[001] A presente invenção refere-se, de forma geral, a imunoconjugados, em particular imunoconjugados que compreendem um polipeptídeo interleucina-2 mutante e um anticorpo que se liga a PD-1. Além disso, a invenção refere-se a moléculas de polinucleotídeos que codificam os imunoconjugados e vetores e células hospedeiras que compreendem tais moléculas de polinucleotídeos. A invenção refere-se ainda a métodos para produzir os imunoconjugados mutantes, composições farmacêuticas que compreendem os mesmos e seus usos.[001] The present invention relates generally to immunoconjugates, in particular immunoconjugates comprising a mutant interleukin-2 polypeptide and an antibody that binds to PD-1. Furthermore, the invention relates to polynucleotide molecules encoding the immunoconjugates and vectors and host cells comprising such polynucleotide molecules. The invention further relates to methods for producing the mutant immunoconjugates, pharmaceutical compositions comprising them and their uses.
[002] A interleucina-2 (IL-2), também conhecida como fator de crescimento de células T (TCGF), é uma glicoproteína globular de 15,5 kDa que desempenha um papel central na geração, sobrevivência e homeostase de linfócitos. Tem um comprimento de 133 aminoácidos e consiste em quatro α- hélices anfipáticas antiparalelas que formam uma estrutura quaternária indispensável à sua função (Smith, Science 240, 1169-76 (1988); Bazan,Science 257, 410-413 (1992)). As sequências de IL-2 de diferentes espécies são encontradas nos NCBI RefSeq Nos. NP000577 (humano), NP032392 (camundongo), NP446288 (camundongo) ou NP517425 (chimpanzé).[002] Interleukin-2 (IL-2), also known as T-cell growth factor (TCGF), is a 15.5 kDa globular glycoprotein that plays a central role in the generation, survival, and homeostasis of lymphocytes. It is 133 amino acids long and consists of four antiparallel amphipathic α-helices that form a quaternary structure indispensable for its function (Smith, Science 240, 1169-76 (1988); Bazan, Science 257, 410-413 (1992)). IL-2 sequences from different species are found in NCBI RefSeq Nos. NP000577 (human), NP032392 (mouse), NP446288 (mouse), or NP517425 (chimpanzee).
[003] A IL-2 medeia a sua ação ligando-se aos receptores de IL-2 (IL-2R), que consistem em até três subunidades individuais, cuja associação diferente pode produzir formas de receptor que diferem na sua afinidade com IL- 2. Associação das subunidades α (CD25), β (CD122), e Y (Y c, CD132) resulta em um receptor trimérico, de alta afinidade para IL-2. O receptor dimérico de IL- 2, que consiste nas subunidades β e Y, é denominado IL-2R de afinidade intermediária. A subunidade α forma o receptor monomérico de baixa afinidade de IL-2. Embora o receptor dimérico de afinidade intermediária de IL-2 se ligue a IL-2 com afinidade aproximadamente 100 vezes menor que o receptor trimérico de alta afinidade, ambas as variantes do receptor IL-2 dimérico e trimérico são capazes de transmitir sinal após a ligação de IL-2 (Minami et al, Annu Rev Immunol 11, 245-268 (1993)). Assim, a subunidade α, CD25, não é essencial para a sinalização de IL-2. Confere ligação de alta afinidade ao seu receptor, enquanto a subunidade β, CD122 e a subunidade Y são cruciais para a transdução de sinal (Krieg et al., proc Natl Acad Sci 107, 11906-11 (2010)). Os receptores triméricos IL-2, incluindo CD25 são expressas por (de repouso) Caixa de cabeça de garfos (forkhead) CD4+ P3 (FoxP3)+ células reguladoras T (Treg). Eles também são transientemente induzidos em células T ativadas convencionais, enquanto no estado de repouso essas células expressam apenas receptores diméricos de IL-2. As células Treg expressam consistentemente o nível mais elevado de CD25 in vivo (Fontenot et al., Nature Immunol 6, 1142-51 (2005)).[003] IL-2 mediates its action by binding to IL-2 receptors (IL-2R), which consist of up to three individual subunits, the different association of which can produce receptor forms that differ in their affinity for IL-2. Association of the α (CD25), β (CD122), and Y (Y c, CD132) subunits results in a trimeric, high-affinity receptor for IL-2. The dimeric IL-2 receptor, consisting of the β and Y subunits, is termed the intermediate-affinity IL-2R. The α subunit forms the monomeric, low-affinity IL-2 receptor. Although the intermediate-affinity dimeric IL-2 receptor binds IL-2 with approximately 100-fold lower affinity than the high-affinity trimeric receptor, both the dimeric and trimeric IL-2 receptor variants are capable of signal transmission following IL-2 binding (Minami et al, Annu Rev Immunol 11, 245-268 (1993)). Thus, the α subunit, CD25, is not essential for IL-2 signaling. It confers high-affinity binding to its receptor, whereas the β subunit, CD122, and the Y subunit are crucial for signal transduction (Krieg et al., Proc Natl Acad Sci 107, 11906-11 (2010)). The trimeric IL-2 receptors, including CD25, are expressed by (resting) CD4+ forkhead box P3 (FoxP3)+ regulatory T (Treg) cells. They are also transiently induced in conventional activated T cells, whereas in the resting state these cells express only dimeric IL-2 receptors. Treg cells consistently express the highest level of CD25 in vivo (Fontenot et al., Nature Immunol 6, 1142-51 (2005)).
[004] A IL-2 é sintetizada principalmente por células T ativadas, em particular células T auxiliares CD4+ Estimula a proliferação e diferenciação de células T, induz a geração de linfócitos T citotóxicos (CTLs) e a diferenciação de linfócitos do sangue periférico em células citotóxicas e células killers ativadas por linfocina (LAK), promove expressão de citocinas e moléculas citolíticas por células T, facilita a proliferação e diferenciação de células B e a síntese de imunoglobulina pelas células B e estimula a geração, proliferação e ativação de células natural killer (NK) (revisadas, por exemplo, em Waldmann, Nat Rev Immunol 6, 595-601 (2009), Olejniczak e Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179- 89 (2008), Malek, Annu Rev Immunol 26, 453-79 (2008)).[004] IL-2 is synthesized primarily by activated T cells, in particular CD4+ T helper cells. It stimulates T cell proliferation and differentiation, induces the generation of cytotoxic T lymphocytes (CTLs) and the differentiation of peripheral blood lymphocytes into cytotoxic cells and lymphokine-activated killer (LAK) cells, promotes expression of cytokines and cytolytic molecules by T cells, facilitates B cell proliferation and differentiation and immunoglobulin synthesis by B cells, and stimulates the generation, proliferation, and activation of natural killer (NK) cells (reviewed, e.g., in Waldmann, Nat Rev Immunol 6, 595-601 (2009), Olejniczak and Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-89 (2008), Malek, Annu Rev Immunol 26, 453-79 (2008)).
[005] Sua capacidade de expandir as populações de linfócitos in vivo e aumentar as funções efetoras dessas células confere efeitos antitumorais à IL-2, tornando a imunoterapia com IL-2 uma opção de tratamento atraente para certos tipos de câncer metastático. Consequentemente, o tratamento com altas doses de IL-2 foi aprovado para uso em pacientes com carcinoma de células renais metastático e melanoma maligno.[005] Its ability to expand lymphocyte populations in vivo and enhance the effector functions of these cells confers antitumor effects to IL-2, making IL-2 immunotherapy an attractive treatment option for certain types of metastatic cancer. Consequently, high-dose IL-2 treatment has been approved for use in patients with metastatic renal cell carcinoma and malignant melanoma.
[006] Contudo, a IL-2 tem uma função dupla na resposta imune, na medida em que não só medeia a expansão e a atividade das células efetoras, mas também está crucialmente envolvida na manutenção da tolerância imune periférica.[006] However, IL-2 has a dual function in the immune response, as it not only mediates the expansion and activity of effector cells, but is also crucially involved in the maintenance of peripheral immune tolerance.
[007] Um importante mecanismo subjacente à auto tolerância periférica é a morte celular induzida por ativação induzida por IL-2 (AICD) em células T. AICD é um processo pelo qual células T totalmente ativadas sofrem morte celular programada através do envolvimento de receptores de morte expressos na superfície celular, tais como CD95 (também conhecido como Fas) ou o receptor de TNF. Quando as células T ativadas por antígeno que expressam um receptor de IL-2 de alta afinidade (após exposição prévia a IL-2) durante a proliferação são reestimuladas com antígeno através do complexo receptor de células T (TCR)/ CD3, a expressão do ligando Fas (FasL) e/ ou fator de necrose tumoral (TNF) é induzido, tornando as células suscetíveis à apoptose mediada por Fas. Este processo é dependente de IL-2 (Lenardo, Nature 353, 858-61 (1991)) e mediado via STAT5. Pelo processo de AICD em linfócitos T, a tolerância não só pode ser estabelecida para auto-antígenos, mas também para antígenos persistentes que claramente não fazem parte da composição do hospedeiro, como os antígenos tumorais.[007] An important mechanism underlying peripheral self-tolerance is IL-2-induced activation-induced cell death (AICD) in T cells. AICD is a process by which fully activated T cells undergo programmed cell death through the engagement of cell surface-expressed death receptors such as CD95 (also known as Fas) or the TNF receptor. When antigen-activated T cells expressing a high-affinity IL-2 receptor (after prior exposure to IL-2) during proliferation are restimulated with antigen through the T cell receptor (TCR)/CD3 complex, expression of Fas ligand (FasL) and/or tumor necrosis factor (TNF) is induced, rendering the cells susceptible to Fas-mediated apoptosis. This process is IL-2-dependent (Lenardo, Nature 353, 858-61 (1991)) and mediated via STAT5. By the process of AICD in T lymphocytes, tolerance can not only be established to self-antigens, but also to persistent antigens that are clearly not part of the host composition, such as tumor antigens.
[008] Além disso, a IL-2 também está envolvida na manutenção de células T reguladoras periféricas CD4+ CD25+ (Treg) (Fontenot et al., Nature Immunol 6, 1142-51 (2005); D'Cruz e Klein, Nature Immunol 6, 1152-59 (2005); Maloy e Powrie, Nature Immunol 6, 1171-72 (2005)), que são tambémconhecidos como células T supressoras. Eles suprimem as células T efetoras de destruir seu (auto) alvo, seja através do contato célula-célula, inibindo a ajuda e ativação de células T, ou através da liberação de citocinas imunossupressoras, como IL-10 ou TGF-β. Verificou-se que a depleção de células Treg aumenta a imunidade antitumoral induzida por IL-2 (Imai et al., Cancer Sci 98, 416-23 (2007)).[008] Furthermore, IL-2 is also involved in the maintenance of peripheral CD4+ CD25+ regulatory T cells (Treg) (Fontenot et al., Nature Immunol 6, 1142-51 (2005); D'Cruz and Klein, Nature Immunol 6, 1152-59 (2005); Maloy and Powrie, Nature Immunol 6, 1171-72 (2005)), which are also known as suppressor T cells. They suppress effector T cells from destroying their (self) target either through cell-cell contact, inhibiting T cell help and activation, or through the release of immunosuppressive cytokines such as IL-10 or TGF-β. Depletion of Treg cells has been shown to enhance IL-2-induced antitumor immunity (Imai et al., Cancer Sci 98, 416-23 (2007)).
[009] Portanto, a IL-2 não é ótima para inibir o crescimento tumoral, porque na presença de IL-2 ou os CTL gerados podem reconhecer o tumor como auto e sofrer AICD ou a resposta imune pode ser inibida por células Treg dependentes de IL-2.[009] Therefore, IL-2 is not optimal for inhibiting tumor growth, because in the presence of IL-2 either the generated CTLs may recognize the tumor as self and undergo AICD or the immune response may be inhibited by IL-2-dependent Treg cells.
[010] Uma outra preocupação em relação à imunoterapia com IL- 2 são os efeitos colaterais produzidos pelo tratamento com IL-2 humana recombinante. Os pacientes que recebem altas doses de tratamento com IL-2 frequentemente experimentam eventos adversos cardiovasculares, pulmonares, renais, hepáticos, gastrointestinais, neurológicos, cutâneos, hematológicos e sistêmicos, que exigem monitoramento intensivo e manejo hospitalar. A maioria desses efeitos colaterais pode ser explicada pelo desenvolvimento da chamada síndrome de vazamento vascular (ou capilar) (VLS), um aumento patológico da permeabilidade vascular que leva ao extravasamento de fluidos em múltiplos órgãos (causando, por exemplo, edema pulmonar e cutâneo e danos em células hepáticas) e depleção de líquido intravascular (causando queda da pressão arterial e aumento compensatório da frequência cardíaca). Não há tratamento de VLS que não seja a retirada de IL-2. Regimes de baixa dose de IL-2 foram testados em pacientes para evitar VLS, no entanto, à custa de resultados terapêuticos abaixo do ideal. Acreditava-se que a VLS fosse causada pela liberação de citocinas pró-inflamatórias, como o fator de necrose tumoral (TNF)- α de células NK ativadas por IL-2, mas recentemente foi demonstrado que o edema pulmonar induzido por ligação de IL-2 a células endoteliais do pulmão que expressam níveis baixos a intermediários de receptores funcionais de αβY IL-2 (Kri por exemplo et al., proc Nat Acad Sci EUA 107, 11906-11 (2010)).[010] Another concern regarding IL-2 immunotherapy is the side effects produced by treatment with recombinant human IL-2. Patients receiving high-dose IL-2 treatment frequently experience cardiovascular, pulmonary, renal, hepatic, gastrointestinal, neurological, cutaneous, hematological and systemic adverse events, which require intensive monitoring and hospital management. Most of these side effects can be explained by the development of the so-called vascular (or capillary) leak syndrome (VLS), a pathological increase in vascular permeability that leads to fluid extravasation in multiple organs (causing, for example, pulmonary and cutaneous edema and liver cell damage) and intravascular fluid depletion (causing a fall in blood pressure and a compensatory increase in heart rate). There is no treatment for VLS other than IL-2 withdrawal. Low-dose IL-2 regimens have been tested in patients to avoid VLS, however, at the cost of suboptimal therapeutic results. VLS was previously thought to be caused by the release of proinflammatory cytokines such as tumor necrosis factor (TNF)-α from IL-2-activated NK cells, but it has recently been shown that pulmonary edema is induced by IL-2 binding to lung endothelial cells that express low to intermediate levels of functional IL-2 αβY receptors (Kri et al., Proc Nat Acad Sci USA 107, 11906-11 (2010)).
[011] Várias abordagens foram tomadas para superar esses problemas associados à imunoterapia com IL-2. Por exemplo, verificou-se que a combinação de IL-2 com certos anticorpos monoclonais anti-IL-2 aumenta os efeitos do tratamento de IL-2 in vivo (Kamimura et al., J Immunol 177, 306-14 (2006); Boyman et al., Science 311, 1924-27 (2006)). Em uma abordagem alternativa, a IL-2 sofreu mutações de várias maneiras para reduzir a sua toxicidade e/ ou aumentar a sua eficácia. Hu et al. (Blood 101,4853-4861 (2003), patente dos EUA N° 2003/0124678) substituíram o resíduo de arginina na posição 38 da IL-2 pelo triptofano para eliminar a atividade de vaso permeabilidade da IL-2. Shanafelt et al. (Nature Biotechnol 18, 1197-1202(2000)) mutaram asparagina 88 para arginina para aumentar a seletividade para células T sobre células NK. Heaton et al. (Cancer Res 53, 2597-602 (1993); Patente dos EUA N° 5.229.109) introduziram duas mutações, Arg38Ala e Phe42Lys, para reduzir a secreção de citocinas pró-inflamatórias das células NK. Gillies et al. (Patente US N° 2007/0036752) substituíram três resíduos de IL-2 (Asp20Thr, Asn88Arg e Gln126Asp) que contribuem para a afinidade pelo receptor de IL-2 de afinidade intermédia para reduzir as VLS. Gillies et al. (WO 2008/0034473) também mutaram a interface de IL-2 com CD25 por substituição de aminoácido Arg38Trp e Phe42Lys para reduzir a interação com CD25 e ativação de células Treg para aumentar a eficácia. Para o mesmo objetivo, Wittrup et al. (WO 2009/061853) produziram mutantes IL-2 que aumentaram a afinidade para CD25, mas não ativam o receptor, atuando assim como antagonistas. As mutações introduzidas visavam interromper a interação com a subunidade β e/ ou Y do receptor.[011] Several approaches have been taken to overcome these problems associated with IL-2 immunotherapy. For example, combining IL-2 with certain anti-IL-2 monoclonal antibodies has been found to enhance the effects of IL-2 treatment in vivo (Kamimura et al., J Immunol 177, 306-14 (2006); Boyman et al., Science 311, 1924-27 (2006)). In an alternative approach, IL-2 has been mutated in various ways to reduce its toxicity and/or increase its efficacy. Hu et al. (Blood 101,4853-4861 (2003), US Patent No. 2003/0124678) replaced the arginine residue at position 38 of IL-2 with tryptophan to eliminate the vasopermeability activity of IL-2. Shanafelt et al. (Nature Biotechnol 18, 1197-1202(2000)) mutated asparagine 88 to arginine to increase selectivity for T cells over NK cells. Heaton et al. (Cancer Res 53, 2597-602 (1993); US Patent No. 5,229,109) introduced two mutations, Arg38Ala and Phe42Lys, to reduce proinflammatory cytokine secretion from NK cells. Gillies et al. (US Patent No. 2007/0036752) replaced three IL-2 residues (Asp20Thr, Asn88Arg, and Gln126Asp) that contribute to affinity for the intermediate-affinity IL-2 receptor to reduce VLS. Gillies et al. (WO 2008/0034473) also mutated the interface of IL-2 with CD25 by amino acid substitution Arg38Trp and Phe42Lys to reduce interaction with CD25 and activation of Treg cells to increase efficacy. For the same purpose, Wittrup et al. (WO 2009/061853) produced IL-2 mutants that increased affinity for CD25 but did not activate the receptor, thus acting as antagonists. The introduced mutations aimed to disrupt interaction with the β and/or Y subunit of the receptor.
[012] Um determinado polipeptídeo de IL-2 mutante, concebido para superar os problemas acima mencionados associados à imunoterapia com IL-2 (toxicidade causada pela indução de VLS, tolerância tumoral causada pela indução de AICD e imunossupressão causada pela ativação de células Treg), é descrito no documento WO, 2012/ 107417. A substituição do resíduo de fenilalanina na posição 42 por alanina, o resíduo de tirosina na posição 45 por alanina e o resíduo de leucina na posição 72 de IL-2 pela glicina, abole essencialmente a ligação deste polipeptídeo de IL-2 mutante à subunidade α do receptor de IL-2 (CD25).[012] A particular mutant IL-2 polypeptide, designed to overcome the above-mentioned problems associated with IL-2 immunotherapy (toxicity caused by VLS induction, tumor tolerance caused by AICD induction, and immunosuppression caused by Treg cell activation), is described in WO, 2012/107417. Substitution of the phenylalanine residue at position 42 with alanine, the tyrosine residue at position 45 with alanine, and the leucine residue at position 72 of IL-2 with glycine, essentially abolishes the binding of this mutant IL-2 polypeptide to the α subunit of the IL-2 receptor (CD25).
[013] Além das abordagens acima mencionadas, a imunoterapia com IL-2 pode ser melhorada por, de forma seletiva, direcionar IL-2 para tumores, por exemplo, na forma de imunoconjugados que compreendem um anticorpo que se liga a um antígeno expresso em células tumorais. Vários imunoconjugados deste tipo foram descritos (ver, por exemplo, Ko et al., JImunother (2004)27, 232-239; Klein et al., Oncoimmunology (2017) 6 (3), e1277306).[013] In addition to the above-mentioned approaches, IL-2 immunotherapy can be improved by selectively targeting IL-2 to tumors, for example, in the form of immunoconjugates comprising an antibody that binds to an antigen expressed on tumor cells. Several immunoconjugates of this type have been described (see, for example, Ko et al., JImunother (2004)27, 232-239; Klein et al., Oncoimmunology (2017) 6 (3), e1277306).
[014] No entanto, os tumores podem ser capazes de escapar a esse alvejamento pela eliminação, mutação ou regulação negativa do antígeno alvo do anticorpo. Além disso, a IL-2 dirigida ao tumor pode não entrar em contato ideal com células efetoras, como os linfócitos T citotóxicos (CTLs), em microambientes tumorais que excluem ativamente os linfócitos.[014] However, tumors may be able to escape such targeting by deletion, mutation, or downregulation of the antibody's target antigen. Furthermore, tumor-targeted IL-2 may not optimally contact effector cells, such as cytotoxic T lymphocytes (CTLs), in tumor microenvironments that actively exclude lymphocytes.
[015] Assim, permanece a necessidade de melhorar ainda mais a imunoterapia com IL-2. Uma abordagem, que pode contornar os problemas de direcionamento para tumores, é direcionar IL-2 diretamente para células efetoras, em particular CTLs.[015] Thus, there remains a need to further improve IL-2 immunotherapy. One approach, which may circumvent tumor targeting problems, is to target IL-2 directly to effector cells, in particular CTLs.
[016] Ghasemi et al. descreveram uma proteína de fusão de IL-2 e uma proteína de ligação a NKG2D (Ghashemi et al., Nat Comm (2016) 7, 12878), para direcionar células contendo IL-2 para NKG2D, tais como células natural killer (NK).[016] Ghasemi et al. described a fusion protein of IL-2 and an NKG2D-binding protein (Ghashemi et al., Nat Comm (2016) 7, 12878), to target IL-2-containing cells to NKG2D, such as natural killer (NK) cells.
[017] A proteína 1 de morte celular programada (PD-1 ou CD279) é um membro inibidor da família de receptores CD28, que também inclui CD28, CTLA-4, ICOS e BTLA. A PD-1 é um receptor da superfície celular e é expressa em células B ativadas, células T e células mieloides (Okazaki etal. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170: 711-8). A estrutura de PD-1 é uma proteína transmembranar monomérica de tipo 1, consistindo em um domínio extracelular tipo variável de imunoglobulina e um domínio citoplasmático contendo um motivo inibidor com base em tirosina imuno receptora (ITIM) e um motivo de interrupção com base em tirosina imuno receptora (ITSM). Foram identificados dois ligandos para PD-1, PD-L1 e PD-L2, que demonstraram regular negativamente a ativação de células T após ligação a PD-1 (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2: 261 -8; Carter et al (2002) Eur J Immunol 32: 634-43). Ambos PD- L1 e PD-L2 são homólogos B7 que se ligam a PD-1, mas não se ligam a outros membros da família CD28. Um ligando para PD-1, PD-L1 é abundante em uma variedade de cânceres humanos (Dong et al (2002) Nat. Med 8: 787-9). A interação entre PD-1 e PD-L1 resulta em uma diminuição dos linfócitos de infiltração tumoral, uma diminuição na proliferação mediada pelo receptor de células T e evasão da imunidade pelas células cancerosas (Dong et al. (2003) J. MoI. Med. Chem. 81: 281-7, Blank et al., (2005) Cancer Immunol, Immunother, 54: 307-314, Konishi et al., (2004) Clin, Cancer Res. 10: 5094-100). A supressão imunológica pode ser revertida inibindo a interação local de PD-1 com PD-L1, e o efeito é aditivo quando a interação de PD-1 com PD-L2 também é bloqueada (Iwai et al. (2002) Proc. Nat. 7. Acad. ScL USA 99: 12293-7, Brown e outros (2003) J. Immunol. 170: 1257-66).[017] Programmed cell death protein 1 (PD-1 or CD279) is an inhibitory member of the CD28 family of receptors, which also includes CD28, CTLA-4, ICOS, and BTLA. PD-1 is a cell surface receptor and is expressed on activated B cells, T cells, and myeloid cells (Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170: 711-8). The structure of PD-1 is a monomeric type 1 transmembrane protein, consisting of an immunoglobulin-like variable extracellular domain and a cytoplasmic domain containing an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM) and an immunoreceptor tyrosine-based stop motif (ITSM). Two ligands for PD-1, PD-L1 and PD-L2, have been identified and have been shown to negatively regulate T cell activation following PD-1 ligation (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2: 261-8; Carter et al (2002) Eur J Immunol 32: 634-43). Both PD-L1 and PD-L2 are B7 homologs that bind to PD-1 but do not bind to other members of the CD28 family. A ligand for PD-1, PD-L1 is abundant on a variety of human cancers (Dong et al (2002) Nat. Med 8: 787-9). The interaction between PD-1 and PD-L1 results in a decrease in tumor infiltrating lymphocytes, a decrease in T cell receptor-mediated proliferation, and evasion of immunity by cancer cells (Dong et al. (2003) J. MoI. Med. Chem. 81: 281-7, Blank et al., (2005) Cancer Immunol, Immunother, 54: 307-314, Konishi et al., (2004) Clin, Cancer Res. 10: 5094-100). Immune suppression can be reversed by inhibiting the local interaction of PD-1 with PD-L1, and the effect is additive when the interaction of PD-1 with PD-L2 is also blocked (Iwai et al. (2002) Proc. Nat. 7. Acad. ScL USA 99: 12293-7, Brown et al. (2003) J. Immunol. 170: 1257-66).
[018] Anticorpos que se ligam a PD-1 são descritos, por exemplo, no pedido de patente PCT N° PCT/ EP2016/ 073248.[018] Antibodies that bind to PD-1 are described, for example, in PCT patent application No. PCT/EP2016/073248.
[019] A presente invenção proporciona uma nova abordagem de direcionamento para uma forma IL-2 mutante com propriedades vantajosas para imunoterapia diretamente para células efetoras imunes, tais como linfócitos T citotóxicos, em vez de células tumorais. O direcionamento para células efetoras imunes é alcançado pela conjugação da molécula de IL-2 mutante a um anticorpo que se liga a PD-1.[019] The present invention provides a novel approach for targeting a mutant IL-2 form with advantageous properties for immunotherapy directly to immune effector cells, such as cytotoxic T lymphocytes, rather than tumor cells. Targeting to immune effector cells is achieved by conjugating the mutant IL-2 molecule to an antibody that binds to PD-1.
[020] O IL-2 mutante utilizado na presente invenção foi concebido para ultrapassar os problemas associados à imunoterapia com IL-2, em particular a toxicidade causada pela indução de VLS, a tolerância do tumor causada pela indução de AICD e a imunossupressão causada pela ativação de Células Treg. Para além de contornar o escape de tumores de direcionamento para tumores como mencionado acima, o direcionamento do IL-2 mutante para células efetoras imunes pode aumentar ainda mais a ativação preferencial de CTLs sobre células Treg imunossupressoras. Utilizando um anticorpo que se liga a PD-1, a supressão da atividade de células T induzida pela interação de PD-1 com o seu ligando PD-L1 pode ser adicionalmente invertida, aumentando assim ainda mais a resposta imune.[020] The mutant IL-2 used in the present invention was designed to overcome the problems associated with IL-2 immunotherapy, in particular the toxicity caused by VLS induction, the tumor tolerance caused by AICD induction and the immunosuppression caused by Treg cell activation. In addition to circumventing tumor escape from tumor targeting as mentioned above, targeting of the mutant IL-2 to immune effector cells may further enhance the preferential activation of CTLs over immunosuppressive Treg cells. Using an antibody that binds to PD-1, the suppression of T cell activity induced by the interaction of PD-1 with its ligand PD-L1 may be further reversed, thereby further enhancing the immune response.
[021] Uma proteína de fusão de IL-2 que compreende o anticorpo anti-PD-L1, atezolizumab, foi descrita por Chen et al. (Chen e outros, Biochem Biophys Res Comm (2016) 480, 160-165).[021] An IL-2 fusion protein comprising the anti-PD-L1 antibody, atezolizumab, has been described by Chen et al. (Chen et al., Biochem Biophys Res Comm (2016) 480, 160-165).
[022] É de notar que o imunoconjugado da invenção, que compreende um anticorpo que se liga a PD-1, apresenta eficácia antitumoral significativamente superior in vivo, em comparação com um imunoconjugado semelhante que tem como alvo PD-L1 (ver Exemplo 3 abaixo).[022] It is noted that the immunoconjugate of the invention, which comprises an antibody that binds to PD-1, exhibits significantly superior antitumor efficacy in vivo compared to a similar immunoconjugate that targets PD-L1 (see Example 3 below).
[023] Em um aspecto geral, a invenção proporciona um imunoconjugado que compreende um anticorpo que se liga a PD-1 e um polipeptídeo que sinaliza através de IL-2RβY. O polipeptídeo de sinalização através de IL-2RβY é em particular um polipeptídeo de IL-2 ou um polipeptídeo de IL-15. Em um primeiro aspecto, a invenção proporciona um imunoconjugado que compreende um polipeptídeo de IL-2 mutante e um anticorpo que se liga a PD-1, em que o polipeptídeo de IL-2 mutante é uma molécula de IL-2 humana que compreende as substituições dos aminoácidos F42A, Y45A e L72G (numeração em relação à sequência de IL-2 humana SEQ. ID N°: 19).[023] In a general aspect, the invention provides an immunoconjugate comprising an antibody that binds to PD-1 and a polypeptide that signals through IL-2RβY. The IL-2RβY signaling polypeptide is in particular an IL-2 polypeptide or an IL-15 polypeptide. In a first aspect, the invention provides an immunoconjugate comprising a mutant IL-2 polypeptide and an antibody that binds to PD-1, wherein the mutant IL-2 polypeptide is a human IL-2 molecule comprising the amino acid substitutions F42A, Y45A and L72G (numbering relative to the human IL-2 sequence SEQ. ID NO: 19).
[024] Em um aspecto adicional, a invenção proporciona um imunoconjugado que compreende um polipeptídeo de IL-2 mutante e um anticorpo que se liga a PD-1, em que o polipeptídeo de IL-2 mutante é uma molécula de IL-2 humana que compreende as substituições dos aminoácidos F42A, Y45A e L72G (numeração em relação à sequência de IL-2 humana SEQ. ID N°: 19); e em que o anticorpo compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma HVR-H1 que compreende a sequência deaminoácidos da SEQ. ID N°: 1, uma HVR-H2 que compreende a sequência deaminoácidos da SEQ. ID N°: 2, uma HVR-H3 que compreende a sequência deaminoácidos da SEQ. ID N°: 3 e uma FR-H3 que compreende a sequência deaminoácidos da SEQ. ID N°: 7 nas posições 71-73 de acordo com a numeração de Kabat, e (b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 5 e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 6, ou em que o anticorpo compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 8, que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 9, e uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 10, e (b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 11, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 12, e uma HVR- L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 13.[024] In a further aspect, the invention provides an immunoconjugate comprising a mutant IL-2 polypeptide and an antibody that binds to PD-1, wherein the mutant IL-2 polypeptide is a human IL-2 molecule comprising the amino acid substitutions F42A, Y45A, and L72G (numbering relative to the human IL-2 sequence SEQ. ID NO:19); and wherein the antibody comprises (a) a heavy chain variable region (VH) comprising an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:2, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:3, and an FR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 7 at positions 71-73 according to Kabat numbering, and (b) a light chain variable region (VL) comprising an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 4, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 5, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 6, or wherein the antibody comprises (a) a heavy chain variable region (VH) comprising an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 8, comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 9, and an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 10, and (b) a light chain variable region (VL) comprising an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 11, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 12, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 13.
[025] Em um outro aspecto, a invenção proporciona um imunoconjugado que compreende um polipeptídeo de IL-2 mutante e um anticorpo que se liga a PD-1, em que o polipeptídeo de IL-2 mutante é uma molécula de IL-2 humana que compreende as substituições dos aminoácidos F42A, Y45A e L72G (numeração em relação à sequência de IL-2 humana SEQ. ID N°: 19); e em que o anticorpo compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência deaminoácidos de SEQ. ID N°: 14 e (b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ. ID N°: 15, SEQ. ID N°: 16, SEQ. ID N°: 17 e SEQ. ID N°: 18.[025] In another aspect, the invention provides an immunoconjugate comprising a mutant IL-2 polypeptide and an antibody that binds to PD-1, wherein the mutant IL-2 polypeptide is a human IL-2 molecule comprising the amino acid substitutions F42A, Y45A, and L72G (numbering relative to the human IL-2 sequence SEQ. ID NO: 19); and wherein the antibody comprises (a) a heavy chain variable region (VH) comprising an amino acid sequence that is at least about 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% identical to the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 14 and (b) a light chain variable region (VL) comprising an amino acid sequence that is at least about 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ. ID NO: 15, SEQ. ID NO: 16, SEQ. ID NO: 17 and SEQ. ID NO: 18.
[026] Em algumas formas de realização do imunoconjugado de acordo com a invenção, o polipeptídeo de IL-2 mutante compreende ainda a substituição de aminoácidos T3A e/ ou a substituição de aminoácidos C125A. Em algumas formas de realização, o polipeptídeo de IL-2 mutante compreende a sequência da SEQ. ID N°: 20. Em algumas formas de realização, oimunoconjugado compreende não mais do que um polipeptídeo de IL-2 mutante. Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade. Em algumas de tais formas de realização, o domínio Fc é uma classe de IgG, em particular uma subclasse de IgG1, domínio Fc, e/ ou o domínio Fc é um domínio Fc humano. Em algumas formas de realização, o anticorpo é uma classe de IgG, em particular uma imunoglobulina de subclasse de IgG1.[026] In some embodiments of the immunoconjugate according to the invention, the mutant IL-2 polypeptide further comprises the T3A amino acid substitution and/or the C125A amino acid substitution. In some embodiments, the mutant IL-2 polypeptide comprises the sequence of SEQ ID NO: 20. In some embodiments, the immunoconjugate comprises no more than one mutant IL-2 polypeptide. In some embodiments, the antibody comprises an Fc domain composed of a first and a second subunit. In some such embodiments, the Fc domain is an IgG class, in particular an IgG1 subclass, Fc domain, and/or the Fc domain is a human Fc domain. In some embodiments, the antibody is an IgG class, in particular an IgG1 subclass immunoglobulin.
[027] Em algumas formas de realização em que o imunoconjugado compreende um domínio Fc, o domínio Fc compreende uma modificação promovendo a associação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc. Em algumas formas de realização, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc, um resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido que possui um volume de cadeia lateral maior, gerando desta forma uma protuberância no domínio CH3 da primeira subunidade que é posicionável em uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade e no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc, um resíduo de aminoácido substituído com um resíduo de aminoácido que possui um volume de cadeia lateral menor, gerando desta forma uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade dentro da qual a protuberância no domínio CH3 da primeira subunidade é posicionável. Em algumas formas de realização, na primeira subunidade do domínio Fc o resíduo de treonina na posição 366 é substituído com um resíduo de triptofano (T366W), e na segunda subunidade do domínio Fc o resíduo de tirosina na posição 407 é substituído com um resíduo de valina (Y407V) e, de forma opcional, o resíduo de treonina na posição 366 é substituído com um resíduo de serina (T366S) e o resíduo de leucina na posição 368 é substituído com um resíduo de alanina (L368A) (numerações de acordo com o Índice EU de Kabat). Em algumas dessas formas de realização, na primeira subunidade do domínio Fc adicionalmente o resíduo de serina na posição 354 é substituído com um resíduo de cisteína (S354C) ou o resíduo de ácido glutâmico na posição 356 é substituído com um resíduo de cisteína (E356C), e na segunda subunidade do domínio Fc adicionalmente o resíduo de tirosina na posição 349 é substituído com um resíduo de cisteína (Y349C) (numerações de acordo com o Índice EU de Kabat). Em algumas formas de realização, o polipeptídeo de IL-2 mutante é fundido no seu aminoácido amino- terminal para o aminoácido carboxi-terminal de uma das subunidades do domínio Fc, em particular a primeira subunidade do domínio Fc, de forma opcional, através de um peptídeo de ligação. Em algumas dessas formas de realização, o peptídeo de ligação tem a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 21.[027] In some embodiments wherein the immunoconjugate comprises an Fc domain, the Fc domain comprises a modification promoting association of the first and second subunits of the Fc domain. In some embodiments, in the CH3 domain of the first subunit of the Fc domain, an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a larger side chain volume, thereby generating a protrusion in the CH3 domain of the first subunit that is positionable in a cavity within the CH3 domain of the second subunit, and in the CH3 domain of the second subunit of the Fc domain, an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a smaller side chain volume, thereby generating a cavity within the CH3 domain of the second subunit within which the protrusion in the CH3 domain of the first subunit is positionable. In some embodiments, in the first subunit of the Fc domain the threonine residue at position 366 is replaced with a tryptophan residue (T366W), and in the second subunit of the Fc domain the tyrosine residue at position 407 is replaced with a valine residue (Y407V) and, optionally, the threonine residue at position 366 is replaced with a serine residue (T366S) and the leucine residue at position 368 is replaced with an alanine residue (L368A) (numberings according to the Kabat EU Index). In some such embodiments, in the first subunit of the Fc domain additionally the serine residue at position 354 is replaced with a cysteine residue (S354C) or the glutamic acid residue at position 356 is replaced with a cysteine residue (E356C), and in the second subunit of the Fc domain additionally the tyrosine residue at position 349 is replaced with a cysteine residue (Y349C) (numbering according to the Kabat EU Index). In some embodiments, the mutant IL-2 polypeptide is fused at its amino-terminal amino acid to the carboxy-terminal amino acid of one of the subunits of the Fc domain, in particular the first subunit of the Fc domain, optionally via a linker peptide. In some such embodiments, the linker peptide has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21.
[028] Em algumas formas de realização em que o imunoconjugado compreende um domínio Fc, o domínio Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor Fc, em particular um receptor Fc, e/ ou função efetora, em particular citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC). Em algumas dessas formas de realização, a referida uma ou mais substituições de aminoácidos está em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo de L234, L235 e P329 (numeração de índice EU de Kabat). Em algumas formas de realização, cada subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A, L235A e P329G (numeração de índice EU de Kabat).[028] In some embodiments wherein the immunoconjugate comprises an Fc domain, the Fc domain comprises one or more amino acid substitutions that reduce binding to an Fc receptor, in particular an Fc receptor, and/or effector function, in particular antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). In some such embodiments, said one or more amino acid substitutions are at one or more positions selected from the group of L234, L235, and P329 (Kabat EU index numbering). In some embodiments, each subunit of the Fc domain comprises the amino acid substitutions L234A, L235A, and P329G (Kabat EU index numbering).
[029] Em algumas formas de realização, o imunoconjugado de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência da SEQ. ID N°: 22, um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência da SEQ. ID N°: 23 ou SEQ. ID N°: 24 e um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % ou 100% idêntica à sequência da SEQ. ID N°: 25. Em algumas formas de realização, o imunoconjugado consiste essencialmente em um polipeptídeo de IL-2 mutante e em uma molécula de imunoglobulina IgG 1, ligadas por uma sequência de ligação.[029] In some embodiments, the immunoconjugate according to the invention comprises a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to the sequence of SEQ. ID NO: 22, a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to the sequence of SEQ. ID NO: 23 or SEQ. ID NO: 24 and a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to the sequence of SEQ ID NO: 25. In some embodiments, the immunoconjugate consists essentially of a mutant IL-2 polypeptide and an IgG 1 immunoglobulin molecule, linked by a linker sequence.
[030] A invenção proporciona ainda um ou mais polinucleotídeos isolados que codificam um imunoconjugado da invenção, um ou mais vetores (em particular vetor de expressão) que compreende os referidos polinucleotídeos e células hospedeiras que compreendem o referido polinucleotídeo (s) ou o (s) referido (s) vetor (es).[030] The invention further provides one or more isolated polynucleotides encoding an immunoconjugate of the invention, one or more vectors (in particular expression vector) comprising said polynucleotides and host cells comprising said polynucleotide(s) or said vector(s).
[031] Além disso é fornecido um método para a produção de um imunoconjugado que compreende um polipeptídeo de IL-2 mutante e um anticorpo que se liga a PD-1, que compreende (a) cultura da célula hospedeira da invenção sob condições adequadas para a expressão do imunoconjugado, e, de forma opcional, (b) recuperar o imunoconjugado. Também proporcionado pela invenção um imunoconjugado que compreende um polipeptídeo de IL-2 mutante e um anticorpo que se liga a PD-1, produzido pelo referido método.[031] Further provided is a method for producing an immunoconjugate comprising a mutant IL-2 polypeptide and an antibody that binds to PD-1, comprising (a) culturing the host cell of the invention under conditions suitable for expression of the immunoconjugate, and optionally (b) recovering the immunoconjugate. Also provided by the invention is an immunoconjugate comprising a mutant IL-2 polypeptide and an antibody that binds to PD-1, produced by said method.
[032] A invenção proporciona ainda uma composição farmacêutica que compreende um imunoconjugado da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável e métodos de uso de um imunoconjugado da invenção.[032] The invention further provides a pharmaceutical composition comprising an immunoconjugate of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier and methods of using an immunoconjugate of the invention.
[033] Em particular, a invenção abrange um imunoconjugado de acordo com a invenção para uso como um medicamento, e para uso no tratamento de uma doença. Em uma forma de realização particular, a referida doença é câncer.[033] In particular, the invention encompasses an immunoconjugate according to the invention for use as a medicament, and for use in the treatment of a disease. In a particular embodiment, said disease is cancer.
[034] Também e compreendido pela invenção o uso de um imunoconjugado de acordo com a invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença. Em uma forma de realização particular, a referida doença é câncer.[034] The invention also encompasses the use of an immunoconjugate according to the invention in the manufacture of a medicament for the treatment of a disease. In a particular embodiment, said disease is cancer.
[035] É ainda proporcionado um método de tratamento de doença em um indivíduo, que compreende administrar ao referido indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende um imunoconjugado de acordo com a invenção em uma forma farmaceuticamente aceitável. Em uma forma de realização particular, a referida doença é câncer.[035] Further provided is a method of treating disease in a subject, comprising administering to said subject a therapeutically effective amount of a composition comprising an immunoconjugate according to the invention in a pharmaceutically acceptable form. In a particular embodiment, said disease is cancer.
[036] Também é proporcionado um método para estimular o sistema imune de um indivíduo, que compreende administrar ao referido indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um imunoconjugado de acordo com a invenção em uma forma farmaceuticamente aceitável.[036] Also provided is a method for stimulating the immune system of a subject, comprising administering to said subject an effective amount of a composition comprising an immunoconjugate according to the invention in a pharmaceutically acceptable form.
[037] Os termos são aqui utilizados como, de forma geral, usados no estado da técnica, a menos que definido de outra forma a seguir.[037] The terms are used herein as they are generally used in the prior art, unless otherwise defined below.
[038] O termo “interleucina-2” ou “IL-2” como usado aqui, refere- se a qualquer IL-2 nativa de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e camundongos), a menos que de outra forma indicado. O termo engloba IL-2 não processada, bem como qualquer forma de IL-2 que resulta do processamento na célula. O termo também abrange variantes de ocorrência natural de IL-2, por exemplo, variantes de splicing ou variantes alélicas. A sequência de aminoácidos de uma IL-2 humana de exemplo é mostrada na SEQ. ID N°: 19. A IL-2 humana não processada compreende adicionalmente um peptídeo sinal de 20 aminoácidos terminal N tendo a sequência da SEQ. ID N°: 26, a qual está ausente na molécula de IL-2 madura.[038] The term “interleukin-2” or “IL-2” as used herein, refers to any native IL-2 from any vertebrate source, including mammals such as primates (e.g., humans) and rodents (e.g., mice and rats), unless otherwise indicated. The term encompasses unprocessed IL-2 as well as any form of IL-2 that results from processing in the cell. The term also encompasses naturally occurring variants of IL-2, e.g., splice variants or allelic variants. The amino acid sequence of an exemplary human IL-2 is shown in SEQ. ID NO:19. Unprocessed human IL-2 further comprises an N-terminal 20 amino acid signal peptide having the sequence of SEQ. ID NO:26, which is absent in the mature IL-2 molecule.
[039] O termo “IL-2 mutante” ou “polipeptídeo de IL-2 mutante” como aqui utilizado pretende abranger quaisquer formas mutantes de várias formas da molécula de IL-2 incluindo IL-2 inteira, formas truncadas de IL-2 e formas em que a IL-2 está ligada a outra molécula, como por fusão ou conjugação química. “Comprimento total” quando usado em referência a IL-2 pretende significar a molécula de IL-2 de comprimento natural madura. Por exemplo, a IL-2 humana inteira refere-se a uma molécula que tem 133 aminoácidos (ver, por exemplo, a SEQ. ID N°: 19). As várias formas de IL-2 mutantes são caracterizadas por terem pelo menos uma mutação de aminoácidos que afetam a interação de IL-2 com CD25. Esta mutação pode envolver substituição, eliminação, truncagem ou modificação do resíduo de aminoácido do tipo selvagem normalmente localizado nessa posição. Os mutantes obtidos por substituição de aminoácidos são preferidos. A menos que indicado de outro modo, um IL-2 mutante pode ser aqui referido como um peptídeo de sequência de IL-2 mutante, um polipeptídeo de IL-2 mutante, uma proteína de IL-2 mutante ou um análogo de IL-2 mutante.[039] The term “mutant IL-2” or “mutant IL-2 polypeptide” as used herein is intended to encompass any mutant forms of various forms of the IL-2 molecule including full-length IL-2, truncated forms of IL-2, and forms in which IL-2 is linked to another molecule, such as by chemical fusion or conjugation. “Full-length” when used in reference to IL-2 is intended to mean the mature, full-length IL-2 molecule. For example, full-length human IL-2 refers to a molecule that is 133 amino acids long (see, e.g., SEQ. ID NO: 19). The various mutant IL-2 forms are characterized by having at least one amino acid mutation that affects the interaction of IL-2 with CD25. This mutation may involve substitution, deletion, truncation, or modification of the wild-type amino acid residue normally located at that position. Mutants obtained by amino acid substitution are preferred. Unless otherwise indicated, a mutant IL-2 may be referred to herein as a mutant IL-2 sequence peptide, a mutant IL-2 polypeptide, a mutant IL-2 protein, or a mutant IL-2 analog.
[040] A designação de várias formas de IL-2 é aqui feita em relação à sequência apresentada na SEQ. ID N°: 19. Várias designações podem ser usadas aqui para indicar a mesma mutação. Por exemplo, uma mutação de fenilalanina na posição 42 para alanina pode ser indicado como 42A, A42, A 42, F42A, ou Phe42Ala.[040] The designation of various forms of IL-2 is made herein relative to the sequence shown in SEQ ID NO: 19. Various designations may be used herein to indicate the same mutation. For example, a mutation of phenylalanine at position 42 to alanine may be indicated as 42A, A42, A 42, F42A, or Phe42Ala.
[041] Por uma “molécula de IL-2 humana” como aqui utilizada entende-se uma molécula de IL-2 que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 96% idêntica à sequência da IL-2 humana da SEQ. ID N°: 19. Em particular, a identidade da sequência é pelo menos cerca de 95%, mais em particular pelo menos cerca de 96%. Em formas de realização particulares, a molécula de IL-2 humana é uma molécula de IL-2 de comprimento total.[041] By a “human IL-2 molecule” as used herein is meant an IL-2 molecule comprising an amino acid sequence that is at least about 90%, at least about 91%, at least about 92%, at least about 94%, at least about 95% or at least about 96% identical to the sequence of the human IL-2 of SEQ ID NO: 19. In particular, the sequence identity is at least about 95%, more in particular at least about 96%. In particular embodiments, the human IL-2 molecule is a full-length IL-2 molecule.
[042] O termo “mutação de aminoácidos” como aqui utilizado pretende abranger substituições, deleções, inserções e modificações de aminoácidos. Qualquer combinação de substituição, deleção, inserção e modificação pode ser feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas, por exemplo, ligação reduzida a CD25. As deleções e inserções da sequência de aminoácidos incluem deleções e inserções de aminoácidos no terminal amino e/ ou carboxila. Um exemplo de uma deleção terminal é a deleção do resíduo de alanina na posição 1 da IL-2 humana de comprimento total. Mutações de aminoácidos preferidas são substituições de aminoácidos. Com a finalidade de alterar por exemplo as características de ligação de um polipeptídeo de IL-2, substituições de aminoácidos não conservativas, isto é, substituindo um aminoácido por outro aminoácido com propriedades estruturais e/ ou químicas diferentes, são em particular preferidas. Substituições de aminoácidos preferidas incluem a substituição de um aminoácido hidrofóbico por um hidrofílico. As substituições de aminoácidos incluem a substituição por aminoácidos de ocorrência não natural ou por derivados de aminoácidos de ocorrência natural dos vinte aminoácidos padrão (por exemplo, 4-hidroxiprolina, 3-metil-histidina, ornitina, homosserina, 5-hidroxilisina). Mutações de aminoácidos podem ser geradas usando métodos genéticos ou químicos bem conhecidos na técnica. Os métodos genéticos podem incluir mutagênese dirigida, PCR, síntese genética e semelhantes. Está contemplado que métodos de alteração do grupo da cadeia lateral de um aminoácido por métodos diferentes da engenharia genética, tal como modificação química, também podem ser úteis.[042] The term “amino acid mutation” as used herein is intended to encompass amino acid substitutions, deletions, insertions and modifications. Any combination of substitution, deletion, insertion and modification may be made to arrive at the final construct, provided that the final construct possesses the desired characteristics, e.g., reduced binding to CD25. Amino acid sequence deletions and insertions include amino acid deletions and insertions at the amino and/or carboxyl terminus. An example of a terminal deletion is the deletion of the alanine residue at position 1 of full-length human IL-2. Preferred amino acid mutations are amino acid substitutions. For the purpose of altering, for example, the binding characteristics of an IL-2 polypeptide, non-conservative amino acid substitutions, i.e., replacing one amino acid with another amino acid with different structural and/or chemical properties, are particularly preferred. Preferred amino acid substitutions include the replacement of a hydrophobic amino acid with a hydrophilic one. Amino acid substitutions include the replacement with non-naturally occurring amino acids or with naturally occurring amino acid derivatives of the twenty standard amino acids (e.g., 4-hydroxyproline, 3-methylhistidine, ornithine, homoserine, 5-hydroxylysine). Amino acid mutations can be generated using genetic or chemical methods well known in the art. Genetic methods can include site-directed mutagenesis, PCR, gene synthesis, and the like. It is contemplated that methods of altering the side chain group of an amino acid by methods other than genetic engineering, such as chemical modification, may also be useful.
[043] Como aqui utilizado, uma forma do tipo selvagem de IL-2 é uma forma de IL-2 que é a mesma que o polipeptídeo IL-2 mutante, exceto que a forma selvagem possui um aminoácido do tipo selvagem em cada posição de aminoácido o polipeptídeo IL-2 mutante. Por exemplo, se o IL-2 mutante for o IL- 2 completo (isto é, IL-2 não fundida ou conjugada com qualquer outra molécula), a forma selvagem deste mutante é a IL-2 nativa de tamanho completo. Se o IL- 2 mutante for uma fusão entre IL-2 e outro polipeptídeo codificado a jusante de IL-2 (por exemplo, uma cadeia de anticorpo), a forma do tipo selvagem deste mutante de IL-2 é IL-2 com uma sequência de aminoácidos do tipo selvagem, fundida ao mesmo polipeptídeo a jusante. Além disso, se o IL-2 mutante é uma forma truncada de IL-2 (a sequência mutada ou modificada dentro da porção não-truncada de IL-2) então a forma de tipo selvagem deste IL-2 mutante é uma IL-2 similarmente truncada que tem uma sequência de tipo selvagem. Com o objetivo de comparar a afinidade de ligação ao receptor de IL-2 ou a atividade biológica de várias formas de IL-2 mutantes à correspondente forma de IL-2 de tipo selvagem, o termo tipo selvagem abrange formas de IL-2 que compreende um ou mais mutação de aminoácidos que não afeta a ligação ao receptor de IL- 2 em comparação com a IL-2 nativa de ocorrência natural, tal como por exemplo uma substituição de cisteína em uma posição correspondente ao resíduo 125 de IL-2 humana para alanina. Em algumas formas de realização, a IL-2 de tipo selvagem para o propósito da presente invenção compreende a substituição de aminoácidos C125A (ver SEQ. ID N°: 29). Em certas formas de realização de acordo com a invenção, o polipeptídeo de IL-2 de tipo selvagem ao qual o polipeptídeo de IL-2 mutante é comparado, compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 9. Em outras formas de realização, o polipeptídeo de IL-2 de tipo selvagem ao qual o polipeptídeo de IL-2 mutante é comparado, compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 29.[043] As used herein, a wild-type form of IL-2 is a form of IL-2 that is the same as the mutant IL-2 polypeptide, except that the wild-type form has a wild-type amino acid at each amino acid position in the mutant IL-2 polypeptide. For example, if the mutant IL-2 is full-length IL-2 (i.e., IL-2 not fused or conjugated to any other molecule), the wild-type form of this mutant is full-length native IL-2. If the mutant IL-2 is a fusion between IL-2 and another polypeptide encoded downstream of IL-2 (e.g., an antibody chain), the wild-type form of this IL-2 mutant is IL-2 with a wild-type amino acid sequence fused to the same downstream polypeptide. Furthermore, if the mutant IL-2 is a truncated form of IL-2 (the mutated or modified sequence within the non-truncated portion of IL-2) then the wild-type form of this mutant IL-2 is a similarly truncated IL-2 that has a wild-type sequence. For the purpose of comparing the IL-2 receptor binding affinity or biological activity of various mutant IL-2 forms to the corresponding wild-type IL-2 form, the term wild-type encompasses forms of IL-2 that comprise one or more amino acid mutations that do not affect IL-2 receptor binding compared to naturally occurring native IL-2, such as for example a cysteine substitution at a position corresponding to residue 125 of human IL-2 to alanine. In some embodiments, wild-type IL-2 for the purpose of the present invention comprises the amino acid substitution C125A (see SEQ. ID NO: 29). In certain embodiments according to the invention, the wild-type IL-2 polypeptide to which the mutant IL-2 polypeptide is compared comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:9. In other embodiments, the wild-type IL-2 polypeptide to which the mutant IL-2 polypeptide is compared comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:29.
[044] O termo “CD25” ou “subunidade α do receptor de IL-2 “como usado aqui, refere-se a qualquer CD25 nativo de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e camundongos), exceto quando indicado. O termo engloba o CD25 “completo”, não processado, bem como qualquer forma de CD25 resultante do processamento na célula. O termo também abrange variantes de ocorrência natural de CD25, por exemplo, variantes de emenda ou variantes alélicas. Em certas formas de realização, CD25 é CD25 humano. A sequência de aminoácidos do CD25 humano encontra-se, por exemplo, na entrada UniProt N° P01589 (versão 185).[044] The term “CD25” or “IL-2 receptor α subunit” as used herein, refers to any native CD25 from any vertebrate source, including mammals such as primates (e.g., humans) and rodents (e.g., mice and rats), except where indicated. The term encompasses “full-length,” unprocessed CD25 as well as any form of CD25 resulting from processing in the cell. The term also encompasses naturally occurring variants of CD25, e.g., splice variants or allelic variants. In certain embodiments, CD25 is human CD25. The amino acid sequence of human CD25 is found, for example, in UniProt entry No. P01589 (version 185).
[045] O termo “de alta afinidade do receptor de IL-2”, tal como aqui utilizado refere-se à forma heterotrimérica do receptor de IL-2, que consiste no receptor de Y-subunidade (também conhecida como receptor de citocina comum Y-subunidade, Y c, ou CD1 32, ver o n° de entrada UniProt P14784 (versão 192)), a subunidade β do receptor (também conhecida como CD122 ou p70, ver n° de entrada UniProt P31785 (versão 197)) e a subunidade α do receptor (também conhecida como CD25 ou p55, consulte o número de entrada UniProt P01589 (versão 185)). O termo “receptor de IL-2 de afinidade intermediária”, por contraste, refere-se ao receptor de IL-2 incluindo apenas a subunidade Y e a subunidade β, sem a subunidade α (para uma revisão ver, por exemplo, Olejniczak e Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-189 (2008)).[045] The term “high-affinity IL-2 receptor” as used herein refers to the heterotrimeric form of the IL-2 receptor, which consists of the receptor Y-subunit (also known as common cytokine receptor Y-subunit, Yc, or CD132, see UniProt accession no. P14784 (version 192)), the receptor β-subunit (also known as CD122 or p70, see UniProt accession no. P31785 (version 197)), and the receptor α-subunit (also known as CD25 or p55, see UniProt accession no. P01589 (version 185)). The term “intermediate-affinity IL-2 receptor,” by contrast, refers to the IL-2 receptor including only the Y subunit and the β subunit, without the α subunit (for a review see, e.g., Olejniczak and Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179–189 (2008)).
[046] “Afinidade” refere-se à força da soma total de interações não covalentes entre um único local de ligação de uma molécula (por exemplo, um receptor) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um ligante). Salvo indicação em contrário, como aqui utilizado, “afinidade de ligação” refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1: 1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, uma porção de ligação ao antígeno e um antígeno ou um receptor e seu ligando). A afinidade de uma molécula de X para o seu parceiro Y pode, de forma geral, ser representada pela constante de dissociação (K D), que é a relação de dissociação e as constantes de taxa de associação (k desligado e k ligado, respectivamente). Assim, afinidades equivalentes podem compreender constantes de velocidade diferentes, desde que a razão das constantes de velocidade permaneça a mesma. A afinidade pode ser medida por métodos bem estabelecidos conhecidos na técnica, incluindo aqueles aqui descritos. Um método particular para medir a afinidade é a Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR).[046] “Affinity” refers to the strength of the sum total of non-covalent interactions between a single binding site of a molecule (e.g., a receptor) and its binding partner (e.g., a ligand). Unless otherwise indicated, as used herein, “binding affinity” refers to the intrinsic binding affinity that reflects a 1:1 interaction between members of a binding pair (e.g., an antigen-binding moiety and an antigen or a receptor and its ligand). The affinity of a molecule X for its partner Y can generally be represented by the dissociation constant (KD), which is the ratio of the dissociation and association rate constants (koff and kon, respectively). Thus, equivalent affinities can comprise different rate constants, as long as the ratio of the rate constants remains the same. Affinity can be measured by well-established methods known in the art, including those described herein. One particular method for measuring affinity is Surface Plasmon Resonance (SPR).
[047] A afinidade do mutante ou de polipeptídeo IL-2 de tipo selvagem para diversas formas de receptor de IL-2 pode ser determinada de acordo com o método apresentado no documento WO 2012/107417 por ressonância de plasmon de superfície (SPR), utilizando instrumentação padrão, tais como um instrumento BIAcore (GE Healthcare) e subunidades de receptor, tais como podem ser obtidas por expressão recombinante (ver, por exemplo, Shanafelt et al., Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000)). De forma alternativa, a afinidade de ligação de IL-2 mutantes para diferentes formas do receptor de IL-2 pode ser avaliada utilizando linhas de células conhecidas por expressarem uma ou outra dessas formas do receptor. Formas de realização ilustrativas e de exemplo específicas para medir a afinidade de ligação são descritas a seguir.[047] The affinity of mutant or wild-type IL-2 polypeptide for various forms of the IL-2 receptor can be determined according to the method set forth in WO 2012/107417 by surface plasmon resonance (SPR) using standard instrumentation such as a BIAcore instrument (GE Healthcare) and receptor subunits as may be obtained by recombinant expression (see, for example, Shanafelt et al., Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000)). Alternatively, the binding affinity of mutant IL-2 for different forms of the IL-2 receptor can be assessed using cell lines known to express one or another of these forms of the receptor. Specific illustrative and exemplary embodiments for measuring binding affinity are described below.
[048] Por “célula T reguladora” ou “célula Treg” entende-se um tipo especializado de célula T CD4+ que pode suprimir as respostas de outras células T. As células Treg são caracterizadas pela expressão da subunidade α do receptor de IL-2 (CD25) e da caixa de garfo do fator de transcrição P3 (FOXP3) (Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004)) e papel crítico na indução e manutenção da auto tolerância periférica a antígenos, incluindo aqueles expressos por tumores. As células Treg requerem IL-2 para sua função e desenvolvimento e indução de suas características supressivas.[048] By “regulatory T cell” or “Treg cell” is meant a specialized type of CD4+ T cell that can suppress the responses of other T cells. Treg cells are characterized by the expression of the IL-2 receptor α subunit (CD25) and the transcription factor forkhead box P3 (FOXP3) (Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004)) and critical role in the induction and maintenance of peripheral self-tolerance to antigens, including those expressed by tumors. Treg cells require IL-2 for their function and development and induction of their suppressive characteristics.
[049] Como usado aqui, o termo “células efetoras” refere-se a uma população de linfócitos que medeiam os efeitos citotóxicos da IL-2. Células efetoras incluem células T efetoras, tais como células T citotóxicas CD8+, células NK, células killers ativadas por linfocinas (LAK) e macrófagos/ monócitos.[049] As used herein, the term “effector cells” refers to a population of lymphocytes that mediate the cytotoxic effects of IL-2. Effector cells include effector T cells, such as CD8+ cytotoxic T cells, NK cells, lymphokine-activated killer (LAK) cells, and macrophages/monocytes.
[050] Como usado aqui, o termo “PD1”, “PD1 humano”, “PD-1” ou “PD-1 humano” (também conhecido como proteína de morte celular programada 1, ou morte programada 1) refere-se à proteína humano PD1 (SEQ. ID N° 27, proteína sem sequência sinal)/ (SEQ. ID N° 28, proteína com sequência sinal). Veja também a entrada UniProt N° Q15116 (versão 156). Como usado aqui, um anticorpo “ligando-se a PD-1”, “de forma específica ligando-se a PD-1”, “que se liga a PD-1” ou “anticorpo anti-PD-1” refere-se a um anticorpo que é capaz de ligar PD-1, especialmente um polipeptídeo PD-1 expresso em uma superfície celular, com afinidade suficiente para que o anticorpo seja útil como um agente de diagnóstico e/ ou terapêutico no direcionamento para PD-1. Em uma forma de realização, a extensão de ligação de um anti- anticorpo PD-1 para uma proteína não relacionada, não-PD-1 é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo à PD-1, como medido, por rádio imuno ensaio (RIA) ou citometria de fluxo (FACS) ou por uma superfície. Ensaio de Ressonância Plasmônica usando um sistema biossensor como o sistema Biacore®. Em certas formas de realização, um anticorpo que se liga a PD-1 tem um valor de KD da afinidade de ligação para ligação com PD-1 humano de < 1 μM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0.1 nM, < 0.01 nM, ou < 0.001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos, por exemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M). Em uma forma de realização, o valor de KD da afinidade de ligação determinado em um ensaio de Ressonância de Plasmon de Superfície utilizando o domínio extracelular (ECD) da PD-1 humano (PD-1-ECD, ver SEQ. ID N°: 43) como antígeno.[050] As used herein, the term “PD1”, “human PD1”, “PD-1” or “human PD-1” (also known as programmed cell death protein 1, or programmed death 1) refers to the human PD1 protein (SEQ. ID NO: 27, protein without signal sequence)/(SEQ. ID NO: 28, protein with signal sequence). See also UniProt Entry No. Q15116 (version 156). As used herein, an antibody “binding to PD-1”, “specifically binding to PD-1”, “that binds to PD-1” or “anti-PD-1 antibody” refers to an antibody that is capable of binding PD-1, especially a PD-1 polypeptide expressed on a cell surface, with sufficient affinity for the antibody to be useful as a diagnostic and/or therapeutic agent in targeting PD-1. In one embodiment, the extent of binding of an anti-PD-1 antibody to an unrelated, non-PD-1 protein is less than about 10% of the binding of the antibody to PD-1, as measured by radioimmunoassay (RIA) or flow cytometry (FACS) or by a surface plasmon resonance assay using a biosensor system such as the Biacore® system. In certain embodiments, an antibody that binds to PD-1 has a binding affinity KD value for binding to human PD-1 of <1 μM, <100 nM, <10 nM, <1 nM, <0.1 nM, <0.01 nM, or <0.001 nM (e.g., 10-8 M or less, e.g., from 10-8 M to 10-13 M, e.g., from 10-9 M to 10-13 M). In one embodiment, the binding affinity KD value is determined in a Surface Plasmon Resonance assay using the extracellular domain (ECD) of human PD-1 (PD-1-ECD, see SEQ. ID NO: 43) as the antigen.
[051] Por “ligação específica” entende-se que a ligação seletiva para o antígeno e pode ser discriminada de interações indesejadas ou não específicas. A capacidade de um anticorpo se ligar a um antígeno específico (por exemplo, PD-1) pode ser medida através de um ensaio imuno absorvente ligado a enzima (ELISA) ou outras técnicas familiares de um técnico no assunto, por exemplo, técnica ressonância plasmônica de superfície (SPR) (analisada por exemplo em um instrumento BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)) e ensaios de ligação tradicionais (Heeley, Endocr Res. 28, 217-229 (2002)). Em uma forma de realização, a extensão da ligação de um anticorpo a uma proteína não relacionada é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo ao antígeno medida, por exemplo, por SPR. O anticorpo compreendido no imunoconjugado aqui descrito liga-se de forma específica a PD-1.[051] By “specific binding” is meant binding that is selective for the antigen and can be discriminated from unwanted or non-specific interactions. The ability of an antibody to bind to a specific antigen (e.g., PD-1) can be measured by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or other techniques familiar to one skilled in the art, e.g., surface plasmon resonance (SPR) technique (analyzed e.g. on a BIAcore instrument) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)) and traditional binding assays (Heeley, Endocr Res. 28, 217-229 (2002)). In one embodiment, the extent of binding of an antibody to an unrelated protein is less than about 10% of the binding of the antibody to the antigen as measured, e.g., by SPR. The antibody comprised in the immunoconjugate described herein specifically binds to PD-1.
[052] Como aqui utilizado, o termo “polipeptídeo” refere-se a uma molécula composta por monômeros (aminoácidos) linearmente ligados por ligações amida (também conhecidas como ligações peptídicas). O termo “polipeptídeo” refere-se a qualquer cadeia de dois ou mais aminoácidos e não se refere a um comprimento específico do produto. Assim, os peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, “proteína”, “cadeia de aminoácidos”, ou qualquer outro termo utilizado para se referir a uma cadeia de dois ou mais aminoácidos, estão incluídas dentro da definição de “polipeptídeo”, e o termo “polipeptídeo” pode ser usado em vez de, ou de forma intermutável com qualquer um destes termos. O termo “polipeptídeo” também se destina a referir os produtos de modificações pós-expressão do polipeptídeo, incluindo sem limitação a glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos protetores/ bloqueadores conhecidos, clivagem proteolítica ou modificação por aminoácidos não-naturalmente ocorrentes. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou produzido por tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzido a partir de uma sequência de ácido nucleico designada. Pode ser gerado de qualquer maneira, inclusive por síntese química. Os polipeptídeos podem ter uma estrutura tridimensional definida, embora não tenham necessariamente essa estrutura. Os polipeptídeos com uma estrutura tridimensional definida são referidos como dobrados e polipeptídeos que não possuem uma estrutura tridimensional definida, mas podem adoptar um grande número de diferentes conformações e são referidos como desdobrados.[052] As used herein, the term “polypeptide” refers to a molecule composed of monomers (amino acids) linearly linked by amide bonds (also known as peptide bonds). The term “polypeptide” refers to any chain of two or more amino acids and does not refer to a specific length of the product. Thus, peptides, dipeptides, tripeptides, oligopeptides, “protein,” “amino acid chain,” or any other term used to refer to a chain of two or more amino acids, are included within the definition of “polypeptide,” and the term “polypeptide” may be used instead of, or interchangeably with, any of these terms. The term “polypeptide” is also intended to refer to the products of post-expression modifications of the polypeptide, including without limitation glycosylation, acetylation, phosphorylation, amidation, derivatization by known protecting/blocking groups, proteolytic cleavage, or modification by non-naturally occurring amino acids. A polypeptide may be derived from a natural biological source or produced by recombinant technology, but is not necessarily translated from a designated nucleic acid sequence. It may be generated in any manner, including by chemical synthesis. Polypeptides may have a defined three-dimensional structure, although they do not necessarily have such a structure. Polypeptides with a defined three-dimensional structure are referred to as folded, and polypeptides that do not have a defined three-dimensional structure but can adopt a large number of different conformations are referred to as unfolded.
[053] Por um polipeptídeo “isolado” ou uma variante, ou um derivado do mesmo, entende-se um polipeptídeo que não está no seu meio natural. Nenhum nível particular de purificação é necessário. Por exemplo, um polipeptídeo isolado pode ser removido do seu ambiente nativo ou natural. Os polipeptídeos e proteínas produzidos de forma recombinante expressos em células hospedeiras são considerados isolados para o objetivo da invenção, assim como polipeptídeos nativos ou recombinantes que foram separados, fracionados ou parcialmente ou substancialmente purificados por qualquer técnica adequada.[053] By an “isolated” polypeptide or a variant or derivative thereof is meant a polypeptide that is not in its natural environment. No particular level of purification is required. For example, an isolated polypeptide may be removed from its native or natural environment. Recombinantly produced polypeptides and proteins expressed in host cells are considered isolated for the purpose of the invention, as are native or recombinant polypeptides that have been separated, fractionated or partially or substantially purified by any suitable technique.
[054] “Porcentagem (%) da identidade da sequência de aminoácidos” em relação a uma sequência polipeptídica de referência é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica de referência, após o alinhamento das sequências lacunas, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade da sequência de alinhamento para fins de determinação da porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser alcançado de várias maneiras que estão na especialidade na técnica, por exemplo, utilizando software de computador publicamente disponível, como o software BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign (DNASTAR) ou o pacote de programas FASTA. Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para alinhar sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar alinhamento máximo ao longo de toda a extensão das sequências que estão sendo comparadas. Para os propósitos aqui descritos, no entanto, os valores de% de identidade de sequência de aminoácidos são gerados usando o programa ggsearch do pacote FASTA versão 36.3.8c ou posterior com uma matriz de comparação BLOSUM50. O pacote do programa FASTA foi escrito por WR Pearson e DJ Lipman (1988), “Ferramentas Melhoradas para Análise de Sequências Biológicas”, pNAS 85: 2444-2448; WR Pearson (1996) “Comparação de sequência de proteína efetiva” Meth. Enzymol. 266: 227-258; e Pearson et. al. (1997) Genomics 46: 24-36, e está publicamente disponível emhttp://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml. De formaalternativa, um servidor público acessível emhttp://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi pode ser usado para comparar as sequências, usando o programa ggsearch (proteína global: proteína) e opções padrão (BLOSUM50; aberto: -10; ext: -2; Ktup = 2) para garantir que um alinhamento global, e não local, seja realizado. A porcentagem de identidade de aminoácidos é dada no cabeçalho de alinhamento de saída.[054] “Percent (%) amino acid sequence identity” to a reference polypeptide sequence is defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical to amino acid residues in the reference polypeptide sequence, after alignment of gapped sequences, if necessary, to achieve maximum percentage sequence identity, and not considering any conservative substitutions as part of the alignment. Sequence identity for purposes of determining percentage amino acid sequence identity can be achieved in a variety of ways that are within the skill in the art, for example, using publicly available computer software such as BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign (DNASTAR) software, or the FASTA program package. Those skilled in the art can determine appropriate parameters for aligning sequences, including any algorithms needed to achieve maximum alignment over the full length of the sequences being compared. For the purposes described here, however, % amino acid sequence identity values are generated using the ggsearch program from the FASTA package version 36.3.8c or later with a BLOSUM50 comparison matrix. The FASTA program package was written by W.R. Pearson and D.J. Lipman (1988), “Improved Tools for Biological Sequence Analysis,” pNAS 85:2444–2448; W.R. Pearson (1996) “Effective Protein Sequence Comparison.” Meth. Enzymol. 266:227–258; and Pearson et. al. (1997) Genomics 46:24–36, and is publicly available at http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml. Alternatively, a public server accessible at http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi can be used to compare sequences, using the ggsearch program (global protein:protein) and default options (BLOSUM50; open: -10; ext: -2; Ktup=2) to ensure that a global, rather than local, alignment is performed. The percentage of amino acid identity is given in the output alignment header.
[055] O termo “polinucleotídeo” refere-se a uma molécula ou construção de ácido nucleico isolada, por exemplo, RNA mensageiro (mRNA), RNA derivado de vírus ou DNA plasmídico (pDNA). Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação fosfodiéster convencional ou uma ligação não convencional (por exemplo uma ligação amida, tal como encontrada em ácidos nucleicos peptídicos (PNA). O termo “molécula de ácido nucleico” refere-se a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, DNA ou fragmentos de RNA, presentes em um polinucleotídeo.[055] The term “polynucleotide” refers to an isolated nucleic acid molecule or construct, e.g., messenger RNA (mRNA), virally derived RNA, or plasmid DNA (pDNA). A polynucleotide may comprise a conventional phosphodiester bond or an unconventional bond (e.g., an amide bond, as found in peptide nucleic acids (PNAs). The term “nucleic acid molecule” refers to any one or more nucleic acid segments, e.g., DNA or RNA fragments, present in a polynucleotide.
[056] Por molécula de ácido nucleico “isolado” ou polinucleotídeo entende-se uma molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA, que foi removida do seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo contido em um vetor é considerado isolado para os fins da presente invenção. Outros exemplos de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotídeos purificados (parcialmente ou substancialmente) em solução. Um polinucleotídeo isolado inclui uma molécula de polinucleotídeo contida em células que normalmente contém a molécula de polinucleotídeo, mas a molécula de polinucleotídeo está presente extracromossomáticamente ou em uma localização cromossômica que diferente da sua localização cromossômica natural. As moléculas de RNA isoladas incluem transcritos de RNA in vivo ou in vitro da presente invenção, assim como formas de cadeia positiva e negativa, e formas de cadeia dupla. Polinucleotídeos isolados ou ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção incluem ainda tais moléculas produzidas sinteticamente. Além disso, um polinucleotídeo ou um ácido nucleico pode ser ou pode incluir um elemento regulador, tal como um promotor, local de ligação ao ribossomo ou um terminador de transcrição.[056] By “isolated” nucleic acid molecule or polynucleotide is meant a nucleic acid molecule, DNA or RNA, that has been removed from its native environment. For example, a recombinant polynucleotide encoding a polypeptide contained in a vector is considered isolated for the purposes of the present invention. Other examples of an isolated polynucleotide include recombinant polynucleotides maintained in heterologous host cells or polynucleotides purified (partially or substantially) in solution. An isolated polynucleotide includes a polynucleotide molecule contained in cells that normally contain the polynucleotide molecule, but the polynucleotide molecule is present extrachromosomally or in a chromosomal location that differs from its natural chromosomal location. Isolated RNA molecules include in vivo or in vitro RNA transcripts of the present invention, as well as positive- and negative-stranded forms, and double-stranded forms. Isolated polynucleotides or nucleic acids according to the present invention further include such synthetically produced molecules. In addition, a polynucleotide or nucleic acid may be or may include a regulatory element, such as a promoter, ribosome binding site, or transcription terminator.
[057] “Polinucleotídeo isolado (ou ácido nucleico) que codifica [por exemplo, um imunoconjugado da invenção]” refere-se a uma ou mais moléculas de polinucleotídeos que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo e/ ou polipeptídeos IL-2 (ou fragmentos dos mesmos), incluindo essas moléculas de polinucleotídeos) em um vetor simples ou vetores separados, e tal (is) molécula (s) de ácido nucleico presente (s) em uma ou mais localizações em uma célula hospedeira.[057] “Isolated polynucleotide (or nucleic acid) encoding [e.g., an immunoconjugate of the invention]” refers to one or more polynucleotide molecules encoding the heavy and light chains of the antibody and/or IL-2 polypeptides (or fragments thereof), including such polynucleotide molecules) in a single vector or separate vectors, and such nucleic acid molecule(s) present in one or more locations in a host cell.
[058] O termo “cassete de expressão” refere-se a um polinucleotídeo gerado de forma recombinante ou sintética, com uma série de elementos de ácido nucleico especificados que permitem a transcrição de um ácido nucleico particular em uma célula alvo. O cassete de expressão recombinante pode ser incorporado em um plasmídeo, cromossomo, DNA mitocondrial, DNA plastidial, vírus ou fragmento de ácido nucleico. Tipicamente, a porção do cassete de expressão recombinante de um vetor de expressão inclui, entre outras sequências, uma sequência de ácido nucleico a transcrever e um promotor. Em certas formas de realização, o cassete de expressão compreende sequências polinucleotídicas que codificam imunoconjugados da invenção ou fragmentos dos mesmos.[058] The term “expression cassette” refers to a recombinantly or synthetically generated polynucleotide having a series of specified nucleic acid elements that allow for the transcription of a particular nucleic acid in a target cell. The recombinant expression cassette may be incorporated into a plasmid, chromosome, mitochondrial DNA, plastid DNA, virus, or nucleic acid fragment. Typically, the recombinant expression cassette portion of an expression vector includes, among other sequences, a nucleic acid sequence to be transcribed and a promoter. In certain embodiments, the expression cassette comprises polynucleotide sequences encoding immunoconjugates of the invention or fragments thereof.
[059] O termo “vetor” ou “vetor de expressão” refere-se a uma molécula de DNA que é usada para introduzir e dirigir a expressão de um gene específico ao qual está operativamente associado em uma célula. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico auto replicante, bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual foi introduzido. O vetor de expressão da presente invenção compreende um cassete de expressão. Os vetores de expressão permitem a transcrição de grandes quantidades de mRNA estável. Uma vez que o vetor de expressão esteja dentro da célula, a molécula de ácido ribonucleico ou proteína que é codificada pelo gene é produzida pela maquinaria de transcrição e/ ou tradução celular. Em uma forma de realização, o vetor de expressão da invenção compreende um cassete de expressão que compreende sequências polinucleotídicas que codificam imunoconjugados da invenção ou fragmentos dos mesmos.[059] The term “vector” or “expression vector” refers to a DNA molecule that is used to introduce and direct the expression of a specific gene to which it is operatively associated into a cell. The term includes the vector as a self-replicating nucleic acid construct, as well as the vector incorporated into the genome of a host cell into which it has been introduced. The expression vector of the present invention comprises an expression cassette. Expression vectors allow for the transcription of large quantities of stable mRNA. Once the expression vector is inside the cell, the ribonucleic acid molecule or protein that is encoded by the gene is produced by the cellular transcription and/or translation machinery. In one embodiment, the expression vector of the invention comprises an expression cassette that comprises polynucleotide sequences encoding immunoconjugates of the invention or fragments thereof.
[060] Os termos “célula hospedeira”, “linha celular hospedeira” e “cultura de célula hospedeira” são usados de forma intercambiável e referem-se a células nas quais o ácido nucléico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras incluem “transformantes” e “células transformadas”, que incluem a célula primária transformada e a progênie derivada a partir da mesma sem ter em conta o número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica no conteúdo de ácido nucléico a uma célula-mãe, mas pode conter mutações. A descendência mutante que tem a mesma função ou atividade biológica como rastreada ou selecionada na célula originalmente transformada é aqui incluída. Uma célula hospedeira é qualquer tipo de sistema celular que pode ser utilizado para gerar os imunoconjugados da presente invenção. As células hospedeiras incluem células cultivadas, por exemplo, células cultivadas em mamíferos, tais como células HEK, células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/ 0, células de mieloma YO, células de mieloma de camundongo P3X63, células PER, células PER.C6 ou células de hibridoma, células de levedura, células de inseto e células de plantas, para mencionar apenas algumas, mas também células compreendidas dentro de um animal transgênico, planta transgênica ou tecido vegetal ou animal cultivado.[060] The terms “host cell”, “host cell line” and “host cell culture” are used interchangeably and refer to cells into which exogenous nucleic acid has been introduced, including the progeny of such cells. Host cells include “transformants” and “transformed cells”, which include the primary transformed cell and the progeny derived therefrom without regard to the number of passages. The progeny may not be completely identical in nucleic acid content to a parent cell, but may contain mutations. Mutant progeny that have the same function or biological activity as screened or selected in the originally transformed cell are included herein. A host cell is any type of cellular system that can be used to generate the immunoconjugates of the present invention. Host cells include cultured cells, for example, mammalian cultured cells such as HEK cells, CHO cells, BHK cells, NS0 cells, SP2/0 cells, YO myeloma cells, P3X63 mouse myeloma cells, PER cells, PER.C6 cells or hybridoma cells, yeast cells, insect cells and plant cells, to name but a few, but also cells comprised within a transgenic animal, transgenic plant or cultured plant or animal tissue.
[061] O termo “anticorpo” aqui utilizado no sentido mais amplo e engloba vias estruturas de anticorpo, incluindo, mas não limitado a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a atividade de ligação ao antígeno desejada.[061] The term “antibody” is used herein in the broadest sense and encompasses various antibody structures, including but not limited to monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies (e.g., bispecific antibodies), and antibody fragments, so long as they exhibit the desired antigen-binding activity.
[062] O termo “anticorpo monoclonal”, tal como aqui utilizado, refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja os anticorpos individuais incluídos na população são idênticos e/ ou ligam-se ao mesmo epítopo, exceto quanto a possíveis anticorpos variantes, por exemplo, mutações que ocorrem ou que surgem durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, estando estas variantes, de forma geral, presentes em quantidades menores. Em contraste com as preparações de anticorpos policlonais, que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal dirigido contra um único determinante em um antígeno. Assim, o modificador “monoclonal” indica o carácter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogénea de anticorpos e não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas, incluindo mas não limitado ao método de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição de fagos e métodos utilizando animais transgênicos contendo todos ou parte dos loci de imunoglobulina humano, tais métodos e outros métodos exemplificativos para a produção de anticorpos monoclonais aqui descritos.[062] The term “monoclonal antibody” as used herein refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, that is, the individual antibodies included in the population are identical and/or bind to the same epitope, except for possible variant antibodies, e.g., mutations that occur or arise during the production of a monoclonal antibody preparation, such variants generally being present in minor amounts. In contrast to polyclonal antibody preparations, which typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody of a monoclonal antibody preparation is directed against a single determinant on an antigen. Thus, the modifier “monoclonal” indicates the character of the antibody as being obtained from a substantially homogeneous population of antibodies and should not be construed as requiring production of the antibody by any particular method. For example, monoclonal antibodies to be used in accordance with the present invention can be made by a variety of techniques, including but not limited to the hybridoma method, recombinant DNA methods, phage display methods, and methods utilizing transgenic animals containing all or part of the human immunoglobulin loci, such methods and other exemplary methods for producing monoclonal antibodies described herein.
[063] Um anticorpo “isolado” é aquele que foi separado de um componente de seu ambiente natural, isto é, que não está em seu meio natural. Nenhum nível particular de purificação é necessário. Por exemplo, um anticorpo isolado pode ser removido do seu ambiente nativo ou natural. Os anticorpos produzidos de forma recombinante expressos em células hospedeiras são considerados isolados para os fins da invenção, assim como os anticorpos nativos ou recombinantes que foram separados, fracionados ou parcialmente ou substancialmente purificados por qualquer técnica adequada. Como tal, os imunoconjugados da presente invenção são isolados. Em algumas formas de realização, um anticorpo é purificado para uma pureza superior a 95% ou 99% conforme determinado, por exemplo, eletroforético (por exemplo, SDS-PAGE, focagem isoelétrica (IEF), eletroforese capilar) ou cromatográfico (por exemplo, troca iônica ou inversa HPLC de fase). Para revisão de métodos para avaliação da pureza do anticorpo, ver, por exemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848: 79-87 (2007).[063] An “isolated” antibody is one that has been separated from a component of its natural environment, i.e., that is not in its natural environment. No particular level of purification is required. For example, an isolated antibody can be removed from its native or natural environment. Recombinantly produced antibodies expressed in host cells are considered isolated for purposes of the invention, as are native or recombinant antibodies that have been separated, fractionated, or partially or substantially purified by any suitable technique. As such, the immunoconjugates of the present invention are isolated. In some embodiments, an antibody is purified to a purity greater than 95% or 99% as determined, for example, electrophoretically (e.g., SDS-PAGE, isoelectric focusing (IEF), capillary electrophoresis) or chromatographically (e.g., ion exchange or reversed phase HPLC). For a review of methods for assessing antibody purity, see, for example, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848: 79-87 (2007).
[064] Os termos “anticorpo de comprimento total”, “anticorpo intacto” e “anticorpo completo” são aqui usados indistintamente para se referirem a um anticorpo que possui uma estrutura substancialmente semelhante a uma estrutura de anticorpo nativa.[064] The terms “full-length antibody”, “intact antibody” and “complete antibody” are used interchangeably herein to refer to an antibody that has a structure substantially similar to a native antibody structure.
[065] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a Fv, Fab, Fab’, Fab'- SH, F (ab')2, diacorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpo de cadeia única (por exemplo scFv) e anticorpos de domínio único. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpos, ver Holliger e Hudson, Nature Biotechnology 23: 1126-1136 (2005). Para uma revisão de fragmentos scFv, ver por exemplo Pluckthun, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315 (1994); ver também WO 93/16185; e Patentes dos EUA Nos. 5.571.894 e 5.587.458. Para discussão de fragmentos Fab e F (ab’)2 que compreende resíduos de epítopo de ligação ao receptor de salvamento e que possui semivida in vivo aumentada, ver Patente US N° 5.869.046. Diacorpos são fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Veja, por exemplo, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al. Nat Med 9, 129-134 (2003); e Hollinger e outros, proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). Triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo que compreende todo ou uma porção do domínio variável da cadeia pesada ou a totalidade ou uma porção do domínio variável da cadeia leve de um anticorpo. Em certas formas de realização, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; ver, por exemplo, patente US N° 6.248.516 B1). Os fragmentos de anticorpos podem serproduzidos por vias técnicas, incluindo, mas não se limitando a digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, E. coli ou fago), como aqui descrito.[065] An “antibody fragment” refers to a molecule other than an intact antibody that comprises a portion of an intact antibody that binds to the antigen to which the intact antibody binds. Examples of antibody fragments include, but are not limited to, Fv, Fab, Fab’, Fab'-SH, F(ab’)2, diabodies, linear antibodies, single chain antibody molecules (e.g. scFv), and single domain antibodies. For a review of certain antibody fragments, see Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 23: 1126-1136 (2005). For a review of scFv fragments, see for example Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); see also WO 93/16185; and U.S. Patent Nos. Nos. 5,571,894 and 5,587,458. For discussion of Fab and F(ab')2 fragments that comprise salvage receptor-binding epitope residues and that have increased in vivo half-lives, see U.S. Patent No. 5,869,046. Diabodies are antibody fragments with two antigen-binding sites that can be bivalent or bispecific. See, e.g., EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); and Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). Triabodies and tetrabodies are also described in Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Single domain antibodies are antibody fragments comprising all or a portion of the heavy chain variable domain or all or a portion of the light chain variable domain of an antibody. In certain embodiments, a single domain antibody is a human single domain antibody (Domantis, Inc., Waltham, MA; see, e.g., U.S. Patent No. 6,248,516 B1). Antibody fragments can be produced by technical routes, including, but not limited to, proteolytic digestion of an intact antibody, as well as production by recombinant host cells (e.g., E. coli or phage), as described herein.
[066] O termo “molécula de imunoglobulina” refere-se a uma proteína com a estrutura de um anticorpo que ocorre naturalmente. Por exemplo, as imunoglobulinas da classe de IgG são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves e duas cadeias pesadas que são ligadas por dissulfureto. Do terminal N ao terminal C, cada cadeia pesada possui um domínio variável (VH), também chamado de domínio leve variável ou uma região variável de cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3), também chamados de região constante de cadeia. Similarmente, do terminal N ao C, cada cadeia leve tem um domínio variável (VL), também chamado de domínio variável leve ou uma região variável de cadeia leve, seguido por um domínio de luz constante (CL), também chamado de região de constante de cadeia leve. A cadeia pesada de uma imunoglobulina pode ser atribuída a um dos cinco tipos, chamados α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), Y (IgG) ou μ(IgM), alguns dos quais podem ser divididos em subtipos, por exemplo, Y 1 (IgG 1), Y 2 (IgG 2), Y 3 (IgG 3), Y 4 (IgG 4), α 1 (IgA 1) e α 2 (IgA 2). A cadeia leve de uma imunoglobulina pode ser atribuída a um de dois tipos, denominados kappa (K) e lambda (À), com base na sequência de aminoácidos do seu domínio constante. Uma imunoglobulina consiste essencialmente em duas moléculas Fab e um domínio Fc, ligadas através da região charneira (hinge) da imunoglobulina.[066] The term “immunoglobulin molecule” refers to a protein with the structure of a naturally occurring antibody. For example, immunoglobulins of the IgG class are heterotetrameric glycoproteins of about 150,000 daltons, composed of two light chains and two heavy chains that are disulfide-linked. From the N-terminus to the C-terminus, each heavy chain has a variable domain (VH), also called a variable light domain or a heavy chain variable region, followed by three constant domains (CH1, CH2, and CH3), also called a chain constant region. Similarly, from the N-terminus to the C-terminus, each light chain has a variable domain (VL), also called a light variable domain or a light chain variable region, followed by a constant light domain (CL), also called a light chain constant region. The heavy chain of an immunoglobulin can be assigned to one of five types, called α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), Y (IgG), or μ (IgM), some of which can be divided into subtypes, e.g., Y1 (IgG1), Y2 (IgG2), Y3 (IgG3), Y4 (IgG4), α1 (IgA1), and α2 (IgA2). The light chain of an immunoglobulin can be assigned to one of two types, called kappa (K) and lambda (Δ), based on the amino acid sequence of its constant domain. An immunoglobulin essentially consists of two Fab molecules and an Fc domain, linked by the immunoglobulin hinge region.
[067] O termo “domínio de ligação ao antígeno” refere-se a parte de um anticorpo que compreende a área que se liga de forma específica e complementar a parte ou a totalidade de um antígeno. Um domínio de ligação ao antígeno pode ser proporcionado, por exemplo, por um ou mais domínios variáveis de anticorpo (também denominados regiões variáveis de anticorpo). Em particular, um domínio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia leve do anticorpo (VL) e um domínio variável da cadeia pesada do anticorpo (VH).[067] The term “antigen-binding domain” refers to the part of an antibody comprising the area that specifically and complementary binds to part or all of an antigen. An antigen-binding domain may be provided, for example, by one or more antibody variable domains (also called antibody variable regions). In particular, an antigen-binding domain comprises an antibody light chain variable domain (VL) and an antibody heavy chain variable domain (VH).
[068] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvida na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo, de forma geral, possuem estruturas semelhantes, com cada domínio que compreende quatro regiões estruturais (FR) conservadas e três regiões hipervariáveis (HVR). Ver, por exemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6a ed., WH Freeman and Co., página 91 (2007). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Como aqui utilizado em ligação com sequências de regiões variáveis, a “numeração de Kabat” refere-se ao sistema de numeração estabelecido por Kabat, et al. Sequências de Proteínas de Interesse Imunológico, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).[068] The term “variable region” or “variable domain” refers to the domain of an antibody heavy or light chain that is involved in binding of the antibody to antigen. The heavy and light chain variable domains (VH and VL, respectively) of a native antibody generally have similar structures, with each domain comprising four conserved framework regions (FR) and three hypervariable regions (HVR). See, for example, Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W. H. Freeman and Co., page 91 (2007). A single VH or VL domain may be sufficient to confer antigen-binding specificity. As used herein in connection with variable region sequences, “Kabat numbering” refers to the numbering system established by Kabat, et al. Protein Sequences of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
[069] Como aqui utilizado, as posições de aminoácidos de todas as regiões e domínios constantes da cadeia pesada e leve são numeradas de acordo com o sistema de numeração de Kabat descrito em Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), referido como “numeração de acordo com Kabat” ou “numeração Kabat” aqui. De forma específica o sistema de numeração de Kabat (ver páginas 647-660 de Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) é usado para a domínio constante de cadeia leve CL do isotipo kappa e lambda e o sistema de numeração de índice EU de Kabat (ver páginas 661-723) é usado para os domínios constantes de cadeia pesada (CH1, Hinge, CH2 e CH3), que é aqui mais clarificado por referência a “numeração de acordo com o índice EU de Kabat”, neste caso.[069] As used herein, the amino acid positions of all heavy and light chain constant regions and domains are numbered according to the Kabat numbering system described in Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), referred to as “Kabat numbering” or “Kabat numbering” herein. Specifically the Kabat numbering system (see pages 647-660 of Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) is used for the CL light chain constant domain of the kappa and lambda isotype and the Kabat EU index numbering system (see pages 661-723) is used for the heavy chain constant domains (CH1, Hinge, CH2, and CH3), which is further clarified here by reference to “numbering according to the Kabat EU index” in this case.
[070] O termo “região hipervariável” ou “HVR”, como usado aqui, refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis em sequência (“regiões determinantes de complementaridade” ou “CDRs”) e/ ou formam laços estruturalmente definidos (“Alças hipervariáveis”) e/ ou contêm os resíduos de contato com o antígeno (“contatos antigênicos”). De forma geral, os anticorpos compreendem seis HVRs; três no VH (H1, H2, H3) e três no VL (L1, L2, L3). Exemplos de HVRs incluem:(a) alças hipervariáveis que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91 -96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987));(b) CDR ocorrendo nos resíduos de aminoácido 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3 (Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));(c) contatos antigênicos que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) e 93-101 (H3) (MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); e(d) combinações de (a), (b) e/ ou (c), incluindo resíduos de aminoácidos de HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (Hl), 26-35b (Hl), 49-65 (H2), 93-102 (H3) e 94-102 (H3).[070] The term “hypervariable region” or “HVR” as used herein refers to each of the regions of an antibody variable domain that are hypervariable in sequence (“complementarity determining regions” or “CDRs”) and/or form structurally defined loops (“hypervariable loops”) and/or contain antigen contact residues (“antigenic contacts”). In general, antibodies comprise six HVRs; three in the VH (H1, H2, H3) and three in the VL (L1, L2, L3). Examples of HVRs include: (a) hypervariable loops occurring at amino acid residues 26–32 (L1), 50–52 (L2), 91–96 (L3), 26–32 (H1), 53–55 (H2), and 96–101 (H3) (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901–917 (1987)); (b) CDRs occurring at amino acid residues 24–34 (L1), 50–56 (L2), 89–97 (L3), 31–35b (H1), 50–65 (H2), and 95–102 (H3 (Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));(c) antigenic contacts occurring at amino acid residues 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), and 93-101 (H3) (MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); and(d) combinations of (a), (b), and/or (c), including HVR amino acid residues 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (Hl), 26-35b (Hl), 49-65 (H2), 93-102 (H3), and 94-102 (H3).
[071] Salvo indicação em contrário, resíduos de HVR e outros resíduos no domínio variável (por exemplo, resíduos de FR) são aqui numerados de acordo com Kabat, et al. supra.[071] Unless otherwise indicated, HVR residues and other residues in the variable domain (e.g., FR residues) are numbered herein according to Kabat, et al. supra.
[072] “Estrutura” ou “FR” refere-se a resíduos do domínio variável que não sejam resíduos da região hipervariável (HVR). A FR de um domínio variável, de forma geral, consiste em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Consequentemente, as sequências HVR e FR aparecem, de forma geral, na seguinte ordem em VH (ou VL): FR1-H1 (L1) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4.[072] “Framework” or “FR” refers to residues of the variable domain other than hypervariable region (HVR) residues. The FR of a variable domain generally consists of four FR domains: FR1, FR2, FR3, and FR4. Consequently, the HVR and FR sequences generally appear in the following order in VH (or VL): FR1-H1 (L1) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4.
[073] Um anticorpo “humanizado” refere-se a um anticorpo quimérico que compreende resíduos de aminoácido de HVRs não humanos e resíduos de aminoácidos de FRs humanos. Em certas formas de realização, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os HVRs (por exemplo, CDRs) correspondem àqueles de um anticorpo não humano, e todos ou substancialmente todos os FRs correspondem aos de um anticorpo humano. Tais domínios variáveis são aqui referidos como “região variável humanizada”. Um anticorpo humanizado, de forma opcional, pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo derivada de um anticorpo humano. Em algumas formas de realização, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos com resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo do qual os resíduos de HVR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, de um anticorpo não humano, refere-se a um anticorpo que foi submetido à humanização. Outras formas de “anticorpos humanizados” abrangidos pela presente invenção são aquelas em que a região constante foi adicionalmente modificada ou alterada da do anticorpo original para gerar as propriedades de acordo com a invenção, especialmente em relação à ligação de C1q e/ ou Fc ligação de receptor (FcR).[073] A “humanized” antibody refers to a chimeric antibody comprising amino acid residues from non-human HVRs and amino acid residues from human FRs. In certain embodiments, a humanized antibody will comprise substantially all of at least one, and typically two, variable domains, wherein all or substantially all of the HVRs (e.g., CDRs) correspond to those of a non-human antibody, and all or substantially all of the FRs correspond to those of a human antibody. Such variable domains are referred to herein as a “humanized variable region.” A humanized antibody may optionally comprise at least a portion of an antibody constant region derived from a human antibody. In some embodiments, some FR residues in a humanized antibody are replaced with corresponding residues from a non-human antibody (e.g., the antibody from which the HVR residues are derived), for example, to restore or improve the specificity or affinity of the antibody. A “humanized form” of an antibody, e.g., of a non-human antibody, refers to an antibody that has undergone humanization. Other forms of “humanized antibodies” encompassed by the present invention are those in which the constant region has been further modified or altered from that of the original antibody to generate the properties according to the invention, especially with respect to C1q binding and/or Fc receptor (FcR) binding.
[074] Um “anticorpo humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde à de um anticorpo produzido por humano ou uma célula humana ou derivado de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências codificadoras de anticorpos humanos. Esta definição de um anticorpo humano exclui de forma específica um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação ao antígeno não humanos. Em certas formas de realização, um anticorpo humano é derivado de um mamífero transgênico não humano, por exemplo, um camundongo, um camundongo ou um coelho. Em certas formas de realização, um anticorpo humano é derivado de uma linha celular de hibridoma. Anticorpos ou fragmentos de anticorpos isolados a partir de bibliotecas de anticorpos humanos são também considerados anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpos humanos da presente invenção.[074] A “human antibody” is one having an amino acid sequence that corresponds to that of a human-produced antibody or a human cell or derived from a non-human source that utilizes human antibody repertoires or other human antibody coding sequences. This definition of a human antibody specifically excludes a humanized antibody comprising non-human antigen-binding residues. In certain embodiments, a human antibody is derived from a non-human transgenic mammal, e.g., a mouse, a mouse, or a rabbit. In certain embodiments, a human antibody is derived from a hybridoma cell line. Antibodies or antibody fragments isolated from human antibody libraries are also considered human antibodies or human antibody fragments of the present invention.
[075] A “classe” de um anticorpo ou imunoglobulina refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante possuído por sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem ser ainda divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG 1, IgG 2, IgG 3, IgG 4, IgA 1, e IgA 2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados α, δ, ε, Y e μ, respectivamente.[075] The “class” of an antibody or immunoglobulin refers to the type of constant domain or constant region possessed by its heavy chain. There are five major classes of antibodies: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, and several of these can be further divided into subclasses (isotypes), for example, IgG 1, IgG 2, IgG 3, IgG 4, IgA 1, and IgA 2. The heavy chain constant domains that correspond to the different classes of immunoglobulins are called α, δ, ε, Y, and μ, respectively.
[076] O termo “domínio Fc” ou “região Fc” aqui utilizado para definir uma região terminal C de uma cadeia pesada de imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de IgG possam variar ligeiramente, a região Fc de cadeia pesada de IgG humano, de forma geral, definida como se estendendo de Cys226, ou de Pro230, ao terminal carboxila da cadeia pesada. No entanto, os anticorpos produzidos pelas células hospedeiras podem sofrer clivagem p- tradução de um ou mais, em particular um ou dois, aminoácidos do terminal C da cadeia pesada. Portanto, um anticorpo produzido por uma célula hospedeira pela expressão de uma molécula de ácido nucleico específica que codifica uma cadeia pesada de comprimento total pode incluir a cadeia pesada de tamanho completo, ou pode incluir uma variante clivada da cadeia pesada de comprimento total (também referida aqui como uma “cadeia pesada variante clivada”). Este pode ser o caso em que os dois últimos aminoácidos do terminal C da cadeia pesada são glicina (G446) e lisina (K447, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Portanto, a lisina terminal C (Lys447), ou a glicina terminal C (Gly446) e a lisina (K447), da região Fc, podem ou não estar presentes. As sequências de aminoácidos de cadeias pesadas incluindo os domínios FC (ou uma subunidade de um domínio Fc como aqui definido) são aqui indicadas sem o dipeptídeo de glicina-lisina terminal C se não indicado de outro modo. Na forma de realização da invenção, uma cadeia pesada incluindo uma subunidade de um domínio Fc como aqui especificado, compreendido em um imunoconjugado de acordo com a invenção, compreende um dipeptídeo glicina-lisina terminal C adicional (G446 e K447, numerando de acordo com o índice EU de Kabat). Em uma forma de realização da invenção, uma cadeia pesada incluindo uma subunidade de um domínio Fc como aqui especificado, compreendido em um imunoconjugado de acordo com a invenção, compreende um resíduo adicional de glicina terminal C (G446, numerando de acordo com o índice EU de Kabat). As composições da invenção, tais como as composições farmacêuticas aqui descritas, compreendem uma população de imunoconjugados da invenção. A população de imunoconjugados pode compreender moléculas que possui uma cadeia pesada de comprimento completo e moléculas que possui uma cadeia pesada variante clivada. A população de imunoconjugados pode consistir em uma mistura de moléculas com uma cadeia pesada de comprimento completo e moléculas que possui uma cadeia pesada variante clivada, em que pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% dos imunoconjugados possuem uma cadeia pesada variante clivada. Em uma forma de realização da invenção, uma composição que compreende uma população de imunoconjugados da invenção compreende um imunoconjugado que compreende uma cadeia pesada incluindo uma subunidade de um domínio Fc como especificado aqui com um dipeptídeo glicina-lisina terminal C adicional (G446 e K447, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em uma forma de realização da invenção, uma composição que compreende uma população de imunoconjugados da invenção compreende um imunoconjugado que compreende uma cadeia pesada incluindo uma subunidade de um domínio Fc como especificado aqui com um resíduo de glicina terminal C adicional (G446, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em uma forma de realização da invenção, tal composição compreende uma população de imunoconjugados constituídos por moléculas que compreendem uma cadeia pesada incluindo uma subunidade de um domínio Fc como especificado aqui; moléculas que compreendem uma cadeia pesada incluindo uma subunidade de um domínio Fc como especificado aqui com um resíduo adicional de glicina terminal C (G446, numerando de acordo com o índice EU de Kabat); e moléculas que compreendem uma cadeia pesada incluindo uma subunidade de um domínio Fc como especificado aqui com um dipeptídeo glicina-lisina terminal C adicional (G446 e K447, numerando de acordo com o índice EU de Kabat). A menos que aqui especificado de outro modo, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração da UE, também designado por índice EU, como descrito em Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) (ver também acima). Uma “subunidade” de um domínio Fc, como aqui utilizado, refere-se a um dos dois polipeptídeos que formam o domínio Fc dimérico, ou seja, um polipeptídeo que compreende regiões constantes terminais C de uma cadeia pesada de imunoglobulina, capaz de auto associação estável. Por exemplo, uma subunidade de um domínio IgG Fc compreende um domínio constante IgG CH2 e um IgG CH3 constante.[076] The term “Fc domain” or “Fc region” is used herein to define a C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain that contains at least a portion of the constant region. The term includes native sequence Fc regions and variant Fc regions. Although the boundaries of the Fc region of an IgG heavy chain may vary slightly, the Fc region of a human IgG heavy chain is generally defined as extending from Cys226, or from Pro230, to the carboxyl terminus of the heavy chain. However, antibodies produced by host cells may undergo post-translational cleavage of one or more, in particular one or two, amino acids from the C-terminus of the heavy chain. Therefore, an antibody produced by a host cell by expression of a specific nucleic acid molecule encoding a full-length heavy chain may include the full-length heavy chain, or may include a cleaved variant of the full-length heavy chain (also referred to herein as a “cleaved variant heavy chain”). This may be the case where the last two amino acids of the C-terminus of the heavy chain are glycine (G446) and lysine (K447, numbering according to Kabat's EU index). Therefore, the C-terminal lysine (Lys447), or the C-terminal glycine (Gly446) and lysine (K447), of the Fc region may or may not be present. The amino acid sequences of heavy chains comprising Fc domains (or a subunit of an Fc domain as defined herein) are indicated herein without the C-terminal glycine-lysine dipeptide if not otherwise indicated. In one embodiment of the invention, a heavy chain comprising a subunit of an Fc domain as specified herein, comprised in an immunoconjugate according to the invention, comprises an additional C-terminal glycine-lysine dipeptide (G446 and K447, numbering according to Kabat's EU index). In one embodiment of the invention, a heavy chain including a subunit of an Fc domain as specified herein, comprised in an immunoconjugate according to the invention, comprises an additional C-terminal glycine residue (G446, numbering according to the Kabat EU index). Compositions of the invention, such as pharmaceutical compositions described herein, comprise a population of immunoconjugates of the invention. The population of immunoconjugates may comprise molecules having a full-length heavy chain and molecules having a cleaved variant heavy chain. The population of immunoconjugates may consist of a mixture of molecules having a full-length heavy chain and molecules having a cleaved variant heavy chain, wherein at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80% or at least 90% of the immunoconjugates have a cleaved variant heavy chain. In one embodiment of the invention, a composition comprising a population of immunoconjugates of the invention comprises an immunoconjugate comprising a heavy chain including a subunit of an Fc domain as specified herein with an additional C-terminal glycine-lysine dipeptide (G446 and K447, numbering according to Kabat's EU index). In one embodiment of the invention, a composition comprising a population of immunoconjugates of the invention comprises an immunoconjugate comprising a heavy chain including a subunit of an Fc domain as specified herein with an additional C-terminal glycine residue (G446, numbering according to Kabat's EU index). In one embodiment of the invention, such a composition comprises a population of immunoconjugates consisting of molecules comprising a heavy chain including a subunit of an Fc domain as specified herein; molecules comprising a heavy chain including a subunit of an Fc domain as specified herein with an additional C-terminal glycine residue (G446, numbering according to Kabat's EU index); and molecules comprising a heavy chain including a subunit of an Fc domain as specified herein with an additional C-terminal glycine-lysine dipeptide (G446 and K447, numbering according to Kabat's EU index). Unless otherwise specified herein, the numbering of amino acid residues in the Fc region or constant region is according to the EU numbering system, also referred to as the EU index, as described in Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) (see also above). A “subunit” of an Fc domain, as used herein, refers to one of the two polypeptides that form the dimeric Fc domain, that is, a polypeptide comprising the C-terminal constant regions of an immunoglobulin heavy chain, capable of stable self-association. For example, a subunit of an IgG Fc domain comprises an IgG CH2 constant domain and an IgG CH3 constant domain.
[077] Uma “modificação que promove a associação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc” é uma manipulação do esqueleto peptídico ou das modificações pós-tradução de uma subunidade do domínio Fc que reduz ou previne a associação de um polipeptídeo que compreende a subunidade do domínio Fc com um polipeptídeo idêntico para formar um homodímero. Uma associação promotora de modificação, tal como aqui utilizada, inclui em particular modificações separadas feitas para cada uma das duas subunidades do domínio Fc desejadas para associar (isto é, a primeira e a segunda subunidades do domínio Fc), em que as modificações são complementares entre si de modo a promover a associação das duas subunidades do domínio Fc. Por exemplo, uma associação promotora de modificação pode alterar a estrutura ou carga de uma ou ambas as subunidades do domínio Fc, de modo a tornar sua associação estéreo ou eletrostaticamente favorável, respectivamente. Assim, ocorre (hetero) dimerização entre um polipeptídeo que compreende a primeira subunidade do domínio Fc e um polipeptídeo que compreende a segunda subunidade do domínio Fc, que pode ser não idêntica no sentido em que outros componentes se fundem a cada uma das subunidades (por exemplo, porções de ligação ao antígeno) não são os mesmos. Em algumas formas de realização, a associação promotora de modificação compreende uma mutação de aminoácido no domínio Fc, de forma específica uma substituição de aminoácidos. Em uma forma de realização particular, a associação promotora de modificação compreende uma mutação de aminoácidos separada, de forma específica uma substituição de aminoácidos, em cada uma das duas subunidades do domínio Fc.[077] A “modification promoting association of the first and second Fc domain subunits” is a manipulation of the peptide backbone or post-translational modifications of an Fc domain subunit that reduces or prevents the association of a polypeptide comprising the Fc domain subunit with an identical polypeptide to form a homodimer. An association promoting modification, as used herein, particularly includes separate modifications made to each of the two Fc domain subunits desired to associate (i.e., the first and second Fc domain subunits), wherein the modifications are complementary to each other so as to promote association of the two Fc domain subunits. For example, an association promoting modification may alter the structure or charge of one or both Fc domain subunits so as to make their association sterically or electrostatically favorable, respectively. Thus, (hetero)dimerization occurs between a polypeptide comprising the first subunit of the Fc domain and a polypeptide comprising the second subunit of the Fc domain, which may be non-identical in the sense that other components fused to each of the subunits (e.g., antigen-binding moieties) are not the same. In some embodiments, the modification-promoting association comprises an amino acid mutation in the Fc domain, specifically an amino acid substitution. In a particular embodiment, the modification-promoting association comprises a separate amino acid mutation, specifically an amino acid substitution, in each of the two subunits of the Fc domain.
[078] O termo “funções efetoras” quando usado em referência a anticorpos refere-se àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem: ligação a C1q e citotoxicidade dependente de complemento (CDC), ligação ao receptor Fc, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP), secreção de citocina, captação de antígeno mediada por complexo imune por células apresentadoras de antígeno, regulação negativa de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B) e ativação de células B.[078] The term “effector functions” when used in reference to antibodies refers to those biological activities attributable to the Fc region of an antibody, which vary with the antibody isotype. Examples of antibody effector functions include: C1q binding and complement-dependent cytotoxicity (CDC), Fc receptor binding, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP), cytokine secretion, immune complex-mediated antigen uptake by antigen-presenting cells, downregulation of cell surface receptors (e.g., B cell receptor), and B cell activation.
[079] A citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) é um mecanismo imune que leva à lise de células alvo revestidas de anticorpos por células efetoras imunes. As células alvo são células às quais os anticorpos ou os seus derivados que compreendem uma região Fc se ligam de forma específica, de forma geral, através da parte de proteína que é terminal N para a região Fc. Como aqui utilizado, o termo “ADCC reduzido” é definido como uma redução no número de células alvo que são lisadas em um dado tempo, a uma dada concentração de anticorpo no meio que envolve as células alvo, pelo mecanismo do ADCC definido acima e/ ou um aumento na concentração de anticorpo no meio que envolve as células alvo, necessário para atingir a lise de um dado número de células alvo em um dado tempo, pelo mecanismo do ADCC. A redução na ADCC é relativa à ADCC mediada pelo mesmo anticorpo produzido pelo mesmo tipo de células hospedeiras, usando os mesmos métodos padrão de produção, purificação, formulação e armazenamento (que são conhecidos dos técnicos no assunto), mas que não foi projetado. Por exemplo, a redução em ADCC mediada por um anticorpo que compreende no seu domínio Fc uma substituição de aminoácidos que reduz ADCC, relativamente ao ADCC mediado pelo mesmo anticorpo sem esta substituição de aminoácidos no domínio Fc. Os ensaios adequados para medir o ADCC são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, publicação PCT n° WO 2006/082515 ou publicação PCT n° WO 2012/130831).[079] Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) is an immune mechanism that leads to the lysis of antibody-coated target cells by immune effector cells. Target cells are cells to which antibodies or their derivatives comprising an Fc region specifically bind, generally via the protein portion that is N-terminal to the Fc region. As used herein, the term “reduced ADCC” is defined as a reduction in the number of target cells that are lysed in a given time, at a given concentration of antibody in the medium surrounding the target cells, by the ADCC mechanism defined above and/or an increase in the concentration of antibody in the medium surrounding the target cells necessary to achieve lysis of a given number of target cells in a given time, by the ADCC mechanism. The reduction in ADCC is relative to ADCC mediated by the same antibody produced by the same type of host cells, using the same standard methods of production, purification, formulation and storage (which are known to those skilled in the art), but which has not been designed. For example, the reduction in ADCC mediated by an antibody comprising in its Fc domain an amino acid substitution that reduces ADCC, relative to ADCC mediated by the same antibody without this amino acid substitution in the Fc domain. Suitable assays for measuring ADCC are well known in the art (see, for example, PCT Publication No. WO 2006/082515 or PCT Publication No. WO 2012/130831).
[080] Um “receptor Fc ativador” é um receptor Fc que, após o envolvimento de um domínio Fc de um anticorpo, desencadeia eventos de sinalização que estimulam a célula portadora de receptor a realizar funções efetoras. Receptores Fc ativadores humanos incluem FcYRIIIa (CD16a), FCYRI (CD64), FcYRIIa (CD32) e FcαRI (CD89).[080] An “activating Fc receptor” is an Fc receptor that, upon engagement of an Fc domain of an antibody, triggers signaling events that stimulate the receptor-bearing cell to perform effector functions. Human activating Fc receptors include FcYRIIIa (CD16a), FCYRI (CD64), FcYRIIa (CD32), and FcαRI (CD89).
[081] Como aqui utilizado, os termos “engenheiro, engenhado, engenharia”, são considerados como incluindo qualquer manipulação do esqueleto peptídico ou as modificações pós-traducionais de um polipeptídeo que ocorre naturalmente ou recombinante ou fragmento do mesmo. A engenharia inclui modificações da sequência de aminoácidos, do padrão de glicosilação ou do grupo da cadeia lateral de aminoácidos individuais, bem como combinações destas abordagens.[081] As used herein, the terms “engineer, engineered, engineering” are considered to include any manipulation of the peptide backbone or post-translational modifications of a naturally occurring or recombinant polypeptide or fragment thereof. Engineering includes modifications of the amino acid sequence, glycosylation pattern or side chain group of individual amino acids, as well as combinations of these approaches.
[082] “Ligação reduzida”, por exemplo, ligação reduzida a um receptor Fc ou CD25, refere-se a uma diminuição na afinidade para a respectiva interação, medida, por exemplo, por SPR. Para maior clareza, o termo inclui também a redução da afinidade para zero (ou abaixo do limite de detecção do método analítico), ou seja, abolição completa da interação. Por outro lado, “ligação aumentada” refere-se a um aumento na afinidade de ligação para a respectiva interação.[082] “Reduced binding”, e.g. reduced binding to an Fc receptor or CD25, refers to a decrease in the affinity for the respective interaction, measured e.g. by SPR. For greater clarity, the term also includes the reduction of the affinity to zero (or below the detection limit of the analytical method), i.e. complete abolition of the interaction. On the other hand, “increased binding” refers to an increase in the binding affinity for the respective interaction.
[083] Como aqui utilizado, o termo “imunoconjugado” refere-se a uma molécula polipeptídica que inclui pelo menos uma molécula de IL-2 e pelo menos um anticorpo. A molécula de IL-2 pode ser unida ao anticorpo por uma variedade de interações e em uma variedade de configurações como aqui descrito. Em formas de realização particulares, a molécula de IL-2 é fundida com o anticorpo através de um ligante peptídico. Imunoconjugados particulares de acordo com a invenção consistem essencialmente em uma molécula de IL-2 e em um anticorpo unidos por uma ou mais sequências de ligação.[083] As used herein, the term "immunoconjugate" refers to a polypeptide molecule that includes at least one IL-2 molecule and at least one antibody. The IL-2 molecule can be joined to the antibody by a variety of interactions and in a variety of configurations as described herein. In particular embodiments, the IL-2 molecule is fused to the antibody via a peptide linker. Particular immunoconjugates according to the invention consist essentially of an IL-2 molecule and an antibody joined by one or more linker sequences.
[084] Por “fundido” entende-se que os componentes (por exemplo, um anticorpo e uma molécula de IL-2) são ligados por ligações peptídicas, quer diretamente quer através de um ou mais de ligação peptídicos.[084] By “fused” it is meant that the components (e.g., an antibody and an IL-2 molecule) are linked by peptide bonds, either directly or through one or more peptide linkers.
[085] Como aqui utilizado, os termos “primeiro” e “segundo” em relação às subunidades do domínio Fc, etc., são utilizados por conveniência de distinguir quando existe mais de um de cada tipo de porção. O uso destes termos não se destina a conferir uma ordem ou orientação específica do imunoconjugado, a menos que explicitamente declarado.[085] As used herein, the terms “first” and “second” with respect to Fc domain subunits, etc., are used for convenience in distinguishing when there is more than one of each type of moiety. The use of these terms is not intended to confer a specific order or orientation of the immunoconjugate unless explicitly stated.
[086] Uma “quantidade eficaz” de um agente refere-se à quantidade que é necessária para resultar em uma alteração fisiológica na célula ou tecido ao qual é administrada.[086] An “effective amount” of an agent refers to the amount that is required to result in a physiological change in the cell or tissue to which it is administered.
[087] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” de um agente, por exemplo, uma composição farmacêutica, refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico ou profilático desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente, por exemplo, elimina, diminui, retarda, minimiza ou previne efeitos adversos de uma doença.[087] A “therapeutically effective amount” of an agent, e.g., a pharmaceutical composition, refers to an amount effective, at dosages and for periods of time necessary, to achieve the desired therapeutic or prophylactic result. A therapeutically effective amount of an agent, for example, eliminates, lessens, delays, minimizes, or prevents adverse effects of a disease.
[088] Um “indivíduo” ou “sujeito” é um mamífero. Os mamíferos incluem, mas não se limitam a animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, humanos e primatas não humanos, como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e camundongos). Em particular, o indivíduo ou sujeito é um humano.[088] An “individual” or “subject” is a mammal. Mammals include, but are not limited to, domesticated animals (e.g., cows, sheep, cats, dogs, and horses), primates (e.g., humans and nonhuman primates such as monkeys), rabbits, and rodents (e.g., mice and rats). In particular, the individual or subject is a human.
[089] O termo “composição farmacêutica” refere-se a uma preparação que é de tal forma que permite que a atividade biológica de um ingrediente ativo contida seja eficaz e que não contenha componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a composição seria administrada.[089] The term “pharmaceutical composition” refers to a preparation that is of such a form that it allows the biological activity of an active ingredient contained therein to be effective and that does not contain additional components that are unacceptably toxic to a subject to whom the composition would be administered.
[090] Um “veículo farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ingrediente em uma composição farmacêutica, que não um ingrediente ativo, que não tóxico para um sujeito. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a um tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.[090] A “pharmaceutically acceptable carrier” refers to an ingredient in a pharmaceutical composition, other than an active ingredient, that is non-toxic to a subject. A pharmaceutically acceptable carrier includes, but is not limited to, a buffer, excipient, stabilizer, or preservative.
[091] Como usado aqui, “tratamento” (e suas variações gramaticais como “tratar” ou “tratar”) refere-se à intervenção clínica na tentativa de alterar o curso natural de uma doença no indivíduo a ser tratado, e pode ser realizada tanto para profilaxia ou durante o curso da patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem, mas não se limitam a prevenir a ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástase, diminuição da taxa de progressão da doença, melhoria ou paliação do estado de doença e remissão ou melhor prognóstico. Em algumas formas de realização, os imunoconjugados da invenção são utilizados para retardar o desenvolvimento de uma doença ou retardar a progressão de uma doença.DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃOPOLIPEPTÍDEO DE IL-2 MUTANTE[091] As used herein, “treatment” (and its grammatical variations such as “treat” or “treat”) refers to clinical intervention in an attempt to alter the natural course of a disease in the individual being treated, and may be performed either for prophylaxis or during the course of clinical pathology. Desirable effects of treatment include, but are not limited to, preventing the occurrence or recurrence of the disease, alleviating symptoms, diminishing any direct or indirect pathological consequences of the disease, preventing metastasis, decreasing the rate of disease progression, ameliorating or palliating the disease state, and remission or improving prognosis. In some embodiments, the immunoconjugates of the invention are used to delay the development of a disease or slow the progression of a disease. DETAILED DESCRIPTION OF EMBODIMENTS MUTANT IL-2 POLYPEPTIDE
[092] Os imunoconjugados de acordo com a presente invenção compreendem um polipeptídeo de IL-2 mutante que possui propriedades vantajosas para imunoterapia. Em particular, as propriedades farmacológicas de IL-2 que contribuem para a toxicidade, mas não são essenciais para a eficácia de IL-2 são eliminadas no polipeptídeo de IL-2 mutante. Tais polipeptídeos de IL-2 mutantes são descritos em detalhe no documento WO 2012/107417, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Como discutido acima, diferentes formas do receptor de IL-2 consistem em diferentes subunidades e exibem diferentes afinidades para IL-2. O receptor de IL-2 de afinidade intermediária, consistindo nas subunidades do receptor “E”, expresso nas células efetoras de repouso e suficiente para a sinalização de IL-2. O receptor de alta afinidade de IL-2, que compreende adicionalmente a subunidade α do receptor, é principalmente expresso em células T reguladoras (Treg), bem como em células efetoras ativadas, onde seu acoplamento pela IL-2 pode promover células Treg, imunossupressão mediada ou morte celular induzida por ativação (AICD), respectivamente. Assim, sem desejar estar limitado pela teoria, reduzir ou abolir a afinidade da IL-2 à subunidade α do receptor IL-2 deve reduzir a regulação negativa induzida pela IL-2 da função das células efetoras pelas células T reguladoras e o desenvolvimento da tolerância ao tumor pelo processo de AICD. Por outro lado, manter a afinidade com o receptor de IL-2 de afinidade intermediária deve preservar a indução de proliferação e ativação de células efetoras como NK e células T pela IL-2.[092] The immunoconjugates according to the present invention comprise a mutant IL-2 polypeptide that has properties advantageous for immunotherapy. In particular, pharmacological properties of IL-2 that contribute to toxicity but are not essential for IL-2 efficacy are eliminated in the mutant IL-2 polypeptide. Such mutant IL-2 polypeptides are described in detail in WO 2012/107417, which is incorporated herein by reference in its entirety. As discussed above, different forms of the IL-2 receptor consist of different subunits and exhibit different affinities for IL-2. The intermediate-affinity IL-2 receptor, consisting of the “E” receptor subunits, is expressed on resting effector cells and is sufficient for IL-2 signaling. The high-affinity IL-2 receptor, which additionally comprises the receptor α subunit, is primarily expressed on regulatory T cells (Treg) as well as on activated effector cells, where its engagement by IL-2 can promote Treg cell-mediated immunosuppression or activation-induced cell death (AICD), respectively. Thus, without wishing to be bound by theory, reducing or abolishing the affinity of IL-2 to the IL-2 receptor α subunit should reduce IL-2-induced downregulation of effector cell function by regulatory T cells and the development of tumor tolerance through the process of AICD. Conversely, maintaining affinity to the intermediate-affinity IL-2 receptor should preserve the induction of proliferation and activation of effector cells such as NK and T cells by IL-2.
[093] O polipeptídeo interleucina-2 (IL-2) mutante compreendido no imunoconjugado de acordo com a invenção compreende pelo menos uma mutação de aminoácido que abole ou reduz a afinidade do polipeptídeo de IL-2 mutante para a subunidade do receptor IL-2 e preserva a afinidade do polipeptídeo de IL-2 mutante com o receptor de IL-2 de afinidade intermediária, cada um comparado com um polipeptídeo de IL-2 de tipo selvagem.[093] The mutant interleukin-2 (IL-2) polypeptide comprised in the immunoconjugate according to the invention comprises at least one amino acid mutation that abolishes or reduces the affinity of the mutant IL-2 polypeptide for the IL-2 receptor subunit and preserves the affinity of the mutant IL-2 polypeptide for the intermediate affinity IL-2 receptor, each compared to a wild-type IL-2 polypeptide.
[094] Os IL-2 mutantes humano (hIL-2) com afinidade diminuída para CD25 podem por exemplo ser gerados por substituição de aminoácidos na posição de aminoácido 35, 38, 42, 43, 45 ou 72 ou combinações dos mesmos (numeração relativa à sequência IL-2 humano SEQ. ID N°: 19). Exemplos de substituições de aminoácidos incluem K35E, K35A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, K43E, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R e L72K. Os IL-2 mutantes particulares úteis nos imunoconjugados da invenção compreendem uma mutação de aminoácidos em uma posição de aminoácido correspondente ao resíduo 42, 45 ou 72 de IL-2 humana, ou uma combinação dos mesmos. Em uma forma de realização, a referida mutação de aminoácidos é uma substituição de aminoácidos selecionada a partir do grupo de F42A, F42G, F42S, F42T, F42E, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R e L72K, de forma mais específica uma substituição de aminoácidos selecionada a partir do grupo de F42A, Y45A e L72G. Estes mutantes exibem uma afinidade de ligação substancialmente semelhante ao receptor de IL-2 de afinidade intermédia e têm uma afinidade substancialmente reduzida para a subunidade do receptor de IL-2 e o receptor de alta afinidade para IL-2 em comparação com uma forma do tipo selvagem do IL-2 mutante.[094] Human IL-2 (hIL-2) mutants with decreased affinity for CD25 can for example be generated by amino acid substitution at amino acid position 35, 38, 42, 43, 45 or 72 or combinations thereof (numbering relative to the human IL-2 sequence SEQ. ID NO: 19). Examples of amino acid substitutions include K35E, K35A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, K43E, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R, and L72K. Particular mutant IL-2 useful in the immunoconjugates of the invention comprise an amino acid mutation at an amino acid position corresponding to residue 42, 45, or 72 of human IL-2, or a combination thereof. In one embodiment, said amino acid mutation is an amino acid substitution selected from the group of F42A, F42G, F42S, F42T, F42E, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R and L72K, more specifically an amino acid substitution selected from the group of F42A, Y45A and L72G. These mutants exhibit substantially similar binding affinity to the intermediate-affinity IL-2 receptor and have substantially reduced affinity for the IL-2 receptor subunit and the high-affinity IL-2 receptor compared to a wild-type form of the mutant IL-2.
[095] Outras características de mutantes úteis podem incluir a capacidade de induzir a proliferação de células T e/ ou NK portadoras do receptor de IL-2, a capacidade de induzir a sinalização de IL-2 em células T e/ ou NK que possuem receptor de IL-2, a capacidade gerar interferon (IFN)-Y como uma citocina secundária pelas células NK, uma capacidade reduzida para induzir a elaboração de citocinas secundárias - em particular IL-10 e TNF-α - por células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), uma capacidade reduzida de ativar células T, uma capacidade reduzida para induzir apoptose em células T e um perfil de toxicidade reduzido in vivo.[095] Other characteristics of useful mutants may include the ability to induce proliferation of IL-2 receptor-bearing T and/or NK cells, the ability to induce IL-2 signaling in IL-2 receptor-bearing T and/or NK cells, the ability to generate interferon (IFN)-Y as a secondary cytokine by NK cells, a reduced ability to induce the elaboration of secondary cytokines - in particular IL-10 and TNF-α - by peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), a reduced ability to activate T cells, a reduced ability to induce apoptosis in T cells, and a reduced toxicity profile in vivo.
[096] Os polipeptídeos de IL-2 mutantes particulares úteis na invenção compreendem três mutações de aminoácidos que abolem ou reduzem a afinidade do polipeptídeo de IL-2 mutante com a subunidade do receptor de IL- 2, mas preservam a afinidade do polipeptídeo de IL-2 mutante para o receptor de IL-2 de afinidade intermediária. Em um dos métodos de realização entende- se que três mutações de aminoácidos estão nas posições correspondentes aos resíduos 42, 45 e 72 da IL-2 humana. Em uma forma de realização, as referidas três mutações de aminoácidos são substituições de aminoácidos. Em uma forma de realização, as referidas três mutações de aminoácidos são substituições de aminoácidos selecionadas a partir do grupo de F42A, F42G, F42S, F42T, F42E, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R e L72K. Em uma forma de realização específica, as referidas três mutações de aminoácidos são as substituições de aminoácidos F42A, Y45A e L72G (numeração relativa à sequência da IL-2 humana da SEQ. ID N°: 19).[096] Particular mutant IL-2 polypeptides useful in the invention comprise three amino acid mutations that abolish or reduce the affinity of the mutant IL-2 polypeptide for the IL-2 receptor subunit, but preserve the affinity of the mutant IL-2 polypeptide for the intermediate affinity IL-2 receptor. In one embodiment, the three amino acid mutations are at positions corresponding to residues 42, 45, and 72 of human IL-2. In one embodiment, said three amino acid mutations are amino acid substitutions. In one embodiment, said three amino acid mutations are amino acid substitutions selected from the group of F42A, F42G, F42S, F42T, F42E, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R, and L72K. In a specific embodiment, said three amino acid mutations are amino acid substitutions F42A, Y45A, and L72G (numbering relative to the human IL-2 sequence of SEQ ID NO:19).
[097] Em certas formas de realização a referida mutação de aminoácidos reduz a afinidade do polipeptídeo de IL-2 mutante à subunidade do receptor de IL-2 em pelo menos 5 vezes, de forma específica pelo menos 10 vezes, de forma mais específica pelo menos 25 vezes. Em formas de realização em que há mais do que uma mutação de aminoácidos que reduz a afinidade do polipeptídeo de IL-2 mutante com a subunidade do receptor da IL-2, a combinação destas mutações de aminoácidos pode reduzir a afinidade do polipeptídeo de IL-2 mutante para a subunidade do receptor de IL-2 em pelo menos 30 vezes, pelo menos 50 vezes, ou mesmo pelo menos 100 vezes. Em uma forma de realização, a referida mutação de aminoácido ou combinação de mutações de aminoácidos suprime a afinidade do polipeptídeo de IL-2 mutante com a subunidade α do receptor de IL-2, pelo que nenhuma ligação é detectável pela ressonância plasmônica da superfície.[097] In certain embodiments said amino acid mutation reduces the affinity of the mutant IL-2 polypeptide for the IL-2 receptor subunit by at least 5-fold, specifically by at least 10-fold, more specifically by at least 25-fold. In embodiments where there is more than one amino acid mutation that reduces the affinity of the mutant IL-2 polypeptide for the IL-2 receptor subunit, the combination of these amino acid mutations can reduce the affinity of the mutant IL-2 polypeptide for the IL-2 receptor subunit by at least 30-fold, at least 50-fold, or even at least 100-fold. In one embodiment, said amino acid mutation or combination of amino acid mutations abolishes the affinity of the mutant IL-2 polypeptide for the IL-2 receptor α subunit, such that no binding is detectable by surface plasmon resonance.
[098] A ligação substancialmente semelhante ao receptor de afinidade intermédia, isto é, a preservação da afinidade do polipeptídeo de IL-2 mutante ao referido receptor, é conseguida quando o IL-2 mutante exibe mais de 70% da afinidade de uma forma do tipo selvagem do IL-2 mutante para o receptor de IL-2 de afinidade intermédia. Os IL-2 mutantes da invenção podem exibir mais do que cerca de 80% e até mais do que cerca de 90% de tal afinidade.[098] Substantially similar binding to the intermediate affinity receptor, i.e., preservation of the affinity of the mutant IL-2 polypeptide for said receptor, is achieved when the mutant IL-2 exhibits greater than 70% of the affinity of a wild-type form of the mutant IL-2 for the intermediate affinity IL-2 receptor. The mutant IL-2s of the invention may exhibit greater than about 80% and even greater than about 90% of such affinity.
[099] A redução da afinidade da IL-2 pela subunidade do receptor IL-2 em combinação com a eliminação da O-glicosilação da IL-2 resulta em uma proteína IL-2 com propriedades melhoradas. Por exemplo, a eliminação do local de O-glicosilação resulta em um produto homogêneo quando o polipeptídeo de IL-2 mutante é expresso em células de mamífero, tais como células CHO ou HEK.[099] Reducing the affinity of IL-2 for the IL-2 receptor subunit in combination with elimination of IL-2 O-glycosylation results in an IL-2 protein with improved properties. For example, elimination of the O-glycosylation site results in a homogeneous product when the mutant IL-2 polypeptide is expressed in mammalian cells, such as CHO or HEK cells.
[0100] Assim, em certas formas de realização, o polipeptídeo de IL- 2 mutante compreende uma mutação de aminoácidos adicional que elimina o local de O-glicosilação da IL-2 em uma posição correspondente ao resíduo 3 da IL-2 humana. Em uma forma de realização, a referida mutação de aminoácidos adicional que elimina o local de O-glicosilação da IL-2 em uma posição correspondente ao resíduo 3 da IL-2 humana é uma substituição de aminoácidos. Exemplos de substituições de aminoácidos incluem T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K e T3P. Em uma forma de realização específica, a referida mutação de aminoácidos adicional é a substituição de aminoácidos T3A.[0100] Thus, in certain embodiments, the mutant IL-2 polypeptide comprises an additional amino acid mutation that eliminates the IL-2 O-glycosylation site at a position corresponding to residue 3 of human IL-2. In one embodiment, said additional amino acid mutation that eliminates the IL-2 O-glycosylation site at a position corresponding to residue 3 of human IL-2 is an amino acid substitution. Examples of amino acid substitutions include T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K, and T3P. In a specific embodiment, said additional amino acid mutation is the T3A amino acid substitution.
[0101] Em certas formas de realização, o polipeptídeo de IL-2 mutante é essencialmente uma molécula de IL-2 de comprimento total. Em certas formas de realização, o polipeptídeo de IL-2 mutante é uma molécula de IL-2 humana. Em uma forma de realização, o polipeptídeo de IL-2 mutante compreende a sequência da SEQ. ID N° 19 com pelo menos uma mutação de aminoácidos que abole ou reduz a afinidade do polipeptídeo de IL-2 mutante para a subunidade do receptor IL-2, mas preservam a afinidade do polipeptídeo de IL-2 mutante com o receptor de IL-2 de afinidade intermédia, em comparação com um polipeptídeo de IL-2 que compreende a SEQ. ID N°: 19 sem a referida mutação. Em outra forma de realização, o polipeptídeo de IL-2 mutante compreende a sequência da SEQ. ID N°: 29 com pelo menos uma mutação de aminoácidos que elimina ou reduz a afinidade do polipeptídeo de IL-2 mutante para o α-subunidade do receptor de IL-2 mas preservar a afinidade do polipeptídeo de IL-2 mutante com o receptor de IL-2 de afinidade intermediária, em comparação com um polipeptídeo de IL-2 que compreende a SEQ. ID N°: 29 sem a referida mutação.[0101] In certain embodiments, the mutant IL-2 polypeptide is essentially a full-length IL-2 molecule. In certain embodiments, the mutant IL-2 polypeptide is a human IL-2 molecule. In one embodiment, the mutant IL-2 polypeptide comprises the sequence of SEQ. ID NO: 19 with at least one amino acid mutation that abolishes or reduces the affinity of the mutant IL-2 polypeptide for the IL-2 receptor subunit, but preserves the affinity of the mutant IL-2 polypeptide for the intermediate-affinity IL-2 receptor, as compared to an IL-2 polypeptide comprising SEQ. ID NO: 19 without said mutation. In another embodiment, the mutant IL-2 polypeptide comprises the sequence of SEQ. ID NO: 29 having at least one amino acid mutation that eliminates or reduces the affinity of the mutant IL-2 polypeptide for the α-subunit of the IL-2 receptor but preserves the affinity of the mutant IL-2 polypeptide for the intermediate-affinity IL-2 receptor, as compared to an IL-2 polypeptide comprising SEQ. ID NO: 29 without said mutation.
[0102] Em uma forma de realização específica, o polipeptídeo de IL-2 mutante pode desencadear uma ou mais das respostas celulares selecionadas a partir do grupo que consiste em: proliferação em uma célula de linfócitos T ativada, diferenciação em uma atividade de célula T de linfócitos T ativada, células T citotóxicas (CTL), proliferação em uma célula B ativada, diferenciação em uma célula B ativada, proliferação em uma célula natural killer (NK), diferenciação em uma célula NK, secreção de citocinas por uma célula T ativada ou em uma célula NK e Natural Killer ativado por linfócitos/ NK (LAK) citotoxicidade antitumoral.[0102] In a specific embodiment, the mutant IL-2 polypeptide can elicit one or more of the cellular responses selected from the group consisting of: proliferation in an activated T lymphocyte cell, differentiation in an activated T lymphocyte T cell activity, cytotoxic T cells (CTL), proliferation in an activated B cell, differentiation in an activated B cell, proliferation in a natural killer (NK) cell, differentiation in an NK cell, cytokine secretion by an activated T cell or an NK cell, and lymphocyte/NK activated Natural Killer (LAK) antitumor cytotoxicity.
[0103] Em uma forma de realização, o polipeptídeo de IL-2 mutante tem uma capacidade reduzida para induzir a sinalização de IL-2 em células T reguladoras, em comparação com um polipeptídeo de IL-2 de tipo selvagem. Em uma forma de realização, o polipeptídeo de IL-2 mutante induz menor morte celular induzida por ativação (AICD) em células T, em comparação com um polipeptídeo de IL-2 de tipo selvagem. Em uma forma de realização, o polipeptídeo de IL-2 mutante tem um perfil de toxicidade reduzido in vivo, em comparação com um polipeptídeo de IL-2 de tipo selvagem. Em uma forma de realização, o polipeptídeo de IL-2 mutante tem uma semi-vida no soro prolongada, em comparação com um polipeptídeo de IL-2 de tipo selvagem.[0103] In one embodiment, the mutant IL-2 polypeptide has a reduced ability to induce IL-2 signaling in regulatory T cells, compared to a wild-type IL-2 polypeptide. In one embodiment, the mutant IL-2 polypeptide induces less activation-induced cell death (AICD) in T cells, compared to a wild-type IL-2 polypeptide. In one embodiment, the mutant IL-2 polypeptide has a reduced toxicity profile in vivo, compared to a wild-type IL-2 polypeptide. In one embodiment, the mutant IL-2 polypeptide has a prolonged serum half-life, compared to a wild-type IL-2 polypeptide.
[0104] Um polipeptídeo de IL-2 mutante particular útil na invenção compreende quatro substituições de aminoácidos nas posições correspondentes aos resíduos 3, 42, 45 e 72 da IL-2 humana. Substituições específicas de aminoácidos são T3A, F42A, Y45A e L72G. Como demonstrado no documento WO 2012/107417, o referido polipeptídeo de IL-2 mutante quádruplo não exibe ligação detectável a CD25, capacidade reduzida para induzir apoptose em células T, capacidade reduzida para induzir sinalização de IL-2 em células Treg e um perfil de toxicidade reduzido em vivo. Contudo, retém a capacidade de ativar a sinalização de IL-2 em células efetoras, de induzir a proliferação de células efetoras e de gerar IFN-y como uma citocina secundária pelas células NK.[0104] A particular mutant IL-2 polypeptide useful in the invention comprises four amino acid substitutions at positions corresponding to residues 3, 42, 45 and 72 of human IL-2. Specific amino acid substitutions are T3A, F42A, Y45A and L72G. As demonstrated in WO 2012/107417, said quadruple mutant IL-2 polypeptide exhibits no detectable binding to CD25, reduced ability to induce apoptosis in T cells, reduced ability to induce IL-2 signaling in Treg cells and a reduced toxicity profile in vivo. However, it retains the ability to activate IL-2 signaling in effector cells, to induce effector cell proliferation and to generate IFN-γ as a secondary cytokine by NK cells.
[0105] Além disso, o referido polipeptídeo de IL-2 mutante tem ainda outras propriedades vantajosas, tais como hidrofobicidade de superfície reduzida, boa estabilidade e bom rendimento de expressão, como descrito em WO 2012/107417. De forma inesperada, o referido polipeptídeo de IL-2 mutante também proporciona uma semi-vida no soro prolongada, em comparação com a IL-2 de tipo selvagem.[0105] Furthermore, said mutant IL-2 polypeptide has further advantageous properties such as reduced surface hydrophobicity, good stability and good expression yield as described in WO 2012/107417. Unexpectedly, said mutant IL-2 polypeptide also provides a prolonged serum half-life compared to wild-type IL-2.
[0106] Os IL-2 mutantes úteis na invenção, além de possuírem mutações na região de IL-2 que forma a interface de IL-2 com CD25 ou o local de glicosilação, também podem ter uma ou mais mutações na sequência de aminoácidos fora destes regiões. Tais mutações adicionais na IL-2 humana podem proporcionar vantagens adicionais, tais como aumento da expressão ou estabilidade. Por exemplo, a cisteína na posição 125 pode ser substituída por um aminoácido neutro, tal como serina, alanina, treonina ou valina, produzindo IL-2 C125S, IL-2 C125A, IL-2 C125T ou IL-2 C125V respectivamente, como descrito na patente US N° 4,518,584. Como aqui descrito, pode-se também eliminar o resíduo de alanina terminal N de IL-2, originando mutantes como des- A1 C125S ou des-A1 C125A. De forma alternativa ou conjuntamente, o IL-2 mutante pode incluir uma mutação em que a metionina que ocorre normalmente na posição 104 de IL-2 humana do tipo selvagem é substituída por um aminoácido neutro, tal como alanina (ver Patente US 5,206,344). Os mutantes resultantes, por exemplo, des-A1M104A IL-2, des-A1 M104A C125S IL-2, M104A IL-2, M104A C125A IL-2, des-A1 M104A C125A IL-2, ou M104A C125S IL-2 (estes e outros mutantes podem ser encontrados na Patente US N° 5,116,943 e em Weiger et al., Eur J Biochem 180, 295-300 (1989)) podem ser utilizados em conjunto com as mutações particulares de IL-2 da invenção.[0106] Mutant IL-2s useful in the invention, in addition to having mutations in the region of IL-2 that forms the interface of IL-2 with CD25 or the glycosylation site, may also have one or more mutations in the amino acid sequence outside of these regions. Such additional mutations in human IL-2 may provide additional advantages, such as increased expression or stability. For example, the cysteine at position 125 may be replaced with a neutral amino acid, such as serine, alanine, threonine, or valine, producing IL-2 C125S, IL-2 C125A, IL-2 C125T, or IL-2 C125V, respectively, as described in U.S. Patent No. 4,518,584. As described herein, the N-terminal alanine residue of IL-2 may also be deleted, yielding mutants such as des-A1 C125S or des-A1 C125A. Alternatively or in conjunction, the mutant IL-2 may include a mutation in which the methionine normally occurring at position 104 of wild-type human IL-2 is replaced by a neutral amino acid, such as alanine (see U.S. Pat. No. 5,206,344). The resulting mutants, e.g., des-A1M104A IL-2, des-A1 M104A C125S IL-2, M104A IL-2, M104A C125A IL-2, des-A1 M104A C125A IL-2, or M104A C125S IL-2 (these and other mutants can be found in U.S. Pat. No. 5,116,943 and in Weiger et al., Eur J Biochem 180, 295-300 (1989)) may be used in conjunction with the particular IL-2 mutations of the invention.
[0107] Assim, em certas formas de realização, o polipeptídeo de IL- 2 mutante compreende uma mutação de aminoácido adicional em uma posição correspondente ao resíduo 125 da IL-2 humana. Em uma forma de realização, a referida mutação de aminoácidos adicional é a substituição de aminoácidos C125A.[0107] Thus, in certain embodiments, the mutant IL-2 polypeptide comprises an additional amino acid mutation at a position corresponding to residue 125 of human IL-2. In one embodiment, said additional amino acid mutation is the amino acid substitution C125A.
[0108] O técnico será capaz de determinar quais mutações adicionais podem proporcionar vantagens adicionais para o propósito da invenção. Por exemplo, ele irá apreciar as mutações de aminoácidos na sequência de IL-2 que reduzem ou abolem a afinidade de IL-2 ao receptor de IL- 2 de afinidade intermédia, tais como D20T, N88R ou Q126D (ver, por exemplo, US 2007/0036752), pode não ser adequado incluir no polipeptídeo de IL-2 mutante de acordo com a invenção.[0108] One skilled in the art will be able to determine which additional mutations may provide additional advantages for the purpose of the invention. For example, one will appreciate that amino acid mutations in the IL-2 sequence that reduce or abolish the affinity of IL-2 to the intermediate affinity IL-2 receptor, such as D20T, N88R or Q126D (see, for example, US 2007/0036752), may not be suitable for inclusion in the mutant IL-2 polypeptide according to the invention.
[0109] Em uma forma de realização, o polipeptídeo de IL-2 mutante compreende não mais de 12, não mais de 11, não mais de 10, não mais de 9, não mais de 8, não mais de 7, não mais de 6 ou não mais do que 5 mutações de aminoácidos em comparação com a correspondente sequência de IL-2 de tipo selvagem, por exemplo, a sequência da IL-2 humana da SEQ. ID N°: 19. Em uma forma de realização particular, o polipeptídeo de IL-2 mutante compreende não mais do que 5 aminoácidos mutações em comparação com a sequência de IL-2 de tipo selvagem correspondente, por exemplo, a sequência de IL-2 humana da SEQ. ID N°: 19.[0109] In one embodiment, the mutant IL-2 polypeptide comprises no more than 12, no more than 11, no more than 10, no more than 9, no more than 8, no more than 7, no more than 6, or no more than 5 amino acid mutations compared to the corresponding wild-type IL-2 sequence, e.g., the human IL-2 sequence of SEQ. ID NO:19. In a particular embodiment, the mutant IL-2 polypeptide comprises no more than 5 amino acid mutations compared to the corresponding wild-type IL-2 sequence, e.g., the human IL-2 sequence of SEQ. ID NO:19.
[0110] Em uma forma de realização, o polipeptídeo de IL-2 mutante compreende a sequência da SEQ. ID N°: 20. Em uma forma de realização, o polipeptídeo de IL-2 mutante consiste na sequência da SEQ. ID N°: 20.IMUNOCONJUGADOS[0110] In one embodiment, the mutant IL-2 polypeptide comprises the sequence of SEQ. ID NO: 20. In one embodiment, the mutant IL-2 polypeptide consists of the sequence of SEQ. ID NO: 20.IMMUNOCONJUGATES
[0111] Os imunoconjugados como aqui descritos compreendem uma molécula de IL e um anticorpo. Tais imunoconjugados aumentam significativamente a eficácia da terapia com IL-2, direcionando diretamente IL-2, por exemplo, para um microambiente tumoral. De acordo com a invenção, um anticorpo que compreende d no imunoconjugado pode ser um anticorpo completo ou imunoglobulina, ou uma sua porção ou variante que tenha uma função biológica, tal como afinidade de ligação específica ao antígeno.[0111] Immunoconjugates as described herein comprise an IL molecule and an antibody. Such immunoconjugates significantly enhance the efficacy of IL-2 therapy by directly targeting IL-2, for example, to a tumor microenvironment. According to the invention, an antibody comprising an immunoconjugate may be a whole antibody or immunoglobulin, or a portion or variant thereof that has a biological function, such as specific antigen binding affinity.
[0112] Os benefícios gerais da terapia com imunoconjugados são facilmente evidentes. Por exemplo, um anticorpo compreendido em um imunoconjugado reconhece um epítopo específico do tumor e resulta no direcionamento da molécula de imunoconjugado para o local do tumor. Por isso, concentrações elevadas de IL-2 podem ser distribuídas no microambiente do tumor, resultando assim na ativação e proliferação de uma variedade de células efetoras imunes aqui mencionadas utilizando uma dose muito menor do imunoconjugado do que seria necessário para a IL-2 não conjugada. Além disso, uma vez que a aplicação de IL-2 na forma de imunoconjugados permite doses mais baixas da própria citocina, o potencial para efeitos colaterais indesejáveis da IL-2 é restrito, e direcionando a IL-2 para um sítio específico no corpo por meio de um imunoconjugado também pode resultar em uma redução da exposição sistêmica e, portanto, menos efeitos colaterais do que o obtido com IL-2 não conjugada. Além disso, o aumento da meia-vida circulante de um imunoconjugado comparado à IL-2 não conjugada contribui para a eficácia do imunoconjugado. No entanto, essa característica dos imunoconjugados de IL-2 pode agravar novamente os efeitos colaterais potenciais da molécula de IL-2: Devido à meia-vida significativamente mais longa de imunoconjugado de IL-2 na corrente sanguínea em relação à IL-2 não conjugada, a probabilidade de IL-2 ou outras porções da molécula de proteína de fusão para ativar componentes, de forma geral, presentes na vasculatura é aumentada. A mesma preocupação aplica-se a outras proteínas de fusão que contém IL-2 fundidas com outra fração, tal como Fc ou albumina, resultando em uma semi-vida prolongada de IL-2 na circulação. Por conseguinte, um imunoconjugado que compreende um polipeptídeo de IL-2 mutante, tal como aqui descrito e em WO, 2012/ 107417, com toxicidade reduzida em comparação com as formas de tipo selvagem de IL- 2, é em particular vantajoso.[0112] The general benefits of immunoconjugate therapy are readily apparent. For example, an antibody comprised in an immunoconjugate recognizes a specific tumor epitope and results in targeting of the immunoconjugate molecule to the tumor site. Therefore, high concentrations of IL-2 can be delivered to the tumor microenvironment, thereby resulting in the activation and proliferation of a variety of immune effector cells mentioned herein using a much lower dose of the immunoconjugate than would be required for unconjugated IL-2. Furthermore, since application of IL-2 in the form of immunoconjugates allows for lower doses of the cytokine itself, the potential for undesirable side effects of IL-2 is limited, and targeting IL-2 to a specific site in the body via an immunoconjugate may also result in reduced systemic exposure and therefore fewer side effects than would be achieved with unconjugated IL-2. Furthermore, the increased circulating half-life of an immunoconjugate compared to unconjugated IL-2 contributes to the efficacy of the immunoconjugate. However, this feature of IL-2 immunoconjugates may again aggravate the potential side effects of the IL-2 molecule: Due to the significantly longer half-life of IL-2 immunoconjugate in the bloodstream relative to unconjugated IL-2, the likelihood of IL-2 or other portions of the fusion protein molecule to activate components generally present in the vasculature is increased. The same concern applies to other fusion proteins that contain IL-2 fused to another moiety, such as Fc or albumin, resulting in a prolonged half-life of IL-2 in the circulation. Therefore, an immunoconjugate comprising a mutant IL-2 polypeptide, as described herein and in WO, 2012/107417, with reduced toxicity compared to wild-type forms of IL-2, is particularly advantageous.
[0113] Como acima descrito, direcionar IL-2 diretamente para células efetoras imunes em vez de células tumorais pode ser vantajoso para imunoterapia com IL-2.[0113] As described above, targeting IL-2 directly to immune effector cells rather than tumor cells may be advantageous for IL-2 immunotherapy.
[0114] Por conseguinte, a invenção proporciona um polipeptídeo de IL-2 mutante como descrito anteriormente e um anticorpo que se liga a PD-1. Em uma forma de realização, o polipeptídeo de IL-2 mutante e o anticorpo formam uma proteína de fusão, isto é, o polipeptídeo de IL-2 mutante partilha uma ligação peptídica com o anticorpo. Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade. Em uma forma de realização específica, o polipeptídeo de IL-2 mutante é fundido no seu aminoácido amino-terminal ao aminoácido carboxi- terminal de uma das subunidades do domínio Fc, de forma opcional, através de um peptídeo de ligação. Em algumas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo de comprimento total. Em algumas formas de realização, o anticorpo é uma molécula de imunoglobulina, em particular uma molécula de classe de imunoglobulinas IgG, mais em particular uma IgG 1 molécula subclasse de imunoglobulina. Em tal forma de realização, o polipeptídeo de IL-2 mutante partilha uma ligação peptídica amino-terminal com uma das cadeias pesadas de imunoglobulina. Em certas formas de realização, o anticorpo é um fragmento de anticorpo. Em algumas formas de realização são o anticorpo é uma molécula Fab ou uma molécula de scFv. Em uma forma de realização o anticorpo é uma molécula de Fab. Em outra forma de realização, o anticorpo é uma molécula scFv. O imunoconjugado também pode compreender mais do que um anticorpo. Quando mais de um anticorpo está compreendido no imunoconjugado, por exemplo, um primeiro e um segundo anticorpo, cada anticorpo pode ser independentemente selecionado a partir de várias formas de anticorpos e fragmentos de anticorpos. Por exemplo, o primeiro anticorpo pode ser uma molécula de Fab e o segundo anticorpo pode ser uma molécula de scFv. Em uma forma de realização específica, cada um dos referidos primeiro e segundo segundos anticorpos uma molécula scFv ou cada um dos referidos primeiro e segundo segundos anticorpos uma molécula de Fab. Em uma forma de realização particular, cada um dos referidos primeiro e segundo segundos anticorpos uma molécula de Fab. Em uma forma de realização cada um dos referidos primeiro e segundo anticorpos ligam-se a PD-1.FORMATOS DE IMUNOCONJUGADOS[0114] Accordingly, the invention provides a mutant IL-2 polypeptide as described above and an antibody that binds to PD-1. In one embodiment, the mutant IL-2 polypeptide and the antibody form a fusion protein, i.e., the mutant IL-2 polypeptide shares a peptide bond with the antibody. In some embodiments, the antibody comprises an Fc domain composed of a first and a second subunit. In a specific embodiment, the mutant IL-2 polypeptide is fused at its amino-terminal amino acid to the carboxy-terminal amino acid of one of the subunits of the Fc domain, optionally via a linker peptide. In some embodiments, the antibody is a full-length antibody. In some embodiments, the antibody is an immunoglobulin molecule, in particular an IgG class immunoglobulin molecule, more in particular an IgG subclass 1 immunoglobulin molecule. In such an embodiment, the mutant IL-2 polypeptide shares an amino-terminal peptide bond with one of the immunoglobulin heavy chains. In certain embodiments, the antibody is an antibody fragment. In some embodiments, the antibody is a Fab molecule or a scFv molecule. In one embodiment, the antibody is a Fab molecule. In another embodiment, the antibody is a scFv molecule. The immunoconjugate may also comprise more than one antibody. When more than one antibody is comprised in the immunoconjugate, e.g., a first and a second antibody, each antibody may be independently selected from various antibody forms and antibody fragments. For example, the first antibody may be a Fab molecule and the second antibody may be a scFv molecule. In a specific embodiment, each of said first and second antibodies comprises a scFv molecule or each of said first and second antibodies comprises a Fab molecule. In a particular embodiment, each of said first and second antibodies comprises a Fab molecule. In one embodiment each of said first and second antibodies bind to PD-1. IMMUNOCONJUGATE FORMATS
[0115] Exemplos de formatos de imunoconjugados são descritos na publicação PCT N° WO 2011/020783, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Estes imunoconjugados compreendem pelo menos dois anticorpos. Assim, em uma forma de realização, o imunoconjugado de acordo com a presente invenção compreende um polipeptídeo de IL-2 mutante, como aqui descrito, e pelo menos um primeiro e um segundo anticorpo. Em uma forma de realização particular, o referido primeiro e segundo anticorpo são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste de uma molécula Fv, em particular uma molécula scFv e uma molécula Fab. Em uma forma de realização específica, o referido polipeptídeo de IL-2 mutante partilha uma ligação peptídica do terminal amino ou carboxila com o referido primeiro anticorpo e o referido segundo anticorpo partilha uma ligação peptídica do terminal amino ou carboxila com i) o polipeptídeo de IL-2 mutante ou ii) o primeiro anticorpo. Em uma forma de realização particular, o imunoconjugado consiste essencialmente em um polipeptídeo de IL-2 mutante e em primeiro e segundo anticorpos, em particular moléculas Fab, ligados por uma ou mais sequências de ligações. Tais formatos têm a vantagem de se ligarem com alta afinidade ao antígeno alvo (PD-1), mas fornecem apenas ligação monomérica ao receptor de IL-2, evitando assim o direcionamento do imunoconjugado ao receptor de IL-2 contendo células imunes em outros locais o site de destino. Em uma forma de realização particular, um polipeptídeo de IL-2 mutante partilha uma ligação peptídica terminal carboxila com um primeiro anticorpo, em particular uma primeira molécula Fab, e partilha ainda uma ligação peptídica amino-terminal com um segundo anticorpo, em particular uma segunda molécula Fab. Em outra forma de realização, um primeiro anticorpo, em particular uma primeira molécula Fab, partilha uma ligação peptídica terminal carboxila com um polipeptídeo de IL-2 mutante e partilha ainda uma ligação peptídica amino-terminal com um segundo anticorpo, em particular uma segunda molécula Fab. Em outra forma de realização, um primeiro anticorpo, em particular uma primeira molécula de Fab, partilha uma ligação peptídica amino-terminal com um primeiro polipeptídeo de IL-2 mutante e partilha ainda um peptídeo terminal carboxila com um segundo anticorpo, em particular uma segunda molécula Fab. Em uma forma de realização particular, um polipeptídeo de IL-2 mutante partilha uma ligação peptídica terminal carboxila com uma primeira região variável de cadeia pesada e partilha ainda uma ligação peptídica amino-terminal com uma segunda região variável de cadeia pesada. Em outra forma de realização, um polipeptídeo de IL- 2 mutante partilha uma ligação peptídica terminal carboxila com uma primeira região variável de cadeia leve e partilha ainda uma ligação peptídica amino- terminal com uma segunda região variável de cadeia leve. Em outra forma de realização, uma primeira região variável de cadeia pesada ou leve unida por uma ligação peptídica terminal carboxílica a um polipeptídeo de IL-2 mutante e ainda ligada por uma ligação peptídica amino-terminal a uma segunda região variável de cadeia pesada ou leve. Em outra forma de realização, uma primeira região variável de cadeia pesada ou leve unida por uma ligação peptídica amino- terminal a um polipeptídeo de IL-2 mutante e ainda ligada por uma ligação peptídica terminal carboxila a uma segunda região variável de cadeia pesada ou leve. Em uma forma de realização, um polipeptídeo de IL-2 mutante partilha uma ligação peptídica terminal carboxila com uma primeira cadeia pesada ou leve de Fab e partilha ainda uma ligação peptídica amino-terminal com uma segunda cadeia pesada ou leve de Fab. Em outra forma de realização, uma primeira cadeia pesada ou leve de Fab partilha uma ligação peptídica terminal carboxila com um polipeptídeo de IL-2 mutante e partilha ainda uma ligação peptídica amino-terminal com uma segunda cadeia pesada ou leve de Fab. Em outras formas de realização, uma primeira cadeia pesada ou leve de Fab partilha uma ligação peptídica amino-terminal com um polipeptídeo de IL-2 mutante e partilha ainda uma ligação peptídica terminal carboxila com uma segunda cadeia pesada ou leve de Fab. Em uma forma de realização, o imunoconjugado compreende um polipeptídeo de IL-2 mutante que partilha uma ligação peptídica amino- terminal com uma ou mais moléculas scFv e partilha adicionalmente uma ligação peptídica terminal carboxila com uma ou mais moléculas scFv.[0115] Examples of immunoconjugate formats are described in PCT Publication No. WO 2011/020783, which is incorporated herein by reference in its entirety. These immunoconjugates comprise at least two antibodies. Thus, in one embodiment, the immunoconjugate according to the present invention comprises a mutant IL-2 polypeptide as described herein and at least a first and a second antibody. In a particular embodiment, said first and second antibody are independently selected from the group consisting of an Fv molecule, in particular an scFv molecule, and a Fab molecule. In a specific embodiment, said mutant IL-2 polypeptide shares an amino- or carboxyl-terminal peptide bond with said first antibody and said second antibody shares an amino- or carboxyl-terminal peptide bond with i) the mutant IL-2 polypeptide or ii) the first antibody. In a particular embodiment, the immunoconjugate consists essentially of a mutant IL-2 polypeptide and first and second antibodies, in particular Fab molecules, linked by one or more linker sequences. Such formats have the advantage of binding with high affinity to the target antigen (PD-1), but provide only monomeric binding to the IL-2 receptor, thereby preventing targeting of the immunoconjugate to IL-2 receptor containing immune cells elsewhere than the target site. In a particular embodiment, a mutant IL-2 polypeptide shares a carboxyl-terminal peptide bond with a first antibody, in particular a first Fab molecule, and further shares an amino-terminal peptide bond with a second antibody, in particular a second Fab molecule. In another embodiment, a first antibody, in particular a first Fab molecule, shares a carboxyl-terminal peptide bond with a mutant IL-2 polypeptide and further shares an amino-terminal peptide bond with a second antibody, in particular a second Fab molecule. In another embodiment, a first antibody, in particular a first Fab molecule, shares an amino-terminal peptide bond with a first mutant IL-2 polypeptide and further shares a carboxyl-terminal peptide bond with a second antibody, in particular a second Fab molecule. In a particular embodiment, a mutant IL-2 polypeptide shares a carboxyl-terminal peptide bond with a first heavy chain variable region and further shares an amino-terminal peptide bond with a second heavy chain variable region. In another embodiment, a mutant IL-2 polypeptide shares a carboxyl-terminal peptide bond with a first light chain variable region and further shares an amino-terminal peptide bond with a second light chain variable region. In another embodiment, a first heavy or light chain variable region is joined by a carboxyl-terminal peptide bond to a mutant IL-2 polypeptide and further linked by an amino-terminal peptide bond to a second heavy or light chain variable region. In another embodiment, a first heavy or light chain variable region is joined by an amino-terminal peptide bond to a mutant IL-2 polypeptide and further linked by a carboxyl-terminal peptide bond to a second heavy or light chain variable region. In one embodiment, a mutant IL-2 polypeptide shares a carboxyl-terminal peptide bond with a first Fab heavy or light chain and further shares an amino-terminal peptide bond with a second Fab heavy or light chain. In another embodiment, a first Fab heavy or light chain shares a carboxyl-terminal peptide bond with a mutant IL-2 polypeptide and further shares an amino-terminal peptide bond with a second Fab heavy or light chain. In other embodiments, a first Fab heavy or light chain shares an amino-terminal peptide bond with a mutant IL-2 polypeptide and further shares a carboxyl-terminal peptide bond with a second Fab heavy or light chain. In one embodiment, the immunoconjugate comprises a mutant IL-2 polypeptide that shares an amino-terminal peptide bond with one or more scFv molecules and further shares a carboxyl-terminal peptide bond with one or more scFv molecules.
[0116] Os formatos de forma específica adequados para os imunoconjugados de acordo com a presente invenção compreendem, no entanto, uma molécula de imunoglobulina como anticorpo. Tais formatos de imunoconjugados estão descritos no documento WO 2012/146628, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.[0116] Suitable form-specific formats for the immunoconjugates according to the present invention however comprise an immunoglobulin molecule as antibody. Such immunoconjugate formats are described in WO 2012/146628, which is incorporated herein by reference in its entirety.
[0117] Por conseguinte, em particular, forma de realização, o imunoconjugado compreende um polipeptídeo de IL-2 mutante, tal como aqui descrito e uma molécula de imunoglobulina que se liga a PD-1, em particular uma molécula de IgG, mais em particular uma IgG 1 molécula. Em uma forma de realização, o imunoconjugado compreende não mais do que um polipeptídeo de IL-2 mutante. Em uma forma de realização, a molécula de imunoglobulina é humana. Em uma forma de realização, a molécula de imunoglobulina compreende uma região constante humano, por exemplo, um domínio CH1, CH2, CH3 e/ ou CL humano. Em uma forma de realização, a imunoglobulina compreende um domínio Fc humano, em particular um domínio IgG 1 Fc humano. Em uma forma de realização, o polipeptídeo de IL-2 mutante partilha uma ligação peptídica terminal amino ou carboxila com a molécula de imunoglobulina. Em uma forma de realização, o imunoconjugado consiste essencialmente de um IL-2 mutante polipeptídeo e uma molécula de imunoglobulina, em particular uma molécula de IgG, mais em particular uma IgG 1 molécula, juntou-se por uma ou mais sequências de ligação. Em uma forma de realização específica, o polipeptídeo de IL-2 mutante é fundido no seu aminoácido amino-terminal ao aminoácido carboxi-terminal de uma das cadeias pesadas de imunoglobulina, de forma opcional, através de um peptídeo de ligação.[0117] Accordingly, in a particular embodiment, the immunoconjugate comprises a mutant IL-2 polypeptide as described herein and an immunoglobulin molecule that binds to PD-1, in particular an IgG molecule, more in particular an IgG 1 molecule. In one embodiment, the immunoconjugate comprises no more than one mutant IL-2 polypeptide. In one embodiment, the immunoglobulin molecule is human. In one embodiment, the immunoglobulin molecule comprises a human constant region, e.g., a human CH1, CH2, CH3 and/or CL domain. In one embodiment, the immunoglobulin comprises a human Fc domain, in particular a human IgG 1 Fc domain. In one embodiment, the mutant IL-2 polypeptide shares an amino- or carboxyl-terminal peptide bond with the immunoglobulin molecule. In one embodiment, the immunoconjugate consists essentially of a mutant IL-2 polypeptide and an immunoglobulin molecule, in particular an IgG molecule, more in particular an IgG 1 molecule, joined by one or more linker sequences. In a specific embodiment, the mutant IL-2 polypeptide is fused at its amino-terminal amino acid to the carboxy-terminal amino acid of one of the immunoglobulin heavy chains, optionally via a linker peptide.
[0118] O polipeptídeo de IL-2 mutante pode ser fundido ao anticorpo diretamente ou através de um peptídeo de ligação, que compreende um ou mais aminoácidos, tipicamente cerca de 2-20 aminoácidos. Os peptídeos de ligações são conhecidos na técnica e são aqui descritos. Os peptídeos de ligação não imunogênicos adequados incluem, por exemplo, peptídeos de ligação (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n ou G4(SG4)n. “N” é, de forma geral, um inteiro de 1 a 10, tipicamente de 2 a 4. Em uma forma de realização, o peptídeo de ligação tem um comprimento de pelo menos 5 aminoácidos, em uma forma de realização, um comprimento de 5 a 100, em uma outra forma de realização de 10 para 50 aminoácidos. Em uma forma de realização particular, o peptídeo de ligação tem um comprimento de 15 aminoácidos. Em uma forma de realização o de ligação peptídeo é ((GxS)n or (GxS)nGm com G = glicina, s =Serina, e (x = 3, n = 3, 4, 5 ou 6, e m = 0, 1,2 ou 3) ou (x = 4, n = 2, 3, 4 ou 5 e m = 0, 1,2 ou 3), em uma forma de realização x = 4 en = 2 ou 3, em uma outra forma de realização x = 4 e n = 3. Em uma determinada forma de realização o de ligação peptídeo é (G4S)3 (SEQ. ID N°: 21). Em uma forma de realização, o peptídeo de ligação tem (ou consiste na) sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 21.[0118] The mutant IL-2 polypeptide can be fused to the antibody directly or via a linker peptide comprising one or more amino acids, typically about 2-20 amino acids. Linker peptides are known in the art and are described herein. Suitable non-immunogenic linker peptides include, for example, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n or G4(SG4)n linker peptides. "N" is generally an integer from 1 to 10, typically from 2 to 4. In one embodiment, the linker peptide is at least 5 amino acids long, in one embodiment from 5 to 100, in another embodiment from 10 to 50 amino acids long. In a particular embodiment, the linker peptide is 15 amino acids long. In one embodiment the binding peptide is ((GxS)n or (GxS)nGm with G = glycine, s = Serine, and (x = 3, n = 3, 4, 5 or 6, and m = 0, 1,2 or 3) or (x = 4, n = 2, 3, 4 or 5 and m = 0, 1,2 or 3), in one embodiment x = 4 and n = 2 or 3, in another embodiment x = 4 and n = 3. In a certain embodiment the binding peptide is (G4S)3 (SEQ. ID NO:21). In one embodiment, the binding peptide has (or consists of) the amino acid sequence of SEQ. ID NO:21.
[0119] Em uma forma de realização particular, o imunoconjugado compreende uma molécula IL-2 mutante e uma molécula de imunoglobulina, em particular uma IgG uma molécula de imunoglobulina subclasse, que se liga a PD- 1, em que o mutante molécula de IL-2 é fundido no seu aminoácido amino- terminal ao aminoácido carboxi-terminal de uma das cadeias pesadas de imunoglobulina através do peptídeo de ligação de SEQ. ID N°: 21.[0119] In a particular embodiment, the immunoconjugate comprises a mutant IL-2 molecule and an immunoglobulin molecule, in particular an IgG subclass immunoglobulin molecule, that binds to PD-1, wherein the mutant IL-2 molecule is fused at its amino-terminal amino acid to the carboxy-terminal amino acid of one of the immunoglobulin heavy chains via the linker peptide of SEQ ID NO: 21.
[0120] Em uma forma de realização particular, o imunoconjugado compreende uma molécula de IL-2 mutante e um anticorpo que se liga a PD-1, em que o anticorpo compreende um domínio Fc, em particular um domínio IgG 1 Fc humano, composto por uma primeira e uma segunda subunidade e a molécula de IL-2 mutante é fundida no seu aminoácido amino-terminal ao aminoácido carboxi-terminal de uma das subunidades do domínio Fc através do peptídeo de ligação de SEQ. ID N°: 21.ANTICORPOS PD-1[0120] In a particular embodiment, the immunoconjugate comprises a mutant IL-2 molecule and an antibody that binds to PD-1, wherein the antibody comprises an Fc domain, in particular a human IgG 1 Fc domain, composed of a first and a second subunit and the mutant IL-2 molecule is fused at its amino-terminal amino acid to the carboxy-terminal amino acid of one of the subunits of the Fc domain via the linker peptide of SEQ ID NO: 21. PD-1 ANTIBODIES
[0121] O anticorpo compreendido no imunoconjugado da invenção liga-se a PD-1, em particular a PD-1 humano e capaz de dirigir o polipeptídeo de IL-2 mutante para um local alvo em que PD-1 expresso, em particular para uma célula T que expressa PD-1, por exemplo, associado a um tumor.[0121] The antibody comprised in the immunoconjugate of the invention binds to PD-1, in particular to human PD-1 and is capable of directing the mutant IL-2 polypeptide to a target site where PD-1 is expressed, in particular to a T cell expressing PD-1, for example associated with a tumor.
[0122] Anticorpos PD-1 adequados que podem ser utilizados no imunoconjugado da invenção são descritos no pedido de patente PCT N° PCT/ EP2016/ 073248, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.[0122] Suitable PD-1 antibodies that may be used in the immunoconjugate of the invention are described in PCT Patent Application No. PCT/EP2016/073248, which is incorporated herein by reference in its entirety.
[0123] O imunoconjugado da invenção pode compreender dois ou mais anticorpos, que podem ligar-se ao mesmo ou a antígenos diferentes. Em formas de realização particulares, contudo, cada um destes anticorpos liga-se a PD-1. Em uma forma de realização, o anticorpo compreendido no imunoconjugado da invenção é monoespecífico. Em uma forma de realização particular, o imunoconjugado compreende um anticorpo monoespecífico único, em particular uma molécula de imunoglobulina monoespecífica.[0123] The immunoconjugate of the invention may comprise two or more antibodies, which may bind to the same or different antigens. In particular embodiments, however, each of these antibodies binds to PD-1. In one embodiment, the antibody comprised in the immunoconjugate of the invention is monospecific. In a particular embodiment, the immunoconjugate comprises a single monospecific antibody, in particular a monospecific immunoglobulin molecule.
[0124] O anticorpo pode ser qualquer tipo de anticorpo ou um fragmento do mesmo que retenha a ligação específica a PD-1, em particular a PD-1 humano. Os fragmentos de anticorpos incluem, mas não estão limitados a fragmentos de moléculas Fv, molécula scFv, molécula Fab e moléculas F(ab')2. Em formas de realização particulares, no entanto, o anticorpo é um anticorpo de comprimento total. Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende um domínio Fc, composto por uma primeira e uma segunda subunidade. Em algumas formas de realização, o anticorpo é uma imunoglobulina, em particular uma classe de IgG, mais em particular uma imunoglobulina de subclasse de IgG1.[0124] The antibody may be any type of antibody or a fragment thereof that retains specific binding to PD-1, in particular human PD-1. Antibody fragments include, but are not limited to, fragments of Fv molecules, scFv molecule, Fab molecule, and F(ab')2 molecules. In particular embodiments, however, the antibody is a full-length antibody. In some embodiments, the antibody comprises an Fc domain, composed of a first and a second subunit. In some embodiments, the antibody is an immunoglobulin, in particular an IgG class, more in particular an IgG1 subclass immunoglobulin.
[0125] Em algumas formas de realização, o anticorpo é umanticorpo monoclonal.[0125] In some embodiments, the antibody is a monoclonal antibody.
[0126] Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 1,uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 2,uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N° 3,uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N° 7 nasposições 71-73 de acordo com a numeração de Kabat, uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N° 4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 5 e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 6.[0126] In some embodiments, the antibody comprises an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:2, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:3, an FR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:7 at positions 71-73 according to Kabat numbering, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:4, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:5, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:6.
[0127] Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende (a)uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidoscompreende a sequência de aminoácidoscompreende a sequência de aminoácidosda SEQ. ID N°: 1, uma HVR-H2 queda SEQ. ID N°: 2, uma HVR-H3 queda SEQ. ID N°: 3 e uma FR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 7 nas posições 71-73 de acordo com a numeração de Kabat, e (b) uma cadeia leve região variável (VL) que compreende uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 5, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 6. Em algumas formas de realização, a região variável de cadeia pesada e/ ou leve é uma região variável humanizada. Em algumas formas de realização, a região variável de cadeia pesada e/ ou leve compreende regiões estruturais humanas (FR).[0127] In some embodiments, the antibody comprises (a) a heavy chain variable region (VH) comprising an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:1, an HVR-H2 falling SEQ. ID NO:2, an HVR-H3 falling SEQ. ID NO:3, and an FR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:7 at positions 71-73 according to Kabat numbering, and (b) a light chain variable region (VL) comprising an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:4, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:5, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 6. In some embodiments, the heavy and/or light chain variable region is a humanized variable region. In some embodiments, the heavy and/or light chain variable region comprises human framework regions (FR).
[0128] Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 8, uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 9, uma HVR- H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N° 10, uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N° 11, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N° 12 e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 13.[0128] In some embodiments, the antibody comprises an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:8, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:9, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:10, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:11, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:12, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:13.
[0129] Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 8, uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 9 e uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 10, e (b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 11, uma HVR- L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 12, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 13. Em algumas formas de realização, a região variável de cadeia pesada e/ ou leve é uma região variável humanizada. Em algumas formas de realização, a região variável de cadeia pesada e/ ou leve compreende regiões estruturais humanas (FR).[0129] In some embodiments, the antibody comprises (a) a heavy chain variable region (VH) comprising an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:8, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:9, and an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:10, and (b) a light chain variable region (VL) comprising an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:11, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:12, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:13. In some embodiments, the heavy and/or light chain variable region is a humanized variable region. In some embodiments, the heavy and/or light chain variable region comprises human framework (FR) regions.
[0130] Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 14. Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos que pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de o grupo que consiste em SEQ. ID N°: 15, SEQ. ID N°: 16, SEQ. ID N°: 17 e SEQ. ID N°: 18. Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica ao aminoácido sequência da SEQ. ID N°: 14 e (b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ. ID N°: 15, SEQ. ID N°: 16, SEQ. ID N°: 17 e SEQ. ID N°: 18.[0130] In some embodiments, the antibody comprises a heavy chain variable region (VH) that comprises an amino acid sequence that is at least about 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% identical to the amino acid sequence of SEQ. ID NO:14. In some embodiments, the antibody comprises a light chain variable region (VL) that comprises an amino acid sequence that is at least about 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ. ID NO:15, SEQ. ID NO:16, SEQ. ID NO:17, and SEQ. ID NO: 18. In some embodiments, the antibody comprises (a) a heavy chain variable region (VH) comprising an amino acid sequence that is at least about 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 14 and (b) a light chain variable region (VL) comprising an amino acid sequence that is at least about 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ. ID NO: 15, SEQ. ID NO: 16, SEQ. ID NO: 17 and SEQ. ID NO: 18.
[0131 ] Em uma forma de realização particular, o anticorpo compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 14 e (b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 15.[0131] In a particular embodiment, the antibody comprises (a) a heavy chain variable region (VH) comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:14 and (b) a light chain variable region (VL) comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:15.
[0132] Em algumas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo humanizado. Em uma forma de realização, o anticorpo é uma molécula de imunoglobulina que compreende uma região constante humano, em particular uma molécula de imunoglobulina de classe de IgG que compreende um domínio CH1, CH2, CH3 e/ ou CL humano. Sequências de exemplo de domínios constantes humanos são dadas em SEQ. ID N°s 31 e 32 (domínios CL kappa e lambda humanos, respectivamente) e SEQ. ID N°: 33 (domínios constantes CH1-CH2-CH3 constantes da cadeia pesada de IgG1). Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende uma região constante da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 31 ou SEQ. ID N°: 32, em particular a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 31. Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende uma região constante da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 33. Em particular, a constante da cadeia pesada região pode compreender mutações de aminoácidos no domínio Fc como aqui descrito.DOMÍNIO FC[0132] In some embodiments, the antibody is a humanized antibody. In one embodiment, the antibody is an immunoglobulin molecule comprising a human constant region, in particular an IgG class immunoglobulin molecule comprising a human CH1, CH2, CH3 and/or CL domain. Exemplary sequences of human constant domains are given in SEQ. ID NO:31 and 32 (human kappa and lambda CL domains, respectively) and SEQ. ID NO:33 (IgG1 heavy chain constant CH1-CH2-CH3 domains). In some embodiments, the antibody comprises a light chain constant region comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:31 or SEQ. ID NO:32, in particular the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 31. In some embodiments, the antibody comprises a heavy chain constant region comprising an amino acid sequence that is at least about 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33. In particular, the heavy chain constant region may comprise amino acid mutations in the Fc domain as described herein. FC DOMAIN
[0133] Em formas de realização particulares, o anticorpo compreendido nos imunoconjugados de acordo com a invenção compreende um domínio Fc, composto por uma primeira e uma segunda subunidade. O domínio Fc de um anticorpo consiste em um par de cadeias polipeptídicas que compreendem domínios da cadeia pesada de uma molécula de imunoglobulina. Por exemplo, o domínio Fc de uma molécula de imunoglobulina G (IgG) é um dímero, cada subunidade da qual compreende os domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 IgG. As duas subunidades do domínio Fc são capazes de associação estável entre si. Em uma forma de realização, o imunoconjugado da invenção compreende não mais do que um domínio Fc.[0133] In particular embodiments, the antibody comprised in the immunoconjugates according to the invention comprises an Fc domain, composed of a first and a second subunit. The Fc domain of an antibody consists of a pair of polypeptide chains comprising domains of the heavy chain of an immunoglobulin molecule. For example, the Fc domain of an immunoglobulin G (IgG) molecule is a dimer, each subunit of which comprises the CH2 and CH3 IgG heavy chain constant domains. The two subunits of the Fc domain are capable of stable association with each other. In one embodiment, the immunoconjugate of the invention comprises no more than one Fc domain.
[0134] Em uma forma de realização, o domínio Fc do anticorpo compreendido no imunoconjugado é um domínio IgG Fc. Em uma forma de realização particular, o domínio Fc é um domínio IgG 1 Fc. Em outra forma de realização o domínio Fc é uma IgG 4 domínio Fc. Em uma forma de realização mais específica, o domínio Fc é uma IgG 4 domínio Fc que compreende uma substituição de aminoácido na posição (Kabat S228 índice UE de numeração), em particular a substituição de aminoácidos S228P. Esta substituição de aminoácido reduz in vivo Fab troca braço de IgG de 4 anticorpos (ver Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). Em uma outra forma de realização particular, o domínio Fc é um domínio Fc humano. Em uma forma de realização ainda mais particular, o domínio Fc é um domínio IgG 1 Fc humano. Uma sequência de exemplo de uma IgG humano 1 Fc região é dada na SEQ. ID N°: 30.MODIFICAÇÕES DO DOMÍNIO FC PROMOVENDO A HETERODIMERIZAÇÃO[0134] In one embodiment, the Fc domain of the antibody comprised in the immunoconjugate is an IgG Fc domain. In a particular embodiment, the Fc domain is an IgG 1 Fc domain. In another embodiment the Fc domain is an IgG 4 Fc domain. In a more specific embodiment, the Fc domain is an IgG 4 Fc domain comprising an amino acid substitution at position (Kabat EU numbering index S228), in particular the amino acid substitution S228P. This amino acid substitution reduces in vivo Fab arm switching of IgG 4 antibodies (see Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). In another particular embodiment, the Fc domain is a human Fc domain. In an even more particular embodiment, the Fc domain is a human IgG 1 Fc domain. An exemplary sequence of a human IgG 1 Fc region is given in SEQ. ID NO: 30. FC DOMAIN MODIFICATIONS PROMOTING HETERODIMERIZATION
[0135] Os imunoconjugados de acordo com a invenção compreendem um polipeptídeo de IL-2 mutante, em particular um polipeptídeo de IL-2 mutante único (não mais do que um), fundido a uma ou outra das duas subunidades do domínio Fc, assim as duas subunidades do domínio Fc são tipicamente compreendidos em duas cadeias polipeptídicas não idênticas. A co expressão recombinante destes polipeptídeos e a dimerização subsequente conduz a várias combinações possíveis dos dois polipeptídeos. Para melhorar o rendimento e pureza do imunoconjugado na produção recombinante, será assim vantajoso introduzir no domínio Fc do anticorpo uma modificação que promova a associação dos polipeptídeos desejados.[0135] The immunoconjugates according to the invention comprise a mutant IL-2 polypeptide, in particular a single mutant IL-2 polypeptide (not more than one), fused to one or other of the two subunits of the Fc domain, so that the two subunits of the Fc domain are typically comprised of two non-identical polypeptide chains. Recombinant co-expression of these polypeptides and subsequent dimerization leads to various possible combinations of the two polypeptides. To improve the yield and purity of the immunoconjugate in recombinant production, it will therefore be advantageous to introduce into the Fc domain of the antibody a modification that promotes the association of the desired polypeptides.
[0136] Consequentemente, em formas de realização particulares, o domínio Fc do anticorpo compreendido no imunoconjugado de acordo com a invenção compreende uma modificação promovendo a associação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc. O local da interação proteína-proteína mais extensa entre as duas subunidades de um domínio Fc de IgG humano está no domínio CH3 do domínio Fc. Assim, em uma forma de realização, a referida modificação está no domínio CH3 do domínio Fc.[0136] Accordingly, in particular embodiments, the Fc domain of the antibody comprised in the immunoconjugate according to the invention comprises a modification promoting the association of the first and second subunits of the Fc domain. The site of the most extensive protein-protein interaction between the two subunits of a human IgG Fc domain is in the CH3 domain of the Fc domain. Thus, in one embodiment, said modification is in the CH3 domain of the Fc domain.
[0137] Existem diversas abordagens para modificações no domínio CH3 do domínio Fc, de modo a impor a heterodimerização, que estão bem descritas, por exemplo, nos documentos WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291. Tipicamente, em todas essas abordagens, o domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e o domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc s ambos manipulados de um modo complementar, de modo que cada domínio CH3 (ou a cadeia pesada compreendendo-o) pode já não se homodimeriza, mas é forçado a heterodimerizar com o outro domínio CH3 modificado complementarmente (de modo que o primeiro e o segundo domínio CH3 se heterodimerizam e não se formam homodímeros entre os dois primeiros ou os dois segundos domínios CH3).[0137] There are several approaches for modifications to the CH3 domain of the Fc domain in order to enforce heterodimerization, which are well described, for example, in WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291. Typically, in all of these approaches, the CH3 domain of the first subunit of the Fc domain and the CH3 domain of the second subunit of the Fc domain are both engineered in a complementary manner, such that each CH3 domain (or the heavy chain comprising it) may no longer homodimerize, but is forced to heterodimerize with the other, complementarily modified CH3 domain (so that the first and second CH3 domains heterodimerize and no homodimers are formed between the first two or the second two CH3 domains).
[0138] Em uma forma de realização específica, a referidamodificação que promove a associação da primeira e da segunda subunidades do domínio Fc uma modificação do tipo “Maçaneta em cavidade - Knob-into- hole”, que compreende uma modificação do “Knob” em uma das duas subunidades do domínio Fc e uma modificação de “cavidade” na outra das duas subunidades do domínio Fc.[0138] In a specific embodiment, said modification that promotes the association of the first and second subunits of the Fc domain is a “Knob-into-hole” modification, which comprises a “Knob” modification in one of the two subunits of the Fc domain and a “hole” modification in the other of the two subunits of the Fc domain.
[0139] A tecnologia da maçaneta na cavidade é descrita, por exemplo, na US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) e Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). De forma geral, o método envolve a introdução de uma protuberância (“maçaneta”) na interface de um primeiro polipeptídeo e uma cavidade correspondente (“cavidade”) na interface de um segundo polipeptídeo, de tal forma que a protuberância possa ser posicionada na cavidade de modo a promovem a formação de heterodímeros e impedem a formação de homodímeros. As protuberâncias são construídas substituindo pequenas cadeias laterais de aminoácidos da interface do primeiro polipeptídeo com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). Cavidades compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante às protuberâncias são criadas na interface do segundo polipeptídeo pela substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidos por outras menores (por exemplo, alanina ou treonina).[0139] Doorknob-in-cavity technology is described, for example, in US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) and Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). In general, the method involves introducing a protrusion (“doorknob”) at the interface of a first polypeptide and a corresponding cavity (“cavity”) at the interface of a second polypeptide, such that the protrusion can be positioned in the cavity so as to promote the formation of heterodimers and prevent the formation of homodimers. The protrusions are constructed by replacing small amino acid side chains from the interface of the first polypeptide with larger side chains (e.g., tyrosine or tryptophan). Compensatory cavities of identical or similar size to the protrusions are created at the interface of the second polypeptide by replacing large amino acid side chains with smaller ones (e.g., alanine or threonine).
[0140] Consequentemente, em uma forma de realização particular, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc do anticorpo compreendido no imunoconjugado, um resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido que possui um volume de cadeia lateral maior, gerando desta forma uma protuberância dentro do Domínio CH3 da primeira subunidade que é posicionável em uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade, e no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc um resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral menor volume, gerando desta forma uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade dentro da qual a protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade é posicionável.[0140] Accordingly, in a particular embodiment, in the CH3 domain of the first subunit of the Fc domain of the antibody comprised in the immunoconjugate, an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a larger side chain volume, thereby generating a protrusion within the CH3 domain of the first subunit that is positionable in a cavity within the CH3 domain of the second subunit, and in the CH3 domain of the second subunit of the Fc domain an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a smaller side chain volume, thereby generating a cavity within the CH3 domain of the second subunit within which the protrusion within the CH3 domain of the first subunit is positionable.
[0141] De forma preferida, o referido resíduo de aminoácido tendo um volume de cadeia lateral maior selecionado a partir do grupo que consiste em arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) e triptofano (W).[0141] Preferably, said amino acid residue having a larger side chain volume is selected from the group consisting of arginine (R), phenylalanine (F), tyrosine (Y) and tryptophan (W).
[0142] De forma preferida, o referido resíduo de aminoácido com um volume de cadeia lateral menor selecionado a partir do grupo que consiste de alanina (A), serina (s), treonina (T) e valina (V).[0142] Preferably, said amino acid residue with a smaller side chain volume is selected from the group consisting of alanine (A), serine (s), threonine (T) and valine (V).
[0143] A protuberância e cavidade podem ser feitas alterando o ácido nucleico que codifica os polipeptídeos, por exemplo, por mutagênese específica do local, ou por síntese peptídica.[0143] The protrusion and cavity can be made by altering the nucleic acid encoding the polypeptides, for example by site-specific mutagenesis, or by peptide synthesis.
[0144] Em uma forma de realização específica, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc (a subunidade “knobs”) o resíduo de treonina na posição 366 substituído com um resíduo de triptofano (T366W) e no domínio CH3 da segunda subunidade de o domínio Fc (a subunidade “cavidade”) o resíduo de tirosina na posição 407 é substituído com um resíduo de valina (Y407V). Em uma forma de realização, na segunda subunidade do domínio Fc adicionalmente o resíduo de treonina na posição 366 é substituído com um resíduo de serina (T366S) e o resíduo de leucina na posição 368 é substituído com um resíduo de alanina (L368A) (numerações de acordo com Kabat EU index).[0144] In a specific embodiment, in the CH3 domain of the first subunit of the Fc domain (the “knobs” subunit) the threonine residue at position 366 is replaced with a tryptophan residue (T366W) and in the CH3 domain of the second subunit of the Fc domain (the “cavity” subunit) the tyrosine residue at position 407 is replaced with a valine residue (Y407V). In an embodiment, in the second subunit of the Fc domain additionally the threonine residue at position 366 is replaced with a serine residue (T366S) and the leucine residue at position 368 is replaced with an alanine residue (L368A) (numberings according to Kabat EU index).
[0145] Ainda em outra forma de realização, na subunidade primeira do domínio Fc adicionalmente o resíduo de serina na posição 354 é substituído por um resíduo de cisteína (S354C) ou o resíduo de ácido glutâmico na posição 356 é substituído por um resíduo de cisteína (E356C) (particularmente o resíduo de serina na posição 354 é substituído por um resíduo de cisteína), e na segunda subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de tirosina na posição 349 é substituído por um resíduo de cisteína (Y349C) (numerações de acordo com o Índice EU de Kabat). A introdução destes dois resíduos de cisteína resulta na formação de uma ponte dissulfureto entre as duas subunidades do domínio Fc, estabilizando ainda mais o dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).[0145] In yet another embodiment, in the first subunit of the Fc domain additionally the serine residue at position 354 is replaced by a cysteine residue (S354C) or the glutamic acid residue at position 356 is replaced by a cysteine residue (E356C) (particularly the serine residue at position 354 is replaced by a cysteine residue), and in the second subunit of the Fc domain additionally the tyrosine residue at position 349 is replaced by a cysteine residue (Y349C) (numberings according to the Kabat EU Index). The introduction of these two cysteine residues results in the formation of a disulfide bridge between the two subunits of the Fc domain, further stabilizing the dimer (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
[0146] Em uma forma de realização particular, a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos S354C e T366W, e a segunda subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos Y349C, T366S, L368A e Y407V (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).[0146] In a particular embodiment, the first subunit of the Fc domain comprises the amino acid substitutions S354C and T366W, and the second subunit of the Fc domain comprises the amino acid substitutions Y349C, T366S, L368A, and Y407V (numbering according to the Kabat EU index).
[0147] Em algumas formas de realização, a segunda subunidade do domínio Fc compreende adicionalmente as substituições de aminoácidos H435R e Y436F (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).[0147] In some embodiments, the second subunit of the Fc domain further comprises the amino acid substitutions H435R and Y436F (numbering according to Kabat's EU index).
[0148] Em uma forma de realização particular, o polipeptídeo de IL- 2 mutante fundido (de forma opcional através de um peptídeo de ligação) com a primeira subunidade do domínio Fc (que compreende a modificação da maçaneta). Sem desejar estar limitado pela teoria, a fusão do polipeptídeo de IL- 2 mutante com a subunidade contendo a maçaneta do domínio Fc irá (adicionalmente) minimizar a geração de imunoconjugados que compreendem dois polipeptídeos IL-2 mutantes (choque estérico de dois polipeptídeos contendo polipeptídeos).[0148] In a particular embodiment, the mutant IL-2 polypeptide is fused (optionally via a linker peptide) to the first subunit of the Fc domain (comprising the knob modification). Without wishing to be bound by theory, fusion of the mutant IL-2 polypeptide to the knob-containing subunit of the Fc domain will (further) minimize the generation of immunoconjugates comprising two mutant IL-2 polypeptides (steric clash of two polypeptide-containing polypeptides).
[0149] Outras técnicas de modificação de CH3 para impor a heterodimerização são contempladas como alternativas de acordo com a invenção e são descritos por exemplo em WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291.[0149] Other techniques of modifying CH3 to enforce heterodimerization are contemplated as alternatives according to the invention and are described for example in WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291.
[0150] Em uma forma de realização a abordagem de heterodimerização descrita no documento EP 1870459 é utilizada alternativamente. Esta abordagem é baseada na introdução de aminoácidos carregados com cargas opostas em posições específicas de aminoácidos na interface do domínio CH3/ CH3 entre as duas subunidades do domínio Fc. Uma forma de realização preferida para o anticorpo compreendido no imunoconjugado da invenção são as são mutações de aminoácidos R409D; K370E em um dos dois domínios CH3 (do domínio Fc) e mutações de aminoácidos D399K; E357K no outro dos domínios CH3 do domínio Fc(numeração de acordo com Kabat índice UE).[0150] In one embodiment the heterodimerization approach described in EP 1870459 is alternatively used. This approach is based on the introduction of oppositely charged amino acids at specific amino acid positions at the CH3/CH3 domain interface between the two subunits of the Fc domain. A preferred embodiment for the antibody comprised in the immunoconjugate of the invention are amino acid mutations R409D; K370E in one of the two CH3 domains (of the Fc domain) and amino acid mutations D399K; E357K in the other of the CH3 domains of the Fc domain (numbering according to Kabat EU index).
[0151] Em outra forma de realização, o anticorpo compreendido no imunoconjugado da invenção compreende a mutação de aminoácidos T366W no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e as mutações de aminoácidos T366S, L368A, Y407V no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc, e adicionalmente mutações de aminoácidos R409D; K370E no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e mutações de aminoácidos D399K; E357K no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc(numerações de acordo com o Índice EU de Kabat).[0151] In another embodiment, the antibody comprised in the immunoconjugate of the invention comprises the amino acid mutation T366W in the CH3 domain of the first subunit of the Fc domain and the amino acid mutations T366S, L368A, Y407V in the CH3 domain of the second subunit of the Fc domain, and additionally amino acid mutations R409D; K370E in the CH3 domain of the first subunit of the Fc domain and amino acid mutations D399K; E357K in the CH3 domain of the second subunit of the Fc domain (numberings according to the Kabat EU Index).
[0152] Em outra forma de realização, o anticorpo compreendido no imunoconjugado da invenção compreende as mutações de aminoácidos S354C, T366W no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e as mutações de aminoácidos Y349C, T366S, L368A, Y407V no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc, ou o referido anticorpo compreende mutações de aminoácidos Y349C, T366W no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e de aminoácidos mutações S354C, T366S, L368A, Y407V nos domínios CH3 da segunda subunidade de Domínio Fc e adicionalmente mutações de aminoácidos R409D; K370E no domínio CH3 da primeirasubunidade do domínio Fc e mutações de aminoácidos D399K; E357K no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc (todas as numerações de acordo com o Índice EU de Kabat).[0152] In another embodiment, the antibody comprised in the immunoconjugate of the invention comprises amino acid mutations S354C, T366W in the CH3 domain of the first subunit of the Fc domain and amino acid mutations Y349C, T366S, L368A, Y407V in the CH3 domain of the second subunit of the Fc domain, or said antibody comprises amino acid mutations Y349C, T366W in the CH3 domain of the first subunit of the Fc domain and amino acid mutations S354C, T366S, L368A, Y407V in the CH3 domains of the second subunit of the Fc domain and additionally amino acid mutations R409D; K370E in the CH3 domain of the first subunit of the Fc domain and amino acid mutations D399K; E357K in the CH3 domain of the second subunit of the Fc domain (all numbering according to the Kabat EU Index).
[0153] Em uma forma de realização, a abordagem heterodimerização descrito no documento WO 2013/157953 é usado em alternativa. Em uma forma de realização, um primeiro domínio CH3 compreende a mutação de aminoácidos T366K e um segundo domínio CH3 compreende a mutação de aminoácidos L351D (numerações de acordo com o Índice EU de Kabat). Em outra forma de realização, o primeiro domínio CH3 compreende mais uma mutação de aminoácidos L351K. Em uma outra forma de realização, o segundo domínio CH3 compreende adicionalmente uma mutação de aminoácidos selecionada a partir de Y349E, Y349D e L368E (de forma preferida L368E) (numeração de acordo com o índice Kabat EU).[0153] In one embodiment, the heterodimerization approach described in WO 2013/157953 is used instead. In one embodiment, a first CH3 domain comprises the amino acid mutation T366K and a second CH3 domain comprises the amino acid mutation L351D (numbering according to the Kabat EU Index). In another embodiment, the first CH3 domain further comprises a L351K amino acid mutation. In another embodiment, the second CH3 domain further comprises an amino acid mutation selected from Y349E, Y349D and L368E (preferably L368E) (numbering according to the Kabat EU Index).
[0154] Em uma forma de realização, a abordagem de heterodimerização descrita no documento WO 2012/058768 é utilizada de forma alternativa. Em uma forma de realização, um primeiro domínio CH3 compreende as mutações de aminoácidos L351Y, Y407A e um segundo domínio CH3 compreende as mutações de aminoácidos T366A, K409F. Em uma outra forma de realização, o segundo domínio CH3 compreende uma outra mutação de aminoácidos na posição T411, D399, S400, F405, N390 ou K392, por exemplo, selecionada a partir da) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E ou T411W, b) D399R, D399W, D399Y ou D399K, c) S400E, S400D, S400R ou S400K, d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V ou F405W, e) N390R, N390K ou N390D, f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F ou K392E (numerações de acordo com o Índice EU de Kabat). Em uma outra forma de realização, um primeiro domínio CH3 compreende as mutações de aminoácidos L351Y, Y407A e um segundo domínio CH3 compreende as mutações de aminoácidos T366V, K409F. Em uma outra forma de realização, um primeiro domínio CH3 compreende a mutação de aminoácidos Y407A e um segundo domínio CH3 compreende as mutações de aminoácidos T366A, K409F. Em uma outra forma de realização, o segundo domínio CH3 compreende ainda mutações de aminoácidos K392E, T411E, D399R e S400R (numeração de acordo com Kabat índice UE).[0154] In one embodiment, the heterodimerization approach described in WO 2012/058768 is alternatively utilized. In one embodiment, a first CH3 domain comprises the amino acid mutations L351Y, Y407A and a second CH3 domain comprises the amino acid mutations T366A, K409F. In another embodiment, the second CH3 domain comprises another amino acid mutation at position T411, D399, S400, F405, N390 or K392, e.g., selected from a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E or T411W, b) D399R, D399W, D399Y or D399K, c) S400E, S400D, S400R or S400K, d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V or F405W, e) N390R, N390K or N390D, f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F or K392E (numbering according to Kabat EU Index). In another embodiment, a first CH3 domain comprises the amino acid mutations L351Y, Y407A and a second CH3 domain comprises the amino acid mutations T366V, K409F. In another embodiment, a first CH3 domain comprises the amino acid mutation Y407A and a second CH3 domain comprises the amino acid mutations T366A, K409F. In another embodiment, the second CH3 domain further comprises amino acid mutations K392E, T411E, D399R and S400R (numbering according to Kabat EU Index).
[0155] Em uma forma de realização, a abordagem de heterodimerização descrita no documento WO 2011/143545 é utilizada de forma alternativa, por exemplo, com a modificação de aminoácidos em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em 368 e 409 (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).[0155] In one embodiment, the heterodimerization approach described in WO 2011/143545 is used in an alternative way, for example with the modification of amino acids at a position selected from the group consisting of 368 and 409 (numbering according to the EU Kabat index).
[0156] Em uma forma de realização, a abordagem heterodimerização descrito no documento WO 2011/090762, que também usa a tecnologia de botões-em-cavidades descrito acima, é utilizado em alternativa. Em uma forma de realização, um primeiro domínio CH3 compreende a mutação de aminoácidos T366W e um segundo domínio CH3 compreende a mutação de aminoácidos Y407A. Em uma forma de realização, um primeiro domínio CH3 compreende aminoácidos mutação T366Y e um segundo domínio CH3 compreende de aminoácidos mutação Y407T (numeração de acordo com Kabat índice UE).[0156] In one embodiment, the heterodimerization approach described in WO 2011/090762, which also uses the knobs-in-cavities technology described above, is alternatively used. In one embodiment, a first CH3 domain comprises amino acid mutation T366W and a second CH3 domain comprises amino acid mutation Y407A. In one embodiment, a first CH3 domain comprises amino acid mutation T366Y and a second CH3 domain comprises amino acid mutation Y407T (numbering according to Kabat EU index).
[0157] Em uma forma de realização, o anticorpo compreendido no imunoconjugado ou o seu domínio Fc é de subclasse IgG2 e a abordagem heterodimerização descrito no documento WO 2010/129304 é usado em alternativa.[0157] In one embodiment, the antibody comprised in the immunoconjugate or its Fc domain is of IgG2 subclass and the heterodimerization approach described in WO 2010/129304 is used instead.
[0158] Em uma forma de realização alternativa, uma associação promotora de modificações da primeira e da segunda subunidades do domínio Fc compreende uma modificação mediando efeitos de direção eletrostática, por exemplo, como descrito na publicação PCT WO 2009/089004. De forma geral, este método envolve a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos na interface das duas subunidades do domínio Fc por resíduos de aminoácidos carregados, de forma que a formação de homodímeros se torne eletrostaticamente desfavorável, mas a heterodimerização é eletrostaticamente favorável. Em tal forma de realização, um primeiro domínio CH3 compreende a substituição de aminoácidos de K392 ou N392 com um aminoácido carregado negativamente (por exemplo ácido glutâmico (E), ou ácido aspártico (D), de forma preferencial K392D ou N392D) e um segundo domínio CH3 compreende substituição de aminoácidos de D399, E356, D356, ou e 357 com uma positivamente aminoácido com carga (por exemplo, lisina (K) ou arginina (R), de preferência, D399K, E356K, D356K, ou E357K, e de forma mais preferencial D399K e E356K). Em uma outra forma de realização, o primeiro domínio CH3 compreende adicionalmente a substituição de aminoácidos de K409 ou R409 com um aminoácido carregado negativamente (por exemplo ácido glutâmico (E), ou ácido aspártico (D), de forma preferida K409D ou R409D). Em uma outra forma de realização, o primeiro domínio CH3 compreende adicionalmente ou de forma alternativa a substituição de aminoácidos de K 439 e/ ou K370 com um aminoácido carregado negativamente (por exemplo ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D)) (todas as numerações de acordo com o Índice EU de Kabat).[0158] In an alternative embodiment, a modification-promoting association of the first and second subunits of the Fc domain comprises a modification mediating electrostatic steering effects, for example, as described in PCT publication WO 2009/089004. In general, this method involves replacing one or more amino acid residues at the interface of the two subunits of the Fc domain with charged amino acid residues such that homodimer formation becomes electrostatically unfavorable but heterodimerization is electrostatically favorable. In such an embodiment, a first CH3 domain comprises the amino acid substitution of K392 or N392 with a negatively charged amino acid (e.g., glutamic acid (E), or aspartic acid (D), preferably K392D or N392D) and a second CH3 domain comprises the amino acid substitution of D399, E356, D356, or E357 with a positively charged amino acid (e.g., lysine (K) or arginine (R), preferably D399K, E356K, D356K, or E357K, and more preferably D399K and E356K). In another embodiment, the first CH3 domain further comprises the amino acid substitution of K409 or R409 with a negatively charged amino acid (e.g., glutamic acid (E), or aspartic acid (D), preferably K409D or R409D). In another embodiment, the first CH3 domain additionally or alternatively comprises the amino acid substitution of K439 and/or K370 with a negatively charged amino acid (e.g. glutamic acid (E) or aspartic acid (D)) (all numberings according to the Kabat EU Index).
[0159] Em ainda uma outra forma de realização, a abordagem heterodimerização descrito no documento WO 2007/147901 é usado em alternativa. Em uma forma de realização, um primeiro domínio CH3 compreende as mutações de aminoácidos K253E, D282K e K322D e um segundo domínio CH3 compreende as mutações de aminoácidos D239K, E240K e K292D (numerações de acordo com o Índice EU de Kabat).[0159] In yet another embodiment, the heterodimerization approach described in WO 2007/147901 is used instead. In one embodiment, a first CH3 domain comprises the amino acid mutations K253E, D282K and K322D and a second CH3 domain comprises the amino acid mutations D239K, E240K and K292D (numberings according to the EU Kabat Index).
[0160] Em ainda outra forma de realização, a abordagem heterodimerização descrito no documento WO 2007/110205 pode ser usado em alternativa.[0160] In yet another embodiment, the heterodimerization approach described in WO 2007/110205 may be used instead.
[0161] Em uma forma de realização, a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos K392D e K409D, e a segunda subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos D356K e D399K (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).MODIFICAÇÕES DO DOMÍNIO FC REDUZINDO A LIGAÇÃO AO RECEPTOR FC E/ OU A FUNÇÃO EFETORA.[0161] In one embodiment, the first subunit of the Fc domain comprises amino acid substitutions K392D and K409D, and the second subunit of the Fc domain comprises amino acid substitutions D356K and D399K (numbering according to the Kabat EU index). FC DOMAIN MODIFICATIONS REDUCING FC RECEPTOR BINDING AND/OR EFFECTOR FUNCTION.
[0162] O domínio Fc confere ao imunoconjugado propriedades farmacocinéticas favoráveis, incluindo uma semi-vida longa no soro que contribui para uma boa acumulação no tecido alvo e uma razão de distribuição tecido- sangue favorável. Ao mesmo tempo, pode, no entanto, conduzir a direcionamento indesejável do imunoconjugado para células que expressam receptores Fc em vez de para as células portadoras de antígeno preferidas. Além disso, a co-ativação das vias de sinalização do receptor Fc pode levar à liberação de citocinas que, em combinação com o polipeptídeo de IL-2 e a meia-vida longa do imunoconjugado, resulta em ativação excessiva de receptores de citocinas e efeitos colaterais severos na administração sistêmica. De acordo com isto, os imunoconjugados de IgG-IL-2 convencionais foram descritos como estando associados a reações de infusão (ver, por exemplo, King et al., J. Clin. Oncol 22, 4463-4473 (2004)).[0162] The Fc domain confers the immunoconjugate favorable pharmacokinetic properties, including a long serum half-life that contributes to good accumulation in the target tissue and a favorable tissue-to-blood distribution ratio. At the same time, it may, however, lead to undesirable targeting of the immunoconjugate to cells expressing Fc receptors rather than to the preferred antigen-bearing cells. Furthermore, co-activation of Fc receptor signaling pathways may lead to the release of cytokines that, in combination with the IL-2 polypeptide and the long half-life of the immunoconjugate, results in excessive activation of cytokine receptors and severe side effects upon systemic administration. In accordance with this, conventional IgG-IL-2 immunoconjugates have been described to be associated with infusion reactions (see, for example, King et al., J. Clin. Oncol 22, 4463-4473 (2004)).
[0163] Consequentemente, em formas de realização particulares, o domínio Fc do anticorpo compreendido no imunoconjugado de acordo com a invenção exibe reduzida afinidade de ligação a um receptor Fc e/ ou função efetora reduzida, em comparação com um domínio IgG 1 Fc nativo. Em tal forma de realização, o domínio Fc (ou o anticorpo que compreende o referido domínio Fc) exibe menos de 50%, de forma preferencial menos de 20%, de forma mais preferida menos de 10% e de forma mais preferida menos de 5% da afinidade de ligação a um receptor Fc, comparativamente a um domínio IgG 1 Fc nativo (ou um anticorpo que compreende um domínio IgG 1 Fc nativo) e/ ou inferior a 50%, de forma preferida inferior a 20%, de forma mais preferida inferior a 10% e de forma mais preferida inferior a 5% de a função efetora, em comparação com um domínio do domínio IgG 1 Fc nativo (ou um anticorpo que compreende um domínio IgG 1 Fc nativo). Em uma forma de realização, o domínio do domínio Fc (ou um anticorpo que compreende o referido domínio Fc) não se liga substancialmente a um receptor Fc e/ ou induz a função efetora. Em uma forma de realização particular, o receptor Fc um receptor Fc. Em uma forma de realização, o receptor Fc um receptor Fc humano. Em uma forma de realização, o receptor Fc um receptor Fc de ativação. Em uma forma de realização específica, o receptor Fc um receptor Fc ativador humano, de forma mais específica FcYRIIIa, FCYRI ou FcYRIIa humano, de forma mais específica FcYRIIIa humano. Em uma forma de realização, a função efetora uma ou mais são selecionadas a partir do grupo de CDC, ADCC, ADCP e secreção de citocinas. Em uma forma de realização particular, a função efetora é ADCC. Em uma forma de realização, o domínio do domínio Fc exibe afinidade de ligação substancialmente semelhante ao receptor Fc neonatal (FcRn), em comparação com um domínio de domínio IgG 1 Fc nativo. É alcançada uma ligação substancialmente semelhante ao FcRn quando o domínio Fc (ou um anticorpo que compreende o referido domínio Fc) exibe mais do que cerca de 70%, em particular maior que cerca de 80%, mais em particular maior que cerca de 90% da afinidade de ligação de um Domínio Fc de IgG1 nativo (ou um anticorpo que compreende um domínio IgG 1 Fc nativo) a FcRn.[0163] Accordingly, in particular embodiments, the Fc domain of the antibody comprised in the immunoconjugate according to the invention exhibits reduced binding affinity to an Fc receptor and/or reduced effector function, compared to a native IgG 1 Fc domain. In such an embodiment, the Fc domain (or the antibody comprising said Fc domain) exhibits less than 50%, preferably less than 20%, more preferably less than 10% and most preferably less than 5% of the binding affinity to an Fc receptor, compared to a native IgG 1 Fc domain (or an antibody comprising a native IgG 1 Fc domain) and/or less than 50%, preferably less than 20%, more preferably less than 10% and most preferably less than 5% of the effector function, compared to a native IgG 1 Fc domain domain (or an antibody comprising a native IgG 1 Fc domain). In one embodiment, the Fc domain domain (or an antibody comprising said Fc domain) does not substantially bind to an Fc receptor and/or induce effector function. In a particular embodiment, the Fc receptor is an Fc receptor. In one embodiment, the Fc receptor is a human Fc receptor. In one embodiment, the Fc receptor is an activating Fc receptor. In a specific embodiment, the Fc receptor is a human activating Fc receptor, more specifically human FcYRIIIa, FCYRI or FcYRIIa, more specifically human FcYRIIIa. In one embodiment, the effector function is one or more selected from the group of CDC, ADCC, ADCP and cytokine secretion. In a particular embodiment, the effector function is ADCC. In one embodiment, the Fc domain domain exhibits substantially similar binding affinity to the neonatal Fc receptor (FcRn) as compared to a native IgG 1 Fc domain domain. Substantially similar binding to FcRn is achieved when the Fc domain (or an antibody comprising said Fc domain) exhibits greater than about 70%, in particular greater than about 80%, more in particular greater than about 90% of the binding affinity of a native IgG1 Fc domain (or an antibody comprising a native IgG1 Fc domain) to FcRn.
[0164] Em certas formas de realização, o domínio Fc é modificado para ter afinidade de ligação reduzida a um receptor Fc e/ ou função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc não manipulado. Em formas de realização particulares, o domínio Fc do anticorpo compreendido no imunoconjugado compreende uma ou mais mutações de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc e/ ou função efetora. Tipicamente, a mesma mutação de um ou mais aminoácidos está presente em cada uma das duas subunidades do domínio Fc. Em uma forma de realização, a mutação de aminoácidos reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc. Em uma forma de realização, a mutação de aminoácidos reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc em pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes. Em formas de realização em que h mais do que uma mutação de aminoácidos que reduz a afinidade de ligação do domínio Fc ao receptor Fc, a combinação destas mutações de aminoácidos pode reduzir a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc em pelo menos 10- dobrar, pelo menos 20 vezes, ou mesmo pelo menos 50 vezes. Em uma forma de realização, o anticorpo que compreende um domínio Fc manipulado exibe menos de 20%, em particular menos de 10%, mais em particular menos de 5% da afinidade de ligação a um receptor Fc em comparação com um anticorpo que compreende um domínio Fc não manipulado. Em uma forma de realização particular, o receptor Fc é um receptor Fc. Em algumas formas de realização, o receptor Fc é um receptor Fc humano. Em algumas formas de realização, o receptor Fc é um receptor Fc ativador. Em uma forma de realização específica, o receptor Fc um receptor Fc ativador humano, de forma mais específica FcYRIIIa, FCYRI ou FcYRIIa humano, de forma mais específica FcYRIIIa humano. De preferência, a ligação a cada um destes receptores é reduzida. Em algumas formas de realização, a afinidade de ligação a um componente de complemento, de forma específica a afinidade de ligação a C1q, também é reduzida. Em uma forma de realização, a afinidade de ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn) não é reduzida. A ligação substancialmente semelhante a FcRn, isto é, a preservação da afinidade de ligação do domínio Fc ao referido receptor, é conseguida quando o domínio Fc (ou um anticorpo que compreende o referido domínio Fc) exibe mais de 70% da afinidade de ligação de um gene não modificado do domínio Fc (ou um anticorpo que compreende a referida forma não modificada do domínio Fc) a FcRn. O domínio Fc, ou anticorpo compreendido no imunoconjugado da invenção que compreende o referido domínio Fc, pode exibir mais do que cerca de 80% e até mais do que cerca de 90% dessa afinidade. Em certas formas de realização, o domínio Fc do anticorpo compreendido no imunoconjugado é modificado para ter função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc não manipulado. A função efetora reduzida pode incluir, mas não está limitada a, um ou mais dos seguintes: citotoxicidade reduzida dependente do complemento (CDC), citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) reduzida, fagocitose celular dependente de anticorpo reduzida (ADCP), redução da secreção de citocina, redução da captação de antígeno mediada pelo complexo imune por células apresentadoras de antígeno, redução da ligação a células NK, redução da ligação a macrófagos, redução da ligação a monócitos, redução da ligação a células polimorfonucleares, redução da apoptose de sinalização direta, redução da reticulação de anticorpos ligados, maturação de células dendríticas reduzida ou redução da iniciação de células T. Em uma forma de realização, a função efetora reduzida uma ou mais selecionada a partir do grupo de CDC reduzido, ADCC reduzido, ADCP reduzido e secreção reduzida de citocina. Em uma forma de realização particular, a reduzida função efetora é reduzida ADCC. Em uma forma de realização, o ADCC reduzido é inferior a 20% do ADCC induzido por um domínio Fc não manipulado (ou um anticorpo que compreende um domínio Fc não manipulado).[0164] In certain embodiments, the Fc domain is engineered to have reduced binding affinity to an Fc receptor and/or reduced effector function, as compared to an unengineered Fc domain. In particular embodiments, the Fc domain of the antibody comprised in the immunoconjugate comprises one or more amino acid mutations that reduce the binding affinity of the Fc domain to an Fc receptor and/or effector function. Typically, the same mutation of one or more amino acids is present in each of the two subunits of the Fc domain. In one embodiment, the amino acid mutation reduces the binding affinity of the Fc domain to an Fc receptor. In one embodiment, the amino acid mutation reduces the binding affinity of the Fc domain to an Fc receptor by at least 2-fold, at least 5-fold, or at least 10-fold. In embodiments where there is more than one amino acid mutation that reduces the binding affinity of the Fc domain to the Fc receptor, the combination of these amino acid mutations can reduce the binding affinity of the Fc domain to an Fc receptor by at least 10-fold, at least 20-fold, or even at least 50-fold. In one embodiment, the antibody comprising an engineered Fc domain exhibits less than 20%, in particular less than 10%, more in particular less than 5% of the binding affinity to an Fc receptor compared to an antibody comprising an unengineered Fc domain. In a particular embodiment, the Fc receptor is an Fc receptor. In some embodiments, the Fc receptor is a human Fc receptor. In some embodiments, the Fc receptor is an activating Fc receptor. In a specific embodiment, the Fc receptor is a human activating Fc receptor, more specifically human FcYRIIIa, FCYRI or FcYRIIa, more specifically human FcYRIIIa. Preferably, binding to each of these receptors is reduced. In some embodiments, binding affinity to a complement component, specifically binding affinity to C1q, is also reduced. In one embodiment, binding affinity to the neonatal Fc receptor (FcRn) is not reduced. Substantially similar binding to FcRn, i.e., preservation of the binding affinity of the Fc domain to said receptor, is achieved when the Fc domain (or an antibody comprising said Fc domain) exhibits greater than 70% of the binding affinity of an unengineered Fc domain (or an antibody comprising said unmodified form of the Fc domain) to FcRn. The Fc domain, or antibody comprised in the immunoconjugate of the invention comprising said Fc domain, may exhibit greater than about 80% and even greater than about 90% of that affinity. In certain embodiments, the Fc domain of the antibody comprised in the immunoconjugate is modified to have reduced effector function, as compared to an unengineered Fc domain. Reduced effector function may include, but is not limited to, one or more of the following: reduced complement-dependent cytotoxicity (CDC), reduced antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), reduced antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP), reduced cytokine secretion, reduced immune complex-mediated antigen uptake by antigen-presenting cells, reduced binding to NK cells, reduced binding to macrophages, reduced binding to monocytes, reduced binding to polymorphonuclear cells, reduced direct signaling apoptosis, reduced cross-linking of bound antibodies, reduced dendritic cell maturation, or reduced T cell priming. In one embodiment, the reduced effector function is one or more selected from the group of reduced CDC, reduced ADCC, reduced ADCP, and reduced cytokine secretion. In a particular embodiment, the reduced effector function is reduced ADCC. In one embodiment, the reduced ADCC is less than 20% of the ADCC induced by an unengineered Fc domain (or an antibody comprising an unengineered Fc domain).
[0165] Em uma forma de realização, a mutação de aminoácidos que reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc e/ ou função efetora uma substituição de aminoácidos. Em uma forma de realização, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo de E233, L234, L235, N297, p331 e P329(numerações de acordo com o Índice EU de Kabat). Em uma forma de realização mais específica, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo de L234, L235 e P329 (numerações de acordo com o Índice EU de Kabat). Em algumas formas de realização, o domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A e L235A (numerações de acordo com o Índice EU de Kabat). Em tal forma de realização, o domínio Fc é um domínio IgG 1 Fc, em particular um domínio IgG 1 Fc humano. Em uma forma de realização, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácidos na posição P329. Em uma forma de realização mais específica, a substituição de aminoácidos é P329A ou P329G, em particular P329G (numerações de acordo com o Índice EU de Kabat). Em uma forma de realização, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácidos na posição P329 e uma outra substituição de aminoácidos em uma posição selecionada a partir de E233, L234, L235, N297 e P331 (numerações de acordo com o índice Kabat EU). Em uma forma de realização mais específica, a substituição adicional de aminoácidos é E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ou P331S. Em formas de realização particulares, o domínio Fc compreende substituições de aminoácidos nas posições P329, L234 e L235 (numerações de acordo com o Índice EU de Kabat). Em formas de realização mais particulares, o domínio Fc compreende as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G (“P329G LALA”, “PGLALA” ou “LALAPG”). De forma específica, em formas de realização particulares, cada subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A, L235A e P329G(numeração de índice EU de Kabat), ou seja em cada uma das primeira e segunda subunidades do domínio Fc o resíduo de leucina na posição 234 é substituído com um resíduo de alanina (L234A), o resíduo de leucina na posição 235 é substituído com um resíduo de alanina (L235A) e o resíduo de prolina na posição 329 é substituído com um resíduo de glicina (P329G) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em tal forma de realização, o domínio Fc é um domínio IgG 1 Fc, em particular um domínio IgG 1 Fc humano. A combinação “P32 9G LALA” de substituições de aminoácidos quase completamente elimina a ligação do receptor FCY (assim como complemento) de um domínio IgG 1 Fc humano, como descrito na publicação PCT N° WO 2012/130831, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. O documento WO 2012/130831 também descreve métodos de preparação desses domínios Fc mutantes e métodos para determinar as suas propriedades, tais como a ligação ao receptor Fc ou funções efetoras.[0165] In one embodiment, the amino acid mutation that reduces the binding affinity of the Fc domain to an Fc receptor and/or effector function is an amino acid substitution. In one embodiment, the Fc domain comprises an amino acid substitution at a position selected from the group of E233, L234, L235, N297, p331, and P329 (numberings according to the Kabat EU Index). In a more specific embodiment, the Fc domain comprises an amino acid substitution at a position selected from the group of L234, L235, and P329 (numberings according to the Kabat EU Index). In some embodiments, the Fc domain comprises the amino acid substitutions L234A and L235A (numberings according to the Kabat EU Index). In such an embodiment, the Fc domain is an IgG 1 Fc domain, in particular a human IgG 1 Fc domain. In one embodiment, the Fc domain comprises an amino acid substitution at position P329. In a more specific embodiment, the amino acid substitution is P329A or P329G, in particular P329G (numberings according to the Kabat EU Index). In one embodiment, the Fc domain comprises an amino acid substitution at position P329 and a further amino acid substitution at a position selected from E233, L234, L235, N297 and P331 (numberings according to the Kabat EU Index). In a more specific embodiment, the further amino acid substitution is E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D or P331S. In particular embodiments, the Fc domain comprises amino acid substitutions at positions P329, L234 and L235 (numberings according to the Kabat EU Index). In more particular embodiments, the Fc domain comprises the amino acid mutations L234A, L235A and P329G (“P329G LALA”, “PGLALA” or “LALAPG”). Specifically, in particular embodiments, each subunit of the Fc domain comprises the amino acid substitutions L234A, L235A and P329G (Kabat EU index numbering), that is, in each of the first and second subunits of the Fc domain the leucine residue at position 234 is replaced with an alanine residue (L234A), the leucine residue at position 235 is replaced with an alanine residue (L235A) and the proline residue at position 329 is replaced with a glycine residue (P329G) (Kabat EU index numbering). In such an embodiment, the Fc domain is an IgG 1 Fc domain, in particular a human IgG 1 Fc domain. The “P32 9G LALA” combination of amino acid substitutions almost completely eliminates the FCY receptor binding (as well as complement) of a human IgG1 Fc domain, as described in PCT Publication No. WO 2012/130831, which is incorporated herein by reference in its entirety. WO 2012/130831 also describes methods of preparing such mutant Fc domains and methods of determining their properties, such as Fc receptor binding or effector functions.
[0166] IgG 4 anticorpos exibem afinidade de ligação reduzida para receptores Fc e funções efetoras reduzidas, em comparação com IgG 1 anticorpos. Assim, em algumas formas de realização o domínio Fc do anticorpo compreendido no imunoconjugado da invenção é uma IgG 4 domínio Fc, em particular um domínio Fc IgG 4 humano. Em uma forma de realização da IgG 4 domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos na posição S228, de forma específica a substituição de aminoácidos S228P (numeração de acordo com Kabat índice UE). Para reduzir ainda mais a sua afinidade de ligação a um receptor de Fc e/ ou a sua função efetora, em uma forma de realização da IgG 4 domínio Fc compreende uma substituição de aminoácido na posição L235, de forma específica o L235E substituição de aminoácidos (numeração de acordo com Kabat índice UE). Em outra forma de realização, a IgG 4 domínio Fc compreende uma substituição de aminoácido na posição P329, de forma específica o P329G substituição de aminoácidos (numeração de acordo com Kabat índice UE). Em uma forma de realização particular, a IgG 4 domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos nas posições S228, L235 e P329, de forma específica substituições de amino ácidos S228P, L235E e P329G (numeração de acordo com Kabat índice UE). Tais mutantes do domínio Fc IgG4 e as suas propriedades de ligação ao receptor Fc são descritos na publicação PCT N° WO 2012/130831, aqui incorporado por referência na sua totalidade.[0166] IgG 4 antibodies exhibit reduced binding affinity for Fc receptors and reduced effector functions, compared to IgG 1 antibodies. Thus, in some embodiments the Fc domain of the antibody comprised in the immunoconjugate of the invention is an IgG 4 Fc domain, in particular a human IgG 4 Fc domain. In one embodiment the IgG 4 Fc domain comprises amino acid substitutions at position S228, specifically the amino acid substitution S228P (numbering according to Kabat EU index). To further reduce its binding affinity for an Fc receptor and/or its effector function, in one embodiment the IgG 4 Fc domain comprises an amino acid substitution at position L235, specifically the amino acid substitution L235E (numbering according to Kabat EU index). In another embodiment, the IgG4 Fc domain comprises an amino acid substitution at position P329, specifically the amino acid substitution P329G (numbering according to Kabat EU index). In a particular embodiment, the IgG4 Fc domain comprises amino acid substitutions at positions S228, L235 and P329, specifically amino acid substitutions S228P, L235E and P329G (numbering according to Kabat EU index). Such mutants of the IgG4 Fc domain and their Fc receptor binding properties are described in PCT Publication No. WO 2012/130831, incorporated herein by reference in its entirety.
[0167] Em uma forma de realização particular, o domínio Fc exibindo afinidade de ligação reduzida a um receptor Fc e/ ou função efetora reduzida, em comparação com um domínio IgG 1 Fc nativo, um domínio IgG 1 Fc humano que compreende as substituições de aminoácidos L234A, L235A e, de forma opcional, P329G, ou uma domínio Fc de IgG 4 humano que compreende as substituições de aminoácidos S228P, L235E e, de formaopcional, p329G (numeração de acordo com Kabat índice UE).[0167] In a particular embodiment, the Fc domain exhibiting reduced binding affinity to an Fc receptor and/or reduced effector function, as compared to a native IgG 1 Fc domain, a human IgG 1 Fc domain comprising the amino acid substitutions L234A, L235A, and optionally P329G, or a human IgG 4 Fc domain comprising the amino acid substitutions S228P, L235E, and optionally p329G (numbering according to Kabat EU index).
[0168] Em certas formas de realização, a N-glicosilação do domínio Fc foi eliminada. Em tal forma de realização, o domínio Fc compreende uma mutação de aminoácidos na posição N297, em particular uma substituição de aminoácidos substituindo asparagina por alanina (N297A) ou ácido aspártico (N297D) (numeradas de acordo com o índice Kabat EU).[0168] In certain embodiments, N-glycosylation of the Fc domain has been eliminated. In such an embodiment, the Fc domain comprises an amino acid mutation at position N297, in particular an amino acid substitution replacing asparagine with alanine (N297A) or aspartic acid (N297D) (numbered according to the Kabat EU index).
[0169] Além dos domínios Fc descritos acima e na publicação PCT N° WO 2012/130831, domínios Fc com ligação ao receptor Fc reduzida e/ ou função efetora também incluem aqueles com substituição de um ou mais dos resíduos do domínio Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente US n6737056) (numerações de acordo com o Índice EU de Kabat). Tais mutantes Fc incluem mutantes Fc com substituições em duas ou mais posições de aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o chamado mutante Fc “DANA” com substituição dos resíduos 265 e 297 por alanina (Patente US N° 7,332,581).[0169] In addition to the Fc domains described above and in PCT Publication No. WO 2012/130831, Fc domains with reduced Fc receptor binding and/or effector function also include those with substitution of one or more of the Fc domain residues 238, 265, 269, 270, 297, 327, and 329 (U.S. Patent No. 6,737,056) (numbering according to the EU Kabat Index). Such Fc mutants include Fc mutants with substitutions at two or more amino acid positions 265, 269, 270, 297, and 327, including the so-called “DANA” Fc mutant with substitution of residues 265 and 297 with alanine (U.S. Patent No. 7,332,581).
[0170] Os domínios Fc mutantes podem ser preparados por deleção, substituição, inserção ou modificação de aminoácidos usando métodos genéticos ou químicos bem conhecidos na técnica. Os métodos genéticos podem incluir mutagênese específica do local da sequência de DNA codificadora, PCR, síntese genética e semelhantes. As alterações de nucleotídeos corretas podem ser verificadas, por exemplo, por sequenciamento.[0170] Mutant Fc domains can be prepared by deletion, substitution, insertion, or modification of amino acids using genetic or chemical methods well known in the art. Genetic methods can include site-specific mutagenesis of the coding DNA sequence, PCR, gene synthesis, and the like. Correct nucleotide changes can be verified, for example, by sequencing.
[0171] A ligação a receptores Fc pode ser facilmente determinada, por exemplo, por ELISA, ou por Ressonância de Superfície de Plasmon (SPR) usando instrumentação padrão, como um instrumento BIAcore (GE Healthcare), e os receptores Fc podem ser obtidos por expressão recombinante. De forma alternativa, a afinidade de ligação dos domínios Fc ou anticorpos que compreendem um domínio Fc para os receptores Fc pode ser avaliada utilizando linhas celulares conhecidas por expressarem receptores Fc particulares, tais como células NK humanos que expressam o receptor FcYlIIa.[0171] Binding to Fc receptors can be readily determined, for example, by ELISA, or by Surface Plasmon Resonance (SPR) using standard instrumentation such as a BIAcore instrument (GE Healthcare), and Fc receptors can be obtained by recombinant expression. Alternatively, the binding affinity of Fc domains or antibodies comprising an Fc domain for Fc receptors can be assessed using cell lines known to express particular Fc receptors, such as human NK cells expressing the FcYlIIa receptor.
[0172] A função efetora de um domínio Fc, ou um anticorpo que compreende um domínio Fc, pode ser medida por métodos conhecidos na técnica. Exemplos de ensaios in vitro para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse são descritos na Patente US N ° 5.500.362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sei USA 83, 7059-7063 (1986) e Hellstrom et al., proc Natl Acad Sei USA 82, 1499-1502 (1985); Patente US N° 5,821,337; Bruggemann et al. J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). De forma alternativa, métodos de ensaios não radioativos podem ser empregados (ver, por exemplo, ensaio de citotoxicidade não radioativo ACTI™ para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA) e ensaio de citotoxicidade não radioativo CytoTox 96 ® (Promega, Madison, WI)). Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK). De forma alternativa, ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, tal como o divulgado em Clynes et al., proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).[0172] The effector function of an Fc domain, or an antibody comprising an Fc domain, can be measured by methods known in the art. Examples of in vitro assays for assessing the ADCC activity of a molecule of interest are described in U.S. Patent No. 5,500,362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) and Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); U.S. Patent No. 5,821,337; Bruggemann et al. J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). Alternatively, non-radioactive assay methods may be employed (see, e.g., ACTI™ non-radioactive cytotoxicity assay for flow cytometry (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA) and CytoTox 96 ® non-radioactive cytotoxicity assay (Promega, Madison, WI)). Useful effector cells for such assays include peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and natural killer (NK) cells. Alternatively, or additionally, the ADCC activity of the molecule of interest may be assessed in vivo, e.g., in an animal model such as that disclosed in Clynes et al., proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).
[0173] Em algumas formas de realização, a ligação do domínio Fc a um componente de complemento, de forma específica a C1q, é reduzida. Consequentemente, em algumas formas de realização em que o domínio Fc é modificado para ter função efetora reduzida, a referida função efetora reduzida inclui CDC reduzido. Os ensaios de ligação de C1q podem ser realizados para determinar se o domínio Fc, ou anticorpo que compreende o domínio Fc, capaz de se ligar a C1q e, portanto, tem atividade de CDC. Ver, por exemplo, ELISA de ligação a C1q e C3c nos documentos WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar a ativação do complemento, pode ser realizado um ensaio de CDC(ver, por exemplo, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); Cragg e Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).[0173] In some embodiments, binding of the Fc domain to a complement component, specifically to C1q, is reduced. Accordingly, in some embodiments wherein the Fc domain is modified to have reduced effector function, said reduced effector function includes reduced CDC. C1q binding assays can be performed to determine whether the Fc domain, or antibody comprising the Fc domain, is capable of binding to C1q and therefore has CDC activity. See, for example, C1q and C3c binding ELISA in WO 2006/029879 and WO 2005/100402. To assess complement activation, a CDC assay can be performed (see, for example, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).
[0174] As determinações de ligação de FcRn e depuração in vivo/ semivida de vida podem também ser realizadas utilizando métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, petkova, SB et al., Int'l. Immunol. 18 (12): 1759- 1769 (2006); WO 2013/120929).ASPECTOS PARTICULARES DA INVENÇÃO[0174] Determinations of FcRn binding and in vivo clearance/half-life may also be performed using methods known in the art (see, e.g., Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18 (12): 1759- 1769 (2006); WO 2013/120929). PARTICULAR ASPECTS OF THE INVENTION
[0175] Em um aspecto, a invenção fornece proporciona um imunoconjugado compreendendo um polipeptídeo IL-2 mutante e um anticorpo que se liga a PD-1, em que o polipeptídeo de IL-2 mutante é uma molécula de IL-2 humana que compreende as substituições dos aminoácidos F42A, Y45A e L72G (numeração em relação à sequência de IL-2 humana SEQ. ID N°: 19); e em que o anticorpo compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 14 e (b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 15.[0175] In one aspect, the invention provides an immunoconjugate comprising a mutant IL-2 polypeptide and an antibody that binds to PD-1, wherein the mutant IL-2 polypeptide is a human IL-2 molecule comprising the amino acid substitutions F42A, Y45A, and L72G (numbering relative to the human IL-2 sequence SEQ. ID NO:19); and wherein the antibody comprises (a) a heavy chain variable region (VH) comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:14 and (b) a light chain variable region (VL) comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:15.
[0176] Em um aspecto, a invenção proporciona um imunoconjugado que compreende um polipeptídeo de IL-2 mutante e um anticorpo que se liga a PD-1, em que o polipeptídeo de IL-2 mutante é uma molécula de IL-2 humana que compreende as substituições de aminoácidos T3A, F42A, Y45A, L72G e C125A (numeração em relação à sequência de IL-2 humana SEQ. ID N°: 19); e em que o anticorpo compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 14 e (b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 15.[0176] In one aspect, the invention provides an immunoconjugate comprising a mutant IL-2 polypeptide and an antibody that binds to PD-1, wherein the mutant IL-2 polypeptide is a human IL-2 molecule comprising the amino acid substitutions T3A, F42A, Y45A, L72G, and C125A (numbering relative to the human IL-2 sequence SEQ. ID NO:19); and wherein the antibody comprises (a) a heavy chain variable region (VH) comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:14 and (b) a light chain variable region (VL) comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:15.
[0177] Em um aspecto, a invenção proporciona um imunoconjugado que compreende um polipeptídeo de IL-2 mutante e um anticorpo que se liga a PD-1, em que o polipeptídeo de IL-2 mutante compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 20; e em que o anticorpo compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 14 e (b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 15.[0177] In one aspect, the invention provides an immunoconjugate comprising a mutant IL-2 polypeptide and an antibody that binds to PD-1, wherein the mutant IL-2 polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ. ID NO:20; and wherein the antibody comprises (a) a heavy chain variable region (VH) comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:14 and (b) a light chain variable region (VL) comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:15.
[0178] Em uma forma de realização de acordo com qualquer um dos aspectos da invenção acima, o anticorpo uma imunoglobulina de classe de IgG, que compreende um domínio IgG 1 Fc humano composto por uma primeira e uma segunda subunidade, em que na primeira subunidade do domínio Fc o resíduo de treonina na posição 366 é substituído com um resíduo de triptofano (T366W), e na segunda subunidade do domínio Fc o resíduo de tirosina na posição 407 é substituído com um resíduo de valina (Y407V) e, de forma opcional, o resíduo de treonina na posição 366 é substituído com um resíduo de serina (T366S) e o resíduo de leucina na posição 368 é substituído com um resíduo de alanina (L368A) (numerações de acordo com o Índice EU de Kabat), e em que adicionalmente cada subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A, L235A e P329G (numeração de índice EU de Kabat).[0178] In an embodiment according to any of the above aspects of the invention, the antibody is an immunoglobulin of class IgG, which comprises a human IgG 1 Fc domain composed of a first and a second subunit, wherein in the first subunit of the Fc domain the threonine residue at position 366 is replaced with a tryptophan residue (T366W), and in the second subunit of the Fc domain the tyrosine residue at position 407 is replaced with a valine residue (Y407V) and, optionally, the threonine residue at position 366 is replaced with a serine residue (T366S) and the leucine residue at position 368 is replaced with an alanine residue (L368A) (numberings according to the Kabat EU Index), and wherein additionally each subunit of the Fc domain comprises the amino acid substitutions L234A, L235A and P329G (index numbering I of Kabat).
[0179] Nesta forma de realização, o polipeptídeo de IL-2 mutante pode ser fundido no seu aminoácido amino-terminal para o aminoácido carboxi- terminal da primeira subunidade do domínio Fc, por meio de um peptídeo adaptador da SEQ. ID N°: 21.[0179] In this embodiment, the mutant IL-2 polypeptide can be fused at its amino-terminal amino acid to the carboxy-terminal amino acid of the first subunit of the Fc domain, via an adapter peptide of SEQ ID NO:21.
[0180] Em um aspecto, a invenção proporciona um imunoconjugado que compreende um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à a sequência da SEQ. ID N°: 22, um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à do sequência da SEQ. ID N°: 23 ou SEQ. ID N°: 24, e um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico sequência da SEQ. ID N°: 25.POLINUCLEOTÍDEOS[0180] In one aspect, the invention provides an immunoconjugate comprising a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to the sequence of SEQ. ID NO:22, a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to the sequence of SEQ. ID NO:23 or SEQ. ID NO: 24, and a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to the sequence of SEQ. ID NO: 25.POLYNUCLEOTIDES
[0181] A invenção proporciona ainda polinucleotídeos isolados que codificam um imunoconjugado como aqui descrito ou um fragmento do mesmo. Em algumas formas de realização, o referido fragmento é um fragmento de ligação ao antígeno.[0181] The invention further provides isolated polynucleotides encoding an immunoconjugate as described herein or a fragment thereof. In some embodiments, said fragment is an antigen-binding fragment.
[0182] Os polinucleotídeos que codificam os imunoconjugados da invenção podem ser expressos como um polinucleotídeo único que codifica o imunoconjugado completo ou como polinucleotídeos múltiplos (por exemplo, dois ou mais) que são co-expressos. Os polipeptídeos codificados por polinucleotídeos que são co-expressos podem associar através, por exemplo, ligações dissulfureto ou outros meios para formar um imunoconjugado funcional. Por exemplo, a porção da cadeia leve de um anticorpo pode ser codificada por um polinucleotídeo separado da porção do imunoconjugado que compreende a porção da cadeia pesada do anticorpo e o polipeptídeo de IL-2 mutante. Quando co-expressos, os polipeptídeos da cadeia pesada irão associar-se aos polipeptídeos da cadeia leve para formar o imunoconjugado. Em outro exemplo, a porção de imunoconjugado que compreende uma das duas subunidades de domínio Fc e o polipeptídeo mutante da IL-2 poderia ser codificado por um polinucleotídeo separado da porção do imunoconjugado compreendendo a outra das duas subunidades do domínio Fc. Quando co-expressas, as subunidades do domínio Fc se associarão para formar o domínio Fc.[0182] The polynucleotides encoding the immunoconjugates of the invention may be expressed as a single polynucleotide encoding the complete immunoconjugate or as multiple polynucleotides (e.g., two or more) that are co-expressed. The polypeptides encoded by the polynucleotides that are co-expressed may associate through, for example, disulfide bonds or other means to form a functional immunoconjugate. For example, the light chain portion of an antibody may be encoded by a separate polynucleotide from the portion of the immunoconjugate that comprises the heavy chain portion of the antibody and the mutant IL-2 polypeptide. When co-expressed, the heavy chain polypeptides will associate with the light chain polypeptides to form the immunoconjugate. In another example, the portion of the immunoconjugate comprising one of the two Fc domain subunits and the mutant IL-2 polypeptide could be encoded by a separate polynucleotide than the portion of the immunoconjugate comprising the other of the two Fc domain subunits. When co-expressed, the Fc domain subunits will associate to form the Fc domain.
[0183] Em algumas formas de realização, o polinucleotídeo isolado codifica todo o imunoconjugado de acordo com a invenção como aqui descrito. Em outras formas de realização, o polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo compreendido no imunoconjugado de acordo com a invenção como aqui descrito.[0183] In some embodiments, the isolated polynucleotide encodes the entire immunoconjugate according to the invention as described herein. In other embodiments, the isolated polynucleotide encodes a polypeptide comprised in the immunoconjugate according to the invention as described herein.
[0184] Em uma forma de realização, um polinucleotídeo isolado da invenção codifica a cadeia pesada do anticorpo compreendido no imunoconjugado (por exemplo, uma cadeia pesada de imunoglobulina) e o polipeptídeo de IL-2 mutante. Em outra forma de realização, um polinucleotídeo isolado da invenção codifica a cadeia leve do anticorpo compreendido no imunoconjugado.[0184] In one embodiment, an isolated polynucleotide of the invention encodes the heavy chain of the antibody comprised in the immunoconjugate (e.g., an immunoglobulin heavy chain) and the mutant IL-2 polypeptide. In another embodiment, an isolated polynucleotide of the invention encodes the light chain of the antibody comprised in the immunoconjugate.
[0185] Em certas formas de realização, o polinucleotídeo ou ácido nucleico é DNA. Em outras formas de realização, um polinucleotídeo da presente invenção é RNA, por exemplo, na forma de RNA mensageiro (mRNA). O RNA da presente invenção pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla.MÉTODOS RECOMBINANTES[0185] In certain embodiments, the polynucleotide or nucleic acid is DNA. In other embodiments, a polynucleotide of the present invention is RNA, e.g., in the form of messenger RNA (mRNA). The RNA of the present invention can be single-stranded or double-stranded. RECOMBINANT METHODS
[0186] Os polipeptídeos IL-2 mutantes úteis na invenção podem ser preparados por deleção, substituição, inserção ou modificação utilizando métodos genéticos ou químicos bem conhecidos na técnica. Os métodos genéticos podem incluir mutagênese específica do local da sequência de DNA codificadora, PCR, síntese genética e semelhantes. As alterações de nucleotídeos corretas podem ser verificadas, por exemplo, por sequenciamento. A este respeito, a sequência nucleotídica da IL-2 nativa foi descrita por Taniguchi etal. (Nature 302, 305-10 (1983)) e ácido nucleico que codifica IL-2 humana está disponível em depositários públicos, tais como a American Type Culture Collection (Rockville MD). A sequência da IL-2 humana nativa é mostrada na SEQ. ID N°: 19. A substituição ou inserção pode envolver resíduos deaminoácidos naturais e não naturais. A modificação de aminoácidos inclui métodos bem conhecidos de modificação química, como a adição de locais de glicosilação ou anexos de carboidratos e semelhantes.[0186] Mutant IL-2 polypeptides useful in the invention can be prepared by deletion, substitution, insertion or modification using genetic or chemical methods well known in the art. Genetic methods can include site-specific mutagenesis of the coding DNA sequence, PCR, gene synthesis, and the like. Correct nucleotide changes can be verified, for example, by sequencing. In this regard, the nucleotide sequence of native IL-2 has been described by Taniguchi et al. (Nature 302, 305-10 (1983)) and nucleic acid encoding human IL-2 is available from public depositories, such as the American Type Culture Collection (Rockville MD). The sequence of native human IL-2 is shown in SEQ. ID NO: 19. The substitution or insertion can involve natural and unnatural amino acid residues. Modification of amino acids includes well-known methods of chemical modification, such as the addition of glycosylation sites or carbohydrate attachments, and the like.
[0187] Os imunoconjugados da invenção podem ser obtidos, por exemplo, por síntese de peptídeos no estado sólido (por exemplo, síntese de fase sólida de Merrifield) ou produção recombinante. Para a produção recombinante, isola-se um ou mais polinucleotídeos que codificam o imunoconjugado (fragmento), por exemplo, como descrito acima, e insere-se em um ou mais vetores para posterior clonagem e/ ou expressão em uma célula hospedeira. Tal polinucleotídeo pode ser prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais. Em uma forma de realização é proporcionado um vetor, de forma preferencial um vetor de expressão, que compreende um ou mais dos polinucleotídeos da invenção. Podem ser utilizados métodos que são bem conhecidos dos técnicos no assunto para construir vetores de expressão contendo a sequência de codificação de um imunoconjugado (fragmento) juntamente com sinais de controle de transcrição/ tradução apropriados. Estes métodos incluem técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas de síntese e recombinação in vivo/ recombinação genética. Veja, por exemplo, as técnicas descritas em Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1989); e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates e Wiley Interscience, NY (1989). O vetor de expressão pode fazer parte de um plasmídeo, vírus ou pode ser um fragmento de ácido nucleico. O vetor de expressão inclui um cassete de expressão na qual o polinucleotídeo que codifica o imunoconjugado (fragmento) (isto é, a região de codificação) é clonado em associação operável com um promotor e/ ou outros elementos de controle de transcrição ou tradução. Como aqui utilizado, uma “região de codificação” é uma porção de ácido nucleico que consiste em códons traduzidos em aminoácidos. Embora um “códon de parada” (TAG, TGA ou TAA) não seja traduzido em um aminoácido, ele pode ser considerado como parte de uma região codificante, se presente, mas quaisquer sequências flanqueadoras, por exemplo, promotores, locais de ligação ao ribossoma, terminadores de transcrição, íntrons, regiões 5 'e 3' não traduzidas e semelhantes, não fazem parte de uma região de codificação. Duas ou mais regiões codificantes podem estar presentes em uma única construção polinucleotídica, por exemplo, em um único vetor, ou em construções polinucleotídicas separadas, por exemplo, em vetores separados (diferentes). Além disso, qualquer vetor pode conter uma única região de codificação, ou pode compreender duas ou mais regiões codificadoras, por exemplo, um vetor da presente invenção pode codificar um ou mais polipeptídeos, que são separados pós ou co-translacionalmente nas proteínas finais via Clivagem proteolítica. Além disso, um vetor, polinucleotídeo ou ácido nucleico da invenção pode codificar regiões codificadoras heterólogas, fundidas ou não fundidas com um polinucleotídeo codificando o imunoconjugado da invenção, ou sua variante ou derivado. As regiões codificadoras heterólogas incluem, sem limitação, elementos ou motivos especializados, tais como um peptídeo sinal secretor ou um domínio funcional heterólogo. Uma associação operável é quando uma região de codificação para um produto gênico, por exemplo, um polipeptídeo, está associada a uma ou mais sequências reguladoras de modo a colocar a expressão do produto gênico sob a influência ou controle da (s) sequência (s) reguladora (s). Dois fragmentos de DNA (tais como uma região codificante de polipeptídeo e um promotor associado com estes) estão “operativamente associados” se a indução da função do promotor resultar na transcrição de mRNA que codifica o produto gênico desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interfere com a capacidade das sequências reguladoras de expressão para direcionar a expressão do produto gênico ou interferir na capacidade do modelo de DNA de ser transcrito. Assim, uma região promotora estaria operacionalmente associada a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo se o promotor fosse capaz de efetuar a transcrição desse ácido nucleico. O promotor pode ser um promotor específico de células que dirija a transcrição substancial do DNA apenas em células predeterminadas. Outros elementos de controle da transcrição, além de um promotor, por exemplo, estimuladores, operadores, repressores e sinais de terminação da transcrição, podem estar operacionalmente associados ao polinucleotídeo para dirigir a transcrição específica da célula. Promotores adequados e outras regiões de controle de transcrição são aqui divulgados. Uma variedade de regiões de controle da transcrição é conhecida pelos técnicos no assunto. Estes incluem, sem limitação, as regiões de controle de transcrição, que funcionam em células de vertebrados, tais como, mas não limitados a, promotores e intensificadores segmentos de citomegalovírus (por exemplo, o promotor precoce imediato, em conjunto com íntron-A), vírus símio 40 (por exemplo, o promotor precoce) e retrovírus (por exemplo, vírus do sarcoma de Rous). Outras regiões de controle da transcrição incluem aquelas derivadas de genes de vertebrados, tais como actina, proteína de choque térmico, hormona de crescimento bovina e β-globina de coelho, bem como outras sequências capazes de controlar a expressão genética em células eucarióticas. Regiões adicionais de controle de transcrição adequadas incluem promotores e potenciadores específicos de tecidos, bem como promotores indutíveis (por exemplo, promotores de tetraciclinas indutíveis). Do mesmo método, uma variedade de elementos de controle de tradução é conhecida dos técnicos no assunto. Estes incluem, mas não estão limitados a locais de ligação ao ribossoma, códons de iniciação e terminação da tradução, e elementos derivados de sistemas virais (em particular um local de entrada no ribossoma interno, ou IRES, também referido como uma sequência CITE). O cassete de expressão pode também incluir outras características, tais como uma origem de replicação e/ ou elementos de integração do cromossomo, tais como repetições terminais longas retrovirais (LTRs), ou repetições terminais invertidas adeno- associadas (AAV) (ITRs).[0187] The immunoconjugates of the invention can be obtained, for example, by solid state peptide synthesis (e.g., Merrifield solid phase synthesis) or recombinant production. For recombinant production, one or more polynucleotides encoding the immunoconjugate (fragment) are isolated, for example, as described above, and inserted into one or more vectors for subsequent cloning and/or expression in a host cell. Such a polynucleotide can be readily isolated and sequenced using conventional procedures. In one embodiment, a vector, preferably an expression vector, comprising one or more of the polynucleotides of the invention is provided. Methods that are well known to those skilled in the art can be used to construct expression vectors containing the coding sequence of an immunoconjugate (fragment) together with appropriate transcription/translation control signals. Such methods include in vitro recombinant DNA techniques, in vivo synthesis and recombination/genetic recombination techniques. See, for example, the techniques described in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1989); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY (1989). The expression vector may be part of a plasmid, virus, or may be a nucleic acid fragment. The expression vector includes an expression cassette into which the polynucleotide encoding the immunoconjugate (fragment) (i.e., the coding region) is cloned in operable association with a promoter and/or other transcriptional or translational control elements. As used herein, a “coding region” is a portion of nucleic acid consisting of codons translated into amino acids. Although a “stop codon” (TAG, TGA or TAA) is not translated into an amino acid, it may be considered part of a coding region if present, but any flanking sequences, e.g., promoters, ribosome binding sites, transcription terminators, introns, 5' and 3' untranslated regions, and the like, are not part of a coding region. Two or more coding regions may be present in a single polynucleotide construct, e.g., in a single vector, or in separate polynucleotide constructs, e.g., in separate (different) vectors. Furthermore, any vector may contain a single coding region, or may comprise two or more coding regions, e.g., a vector of the present invention may encode one or more polypeptides, which are post- or co-translationally cleaved into the final proteins via proteolytic cleavage. Furthermore, a vector, polynucleotide or nucleic acid of the invention may encode heterologous coding regions, fused or unfused to a polynucleotide encoding the immunoconjugate of the invention, or its variant or derivative. Heterologous coding regions include, without limitation, specialized elements or motifs, such as a secretory signal peptide or a heterologous functional domain. An operable association is when a coding region for a gene product, e.g., a polypeptide, is associated with one or more regulatory sequences in such a way as to place the expression of the gene product under the influence or control of the regulatory sequence(s). Two DNA fragments (such as a polypeptide coding region and a promoter associated therewith) are “operably associated” if induction of promoter function results in the transcription of mRNA encoding the desired gene product and if the nature of the linkage between the two DNA fragments does not interfere with the ability of the expression regulatory sequences to direct expression of the gene product or interfere with the ability of the DNA template to be transcribed. Thus, a promoter region would be operably associated with a nucleic acid encoding a polypeptide if the promoter were capable of effecting transcription of that nucleic acid. The promoter may be a cell-specific promoter that directs substantial transcription of DNA only in predetermined cells. Other transcriptional control elements in addition to a promoter, e.g., enhancers, operators, repressors, and transcription termination signals, may be operably associated with the polynucleotide to direct cell-specific transcription. Suitable promoters and other transcriptional control regions are disclosed herein. A variety of transcriptional control regions are known to those skilled in the art. These include, without limitation, transcriptional control regions that function in vertebrate cells, such as, but not limited to, promoters and enhancer segments of cytomegalovirus (e.g., the immediate early promoter, in conjunction with intron-A), simian virus 40 (e.g., the early promoter), and retroviruses (e.g., Rous sarcoma virus). Other transcriptional control regions include those derived from vertebrate genes, such as actin, heat shock protein, bovine growth hormone, and rabbit β-globin, as well as other sequences capable of controlling gene expression in eukaryotic cells. Additional suitable transcriptional control regions include tissue-specific promoters and enhancers, as well as inducible promoters (e.g., inducible tetracycline promoters). In the same method, a variety of translational control elements are known to those skilled in the art. These include, but are not limited to, ribosome binding sites, translation initiation and termination codons, and elements derived from viral systems (in particular an internal ribosome entry site, or IRES, also referred to as a CITE sequence). The expression cassette may also include other features, such as an origin of replication and/or chromosome integration elements, such as retroviral long terminal repeats (LTRs), or adeno-associated (AAV) inverted terminal repeats (ITRs).
[0188] As regiões de codificação polinucleotídica e de ácido nucleico da presente invenção podem estar associadas a regiões de codificação adicionais que codificam peptídeos secretórios ou de sinalização, que dirigem a secreção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. De acordo com a hipótese do sinal, proteínas secretadas por células de mamíferos têm um peptídeo sinal ou sequência líder de secreção que é clivada da proteína madura uma vez que a exportação da cadeia proteica em crescimento através do retículo endoplasmático rugoso tenha sido iniciada. Os técnicos no assunto sabem que os polipeptídeos segregados pelas células dos vertebrados têm, de forma geral, um peptídeo de sinal fundido com o terminal N do polipeptídeo, que é clivado do polipeptídeo traduzido para produzir uma forma segregada ou “madura” do polipeptídeo. Por exemplo, a IL-2 humana é traduzida com uma sequência sinal de 20 aminoácidos no terminal N do polipeptídeo, que é subsequentemente clivada para produzir a IL-2 humana madura de 133 aminoácidos. Em certas formas de realização, é utilizado o peptídeo sinal nativo, por exemplo, o peptídeo sinal IL-2 ou um peptídeo sinal da cadeia pesada ou da cadeia pesada de imunoglobulina, ou um derivado funcional dessa sequência que retém a capacidade de dirigir a secreção do polipeptídeo que é operacionalmente associado a isso. De forma alternativa, pode ser utilizado um peptídeo sinal de mamífero heterólogo, ou um derivado do mesmo funcional. Por exemplo, a sequência ler do tipo selvagem pode ser substituída pela sequência ler do ativador do plasminogênio tecidual humano (TPA) ou da β-glucuronidase do camundongo.[0188] The polynucleotide and nucleic acid coding regions of the present invention may be associated with additional coding regions that encode secretory or signal peptides that direct secretion of a polypeptide encoded by a polynucleotide of the present invention. According to the signal hypothesis, proteins secreted by mammalian cells have a signal peptide or secretory leader sequence that is cleaved from the mature protein once export of the growing protein chain across the rough endoplasmic reticulum has begun. Those skilled in the art will recognize that polypeptides secreted by vertebrate cells generally have a signal peptide fused to the N-terminus of the polypeptide that is cleaved from the translated polypeptide to produce a secreted or “mature” form of the polypeptide. For example, human IL-2 is translated with a 20 amino acid signal sequence at the N-terminus of the polypeptide that is subsequently cleaved to produce the 133 amino acid mature human IL-2. In certain embodiments, the native signal peptide, e.g., the IL-2 signal peptide or a heavy chain or immunoglobulin heavy chain signal peptide, or a functional derivative of such a sequence that retains the ability to direct secretion of the polypeptide that is operatively associated therewith, is used. Alternatively, a heterologous mammalian signal peptide, or a functional derivative thereof, may be used. For example, the wild-type ler sequence may be replaced by the ler sequence of human tissue plasminogen activator (TPA) or mouse β-glucuronidase.
[0189] O DNA en que codifica uma sequência proteica curta que pode ser utilizada para facilitar a purificação posterior (por exemplo, um marcador de histidina) ou auxiliar na marcação do imunoconjugado pode ser incluído nas extremidades do polinucleotídeo que codifica o imunoconjugado (fragmento).[0189] DNA encoding a short protein sequence that can be used to facilitate later purification (e.g., a histidine tag) or aid in labeling the immunoconjugate can be included at the ends of the polynucleotide encoding the immunoconjugate (fragment).
[0190] Em uma outra forma de realização, é proporcionada uma célula hospedeira que compreende um ou mais polinucleotídeos da invenção. Em certas formas de realização é fornecida uma célula hospedeira que compreende um ou mais vetores da invenção. Os polinucleotídeos e vetores podem incorporar quaisquer das características, isoladamente ou em combinação, aqui descritas em relação a polinucleotídeos e vetores, respectivamente. Em tal forma de realização, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada ou transfectada com) um ou mais vetores que compreendem um ou mais polinucleotídeos que codificam o imunoconjugado da invenção. Como aqui utilizado, o termo “célula hospedeira” refere-se a qualquer tipo de sistema celular que pode ser manipulado para gerar os imunoconjugados da invenção ou fragmentos dos mesmos. As células hospedeiras adequadas para replicação e para suportar a expressão de imunoconjugados são bem conhecidas na técnica. Tais células podem ser transfectadas ou transduzidas, conforme apropriado, com o vetor de expressão particular e podem ser cultivadas grandes quantidades de células contendo vetor para a sementeira de fermentadores de larga escala para obter quantidades suficientes do imunoconjugado para aplicações cíclicas. Células hospedeiras adequadas incluem microrganismos procarióticos, tais como E. coli, ou vias células eucarióticas, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), células de inseto ou semelhantes. Por exemplo, os polipeptídeos podem ser produzidos em bactérias em particular quando a glicosilação não é necessária. Após expressão, o polipeptídeo pode ser isolado a partir da pasta celular bacteriana em uma fração solúvel e pode ser ainda purificado. Além dos procariotos, os micróbios eucariotas, como fungos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores codificadores de polipeptídeos, incluindo cepas de fungos e leveduras cujas vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de um polipeptídeo com ou padrão de glicosilação totalmente humano. Ver Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), e Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006). As células hospedeiras adequadas para a expressão de polipeptídeos (glicosilados) são também derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células de plantas e insetos. Foram identificadas numerosas estirpes baculovirais que podem ser utilizadas em conjunto com células de inseto, em particular para transfecção de células de Spodoptera frugiperda. Culturas de células de plantas também podem ser utilizadas como hospedeiras. Ver, por exemplo, Patentes US Nos. 5959177, 6040498, 6420548, 7125978, e 6417429 (que descrevem PlantibodiesTMtecnologia para a produção de anticorpos em plantas transgénicas). Células vertebradas também podem ser usadas como hospedeiros. Por exemplo, linhas de células de mamífero que são adaptadas para crescer em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhas celulares hospedeiras de mamífero úteis são a linha CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linha de rim embrionário humano (células 293 ou 293T como descrito, por exemplo, em Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), células renais de hamster bebé (BHK), células de sertoli de camundongo (células TM4 como descrito, por exemplo, em Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), células de rim de macaco (CV1), células de rim de macaco verde africano (VERO-76), células de carcinoma cervical humano (HELA), células de rim canino (MDCK), células de fígado de camundongo búfalo (BRL 3A), células pulmonares humanas (W138) células hepáticas (Hep G2), células tumorais mamárias de ratinho (MMT 060562), células TRI (como descrito, por exemplo, em Mather et al., Annals NY Acad Sci 383, 44-68 (1982)), células MRC 5 e células FS4. Outras linhas celulares hospedeiras de mamífero úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células dhfr - CHO (Urlaub et al., proc Natl Acad Sei USA 77, 4216 (1980)); e linhas celulares de mieloma, tais como YO, NS0, p3X63 e Sp2/ 0. Para uma revisão de certas linhas celulares hospedeiras de mamíferos adequadas para a produção de proteínas, ver, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (BKC Lo, ed., Humano Pressão, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003). As células hospedeiras incluem células cultivadas, por exemplo, células cultivadas em mamíferos, células de levedura, células de inseto, células bacterianas e células de plantas, para mencionar apenas algumas, mas também células compreendidas dentro de um animal transgênico, planta transgénica ou tecido vegetal ou animal cultivado. Em uma forma de realização, a célula hospedeira uma célula eucariótica, de forma preferencial uma célula de mamífero, tal como uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO), uma célula de rim embrionário humano (HEK) ou uma célula linfóide (por exemplo, Y0, NS0, célula Sp20).[0190] In another embodiment, a host cell comprising one or more polynucleotides of the invention is provided. In certain embodiments, a host cell comprising one or more vectors of the invention is provided. The polynucleotides and vectors may incorporate any of the features, alone or in combination, described herein with respect to polynucleotides and vectors, respectively. In such an embodiment, a host cell comprises (e.g., has been transformed or transfected with) one or more vectors comprising one or more polynucleotides encoding the immunoconjugate of the invention. As used herein, the term “host cell” refers to any type of cellular system that can be engineered to generate the immunoconjugates of the invention or fragments thereof. Suitable host cells for replication and for supporting expression of immunoconjugates are well known in the art. Such cells can be transfected or transduced, as appropriate, with the particular expression vector, and large numbers of vector-containing cells can be cultured for seeding large-scale fermenters to obtain sufficient quantities of the immunoconjugate for cyclic applications. Suitable host cells include prokaryotic microorganisms, such as E. coli, or eukaryotic cells, such as Chinese hamster ovary (CHO) cells, insect cells, or the like. For example, polypeptides can be produced in particular bacteria when glycosylation is not required. After expression, the polypeptide can be isolated from the bacterial cell paste in a soluble fraction and can be further purified. In addition to prokaryotes, eukaryotic microbes, such as filamentous fungi or yeast, are suitable cloning or expression hosts for polypeptide-encoding vectors, including fungal and yeast strains whose glycosylation pathways have been “humanized,” resulting in the production of a polypeptide with a fully human glycosylation pattern. See Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), and Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006). Suitable host cells for expression of (glycosylated) polypeptides are also derived from multicellular organisms (invertebrates and vertebrates). Examples of invertebrate cells include plant and insect cells. Numerous baculoviral strains have been identified that can be used in conjunction with insect cells, in particular for transfection of Spodoptera frugiperda cells. Plant cell cultures can also be used as hosts. See, for example, U.S. Patent Nos. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, and 6,417,429 (describing Plantibodies™ technology for the production of antibodies in transgenic plants). Vertebrate cells can also be used as hosts. For example, mammalian cell lines that are adapted to growth in suspension may be useful. Other examples of useful mammalian host cell lines are the SV40-transformed monkey kidney CV1 line (COS-7); human embryonic kidney line (293 or 293T cells as described, e.g., in Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), baby hamster kidney (BHK) cells, mouse Sertoli cells (TM4 cells as described, e.g., in Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), monkey kidney (CV1) cells, African green monkey kidney (VERO-76) cells, human cervical carcinoma (HELA) cells, canine kidney (MDCK) cells, buffalo mouse liver (BRL 3A) cells, human lung (W138) cells, liver (Hep G2) cells, mouse mammary tumor (MMT 060562) cells, TRI cells (as described, e.g., in Mather et al., Annals NY Acad Sci 383, 44-68 (1982)), MRC 5 cells, and FS4 cells. Other useful mammalian host cell lines include Chinese hamster ovary (CHO) cells, including dhfr - CHO cells (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); and myeloma cell lines, such as YO, NS0, p3X63, and Sp2/0. For a review of certain mammalian host cell lines suitable for protein production, see, for example, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (BKC Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ), pp. 255–268 (2003). Host cells include cultured cells, for example, cultured mammalian cells, yeast cells, insect cells, bacterial cells and plant cells, to name but a few, but also cells comprised within a transgenic animal, transgenic plant or cultured plant or animal tissue. In one embodiment, the host cell is a eukaryotic cell, preferably a mammalian cell, such as a Chinese Hamster Ovary (CHO) cell, a human embryonic kidney (HEK) cell or a lymphoid cell (e.g., Y0, NS0, Sp20 cell).
[0191] As tecnologias padrão são conhecidas na técnica para expressar genes estranhos nestes sistemas. As células que expressam um polipeptídeo de IL-2 mutante fundido com a cadeia pesada ou leve de um anticorpo podem ser manipuladas de modo a também expressar a outra das cadeias de anticorpo de tal forma que o produto de fusão IL-2 mutante expresso é um anticorpo que tem tanto uma pesada quanto uma leve.[0191] Standard technologies are known in the art for expressing foreign genes in these systems. Cells expressing a mutant IL-2 polypeptide fused to either the heavy or light chain of an antibody can be engineered to also express the other of the antibody chains such that the expressed mutant IL-2 fusion product is an antibody having both a heavy and a light chain.
[0192] Em uma forma de realização, proporcionado um método para a produção de um imunoconjugado de acordo com a invenção, em que o método compreende cultivar uma célula hospedeira que compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam o imunoconjugado, como aqui proporcionado, sob condições adequadas para expressão do imunoconjugado e, de forma opcional, recuperando o imunoconjugado da célula hospedeira (ou meio de cultura de células hospedeiras).[0192] In one embodiment, provided is a method for producing an immunoconjugate according to the invention, wherein the method comprises culturing a host cell comprising one or more polynucleotides encoding the immunoconjugate, as provided herein, under conditions suitable for expression of the immunoconjugate, and optionally recovering the immunoconjugate from the host cell (or host cell culture medium).
[0193] No imunoconjugado da invenção, o polipeptídeo de IL-2 mutante pode ser geneticamente fundido ao anticorpo, ou pode ser quimicamente conjugado com o anticorpo. A fusão genética do polipeptídeo de IL-2 ao anticorpo pode ser concebida de forma que a sequência de IL-2 seja fundida diretamente no polipeptídeo ou indiretamente através de uma sequência de ligação. A composição e comprimento do de ligação podem ser determinados de acordo com métodos bem conhecidos na técnica e podem ser testados quanto eficácia. Os peptídeos de ligações particulares são aqui descritos. Sequências adicionais podem também ser incluídas para incorporar um local de clivagem para separar os componentes individuais da fusão, se desejado, por exemplo, uma sequência de reconhecimento de endopeptidase. Adicionalmente, uma proteína de fusão de IL-2 pode também ser sintetizada quimicamente utilizando métodos de síntese de polipeptídeos como bem conhecido na especialidade (por exemplo, síntese de série sólida de Merrifield). Os polipeptídeos de IL-2 mutantes podem ser quimicamente conjugados com outras moléculas, por exemplo, anticorpos, utilizando métodos de conjugação química bem conhecidos. Reagentes de reticulação bi-funcionais, tais como reagentes de reticulação homofuncionais e heterofuncionais bem conhecidos na técnica, podem ser utilizados para este fim. O tipo de reagente de reticulação a utilizar depende da natureza da molécula a ser acoplada a IL-2 e pode ser prontamente identificada pelos técnicos no assunto. De forma alternativa, ou adicionalmente, a IL-2 mutante e/ ou a molécula à qual se pretende que seja conjugada podem ser derivadas quimicamente de tal forma que as duas possam ser conjugadas em uma reação separada como também é bem conhecido na técnica.[0193] In the immunoconjugate of the invention, the mutant IL-2 polypeptide may be genetically fused to the antibody, or may be chemically conjugated to the antibody. The genetic fusion of the IL-2 polypeptide to the antibody may be designed such that the IL-2 sequence is fused directly to the polypeptide or indirectly through a linker sequence. The composition and length of the linker may be determined according to methods well known in the art and may be tested for efficacy. Particular linker peptides are described herein. Additional sequences may also be included to incorporate a cleavage site to separate the individual components of the fusion, if desired, e.g., an endopeptidase recognition sequence. Additionally, an IL-2 fusion protein may also be chemically synthesized using polypeptide synthesis methods as well known in the art (e.g., Merrifield solid-array synthesis). Mutant IL-2 polypeptides can be chemically conjugated to other molecules, e.g., antibodies, using well-known chemical conjugation methods. Bi-functional cross-linking reagents, such as homofunctional and heterofunctional cross-linking reagents well known in the art, can be used for this purpose. The type of cross-linking reagent to be used depends on the nature of the molecule to be coupled to IL-2 and can be readily identified by those skilled in the art. Alternatively, or additionally, the mutant IL-2 and/or the molecule to which it is intended to be conjugated can be chemically derivatized such that the two can be conjugated in a separate reaction as is also well known in the art.
[0194] Os imunoconjugados da invenção compreendem um anticorpo. Os métodos para produzir anticorpos são bem conhecidos no estado da técnica (ver, por exemplo, Harlow e Lane, “Antibodies, a laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Anticorpos de ocorrência não natural podem ser construídos usando síntese de peptídeos em fase sólida, podem ser produzidos de forma recombinante (por exemplo, como descrito na patente US N4,186,567) ou pode ser obtido, por exemplo, por rastreio de bibliotecas combinatórias compreendendo cadeias pesadas varieis e cadeias leves varieis (veja-se, por exemplo, patente US N° 5.969.108 de McCafferty). Imunoconjugados, anticorpos e métodos para produzir os mesmos são também descritos em detalhe, por exemplo, na publicação PCT N°s. O documento WO 2011/020783, WO, 2012/ 107417, e WO 2012/146628, cada um dos quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.[0194] The immunoconjugates of the invention comprise an antibody. Methods for producing antibodies are well known in the art (see, e.g., Harlow and Lane, “Antibodies, a laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Non-naturally occurring antibodies can be constructed using solid-phase peptide synthesis, can be produced recombinantly (e.g., as described in U.S. Pat. No. 4,186,567), or can be obtained, e.g., by screening combinatorial libraries comprising variable heavy chains and variable light chains (see, e.g., U.S. Pat. No. 5,969,108 to McCafferty). Immunoconjugates, antibodies, and methods for producing the same are also described in detail, e.g., in PCT Publication Nos. WO 2011/020783, WO 2012/107417, and WO 2012/146628, each of which are incorporated herein by reference in their entirety.
[0195] Qualquer espécie animal de anticorpo pode ser utilizada nos imunoconjugados da invenção. Anticorpos não limitantes úteis na presente invenção podem ser de origem murina, primata ou humano. Se o imunoconjugado for destinado ao uso humano, pode ser utilizada uma forma química de anticorpo em que as regiões constantes do anticorpo são de um humano. Uma forma humanizada ou totalmente humano do anticorpo pode também ser preparada de acordo com métodos bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, patente US N° 5,565,332 de Winter). A humanização pode ser conseguida por vários métodos incluindo, mas não limitados a (a) enxertar as CDRs não humanos (por exemplo, anticorpo dador) na estrutura humano (por exemplo anticorpo receptor) e regiões constantes com ou sem retenção de resíduos estruturais críticos (por exemplo, aqueles que são importantes para manter uma boa afinidade de ligação ao antígeno ou funções do anticorpo), (b) enxertar apenas as regiões determinantes da especificidade não humano (SDRs ou a-CDRs; os resíduos críticos para a interação anticorpo-antígeno) na estrutura humano e regiões constantes ou (c) transplantar todos os domínios variáveis não humanos, mas “ocultando-os” com uma seção semelhante a humano por substituição de resíduos superficiais. Anticorpos humanizados e métodos de fazê-los são revisados, por exemplo, em Almagro e Fransson, Front. Biosci 13: 1619-1633 (2008), e são descritos mais adiante, por exemplo, em Riechmann et al. Nature 332: 323-329 (1988); Queen et al., proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989); Patentes US Nos. 5, 821.337, 7.527.791,6.982.321 e 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36: 25-34 (2005) (descrevendo a região determinante da especificidade (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28: 489- 498 (1991) (descrevendo “resurfacing”); Dall'Acqua et al., Methods 36: 43-60 (2005) (descrevendo “FR shuffling”); e Osbourn et al., Methods 36: 61-68 (2005) e Klimka et al. J. Câncer, 83: 252-260 (2000) (descrevendo a abordagem de “seleção guiada” para embaralhar FR). As regiões estruturais humanas que podem ser utilizadas para humanização incluem, mas não se limitam a: regiões estruturais selecionadas utilizando o método “melhor ajuste” (ver, por exemplo, Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993)); regiões estruturais derivadas da sequência de consenso de anticorpos humanos de um subgrupo particular de regiões variáveis da cadeia leve ou pesada (ver, por exemplo, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 4285 (1992); e Presta et. al. J. Immunol., 151: 2623 (1993)); regiões de estrutura humanos maduras (somaticamente mutadas) ou regiões de estrutura de linha germinal humano (ver, por exemplo, Almagro e Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)); e regiões estruturais derivadas da pesquisa de bibliotecas FR (ver, por exemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272: 10678-10684 (1997) e Rosok et al., J. Biol. Chem. 271: 22611-22618 (1996)).[0195] Any animal species of antibody may be used in the immunoconjugates of the invention. Non-limiting antibodies useful in the present invention may be of murine, primate, or human origin. If the immunoconjugate is intended for human use, a chemical form of the antibody in which the constant regions of the antibody are from a human may be used. A humanized or fully human form of the antibody may also be prepared according to methods well known in the art (see, e.g., U.S. Patent No. 5,565,332 to Winter). Humanization can be achieved by several methods including, but not limited to, (a) grafting the nonhuman (e.g., donor antibody) CDRs onto the human (e.g., recipient antibody) framework and constant regions with or without retention of critical framework residues (e.g., those that are important for maintaining good antigen-binding affinity or antibody functions), (b) grafting only the nonhuman specificity-determining regions (SDRs or a-CDRs; the residues critical for antibody-antigen interaction) onto the human framework and constant regions, or (c) transplanting all nonhuman variable domains but “hiding” them with a human-like section by substitution of surface residues. Humanized antibodies and methods of making them are reviewed, e.g., in Almagro and Fransson, Front. Biosci 13: 1619–1633 (2008), and are described further, e.g., in Riechmann et al. Nature 332:323–329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029–10033 (1989); US Patent Nos. 5,821,337, 7,527,791,6,982,321, and 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25–34 (2005) (describing the specificity determining region (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489– 498 (1991) (describing “resurfacing”); Dall'Acqua et al., Methods 36:43–60 (2005) (describing “FR shuffling”); and Osbourn et al., Methods 36:61–68 (2005) and Klimka et al., J. Cancer, 83:252–260 (2000) (describing the “guided selection” approach to FR shuffling). Human framework regions that can be used for humanization include, but are not limited to: framework regions selected using the “best fit” method (see, e.g., Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993)); framework regions derived from the human antibody consensus sequence of a particular subgroup of light or heavy chain variable regions (see, e.g., Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); and Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)); mature (somatically mutated) human framework regions or human germline framework regions (see, e.g., Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619–1633 (2008)); and framework regions derived from screening of FR libraries (see, e.g., Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678–10684 (1997) and Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611–22618 (1996)).
[0196] Os anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na técnica. Os anticorpos humanos são descritos genericamente em van Dijk e van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) e Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Os anticorpos humanos podem ser preparados administrando um imunogênio a um animal transgênico que foi modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta a provocação antigênica. Estes animais contêm tipicamente toda ou uma parte dos loci de imunoglobulina humano, que substituem os loci de imunoglobulina endógenos, ou que estão presentes extracromossomáticamente ou integrados aleatoriamente nos cromossomos do animal. Em tais camundongos transgênicos, os loci de imunoglobulina endógenos foram geralmente inativados. Para revisão de métodos para obtenção de anticorpos humanos a partir de animais transgênicos, ver Lonberg, Nat. Biotecnologia 23: 1117-1125 (2005). Ver também, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 6.075.181 e 6.150.584 descrevendo a tecnologia XENOMOUSETM; Patente U.S. N° 5.770.429 descrevendo a tecnologia HUMAB®; Patente U.S. N° 7,041,870 descrevendo a tecnologia K-M MOUSE® e a Publicação do Pedido de Patente U.S. N° US 2007/0061900, descrevendo a tecnologia VELOCIMOUSE®). As regiões variáveis humanas de anticorpos intactos gerados por tais animais podem ser adicionalmente modificadas, por exemplo, combinando com uma região constante humano diferente.[0196] Human antibodies can be produced using a variety of techniques known in the art. Human antibodies are described generically in van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) and Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Human antibodies can be prepared by administering an immunogen to a transgenic animal that has been engineered to produce intact human antibodies or intact antibodies with human variable regions in response to antigenic challenge. These animals typically contain all or a portion of the human immunoglobulin loci, which replace the endogenous immunoglobulin loci, or which are present extrachromosomally or randomly integrated into the chromosomes of the animal. In such transgenic mice, the endogenous immunoglobulin loci have generally been inactivated. For a review of methods for obtaining human antibodies from transgenic animals, see Lonberg, Nat. Biotechnology 23: 1117-1125 (2005). See also, for example, U.S. Patent Nos. 6,075,181 and 6,150,584 describing the XENOMOUSETM technology; U.S. Patent No. 5,770,429 describing the HUMAB® technology; U.S. Patent No. 7,041,870 describing the K-M MOUSE® technology; and U.S. Patent Application Publication No. US 2007/0061900 describing the VELOCIMOUSE® technology). The human variable regions of intact antibodies generated by such animals can be further modified, for example, by combining with a different human constant region.
[0197] Anticorpos humanos também podem ser produzidos por métodos com base em hibridoma. Foram descritas linhas celulares de mieloma humano e heteromieloma camundongo-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos. (Ver, por exemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001(1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, p. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987); e Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991). Anticorpos humanos gerados via tecnologia de hibridoma de células B humanas são também descritos em Li et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562 (2006). Métodos adicionais incluem osdescritos, por exemplo, na Patente US N° 7,189,826 (descrevendo a produção de anticorpos IgM humanos monoclonais a partir de linhas celulares de hibridoma) e Ni, Xiandai Mianyixue, 26 (4): 265-268 (2006) (descrevendohibridomas humano-humano). A tecnologia de hibridomas humanos (tecnologia Trioma) também é descrita em Vollmers e Brandlein, Histology and Histopathology, 20 (3): 927-937 (2005) e Vollmers e Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27 (3): 185-91 (2005).[0197] Human antibodies can also be produced by hybridoma-based methods. Human myeloma and mouse-human heteromyeloma cell lines have been described for the production of human monoclonal antibodies. (See, e.g., Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991). Human antibodies generated via human B-cell hybridoma technology are also described in Li et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562 (2006). Additional methods include those described, e.g., in U.S. Patent No. 7,189,826 (describing the production of human monoclonal IgM antibodies from hybridoma cell lines) and Ni, Xiandai Mianyixue, 26 (4): 265–268 (2006) (describing human–human hybridomas). Human hybridoma technology (Trioma technology) is also described in Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20 (3): 927–937 (2005) and Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27 (3): 185–91 (2005).
[0198] Anticorpos humanos podem também ser gerados por isolamento de bibliotecas de anticorpos humanos, como aqui descrito.[0198] Human antibodies can also be generated by isolating human antibody libraries as described herein.
[0199] Anticorpos úteis na invenção podem ser isolados rastreando bibliotecas combinatórias para anticorpos com a atividade ou atividades desejadas. Métodos para rastrear bibliotecas combinatórias são revisados, por exemplo, em Lerner et al. na Nature Reviews 16: 498-508 (2016). Por exemplo, uma variedade de métodos é conhecida na técnica para gerar bibliotecas de exibição de fagos e rastrear tais bibliotecas para anticorpos que possui as características de ligação desejadas. Tais métodos são revisados, por exemplo, em Frenzel et al. em mAbs 8: 1177-1194 (2016); Bazan et al. em Human Vaccines and Immunotherapeutics 8: 1817-1828 (2012) e Zhao et al. em Critical Reviews in Biotechnology 36: 276-289 (2016) bem como em Hoogenboom et al. em Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Pressão, Totowa, NJ, 2001) e em Marks e Bradbury em Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, ed., Human Pressão, Totowa, NJ, 2003).[0199] Antibodies useful in the invention can be isolated by screening combinatorial libraries for antibodies with the desired activity or activities. Methods for screening combinatorial libraries are reviewed, for example, in Lerner et al. in Nature Reviews 16:498-508 (2016). For example, a variety of methods are known in the art for generating phage display libraries and screening such libraries for antibodies that have the desired binding characteristics. Such methods are reviewed, for example, in Frenzel et al. in mAbs 8:1177-1194 (2016); Bazan et al. in Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828 (2012) and Zhao et al. in Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289 (2016) as well as in Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Pressure, Totowa, NJ, 2001) and in Marks and Bradbury in Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, ed., Human Pressure, Totowa, NJ, 2003).
[0200] Em determinados métodos de apresentação em fagos, os repertórios dos genes VH e VL são separadamente clonados por reação em cadeia com polimerase (PCR) e recombinados aleatoriamente em bibliotecas de fagos, que podem então ser rastreadas para fago de ligação ao antígeno como descrito em Winter et al. em Annual Review of Immunology 12: 433-455 (1994). Os fagos apresentam tipicamente fragmentos de anticorpo, quer como fragmentos Fv de cadeia simples (scFv), quer como fragmentos Fab. Bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos de alta afinidade para o imunogênio sem a necessidade de construir hibridomas. De forma alternativa, o repertório ingênuo pode ser clonado (por exemplo, de humano) para proporcionar uma única fonte de anticorpos para uma vasta faixa de não-próprios e também de auto-antígenos sem qualquer imunização, como descrito por Griffiths et al. em EMBO Journal 12: 725-734 (1993). Finalmente, também podem ser feitas bibliotecas naive por clonagem de segmentos de genes V não rearranjados a partir de células estaminais, e utilizando iniciadores de PCR contendo sequência aleatória para codificar as regiões de CDR3 altamente variáveis e para realizar o rearranjo in vitro, como descrito por Hoogenboom e Winter in Journal of Journal. Molecular Biology 227: 381-388 (1992). As publicações de patentes que descrevem bibliotecas de fagos de anticorpos humanos incluem, por exemplo: Patente US Nos. 5.750.373; 7,985,840; 7.785.903 e 8.679.490, bem como nas Publicações de Patente US Nos. 2005/0079574, 2007/0117126, 2007/0237764 e 2007/0292936. Outros exemplos de métodos conhecidos na especialidade para rastrear bibliotecas combinatórias para anticorpos com uma atividade ou atividades desejadas incluem apresentação de ribossoma e mRNA, bem como métodos para apresentação e seleção de anticorpos em bactérias, células de mamífero, células de inseto ou células de levedura. Os métodos para a exibição da superfície da levedura são revisados, por exemplo, em Scholler et al. em Methods in Molecular Biology 503: 135-56 (2012) e em Cherf et al. em Methods in Molecular biology 1319: 155-175 (2015) e também em Zhao et al. em Methods in Molecular Biology 889: 73-84 (2012). Os métodos para apresentação do ribossoma estão descritos, por exemplo, em He etal. em Nucleic Acids Research 25: 5132-5134 (1997) e em Hanes et al. em PNAS 94: 4937-4942 (1997).[0200] In certain phage display methods, the VH and VL gene repertoires are separately cloned by polymerase chain reaction (PCR) and randomly recombined into phage libraries, which can then be screened for antigen-binding phage as described in Winter et al. in Annual Review of Immunology 12: 433-455 (1994). Phage typically display antibody fragments, either as single-chain Fv fragments (scFv) or as Fab fragments. Libraries from immunized sources provide high-affinity antibodies to the immunogen without the need to construct hybridomas. Alternatively, the naive repertoire can be cloned (e.g., from human) to provide a single source of antibodies to a broad range of non-self as well as self-antigens without any immunization, as described by Griffiths et al. in EMBO Journal 12: 725-734 (1993). Finally, naive libraries can also be made by cloning unrearranged V gene segments from stem cells, and using PCR primers containing random sequence to encode the highly variable CDR3 regions and to perform the rearrangement in vitro, as described by Hoogenboom and Winter in Journal of Molecular Biology 227: 381-388 (1992). Patent publications describing human antibody phage libraries include, for example: U.S. Patent Nos. 5,750,373; 7,985,840; 7,785,903 and 8,679,490, as well as U.S. Patent Publication Nos. 2005/0079574, 2007/0117126, 2007/0237764 and 2007/0292936. Other examples of methods known in the art for screening combinatorial libraries for antibodies with a desired activity or activities include ribosome and mRNA display, as well as methods for displaying and selecting antibodies in bacteria, mammalian cells, insect cells, or yeast cells. Methods for yeast surface display are reviewed, for example, in Scholler et al. in Methods in Molecular Biology 503:135–56 (2012) and in Cherf et al. in Methods in Molecular biology 1319:155–175 (2015) and also in Zhao et al. in Methods in Molecular Biology 889:73–84 (2012). Methods for ribosome display are described, for example, in He et al. in Nucleic Acids Research 25:5132–5134 (1997) and in Hanes et al. in PNAS 94: 4937–4942 (1997).
[0201] Outra modificação química do imunoconjugado da invenção pode ser desejável. Por exemplo, problemas de imunogenicidade e semi-vida curta podem ser melhorados por conjugação com polímeros de cadeia substancialmente linear, tais como polietilenoglicol (PEG) ou polipropilenoglicol (PPG) (ver, por exemplo, WO 87/00056).[0201] Other chemical modification of the immunoconjugate of the invention may be desirable. For example, problems of immunogenicity and short half-life may be ameliorated by conjugation with substantially linear chain polymers such as polyethylene glycol (PEG) or polypropylene glycol (PPG) (see, for example, WO 87/00056).
[0202] Imunoconjugados preparado como aqui descrito, pode ser purificado por técnicas conhecidas na técnica, tais como cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia de permutação iônica, eletroforese em gel, cromatografia de afinidade, cromatografia de exclusão de tamanho, e semelhantes. As condições reais utilizadas para purificar uma proteína particular dependerão, em parte, de fatores, tais como carga líquida, hidrofobicidade, hidrofilicidade, etc., e serão evidentes para os técnicos no assunto. Para purificação por cromatografia de afinidade, pode ser utilizado um anticorpo, ligando, receptor ou antígeno ao qual o imunoconjugado se liga. Por exemplo, pode ser utilizado um anticorpo que se ligue de forma específica ao polipeptídeo de IL-2 mutante. Para purificação por cromatografia de afinidade de imunoconjugados da invenção, pode ser utilizada uma matriz com proteína A ou proteína G. Por exemplo, podem ser utilizadas cromatografia de afinidade sequencial de Proteína A ou G e cromatografia de exclusão de tamanho para isolar um imunoconjugado essencialmente como descrito nos Exemplos. A pureza do imunoconjugado pode ser determinada por qualquer um de uma variedade de métodos analíticos bem conhecidos, incluindo eletroforese em gel, cromatografia liquida de alta pressão e semelhantes.COMPOSIÇÕES, FORMULAÇÕES E ROTAS DE ADMINISTRAÇÃO[0202] Immunoconjugates prepared as described herein can be purified by techniques known in the art, such as high performance liquid chromatography, ion exchange chromatography, gel electrophoresis, affinity chromatography, size exclusion chromatography, and the like. The actual conditions used to purify a particular protein will depend, in part, on factors such as net charge, hydrophobicity, hydrophilicity, etc., and will be apparent to those skilled in the art. For affinity chromatography purification, an antibody, ligand, receptor, or antigen to which the immunoconjugate binds can be used. For example, an antibody that specifically binds to the mutant IL-2 polypeptide can be used. For affinity chromatography purification of immunoconjugates of the invention, a matrix with protein A or protein G can be used. For example, sequential affinity chromatography of Protein A or G and size exclusion chromatography can be used to isolate an immunoconjugate essentially as described in the Examples. The purity of the immunoconjugate can be determined by any of a variety of well-known analytical methods, including gel electrophoresis, high-pressure liquid chromatography, and the like.COMPOSITIONS, FORMULATIONS, AND ROUTES OF ADMINISTRATION
[0203] Em um outro aspecto, a invenção proporciona composições farmacêuticas que compreendem um imunoconjugado como aqui descrito, por exemplo, para uso em qualquer um dos métodos terapêuticos abaixo. Em uma forma de realização, uma composição farmacêutica compreende qualquer um dos imunoconjugados aqui proporcionados e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outra forma de realização, uma composição farmacêutica compreende qualquer um dos imunoconjugados aqui proporcionados e pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, como descrito abaixo.[0203] In another aspect, the invention provides pharmaceutical compositions comprising an immunoconjugate as described herein, for example, for use in any of the therapeutic methods below. In one embodiment, a pharmaceutical composition comprises any of the immunoconjugates provided herein and a pharmaceutically acceptable carrier. In another embodiment, a pharmaceutical composition comprises any of the immunoconjugates provided herein and at least one additional therapeutic agent, for example, as described below.
[0204] É ainda proporcionado um método para produzir um imunoconjugado da invenção em uma forma adequada para administração in vivo, que compreende o método (a) obter um imunoconjugado de acordo com a invenção, e (b) formular o imunoconjugado com pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável, em que uma preparação de imunoconjugado é formulada para administração in vivo.[0204] There is further provided a method for producing an immunoconjugate of the invention in a form suitable for in vivo administration, which method comprises (a) obtaining an immunoconjugate according to the invention, and (b) formulating the immunoconjugate with at least one pharmaceutically acceptable carrier, wherein an immunoconjugate preparation is formulated for in vivo administration.
[0205] As composições farmacêuticas da presente invenção compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de imunoconjugado dissolvido ou disperso em um veículo farmaceuticamente aceitável. As frases “farmacêutica ou farmacologicamente aceitável” referem-se a entidades moleculares e composições que são, de forma geral, não tóxicas para os receptores nas dosagens e concentrações empregues, ou seja, não produzem uma reação adversa, alérgica ou outra reação inconveniente quando administrada a um animal, tal como por exemplo, um humano, conforme apropriado. A preparação de uma composição farmacêutica que contenha imunoconjugado e, de forma opcional, um ingrediente ativo adicional, será conhecida dos técnicos no assunto à luz da presente invenção, como exemplificado por Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990, aqui incorporada por referência. Além disso, para administração em animais (por exemplo, humanos), será entendido que as preparações devem atender aos padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e pureza conforme exigido pelo Escritório de Padrões Biológicos da FDA ou autoridades correspondentes em outros países. Composições preferidas são formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Como aqui utilizado, “veículo farmaceuticamente aceitável” inclui qualquer e todos os solventes, tampões, meios de dispersão, revestimentos, surfactantes, antioxidantes, conservantes (por exemplo agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotônicos, agentes retardadores da absorção, sais, conservantes, antioxidantes, proteínas, fármacos, estabilizadores de fármacos, polímeros, gás, ligantes, excipientes, agentes de desintegração, lubrificantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, corantes, materiais semelhantes e combinações dos mesmos, como seria conhecido por um técnico no assunto (ver, para por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990, págs. 1289-1329, aqui incorporado por referência). Exceto na medida em que qualquer veículo convencional é incompatível com o ingrediente ativo, a seu uso nas composições terapêuticas ou farmacêuticas é contemplada.[0205] The pharmaceutical compositions of the present invention comprise a therapeutically effective amount of immunoconjugate dissolved or dispersed in a pharmaceutically acceptable carrier. The phrases “pharmaceutically or pharmacologically acceptable” refer to molecular entities and compositions that are generally nontoxic to recipients at the dosages and concentrations employed, i.e., do not produce an adverse, allergic or other untoward reaction when administered to an animal, such as, for example, a human, as appropriate. The preparation of a pharmaceutical composition containing immunoconjugate and, optionally, an additional active ingredient will be known to those skilled in the art in light of the present invention, as exemplified by Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, incorporated herein by reference. In addition, for administration to animals (e.g., humans), it will be understood that the preparations must meet the standards of sterility, pyrogenicity, general safety and purity as required by the FDA Office of Biological Standards or corresponding authorities in other countries. Preferred compositions are lyophilized formulations or aqueous solutions. As used herein, “pharmaceutically acceptable carrier” includes any and all solvents, buffers, dispersion media, coatings, surfactants, antioxidants, preservatives (e.g., antibacterial agents, antifungal agents), isotonic agents, absorption delaying agents, salts, preservatives, antioxidants, proteins, drugs, drug stabilizers, polymers, gas, binders, excipients, disintegrating agents, lubricants, sweetening agents, flavoring agents, colorants, similar materials, and combinations thereof, as would be known to one skilled in the art (see, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329, incorporated herein by reference). Except to the extent that any conventional carrier is incompatible with the active ingredient, its use in therapeutic or pharmaceutical compositions is contemplated.
[0206] Um imunoconjugado da invenção (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer meio adequado, incluindo parenteral, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. Infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A dosagem pode ser por qualquer via adequada, por exemplo, por injeções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte da administração ser breve ou crônica.[0206] An immunoconjugate of the invention (and any additional therapeutic agent) may be administered by any suitable means, including parenteral, intrapulmonary, and intranasal, and, if desired for local treatment, intralesional administration. Parenteral infusions include intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, or subcutaneous administration. Dosing may be by any suitable route, for example, by injections, such as intravenous or subcutaneous injections, depending in part on whether administration is brief or chronic.
[0207] As composições parenterais incluem aquelas concebidas para administração por injeção, por exemplo, injeção subcutânea, intradérmica, intralesional, intravenosa, intra-arterial intramuscular, intratecal ou intraperitoneal. Para injeção, os imunoconjugados da invenção podem ser formulados em soluções aquosas, de preferência em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como solução de Hanks, solução de Ringer ou tampão salino fisiológico. A solução pode conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, estabilização e/ ou dispersão. De forma alternativa, os imunoconjugados podem estar na forma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril isenta de pirogênios, antes da utilização. As soluções injetáveis estéreis são preparadas por incorporação dos imunoconjugados da invenção na quantidade requerida no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados abaixo, conforme necessário. A esterilidade pode ser prontamente realizada, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis. De forma geral, as dispersões são preparadas incorporando os vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e/ ou os outros ingredientes. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, suspensões ou emulsões, os métodos preferidos de preparação são técnicas de secagem sob vácuo ou secagem por congelação que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma forma previamente esterilizada em meio líquido filtrado do mesmo. O meio líquido deve ser adequadamente tamponado se necessário e o diluente líquido deve ser primeiro isotônico antes da injeção com solução salina ou glucose suficientes. A composição deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento, e preservada contra a ação contaminante de microrganismos, como bactérias e fungos. Entender-se-á que a contaminação com endotoxina deve ser mantida minimamente a um nível seguro, por exemplo, menos de 0,5 ng/ mg de proteína. Veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não estão limitados a: tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquilparabenos, tais como metil ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros hidratos de carbono incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tais como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de proteínas Zn); e/ ou tensoativos não iônicos, tais como polietilenoglicol (PEG). As suspensões aquosas para injeção podem conter compostos que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol, dextrano ou semelhantes. De forma opcional, a suspensão também pode conter estabilizantes ou agentes adequados que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas. Adicionalmente, as suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosas apropriadas. Solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos, tais como óleo como o óleo de gergelim, ou ésteres de ácidos graxos sintéticos, tais como cravos de etila ou triglicerídeos, ou lipossomas.[0207] Parenteral compositions include those designed for administration by injection, e.g., subcutaneous, intradermal, intralesional, intravenous, intraarterial, intramuscular, intrathecal, or intraperitoneal injection. For injection, the immunoconjugates of the invention may be formulated in aqueous solutions, preferably in physiologically compatible buffers, such as Hanks' solution, Ringer's solution, or physiological saline buffer. The solution may contain formulatory agents, such as suspending, stabilizing, and/or dispersing agents. Alternatively, the immunoconjugates may be in powder form for constitution with a suitable vehicle, e.g., sterile pyrogen-free water, before use. Sterile injectable solutions are prepared by incorporating the immunoconjugates of the invention in the required amount in the appropriate solvent with various of the other ingredients enumerated below, as needed. Sterility may be readily accomplished, e.g., by filtration through sterile filtration membranes. In general, dispersions are prepared by incorporating the various sterilized active ingredients into a sterile vehicle containing the basic dispersion medium and/or the other ingredients. In the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions, suspensions or emulsions, the preferred methods of preparation are vacuum drying or freeze-drying techniques which produce a powder of the active ingredient plus any additional desired ingredient in a previously sterilized form in a liquid medium filtered from the same. The liquid medium should be adequately buffered if necessary and the liquid diluent should first be made isotonic prior to injection with sufficient saline or glucose. The composition should be stable under the conditions of manufacture and storage, and preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi. It will be understood that endotoxin contamination should be kept to a minimum safe level, e.g. less than 0.5 ng/mg protein. Suitable pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to: buffers such as phosphate, citrate, and other organic acids; antioxidants including ascorbic acid and methionine; preservatives (such as octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride; benzethonium chloride; phenol, butyl or benzyl alcohol; alkylparabens such as methyl or propylparaben; catechol; resorcinol; cyclohexanol; 3-pentanol; and m-cresol); low molecular weight polypeptides (less than about 10 residues); proteins such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine, or lysine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates including glucose, mannose or dextrins; chelating agents such as EDTA; sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; salt-forming counterions such as sodium; metal complexes (e.g. Zn-protein complexes); and/or nonionic surfactants such as polyethylene glycol (PEG). Aqueous injection suspensions may contain compounds which increase the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol, dextran or the like. Optionally, the suspension may also contain suitable stabilizers or agents which increase the solubility of the compounds to enable the preparation of highly concentrated solutions. Additionally, suspensions of the active compounds may be prepared as suitable oily injection suspensions. Suitable lipophilic solvents or vehicles include fatty oils, such as sesame oil, or synthetic fatty acid esters, such as ethyl carnosine or triglycerides, or liposomes.
[0208] Os ingredientes ativos podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e poli (metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas coloidais de liberação de fármaco (por exemplo, lipossomas, albumina microesferas, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences (18a Ed. Mack Printing Company, 1990). Preparações de liberação prolongada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o polipeptídeo, matrizes essas que estão na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Em formas de realização particulares, a absorção prolongada de uma composição injetável pode ser conseguida pela utilização nas composições de agentes que retardam a absorção, tais como, por exemplo, monoestearato de alumínio, gelatina ou combinações dos mesmos.[0208] The active ingredients may be entrapped in microcapsules prepared, for example, by coacervation techniques or by interfacial polymerization, for example, hydroxymethyl cellulose microcapsules or gelatin and poly(methyl methacrylate) microcapsules, respectively, in colloidal drug delivery systems (for example, liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles, and nanocapsules) or in macroemulsions. Such techniques are disclosed in Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed. Mack Printing Company, 1990). Sustained-release preparations may be prepared. Suitable examples of sustained-release preparations include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing the polypeptide, which matrices are in the form of shaped articles, for example, films or microcapsules. In particular embodiments, prolonged absorption of an injectable composition may be achieved by the use in the compositions of agents that delay absorption, such as, for example, aluminum monostearate, gelatin, or combinations thereof.
[0209] Além das composições descritas anteriormente, os imunoconjugados podem também ser formulados como uma preparação de depósito. Tais formulações de atuação prolongada podem ser administradas por implantação (por exemplo subcutaneamente ou intramuscularmente) ou por injeção intramuscular. Assim, por exemplo, os imunoconjugados podem ser formulados com materiais de polímero ou hidrofóbicos adequados (por exemplo como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de permutação iônica, ou como derivados fracamente solúveis, por exemplo, como um sal moderadamente solúvel.[0209] In addition to the compositions described above, the immunoconjugates may also be formulated as a depot preparation. Such long-acting formulations may be administered by implantation (e.g. subcutaneously or intramuscularly) or by intramuscular injection. Thus, for example, the immunoconjugates may be formulated with suitable polymeric or hydrophobic materials (e.g. as an emulsion in an acceptable oil) or ion exchange resins, or as sparingly soluble derivatives, e.g. as a sparingly soluble salt.
[0210] Composições farmacêuticas que compreendem os imunoconjugados da invenção podem ser fabricados por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, emulsificação, encapsulação, aprisionamento ou liofilização. As composições farmacêuticas podem ser formuladas de maneira convencional utilizando um ou mais veículos, diluentes, excipientes ou auxiliares fisiologicamente aceitáveis que facilitam o processamento das proteínas em preparações que podem ser utilizadas farmaceuticamente. A formulação adequada depende da via de administração escolhida.[0210] Pharmaceutical compositions comprising the immunoconjugates of the invention may be manufactured by conventional mixing, dissolving, emulsifying, encapsulating, entrapping or lyophilizing processes. The pharmaceutical compositions may be formulated in a conventional manner using one or more physiologically acceptable carriers, diluents, excipients or auxiliaries that facilitate the processing of the proteins into preparations that can be used pharmaceutically. The appropriate formulation depends on the route of administration chosen.
[0211] Os imunoconjugados podem ser formulados em uma composição em uma forma livre de ácido ou base, neutra ou salina. Sais farmaceuticamente aceitáveis são sais que retêm substancialmente a atividade biológica do ácido ou base livre. Estes incluem os sais de adição de ácido, por exemplo, aqueles formados com os grupos amino livres de uma composição proteica, ou que são formados com ácidos inorgânicos, tais como por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos como ácido acético, oxálico, tartárico ou mandélico. Sais formados com os grupos carboxila livres podem também ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico; ou bases orgânicas, tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina ou procaína. Os sais farmacêuticos tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos e outros solventes próticos do que as correspondentes formas de base livre.MÉTODOS TERAPÊUTICOS E COMPOSIÇÕES[0211] Immunoconjugates may be formulated in a composition in a free acid or base, neutral or saline form. Pharmaceutically acceptable salts are salts which substantially retain the biological activity of the free acid or base. These include acid addition salts, for example, those formed with the free amino groups of a protein composition, or which are formed with inorganic acids, such as, for example, hydrochloric or phosphoric acids, or organic acids such as acetic, oxalic, tartaric or mandelic acid. Salts formed with the free carboxyl groups may also be derived from inorganic bases such as, for example, sodium, potassium, ammonium, calcium or ferric hydroxides; or organic bases, such as isopropylamine, trimethylamine, histidine or procaine. Pharmaceutical salts tend to be more soluble in aqueous and other protic solvents than the corresponding free base forms.THERAPEUTIC METHODS AND COMPOSITIONS
[0212] Qualquer um dos imunoconjugados aqui proporcionados pode ser utilizado em métodos terapêuticos. Os imunoconjugados da invenção podem ser utilizados como agentes imunoterapêuticos, por exemplo, no tratamento de cânceres.[0212] Any of the immunoconjugates provided herein may be used in therapeutic methods. The immunoconjugates of the invention may be used as immunotherapeutic agents, for example, in the treatment of cancers.
[0213] Para uso em métodos terapêuticos, os imunoconjugados da invenção seriam formulados, dosados e administrados de forma coerente com a boa prática médica. Os fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio particular a ser tratado, o mamífero particular a ser tratado, o estado clínico do doente individual, a causa do distúrbio, o local de entrega do agente, o método de administração, o agendamento da administração e outros fatores conhecidos pelos médicos.[0213] For use in therapeutic methods, the immunoconjugates of the invention would be formulated, dosed, and administered in a manner consistent with good medical practice. Factors for consideration in this context include the particular disorder being treated, the particular mammal being treated, the clinical condition of the individual patient, the cause of the disorder, the site of delivery of the agent, the method of administration, the schedule of administration, and other factors known to clinicians.
[0214] Os imunoconjugados da invenção podem ser em particular úteis no tratamento de estados de doença onde a estimulação do sistema imune do hospedeiro é benéfica, em condições particulares em que seja desejável uma resposta imunológica celular intensificada. Estes podem incluir estados de doença em que a resposta imune do hospedeiro é insuficiente ou deficiente. Os estados de doença para os quais os imunoconjugados da invenção podem ser administrados compreendem, por exemplo, um tumor ou infecção em que uma resposta imune celular seria um mecanismo crítico para imunidade específica. Os imunoconjugados da invenção podem ser administrados per se ou em qualquer composição farmacêutica adequada.[0214] The immunoconjugates of the invention may be particularly useful in the treatment of disease states where stimulation of the host's immune system is beneficial, in particular conditions where an enhanced cellular immune response is desirable. These may include disease states where the host's immune response is insufficient or deficient. Disease states for which the immunoconjugates of the invention may be administered include, for example, a tumor or infection where a cellular immune response would be a critical mechanism for specific immunity. The immunoconjugates of the invention may be administered per se or in any suitable pharmaceutical composition.
[0215] Em um aspecto, são proporcionados imunoconjugados da invenção para uso como medicamento. Em aspectos adicionais, são proporcionados imunoconjugados da invenção para uso no tratamento de uma doença. Em certas formas de realização, são proporcionados imunoconjugados da invenção para uso em um método de tratamento. Em uma forma de realização, a invenção proporciona um imunoconjugado como aqui descrito para uso no tratamento de uma doença em um indivíduo disso necessitado. Em certas formas de realização, a invenção proporciona um imunoconjugado para uso em um método de tratamento de um indivíduo com uma doença que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz do imunoconjugado. Em certas formas de realização, a doença a ser tratada é um distúrbio proliferativo. Em uma forma de realização particular, a doença é câncer. Em certas formas de realização, o método compreende ainda a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de, pelo menos, um agente terapêutico adicional, por exemplo, um agente anticanceroso, se a doença a tratar for câncer. Em outras formas de realização, a invenção proporciona um imunoconjugado para uso na estimulação do sistema imune. Em certas formas de realização, a invenção proporciona um imunoconjugado para uso em um método de estimulação do sistema imune em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do imunoconjugado para estimular o sistema imune. Um “indivíduo” de acordo com qualquer uma das formas de realização acima é um mamífero, de preferência um humano. “Estimulação do sistema imune” de acordo com qualquer uma das formas de realização acima pode incluir qualquer um ou mais de um aumento geral na função imune, um aumento na função das células T, um aumento nafunção das células B, uma restauração da função linfocitária, um aumento naexpressão de receptores de IL-2, um aumento na capacidade de resposta decélulas T, um aumento na atividade de células killers naturais ou atividade decélulas killers ativadas por linfoquinas (LAK) e semelhantes.[0215] In one aspect, there are provided immunoconjugates of the invention for use as a medicament. In additional aspects, there are provided immunoconjugates of the invention for use in treating a disease. In certain embodiments, there are provided immunoconjugates of the invention for use in a method of treatment. In one embodiment, the invention provides an immunoconjugate as described herein for use in treating a disease in a subject in need thereof. In certain embodiments, the invention provides an immunoconjugate for use in a method of treating a subject having a disease comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the immunoconjugate. In certain embodiments, the disease to be treated is a proliferative disorder. In a particular embodiment, the disease is cancer. In certain embodiments, the method further comprises administering to the subject a therapeutically effective amount of at least one additional therapeutic agent, e.g., an anti-cancer agent, if the disease to be treated is cancer. In other embodiments, the invention provides an immunoconjugate for use in stimulating the immune system. In certain embodiments, the invention provides an immunoconjugate for use in a method of stimulating the immune system in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of the immunoconjugate to stimulate the immune system. A “subject” according to any of the above embodiments is a mammal, preferably a human. “Stimulation of the immune system” according to any of the above embodiments can include any one or more of a general increase in immune function, an increase in T cell function, an increase in B cell function, a restoration of lymphocyte function, an increase in the expression of IL-2 receptors, an increase in T cell responsiveness, an increase in natural killer cell activity or lymphokine-activated killer cell (LAK) activity, and the like.
[0216] Em um outro aspecto, a invenção proporciona o uso de um imunoconjugado da invenção na fabricação ou preparação de um medicamento. Em uma forma de realização, o medicamento para o tratamento de uma doença em um indivíduo disso necessitado. Em uma forma de realização, o medicamento é para uso em um Método para o tratamento de uma doença que compreende a administração a um indivíduo tendo a doença de uma quantidade terapeuticamente eficaz do medicamento. Em certas formas de realização, a doença a ser tratada é um distúrbio proliferativo. Em uma forma de realização particular, a doença é câncer. Em uma forma de realização, o método compreende ainda a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, um agente anticanceroso se a doença a tratar for câncer. Em uma outra forma de realização, o medicamento é para estimular o sistema imune. Em uma outra forma de realização, o medicamento é para uso em um método de estimulação do sistema imune em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do medicamento para estimular o sistema imune. Um “indivíduo” de acordo com qualquer uma das formas de realização acima pode ser um mamífero, de preferência um humano. “Estimulação do sistema imune” de acordo com qualquer uma das formas de realização acima pode incluir qualquer um ou mais de um aumento geral na função imune, um aumento na função das células T, um aumento na função das células B, uma restauração da função linfocitária, um aumento na expressão de receptores de IL-2, um aumento na capacidade de resposta de células T, um aumento na atividade de células killers naturais ou atividade de células killers ativadas por linfoquinas (LAK) e semelhantes.[0216] In another aspect, the invention provides the use of an immunoconjugate of the invention in the manufacture or preparation of a medicament. In one embodiment, the medicament is for treating a disease in a subject in need thereof. In one embodiment, the medicament is for use in a method for treating a disease comprising administering to a subject having the disease a therapeutically effective amount of the medicament. In certain embodiments, the disease to be treated is a proliferative disorder. In a particular embodiment, the disease is cancer. In one embodiment, the method further comprises administering to the subject a therapeutically effective amount of at least one additional therapeutic agent, e.g., an anti-cancer agent if the disease to be treated is cancer. In another embodiment, the medicament is for stimulating the immune system. In another embodiment, the medicament is for use in a method of stimulating the immune system in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of the medicament to stimulate the immune system. A “subject” according to any of the above embodiments may be a mammal, preferably a human. “Stimulation of the immune system” according to any of the above embodiments may include any one or more of a general increase in immune function, an increase in T cell function, an increase in B cell function, a restoration of lymphocyte function, an increase in the expression of IL-2 receptors, an increase in T cell responsiveness, an increase in natural killer cell activity or lymphokine-activated killer cell (LAK) activity, and the like.
[0217] Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para tratar uma doença em um indivíduo. Em uma forma de realização, o método compreende administrar a um indivíduo tendo essa doença uma quantidade terapeuticamente eficaz de um imunoconjugado da invenção. Em uma forma de realização, uma composição é administrada ao referido individual, que compreende o imunoconjugado da invenção em uma forma farmaceuticamente aceitável. Em certas formas de realização, a doença a ser tratada é um distúrbio proliferativo. Em uma forma de realização particular, a doença é câncer. Em certas formas de realização, o método compreende ainda a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de, pelo menos, um agente terapêutico adicional, por exemplo, um agente anticanceroso, se a doença a tratar for câncer. Em um outro aspecto, a invenção proporciona um método para estimular o sistema imune em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um imunoconjugado para estimular o sistema imune. Um “indivíduo” de acordo com qualquer uma das formas de realização acima pode ser um mamífero, de preferência um humano. “Estimulação do sistema imune” de acordo com qualquer uma das formas de realização acima pode incluir qualquer um ou mais de um aumento geral na função imune, um aumento na função das células T, um aumento nafunção das células B, uma restauração da função linfocitária, um aumento naexpressão de receptores de IL-2, um aumento na capacidade de resposta decélulas T, um aumento na atividade de células killers naturais ou atividade decélulas killers ativadas por linfoquinas (LAK) e semelhantes.[0217] In another aspect, the invention provides a method of treating a disease in a subject. In one embodiment, the method comprises administering to a subject having such a disease a therapeutically effective amount of an immunoconjugate of the invention. In one embodiment, a composition is administered to said subject which comprises the immunoconjugate of the invention in a pharmaceutically acceptable form. In certain embodiments, the disease to be treated is a proliferative disorder. In a particular embodiment, the disease is cancer. In certain embodiments, the method further comprises administering to the subject a therapeutically effective amount of at least one additional therapeutic agent, e.g., an anti-cancer agent, if the disease to be treated is cancer. In another aspect, the invention provides a method of stimulating the immune system in a subject, which comprises administering to the subject an effective amount of an immunoconjugate to stimulate the immune system. A “subject” according to any of the above embodiments may be a mammal, preferably a human. “Stimulation of the immune system” according to any of the above embodiments may include any one or more of a general increase in immune function, an increase in T cell function, an increase in B cell function, a restoration of lymphocyte function, an increase in the expression of IL-2 receptors, an increase in T cell responsiveness, an increase in natural killer cell activity or lymphokine-activated killer cell (LAK) activity, and the like.
[0218] Em certas formas de realização, a doença a ser tratada é um distúrbio proliferativo, em particular câncer. Exemplos não limitantes de cânceres incluem câncer de bexiga, câncer cerebral, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pâncreas, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer uterino, câncer cervical, câncer de endométrio, câncer de esôfago, câncer colorretal, câncer retal, câncer gástrico, câncer de próstata, câncer de sangue, câncer de pele, carcinoma de células escamosas, câncer ósseo e câncer renal. Outros distúrbios de proliferação celular que podem ser tratados utilizando um imunoconjugado da presente invenção incluem, mas não se limitam a neoplasias localizadas no: abdômen, osso, mama, sistema digestivo, fígado, pâncreas, peritônio, glândulas endócrinas (adrenal, paratireóide, pituitária, testículos, ovário, timo, tireóide), olho, cabeça e pescoço, sistema nervoso (central e periférico ), sistema linfático, pélvico, pele, tecido mole, baço, região torácica e sistema urogenital. Também estão incluídas condições ou lesões pré- cancerígenas e metástases de câncer. Em certas formas de realização, o câncer escolhido do grupo que consiste de câncer de rim, câncer de pele, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer de mama, câncer cerebral, câncer de cabeça e pescoço, câncer de próstata e câncer de bexiga. Um técnico no assunto reconhece prontamente que, em muitos casos, os imunoconjugados podem não proporcionar uma cura, mas podem apenas proporcionar um benefício parcial. Em algumas formas de realização, uma alteração fisiológica com algum benefício é também considerada terapeuticamente benéfica. Assim, em algumas formas de realização, uma quantidade de imunoconjugado que proporciona uma alteração fisiológica é considerada uma “quantidade eficaz” ou uma “quantidade terapeuticamente eficaz”. O sujeito, paciente ou indivíduo que necessita de tratamento é tipicamente um mamífero, de forma mais específica um humano.[0218] In certain embodiments, the disease to be treated is a proliferative disorder, in particular cancer. Non-limiting examples of cancers include bladder cancer, brain cancer, head and neck cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, uterine cancer, cervical cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, colorectal cancer, rectal cancer, gastric cancer, prostate cancer, blood cancer, skin cancer, squamous cell carcinoma, bone cancer, and kidney cancer. Other cell proliferation disorders that may be treated using an immunoconjugate of the present invention include, but are not limited to, neoplasms located in the: abdomen, bone, breast, digestive system, liver, pancreas, peritoneum, endocrine glands (adrenal, parathyroid, pituitary, testis, ovary, thymus, thyroid), eye, head and neck, nervous system (central and peripheral), lymphatic system, pelvic, skin, soft tissue, spleen, thoracic region, and urogenital system. Also included are pre-cancerous conditions or lesions and metastases of cancer. In certain embodiments, the cancer selected from the group consisting of kidney cancer, skin cancer, lung cancer, colorectal cancer, breast cancer, brain cancer, head and neck cancer, prostate cancer, and bladder cancer. One skilled in the art readily recognizes that in many cases, immunoconjugates may not provide a cure, but may only provide partial benefit. In some embodiments, a physiological change with some benefit is also considered therapeutically beneficial. Thus, in some embodiments, an amount of immunoconjugate that provides a physiological change is considered an “effective amount” or a “therapeutically effective amount.” The subject, patient, or individual in need of treatment is typically a mammal, more specifically a human.
[0219] Em algumas formas de realização, uma quantidade eficaz de um imunoconjugado da invenção é administrada a uma célula. Em outras formas de realização, uma quantidade terapêutica eficaz de um imunoconjugados da invenção administrada a um indivíduo para o tratamento de doença.[0219] In some embodiments, an effective amount of an immunoconjugate of the invention is administered to a cell. In other embodiments, a therapeutically effective amount of an immunoconjugate of the invention is administered to a subject for the treatment of disease.
[0220] Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de um imunoconjugado da invenção (quando utilizado isoladamente ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratada, da via de administração, o peso corporal do doente, o tipo de molécula (por exemplo, que compreende um domínio Fc ou não), a gravidade e o curso da doença, se o imunoconjugado é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, intervenções terapêuticas prévias ou concorrentes, o historial clínico do doente e resposta ao imunoconjugado e discrição do médico assistente. O médico responsável pela administração determinará, em qualquer caso, a concentração do (s) ingrediente (s) ativo (s) em uma composição e dose (s) apropriada (s) para o sujeito individual. Vários esquemas de dosagem incluindo, mas não se limitando a administrações únicas ou múltiplas ao longo de vários pontos de tempo, administração de bolus e infusão de pulso são aqui contemplados.[0220] For the prevention or treatment of disease, the appropriate dosage of an immunoconjugate of the invention (when used alone or in combination with one or more other additional therapeutic agents) will depend on the type of disease being treated, the route of administration, the patient's body weight, the type of molecule (e.g., comprising an Fc domain or not), the severity and course of the disease, whether the immunoconjugate is administered for preventative or therapeutic purposes, prior or concurrent therapeutic interventions, the patient's clinical history and response to the immunoconjugate, and the discretion of the attending physician. The administering physician will in any event determine the concentration of the active ingredient(s) in a composition and dose(s) appropriate for the individual subject. Various dosage regimens including, but not limited to, single or multiple administrations over multiple time points, bolus administration, and pulse infusion are contemplated herein.
[0221] O imunoconjugado é adequadamente administrado ao paciente de uma só vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 μg/ kg a 15 mg/ kg (por exemplo, 0,1 mg/ kg - 10 mg/ kg) de imunoconjugado pode ser uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, se, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Uma dose diária típica pode variar de cerca de 1 μg/ kg a 100 mg/ kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento seria, de forma geral, mantido até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplificativa do imunoconjugado estaria na faixa de cerca de 0,005 mg/ kg a cerca de 10 mg/ kg. Em outros exemplos não limitativos, uma dose pode também compreender desde cerca de 1 micrograma/ kg/ peso corporal, cerca de 5 microgramas/ kg/ peso corporal, cerca de 10 microgramas/ kg/ peso corporal, cerca de 50 microgramas/ kg/ peso corporal, 100 microgramas/ kg/ peso corporal, cerca de 200 microgramas/ kg/ peso corporal, cerca de 350 microgramas/ kg/ peso corporal, cerca de 500 microgramas/ kg/ peso corporal, cerca de 1 miligrama/ kg/ peso corporal, cerca de 5 miligramas/ kg/ peso corporal, cerca de 10 miligramas/ kg/ peso corporal, cerca de 50 miligramas/ kg/ peso corporal, cerca de 100 miligramas/ kg/ peso corporal, cerca de 200 miligramas/ kg/ peso corporal, cerca de 350 miligramas/ kg/ peso corporal, cerca de 500 miligramas/ kg/ peso corporal, a cerca de 1000 mg/ kg/ peso corporal ou mais por administração, e qualquer intervalo derivável. Em exemplos não limitativos de um intervalo derivável dos números aqui listados, uma faixa de cerca de 5 mg/ kg/ peso corporal a cerca de 100 mg/ kg/ peso corporal, cerca de 5 microgramas/ kg/ peso corporal a cerca de 500 miligramas/ kg/ peso corporal, etc., podem ser administrados, com base nos números descritos acima. Assim, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/ kg, 2,0 mg/ kg, 5,0 mg/ kg ou 10 mg/ kg (ou qualquer sua combinação) podem ser administradas ao paciente. Tais doses podem ser administradas de forma intermitente, por exemplo, todas as semanas ou de três em três semanas (por exemplo, de tal forma que o paciente recebe de cerca de duas a cerca de vinte, ou por exemplo cerca de seis doses do imunoconjugado). Uma dose de carga inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses menores, pode ser administrada. No entanto, outros regimes posológicos podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.[0221] The immunoconjugate is suitably administered to the patient all at once or over a series of treatments. Depending on the type and severity of the disease, about 1 μg/kg to 15 mg/kg (e.g., 0.1 mg/kg - 10 mg/kg) of immunoconjugate may be an initial candidate dosage for administration to the patient, whether, for example, by one or more separate administrations, or by continuous infusion. A typical daily dose may range from about 1 μg/kg to 100 mg/kg or more, depending on the factors mentioned above. For repeated administrations over several days or more, depending on the condition, treatment would generally be continued until a desired suppression of disease symptoms occurs. An exemplary dosage of the immunoconjugate would be in the range of about 0.005 mg/kg to about 10 mg/kg. In other non-limiting examples, a dose may also comprise from about 1 microgram/kg/body weight, about 5 micrograms/kg/body weight, about 10 micrograms/kg/body weight, about 50 micrograms/kg/body weight, 100 micrograms/kg/body weight, about 200 micrograms/kg/body weight, about 350 micrograms/kg/body weight, about 500 micrograms/kg/body weight, about 1 milligram/kg/body weight, about 5 milligrams/kg/body weight, about 10 milligrams/kg/body weight, about 50 milligrams/kg/body weight, about 100 milligrams/kg/body weight, about 200 milligrams/kg/body weight, about 350 milligrams/kg/body weight, about 500 milligrams/kg/body weight body weight, at about 1000 mg/kg/body weight or more per administration, and any range derivable therefrom. In non-limiting examples of a range derivable from the numbers listed herein, a range of about 5 mg/kg/body weight to about 100 mg/kg/body weight, about 5 micrograms/kg/body weight to about 500 milligrams/kg/body weight, etc., may be administered, based on the numbers described above. Thus, one or more doses of about 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/kg, or 10 mg/kg (or any combination thereof) may be administered to the patient. Such doses may be administered intermittently, e.g., every week or every three weeks (e.g., such that the patient receives from about two to about twenty, or for example about six, doses of the immunoconjugate). A higher initial loading dose, followed by one or more smaller doses, may be administered. However, other dosage regimens may be useful. The progress of this therapy is easily monitored by conventional techniques and assays.
[0222] Os imunoconjugados da invenção serão, de forma geral, utilizados em uma quantidade eficaz para alcançar o objetivo pretendido. Para uso para tratar ou prevenir uma condição de doença, os imunoconjugados da invenção, ou suas composições farmacêuticas, são administrados ou aplicados em uma quantidade terapeuticamente eficaz. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está bem dentro das capacidades dos técnicos no assunto, especialmente à luz da descrição detalhada aqui proporcionada.[0222] The immunoconjugates of the invention will generally be used in an amount effective to achieve their intended purpose. For use to treat or prevent a disease condition, the immunoconjugates of the invention, or pharmaceutical compositions thereof, are administered or applied in a therapeutically effective amount. Determination of a therapeutically effective amount is well within the capabilities of those skilled in the art, especially in light of the detailed description provided herein.
[0223] Para administração sistêmica, uma dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios in vitro, tais como ensaios de cultura de células. Uma dose pode, então, ser formulada em modelos animais para atingir uma faixa de concentrações em circulação que inclui o IC 50 como determinado em cultura celular. Tal informação pode ser usada para determinar com maior precisão as doses úteis em seres humanos.[0223] For systemic administration, a therapeutically effective dose can be estimated initially from in vitro assays, such as cell culture assays. A dose can then be formulated in animal models to achieve a range of circulating concentrations that includes the IC 50 as determined in cell culture. Such information can be used to more accurately determine useful doses in humans.
[0224] As dosagens iniciais podem também ser estimadas a partir de dados in vivo, por exemplo, modelos animais, utilizando técnicas que são bem conhecidas na técnica. Um técnico no assunto pode prontamente otimizar a administração para humanos com base em dados de animais.[0224] Initial dosages can also be estimated from in vivo data, e.g., animal models, using techniques that are well known in the art. One skilled in the art can readily optimize administration for humans based on animal data.
[0225] A quantidade e o intervalo de dosagem podem ser ajustados individualmente para proporcionar níveis plasmáticos dos imunoconjugados que sejam suficientes para manter o efeito terapêutico. Dosagens usuais para administração por injeção variam entre cerca de 0,1 e 50 mg/ kg/ dia, tipicamente entre cerca de 0,5 e 1 mg/ kg/ dia. Níveis plasmáticos terapeuticamente eficazes podem ser alcançados pela administração de múltiplas doses por dia. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por HPLC.[0225] The amount and interval of dosage may be individually adjusted to provide plasma levels of the immunoconjugates that are sufficient to maintain the therapeutic effect. Usual dosages for administration by injection range from about 0.1 to 50 mg/kg/day, typically from about 0.5 to 1 mg/kg/day. Therapeutically effective plasma levels may be achieved by administering multiple doses per day. Plasma levels may be measured, for example, by HPLC.
[0226] Em casos de administração local ou captação seletiva, a concentração local efetiva dos imunoconjugados pode não estar relacionada à concentração plasmática. Um técnico no assunto será capaz de otimizar as dosagens locais terapeuticamente eficazes sem experimentação indevida.[0226] In cases of local administration or selective uptake, the effective local concentration of the immunoconjugates may not be related to the plasma concentration. One skilled in the art will be able to optimize therapeutically effective local dosages without undue experimentation.
[0227] Uma dose terapeuticamente eficaz dos imunoconjugados aqui descritos proporcionará, de forma geral, benefícios terapêuticos sem causar toxicidade substancial. A toxicidade e a eficácia terapêutica de um imunoconjugado podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em animais de cultura ou experimentais. Ensaios de cultura celular e estudos animais podem ser utilizados para determinar a LD 50 (a dose letal para 50% da população) e a ED 50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico, que pode ser expresso como a razão LD 50/ ED 50. Imunoconjugados que exibem índices terapêuticos grandes são preferidas. Em uma forma de realização, o imunoconjugado de acordo com a presente invenção exibe um alto índice terapêutico. Os dados obtidos a partir de ensaios de cultura de células e estudos em animais podem ser utilizados na formulação de uma faixa de dosagens adequadas para uso em seres humanos. A dosagem situa-se de forma preferencial dentro de uma faixa de concentrações que incluem o ED em circulação 50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo de uma variedade de fatores, por exemplo, a forma de dosagem utilizada, a via de administração utilizada, a condição do sujeito e semelhantes. A formulação exata, via de administração e dosagem podem ser escolhidas pelo mico individual tendo em vista a condição do paciente. (Ver, por exemplo, Fingl et al., 1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Cap. 1, p. 1, aqui incorporado por referência na sua totalidade).[0227] A therapeutically effective dose of the immunoconjugates described herein will generally provide therapeutic benefits without causing substantial toxicity. The toxicity and therapeutic efficacy of an immunoconjugate can be determined by standard pharmaceutical procedures in cultured or experimental animals. Cell culture assays and animal studies can be used to determine the LD 50 (the lethal dose for 50% of the population) and the ED 50 (the therapeutically effective dose in 50% of the population). The dose ratio between toxic and therapeutic effects is the therapeutic index, which can be expressed as the ratio LD 50/ED 50. Immunoconjugates that exhibit large therapeutic indices are preferred. In one embodiment, the immunoconjugate of the present invention exhibits a high therapeutic index. Data obtained from cell culture assays and animal studies can be used in formulating a range of dosages suitable for use in humans. The dosage preferably falls within a range of concentrations that include the circulating ED 50 with little or no toxicity. The dosage may vary within this range depending on a variety of factors, e.g., the dosage form used, the route of administration employed, the condition of the subject, and the like. The exact formulation, route of administration, and dosage may be chosen by the individual physician in view of the patient's condition. (See, e.g., Fingl et al., 1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1, incorporated herein by reference in its entirety.)
[0228] O médico assistente para pacientes tratados com imunoconjugados da invenção saberia como e quando terminar, interromper ou ajustar a administração devido a toxicidade, disfunção orgânica e semelhantes. Por outro lado, o médico assistente também saberia ajustar o tratamento para níveis mais altos se a resposta clínica não fosse adequada (impedindo a toxicidade). A magnitude de uma dose administrada na gestão do distúrbio de interesse variará com a gravidade da condição a ser tratada, com a via de administração e semelhantes. A gravidade da condição pode, por exemplo, ser avaliada, em parte, por métodos padrão de avaliação prognóstica. Além disso, a dose e talvez a frequência da dose também variam de acordo com a idade, peso corporal e resposta do paciente individual.[0228] The attending physician for patients treated with immunoconjugates of the invention would know how and when to terminate, discontinue, or adjust administration due to toxicity, organ dysfunction, and the like. Conversely, the attending physician would also know to adjust treatment to higher levels if clinical response is not adequate (preventing toxicity). The magnitude of a dose administered in the management of the disorder of interest will vary with the severity of the condition being treated, the route of administration, and the like. The severity of the condition may, for example, be assessed, in part, by standard methods of prognostic assessment. In addition, the dose and perhaps the frequency of dosing will also vary with the age, body weight, and response of the individual patient.
[0229] A dose terapêutica máxima de um imunoconjugado não que compreende um polipeptídeo de IL-2 mutante como aqui descrito pode ser aumentada das utilizadas para um imunoconjugado que compreende IL-2 de tipo selvagem.OUTROS AGENTES E TRATAMENTOS[0229] The maximum therapeutic dose of an immunoconjugate not comprising a mutant IL-2 polypeptide as described herein may be increased from that used for an immunoconjugate comprising wild-type IL-2.OTHER AGENTS AND TREATMENTS
[0230] Os imunoconjugados de acordo com a invenção podem ser administrados em combinação com um ou mais outros agentes em terapia. Por exemplo, um imunoconjugado não da invenção pode ser co-administrado com pelo menos um agente terapêutico adicional. O termo “agente terapêutico” abrange qualquer agente administrado para tratar um sintoma ou doença em um indivíduo em necessidade de tal tratamento. Tal agente terapêutico adicional pode compreender quaisquer ingredientes ativos adequados para a indicação particular a ser tratada, de preferência aqueles com atividades complementares que não Afetam adversamente uns aos outros Em certas formas de realização, um agente terapêutico adicional é um agente imunomodulador, um agente citostático, um inibidor da adesão celular, um agente citotóxico, um ativador da apoptose celular ou um agente que aumenta a sensibilidade das células a indutores apoptóticos. Em uma forma de realização particular, o agente terapêutico adicional é um agente anti-câncer, por exemplo, um disruptor de microtúbulos, um antimetabolito, um inibidor de topoisomerase, um intercalador de DNA, um agente alquilante, uma terapia hormonal, um inibidor de quinase, um antagonista do receptor, um ativador da apoptose de células tumorais, ou um agente antiangiogênico.[0230] Immunoconjugates according to the invention may be administered in combination with one or more other agents in therapy. For example, an immunoconjugate not of the invention may be co-administered with at least one additional therapeutic agent. The term “therapeutic agent” encompasses any agent administered to treat a symptom or disease in a subject in need of such treatment. Such an additional therapeutic agent may comprise any active ingredients suitable for the particular indication to be treated, preferably those with complementary activities that do not adversely affect each other. In certain embodiments, an additional therapeutic agent is an immunomodulatory agent, a cytostatic agent, a cell adhesion inhibitor, a cytotoxic agent, an activator of cell apoptosis, or an agent that increases the sensitivity of cells to apoptotic inducers. In a particular embodiment, the additional therapeutic agent is an anti-cancer agent, e.g., a microtubule disruptor, an antimetabolite, a topoisomerase inhibitor, a DNA intercalator, an alkylating agent, a hormone therapy, a kinase inhibitor, a receptor antagonist, an activator of tumor cell apoptosis, or an antiangiogenic agent.
[0231] Esses outros agentes estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido. A quantidade eficaz de tais outros agentes dependem da quantidade de imunoconjugado utilizado, do tipo de distúrbio ou tratamento e de outros fatores discutidos acima. Os imunoconjugados são, de forma geral, utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração como aqui descrito, ou cerca de 1 a 99% das dosagens aqui descritas, ou em qualquer dosagem e por qualquer via que seja empiricamente/ clinicamente determinada como sendo apropriada.[0231] Such other agents are suitably present in combination in amounts that are effective for the intended purpose. The effective amount of such other agents depends on the amount of immunoconjugate used, the type of disorder or treatment, and other factors discussed above. Immunoconjugates are generally used in the same dosages and with routes of administration as described herein, or at about 1 to 99% of the dosages described herein, or at any dosage and by any route that is empirically/clinically determined to be appropriate.
[0232] Tais terapias de combinação referidas acima abrangem administração combinada (em que dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos nas mesmas composições ou em composições separadas) e administração separada, caso em que a administração do imunoconjugado da invenção pode ocorrer antes, simultaneamente e/ ou a seguir, administração do agente terapêutico e/ ou adjuvante adicional. Os imunoconjugados da invenção também podem ser utilizados em combinação com terapia de radiação.ARTIGOS DE FABRICAÇÃO[0232] Such combination therapies referred to above encompass combined administration (wherein two or more therapeutic agents are included in the same or separate compositions) and separate administration, in which case administration of the immunoconjugate of the invention may occur prior to, simultaneously with, and/or following administration of the additional therapeutic agent and/or adjuvant. The immunoconjugates of the invention may also be used in combination with radiation therapy. ARTICLES OF MANUFACTURE
[0233] Em outro aspecto da invenção, proporcionado um artigo de fabricação contendo materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ ou diagnóstico dos distúrbios descritos acima. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo ou folheto informativo sobre ou associado ao recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, sacos de solução IV, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é por si só ou combinada com outra composição eficaz para tratar, prevenir e/ ou diagnosticar a condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco perfurável) por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um imunoconjugado da invenção. O rótulo ou folheto informativo indica que a composição é usada para tratar a condição de escolha. Além disso, o artigo de fabricação pode compreender: (a) um primeiro recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um imunoconjugado da invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um outro agente citotico ou de outro modo terapêutico. O artigo de fabricação nesta forma de realização da invenção pode ainda compreender um folheto informativo indicando que as composições podem ser utilizadas para tratar uma condição particular. De forma alternativa, ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode ainda compreender um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS[0233] In another aspect of the invention, there is provided an article of manufacture containing materials useful for the treatment, prevention and/or diagnosis of the disorders described above. The article of manufacture comprises a container and a label or package insert on or associated with the container. Suitable containers include, for example, bottles, vials, syringes, IV solution bags, etc. The containers may be formed from a variety of materials, such as glass or plastic. The container contains a composition that is alone or combined with another composition effective for treating, preventing and/or diagnosing the condition and may have a sterile access port (for example, the container may be an IV solution bag or a vial pierceable by a hypodermic injection needle). At least one active agent in the composition is an immunoconjugate of the invention. The label or package insert indicates that the composition is used to treat the condition of choice. Furthermore, the article of manufacture may comprise: (a) a first container with a composition contained therein, wherein the composition comprises an immunoconjugate of the invention; and (b) a second container with a composition contained therein, wherein the composition comprises another cytotoxic or other therapeutic agent. The article of manufacture in this embodiment of the invention may further comprise a package insert indicating that the compositions can be used to treat a particular condition. Alternatively, or additionally, the article of manufacture may further comprise a second (or third) container comprising a pharmaceutically acceptable buffer, such as bacteriostatic water for injection (BWFI), phosphate buffered saline, Ringer's solution, and dextrose solution. It may further include other materials desirable from a commercial and user standpoint, including other buffers, diluents, filters, needles, and syringes. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
[0234] Figura 1. Representação esquemática do formato de imunoconjugado de IgG-IL-2, que compreende polipeptídeo de IL-2 mutante.[0234] Figure 1. Schematic representation of the IgG-IL-2 immunoconjugate format comprising mutant IL-2 polypeptide.
[0235] Figura 2. Ligação de PD1-IL2v a células T CD4 (A) e células T CD8 (B) dentro de PBMC ativadas por PHA, em comparação com PD1 IgG e CEA-IL2v.[0235] Figure 2. Binding of PD1-IL2v to CD4 T cells (A) and CD8 T cells (B) within PHA-activated PBMC, compared with PD1 IgG and CEA-IL2v.
[0236] Figura 3. Proliferação de células NK (A), células T CD8 (B) e células T CD4 (C) dentro de PBMCs com PD1-IL2v, CEA-IL2v e a combinação de PD1 IgG mais CEA-IL2v. PD1 IgG foi incluído como controle.[0236] Figure 3. Proliferation of NK cells (A), CD8 T cells (B), and CD4 T cells (C) within PBMCs with PD1-IL2v, CEA-IL2v, and the combination of PD1 IgG plus CEA-IL2v. PD1 IgG was included as a control.
[0237] Figura 4. Ativação de células NK (A), células T CD8 (B) e células T CD4 (C) dentro de PBMCs com PD1-IL2v, CEA-IL2v e a combinação de PD1 IgG mais CEA-IL2v. PD1 IgG foi incluído como controle. A expressão de CD25 em células NK, células T CD4 e células T CD8 foi usada como um marcador de ativação.[0237] Figure 4. Activation of NK cells (A), CD8 T cells (B), and CD4 T cells (C) within PBMCs with PD1-IL2v, CEA-IL2v, and the combination of PD1 IgG plus CEA-IL2v. PD1 IgG was included as a control. CD25 expression on NK cells, CD4 T cells, and CD8 T cells was used as a marker of activation.
[0238] Figura 5. Proliferação de células T CD8 pré-ativadas por PHA (A) e células T CD4 (B) em PBMC com PD1-IL2v, CEA-IL2v e a combinação de PD1 IgG mais CEA-IL2. PD1 IgG foi incluído como controle.[0238] Figure 5. Proliferation of PHA-preactivated CD8 T cells (A) and CD4 T cells (B) in PBMC with PD1-IL2v, CEA-IL2v, and the combination of PD1 IgG plus CEA-IL2. PD1 IgG was included as a control.
[0239] Figura 6. Ativação de células T CD8 pré-estimuladas com PHA (A) e células T CD4 (B) dentro de PBMC com PD1-IL2v, CEA-IL2v e a combinação de PD1 IgG mais CEA-IL2v. PD1 IgG foi incluído como controle. A expressão de CD25 em células T CD4 e células T CD8 foi utilizada como marcador de ativação.[0239] Figure 6. Activation of PHA-prestimulated CD8 T cells (A) and CD4 T cells (B) within PBMC with PD1-IL2v, CEA-IL2v, and the combination of PD1 IgG plus CEA-IL2v. PD1 IgG was included as a control. CD25 expression on CD4 T cells and CD8 T cells was used as a marker of activation.
[0240] Figura 7. Proliferação da linha celular NK humano NK92 induzida por PD-L1-IL2v em comparação com CEA-IL2v (A), ou por PD-L1-IL2v em comparação com PD1-IL2v (B), medida após 2 dias.[0240] Figure 7. Proliferation of the human NK cell line NK92 induced by PD-L1-IL2v compared to CEA-IL2v (A), or by PD-L1-IL2v compared to PD1-IL2v (B), measured after 2 days.
[0241 ] Figura 8. Ligação de PD-L1 -muIL2v e PD-L1 muIgG1 à linha de células T de camundongo CTLL2 positiva para PD-L1.[0241 ] Figure 8. Binding of PD-L1 -muIL2v and PD-L1 muIgG1 to the PD-L1-positive mouse T cell line CTLL2.
[0242] Figura 9. A proliferação da linha celular T positiva para PD- L1 murina CTLL2 induzida por PD1-muIL2v em comparação com CEA-muIL2v (A), ou por PD1-muIL2v em comparação com PD-L1-muIL2v (B), determinada após 3 dias.[0242] Figure 9. Proliferation of the murine PD-L1-positive T cell line CTLL2 induced by PD1-muIL2v compared to CEA-muIL2v (A), or by PD1-muIL2v compared to PD-L1-muIL2v (B), determined after 3 days.
[0243] Figura 10. Resultados de uma experiência de eficácia com anticorpos PD1-IL2v, PD-L1-IL2v ou PD1 e PD-L1 como agentes únicos. A linha celular de carcinoma pancreático transfectante Panc02-H7-Fluc foi injetada no pâncreas de camundongos Black 6 para estudar a sobrevivência em um modelo sinérgico ortotópico pancreático.[0243] Figure 10. Results of an efficacy experiment with PD1-IL2v, PD-L1-IL2v, or PD1 and PD-L1 antibodies as single agents. The transfectant pancreatic carcinoma cell line Panc02-H7-Fluc was injected into the pancreas of Black 6 mice to study survival in a synergistic orthotopic pancreatic model.
[0244] Figura 11. Resultados de uma experiência de eficácia com anticorpos PD1-IL2v, PD-L1-IL2v ou PD1 e PD-L1 como agentes únicos. A linha celular de carcinoma pancreático transfectante Panc02-H7-Fluc foi injetada no pâncreas em camundongos Black 6 para estudar a sobrevivência em um modelo sinérgico ortotópico pancreático por meio de bioluminescência.[0244] Figure 11. Results of an efficacy experiment with PD1-IL2v, PD-L1-IL2v, or PD1 and PD-L1 antibodies as single agents. The transfectant pancreatic carcinoma cell line Panc02-H7-Fluc was injected into the pancreas of Black 6 mice to study survival in a synergistic orthotopic pancreatic model via bioluminescence.
[0245] Figura 12. Capacidade das células T CD4 de segregarem IL- 2 (A), IL-2 e IFN- Y (B) ou IFN- Y (C) após 48 horas recorda com a proteína imunogênica CM65 pp65 na presença de anti-PD-1 ou anti- PD-L 1 sozinho, em combinação com IL-2v, ou como proteínas de fusão.[0245] Figure 12. Ability of CD4 T cells to secrete IL-2 (A), IL-2 and IFN-Y (B), or IFN-Y (C) after 48 hours challenge with the immunogenic CM65 pp65 protein in the presence of anti-PD-1 or anti-PD-L 1 alone, in combination with IL-2v, or as fusion proteins.
[0246] Figura 13. Estado de diferenciação de células T CD4 específicas do vírus que secretam apenas IL-2 (A), tanto IL-2 quanto IFN- Y (B), ou apenas IFN- Y (C e D) após 48 horas lembram a proteína imunogênica CMV pp65 na presença de anticorpos anti-PD-1 ou um anti- PD-G 1 sozinho, em combinação com a IL-2v, ou como proteínas de fusão.[0246] Figure 13. Differentiation state of virus-specific CD4 T cells secreting IL-2 alone (A), both IL-2 and IFN-Y (B), or IFN-Y alone (C and D) after 48 hours resembling the immunogenic CMV pp65 protein in the presence of anti-PD-1 antibodies or an anti-PD-G 1 alone, in combination with IL-2v, or as fusion proteins.
[0247] Figura 14. Ensaio de ligação competitiva de PD1 e PD1-IL2v a células T convencionais e reguladoras ativadas. Delta da frequência ligada em Tconv versus Treg (Figura 14 A) e ligação a Tconv e Treg (Figura 14 B).[0247] Figure 14. Competitive binding assay of PD1 and PD1-IL2v to activated conventional and regulatory T cells. Delta of bound frequency on Tconv versus Treg (Figure 14 A) and binding to Tconv and Treg (Figure 14 B).
[0248] Figura 15. PD1-IL2v reversão da supressão Treg de Tconv. Porcentagem de supressão por Treg de granzima B (Figura 15 A) e interferon^ (Figura 15 B) secretada por Tconv após 5 dias de co-cultura.[0248] Figure 15. PD1-IL2v reversal of Treg suppression of Tconv. Percentage Treg suppression of granzyme B (Figure 15 A) and interferon^ (Figure 15 B) secreted by Tconv after 5 days of co-culture.
[0249] Figura 16. Resultados de uma experiência de eficácia comparando anticorpos muPD1-IL2v com muFAP-IL2v e muPD-1 como agentes únicos e em combinação.[0249] Figure 16. Results of an efficacy experiment comparing muPD1-IL2v antibodies with muFAP-IL2v and muPD-1 as single agents and in combination.
[0250] Figura 17. Os resultados de uma experiência de eficácia comparando muPD1-IL2v para FAP-IL2v, muPD1 e sua combinação.[0250] Figure 17. Results of an efficacy experiment comparing muPD1-IL2v to FAP-IL2v, muPD1 and their combination.
[0251 ] Figura 18A e 18B. Imagens imuno-histoquímicas de tumores do pâncreas coradas por anti-CD3 de camundongo (Figura 18 A) e a análise de quantificação de células T (Figura 18 B).[0251 ] Figure 18A and 18B. Immunohistochemical images of pancreatic tumors stained with mouse anti-CD3 (Figure 18 A) and T cell quantification analysis (Figure 18 B).
[0252] Figura 19. Imagens imuno-histoquímicas de tumores do pâncreas coradas por anti-camundongo PD1.[0252] Figure 19. Immunohistochemical images of pancreatic tumors stained with anti-mouse PD1.
[0253] Figura 20. Imagens imuno-histoquímicas de tumores do pâncreas coradas por anti-camundongo de ICOS.[0253] Figure 20. Immunohistochemical images of pancreatic tumors stained with anti-mouse ICOS.
[0254] Figura 21. Resultados de uma experiência de eficácia comparando muPD1-IL2v com FAP-IL2v e muPD1 como agentes únicos e em combinação.[0254] Figure 21. Results of an efficacy trial comparing muPD1-IL2v with FAP-IL2v and muPD1 as single agents and in combination.
[0255] Figura 22. Resultados de uma experiência de eficácia comparando muPD1 -IL2v para FAP-IL2v, muPD1 e a sua combinação com duas doses diferentes.[0255] Figure 22. Results of an efficacy experiment comparing muPD1-IL2v to FAP-IL2v, muPD1 and their combination at two different doses.
[0256] Figura 23. Imagens imuno-histoquímicas de tumores do pâncreas coradas por anti-CD3 de camundongo.[0256] Figure 23. Immunohistochemical images of pancreatic tumors stained with mouse anti-CD3.
[0257] Figura 24A e 24B. Imagens imuno-histoquímicas de tumores do pâncreas coradas para camundongo anti-CD8 (Figura 24A) e a análise de quantificação de células T (Figura 24B).[0257] Figure 24A and 24B. Immunohistochemical images of pancreatic tumors stained for mouse anti-CD8 (Figure 24A) and T cell quantification analysis (Figure 24B).
[0258] Figura 25A e 25B. Imagens imuno-histoquímicas de tumores do pâncreas coradas por anti-granzima B (Figura 25A) e granzima B análise área marcador quantificação (Figura 25B).[0258] Figure 25A and 25B. Immunohistochemical images of pancreatic tumors stained by anti-granzyme B (Figure 25A) and granzyme B marker area quantification analysis (Figure 25B).
[0259] Figura 26A e 26B. Imagens imuno-histoquímicas de tumores do pâncreas coradas para camundongo anti-PD1 (Figura 26A) e a análise de quantificação de células positivas PD1 (Figura 26B).[0259] Figure 26A and 26B. Immunohistochemical images of pancreatic tumors stained for mouse anti-PD1 (Figure 26A) and quantification analysis of PD1 positive cells (Figure 26B).
[0260] Figura 27 A-D. Capacidade de células T CD4 para secretar IL-2 (A), IL-2 e IFN- Y (B) ou IFN- Y (C) e proliferar (D) após 48 horas de recordação com a proteína imunogênica CM65 pp65 na presença de anti -PD-1 sozinho, em combinação com IL-2v, ou como proteína de fusão.[0260] Figure 27 A-D. Ability of CD4 T cells to secrete IL-2 (A), IL-2 and IFN-Y (B), or IFN-Y (C) and proliferate (D) after 48 hours of recall with the immunogenic CM65 pp65 protein in the presence of anti-PD-1 alone, in combination with IL-2v, or as a fusion protein.
[0261] Figura 28. Estado de diferenciação, de acordo com a expressão de CD45RO e CD62L, de células T CD4 específicas para o vírus que secretam IFN- Y após 48 horas recordar com a proteína pp65 imunogênica de CMV na presença de anti-PD-1 isolado, em combinação com IL-2v, ou como proteína de fusão.[0261] Figure 28. Differentiation status, according to CD45RO and CD62L expression, of virus-specific CD4 T cells secreting IFN-γ after 48 hours of recall with the immunogenic CMV pp65 protein in the presence of anti-PD-1 alone, in combination with IL-2v, or as a fusion protein.
[0262] Figura 29 A-D. Ensaio de STAT5 em PBMC em repouso de um primeiro dador (células T CD8 (A), células NK (B), células T CD4 (C) e células T reguladoras (D)).[0262] Figure 29 A-D. STAT5 assay in resting PBMC from a first donor (CD8 T cells (A), NK cells (B), CD4 T cells (C), and regulatory T cells (D)).
[0263] Figura 30 A-D. Ensaio de STAT5 em PBMC em repouso de um segundo dador (células T CD4 (A), células T CD8 (B), células T reguladoras (C) e células NK (D)).[0263] Figure 30 A-D. STAT5 assay in resting PBMC from a second donor (CD4 T cells (A), CD8 T cells (B), regulatory T cells (C), and NK cells (D)).
[0264] Figura 31 A-D. Ensaio de STAT5 em PBMC em repouso de um terceiro dador (células T CD8 (A), células NK (B), células T CD4 (C) e células T reguladoras (D)).[0264] Figure 31 A-D. STAT5 assay in resting PBMC from a third donor (CD8 T cells (A), NK cells (B), CD4 T cells (C), and regulatory T cells (D)).
[0265] Figura 32 A-D. Ensaio de STAT5 em PBMC em repouso de um quarto dador (células T CD8 (A), células NK (B), células T CD4 (C) e células T reguladoras (D).SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOSEXEMPLOS[0265] Figure 32 AD. STAT5 assay in resting PBMC from a fourth donor (CD8 T cells (A), NK cells (B), CD4 T cells (C), and regulatory T cells (D). AMINO ACID SEQUENCES EXAMPLES
[0266] Os seguintes são exemplos de métodos e composições da invenção. Entende-se que várias outras formas de realização podem ser praticadas, dada a descrição geral fornecida acima.EXEMPLO 1EXEMPLO 1A. PREPARAÇÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO PD1-IL2V[0266] The following are examples of methods and compositions of the invention. It is understood that various other embodiments may be practiced, given the general description provided above. EXAMPLE 1 EXAMPLE 1A. PREPARATION OF PD1-IL2V FUSION PROTEINS
[0267] A cassete de expressão para a cadeia pesada do anticorpo - interleucina-2 (IL-2) proteína de fusão [região variável de cadeia pesada de anticorpo PD-1 anti-humano, de IgG humano uma cadeia pesada (mutações rolamento L234A, L235A e P329G (numeração UE) para a remoção de funções efetoras, e mutações S354C e T366W (numeração UE) para a heterodimerização (“maçaneta”)), (G4S)3 de ligação, e IL-2v humano (tendo as mutações T3A, F42A, Y45A, L72G e C125A)], o cassete de expressão para a cadeia pesada do anticorpo [região variável de cadeia pesada de anticorpo PD- 1 anti-humano, e IgG humano de uma cadeia pesada de mutações (mutações rolamento L234A, L235A e P329G (numeração UE) para a remoção de funções efetoras, Y349C, T366S, L368A e Y410V (numeração UE) paraheterodimerização (“cavidade”) e, de forma opcional, mutações H435R e Y436F (numeração UE)] e o cassete de expressão para a cadeia leve do anticorpo [região variável de cadeia leve de PD humano- 1 anticorpo, e região constante C kappa humano] e foi produzido por sintese genética.[0267] The expression cassette for the antibody heavy chain - interleukin-2 (IL-2) fusion protein [anti-human PD-1 antibody heavy chain variable region, human IgG 1 heavy chain (bearing mutations L234A, L235A and P329G (EU numbering) for removal of effector functions, and mutations S354C and T366W (EU numbering) for heterodimerization (“doorknob”)), (G4S)3 binding, and human IL-2v (bearing the mutations T3A, F42A, Y45A, L72G and C125A)], the expression cassette for the antibody heavy chain [anti-human PD-1 antibody heavy chain variable region, and human IgG 1 heavy chain mutations (bearing mutations L234A, L235A and P329G (EU numbering) for removal of effector functions, Y349C, T366S, L368A and Y410V (EU numbering) for heterodimerization (“cavity”) and, optionally, mutations H435R and Y436F (EU numbering)] and the expression cassette for the antibody light chain [human PD-1 antibody light chain variable region, and human C kappa constant region] and was produced by gene synthesis.
[0268] Cada um foi clonado por digestão com HindIII e NheI em um vetor de expressão sob o controle do promotor CMV seguido por Intron-A e terminado por sinal BGH-poli A. O vetor continha ainda um gene de resistência à ampicilina bacteriana e uma origem de replicação de E. coli.[0268] Each was cloned by digestion with HindIII and NheI into an expression vector under the control of the CMV promoter followed by Intron-A and terminated by BGH-poly A signal. The vector further contained a bacterial ampicillin resistance gene and an E. coli origin of replication.
[0269] A proteína humanizada de fusão IL-PD1-2v (SEQ. ID N°s 22, 24 e 25) foi gerada por co-transfecção de células HEK293F (Invitrogen) com os vetores acima descritos na proporção de 1: 1: 1 em agitação frascos. Após uma semana, o sobrenadante foi colhido e filtrado através de filtros estéreis.[0269] Humanized IL-PD1-2v fusion protein (SEQ. ID NOs: 22, 24 and 25) was generated by co-transfecting HEK293F cells (Invitrogen) with the above-described vectors at a 1:1:1 ratio in shaking flasks. After one week, the supernatant was harvested and filtered through sterile filters.
[0270] A proteína de fusão foi purificada a partir do sobrenadante por uma combinação de cromatografia de afinidade com Proteína A e cromatografia de exclusão por tamanho. O produto obtido foi caracterizado por identidade por espectrometria de massa e propriedades analíticas como pureza por eletroforese capilar (CE-SDS), teor de monômero e estabilidade.[0270] The fusion protein was purified from the supernatant by a combination of Protein A affinity chromatography and size exclusion chromatography. The obtained product was characterized by identity by mass spectrometry and analytical properties such as purity by capillary electrophoresis (CE-SDS), monomer content and stability.
[0271] A proteína de fusão substituta de murino PD1- IL2v (SEQ. ID N°s 34-36) foi produzida analogamente. A molécula substituta compreende um anticorpo anti-camundongo de IgG1 de murídeo murino (portando mutações de Fc para remoção da função efetora e para heterodimerização) e interleucina-2 de murídeo com mutações análogas à molécula humana.[0271] The surrogate murine PD1-IL2v fusion protein (SEQ. ID NOs: 34-36) was produced analogously. The surrogate molecule comprises a murine anti-mouse IgG1 antibody (bearing Fc mutations for removal of effector function and for heterodimerization) and murine interleukin-2 with mutations analogous to the human molecule.
[0272] Ambas as proteínas de fusão podem ser produzidas com bons rendimentos e são estáveis.EXEMPLO 1B. PREPARAÇÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO PD-L1-IL2V[0272] Both fusion proteins can be produced in good yields and are stable.EXAMPLE 1B. PREPARATION OF PD-L1-IL2V FUSION PROTEINS
[0273] A cassete de expressão para a cadeia pesada do anticorpo - interleucina-2 (IL-2) proteína de fusão [região variável de cadeia pesada de anticorpo PD-L1 anti-humano, de IgG humano uma cadeia pesada (mutações rolamento L234A, L235A e P329G (numeração UE) para a remoção de funções efetoras, e mutações S354C e T366W (numeração UE) para a heterodimerização (“maçaneta”)), (G4S)3 de ligação, e IL-2v humano (tendo as mutações T3A, F42A, Y45A, L72G e C125A)], o cassete de expressão para a cadeia pesada do anticorpo [região variável de cadeia pesada de anticorpo PD- L1 anti-humano, e IgG humano de uma cadeia pesada de mutações (mutações rolamento L234A, L235A e P329G (numeração UE) para a remoção de funções efetoras, Y349C, T366S, L368A e Y410V (numeração UE) paraheterodimerização (“cavidade”))] e o cassete de expressão para a cadeia leve do anticorpo [região variável de cadeia leve do anticorpo anti-humano PD-L1 e região constante capa humano C] foram produzidos por síntese genética. A expressão de anticorpo foi dirigida por um promotor químico de MPSV e uma sequência de sinal poliA sintética foi localizada na extremidade 3 'do CDS. Além disso, cada vetor continha uma sequência EBV OriP.[0273] The expression cassette for the antibody heavy chain - interleukin-2 (IL-2) fusion protein [anti-human PD-L1 antibody heavy chain variable region, human IgG A heavy chain (bearing mutations L234A, L235A and P329G (EU numbering) for removal of effector functions, and mutations S354C and T366W (EU numbering) for heterodimerization (“doorknob”)), (G4S)3 binding, and human IL-2v (bearing the mutations T3A, F42A, Y45A, L72G and C125A)], the expression cassette for the antibody heavy chain [anti-human PD-L1 antibody heavy chain variable region, and human IgG A heavy chain mutations (bearing mutations L234A, L235A and P329G (EU numbering) for removal of effector functions, Y349C, T366S, L368A and Y410V (EU numbering) for heterodimerization (“cavity”))] and the expression cassette for the antibody light chain [anti-human PD-L1 antibody light chain variable region and human kappa constant region C] were produced by gene synthesis. Antibody expression was driven by an MPSV chemical promoter and a synthetic polyA signal sequence was located at the 3′ end of the CDS. In addition, each vector contained an EBV OriP sequence.
[0274] As moléculas foram produzidas por co-transfecção de células HEK293-EBNA crescendo em suspensão com os vetores de expressão de mamíferos utilizando polietilenimina. As células foram transfectadas com os vetores de expressão correspondentes em uma proporção de 1: 1: 2 (“cadeia pesada de vetores (VH-CH1-CH2-CH3-IL2v)”: “cadeia pesada de vetores (VH- CH1-CH2-CH3)”: “Cadeia leve vetorial (VL-CL)”).[0274] The molecules were produced by co-transfection of HEK293-EBNA cells growing in suspension with the mammalian expression vectors utilizing polyethylenimine. The cells were transfected with the corresponding expression vectors in a ratio of 1:1:2 (“vector heavy chain (VH-CH1-CH2-CH3-IL2v)” : “vector heavy chain (VH-CH1-CH2-CH3)” : “vector light chain (VL-CL)”).
[0275] Para transfecção, as células HEK293 EBNA são cultivadas em suspensão em meio de cultura Excell sem soro contendo 6 mM de L- glutamina e 250 mg/ l de meio de cultura G418. Para a produção em frascos de tubos de ensaio de 600 ml (volume máximo de trabalho de 400 ml) 600 milhões de células HEK293 EBNA foram semeadas 24 horas antes da transfecção. Para transfecção, as células foram centrifugadas durante 5 min por 210 x g e o sobrenadante foi substituído por 20 mL de meio CD CHO pré-aquecido. Os vetores de expressão foram misturados em 20 mL de meio CD-CHO atuma quantidade final de 400 de DNA. Após a adição de 1080 μl de solução de PEI (2,7 μg/ ml), a mistura foi agitada em vortex durante 15 s e subsequentemente incubada durante 10 min à temperatura ambiente. Depois as células foram misturadas com a solução de DNA/ PEI, transferidas para um frasco de tubos de ensaio de 600 ml e incubadas durante 3 horas a 37 ° C numa incubadora com uma atmosfera de CO2 a 5%. Após o tempo de incubação, foram adicionados 360 ml de Excell + L-glutamina 6 mM + 5 g/ l de Pepsoy + meio VPA 1,0 mM e as células foram cultivadas durante 24 horas. Um dia após a transfecção adicionou-se 7% de alimento 7. Após 7 dias de cultivo, o sobrenadante foi coletado para purificação por centrifugação por 20 - 30 min a 3600 x g (centrífuga Sigma 8K), a solução foi esterilizada por filtração (filtro de 0,22 mm) e azida sódica em concentração final de 0,01% (p/ v) foi adicionado. A solução foi mantida a 4 °C.[0275] For transfection, HEK293 EBNA cells are cultured in suspension in serum-free Excell culture medium containing 6 mM L-glutamine and 250 mg/l G418 culture medium. For production in 600 ml test tube flasks (maximum working volume 400 ml) 600 million HEK293 EBNA cells were seeded 24 hours before transfection. For transfection, the cells were centrifuged for 5 min at 210 x g and the supernatant was replaced with 20 ml of pre-warmed CD-CHO medium. The expression vectors were mixed in 20 ml of CD-CHO medium to a final amount of 400 µg DNA. After addition of 1080 μl of PEI solution (2.7 μg/ml), the mixture was vortexed for 15 s and subsequently incubated for 10 min at room temperature. Then the cells were mixed with the DNA/PEI solution, transferred to a 600 ml test tube flask and incubated for 3 h at 37 °C in an incubator with a 5% CO2 atmosphere. After the incubation time, 360 ml of Excell + 6 mM L-glutamine + 5 g/l Pepsoy + 1.0 mM VPA medium were added and the cells were cultured for 24 h. One day after transfection, 7% food 7 was added. After 7 days of culture, the supernatant was collected for purification by centrifugation for 20 - 30 min at 3600 x g (Sigma 8K centrifuge), the solution was sterilized by filtration (0.22 mm filter) and sodium azide at a final concentration of 0.01% (w/v) was added. The solution was kept at 4 °C.
[0276] A construção humana de PD-L1-IL2v (SEQ ID NOs 37-39) foi purificada por um passo de afinidade com proteína A (MabSeletSure, GE Healthcare) seguido por cromatografia de exclusão de tamanho (HiLoad 16/60 Superdex 200, GE Healthcare). Para cromatografia de afinidade, o sobrenadante foi carregado em uma coluna HiTrap Proteína A HP (CV = 5 mL, GE Healthcare) equilibrada com 25 mL de fosfato de sódio 20 mM, citrato de sódio 20 mM, pH 7,5. A proteína não ligada foi removida lavando com pelo menos 10 volumes de coluna 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio, pH 7,5 e a proteína alvo foi eluída em 6 volumes de coluna 20 mM de citrato de sódio, 100 mM de cloreto de sódio, 100 mM de glicina, 0,01% Tween20 pH 3,0. A solução de proteína foi neutralizada pela adição de 1/10 de fosfato de sódio 0,5 M, pH 8,0. A proteína alvo foi concentrada e filtrada antes do carregamento em uma coluna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada com histidina 20 mM, cloreto de sódio 140 mM, pH 6,0, Tween 20 a 0,01%.[0276] The human PD-L1-IL2v construct (SEQ ID NOs 37-39) was purified by a protein A affinity step (MabSeletSure, GE Healthcare) followed by size exclusion chromatography (HiLoad 16/60 Superdex 200, GE Healthcare). For affinity chromatography, the supernatant was loaded onto a HiTrap Protein A HP column (CV = 5 mL, GE Healthcare) equilibrated with 25 mL of 20 mM sodium phosphate, 20 mM sodium citrate, pH 7.5. Unbound protein was removed by washing with at least 10 column volumes 20 mM sodium phosphate, 20 mM sodium citrate, pH 7.5 and target protein was eluted in 6 column volumes 20 mM sodium citrate, 100 mM sodium chloride, 100 mM glycine, 0.01% Tween20 pH 3.0. The protein solution was neutralized by the addition of 1/10 0.5 M sodium phosphate, pH 8.0. Target protein was concentrated and filtered prior to loading onto a HiLoad Superdex 200 column (GE Healthcare) equilibrated with 20 mM histidine, 140 mM sodium chloride, pH 6.0, 0.01% Tween 20.
[0277] A construção murina de PD-L1-IL2v (SEQ. ID N°s 40-42) foi igualmente purificada por um passo de afinidade com proteína A (MabSeletSure, GE Healthcare) seguida por cromatografia de exclusão de tamanho (HiLoad 16/60 Superdex 200, GE Healthcare). Para cromatografia de afinidade o sobrenadante foi misturado 1: 1 com 2 M glicina, 0,6 M NaCl pH 8,6 e carregado em uma coluna HiTrap Proteína A HP (CV = 5 mL, GE Healthcare) equilibrada com 25 ml de glicina 1M, 0,3 M NaCl pH 8,6. A proteína não ligada foi removida por lavagem com pelo menos 10 volumes de coluna de 1M glicina, 0,3 M NaCl pH 8,6 e a proteína alvo foi eluída em 6 volumes de coluna de 1 M glicina, 0,3 M NaCl pH 4,0. A solução de proteína foi neutralizada pela adição de 1/10 de fosfato de sódio a 0,5 M, pH 8,0. A proteína alvo foi concentrada e filtrada antes do carregamento em uma coluna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada com histidina 20 mM, cloreto de sódio 140 mM, pH 6,0, Tween 20 a 0,01%.[0277] The murine PD-L1-IL2v construct (SEQ. ID NOs: 40-42) was similarly purified by a protein A affinity step (MabSeletSure, GE Healthcare) followed by size exclusion chromatography (HiLoad 16/60 Superdex 200, GE Healthcare). For affinity chromatography the supernatant was mixed 1:1 with 2 M glycine, 0.6 M NaCl pH 8.6 and loaded onto a HiTrap Protein A HP column (CV = 5 mL, GE Healthcare) equilibrated with 25 mL of 1 M glycine, 0.3 M NaCl pH 8.6. Unbound protein was removed by washing with at least 10 column volumes of 1 M glycine, 0.3 M NaCl pH 8.6 and the target protein was eluted in 6 column volumes of 1 M glycine, 0.3 M NaCl pH 4.0. The protein solution was neutralized by the addition of 1/10 0.5 M sodium phosphate, pH 8.0. The target protein was concentrated and filtered prior to loading onto a HiLoad Superdex 200 column (GE Healthcare) equilibrated with 20 mM histidine, 140 mM sodium chloride, pH 6.0, 0.01% Tween 20.
[0278] A preparação final de humano PD-L1-IL2v continha 99% de monômero (determinado com uma coluna analítica de exclusão de tamanho TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) em 25 mM de K 2 HPO 4, 125 mM de NaCl, 200 mM de monohidroclorido L-arginina, 0,02 % (w/ v) NaN 3, pH 6,7 tampão de corrida a 25 °C) e tinha 100% de pureza (determinada por eletroforese capilar não-reduzida de SDS em um sistema Caliper LabChip GXII (Caliper LifeScience) utilizado de acordo com as instruções do fabricante). O rendimento de produção foi de 23 mg/ l. A análise de espectrometria de massa revelou uma molécula montada de forma mais correta com traços (<5%) de moléculas sem interleucina-2 (espectrometria de massa realizada em um sistema Agilent LC-MS (Agilent Technologies) com coluna NUCLEOGEL RP1000-8, 250 mm x 4,6 mm (MACHEREY-NAGEL GmbH) e um gradiente de ácido acetonitrila-fórmico).[0278] The final preparation of human PD-L1-IL2v contained 99% monomer (determined with a TSKgel G3000 SW XL size exclusion analytical column (Tosoh) in 25 mM K 2 HPO 4 , 125 mM NaCl, 200 mM L-arginine monohydrochloride, 0.02% (w/v) NaN 3 , pH 6.7 running buffer at 25 °C) and had 100% purity (determined by non-reduced SDS capillary electrophoresis on a Caliper LabChip GXII system (Caliper LifeScience) used according to the manufacturer's instructions). The production yield was 23 mg/L. Mass spectrometry analysis revealed a more correctly assembled molecule with traces (<5%) of interleukin-2-free molecules (mass spectrometry performed on an Agilent LC-MS system (Agilent Technologies) with a NUCLEOGEL RP1000-8 column, 250 mm x 4.6 mm (MACHEREY-NAGEL GmbH) and an acetonitrile-formic acid gradient).
[0279] Para o substituto murino PD-L1 -IL2v, o teor de monômero foi de 96%, a pureza de 100% e o rendimento de produção de 3,8 mg/ L.EXEMPLO 1C. PREPARAÇÃO DE CEA-IL2V SUBSTITUTO DE MURINO E FAP-IL2V SUBSTITUTO DE MURINO[0279] For the murine PD-L1-IL2v surrogate, the monomer content was 96%, the purity was 100%, and the production yield was 3.8 mg/L. EXAMPLE 1C. PREPARATION OF MURINE CEA-IL2V SUBSTITUTE AND MURINE FAP-IL2V SUBSTITUTE
[0280] Uma molécula substituta murada da imunocitocina CEA-IL2v dirigida a CEA-alvo, denominada muCEA-muIL2v (também denominada muCEA-IL2v), foi gerada para uso em modelos tumorais in vivo em camundongos totalmente imunocompetentes, a fim de reduzir a formação de anti anticorpos anti-droga (ADA). Adicionalmente, foi gerada uma versão química murada da imunocitocina FAP-IL2v alvo da IL-2 dirigida a FAP, denominada muFAP-muIL2v (também designada muFAP-IL2v), respectivamente, para uso de modelos tumorais in vivo em camundongos totalmente imunocompetentes, de modo a reduzir a formação de anticorpos anti-droga (ADA). Nas moléculas substitutas muradas, as mutações maçaneta-a-cavidade do domínio Fc foram substituídas por mutações DDKK em muIgG1 e as mutações LALA P329G foram substituídas por mutações DAPG em muIgG1 (como divulgado no pedido PCT WO 2016/0330350 A1, que é incorporado por referência na sua totalidade).[0280] A walled surrogate molecule of the CEA-targeted immunocytokine CEA-IL2v, termed muCEA-muIL2v (also referred to as muCEA-IL2v), has been generated for use in in vivo tumor models in fully immunocompetent mice to reduce the formation of anti-drug antibodies (ADA). Additionally, a walled chemical version of the FAP-targeted IL-2 immunocytokine FAP-IL2v, termed muFAP-muIL2v (also referred to as muFAP-IL2v), respectively, has been generated for use in in vivo tumor models in fully immunocompetent mice to reduce the formation of anti-drug antibodies (ADA). In the walled-off surrogate molecules, the Fc domain knob-to-hole mutations were replaced by DDKK mutations in muIgG1 and the LALA P329G mutations were replaced by DAPG mutations in muIgG1 (as disclosed in PCT application WO 2016/0330350 A1, which is incorporated by reference in its entirety).
[0281] Por exemplo, muCEA-muIL2v é caracterizado pelos seguintes recursos. Como anticorpo parental, é aplicado um anticorpo IgG1 quimérico humano-camundongo com regiões variáveis humanos, mas com regiões constantes murinas. De modo a evitar a imunogenicidade potencial, utilizou-se o correspondente alótipo Black 6 (sequência publicada por Mouse Genomes Projet). A ligação a muIL2Rα foi abolida por três mutações homólogas às identificadas na IL-2v humano e o respectivo local de O-glicosilação foi removido: T23A (O-Glico), F76A, Y79A, L106G. Além disso, tal como na aldesleucina, o resíduo de cisteina foi mutado para evitar a agregação por uma mutação C160A (numeração com base na UniProt ID P04351 incluindo o peptídeo sinal). Embora muIgG1 já tenha reduzido a ligação de FCYR, a ligação a FCYRS murinos foi completamente abolida pela introdução das mutações DAPG (D265A, p329G), enquanto a ligação muFcRn é retida. muIL-2v foi fundida através de um conector não-imunogênico (G4S)2 - apenas para o terminal C de uma cadeia pesada do anticorpo muIgG1. Para conseguir isso, a imunocitocina foi manipulada usando direção eletrostática via mutações DDKK no domínio Fc para permitir a heterodimerização no fundo do camundongo.[0281] For example, muCEA-muIL2v is characterized by the following features. As parental antibody, a chimeric human-mouse IgG1 antibody with human variable regions but murine constant regions is applied. In order to avoid potential immunogenicity, the corresponding Black 6 allotype (sequence published by Mouse Genomes Project) was used. Binding to muIL2Rα was abolished by three mutations homologous to those identified in human IL-2v and the respective O-glycosylation site was removed: T23A (O-Glyco), F76A, Y79A, L106G. Furthermore, as in aldesleukin, the cysteine residue was mutated to prevent aggregation by a C160A mutation (numbering based on UniProt ID P04351 including the signal peptide). Although muIgG1 already has reduced FCYR binding, binding to murine FCYRs was completely abolished by the introduction of the DAPG mutations (D265A, p329G), while muFcRn binding is retained. muIL-2v was fused via a non-immunogenic (G4S)2-only connector to the C-terminus of a muIgG1 antibody heavy chain. To achieve this, the immunocytokine was engineered using electrostatic steering via DDKK mutations in the Fc domain to allow heterodimerization in the mouse background.
[0282] As sequências polipeptídicas de muCEA-muIL2v são as seguintes:- Cadeia pesada com mutação DD e com muIL2v fundida (SEQ. ID N°: 44):QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPG QGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVY YCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVT LGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWP SQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTIT LTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPI MHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAK DKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYDNTQPIMDTDGSYFVYSDLNV QKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGGGGGSGGGGSGGGGSA PASSSTSSSTAEAQQQQQQQQQQQQHLEQLLMDLQELLSRMENYRNLKLPR MLTAKFALPKQATELKDLQCLEDELGPLRHVLDGTQSKSFQLEDAENFISNIRV TVVKLKGSDNTFECQFDDESATVVDFLRRWIAFAQSIISTSPQ- Cadeia pesada com mutação KK (SEQ. ID N°: 45):QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPG QGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVY YCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVT LGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWP SQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTIT LTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPI MHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKKQMAK DKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMKTDGSYFVYSKLNV QKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK- Cadeia leve (SEQ. ID N°: 46): DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKA PKLLIYSASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLF TFGQGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKI DGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTS TSPIVKSFNRNEC[0282] The polypeptide sequences of muCEA-muIL2v are as follows:- Heavy chain with DD mutation and with fused muIL2v (SEQ. ID NO: 44):QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPG QGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVY YCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVT LGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWP SQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTIT LTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPI MHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAK DKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYDNTQPIMDTDGSYFVYSDLNV QKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGGGGGSGGGGSGGGGSA PASSSTSSSTAEAQQQQQQQQQQQQHLEQLLMDLQELLSRMENYRNLKLPR MLTAKFALPKQATELKDLQCLEDELGPLRHVLDGTQSKSFQLEDAENFISNIRV TVVKLKGSDNTFECQFDDESATVVDFLRRWIAFAQSIISTSPQ- Heavy chain with KK mutation (SEQ. ID NO.: 45):QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPG QGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVY YCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVT LGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWP SQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTIT LTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPI MHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKKQMAK DKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMKTDGSYFVYSKLNV QKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK- Light chain (SEQ. ID NO: 46): DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKA PKLLIYSASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLF TFGQGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKI DGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTS TSPIVKSFNRNEC
[0283] As sequências polipeptídicas de muFAP-muIL2v são as seguintes:Cadeia pesada com mutação DD e com muIL2v fundida (SEQ. ID N°: 47):EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPG KGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY CAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLV KGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVT CNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKV TCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQD WLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSL TCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYDNTQPIMDTDGSYFVYSDLNVQKSN WEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGGGGGSGGGGSGGGGSAPASS STSSSTAEAQQQQQQQQQQQQHLEQLLMDLQELLSRMENYRNLKLPRMLTA KFALPKQATELKDLQCLEDELGPLRHVLDGTQSKSFQLEDAENFISNIRVTVVK LKGSDNTFECQFDDESATVVDFLRRWIAFAQSIISTSPQCadeia pesada com mutação KK (SEQ. ID N°: 48):EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPG KGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY CAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLV KGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVT CNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKV TCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQD WLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKKQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMKTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKCadeia leve (SEQ. ID N°: 49):EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQA PRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPT FGQGTKVEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKID GSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTS PIVKSFNRNEC[0283] The polypeptide sequences of muFAP-muIL2v are as follows: Heavy chain with DD mutation and with fused muIL2v (SEQ. ID NO:47): EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPG KGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY CAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLV KGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVT CNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKV TCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQD WLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSL TCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYDNTQPIMDTDGSYFVYSDLNVQKSN WEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGGGGGSGGGGSGGGGSAPASS STSSSTAEAQQQQQQQQQQQQHLEQLLMDLQELLSRMENYRNLKLPRMLTA KFALPKQATELKDLQCLEDELGPLRHVLDGTQSKSFQLEDAENFISNIRVTVVK LKGSDNTFECQFDDESATVVDFLRRWIAFAQSIISTSPQChain heavy with KK mutation (SEQ. ID NO: 48) KGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVT CNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKV TCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQD WLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKKQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMKTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKLight chain (SEQ. ID NO: 49) GSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTS PIVKSFNRNEC
[0284] As sequências polipeptídicas de muPDI são as seguintes:Cadeia pesada (SEQ. ID N°: 50):EVQLQESGPG LVKPSQSLSLTCSVTGYSITSSYRWNWIRKFPGNRLEWMG YINSAGISNYNPSLKRRISITRDTSKNQFFLQVNSVTTEDAATYYCARSD NMGTTPFTYWGQGTLVTVSSASTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVK GYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSI TCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNAAGGPSVFIFPPKI KDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYN STLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLGAPIERTISKPKGSVRAPQ VYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPV LDSDGSYFMY SKLRVEKKNW VERNSYSCSV VHEGLHNHHTTKSFSRTPGKCadeia leve (SEQ. ID N°: 51):DIVMTQGTLPNPVPSGESVSITCRSSKSLLYSDGKTYLNWYLQRPGQSPQLLIYWMSTRA SGVSDRFSGSGSGTDFTLKISGVEAEDV GI YYCQQGLEFP TFGGGTKLEL KRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFL NNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQ D SKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEA THKTSTSPIV KSFNRNEC[0284] The polypeptide sequences of muPDI are as follows:Heavy chain (SEQ. ID NO:50):EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSSYRWNWIRKFPGNRLEWMGYINSAGISNYNPSLKRRISITRDTSKNQFFLQVNSVTTEDAATYYCARSDNMGTPFTYWGQGTLVTVSSASTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNAAGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYN STLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLGAPIERTISKPKGSVRAPQ VYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPV LDSDGSYFMY SKLRVEKKNW VERNSYSCSV VHEGLHNHHTTKSFSRTPGKLight chain (SEQ. ID NO: 51) SKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEA THKTSTSPIV KSFNRNEC
[0285] Os imunoconjugados preparados neste Exemplo foram ainda utilizados nos Exemplos seguintes.EXEMPLO 2EXEMPLO 2A. LIGAÇÃO DE PD1-IL2V A CÉLULAS T CD8 E CD4 ATIVADAS[0285] The immunoconjugates prepared in this Example were further used in the following Examples. EXAMPLE 2 EXAMPLE 2A. BINDING OF PD1-IL2V TO ACTIVATED CD8 AND CD4 T CELLS
[0286] PBMCs recentemente isoladas de dadores humanos saudáveis foram estimuladas durante a noite com CD3 e CD28 para induzir a regulação positiva de PD1 em células T. As PBMC foram semeadas em meio (RPMI1640, 10% de FCS, glutamina 2 mM) em frascos de cultura de células que foram revestidas durante 1 h a 37 °C com um μg/ ml CD3 (OKT3 clone, # 317304, BioLegend). CD28 foi adicionado em uma solução para as PBMC a uma concentração de 2 μg/ ml (clone CD28.2, # 302914, BioLegend). No dia seguinte, as PBMC foram colhidas e transferidas para uma placa de fundo redondo de 96 poços (200.000 células por poço). As células foram lavadas com tampão FACS (PBS, 2% de FBS, 5 mM de EDTA, 0,025% de NaN 3) e coradas com 40 μl das moléculas indicadas (PD1 IgG, pD1-IL2v e CEA-IL2v) em tampão de FACS durante 30 min a 4 °C. As células foram lavadas duas vezes com tampão FACS para remover moléculas não ligadas. Em seguida, 40 μl de anticorpo secundário diluído PE anti-Fc humano específico (# 109-116-170, Jackson ImmunoResearch) foi adicionada às células. Após 30 min de incubação a 4 °C, as células foram lavadas duas vezes com tampão FACS. Para detectar células T, os PBMCs foram corados com 40 μl de uma mistura de CD3 FITC (clone UCHT1, # 300406, BioLegend), CD4 APC (clone RPA-T4, 300514, BioLegend) e CD8 BV421 (clone RPA-T8, # 301036, BioLegend) durante 30 min a 4. Os anticorpos não ligados foram removidos por lavagem duas vezes com tampão FACS. Finalmente as células foram fixadas com 1% de PFA em tampão FACS e medidas utilizando um bloqueio de BD Fortessa em células CD3+ CD4+ (células T CD4) e células CD3+ CD8+ (células T CD8).[0286] Freshly isolated PBMCs from healthy human donors were stimulated overnight with CD3 and CD28 to induce PD1 upregulation on T cells. PBMCs were seeded in medium (RPMI1640, 10% FCS, 2 mM glutamine) in cell culture flasks that were coated for 1 h at 37 °C with 1 μg/ml CD3 (OKT3 clone, #317304, BioLegend). CD28 was added in solution to the PBMCs at a concentration of 2 μg/ml (clone CD28.2, #302914, BioLegend). The next day, PBMCs were harvested and transferred to a 96-well round bottom plate (200,000 cells per well). Cells were washed with FACS buffer (PBS, 2% FBS, 5 mM EDTA, 0.025% NaN 3 ) and stained with 40 μl of the indicated molecules (PD1 IgG, pD1-IL2v, and CEA-IL2v) in FACS buffer for 30 min at 4 °C. Cells were washed twice with FACS buffer to remove unbound molecules. Then, 40 μl of diluted PE-specific anti-human Fc secondary antibody (#109-116-170, Jackson ImmunoResearch) was added to the cells. After 30 min of incubation at 4 °C, cells were washed twice with FACS buffer. To detect T cells, PBMCs were stained with 40 μl of a mixture of CD3 FITC (clone UCHT1, #300406, BioLegend), CD4 APC (clone RPA-T4, 300514, BioLegend), and CD8 BV421 (clone RPA-T8, #301036, BioLegend) for 30 min at 4 °C. Unbound antibodies were removed by washing twice with FACS buffer. Finally cells were fixed with 1% PFA in FACS buffer and measured using a BD Fortessa block on CD3+ CD4+ cells (CD4 T cells) and CD3+ CD8+ cells (CD8 T cells).
[0287] Como mostrado na Figura 2, pD1-IL2v e o correspondente IgG PD1 ligam-se de forma semelhante às células T CD4 e CD8. Uma imunocitocina análoga: CEA-IL2v, direcionada para CEA em células tumorais em vez de PD1, serviu como um controle não direcionado para comparar com o efeito isolado de imunocitocinas com base em IL2v que não são direcionadas para PD1.EXEMPLO 2B. ATIVAÇÃO E PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS T E CÉLULAS NK COM PD1- IL2v[0287] As shown in Figure 2, pD1-IL2v and the corresponding IgG PD1 bind similarly to CD4 and CD8 T cells. An analogous immunocytokine: CEA-IL2v, targeting CEA on tumor cells instead of PD1, served as a non-targeting control to compare with the isolated effect of IL2v-based immunocytokines that do not target PD1. EXAMPLE 2B. T CELL AND NK CELL ACTIVATION AND PROLIFERATION WITH PD1-IL2v
[0288] As PBMCs recentemente isoladas de dadores humanos saudáveis foram incubadas durante a noite e depois marcadas com CFSE (Éster N-succinimidílico de diacetato de 5 (6) -Carboxifluoresceína, # 21888, Sigma- Aldrich). Em resumo, 30 milhões de PBMCs foram lavados uma vez com PBS. Em paralelo, a solução mãe de CSFE (2 mM em DMSO) foi diluída 1:20 em PBS. As PBMC foram ressuspensas em 30 ml de PBS pré-aquecido, 30 μl da solução CFSE foi adicionado e as células foram misturadas imediatamente. Para uma marcação ótima, as células foram incubadas durante 15 min a 37. Em seguida, adicionou-se 10 ml de meio pré-aquecido (RPMI1640, 10% de FCS, 1% de Glutamina) para parar a reação de marcação. As células foram centrifugadas durante 10 min a 400 x g e ressuspensas em 20 ml de meio fresco e incubadas durante mais 30 min a 37. Finalmente, as células foram lavadas uma vez com meio e ressuspensas em meio fresco a 1 milhão de células por ml. As PBMC marcadas foram semeadas em uma placa de fundo redondo de 96 poços (200.000 células por poço) e tratadas durante 5 dias com as moléculas indicadas (PD1-IL2v, CEA-IL2v, pD1 IgG e a combinação de PD1 IgG mais CEA- IL2v). Após a incubação, as células foram lavadas uma vez com tampão FACS e coradas com 20 μl de uma mistura de CD3 APC/ Cy7 (clone UCHT1, # 300426, BioLegend), CD56 da APC(HCH56 clone, 3 # 18310, BioLegend), CD4 PE (clone RPA-T4, # 300508, BioLegend) e CD25 BV421 (clone M-A251, BioLegend) em tampão FACS durante 30 min a 4 °C. Posteriormente, as PBMCs foram lavadas duas vezes com tampão FACS antes de serem fixadas com PFA a 1% em tampão FACS e medindo a fluorescência com um BD Fortessa. A proliferação foi determinada medindo a diluição da CFSE de células T CD8 (CD3+ CD4-), células T CD4 (CD3+ CD4+) e células NK (CD3-CD56+).[0288] Freshly isolated PBMCs from healthy human donors were incubated overnight and then labeled with CFSE (5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester, #21888, Sigma-Aldrich). Briefly, 30 million PBMCs were washed once with PBS. In parallel, CSFE stock solution (2 mM in DMSO) was diluted 1:20 in PBS. PBMCs were resuspended in 30 ml of pre-warmed PBS, 30 μl of CFSE solution was added and the cells were mixed immediately. For optimal labeling, cells were incubated for 15 min at 37 °C. Then, 10 ml of pre-warmed medium (RPMI1640, 10% FCS, 1% Glutamine) was added to stop the labeling reaction. Cells were centrifuged for 10 min at 400 × g and resuspended in 20 ml of fresh medium and incubated for an additional 30 min at 37 °C. Finally, cells were washed once with medium and resuspended in fresh medium at 1 million cells per ml. Labeled PBMC were seeded in a 96-well round-bottom plate (200,000 cells per well) and treated for 5 days with the indicated molecules (PD1-IL2v, CEA-IL2v, pD1 IgG, and the combination of PD1 IgG plus CEA-IL2v). After incubation, cells were washed once with FACS buffer and stained with 20 μl of a mixture of APC CD3/Cy7 (clone UCHT1, #300426, BioLegend), APC CD56 (HCH56 clone, 3 #18310, BioLegend), PE CD4 (clone RPA-T4, #300508, BioLegend), and BV421 CD25 (clone M-A251, BioLegend) in FACS buffer for 30 min at 4 °C. Subsequently, PBMCs were washed twice with FACS buffer before being fixed with 1% PFA in FACS buffer and measuring fluorescence with a BD Fortessa. Proliferation was determined by measuring CFSE dilution of CD8 T cells (CD3+ CD4-), CD4 T cells (CD3+ CD4+), and NK cells (CD3-CD56+).
[0289] Como mostrado na Figura 3, a atividade de PD1-IL2v é comparável à atividade de CEA-IL2v e CEA-IL2v em combinação com PD1 IgG. PD1 IgG sozinho não tem atividade nesse cenário.[0289] As shown in Figure 3, the activity of PD1-IL2v is comparable to the activity of CEA-IL2v and CEA-IL2v in combination with PD1 IgG. PD1 IgG alone has no activity in this setting.
[0290] A Figura 4 mostra que PD1-IL2v induz ativação (medida por regulação positiva de CD25) de células NK, células T CD8 e células T CD4. A ativação induzida por CEA-IL2v e a combinação de CEA-IL2v com PD1 IgG é semelhante. O PD1 IgG sozinho não induz a ativação nesse cenário.EXEMPLO 2C ATIVAÇÃO E PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS T CD8 E CD4 PRÉ-ATIVADAS COM PD1-IL2V[0290] Figure 4 shows that PD1-IL2v induces activation (measured by CD25 upregulation) of NK cells, CD8 T cells, and CD4 T cells. Activation induced by CEA-IL2v and the combination of CEA-IL2v with PD1 IgG is similar. PD1 IgG alone does not induce activation in this setting. EXAMPLE 2C ACTIVATION AND PROLIFERATION OF CD8 AND CD4 T CELLS PREACTIVATED WITH PD1-IL2V
[0291] PBMC isoladas de dadores humanos saudáveis foram marcadas com CFSE (Éster N-succinimidílico de diacetato de 5 (6) -Carboxifluoresceína, # 21888, Sigma-Aldrich). Em resumo, 30 milhões de PBMCs foram lavados uma vez com PBS. Em paralelo, a solução mãe de CSFE (2 mM em DMSO) foi diluída 1:20 em PBS. As PBMC foram ressuspensas em 30 ml de PBS pré-aquecido, 30 μl da solução CFSE foi adicionado e as células foram misturadas imediatamente. Para uma marcação ótima, as células foram incubadas durante 15 min a 37. Em seguida, adicionou-se 10 ml de meio pré- aquecido (RPMI1640, 10% de FCS, 1% de Glutamina) para parar a reação de marcação. As células foram centrifugadas durante 10 min a 400 x g e ressuspensas em 20 ml de meio fresco e incubadas durante mais 30 min a 37. Finalmente, as células foram lavadas uma vez com meio e ressuspensas em meio fresco a 1 milhão de células por ml. As PBMC CFSE marcada foram pré- ativados durante a noite com uma μg/ ml de PHA (# L8902, Sigma-Aldrich) para induzir a regulação positiva da PD-1 em células T. No dia seguinte, os PBMC pré-ativados foram coletados e contados. As PBMCs foram então semeadas em uma placa de 96 poços de fundo redondo (200.000 células por poço) e tratadas durante 4 dias com as moléculas indicadas (PD1-IL2v, CEA-IL2v, pD1 IgG e a combinação de PD1 IgG mais CEA- IL2v). Após a incubação, as células foram lavadas uma vez com tampão FACS e coradas com 20 μl de uma mistura de APC CD3/ Cy7 (clone UCHT1, # 300426, BioLegend), CD8 APC(clone SK1, BioLegend) e CD25 BV421 (clone M- A251, BioLegend) em tampão FACS durante 30 min a 4 °C. Posteriormente, as PBMCs foram lavadas duas vezes com tampão FACS antes de serem fixadas com PFA a 1% em tampão FACS e medindo a fluorescência com um BD Fortessa. A proliferação foi determinada medindo a diluição da CFSE de células T CD8 (CD3+ CD8+) e células T CD4 (CD3+ CD8-).[0291] PBMC isolated from healthy human donors were labeled with CFSE (5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester, #21888, Sigma-Aldrich). Briefly, 30 million PBMCs were washed once with PBS. In parallel, CSFE stock solution (2 mM in DMSO) was diluted 1:20 in PBS. PBMCs were resuspended in 30 ml of pre-warmed PBS, 30 μl of CFSE solution was added and the cells were mixed immediately. For optimal labeling, cells were incubated for 15 min at 37 °C. Then, 10 ml of pre-warmed medium (RPMI1640, 10% FCS, 1% Glutamine) was added to stop the labeling reaction. Cells were centrifuged for 10 min at 400 × g and resuspended in 20 ml fresh medium and incubated for an additional 30 min at 37 °C. Finally, cells were washed once with medium and resuspended in fresh medium at 1 million cells per ml. CFSE-labeled PBMCs were preactivated overnight with 1 μg/ml PHA (#L8902, Sigma-Aldrich) to induce PD-1 upregulation on T cells. The next day, preactivated PBMCs were collected and counted. PBMCs were then seeded in a 96-well round-bottom plate (200,000 cells per well) and treated for 4 days with the indicated molecules (PD1-IL2v, CEA-IL2v, pD1 IgG, and the combination of PD1 IgG plus CEA-IL2v). After incubation, cells were washed once with FACS buffer and stained with 20 μl of a mixture of CD3/Cy7 APC (clone UCHT1, #300426, BioLegend), CD8 APC (clone SK1, BioLegend), and CD25 BV421 (clone M-A251, BioLegend) in FACS buffer for 30 min at 4 °C. Subsequently, PBMCs were washed twice with FACS buffer before being fixed with 1% PFA in FACS buffer and measuring fluorescence with a BD Fortessa. Proliferation was determined by measuring CFSE dilution of CD8 T cells (CD3+ CD8+) and CD4 T cells (CD3+ CD8−).
[0292] A Figura 5 mostra que PD1-IL2v induz a proliferação de células T CD8 e CD4 ativadas por PHA que expressam PD-1. A atividade é comparável à CEA-IL2v e à combinação de CEA-IL2v com PD1 IgG. PD1 IgG sozinho não tem atividade nesse cenário. Nenhum efeito adicional de bloqueio de PD-1 pode ser observado neste cenário, provavelmente devido à ausência de células tumorais positivas para PD-L1.[0292] Figure 5 shows that PD1-IL2v induces the proliferation of PHA-activated CD8 and CD4 T cells expressing PD-1. The activity is comparable to CEA-IL2v and the combination of CEA-IL2v with PD1 IgG. PD1 IgG alone has no activity in this setting. No additional effect of PD-1 blockade can be observed in this setting, likely due to the absence of PD-L1-positive tumor cells.
[0293] Como mostrado na Figura 6, pD1-IL2v induz a ativação de células T CD8 e CD4 ativadas por PHA que expressam PD-1 (utilizando a expressão de CD25 como marcador de ativação). CEA-IL2v e a combinação de CEA-IL2v com PD1 IgG induz uma ativação comparável de células T. PD1 IgG sozinho não tem atividade nesse cenário. Nenhum efeito adicional de bloqueio de PD-1 pode ser observado neste cenário, provavelmente devido à ausência de células tumorais positivas para PD-L1.EXEMPLO 2D PROLIFERAÇÃO DE NK92 COM PD1-IL2V E PD-L1-IL2V[0293] As shown in Figure 6, pD1-IL2v induces activation of PHA-activated CD8 and CD4 T cells expressing PD-1 (using CD25 expression as an activation marker). CEA-IL2v and the combination of CEA-IL2v with PD1 IgG induce comparable T cell activation. PD1 IgG alone has no activity in this setting. No additional PD-1 blockade effect can be observed in this setting, likely due to the absence of PD-L1-positive tumor cells. EXAMPLE 2D NK92 PROLIFERATION WITH PD1-IL2V AND PD-L1-IL2V
[0294] As células NK92 foram colhidas, contadas e avaliadas quanto à viabilidade. As células foram lavadas três vezes com PBS para remover a IL-2 residual e foram ressuspensas em meio (RPMI1640, 10% de FCS, 1% de Glutamina) sem IL-2. As células NK92 lavadas foram incubadas durante duas horas em incubadora de células (privação de IL-2). Após a privação, as células foram ressuspensas em meio fresco sem IL2- a 200.000 células por ml e 50 μl da suspensão celular foram transferidos para uma placa de fundo plano de 96 poços tratados com cultura celular e suplementados com 50 μl dos anticorpos diluídos (em meio sem IL-2), proleucina (concentração final de 1,5/ mL) ou meio (poços de controle) para atingir um volume final de 100 por poço. A placa foi incubada durante 2 dias na incubadora. Após 2 dias os reagentes CellTiter-Glo (Promega) e a placa de cultura celular foram equilibrados à temperatura ambiente. A solução CellTiter-Glo foi preparada como descrito nas instruções do fabricante e 100 μl da solução foram adicionados a cada poço. Após 10 min de incubação, os agregados restantes foram ressuspensos por pipetagem e 150 μl da mistura foram transferidos para uma placa de fundo plano branco. A luminescência foi medida com o leitor multimodo Tecan Spark 10M.[0294] NK92 cells were harvested, counted and assessed for viability. Cells were washed three times with PBS to remove residual IL-2 and were resuspended in medium (RPMI1640, 10% FCS, 1% Glutamine) without IL-2. Washed NK92 cells were incubated for two hours in a cell incubator (IL-2 deprivation). After deprivation, cells were resuspended in fresh medium without IL2- at 200,000 cells per ml and 50 μl of the cell suspension was transferred to a cell culture-treated 96-well flat-bottom plate and supplemented with 50 μl of the diluted antibodies (in medium without IL-2), proleukin (final concentration of 1.5/ml) or medium (control wells) to reach a final volume of 100 µl per well. The plate was incubated for 2 days in the incubator. After 2 days, the CellTiter-Glo reagents (Promega) and the cell culture plate were equilibrated to room temperature. The CellTiter-Glo solution was prepared as described in the manufacturer's instructions, and 100 μl of the solution was added to each well. After 10 min of incubation, the remaining pellets were resuspended by pipetting, and 150 μl of the mixture was transferred to a white flat-bottom plate. Luminescence was measured with the Tecan Spark 10M multimode reader.
[0295] Figura 7 A mostra que a PD-L1-IL2v induz a proliferação de células NK92 de forma tão eficiente como o CEA-IL2v. A Figura 7 B mostra que a PD-L1-IL2v e PD1-IL2v têm a mesma atividade na indução da proliferação de células NK92. As células NK92 são PD1 negativas.EXEMPLO 2E LIGAÇÃO DE PD-L1-IL2V A CÉLULAS CTLL2[0295] Figure 7 A shows that PD-L1-IL2v induces NK92 cell proliferation as efficiently as CEA-IL2v. Figure 7 B shows that PD-L1-IL2v and PD1-IL2v have the same activity in inducing NK92 cell proliferation. NK92 cells are PD1 negative. EXAMPLE 2E BINDING OF PD-L1-IL2V TO CTLL2 CELLS
[0296] A linha de células T murinas CTLL2 expressa PD-L1. Estas células foram utilizadas para testar a ligação de PD-L1-IL2v (substituto murino) a PD-L1. As células foram colhidas, a viabilidade foi verificada e foram transferidas para uma placa de fundo redondo de 96 poços (200.000 células por poço). As células foram lavadas com tampão FACS (PBS, 2% de FBS, 5 mM de EDTA, 0,025% de NaN 3) e coradas com 40 μl das moléculas indicadas em tampão de SCAF, durante 30 min a 4 °C. As células foram lavadas duas vezes com tampão FACS para remover moléculas não ligadas. Em seguida, 40 μl de anticorpo secundário diluído APC anti-Fc de camundongo específico (# 115-136- 071, Jackson ImmunoResearch) foi adicionada às células. Após 30 min de incubação a 4 °C, as células foram lavadas duas vezes com tampão FACS. As células foram analisadas com um BD LSR Fortessa.[0296] The murine T cell line CTLL2 expresses PD-L1. These cells were used to test the binding of PD-L1-IL2v (murine surrogate) to PD-L1. Cells were harvested, viability was checked, and transferred to a 96-well round bottom plate (200,000 cells per well). Cells were washed with FACS buffer (PBS, 2% FBS, 5 mM EDTA, 0.025% NaN 3 ) and stained with 40 μL of the indicated molecules in FACS buffer for 30 min at 4 °C. Cells were washed twice with FACS buffer to remove unbound molecules. Then, 40 μL of diluted APC-specific anti-mouse Fc secondary antibody (#115-136-071, Jackson ImmunoResearch) was added to the cells. After 30 min incubation at 4 °C, cells were washed twice with FACS buffer. Cells were analyzed with a BD LSR Fortessa.
[0297] A Figura 8 mostra que a PD-L1-IL2v se liga tão bem quanto as células muIgG1 PD-L1 correspondentes às células CTLL2. Essas células são PD1 negativas.EXEMPLO 2F. PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS CTLL2 COM PD1-IL2V E PD-L1-IL2V[0297] Figure 8 shows that PD-L1-IL2v binds as well as the corresponding muIgG1 PD-L1 cells to CTLL2 cells. These cells are PD1 negative. EXAMPLE 2F. PROLIFERATION OF CTLL2 CELLS WITH PD1-IL2V AND PD-L1-IL2V
[0298] Células CTLL2 foram colhidas, contadas e avaliadas quanto à viabilidade. As células foram lavadas três vezes com PBS (para remover a IL- 2 residual), ressuspensas em meio (RPMI1640, 10% de FCS, 1% de Glutamina) sem IL-2 e incubadas durante duas horas em incubadora de células (IL-2 inanição). Após a privação, 200'000 células CTLL2 por ml foram ressuspensas em meio fresco sem IL2 e 50 μl de suspensão celular transferida em uma placa de fundo plano de 96 poços tratada com cultura de células. 50 μl de substituto murino PD1-IL2v, substituto murino PD-L1-IL2v, substituto CEA-IL2v murino, proleucina diluído (1,5 μg/ ml concentração final) ou meio sozinho (todos usando meio isento de IL-2) foram adicionados a poços até um volume final de 100 μl/ poço. As amostras foram incubadas durante 3 dias em incubadora de células e a proliferação foi avaliada utilizando CellTiter-Glo de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, 100 de reagentes foram adicionados a cada poço e incubados durante 10 min. Os agregados remanescentes foram ressuspensos por pipetagem e 150 de mistura foram transferidos para uma placa de fundo plano branco. A luminescência foi medida com o leitor multimodo Tecan Spark 10M.[0298] CTLL2 cells were harvested, counted and assessed for viability. Cells were washed three times with PBS (to remove residual IL-2), resuspended in medium (RPMI1640, 10% FCS, 1% Glutamine) without IL-2 and incubated for two hours in a cell incubator (IL-2 starvation). After starvation, 200'000 CTLL2 cells per ml were resuspended in fresh medium without IL2 and 50 μl of cell suspension transferred into a cell culture treated 96-well flat bottom plate. 50 μl of murine PD1-IL2v surrogate, murine PD-L1-IL2v surrogate, murine CEA-IL2v surrogate, diluted proleukin (1.5 μg/ml final concentration) or medium alone (all using IL-2-free medium) were added to wells to a final volume of 100 μl/well. Samples were incubated for 3 days in a cell incubator and proliferation was assessed using CellTiter-Glo according to the manufacturer's instructions. Briefly, 100 μl of reagents were added to each well and incubated for 10 min. Remaining pellets were resuspended by pipetting and 150 μl of mixture was transferred to a white flat-bottom plate. Luminescence was measured with the Tecan Spark 10M multimode reader.
[0299] Figura 9 Um mostra que o PD-L1-IL2v induz a proliferação de células CTLL2. A atividade parece ser maior em comparação ao CEA-IL2v, provavelmente devido à expressão de PD-L1 nas células CTLL2. A Figura 9 B mostra novamente que PD1-IL2v induz a proliferação de células CTLL2. A atividade parece ser menor em comparação à PD-L1-IL2v, provavelmente porque essas células expressam apenas PD-L1, mas não PD1.EXEMPLO 3EFICÁCIA IN VIVO DE PD1 -IL2V E PD-L1 -IL2V EM MODELO DE TUMOR DECAMUNDONGO SINGENEICO[0299] Figure 9 A shows that PD-L1-IL2v induces proliferation of CTLL2 cells. The activity appears to be higher compared to CEA-IL2v, probably due to the expression of PD-L1 on CTLL2 cells. Figure 9 B again shows that PD1-IL2v induces proliferation of CTLL2 cells. The activity appears to be lower compared to PD-L1-IL2v, probably because these cells express only PD-L1 but not PD1. EXAMPLE 3 IN VIVO EFFICACY OF PD1-IL2V AND PD-L1-IL2V IN A SYNGENEIC MICE TUMOR MODEL
[0300] Os PD1-IL2v e PD-L1 -IL2v imuno conjugados (substitutos de murino) foram testados isoladamente e em comparação com os correspondentes anticorpos PD1 e PD-L1 para a sua eficácia anti-tumoral no modelo singeneico Panc02-Fluc.[0300] PD1-IL2v and PD-L1-IL2v immunoconjugates (murine surrogates) were tested alone and in comparison to the corresponding PD1 and PD-L1 antibodies for their anti-tumor efficacy in the Panc02-Fluc syngeneic model.
[0301] As células Panc02-H7 (carcinoma pancreático de camundongo) foram originalmente obtidas do centro de câncer MD Anderson (Texas, EUA) e após expansão depositada no banco de células interno Roche- Glycart. A linha celular Panc02-H7-Fluc foi produzida internamente por técnicas de transfecção de cálcio e subclonagem. O Panc02-H7-Fluc foi cultivado em meio RPMI contendo 10% de FCS (Sigma), 500/ ml de higromicina e 1% de Glutamax. As células foram cultivadas a 37 °C em uma atmosfera saturada de água com 5% de CO 2. A passagem 23 foi usada para transplante. A viabilidade celular foi de 90,4%. 1 x 105 células por animal foram injetadas no pâncreas de camundongos pretos 6, utilizando uma seringa de tuberculina de 0,3 ml (BD Biosciences, Alemanha). Para isso, uma pequena incisão foi feita no local abdominal esquerdo de camundongos anestesiados. A parede peritoneal foi aberta e o pâncreas cuidadosamente isolado com fórceps. Dez microlitros (1 x 105 células Panc02-H7-Fluc em meio RPMI) suspensão de células foram injetados na cauda do pâncreas. A parede peritoneal e as feridas da pele foram fechadas usando suturas 5/0 resolvíveis.[0301] Panc02-H7 (mouse pancreatic carcinoma) cells were originally obtained from MD Anderson Cancer Center (Texas, USA) and after expansion deposited in the Roche-Glycart in-house cell bank. The Panc02-H7-Fluc cell line was produced in-house by calcium transfection and subcloning techniques. Panc02-H7-Fluc was cultured in RPMI medium containing 10% FCS (Sigma), 500 µg/ml hygromycin and 1% Glutamax. Cells were grown at 37 °C in a water-saturated atmosphere with 5% CO 2 . Passage 23 was used for transplantation. Cell viability was 90.4%. 1 x 10 5 cells per animal were injected into the pancreas of black 6 mice using a 0.3 ml tuberculin syringe (BD Biosciences, Germany). For this purpose, a small incision was made in the left abdominal site of anesthetized mice. The peritoneal wall was opened and the pancreas carefully isolated with forceps. Ten microliters (1 × 105 Panc02-H7-Fluc cells in RPMI medium) cell suspension was injected into the tail of the pancreas. The peritoneal wall and skin wounds were closed using 5/0 resolvable sutures.
[0302] Camundongos fêmeas Pretas 6 com idades entre 10-12 semanas no início da experiência (Charles Rivers, Lyon, França) foram mantidos em condições isentas de patogênicos específicos com ciclos diários de 12 h de luz/ 12 h de escuridão de acordo com as diretrizes autorizadas (GV- Solas; Felasa; TierschG). O protocolo do estudo experimental foi revisado e aprovado pelo governo local (ZH193/ 2014). Após a chegada, os animais foram mantidos por uma semana para se acostumarem ao novo ambiente e para observação. O monitoramento contínuo da saúde foi realizado regularmente.[0302] Female Black 6 mice aged 10–12 weeks at the start of the experiment (Charles Rivers, Lyon, France) were kept under specific pathogen-free conditions with daily 12 h light/12 h dark cycles according to authorized guidelines (GV-Solas; Felasa; TierschG). The experimental study protocol was reviewed and approved by the local government (ZH193/2014). Upon arrival, the animals were kept for one week to acclimatize to the new environment and for observation. Continuous health monitoring was performed regularly.
[0303] Os camundongos foram injetados intra-pancreaticamente no dia 0 de estudo com 1 x 105 células Panc02-Fluc, aleatorizados e pesados. Uma semana após a injeção de células tumorais injetaram-se camundongos iv com anticorpos PD1 -IL2v, PD-L1 -IL2v ou PD1 e PD-L1, uma vez por semana durante quatro semanas.[0303] Mice were injected intra-pancreatically on study day 0 with 1 x 105 Panc02-Fluc cells, randomized and weighed. One week after tumor cell injection, mice were injected iv with PD1-IL2v, PD-L1-IL2v, or PD1 and PD-L1 antibodies once a week for four weeks.
[0304] Todos os camundongos foram injetados iv com 200 da solução apropriada. Os camundongos no grupo veículo foram injetados com tampão de histidina e os grupos de tratamento com os substitutos murinos de conjugados de PD1-IL2v e PD-L1 -IL2v ou os anticorpos correspondentes de PD1 e PD-L1, diluídos com tampão de histidina como apropriado. A quantidade de anticorpos injetados por camundongo em mg/ kg foi a seguinte: 1,5 mg/ kg de anticorpos PD1-IL2v e PD-L1 -IL2v, 10 mg/ kg de PD1 e PD-L1.[0304] All mice were injected iv with 200 µl of the appropriate solution. Mice in the vehicle group were injected with histidine buffer and the treatment groups with the murine surrogates of PD1-IL2v and PD-L1-IL2v conjugates or the corresponding PD1 and PD-L1 antibodies, diluted with histidine buffer as appropriate. The amount of antibodies injected per mouse in mg/kg was as follows: 1.5 mg/kg PD1-IL2v and PD-L1-IL2v antibodies, 10 mg/kg PD1 and PD-L1.
[0305] A Figura 10 e a Tabela 1 mostram que a PD1-IL2v mediou eficácia significativamente superior em termos de sobrevivência mediana e global melhorada em comparação com todos os outros agentes únicos testados, notavelmente incluindo PD-L1-IL2v.[0305] Figure 10 and Table 1 show that PD1-IL2v mediated significantly superior efficacy in terms of improved median and overall survival compared to all other single agents tested, notably including PD-L1-IL2v.
[0306] Tabela 1. Sobrevida mediana e global de camundongosBlack 6 tratados com anticorpo PD1-IL2v, PD-L1 -IL2v, pD1 ou PD-L1, no modelo de tumor sinérgico Panc02-Fluc.[0306] Table 1. Median and overall survival of Black 6 mice treated with PD1-IL2v, PD-L1-IL2v, pD1 or PD-L1 antibody, in the Panc02-Fluc synergistic tumor model.
[0307] Para imagens de Bioluminescência por IVIS® SPECTRUM,os camundongos foram injetados intraperitonealmente com 150 mg/ kg de D- Luciferina 10 minutos antes da aquisição da imagem de bioluminescência (BLI) e posteriormente anestesiados com 4% de isoflurano. Posteriormente, os camundongos foram transferidos para uma câmara de isolamento, que é posicionada no espectro IVIS®. As aquisições de BLI in vivo foram realizadas através da aquisição do sinal de luminescência durante 10-50 segundos. Os dados foram armazenados como radiância (fótons)/ sec/ cm2/ sr. A análise de dados BLI in vivo foi realizada com o software Living Image® 4.4 e representado por uma curva de inibição do tumor.[0307] For Bioluminescence imaging by IVIS® SPECTRUM, mice were injected intraperitoneally with 150 mg/kg D-Luciferin 10 minutes prior to bioluminescence imaging (BLI) acquisition and subsequently anesthetized with 4% isoflurane. Subsequently, mice were transferred to an isolation chamber, which is positioned in the IVIS® SPECTRUM. In vivo BLI acquisitions were performed by acquiring the luminescence signal for 10-50 seconds. Data were stored as radiance (photons)/sec/cm2/sr. In vivo BLI data analysis was performed with Living Image® 4.4 software and represented by a tumor inhibition curve.
[0308] A Figura 11 mostra a eficácia superior de PD1-IL2v em termos de diminuição do sinal de bioluminescência (fótons/ segundo) em comparação com todos os outros grupos, notavelmente incluindo PD-L1-IL2v. Logo após a primeira administração da terapia no dia 7, uma redução no sinal de bioluminescência Panc02-Fluc foi detectada pelo IVIS® Spectrum em vários grupos tratados, mas somente PD1-IL2v mostrou um desaparecimento completo do sinal BLI na maioria dos camundongos que durou o duração total da experiência, indicativa de uma resposta completa em 7 de 8 camundongos.EXEMPLO 4EFEITO DA LIBERAÇÃO DE IL-2V PARA TCLS ESPECÍFICOS DE VÍRUS EXAURIDOS ATRAVÉS DO BLOQUEIO DE PD-1 OU PD-L1[0308] Figure 11 shows the superior efficacy of PD1-IL2v in terms of decrease in bioluminescence signal (photons/second) compared to all other groups, notably including PD-L1-IL2v. Soon after the first administration of therapy on day 7, a reduction in the Panc02-Fluc bioluminescence signal was detected by IVIS® Spectrum in several treated groups, but only PD1-IL2v showed a complete disappearance of the BLI signal in the majority of mice that lasted for the entire duration of the experiment, indicative of a complete response in 7 out of 8 mice. EXAMPLE 4 EFFECT OF IL-2V RELEASE FOR VIRUS-SPECIFIC TCLS EXHAUSTED THROUGH PD-1 OR PD-L1 BLOCKADE
[0309] A expressão de PD-1 foi descrita pela primeira vez em células T específicas de vírus exauridas como consequência da exposição crônica a antígenos virais e tem sido associada à incapacidade de células T de montar uma resposta anti-viral eficaz. As células T CD4 específicas de vírus capazes de secretar IL-2 e IFN-Y conferem proteção contra a re-ativação viral em infecções crônicas. De fato, a assinatura polifuncional das células T CD4 tem sido associada ao controle viral em indivíduos saudáveis infectados por Citomegalovírus (CMV), vírus Epst ein-Barr (EBV) e vírus Herpes Simplex (HSV), bem como naqueles indivíduos infectados com humanos. Vírus da imunodeficiência (HIV), que permanece livre de sintomas por vários anos.[0309] PD-1 expression was first described on virus-specific T cells exhausted as a consequence of chronic exposure to viral antigens and has been associated with the inability of T cells to mount an effective anti-viral response. Virus-specific CD4 T cells capable of secreting IL-2 and IFN-Y confer protection against viral reactivation in chronic infections. Indeed, the polyfunctional CD4 T cell signature has been associated with viral control in healthy individuals infected with Cytomegalovirus (CMV), Epst ein-Barr virus (EBV) and Herpes Simplex virus (HSV), as well as in those individuals infected with Human Immunodeficiency Virus (HIV) who remain symptom-free for several years.
[0310] No contexto de infecções virais crônicas, portanto, desenvolvemos um ensaio in vitro para avaliar o efeito do direcionamento de PD- 1 e PD-L1 para fornecer uma versão mutada de IL-2 (IL-2v) para células T específicas de antígeno disfuncionais. Para evitar restrições sobre a quantidade de doadores adequados para o nosso ensaio, optamos por uma proteína viral imunogênica do CMV (pp65) como antígeno de re-chamada para células T, dado que cerca de 80% da população é sero positiva para CMV. Assim, estimulamos células mononucleares de sangue periférico de dadores humanos saudáveis (PBMCs) com CMV-pp65 durante algumas horas antes de adicionarmos as nossas construções à concentração de 10 μg/ ml. 43 horas depois, bloqueamos o transporte de proteínas do Golgi adicionando o Plugue de Golgi (Brefeldina A) e Golgi Stop (Monensina) e incubamos as células a 37 °C por mais 5 horas. As células foram então lavadas, coradas na superfície com anticorpos anti-CD3, CD4, CD8, CD62L e CD45RO antes de serem fixadas/ permeabilizadas com Fix/ Perm Buffer (BD Bioscience). Por fim, realizamos coloração intracelular para IL- 2, IFN-Y e Ki67 (ambos da eBioscience).[0310] In the context of chronic viral infections, we therefore developed an in vitro assay to evaluate the effect of targeting PD-1 and PD-L1 to deliver a mutated version of IL-2 (IL-2v) to dysfunctional antigen-specific T cells. To avoid constraints on the number of suitable donors for our assay, we chose an immunogenic viral protein from CMV (pp65) as the T-cell recall antigen, given that approximately 80% of the population is seropositive for CMV. We therefore stimulated healthy human donor peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) with CMV-pp65 for a few hours before adding our constructs at a concentration of 10 μg/ml. 43 hours later, we blocked Golgi protein transport by adding Golgi Plug (Brefeldin A) and Golgi Stop (Monensin) and incubated the cells at 37°C for a further 5 hours. Cells were then washed, surface stained with anti-CD3, CD4, CD8, CD62L and CD45RO antibodies before being fixed/permeabilized with Fix/Perm Buffer (BD Bioscience). Finally, we performed intracellular staining for IL-2, IFN-Y and Ki67 (both from eBioscience).
[0311] Observamos que tanto a PD 1-IL2v quanto a PD-L1-IL2v, assim como a combinação dos correspondentes anticorpos IgG com IL-2v, aumentaram, em níveis comparáveis, as frequências de polifuncionais (Figura 12 B) e IL-2 e IFN-Y monofuncional (Figura 12 A e 12 C, respectivamente) Célula T CD4, proporcionando um efeito melhorado em comparação com o bloqueio anti-PD-1 e anti-PD-L1, respectivamente. As populações expandidas no polifuncional (Figura 13 B) e células T CD4 monofuncionais IFN-Y (Figura 13 C e 13 D) mostram um efetor da memória (CD45RO+ CD62L-) e perfil efetora terminalmente diferenciadas (CD45RO - CD62L-). Por outro lado, as células IL- 2-monofuncionais T CD4 induzida por PD-L1 antagonismo, e ainda mais expandidas por co-entrega de IL-2v, exibir uma assinatura ingênuos (CD62L+ CD45RO -) (Figura 13 A).[0311] We observed that both PD 1-IL2v and PD-L1-IL2v, as well as the combination of the corresponding IgG antibodies with IL-2v, increased, to comparable levels, the frequencies of polyfunctional (Figure 12 B) and monofunctional IL-2 and IFN-Y (Figure 12 A and 12 C, respectively) CD4 T cells, providing an improved effect compared to anti-PD-1 and anti-PD-L1 blockade, respectively. The expanded populations of polyfunctional (Figure 13 B) and monofunctional IFN-Y CD4 T cells (Figure 13 C and 13 D) show a memory effector (CD45RO+ CD62L-) and terminally differentiated effector (CD45RO- CD62L-) profile. Conversely, IL-2-monofunctional CD4 T cells induced by PD-L1 antagonism, and further expanded by co-delivery of IL-2v, display a naïve signature (CD62L+ CD45RO − ) (Figure 13 A).
[0312] Podemos concluir que a administração de IL-2v às células T CD4 específicas para CMV, através da proteína de fusão PD1-IL-2v, resultou na expansão de uma população protetora específica para vírus de vida longa, caracterizada pela capacidade de co-secretar IL-2v e IFN -Y.EXEMPLO 5EXEMPLO 5A. LIGAÇÃO PREFERENCIAL DE PD1-IL2V A CÉLULAS T CONVENCIONAIS ATIVADAS SOBRE CÉLULAS T REGULADORAS ATIVADAS[0312] We can conclude that administration of IL-2v to CMV-specific CD4 T cells via the PD1-IL-2v fusion protein resulted in the expansion of a long-lived virus-specific protective population characterized by the ability to co-secrete IL-2v and IFN-Y.EXAMPLE 5EXAMPLE 5A. PREFERENTIAL BINDING OF PD1-IL2V TO ACTIVATED CONVENTIONAL T CELLS OVER ACTIVATED REGULATORY T CELLS
[0313] As propriedades de ligação de PD1-IL2v a células T convencionais e reguladas ativadas foram avaliadas em um ensaio de ligação competitiva. Células T reguladoras CD4+ CD25+ CD127dim (Treg) foram isoladas com o kit de isolamento de células T reguladoras de dois passos (Miltenyi, # 130- 094-775). Paralelamente, o CD4+ CD25- células T convencionais (T conv) foram isoladas recolhendo a fração negativa de uma seleção positiva para CD25 (Miltenyi, # 130-092-983) seguida por um enriquecimento de CD4+ (Miltenyi, # 130-045- 101). As Tconv foram marcadas com CFSE (eBioscience, # 65-0850- 84) e as Treg foram marcadas com Cell Trace Violet (ThermoFisher scientific, C34557) para rastrear a proliferação de ambas as populações. Tconv e Teg foram semeados em conjunto em uma placa de cultura que foram revestidos durante a noite a 4 com 1/ mL de CD3 (clone OKT3, # 317315, BioLegend). O CD28 foi adicionado em solução a uma concentração de 1 μg/ ml de CD28 (clone CD28.2, # 3 02923, BioLegend). Após 5 dias de estimulação foi realizado um ensaio de ligação com PD1 (0376) e PD1-IL2v (0590), ambos marcados internamente com AF647.[0313] The binding properties of PD1-IL2v to activated conventional and regulated T cells were assessed in a competitive binding assay. CD4+CD25+CD127dim regulatory T cells (Treg) were isolated with the two-step regulatory T cell isolation kit (Miltenyi, #130-094-775). In parallel, CD4+CD25- conventional T cells (T conv) were isolated by collecting the negative fraction from a CD25-positive selection (Miltenyi, #130-092-983) followed by a CD4+ enrichment (Miltenyi, #130-045-101). Tconv were labeled with CFSE (eBioscience, #65-0850-84) and Treg were labeled with Cell Trace Violet (ThermoFisher scientific, C34557) to track the proliferation of both populations. Tconv and Treg were seeded together in a culture dish that were coated overnight at 4 °C with 1 µg/mL CD3 (clone OKT3, #317315, BioLegend). CD28 was added in solution at a concentration of 1 µg/mL CD28 (clone CD28.2, #3 02923, BioLegend). After 5 days of stimulation, a binding assay was performed with PD1 (0376) and PD1-IL2v (0590), both labeled internally with AF647.
[0314] O anticorpo biespecífico PD1-IL2v apresenta um perfil de ligação comparável ao PD1 (Figura 14A e 14B). A Figura 14A mostra o Delta da frequência de um determinado anticorpo ligado a Tconv versus T reg dentro da mesma amostra. Cada símbolo representa um doador separado, as linhas horizontais indicam medianas com N = 4. Ambas as moléculas mostram maior capacidade de ligação a Tconv sobre Treg devido a maiores níveis de expressão de PD-1 em t conv do que no Treg (Figura 14B; dados a partir de um dador representativo que mostra a ligação a Tconv (linha preta) e T r por exemplo (cinza)). Assim, o anticorpo biespecífico PD1-IL2v mantém as propriedades de ligação de PD1 apesar de a IL2v estar acoplada ao anticorpo.EXEMPLO 5B. RESGATE DE T CONV FUNÇÃO EFETORA APÓS TRATAMENTO PD1 -IL2V EM TREG ENSAIO DE SUPRESSÃO[0314] The bispecific antibody PD1-IL2v displays a binding profile comparable to PD1 (Figure 14A and 14B). Figure 14A shows the Delta frequency of a given antibody binding to Tconv versus Treg within the same sample. Each symbol represents a separate donor, horizontal lines indicate medians with N = 4. Both molecules show greater binding capacity to Tconv over Treg due to higher levels of PD-1 expression on Tconv than on Treg (Figure 14B; data from a representative donor showing binding to Tconv (black line) and Treg (gray)). Thus, the bispecific antibody PD1-IL2v maintains PD1 binding properties despite IL2v being coupled to the antibody. EXAMPLE 5B. RESCUE OF TCONV EFFECTOR FUNCTION FOLLOWING PD1-IL2V TREATMENT IN TREG SUPPRESSION ASSAY
[0315] Em um próximo passo foi testado, se o PD1-IL2v pode reverter a supressão Treg de Tconv. Portanto, um ensaio de função supressora foi estabelecido, onde Tconv e Treg são cultivadas em conjunto durante 5 dias, com ou sem os anticorpos de bloqueio, na presença de células T CD4 - CD25- a partir de um dador não relacionado para a estimulação aloespecífica. Para este propósito, Tconv e Treg foram isolados e rotulados como descrito acima. A acumulação de citocinas no complexo de Golgi foi aumentada aplicando Inibidores do Transporte de Proteínas (GolgiPlug # 555029, BD e GolgiStop # 554724, BD) durante 5 horas antes da coloração com FACS.[0315] In a next step it was tested, whether PD1-IL2v can reverse Treg suppression of Tconv. Therefore, a suppressor function assay was established, where Tconv and Treg are cultured together for 5 days, with or without blocking antibodies, in the presence of CD4-CD25- T cells from an unrelated donor for allospecific stimulation. For this purpose, Tconv and Treg were isolated and labeled as described above. Cytokine accumulation in the Golgi complex was increased by applying Protein Transport Inhibitors (GolgiPlug #555029, BD and GolgiStop #554724, BD) for 5 hours prior to FACS staining.
[0316] A capacidade do Tconv proliferado para secretar granzima B (GrzB; Figura 15A) e interferon gama (IFNy; Figura 15B) na presença e ausência de Treg foi medido. A supressão Treg foi calculada com a seguinte fórmula:% Citocina supressão = 100 - % de citocina Tconv + Treg ± anticorpo de bloqueio) / (% de citocina Tconv não tratada) * 100) em que % citocina Tconv+ Treg ± anticorpo bloqueador é o nível de citocina secretada por Tconv na presença de anticorpo bloqueador Treg+, % citocina Tconv não tratada é o nível de citocina secretada por Tconv na ausência de Treg. Na Figura 15 A e 15B, um símbolo representa um doador separado, linhas horizontais indicam medianas com N = 5, linhas pontilhadas a 0% não representam supressão por Treg. P foi calculado usando ANOVA de uma via (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001).[0316] The ability of proliferated Tconv to secrete granzyme B (GrzB; Figure 15A) and interferon gamma (IFNγ; Figure 15B) in the presence and absence of Treg was measured. Treg suppression was calculated with the following formula: %Cytokine suppression = 100 - %Tconv+Treg cytokine ± blocking antibody) / (%Tconv untreated cytokine * 100) where %Tconv+Treg cytokine ± blocking antibody is the level of cytokine secreted by Tconv in the presence of Treg+blocking antibody, %Tconv untreated cytokine is the level of cytokine secreted by Tconv in the absence of Treg. In Figure 15A and 15B, a symbol represents a separate donor, horizontal lines indicate medians with N = 5, dotted lines at 0% represent no Treg suppression. P was calculated using one-way ANOVA (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).
[0317] A Figura 15A mostra que o tratamento com o anticorpo PD1 (0376) resulta em uma mediana de 47,7% da supressão da função Tconv, em comparação com uma média de 68,6% de supressão no grupo não tratado (sem significância estatística). Da mesma forma, o bloqueio da interação PD-1/ PD-L1 com o Atezolizumab, Nivolumab e Pembrolizumab mostrou a mesma tendência que para o anticorpo PD1. Curiosamente DP47-IL2v (mediana = -11,3%, p = 0,0011) e PD1-IL2v (mediana = - 43,6%, p <0,0001) resgataram a função efetora Tconv GrzB da supressão de Treg. Além disso, pD1-IL2v foi ainda significativamente (p = 0,0026) mais potente do que o anticorpo PD1 sozinho.[0317] Figure 15A shows that treatment with the PD1 antibody (0376) results in a median of 47.7% suppression of Tconv function, compared to a median of 68.6% suppression in the untreated group (not statistically significant). Similarly, blocking the PD-1/PD-L1 interaction with Atezolizumab, Nivolumab and Pembrolizumab showed the same trend as for the PD1 antibody. Interestingly DP47-IL2v (median = -11.3%, p = 0.0011) and PD1-IL2v (median = - 43.6%, p < 0.0001) rescued the Tconv GrzB effector function from Treg suppression. Furthermore, pD1-IL2v was even significantly (p = 0.0026) more potent than the PD1 antibody alone.
[0318] Paralelamente, a mesma análise foi realizada para a supressão do INFyT conv por Treg (Figura 15B). DP47-IL2v (mediana = 51,77%, p = 0,0251) e PD1-IL2v (mediana = 31,23%, p = <0,0001) resgataram a função efetora Tconv IFNy da supressão de Treg.EXEMPLO 6EFICÁCIA IN VIVO DE IMUNOCONJUGADOS DE PD1 -IL2V NUM MODELO SINGENEICO DE LINHAS CELULARES DE TUMOR DE MURGANHO EM COMPARAÇÃO COM OS ANTICORPOS PD1 E FAP-IL2V COMO AGENTES ÚNICOS E EM COMBINAÇÃO[0318] In parallel, the same analysis was performed for Tconv IFNy suppression by Treg (Figure 15B). DP47-IL2v (median = 51.77%, p = 0.0251) and PD1-IL2v (median = 31.23%, p = <0.0001) rescued the Tconv IFNy effector function from Treg suppression. EXAMPLE 6 IN VIVO EFFICACY OF PD1-IL2V IMMUNOCONJUGATES IN A SYNGENEOUS MODEL OF MUSE TUMOR CELL LINES COMPARED TO PD1 AND FAP-IL2V ANTIBODIES AS SINGLE AGENTS AND IN COMBINATION
[0319] O imunoconjugado substituto murino PD1-IL2v (muPD1-IL2v) foi testado em comparação com uma combinação de substituto de murídeo PD1 e FAP-IL2v murino substituto (muFAP-IL2v) para a sua eficácia antitumoral num modelo singeneico. O modelo singênico utilizado foi o modelo singeneico pancreático Panc02-Fluc.[0319] Murine PD1-IL2v surrogate immunoconjugate (muPD1-IL2v) was tested in comparison to a combination of murine PD1 surrogate and murine FAP-IL2v surrogate (muFAP-IL2v) for its antitumor efficacy in a syngeneic model. The syngeneic model used was the Panc02-Fluc pancreatic syngeneic model.
[0320] O imunoconjugado substituto murino PD1-IL2v foi testado na linha celular transfectante pancreática Panc02-Fluc de murganho injetada intra- pancreaticamente em murganhos Black 6. As células Panc02-H7 (carcinoma pancreático de camundongo) foram originalmente obtidas do centro de câncer MD Anderson (Texas, EUA) e após expansão depositada no banco de células interno Roche-Glycart. A linha celular Panc02-H7-Fluc foi produzida internamente por técnicas de transfecção de cálcio e subclonagem. Panc02-H7-Fluc foi cultivada em meio RPMI contendo 10% de FCS (Sigma), 500 μg/ ml de higromicina e 1% de Glutamax. As células foram cultivadas a 37 °C em uma atmosfera saturada de água com 5 % de CO 2. A passagem 23 foi usada para transplante. A viabilidade celular foi de 87,5%. 1 x 105 células por animal foram injetadas no pâncreas doscamundongos utilizando uma seringa de tuberculina de 0,3 ml (BD Biosciences, Alemanha). Para isso, uma pequena incisão foi feita no local abdominal esquerdo do camundongo Black 6 anestesiado. A parede peritoneal foi aberta e o pâncreas cuidadosamente isolado com fórceps. Dez microlitros (1 x 105 células Panc02-H7- Fluc em meio RPMI) suspensão de células foram injetados na cauda do pâncreas. A parede peritoneal e as feridas da pele foram fechadas usando suturas 5/0 resolvíveis.[0320] The murine PD1-IL2v surrogate immunoconjugate was tested on the mouse pancreatic transfectant cell line Panc02-Fluc injected intra-pancreatically into Black 6 mice. Panc02-H7 (mouse pancreatic carcinoma) cells were originally obtained from MD Anderson Cancer Center (Texas, USA) and after expansion deposited in the Roche-Glycart in-house cell bank. The Panc02-H7-Fluc cell line was produced in-house by calcium transfection and subcloning techniques. Panc02-H7-Fluc was cultured in RPMI medium containing 10% FCS (Sigma), 500 μg/ml hygromycin and 1% Glutamax. The cells were grown at 37 °C in a water-saturated atmosphere with 5% CO 2 . Passage 23 was used for transplantation. Cell viability was 87.5%. 1 × 105 cells per animal were injected into the pancreas of mice using a 0.3 ml tuberculin syringe (BD Biosciences, Germany). For this purpose, a small incision was made in the left abdominal site of the anesthetized Black 6 mouse. The peritoneal wall was opened and the pancreas carefully isolated with forceps. Ten microliters (1 × 105 Panc02-H7-Fluc cells in RPMI medium) cell suspension was injected into the tail of the pancreas. The peritoneal wall and skin wounds were closed using 5/0 resolvable sutures.
[0321] Camundongos fêmeas Pretas 6 com idades entre 10-12 semanas no início da experiência (Charles Rivers, Lyon, França) foram mantidos em condições isentas de patogênicos específicos com ciclos diários de 12 h de luz/ 12 h de escuridão de acordo com as diretrizes autorizadas (GV- Solas; Felasa; TierschG). O protocolo do estudo experimental foi revisado e aprovado pelo governo local (ZH193/ 2014). Após a chegada, os animais foram mantidos por uma semana para se acostumarem ao novo ambiente e para observação. O monitoramento da saúde foi realizado regularmente.[0321] Female Black 6 mice aged 10–12 weeks at the start of the experiment (Charles Rivers, Lyon, France) were kept under specific pathogen-free conditions with daily 12 h light/12 h dark cycles according to authorized guidelines (GV-Solas; Felasa; TierschG). The experimental study protocol was reviewed and approved by the local government (ZH193/2014). Upon arrival, the animals were kept for one week to acclimatize to the new environment and for observation. Health monitoring was performed regularly.
[0322] Os camundongos foram injetados intra-pancreaticamente no dia 0 de estudo com 1 x 105 células Panc02-Fluc, aleatorizados e pesados. Uma semana após os camundongos injeção de células de tumor foram injetados por via intravenosa com duas doses diferentes de PD1 -IL2v e comparar d para a combinação de PD1 e FAP-IL2v anticorpos, uma vez por semana durante quatro semanas.[0322] Mice were injected intra-pancreatically on day 0 of study with 1 x 105 Panc02-Fluc cells, randomized and weighed. One week after tumor cell injection mice were injected intravenously with two different doses of PD1-IL2v and compare d to the combination of PD1 and FAP-IL2v antibodies, once a week for four weeks.
[0323] Todos os camundongos foram injetados intravenosamente com 200 da solução apropriada. Os camundongos no grupo de veículo foram injetados com tampão de histidina e os grupos de tratamento com o PD1-IL2v (0,5 mg/ kg ou 1 mg/ kg), pD1 (10 mg/ kg) e PAF-IL2v (2,5 mg/ kg) anticorpos ou a combinação de PD1 e FAP-IL2v (10 mg/ kg 2,5 mg/ kg de PAF-IL2v PD1 e) anticorpos. Para obter a quantidade apropriada de o- conjugados imunológicos por 200 μl, as soluções mãe foram diluídas com o tampão Histidina quando necessário, de acordo com a Tabela 2.[0323] All mice were injected intravenously with 200 μL of the appropriate solution. Mice in the vehicle group were injected with Histidine buffer and the treatment groups with the PD1-IL2v (0.5 mg/kg or 1 mg/kg), pD1 (10 mg/kg) and PAF-IL2v (2.5 mg/kg) antibodies or the combination of PD1 and FAP-IL2v (10 mg/kg and 2.5 mg/kg of PAF-IL2v and PD1) antibodies. To obtain the appropriate amount of immunological conjugates per 200 μL, the stock solutions were diluted with Histidine buffer when necessary according to Table 2.
[0324] Tabela 2. Compostos, doses, tampões de formulação econcentração de solução estoque.[0324] Table 2. Compounds, doses, formulation buffers and stock solution concentration.
[0325] Para a imagem de Bioluminescência pelo IVIS ®SPECTRUM, os camundongos são injetados intraperitonealmente com 150 mg/ kg de D-Luciferina 10 minutos antes da aquisição da imagem de bioluminescência (BLI) e posteriormente anestesiados com 4% de isoflurano. Subsequentemente, os camundongos são transferidos para uma câmara de isolamento, que é posicionada no espectro IVIS®. As aquisições de BLI in vivo são realizadas através da aquisição do sinal de luminescência durante 10-50 segundos. Os dados são armazenados como Radiância (fótons)/ sec/ cm 2/ sr. A análise dos dados BLI in vivo é realizada com o software Living Image® 4.4 e representado por uma curva de inibição do tumor.[0325] For Bioluminescence imaging by IVIS ®SPECTRUM, mice are injected intraperitoneally with 150 mg/kg D-Luciferin 10 minutes prior to bioluminescence imaging (BLI) acquisition and subsequently anesthetized with 4% isoflurane. Subsequently, mice are transferred to an isolation chamber, which is positioned in the IVIS® spectrometer. In vivo BLI acquisitions are performed by acquiring the luminescence signal for 10-50 seconds. Data are stored as Radiance (photons)/sec/cm2/sr. Analysis of in vivo BLI data is performed with Living Image® 4.4 software and represented by a tumor inhibition curve.
[0326] Para avaliar a imunofarmacodinâmica por histologia, 3 camundongos por grupo foram sacrificados 4 dias após a primeira terapia por deslocamento do pescoço. Os tumores do pâncreas foram colhidos e fixados imediatamente em formalina a 10%. O tecido foi deixado em solução de formalina durante a noite e depois processado para FFPET (Leica 1020, Alemanha). Seções de parafina de 4 μm foram subsequentemente cortadas em um micrótomo (Leica RM2235, Alemanha). A imuno-histoquímica de CD3, CD1 e ICOS de camundongo foi realizada no Leica autostainer (Leica ST5010, Alemanha) seguindo os protocolos do fabricante. As imagens foram digitalizadas com o scanner Olympus.[0326] To assess immunopharmacodynamics by histology, 3 mice per group were sacrificed 4 days after the first therapy by neck dislocation. Pancreatic tumors were harvested and fixed immediately in 10% formalin. The tissue was left in formalin solution overnight and then processed for FFPET (Leica 1020, Germany). 4 μm paraffin sections were subsequently cut on a microtome (Leica RM2235, Germany). Immunohistochemistry of mouse CD3, CD1 and ICOS was performed on Leica autostainer (Leica ST5010, Germany) following the manufacturer's protocols. Images were digitized with Olympus scanner.
[0327] A Figura 16 mostra os resultados de uma experiência de eficácia comparando o substituto de murganho PD1-IL2v com os substitutos de murganho FAP-IL2v e os substitutos de murganho PD-1 como agentes únicos e em combinação. A linha celular de carcinoma pancreático transfectante Panc02- H7-Fluc foi injetada no pâncreas em camundongos Black 6 para estudar a sobrevivência em um método sinérgico cíclico ortotópico pancreático. A quantidade de anticorpos injetada por camundongo em mg/ kg são as seguintes: 0,5 e 1 mg/ kg de murino substituto PD1-IL2v, 10 mg/ kg de murino substituto PD1 e 2,5 mg/ kg de murino substitutos FAP-IL2v anticorpos. Os anticorpos foram injetados intravenosamente uma vez por semana durante 4 semanas. Sobrevida mediana e global superior significativa foi observada no substituto murino de 0,5 e 1 mg/ kg de PD1-IL2v em comparação com todos os outros agentes únicos e a combinação de substituto de camundongo PD-1 e FAP-IL2v substituto de murídeo. A Figura 1 6 e a Tabela 3 mostram que ambas as doses de PD1-IL2v mediram eficácia superior em termos de sobrevivência mediana e global melhorada em comparação com todos os outros agentes únicos, bem como a combinação de PD1 e FAP-IL2v.[0327] Figure 16 shows the results of an efficacy experiment comparing the mouse PD1-IL2v surrogate with the mouse FAP-IL2v surrogates and the mouse PD-1 surrogates as single agents and in combination. The transfectant pancreatic carcinoma cell line Panc02-H7-Fluc was injected into the pancreas of Black 6 mice to study survival in a pancreatic orthotopic cyclic synergistic method. The amount of antibodies injected per mouse in mg/kg are as follows: 0.5 and 1 mg/kg murine PD1-IL2v surrogate, 10 mg/kg murine PD1 surrogate, and 2.5 mg/kg murine FAP-IL2v surrogate antibodies. Antibodies were injected intravenously once weekly for 4 weeks. Significant superior median and overall survival was observed with the 0.5 and 1 mg/kg murine PD1-IL2v surrogate compared with all other single agents and the combination of mouse PD-1 surrogate and murine FAP-IL2v surrogate. Figure 1 6 and Table 3 show that both doses of PD1-IL2v measured superior efficacy in terms of improved median and overall survival compared with all other single agents as well as the combination of PD1 and FAP-IL2v.
[0328] Tabela 3: Mediana e sobrevivência global de camundongosBlack 6 tratados com PD1-IL2v, pD1, FAP-IL2v e uma combinação de anticorpoPD-1 e FAP-IL2v, no modelo tumoral singeneico Panc02-Fluc.[0328] Table 3: Median and overall survival of Black 6 mice treated with PD1-IL2v, pD1, FAP-IL2v and a combination of PD-1 and FAP-IL2v antibodies, in the Panc02-Fluc syngeneic tumor model.
[0329] A Figura 17 mostra os resultados de uma experiência deeficácia comparando o substituto murino PD1-IL2v a FAP-IL2v, o substituto murino PD1 e a sua combinação. A linha celular de carcinoma pancreático transfectante Panc02-H7-Fluc foi injetada no pâncreas em camundongos Black 6 para estudar a sobrevivência em um modelo sinérgico ortotópico pancreático por meio de bioluminescência. Logo após a primeira administração da terapia no dia 7, uma redução no sinal de bioluminescência Panc02-Fluc foi detectada pelo IVIS® Spectrum em vários grupos tratados, mas somente PD1-IL2v mostrou um desaparecimento completo do sinal BLI na maioria dos camundongos que durou o duração total da experiência, indicativa de uma resposta completa em 4 de 7 camundongos para a dose de 0,5 mg/ kg e 7 em 7 camundongos para a dose de 1 mg/ kg. A Figura 17 mostra de que ambas as doses de PD1-IL2v eficácia superior mediada em termos de diminuição do sinal de bioluminescência (fotões/ segundo) em comparação com todos os outros agente único e o grupo de combinação.[0329] Figure 17 shows the results of an efficacy experiment comparing the murine PD1-IL2v surrogate to FAP-IL2v, the murine PD1 surrogate and their combination. The transfectant pancreatic carcinoma cell line Panc02-H7-Fluc was injected into the pancreas of Black 6 mice to study survival in a synergistic orthotopic pancreatic model via bioluminescence. Soon after the first administration of therapy on day 7, a reduction in the Panc02-Fluc bioluminescence signal was detected by IVIS® Spectrum in several treated groups, but only PD1-IL2v showed a complete disappearance of the BLI signal in the majority of mice lasting for the entire duration of the experiment, indicative of a complete response in 4 of 7 mice at the 0.5 mg/kg dose and 7 of 7 mice at the 1 mg/kg dose. Figure 17 shows that both doses of PD1-IL2v mediated superior efficacy in terms of decrease in bioluminescence signal (photons/second) compared to all other single agent and the combination group.
[0330] As Figuras 18A e 18B mostram os resultados de imagens imuno-histoquímicas de tumores de pâncreas corados para CD3 anti- camundongo (Figura 18A) e a análise de quantificação de células T (Figura 18B). A coloração por imuno-histoquímica de células T CD3 foi realizada em tumores de pâncreas de camundongo Black 6 derivados dos grupos de tratamento indicados. Amostras de tecidos foram preparadas para coloração imuno- histoquímica: os tumores foram colhidos de animais após a administração do tratamento, fixados em formalina a 10% (Sigma, Alemanha) e posteriormente processados para FFPET (Leica 1020, Alemanha). Seções de parafina de 4 μm foram subsequentemente cortadas em um micrótomo (Leica RM2235, Alemanha). A imuno-histoquímica de CD3 de camundongo foi realizada com CD3 anti-camundongo (Diagnostic Biosystem, Alemanha) no Leica autostainer (Leica ST5010, Alemanha) seguindo os protocolos do fabricante. As imagens foram digitalizadas com o scanner Olympus. A quantificação de células T positivas para muCD3 foi realizada com o software Definiens (Definiens, Alemanha). As estatísticas foram analisadas por ANOVA unidirecional com testes de comparação múltipla. Logo após a primeira administração da terapia, no dia 4, foi detectado um aumento significativo no número de células T positivas para CD3 nos grupos tratados com PD1-IL2v em comparação com o grupo veículo. Observou-se também uma tendência para o aumento de células positivas para CD3 na combinação de substituto murino PD1 e substituto murino de FAP-IL2v em relação ao veículo, mas não foi significativo. Figura 18 A e 18 B mostram que PD1-IL2v provocou um aumento na infiltração CD3 no tumor pancreático 4 dias após a primeira terapia em comparação com todos os grupos.[0330] Figures 18A and 18B show the results of immunohistochemical imaging of pancreatic tumors stained for anti-mouse CD3 (Figure 18A) and T cell quantification analysis (Figure 18B). Immunohistochemical staining of CD3 T cells was performed on Black 6 mouse pancreatic tumors derived from the indicated treatment groups. Tissue samples were prepared for immunohistochemical staining: tumors were harvested from animals after treatment administration, fixed in 10% formalin (Sigma, Germany), and further processed for FFPET (Leica 1020, Germany). 4 μm paraffin sections were subsequently cut on a microtome (Leica RM2235, Germany). Mouse CD3 immunohistochemistry was performed with anti-mouse CD3 (Diagnostic Biosystem, Germany) on the Leica autostainer (Leica ST5010, Germany) following the manufacturer's protocols. Images were digitized with the Olympus scanner. Quantification of muCD3-positive T cells was performed with Definiens software (Definiens, Germany). Statistics were analyzed by one-way ANOVA with multiple comparison tests. Soon after the first administration of therapy, on day 4, a significant increase in the number of CD3-positive T cells was detected in the PD1-IL2v-treated groups compared with the vehicle group. A trend towards increased CD3-positive cells was also observed in the combination of murine PD1 surrogate and murine FAP-IL2v surrogate compared with the vehicle, but it was not significant. Figure 18 A and 18 B show that PD1-IL2v caused an increase in CD3 infiltration in the pancreatic tumor 4 days after the first therapy compared with all groups.
[0331] A Figura 19 mostra os resultados de imagens imuno- histoquímicas de tumores de pâncreas corados para PD1 anti-camundongo. A coloração por imuno-histoquímica de células T positivas para PD1 foi realizada em tumores de pâncreas de camundongo Black 6 derivados dos grupos de tratamento indicados. Amostras de tecidos foram preparadas para coloração imuno-histoquímica: os tumores foram colhidos de animais após a administração do tratamento, fixados em formalina a 10% (Sigma, Alemanha) e posteriormente processados para FFPET (Leica 1020, Alemanha). Seções de parafina de 4 μm foram subsequentemente cortadas em um micrótomo (Leica RM2235, Alemanha). A imuno-histoquímica de PD1 de camundongo foi realizada com PD1 anti-camundongo (R & D System, Alemanha) no autotainer Leica (Leica ST5010, Alemanha) seguindo os protocolos do fabricante. As imagens foram digitalizadas com o scanner Olympus. Logo após a primeira administração da terapia, no dia 4, foi detectado um aumento muito elevado no número de células T positivas para PD1 nos grupos tratados com PD1-IL2v em comparação com o grupo veículo. Também foi observado um aumento moderado nas células positivas para PD1 na combinação de substituto murino de PD1 e substituto murino de FAP-IL2v quando comparado com o veículo. A Figura 19 mostra de que PD1-IL2v provocou um aumento na infiltração de células T positiva PD1 no tumor pancreático 4 dias após a primeira terapia em comparação com todos os grupos.[0331] Figure 19 shows the results of immunohistochemical imaging of pancreatic tumors stained for anti-mouse PD1. Immunohistochemical staining of PD1-positive T cells was performed on Black 6 mouse pancreatic tumors derived from the indicated treatment groups. Tissue samples were prepared for immunohistochemical staining: tumors were harvested from animals after treatment administration, fixed in 10% formalin (Sigma, Germany), and further processed for FFPET (Leica 1020, Germany). 4 μm paraffin sections were subsequently cut on a microtome (Leica RM2235, Germany). Mouse PD1 immunohistochemistry was performed with anti-mouse PD1 (R&D System, Germany) on the Leica autotainer (Leica ST5010, Germany) following the manufacturer's protocols. Images were digitized with the Olympus scanner. Immediately after the first administration of therapy, on day 4, a very high increase in the number of PD1-positive T cells was detected in the PD1-IL2v treated groups compared to the vehicle group. A moderate increase in PD1-positive cells was also observed in the combination of murine PD1 surrogate and murine FAP-IL2v surrogate when compared to the vehicle. Figure 19 shows that PD1-IL2v caused an increase in PD1-positive T cell infiltration in the pancreatic tumor 4 days after the first therapy compared to all groups.
[0332] A Figura 20 mostra os resultados de imagens imuno- histoquímicas de tumores de pâncreas corados para ICOS anti-camundongo. A coloração por imuno-histoquímica de células T positivas para ICOS foi realizada em tumores de pâncreas de camundongo Black 6 derivados dos grupos de tratamento indicados. Amostras de tecidos foram preparadas para coloração imuno- histoquímica: os tumores foram colhidos de animais após a administração do tratamento, fixados em formalina a 10% (Sigma, Alemanha) e posteriormente processados para FFPET (Leica 1020, Alemanha). Seções de parafina de 4 μm foram subsequentemente cortadas em um micrótomo (Leica RM2235, Alemanha). A imuno-histoquímica de ICOS de camundongo foi realizada com ICOS anti- camundongo (My Biosource, Alemanha) no Leica autostainer (Leica ST5010, Alemanha) seguindo os protocolos do fabricante. As imagens foram digitalizadas com o scanner Olympus. Logo após a primeira administração da terapia, no dia 4, foi detectada uma diminuição no número de células T positivas para ICOS nos grupos tratados com PD1 -IL2v em comparação com o grupo veículo. A Figura 20 mostra que a PD1-IL2v provocou uma diminuição na infiltração de células T positivas para ICOS no tumor pancreático 4 dias após a primeira terapia, em comparação com todos os grupos.EXEMPLO 7EFICÁCIA IN VIVO DE IMUNOCONJUGADOS DE PD1 -IL2V EM UM MODELO SINGENEICO DE LINHAS CELULARES TUMORAIS DE CAMUNDONGO EM COMPARAÇÃO COM ANTICORPOS PD1 E FAP-IL2V (DUAS DOSES DIFERENTES) COMO AGENTESÚNICOS E EM COMBINAÇÃO.[0332] Figure 20 shows the results of immunohistochemical imaging of pancreatic tumors stained for anti-mouse ICOS. Immunohistochemical staining of ICOS-positive T cells was performed on Black 6 mouse pancreatic tumors derived from the indicated treatment groups. Tissue samples were prepared for immunohistochemical staining: tumors were harvested from animals after treatment administration, fixed in 10% formalin (Sigma, Germany), and further processed for FFPET (Leica 1020, Germany). 4 μm paraffin sections were subsequently cut on a microtome (Leica RM2235, Germany). Immunohistochemistry of mouse ICOS was performed with anti-mouse ICOS (My Biosource, Germany) on the Leica autostainer (Leica ST5010, Germany) following the manufacturer's protocols. Images were digitized with the Olympus scanner. Immediately after the first administration of therapy, on day 4, a decrease in the number of ICOS-positive T cells was detected in the PD1-IL2v-treated groups compared with the vehicle group. Figure 20 shows that PD1-IL2v caused a decrease in the infiltration of ICOS-positive T cells into the pancreatic tumor 4 days after the first therapy, compared with all groups. EXAMPLE 7 IN VIVO EFFICACY OF PD1-IL2V IMMUNOCONJUGATES IN A SYNGENEIC MODEL OF MICE TUMOR CELL LINES COMPARED WITH PD1 AND FAP-IL2V ANTIBODIES (TWO DIFFERENT DOSES) AS SINGLE AGENTS AND IN COMBINATION.
[0333]O conjugado imunitário PD1-IL2v foi testado em comparação com o substituto murino PD1 mais a combinação FAP-IL2v substituta murina com duas doses diferentes para a sua eficácia antitumoral num modelo singeneico. O modelo singênico utilizado foi o modelo singeneico pancreático Panc02-Fluc. O sub-conjugado murino conjugado imunológico PD1-IL2v foi testado na linha celular transfectante Panc02-Fluc pancreática de camundongo intra-pancreática injetada em camundongos Black 6. As células Panc02-H7 (carcinoma pancreático de camundongo) foram originalmente obtidas do centro de câncer MD Anderson (Texas, EUA) e após expansão depositada no banco de células interno Roche-Glycart. Panc02-H7- Fluc célula linha foi produzida em casa por transfecção de cálcio e técnicas de sub-clonagem. Panc02-H7-Fluc w como cultivadas em meio RPMI contendo 10% de FCS (Sigma), 500 μg/ ml de higromicina e 1% de Glutamax. As células foram cultivadas a 37 °C em uma atmosfera saturada de água com 5% de CO 2. A passagem 16 foi usada para transplante. A viabilidade celular foi de 83,3%. 1 x 105 células por animal foram injetadas no pâncreas dos camundongos utilizando uma seringa de tuberculina de 0,3 ml (BD Biosciences, Alemanha). Para isso, uma pequena incisão foi feita no local abdominal esquerdo do camundongo Black 6 anestesiado. A parede peritoneal foi aberta e o pâncreas cuidadosamente isolado com fórceps. Dez microlitros (1 x 105 Panc02-H7- Fluc células em meio RPMI) suspensão celular foi injetado na cauda do pâncreas. A parede peritoneal e as feridas da pele foram fechadas usando suturas 5/0 resolvíveis.[0333]The PD1-IL2v immune conjugate was tested in comparison with the murine PD1 surrogate plus the murine FAP-IL2v surrogate combination at two different doses for its antitumor efficacy in a syngeneic model. The syngeneic model used was the Panc02-Fluc pancreatic syngeneic model. The murine PD1-IL2v immune conjugate subconjugate was tested on the intra-pancreatic mouse pancreatic transfectant cell line Panc02-Fluc injected into Black 6 mice. Panc02-H7 (mouse pancreatic carcinoma) cells were originally obtained from MD Anderson Cancer Center (Texas, USA) and after expansion deposited in the Roche-Glycart in-house cell bank. Panc02-H7-Fluc cell line was produced in-house by calcium transfection and sub-cloning techniques. Panc02-H7-Fluc w cells were cultured in RPMI medium containing 10% FCS (Sigma), 500 μg/ml hygromycin and 1% Glutamax. Cells were grown at 37 °C in a water-saturated atmosphere with 5% CO 2. Passage 16 was used for transplantation. Cell viability was 83.3%. 1 × 105 cells per animal were injected into the pancreas of mice using a 0.3 ml tuberculin syringe (BD Biosciences, Germany). For this, a small incision was made in the left abdominal site of anesthetized Black 6 mice. The peritoneal wall was opened and the pancreas carefully isolated with forceps. Ten microliters (1 × 105 Panc02-H7-Fluc cells in RPMI medium) cell suspension was injected into the tail of the pancreas. The peritoneal wall and skin wounds were closed using 5/0 resolvable sutures.
[0334] Camundongos fêmeas Pretas 6 com idades entre 10-12 semanas no início da experiência (Charles Rivers, Lyon, França) foram mantidos em condições isentas de patogênicos específicos com ciclos diários de 12 h de luz/ 12 h de escuridão de acordo com as diretrizes autorizadas (GV- Solas; Felasa; TierschG). O protocolo do estudo experimental foi revisado e aprovado pelo governo local (ZH193/ 2014). Após a chegada, os animais foram mantidos por uma semana para se acostumarem ao novo ambiente e para observação. A monitoramento contínua da saúde foi realizada regularmente.[0334] Female Black 6 mice aged 10–12 weeks at the start of the experiment (Charles Rivers, Lyon, France) were kept under specific pathogen-free conditions with a daily 12 h light/12 h dark cycle according to authorized guidelines (GV-Solas; Felasa; TierschG). The experimental study protocol was reviewed and approved by the local government (ZH193/2014). Upon arrival, the animals were kept for one week to acclimatize to the new environment and for observation. Continuous health monitoring was performed regularly.
[0335] Os camundongos foram injetados intra - pancreaticamente no dia 0 do estudo com 1 x 105 células Panc02 - Fluc, distribuídos aleatoriamente e pesados. Uma semana após a injeção de células tumorais injetaram-se camundongos intravenosamente com PD1- IL2v e comparam-se com a combinação de Mab são de PD1+ FAP-IL2v com duas doses diferentes, uma vez por semana durante três semanas.[0335] Mice were injected intra-pancreatically on day 0 of the study with 1 x 105 Panc02-Fluc cells, randomly distributed and weighed. One week after tumor cell injection, mice were injected intravenously with PD1-IL2v and compared with the PD1+ FAP-IL2v Mab combination at two different doses, once a week for three weeks.
[0336] Todos os camundongos foram injetados intravenosamente com 200 da solução apropriada. Os camundongos no grupo veículo foram injetados com tampão histidina e os grupos de tratamento com os anticorpos PD1-IL2v (1 mg/ kg), pD1 (10 mg/ kg) e FAP-IL2v (0,625 mg/ kg ou 1,25 mg/ kg) ou a combinação de PD 1+ FAP-IL2v (10 mg/ kg+ 1,25 mg/ kg ou/+ 10 mg kg 0,625 mg/ kg) anticorpos. Para obter a quantidade apropriada de conjugados imunológicos por 200 μl, as soluções mãe foram diluídas com tampão histidina quando necessário, de acordo com a Tabela 4.[0336] All mice were injected intravenously with 200 µL of the appropriate solution. Mice in the vehicle group were injected with histidine buffer and the treatment groups with PD1-IL2v (1 mg/kg), pD1 (10 mg/kg) and FAP-IL2v (0.625 mg/kg or 1.25 mg/kg) antibodies or the combination of PD 1+ FAP-IL2v (10 mg/kg+ 1.25 mg/kg or/+ 10 mg kg 0.625 mg/kg) antibodies. To obtain the appropriate amount of immune conjugates per 200 µL, the stock solutions were diluted with histidine buffer when necessary according to Table 4.
[0337] Tabela 4. Compostos, doses, tampões de formulação econcentração de solução estoque.[0337] Table 4. Compounds, doses, formulation buffers and stock solution concentration.
[0338] Para a imagem de Bioluminescência pelo IVIS®SPECTRUM, os camundongos são injetados intraperitonealmente com 150 mg/ kg de D-Luciferina 10 minutos antes da aquisição da imagem de bioluminescência (BLI) e posteriormente anestesiados com 4% de isoflurano. Subsequentemente, os camundongos são transferidos para uma câmara de isolamento, que é posicionada no espectro IVIS®. As aquisições de BLI in vivo são realizadas através da aquisição do sinal de luminescência durante 10-50 segundos. Os dados são armazenados como Radiância (fótons)/ sec/ cm 2/ sr. A análise dos dados BLI in vivo é realizada com o software Living Image® 4.4 e representado por uma curva de inibição do tumor.[0338] For Bioluminescence imaging by IVIS®SPECTRUM, mice are injected intraperitoneally with 150 mg/kg D-Luciferin 10 minutes prior to bioluminescence imaging (BLI) acquisition and subsequently anesthetized with 4% isoflurane. Subsequently, mice are transferred to an isolation chamber, which is positioned in the IVIS® spectrum. In vivo BLI acquisitions are performed by acquiring the luminescence signal for 10-50 seconds. Data are stored as Radiance (photons)/sec/cm2/sr. Analysis of in vivo BLI data is performed with Living Image® 4.4 software and represented by a tumor inhibition curve.
[0339] Para avaliar a imunofarmacodinâmica por histologia, 3 camundongos de grupos selecionados foram sacrificados 4 dias após a primeira terapia por deslocamento do pescoço. Os tumores do pâncreas foram colhidos e fixados imediatamente em formalina a 10%. O tecido foi deixado em solução de formalina durante a noite e depois processado para FFPET (Leica 1020, Alemanha). Seções de parafina de 4 μm foram subsequentemente cortadas em um micrótomo (Leica RM2235, Alemanha). A imuno-histoquímica de camundongo CD3, CD8, pD1 e Granzima B foi realizada no autocolante Leica (Leica ST5010, Alemanha) seguindo os protocolos do fabricante. As imagens foram digitalizadas com o scanner Olympus.[0339] To assess immunopharmacodynamics by histology, 3 mice from selected groups were sacrificed 4 days after the first therapy by neck dislocation. Pancreatic tumors were harvested and fixed immediately in 10% formalin. The tissue was left in formalin solution overnight and then processed for FFPET (Leica 1020, Germany). 4 μm paraffin sections were subsequently cut on a microtome (Leica RM2235, Germany). Immunohistochemistry of mouse CD3, CD8, pD1 and Granzyme B was performed on Leica autostainer (Leica ST5010, Germany) following the manufacturer's protocols. Images were digitized with Olympus scanner.
[0340] A Figura 21 e Tabela 5 mostra os resultados de uma experiência comparando a eficácia muPD1-IL2v para muFAP-IL2v e muPD1 anticorpos como agentes isolados e em combinação. A linha celular de carcinoma pancreático transfectante Panc02-H7-Fluc foi injetada no pâncreas em camundongos Black 6 para estudar a sobrevivência em um modelo sinérgico ortotópico pancreático. A quantidade de anticorpos injetados por camundongo em mg/ kg é a seguinte:/ kg muPD1-IL2v, 10 mg/ kg muPD1 e 0,625 ou 1,25 mg/ kg muFAP-IL2v 1 mg anticorpos. Os anticorpos foram injetados por via intravenosa uma vez por semana durante 4 semanas. A mediana superior significativa e a sobrevida global foram observadas em 1 mg/ kg de muPD1-IL2v em comparação com todos os outros agentes únicos e a combinação de muPD- 1+ muFAP-IL2v em ambas as doses testadas. Assim, pode concluir-se que a PD1-IL2v mediou uma eficácia superior em termos de sobrevivência mediana e global melhorada em comparação com todos os outros agentes únicos, bem como as combinações de PD1+ FAP-IL2v em ambas as doses testadas.[0340] Figure 21 and Table 5 show the results of an experiment comparing the efficacy of muPD1-IL2v to muFAP-IL2v and muPD1 antibodies as single agents and in combination. The transfectant pancreatic carcinoma cell line Panc02-H7-Fluc was injected into the pancreas of Black 6 mice to study survival in a synergistic pancreatic orthotopic model. The amount of antibodies injected per mouse in mg/kg is as follows: 1 mg/kg muPD1-IL2v, 10 mg/kg muPD1, and 0.625 or 1.25 mg/kg muFAP-IL2v antibodies. Antibodies were injected intravenously once weekly for 4 weeks. Significant superior median and overall survival were observed with 1 mg/kg muPD1-IL2v compared to all other single agents and the combination of muPD-1+muFAP-IL2v at both doses tested. Thus, it can be concluded that PD1-IL2v mediated superior efficacy in terms of improved median and overall survival compared to all other single agents as well as PD1+FAP-IL2v combinations at both doses tested.
[0341] Tabela 5: Sobrevida mediana e global de camundongosBlack 6 tratados com PD1-IL2v, pD1, FAP-IL2v e uma combinação de anticorpoPD-1 e FAP-IL2v, no modelo de tumor singeneico Panc02-Fluc.[0341] Table 5: Median and overall survival of Black 6 mice treated with PD1-IL2v, pD1, FAP-IL2v and a combination of PD-1 and FAP-IL2v antibodies, in the Panc02-Fluc syngeneic tumor model.
[0342] A Figura 22 mostra os resultados de uma experiência de eficácia comparando a muPDI- IL2v com a FAP-IL2v, muPDI e a sua combinação com duas doses diferentes. A linha celular de carcinoma pancreático transfectante Panc02-H7-Fluc foi injetada no pâncreas em camundongos Black 6 para estudar a sobrevivência em um modelo sinérgico ortotópico pancreático por meio de bioluminescência. Durante o curso do estudo, uma redução no sinal de bioluminescência Panc02- Fluc foi detectada pelo IVIS® Spectrum em vários grupos tratados, mas somente a terapia com muPD1- IL2v mostrou um desaparecimento completo do sinal BLI em todos os camundongos que duraram toda a duração do experimento, indicativo de uma resposta completa em todos os 6 camundongos. A Figura 22 mostra que a eficácia superior mediada por PD1- IL2v em termos de diminuição do sinal de bioluminescência (fótons/ segundo) em comparação com todos os outros agentes únicos e grupos de combinação.[0342] Figure 22 shows the results of an efficacy experiment comparing muPDI-IL2v with FAP-IL2v, muPDI and their combination at two different doses. The transfectant pancreatic carcinoma cell line Panc02-H7-Fluc was injected into the pancreas of Black 6 mice to study survival in a synergistic orthotopic pancreatic model by means of bioluminescence. During the course of the study, a reduction in the Panc02-Fluc bioluminescence signal was detected by IVIS® Spectrum in several treated groups, but only muPD1-IL2v therapy showed a complete disappearance of the BLI signal in all mice lasting the entire duration of the experiment, indicative of a complete response in all 6 mice. Figure 22 shows that PD1-IL2v-mediated superior efficacy in terms of bioluminescence signal decrease (photons/second) compared to all other single agents and combination groups.
[0343] A Figura 23 mostra os resultados de imagens imuno- histoquímicas de tumores de pâncreas corados para CD3 anti-camundongo. A coloração por imuno-histoquímica de células T CD3 foi realizada em tumores de pâncreas de camundongo Black 6 derivados dos grupos de tratamento indicados. Amostras de tecidos foram preparadas para coloração imuno- histoquímica: os tumores foram colhidos de animais após a administração do tratamento, fixados em formalina a 10% (Sigma, Alemanha) e posteriormente processados para FFPET (Leica 1020, Alemanha). Seções de parafina de 4 μm foram subsequentemente cortadas em um micrótomo (Leica RM2235, Alemanha). A imuno-histoquímica de CD3 de camundongo foi realizada com CD3 anti-camundongo (Diagnostic Biosystem, Alemanha) no Leica autostainer (Leica ST5010, Alemanha) seguindo os protocolos do fabricante. As imagens foram digitalizadas com o scanner Olympus. Logo após a primeira administração da terapia, no dia 4, foi detectado um aumento muito elevado no número de células T positivas para CD3 nos grupos tratados com muPDl-IL2v em comparação com o grupo veículo. Também foi observado um aumento moderado nas células positivas para CD3 em todos os outros grupos terapêuticos quando comparado com o veículo. A Figura 23 mostra que PD1- IL2v provocou um aumento na infiltração de células T positivas para CD3 no tumor pancreático 4 dias após a primeira terapia, em comparação com todos os grupos.[0343] Figure 23 shows the results of immunohistochemical imaging of pancreatic tumors stained for anti-mouse CD3. Immunohistochemical staining of CD3 T cells was performed on Black 6 mouse pancreatic tumors derived from the indicated treatment groups. Tissue samples were prepared for immunohistochemical staining: tumors were harvested from animals after treatment administration, fixed in 10% formalin (Sigma, Germany), and further processed for FFPET (Leica 1020, Germany). 4 μm paraffin sections were subsequently cut on a microtome (Leica RM2235, Germany). Mouse CD3 immunohistochemistry was performed with anti-mouse CD3 (Diagnostic Biosystem, Germany) on the Leica autostainer (Leica ST5010, Germany) following the manufacturer's protocols. Images were digitized with the Olympus scanner. Immediately after the first administration of therapy, on day 4, a very high increase in the number of CD3-positive T cells was detected in the muPD1-IL2v-treated groups compared with the vehicle group. A moderate increase in CD3-positive cells was also observed in all other therapeutic groups when compared with the vehicle. Figure 23 shows that PD1-IL2v caused an increase in CD3-positive T cell infiltration in the pancreatic tumor 4 days after the first therapy, compared with all groups.
[0344] Figura 24 A e 24B um d tabela 6 mostra os resultados de imagens de imuno-histoquímica de tumores do pâncreas coradas para camundongo anti-CD8 (Figura 24A) e a análise de quantificação de células T (Figura 24B). Coloração imuno-histoquímica de CD 8 células T foi realizada no camundongo Black 6 tumores do pâncreas derivadas a partir dos grupos de tratamento indicados. Amostras de tecidos foram preparadas para coloração imuno-histoquímica: os tumores foram colhidos de animais após a administração do tratamento, fixados em formalina a 10% (Sigma, Alemanha) e posteriormente processados para FFPET (Leica 1020, Alemanha). Seções de parafina de 4 μm foram subsequentemente cortadas em um micrótomo (Leica RM2235, Alemanha). Camundongo CD 8 imuno-histoquímica foi realizada com CD anti- camundongo 8 (Serotec, Alemanha) no Autostainer Leica (Leica ST5010, Alemanha) seguindo os protocolos do fabricante. As imagens foram digitalizadas com o scanner Olympus. A quantificação de células T positivas para muCD 8 foi realizada com o software Definiens (Definiens, Alemanha). As estatísticas foram analisadas por ANOVA unidirecional com testes de comparação múltipla. Logo após a primeira administração da terapia, no dia 4, foi detectado um aumento significativo no número de células T CD8 positivas nos grupos tratados com muPD1-IL2v em comparação com todos os outros grupos. A tendência de aumento nas células positivas para CD8 também foi observada em todos os outros grupos terapêuticos testados, mas não foi significativa. Assim, a Figura 2 4A e 2 4B mostram que PD1-IL2v provocou um aumento na infiltração de CD8 no tumor pancreático 4 dias após a primeira terapia, em comparação com todos os grupos.[0344] Figure 24 A and 24B and Table 6 show the results of immunohistochemical images of pancreatic tumors stained for mouse anti-CD8 (Figure 24A) and T cell quantification analysis (Figure 24B). Immunohistochemical staining of CD 8 T cells was performed on Black 6 mouse pancreatic tumors derived from the indicated treatment groups. Tissue samples were prepared for immunohistochemical staining: tumors were harvested from animals after treatment administration, fixed in 10% formalin (Sigma, Germany) and subsequently processed for FFPET (Leica 1020, Germany). 4 μm paraffin sections were subsequently cut on a microtome (Leica RM2235, Germany). Mouse CD 8 immunohistochemistry was performed with anti-mouse CD 8 (Serotec, Germany) on the Leica Autostainer (Leica ST5010, Germany) following the manufacturer's protocols. Images were digitized with the Olympus scanner. Quantification of muCD 8-positive T cells was performed with Definiens software (Definiens, Germany). Statistics were analyzed by one-way ANOVA with multiple comparison tests. Soon after the first administration of therapy, on day 4, a significant increase in the number of CD8-positive T cells was detected in the groups treated with muPD1-IL2v compared to all other groups. The trend of increase in CD8-positive cells was also observed in all other therapeutic groups tested, but was not significant. Thus, Figure 2 4A and 2 4B show that PD1-IL2v provoked an increase in CD8 infiltration in the pancreatic tumor 4 days after the first therapy, compared to all groups.
[0345] Tabela 6. Células T CD8 positivas.[0345] Table 6. CD8-positive T cells.
[0346] A Figura 25 A e 25B e a Tabela 7 mostram os resultados deimagens imuno-histoquímicas de tumores de pâncreas marcados para análise de quantificação de área de marcador anti-Granzima B (5A) e Granzima B (5B). A coloração por imuno-histoquímica de Granzima B foi realizada em tumores de pâncreas de camundongo Black 6 derivados dos grupos de tratamento indicados. Amostras de tecidos foram preparadas para coloração imuno- histoquímica: os tumores foram colhidos de animais após a administração do tratamento, fixados em formalina a 10% (Sigma, Alemanha) e posteriormente processados para FFPET (Leica 1020, Alemanha). Seções de parafina de 4 μm foram subsequentemente cortadas em um micrótomo (Leica RM2235, Alemanha). Camundongo A granzima B imuno-histoquímica foi realizada com anti-camundongo de granzima B (Abcam, Alemanha) no Autostainer Leica (Leica ST5010, Alemanha) seguindo os protocolos do fabricante. As imagens foram digitalizadas com o scanner Olympus. A quantificação da área do marcador Granzima B foi realizada com o software Definiens (Definiens, Alemanha). As estatísticas foram analisadas por ANOVA unidirecional com testes de comparação múltipla. Logo após a primeira administração da terapia, no dia 4, foi detectado um aumento significativo na Granzima B nos grupos tratados com muPD1-IL2v em comparação com todos os outros grupos. Uma tendência para aumentar a área do marcador Granzima B foi também observada em todos os outros grupos terapêuticos testados, mas não foi significativa. Assim, a Figura 2 5 A e 2 5 B mostram que a PD1-IL2v provocou um aumento na área positiva da Granzima B no tumor pancreático 4 dias após a primeira terapia, em comparação com todos os grupos.[0346] Figure 25 A and 25B and Table 7 show the results of immunohistochemical images of pancreatic tumors labeled for anti-Granzime B (5A) and Granzyme B (5B) marker area quantification analysis. Granzyme B immunohistochemical staining was performed on Black 6 mouse pancreatic tumors derived from the indicated treatment groups. Tissue samples were prepared for immunohistochemical staining: tumors were harvested from animals after treatment administration, fixed in 10% formalin (Sigma, Germany), and subsequently processed for FFPET (Leica 1020, Germany). 4 μm paraffin sections were subsequently cut on a microtome (Leica RM2235, Germany). Mouse Granzyme B immunohistochemistry was performed with anti-mouse granzyme B (Abcam, Germany) on the Leica Autostainer (Leica ST5010, Germany) following the manufacturer's protocols. Images were digitized with the Olympus scanner. Quantification of the Granzyme B marker area was performed with the Definiens software (Definiens, Germany). Statistics were analyzed by one-way ANOVA with multiple comparison tests. Soon after the first administration of therapy, on day 4, a significant increase in Granzyme B was detected in the groups treated with muPD1-IL2v compared to all other groups. A trend to increase the Granzyme B marker area was also observed in all other therapeutic groups tested, but it was not significant. Thus, Figure 25A and 25B show that PD1-IL2v caused an increase in the Granzyme B positive area in the pancreatic tumor 4 days after the first therapy, compared to all groups.
[0347] Tabela 7. Área Positiva de Granzima B[0347] Table 7. Granzyme B Positive Area
[0348] Figura 26 A e 26B e tabela 8 presente os resultados deimagens de imuno-histoquímica de tumores do pâncreas coradas para camundongo anti-PD1 (Figura 2 6A) e a análise de quantificação de células positivas PD1 (Figura 26 B). A coloração por imuno-histoquímica de células PD1 foi realizada em tumores de pâncreas de camundongo Black 6 derivados dos grupos de tratamento indicados. Amostras de tecidos foram preparadas para coloração imuno-histoquímica: os tumores foram colhidos de animais após a administração do tratamento, fixados em formalina a 10% (Sigma, Alemanha) e posteriormente processados para FFPET (Leica 1020, Alemanha). Seções de parafina de 4 μm foram subsequentemente cortadas em um micrótomo (Leica RM2235, Alemanha). A imuno-histoquímica de PD1 de camundongo foi realizada com PD1 anti-camundongo (Serotec, Alemanha) no autotainer Leica (Leica ST5010, Alemanha) seguindo os protocolos do fabricante. As imagens foram digitalizadas com o scanner Olympus. A quantificação de mu células positivas para PD1 foi realizada com o software Definiens (Definiens, Alemanha). As estatísticas foram analisadas por ANOVA unidirecional com testes de comparação múltipla. Logo após a primeira administração da terapia, no dia 4, foi detectado um aumento significativo no número de células positivas para PD1 nos grupos tratados com muPD1-IL2v em comparação com todos os outros grupos. A tendência de aumento nas células positivas para PD1 também foi observada em todos os outros grupos terapêuticos testados, mas não foi significativa. Assim, a Figura 26 A e 26 B mostram que PD1-IL2v provocou um aumento em células positivas PD1 no tumor pancreático 4 dias após a primeira terapia em comparação com todos os grupos.[0348] Figure 26 A and 26B and Table 8 present the results of immunohistochemical images of pancreatic tumors stained for mouse anti-PD1 (Figure 26A) and the quantification analysis of PD1 positive cells (Figure 26B). Immunohistochemical staining of PD1 cells was performed on Black 6 mouse pancreatic tumors derived from the indicated treatment groups. Tissue samples were prepared for immunohistochemical staining: tumors were harvested from animals after treatment administration, fixed in 10% formalin (Sigma, Germany) and subsequently processed for FFPET (Leica 1020, Germany). 4 μm paraffin sections were subsequently cut on a microtome (Leica RM2235, Germany). Mouse PD1 immunohistochemistry was performed with anti-mouse PD1 (Serotec, Germany) on the Leica autotainer (Leica ST5010, Germany) following the manufacturer's protocols. Images were digitized with the Olympus scanner. Quantification of PD1-positive mu cells was performed with the Definiens software (Definiens, Germany). Statistics were analyzed by one-way ANOVA with multiple comparison tests. Soon after the first administration of therapy, on day 4, a significant increase in the number of PD1-positive cells was detected in the muPD1-IL2v-treated groups compared to all other groups. The trend of increase in PD1-positive cells was also observed in all other therapeutic groups tested, but was not significant. Thus, Figure 26 A and 26 B show that PD1-IL2v caused an increase in PD1-positive cells in the pancreatic tumor 4 days after the first therapy compared to all groups.
[0349] Tabela 8. Células positivas para PD1.EXEMPLO 7EFEITO DA LIBERAÇÃO DE IL-2V PARA CÉLULAS T ESPECÍFICAS DE VÍRUS EXAURIDAS ATRAVÉS DO BLOQUEIO DE PD-1[0349] Table 8. PD1-positive cells. EXAMPLE 7EFFECT OF IL-2V RELEASE ON VIRUS-SPECIFIC T CELLS EXHAUSTED BY PD-1 BLOCKADE
[0350] A expressão de PD-1 foi descrita pela primeira vez em células T específicas de vírus exauridas como resultado da exposição crônica a antígenos virais e foi associada à incapacidade de células T de montar uma resposta anti-viral eficaz. As células T CD4 específicas de vírus capazes de secretar simultaneamente IL-2 e IFN- Y conferem proteção contra a re-ativação viral em infecções crônicas. De fato, a assinatura polifuncional das células T CD4 tem sido associada ao controle viral em indivíduos saudáveis infectados por citomegalovírus (CMV), vírus Epstein-Barr (EBV) e Vírus Herpes Simplex (HSV), bem como naqueles indivíduos infectados com humanos. Vírus da imunodeficiência (HIV), que permanece livre de sintomas por vários anos.[0350] PD-1 expression was first described on virus-specific T cells exhausted as a result of chronic exposure to viral antigens and was associated with the inability of T cells to mount an effective anti-viral response. Virus-specific CD4 T cells capable of simultaneously secreting IL-2 and IFN-γ confer protection against viral reactivation in chronic infections. Indeed, the polyfunctional CD4 T cell signature has been associated with viral control in healthy individuals infected with cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr virus (EBV) and Herpes Simplex Virus (HSV), as well as in those individuals infected with Human Immunodeficiency Virus (HIV) who remain symptom-free for several years.
[0351] No contexto de infecções virais crônicas, portanto, desenvolvemos um ensaio in vitro para avaliar o efeito do direcionamento da PD- 1 para liberar uma versão mutada de IL-2 (IL-2v) para células T específicas de antígeno disfuncionais. Para evitar restrições quanto à quantidade de doadores adequados para nosso ensaio, optamos por uma proteína viral imunogênica para CMV (pp65) como antígeno de re-chamada para células T, dado que aproximadamente 80% da população é sero positiva para CMV. Assim, estimulamos células mononucleares de sangue periférico de dadores humanos saudáveis (PBMCs) com CMV-pp65 (Miltenyi) na presença das nossas construções na concentração de 10 μg/ ml. 43 horas depois, bloqueamos o transporte de proteínas do Golgi adicionando o Plugue de Golgi (BD Bioscience, Brefeldin A) e Golgi Stop (BD Bioscience, Monensin) e incubamos as células a 37 °C por mais 5 horas. As células foram então lavadas, coradas na superfície com anticorpos anti-CD3, CD4, CD8, CD62L e CD45RO antes de serem fixadas/ permeabilizadas com o “FoxP3 Transcription Fator Staining Buffer Set” (eBioscience). Por fim, realizamos coloração intracelular para IL-2, IFN- y e Ki67 (todos da eBioscience) para medir a proliferação celular.[0351] In the context of chronic viral infections, we therefore developed an in vitro assay to evaluate the effect of targeting PD-1 to release a mutated version of IL-2 (IL-2v) to dysfunctional antigen-specific T cells. To avoid constraints on the number of suitable donors for our assay, we chose a viral protein immunogenic to CMV (pp65) as the T-cell recall antigen, given that approximately 80% of the population is seropositive for CMV. Thus, we stimulated healthy human donor peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) with CMV-pp65 (Miltenyi) in the presence of our constructs at a concentration of 10 μg/ml. 43 hours later, we blocked Golgi protein transport by adding Golgi Plug (BD Bioscience, Brefeldin A) and Golgi Stop (BD Bioscience, Monensin) and incubated the cells at 37 °C for an additional 5 hours. Cells were then washed, surface stained with anti-CD3, CD4, CD8, CD62L and CD45RO antibodies before being fixed/permeabilized with the “FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set” (eBioscience). Finally, we performed intracellular staining for IL-2, IFN-γ and Ki67 (all from eBioscience) to measure cell proliferation.
[0352] A Figura 27 mostra a capacidade das células T CD4 segregarem IL-2 (A), IL-2 e IFN-Y (B) ou IFN-Y (C) e proliferarem (D) após 48 horas de recordação com a proteína imunogênica CMV pp65 em presença de anti-PD-1 sozinho, em combinação com IL-2v, ou como proteína de fusão. Observou-se uma tendência na capacidade PD1-IL2v para aumentar as frequências de células T CD4 polifuncionais, capaz de co-segregar IFN- IL-2 e Y (Figura 21 B), e um aumento significativo no IFN- Y população que segrega único (Figura 21 C), quando comparado com amostras tratadas com pp65 e anti-PD1. Por outro lado, a combinação de pp65 e IL-2v não alvo (DP47-IL2v) aumentou as frequências de células T CD4 mono-funcionais de IL-2 (Figura 21 A). Como esperado, todas as células tratadas com IL-2v alvo ou não direcionada proliferaram como indicado pela positividade para coloração com Ki67.[0352] Figure 27 shows the ability of CD4 T cells to secrete IL-2 (A), IL-2 and IFN-Y (B), or IFN-Y (C), and to proliferate (D) after 48 hours of recall with the immunogenic CMV protein pp65 in the presence of anti-PD-1 alone, in combination with IL-2v, or as a fusion protein. A trend was observed in the ability of PD1-IL2v to increase the frequencies of polyfunctional CD4 T cells capable of co-segregating IFN-Y and IL-2 (Figure 21B), and a significant increase in the IFN-Y single-secreting population (Figure 21C), when compared with samples treated with pp65 and anti-PD1. Conversely, the combination of pp65 and non-targeted IL-2v (DP47-IL2v) increased the frequencies of IL-2 mono-functional CD4 T cells (Figure 21A). As expected, all cells treated with targeted or nontargeted IL-2v proliferated as indicated by positivity for Ki67 staining.
[0353] A Figura 28 mostra o estado de diferenciação, de acordo com a expressão de CD45RO e CD62L, de células T CD4 específicas de vírus que segregam IFN-Y após 48 horas de recordação com a proteína pp65 imunogênica de CMV na presença de anti-PD-1 isolado, em combinação com IL- 1. 2v, ou como proteína de fusão. Uma caracterização fenótipo dos IFN- expandidas Y - secretoras de células T CD4+ específicas para o vírus (Figura 22) revelou um efetor de memória (CD45RO+ CD62L-) perfil. Podemos concluir que a administração de IL-2v às células T CD4 específicas para CMV, através da proteína de fusão PD1-IL2v, resulta na expansão de uma população específica de vírus protetora de vida longa, caracterizada por um perfil de memória diferenciado e capacidade de secretar IL-2 e IFN- y.EXEMPLO 8EXEMPLO 8A. ATIVAÇÃO CELULAR DOS DOADORES 1 E 2 (ENSAIO PSTAT5)[0353] Figure 28 shows the differentiation state, according to CD45RO and CD62L expression, of IFN-γ-secreting virus-specific CD4 T cells after 48 hours of recall with the immunogenic CMV pp65 protein in the presence of anti-PD-1 alone, in combination with IL-1.2v, or as a fusion protein. A phenotypic characterization of the expanded IFN-γ-secreting virus-specific CD4+ T cells (Figure 22) revealed an effector memory (CD45RO+ CD62L-) profile. We can conclude that administration of IL-2v to CMV-specific CD4 T cells, via the PD1-IL2v fusion protein, results in the expansion of a long-lived, protective virus-specific population characterized by a differentiated memory profile and the ability to secrete IL-2 and IFN-γ.EXAMPLE 8EXAMPLE 8A. CELLULAR ACTIVATION OF DONORS 1 AND 2 (PSTAT5 TEST)
[0354] As PBMCs recentemente isoladas de dadores saudáveis foram semeadas em meio morno (RPMI1640, 10% de FCS, 2 mM de Glutamina) em uma placa de fundo redondo de 96 poços (200'000 células/ poço). As placas foram centrifugadas a 300 g durante 10 min e o sobrenadante foi removido. As células foram re-suspensas em 50 μL de meio contendo as moléculas de IL-2 e estimulada por 20 min a 37 °C. Para preservar o estado de fosforilação, as células foram imediatamente fixadas após estimulação com igual quantidade de tampão Cytofix pré-aquecido (554655, BD Bioscience) durante 10 min a 37 °C. Posteriormente, as placas foram centrifugadas durante 10 min a 300 g e o sobrenadante foi removido. Para permitir a coloração intracelular, as células foram permeabilizadas em 200 de tampão Phosflow Perm III (558050, BD Bioscience) durante 30 min a 4. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com 150 de tampão FACS frio e dividida em duas placas de 96 poços de fundo redondo e corados cada um com 20 μl da mistura de anticorpo I ou II durante 60 minutos no frigorífico. A mistura de anticorpos I foi utilizada para corar pSTAT5 em células T CD4 e células T reguladoras e a mistura de anticorpos II foi utilizada para corar pSTAT5 em células T CD8 e células NK. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com tampão FACS e ressuspensas em 200 μl de tampão FACS contendo 2% de PFA por poço. A análise foi realizada usando um citômetro de fluxo BD Fortessa.[0354] Freshly isolated PBMCs from healthy donors were seeded in warm medium (RPMI1640, 10% FCS, 2 mM Glutamine) in a 96-well round-bottom plate (200'000 cells/well). The plates were centrifuged at 300 g for 10 min and the supernatant was removed. The cells were resuspended in 50 μL of medium containing IL-2 molecules and stimulated for 20 min at 37 °C. To preserve the phosphorylation state, the cells were immediately fixed after stimulation with an equal amount of pre-warmed Cytofix buffer (554655, BD Bioscience) for 10 min at 37 °C. Subsequently, the plates were centrifuged for 10 min at 300 g and the supernatant was removed. To allow intracellular staining, cells were permeabilized in 200 µL Phosflow Perm III buffer (558050, BD Bioscience) for 30 min at 4 °C. Then, cells were washed twice with 150 µL cold FACS buffer and divided into two 96-well round-bottom plates and stained each with 20 µL of antibody mix I or II for 60 min in the refrigerator. Antibody mix I was used to stain pSTAT5 on CD4 T cells and regulatory T cells, and antibody mix II was used to stain pSTAT5 on CD8 T cells and NK cells. Then, cells were washed twice with FACS buffer and resuspended in 200 µL FACS buffer containing 2% PFA per well. Analysis was performed using a BD Fortessa flow cytometer.
[0355] As misturas de anticorpo FACS de acordo com a tabela 9 e a tabela 10 foram utilizadas.[0355] FACS antibody mixtures according to Table 9 and Table 10 were used.
[0356] Tabela 9. Mistura de anticorpos FACS I (células T CD4 e células T reguladoras)[0356] Table 9. FACS I antibody mix (CD4 T cells and regulatory T cells)
[0357] Tabela 10. Mistura de anticorpos II FACS (células T CD8 ecélulas NK)[0357] Table 10. FACS antibody mix II (CD8 T cells and NK cells)
[0358] A Figura 29 mostra a fosforilação de STAT5 em células T CD8(A), células NK (B), células T CD4 (C) e células T reguladoras (D) após tratamento de PBMC em repouso do dador 1 com PD1-IL2v, FAP- IL2v e FAP-IL2wt. Todas as três moléculas testadas são igualmente potentes em células T CD8, células NK e células T CD4 (excluindo Tregs). A FAP-IL2wt mais potente na indução da fosforilação de STAT5 em Tregs seguida por PD1-IL2v. O FAP-IL2v tem a atividade mais baixa em Tregs.[0358] Figure 29 shows STAT5 phosphorylation on CD8 T cells (A), NK cells (B), CD4 T cells (C) and regulatory T cells (D) after treatment of resting PBMC from donor 1 with PD1-IL2v, FAP-IL2v and FAP-IL2wt. All three molecules tested are equally potent on CD8 T cells, NK cells and CD4 T cells (excluding Tregs). FAP-IL2wt is most potent in inducing STAT5 phosphorylation on Tregs followed by PD1-IL2v. FAP-IL2v has the lowest activity on Tregs.
[0359] A Figura 30 mostra a fosforilação de STAT5 em células T CD4 (A), células T CD8 (B), células T reguladoras (C) e células NK (D) após tratamento de PBMC em repouso do dador 2 com FAP-IL2v, pD1 - IL 2c, FAP-IL2wt e PD1-TIM3-IL2v. Todas as quatro moléculas testadas são comparáveis, ativas em células T CD8, células NK e células T CD4 (excluindo Tregs). A FAP-IL2wt mais potente na indução da fosforilação de STAT5 em Tregs seguida por PD1-IL2v. O FAP-IL2v tem a atividade mais baixa em Tregs.EXEMPLO 8B. ATIVAÇÃO CELULAR DOS DOADORES 3 E 4 (ENSAIO PSTAT5)[0359] Figure 30 shows STAT5 phosphorylation on CD4 T cells (A), CD8 T cells (B), regulatory T cells (C), and NK cells (D) after treatment of resting PBMC from donor 2 with FAP-IL2v, pD1-IL 2c, FAP-IL2wt, and PD1-TIM3-IL2v. All four molecules tested are comparable, active on CD8 T cells, NK cells, and CD4 T cells (excluding Tregs). FAP-IL2wt is most potent in inducing STAT5 phosphorylation on Tregs followed by PD1-IL2v. FAP-IL2v has the lowest activity on Tregs. EXAMPLE 8B. CELLULAR ACTIVATION OF DONORS 3 AND 4 (PSTAT5 ASSAY)
[0360] As PBMC congeladas isoladas de dadores saudáveis foram descongeladas e cultivadas durante a noite a 37. No dia seguinte, as células foram semeadas em meio quente (RPMI1640, FCS a 10%, Glutamina 2 mM) em uma placa de fundo redondo de 96 poços (200'000 células/ poço). As placas foram centrifugadas a 300 g durante 10 min e o sobrenadante foi removido. As células foram re-suspensas em 50 μL de meio contendo as moléculas de IL-2 e estimulada por 20 min a 37 °C. Para preservar o estado de fosforilação, as células foram imediatamente fixadas após estimulação com igual quantidade de tampão Cytofix pré-aquecido (554655, BD Bioscience) durante 10 min a 37 °C. Posteriormente, as placas foram centrifugadas durante 10 min a 300 g e o sobrenadante foi removido. Para permitir a coloração intracelular, as células foram permeabilizadas em 200 de tampão Phosflow Perm III (558050, BD Bioscience) durante 30 min a 4. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com 150 de tampão FACS frio e dividida em duas placas de 96 poços de fundo redondo e corados cada um com 20 μl da mistura de anticorpo I ou II durante 60 minutos no frigorífico. A mistura de anticorpos I foi utilizada para corar pSTAT5 em células T CD4 e células T reguladoras e a mistura de anticorpos II foi utilizada para corar pSTAT5 em células T CD8 e células NK. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com tampão FACS e ressuspensas em 200 μl de tampão FACS contendo 2% de PFA por poço. A análise foi realizada usando um citômetro de fluxo BD Fortessa. O anticorpo FACS mistura de acordo com a tabela 11 e a tabela 12 foi utilizada.[0360] Frozen PBMC isolated from healthy donors were thawed and cultured overnight at 37 °C. The next day, cells were seeded in warm medium (RPMI1640, 10% FCS, 2 mM Glutamine) in a 96-well round-bottom plate (200'000 cells/well). The plates were centrifuged at 300 g for 10 min and the supernatant was removed. Cells were resuspended in 50 μL of medium containing IL-2 molecules and stimulated for 20 min at 37 °C. To preserve the phosphorylation state, cells were immediately fixed after stimulation with an equal amount of pre-warmed Cytofix buffer (554655, BD Bioscience) for 10 min at 37 °C. Subsequently, the plates were centrifuged for 10 min at 300 g and the supernatant was removed. To allow intracellular staining, cells were permeabilized in 200 µl Phosflow Perm III buffer (558050, BD Bioscience) for 30 min at 4 °C. Then, cells were washed twice with 150 µl cold FACS buffer and divided into two 96-well round-bottom plates and stained each with 20 µl of antibody mix I or II for 60 min in the refrigerator. Antibody mix I was used to stain pSTAT5 on CD4 T cells and regulatory T cells, and antibody mix II was used to stain pSTAT5 on CD8 T cells and NK cells. Then, cells were washed twice with FACS buffer and resuspended in 200 µl FACS buffer containing 2% PFA per well. Analysis was performed using a BD Fortessa flow cytometer. FACS antibody mix according to Table 11 and Table 12 was used.
[0361] Tabela 11. Mistura de anticorpos FACS I (células T CD4 e célulasT regimentais)[0361] Table 11. FACS I antibody mix (CD4 T cells and regimental T cells)
[0362] Tabela 12. Mistura de anticorpos II FACS (células T CD8 ecélulas NK)[0362] Table 12. FACS II antibody mix (CD8 T cells and NK cells)
[0363] A Figura 31 mostra a fosforilação de STAT5 em células TCD8 (A), células NK (B), células T CD4 (C) e células T reguladoras (D) após tratamento de PBMC em repouso do dador 3 com FAP-IL2v, pD1- IL2v, FAP- IL2wt, pD1-TIM3-IL2v. Todas as quatro moléculas testadas são comparáveis, ativas em células T CD8, células NK e células T CD4 (excluindo Tregs). A FAP- IL2wt mais potente na indução da fosforilação de STAT5 em Tregs seguida por PD1-IL2v. O FAP-IL2v tem a atividade mais baixa em Tregs.[0363] Figure 31 shows STAT5 phosphorylation in CD8 T cells (A), NK cells (B), CD4 T cells (C) and regulatory T cells (D) after treatment of resting PBMC from donor 3 with FAP-IL2v, pD1-IL2v, FAP-IL2wt, pD1-TIM3-IL2v. All four molecules tested are comparable, active on CD8 T cells, NK cells and CD4 T cells (excluding Tregs). FAP-IL2wt is most potent in inducing STAT5 phosphorylation in Tregs followed by PD1-IL2v. FAP-IL2v has the lowest activity on Tregs.
[0364] A Figura 32 mostra a fosforilação de STAT5 em células T CD8 (A), células NK (B), células T CD4 (C) e células T reguladoras (D) após tratamento de PBMC em repouso do dador 4 com FAP-IL2v, pD1- IL2v, FAP- IL2wt, pD1-TIM3-IL2v. Todas as quatro moléculas testadas são comparáveis, ativas em células T CD8, células NK e células T CD4 (excluindo Tregs). A FAP- IL2wt mais potente na indução da fosforilação de STAT5 em Tregs seguida por PD1-IL2v. O FAP-IL2v tem a atividade mais baixa em Tregs.[0364] Figure 32 shows STAT5 phosphorylation in CD8 T cells (A), NK cells (B), CD4 T cells (C) and regulatory T cells (D) after treatment of resting PBMC from donor 4 with FAP-IL2v, pD1-IL2v, FAP-IL2wt, pD1-TIM3-IL2v. All four molecules tested are comparable, active on CD8 T cells, NK cells and CD4 T cells (excluding Tregs). FAP-IL2wt is most potent in inducing STAT5 phosphorylation in Tregs followed by PD1-IL2v. FAP-IL2v has the lowest activity on Tregs.
[0365] Aspectos adicionais da invenção:1. Um imunoconjugado que compreende um polipeptídeo de IL-2 mutante de um anticorpo que se liga a PD-1,em que o polipeptídeo de IL-2 mutante é uma molécula de IL-2 humana que compreende as substituições dos aminoácidos F42A, Y45A e L72G (numeração em relação à sequência de IL-2 humana SEQ. ID N°: 19);2. Um imunoconjugado que compreende um polipeptídeo de IL-2 mutante de um anticorpo que se liga a PD-1,em que o polipeptídeo de IL-2 mutante é uma molécula de IL-2 humana que compreende as substituições dos aminoácidos F42A, Y45A e L72G (numeração em relação à sequência de IL-2 humana SEQ. ID N°: 19); eem que o anticorpo compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma HVR-H1 que compreende a sequência deaminoácidos da SEQ. ID N°: 1, uma HVR-H2 que compreende a sequência deaminoácidos da SEQ. ID N°: 2, uma HVR-H3 que compreende a sequência deaminoácidos da SEQ. ID N°: 3 e uma FR-H3 que compreende a sequência deaminoácidos da SEQ. ID N°: 7 nas posições 71-73 de acordo com a numeração de Kabat, e (b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 5 e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 6;3. Um imunoconjugado que compreende um polipeptídeo de IL-2 mutante de um anticorpo que se liga a PD-1,em que o polipeptídeo de IL-2 mutante é uma molécula de IL-2 humana que compreende as substituições dos aminoácidos F42A, Y45A e L72G (numeração em relação à sequência de IL-2 humana SEQ. ID N°: 19); eem que o anticorpo compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 8, uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 9 e HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 10, e (b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 11, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 12, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 13;4. Um imunoconjugado que compreende um polipeptídeo de IL-2 mutante de um anticorpo que se liga a PD-1,em que o polipeptídeo de IL-2 mutante é uma molécula de IL-2 humana que compreende as substituições dos aminoácidos F42A, Y45A e L72G (numeração em relação à sequência de IL-2 humana SEQ. ID N°: 19); eem que o anticorpo compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência deaminoácidos da SEQ. ID N° 14 e (b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ. ID N°: 15, SEQ. ID N°: 16, SEQ. ID N°: 17 e SEQ. ID N°: 18;5. O imunoconjugado de qualquer um dos aspectos 1 a 4, em que o polipeptídeo de IL-2 mutante compreende ainda a substituição de aminoácidos T3A e/ ou a substituição de aminoácidos C125A;6. O imunoconjugado de qualquer um dos aspectos 1 a 5, em que o polipeptídeo de IL-2 mutante compreende a sequência da SEQ. ID N°: 20;7. O imunoconjugado de qualquer um dos aspectos 1 a 6, em que o imunoconjugado compreende não mais do que um polipeptídeo de IL-2 mutante;8. O imunoconjugado de qualquer um dos aspectos 1 a 7, em que o anticorpo compreende um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade;9. O imunoconjugado do aspecto 8, em que o domínio Fc uma classe de IgG, particularmente um domínio Fc de subclasse de IgG1;10. O imunoconjugado de um aspecto 8 ou 9, em que o domínio Fc um domínio Fc humano;11. O imunoconjugado de qualquer um dos aspectos 1 a 10, em que o anticorpo é uma classe de IgG, em particular uma imunoglobulina de subclasse de IgG1;12. O imunoconjugado de qualquer um dos aspectos 8 a 11, em que o domínio Fc compreende uma modificação promovendo a associação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc;13. O imunoconjugado de qualquer um dos aspectos 8 a 12, em que no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc um resíduo de aminoácido substituído com um resíduo de aminoácido que possui um maior volume de cadeia lateral, gerando desta forma uma protuberância dentro do Domínio CH3 da primeira subunidade que é posicionável em uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade, e no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc um resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral menor volume, gerando desta forma uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade dentro da qual a protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade é posicionável; 14. O imunoconjugado de qualquer um dos aspectos 8 a 13, em que na primeira subunidade do domínio Fc o resíduo de treonina na posição 366 é substituído com um resíduo de triptofano (T366W), e na segunda subunidade do domínio Fc o resíduo de tirosina na posição 407 substituída por um resíduo de valina (Y407V) e, de forma opcional, o resíduo de treonina na posição 366 substituído com um resíduo de serina (T366S) e o resíduo de leucina na posição 368 substituído com um resíduo de alanina (L368A) (numeradas de acordo com Kabat Índice da UE);15. O imunoconjugado de um espetáculo 14, em que na primeira subunidade do domínio Fc adicionalmente o resíduo de serina na posição 354 é substituído com um resíduo de cisteína (S354C) ou o resíduo de ácido glutâmico na posição 356 é substituído com um resíduo de cisteína (E356C), e na segunda subunidade do domínio Fc adicionalmente o resíduo de tirosina na posição 349 é substituído com um resíduo de cisteína (Y349C) (numerações de acordo com o Índice EU de Kabat);16. O imunoconjugado de qualquer um dos aspectos 8 a 15, em que o polipeptídeo de IL-2 mutante é fundido no seu aminoácido amino-terminal ao aminoácido carboxi-terminal de uma das subunidades do domínio Fc, em particular a primeira subunidade do domínio Fc, de forma opcional, através de um peptídeo de ligação;17. O imunoconjugado de um aspecto 16, em que o peptídeo de ligação tem a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N°: 21;18. O imunoconjugado de qualquer um dos aspectos 8 a 16, em que o domínio Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor Fc, em particular um receptor Fc, e/ ou função efetora, em particular citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC);19. O imunoconjugado de um aspecto 18, em que a referida uma ou mais substituições de aminoácidos está em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo de L234, L235 e P329 (numeração de índice EU de Kabat);20. O imunoconjugado de qualquer um dos aspectos 8 a 19, em que cada subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A, L235A e P329G (numeração de índice EU de Kabat);21. O imunoconjugado de qualquer uma das reivindicações 1 a 20, que compreende um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico sequência da SEQ. ID N°: 22, um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100 % idêntica à sequência da SEQ. ID N°: 23 ou SEQ. ID N°: 24 e um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% ou 100% idêntica à sequência da SEQ. ID N°: 25;22. O imunoconjugado de qualquer um dos aspectos 1 a 21, que consiste essencialmente de um polipeptídeo de IL-2 mutante e uma molécula de imunoglobulina de IgG1, unidos por uma sequência de ligação;23. Um ou mais polinucleotídeos isolados que codificam o imunoconjugado de qualquer um dos aspectos 1 a 22;24. Um ou mais vetores, em particular vetor de expressão, que compreende o(s) polinucleotídeo(s) de um aspecto 23;25. Uma célula hospedeira que compreende o(s) polinucleotídeo(s) de um aspecto 23 ou o (s) vetor (es) de um aspecto 24;26. Um método para produzir um imunoconjugado que compreende um polipeptídeo de IL-2 mutante de um anticorpo que se liga a PD-1, que compreende (a) cultivar a célula hospedeira de um aspecto 25 sob condições adequadas para a expressão do imunoconjugado, e, de forma opcional, (b) recuperar o imunoconjugado;27. Um imunoconjugado que compreende um polipeptídeo de IL-2 mutante e um anticorpo que se liga a PD-1, produzido pelo método de um aspecto 26;28. Composição farmacêutica que compreende o imunoconjugado de qualquer um dos aspectos 1 a 22 ou 27 e um veículo farmaceuticamente aceitável;29. O imunoconjugado de qualquer um dos aspectos 1 a 22 ou 27 para uso como medicamento;30. O imunoconjugado de qualquer um dos aspectos 1 a 22 ou 27 para uso no tratamento de uma doença;31. O imunoconjugado para uso no tratamento de uma doença do aspecto 30, em que a referida doença é câncer;32. Uso do imunoconjugado de qualquer um dos aspectos 1 a 22 ou 27 na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença;33. o uso dos aspectos 32, em que a referida doença é câncer;34. Um método para tratar uma doença em um indivíduo, que compreende administrar ao referido indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende o imunoconjugado de qualquer um dos aspectos 1 a 22 ou 27 em uma forma farmaceuticamente aceitável;35. O método de um espetáculo 34, em que a referida doença é câncer;36. Um método para estimular o sistema imunológico de um indivíduo, que compreende administrar ao referido indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende o imunoconjugado de qualquer um dos aspectos 1 a 22 ou 27 em uma forma farmaceuticamente aceitável; e37. A invenção conforme descrita anteriormente.[0365] Additional aspects of the invention: 1. An immunoconjugate comprising a mutant IL-2 polypeptide of an antibody that binds to PD-1, wherein the mutant IL-2 polypeptide is a human IL-2 molecule comprising the amino acid substitutions F42A, Y45A, and L72G (numbering relative to the human IL-2 sequence SEQ. ID NO:19); 2. An immunoconjugate comprising a mutant IL-2 polypeptide of an antibody that binds to PD-1, wherein the mutant IL-2 polypeptide is a human IL-2 molecule comprising the amino acid substitutions F42A, Y45A, and L72G (numbering relative to the human IL-2 sequence SEQ. ID NO:19); and wherein the antibody comprises (a) a heavy chain variable region (VH) comprising an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 2, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 3 and an FR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 7 at positions 71-73 according to Kabat numbering, and (b) a light chain variable region (VL) comprising an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 4, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 5 and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 6;3. An immunoconjugate comprising a mutant IL-2 polypeptide of an antibody that binds to PD-1, wherein the mutant IL-2 polypeptide is a human IL-2 molecule comprising the amino acid substitutions F42A, Y45A, and L72G (numbering relative to the human IL-2 sequence of SEQ. ID NO:19); and wherein the antibody comprises (a) a heavy chain variable region (VH) comprising an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:8, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:9, and HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:10, and (b) a light chain variable region (VL) comprising an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO:11, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 12, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 13; 4. An immunoconjugate comprising a mutant IL-2 polypeptide of an antibody that binds to PD-1, wherein the mutant IL-2 polypeptide is a human IL-2 molecule comprising the amino acid substitutions F42A, Y45A, and L72G (numbering relative to the human IL-2 sequence SEQ. ID NO: 19); and wherein the antibody comprises (a) a heavy chain variable region (VH) comprising an amino acid sequence that is at least about 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% identical to the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 14 and (b) a light chain variable region (VL) comprising an amino acid sequence that is at least about 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ. ID NO: 15, SEQ. ID NO: 16, SEQ. ID NO: 17 and SEQ. ID NO: 18;5. The immunoconjugate of any one of aspects 1 to 4, wherein the mutant IL-2 polypeptide further comprises the T3A amino acid substitution and/or the C125A amino acid substitution;6. The immunoconjugate of any one of aspects 1 to 5, wherein the mutant IL-2 polypeptide comprises the sequence of SEQ. ID NO: 20;7. The immunoconjugate of any one of aspects 1 to 6, wherein the immunoconjugate comprises no more than one mutant IL-2 polypeptide; 8. The immunoconjugate of any one of aspects 1 to 7, wherein the antibody comprises an Fc domain composed of a first and a second subunit; 9. The immunoconjugate of aspect 8, wherein the Fc domain is a class of IgG, particularly an Fc domain of subclass IgG1; 10. The immunoconjugate of an aspect 8 or 9, wherein the Fc domain is a human Fc domain; 11. The immunoconjugate of any one of aspects 1 to 10, wherein the antibody is a class of IgG, particularly an immunoglobulin of subclass IgG1; 12. The immunoconjugate of any one of aspects 8 to 11, wherein the Fc domain comprises a modification promoting association of the first and second subunits of the Fc domain; The immunoconjugate of any one of aspects 8 to 12, wherein in the CH3 domain of the first subunit of the Fc domain an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a larger side chain volume, thereby generating a protrusion within the CH3 domain of the first subunit that is positionable in a cavity within the CH3 domain of the second subunit, and in the CH3 domain of the second subunit of the Fc domain an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a smaller side chain volume, thereby generating a cavity within the CH3 domain of the second subunit within which the protrusion within the CH3 domain of the first subunit is positionable; 14. The immunoconjugate of any one of aspects 8 to 13, wherein in the first subunit of the Fc domain the threonine residue at position 366 is replaced with a tryptophan residue (T366W), and in the second subunit of the Fc domain the tyrosine residue at position 407 is replaced with a valine residue (Y407V) and, optionally, the threonine residue at position 366 is replaced with a serine residue (T366S) and the leucine residue at position 368 is replaced with an alanine residue (L368A) (numbered according to the EU Kabat Index);15. The immunoconjugate of aspect 14, wherein in the first subunit of the Fc domain additionally the serine residue at position 354 is replaced with a cysteine residue (S354C) or the glutamic acid residue at position 356 is replaced with a cysteine residue (E356C), and in the second subunit of the Fc domain additionally the tyrosine residue at position 349 is replaced with a cysteine residue (Y349C) (numbering according to the Kabat EU Index); 16. The immunoconjugate of any one of aspects 8 to 15, wherein the mutant IL-2 polypeptide is fused at its amino-terminal amino acid to the carboxy-terminal amino acid of one of the subunits of the Fc domain, in particular the first subunit of the Fc domain, optionally via a linker peptide; 17. The immunoconjugate of aspect 16, wherein the linker peptide has the amino acid sequence of SEQ. ID NO: 21;18. The immunoconjugate of any one of aspects 8 to 16, wherein the Fc domain comprises one or more amino acid substitutions that reduce binding to an Fc receptor, in particular an Fc receptor, and/or effector function, in particular antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC);19. The immunoconjugate of aspect 18, wherein said one or more amino acid substitutions are at one or more positions selected from the group of L234, L235, and P329 (Kabat EU index numbering);20. The immunoconjugate of any one of aspects 8 to 19, wherein each subunit of the Fc domain comprises amino acid substitutions L234A, L235A, and P329G (Kabat EU index numbering);21. The immunoconjugate of any one of claims 1 to 20, comprising a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to the sequence of SEQ. ID NO:22, a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to the sequence of SEQ. ID NO:23 or SEQ. ID NO:24 and a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to the sequence of SEQ. ID NO: 25;22. The immunoconjugate of any one of aspects 1 to 21, consisting essentially of a mutant IL-2 polypeptide and an IgG1 immunoglobulin molecule, joined by a linker sequence;23. One or more isolated polynucleotides encoding the immunoconjugate of any one of aspects 1 to 22;24. One or more vectors, in particular expression vectors, comprising the polynucleotide(s) of an aspect 23;25. A host cell comprising the polynucleotide(s) of an aspect 23 or the vector(s) of an aspect 24;26. A method for producing an immunoconjugate comprising a mutant IL-2 polypeptide of an antibody that binds to PD-1, comprising (a) culturing the host cell of an aspect 25 under conditions suitable for expression of the immunoconjugate, and, optionally, (b) recovering the immunoconjugate;27. An immunoconjugate comprising a mutant IL-2 polypeptide and an antibody that binds to PD-1, produced by the method of aspect 26; 28. A pharmaceutical composition comprising the immunoconjugate of any one of aspects 1 to 22 or 27 and a pharmaceutically acceptable carrier; 29. The immunoconjugate of any one of aspects 1 to 22 or 27 for use as a medicament; 30. The immunoconjugate of any one of aspects 1 to 22 or 27 for use in the treatment of a disease; 31. The immunoconjugate for use in the treatment of a disease of aspect 30, wherein said disease is cancer; 32. Use of the immunoconjugate of any one of aspects 1 to 22 or 27 in the manufacture of a medicament for the treatment of a disease; 33. The use of aspects 32, wherein said disease is cancer; 34. A method of treating a disease in a subject, comprising administering to said subject a therapeutically effective amount of a composition comprising the immunoconjugate of any one of aspects 1 to 22 or 27 in a pharmaceutically acceptable form; 35. The method of a show 34, wherein said disease is cancer; 36. A method of stimulating the immune system of a subject, comprising administering to said subject an effective amount of a composition comprising the immunoconjugate of any one of aspects 1 to 22 or 27 in a pharmaceutically acceptable form; and 37. The invention as previously described.
[0366] Embora a invenção anterior tenha sido descrita com algum pormenor a título de ilustração e exemplo para fins de clareza de compreensão, as descrições e exemplos não devem ser interpretados como limitativos do escopo da invenção. As divulgações de todas as patentes e literatura científica aqui citadas são expressamente incorporadas em sua totalidade por referência.[0366] Although the foregoing invention has been described in some detail by way of illustration and example for purposes of clarity of understanding, the descriptions and examples should not be construed as limiting the scope of the invention. The disclosures of all patents and scientific literature cited herein are expressly incorporated in their entirety by reference.
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP17164533.6 | 2017-04-03 | ||
| EP17164533 | 2017-04-03 | ||
| PCT/EP2018/058034WO2018184964A1 (en) | 2017-04-03 | 2018-03-29 | Immunoconjugates of an anti-pd-1 antibody with a mutant il-2 or with il-15 |
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR112019017329A2 BR112019017329A2 (en) | 2020-04-14 |
| BR112019017329B1true BR112019017329B1 (en) | 2025-04-24 |
| Publication | Publication Date | Title |
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| WO2021001289A1 (en) | Immunoconjugates comprising a mutant interleukin-2 and an anti-cd8 antibody | |
| US20230192795A1 (en) | Immunoconjugates | |
| WO2022148853A1 (en) | Immunoconjugates | |
| BR112019017329B1 (en) | IMMUNOCONJUGATE, METHOD FOR PRODUCTION OF AN IMMUNOCONJUGATE, PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND USE OF THE IMMUNOCONJUGATE | |
| WO2024153722A1 (en) | Immunoconjugates | |
| HK40015970A (en) | Immunoconjugates of an anti-pd-1 antibody with a mutant il-2 or with il-15 | |
| HK40015869A (en) | Immunoconjugates |