication No. 20020025313), and coat the antibody or antigen-binding fragment thereof on low-density lipoprotein particles (see, for example, for example, US Patent Application Publication No. 20040204354) or apolipoprotein E (see, for example, US Patent Application Publication No. 20040131692).
[222] Em várias modalidades, uma composição pode compreender qualquer um ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno no presente documento descritos e um veículo e/ou diluente. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende qualquer uma ou mais (por exemplo, todas as seis CDRs e/ou um domínio variável de cadeia pesada e/ou leve) sequência selecionada daquelas mostradas na Tabela 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende qualquer uma das sequências mostradas na tabela 1, por exemplo, um conjunto de seis CDRs e/ou sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve emparelhadas listadas na Tabela 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende SEQ ID NOS: 29 e 30. Em algumas modalidades, a composição é adequada para uso em um ensaio de diagnóstico, por exemplo, ELISA clássico ou digital. Em algumas modalidades, a composição é uma composição farmacêutica e compreende um veículo farmaceuticamente aceitável.[222] In various embodiments, a composition can comprise any one or more antibodies or antigen-binding fragments described herein and a carrier and / or diluent. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises three heavy chain complementarity determining regions (HCDR1, HCDR2 and HCDR3 ) and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO : 2 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and where LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In some embodiments, the antibody or fragment antigen-binding sequence comprises any one or more (for example, all six CDRs and / or a heavy and / or light chain variable domain) sequence selected from those shown in Table 1. In some embodiments, the antibody or fragment binding to antigen comprises any of the sequences shown in table 1, for example, a set of six paired heavy and light chain variable domain CDRs and / or sequences listed in Table 1. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment comprises SEQ ID NOS: 29 and 30. In some embodiments, the composition is suitable for use in a diagnostic assay, for example, classic or digital ELISA. In some embodiments, the composition is a pharmaceutical composition and comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
[223] Em certas modalidades, uma composição compreende quaisquer dois anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, conforme descrito precedentemente. Em certas modalidades, uma composição compreende pelo menos um outro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno e/ou pelo menos um agente adicional. Em uma modalidade exemplar, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; e o outro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.[223] In certain embodiments, a composition comprises any two antibodies or antigen-binding fragments, as described above. In certain embodiments, a composition comprises at least one other antibody or antigen-binding fragment and / or at least one additional agent. In an exemplary embodiment, an antibody or antigen-binding fragment comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises three heavy chain complementarity determining regions (HCDR1, HCDR2 and HCDR3) and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; and the other antibody or antigen binding fragment comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises three determining regions for heavy chain complementarity (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
[224] Em algumas modalidades, o primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende qualquer uma ou mais (por exemplo, todas as seis CDRs e/ou um domínio variável de cadeia pesada e/ou leve) sequência selecionada daquelas mostradas na Tabela 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende qualquer uma das sequências mostradas na tabela 1, por exemplo, um conjunto de seis CDRs e/ou sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve emparelhadas listadas na Tabela 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende SEQ ID NOS: 29 e 30. Em algumas modalidades, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende qualquer uma ou mais (por exemplo, todas as seis CDRs e/ou um domínio variável de cadeia pesada e/ou leve) da sequência selecionada daquelas mostradas na Tabela 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende qualquer uma das sequências mostradas na tabela 1, por exemplo, um conjunto de seis CDRs e/ou sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve emparelhadas listadas na Tabela 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende SEQ ID NOS: 29 e 30.[224] In some embodiments, the first antibody or antigen binding fragment comprises any one or more (for example, all six CDRs and / or a heavy and / or light chain variable domain) sequence selected from those shown in Table 1 In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment comprises any of the sequences shown in Table 1, for example, a set of six paired CDRs and / or paired heavy and light chain variable domain sequences listed in Table 1. In in some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment comprises SEQ ID NOS: 29 and 30. In some embodiments, the second antibody or antigen-binding fragment comprises any one or more (for example, all six CDRs and / or one heavy and / or light chain variable domain) of the selected sequence from those shown in Table 1. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment comprises any of the most In Table 1, for example, a set of six paired CDRs and / or heavy and light chain variable domain sequences listed in Table 1. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment comprises SEQ ID NOS: 29 and 30.
[225] Em algumas modalidades, a composição é adequada para uso em um ensaio de diagnóstico, por exemplo, ELISA clássico ou digital. Em algumas modalidades, a composição é uma composição farmacêutica e compreende um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode compreender ainda pelo menos um agente terapêutico adicional para o tratamento da doença de Alzheimer ou outra tauopatia. Métodos de Tratamento[225] In some embodiments, the composition is suitable for use in a diagnostic assay, for example, classic or digital ELISA. In some embodiments, the composition is a pharmaceutical composition and comprises a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutical composition can further comprise at least one additional therapeutic agent for the treatment of Alzheimer's disease or other tauopathy. Treatment Methods
[226] Os anticorpos e composições no presente documento descritos podem ser usados para vários métodos de tratamento e prevenção de AD e outras tauopatias. Em algumas modalidades, os anticorpos e as composições podem ser usados para detectar pacientes adequados para tratamentos baseado em anti-tau, para informar a seleção do tratamento ou para monitorar o progresso do tratamento ao longo do tempo. Em outras modalidades, os anticorpos e as composições no presente documento descritos podem ser usados como tratamentos diretos ou prevenção para AD e outras tauopatias por administração de um ou mais anticorpos ou composições a um paciente em necessidade dos mesmos.[226] The antibodies and compositions described herein can be used for various methods of treatment and prevention of AD and other tauopathies. In some embodiments, antibodies and compositions can be used to detect patients suitable for anti-tau-based treatments, to inform treatment selection, or to monitor treatment progress over time. In other embodiments, the antibodies and compositions described herein can be used as direct treatments or prevention for AD and other tauopathies by administering one or more antibodies or compositions to a patient in need thereof.
[227] Em aplicações preventivas (ou seja, profiláticas), os anticorpos e composições farmacêuticas no presente documento descritos (por exemplo, anticorpo DC2E7 ou um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que pode se ligar ao mesmo epítopo que, ou compreende as CDRs ou domínios variáveis do anticorpo DC2E7) pode ser administrado a um paciente suscetível a, ou de outra forma em risco de, doença de Alzheimer ou outra tauopatia. Em algumas modalidades, o anticorpo ou composição farmacêutica é administrado em uma quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco, diminuir a gravidade ou atrasar o início da doença, incluindo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais da doença, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários que se apresentam durante o desenvolvimento da doença. Em aplicações terapêuticas, as composições são administradas a um paciente suspeito, diagnosticado e/ou já sofrendo de tal doença em uma quantidade suficiente para curar ou, pelo menos, reduzir parcialmente, deter ou reverter os sintomas da doença (bioquímicos, histológica e/ou comportamental), incluindo suas complicações e fenótipos patológicos intermediários no desenvolvimento da doença.[227] In preventive (ie prophylactic) applications, the antibodies and pharmaceutical compositions described in this document (for example, DC2E7 antibody or an antibody or antigen binding fragment that can bind to the same epitope that, or comprises CDRs or variable domains of the DC2E7 antibody) can be administered to a patient susceptible to, or otherwise at risk for, Alzheimer's disease or other tauopathy. In some embodiments, the antibody or pharmaceutical composition is administered in an amount sufficient to eliminate or reduce the risk, decrease the severity or delay the onset of the disease, including biochemical, histological and / or behavioral symptoms of the disease, its complications and intermediate pathological phenotypes that present themselves during the development of the disease. In therapeutic applications, the compositions are administered to a suspect patient, diagnosed and / or already suffering from such a disease in an amount sufficient to cure or, at least partially reduce, arrest or reverse the symptoms of the disease (biochemical, histological and / or behavioral), including its complications and intermediate pathological phenotypes in the development of the disease.
[228] Em algumas modalidades, o tratamento da doença de Alzheimer refere-se a diminuir ou prevenir a deterioração comportamental, funcional e cognitiva ao longo do tempo. Em algumas modalidades, os aspectos comportamentais, funcionais e cognitivos da doença de Alzheimer podem ser avaliados por qualquer um ou mais de uma série de testes padronizados conhecidos por pessoas de habilidade comum na técnica, incluindo, mas não se limitando a, testes neuropsicológicos, o Miniexame do Estado Mental, Miniexame cog, Inventário Neuropsiquiátrico, Escala de Avaliação de Demência Blessed Roth, Escalas de Avaliação Neuropsicológicas (SENAS) em Espanhol e Inglês, Avaliação Comportamental Psiquiátrica, Avaliação Funcional, Teste de Desenho do Relógio, Teste de Nomenclatura de Boston. Teste de Aprendizado Verbal da Califórnia, Lista de Verificação de Sintomas Cognitivos, Teste de Desempenho Contínuo, Teste de Associação de Palavras Oral Controlada, Cognistat, Teste de Atenção d2, Sistema de Função de Execução Delis-Kaplan, Escala de Classificação de Demência, Teste de Vigilância do Dígito, Teste de Fluência de Figura, Teste de Batidas do Dedo, Teste de Categoria Halstead, Bateria Neuropsicológica Halstead-Reitan, Teste de[228] In some modalities, treatment of Alzheimer's disease refers to decreasing or preventing behavioral, functional and cognitive deterioration over time. In some modalities, the behavioral, functional and cognitive aspects of Alzheimer's disease can be assessed by any one or more of a series of standardized tests known to people of ordinary skill in the art, including, but not limited to, neuropsychological tests, the Mini Mental State Examination, Mini Cog Examination, Neuropsychiatric Inventory, Blessed Roth Dementia Assessment Scale, Neuropsychological Assessment Scales (SENAS) in Spanish and English, Psychiatric Behavioral Assessment, Functional Assessment, Clock Drawing Test, Boston Nomenclature Test. California Verbal Learning Test, Cognitive Symptom Checklist, Continuous Performance Test, Oral Controlled Word Association Test, Cognistat, Attention Test d2, Delis-Kaplan Execution Function System, Dementia Rating Scale, Test Digit Surveillance, Figure Fluency Test, Finger Strike Test, Halstead Category Test, Halstead-Reitan Neuropsychological Battery,
Organização Visual Hooper, Avaliação Neurocognitiva Kaplan Baycrest, Avaliação Neuropsicológica Kaufman Short, Bateria Neuropsicológica Luria-Nebraska, Escalas de Avaliação de Memória, Teste de Triagem Neurológica Rápida, Bateria Repetível para Avaliação do Status Neuropsicológico, Teste de Stroop, Teste de Modalidades de Símbolos-Dígitos, Teste de Desempenho Tactual, Teste de Apercepção Temática, Torre de Londres, Testes de Trilha A e B, Testes de Fluência Verbal (Palavra), e Teste de Classificação de Cartas Wisconsin. Também são usados testes adicionais para depressão, ansiedade, afasia, agitação e parâmetros comportamentais conhecidos por pessoas ordinariamente versadas na técnica. Além disso, em algumas modalidades, os pacientes podem ser diagnosticados ou monitorados quanto à eficácia do tratamento usando qualquer um dos métodos de detecção descritos no presente documento envolvendo um ou mais dos anticorpos descritos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos.Visual Hooper Organization, Kaplan Baycrest Neurocognitive Assessment, Kaufman Short Neuropsychological Assessment, Luria-Nebraska Neuropsychological Battery, Memory Assessment Scales, Rapid Neurological Screening Test, Repeatable Battery for Assessment of Neuropsychological Status, Stroop Test, Symbol Modality Test- Digits, Tactual Performance Test, Thematic Apperception Test, Tower of London, Trail Tests A and B, Verbal Fluency Tests (Word), and Wisconsin Card Classification Test. Additional tests are also used for depression, anxiety, aphasia, agitation and behavioral parameters known to people ordinarily skilled in the art. In addition, in some embodiments, patients can be diagnosed or monitored for treatment effectiveness using any of the detection methods described in this document involving one or more of the described antibodies or antigen-binding fragments thereof.
[229] Em algumas modalidades, os anticorpos e composições farmacêuticas descritos no presente documento (por exemplo, anticorpo DC2E7 ou um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que pode se ligar ao mesmo epítopo que, ou compreende as CDRs ou domínios variáveis do anticorpo DC2E7) podem ser administrados para tratar AD ou outra tauopatia em um paciente. Em algumas modalidades, a eficácia de um tratamento da doença de Alzheimer é determinada pela melhora ou falta de deterioração ou redução na taxa de deterioração em pelo menos uma avaliação selecionada a partir do grupo que consiste em Escala de Avaliação da Doença de Alzheimer - subescala cognitiva (ADAS-cog), a Soma de Caixas de Avaliação de Demência Clínica (CDR-sb), Atividades de Estudo Cooperativo da Doença de Alzheimer da Escala de Vida Diária (ADCS-ADL), o inventário Neuropsiquiátrico (NPI), a Escala de[229] In some embodiments, the antibodies and pharmaceutical compositions described in this document (for example, DC2E7 antibody or an antibody or antigen binding fragment that can bind to the same epitope that, or comprises the CDRs or variable domains of the DC2E7 antibody ) can be administered to treat AD or other tauopathy in a patient. In some modalities, the effectiveness of a treatment for Alzheimer's disease is determined by the improvement or lack of deterioration or reduction in the rate of deterioration in at least one assessment selected from the group consisting of the Alzheimer's Disease Assessment Scale - cognitive subscale (ADAS-cog), the Sum of Clinical Dementia Assessment Boxes (CDR-sb), Activities of Cooperative Study of Alzheimer's Disease of the Daily Life Scale (ADCS-ADL), the Neuropsychiatric Inventory (NPI), the Scale of
Deterioração Progressiva (PDS), Atividades Instrumentais de Amsterdam da Vida Diária (AIVD), a Escala de Avaliação de Demência Clínica (CDR), a Avaliação de Incapacidade para Escala de Demência (DAD), e a Avaliação do Estado Minimental (MMSE). Em algumas modalidades, o tratamento resulta em uma redução na taxa de deterioração nas pontuações ADAS-cog. Em outras modalidades, o tratamento resulta em uma redução mediana na taxa de deterioração das pontuações ADAS-cog de dois a cinco pontos.Progressive Deterioration (PDS), Amsterdam Instrumental Activities of Daily Living (IADL), the Clinical Dementia Assessment Scale (CDR), the Disability Assessment for Dementia Scale (DAD), and the Minimal State Assessment (MMSE). In some modalities, treatment results in a reduction in the rate of deterioration in ADAS-cog scores. In other modalities, the treatment results in a median reduction in the rate of deterioration of the ADAS-cog scores by two to five points.
[230] Em algumas modalidades, um método para retardar a progressão da doença de Alzheimer é fornecido, compreendendo a administração de um ou mais dos anticorpos descritos, por exemplo, anticorpo DC2E7 ou um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga ao mesmo epítopo que, ou compreende as CDRs ou domínios variáveis do anticorpo DC2E7. Em uma modalidade, "atrasar" a progressão da DA significa adiar, impedir, retardar, retardar, estabilizar e/ou adiar o desenvolvimento da doença. Esse retardo pode ser por um período de tempo variável, dependendo do histórico da doença e/ou do indivíduo sendo tratado. Como é evidente para um especialista na técnica, um atraso suficiente ou significativo pode, com efeito, abranger a prevenção, em que o indivíduo não desenvolve a doença. Em uma modalidade, um método que "retarda" a progressão da AD ou outra tauopatia é um método que reduz a probabilidade de desenvolvimento da doença em um determinado período de tempo e/ou reduz a extensão da doença em um determinado período de tempo, quando comparado ao não uso do método. Essas comparações são normalmente baseadas em estudos clínicos, usando um número estatisticamente significativo de objetos.[230] In some embodiments, a method for slowing the progression of Alzheimer's disease is provided, comprising administering one or more of the described antibodies, for example, DC2E7 antibody or an antibody or antigen-binding fragment that binds to it epitope that either comprises the CDRs or variable domains of the DC2E7 antibody. In one embodiment, "delaying" the progression of AD means postponing, preventing, delaying, delaying, stabilizing and / or postponing the development of the disease. This delay can be for a variable period of time, depending on the history of the disease and / or the individual being treated. As is evident to a person skilled in the art, a sufficient or significant delay can, in effect, encompass prevention, in which the individual does not develop the disease. In one embodiment, a method that "slows" the progression of AD or another tauopathy is a method that reduces the likelihood of disease development over a period of time and / or reduces the extent of the disease over a period of time, when compared to not using the method. These comparisons are usually based on clinical studies, using a statistically significant number of objects.
[231] Em certas modalidades, AD ou outra tauopatia pode ser atrasada por dias, meses ou anos. Por exemplo, o método pode atrasar o progresso de AD ou outra tauopatia por uma ou mais semanas, meses ou anos.[231] In certain modalities, AD or other tauopathy can be delayed for days, months or years. For example, the method can delay the progress of AD or another tauopathy for one or more weeks, months or years.
[232] Pacientes, objetos ou indivíduos incluem mamíferos, como humanos, bovinos, equinos, caninos, felinos, suínos e ovinos. O objeto pode ser um ser humano e pode ou não estar afetado por uma doença ou apresentar sintomas no momento. No caso de AD, virtualmente qualquer pessoa corre o risco de sofrer de AD se viver o suficiente. Portanto, os presentes métodos podem ser administrados profilaticamente à população em geral sem a necessidade de qualquer avaliação do risco do paciente em questão. Em outras modalidades, o objeto é avaliado para AD usando um método para detecção no presente documento descrito.[232] Patients, objects or individuals include mammals, such as humans, cattle, horses, canines, felines, pigs and sheep. The object may be a human being and may or may not be affected by a disease or present symptoms at the time. In the case of AD, virtually anyone is at risk of suffering from AD if they live long enough. Therefore, the present methods can be administered prophylactically to the general population without the need for any risk assessment of the patient in question. In other embodiments, the object is evaluated for AD using a method for detection in this document described.
[233] Em uma modalidade, o paciente no presente documento é opcionalmente submetido a um teste de diagnóstico antes da terapia, que pode incluir os métodos de diagnóstico no presente documento descritos. Em uma modalidade, os métodos descritos são úteis para indivíduos que têm um risco genético conhecido de AD. Esses indivíduos incluem aqueles que têm parentes que sofreram dessa doença e aqueles cujo risco é determinado pela análise de marcadores genéticos ou bioquímicos. Os marcadores genéticos de risco para AD incluem mutações no gene APP, particularmente mutações na posição 717 e posições 670 e 671 referidas como mutações Hardy e Swedish, respectivamente. Vide Hardy (1997) Trends Neurosci. 20: 154-9). Outros marcadores de risco são mutações nos genes da presenilina, PS1 PS2 e ApoE4, histórico familiar de AD, hipercolesterolemia ou aterosclerose. Os indivíduos que atualmente sofrem de AD também podem ser identificados a partir de características comportamentais. Em pacientes assintomáticos, o tratamento pode começar em qualquer idade (por exemplo, 10, 20, 30). Em alguns pacientes, pode não ser necessário iniciar o tratamento e/ou monitoramento até que o paciente atinja uma idade mais avançada, por exemplo, 40, 50, 60 ou 70, ou mais tarde, ou qualquer período de tempo entre. O tratamento pode envolver várias dosagens ao longo de um período de tempo. O tratamento pode ser monitorado de várias maneiras, incluindo o uso dos métodos de detecção de AD no presente documento descritos.[233] In one embodiment, the patient in this document is optionally subjected to a diagnostic test prior to therapy, which may include the diagnostic methods in this document described. In one embodiment, the methods described are useful for individuals who have a known genetic risk of AD. These individuals include those who have relatives who have suffered from this disease and those whose risk is determined by analyzing genetic or biochemical markers. Genetic risk markers for AD include mutations in the APP gene, particularly mutations at position 717 and positions 670 and 671 referred to as Hardy and Swedish mutations, respectively. See Hardy (1997) Trends Neurosci. 20: 154-9). Other risk markers are mutations in the genes for presenilin, PS1 PS2 and ApoE4, family history of AD, hypercholesterolemia or atherosclerosis. Individuals who currently suffer from AD can also be identified from behavioral characteristics. In asymptomatic patients, treatment can begin at any age (for example, 10, 20, 30). In some patients, it may not be necessary to start treatment and / or monitoring until the patient reaches a later age, for example, 40, 50, 60 or 70, or later, or any period of time between. Treatment can involve several dosages over a period of time. Treatment can be monitored in several ways, including the use of the AD detection methods described herein.
[234] O uso periódico de um ou mais desses testes pode aconselhar um médico ou outro profissional médico quanto à progressão ou regressão da doença de Alzheimer e tauopatias relacionadas e a necessidade de tratamento adicional. A escolha do teste e a determinação do sucesso do tratamento são da competência dos profissionais médicos na área da doença de Alzheimer. Uma pontuação melhorada em um ou mais testes é uma indicação de diminuição na gravidade da AD naquele objeto.[234] Periodic use of one or more of these tests may advise a physician or other medical professional regarding the progression or regression of Alzheimer's disease and related tauopathies and the need for additional treatment. The choice of the test and the determination of the success of the treatment are the competence of medical professionals in the area of Alzheimer's disease. An improved score on one or more tests is an indication of a decrease in the severity of AD in that object.
[235] Em várias modalidades, é descrito um método para tratamento, retardamento da progressão ou prevenção da progressão da doença de Alzheimer de outra tauopatia em um objeto, compreendendo administrar ao objeto uma quantidade eficaz de pelo menos um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descrito. Este método pode resultar na redução do comprometimento motor, melhorando a função motora, reduzindo o comprometimento cognitivo, melhorando a função cognitiva ou uma combinação dos mesmos. O uso de qualquer anticorpo no presente documento descrito pode ser usado no tratamento, retardamento da progressão ou prevenção da doença de Alzheimer pela administração do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno a um objeto em necessidade do mesmo.[235] In various modalities, a method for treating, delaying the progression or preventing the progression of Alzheimer's disease from another tauopathy in an object is described, comprising administering to the object an effective amount of at least one antibody or antigen-binding fragment. in this document described. This method can result in the reduction of motor impairment, improving motor function, reducing cognitive impairment, improving cognitive function or a combination of them. The use of any antibody in this described document can be used to treat, slow the progression or prevent Alzheimer's disease by administering the antibody or antigen-binding fragment to an object in need of it.
[236] Métodos de detecção e monitoramento da progressão da AD e outras tauopatias[236] Methods of detecting and monitoring the progression of AD and other tauopathies
[237] A invenção no presente documento se concentra, em parte, na descoberta de certos resíduos de epítopo em tau, particularmente aqueles contendo um ou mais resíduos fosforilados em tau, que podem ser detectados em certas amostras biológicas (por exemplo, sangue ou CSF) e usados para identificar e distinguir AD, outras tauopatias e outras formas de demência.[237] The invention in this document focuses, in part, on the discovery of certain epitope residues in tau, particularly those containing one or more phosphorylated residues in tau, which can be detected in certain biological samples (for example, blood or CSF ) and used to identify and distinguish AD, other tauopathies and other forms of dementia.
Por exemplo, os resíduos de epítopo úteis podem compreender um ou mais dos resíduos 188-227 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 10). Em certas modalidades, o epítopo compreende um ou mais dos resíduos 210-221 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 11). Em certas modalidades, o epítopo compreende pelo menos um resíduo fosforilado, por exemplo, fosfo- treonina na posição 217 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) e, opcionalmente, também compreende uma serina fosforilada na posição 210, treonina na posição 212, serina na posição 214, ou treonina na posição 220 da proteína tau 2N4R, ou qualquer combinação das mesmas.For example, useful epitope residues may comprise one or more of residues 188-227 of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 10). In certain embodiments, the epitope comprises one or more of residues 210-221 of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 11). In certain embodiments, the epitope comprises at least one phosphorylated residue, for example, phosphorthreonine at position 217 of the tau protein 2N4R (SEQ ID NO: 9) and, optionally, also comprises a phosphorylated serine at position 210, threonine at position 212 , serine at position 214, or threonine at position 220 of the 2N4R tau protein, or any combination thereof.
Em outra modalidade, o epítopo compreende ou consiste em SRTPSLPpTPPTR (sequência de SEQ ID NO: 12) ou aquele trecho de resíduos de aminoácidos com uma ou mais posições fosforiladas adicionais nele.In another embodiment, the epitope comprises or consists of SRTPSLPpTPPTR (sequence of SEQ ID NO: 12) or that stretch of amino acid residues with one or more additional phosphorylated positions in it.
Em outra modalidade, o epítopo compreende ou consiste em SRpTPSLPpTPPTR (sequência de SEQ ID NO: 31). A invenção é baseada em parte na descoberta surpreendente de que a quantidade de espécies de tau fosforiladas nessas amostras pode ser usada para distinguir AD de outras tauopatias e de objetos com outras formas de demência e, assim, diagnosticar, monitorar e/ou orientar as decisões de tratamento para AD ou para outra tauopatia ou para outra causa de demência com base nos resultados do ensaio.In another embodiment, the epitope comprises or consists of SRpTPSLPpTPPTR (sequence of SEQ ID NO: 31). The invention is based in part on the surprising discovery that the amount of phosphorylated tau species in these samples can be used to distinguish AD from other tauopathies and objects with other forms of dementia and thus diagnose, monitor and / or guide decisions treatment for AD or another tauopathy or other cause of dementia based on the results of the trial.
Sem estar limitado pela teoria, a descoberta de que o nível desses epítopos fosforilados (por exemplo, na posição 217) pode ser usado para distinguir AD, outras tauopatias e outras formas de demência em certas amostras é particularmente inesperado, dado o fato de que os epítopos fosforilados podem frequentemente ser detectados no cérebro em diferentes tauopatias.Without being limited by theory, the finding that the level of these phosphorylated epitopes (for example, at position 217) can be used to distinguish AD, other tauopathies and other forms of dementia in certain samples is particularly unexpected, given the fact that Phosphorylated epitopes can often be detected in the brain in different tauopathies.
[238] A invenção fornecida no presente documento também se concentra, em parte, em anticorpos (por exemplo, quaisquer anticorpos compreendendo uma ou mais sequências mostradas na Tabela 1, por exemplo, todas as seis CDRs e/ou um domínio variável de cadeia pesada e/ou leve selecionado daqueles mostrado na Tabela 1) que são capazes de se ligar a esses epítopos de tau fosforiladas particulares em certos tipos de amostras biológicas (por exemplo, CSF ou sangue) e são particularmente úteis para identificar e distinguir AD, outras tauopatias e outras formas de demência com base no nível de ligação nas amostras. A invenção é baseada em parte na descoberta surpreendente de que a quantidade de espécies de tau fosforiladas ligadas pelos anticorpos descritos nessas amostras pode ser usada para distinguir AD de outras tauopatias e de objetos com outras formas de demência e, assim, diagnosticar, monitorar e/ou orientar as decisões de tratamento para AD ou para outra tauopatia ou para outra causa de demência com base nos resultados do ensaio.[238] The invention provided herein also focuses in part on antibodies (for example, any antibodies comprising one or more sequences shown in Table 1, for example, all six CDRs and / or a heavy chain variable domain and / or mild selected from those shown in Table 1) that are able to bind to those particular phosphorylated tau epitopes in certain types of biological samples (for example, CSF or blood) and are particularly useful for identifying and distinguishing AD, other tauopathies and other forms of dementia based on the level of binding in the samples. The invention is based in part on the surprising discovery that the amount of phosphorylated tau species linked by the antibodies described in these samples can be used to distinguish AD from other tauopathies and objects with other forms of dementia and thus diagnose, monitor and / or direct treatment decisions towards AD or another tauopathy or another cause of dementia based on the results of the trial.
[239] Além da AD, outras tauopatias são conhecidas na técnica, incluindo demência frontotemporal (FTD), doença corticobasal (CBD) e paralisia supranuclear progressiva (PSP). Murray et al., Clinicopathologic assessment and imaging of tauopathies in neurodegenerative dementias, Alzheimer’s Research & Therapy, 6: 1,[239] In addition to AD, other tauopathies are known in the art, including frontotemporal dementia (FTD), corticobasal disease (CBD) and progressive supranuclear palsy (PSP). Murray et al., Clinicopathologic assessment and imaging of tauopathies in neurodegenerative dementias, Alzheimer’s Research & Therapy, 6: 1,
2014. Inúmeras outras causas de demência também são conhecidas. Sem estar limitado pela teoria, as quantidades elevadas das espécies de tau fosforiladas em certas amostras biológicas de pacientes com AD e pacientes com outras tauopatias (por exemplo, CSF ou sangue) que são ligadas pelos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno descritos no presente documento podem contribuir para sua utilidade na detecção e distinção não invasiva de AD de outras causas de demência ou outras tauopatias nestes fluidos corporais.2014. Numerous other causes of dementia are also known. Without being limited by theory, the high amounts of phosphorylated tau species in certain biological samples from patients with AD and patients with other tauopathies (for example, CSF or blood) that are linked by the antibodies or antigen-binding fragments described in this document may contribute to its usefulness in the detection and non-invasive distinction of AD from other causes of dementia or other tauopathies in these body fluids.
[240] Numerosas espécies de tau estão presentes em certos tipos de amostras (por exemplo, sangue e/ou CSF) tanto de objetos saudáveis quanto daqueles com demência.[240] Numerous species of tau are present in certain types of samples (for example, blood and / or CSF) from both healthy objects and those with dementia.
Apesar desses muitos alvos potenciais, os anticorpos que podem se ligar a determinadas espécies de tau nessas amostras podem fornecer poder diagnóstico (por exemplo, anticorpos que se ligam a espécies de tau apenas presentes em amostras objetos indivíduos com AD e/ou outras tauopatias ou presentes em amostras daqueles objetos em níveis elevados e/ou distintos) não foram identificados precedentemente.Despite these many potential targets, antibodies that can bind to certain tau species in these samples can provide diagnostic power (for example, antibodies that bind to tau species only present in samples of individuals with AD and / or other tauopathies or gifts in samples of those objects at high and / or distinct levels) have not been previously identified.
Sem ser limitado pela teoria, em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento fornece uma melhoria em relação à técnica devido à sua capacidade de se ligar a um epítopo fosforilado em tau que está presente em certos tipos de amostras (por exemplo, sangue ou CSF) de um paciente com AD em um nível maior do que em uma amostra comparável de um paciente com outra tauopatia, outra doença neurológica ou em um objeto saudável.Without being limited by theory, in some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described in this document provides an improvement over the technique due to its ability to bind to a tau phosphorylated epitope that is present in certain types of samples (for example, blood or CSF) from a patient with AD at a higher level than in a comparable sample from a patient with another tauopathy, another neurological disease or a healthy object.
Esta diferença pode ser usada, em algumas modalidades, para detectar se um objeto que apresenta demência tem AD, outra tauopatia ou outra causa de demência e/ou para monitorar o curso do tratamento de AD.This difference can be used, in some modalities, to detect whether an object that has dementia has AD, another tauopathy or another cause of dementia and / or to monitor the course of AD treatment.
Por exemplo, limites distintos ou diferenças de dobra na quantidade de tau ligada pelo anticorpo (por exemplo, em comparação com os níveis em objetos saudáveis ou em comparação com objetos com causas conhecidas de demência) podem ser detectados e correlacionados com AD, outra tauopatia ou outra causa de demência em um objeto.For example, distinct limits or doubling differences in the amount of tau bound by the antibody (for example, compared to levels in healthy objects or compared to objects with known causes of dementia) can be detected and correlated with AD, another tauopathy or another cause of dementia in an object.
Em algumas modalidades, esta diferença pode ser usada para detectar se um objeto que apresenta demência tem AD ou outra tauopatia.In some modalities, this difference can be used to detect whether an object that has dementia has AD or another tauopathy.
Em algumas modalidades, esta diferença pode ser usada para detectar se um objeto que apresenta demência tem AD ou alguma outra causa de demência.In some modalities, this difference can be used to detect whether an object that has dementia has AD or some other cause of dementia.
Em algumas modalidades, esta diferença pode ser usada para distinguir se um objeto que apresenta demência tem AD ou outra tauopatia. Em algumas modalidades, esta diferença pode ser usada para distinguir se um objeto que apresenta demência tem AD ou alguma outra causa de demência.In some modalities, this difference can be used to distinguish whether an object that has dementia has AD or another tauopathy. In some modalities, this difference can be used to distinguish whether an object that has dementia has AD or some other cause of dementia.
[241] Em várias modalidades, um método para detectar uma tauopatia em um objeto é descrito, compreendendo: obter uma amostra biológica do objeto; contatar a amostra do objeto com uma quantidade eficaz de uma molécula que é capaz de formar um complexo tau-molécula (por exemplo, pelo menos um receptor, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento que é capaz de ligar tau para formar um tau complexo de anticorpo); detectar a presença e/ou quantidade do complexo tau- molécula usando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descrito; em que a presença e/ou quantidade de complexo tau-molécula indica uma tauopatia no objeto. Em várias modalidades, um método para detectar uma tauopatia em um objeto compreende: contatar uma amostra biológica do objeto com uma quantidade eficaz de pelo menos um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento que é capaz de se ligar a tau para formar um complexo tau-anticorpo, em que a presença e/ou quantidade do complexo tau-anticorpo indica uma tauopatia no objeto. Em algumas modalidades, a detecção é por um bioensaio de redução imunomagnética, por exemplo, usando um dispositivo de bioensaio da MagQu Co. Ltd.[241] In several modalities, a method for detecting tauopathy in an object is described, comprising: obtaining a biological sample from the object; contacting the object sample with an effective amount of a molecule that is capable of forming a tau-molecule complex (for example, at least one receptor, antibody or antigen-binding fragment described in this document that is capable of binding tau to form an antibody complex tau); detecting the presence and / or quantity of the tau-molecule complex using an antibody or antigen-binding fragment in the present document; where the presence and / or amount of tau-molecule complex indicates a tauopathy in the object. In several embodiments, a method for detecting tauopathy in an object comprises: contacting a biological sample of the object with an effective amount of at least one antibody or antigen-binding fragment described in this document that is capable of binding to tau to form a tau-antibody complex, in which the presence and / or amount of the tau-antibody complex indicates a tauopathy in the object. In some embodiments, detection is by an immunomagnetic reduction bioassay, for example, using a bioassay device from MagQu Co. Ltd.
[242] Em algumas modalidades, a tau detectada na amostra é uma tau fosforilada. Em várias modalidades, o pelo menos um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 188-227 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 10). Em várias modalidades, o pelo menos um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos[242] In some embodiments, the tau detected in the sample is phosphorylated tau. In several embodiments, the at least one antibody or antigen-binding fragment can bind to a tau epitope comprising one or more of residues 188-227 of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 10). In several embodiments, the at least one antibody or antigen-binding fragment can bind to a tau epitope comprising one or more of the residues
210-221 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 11). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno usados nos métodos compreendem uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.210-221 of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 11). In some embodiments, the antibody or antigen binding fragments used in the methods comprise a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises three determinants of heavy chain complementarity (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
[243] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno usado nos métodos compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 com uma substituição na posição 2, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 com uma substituição em uma ou mais das posições 2 e 12, e/ou HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e/ou em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 com uma substituição na posição 2, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e/ou[243] In certain embodiments, the antibody or antigen binding fragment used in the methods comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises three determinants of heavy chain complementarity. (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with a substitution in position 2, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 with a substitution at one or more of positions 2 and 12, and / or HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and / or where LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 with a substitution in position 2, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and / or
LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em várias modalidades, a substituição na posição 2 em HCDR1 é glicina, a substituição na posição 2 em HCDR2 é isoleucina, a substituição na posição 12 em HCDR2 é valina e/ou a substituição na posição 2 em LCDR1 é asparagina.LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In several embodiments, the substitution at position 2 in HCDR1 is glycine, the substitution at position 2 in HCDR2 is isoleucine, the substitution at position 12 in HCDR2 is valine and / or replacement in position 2 on LCDR1 is asparagine.
[244] Em várias modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende qualquer uma das sequências mostradas na tabela 1, por exemplo, um conjunto de seis CDRs e/ou sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve emparelhadas listadas na Tabela 1.[244] In various embodiments, the antibody or antigen binding fragment comprises any of the sequences shown in Table 1, for example, a set of six paired CDRs and / or paired heavy and light chain variable domain sequences listed in Table 1 .
[245] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno usado nos métodos compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno usado nos métodos descritos pode, em várias modalidades, compreender DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou qualquer uma das variantes no presente documento descritas que são capazes de ligação a tau. Em várias modalidades, o antígeno ou fragmento de ligação ao antígeno adicionalmente compreende um marcador detectável.[245] In certain embodiments, the antibody or antigen binding fragment used in the methods comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO : 7 and the light chain variable region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. The antibody or antigen-binding fragment used in the described methods may, in several embodiments, comprise DC2E7 or an antigen-binding fragment thereof or any of the variants described herein that are capable of binding to tau. In various embodiments, the antigen or antigen-binding fragment further comprises a detectable marker.
[246] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 7 com uma substituição em uma ou mais das posições 1, 2, 3, 9, 12, 19, 30, 31, 35, 37, 42, 43, 48, 49, 51, 54, 55, 56, 58, 62, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 73, 76, 77, 78, 79, 80, 83, 84, 88, 94, 96, 107, 108 e 112, e/ou a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 8 com uma substituição em um ou mais da posição 3, 7, 11, 14, 17, 19, 20, 21, 24, 25, 28, 39, 42, 49, 52, 56, 69, 71, 75, 92, 94, 99, 105 e 106. Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 1 é glicina, na posição 2 é alanina, na posição 3 é arginina, na posição 9 é arginina, na posição 12 é alanina, na posição 19 é arginina, na posição 30 é glicina, na posição 31 é glicina, na posição 35 é arginina, na posição 37 é alanina, na posição 42 é glicina, na posição 43 é metionina, na posição o íon 48 é isoleucina, na posição 49 é treonina, na posição 51 é valina, na posição 54 alanina, na posição 55 é glicina, na posição 56 é serina, na posição 58 é valina, na posição 62 é glicina, na posição 63 é alanina, na posição 64 é selecionada a partir de alanina e ácido glutâmico, na posição 65 é ácido glutâmico, na posição 66 é ácido aspártico, na posição 68 é leucina, na posição 69 é alanina, na posição 70 é treonina, na posição 73 é asparagina, na posição 76 é glutâmico ácido, na posição 77 é serina, na posição 78 é alanina, na posição 79 é metionina, na posição 80 é selecionado de serina, leucina e histidina, na posição 83 é treonina, na posição 84 é alanina, na posição 88 é prolina, na posição 94 é cisteína, na posição 95 é glicina, na posição 107 é alanina, na posição 108 é prolina e/ou na posição 112 é prolina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 3 é arginina, na posição 7 é prolina, na posição 11 é selecionada a partir de serina e leucina, na posição 14 é prolina, na posição 17 é valina, na posição 19 é alanina, na posição 20 é alanina, na posição 21 é valina, na posição 24 é ácido glutâmico, na posição 25 é treonina, na posição 28 asparagina, na posição 39 isoleucina, na posição 42 é selecionada a partir de serina e ácido aspártico, na posição 49 é prolina, na posição 52 é glicina, na posição 56 é prolina, em posição 69 é glicina, na posição 71 é histidina, na posição n 75 é valina, na posição 92 é arginina, na posição 94 é treonina, na posição 99 é serina, na posição 105 é glicina e/ou na posição 106 é valina.[246] In some embodiments, the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 7 with a substitution in one or more of positions 1, 2, 3, 9, 12, 19 , 30, 31, 35, 37, 42, 43, 48, 49, 51, 54, 55, 56, 58, 62, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 73, 76, 77, 78 , 79, 80, 83, 84, 88, 94, 96, 107, 108 and 112, and / or the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 8 with a substitution in one or more of position 3, 7, 11, 14, 17, 19, 20, 21, 24, 25, 28, 39, 42, 49, 52, 56, 69, 71, 75, 92, 94, 99, 105 and 106. In some embodiments, substitution in the variable region of heavy chain in position 1 is glycine, in position 2 is alanine, in position 3 is arginine, in position 9 is arginine, in position 12 is alanine, in position 19 is arginine, position 30 is glycine, position 31 is glycine, position 35 is arginine, position 37 is alanine, position 42 is glycine, position 43 is methionine, position ion 48 is is oleucine, position 49 is threonine, position 51 is valine, position 54 is alanine, position 55 is glycine, position 56 is serine, position 58 is valine, position 62 is glycine, position 63 is alanine, position 64 is selected from alanine and glutamic acid, position 65 is glutamic acid, position 66 is aspartic acid, position 68 is leucine, position 69 is alanine, position 70 is threonine, position 73 is asparagine, in position 76 it is glutamic acid, in position 77 it is serine, in position 78 it is alanine, in position 79 it is methionine, in position 80 it is selected from serine, leucine and histidine, in position 83 it is threonine, in position 84 it is alanine, in position 88 is proline, position 94 is cysteine, position 95 is glycine, position 107 is alanine, position 108 is proline and / or position 112 is proline and / or the substitution in the variable region of light chain in position 3 is arginine, in position 7 is proline, in position 11 is selected from serine and leucine, in position 14 is pro line, position 17 is valine, position 19 is alanine, position 20 is alanine, position 21 is valine, position 24 is glutamic acid, position 25 is threonine, position 28 is asparagine, position 39 isoleucine, position 42 is selected from serine and aspartic acid, position 49 is proline, position 52 is glycine, position 56 is proline, position 69 is glycine, position 71 is histidine, position n 75 is valine, position 92 is arginine, position 94 is threonine, position 99 is serine, position 105 is glycine and / or position 106 is valine.
[247] Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 68 é leucina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 39 é isoleucina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 48 é isoleucina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 30 é glicina e na posição 58 é valina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 7 é prolina e na posição 69 é glicina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é serina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 77 é serina e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina, na posição 20 é alanina e na posição 28 é asparagina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 37 é alanina, na posição 63 é alanina e a posição 80 é serina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 1 é glicina, na posição 3 é arginina, na posição 76 é ácido glutâmico e na posição 77 é serina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina.[247] In several embodiments, substitution in the variable region of heavy chain at position 68 is leucine, and substitution in the variable region of light chain at position 39 is isoleucine. In several embodiments, substitution in the heavy chain variable region at position 48 is isoleucine. In several embodiments, substitution in the variable region of heavy chain at position 30 is glycine and at position 58 is valine, and substitution in the variable region of light chain at position 7 is proline and at position 69 is glycine. In several modalities, the substitution in the variable region of the light chain at position 11 is serine. In several embodiments, substitution in the variable region of heavy chain at position 77 is serine and substitution in the variable region of light chain at position 11 is leucine, at position 20 is alanine and at position 28 is asparagine. In several embodiments, the substitution in the variable region of heavy chain at position 37 is alanine, in position 63 is alanine and position 80 is serine, and the substitution in the variable region of light chain at position 11 is leucine. In several embodiments, the substitution in the variable region of heavy chain at position 1 is glycine, at position 3 is arginine, at position 76 is glutamic acid and at position 77 is serine. In several embodiments, substitution in the variable region of the light chain at position 11 is leucine.
[248] Em várias modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende qualquer uma das sequências mostradas na tabela 1, por exemplo, um conjunto de seis CDRs e/ou sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve emparelhadas listadas na Tabela 1.[248] In several embodiments, the antibody or antigen binding fragment comprises any of the sequences shown in Table 1, for example, a set of six paired CDRs and / or paired heavy and light chain variable domain sequences listed in Table 1 .
[249] Em algumas modalidades, o método compreende o contato de uma amostra biológica de um objeto (por exemplo, sangue ou CSF) com pelo menos um anticorpo de captura e pelo menos um anticorpo de detecção. Em algumas modalidades, mais de um anticorpo de captura e/ou mais de um anticorpo de detecção é usado. Em algumas modalidades, os anticorpos de captura e detecção são os mesmos (por exemplo, ao detectar oligômeros de tau em uma amostra). Em algumas modalidades, um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, um anticorpo de detecção) capaz de formar um complexo tau-anticorpo, e em que a presença do complexo tau- anticorpo é detectada usando um segundo anticorpo anti-tau ou fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, um anticorpo de detecção) no presente documento descrito. Em algumas modalidades, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno se liga a um epítopo diferente em tau do que o primeiro anticorpo.[249] In some embodiments, the method comprises contacting a biological sample of an object (for example, blood or CSF) with at least one capture antibody and at least one detection antibody. In some embodiments, more than one capture antibody and / or more than one detection antibody is used. In some embodiments, the capture and detection antibodies are the same (for example, when detecting tau oligomers in a sample). In some embodiments, a first antibody or antigen-binding fragment (for example, a detection antibody) capable of forming a tau-antibody complex, and in which the presence of the tau-antibody complex is detected using a second anti-tau antibody or antigen-binding fragment (for example, a detection antibody) in the present described document. In some embodiments, the second antibody or antigen-binding fragment binds a different epitope in tau than the first antibody.
[250] Em algumas modalidades, o primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 188-227 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 10) ou um ou mais dos resíduos 210-221 de proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 11). O epítopo pode compreender pelo menos um resíduo fosforilado na posição 217 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) e, opcionalmente, também pode compreender uma serina fosforilada na posição 210, treonina na posição 212, serina na posição 214 ou treonina na posição 220 da proteína tau 2N4R ou qualquer combinação das mesmas. Em certas modalidades, o epítopo em tau compreende ou consiste em SRTPSLPpTPPTR (SEQ ID NO: 12). Em certas modalidades, o epítopo em tau compreende ou consiste em SRpTPSLPpTPPTR (SEQ ID NO 31). Em algumas modalidades, o primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, o primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, o primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende o anticorpo DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.[250] In some embodiments, the first antibody or antigen-binding fragment may bind to a tau epitope comprising one or more of the 188-227 residues of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 10) or one or more of the residues 210-221 of 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 11). The epitope may comprise at least one phosphorylated residue at position 217 of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 9) and, optionally, may also comprise a phosphorylated serine at position 210, threonine at position 212, serine at position 214 or threonine at position 220 of the 2N4R tau protein or any combination thereof. In certain embodiments, the tau epitope comprises or consists of SRTPSLPpTPPTR (SEQ ID NO: 12). In certain embodiments, the tau epitope comprises or consists of SRpTPSLPpTPPTR (SEQ ID NO 31). In some embodiments, the first antibody or antigen binding fragment comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises three heavy chain complementarity determining regions (HCDR1, HCDR2 and HCDR3) and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and where LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In certain embodiments, the first antibody or The antigen binding fragment comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and the light chain variable region comprises a sequence of amino acids of SEQ ID NO: 8. In one embodiment, the first antibody or antigen-binding fragment comprises the DC2E7 antibody or an antigen-binding fragment thereof.
[251] Em outra modalidade, o primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.[251] In another embodiment, the first antibody or antigen binding fragment comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises three heavy chain complementarity determining regions (HCDR1 , HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, HCDR2 comprises the sequence of amino acids of SEQ ID NO: 24 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; and where LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28. In some embodiments, the variable region of The heavy chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 29 and the variable region of the light chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.
[252] Em várias modalidades, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 151 a 188 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 13). Em algumas modalidades, o epítopo compreende um ou mais dos resíduos 163-172 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 14). Em certas modalidades, um ou mais dos resíduos no epítopo são fosforilados, por exemplo, uma treonina fosforilada na posição 169 da proteína tau 2N4R. Em algumas modalidades, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Em certas modalidades, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. Em uma modalidade, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende o anticorpo DC2E2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.[252] In several embodiments, the second antibody or antigen-binding fragment can bind to a tau epitope comprising one or more of residues 151 to 188 of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 13). In some embodiments, the epitope comprises one or more of residues 163-172 of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 14). In certain embodiments, one or more of the residues in the epitope are phosphorylated, for example, a phosphorylated threonine at position 169 of the 2N4R tau protein. In some embodiments, the second antibody or antigen binding fragment comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises three heavy chain complementarity determining regions (HCDR1, HCDR2 and HCDR3) and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. In certain embodiments, the second antibody or The antigen binding fragment comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and the light chain variable region comprises a sequence of amino acids of SEQ ID NO: 22. In one embodiment, the second antibody or antigen-binding fragment comprises the DC2E2 antibody or an antigen-binding fragment thereof.
[253] Em outras modalidades, o primeiro e o segundo anticorpos são invertidos e/ou mais de um primeiro e segundo anticorpos são usados (que podem ser os mesmos ou diferentes).[253] In other embodiments, the first and second antibodies are inverted and / or more than one first and second antibodies are used (which can be the same or different).
[254] Em algumas das modalidades reversas, o primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 151 a 188 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 13). Em algumas modalidades, o epítopo compreende um ou mais dos resíduos 163-172 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 14). Em certas modalidades, um ou mais dos resíduos no epítopo são fosforilados, por exemplo, uma treonina fosforilada na posição 169 da proteína tau 2N4R. Em algumas modalidades, o primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende qualquer uma das sequências mostradas na tabela 1, por exemplo, um conjunto de seis CDRs e/ou sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve emparelhadas listadas na Tabela 1.[254] In some of the reverse modalities, the first antibody or antigen binding fragment can bind to a tau epitope comprising one or more of residues 151 to 188 of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 13). In some embodiments, the epitope comprises one or more of residues 163-172 of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 14). In certain embodiments, one or more of the residues in the epitope are phosphorylated, for example, a phosphorylated threonine at position 169 of the 2N4R tau protein. In some embodiments, the first antibody or antigen binding fragment comprises any of the sequences shown in Table 1, for example, a set of six paired CDRs and / or paired heavy and light chain variable domain sequences listed in Table 1.
[255] Em algumas modalidades, o primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Em uma modalidade, o f O primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. Em uma modalidade, o primeiro anticorpo ou antígeno o fragmento de ligação compreende o anticorpo DC2E2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.[255] In some embodiments, the first antibody or antigen binding fragment comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises three heavy chain complementarity determining regions (HCDR1 , HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, HCDR2 comprises the sequence of amino acids of SEQ ID NO: 16 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; and where LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. In one embodiment, of the first antibody or antigen-binding fragment comprises a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. In one embodiment, the first antibody or antigen the binding fragment comprises the DC2E2 antibody or an antigen binding fragment thereof.
[256] Em algumas das modalidades reversas, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 188-227 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 10) ou um ou mais dos resíduos 210 - 221 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 11). O epítopo ligado ao segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode compreender pelo menos um resíduo fosforilado na posição 217 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9). Em algumas modalidades, o epítopo também compreende uma serina fosforilada na posição 210, treonina na posição 212, serina na posição 214 ou treonina na posição 220 da proteína tau 2N4R ou qualquer combinação das mesmas. Em certas modalidades, o segundo anticorpo pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo SRTPSLPpTPPTR (SEQ ID NO: 12). Em algumas modalidades, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende qualquer uma das sequências mostradas na tabela 1, por exemplo, um conjunto de seis CDRs e/ou sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve emparelhadas listadas na Tabela 1.[256] In some of the reverse modalities, the second antibody or antigen-binding fragment can bind to a tau epitope comprising one or more of the 188-227 residues of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 10) or one or more of residues 210 - 221 of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 11). The epitope attached to the second antibody or antigen binding fragment can comprise at least one phosphorylated residue at position 217 of the 2N4R tau protein (SEQ ID NO: 9). In some embodiments, the epitope also comprises a phosphorylated serine at position 210, threonine at position 212, serine at position 214 or threonine at position 220 of the 2N4R tau protein or any combination thereof. In certain embodiments, the second antibody can bind to a tau epitope comprising SRTPSLPpTPPTR (SEQ ID NO: 12). In some embodiments, the second antibody or antigen-binding fragment comprises any of the sequences shown in Table 1, for example, a set of six paired CDRs and / or paired heavy and light chain variable domain sequences listed in Table 1.
[257] Em algumas modalidades, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende o anticorpo DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.[257] In some embodiments, the second antibody or antigen binding fragment comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises three determining regions for heavy chain complementarity (HCDR1 , HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprises the sequence of amino acids of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and where LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In certain embodiments, the second antibody or The antigen binding fragment comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and the light chain variable region comprises a sequence of amino acids of SEQ ID NO: 8. In one embodiment, the second antibody or antigen-binding fragment comprises the DC2E7 antibody or an antigen-binding fragment thereof.
[258] Em várias modalidades, o primeiro ou segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é ligado e/ou revestido em uma superfície sólida ou partícula. A superfície sólida pode ser a superfície de uma placa de microtitulação. Uma placa de microtitulação ou placa de múltiplos poços tipicamente tem, por exemplo, 6, 12, 24, 48, 96, 384 ou 1536 ou mais poços de amostra dispostos em uma matriz retangular 2: 3. Cada poço normalmente contém algo entre dezenas de nanolitros e vários mililitros de líquido. Se uma partícula sólida for usada no lugar ou em adição a uma superfície sólida, pode ser uma esfera. A partícula pode ser uma esfera magnética. A esfera pode ser um leito de polímero sintético ou plástico que compreende: polietileno, polipropileno, poliestireno, poliamida, poliuretano, polímero fenólico,[258] In several embodiments, the first or second antibody or antigen-binding fragment is bound and / or coated on a solid surface or particle. The solid surface can be the surface of a microtiter plate. A microtiter plate or multi-well plate typically has, for example, 6, 12, 24, 48, 96, 384 or 1536 or more sample wells arranged in a 2: 3 rectangular matrix. Each well typically contains somewhere between dozens of nanoliters and several milliliters of liquid. If a solid particle is used in place or in addition to a solid surface, it can be a sphere. The particle can be a magnetic sphere. The sphere may be a bed of synthetic or plastic polymer comprising: polyethylene, polypropylene, polystyrene, polyamide, polyurethane, phenolic polymer,
nitrocelulose, polímero derivado naturalmente, borracha de látex, polissacarídeo, polipeptídeo, material compósito, cerâmica, sílica ou material à base de sílica, carbono, metal ou composto de metal, ouro, prata, aço, alumínio, cobre, vidro inorgânico ou material de sílica ou uma combinação dos mesmos. A esfera pode ter uma forma esférica, de disco, anel ou similar a um cubo.nitrocellulose, naturally derived polymer, latex rubber, polysaccharide, polypeptide, composite material, ceramic, silica or silica-based material, carbon, metal or metal compound, gold, silver, steel, aluminum, copper, inorganic glass or silica or a combination thereof. The sphere may have a spherical, disk, ring or cube-like shape.
[259] Em certas modalidades, o primeiro e/ou segundo anticorpo é conjugado a um marcador detectável. O marcador pode compreender uma enzima, um radioisótopo, biotina, um marcador de ressonância magnética nuclear, um metal pesado ou uma combinação dos mesmos. O método pode ainda compreender a detecção de um sinal do marcador detectável. Em uma modalidade, a detecção do marcador é conseguida pela detecção de um sinal fluorescente ou da intensidade desse sinal de um anticorpo marcado após a ligação a tau. Em algumas modalidades, o marcador detectável é biotina e é detectado pelo contato da amostra com estreptavidina conjugada a uma enzima, de preferência peroxidase de rábano, fosfatase alcalina ou β-galactosidase.[259] In certain embodiments, the first and / or second antibody is conjugated to a detectable marker. The marker may comprise an enzyme, a radioisotope, biotin, a nuclear magnetic resonance marker, a heavy metal, or a combination thereof. The method may further comprise detecting a detectable marker signal. In one embodiment, detection of the marker is achieved by detecting a fluorescent signal or the intensity of that signal from a labeled antibody after binding to tau. In some embodiments, the detectable marker is biotin and is detected by contacting the sample with streptavidin conjugated to an enzyme, preferably horseradish peroxidase, alkaline phosphatase or β-galactosidase.
[260] Em certas modalidades, os métodos de detecção de tau no presente documento descritos compreendem um ensaio ELISA clássico/convencional (isto é, sistemas de leitura analógica). Adicionalmente ou alternativamente, os métodos podem compreender um ELISA digital (isto é, sistemas de leitura digital que permitem que as concentrações sejam determinadas digitalmente, em vez da medição do sinal analógico total até um único imunocomplexo, embora, em algumas concentrações, esses métodos também possam ser usados para ler sinais analógicos). Vide Rissin, D.M., et al., Single- molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol., 2010. 28(6), 555-[260] In certain embodiments, the methods for detecting tau described herein comprise a classic / conventional ELISA assay (ie, analog reading systems). In addition or alternatively, the methods may comprise a digital ELISA (that is, digital reading systems that allow concentrations to be determined digitally, instead of measuring the total analog signal to a single immunocomplex, although, in some concentrations, these methods also can be used to read analog signals). See Rissin, D.M., et al., Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol., 2010. 28 (6), 555-
559. Por exemplo, uma matriz de molécula única (simoa) pode ser usada, que é um ELISA digital em que, após a formação de um complexo sanduíche em microesferas magnéticas, as contas são transferidas, em solução de substrato, para uma matriz de micropoços, por exemplo, micropoços do tamanho de um femtolitro. Em algumas modalidades, esses poços acomodam apenas uma esfera cada. Em algumas modalidades, após a adição de um substrato fluorogênico para a enzima com a qual o anticorpo de detecção é rotulado, um filme de óleo é então aplicado para selar os poços em um pequeno volume, por exemplo, confinando o volume da reação a 50 fL. Em algumas modalidades, este pequeno volume permite que um sinal legível seja detectado mesmo se apenas um complexo sanduíche estiver presente na esfera. Como repórter, a enzima β-galactosidase e o substrato resorufina-β-D-galactopiranosídeo podem ser usados e os poços com um sinal detectável são contados, assim como todos os poços contendo uma esfera. A razão entre essas contagens pode fornecer uma produção enzimática média por esfera (AEB). Quando a AEB é baixa (<0,1), a estatística de Poisson pode ser usada para mostrar que uma das esferas tem apenas um ou menos complexos em sua superfície. Quando o sinal AEB fica mais alto, aumentando a probabilidade de mais de um complexo por esfera, uma transição para cálculos de intensidade de luz pode ser usada, o que permite uma AEB utilizável mesmo em sinais > 0,1. O algoritmo para a transição pode ser implementado usando software para um instrumento Simoa, por exemplo, software que faz a amostragem e calibra, por exemplo, a partir de uma placa de microtitulação de 96 poços ou frascos separados.559. For example, a single molecule matrix (simoa) can be used, which is a digital ELISA in which, after the formation of a sandwich complex in magnetic microspheres, the beads are transferred, in substrate solution, to a matrix of microwells, for example, microwells the size of a femtoliter. In some modalities, these wells accommodate only one sphere each. In some embodiments, after adding a fluorogenic substrate for the enzyme with which the detection antibody is labeled, an oil film is then applied to seal the wells in a small volume, for example, by confining the reaction volume to 50 fL. In some embodiments, this small volume allows a readable signal to be detected even if only one sandwich complex is present in the sphere. As a reporter, the enzyme β-galactosidase and the substrate resorufin-β-D-galactopyranoside can be used and wells with a detectable signal are counted, as well as all wells containing a sphere. The ratio between these counts can provide an average enzyme production per bead (AEB). When AEB is low (<0.1), the Poisson statistic can be used to show that one of the spheres has only one or less complexes on its surface. When the AEB signal gets higher, increasing the probability of more than one complex per sphere, a transition to light intensity calculations can be used, which allows an AEB to be used even on signals> 0.1. The transition algorithm can be implemented using software for a Simoa instrument, for example, software that samples and calibrates, for example, from a 96 well microtiter plate or separate flasks.
[261] Outros imunoensaios são conhecidos na técnica e podem ser usados com os anticorpos descritos e anticorpos marcados para detectar tau fosforilada em uma amostra. Por exemplo, uma plataforma de contagem de molécula única (SMC) pode ser usada, por exemplo, aquela em que os anticorpos com e sem marcadores fluorescentes formam complexos sanduíche com tau, seja em esferas ou placas, os complexos são então quebrados e as moléculas de fluorescência anticorpos de detecção marcados (por exemplo, Alexa Fluor) são puxados para um tubo capilar e contados à medida que passam por um feixe de laser que excita o fluoróforo. Um evento digital pode ser contado se a fluorescência ultrapassar um limite de fundo. Em concentrações mais altas, a soma total de todos os fótons emitidos pode ser usada como leitura do sinal, permitindo uma alta faixa dinâmica. Em algumas modalidades, a detecção é por contagem de molécula única, por exemplo, usando um dispositivo de contagem de molécula única da Merck Millipore (desenvolvido pela Singulex). Outro imunoensaio de alta sensibilidade que pode ser usado envolve anexar nanopartículas magnéticas a um anticorpo no presente documento descrito e detectar uma alteração na oscilação das nanopartículas em um campo magnético alternado de uma maneira dependente da concentração após a ligação ao analito, por exemplo, detecção de redução imunomagnética (IMR). Em algumas modalidades, a detecção é por um bioensaio de redução imunomagnética, por exemplo, usando bioensaio da MagQu Co. Ltd.[261] Other immunoassays are known in the art and can be used with the described antibodies and labeled antibodies to detect phosphorylated tau in a sample. For example, a single molecule counting platform (SMC) can be used, for example, one in which antibodies with and without fluorescent markers form sandwich complexes with tau, either in spheres or plates, the complexes are then broken down and the molecules fluorescence labeled detection antibodies (for example, Alexa Fluor) are pulled into a capillary tube and counted as they pass through a laser beam that excites the fluorophore. A digital event can be counted if the fluorescence exceeds a background limit. At higher concentrations, the sum total of all emitted photons can be used as a signal reading, allowing a high dynamic range. In some embodiments, detection is by single molecule counting, for example, using a Merck Millipore single molecule counting device (developed by Singulex). Another highly sensitive immunoassay that can be used involves attaching magnetic nanoparticles to an antibody in this document and detecting a change in the oscillation of the nanoparticles in an alternating magnetic field in a concentration-dependent manner after binding to the analyte, for example, detection of immunomagnetic reduction (IMR). In some embodiments, detection is by an immunomagnetic reduction bioassay, for example, using a bioassay from MagQu Co. Ltd.
[262] Em várias modalidades, uma amostra pode ser diluída antes de ser contatada com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em certas situações, os antígenos circulantes podem ser mascarados por anticorpos naturalmente existentes contra os antígenos que também circulam no sangue. A proteína p24 do HIV é um exemplo bem conhecido. Além disso, complexos tau/anticorpo anti-tau naturalmente existentes foram relatados na literatura. Wu J, Li L. Autoantibodies in Alzheimer’s disease: potential biomarkers, pathogenic roles, and therapeutic implications. Journal of Biomedical Research. 2016;30(5):361 a 372. A presença desses complexos pode interferir com os ensaios de detecção no presente documento descritos. Por conseguinte, em várias modalidades, a amostra pode ser submetida à dissociação de complexo imune (ICD) (por exemplo, dissociação do complexo tau-anticorpo/tau-molécula naturalmente existente na amostra de modo que tau não esteja mais ligada ao anticorpo/molécula naturalmente existente e é, portanto, livre para ser detectado pelos métodos da invenção) antes de ser contatado com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção. Em algumas modalidades, a dissociação de imunocomplexos é obtida aplicando calor e/ou ácido à amostra ou qualquer outro método conhecido de obtenção de ICD.[262] In several embodiments, a sample can be diluted before being contacted with an antibody or antigen-binding fragment. In certain situations, circulating antigens can be masked by naturally occurring antibodies against antigens that also circulate in the blood. The HIV p24 protein is a well-known example. In addition, naturally existing tau / anti-tau antibody complexes have been reported in the literature. Wu J, Li L. Autoantibodies in Alzheimer’s disease: potential biomarkers, pathogenic roles, and therapeutic implications. Journal of Biomedical Research. 2016; 30 (5): 361 to 372. The presence of these complexes may interfere with the detection tests described in this document. Therefore, in several modalities, the sample can be subjected to immune complex dissociation (ICD) (for example, dissociation of the tau-antibody / tau-molecule complex naturally found in the sample so that tau is no longer bound to the antibody / molecule it naturally exists and is therefore free to be detected by the methods of the invention) before being contacted with an antibody or antigen-binding fragment of the invention. In some embodiments, the dissociation of immune complexes is achieved by applying heat and / or acid to the sample or any other known method of obtaining ICD.
[263] Em qualquer uma das modalidades precedentes, a amostra biológica pode compreender fluido cerebroespinhal (CSF). O CSF pode ser obtido de um paciente, por exemplo, por uma punção lombar realizada em um ambiente médico. Alternativamente, a amostra biológica pode compreender plasma sanguíneo e/ou soro.[263] In any of the preceding modalities, the biological sample may comprise cerebrospinal fluid (CSF). The CSF can be obtained from a patient, for example, by a lumbar puncture performed in a medical setting. Alternatively, the biological sample can comprise blood plasma and / or serum.
[264] Em várias modalidades, os métodos descritos no presente documento detectam a presença e/ou quantidade de uma tau fosforilada em uma amostra, que é comparada com a quantidade de tau fosforilada na amostra ao nível em uma amostra de controle de um indivíduo saudável, e em que um aumento no nível de tau fosforilada na amostra em relação ao controle indica uma tauopatia. Em outra modalidade, a tauopatia detectada é a doença de Alzheimer. Em certas modalidades, um aumento no nível de tau fosforilada em uma amostra de um objeto sobre uma amostra de um controle saudável e/ou um paciente com uma amostra de tauopatia não AD conhecida indica que o objeto tem doença de Alzheimer em vez de outra tauopatia ou outra causa de demência.[264] In various modalities, the methods described in this document detect the presence and / or amount of a phosphorylated tau in a sample, which is compared with the amount of phosphorylated tau in the sample at the level in a control sample of a healthy individual , and in which an increase in the level of phosphorylated tau in the sample in relation to the control indicates a tauopathy. In another modality, the detected tauopathy is Alzheimer's disease. In certain embodiments, an increase in the level of phosphorylated tau in a sample of an object over a sample of a healthy control and / or a patient with a known non-AD sample of tauopathy indicates that the object has Alzheimer's disease instead of another tauopathy or another cause of dementia.
[265] Por exemplo, a 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 ou mais desdobramentos no nível de tau detectado por um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (ou qualquer aumento no meio) em uma amostra de um objeto com demência em comparação ao nível em uma amostra de controle de um objeto saudável pode indicar a presença de AD ou outra tauopatia.[265] For example, at 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4 , 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 or more developments at the level of tau detected by an antibody or antigen-binding fragment ( or any increase in the middle) in a sample of an object with dementia compared to the level in a control sample of a healthy object can indicate the presence of AD or other tauopathy.
Em algumas modalidades, o aumento de desdobramentos está entre cerca de 1 a 100 vezes ou cerca de 2-3 vezes.In some embodiments, the increase in splits is between about 1 to 100 times or about 2-3 times.
Em algumas modalidades, o aumento de desdobramento é entre cerca de 1 a 50, 1 a 25, 1 a 10 ou 1 a 5 vezes.In some embodiments, the spread increase is between about 1 to 50, 1 to 25, 1 to 10 or 1 to 5 times.
Em algumas modalidades, um nível de tau ligada em uma amostra de um objeto com demência maior do que um limite (por exemplo, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 9,3 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ou 1000 pg/ml, ou qualquer valor entre) observado em uma amostra de controle de um objeto saudável pode indicar a presença de AD ou outra tauopatia.In some embodiments, a level of tau bound in a sample of an object with dementia greater than a threshold (for example, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 9.3 10, 11, 12, 13, 14 , 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 200 , 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 or 1000 pg / ml, or any value in between) observed in a control sample of an object healthy can indicate the presence of AD or other tauopathy.
Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 9,3 pg/ml de tau.In some embodiments, the limit is about 9.3 pg / ml of tau.
Em algumas modalidades, o limite é qualquer valor entre 0,93 e 93 pg/ml de tau.In some embodiments, the limit is any value between 0.93 and 93 pg / ml of tau.
Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 5,37 pg/ml.In some embodiments, the limit is about 5.37 pg / ml.
Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 305 pg/ml.In some embodiments, the limit is around 305 pg / ml.
Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 100-600 pg/ml.In some embodiments, the limit is around 100-600 pg / ml.
Em algumas modalidades, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, ou mais de aumento desdobramento no nível de tau detectado por um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (ou qualquer aumento no meio) em uma amostra de um objeto com demência em comparação com o nível em um controle amostra de um paciente com uma tauopatia conhecida diferente de AD (por exemplo, FTD, CBD ou PSP), ou uma amostra de controle de um paciente com outra forma de demência, pode indicar a presença de AD no objeto com demência.In some embodiments, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, or more of an increase in the level of tau detected by an antibody or antigen-binding fragment (or any increase in middle) in a sample of an object with dementia compared to the level in a control sample from a patient with a known tauopathy other than AD (for example, FTD, CBD or PSP), or a control sample from a patient with another form of dementia, can indicate the presence of AD in the object with dementia.
Em algumas modalidades, o aumento de desdobramento é entre cerca de 1 a 100 vezes, ou cerca de 1 a 50 vezes, ou cerca de 1 a 25 vezes, ou cerca de 1 a 5 vezes, ou cerca de 2-3 vezes. Em algumas modalidades, um nível de tau ligada em uma amostra de um objeto com demência maior do que um limite (por exemplo, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 9,3, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ou 1000 pg/ml, ou qualquer valor intermediário) observado em uma amostra de controle de um paciente com uma tauopatia conhecida diferente de AD (por exemplo, FTD, CBD ou PSP), ou uma amostra de controle de um paciente com outra forma de demência, pode indicar a presença de AD no objeto com demência. Em várias modalidades, o nível de tau detectado pela ligação do anticorpo é quantificado usando métodos de rotina, por exemplo, medindo a intensidade de fluorescência, por Western blot, espectrometria de massa, ELISA clássico, ELISA digital ou outros métodos conhecidos pelo versado na técnica.In some embodiments, the spread increase is between about 1 to 100 times, or about 1 to 50 times, or about 1 to 25 times, or about 1 to 5 times, or about 2-3 times. In some embodiments, a level of tau bound in a sample of an object with dementia greater than a threshold (for example, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 9.3, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 or 1000 pg / ml, or any intermediate value) observed in a control sample from a patient with a known tauopathy other than AD (for example, FTD, CBD or PSP), or a control sample from a patient with another form of dementia, may indicate the presence of AD in the object with dementia. In various modalities, the level of tau detected by antibody binding is quantified using routine methods, for example, by measuring fluorescence intensity, by Western blot, mass spectrometry, classic ELISA, digital ELISA or other methods known to the person skilled in the art .
[266] Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 0,1 a 10 pg/ml quando o ensaio de detecção é calibrado usando uma proteína tau fosforilada, isto é, uma proteína tau de comprimento total compreendendo uma ou mais posições fosforiladas. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 100-600 pg/ml quando o ensaio de detecção é calibrado usando um peptídeo sintético 2E7 (2E7pep) com a seguinte sequência: GQKGQANATRIPAKGGGSGGGSGGGSSRTPSLPpTPPTREPK.[266] In some embodiments, the limit is about 0.1 to 10 pg / ml when the detection assay is calibrated using a phosphorylated tau protein, that is, a full length tau protein comprising one or more phosphorylated positions. In some embodiments, the limit is around 100-600 pg / ml when the detection assay is calibrated using a synthetic peptide 2E7 (2E7pep) with the following sequence: GQKGQANATRIPAKGGGSGGGSGGGSSRTPSLPpTPPTREPK.
[267] Em várias modalidades, é descrito um método para distinguir a doença de Alzheimer de outra tauopatia ou outra causa de demência em um objeto, compreendendo: obter uma amostra biológica do objeto; contatar a amostra do objeto com uma quantidade eficaz de uma molécula que é capaz de formar um complexo tau- molécula (por exemplo, pelo menos um receptor, ou anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno descrito hererin que é capaz de ligar tau para formar uma tau -complexo de anticorpos); detectar a presença e/ou quantidade do complexo tau-molécula usando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descrito; em que a presença e/ou um nível elevado de tau fosforilada ligada à molécula na amostra em relação ao nível em uma amostra de um objeto de controle saudável e/ou em relação ao nível em uma amostra de um objeto com uma tauopatia conhecida diferente de AD (por exemplo, FTD, CBD ou PSP) indica que o objeto tem doença de Alzheimer em vez de outra tauopatia ou uma causa alternativa de demência. Em várias modalidades, o objeto com Demência frontotemporal (FTD) pode ter Afasia Progressiva Primária Agramática/Não Fluente (nfPPA), Afasia Progressiva Primária Variante Semântica (svPPA), Demência Frontotemporal Variante Comportamental (bvFTD) ou Esclerose Lateral Amiotemporal (ALSclerose Frontotemporal)/FTD).[267] In several modalities, a method is described to distinguish Alzheimer's disease from another tauopathy or another cause of dementia in an object, comprising: obtaining a biological sample from the object; contacting the object sample with an effective amount of a molecule that is capable of forming a tau- molecule complex (eg, at least one receptor, or antibody, or antigen-binding fragment described hererin that is capable of binding tau to form a tau-antibody complex); detecting the presence and / or amount of the tau-molecule complex using an antibody or antigen-binding fragment in the present document; where the presence and / or a high level of phosphorylated tau bound to the molecule in the sample in relation to the level in a sample of a healthy control object and / or in relation to the level in a sample of an object with a known tauopathy other than AD (for example, FTD, CBD or PSP) indicates that the object has Alzheimer's disease instead of another tauopathy or an alternative cause of dementia. In several modalities, the object with Frontotemporal Dementia (FTD) may have Agrammatic / Non-Fluent Primary Progressive Aphasia (nfPPA), Semantic Variant Primary Progressive Aphasia (svPPA), Frontotemporal Variant Behavioral Dementia (bvFTD) or Amyotremporal Lateral Sclerosis (Frontotemporal ALSclerosis) / FTD).
[268] Em várias modalidades, é descrito um método para distinguir a doença de Alzheimer de outra tauopatia ou outra causa de demência em um objeto, compreendendo: obter um fluido cerebroespinhal ou amostra de sangue de um objeto; contatar a amostra com um anticorpo anti-tau ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo no presente documento descrito; e detectar a presença e/ou quantidade do complexo tau-anticorpo usando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descrito, em que a presença e/ou um nível elevado de tau fosforilada ligada ao anticorpo na amostra em relação ao nível em uma amostra de um objeto de controle saudável e/ou em relação ao nível em uma amostra de um objeto com uma tauopatia conhecida diferente de AD (por exemplo, FTD, CBD ou PSP) indica que o objeto tem doença de Alzheimer em vez de outra tauopatia ou outra forma de demência.[268] In several modalities, a method is described to distinguish Alzheimer's disease from another tauopathy or another cause of dementia in an object, comprising: obtaining a cerebrospinal fluid or blood sample from an object; contacting the sample with an anti-tau antibody or antigen-binding fragment thereof in this document described; and detecting the presence and / or amount of the tau-antibody complex using an antibody or antigen-binding fragment in the present document, wherein the presence and / or a high level of phosphorylated tau bound to the antibody in the sample relative to the level in a sample of a healthy control object and / or relative to the level in a sample of an object with a known tauopathy other than AD (for example, FTD, CBD or PSP) indicates that the object has Alzheimer's disease instead of another tauopathy or other form of dementia.
Em algumas modalidades, o método usa um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é capaz de se ligar a tau fosforilada para formar um complexo tau fosforilada-anticorpo; e detectar a presença e/ou quantidade de tau fosforilada complexada com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno na amostra, em que a presença e/ou um nível elevado de tau fosforilada na amostra em relação ao nível em uma amostra de um objeto de controle saudável indica que o objeto tem doença de Alzheimer em vez de outra tauopatia ou uma causa alternativa de demência.In some embodiments, the method uses an antibody or antigen binding fragment comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises three determinants of heavy chain complementarity (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, wherein the antibody or binding fragment to the antigen it is able to bind phosphorylated tau to form a phosphorylated tau-antibody complex; and detecting the presence and / or amount of phosphorylated tau complexed with the antibody or antigen binding fragment in the sample, where the presence and / or a high level of phosphorylated tau in the sample relative to the level in a sample of an object of healthy control indicates that the object has Alzheimer's disease instead of another tauopathy or an alternative cause of dementia.
Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende um aminoácido sequência de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação compreende o anticorpo DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.In certain embodiments, the antibody or antigen binding fragment comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and the variable region The light chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In one embodiment, the antibody or binding fragment comprises the DC2E7 antibody or an antigen binding fragment thereof.
[269] Em várias modalidades, o complexo anticorpo-tau é detectado com um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a tau. Em algumas modalidades, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Em certas modalidades, o segundo anticorpo ou O fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. Em várias modalidades, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende o anticorpo DC2E2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, os anticorpos de detecção e captura são invertidos.[269] In several embodiments, the antibody-tau complex is detected with a second antibody or antigen-binding fragment capable of binding to tau. In some embodiments, the second antibody or antigen binding fragment comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises three heavy chain complementarity determining regions (HCDR1, HCDR2 and HCDR3) and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. In certain embodiments, the second antibody or The antigen-binding fragment comprises a variable region of heavy chain comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and a variable region of light chain comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. In several embodiments, the second antibody or antigen binding fragment comprises the DC2E2 antibody or an antigen binding fragment thereof. In some embodiments, the detection and capture antibodies are reversed.
[270] Em várias modalidades, um método para tratamento é descrito, compreendendo a administração de um agente terapêutico para a doença de Alzheimer a um objeto que sofre da doença de Alzheimer, em que o objeto foi identificado como portador da doença de Alzheimer de acordo com qualquer um dos métodos precedentes. O tratamento pode compreender a administração de um anticorpo, peptídeo terapêutico ou molécula pequena que trata a AD, por exemplo, qualquer um dos tratamentos no presente documento mencionados. Em várias modalidades, os agentes terapêuticos podem incluir um ou mais dos anticorpos ou peptídeos terapêuticos descritos na Patente U.S. No. 9.518.101 e/ou WO 2016/079597, que são no presente documento incorporados por referência em sua totalidade. Em certas modalidades, o agente terapêutico pode ser o anticorpo DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e/ou DC2E2, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em uma modalidade, o agente terapêutico pode ser um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao mesmo epítopo que DC2E7 e/ou DC2E2.[270] In several embodiments, a method for treatment is described, comprising administering a therapeutic agent for Alzheimer's disease to an object suffering from Alzheimer's disease, in which the object has been identified as having Alzheimer's disease according to with any of the preceding methods. The treatment may comprise the administration of an antibody, therapeutic peptide or small molecule that treats AD, for example, any of the treatments mentioned herein. In various embodiments, therapeutic agents can include one or more of the therapeutic antibodies or peptides described in U.S. Patent No. 9,518,101 and / or WO 2016/079597, which are hereby incorporated by reference in their entirety. In certain embodiments, the therapeutic agent may be the DC2E7 antibody or an antigen-binding fragment thereof and / or DC2E2, or an antigen-binding fragment thereof. In one embodiment, the therapeutic agent can be an antibody or antigen-binding fragment of the same that binds to the same epitope as DC2E7 and / or DC2E2.
[271] Também são descritos no presente documento, em certas modalidades, os usos dos anticorpos descritos e fragmentos de ligação ao antígeno conjugados com marcadores detectáveis (por exemplo, marcadores radioativos) que podem ser administrados (por exemplo, por via intravenosa) a um objeto para detectar o padrão de tau fosforilada em o cérebro e, assim, diagnosticar AD ou outra tauopatia.[271] The uses of the described antibodies and antigen-binding fragments conjugated to detectable markers (eg, radioactive markers) that can be administered (eg, intravenously) to a object to detect the pattern of phosphorylated tau in the brain and thus diagnose AD or other tauopathy.
[272] Em várias modalidades, um método para detectar a doença de Alzheimer ou outra tauopatia em um objeto humano é descrito, compreendendo administrar ao objeto o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento conjugado a um marcador detectável, como um radioisótopo e detectar um sinal de o radioisótopo ou outro marcador detectável no cérebro do paciente, em que a detecção de um sinal indica que o objeto tem doença de Alzheimer ou outra tauopatia. Em algumas modalidades, a distribuição do cérebro das espécies de tau ligadas pelos anticorpos descritos e fragmentos de ligação ao antígeno conjugados com marcadores detectáveis podem ser usados para determinar se um objeto tem AD ou outra tauopatia. Por exemplo, a ligação do anticorpo pode diferir na AD (onde a espécie tau pode ser mais proeminente no hipocampo CA1) em comparação com outras tauopatias, como FTD - doença de Pick (onde a espécie tau pode ser mais proeminente no giro dentado, e, em alguma extensão, hipocampo), CBD (onde a espécie tau pode ser mais proeminente no núcleo caudatus) e PSP (onde a espécie tau pode ser mais proeminente no putâmen/núcleo caudatus). Em algumas modalidades, um objeto é administrado com um anticorpo e fragmento de ligação ao antígeno conjugado a um marcador detectável (por exemplo, via administração intravenosa) e, em seguida, seu cérebro é fotografado (por exemplo, via PET) para gerar um mapa de tau ligado pelo anticorpo marcado e fragmento de ligação ao antígeno no cérebro. O mapa pode ser analisado contra mapas conhecidos de AD e outras tauopatias para determinar se o paciente tem AD ou outra tauopatia.[272] In several embodiments, a method for detecting Alzheimer's disease or other tauopathy in a human object is described, comprising administering to the object the antibody or antigen-binding fragment described herein conjugated to a detectable marker, such as a radioisotope and detecting a signal from the radioisotope or other detectable marker in the patient's brain, where the detection of a signal indicates that the object has Alzheimer's disease or other tauopathy. In some embodiments, the brain distribution of the tau species linked by the described antibodies and antigen-binding fragments conjugated to detectable markers can be used to determine whether an object has AD or another tauopathy. For example, antibody binding may differ in AD (where the tau species may be more prominent in the hippocampus CA1) compared to other tauopathies, such as FTD - Pick's disease (where the tau species may be more prominent in the dentate gyrus, and , to some extent, hippocampus), CBD (where the tau species may be more prominent in the caudatus nucleus) and PSP (where the tau species may be more prominent in the putamen / caudatus nucleus). In some embodiments, an object is administered with an antibody and antigen-binding fragment conjugated to a detectable marker (for example, via intravenous administration) and then your brain is photographed (for example, via PET) to generate a map of tau bound by the labeled antibody and antigen binding fragment in the brain. The map can be analyzed against known maps of AD and other tauopathies to determine whether the patient has AD or another tauopathy.
[273] Em certas modalidades, a detecção é feita por tomografia de emissão de pósitrons. A distribuição do sinal no cérebro pode indicar se o objeto tem doença de Alzheimer ou outra tauopatia. Vide Murray et al., Clinicopathologic assessment and imaging of tauopathies in neurodegenerative demmentias, Alzheimer's Research & Therapy, 6:1, 2014. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes da complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes da complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação compreende o anticorpo DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que compete pela ligação ou se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.[273] In certain modalities, detection is done by positron emission tomography. The distribution of the signal in the brain can indicate whether the object has Alzheimer's disease or another tauopathy. See Murray et al., Clinicopathologic assessment and imaging of tauopathies in neurodegenerative demmentias, Alzheimer's Research & Therapy, 6: 1, 2014. In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment comprises a variable region of the heavy chain and a variable region light chain, where the heavy chain variable region comprises three regions determining heavy chain complementarity (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three regions determining light chain complementarity (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and where LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In one embodiment, the variable region of The heavy chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and the variable region of the light chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In one embodiment, the antibody or binding fragment comprises the antibody DC2E7 or a fragment of binding to its antigen. In one embodiment, the antibody or binding fragment comprises an antibody or antigen binding fragment that competes for binding or binds to the same epitope as the DC2E7 antibody or an antigen binding fragment thereof.
[274] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conjugado a um radioisótopo pode ser administrado a um objeto como no presente documento descrito. O radiossinal pode ser detectado no cérebro por tomografia por emissão de pósitrons. Imagens tridimensionais da concentração de conjugado de anticorpo dentro do corpo podem então ser construídas por análise de computador. As concentrações de sinal em todo o cérebro podem ser usadas para correlacionar com padrões distintos associados com AD ou outras tauopatias, ou para determinar se um paciente que apresenta demência tem ou não tem AD, outra tauopatia ou outra causa de sua demência. Esses padrões de sinal podem ser interpretados por um especialista na técnica para determinar se um objeto tem AD ou outra tauopatia. Vide Murray et al., Clinicopathologic assessment and imaging of tauopathies in neurodegenerative dementias, Alzheimer’s Research & Therapy, 6:1, 2014.[274] In various embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof conjugated to a radioisotope can be administered to an object as described herein. The radiosignal can be detected in the brain by positron emission tomography. Three-dimensional images of the antibody conjugate concentration within the body can then be constructed by computer analysis. Signal concentrations across the brain can be used to correlate with distinct patterns associated with AD or other tauopathies, or to determine whether or not a patient who has dementia has AD, another tauopathy or another cause of his dementia. These signal patterns can be interpreted by a person skilled in the art to determine whether an object has AD or another tauopathy. See Murray et al., Clinicopathologic assessment and imaging of tauopathies in neurodegenerative dementias, Alzheimer’s Research & Therapy, 6: 1, 2014.
[275] Em várias modalidades, um objeto humano apresentando sintomas de demência é primeiro submetido a qualquer um ou mais dos métodos de detecção da doença de Alzheimer ou outra tauopatia descrita no presente documento antes de uma decisão de tratamento ser feita. Em certas modalidades, uma amostra (por exemplo, CSF ou sangue) é retirada de um objeto humano apresentando sintomas de demência e analisada de acordo com os métodos descritos acima, e/ou o objeto humano é administrado com anticorpo DC2E7 conjugado com um radioisótopo e um sinal é detectado no cérebro do objeto para determinar se o objeto tem a doença de Alzheimer ou outra tauopatia. Em uma modalidade, um objeto humano que foi determinado ter a doença de Alzheimer ou outra tauopatia pode ser administrado com uma composição farmacêutica que trata AD ou outra tauopatia. Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descrito. Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende um ou mais dos anticorpos ou peptídeos terapêuticos descritos na Patente U.S. No. 9.518.101 e/ou WO 2016/079597. Alternativamente, se for determinado que o objeto não tem AD ou outra tauopatia, um tratamento alternativo pode ser administrado.[275] In various modalities, a human object showing symptoms of dementia is first subjected to any one or more of the methods of detecting Alzheimer's disease or other tauopathy described in this document before a treatment decision is made. In certain embodiments, a sample (for example, CSF or blood) is taken from a human object showing symptoms of dementia and analyzed according to the methods described above, and / or the human object is administered with a DC2E7 antibody conjugated to a radioisotope and a signal is detected in the object's brain to determine whether the object has Alzheimer's disease or other tauopathy. In one embodiment, a human object that has been determined to have Alzheimer's disease or another tauopathy can be administered with a pharmaceutical composition that treats AD or another tauopathy. In one embodiment, the pharmaceutical composition comprises an antibody or antigen-binding fragment in the present document described. In one embodiment, the pharmaceutical composition comprises one or more of the therapeutic antibodies or peptides described in U.S. Patent No. 9,518,101 and / or WO 2016/079597. Alternatively, if it is determined that the object has no AD or other tauopathy, an alternative treatment can be administered.
[276] Em várias modalidades, um método para determinar o estágio da doença de Alzheimer em um objeto humano é descrito, compreendendo: obter um fluido cerebroespinhal ou amostra de sangue do objeto, contatar a amostra com uma quantidade eficaz de uma molécula que é capaz de formar um complexo tau-molécula (por exemplo, pelo menos um receptor, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento que é capaz de se ligar a tau para formar um complexo tau-anticorpo); detectar a quantidade do complexo tau-molécula usando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descrito; e comparar a quantidade de tau complexada com a molécula com a quantidade em uma amostra de estágio de AD conhecido ou um limite, identificando assim o estágio da doença de Alzheimer. Em algumas modalidades, uma quantidade maior de tau na amostra indica um estágio mais avançado de AD. Em várias modalidades, os níveis e/ou limites são avaliados conforme descrito acima. Em algumas modalidades, um estágio avançado é determinado por comparação com a quantidade de tau fosforilada detectada em uma amostra de estágio AD conhecido, por exemplo, Estágios I-VI de Braak. Braak et al., "Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes". Acta Neuropathologica, 82 (4): 239-59 (1991).[276] In various modalities, a method for determining the stage of Alzheimer's disease in a human object is described, comprising: obtaining a cerebrospinal fluid or blood sample from the object, contacting the sample with an effective amount of a molecule that is capable of to form a tau-molecule complex (for example, at least one antigen-binding receptor, antibody or fragment described herein that is capable of binding to tau to form a tau-antibody complex); detecting the amount of the tau-molecule complex using an antibody or antigen-binding fragment in this document described; and comparing the amount of tau complexed with the molecule with the amount in a sample of known AD stage or a threshold, thereby identifying the stage of Alzheimer's disease. In some embodiments, a larger amount of tau in the sample indicates a more advanced stage of AD. In various modalities, levels and / or limits are assessed as described above. In some embodiments, an advanced stage is determined by comparison with the amount of phosphorylated tau detected in a sample of known AD stage, for example, Braak Stage I-VI. Braak et al., "Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes". Acta Neuropathologica, 82 (4): 239-59 (1991).
[277] Em várias modalidades, um método para determinar o estágio da doença de Alzheimer em um objeto humano é descrito, compreendendo: obter um fluido cerebroespinhal ou amostra de sangue do objeto, contatar a amostra com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é capaz de se ligar à tau fosforilada para formar um complexo tau fosforilada-anticorpo, detectando a quantidade de tau fosforilada complexada com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno na amostra e comparando a quantidade de tau complexada com o anticorpo para a quantidade em uma amostra de estágio de AD conhecido ou um limite, identificando assim o estágio da doença de Alzheimer. Em algumas modalidades, uma quantidade maior de tau na amostra indica um estágio mais avançado de AD. Em várias modalidades, os níveis e/ou limites são avaliados conforme descrito acima. Em algumas modalidades, um estágio avançado é determinado por comparação com a quantidade de tau fosforilada detectada em uma amostra de estágio AD conhecido, por exemplo, Estágios I-VI de Braak. Braak et al., "Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes". Acta Neuropathologica, 82 (4): 239-59 (1991). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação compreende o anticorpo DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o nível de tau determinado na amostra é comparado ao nível em uma amostra de um paciente de estágio conhecido de AD e/ou a uma amostra de controle de um indivíduo saudável para determinar se o objeto de teste tem uma quantidade elevada de tau em sua amostra.[277] In several modalities, a method for determining the stage of Alzheimer's disease in a human object is described, comprising: obtaining a cerebrospinal fluid or blood sample from the object, contacting the sample with an antibody or antigen-binding fragment described in this document, where the antibody or antigen-binding fragment is capable of binding to phosphorylated tau to form a phosphorylated tau-antibody complex, detecting the amount of phosphorylated tau complexed with the antibody or antigen-binding fragment in the sample and comparing the amount of tau complexed with the antibody to the amount in a sample of known AD stage or a threshold, thereby identifying the stage of Alzheimer's disease. In some embodiments, a larger amount of tau in the sample indicates a more advanced stage of AD. In various modalities, levels and / or limits are assessed as described above. In some embodiments, an advanced stage is determined by comparison with the amount of phosphorylated tau detected in a sample of known AD stage, for example, Braak Stage I-VI. Braak et al., "Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes". Acta Neuropathologica, 82 (4): 239-59 (1991). In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises three heavy chain complementarity determining regions (HCDR1, HCDR2 and HCDR3 ) and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO : 2 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In certain embodiments, the antibody or fragment antigen-binding region comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and the light chain variable region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In one embodiment, the antibody or binding fragment comprises the DC2E7 antibody or an antigen binding fragment thereof. In some embodiments, the level of tau determined in the sample is compared to the level in a sample from a patient of known stage of AD and / or a control sample from a healthy individual to determine whether the test object has a high amount of tau in your sample.
[278] Em várias modalidades, um método para determinar a eficácia de uma terapia anti-tau para a doença de Alzheimer é descrito, compreendendo: obter um líquido cefalorraquidiano ou amostra de sangue de um objeto humano; contatar a amostra com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descrito, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é capaz de se ligar a tau fosforilada para formar um complexo tau fosforilada-anticorpo; e detectar a presença e/ou quantidade de tau fosforilada complexada com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno na amostra, em que um nível elevado de tau fosforilada na amostra em relação ao nível em uma amostra de um objeto de controle saudável ou um limite indica que o objeto tem probabilidade aumentada de responder a uma terapia anti-tau para a doença de Alzheimer. Em várias modalidades, um nível elevado acima de um limite ou um aumento em tau é determinado conforme descrito acima.[278] In several modalities, a method for determining the effectiveness of an anti-tau therapy for Alzheimer's disease is described, comprising: obtaining a cerebrospinal fluid or blood sample from a human object; contacting the sample with an antibody or antigen binding fragment in the present described document, wherein the antibody or antigen binding fragment is capable of binding to phosphorylated tau to form a phosphorylated tau-antibody complex; and detecting the presence and / or amount of phosphorylated tau complexed with the antibody or antigen binding fragment in the sample, where a high level of phosphorylated tau in the sample compared to the level in a sample of a healthy control object or a boundary indicates that the object is more likely to respond to anti-tau therapy for Alzheimer's disease. In various embodiments, a high level above a limit or an increase in tau is determined as described above.
[279] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-tau ou fragmento de ligação ao antígeno usado na determinação da eficácia de uma terapia anti-tau para a doença de Alzheimer compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes da complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação compreende o anticorpo DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.[279] In some embodiments, the anti-tau antibody or antigen-binding fragment used in determining the effectiveness of an anti-tau therapy for Alzheimer's disease comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, in that the heavy chain variable region comprises three heavy chain complementarity determining regions (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In certain embodiments, the antibody or fragment antigen-binding region comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and the light chain variable region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In one embodiment, the antibody or binding fragment comprises the DC2E7 antibody or an antigen binding fragment thereof.
[280] Em certas modalidades, uma terapia anti-tau é administrada a um objeto identificado como sendo mais propenso a responder à terapia. Em uma modalidade, a terapia anti-tau compreende administrar um anticorpo que se liga a tau e promove sua eliminação do cérebro ou inibe a disseminação da patologia tau. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, a terapia anti-tau compreende qualquer uma das no presente documento descritas e/ou qualquer uma descrita na Patente U.S. No. 9.518.101 e WO 2016/079597. Em várias modalidades, a terapia anti-tau compreende uma molécula pequena ou terapia de vacina de peptídeo ou terapia de anticorpo. Vide Patente[280] In certain embodiments, anti-tau therapy is administered to an object identified as being more likely to respond to therapy. In one embodiment, anti-tau therapy comprises administering an antibody that binds tau and promotes its elimination from the brain or inhibits the spread of the tau pathology. In one embodiment, the antibody or antigen-binding fragment comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises three heavy chain complementarity determining regions (HCDR1, HCDR2 and HCDR3 ) and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO : 2 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and where LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In one embodiment, anti- tau comprises any of those described herein and / or any described in US Patent No. 9,518,101 and WO 2016/079597. In various embodiments, anti-tau therapy comprises a small molecule or peptide vaccine therapy or antibody therapy. See Patent
U.S. No. 9.518.101 e WO 2016/079597, que são incorporados por referência na sua totalidade.No. 9,518,101 and WO 2016/079597, which are incorporated by reference in their entirety.
[281] Em várias modalidades, é descrito um método para monitoramento da eficácia de uma terapia anti-tau para a doença de Alzheimer, compreendendo: (a) obter fluido cerebroespinhal ou amostra de sangue de um objeto humano antes do tratamento; (b) contatar a amostra com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descrito, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é capaz de se ligar a tau fosforilada para formar um complexo tau fosforilada-anticorpo; (c) detectar a presença e/ou quantidade de tau fosforilada complexada com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno; (d) administrar uma terapia anti-tau ao objeto; (e) repetir as etapas (a) - (c) após a administração da terapia anti-tau, em que uma redução no nível de tau fosforilada na amostra após o tratamento em comparação com o nível na amostra antes do tratamento indica uma terapia eficaz. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-tau ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, o método adicionalmente compreende administrar a terapia anti-tau novamente a um objeto que tem um nível mais baixo de tau fosforilada na amostra obtida após o tratamento, em comparação com o nível na amostra obtida antes do tratamento.[281] In several modalities, a method for monitoring the effectiveness of an anti-tau therapy for Alzheimer's disease is described, comprising: (a) obtaining cerebrospinal fluid or blood sample from a human object before treatment; (b) contacting the sample with an antibody or antigen binding fragment in the present described document, wherein the antibody or antigen binding fragment is capable of binding to phosphorylated tau to form a phosphorylated tau-antibody complex; (c) detecting the presence and / or amount of phosphorylated tau complexed with the antibody or antigen binding fragment; (d) administering anti-tau therapy to the object; (e) repeat steps (a) - (c) after administration of anti-tau therapy, in which a reduction in the level of phosphorylated tau in the sample after treatment compared to the level in the sample before treatment indicates effective therapy . In some embodiments, the anti-tau antibody or antigen binding fragment comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises three heavy chain complementarity determining regions (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In certain embodiments, the method additionally comprises administer anti-tau therapy again to an object that has a lower level of phosphorylated tau in the sample obtained after treatment, compared to the level in the sample obtained before treatment.
Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende um aminoácido sequência de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação compreende o anticorpo DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.In one embodiment, the antibody or antigen binding fragment comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and the variable region The light chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In one embodiment, the antibody or binding fragment comprises the DC2E7 antibody or an antigen binding fragment thereof.
Em várias modalidades, a terapia anti-tau compreende uma pequena molécula ou vacina de peptídeo ou terapia com anticorpos.In various embodiments, anti-tau therapy comprises a small molecule or peptide vaccine or antibody therapy.
Vide WO 2016/079597 e Patente U.S.See WO 2016/079597 and U.S. Patent
No. 9.518.101, que são incorporados por referência na sua totalidade.No. 9,518,101, which are incorporated by reference in their entirety.
Em uma modalidade, a terapia anti-tau compreende administrar um anticorpo que se liga a tau e promove sua eliminação do cérebro.In one embodiment, anti-tau therapy involves administering an antibody that binds tau and promotes its elimination from the brain.
Em certas modalidades, a terapia anti-tau compreende administrar um anticorpo anti-tau ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, a terapia anti-tau compreende qualquer uma das no presente documento descritas e/ou qualquer uma descrita na Patente U.S. No. 9.518.101 e WO 2016/079597. Outros métodos de monitoramento e/ou confirmação de DAIn certain embodiments, anti-tau therapy comprises administering an anti-tau antibody or antigen-binding fragment comprising a variable region of heavy chain and a variable region of light chain, wherein the variable region of heavy chain comprises three determining regions of heavy chain complementarity (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 , HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and where LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In one embodiment, anti- tau comprises any of those described herein and / or any described in US Patent No. 9,518,101 and WO 2016/079597. Other methods of monitoring and / or confirming AD
[282] Uma série de medidas adicionais pode ser usada para determinar, confirmar e/ou monitorar o estado de AD, por exemplo, por avaliação comportamental, para uso na confirmação de um diagnóstico de AD ou para avaliar os efeitos do tratamento e/ou progressão da doença. Em algumas modalidades, as medidas incluem alteração média nas pontuações da escala de atividade da doença de Alzheimer-subescala cognitiva 13 (ADAS-Cog 13) e alteração média nas pontuações do estudo cooperativo de atividades de vida diária da doença de Alzheimer (ADCS-ADL). Outras medidas podem incluir mudança na volumetria de MRI, mudança na Classificação Clínica de Demência (CDR-SB/CDR-GS), mudança no comportamento neuropsiquiátrico: pontuações total e de domínio de inventário neuropsiquiátrico (NPI) e/ou mudança na cognição: pontuação total MMSE. Em outra modalidade, as medidas podem incluir qualquer um dos seguintes: tempo para a ocorrência de morte, institucionalização, perda da capacidade de realizar atividades da vida diária, tempo para demência grave, ADCS-ADL, pontuação ADAS-cog, pontuação MMSE, desempenho cognitivo, biomarcadores de plasma CSF, pontuação total de ADAS, Qualidade de vida avaliada pela escala de Qualidade de Vida da doença de Alzheimer, pontuações de testes comportamentais, e soma de caixas da classificação de demência clínica da FDA dos EUA.[282] A number of additional measures can be used to determine, confirm and / or monitor the status of AD, for example, by behavioral assessment, for use in confirming a diagnosis of AD or to assess the effects of treatment and / or disease progression. In some modalities, the measures include average change in Alzheimer's disease activity scale scores - cognitive subscale 13 (ADAS-Cog 13) and average change in Alzheimer's disease activity cooperative study scores (ADCS-ADL ). Other measures may include change in MRI volumetry, change in Clinical Dementia Classification (CDR-SB / CDR-GS), change in neuropsychiatric behavior: total scores and neuropsychiatric inventory domain (NPI) scores and / or change in cognition: score total MMSE. In another modality, measures can include any of the following: time to death, institutionalization, loss of ability to perform activities of daily living, time for severe dementia, ADCS-ADL, ADAS-cog score, MMSE score, performance cognitive, CSF plasma biomarkers, total ADAS score, Quality of life as measured by the Alzheimer's Quality of Life scale, behavioral test scores, and US FDA clinical dementia box scores.
[283] Em várias modalidades, um método para detectar doenças de Alzheimer ou outra tauopatia em um objeto humano compreende administrar a um objeto um anticorpo ou fragmento de antígeno descrito no presente documento que foi conjugado a um radioisótopo e a detecção de um sinal no cérebro do paciente, em que o padrão de sinal detectado no cérebro indica se o objeto tem doença de Alzheimer ou outra tauopatia. A detecção do sinal pode ser feita por topografia de emissão de pósitrons. A distribuição do sinal no cérebro pode ser usada para indicar se o objeto tem doença de Alzheimer ou outra tauopatia. Em uma modalidade, o anticorpo administrado ou fragmento de ligação ao antígeno conjugado a um radioisótopo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.[283] In several modalities, a method for detecting Alzheimer's disease or other tauopathy in a human object comprises administering to an object an antibody or antigen fragment described in this document that has been conjugated to a radioisotope and detecting a signal in the brain of the patient, in which the signal pattern detected in the brain indicates whether the object has Alzheimer's disease or other tauopathy. Signal detection can be done by positron emission topography. The signal distribution in the brain can be used to indicate whether the object has Alzheimer's disease or other tauopathy. In one embodiment, the administered antibody or antigen-binding fragment conjugated to a radioisotope comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises three heavy chain complementarity determining regions ( HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprises the sequence amino acid of SEQ ID NO: 2, and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and where LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In one embodiment, the antibody or fragment antigen-binding region comprises a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In one embodiment, the antibody or fragment of antigen binding comprises DC2E7 or an antigen binding fragment thereof.
[284] Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno descritos no presente documento para usos terapêuticos ou de diagnóstico podem ser administrados por qualquer via de administração adequada, por exemplo, via parenteral, tópica, intradérmica, intravenosa, oral, subcutânea, intraperitoneal, intranasal ou intramuscular. Uma via típica de administração pode ser subcutânea, embora outras possam ser igualmente eficazes. Outra via típica pode ser a injeção intramuscular. Este tipo de injeção é normalmente realizado nos músculos do braço ou perna. As injeções intravenosas, bem como as injeções intraperitoneais, intra-arteriais, intracranianas ou intradérmicas também podem ser usadas. Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno descritos no presente documento podem ser administrados como dosagens injetáveis de uma solução ou suspensão da substância em um veículo e/ou diluente fisiologicamente aceitável, por exemplo, um líquido estéril, como água, óleo, solução salina, glicerol ou etanol. Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno descritos no presente documento também podem ser administrados por meio da perfuração de um pequeno orifício no crânio para administração, o que pode permitir o cruzamento da barreira hematoencefálica. Kits[284] The antibodies and antigen-binding fragments described herein for therapeutic or diagnostic uses can be administered by any suitable route of administration, for example, parenteral, topical, intradermal, intravenous, oral, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal or intramuscular. A typical route of administration can be subcutaneous, although others can be just as effective. Another typical route may be intramuscular injection. This type of injection is usually performed in the muscles of the arm or leg. Intravenous injections as well as intraperitoneal, intra-arterial, intracranial or intradermal injections can also be used. The antibodies or antigen-binding fragments described in this document can be administered as injectable dosages of a solution or suspension of the substance in a physiologically acceptable carrier and / or diluent, for example, a sterile liquid, such as water, oil, saline, glycerol or ethanol. The antibodies or antigen-binding fragments described in this document can also be administered by drilling a small hole in the skull for administration, which may allow the blood-brain barrier to cross. Kits
[285] Em várias modalidades, os kits são descritos no presente documento, compreendendo um ou mais dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno no presente documento descritos. Em certas modalidades, o kit compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação compreende o anticorpo DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.[285] In various embodiments, the kits are described herein, comprising one or more of the antibodies or antigen-binding fragments described herein. In certain embodiments, the kit comprises an antibody or antigen binding fragment comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises three heavy chain complementarity determining regions (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In certain embodiments, the antibody or fragment antigen-binding region comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and the light chain variable region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In one embodiment, the antibody or binding fragment comprises the DC2E7 antibody or an antigen binding fragment thereof.
[286] Em certas modalidades, o kit compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) selecionadas daqueles na Tabela 1, por exemplo, um conjunto de seis CDRs daquelas na tabela 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve selecionado daqueles na Tabela 1, por exemplo, sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve pareadas selecionadas daqueles na Tabela 1.[286] In certain embodiments, the kit comprises an antibody or antigen binding fragment comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises three determining regions of heavy chain complementarity (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3) selected from those in Table 1, for example, a set of six CDRs from those in Table 1. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment comprises a light chain variable domain and a heavy chain variable domain and a light chain variable domain selected from those in Table 1, for example, heavy chain variable domain sequences and take selected matches from those in Table 1.
[287] Em certas modalidades, o kit compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 com uma substituição na posição 2, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 com uma substituição em uma ou mais das posições 2 e 12, e/ou HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e/ou em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 com uma substituição na posição 2, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e/ou LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em várias modalidades, a substituição na posição 2 em HCDR1 é glicina e, a substituição na posição 2 em HCDR2 é isoleucina e/ou a substituição na posição 12 em HCDR2 é valina e/ou a substituição na posição 2 em LCDR1 é asparagina.[287] In certain embodiments, the kit comprises an antibody or antigen binding fragment comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises three determinants of heavy chain complementarity. (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with a substitution in position 2, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 with a substitution at one or more of positions 2 and 12, and / or HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and / or where LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 with a substitution in position 2, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and / or LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In several embodiments,the substitution in position 2 in HCDR1 is glycine and, the substitution in position 2 in HCDR2 is isoleucine and / or the substitution in position 12 in HCDR2 is valine and / or the substitution in position 2 in LCDR1 is asparagine.
Em várias modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 com uma substituição em uma ou mais das posições 1, 3, 30, 37, 48, 58, 63, 68, 76, 77, e 80, e/ou a região variável de cadeia leve compreende o amino a sequência cid de SEQ ID SEQ ID NO: 8 com uma substituição em uma ou mais das posições 7, 11, 20, 28, 39 e 69. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 68 é leucina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 39 é isoleucina.In various embodiments, the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 with a substitution at one or more of positions 1, 3, 30, 37, 48, 58, 63, 68, 76, 77, and 80, and / or the light chain variable region comprises the amino cid sequence of SEQ ID SEQ ID NO: 8 with a substitution in one or more of positions 7, 11, 20, 28, 39 and 69. In various embodiments , substitution in the variable region of heavy chain at position 68 is leucine, and substitution in the variable region of light chain at position 39 is isoleucine.
Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 48 é isoleucina.In several embodiments, substitution in the heavy chain variable region at position 48 is isoleucine.
Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 30 é glicina e na posição 58 é valina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 7 é prolina e na posição 69 é glicina.In several embodiments, substitution in the variable region of heavy chain at position 30 is glycine and at position 58 is valine, and substitution in the variable region of light chain at position 7 is proline and at position 69 is glycine.
Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é serina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 77 é serina e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina, na posição 20 é alanina e na posição 28 é asparagina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 37 é alanina, na posição 63 é alanina e a posição 80 é serina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 1 é glicina, na posição 3 é arginina, na posição 76 é ácido glutâmico e na posição 77 é serina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina.In several modalities, the substitution in the variable region of the light chain at position 11 is serine. In several embodiments, substitution in the variable region of heavy chain at position 77 is serine and substitution in the variable region of light chain at position 11 is leucine, at position 20 is alanine and at position 28 is asparagine. In several embodiments, the substitution in the variable region of heavy chain at position 37 is alanine, in position 63 is alanine and position 80 is serine, and the substitution in the variable region of light chain at position 11 is leucine. In several embodiments, the substitution in the variable region of heavy chain at position 1 is glycine, at position 3 is arginine, at position 76 is glutamic acid and at position 77 is serine. In several embodiments, substitution in the variable region of the light chain at position 11 is leucine.
[288] Em várias modalidades, um kit compreende dois ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno. Em certas modalidades, um kit compreende: a. um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N ° 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; e b. outro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.[288] In several embodiments, a kit comprises two or more antibodies or antigen-binding fragments. In certain embodiments, a kit comprises: a. an antibody or antigen binding fragment comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises three heavy chain complementarity determining regions (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and light chain variable region comprises three chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID No. 3; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; and b. another antibody or antigen binding fragment comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises three heavy chain complementarity determining regions (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
[289] Em certas modalidades, o kit compreende dois ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, em que um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, e o outro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. Em certas modalidades, o kit compreende anticorpo ou DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e/ou anticorpo ou DC2E2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.[289] In certain embodiments, the kit comprises two or more antibodies or antigen-binding fragments, where an antibody or antigen-binding fragment comprises a variable heavy chain region and a variable region of light chain, where the region The heavy chain variable comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and the light chain variable region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and the other antibody or antigen binding fragment comprises a variable chain region heavy and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and the light chain variable region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. In certain embodiments , the kit comprises antibody or DC2E7 or an antigen binding fragment thereof and / or antibody or DC2E2 or an antigen binding fragment thereof.
[290] Em várias modalidades, um kit compreende dois ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno. Em certas modalidades, um kit compreende: a. um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo qualquer uma das sequências mostradas na tabela 1, por exemplo, um conjunto de seis CDRs e/ou sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve emparelhadas listadas na Tabela 1; b. outro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.[290] In several embodiments, a kit comprises two or more antibodies or antigen-binding fragments. In certain embodiments, a kit comprises: a. an antibody or antigen binding fragment comprising any of the sequences shown in table 1, for example, a set of six paired CDRs and / or heavy and light chain variable domain sequences listed in Table 1; B. another antibody or antigen binding fragment comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises three heavy chain complementarity determining regions (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
[291] Em várias modalidades, um kit compreende dois ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno. Em certas modalidades, um kit compreende: a. um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23,[291] In several embodiments, a kit comprises two or more antibodies or antigen-binding fragments. In certain embodiments, a kit comprises: a. an antibody or antigen binding fragment comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises three heavy chain complementarity determining regions (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23,
HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; b. e outro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; B. and another antibody or antigen binding fragment comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises three heavy chain complementarity determining regions (HCDR1, HCDR2 and HCDR3), and the light chain variable region comprises three light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3), where HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; and wherein LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
[292] Em outra modalidade, qualquer um dos kits precedentes pode compreender ainda instruções para o uso de um ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno para detectar tau fosforilada em uma amostra de um objeto de acordo com os métodos no presente documento descritos e, assim, detectar a doença de Alzheimer no objeto. As instruções podem exigir que a amostra seja líquido cefalorraquidiano ou sangue. Os kits podem compreender ainda componentes adicionais para uso com um ELISA clássico ou um ELISA digital.[292] In another embodiment, any of the preceding kits may further comprise instructions for using one or more antibodies or antigen-binding fragments to detect phosphorylated tau in a sample of an object according to the methods in this document described and thus, detecting Alzheimer's disease in the object. The instructions may require the sample to be cerebrospinal fluid or blood. The kits can also comprise additional components for use with a classic ELISA or a digital ELISA.
[293] Várias das modalidades precedentes são ilustradas nos exemplos não limitativos apresentados abaixo. No entanto, outras modalidades da invenção serão evidentes para os versados na técnica a partir da consideração do relatório descritivo como um todo. Pretende-se que a especificação e os exemplos sejam considerados apenas exemplificativos. Além disso, todas as referências citadas no presente documento devem ser consideradas incorporadas por referência em sua totalidade. Exemplo 1 Preparação de Proteínas Tau Humanas Recombinantes[293] Several of the preceding modalities are illustrated in the non-limiting examples presented below. However, other embodiments of the invention will be evident to those skilled in the art from the consideration of the specification as a whole. It is intended that the specification and examples are considered as exemplary only. In addition, all references cited in this document should be considered incorporated by reference in their entirety. Example 1 Preparation of Recombinant Human Tau Proteins
[294] Tau 2N4R de comprimento total humana e mutantes de deleção de tau: As proteínas tau recombinantes foram geradas a partir do clone τ40 (Goedert et al., Multiple isoforms of human microtubule- associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer’s disease, Neuron 3, 519-526 (1989), que foi subclonado no plasmídeo de expressão pET-17b (Novagen) e expresso em bactérias. Cada mutante de deleção de tau foi verificado por sequenciamento de DNA. Todos os mutantes de deleção de tau e peptídeos de tau foram numerados de acordo com a isoforma 2N4R mais longo da tau humana, que tem 441 aminoácidos de comprimento e, portanto, também é chamada de tau441 (D'Souza, I., and Schellenberg, G.D. (2005). Regulation of tau isoform expression and dementia. Biochimica et biophysica acta 1739, 104-115). A produção de proteínas tau envolveu as seguintes etapas: a) expressão de tau em bactérias; b) purificação de tau por cromatografia de troca iônica; c) purificação de tau por filtração em gel; d) concentração e armazenamento de tau isolada. a) Expressão bacteriana de tau de comprimento total humana (2N4R) e mutantes de deleção de tau recombinante: os plasmídeos de expressão de tau humana (acima) foram transformados em Escherichia coli (E. coli), cepa de produção BL21 (DE3). As células bacterianas contendo o plasmídeo de expressão apropriado foram cultivadas e induzidas conforme descrito em "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" por Sambrook e Russell (2001). Uma única colônia de bactérias BL21 (DE3), transformada com o plasmídeo pET-17b dirigindo a expressão de uma proteína tau ou seu fragmento, foi cultivada a 37 ºC em 500 mL de meio de caldo Luria com 100 μg/ml de ampicilina a 300 rpm e induzida pela adição de isopropil-β-D-1 a tiogalactopiranosídeo (IPTG) a uma concentração final de 0,4 mM.[294] Tau 2N4R full length human and tau deletion mutants: Recombinant tau proteins were generated from clone τ40 (Goedert et al., Multiple isoforms of human microtubule- associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease, Neuron 3, 519-526 (1989), which was subcloned into the expression plasmid pET-17b (Novagen) and expressed in bacteria. Each tau deletion mutant was verified by DNA sequencing. tau and tau peptides have been numbered according to the longest 2N4R isoform in human tau, which is 441 amino acids long and therefore also called tau441 (D'Souza, I., and Schellenberg, GD (2005). Regulation of tau isoform expression and dementia Biochimica et biophysica acta 1739, 104-115) The production of tau proteins involved the following steps: a) expression of tau in bacteria; b) purification of tau by ion exchange chromatography; c) purification of tau by gel filtration; d) concentration and storage of isolated tau. a) Bacterial expression of human full length tau (2N4R) and recombinant tau deletion mutants: the human tau expression plasmids (above) were transformed into Escherichia coli (E. coli), BL21 (DE3) production strain. Bacterial cells containing the appropriate expression plasmid were cultured and induced as described in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" by Sambrook and Russell (2001). A single colony of BL21 (DE3) bacteria, transformed with plasmid pET-17b directing the expression of a tau protein or its fragment, was cultured at 37 ºC in 500 mL of Luria broth medium with 100 μg / ml ampicillin at 300 rpm and induced by the addition of isopropyl-β-D-1 to thiogalactopyranoside (IPTG) at a final concentration of 0.4 mM.
Após incubação adicional a 37 ºC por 3 horas, as bactérias foram coletadas por centrifugação a 3.000xg por 15 min a 4 ºC. b) Purificações por cromatografia de troca catiônica das proteínas tau básicas e neutras (seis isoformas tau, mutantes pontuais da isoforma tau 2N4R: Ser198Ala, Ser199Ala, Ser202Ala, Thr205Ala, Ser208Ala, Ser210Ala, Thr212Ala, Ser214Ala, Thr222Ala, Ser214Ala, Thr222Ala, Ser214Ala, Thr222Ala, tau99- 441, tau188- 44, tau31 a 441, tau151 a 391, tau127-441, tau2N4RΔ (134-168), tau2N4RΔ (49- 243) foram concluídos essencialmente como descrito precedentemente (Krajciova et al.,Preserving free thios of intrinsically disordered tau protein without use of a reducing agent, Analytical Biochemistry, 383:343-345, 2008). Após a expressão, os péletes bacterianos foram ressuspensos em 10 ml de tampão de lise (50 mM de ácido 1,4-piperazinodietanossulfônico (PIPES) pH 6,9, 50 mM de cloreto de sódio (NaCl), 1 mM de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), 5 mM de ditiotreitol (DTT), 0,1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF), 5% (v/v) glicerol), rapidamente congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80 ºC até ser usado para purificação de proteínas tau.After additional incubation at 37 ºC for 3 hours, the bacteria were collected by centrifugation at 3,000xg for 15 min at 4 ºC. b) Purification by cation exchange chromatography of basic and neutral tau proteins (six tau isoforms, point mutants of the 2N4R tau isoform: Ser198Ala, Ser199Ala, Ser202Ala, Thr205Ala, Ser208Ala, Ser210Ala, Thr212Ala, Ser214Ala, Thr212Ala, Thr222Ala, Thr222 Thr222Ala, tau99- 441, tau188-44, tau31 to 441, tau151 to 391, tau127-441, tau2N4RΔ (134-168), tau2N4RΔ (49-243) were completed essentially as described above (Krajciova et al., Preserving free thios of intrinsically disordered tau protein without use of a reducing agent, Analytical Biochemistry, 383: 343-345, 2008) After expression, the bacterial pellets were resuspended in 10 ml of lysis buffer (50 mM 1,4-piperazinodiethanesulfonic acid (PIPES) pH 6.9, 50 mM sodium chloride (NaCl), 1 mM ethylene diaminetetraacetic acid (EDTA), 5 mM dithiothreitol (DTT), 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 5% ( v / v) glycerol), quickly frozen in liquid nitrogen and stores from -80 ºC until used for purification of tau proteins.
Para a purificação da proteína tau, as suspensões bacterianas congeladas foram rapidamente descongeladas e colocadas em gelo.For the purification of the tau protein, the frozen bacterial suspensions were quickly thawed and placed on ice.
As paredes das células bacterianas foram quebradas por sonicação em gelo usando Sonopuls HD 2200, ponta TT-13 (Bandelin, Alemanha) definida para ciclo de trabalho de 50%, potência de saída de 50 W, 6 vezes por 30 s com pausas de 30 s.The bacterial cell walls were broken by sonication on ice using Sonopuls HD 2200, tip TT-13 (Bandelin, Germany) set for 50% duty cycle, 50 W output power, 6 times for 30 s with breaks of 30 s.
Os lisados foram clarificados por centrifugação (21.000xg por 15 min a 4 ºC) e os sobrenadantes foram filtrados em um filtro de membrana de 0,45 μm.The lysates were clarified by centrifugation (21,000xg for 15 min at 4 ºC) and the supernatants were filtered through a 0.45 μm membrane filter.
A purificação em grande escala das proteínas tau recombinantes foi realizada a 6 ºC usando uma estação de trabalho ÄKTA-FPLC (Amersham Biosciences, Suécia). Os lisados filtrados foram carregados a uma taxa de fluxo de 3 ml/min em uma coluna HiTrap SP HP de 5 ml (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) equilibrada com o tampão de lise e lavados extensivamente com 60 ml do tampão de lise até a linha de base em 280 nm tornar-se estável.Large-scale purification of recombinant tau proteins was carried out at 6 ° C using an ÄKTA-FPLC workstation (Amersham Biosciences, Sweden). The filtered lysates were loaded at a flow rate of 3 ml / min onto a 5 ml HiTrap SP HP column (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) equilibrated with the lysis buffer and washed extensively with 60 ml of the lysis buffer until baseline at 280 nm become stable.
As proteínas tau ligadas foram eluídas por um gradiente (0-30% em 15 ml) de Tampão B (tampão de lise suplementado com 1 M de NaCl). Frações individuais de 1 mL foram recolhidas e analisadas por eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS- PAGE). Para remover os ácidos nucleicos, que copurificam-se com proteínas tau carregadas positivamente, as frações contendo proteína tau foram reunidas e purificadas por uma segunda etapa de cromatografia de troca catiônica, usando uma coluna HiTrap SP HP de 5 ml (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) com um gradiente menos acentuado de Tampão B (0–30% em 45 ml). A purificação por cromatografia de troca aniônica das proteínas tau ácidas (tau1 a 226, tau1 a 136, tau1 a 242) foi feita conforme descrito precedentemente (Csokova et. al, Rapid purification of truncated tau proteins: model approach to purification of functionally active fragments of disordered proteins, implication for neurodegenerative diseases, Protein Expression and Purification, 35:366-372, 2004). Após a expressão, os péletes bacterianos foram ressuspensos em 10 ml de tampão de lise de histidina (20 mM de histidina, pH 6,0, 50 mM de NaCl, 1 mM deBound tau proteins were eluted by a gradient (0-30% in 15 ml) of Buffer B (lysis buffer supplemented with 1 M NaCl). Individual fractions of 1 mL were collected and analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). To remove nucleic acids, which copurify with positively charged tau proteins, the fractions containing tau protein were pooled and purified by a second cation exchange chromatography step, using a 5 ml HiTrap SP HP column (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) with a less pronounced gradient of Buffer B (0–30% in 45 ml). Purification by anion exchange chromatography of acidic tau proteins (tau1 to 226, tau1 to 136, tau1 to 242) was performed as previously described (Csokova et. Al, Rapid purification of truncated tau proteins: model approach to purification of functionally active fragments of disordered proteins, implication for neurodegenerative diseases, Protein Expression and Purification, 35: 366-372, 2004). After expression, the bacterial pellets were resuspended in 10 ml of histidine lysis buffer (20 mM histidine, pH 6.0, 50 mM NaCl, 1 mM
EDTA, 5 mM de DTT, 0,1 mM de PMSF e glicerol 5% (v/v)). As paredes das células bacterianas foram quebradas por sonicação em gelo usando Sonopuls HD 2200, ponta TT-13 (Bandelin, Alemanha) definida para ciclo de trabalho de 50%, potência de saída de 50 W, 6 vezes por 30 s com pausas de 30 s.EDTA, 5 mM DTT, 0.1 mM PMSF and 5% glycerol (v / v)). The bacterial cell walls were broken by sonication on ice using Sonopuls HD 2200, tip TT-13 (Bandelin, Germany) set for 50% duty cycle, 50 W output power, 6 times for 30 s with breaks of 30 s.
Os lisados foram clarificados por centrifugação (21.000xg durante 15 min a 4 ºC). Os lisados bacterianos foram precipitados por sulfato de estreptomicina a 1% (Medexport, Rússia), incubados em gelo por 5 min, clarificados por centrifugação (21.000xg por 15 min a 4 ºC) e filtrados por um filtro de membrana de 0,45 μm.The lysates were clarified by centrifugation (21,000xg for 15 min at 4 ºC). The bacterial lysates were precipitated by 1% streptomycin sulfate (Medexport, Russia), incubated on ice for 5 min, clarified by centrifugation (21,000xg for 15 min at 4 ºC) and filtered through a 0.45 μm membrane filter. .
Os lisados precipitados de estreptomicina filtrados foram carregados a uma taxa de fluxo de 3 ml/min em uma coluna HiTrap QSepharose HP de 5 ml (Amersham Biosciences, Suécia) e lavados extensivamente com 30-50 ml de tampão de lise de histidina até a linha de base A280 se tornar estável.The filtered streptomycin precipitated lysates were loaded at a flow rate of 3 ml / min onto a 5 ml HiTrap QSepharose HP column (Amersham Biosciences, Sweden) and washed extensively with 30-50 ml of histidine lysis buffer to the line A280 base becomes stable.
As proteínas tau foram eluídas com um gradiente de sal em duas etapas (0,05-0,5M de NaCl em 40ml seguido por 0,5-1M de NaCl em 20 ml) em tampão de lise de histidina. a) Na etapa final de purificação de filtração em gel (a mesma para todas as proteínas tau), as frações de proteína tau reunidas obtidas por cromatografia de troca iônica foram injetadas em uma coluna de filtração em gel (coluna HiLoad 26/60 Superdex 200 prep grade, GE Healthcare) a 3 ml/min em Tampão de lise PIPES ou Histidina para proteínas tau básicas/neutras ou ácidas, respectivamente, suplementado com 100 mM de NaCl.The tau proteins were eluted with a two-step salt gradient (0.05-0.5M NaCl in 40ml followed by 0.5-1M NaCl in 20ml) in histidine lysis buffer. a) In the final gel filtration purification step (the same for all tau proteins), the combined tau protein fractions obtained by ion exchange chromatography were injected into a gel filtration column (HiLoad 26/60 Superdex 200 column prep grade, GE Healthcare) at 3 ml / min in LIP Buffer PIPES or Histidine for basic / neutral or acid tau proteins, respectively, supplemented with 100 mM NaCl.
As proteínas tau eluídas foram agrupadas. c) Para a concentração de proteína tau após a purificação por filtração em gel, as frações reunidas foram diluídas com 1,5 volume de glicerol 2,5% e carregadas novamente em uma coluna HiTrap SP HP (proteínas tau básicas e neutras) ou em uma coluna HiTrap Q HP (proteínas tau ácida). A proteína tau recombinante concentrada foi então eluída da coluna com um gradiente de NaCl a 1 M em etapas. Finalmente, o tampão foi trocado por solução salina tamponada com fosfato (PBS, fosfato dissódico a 8,09 mM (Na2HPO4), dihidrogenofosfato de potássio a 1,47 mM (KH2PO4), NaCl a 136,89 mM, cloreto de potássio a 2,7 mM (KCl)) saturado com argônio, usando uma coluna de dessalinização HiTrap de 5 mL (GE Healthcare). A quantificação de proteínas das amostras purificadas foi feita usando kits de quantificação de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, EUA), com albumina de soro bovino (BSA) como padrão. As proteínas Tau foram divididas em alíquotas de trabalho, congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e armazenadas a -70 ºC. Exemplo 2 Preparação de linhagens celulares de hibridoma que produzem anticorpos monoclonais contra Tau1 a 242 humano, triagem de anticorpos monoclonais por ELISA e caracterização inicial de anticorpo monoclonal DC2E2The eluted tau proteins were pooled. c) For the concentration of tau protein after purification by gel filtration, the combined fractions were diluted with 1.5 volume of 2.5% glycerol and loaded again in a HiTrap SP HP column (basic and neutral tau proteins) or in a HiTrap Q HP column (acid tau proteins). The concentrated recombinant tau protein was then eluted from the column with a 1 M NaCl gradient in stages. Finally, the buffer was exchanged for phosphate buffered saline (PBS, 8.09 mM disodium phosphate (Na2HPO4), 1.47 mM potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4), 136.89 mM NaCl, 2 potassium chloride , 7 mM (KCl) saturated with argon, using a 5 mL HiTrap desalination column (GE Healthcare). The quantification of proteins in the purified samples was done using quantification kits of bicinconinic acid (BCA) (Pierce, USA), with bovine serum albumin (BSA) as standard. Tau proteins were divided into working aliquots, quickly frozen in liquid nitrogen and stored at -70 ºC. Example 2 Preparation of hybridoma cell lines that produce monoclonal antibodies against human Tau1 to 242, screening for monoclonal antibodies by ELISA and initial characterization of monoclonal antibody DC2E2
[295] Camundongos Balb/c de seis semanas de idade foram iniciados por via subcutânea com 50 μg de tau1 a 242-recombinante (preparado como descrito no Exemplo 1) em adjuvante de Freund completo (SIGMA) e reforçado três vezes em intervalos de quatro semanas com 50 μg do mesmo antígeno em adjuvante de Freund incompleto. Três dias antes da fusão, os camundongos foram injetados por via intravenosa com 50 μg do mesmo antígeno em PBS. As células do baço de camundongos imunizados foram fundidas com células de mieloma NS/0 de acordo com o método para Kontsekova et al., The effect of postfusion cell density on establishment of hybridomas, Folia Biol. 34, 18-22 (1988). Os esplenócitos foram misturados com células de mieloma NS/0 (razão 5:1) e fundidos por 1 minuto em 1 ml de polietilenoglicol (PEG) 1550 (Serva) 50% em meio Eagle modificado por Dulbecco sem soro (DMEM) suplementado com[295] Six-week-old Balb / c mice were started subcutaneously with 50 μg of tau1 at 242-recombinant (prepared as described in Example 1) in complete Freund's adjuvant (SIGMA) and boosted three times at intervals of four weeks with 50 μg of the same antigen in incomplete Freund's adjuvant. Three days before fusion, the mice were injected intravenously with 50 μg of the same antigen in PBS. Spleen cells from immunized mice were fused with NS / 0 myeloma cells according to the method for Kontsekova et al., The effect of postfusion cell density on establishment of hybridomas, Folia Biol. 34, 18-22 (1988). Splenocytes were mixed with NS / 0 myeloma cells (5: 1 ratio) and fused for 1 minute in 1 ml of polyethylene glycol (PEG) 1550 (Serva) 50% in Dulbecco's modified Eagle medium without serum (DMEM) supplemented with
10% de dimetilsulfóxido. As células fundidas foram ressuspensas em DMEM contendo 20% de soro de cavalo, L-glutamina (2 mM), hipoxantina (0,1 mM), aminopterina (0,04 mM), timidina (0,016 mM) e gentamicina (40 U/ml), em uma densidade de 2,5 x 105 células de baço por poço em placas de 96 poços.10% dimethyl sulfoxide. The fused cells were resuspended in DMEM containing 20% horse serum, L-glutamine (2 mM), hypoxanthine (0.1 mM), aminopterin (0.04 mM), thymidine (0.016 mM) and gentamicin (40 U / ml), at a density of 2.5 x 105 spleen cells per well in 96-well plates.
[296] As células foram incubadas durante 10 dias a 37 ºC e os hibridomas em crescimento foram rastreados para a produção de anticorpos monoclonais específicos anti-tau1 a 242 por um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). As placas de microtitulação foram revestidas durante a noite com tau1 a 242 (5 μg/ml, 50 μl/poço) a 37 ºC em PBS. As placas foram bloqueadas com 1% de leite em pó desnatado para reduzir a ligação não específica, lavadas com PBS- Tween 20 a 0,05% e incubadas com 50 μl/poço de sobrenadante de cultura de hibridoma por 1 hora a 37 ºC. Os anticorpos monoclonais ligados foram detectados com imunoglobulina (Ig) de ovelha anticamundongo conjugada com peroxidase de rábano silvestre (HRP, DAKO). A reação foi desenvolvida com TMB one (Kem-En-Tec Diagnostics) como substrato de peroxidase e interrompida com 50 μl de H2SO4 a 2 M. A absorbância a 450 nm foi medida usando um Powerwave HT (Bio-Tek). As leituras com um valor de absorbância de pelo menos duas vezes o valor dos controles negativos (PBS) foram consideradas positivas. Culturas de hibridoma positivas foram subclonadas em ágar mole de acordo com o procedimento descrito em Kontsekova et al., Método para uma etapa para estabelecer hibridomas resistentes a 8-azaguanina adequados para preparação de triomas, J. Immunol. Methods, 145, 247-250 (1991).[296] The cells were incubated for 10 days at 37 ° C and the growing hybridomas were screened for the production of specific anti-tau1 monoclonal antibodies at 242 by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The microtiter plates were coated overnight with tau1 at 242 (5 μg / ml, 50 μl / well) at 37 ºC in PBS. The plates were blocked with 1% skimmed-milk powder to reduce non-specific binding, washed with 0.05% PBS-Tween 20 and incubated with 50 μl / well of hybridoma culture supernatant for 1 hour at 37 ºC. Bound monoclonal antibodies were detected with anti-mouse sheep immunoglobulin (Ig) conjugated to horseradish peroxidase (HRP, DAKO). The reaction was developed with TMB one (Kem-En-Tec Diagnostics) as a peroxidase substrate and interrupted with 50 μl of H2SO4 at 2 M. The absorbance at 450 nm was measured using a Powerwave HT (Bio-Tek). Readings with an absorbance value of at least twice the value of the negative controls (PBS) were considered positive. Positive hybridoma cultures were subcloned on soft agar according to the procedure described in Kontsekova et al., One-step method for establishing 8-azaguanine resistant hybridomas suitable for preparation of triomas, J. Immunol. Methods, 145, 247-250 (1991).
[297] O anticorpo monoclonal DC2E2 (produzido pela linhagem celular de hibridoma de camundongo depositada na Catálogo de Culturas do Tipo Americanas, com a designação de depósito de patente ATCC PTA-124991) foi identificado entre as culturas de hibridoma positivas assim produzidas e selecionadas. DC2E2 foi ainda caracterizado como descrito abaixo. O isótipo do anticorpo foi determinado ser IgG1 murino por ELISA (Fig. 1) usando um kit de isotipagem de Ig de camundongo (ISO-2, SIGMA). Exemplo 3 Mapeamento do Epítopo DC2E2 Usando Mutantes de Deleção de Tau Recombinantes, Peptídeos Derivados de Tau e Espectrometria de Massa[297] The monoclonal antibody DC2E2 (produced by the mouse hybridoma cell line deposited in the American Type Cultures Catalog, with the ATCC patent filing designation PTA-124991) was identified among the positive hybridoma cultures thus produced and selected. DC2E2 was further characterized as described below. The antibody isotype was determined to be murine IgG1 by ELISA (Fig. 1) using a mouse Ig isotyping kit (ISO-2, SIGMA). Example 3 Mapping the DC2E2 Epitope Using Recombinant Tau Deletion Mutants, Tau-Derived Peptides and Mass Spectrometry
[298] Mutantes de deleção da proteína tau humana 2N4R foram usados para mapeamento de epítopo de DC2E2 usando ELISA (Fig. 2A). Isoformas de tau humana recombinante 2N4R, 1N4R, 2N3R, 0N4R, 1N3R, 0N3R e mutantes de deleção tau foram preparados conforme descrito no Exemplo 1. Placas de microtitulação foram revestidas durante a noite a 37 ºC com proteínas tau recombinantes (5 μg/ml em PBS, 50 μl/poço). As placas foram bloqueadas com PBS- Tween20 (0,1% v/v) para reduzir a ligação não específica e foram incubadas com 50 μl/poço de sobrenadante de cultura de hibridoma DC2E2, por 1 hora a 37 ºC. O anticorpo monoclonal ligado foi detectado com Ig HRP de ovelha anticamundongo conjugado (DAKO). A reação foi desenvolvida com uma solução TMB (Kem-En-Tec Diagnostics) como substrato de peroxidase e interrompida com 50 μl de H2SO4 a 2M. A absorbância foi medida a 450 nm usando um Powerwave HT (Bio-Tek). As leituras com um valor de absorbância de pelo menos duas vezes o valor dos controles negativos (PBS) foram consideradas positivas. DC2E2 reconheceu as seguintes proteínas tau humana: seis isoformas de tau humana (Fig. 2B), tau 1 a 242, tau 31 a 441, tau 99-441, tau 1 a 226, tau151 a 391, tau 127-441, mas falhou em reconhecer os mutantes de deleção tau 1 a 136, tau 221 a 441 e tau 2N4R (Δ134-168) (Fig. 2C). Juntos, esses resultados sugerem que DC2E2 reconhece sítios de ligação ou epítopos em tau, localizados na região de alcance de prolina de tau entre os aminoácidos 151 a 188.[298] Deletion mutants of the human 2N4R tau protein were used for epitope mapping of DC2E2 using ELISA (Fig. 2A). Isoforms of recombinant human tau 2N4R, 1N4R, 2N3R, 0N4R, 1N3R, 0N3R and tau deletion mutants were prepared as described in Example 1. Microtiter plates were coated overnight at 37 ºC with recombinant tau proteins (5 μg / ml in PBS, 50 μl / well). The plates were blocked with PBS-Tween20 (0.1% v / v) to reduce non-specific binding and were incubated with 50 μl / well of DC2E2 hybridoma culture supernatant, for 1 hour at 37 ºC. Bound monoclonal antibody was detected with conjugated sheep anti-mouse Ig HRP (DAKO). The reaction was developed with a TMB solution (Kem-En-Tec Diagnostics) as a peroxidase substrate and interrupted with 50 μl of 2M H2SO4. Absorbance was measured at 450 nm using a Powerwave HT (Bio-Tek). Readings with an absorbance value of at least twice the value of the negative controls (PBS) were considered positive. DC2E2 recognized the following human tau proteins: six isoforms of human tau (Fig. 2B), tau 1 to 242, tau 31 to 441, tau 99-441, tau 1 to 226, tau151 to 391, tau 127-441, but failed in recognizing the deletion mutants tau 1 to 136, tau 221 to 441 and tau 2N4R (Δ134-168) (Fig. 2C). Together, these results suggest that DC2E2 recognizes binding sites or epitopes in tau, located in the region of tau proline span between amino acids 151 to 188.
[299] Para definir ainda mais o epítopo, foi realizado ELISA de competição. Para experimentos de competição, o anticorpo monoclonal DC2E2 (mAb) foi purificado a partir do sobrenadante de hibridoma sem soro em uma coluna de afinidade de Proteína G, como segue. O sobrenadante do hibridoma foi ajustado para pH 7,5, a solução foi pré-purificada por centrifugação, filtrada em um filtro de membrana de 0,45 μm e carregada em uma coluna de 5 ml de Proteína G Sepharose. O mAb DC2E2 foi eluído da coluna com glicina-HCl a 0,1 M, pH 2,7. As frações eluídas foram imediatamente neutralizadas com Tris-HCl a 1M pH 9,0. As frações combinadas foram dialisadas contra PBS, concentradas por ultrafiltração e armazenadas a -70 ºC. A concentração do anticorpo foi determinada medindo a absorbância a 280 nm, usando a fórmula c (mg/ml) = A280nm/1,43.[299] To further define the epitope, a competition ELISA was performed. For competition experiments, the monoclonal antibody DC2E2 (mAb) was purified from the hybridoma supernatant without serum in a Protein G affinity column, as follows. The hybridoma supernatant was adjusted to pH 7.5, the solution was pre-purified by centrifugation, filtered through a 0.45 μm membrane filter and loaded onto a 5 ml Protein G Sepharose column. The DC2E2 mAb was eluted from the column with 0.1 M glycine-HCl, pH 2.7. The eluted fractions were immediately neutralized with 1M Tris-HCl pH 9.0. The combined fractions were dialyzed against PBS, concentrated by ultrafiltration and stored at -70 ºC. The concentration of the antibody was determined by measuring the absorbance at 280 nm, using the formula c (mg / ml) = A280nm / 1.43.
[300] Para ELISA de competição, peptídeos (tau 141 a 17 0, 161 a 190, 181 a 210, 171 a 200) foram sintetizados por EZBiolabs com pureza superior a 90%. Placas de ELISA (Nunc Medisorp, Thermo Scientific, Dinamarca) foram revestidas durante a noite a 4 ºC com 50 μl/poço de 0,4 μg/ml de tau 1 a 242 recombinante purificado em PBS. As placas foram lavadas 4 vezes com PBS/Tween 20 (0,1% v/v) e bloqueadas com PBS/Tween 20 durante 2 h a 25 ºC. Os peptídeos foram dissolvidos separadamente em PBS a uma concentração final de 5 mM. Diluições em série (2,5 vezes) dos peptídeos em PBS/Tween 20 foram preparadas em placas de polipropileno com fundo de poço cônico (Greiner, # 651201) (faixa de concentração 200 μM, 32 μM, 12,8 μM, 5,1 μM, 2 μM, 0,8 μM e 0,3 μM). 60 μl de cada diluição foram adicionados por poço. DC2E2 purificado foi diluído para uma concentração de 0,6 μg/ml em PBS/Tween 20 e 60 μl deste anticorpo diluído foi misturado com cada diluição em série de peptídeos, resultando em misturas de 120 μl com 0,36 ng de anticorpo/60μl contendo cada respectivo peptídeo de teste em uma concentração de 200 μM, 32 μM, 12,8 μM, 5,1 μM, 2 μM, 0,8 μM e 0,3 μM. As misturas de anticorpo/peptídeo foram incubadas por 1 hora a 25 ºC em uma plataforma rotativa ajustada para 250 rpm. Cinquenta microlitros (50 μl) de misturas de anticorpo/peptídeo foram transferidos das placas de polipropileno para placas revestidas com tau1 a 242 e bloqueadas com PBS/Tween 20 (em duplicatas) e incubadas por 1 hora a 25 ºC em uma plataforma giratória configurada para 250 rpm. As placas foram lavadas 4x com PBS/Tween 20 e incubadas por 1 hora a 25 ºC em uma plataforma rotativa (definida para 250 rpm) com 50 μl de imunoglobulinas policlonais anticamundongo de cabra/HRP (Dako, # P0447) diluídas 1:1000 em PBS/Tween 20. As placas foram lavadas 4x com PBS/Tween e depois incubadas com 50 μl/poço de uma solução TMB (Kem-En-Tec Diagnostics) como substrato de peroxidase. A reação foi interrompida pela adição de 50 μl de H2SO4 a 2 M (Merck). A absorbância foi medida a 450 nm usando um Powerwave HT (Bio-Tek).[300] For competition ELISA, peptides (tau 141 to 170, 161 to 190, 181 to 210, 171 to 200) were synthesized by EZBiolabs with purity greater than 90%. ELISA plates (Nunc Medisorp, Thermo Scientific, Denmark) were coated overnight at 4 ºC with 50 μl / well of 0.4 μg / ml of purified recombinant tau 1 to 242 in PBS. The plates were washed 4 times with PBS / Tween 20 (0.1% v / v) and blocked with PBS / Tween 20 for 2 h at 25 ° C. The peptides were dissolved separately in PBS at a final concentration of 5 mM. Serial dilutions (2.5-fold) of the peptides in PBS / Tween 20 were prepared in polypropylene plates with conical well bottom (Greiner, # 651201) (concentration range 200 μM, 32 μM, 12.8 μM, 5, 1 μM, 2 μM, 0.8 μM and 0.3 μM). 60 μl of each dilution was added per well. Purified DC2E2 was diluted to a concentration of 0.6 μg / ml in PBS / Tween 20 and 60 μl of this diluted antibody was mixed with each serial dilution of peptides, resulting in mixtures of 120 μl with 0.36 ng of antibody / 60μl containing each respective test peptide at a concentration of 200 μM, 32 μM, 12.8 μM, 5.1 μM, 2 μM, 0.8 μM and 0.3 μM. The antibody / peptide mixtures were incubated for 1 hour at 25 ºC on a rotating platform adjusted to 250 rpm. Fifty microliters (50 μl) of antibody / peptide mixtures were transferred from polypropylene plates to plates coated with tau1 at 242 and blocked with PBS / Tween 20 (in duplicates) and incubated for 1 hour at 25 ºC on a turntable configured for 250 rpm. The plates were washed 4x with PBS / Tween 20 and incubated for 1 hour at 25 ºC on a rotating platform (defined for 250 rpm) with 50 μl of polyclonal goat anti-mouse immunoglobulins / HRP (Dako, # P0447) diluted 1: 1000 in PBS / Tween 20. The plates were washed 4x with PBS / Tween and then incubated with 50 μl / well of a TMB solution (Kem-En-Tec Diagnostics) as a peroxidase substrate. The reaction was stopped by adding 50 μl of 2 M H2SO4 (Merck). Absorbance was measured at 450 nm using a Powerwave HT (Bio-Tek).
[301] ELISA de competição foi realizado com os seguintes peptídeos: tau 141 a 170, 161 a 190, 171 a 200, 181 a 210. (Fig. 2D) Apenas o peptídeo de tau 161 a 190 competiu com tau 1 a 242 pela ligação a DC2E2 (Fig. 2D). No entanto, o deslocamento de peptídeos para o terminal C de tau (171 a 200, 181 a 210) ou para o terminal N de tau (141 a 170) levou à perda de atividade competitiva com tau 1 a 242 para ligação a DC2E2. Estes resultados sugerem que o epítopo está localizado entre os aminoácidos 161 a 181.[301] Competition ELISA was performed with the following peptides: tau 141 to 170, 161 to 190, 171 to 200, 181 to 210. (Fig. 2D) Only tau peptide 161 to 190 competed with tau 1 to 242 for connection to DC2E2 (Fig. 2D). However, the displacement of peptides to the C-terminal of tau (171 to 200, 181 to 210) or to the N-terminal of tau (141 to 170) led to the loss of competitive activity with tau 1 to 242 for binding to DC2E2. These results suggest that the epitope is located between amino acids 161 to 181.
[302] Uma abordagem de espectrometria de massa LC/MALDI foi usada com o objetivo de definir o epítopo mais precisamente. A sequência do sítio de ligação foi identificada pela ligação de proteínas tau digeridas proteoliticamente ao anticorpo monoclonal DC2E2 imobilizado em esferas magnéticas e subsequente identificação de peptídeos eluídos por espectrometria de massa LC/MALDI. Proteínas tau (tau 2N4R e tau151 a 391) foram digeridas com a mistura de tripsina, Glu-C, quimiotripsina a 37 ºC durante a noite ou ácido fórmico durante 2 horas a 108 ºC. A reação de ligação foi realizada em CHAPS a 1% em PBS durante 2 horas. Os peptídeos não ligados foram removidos por três lavagens com 1% de CHAPS em PBS. Os peptídeos ligados foram eluídos por três lavagens com ácido fórmico e liofilizados. Os peptídeos foram separados por UHPLC (Dionex, Ultimate 3000 nano-LC system), as frações foram misturadas com solução de matriz HCCA e distribuídas em placa de amostra MTP Anchor Chip 384 MALDI (Bruker Daltonics). As amostras fracionadas foram analisadas com um instrumento MALDI TOF/TOF (Ultraflextreme, Bruker Daltonics) operado no modo de íon positivo. Os espectros de MS e MS/MS coletados foram buscados contra banco de dados de proteínas tau usando o mecanismo de busca Mascot (Matrix Science).[302] An LC / MALDI mass spectrometry approach was used in order to define the epitope more precisely. The sequence of the binding site was identified by the binding of proteolytically digested tau proteins to monoclonal antibody DC2E2 immobilized on magnetic beads and subsequent identification of peptides eluted by LC / MALDI mass spectrometry. Tau proteins (tau 2N4R and tau151 to 391) were digested with the mixture of trypsin, Glu-C, chymotrypsin at 37 ºC overnight or formic acid for 2 hours at 108 ºC. The ligation reaction was carried out in 1% CHAPS in PBS for 2 hours. Unbound peptides were removed by three washes with 1% CHAPS in PBS. Bound peptides were eluted by three washes with formic acid and lyophilized. The peptides were separated by UHPLC (Dionex, Ultimate 3000 nano-LC system), the fractions were mixed with HCCA matrix solution and distributed on an MTP Anchor Chip 384 MALDI sample plate (Bruker Daltonics). The fractionated samples were analyzed with a MALDI TOF / TOF instrument (Ultraflextreme, Bruker Daltonics) operated in the positive ion mode. The collected MS and MS / MS spectra were searched against a tau protein database using the Mascot search engine (Matrix Science).
[303] A análise do banco de dados revelou várias sequências de peptídeos, todas contendo KGQANATRIP. Este peptídeo está localizado em tau 2N4R na região de 163-172, uma região rica em prolina. Exemplo 4 DC2E2 Reconhece um Tripleto A68 Específico para Tau Insolúvel na Doença de Alzheimer, Tau Fosforilada e Tau Não Fosforilada[303] Analysis of the database revealed several peptide sequences, all containing KGQANATRIP. This peptide is located in 2N4R tau in the 163-172 region, a region rich in proline. Example 4 DC2E2 Recognizes an A68 Triplet Specific for Insoluble Tau in Alzheimer's Disease, Phosphorylated Tau and Non-Phosphorylated Tau
[304] Na doença de Alzheimer, a tau é hiperfosforilada. Portanto, para caracterização detalhada das propriedades de ligação de DC2E2, PHF-tau hiperfosforilada e tau fosforilada in vitro foram examinadas.[304] In Alzheimer's disease, tau is hyperphosphorylated. Therefore, for detailed characterization of the binding properties of DC2E2, hyperphosphorylated PHF-tau and phosphorylated tau in vitro were examined.
[305] Complexos de tau insolúveis em sarcosil (PHF-Tau) foram isolados de cérebros humanos com AD usando o método sarcosil (Greenberg and Davies, A preparation of Alzheimer’s paried helical filaments that displays distint tau proteins by polyacrylamide gel electrophoresis, PNAS, 87:5827-31, 1990). Para a extração de proteínas, tecido cerebral humano com AD congelado (córtex frontal, amostras de Braak estágio VI obtidas do banco de cérebro da Holanda) foi homogeneizado em 10 volumes de tampão de extração frio (10 mM de Tris pH 7,4, 0,8 M de NaCl, 1 mM de EGTA e Sacarose a 10%) e o homogenato foi centrifugado durante 20 min a 20.000xg. Para preparar tau insolúvel em sarcosil, o sobrenadante foi suplementado com N-lauroilsarcosina (SIGMA) até uma concentração final de 1% e incubado por 1 h em temperatura ambiente, com agitação. Após centrifugação a 100.000xg por 1h, o sobrenadante resultante foi descartado e um pélete compreendendo a fração de tau insolúvel em sarcosil foi ressuspenso em 1/50 volume do sobrenadante usado para a preparação da tau insolúvel.[305] Sarcosil-insoluble tau complexes (PHF-Tau) were isolated from human brains with AD using the sarcosil method (Greenberg and Davies, A preparation of Alzheimer's paried helical filaments that displays distinct tau proteins by polyacrylamide gel electrophoresis, PNAS, 87 : 5827-31, 1990). For protein extraction, human brain tissue with frozen AD (frontal cortex, Braak stage VI samples obtained from the Netherlands brain bank) was homogenized in 10 volumes of cold extraction buffer (10 mM Tris pH 7.4, 0 , 8 M NaCl, 1 mM EGTA and 10% Sucrose) and the homogenate was centrifuged for 20 min at 20,000xg. To prepare tau insoluble in sarcosil, the supernatant was supplemented with N-lauroylsarcosine (SIGMA) to a final concentration of 1% and incubated for 1 h at room temperature, with shaking. After centrifugation at 100,000xg for 1h, the resulting supernatant was discarded and a pellet comprising the fraction of sarcosil insoluble tau was resuspended in 1/50 volume of the supernatant used for the preparation of insoluble tau.
[306] Para a fosforilação in vitro de tau 2N4R e tau151 a 391, foi usado o extrato de quinase. Cérebro de rato adulto (1g/2,5 ml) foi homogeneizado em tampão de quinase (10 mM de TRIS-HCl, pH 7,4; 5mM EGTA, 2mM de DTT; 1mM de PMSF; 2mM de MgCl2, leupeptina (20 μg/ml), pepstatina (20 μg/ml), aprotinina (20 μg/ml)) e após centrifugação a 100.000 xg por 30 min a 4 ºC o sobrenadante (extrato de quinase) foi utilizado para a fosforilação da tau. A reação de fosforilação foi realizada a 37 ºC em 10 mM de TRIS-HCl, pH 7,4; 5mM de EGTA, 2mM de DTT; 1 mM de PMSF; leupeptina (20μg/ml); pepstatina (20μg/ml); aprotinina (20μg/ml); 2 mM de ATP; 2 mM de MgCl2 e 10 µM de ácido ocadaico. O extrato da quinase cerebral (5 µl) foi adicionado a 50 µl de solução de tau (1 µM) e a reação foi incubada a 37 ºC por 24h. A fosforilação de tau foi analisada por SDS-PAGE e immunoblotting usando antissoro de coelho criado contra seis isoformas de tau humana recombinante (Csokova et al., Rapid purification of truncated tau proteins: model approach to purification of functionally active fragments of disordered proteins, implication for neurodegenerative diseases, Protein Expression and Purification, 35:366-372, 2004).[306] For in vitro phosphorylation of tau 2N4R and tau151 to 391, kinase extract was used. Adult rat brain (1g / 2.5 ml) was homogenized in kinase buffer (10 mM TRIS-HCl, pH 7.4; 5 mM EGTA, 2 mM DTT; 1 mM PMSF; 2 mM MgCl2, leupeptin (20 μg / ml), pepstatin (20 μg / ml), aprotinin (20 μg / ml)) and after centrifugation at 100,000 xg for 30 min at 4 ºC the supernatant (kinase extract) was used for phosphorylation of tau. The phosphorylation reaction was carried out at 37 ºC in 10 mM TRIS-HCl, pH 7.4; 5mM EGTA, 2mM DTT; 1 mM PMSF; leupeptin (20μg / ml); pepstatin (20μg / ml); aprotinin (20μg / ml); 2 mM ATP; 2 mM MgCl2 and 10 µM ocadaic acid. The cerebral kinase extract (5 µl) was added to 50 µl of tau solution (1 µM) and the reaction was incubated at 37 ºC for 24h. Phosphorylation of tau was analyzed by SDS-PAGE and immunoblotting using rabbit antiserum created against six isoforms of recombinant human tau (Csokova et al., Rapid purification of truncated tau proteins: model approach to purification of functionally active fragments of disordered proteins, implication for neurodegenerative diseases, Protein Expression and Purification, 35: 366-372, 2004).
[307] As proteínas tau 2N4R e tau151 a 391 fosforilada e não fosforilada e PHF-tau insolúvel em sarcosil foram analisadas por imunotransferência usando DC2E2. As proteínas tau solúveis foram diluídas com um volume igual de tampão de carregamento de amostra 2x SDS (dodecilsulfato de sódio) (com β-mercaptoetanol) (Laemmli, 1970) e 250 ng de proteínas foram carregadas por pista. Para PHF-tau insolúvel, os péletes foram dissolvidos em tampão de carregamento de amostra SDS 1x, em 1/50 do volume da fração solúvel usada para a preparação da fração insolúvel de tau. Em seguida, volumes iguais de tau solúvel e frações de tau insolúvel em sarcosil foram usados para imunoblotting, que correspondeu a 15 μg de proteína total na fração solúvel (vide Filipcik et al. 2010). As amostras foram aquecidas a 95 ºC durante 5 min, carregadas em géis de SDS poliacrilamida com gradiente de 5-20% e sujeitas a eletroforese em um sistema tampão Tris-glicina-SDS durante 40 minutos a 25 mA. As proteínas foram transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (1 h a 150 mA em 10 mM de CAPS, pH 12). Após a transferência, as membranas foram bloqueadas em 5% de leite em pó desnatado em solução salina tamponada com fosfato (PBS; 136,89 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 8,09 mM de Na2HPO4, 1,47 mM de KH2PO4) por 1 h em temperatura ambiente e, em seguida, incubadas por 12 h com sobrenadante de cultura de hibridoma DC2E2, seguido por três lavagens com grandes volumes de PBS-T (1% Tween 20). As membranas foram incubadas (1 h em temperatura ambiente) com Ig anticamundongo de cabra conjugado com HRP (DAKO, Dinamarca), diluído 1:3.000 com leite em pó desnatado a 1% em PBS, como anticorpo secundário. Esta incubação foi seguida por lavagem (três vezes) com Tween 20 a 0,1% em PBS. Os blots foram desenvolvidos com Substrato Quimioluminescente SuperSignal West Pico (Pierce, U.S.A), e os sinais de proteína detectados usando um sistema de imagem LAS3000 (FUJI Photo Film Co., Japão). As intensidades do sinal de quimioluminescência foram quantificadas usando o software AIDA (Advanced Image Data Analyzer, Raytest, Straubenhardt, Germany).[307] The proteins tau 2N4R and tau151 to 391 phosphorylated and non-phosphorylated and PHF-tau insoluble in sarcosil were analyzed by immunoblotting using DC2E2. The soluble tau proteins were diluted with an equal volume of 2x SDS sample loading buffer (sodium dodecyl sulfate) (with β-mercaptoethanol) (Laemmli, 1970) and 250 ng of proteins were loaded per lane. For insoluble PHF-tau, the pellets were dissolved in 1x SDS sample loading buffer, in 1/50 of the volume of the soluble fraction used for the preparation of the insoluble tau fraction. Then, equal volumes of soluble tau and fractions of sarcosil-insoluble tau were used for immunoblotting, which corresponded to 15 μg of total protein in the soluble fraction (see Filipcik et al. 2010). The samples were heated to 95 ºC for 5 min, loaded on SDS polyacrylamide gels with a 5-20% gradient and subjected to electrophoresis in a Tris-glycine-SDS buffer system for 40 minutes at 25 mA. The proteins were transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (1 h at 150 mA in 10 mM CAPS, pH 12). After transfer, the membranes were blocked in 5% skimmed-milk powder in phosphate buffered saline (PBS; 136.89 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.09 mM Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4) for 1 h at room temperature and then incubated for 12 h with DC2E2 hybridoma culture supernatant, followed by three washes with large volumes of PBS-T (1% Tween 20). The membranes were incubated (1 h at room temperature) with goat anti-mouse Ig conjugated to HRP (DAKO, Denmark), diluted 1: 3,000 with 1% skimmed-milk powder in PBS, as a secondary antibody. This incubation was followed by washing (three times) with 0.1% Tween 20 in PBS. The blots were developed with SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, U.S.A), and the protein signals detected using a LAS3000 imaging system (FUJI Photo Film Co., Japan). The chemiluminescence signal intensities were quantified using the AIDA software (Advanced Image Data Analyzer, Raytest, Straubenhardt, Germany).
[308] DC2E2 reconheceu ambas as formas de proteínas tau, tau 2N4R fosforilada in vivo, 151 a 391 e formas de tipo selvagem (não fosforilada) de tau 2N4R e tau151 a 391 (Fig. 3).[308] DC2E2 recognized both forms of tau protein, 2N4R phosphorylated tau in vivo, 151 to 391 and wild-type (non-phosphorylated) forms of 2N4R tau and tau151 to 391 (Fig. 3).
[309] Além disso, é digno de nota que DC2E2 reconheceu o tripleto A68, uma característica da tau patológica (PHF-tau) na degeneração neurofibrilar da AD. Estes resultados demonstram que DC2E2 pode reconhecer e ligar diferentes tipos de proteínas tau, tau patológica isolada de cérebro com AD, tau fisiológica (2N4R), tau151 a 391 truncada e suas formas fosforiladas. Assim, o DC2E2 reconheceu epítopos independentes da fosforilação do epítopo. As propriedades de ligação descritas de DC2E2 sugerem a possibilidade de usar o anticorpo como ferramenta de diagnóstico para AD. Exemplo 5 Sequenciamento de Regiões Variáveis DC2E2[309] Furthermore, it is noteworthy that DC2E2 recognized the A68 triplet, a characteristic of pathological tau (PHF-tau) in AD neurofibrillary degeneration. These results demonstrate that DC2E2 can recognize and bind different types of tau proteins, pathological tau isolated from brain with AD, physiological tau (2N4R), truncated tau151 to 391 and their phosphorylated forms. Thus, DC2E2 recognized epitopes independent of epitope phosphorylation. The described binding properties of DC2E2 suggest the possibility of using the antibody as a diagnostic tool for AD. Example 5 Sequencing of Variable Regions DC2E2
[310] Determinação das sequências de nucleotídeos e aminoácidos das regiões variáveis da cadeia leve e pesada de DC2E2 (Fig. 5). A sequência de nucleotídeos das regiões variáveis DC2E2 (Fig. 5A e 5C) foi determinada por sequenciamento de DNA de cDNA sintetizado usando RNA total extraído da linhagem celular de hibridoma de camundongo DC2E2 (ATCC), que expressa o anticorpo monoclonal DC2E2. O RNA total foi extraído usando o MiniKit RNeasy (Qiagen, Alemanha). A síntese do primeiro filamento de cDNA foi realizada usando o kit de "Transcrição reversa de cDNA de alta capacidade" de acordo com o protocolo do fabricante (Applied[310] Determination of the nucleotide and amino acid sequences of the variable regions of the light and heavy chain of DC2E2 (Fig. 5). The nucleotide sequence of the variable regions DC2E2 (Fig. 5A and 5C) was determined by DNA sequencing of cDNA synthesized using total RNA extracted from the mouse hybridoma cell line DC2E2 (ATCC), which expresses the monoclonal antibody DC2E2. The total RNA was extracted using the MiniKit RNeasy (Qiagen, Germany). The synthesis of the first cDNA strand was performed using the "High capacity cDNA reverse transcription" kit according to the manufacturer's protocol (Applied
Biosystems, EUA). A composição dos reagentes para a mistura mestre de transcrição reversa 2x foi a seguinte (quantidades por 20 μL de reação): 2 μL de tampão RT 10x; 0,8 μL de 25x dNTP Mix (100 mM); 2 μl de Iniciadores Aleatórios 10x RT (50 μM); 1 μL de Transcriptase Reversa MultiScribe™ (50 U/μL); 4,2 μL de H2O livre de nuclease. Para a transcrição reversa, 10 μL da mistura principal de transcrição reversa 2x foram misturados com a amostra de RNA (1 μg/10 μL) e o cDNA foi sintetizado nas seguintes condições: 10 min a 25 ºC, 120 min a 37 ºC, 5 min a 85 ºC e resfriamento final a 4 ºC. Os genes que codificam as regiões variáveis das cadeias leves e pesadas foram amplificados por reação em cadeia da polimerase (PCR) usando DNA Polimerase de Alta Fidelidade Phusion® (Thermo Fisher Scientific, EUA). Os iniciadores diretos (M13 a L6 5’-Biosystems, USA). The composition of the reagents for the 2x reverse transcription master mix was as follows (amounts per 20 μL of reaction): 2 μL of RT 10x buffer; 0.8 μL of 25x dNTP Mix (100 mM); 2 μl of Random Initiators 10x RT (50 μM); 1 μL of MultiScribe ™ Reverse Transcriptase (50 U / μL); 4.2 μL of nuclease-free H2O. For reverse transcription, 10 μL of the 2x reverse transcription master mix was mixed with the RNA sample (1 μg / 10 μL) and the cDNA was synthesized under the following conditions: 10 min at 25 ° C, 120 min at 37 ° C, 5 min at 85ºC and final cooling at 4ºC. The genes encoding the variable regions of the light and heavy chains were amplified by polymerase chain reaction (PCR) using Phusion® High Fidelity DNA Polymerase (Thermo Fisher Scientific, USA). Direct primers (M13 to L6 5’-
TGTAAAACGACGGCCAGTΑTGAGGTKCYYTGYTSAGYTYCTGRGG -3’ e M13 a H1 5’- TGTAAAACGACGGCCAGTATGAAATGCAGCTGGGTCATSTTCTTC- 3’), para a cadeia leve e pesada, respectivamente, foram selecionados após a triagem de iniciadores diretos da sequência de imunoglobulina de camundongo, respectivamente. O uso de iniciadores diretos de sequência de sinal tem a vantagem de amplificar todo o gene V de cadeias leves e pesadas de anticorpos, sem polarização introduzida quando o início da região variável estiver sendo usado para o projeto de iniciadores. Os iniciadores reversos para as cadeias leves e pesadas (M13 a KC 5’- CAGGAAACAGCTATGACCACTGGATGGTGGGAAGATGG-3’ e M13 a CG1 5’- CAGGAAACAGCTATGACCCAGTGGATAGACAGATGGGGG-3’, respectivamente) foram derivados de cadeias constantes kapa e IgG1, respectivamente.TGTAAAACGACGGCCAGTΑTGAGGTKCYYTGYTSAGYTYCTGRGG -3 ’and M13 to H1 5’- TGTAAAACGACGGCCAGTATGAAATGCAGCTGGGTCATSTTCTTC-3’), for the light and heavy chain, respectively, of trunks, respectively. The use of direct signal sequence primers has the advantage of amplifying the entire antibody V light and heavy chain gene, without polarization introduced when the beginning of the variable region is being used for the design of primers. The reverse primers for the light and heavy chains (M13 to KC 5'- CAGGAAACAGCTATGACCACTGGATGGTGGGAAGATGG-3 'and M13 to CG1 5'-CAGGAAACAGCTATGACCCAGTGGATAGACAGATGGGGG-3 ’, respectively) were derived from Ig1 chains.
[311] Os produtos de PCR foram sequenciados e as sequências de DNA resultantes das regiões variáveis das cadeias leve e pesada de DC2E2 são mostradas nas Figs. 5A e 5C, respectivamente. As regiões determinantes de complementaridade (CDRs) estão sublinhadas nas sequências de proteínas das cadeias leve e pesada de DC2E2 (Figs. 5B e 5D, respectivamente). CDRs e regiões estruturais (FR) foram identificadas de acordo com o sistema de numeração ImMunoGeneTics (IMGT) (vide, por exemplo, Lefranc MP The IMGT unique numbering for immunoglobulins, T-cell receptors, and Ig-like domains. The Immunologist, 7, 132-1 36, 1999 (1999)).similares Exemplo 6 Preparação de Linhagens Celulares de Hibridoma que Produzem Anticorpos Monoclonais Contra Espécies de Tau Insolúveis na Doença de Alzheimer Humana, Triagem de Anticorpos Monoclonais por ELISA e Caracterização Inicial do Anticorpo Monoclonal DC2E7[311] The PCR products have been sequenced and the DNA sequences resulting from the variable regions of the DC2E2 light and heavy chains are shown in Figs. 5A and 5C, respectively. The complementarity determining regions (CDRs) are underlined in the protein sequences of the DC2E2 light and heavy chains (Figs. 5B and 5D, respectively). CDRs and structural regions (FR) have been identified according to the ImMunoGeneTics (IMGT) numbering system (see, for example, Lefranc MP The IMGT unique numbering for immunoglobulins, T-cell receptors, and Ig-like domains. The Immunologist, 7 , 132-1 36, 1999 (1999)) similar Example 6 Preparation of Hybridoma Cell Lines that Produce Monoclonal Antibodies Against Insoluble Tau Species in Human Alzheimer's Disease, Monoclonal Antibody Screening by ELISA and Initial Characterization of the DC2E7 Monoclonal Antibody
[312] Tau insolúvel em sarcosil (PHF-tau) de cérebro com AD foi usada como um imunogênio para imunização de camundongos Balb/c. Os complexos de tau insolúveis em sarcosil foram isolados do cérebro humano com AD (córtex frontal, Braak estágio VI, banco de cérebro da Holanda) usando o método sarcosil (Greenberg e Davies, A preparation of Alzheimer paired helical filaments that diplays distinct tau proteins by polyacrylamide gel electrophoresis, PNAS, 87:5827-31, 1990) conforme descrito no Exemplo 4.[312] Sarcosil insoluble tau (PHF-tau) from brain with AD was used as an immunogen for immunizing Balb / c mice. Sarcosil-insoluble tau complexes were isolated from the human brain with AD (frontal cortex, Braak stage VI, Netherlands brain bank) using the sarcosil method (Greenberg and Davies, A preparation of Alzheimer paired helical filaments that diplays distinct tau proteins by polyacrylamide gel electrophoresis, PNAS, 87: 5827-31, 1990) as described in Example 4.
[313] Camundongos Balb/c de seis semanas de idade foram preparados por via subcutânea com aproximadamente 20-30 μg de proteína tau insolúvel isolada do tecido cerebral de Alzheimer humano em adjuvante completo de Freund (SIGMA) e reforçados cinco vezes em intervalos de quatro semanas com 20-30 μg do mesmo antígeno em adjuvante incompleto de Freund. Três dias antes da fusão, os camundongos foram injetados por via intravenosa com 20-30 μg do mesmo antígeno em PBS. As células do baço de camundongos imunizados foram fundidas com células de mieloma NS/0 de acordo com o método para Kontsekova et al., The effect of postfusion cell density on establishment of hybridomas, Folia Biol. 34, 18-22 (1988). Os esplenócitos foram misturados com células de mieloma NS/0 (razão 5:1) e fundidos por 1 minuto em 1 ml de polietilenoglicol (PEG) 1550 (Serva) 50% em meio de Eagle modificado por Dulbecco sem soro (DMEM) suplementado com 10% de dimetilsulfóxido. As células fundidas foram ressuspensas em DMEM contendo 20% de soro de cavalo, L-glutamina (2 mM), hipoxantina (0,1 mM), aminopterina (0,04 mM), timidina (0,016 mM) e gentamicina (40 U/ml), em uma densidade de 2,5 x 105 células de baço por poço em placas de 96 poços.[313] Six-week-old Balb / c mice were prepared subcutaneously with approximately 20-30 μg of insoluble tau protein isolated from human Alzheimer's brain tissue in Freund's complete adjuvant (SIGMA) and boosted five times at intervals of four weeks with 20-30 μg of the same antigen in Freund's incomplete adjuvant. Three days before the fusion, the mice were injected intravenously with 20-30 μg of the same antigen in PBS. Spleen cells from immunized mice were fused with NS / 0 myeloma cells according to the method for Kontsekova et al., The effect of postfusion cell density on establishment of hybridomas, Folia Biol. 34, 18-22 (1988). Splenocytes were mixed with NS / 0 myeloma cells (5: 1 ratio) and fused for 1 minute in 1 ml of polyethylene glycol (PEG) 1550 (Serva) 50% in Dulbecco's modified Eagle's medium without serum (DMEM) supplemented with 10% dimethyl sulfoxide. The fused cells were resuspended in DMEM containing 20% horse serum, L-glutamine (2 mM), hypoxanthine (0.1 mM), aminopterin (0.04 mM), thymidine (0.016 mM) and gentamicin (40 U / ml), at a density of 2.5 x 105 spleen cells per well in 96-well plates.
[314] As células foram incubadas por 10-14 dias a 37 ºC e os hibridomas em crescimento foram rastreados para a produção de anticorpos monoclonais específicos anti-PHF-tau por um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). As placas de microtitulação foram revestidas durante a noite com PHF-tau (5 μg/ml, 50 μl/poço) a 37 ºC em PBS. As placas foram bloqueadas com 1% de leite em pó desnatado para reduzir a ligação não específica, lavadas com PBS- Tween 20 a 0,05% e incubadas com 50 μl/poço de sobrenadante de cultura de hibridoma por 1 hora a 37 ºC. Os anticorpos monoclonais ligados foram detectados com imunoglobulina (Ig) de ovelha anticamundongo conjugada com peroxidase de rábano (HRP, DAKO). A reação foi desenvolvida com TMB one (Kem-En-Tec Diagnostics) como substrato de peroxidase e interrompida com 50 μl de H2SO4 a 2 M. A absorbância a 450 nm foi medida usando um Powerwave HT (Bio-Tek). As leituras com um valor de absorbância de pelo menos duas vezes o valor dos controles negativos (PBS) foram consideradas positivas. Culturas de hibridoma positivas foram subclonadas em ágar mole de acordo com o procedimento descrito em Kontsekova et al., One-step method for establishing 8-azaguanine-resistant hybridomas suitable for preparation of triomas, J. Immunol. Methods, 145, 247-250, (1991).[314] The cells were incubated for 10-14 days at 37 ºC and growing hybridomas were screened for the production of specific monoclonal anti-PHF-tau antibodies by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The microtiter plates were coated overnight with PHF-tau (5 μg / ml, 50 μl / well) at 37 ºC in PBS. The plates were blocked with 1% skimmed-milk powder to reduce non-specific binding, washed with 0.05% PBS-Tween 20 and incubated with 50 μl / well of hybridoma culture supernatant for 1 hour at 37 ºC. Bound monoclonal antibodies were detected with anti-mouse sheep immunoglobulin (Ig) conjugated to horseradish peroxidase (HRP, DAKO). The reaction was developed with TMB one (Kem-En-Tec Diagnostics) as a peroxidase substrate and interrupted with 50 μl of H2SO4 at 2 M. The absorbance at 450 nm was measured using a Powerwave HT (Bio-Tek). Readings with an absorbance value of at least twice the value of the negative controls (PBS) were considered positive. Positive hybridoma cultures were subcloned on soft agar according to the procedure described in Kontsekova et al., One-step method for establishing 8-azaguanine-resistant hybridomas suitable for preparation of triomas, J. Immunol. Methods, 145, 247-250, (1991).
[315] O anticorpo monoclonal DC2E7 (produzido pela linhagem celular de hibridoma de camundongo depositada no Catálogo de Culturas do Tipo Americanas, com a Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-124992) foi identificado entre as culturas de hibridoma positivas. DC2E7 foi ainda caracterizado conforme descrito abaixo. O isótipo do anticorpo foi determinado ser IgG2a murino por ELISA (Fig. 4) usando um kit de isotipagem de Ig de camundongo (ISO-2, SIGMA). Exemplo 7 Sequenciamento de Regiões Variáveis DC2E7[315] The monoclonal antibody DC2E7 (produced by the mouse hybridoma cell line deposited in the American Type Cultures Catalog, under the ATCC Patent Filing Designation PTA-124992) has been identified among the positive hybridoma cultures. DC2E7 was further characterized as described below. The antibody isotype was determined to be murine IgG2a by ELISA (Fig. 4) using a mouse Ig isotyping kit (ISO-2, SIGMA). Example 7 Sequencing of Variable Regions DC2E7
[316] Determinação das sequências de nucleotídeos e aminoácidos das regiões variáveis de cadeia leve e pesada de DC2E7 (Fig. 6). A sequência de nucleotídeos das regiões variáveis de DC2E7 (Figs. 6A e 6C) foi determinada por sequenciamento de DNA de cDNA sintetizado usando RNA total extraído da linhagem celular de hibridoma de camundongo DC2E7 (ATCC), que expressa o anticorpo monoclonal DC2E7. O RNA total foi extraído usando o MiniKit RNeasy (Qiagen, Alemanha). A síntese do primeiro filamento de cDNA foi realizada usando o kit de "Transcrição reversa de cDNA de alta capacidade" de acordo com o protocolo do fabricante (Applied Biosystems, EUA). A composição dos reagentes para a mistura mestre de transcrição reversa 2x foi a seguinte (quantidades por 20 μL de reação): 2 μL de tampão RT 10x; 0,8 μL de 25x Mistura de dNTP (100 mM); 2 μl de Iniciadores Aleatórios 10x RT (50 μM); 1 μL de Transcriptase Reversa MultiScribe™ (50 U/μL); 4,2 μL de H2O sem nuclease. Para a transcrição reversa, 10 μL da mistura mestre 2x de transcrição reversa foram misturados com a amostra de RNA (1 μg/10 μL) e o cDNA foi sintetizado nas seguintes condições: 10 min a 25 ºC, 120 min a 37 ºC, 5 min a 85 ºC e resfriamento final a 4 ºC. A amplificação dos genes que codificam as regiões variáveis das cadeias leves e pesadas foi feita por reação em cadeia da polimerase (PCR) usando DNA de Alta Fidelidade Polimerase Phusion® (Thermo Fisher Scientific, EUA). Os iniciadores diretos (M13 a L12 5'- TGTAAAACGACGGCCAGTATGAAGTTTCCTTCTCAACTTCTGCTC- 3' e M13 a H5 5'-[316] Determination of the nucleotide and amino acid sequences of the variable regions of the light and heavy chain of DC2E7 (Fig. 6). The nucleotide sequence of the variable regions of DC2E7 (Figs. 6A and 6C) was determined by sequencing cDNA DNA synthesized using total RNA extracted from the mouse hybridoma cell line DC2E7 (ATCC), which expresses the monoclonal antibody DC2E7. The total RNA was extracted using the MiniKit RNeasy (Qiagen, Germany). The synthesis of the first cDNA strand was performed using the "High capacity cDNA reverse transcription" kit according to the manufacturer's protocol (Applied Biosystems, USA). The composition of the reagents for the 2x reverse transcription master mix was as follows (quantities per 20 μL of reaction): 2 μL of RT 10x buffer; 0.8 μL of 25x Mixture of dNTP (100 mM); 2 μl of Random Initiators 10x RT (50 μM); 1 μL of MultiScribe ™ Reverse Transcriptase (50 U / μL); 4.2 μL of H2O without nuclease. For reverse transcription, 10 μL of the 2x reverse transcription master mix was mixed with the RNA sample (1 μg / 10 μL) and the cDNA was synthesized in the following conditions: 10 min at 25 ° C, 120 min at 37 ° C, 5 min at 85ºC and final cooling at 4ºC. The amplification of the genes encoding the variable regions of the light and heavy chains was done by polymerase chain reaction (PCR) using High Fidelity Polymerase Phusion® DNA (Thermo Fisher Scientific, USA). The direct primers (M13 to L12 5'- TGTAAAACGACGGCCAGTATGAAGTTTCCTTCTCAACTTCTGCTC- 3 'and M13 to H5 5'-
TGTAAAACGACGGCCAGTATGGACTCCAGGCTCAAMAGTTTTCCT T-3') foram selecionados após a triagem de uma biblioteca de iniciadores diretos da sequência de sinal de imunoglobulina de camundongo. O uso dos iniciadores diretos da sequência de sinal tem a vantagem de amplificar todo o gene V de ambas as cadeias de anticorpos leves e pesadas, sem desvios introduzidos quando o início da região variável está sendo usado para o projeto de iniciador. Os iniciadores reversos para as cadeias leve e pesada (M13 a KC 5'- CAGGAAACAGCTATGACCACTGGATGGTGGGAAGATGG-3' e M13 a CG2a 5'- CAGGAAACAGCTATGACCCAGTGGATAGACCGATGGGGC-3') foram derivados das regiões constantes das cadeias kapa e IgG2a, respectivamente.TGTAAAACGACGGCCAGTATGGACTCCAGGCTCAAMAGTTTTCCT T-3 ') were selected after screening a library of direct primers of the mouse immunoglobulin signal sequence. The use of direct signal sequence primers has the advantage of amplifying the entire V gene of both light and heavy antibody chains, with no deviations introduced when the beginning of the variable region is being used for the primer design. The reverse primers for the light and heavy chains (M13 to KC 5'- CAGGAAACAGCTATGACCACTGGATGGTGGGAAGATGG-3 'and M13 to CG2a 5'- CAGGAAACAGCTATGACCCAGTGGATAGACCGATGGGGC-3') were derived from the k2 chain regions, respectively.
[317] Os produtos de PCR foram sequenciados e as sequências de DNA resultantes de regiões variáveis de cadeias leve e pesada de DC2E7 são mostradas nas Figs. 6A e 6C, respectivamente. As regiões determinantes de complementaridade (CDRs) estão sublinhadas nas sequências de proteínas das cadeias leve e pesada de DC2E7 (Figs. 6B e 6D, respectivamente). As CDRs e as regiões estruturais (FR) foram identificadas de acordo com o sistema de numeração ImMunoGeneTics (IMGT) (vide, por exemplo, Lefranc M.P. The IMGT unique numbering for immunoglobulins, T-cell receptors, and Ig-like domains. The Immunologist 7, 132-1 36, 1999 (1999)).similares Exemplo 8 Anticorpo Monoclonal DC2E7 é Específico Para Formas Fosforiladas de Proteína Tau[317] The PCR products were sequenced and the DNA sequences resulting from variable regions of DC2E7 light and heavy chains are shown in Figs. 6A and 6C, respectively. The complementarity-determining regions (CDRs) are underlined in the protein sequences of the DC2E7 light and heavy chains (Figs. 6B and 6D, respectively). CDRs and structural regions (FR) were identified according to the ImMunoGeneTics (IMGT) numbering system (see, for example, Lefranc MP The IMGT unique numbering for immunoglobulins, T-cell receptors, and Ig-like domains. 7, 132-1 36, 1999 (1999)). Similar Example 8 Monoclonal Antibody DC2E7 Is Specific For Phosphorylated Forms Of Tau Protein
[318] Tau 2N4R de comprimento total recombinante, 2N4R fosforilada, PHF-tau e tau fetal foram usadas para caracterização adicional da atividade de ligação de anticorpo monoclonal DC2E7 por imunoblotting. A isoforma 2N4R de tau humana recombinante foi preparada conforme descrito no Exemplo 1. PHF-tau foi preparada conforme descrito no Exemplo 4.[318] Recombinant full-length 2N4R, phosphorylated 2N4R, PHF-tau and fetal tau were used for further characterization of monoclonal antibody binding activity DC2E7 by immunoblotting. The recombinant human tau 2N4R isoform was prepared as described in Example 1. PHF-tau was prepared as described in Example 4.
[319] A extração e purificação de tau de rato fetal foram feitas essencialmente como descrito em Ivanovova et al., High-yield purification of fetal tau preserving its structure and phosphorylation, J. Immunol. Methods, 339:17 a 22, 2008, usando ácido perclórico a 1%. Tecido cerebral obtido de filhotes de ratos com 1 a 7 dias de idade foi homogeneizado em ácido perclórico a 1% resfriados em gelo (1,5 g de tecido por 5 ml de ácido perclórico, Applichem) e deixado em gelo por 20 min. O homogenato foi centrifugado a 15.000xg por 20 min, e o sobrenadante límpido foi concentrado e, simultaneamente, o tampão foi mudado para tampão de lavagem (20 mM de Tris, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 0,1% Tween 20) usando um dispositivo de Filtro UltraCentrífuga Amicon (Millipore). O extrato filtrado foi carregado a uma taxa de fluxo de 0,2 ml/min em uma coluna Poly-Prep C10/10 (GE Healthcare) embalada com Sepharose portadora do mAb DC25 pan-[319] The extraction and purification of fetal rat tau was done essentially as described in Ivanovova et al., High-yield purification of fetal tau preserving its structure and phosphorylation, J. Immunol. Methods, 339: 17 to 22, 2008, using 1% perchloric acid. Brain tissue obtained from puppies of rats 1 to 7 days old was homogenized in 1% perchloric acid cooled on ice (1.5 g of tissue per 5 ml of perchloric acid, Applichem) and left on ice for 20 min. The homogenate was centrifuged at 15,000xg for 20 min, and the clear supernatant was concentrated and, simultaneously, the buffer was changed to wash buffer (20 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20) using an Amicon UltraCentrifuge Filter device (Millipore). The filtered extract was loaded at a flow rate of 0.2 ml / min on a Poly-Prep C10 / 10 column (GE Healthcare) packed with Sepharose carrying the mAb DC25
tau imobilizado. As proteínas não ligadas foram lavadas com 10-15 ml de tampão de lavagem até a absorbância das frações de eluição (a 280 nm) se tornar estável. A tau fetal, ligada ao mAb DC25, foi eluída com glicina a 0,1 M, pH 2,6. As frações de 0,5 ml eluídas foram imediatamente neutralizadas com 50 μl de Tris-HCl a 1M, pH 9, e analisadas por SDS-PAGE. As frações contendo tau fetal foram concentradas usando dispositivos Filtro UltraCentrífuga Amicon (Millipore) com troca de tampão simultânea para PBS. A tau fetal purificada por cromatografia de afinidade foi precipitada de acordo com Chen et al., (2005) por adição de quatro volumes de acetona resfriada em gelo contendo 10% de ácido tricloroacético. A mistura foi incubada a -20 ºC durante 2 horas e centrifugada a 15.000xg durante 20 min a 2 ºC. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi ressuspenso em 1 ml de acetona gelada, deixada em gelo por 20 min e novamente centrifugada como acima. O pélete resultante foi seco à temperatura ambiente e dissolvido em um volume de PBS igual àquele volume antes da precipitação.immobilized tau. Unbound proteins were washed with 10-15 ml of wash buffer until the absorbance of the elution fractions (at 280 nm) was stable. Fetal tau, bound to mAb DC25, was eluted with 0.1 M glycine, pH 2.6. The eluted 0.5 ml fractions were immediately neutralized with 50 μl of 1M Tris-HCl, pH 9, and analyzed by SDS-PAGE. Fractions containing fetal tau were concentrated using Amicon UltraCentrifugal Filter devices (Millipore) with simultaneous buffer exchange for PBS. Fetal tau purified by affinity chromatography was precipitated according to Chen et al., (2005) by adding four volumes of ice-cooled acetone containing 10% trichloroacetic acid. The mixture was incubated at -20 ºC for 2 hours and centrifuged at 15,000xg for 20 min at 2 ºC. The supernatant was discarded and the precipitate was resuspended in 1 ml of cold acetone, left on ice for 20 min and again centrifuged as above. The resulting pellet was dried at room temperature and dissolved in a volume of PBS equal to that volume before precipitation.
[320] Isoforma 2N4R de tau de comprimento total, PHF-tau insolúvel em sarcosil e tau fetal foram analisadas por imunotransferência usando DC2E7 como descrito no Exemplo 4. Em imunotransferência, o anticorpo DC2E7 reconheceu PHF-tau e tau fetal (Fig. 7). Ambos os tipos de tau testados foram fosforilados, mas em diferentes níveis de fosforilação. Nenhuma imunorreatividade foi observada em tau 2N4R humana recombinante. Por outro lado, o anticorpo se ligou a versões fosforiladas in vitro da isoforma 2N4R de tau humana. Os resultados indicam que DC2E7 reconhece um epítopo que é fosforilado, portanto, o anticorpo é específico para espécies de tau fosforiladas. O epítopo reconhecido pelo anticorpo está presente em PHF-tau fosforilada, tau fetal e tau fosforilada in vitro. Consequentemente, DC2E7 é capaz de distinguir tau fosforilada derivada do tecido cerebral com doença de Alzheimer (PHF-tau) de tau fisiológica (2N4R). Exemplo 9 Mapeamento do Fosfoepítopo DC2E7 Usando Mutantes de Deleção de Tau Recombinantes, Mutantes de Ponto de Tau e Peptídeos Derivados de Tau[320] 2N4R isoform of full length tau, sarcosil-insoluble PHF-tau and fetal tau were analyzed by immunoblotting using DC2E7 as described in Example 4. In immunoblotting, the antibody DC2E7 recognized PHF-tau and fetal tau (Fig. 7) . Both types of tau tested were phosphorylated, but at different levels of phosphorylation. No immunoreactivity was observed in recombinant human 2N4R tau. On the other hand, the antibody bound to phosphorylated in vitro versions of the human tau 2N4R isoform. The results indicate that DC2E7 recognizes an epitope that is phosphorylated, therefore, the antibody is specific for phosphorylated tau species. The epitope recognized by the antibody is present in PHF-phosphorylated tau, fetal tau and phosphorylated tau in vitro. Consequently, DC2E7 is able to distinguish phosphorylated tau derived from brain tissue with Alzheimer's disease (PHF-tau) from physiological tau (2N4R). Example 9 Mapping of the DC2E7 Phosphoepitope Using Recombinant Tau Deletion Mutants, Tau Spot Mutants and Tau-Derived Peptides
[321] A imunorreatividade de DC2E7 sugeriu que o anticorpo reconhece o epítopo em tau fosforilada (tau fetal, PHF-tau, tau fosforilada in vitro, vide supra). Portanto, para determinar o epítopo, mutantes de deleção fosforilados da proteína tau foram usados (Fig. 8). A fosforilação de mutantes de deleção de tau foi feita usando extrato de quinase como descrito no Exemplo 4.[321] The immunoreactivity of DC2E7 suggested that the antibody recognizes the epitope in phosphorylated tau (fetal tau, PHF-tau, phosphorylated tau in vitro, see supra). Therefore, to determine the epitope, phosphorylated deletion mutants of the tau protein were used (Fig. 8). Phosphorylation of tau deletion mutants was done using kinase extract as described in Example 4.
[322] Mutantes de deleção fosforilados da proteína tau humana 2N4R (tau 1 a 296, tau 188-441, tau 221 a 441, tau151 a 391, tau 122- 227) foram usados para a localização do epítopo de DC2E7 em immunoblotting (vide Exemplo 4). A análise de imunoblotting demonstrou que DC2E7 reconheceu todos os seguintes mutantes de deleção: tau1 a 296, tau188-441, tau151 a 391, tau122-227, exceto proteína tau 221 a 441 (Fig. 9). Estes resultados indicam que o fosfoepítopo DC2E7 se encontra na região de alcance da prolina, entre os resíduos de aminoácidos 188-227.[322] Phosphorylated deletion mutants of the human 2N4R tau protein (tau 1 to 296, tau 188-441, tau 221 to 441, tau151 to 391, tau 122-227) were used to locate the DC2E7 epitope in immunoblotting (see Example 4). Immunoblotting analysis showed that DC2E7 recognized all of the following deletion mutants: tau1 to 296, tau188-441, tau151 to 391, tau122-227, except tau 221 to 441 protein (Fig. 9). These results indicate that the phosphoepitope DC2E7 is found in the region of proline reach, among the amino acid residues 188-227.
[323] O mapeamento acima mencionado do epítopo DC2E7 com mutantes de deleção tau sugeriu um epítopo entre Pro188-Ala227. Nesta região de tau, existem 11 sítios de fosforilação (Ser191, Tyr197, Ser198, Ser199, Ser202, Thr205, Ser208, Ser210, Thr212, Ser214, Thr217) detectados em PHF-tau (Hanger et al., 2009, Fig. 10). Quatro deles (Ser198, Ser199, Ser202, Thr217) foram encontrados também em tau fetal (Morishima-Kawashima et al., 1995, Fig. 10). Como o DC2E7 também reconhece a tau fetal, o primeiro foco foi nos fosfo- sítios que estão presentes e confirmados em tau fetal (Ser198;[323] The aforementioned mapping of the DC2E7 epitope with tau deletion mutants suggested an epitope between Pro188-Ala227. In this tau region, there are 11 phosphorylation sites (Ser191, Tyr197, Ser198, Ser199, Ser202, Thr205, Ser208, Ser210, Thr212, Ser214, Thr217) detected in PHF-tau (Hanger et al., 2009, Fig. 10) . Four of them (Ser198, Ser199, Ser202, Thr217) were also found in fetal tau (Morishima-Kawashima et al., 1995, Fig. 10). As DC2E7 also recognizes fetal tau, the first focus was on phospho-sites that are present and confirmed in fetal tau (Ser198;
Ser199; Ser202; Thr217).Ser199; Ser202; Thr217).
[324] Para definir o fosfosito (s) exato para DC2E7, foram geradas formas mutadas de tau 2N4R com mutações de ponto único em que os resíduos de Serina e Treonina foram substituídos por Alanina. A inserção das mutações pontuais desejadas (Ser198Ala; Ser199Ala; Ser202Ala; Thr217Ala) na proteína tau 2N4R humana foi feita usando o kit de mutagênese dirigida ao sítio QuickChange (Agilent Technologies, EUA, CA) de acordo com as instruções do fabricante. 5-50 µg de plasmídeo contendo a sequência de codificação para a proteína tau 2N4R de tipo selvagem e 125 ng de cada iniciador foram usados em uma reação de 50 µL. Parâmetros de ciclagem foram os seguintes: 95 ºC durante 30 segundos, depois a PCR continuou com o ciclo que foi repetido 16 vezes: desnaturação 95 ºC durante 30 segundos, hibridação 55 ºC durante 60 segundos, alongamento 68 ºC durante 6 min. Toda a reação foi digerida com DpnI, que é específico para DNA metilado, para eliminar o plasmídeo parental. 50 µl de Escherichia coli XL-1 Blue supercompetente (fornecido com o kit de mutagênese) foram transformados com 1 µl da reação e espalhados em placas de ágar LB suplementadas com ampicilina. Os plasmídeos foram isolados de colônias cultivadas e a verificação da mutagênese foi feita usando sequenciamento de DNA. Os plasmídeos com as mutações desejadas foram usados para a produção de proteínas recombinantes, conforme descrito no Exemplo[324] To define the exact phosphosite (s) for DC2E7, mutated forms of 2N4R tau were generated with single-point mutations in which the Serine and Threonine residues were replaced by Alanine. The insertion of the desired point mutations (Ser198Ala; Ser199Ala; Ser202Ala; Thr217Ala) in the human 2N4R tau protein was performed using the mutagenesis kit directed to the QuickChange site (Agilent Technologies, USA, CA) according to the manufacturer's instructions. 5-50 µg of plasmid containing the coding sequence for the wild-type 2N4R tau protein and 125 ng of each primer were used in a 50 µL reaction. Cycling parameters were as follows: 95 ºC for 30 seconds, then the PCR continued with the cycle which was repeated 16 times: denaturation 95 ºC for 30 seconds, hybridization 55 ºC for 60 seconds, elongation 68 ºC for 6 min. The entire reaction was digested with DpnI, which is specific for methylated DNA, to eliminate the parent plasmid. 50 µl of supercompetent Escherichia coli XL-1 Blue (supplied with the mutagenesis kit) were transformed with 1 µl of the reaction and spread on LB agar plates supplemented with ampicillin. The plasmids were isolated from cultured colonies and the verification of mutagenesis was done using DNA sequencing. Plasmids with the desired mutations were used for the production of recombinant proteins, as described in Example
1.1.
[325] Mutantes de tau preparados foram purificados conforme descrito no Exemplo 1, fosforilados por extrato de quinase do cérebro de rato e corados com DC2E7 em imunotransferência. A fosforilação de mutantes de deleção de tau induziu mudança no peso molecular, portanto, todas as proteínas foram fosforiladas, como mostrado na coloração com anticorpo pan tau DC25 (epítopo 347-353 aa, AXON[325] Tau mutants prepared were purified as described in Example 1, phosphorylated by rat brain kinase extract and stained with DC2E7 in immunoblot. Phosphorylation of tau deletion mutants induced a change in molecular weight, therefore, all proteins were phosphorylated, as shown in staining with pan tau antibody DC25 (epitope 347-353 aa, AXON
Neuroscience, SE) (Fig. 11). A análise do mutante de ponto tau fosforilada demonstrou que DC2E7 detectou todas as mutações únicas (Ser198Ala, Ser199Ala, Ser202Ala), mas Thr217Ala (Fig. 11). Estes resultados sugeriram que a fosfo-treonina na posição 217 cria uma parte chave do epítopo reconhecido pelo anticorpo DC2E7.Neuroscience, SE) (Fig. 11). Analysis of the phosphorylated tau point mutant demonstrated that DC2E7 detected all unique mutations (Ser198Ala, Ser199Ala, Ser202Ala), but Thr217Ala (Fig. 11). These results suggested that the phospho-threonine at position 217 creates a key part of the epitope recognized by the antibody DC2E7.
[326] No entanto, outros fosfo-sítios que estão localizados nas proximidades do fosfo-sítio Thr217 podem ser uma parte do epítopo ou podem estar envolvidos na criação do epítopo. Portanto, o possível impacto dos fosfo-sítios Thr205, Ser208, Ser210, Thr212, Ser214, Ser231 no epítopo reconhecido por DC2E7 foi examinado. As proteínas tau mutantes preparadas com mutações de ponto único (Thr205Ala, Ser208Ala, Ser210Ala, Thr212Ala, Ser214Ala, Ser231A) foram fosforiladas por extrato de quinase e testadas em immunoblotting com DC2E7 (Fig. 11). A análise de imunotransferência demonstrou que o anticorpo reconheceu todas as proteínas tau portadoras das mutações pontuais (Fig. 11). Assim, os fosfo-sítios localizados na proximidade de Thr217 não afetaram o epítopo reconhecido por DC2E7.[326] However, other phospho-sites that are located in the vicinity of the Thr217 phospho-site may be a part of the epitope or may be involved in the creation of the epitope. Therefore, the possible impact of the Thr205, Ser208, Ser210, Thr212, Ser214, Ser231 phospho-sites on the epitope recognized by DC2E7 was examined. The mutant tau proteins prepared with single point mutations (Thr205Ala, Ser208Ala, Ser210Ala, Thr212Ala, Ser214Ala, Ser231A) were phosphorylated by kinase extract and tested in immunoblotting with DC2E7 (Fig. 11). Immunoblot analysis showed that the antibody recognized all tau proteins carrying point mutations (Fig. 11). Thus, the phospho-sites located in the vicinity of Thr217 did not affect the epitope recognized by DC2E7.
[327] Esses experimentos de mapeamento sugeriram a presença de fosfo-treonina 217 dentro do epítopo de DC2E7. A fim de examinar o efeito dos resíduos na região do epítopo DC2E7 na ligação do anticorpo, os peptídeos sintéticos de diferentes comprimentos transportando diferentes fosfo-sítios foram analisados em ELISA competitivo. Peptídeos (tau 210-224/pT212/pT217, 210- 222/pT212/pT217, 210-221/pT212/pT217, 210-220/pT212/pT217, 210- 219/pT212/pT217, 210-218/pT212/pT217, tau 201 a 230/pT212, tau 193-222/pS208, 193-222/pS214, tau 193- 231/pS208/pS210/pT212/pS214/pT217, tau 193- 231/pS202/pS205/pT212/pT220, tau 201 a 229), foram sintetizados pela EZBiolabs (EUA) com pureza superior a 95%. Cada peptídeo sintetizado continha fosfo-sítio localizado (s) em torno do resíduo Thr217, exceto do peptídeo não fosforilado tau 201 a 229 (usado como controle negativo). Como controle positivo, tau151 a 391 fosforilada in vitro foi usada.[327] These mapping experiments suggested the presence of phospho-threonine 217 within the DC2E7 epitope. In order to examine the effect of residues in the DC2E7 epitope region on antibody binding, synthetic peptides of different lengths carrying different phospho-sites were analyzed in a competitive ELISA. Peptides (tau 210-224 / pT212 / pT217, 210-222 / pT212 / pT217, 210-221 / pT212 / pT217, 210-220 / pT212 / pT217, 210- 219 / pT212 / pT217, 210-218 / pT212 / pT217 , tau 201 to 230 / pT212, tau 193-222 / pS208, 193-222 / pS214, tau 193- 231 / pS208 / pS210 / pT212 / pS214 / pT217, tau 193- 231 / pS202 / pS205 / pT212 / pT220, tau 201 to 229), were synthesized by EZBiolabs (USA) with purity greater than 95%. Each synthesized peptide contained phospho-site (s) located around the Thr217 residue, except for the non-phosphorylated peptide tau 201 to 229 (used as a negative control). As a positive control, tau151 to 391 phosphorylated in vitro was used.
[328] Em seguida, todos os peptídeos foram analisados quanto à sua capacidade de competir com tau151 a 391 fosforilada in vitro pela ligação a DC2E7 por ELISA de competição. Placas de ELISA (Nunc Medisorp, Thermo Scientific, Dinamarca) foram revestidas durante a noite a 37 ºC com 50 μl/poço de PHF-tau, diluídas 200 x em PBS. As placas revestidas foram lavadas 5 vezes com PBS/Tween 20 (0,05% v/v) e bloqueadas com PBS/Tween 20 durante 1 h a 25 ºC. Cada um dos peptídeos foi dissolvido separadamente em PBS a uma concentração final de 1 mM. Diluições em série (2,5x) de peptídeos em PBS/Tween 20 foram preparadas em placas de microtitulação de polipropileno com fundo de poço cônico (Greiner) dentro da faixa de concentração de 200 μM; 80 μM; 32 μM; 12,8 μM; 5,12 μM; 2,048 μM; 0,8192 μM; 0,32768 μM). O anticorpo monoclonal DC2E7 foi diluído para uma concentração de 0,6 μg/ml em PBS e 60 μl deste anticorpo diluído foi adicionado em cada poço para diluição em série de peptídeos resultando em 120 μl/poço de mistura. As misturas de anticorpo/peptídeo foram incubadas por 1 hora a 25 ºC em uma plataforma rotativa ajustada para 230 rpm. 50 μl/poço de misturas de anticorpo/peptídeo foram transferidos de placas de polipropileno para placas de ELISA revestidas com PHF-tau e PBS/Tween 20 bloqueadas (em duplicatas) e incubadas por 1 hora a 25 ºC. As placas foram lavadas 5x com PBS/Tween 20 e incubadas com 50 μl/poço de imunoglobulinas policlonais de cabra anticamundongo/HRP (Dako) diluídas 1:1000 em PBS/Tween 20 por 1 hora a 25 ºC. Após a lavagem, as placas foram incubadas com 50 μl/poço de 1 mg/2 mL de o-PDA (o-fenilenodiamina, Sigma) em Na-Acetato 0,1 M pH = 6,0[328] Next, all peptides were analyzed for their ability to compete with tau151 to 391 phosphorylated in vitro for binding to DC2E7 by competition ELISA. ELISA plates (Nunc Medisorp, Thermo Scientific, Denmark) were coated overnight at 37 ºC with 50 μl / well of PHF-tau, diluted 200 x in PBS. The coated plates were washed 5 times with PBS / Tween 20 (0.05% v / v) and blocked with PBS / Tween 20 for 1 h at 25 ° C. Each of the peptides was dissolved separately in PBS at a final concentration of 1 mM. Serial dilutions (2.5x) of peptides in PBS / Tween 20 were prepared in polypropylene microtiter plates with conical well bottom (Greiner) within the concentration range of 200 μM; 80 μM; 32 μM; 12.8 μM; 5.12 μM; 2.048 μM; 0.8192 μM; 0.32768 μM). The monoclonal antibody DC2E7 was diluted to a concentration of 0.6 μg / ml in PBS and 60 μl of this diluted antibody was added to each well for serial dilution of peptides resulting in 120 μl / mixing well. The antibody / peptide mixtures were incubated for 1 hour at 25 ºC on a rotating platform adjusted to 230 rpm. 50 μl / well of antibody / peptide mixtures were transferred from polypropylene plates to ELISA plates coated with PHF-tau and blocked PBS / Tween 20 (in duplicates) and incubated for 1 hour at 25 ºC. The plates were washed 5x with PBS / Tween 20 and incubated with 50 μl / well of polyclonal goat anti-mouse immunoglobulins / HRP (Dako) diluted 1: 1000 in PBS / Tween 20 for 1 hour at 25 ºC. After washing, the plates were incubated with 50 μl / well of 1 mg / 2 mL of o-PDA (o-phenylenediamine, Sigma) in 0.1 M Na-Acetate pH = 6.0
(Roth) suplementado com 1,5 μl/2 ml de H2O2 a 30% (Sigma) por 20 minutos a 25 ºC no escuro. A reação foi interrompida pela adição de 50 μl/poço de H2SO4 a 2M (Merck) seguido pela leitura das placas a 492 nm (Powerwave HT, Bio-Tek).(Roth) supplemented with 1.5 μl / 2 ml of 30% H2O2 (Sigma) for 20 minutes at 25 ºC in the dark. The reaction was stopped by adding 50 μl / well of 2M H2SO4 (Merck) followed by reading the plates at 492 nm (Powerwave HT, Bio-Tek).
[329] Todos os peptídeos analisados que abrangiam a treonina fosforilada 217 competiram com tau151 a 391 fosforilada pela ligação a DC2E7 (Fig.12). Em resumo, o DC2E7 se liga a um epítopo tau que inclui uma treonina 217 fosforilada. Nenhum outro fosfo-sítio pareceu afetar a imunorreatividade do anticorpo. Mas, notavelmente, o encurtamento da parte C terminal dos peptídeos testados de 224 para 220 aminoácidos (210-220/pT212/pT217, 210-219/pT212/pT217, 210- 218/pT212/pT217) levou à perda de atividade competitiva apesar da presença de treonina fosforilada 217. Os dados sugerem, portanto, que DC2E7 se liga a um fosfoepítopo em tau fosforilada humana de 12 aminoácidos que compreende os resíduos 210-SRTPSLPTPPTR-221, onde pelo menos a treonina 217 é fosforilada. Exemplo 10 Anticorpos Monoclonais DC2E2 e DC2E7 Reconhecem Patologia no Cérebro Humano com Doença de Alzheimer e Tauopatias[329] All analyzed peptides that comprised phosphorylated threonine 217 competed with tau151 to 391 phosphorylated for binding to DC2E7 (Fig.12). In summary, DC2E7 binds to a tau epitope that includes a phosphorylated threonine 217. No other phospho-site appeared to affect the antibody's immunoreactivity. But notably, the shortening of the terminal C part of the tested peptides from 224 to 220 amino acids (210-220 / pT212 / pT217, 210-219 / pT212 / pT217, 210- 218 / pT212 / pT217) led to the loss of competitive activity despite of the presence of phosphorylated threonine 217. The data therefore suggest that DC2E7 binds to a 12-amino acid human phosphorylated phosphoepitope comprising residues 210-SRTPSLPTPPTR-221, where at least threonine 217 is phosphorylated. Example 10 Monoclonal Antibodies DC2E2 and DC2E7 Recognize Pathology in the Human Brain with Alzheimer's Disease and Tauopathies
[330] Este exemplo mostra que DC2E7 e DC2E2 reconhecem lesões neurofibrilares na doença de Alzhemer. As seguintes áreas do cérebro foram usadas para estudo imuno-histoquímico: hipocampo e córtex entorrinal da doença de Alzheimer (estágio 6 de Braak), FTD (doença de Pick) e cérebros de controle (Braak estágio 1 e 3), núcleo caudado da degeneração corticobasal (CBD) e putâmen/núcleo caudado de paralisia supranuclear progressiva (PSP). Os blocos de parafina do tecido cerebral foram obtidos no banco de cérebros de Amsterdam.[330] This example shows that DC2E7 and DC2E2 recognize neurofibrillary lesions in Alzhemer's disease. The following areas of the brain were used for immunohistochemical study: hippocampus and entorhinal cortex of Alzheimer's disease (Braak stage 6), FTD (Pick disease) and control brains (Braak stage 1 and 3), caudate nucleus of degeneration corticobasal (CBD) and putamen / nucleus caudate of progressive supranuclear palsy (PSP). The paraffin blocks of brain tissue were obtained from the brain bank in Amsterdam.
[331] Os blocos de cérebros incluídos em parafina foram cortados em um micrótomo (Leica RM2255) para obter seções de 8 μm de espessura. As seções foram colocadas em slides HistoBond (Marienfeld, Alemanha). Para imunohistoquímica, as seções foram pré-tratadas com ácido fórmico (98% por 1 min a 4 ºC ou 80% por 1 hora) e calor (autoclave, 121 ºC, 20 min.), seguido de incubação durante a noite com anticorpos primários (AT8 1:1000, DC2E7 1:10.000, DC2E2 1:200). Todas as seções foram incubadas com anticorpo secundário biotinilado anticamundongo à temperatura ambiente durante 1 hora e com complexo avidina-biotina-peroxidase durante 1 hora. A imunorreação foi visualizada com VIP (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories, CA, EUA) e contrastada com verde de metila (Vector Laboratories).[331] The paraffin-embedded brain blocks were cut in a microtome (Leica RM2255) to obtain 8 μm thick sections. The sections were placed on HistoBond slides (Marienfeld, Germany). For immunohistochemistry, the sections were pre-treated with formic acid (98% for 1 min at 4 ºC or 80% for 1 hour) and heat (autoclave, 121 ºC, 20 min.), Followed by overnight incubation with primary antibodies (AT8 1: 1000, DC2E7 1: 10,000, DC2E2 1: 200). All sections were incubated with biotinylated secondary anti-mouse antibody at room temperature for 1 hour and with avidin-biotin-peroxidase complex for 1 hour. The immunoreaction was visualized with VIP (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories, CA, USA) and contrasted with methyl green (Vector Laboratories).
[332] Análises imunohistoquímicas revelaram que DC2E7 e DC2E2 reconheceram a patologia tau na doença de Alzheimer e outras tauopatias (Fig. 13) de maneira similar ao anticorpo monoclonal AT8, que é considerado padrão ouro para coloração histopatológica. Patologia neurofibrilar corada com DC2E7 e DC2E2 no hipocampo do paciente com AD, corpos de Pick no giro dentado do paciente com FTD, patologia da tau glial no núcleo caudado de pacientes que sofrem de CBD e PSP. DC2E7 e DC2E2 não reconhecem a patologia tau no cérebro normal cumprindo os critérios para o estágio 1 de Braak, no estágio prodrômico (estágio 3 de Braak), ambos os anticorpos identificados na patologia neurofibrilar do hipocampo, nos anticorpos de AD totalmente desenvolvidos visualizaram patologia tau extensa na forma de neurofibrilar emaranhados, fios de neurópilos e placas neuríticas (Fig. 14). Usando uma ampliação maior, foi demonstrado que os anticorpos se ligam a emaranhados neurofibrilares em AD, corpos de Pick em FTD e patologia de tau glial em PSP e CBD (Fig. 15). Exemplo 11 DC2E7 ELISA[332] Immunohistochemical analyzes revealed that DC2E7 and DC2E2 recognized the tau pathology in Alzheimer's disease and other tauopathies (Fig. 13) in a similar way to monoclonal antibody AT8, which is considered the gold standard for histopathological staining. Neurofibrillary pathology stained with DC2E7 and DC2E2 in the hippocampus of the patient with AD, Pick bodies in the toothed gyrus of the patient with FTD, pathology of glial tau in the caudate nucleus of patients suffering from CBD and PSP. DC2E7 and DC2E2 do not recognize the tau pathology in the normal brain fulfilling the criteria for Braak stage 1, in the prodromal stage (Braak stage 3), both antibodies identified in the neurofibrillary pathology of the hippocampus, in fully developed AD antibodies visualized tau pathology extensive in the form of neurofibrillary tangles, neuropile threads and neuritic plaques (Fig. 14). Using greater magnification, antibodies have been shown to bind to neurofibrillary tangles in AD, Pick bodies in FTD and tau glial pathology in PSP and CBD (Fig. 15). Example 11 DC2E7 ELISA
Preparação de padrão para DC2E7 ELISAStandard preparation for DC2E7 ELISA
[333] Tau151 a 391 fosforilada in vitro foi purificada por cromatografia de afinidade. Duas colunas de afinidade foram preparadas: DC2E7 e DC190 (epítopo 368-376, AXON Neuroscience, SE). Os anticorpos foram purificados de acordo com o método parascrito no Exemplo 3. Os anticorpos foram acoplados a Sepharose 4B ativada por CnBr (GE Healthcare, # 17 a 0430-01) de acordo com a recomendação do fabricante. A reação de fosforilação in vitro (vide Exemplo 4) foi dialisada contra PBS a 4 ºC (3 x 100 vezes de excesso). Todas as etapas de purificação foram realizadas a 4 ºC. A coluna DC2E7 foi lavada com 3 x 5 ml de tampão WBNP0.1 (50 mM de Tris pH 7,4, 150 mM de NaCl e NP40 a 0,1%). A reação de fosforilação in vitro foi diluída 4 vezes com tampão WBNP1 gelado (50 mM de Tris pH 7,4, 150 mM de NaCl e NP40 a 1%) e filtrada através de filtro de 0,2 µm. A amostra foi aplicada na coluna DC2E7. Após a amostra ter entrado, a coluna de resina foi lavada da seguinte forma: 2 x 5 mL com tampão WBNP1, 2 x 5 mL com tampão WBNP0.1, 1 x 5 mL com 50 mM de Tris.HCl pH 7,4, 150 mM de NaCl. As proteínas ligadas foram eluídas com 3 x 2 ml de tampão de eluição (100 mM de glicina/HCl, pH 2,8). As proteínas eluídas foram imediatamente ajustadas a pH 7-8 com 1 M de Tris.HCl, pH 9, e diluídas 1:1 com tampão WBNP0.1. A amostra foi aplicada na coluna de afinidade DC190 e purificada conforme descrito para purificação de afinidade DC2E7. As proteínas eluídas foram dialisadas contra PBS e a concentração foi estimada espectrofotometricamente. A proteína purificada foi designada “calibrador DC2E7”.[333] Tau151 to 391 phosphorylated in vitro was purified by affinity chromatography. Two affinity columns were prepared: DC2E7 and DC190 (epitope 368-376, AXON Neuroscience, SE). The antibodies were purified according to the method described in Example 3. The antibodies were coupled to CnBr activated Sepharose 4B (GE Healthcare, # 17 to 0430-01) according to the manufacturer's recommendation. The in vitro phosphorylation reaction (see Example 4) was dialyzed against PBS at 4 ° C (3 x 100 times excess). All purification steps were performed at 4 ºC. The DC2E7 column was washed with 3 x 5 ml of WBNP0.1 buffer (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl and 0.1% NP40). The in vitro phosphorylation reaction was diluted 4 times with cold WBNP1 buffer (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl and 1% NP40) and filtered through a 0.2 µm filter. The sample was applied to the DC2E7 column. After the sample had entered, the resin column was washed as follows: 2 x 5 ml with WBNP1 buffer, 2 x 5 ml with WBNP0.1 buffer, 1 x 5 ml with 50 mM Tris.HCl pH 7.4, 150 mM NaCl. Bound proteins were eluted with 3 x 2 ml of elution buffer (100 mM glycine / HCl, pH 2.8). The eluted proteins were immediately adjusted to pH 7-8 with 1 M Tris.HCl, pH 9, and diluted 1: 1 with WBNP0.1 buffer. The sample was applied to the DC190 affinity column and purified as described for DC2E7 affinity purification. The eluted proteins were dialyzed against PBS and the concentration was estimated spectrophotometrically. The purified protein was designated "DC2E7 calibrator".
[334] DC2E7 ELISA foi configurado em formato de alta sensibilidade, ELISA digital, usando o analisador Simoa-HD1 (Quanterix). Os reagentes para ELISA digital foram preparados de acordo com o Quanterix Homebrew Assay Development Guide com os seguintes detalhes.[334] DC2E7 ELISA was configured in a highly sensitive format, digital ELISA, using the Simoa-HD1 analyzer (Quanterix). The reagents for digital ELISA were prepared according to the Quanterix Homebrew Assay Development Guide with the following details.
O anticorpo DC2E7 foi usado como um anticorpo de captura e o anticorpo DC2E2 foi usado como um anticorpo detector.The DC2E7 antibody was used as a capture antibody and the DC2E2 antibody was used as a detector antibody.
DC2E7 foi acoplado a esferas magnéticas (Quanterix) na concentração de 0,5 mg/mL.DC2E7 was coupled to magnetic spheres (Quanterix) at a concentration of 0.5 mg / mL.
O anticorpo detector foi preparado por biotinilação de DC2E2, em que um excesso de 120 vezes de Biotina, EZ‐Link™ NHS‐PEG4‐Biotina (Thermo Scientific, #21329) sobre a concentração de anticorpo foi usado.The detector antibody was prepared by biotinylation of DC2E2, in which a 120-fold excess of Biotin, EZ-Link ™ NHS-PEG4-Biotin (Thermo Scientific, # 21329) on the antibody concentration was used.
O calibrador DC2E7 foi diluído em diluente calibrador (20 mM de fosfato de sódio pH 7,4, 137 mM de NaCl, KCl 2,7 mM, BSA a 2% e caseína 0,01%) em diluições seriadas de duas vezes a partir de 100 pg/mL, seguido de 50, 25, 12,5, 6,25, 3,13, 1,56 e 0 pg/ml.The DC2E7 calibrator was diluted in a calibrating diluent (20 mM sodium phosphate pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 2% BSA and 0.01% casein) in serial dilutions twice from 100 pg / ml, followed by 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56 and 0 pg / ml.
As concentrações de calibrador preparadas foram misturadas em uma razão de 3:1 com diluente de amostra (80 mM de fosfato de sódio pH 7,4, 548 mM de NaCl, 10,8 mM de KCl, caseína 0,04% e Tween 20 a 0,4%). Amostras de CSF de indivíduos de controle também foram diluídas com diluente de amostra, conforme descrito precedentemente.The prepared calibrator concentrations were mixed in a 3: 1 ratio with sample diluent (80 mM sodium phosphate pH 7.4, 548 mM NaCl, 10.8 mM KCl, 0.04% casein and Tween 20 0.4%). CSF samples from control subjects were also diluted with sample diluent, as previously described.
A recuperação de pico da amostra de CSF foi realizada usando picos de CSF com 10, 5, 2 e 0 pg/ml de calibrador DC2E7. Calibradores e amostras diluídos foram pipetados em placa de 96 poços, inseridos no analisador Simoa HD1 e também capturam esferas de anticorpo DC2E7 diluídas em diluente de esfera, detector DC2E2 diluído em diluente detector a 1,2 µg/ml, SBG diluído em diluente SBG a 200 pM e substrato RGP foram inseridos no analisador (todos os tampões, SBG e RGP foram obtidos da Quanterix). O ensaio foi programado no software Simoa 1.5 e a análise foi realizada.Peak recovery of the CSF sample was performed using CSF peaks with 10, 5, 2 and 0 pg / ml DC2E7 calibrator. Calibrators and diluted samples were pipetted into a 96-well plate, inserted in the Simoa HD1 analyzer and also captured DC2E7 antibody beads diluted in sphere diluent, DC2E2 detector diluted in 1.2 µg / ml detector diluent, SBG diluted in SBG diluent a 200 pM and RGP substrate were inserted into the analyzer (all buffers, SBG and RGP were obtained from Quanterix). The test was programmed in the Simoa 1.5 software and the analysis was performed.
Após a análise, a avaliação foi feita por Graphpad Prism e/ou por software incluído no software Simoa 1.5. Um exemplo de uma curva de calibração é mostrado na Fig. 16. Um exemplo de um experimento de recuperação de pico é mostrado na Fig. 17. Exemplo 12 ELISA Digital de DC2E7 Distingue-se Significativamente entreAfter the analysis, the evaluation was made by Graphpad Prism and / or by software included in the Simoa 1.5 software. An example of a calibration curve is shown in Fig. 16. An example of a peak recovery experiment is shown in Fig. 17. Example 12 Digital ELISA of DC2E7 Significantly distinguishes between
Pacientes com Doença de Alzheimer e Indivíduos de ControleAlzheimer's Disease Patients and Control Subjects
[335] ELISA digital de DC2E7 foi usado para análise de amostras de CSF de pacientes com doença de Alzheimer (n = 20) e indivíduos saudáveis n = 20) (Fig. 18). A análise demonstrou que ELISA digital de DC2E7 distinguiu pacientes com doença de Alzheimer de indivíduos de controle com significância muito alta. A área da curva ROC foi muito próxima de 1. A uma concentração > 4,43 pg/mL, o ensaio fornece 95% de sensibilidade e 89,5% de especificidade e em concentração > 6,19 pg/mL, a sensibilidade é de 95% e a especificidade de 100%. Exemplo 13 ELISA Digital de DC2E7 Distingue-se Significativamente entre Pacientes com Doença de Alzheimer e Pacientes que Sofrem de Outras Tauopatias[335] DC2E7 digital ELISA was used to analyze CSF samples from patients with Alzheimer's disease (n = 20) and healthy individuals n = 20) (Fig. 18). The analysis showed that DC2E7 digital ELISA distinguished patients with Alzheimer's disease from control subjects with very high significance. The area of the ROC curve was very close to 1. At a concentration> 4.43 pg / mL, the assay provides 95% sensitivity and 89.5% specificity and at a concentration> 6.19 pg / mL, the sensitivity is 95% and specificity of 100%. Example 13 DC2E7 Digital ELISA Distinguishes Significantly Between Patients With Alzheimer's Disease And Patients Suffering From Other Tauopathies
[336] ELISA digital de DC2E7 foi usado para análise de amostras de CSF de pacientes com doença de Alzheimer (n = 6) e demência frontotemporal (n = 16) (Fig.19). A análise demonstrou que ELISA digital de DC2E7 distinguiu pacientes com doença de Alzheimer de pacientes com outras tauopatias com significância muito alta. A área da curva ROC é 0,97. Na concentração > 3,89 pg/ml, o ensaio apresenta sensibilidade de 93,8% e especificidade de 100%. Exemplo 14 DC2E7 Reconhece Espécies Insolúveis de Tau na Doença de Alzheimer e Tauopatias Humanas[336] DC2E7 digital ELISA was used to analyze CSF samples from patients with Alzheimer's disease (n = 6) and frontotemporal dementia (n = 16) (Fig.19). The analysis showed that digital ELISA of DC2E7 distinguished patients with Alzheimer's disease from patients with other highly significant tauopathies. The area of the ROC curve is 0.97. At a concentration> 3.89 pg / ml, the assay has a sensitivity of 93.8% and specificity of 100%. Example 14 DC2E7 Recognizes Insoluble Species of Tau in Alzheimer's Disease and Human Tauopathies
[337] Resultados precedentes mostraram que o DC2E7 reconheceu um epítopo que ocorre em tau fosforilada. Portanto, a imunorreatividade de DC2E7 para a proteína tau fosforilada que ocorre em outras tauopatias foi analisada.[337] Previous results showed that DC2E7 recognized an epitope that occurs in phosphorylated tau. Therefore, the immunoreactivity of DC2E7 to the phosphorylated tau protein that occurs in other tauopathies was analyzed.
[338] Complexos insolúveis de tau (formas anormais de tau) foram isolados do cérebro humano de AD (Braak estágio V, córtex frontal, banco de cérebro de Amsterdã), degeneração corticobasal (banco de cérebro de Londres, córtex frontal) e FTD (banco de cérebro de Amsterdã), conforme descrito em Exemplo 4. Proteínas tau insolúveis extraídas foram analisadas em immunoblotting usando DC2E7 como descrito no Exemplo 4.[338] Insoluble tau complexes (abnormal forms of tau) have been isolated from the human AD brain (Braak stage V, frontal cortex, Amsterdam brain bank), corticobasal degeneration (London brain bank, frontal cortex) and FTD ( Amsterdam brain bank), as described in Example 4. Tau insoluble proteins extracted were analyzed in immunoblotting using DC2E7 as described in Example 4.
[339] As análises de imunoblot de cérebros de pacientes com AD e tauopatias mencionadas acima revelaram que as frações insolúveis de tau foram detectadas usando DC2E7. Os resultados sugerem que os agregados patológicos de tau em tauopatias são compostos de tau hiperfosforilada similar a PHF-tau em DA (Fig. 20). Além disso, o DC2E7 reconheceu três bandas similares a PHF-tau de 60, 64 e 68 KDa (tripleto A68) em CBD e FTD similares ao de AD. Exemplo 15 Ensaio ELISA Digital de Tau pT217 Distinguiu Pacientes com AD de FTD e Objetos Saudáveis com Alta Sensibilidade e Especificidade[339] Immunoblot analyzes of the brains of patients with AD and tauopathies mentioned above revealed that insoluble fractions of tau were detected using DC2E7. The results suggest that the pathological aggregates of tau in tauopathies are composed of hyperphosphorylated tau similar to PHF-tau in AD (Fig. 20). In addition, DC2E7 recognized three PHF-tau bands of 60, 64 and 68 KDa (A68 triplet) in CBD and FTD similar to that of AD. Example 15 Tau Digital ELISA Assay pT217 Distinguished Patients with AD from FTD and Healthy Objects with High Sensitivity and Specificity
[340] Um ensaio digital de tau pT217 usando anticorpo DC2E7 foi usado para analisar CSF de pacientes com AD (n = 30), pacientes FTD (nfPPA, n = 14; svPPA, n = 10; bvFTD, n = 10, PSP, n = 19; e CBD, n = 15), e objetos saudáveis (n = 30). O ensaio foi comparado com um ensaio INNOTEST Phospho-Tau (181P).[340] A digital tau pT217 assay using DC2E7 antibody was used to analyze CSF of patients with AD (n = 30), FTD patients (nfPPA, n = 14; svPPA, n = 10; bvFTD, n = 10, PSP, n = 19; and CBD, n = 15), and healthy objects (n = 30). The assay was compared to an INNOTEST Phospho-Tau (181P) assay.
[341] A análise demonstrou que o ensaio ELISA digital tau pT217 distinguiu pacientes com AD de FTD e objetos saudáveis. O ensaio separou melhor AD de FTD/controles (> 5,37 pg/ml, 94,1% de sensibilidade, 91,7% de especificidade, Fig. 21), em comparação com o ensaio Innotest Phospho-Tau (181P) (> 52 pg/ml, 78,0% sensibilidade, 100% de especificidade. (Fig. 21). O ensaio também foi ligeiramente melhor em distinguir pacientes com AD de objetos saudáveis (> 3,855 pg/ml, AUC 0,96, IC de 95%, 0,89-0,99, sensibilidade de 95%, especificidade de 89,7%) do que o ensaio p-tau[341] The analysis demonstrated that the tau pT217 digital ELISA assay distinguished patients with AD from FTD and healthy objects. The assay separated better AD from FTD / controls (> 5.37 pg / ml, 94.1% sensitivity, 91.7% specificity, Fig. 21), compared to the Innotest Phospho-Tau assay (181P) ( > 52 pg / ml, 78.0% sensitivity, 100% specificity (Fig. 21). The trial was also slightly better at distinguishing AD patients from healthy objects (> 3,855 pg / ml, AUC 0.96, CI 95%, 0.89-0.99, 95% sensitivity, 89.7% specificity) than the p-tau assay
181 (> 52 pg/ml, AUC 0,93, IC 95%, 0,85-0,97, sensibilidade 92%, especificidade 87,5%) (Fig. 22). Comparando a alta correlação entre os ensaios pT217 e pT181 no grupo AD (P <0,0001, coeficiente de Spearman r = 0,8226) com as correlações baixas observadas em controles saudáveis (P < 0,5, coeficiente de Spearman r = 0,4032) e FTD (P = 0,387, coeficiente de Spearman r = 0,232) sugere que o pT217. As espécies de tau no CSF podem fornecer um biomarcador específico da DA no CSF. Nenhum benefício foi observado no uso da razão INNOTEST Aβ42/pT217 tau quando comparado com o próprio pT217 tau.181 (> 52 pg / ml, AUC 0.93, 95% CI, 0.85-0.97, sensitivity 92%, specificity 87.5%) (Fig. 22). Comparing the high correlation between the pT217 and pT181 assays in the AD group (P <0.0001, Spearman coefficient r = 0.8226) with the low correlations observed in healthy controls (P <0.5, Spearman coefficient r = 0 , 4032) and FTD (P = 0.387, Spearman's coefficient r = 0.232) suggests that pT217. Tau species in the CSF can provide a specific biomarker for AD in the CSF. No benefit was observed in the use of the INNOTEST Aβ42 / pT217 tau ratio when compared to pT217 tau itself.
[342] Foi observada alta correlação entre os ensaios de tau pT217 e pT181 tau no grupo AD (P < 0,0001, coeficiente de Spearman r = 0,8226) e as correlações baixas foram observadas em controles sem demência (P < 0,5, coeficiente de Spearman r = 0,4032).[342] A high correlation was found between the pT217 and pT181 tau tau assays in the AD group (P <0.0001, Spearman coefficient r = 0.8226) and low correlations were observed in controls without dementia (P <0, 5, Spearman's coefficient r = 0.4032).
[343] Nenhuma correlação foi observada entre os ensaios de tau pT217 e pT181 tau em pacientes de FTD (P = 0,7517, coeficiente de Spearman r = 0,08929); em que forte correlação foi observada entre os ensaios pT181 e HTAU nos mesmos pacientes FTD (P = 0,0019, coeficiente de Spearman r = 0,7321).[343] No correlation was observed between the pT217 and pT181 tau tau trials in FTD patients (P = 0.7517, Spearman coefficient r = 0.08929); in which a strong correlation was observed between the pT181 and HTAU trials in the same FTD patients (P = 0.0019, Spearman coefficient r = 0.7321).
[344] Todos esses resultados sugerem que a espécie pT217 tau no CSF pode fornecer um biomarcador específico de AD no CSF. Exemplo 16 Ensaio ELISA Digital de Tau pT217 Diferenciou Pacientes com AD de FTD e Objetos Saudáveis com Alta Sensibilidade e Especificidade Usando Diferentes Calibradores[344] All of these results suggest that the pT217 tau species in the CSF may provide a specific biomarker of AD in the CSF. Example 16 Digital Tau ELISA Assay pT217 Differentiated Patients with AD from FTD and Healthy Objects with High Sensitivity and Specificity Using Different Calibrators
[345] O ensaio ELISA digital de tau pT217 pode distinguir entre indivíduos com comprometimento cognitivo leve (LCC) e objetos saudáveis. As concentrações de pT217 tau no líquido cefalorraquidiano (CSF) são similares para indivíduos com LCC e AD (Fig. 23A). Três objetos com LCC desenvolveram posteriormente AD.[345] The pT217 digital tau ELISA assay can distinguish between individuals with mild cognitive impairment (CCL) and healthy objects. The concentrations of pT217 tau in cerebrospinal fluid (CSF) are similar for individuals with LCC and AD (Fig. 23A). Three objects with LCC later developed AD.
[346] O ensaio de tau pT217 foi usado para testar amostras de CSF de indivíduos com outros distúrbios neurológicos, incluindo esclerose múltipla (MS), doença de Parkinson (DP), esclerose lateral amotrófica (ALS) e demência frontotemporal (FTD), onde a patologia tau pode estar presente (Fig. 23B). Os pacientes com FTD representam populações bastante heterogêneas, alguns deles sofriam de paralisia supranuclear progressiva (PSP) ou degeneração corticobasal (CBD), enquanto os outros desenvolveram sintomas típicos de afasia progressiva primária (PPA). O ensaio ELISA digital de tau pT217 distingue entre DA e os outros distúrbios neurológicos (ponto de corte 9,3 pg/ml, especificidade, 94%, sensibilidade 100%).[346] The pT217 tau assay was used to test CSF samples from individuals with other neurological disorders, including multiple sclerosis (MS), Parkinson's disease (PD), amotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal dementia (FTD), where tau pathology may be present (Fig. 23B). FTD patients represent very heterogeneous populations, some of whom suffered from progressive supranuclear palsy (PSP) or corticobasal degeneration (CBD), while the others developed typical symptoms of primary progressive aphasia (PPA). The digital tau ELISA assay pT217 distinguishes between AD and other neurological disorders (cutoff point 9.3 pg / ml, specificity, 94%, sensitivity 100%).
[347] O ensaio ELISA digital de tau pT217 pode distinguir pacientes com DA de pacientes com DFT e objetos saudáveis com sensibilidade e especificidade similares, independentemente do calibrador escolhido. A distribuição de pT217 tau em amostras de CSF de pacientes com AD, pacientes com FTD e objetos saudáveis usando proteína tau fosforilada in vitro ou peptídeo sintético mostrou sensibilidade e especificidade similares. Usando o calibrador de proteína tau fosforilada, o ensaio exibiu 94,1% de sensibilidade e 91,7% de especificidade (> 5,37 pg/ml). Usando o peptídeo 2E7 (2E7pep), o ensaio exibiu 93,9% de sensibilidade e 90,0% de especificidade (> 305 pg/ml) (Fig. 29). 2E7pep possuía a seguinte sequência de aminoácidos: GQKGQANATRIPAKGGGSGGGSGGGSSRTPSLPpTPPT REP. A primeira sequência sublinhada representa um epítopo do anticorpo DC2E2, a segunda sequência sublinhada representa um epítopo do anticorpo DC2E7 (os primeiros 3 aminoácidos e os últimos aminoácidos são derivados da proteína tau, enquanto a sequência (GGGS)3 é um ligante conectando o epítopos de DC2E2 e DC2E7). Exemplo 17[347] The digital tau ELISA assay pT217 can distinguish AD patients from patients with DFT and healthy objects with similar sensitivity and specificity, regardless of the calibrator chosen. The distribution of pT217 tau in CSF samples from patients with AD, patients with FTD and healthy objects using phosphorylated tau protein in vitro or synthetic peptide showed similar sensitivity and specificity. Using the phosphorylated tau protein calibrator, the assay exhibited 94.1% sensitivity and 91.7% specificity (> 5.37 pg / ml). Using peptide 2E7 (2E7pep), the assay exhibited 93.9% sensitivity and 90.0% specificity (> 305 pg / ml) (Fig. 29). 2E7pep had the following amino acid sequence: GQKGQANATRIPAKGGGSGGGSGGGSSRTPSLPpTPPT REP. The first underlined sequence represents an epitope of the DC2E2 antibody, the second underlined sequence represents an epitope of the DC2E7 antibody (the first 3 amino acids and the last amino acids are derived from the tau protein, while the sequence (GGGS) 3 is a linker connecting the epitopes of DC2E2 and DC2E7). Example 17
Otimização de Anticorpo DC2E7 por Tecnologias RecombinantesOptimization of DC2E7 Antibody by Recombinant Technologies
[348] A afinidade do anticorpo DC2E7 foi otimizada por exibição de ribossomo e tecnologias de exibição de fago. Primeiro, o cDNA que codifica um formato scFv do anticorpo DC2E7 foi gerado por amplificação e clonagem a partir de uma linhagem celular de hibridoma DC2E7. O gene para o scFv DC2E7 foi então mutado por PCR propenso a erros e uma biblioteca de fragmentos scFv DC2E7 mutados foi selecionada por afinidade contra 2E7pep por exibição de ribossomo (Hanes et al., 1998) e tecnologias de exibição de fago (Harrison at al., 1996)[348] The affinity of the DC2E7 antibody was optimized by ribosome display and phage display technologies. First, the cDNA encoding a scFv format of the DC2E7 antibody was generated by amplification and cloning from a DC2E7 hybridoma cell line. The gene for scFv DC2E7 was then mutated by error-prone PCR and a library of mutated scFv DC2E7 fragments was selected for affinity against 2E7pep by ribosome display (Hanes et al., 1998) and phage display technologies (Harrison at al ., 1996)
[349] Após quatro rodadas de seleção, fragmentos de scFvs isolados foram clonados em um vetor de expressão de modo que os scFvs foram fundidos a um marcador myc e expressos em E. coli JM109 (Sanmark et. Al., 2015). Os lisados bacterianos de 30 colônias contendo scFv DC2E7 mutado foram testados usando um imunoensaio de competição de peptídeo. Os imunoensaios foram realizados em placas de microtitulação de 96 poços revestidas com 100 µl/poço de 0,01 µg/ml de 2E7pep em PBS a 4 ºC durante a noite. As placas foram lavadas 4x e bloqueadas em PBS-T durante 30 min à temperatura ambiente. A ligação foi realizada com 100 µl de lisado bacteriano diluído 10x em PBS-T, contendo anticorpo anti-myc diluído[349] After four rounds of selection, isolated scFvs fragments were cloned into an expression vector so that the scFvs were fused to a myc marker and expressed in E. coli JM109 (Sanmark et. Al., 2015). Bacterial lysates from 30 colonies containing mutated DC2E7 scFv were tested using a peptide competition immunoassay. Immunoassays were performed in 96-well microtiter plates coated with 100 µl / well of 0.01 µg / ml of 2E7pep in PBS at 4 ° C overnight. The plates were washed 4x and blocked in PBS-T for 30 min at room temperature. Binding was performed with 100 µl of bacterial lysate diluted 10x in PBS-T, containing diluted anti-myc antibody
10.000 x, em uma plataforma de agitação por 1 hora à temperatura ambiente. Os poços foram lavados quatro vezes com PBS-T e a competição com um 2E7pep a uma concentração de 10 µg/ml por lisado foi realizada durante 2 horas à TA em uma plataforma de agitação. Em seguida, as placas foram lavadas 4x com PBS-T e incubadas com conjugado de estreptavidina-HRP diluído 1:10.000 em PBS-T por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas 4xPBS-T e desenvolvidas usando um substrato TMB por 5 min antes da reação colorimétrica ser interrompida usando H2SO4 1 M. A absorbância a 450 nm foi lida usando um leitor de absorbância de placa de microtitulação.10,000 x, on a shaking platform for 1 hour at room temperature. The wells were washed four times with PBS-T and competition with a 2E7pep at a concentration of 10 µg / ml per lysate was carried out for 2 hours at RT on a shaking platform. Then, the plates were washed 4x with PBS-T and incubated with streptavidin-HRP conjugate diluted 1: 10,000 in PBS-T for 1 hour at room temperature. The plates were washed 4xPBS-T and developed using a TMB substrate for 5 min before the colorimetric reaction was stopped using 1 M H2SO4. The absorbance at 450 nm was read using a microtiter plate absorbance reader.
[350] A absorbância para os scFvs gerados pela exibição de ribossomo e exibição de fago são mostradas na Fig. 24. scFv K+ representa DC217 não mutado. Espera-se que todos os scFv mostrando sinal acima da linha correspondente a scFv K+ tenham maior afinidade (marcado com um asterisco), em comparação com o DC217 scFv original.[350] The absorbance for scFvs generated by the ribosome display and phage display are shown in Fig. 24. scFv K + represents unmuted DC217. All scFv showing a signal above the line corresponding to scFv K + are expected to have greater affinity (marked with an asterisk), compared to the original DC217 scFv.
[351] Os alinhamentos das sequências de aminoácidos da cadeia pesada e leve dos scFvs isolados por exibição de ribossomo e exibição de fago ("PD" no final de um nome de clone indica que foi obtido por exibição de fago) são mostrados na Fig 25. VL (Fig. 25A) e sequências de VH (Fig. 25B) são mostradas. Os anticorpos com ligação melhorada em relação a DC2E7 são mostrados na Fig. 25C (cadeia leve) e Fig. 25D (cadeia pesada). A primeira linha representa o anticorpo DC2E7 original. Os resíduos idênticos à sequência em DC2E7 são representados por pontos. A numeração de resíduos de aminoácidos em VL e VH e a marcação de CDRs estão de acordo com o sistema de numeração IMGT. Exemplo 18 Comparação de Anticorpos DC2E7, DC149 e DC807[351] The alignments of the heavy and light chain amino acid sequences of the scFvs isolated by ribosome display and phage display ("PD" at the end of a clone name indicates that it was obtained by phage display) are shown in Fig 25 VL (Fig. 25A) and VH sequences (Fig. 25B) are shown. Antibodies with improved binding to DC2E7 are shown in Fig. 25C (light chain) and Fig. 25D (heavy chain). The first line represents the original DC2E7 antibody. Residues identical to the sequence in DC2E7 are represented by dots. The numbering of amino acid residues in VL and VH and the labeling of CDRs are in accordance with the IMGT numbering system. Example 18 Comparison of Antibodies DC2E7, DC149 and DC807
[352] Anticorpo DC149 foi gerado de maneira similar ao que foi descrito no Exemplo 2, com a seguinte diferença: Os camundongos foram imunizados com um peptídeo duplo fosforilado nas posições Thr212 e Thr217, ou seja, CSRpTPSLPpTPPTREPK (210-224 de 2N4R tau) conjugado através da primeira cisteína para KLH. A triagem foi realizada por ELISA como descrito no Exemplo 2, em que DC149 foi identificado por ligação específica ao peptídeo compreendendo SRTPSLPpTPPTREPK (isto é, o mesmo peptídeo mono-fosforilado em Thr217 que DC2E7 se ligou) e DC807 por ligação específica ao peptídeo duplo-fosforilado. Os anticorpos DC149 e DC807 não se ligaram a um peptídeo não fosforilado ou a uma proteína tau não fosforilada, enquanto o DC807 também não se ligou a peptídeos monofosforilados.[352] Antibody DC149 was generated in a similar manner to that described in Example 2, with the following difference: The mice were immunized with a phosphorylated double peptide at the Thr212 and Thr217 positions, that is, CSRpTPSLPpTPPTREPK (210-224 of 2N4R tau) conjugated via the first cysteine to KLH. Screening was performed by ELISA as described in Example 2, where DC149 was identified by specific binding to the peptide comprising SRTPSLPpTPPTREPK (i.e., the same monophosphorylated peptide at Thr217 that DC2E7 bound) and DC807 by specific binding to the double- phosphorylated. Antibodies DC149 and DC807 did not bind to a non-phosphorylated peptide or to an unphosphorylated tau protein, while DC807 also did not bind to monophosphorylated peptides.
[353] DC2E7 e DC149 e DC807 foram analisados em um ensaio ELISA clássico usando uma configuração similar à que foi descrita no exemplo 10, em que o calibrador 2E7pep foi usado. Todos os três anticorpos ligados ao peptídeo de tau fosforilada pelo menos em Thr217 com afinidades muito similares (Fig. 26).[353] DC2E7 and DC149 and DC807 were analyzed in a classic ELISA assay using a configuration similar to that described in example 10, in which the calibrator 2E7pep was used. All three antibodies bound to the phosphorylated tau peptide at least in Thr217 with very similar affinities (Fig. 26).
[354] Sequências de aminoácidos para os anticorpos DC217, DC149 e DC807 foram determinadas por clonagem e por espectrometria de massa. O alinhamento das sequências da cadeia pesada e leve em DC2E7 e DC149 é mostrado na Fig. 27A-B. Os alinhamentos das sequências da cadeia pesada e leve em DC2E7 e DC807 são mostrados na Fig. 28A-B. Os resíduos idênticos à sequência de DC2E7 são representados por pontos. As regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de VL e VH estão dentro de uma caixa. A numeração de resíduos de aminoácidos em VL e VH e a marcação de CDRs estão de acordo com o sistema de numeração IMGT. Referências de literatura: Hanes et al., (1998). Ribosome display efficiently selects and evolves high-affinity antibodies in vitro from immune libraries. PNAS, Vol. 95, pp. 14130–14135. doi.org/10.1073/pnas.95.24.14130. Harrison et al., (1996). Screening of phage antibody libraries. vol. 26783-109, pp. 83-109. doi.org/10.1016/S0076- 6879(96)67007-4. Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesmann, K. S. & Foeller, C. (1991) in Sequences of Proteins of Immunological Interest (U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda, MD) Vol.[354] Amino acid sequences for antibodies DC217, DC149 and DC807 were determined by cloning and mass spectrometry. The alignment of the heavy and light chain sequences in DC2E7 and DC149 is shown in Fig. 27A-B. The alignments of the heavy and light chain sequences in DC2E7 and DC807 are shown in Fig. 28A-B. Residues identical to the DC2E7 sequence are represented by dots. The VL and VH complementarity determining regions (CDRs) are enclosed in a box. The numbering of amino acid residues in VL and VH and the labeling of CDRs are in accordance with the IMGT numbering system. Literature references: Hanes et al., (1998). Ribosome display efficiently selects and evolves high-affinity antibodies in vitro from immune libraries. PNAS, Vol. 95, pp. 14130–14135. doi.org/10.1073/pnas.95.24.14130. Harrison et al., (1996). Screening of phage antibody libraries. vol. 26783-109, pp. 83-109. doi.org/10.1016/S0076- 6879 (96) 67007-4. Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesmann, K. S. & Foeller, C. (1991) in Sequences of Proteins of Immunological Interest (U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda, MD) Vol.
I, pp. 151 e 464, 5a Ed. Exemplo 19 Validação Independente do Ensaio pT217I, pp. 151 and 464, 5th Ed. Example 19 Independent Validation of the pT217 Assay
[355] O protocolo para detecção e quantificação de pT217 discutido precedentemente foi aplicado ao SIMOA usando um analisador HD-1. O protocolo foi considerado adequado para a medição de pT217 em amostras de CSF humano. A sensibilidade, linearidade, paralelismo e recuperação do ensaio foram analisados. As curvas padrão foram medidas adicionando o peptídeo calibrador 2E7 pep em amostras de CSF e em PBS. DC2E7 foi usado como o anticorpo de captura e DC2E2 foi usado como o anticorpo de detecção. O limite de detecção observado foi de 184,4 pg/mL. A repetibilidade foi avaliada: Intraensaio (<15% para valores dentro do intervalo linear da curva padrão), Interensaio (<15% para valores dentro do intervalo linear da curva padrão) e Intraplaca (ensaio (<15% para valores dentro da faixa linear da curva padrão). Paralelismo e recuperação foram determinados como sendo <15%.[355] The protocol for detection and quantification of pT217 discussed earlier was applied to SIMOA using an HD-1 analyzer. The protocol was considered suitable for the measurement of pT217 in human CSF samples. Assay sensitivity, linearity, parallelism and recovery were analyzed. Standard curves were measured by adding the calibrator peptide 2E7 pep to CSF and PBS samples. DC2E7 was used as the capture antibody and DC2E2 was used as the detection antibody. The observed detection limit was 184.4 pg / mL. Repeatability was assessed: Intraassay (<15% for values within the linear range of the standard curve), Interassay (<15% for values within the linear range of the standard curve) and Intraplate (assay (<15% for values within the linear range) of the standard curve). Parallelism and recovery were determined to be <15%.
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