[0001] O advento da tecnologia do DNA recombinante permitiu o desenvolvimento de muitos produtos farmacêuticos proteicos nas últimas três décadas. Os fármacos à base de proteínas se encontram agora entre as categorias de agentes terapêuticos que mais crescem no desenvolvimento (pré) clínico e como produtos comerciais. Em comparação com pequenas drogas químicas, os produtos farmacêuticos de proteína têm alta especificidade e atividade em concentrações relativamente baixas, e normalmente proporcionam uma terapia de doenças de alto impacto, como vários tipos de câncer, doenças autoimunes e distúrbios metabólicos (Roberts, Trends Biotechnol. 2014 Jl*ul;32(7):372-80, Wang, Int J Pharm. 20 de agosto de 1999; 185 (2): 129-88).[0001] The advent of recombinant DNA technology has enabled the development of many protein pharmaceuticals over the past three decades. Protein pharmaceuticals are now among the fastest growing categories of therapeutic agents in (pre)clinical development and as commercial products. Compared with small chemical drugs, protein pharmaceuticals have high specificity and activity at relatively low concentrations, and typically provide therapy for high-impact diseases such as various cancers, autoimmune diseases, and metabolic disorders (Roberts, Trends Biotechnol. 2014 Jl*ul;32(7):372-80, Wang, Int J Pharm. 1999 Aug 20;185(2):129-88).
[0002] Devido aos avanços nos processos de purificação em escala comercial, as proteínas recombinantes agora podem ser obtidas com elevada pureza quando fabricadas pela primeira vez. No entanto, as proteínas são apenas marginalmente estáveis e são altamente suscetíveis à degradação, tanto química quanto física. A degradação química refere-se a modificações envolvendo ligações covalentes, tais como desamidação, oxidação, clivagem ou formação de novas pontes dissulfureto, hidrólise, isomerização ou desglicosilação. A degradação física inclui desdobramento de proteínas, adsorção indesejável a superfícies e agregação. Lidar com essas instabilidades físicas e químicas é uma das tarefas mais desafiadoras no desenvolvimento de produtos farmacêuticos proteicos (Chi et al., Pharm ResVol. 20, No. 9, setembro de 2003, pp. 1325-1336, Roberts, Trends Biotechnol. julho de 2014; 32 (7): 372-80).[0002] Due to advances in commercial-scale purification processes, recombinant proteins can now be obtained in high purity when first manufactured. However, proteins are only marginally stable and are highly susceptible to degradation, both chemical and physical. Chemical degradation refers to modifications involving covalent bonds, such as deamidation, oxidation, cleavage or formation of new disulfide bonds, hydrolysis, isomerization, or deglycosylation. Physical degradation includes protein unfolding, undesirable adsorption to surfaces, and aggregation. Addressing these physical and chemical instabilities is one of the most challenging tasks in the development of protein pharmaceuticals (Chi et al., Pharm ResVol. 20, No. 9, September 2003, pp. 1325–1336, Roberts, Trends Biotechnol. 2014 Jul; 32(7): 372–80).
[0003] A agregação de proteínas representa um evento importante de instabilidade física de proteínas e ocorre devido à tendência inerente de minimizar a interação termodinamicamente desfavorável entre o solvente e os resíduos proteicos hidrofóbicos. Ela é particularmente problemática porque é encontrada rotineiramente durante os processos de redobramento, purificação, esterilização, transporte e armazenamento. A agregação pode ocorrer mesmo sob condições de solução onde o estado nativo da proteína é altamente favorecido em termos de termodinâmica (por exemplo, pH neutro e 37°C) e na ausência de tensão (Chi et al., Pharm ResVol. 20, No. 9, setembro de 2003, pp. 1325-1336, Roberts, Trends Biotechnol. Jul de 2014;32(7):372-80, Wang, Int J Pharm. 20 de agosto de 1999; 185 (2): 129-88, Mahler J Pharm Sci. Set de 2009; 98 (9): 2909-34).[0003] Protein aggregation represents an important event of physical instability of proteins and occurs due to the inherent tendency to minimize the thermodynamically unfavorable interaction between the solvent and hydrophobic protein residues. It is particularly problematic because it is routinely encountered during refolding, purification, sterilization, transport and storage processes. Aggregation can occur even under solution conditions where the native state of the protein is highly thermodynamically favored (e.g., neutral pH and 37°C) and in the absence of strain (Chi et al., Pharm ResVol. 20, No. 9, 2003 Sep; pp. 1325–1336, Roberts, Trends Biotechnol. 2014 Jul;32(7):372–80, Wang, Int J Pharm. 1999 Aug 20;185(2):129–88, Mahler J Pharm Sci. 2009 Sep;98(9):2909–34).
[0004] A agregação de proteínas é problemática, pois pode prejudicar a atividade biológica das proteínas terapêuticas. Ademais, a agregação de proteínas leva a uma estética indesejável do medicamento e diminui o rendimento do produto devido a etapas elaboradas de purificação que são necessárias para remover os agregados do produto final. Mais recentemente, tem havido também uma crescente preocupação e evidência de que a presença de proteínas agregadas (mesmo humanizadas ou totalmente humanas) pode aumentar significativamente o risco de um paciente desenvolver uma resposta imunológica ao monômero ativo da proteína, resultando na formação de anticorpos neutralizantes e em resistência a drogas, ou outros efeitos colaterais adversos (Mahler J Pharm Sci. Set de 2009; 98 (9): 2909-34.[0004] Protein aggregation is problematic because it can impair the biological activity of therapeutic proteins. Furthermore, protein aggregation leads to undesirable drug product aesthetics and decreases product yield due to elaborate purification steps that are required to remove aggregates from the final product. More recently, there has also been growing concern and evidence that the presence of aggregated proteins (even humanized or fully human) can significantly increase the risk of a patient developing an immune response to the active monomer of the protein, resulting in the formation of neutralizing antibodies and drug resistance, or other adverse side effects (Mahler J Pharm Sci. 2009 Sep;98(9):2909-34.
[0005] Vários esforços têm sido relatados na literatura para minimizar a agregação de proteínas por vários mecanismos. As proteínas podem ser estabilizadas e, assim, protegidas da formação de agregados e outras alterações químicas, modificando sua estrutura primária, aumentando assim a hidrofobicidade interior e reduzindo a hidrofobicidade externa. No entanto, a engenharia genética de proteínas pode resultar em uma funcionalidade prejudicada e/ou no aumento da imunogenicidade. Outra abordagem enfoca a dissociação de agregados (denominada "desagregação") para recuperar monômeros funcionais nativos, usando vários mecanismos, como temperatura, pressão, pH e sais. Atualmente, os agregados proteicos são removidos como impurezas, principalmente nas etapas de polimento do processamento posterior. No entanto, em casos de altos níveis de alto peso molecular (HMW), a remoção de uma quantidade significativa de HMW não apenas resulta em uma perda substancial de rendimento, mas também torna desafiadora a concepção de um processo robusto à jusante (Chi et al., Pharm ResVol. 20, No. 9, setembro de 2003, pp. 1325-1336).[0005] Several efforts have been reported in the literature to minimize protein aggregation by various mechanisms. Proteins can be stabilized and thus protected from aggregate formation and other chemical alterations by modifying their primary structure, thereby increasing internal hydrophobicity and reducing external hydrophobicity. However, genetic engineering of proteins may result in impaired functionality and/or increased immunogenicity. Another approach focuses on dissociation of aggregates (termed "disaggregation") to recover native functional monomers, using various mechanisms such as temperature, pressure, pH, and salts. Currently, protein aggregates are removed as impurities, mainly in the polishing steps of downstream processing. However, in cases of high levels of high molecular weight (HMW), removal of a significant amount of HMW not only results in a substantial yield loss but also makes the design of a robust downstream process challenging (Chi et al., Pharm ResVol. 20, No. 9, September 2003, pp. 1325-1336).
[0006] Preservar a estabilidade e a atividade das proteínas em aplicações biológicas e biotecnológicas representa sérios desafios. Há uma necessidade na técnica de composições farmacêuticas otimizadas que proporcionem uma estabilização melhorada de proteínas terapêuticas e reduza a agregação e desnaturação durante a formulação, o enchimento, o transporte, o armazenamento e a administração, prevenindo a perda de função e reações imunogênicas adversas. É o objetivo da presente invenção atender a essa necessidade.[0006] Preserving the stability and activity of proteins in biological and biotechnological applications represents serious challenges. There is a need in the art for optimized pharmaceutical compositions that provide improved stabilization of therapeutic proteins and reduce aggregation and denaturation during formulation, filling, transportation, storage and administration, preventing loss of function and adverse immunogenic reactions. It is the objective of the present invention to meet this need.
[0007] A instabilidade proteica, e em particular a agregação de proteínas, é um desafio crescente na indústria da biotecnologia, onde a agregação é encontrada ao longo da vida de uma proteína terapêutica, incluindo durante os processos de redobramento, purificação, esterilização, transporte e armazenamento. Assim, é o objetivo da presente invenção proporcionar uma composição farmacêutica estável compreendendo uma construção de anticorpo de cadeia simples biespecífica ligando-se a um antígeno da superfície de célula-alvo através de um primeiro domínio de ligação e ao antígeno CD3 da superfície de células T por um segundo domínio de ligação; uma β- ciclodextrina; e um tampão.[0007] Protein instability, and in particular protein aggregation, is a growing challenge in the biotechnology industry, where aggregation is encountered throughout the life of a therapeutic protein, including during refolding, purification, sterilization, transport and storage processes. Thus, it is the object of the present invention to provide a stable pharmaceutical composition comprising a bispecific single chain antibody construct binding to a target cell surface antigen via a first binding domain and to T cell surface antigen CD3 via a second binding domain; a β-cyclodextrin; and a buffer.
[0008] A β-ciclodextrina pode ser selecionada do grupo que consiste em β-ciclodextrina, metil-β-ciclodextrina, hidroxietil-β- ciclodextrina, hidroxipropil-β-ciclodextrina, etil-β-ciclodextrina, butil-β- ciclodextrina Succinil-(2-hidroxipropil)-β-ciclodextrina, heptaquis(2,3,6- tri-O-metil)-β-ciclodextrina, heptaquis(2,3,6-tri-O-benzoil)-β-ciclodextrina, sal sódico de fosfato β-ciclodextrina, sal sódico de sulfato β-ciclodextrina, triacetil-β-ciclodextrina, sal heptassódico de heptaquis(6-O-sulfo)-β-ciclodextrina, sal sódico de carboximetil-β- ciclodextrina, sal sódico de sulfobutiléter-e-ciclodextrina, e em particular do sal de sódio sulfobutileter-β-ciclodextrina, hidroxipropil-β- ciclodextrina. Ela pode estar presente em uma concentração na gama de 0,1% a 20% (p/v), preferencialmente de 0,5% a 2% (p/v) e mais preferencialmente de 0,8% a 1,5% (p/v).[0008] The β-cyclodextrin may be selected from the group consisting of β-cyclodextrin, methyl-β-cyclodextrin, hydroxyethyl-β-cyclodextrin, hydroxypropyl-β-cyclodextrin, ethyl-β-cyclodextrin, butyl-β-cyclodextrin, succinyl-(2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin, heptakis(2,3,6-tri-O-methyl)-β-cyclodextrin, heptakis(2,3,6-tri-O-benzoyl)-β-cyclodextrin, β-cyclodextrin phosphate sodium salt, β-cyclodextrin sulfate sodium salt, triacetyl-β-cyclodextrin, heptakis(6-O-sulfo)-β-cyclodextrin heptasodium salt, carboxymethyl-β-cyclodextrin, sulfobutylether-e-cyclodextrin sodium salt, and in particular sulfobutylether-β-cyclodextrin sodium salt, hydroxypropyl-β-cyclodextrin. It may be present in a concentration in the range of 0.1% to 20% (w/v), preferably 0.5% to 2% (w/v) and more preferably 0.8% to 1.5% (w/v).
[0009] A construção de anticorpo de cadeia simples biespecífica pode estar presente em uma gama de concentrações de 0,1-5 mg/ml, preferivelmente de 0,2-2,5 mg/ml, mais preferenciamente de 0,25-1,0 mg/ml. Seu primeiro domínio de ligação pode se ligar ao CD33. Em particular, a sequência de aminoácidos do primeiro domínio de ligação da construção de cadeia simples biespecífica é selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID 99, 109, 119, 128, 137, 146, 155, 164 e 173 e a sequência de aminoácidos do segundo domínio de ligação da construção de cadeia simples biespecífica é selecionada do grupo constituído por SEQ ID NO: 9, 18, 27, 36, 45, 54, 63, 72, 81, 179 e 90.[0009] The bispecific single chain antibody construct may be present in a concentration range of 0.1-5 mg/ml, preferably 0.2-2.5 mg/ml, more preferably 0.25-1.0 mg/ml. Its first binding domain may bind to CD33. In particular, the amino acid sequence of the first binding domain of the bispecific single chain construct is selected from the group consisting of SEQ ID 99, 109, 119, 128, 137, 146, 155, 164 and 173 and the amino acid sequence of the second binding domain of the bispecific single chain construct is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 9, 18, 27, 36, 45, 54, 63, 72, 81, 179 and 90.
[0010] O tampão pode ser selecionado do grupo que consiste em fosfato de potássio, ácido acético/acetato de sódio, ácido cítrico/citrato de sódio, ácido sucínico/sucinato de sódio, ácido tartárico/tartarato de sódio, histidina/HCl de histidina, glicina, Tris, glutamato, acetato e misturas destes, e em particular de fosfato de potássio, ácido cítrico/citrato de sódio, ácido sucínico, histidina, glutamato, acetato e suas combinações.[0010] The buffer may be selected from the group consisting of potassium phosphate, acetic acid/sodium acetate, citric acid/sodium citrate, succinic acid/sodium succinate, tartaric acid/sodium tartrate, histidine/histidine HCl, glycine, Tris, glutamate, acetate and mixtures thereof, and in particular potassium phosphate, citric acid/sodium citrate, succinic acid, histidine, glutamate, acetate and combinations thereof.
[0011] O pH da composição farmacêutica pode estar na gama de 4 a 7,5.[0011] The pH of the pharmaceutical composition may be in the range of 4 to 7.5.
[0012] Um ou mais excipientes podem estar presentes na composição farmacêutica aqui proporcionada, incluindo sacarose, trealose, manitol, sorbitol, arginina, lisina, polissorbato 20, polissorbato 80, poloxâmero 188, plurônico e suas combinações.[0012] One or more excipients may be present in the pharmaceutical composition provided herein, including sucrose, trehalose, mannitol, sorbitol, arginine, lysine, polysorbate 20, polysorbate 80, poloxamer 188, pluronic and combinations thereof.
[0013] A composição pode compreender um ou mais conservantes, particularmente álcool benzílico, clorobutanol, fenol, meta-cresol, metilparabeno, fenoxietanol, tiomersal de propilparabeno. A estrutura e a concentração típica para o uso desses conservantes estão descritas na Tabela 1 de Meyer et al. J Pharm Sci. 96(12), 3155.[0013] The composition may comprise one or more preservatives, particularly benzyl alcohol, chlorobutanol, phenol, meta-cresol, methylparaben, phenoxyethanol, propylparaben thiomersal. The structure and typical concentration for use of these preservatives are described in Table 1 of Meyer et al. J Pharm Sci. 96(12), 3155.
[0014] Também é fornecida neste documento uma composição farmacêutica sem conservantes, compreendendo uma construção de anticorpo de cadeia simples biespecífica, tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 100 ou 110 e estando em uma concentração de cerca de 0,5 mg/ml e uma ciclodextrina sendo ainda sal sódico de sulfobutiléter-e-cicodextrina em uma concentração de cerca de 1% (p/v) e um tampão sendo ainda fosfato de potássio em uma concentração de cerca de 10 mM, compreendendo ainda a formulação sacarose a uma concentração de cerca de 8% (p/v) de e polissorbato 80 a uma concentração de cerca de 0,01% (p/v) a um pH de cerca de 6,0.[0014] Also provided herein is a preservative-free pharmaceutical composition comprising a bispecific single chain antibody construct having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 or 110 and being at a concentration of about 0.5 mg/ml and a cyclodextrin further being sulfobutylether-e-cyclodextrin sodium salt at a concentration of about 1% (w/v) and a buffer further being potassium phosphate at a concentration of about 10 mM, the formulation further comprising sucrose at a concentration of about 8% (w/v) and polysorbate 80 at a concentration of about 0.01% (w/v) at a pH of about 6.0.
[0015] Figura 1: Quantificação de espécies de alto peso molecular e do conformador por cromatografia líquida de resolução ultra elevada de exclusão de tamanho (SE-UPLC) em preparações AMG 330 (SEQ ID NO: 100) contendo polissorbato 20, 80 ou HP-β-CD.[0015] Figure 1: Quantification of high molecular weight species and conformer by size exclusion ultra high performance liquid chromatography (SE-UPLC) in AMG 330 (SEQ ID NO: 100) preparations containing polysorbate 20, 80 or HP-β-CD.
[0016] Figura 2: Efeito do polissorbato (PS) 20, 80 e HP-β-CD na quantidade de espécies não monoméricas (incluindo conformadores, dímeros, agregados) em preparações de AMG 330 em função dos fatores de tensão: sem tensão (A), formação de espuma (B) e 10 ciclos de congelamento/degelo (C). A quantificação de espécies foi atingida por cromatografia de cromatografia de desempenho ultra elevado (SE- UPLC). A concentração de proteína foi abordada pelo mesmo ensaio (detecção A280).[0016] Figure 2: Effect of polysorbate (PS) 20, 80 and HP-β-CD on the amount of non-monomeric species (including conformers, dimers, aggregates) in AMG 330 preparations as a function of stress factors: no stress (A), foaming (B) and 10 freeze/thaw cycles (C). Species quantification was achieved by ultra-high performance liquid chromatography (SE-UPLC). Protein concentration was addressed by the same assay (A280 detection).
[0017] Figura 3: Efeito dependente da concentração de HP-β-CD e SBE-β-CD na propensão de agregação (medida por densidade ótica a 350 nm; densidades óticas referem-se a um comprimento de caminho de 10 mm) de AMG 103 na presença de 0,9% (V/V) de álcool benzílico. .[0017] Figure 3: Concentration-dependent effect of HP-β-CD and SBE-β-CD on the aggregation propensity (measured by optical density at 350 nm; optical densities refer to a 10 mm path length) of AMG 103 in the presence of 0.9% (V/V) benzyl alcohol. .
[0018] Figura 4: Medidas de intensidade de emissão de fluorescência intrínseca de AMG 103 antes (A) e após (B) a incubação a 37°C durante 24 horas na presença de 0,9% (V/V) de álcool benzílico.[0018] Figure 4: Intrinsic fluorescence emission intensity measurements of AMG 103 before (A) and after (B) incubation at 37°C for 24 hours in the presence of 0.9% (V/V) benzyl alcohol.
[0019] Figura 5: Modelos preditivos derivados de estudos de concepção experimental (fatorial completo de 4 fatores de nível 2) descrevendo o efeito de concentrações crescentes de HP-β-CD (A) e SBE-β-CD (B) em densidade ótica a 350 nm de preparações de AMG 103 (SEQ ID NO: 174).[0019] Figure 5: Predictive models derived from experimental design studies (level 2 4-factor full factorial) describing the effect of increasing concentrations of HP-β-CD (A) and SBE-β-CD (B) on optical density at 350 nm of AMG 103 (SEQ ID NO: 174) preparations.
[0020] Figura 6: Avaliação de espécies de alto peso molecular (HMWS) por cromatografia de exclusão de tamanho em diferentes formulações contendo 5 mg/mL de CD33_2-hALB (SEQ ID NO: 175).[0020] Figure 6: Assessment of high molecular weight species (HMWS) by size exclusion chromatography in different formulations containing 5 mg/mL CD33_2-hALB (SEQ ID NO: 175).
[0021] Figura 7: Taxa de formação de espécies com elevado peso molecular a 25°C e 37°C para três formulações diferentes de MSLN- hALB (SEQ ID NO: 176) (K60RTrT (A), K60SBESuT (B) e K60RMSuT (C)) determinada pela cromatografia de exclusão de tamanho (SEC)[0021] Figure 7: Rate of formation of high molecular weight species at 25°C and 37°C for three different formulations of MSLN-hALB (SEQ ID NO: 176) (K60RTrT (A), K60SBESuT (B) and K60RMSuT (C)) determined by size exclusion chromatography (SEC)
[0022] Figura 8: Formação de variantes de carga ácida a 25°C e 37°C para três formulações diferentes de MSLN-hALB determinadas por cromatografia líquida de desempenho ultraelevado de permuta catiônica fraca (WCX-UPLC)[0022] Figure 8: Formation of acidic charge variants at 25°C and 37°C for three different MSLN-hALB formulations determined by weak cation exchange ultrahigh performance liquid chromatography (WCX-UPLC)
[0023] Figura 9. Solubilidade de AMG 330 a 40C na presença de 12% de PEG-3350. Tanto o SBE-β-CD (Captisol) como o Alginato (Protanal) aumentam a solubilidade do AMG 330 agregado e monomérico quando usados em concentrações mais altas. No entanto, o SBE-β-CD solubiliza preferencialmente o monômero. O controle à esquerda (1X PBS) foi incubado sem SBE-β-CD, enquanto que o controle à direita (1X PBS) foi incubado sem PEG e SBE-β-CD.[0023] Figure 9. Solubility of AMG 330 at 40C in the presence of 12% PEG-3350. Both SBE-β-CD (Captisol) and Alginate (Protanal) increase the solubility of both aggregated and monomeric AMG 330 when used at higher concentrations. However, SBE-β-CD preferentially solubilizes the monomer. The control on the left (1X PBS) was incubated without SBE-β-CD, while the control on the right (1X PBS) was incubated without PEG and SBE-β-CD.
[0024] Figura 10: Dados do mesmo experimento, como mostrado na Figura 9, que demonstram o efeito de diferentes concentrações de SBE-β-CD e Alginato em % de monômero e % de agregados em AMG 330. O SBE-β-CD a ~ 0,1-1% é eficaz em aumentar o teor de monômero à custa dos agregados (mostrado por setas verdes). Em contraste, os dados de alginato mostram uma tendência oposta de agregados crescentes (mostrados por uma seta vermelha). O SBE-β-CD também mostrou reduzir o impacto negativo da superconcentração, nesse caso.[0024] Figure 10: Data from the same experiment as shown in Figure 9 demonstrating the effect of different concentrations of SBE-β-CD and Alginate on % monomer and % aggregates in AMG 330. SBE-β-CD at ~0.1-1% is effective in increasing monomer content at the expense of aggregates (shown by green arrows). In contrast, the alginate data shows an opposite trend of increasing aggregates (shown by a red arrow). SBE-β-CD was also shown to reduce the negative impact of overconcentration in this case.
[0025] Figura 11: Área média de pico relativo de SEC de AMG 330 após a permuta de tampão e concentração de proteínas por ultrafiltração/centrifugação.[0025] Figure 11: Mean relative SEC peak area of AMG 330 after buffer exchange and protein concentration by ultrafiltration/centrifugation.
[0026] Figura 12. A: Resumo das concentrações máximas de AMG 330 obtidas por superconcentração, calculadas pelo pico principal de SEC + HMW. As formulações de SBE-β-CD (indicadas por asteriscos) atingiram concentrações mais elevadas e mantiveram percentuais mais altos de monômero. B: Dados do mesmo experimento, como mostrado na Figura 12A, onde o AMG 330 foi concentrado até 7-8 mg/mL na presença de concentrações crescentes de SBE-β-CD com ou sem glicina e sacarose (ver asteriscos). O controle à esquerda foi concentrado sem SBE-β-CD. O controle à direita não foi concentrado além da sua concentração inicial de 0,4 mg/ml. Uma amostra adicional marcada como "2% de glicina, 1% de sacarose" foi concentrada sem SBE-β-CD para demonstrar a vantagem do uso do SBE-β-CD. C: áreas de pico relativo de AMG 330 CEX após 5 dias de incubação a 4°C, média de duas repetições. Todas as amostras contêm 20 mM de citrato, 0,01% de PS-80, pH 6,0. D: Área de pico principal relativa de AMG 330 após a análise de SEC. Todas as amostras também incluem citrato de 20 mM, PS-80 a 0,01%, pH 6,0.[0026] Figure 12. A: Summary of maximum AMG 330 concentrations obtained by superconcentration, calculated from the main SEC + HMW peak. SBE-β-CD formulations (indicated by asterisks) achieved higher concentrations and maintained higher percentages of monomer. B: Data from the same experiment as shown in Figure 12A, where AMG 330 was concentrated to 7–8 mg/mL in the presence of increasing concentrations of SBE-β-CD with or without glycine and sucrose (see asterisks). The control on the left was concentrated without SBE-β-CD. The control on the right was not concentrated beyond its starting concentration of 0.4 mg/mL. An additional sample labeled “2% glycine, 1% sucrose” was concentrated without SBE-β-CD to demonstrate the advantage of using SBE-β-CD. C: Relative peak areas of AMG 330 CEX after 5 days of incubation at 4°C, average of two replicates. All samples contain 20 mM citrate, 0.01% PS-80, pH 6.0. D: Relative major peak area of AMG 330 after SEC analysis. All samples also include 20 mM citrate, 0.01% PS-80, pH 6.0.
[0027] Figura 13: Concentração de AMG 330 calculada a partir do pico principal de SEC + HMW.[0027] Figure 13: AMG 330 concentration calculated from the main peak of SEC + HMW.
[0028] Figura 14: área de pico relativo de AMG 330 de SEC após permuta e concentração de tampão.[0028] Figure 14: Relative peak area of AMG 330 from SEC after buffer exchange and concentration.
[0029] Figura 15: Pico total das áreas de pico de AMG 330 SEC (pico principal + HMW) após incubação com várias ciclodextrinas[0029] Figure 15: Total peak areas of AMG 330 SEC (main peak + HMW) after incubation with various cyclodextrins
[0030] Figura 16: AMG 330 em 13 formulações diferentes a 1 mg/mL e armazenadas a -20, -30 e -700°C por até 6 semanas.[0030] Figure 16: AMG 330 in 13 different formulations at 1 mg/mL and stored at -20, -30 and -700°C for up to 6 weeks.
[0031] Figura 17: A: Embora o SBE-β-CD a 0,5% possa não ser totalmente suficiente para fornecer um bolo de lyo elegante por si só, ele é compatível com agentes de volume mais comuns, como glicina e manitol. Todos esses bolos de lyo reconstituíram-se bem e produziram pouca ou nenhuma agregação ou particulação na presença do SBE-β- CD. B: O uso de SBE-β-CD (cromatograma azul, indicado por uma seta), mas não o α-ciclodextrano (cromatograma rosa, indicado por uma seta) reduz o percentual de agregação pós-reconstituição. A formulação de controle sem nenhuma ciclodextrina (em uma linha preta espessa) também apresenta um nível elevado de agregados, embora menor do que o α-ciclodextrano. Esses resultados demonstram a vantagem do uso de SBE-β-CD. C: SEC analítica de diferentes formulações (pré e pós representam pré-liofilização e pós-constituição). D: Análise de MFI de diferentes formulações após liofilização.[0031] Figure 17: A: Although 0.5% SBE-β-CD may not be entirely sufficient to provide an elegant lyo bolus by itself, it is compatible with more common bulking agents such as glycine and mannitol. All of these lyo bolus reconstituted well and produced little to no aggregation or particulate matter in the presence of SBE-β-CD. B: The use of SBE-β-CD (blue chromatogram, indicated by an arrow) but not α-cyclodextran (pink chromatogram, indicated by an arrow) reduces the percentage of post-reconstitution aggregation. The control formulation without any cyclodextrin (in a thick black line) also shows a high level of aggregates, although less than α-cyclodextran. These results demonstrate the advantage of using SBE-β-CD. C: Analytical SEC of different formulations (pre and post represent pre-lyophilization and post-constitution). D: MFI analysis of different formulations after lyophilization.
[0032] Figura 18. Resumo das concentrações máximas de Fapα BiTE® (SEQ ID NO: 177) alcançadas por superconcentração. As formulações de SBE-β-CD (indicadas por asteriscos) atingiram concentrações de proteína mais elevadas em comparação com o α- ciclodextrano e mantiveram percentuais mais altos de monômero. As formulações de α-ciclodextrano perderam a maior parte da sua proteína solúvel devido à precipitação.[0032] Figure 18. Summary of maximum concentrations of Fapα BiTE® (SEQ ID NO: 177) achieved by superconcentration. SBE-β-CD formulations (indicated by asterisks) achieved higher protein concentrations compared to α-cyclodextran and maintained higher percentages of monomer. α-cyclodextran formulations lost most of their soluble protein due to precipitation.
[0033] Figura 19. Visão geral sobre o teor percentual de espécies de alto peso molecular (HMWS) determinado por cromatografia de desempenho ultra elevado de exclusão de tamanho (SE-UPLC) em função da formulação de construção de anticorpo CD33-scFc BiTE.[0033] Figure 19. Overview of the percentage content of high molecular weight species (HMWS) determined by size exclusion ultra high performance chromatography (SE-UPLC) as a function of the CD33-scFc BiTE antibody construct formulation.
[0034] Figura 20. Resumo do teor percentual de espécies de elevado peso molecular (HMWS) determinado por cromatografia de desempenho ultraelevado de exclusão de tamanho (SE-UPLC) em função da formulação de construção de anticorpo FLT3-scFc BiTE.[0034] Figure 20. Summary of percent content of high molecular weight species (HMWS) determined by size exclusion ultra-high performance chromatography (SE-UPLC) as a function of FLT3-scFc BiTE antibody construct formulation.
[0035] Figura 21. Visão geral sobre o teor percentual de espécies de alto peso molecular (HMWS) determinado por cromatografia de desempenho ultra elevado de exclusão de tamanho (SE-UPLC) em função da formulação de construção de anticorpo BCMA-scFc BiTE.[0035] Figure 21. Overview of the percentage content of high molecular weight species (HMWS) determined by size exclusion ultra high performance chromatography (SE-UPLC) as a function of the BCMA-scFc BiTE antibody construct formulation.
[0036] Apesar da alta qualidade dos atuais produtos biotecnológicos terapêuticos e da semelhança de proteínas humanas recombinantes e anticorpos com proteínas humanas endógenas, a instabilidade proteica permanece sendo uma preocupação importante. Além das consequências relacionadas à qualidade da agregação proteica, tais como uma possível perda de atividade proteica e estética indesejável do medicamento, os agregados proteicos solúveis têm sido relatados como tendo efeitos citotóxicos significativos e, mais importante, são um fator de risco em potencial para o desenvolvimento de uma resposta imunológica a produtos proteicos.[0036] Despite the high quality of current therapeutic biotechnological products and the similarity of recombinant human proteins and antibodies to endogenous human proteins, protein instability remains a major concern. In addition to the consequences related to the quality of protein aggregation, such as a possible loss of protein activity and undesirable aesthetics of the drug, soluble protein aggregates have been reported to have significant cytotoxic effects and, more importantly, are a potential risk factor for the development of an immune response to protein products.
[0037] A agregação de proteínas pode ocorrer durante vários pontos ao longo da vida útil de uma proteína, incluindo a fermentação, o redobramento, a purificação, o enchimento, o transporte, o armazenamento ou a administração, e é intensamente dependente de vários fatores ambientais. Há uma necessidade crítica na técnica de aumentar a estabilidade e reduzir a agregação de proteínas terapêuticas; e as formulações farmacêuticas otimizadas podem ajudar a fazê-lo. Os presentes inventores investigaram os efeitos de diferentes ciclodextrinas na agregação de construções de anticorpos biespecíficas (especificamente, conectores de células T bi-específicas, BiTE®) quando expostas a diversos fatores de tensão ambiental. Surpreendentemente, os inventores descobriram que as construções de anticorpos poderiam ser significativamente estabilizadas na presença de ciclodextrinas e, em particular, β-ciclodextrinas.[0037] Protein aggregation can occur at various points throughout a protein's lifespan, including fermentation, refolding, purification, filling, transport, storage, or administration, and is highly dependent on a variety of environmental factors. There is a critical need in the art to increase the stability and reduce aggregation of therapeutic proteins; and optimized pharmaceutical formulations can help to do so. The present inventors investigated the effects of different cyclodextrins on the aggregation of bispecific antibody constructs (specifically, bispecific T-cell connectors, BiTE®) when exposed to a variety of environmental stressors. Surprisingly, the inventors found that the antibody constructs could be significantly stabilized in the presence of cyclodextrins, and in particular, β-cyclodextrins.
[0038] Assim, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica estável compreendendo a) uma construção de anticorpo de cadeia simples biespecífica, ligando-se a um antígeno da superfície de célula-alvo através de um primeiro domínio de ligação e ao antígeno CD3 da superfície das células T através de um segundo domínio de ligação, b) -ciclodextrina e c) um tampão.[0038] Thus, the present invention provides a stable pharmaceutical composition comprising a) a bispecific single chain antibody construct, binding to a target cell surface antigen via a first binding domain and to T cell surface antigen CD3 via a second binding domain, b) β-cyclodextrin and c) a buffer.
[0039] Quanto à presente invenção, o termo "estabilidade" ou "estabilização" refere-se à estabilidade da composição farmacêutica no total e em particular à estabilidade do ingrediente ativo (isto é, a construção de anticorpo de cadeia simples biespecífica), especificamente durante a formulação, o enchimento, o transporte, o armazenamento e a administração. Os termos "estabilidade" ou "estável" no contexto da composição farmacêutica da invenção e da construção de anticorpo de cadeia simples biespecífica referem-se particularmente à redução ou prevenção da formação de agregados de proteína (HMWS). Especificamente, o termo "estabilidade" também se relaciona com a estabilidade coloidal das construções de anticorpo de cadeia simples biespecíficas compreendidas na composição farmacêutica aqui descrita. "Estabilidade coloidal" é a capacidade de partículas coloidais (como proteínas) permanecerem dispersas em líquidos por um período prolongado de tempo (de dias a anos).[0039] As to the present invention, the term "stability" or "stabilization" refers to the stability of the pharmaceutical composition in total and in particular to the stability of the active ingredient (i.e., the bispecific single chain antibody construct), specifically during formulation, filling, shipping, storage and administration. The terms "stability" or "stable" in the context of the pharmaceutical composition of the invention and the bispecific single chain antibody construct particularly refer to the reduction or prevention of the formation of protein aggregates (HMWS). Specifically, the term "stability" also relates to the colloidal stability of the bispecific single chain antibody constructs comprised in the pharmaceutical composition described herein. "Colloidal stability" is the ability of colloidal particles (such as proteins) to remain dispersed in liquids for an extended period of time (from days to years).
[0040] O termo "agregado de (proteína)", conforme usado aqui, geralmente engloba espécies de proteínas de maior peso molecular, tais como "oligômeros" ou "multímeros", em vez das espécies definidas desejadas (por exemplo, um monômero). O termo é utilizado aqui intercambiavelmente com os termos "espécies de elevado peso molecular" e "HMWS". Os agregados de proteína geralmente podem diferir em tamanho (variando de pequenos (dímeros) a grandes conjuntos (partículas subvisíveis ou visíveis) e da gama de nanômetro a micrômetro), morfologia (de aproximadamente esféricos a fibrilares), estrutura proteica (nativa versus não nativa/desnaturada), tipo de ligação intermolecular (covalente versus não covalente), reversibilidade e solubilidade. Os agregados solúveis cobrem a gama de tamanho de aproximadamente 1 a 100 nm e as partículas proteicas cobrem gamas subvisíveis (~0,1-100 m) e visíveis (> 100 m). Todos os tipos supramencionados de agregados de proteína geralmente são englobados pelo termo. O termo "agregado (de proteína)" refere-se, assim, a todos os tipos de espécies não nativas fisicamente associadas ou quimicamente ligadas de dois ou mais monômeros de proteína.[0040] The term "protein aggregate" as used herein generally encompasses higher molecular weight protein species, such as "oligomers" or "multimers", rather than the desired defined species (e.g., a monomer). The term is used interchangeably herein with the terms "high molecular weight species" and "HMWS". Protein aggregates can generally differ in size (ranging from small (dimers) to large assemblies (subvisible or visible particles) and from the nanometer to micrometer range), morphology (from approximately spherical to fibrillar), protein structure (native versus non-native/denatured), type of intermolecular bonding (covalent versus non-covalent), reversibility, and solubility. Soluble aggregates cover the size range of approximately 1 to 100 nm and protein particles cover the subvisible (~0.1–100 μm) and visible (>100 μm) size ranges. All of the above types of protein aggregates are generally encompassed by the term. The term "protein aggregate" thus refers to all types of physically associated or chemically linked non-native species of two or more protein monomers.
[0041] O termo "agregação de proteína" ou "agregação não nativa" denota, assim, o(s) processo(s) pelo(s) qual(is) as moléculas de proteínas se agrupam em complexos compostos de duas ou mais proteínas, com as proteínas individuais indicadas como monômero. Existem diversas vias que levam à agregação de proteínas que podem ser induzidas por uma ampla variedade de condições, incluindo temperatura, tensão mecânica, como agitar e sacudir, bombeamento, congelamento e/ou descongelamento e formulação.[0041] The term "protein aggregation" or "non-native aggregation" thus denotes the process(es) by which protein molecules assemble into complexes composed of two or more proteins, with the individual proteins indicated as the monomer. There are several pathways leading to protein aggregation that can be induced by a wide variety of conditions, including temperature, mechanical stress such as shaking and shaking, pumping, freezing and/or thawing, and formulation.
[0042] Um aumento na temperatura acelera as reações químicas, como oxidação e desamidação de proteínas, que por sua vez pode promover a agregação. A temperatura mais alta também influencia diretamente a conformação de proteínas no nível da estrutura quaternária, terciária e secundária e pode levar a um desdobramento induzido pela temperatura que pode promover a agregação.[0042] An increase in temperature accelerates chemical reactions such as protein oxidation and deamidation, which in turn can promote aggregation. Higher temperature also directly influences protein conformation at the quaternary, tertiary and secondary structure level and can lead to temperature-induced unfolding that can promote aggregation.
[0043] A desnaturação e a agregação de proteínas podem ocorrer durante o congelamento/degelo devido a complexas alterações físicas e químicas, como a criação de novas interfaces de gelo/solução, adsorção a superfícies de recipientes, crioconcentração da proteína e solutos e alterações de pH devido à cristalização dos componentes do tampão.[0043] Protein denaturation and aggregation can occur during freezing/thawing due to complex physical and chemical changes, such as creation of new ice/solution interfaces, adsorption to container surfaces, freeze-concentration of protein and solutes, and pH changes due to crystallization of buffer components.
[0044] Um aumento na concentração de proteína também pode melhorar a formação de agregados proteicos. Em altas concentrações proteicas, ocorre a aglomeração macromolecular, um termo usado para descrever o efeito da ocupação de volume total elevado por solutos macromoleculares sobre o comportamento de cada espécie macromolecular naquela solução. De acordo com essa teoria do volume excluído, a automontagem e, assim, a agregação potencial podem ser favorecidas.[0044] An increase in protein concentration can also enhance the formation of protein aggregates. At high protein concentrations, macromolecular crowding occurs, a term used to describe the effect of high total volume occupation by macromolecular solutes on the behavior of each macromolecular species in that solution. According to this excluded volume theory, self-assembly and thus potential aggregation may be favored.
[0045] Os conservantes antimicrobianos, tais como álcool benzílico e fenol, frequentemente são necessários em formulações líquidas de proteína para garantir a esterilidade durante a sua vida de prateleira, e adicionalmente, necessários em formulações de diversas doses e certos sistemas de administração de droga, por exemplo, canetas de injeção, minibombas e aplicações tópicas. Muitos conservantes foram relatados para induzir a agregação de proteínas, embora o mecanismo subjacente não seja bem compreendido. Tem sido proposto que os conservantes se ligam e preenchem estados de proteína desdobrados que são propensos à agregação.[0045] Antimicrobial preservatives, such as benzyl alcohol and phenol, are often required in liquid protein formulations to ensure sterility during their shelf life, and are additionally required in multi-dose formulations and certain drug delivery systems, e.g., injection pens, mini-pumps, and topical applications. Many preservatives have been reported to induce protein aggregation, although the underlying mechanism is not well understood. It has been proposed that preservatives bind and fill unfolded protein states that are prone to aggregation.
[0046] Vantajosamente, as composições farmacêuticas da invenção são consideradas estáveis, isto é, permanecerem livres ou substancialmente isentas de agregados proteicos mesmo quando submetidas a tensão, em particular tensão térmica, armazenamento, tensão induzida por superfície (como ciclos de congelamento/degelo, formação de espuma), concentração (por ultra e diafiltração) ou mistura com compostos orgânicos, como conservantes antimicrobianos. Preferencialmente, as composições farmacêuticas podem ter características semelhantes ou mesmo melhoradas em comparação com as composições compreendendo SBE-β-CD ou HP β-CD que foram avaliadas nos Exemplos em anexo. As composições farmacêuticas da invenção são, preferencialmente, soluções homogêneas de construções de anticorpos de cadeia simples biespecíficas monoméricas dispersas.[0046] Advantageously, the pharmaceutical compositions of the invention are considered stable, that is, they remain free or substantially free of protein aggregates even when subjected to stress, in particular thermal stress, storage, surface-induced stress (such as freeze/thaw cycles, foaming), concentration (by ultra- and diafiltration) or mixing with organic compounds such as antimicrobial preservatives. Preferably, the pharmaceutical compositions may have similar or even improved characteristics compared to the compositions comprising SBE-β-CD or HP β-CD that were evaluated in the attached Examples. The pharmaceutical compositions of the invention are preferably homogeneous solutions of dispersed monomeric bispecific single-chain antibody constructs.
[0047] Aqueles versados na técnica apreciarão que, embora a composição farmacêutica proporcione a estabilização do ingrediente ativo (isto é, reduza ou iniba a formação de agregados proteicos da construção de anticorpo de cadeia simples biespecífica) com eficácia, alguns agregados ou conformadores podem ocasionalmente formar, mas sem comprometer substancialmente a usabilidade da composição farmacêutica. Nesse contexto, "substancialmente sem" agregados significa que a quantidade de agregados permanece inferior a 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% (com p/v), também particularmente quando submetidos à tensão do ambiente, por exemplo, conforme avaliado nos Exemplos em anexo.[0047] Those skilled in the art will appreciate that although the pharmaceutical composition effectively provides for stabilization of the active ingredient (i.e., reduces or inhibits the formation of protein aggregates of the bispecific single chain antibody construct), some aggregates or conformers may occasionally form, but without substantially compromising the usability of the pharmaceutical composition. In this context, "substantially free" of aggregates means that the amount of aggregates remains less than 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% or 1% (w/v), also particularly when subjected to environmental stress, for example, as assessed in the attached Examples.
[0048] Os métodos para determinar a presença de agregados proteicos solúveis e insolúveis foram, inter alia, avaliados por Mahler et al., J Pharm Sci. Set de 2009; 98 (9): 2909-34. A formação de agregados de proteína solúvel pode ser avaliada por cromatografia líquida de desempenho ultra elevado de exclusão de tamanho (SE-UPLC), como descrito nos Exemplos em anexo. A SEC é um dos métodos analíticos mais utilizados para a detecção e quantificação de agregados proteicos. A análise de SEC permite o dimensionamento de agregados e a sua quantificação. Com o SEQ-UPLC, é possível a separação seletiva e rápida de macromoléculas com base em sua forma e tamanho (raio hidrodinâmico) em uma gama de peso molecular de cerca de 5-1000 kDa.[0048] Methods for determining the presence of soluble and insoluble protein aggregates have been, inter alia, evaluated by Mahler et al., J Pharm Sci. 2009 Sep;98(9):2909-34. The formation of soluble protein aggregates can be evaluated by size exclusion ultra high performance liquid chromatography (SE-UPLC) as described in the attached Examples. SEC is one of the most widely used analytical methods for the detection and quantification of protein aggregates. SEC analysis allows the sizing of aggregates and their quantification. With SEQ-UPLC, selective and rapid separation of macromolecules based on their shape and size (hydrodynamic radius) in a molecular weight range of about 5-1000 kDa is possible.
[0049] As soluções de proteínas mostram uma propriedade ótica, chamada opalescência ou turbidez. A propriedade ótica de uma solução é uma função das partículas presentes para dispersar e absorver luz. As proteínas são coloides naturais e a turbidez das formulações aquosas depende da concentração de proteínas, da presença de partículas não dissolvidas, do tamanho das partículas e do número de partículas por unidade de volume. A turbidez pode ser medida por espectroscopia UV-Vis como a densidade ótica na gama de 340 a 360 nm e pode ser usada para detectar agregados solúveis e insolúveis.[0049] Protein solutions exhibit an optical property, called opalescence or turbidity. The optical property of a solution is a function of the particles present to scatter and absorb light. Proteins are natural colloids and the turbidity of aqueous formulations depends on the protein concentration, the presence of undissolved particles, the particle size and the number of particles per unit volume. Turbidity can be measured by UV-Vis spectroscopy as the optical density in the range 340 to 360 nm and can be used to detect soluble and insoluble aggregates.
[0050] Além disso, a inspeção de amostras por meios visuais ainda é um aspecto importante da avaliação de agregados de proteínas. A avaliação visual quanto à ausência ou presença de agregados visíveis é preferencialmente realizada de acordo com o Teste 5 do Deutscher Arzneimittel Codex (DAC).[0050] Furthermore, inspection of samples by visual means remains an important aspect of the assessment of protein aggregates. Visual assessment for the absence or presence of visible aggregates is preferably performed according to Test 5 of the Deutscher Arzneimittel Codex (DAC).
[0051] Como estabelecido em outra parte deste documento, considera-se a composição farmacêutica da invenção, muito provavelmente pela ação das β-ciclodextrinas lá compreendidas, favorecendo um aumento da estabilidade coloidal das construções de anticorpo de cadeia simples biespecíficas e, assim, exibindo uma redução ou mesmo ausência de separação de fase sem líquido-de base líquida (LLPS). A LLPS é um evento conduzido em âmbito termodinâmico, em que uma solução de proteína homogênea se separa em uma fase escassa em proteína (geralmente a camada superior) e uma fase rica em proteína (geralmente a camada inferior) com temperaturas decrescentes. A LLPS é, tipicamente, totalmente reversível, simplesmente misturando as duas fases e elevando a temperatura da solução. A ocorrência da LLPS tem sido atribuída a interações proteína-proteína atraentes de curto alcance, tornando-a uma medida da força da atração proteína-proteína. Descobriu-se que as composições farmacêuticas compreendendo as ciclodextrinas de acordo com a invenção compreendem concentrações mais elevadas da construção de anticorpo de cadeia simples biespecífica na fase escassa em proteína de LLPS, em comparação com composições farmacêuticas que não compreendem as ciclodextrinas. Consequentemente, as composições farmacêuticas da invenção são consideradas como apresentando uma LLPS reduzida ou sem LLPS em comparação com controles, promovendo assim uma estabilidade coloidal aumentada das construções de anticorpo de cadeia simples biespecíficas da presente invenção. A LLPS pode ser induzida e o teor de proteína das diferentes fases pode ser examinado conforme descrito nos Exemplos em anexo.[0051] As set forth elsewhere in this document, the pharmaceutical composition of the invention is considered, most likely by the action of the β-cyclodextrins comprised therein, favoring an increase in the colloidal stability of the bispecific single-chain antibody constructs and, thus, exhibiting a reduction or even absence of liquid-liquid-base phase separation (LLPS). LLPS is a thermodynamically driven event in which a homogeneous protein solution separates into a protein-poor phase (usually the upper layer) and a protein-rich phase (usually the lower layer) with decreasing temperatures. LLPS is typically fully reversible, simply by mixing the two phases and raising the temperature of the solution. The occurrence of LLPS has been attributed to short-range attractive protein-protein interactions, making it a measure of the strength of protein-protein attraction. It has been found that pharmaceutical compositions comprising the cyclodextrins according to the invention comprise higher concentrations of the bispecific single chain antibody construct in the LLPS protein-poor phase compared to pharmaceutical compositions not comprising the cyclodextrins. Accordingly, the pharmaceutical compositions of the invention are considered to exhibit reduced or no LLPS compared to controls, thereby promoting increased colloidal stability of the bispecific single chain antibody constructs of the present invention. LLPS can be induced and the protein content of the different phases can be examined as described in the attached Examples.
[0052] A tensão do ambiente também pode, em particular devido à desnaturação térmica e/ou química, levar a alterações conformacionais, que por sua vez favorecem a agregação. Surpreendentemente, os presentes inventores verificaram que as construções de anticorpos de cadeia simples biespecíficas também são estabilizadas em relação às alterações conformacionais, conforme avaliadas medindo-se a intensidade da emissão de fluorescência intrínseca dos aminoácidos aromáticos. A composição farmacêutica da presente invenção, portanto, preferencialmente também reduz ou inibe a formação de conformadores (isto é, espécies proteicas não nativas, dobradas de forma anormal).[0052] Environmental stress can also, in particular due to thermal and/or chemical denaturation, lead to conformational changes, which in turn favor aggregation. Surprisingly, the present inventors have found that bispecific single-chain antibody constructs are also stabilized with respect to conformational changes, as assessed by measuring the intensity of the intrinsic fluorescence emission of aromatic amino acids. The pharmaceutical composition of the present invention therefore preferentially also reduces or inhibits the formation of conformers (i.e., abnormally folded, non-native protein species).
[0053] Como explicado anteriormente, a composição farmacêutica estável da presente invenção compreende uma construção de anticorpo de cadeia simples biespecífica, ligando-se a um antígeno de superfície da célula-alvo através de um domínio de ligação e ao CD3 de antígeno de superfície de células T através de um segundo domínio de ligação.[0053] As explained above, the stable pharmaceutical composition of the present invention comprises a bispecific single chain antibody construct, binding to a target cell surface antigen through one binding domain and to the T cell surface antigen CD3 through a second binding domain.
[0054] O termo " construção de anticorpo" geralmente se refere a uma molécula na qual a estrutura e/ou função é baseada na estrutura e/ou função de um anticorpo, por exemplo, de uma molécula de imunoglobulina inteira ou de comprimento total. Um construto de anticorpo é, portanto, capaz de se ligar ao seu-alvo ou antígeno específico. Além disso, um construto de anticorpo de acordo com a invenção compreende os requisitos estruturais mínimos de um anticorpo que permitem a ligação-alvo. Este requisito mínimo pode, por exemplo, ser definido pela presença dos pelo menos três CDRs de cadeia leve (isto é, CDR1, CDR2 e CDR3 da região VL) e/ou as três CDRs de cadeia pesada (isto é, CDR1, CDR2 e CDR3 da região VH). Os anticorpos em que as construções descritas aqui são baseadas, por exemplo, em anticorpos monoclônicos, recombinantes, quiméricos, imunizados, humanizados e humanos.[0054] The term "antibody construct" generally refers to a molecule in which the structure and/or function is based on the structure and/or function of an antibody, for example of a whole or full-length immunoglobulin molecule. An antibody construct is therefore capable of binding to its specific target or antigen. Furthermore, an antibody construct according to the invention comprises the minimum structural requirements of an antibody that allow target binding. This minimum requirement may, for example, be defined by the presence of the at least three light chain CDRs (i.e. CDR1, CDR2 and CDR3 of the VL region) and/or the three heavy chain CDRs (i.e. CDR1, CDR2 and CDR3 of the VH region). The antibodies on which the constructs described herein are based are, for example, monoclonal, recombinant, chimeric, immunized, humanized and human antibodies.
[0055] Dentro da definição de "construtos de anticorpos" encontram-se os anticorpos completos ou de comprimento total, incluindo anticorpos de camelídeo e outros anticorpos de imunoglobulina gerados por métodos ou processos de manipulação de proteína ou biotecnológicos. Esses anticorpos de comprimento total podem ser, por exemplo, anticorpos monoclônicos, recombinantes, quiméricos, imunizados, humanizados e humanos. Também fazem parte da definição de "construções de anticorpos" os fragmentos de anticorpos completos, como VH, VHH, VL, (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 ou "r IgG". ("meio anticorpo"). As construções de anticorpos também podem ser fragmentos modificados de anticorpos, também denominados variantes de anticorpo, como scFv, di-scFv ou bi(s)-scFv, scFv-Fc, zíper de scFv, scFab, Fab2, Fab3, diacorpos, diacorpos de cadeia simples, diacorpos em tandem (Tandab's), di-scFv em tandem, tri-scFv em tandem, "minicorpos" exemplificados por uma estrutura que é: (VH-VL-CH3)2, (scFv-CH3)2 ou (scFv-CH3-scFv)2, multicorpos, tais como triacorpos ou tetracorpos, e anticorpos de domínio simples, tais como nanocorpos ou anticorpos de domínio variável simples, compreendendo apenas um domínio variável, que pode ser VHH, VNAR VH ou VL, que se liga especificamente a um antígeno ou epítopo independentemente de outras regiões ou domínios V. Também são englobadas pelo termo " construção de anticorpo" as construção de anticorpo de domínio simples compostos de (pelo menos) dois anticorpos monoclônicos de domínio simples que são individualmente selecionadas do grupo compreendendo VH, VL, VHH e VNAR e um ligante. O ligante, preferencialmente, encontra-se na forma de um ligante peptídico. De modo semelhante, um "mAb de domínio único de scFv" é uma construção de anticorpo monoclonal composto por pelo menos um anticorpo de domínio único como descrito acima e uma molécula de scFv como descrito acima. Novamente, o ligante preferencialmente está na forma de um ligante peptídico.[0055] Within the definition of "antibody constructs" are complete or full-length antibodies, including camelid antibodies and other immunoglobulin antibodies generated by protein engineering or biotechnological methods or processes. Such full-length antibodies may be, for example, monoclonal, recombinant, chimeric, immunized, humanized and human antibodies. Also within the definition of "antibody constructs" are fragments of complete antibodies, such as VH, VHH, VL, (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 or "r IgG". ("half antibody"). Antibody constructs can also be modified fragments of antibodies, also termed antibody variants, such as scFv, di-scFv or bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFv zipper, scFab, Fab2, Fab3, diabodies, single chain diabodies, tandem diabodies (Tandab's), tandem di-scFv, tandem tri-scFv, "minibodies" exemplified by a structure that is: (VH-VL-CH3)2, (scFv-CH3)2, or (scFv-CH3-scFv)2, multibodies such as triabodies or tetrabodies, and single domain antibodies such as nanobodies or single variable domain antibodies comprising only one variable domain, which may be VHH, VNAR VH, or VL, that specifically binds to an antigen or epitope independently of other regions or domains. V. Also encompassed by the term "antibody construct" are single domain antibody constructs composed of (at least) two single domain monoclonal antibodies that are individually selected from the group comprising VH, VL, VHH and VNAR and a linker. The linker is preferably in the form of a peptide linker. Similarly, a "scFv single domain mAb" is a monoclonal antibody construct composed of at least one single domain antibody as described above and a scFv molecule as described above. Again, the linker is preferably in the form of a peptide linker.
[0056] Além disso, a definição do termo " construção de anticorpo" geralmente inclui construções monovalentes, bivalentes e polivalentes/multivalentes e, portanto, construção monoespecíficas, ligando-se especificamente a apenas uma estrutura antigênica, bem como construções biespecíficas e poliespecíficas/multispecíficas, que especificamente ligam mais do que uma estrutura antigênica, por exemplo duas, três ou mais, através de diferentes domínios de ligação. Além disso, a definição do termo "construções de anticorpo" inclui moléculas que consistem em apenas uma cadeia polipeptídica, bem como moléculas que consistem em mais de uma cadeia polipeptídica, cadeias as quais que podem ser idênticas (homodímeros, homotrímeros ou homooligômeros) ou diferentes (heterodímero, heterotrímero ou heterooligômero). No contexto da presente invenção, as construções de anticorpos de cadeia simples biespecífica que se ligam a um antígeno de superfície das células-alvo por um primeiro domínio de ligação e ao CD3 do antígeno de superfície de células T através de um segundo domínio de ligação são particularmente visadas.[0056] Furthermore, the definition of the term "antibody construct" generally includes monovalent, bivalent and polyvalent/multivalent constructs and therefore monospecific constructs, specifically binding to only one antigenic structure, as well as bispecific and polyspecific/multispecific constructs, which specifically bind more than one antigenic structure, for example two, three or more, through different binding domains. Furthermore, the definition of the term "antibody constructs" includes molecules consisting of only one polypeptide chain, as well as molecules consisting of more than one polypeptide chain, which chains may be identical (homodimers, homotrimers or homooligomers) or different (heterodimer, heterotrimer or heterooligomer). In the context of the present invention, bispecific single chain antibody constructs that bind to a target cell surface antigen via a first binding domain and to the T cell surface antigen CD3 via a second binding domain are particularly envisaged.
[0057] O termo "domínio de ligação" caracteriza um domínio que (especificamente) se liga a/interage com/reconhece um determinado epítopo-alvo ou um determinado local-alvo nas moléculas-alvo (antígenos). Os domínios de ligação estão preferencialmente na forma de polipeptídeos. Esses polipeptídeos podem incluir partes proteináceas e partes não proteináceas (por exemplo, ligantes químicos ou agentes de reticulação química, tais como glutaraldeído). As proteínas (incluindo os seus fragmentos, preferencialmente fragmentos biologicamente activos e péptidos, geralmente com menos de 30 aminoácidos) compreendem dois ou mais aminoácidos acoplados entre si através de uma ligação peptídica covalente (resultando em uma cadeia de aminoácidos). O termo "polipeptídeo", tal como aqui utilizado, descreve um grupo de moléculas, que geralmente consistem em mais de 30 aminoácidos. Os polipeptídeos podem ainda formar multímeros, como dímeros, trímeros e oligômeros superiores, isto é, constituído em mais de uma molécula polipeptídica. As moléculas polipeptídica que formam esses dímeros, trímeros etc. podem ser idênticas ou não idênticas. As estruturas de ordem superior correspondentes desses multímeros são, consequentemente, denominados homo ou heterodímeros, homo ou heterotrímeros, etc. Um exemplo de um hereteromultímero é uma molécula de anticorpo que, na sua forma natural, consiste em duas cadeias de polipeptídeos leves idênticas e duas cadeias polipeptídicas pesadas idênticas. Os termos "peptídeo", "polipeptídeo" e "proteína" também se referem a peptídeos/polipeptídeos/proteínas naturalmente modificados em que a modificação é efetuada, por exemplo, por modificações pós-tradução, como glicosilação, acetilação, fosforilação e semelhantes. Um "peptídeo", "polipeptídeo" ou "proteína", quando referido aqui, também pode ser quimicamente modificado, por exemplo: peguilado. Essas modificações são bem conhecidas na técnica e são descritas abaixo.[0057] The term "binding domain" characterizes a domain that (specifically) binds to/interacts with/recognizes a particular target epitope or a particular target site on target molecules (antigens). Binding domains are preferably in the form of polypeptides. Such polypeptides may include proteinaceous parts and non-proteinaceous parts (e.g. chemical linkers or chemical cross-linking agents such as glutaraldehyde). Proteins (including their fragments, preferably biologically active fragments and peptides, generally less than 30 amino acids) comprise two or more amino acids coupled together by a covalent peptide bond (resulting in an amino acid chain). The term "polypeptide" as used herein describes a group of molecules, which generally consist of more than 30 amino acids. Polypeptides can also form multimers such as dimers, trimers and higher oligomers, i.e. consisting of more than one polypeptide molecule. The polypeptide molecules forming these dimers, trimers etc. may be identical or non-identical. The corresponding higher-order structures of these multimers are consequently called homo- or heterodimers, homo- or heterotrimers, etc. An example of a hereteromultimer is an antibody molecule which in its natural form consists of two identical light polypeptide chains and two identical heavy polypeptide chains. The terms "peptide", "polypeptide" and "protein" also refer to naturally modified peptides/polypeptides/proteins where the modification is effected, for example, by post-translational modifications such as glycosylation, acetylation, phosphorylation and the like. A "peptide", "polypeptide" or "protein" when referred to herein may also be chemically modified, e.g., pegylated. Such modifications are well known in the art and are described below.
[0058] A estrutura e a função do primeiro domínio de ligação, e de preferência também a estrutura e/ou a função do segundo domínio de ligação é/são baseada(s) na estrutura e/ou função de um anticorpo, por exemplo, de uma molécula de imunoglobulina completa ou de comprimento total. O primeiro domínio de ligação é caracterizado pela presença de três CDRs de cadeia leve (isto é, CDR1, CDR2 e CDR3 da região leve variável [VL]) e três CDRs de cadeia pesada (isto é, CDR1, CDR2 e CDR3 da região pesada variável [VH]). O segundo domínio de ligação preferencialmente também compreende os requisitos estruturais mínimos de um anticorpo que permitem a ligação-alvo. Mais preferencialmente, o segundo domínio de ligação compreende pelo menos três CDRs de cadeia leve (isto é, CDR1, CDR2 e CDR3 da região VL) e/ou três CDRs de cadeia pesada (isto é, CDR1, CDR2 e CDR3 da região VH).[0058] The structure and function of the first binding domain, and preferably also the structure and/or function of the second binding domain is/are based on the structure and/or function of an antibody, e.g. of a complete or full-length immunoglobulin molecule. The first binding domain is characterized by the presence of three light chain CDRs (i.e., CDR1, CDR2 and CDR3 of the variable light region [VL]) and three heavy chain CDRs (i.e., CDR1, CDR2 and CDR3 of the variable heavy region [VH]). The second binding domain preferably also comprises the minimum structural requirements of an antibody that allow target binding. More preferably, the second binding domain comprises at least three light chain CDRs (i.e., CDR1, CDR2 and CDR3 of the VL region) and/or three heavy chain CDRs (i.e., CDR1, CDR2 and CDR3 of the VH region).
[0059] Como mencionou-se acima, um domínio de ligação pode tipicamente compreender uma região variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e uma região variável de cadeia pesada de anticorpo (VH); no entanto, não tem que compreender ambos. Os fragmentos de Fd, por exemplo, têm duas regiões de VH e, muitas vezes, retêm certa função de ligação ao antígeno do domínio de ligação ao antígeno intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo de ligação a antígeno (modificados) incluem (1) um fragmento Fab, um fragmento monovalente com os domínios VL, VH, CL e CH1; (2) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente possuindo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfureto na região de dobradiça; (3) um fragmento Fd possuindo os dois domínios VH e CH1; (4) um fragmento Fv possuindo os domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (5) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que possui um domínio VH; (6) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR) e (7) um Fv de cadeia simples (scFv).[0059] As mentioned above, a binding domain can typically comprise an antibody light chain variable region (VL) and an antibody heavy chain variable region (VH); however, it does not have to comprise both. Fd fragments, for example, have two VH regions and often retain some antigen-binding function of the intact antigen-binding domain. Examples of (modified) antigen-binding antibody fragments include (1) a Fab fragment, a monovalent fragment having VL, VH, CL, and CH1 domains; (2) an F(ab')2 fragment, a bivalent fragment having two Fab fragments linked by a disulfide bridge in the hinge region; (3) an Fd fragment having both VH and CH1 domains; (4) an Fv fragment possessing the VL and VH domains of a single arm of an antibody, (5) a dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), which possesses a VH domain; (6) an isolated complementarity determining region (CDR) and (7) a single chain Fv (scFv).
[0060] O termo "variável" refere-se às porções do anticorpo ou domínios de imunoglobulina que apresentam uma variabilidade na sua sequência e que estão envolvidos na determinação da especificidade e da afinidade de ligação de um anticorpo em particular (isto é, o(s) "domínio(s) variável(is)"). O emparelhamento de uma cadeia pesada variável (VH) e uma cadeia leve variável (VL) em conjunto formam um único local de ligação a antígeno. O domínio CH mais proximal a VH é designado como CH1. Cada cadeia leve (L) está ligada a uma cadeia pesada (H) por uma ligação de dissulfureto covalente, enquanto que as duas cadeias H estão ligadas entre si por uma ou mais ligações de dissulfureto, dependendo do isotipo da cadeia H.[0060] The term "variable" refers to those portions of the antibody or immunoglobulin domains that exhibit variability in their sequence and that are involved in determining the specificity and binding affinity of a particular antibody (i.e., the "variable domain(s)"). The pairing of a variable heavy chain (VH) and a variable light chain (VL) together form a single antigen-binding site. The CH domain most proximal to the VH is designated CH1. Each light chain (L) is linked to a heavy chain (H) by a covalent disulfide bond, while the two H chains are linked to each other by one or more disulfide bonds, depending on the isotype of the H chain.
[0061] A variabilidade não é distribuída uniformemente em todos os domínios variáveis dos anticorpos; está concentrado em subdomínios de cada uma das regiões variáveis da cadeia pesada e leve. Esses subdomínios são chamados de "regiões hipervariáveis" ou "regiões determinantes da complementaridade" (CDRs). As CDRs contêm a maioria dos resíduos responsáveis pelas interações específicas do anticorpo com o antígeno e, assim, contribuem para a atividade funcional de uma molécula de anticorpo: elas são os principais determinantes da especificidade do antígeno.[0061] Variability is not evenly distributed throughout the variable domains of antibodies; it is concentrated in subdomains of each of the heavy and light chain variable regions. These subdomains are called "hypervariable regions" or "complementarity-determining regions" (CDRs). CDRs contain most of the residues responsible for antibody-antigen-specific interactions and thus contribute to the functional activity of an antibody molecule: they are the major determinants of antigen specificity.
[0062] Os limites e comprimentos de CDR de definição exata estão sujeitos a diferentes sistemas de classificação e numeração. As CDRs podem, portanto, ser referidas como Kabat, Chothia, contato ou quaisquer outras definições de limites, incluindo o sistema de numeração aqui descrito. Apesar dos diferentes limites, cada um desses sistemas tem algum grau de sobreposição no que constitui as chamadas "regiões hipervariáveis" dentro das sequências variáveis. As definições de CDR, de acordo com esses sistemas podem, portanto, diferir em comprimento e áreas de limite em relação à região de estrutura adjacente. Vide, por exemplo, Kabat (uma abordagem baseada na variabilidade da sequência de espécies cruzadas), Chothia (uma abordagem baseada em estudos cristalográficos de complexos antígeno-anticorpo) e/ou MacCallum (Kabat et al., loc. cit.; Chothia et al., J. MoI. Biol, 1987, 196: 901-917; e MacCallum et al., J. MoI. Biol, 1996, 262: 732). Ainda outro padrão para caracterizar o sítio de ligação ao antígeno é a definição AbM usada pelo software de modelagem de anticorpos AbM da Oxford Molecular. Ver, por exemplo, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. e Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). Na medida em que duas técnicas de identificação de resíduos definem regiões de sobreposição, mas não regiões idênticas, elas podem ser combinadas para definir uma CDR híbrida. No entanto, a numeração de acordo com o chamado sistema de Kabat é preferida.[0062] The exact definition CDR boundaries and lengths are subject to different classification and numbering systems. CDRs may therefore be referred to as Kabat, Chothia, contact or any other boundary definitions including the numbering system described herein. Despite the different boundaries, each of these systems has some degree of overlap in what constitutes so-called "hypervariable regions" within the variable sequences. CDR definitions according to these systems may therefore differ in length and boundary areas relative to the adjacent framework region. See, for example, Kabat (an approach based on cross-species sequence variability), Chothia (an approach based on crystallographic studies of antigen-antibody complexes), and/or MacCallum (Kabat et al., loc. cit.; Chothia et al., J. MoI. Biol., 1987, 196: 901-917; and MacCallum et al., J. MoI. Biol., 1996, 262: 732). Yet another standard for characterizing the antigen-binding site is the AbM definition used by Oxford Molecular's AbM antibody modeling software. See, for example, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). To the extent that two residue identification techniques define regions of overlap but not identical regions, they can be combined to define a hybrid CDR. However, numbering according to the so-called Kabat system is preferred.
[0063] Normalmente, as CDRs formam uma estrutura de loop que pode ser classificada como uma estrutura canônica. O termo "estrutura canônica" refere-se à conformação da cadeia principal que é adotada pelos loops de ligação ao antígeno (CDR). A partir de estudos estruturais comparativos, verificou-se que cinco dos seis laços de ligação ao antígeno possuem apenas um repertório limitado de conformações disponíveis. Cada estrutura canônica pode ser caracterizada pelos ângulos de torção da estrutura polipeptídica. Os loops correspondentes entre os anticorpos podem, portanto, ter estruturas tridimensionais muito similares, apesar da alta variabilidade da sequência de aminoácidos na maior parte dos loops (Chothia e Lesk, J. MoI. Biol., 1987, 196: 901; Chothia et al., Nature, 1989, 342: 877; Martin e Thornton, J. MoI. Biol, 1996, 263: 800). Além disso, há uma relação entre a estrutura de loop adotada e as sequências de aminoácidos que o cercam. A conformação de uma determinada classe canônica é determinada pelo comprimento do loop e os resíduos de aminoácidos que residem nas posições-chave dentro do loop, bem como dentro da estrutura conservada (isto é, fora do loop). A atribuição a uma classe canônica em particular pode, portanto, ser feita com base na presença desses resíduos de aminoácidos essenciais.[0063] Typically, CDRs form a loop structure that can be classified as a canonical structure. The term "canonical structure" refers to the main chain conformation that is adopted by antigen-binding loops (CDRs). From comparative structural studies, it has been found that five of the six antigen-binding loops have only a limited repertoire of conformations available. Each canonical structure can be characterized by the torsion angles of the polypeptide backbone. Corresponding loops among antibodies can therefore have very similar three-dimensional structures, despite the high variability of the amino acid sequence in most of the loops (Chothia and Lesk, J. MoI. Biol., 1987, 196: 901; Chothia et al., Nature, 1989, 342: 877; Martin and Thornton, J. MoI. Biol., 1996, 263: 800). Furthermore, there is a relationship between the adopted loop structure and the amino acid sequences surrounding it. The conformation of a given canonical class is determined by the length of the loop and the amino acid residues that reside at key positions within the loop as well as within the conserved structure (i.e., outside the loop). Assignment to a particular canonical class can therefore be made based on the presence of these essential amino acid residues.
[0064] O termo "estrutura canônica" também pode incluir considerações quanto à sequência linear do anticorpo, por exemplo, conforme catalogado por Kabat (Kabat et al., loc. cit.). O esquema de numeração de Kabat (sistema) é um padrão amplamente adotado para numerar os resíduos de aminoácidos de um domínio variável de anticorpo de forma consistente e é o esquema preferido aplicado na presente invenção como também mencionado em outro lugar aqui. Considerações estruturais adicionais também podem ser usadas para determinar a estrutura canônica de um anticorpo. Por exemplo, essas diferenças não refletidas completamente pela numeração de Kabat podem ser descritas pelo sistema de numeração de Chothia et al e/ou revelado por outras técnicas, por exemplo, cristalografia e modelagem computacional bidimensional ou tridimensional. Consequentemente, uma determinada sequência de anticorpos pode ser colocada em uma classe canônica que permita, entre outras coisas, identificar sequências de chassi apropriadas (por exemplo, com base no desejo de incluir uma variedade de estruturas canônicas em uma biblioteca). A numeração de Kabat de sequências de anticorpos de aminoácidos e as considerações estruturais, como descrito por Chothia et al, loc. cit., e suas implicações para a interpretação de aspectos canônicos da estrutura de anticorpos, são descritos na literatura. As estruturas de subunidade e as configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas na técnica. Para uma revisão da estrutura do anticorpo, vide Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988.[0064] The term "canonical structure" may also include considerations as to the linear sequence of the antibody, for example, as catalogued by Kabat (Kabat et al., loc. cit.). The Kabat numbering scheme (system) is a widely adopted standard for numbering the amino acid residues of an antibody variable domain in a consistent manner and is the preferred scheme applied in the present invention as also mentioned elsewhere herein. Additional structural considerations may also be used to determine the canonical structure of an antibody. For example, those differences not fully reflected by the Kabat numbering may be described by the Chothia et al numbering system and/or revealed by other techniques, for example, crystallography and two- or three-dimensional computer modeling. Accordingly, a given antibody sequence may be placed in a canonical class that allows, among other things, identification of appropriate chassis sequences (e.g., based on the desire to include a variety of canonical structures in a library). Kabat numbering of antibody amino acid sequences and structural considerations, as described by Chothia et al, loc. cit., and their implications for the interpretation of canonical aspects of antibody structure, are described in the literature. The subunit structures and three-dimensional configurations of the different classes of immunoglobulins are well known in the art. For a review of antibody structure, see Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988.
[0065] A CDR3 da cadeia leve e, em especial, a CDR3 da cadeia pesada podem constituir os determinantes mais importantes na ligação ao antígeno dentro das regiões variáveis de cadeia leve e pesada. Em algumas construções de anticorpo, a CDR3 de cadeia pesada parece constituir a principal área de contato entre o antígeno e o anticorpo. Esquemas de seleção in vitro, em que a CDR3 apenas é variada, podem ser usados para variar as propriedades de ligação de um anticorpo ou determinar quais os resíduos que contribuem para a ligação de um antigénio. Assim, a CDR3 tipicamente é a maior fonte de diversidade molecular no local de ligação ao anticorpo. H3, por exemplo, pode ser dois resíduos de aminoácidos ou mais do que 26 aminoácidos.[0065] The light chain CDR3 and, in particular, the heavy chain CDR3 may constitute the most important determinants of antigen binding within the light and heavy chain variable regions. In some antibody constructs, the heavy chain CDR3 appears to constitute the major area of contact between the antigen and the antibody. In vitro selection schemes in which only the CDR3 is varied can be used to vary the binding properties of an antibody or to determine which residues contribute to antigen binding. Thus, the CDR3 typically is the major source of molecular diversity at the antibody binding site. H3, for example, may be two amino acid residues or more than 26 amino acids.
[0066] As porções mais conservadas (ou seja, não hipervariáveis) dos domínios variáveis são denominadas regiões "framework" (FRM) e fornecem um andaime para as seis CDRs em espaço tridimensional para formar uma superfície de ligação ao antígeno. Os domínios variáveis de cadeias leves e pesadas de ocorrência natural, cada um, compreendem quatro regiões de FRM (FR1, FR2 e FR4), adotando amplamente uma configuração de lâmina β, conectada por três regiões hipervariáveis, que formam uma conexão em loops e, em alguns casos, formando parte da estrutura de lâmina β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas unidas em proximidade por FRM e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação ao antígeno (ver Kabat et al., loc. cit.). Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligação ao antígeno, mas exibem várias funções efetoras, como, por exemplo, citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos e da ativação de complemento.[0066] The more conserved (i.e., non-hypervariable) portions of the variable domains are termed framework (FRM) regions and provide a scaffold for the six CDRs in three-dimensional space to form an antigen-binding surface. The variable domains of naturally occurring light and heavy chains each comprise four FRM regions (FR1, FR2, and FR4), largely adopting a β-sheet configuration, connected by three hypervariable regions, which form a loop connection and, in some cases, form part of the β-sheet structure. The hypervariable regions in each chain are held together in proximity by FRM and, with the hypervariable regions of the other chain, contribute to the formation of the antigen-binding site (see Kabat et al., loc. cit.). The constant domains are not directly involved in antigen binding, but exhibit various effector functions, such as antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity and complement activation.
[0067] Como explicado anteriormente, a construção de anticorpo compreendida na composição farmacêutica da invenção é particularmente considerada como uma construção de anticorpo de cadeia simples biespecífica. O termo "biespecífico", como aqui utilizado, refere-se a uma construção de anticorpo que é "pelo menos biespecífico", isto é, compreende pelo menos um primeiro domínio de ligação e um segundo domínio de ligação, em que o primeiro domínio de ligação se liga a um antígeno ou alvo e o segundo domínio de ligação se liga a outro antígeno ou alvo. Consequentemente, as construções de anticorpo abrangidas pelo termo compreendem especificidades de pelo menos dois antígenos ou alvos diferentes. O termo "construto de anticorpo biespecífico" também engloba construtos de anticorpos multiespecíficos, tais como construções de anticorpos trispecíficos, as últimas incluindo três domínios de ligação ou construções com mais de três (por exemplo, quatro, cinco...) especificidades. Dado que os construtos de anticorpo de acordo com a invenção são (pelo menos) biespecíficos, elas não ocorrem naturalmente e são marcadamente diferentes dos produtos de ocorrência natural. Um construto de anticorpo "biespecífico" é, portanto, um anticorpo híbrido artificial ou uma imunoglobulina com pelo menos dois locais de ligação distintos com diferentes especificidades. Os anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por conjugação química de dois anticorpos monoclônicos (mAb) purificados diferentes ou fragmentos de anticorpo ou fundindo-se dois hibridomas resultando em uma linha celular de quadroma produzindo, entre outros, moléculas de IgG biespecíficas (ver Kontermann e Brinkmann, Drug Discov Hoje. jul. de 2015;20(7):838-47 para obter uma análise).[0067] As explained above, the antibody construct comprised in the pharmaceutical composition of the invention is particularly considered as a bispecific single chain antibody construct. The term "bispecific" as used herein refers to an antibody construct that is "at least bispecific", i.e. comprises at least a first binding domain and a second binding domain, wherein the first binding domain binds to one antigen or target and the second binding domain binds to another antigen or target. Accordingly, the antibody constructs encompassed by the term comprise specificities of at least two different antigens or targets. The term "bispecific antibody construct" also encompasses multispecific antibody constructs, such as trispecific antibody constructs, the latter including three binding domains, or constructs with more than three (e.g. four, five...) specificities. Since the antibody constructs according to the invention are (at least) bispecific, they do not occur naturally and are markedly different from naturally occurring products. A "bispecific" antibody construct is therefore an artificial hybrid antibody or immunoglobulin with at least two distinct binding sites with different specificities. Bispecific antibodies can be produced by a variety of methods known in the art, for example, by chemically conjugating two different purified monoclonal antibodies (mAb) or antibody fragments or by fusing two hybridomas resulting in a quadroma cell line producing, inter alia, bispecific IgG molecules (see Kontermann and Brinkmann, Drug Discov Today. 2015 Jul;20(7):838-47 for a review).
[0068] Como explicado anteriormente, a composição farmacêutica da presente invenção compreende um construto de anticorpo de cadeia simples biespecífico, ligando-se a um antígeno de superfície da célula- alvo através de um domínio de ligação e ao CD3 de antígeno de superfície de células T através de um segundo domínio de ligação.[0068] As explained above, the pharmaceutical composition of the present invention comprises a bispecific single chain antibody construct, binding to a target cell surface antigen through one binding domain and to the T cell surface antigen CD3 through a second binding domain.
[0069] Os termos "se liga (especificamente) a", "reconhece (especificamente)", " é direcionado (especificamente) a" e "reage (especificamente) com" significa, de acordo com esta invenção, que um domínio de ligação interage ou interage especificamente com um ou mais, preferivelmente pelo menos dois, mais preferencialmente pelo menos três e mais preferencialmente pelo menos quatro aminoácidos de um epítopo localizado na proteína ou antígeno-alvo.[0069] The terms "binds (specifically) to", "recognizes (specifically)", "is (specifically) targeted to" and "reacts (specifically) with" mean, according to this invention, that a binding domain interacts or specifically interacts with one or more, preferably at least two, more preferably at least three and most preferably at least four amino acids of an epitope located on the target protein or antigen.
[0070] O termo "epítopo" refere-se a um local em um antígeno ao qual um domínio de ligação, tal como um anticorpo ou imunoglobulina ou derivado ou fragmento de um anticorpo ou de uma imunoglobulina, se liga especificamente. Um "epítopo" é antigênico e, portanto, o termo epítopo às vezes também é referido aqui como "estrutura antigênica" ou "determinante antigênico". Assim, o domínio de ligação é um "site de interação de antígeno". A referida ligação/interação também é entendida definindo um "reconhecimento específico". Os "epítopos" podem ser formados tanto por aminoácidos contíguos (epítopo linear) quanto por aminoácidos não contíguos justapostos por dobramento terciário de uma proteína (epítopo conformacional). Os epítopos lineares tipicamente incluem pelo menos 3 ou pelo menos 4, e mais geralmente, pelo menos 5 ou pelo menos 6 ou pelo menos 7, por exemplo, cerca de 8 a cerca de 10 aminoácidos em uma sequência simples. Tipicamente, um epítopo conformacional compreende um número aumentado de aminoácidos em relação a um epítopo linear. Os métodos para determinar a conformação de epítopos incluem, mas não estão limitados a, cristalografia de raios-x, espectroscopia bidimensional de ressonância magnética nuclear (2D-RMN) e marcação de rotação direcionada ao local e espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica (EPR).[0070] The term "epitope" refers to a site on an antigen to which a binding domain, such as an antibody or immunoglobulin or derivative or fragment of an antibody or immunoglobulin, specifically binds. An "epitope" is antigenic and therefore the term epitope is sometimes also referred to herein as "antigenic structure" or "antigenic determinant". Thus, the binding domain is an "antigen interaction site". Said binding/interaction is also understood to define a "specific recognition". "Epitopes" can be formed either by contiguous amino acids (linear epitope) or by non-contiguous amino acids juxtaposed by tertiary folding of a protein (conformational epitope). Linear epitopes typically include at least 3 or at least 4, and more generally, at least 5 or at least 6 or at least 7, e.g., about 8 to about 10 amino acids in a simple sequence. Typically, a conformational epitope comprises an increased number of amino acids relative to a linear epitope. Methods for determining the conformation of epitopes include, but are not limited to, X-ray crystallography, two-dimensional nuclear magnetic resonance (2D-NMR) spectroscopy, and site-directed spin labeling and electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy.
[0071] A interação entre o domínio de ligação e o epítopo ou conjunto de epítopos implica que um domínio de ligação apresenta uma atividade apreciável com o epítopo ou conjunto de epítopos em uma proteína ou antígeno em particular e, geralmente, não apresenta uma reatividade significativa com proteínas ou antígenos não alvo. "Afinidade apreciável" inclui ligação com uma afinidade de cerca de 10-6 M (KD) ou mais forte. De preferência, a ligação é considerada específica quando a afinidade de ligação for de cerca de 10-12 a 10-8 M, 10-12 a 10-9 M, 10-12 a 10-10 M, 10-11 a 10-8 M, de preferência de cerca de 10-11 a 10-9 M. Preferencialmente, um domínio de ligação da invenção não se liga essencialmente ou substancialmente a proteínas ou antígenos que não sejam suas proteínas ou antígenos-alvo (ou seja, o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação não são capazes de se ligar a proteínas que não a respectiva proteína-alvo).[0071] Interaction between the binding domain and the epitope or set of epitopes implies that a binding domain exhibits appreciable activity with the epitope or set of epitopes on a particular protein or antigen and generally does not exhibit significant reactivity with non-target proteins or antigens. "Appreciable affinity" includes binding with an affinity of about 10-6 M (KD) or stronger. Preferably, binding is considered specific when the binding affinity is about 10-12 to 10-8 M, 10-12 to 10-9 M, 10-12 to 10-10 M, 10-11 to 10-8 M, preferably about 10-11 to 10-9 M. Preferably, a binding domain of the invention does not bind essentially or substantially to proteins or antigens other than its target proteins or antigens (i.e., the first binding domain and the second binding domain are not capable of binding to proteins other than the respective target protein).
[0072] O termo "não se liga substancialmente/essencialmente" ou "não é capaz de se ligar" significa que um domínio de ligação da presente invenção não se liga a uma proteína ou antígeno diferente da sua proteína ou antígeno-alvo, isto é, não apresenta reatividade superior a 30%, de preferência não superior a 20%, mais preferencialmente não superior a 10%, particularmente de preferência não superior a 9%, 8%, 7%, 6% ou 5% com proteínas ou antígenos que não sua proteína ou seu antígeno-alvo, a partir do qual a ligação ao seu respetico antígeno ou à sua respectiva proteína-alvo é definida como sendo de 100%.[0072] The term "does not substantially/essentially bind" or "is not capable of binding" means that a binding domain of the present invention does not bind to a protein or antigen other than its target protein or antigen, that is, it does not exhibit reactivity of more than 30%, preferably not more than 20%, more preferably not more than 10%, particularly preferably not more than 9%, 8%, 7%, 6% or 5% with proteins or antigens other than its target protein or antigen, from which the binding to its respective antigen or to its respective target protein is defined as being 100%.
[0073] Como explicou-se aqui, a construção de anticorpo de cadeia simples biespecífica é considerada como compreendendo um primeiro domínio de ligação capaz de se ligar a um antígeno de superfície da célula-alvo e a um segundo domínio de ligação capaz de se ligar ao CD3 do antígeno de superfície de células T. Pretende-se que o construto de anticorpo, os domínios de ligação e, em particular, o segundo domínio de ligação (que se liga ao CD3 humano na superfície de uma célula T) tenha, particularmente, o seguinte formato: os pares de regiões VH e VL estão no formato de um anticorpo de cadeia simples (scFv). As regiões VH e VL estão dispostas na ordem VH-VL ou VL-VH. Prefere-se que a região VH seja posicionada no terminal N de uma sequência de ligação e que a região VL seja posicionada no terminal C da sequência de ligação.[0073] As explained herein, the bispecific single chain antibody construct is envisaged as comprising a first binding domain capable of binding to a target cell surface antigen and a second binding domain capable of binding to the T cell surface antigen CD3. It is intended that the antibody construct, the binding domains and in particular the second binding domain (which binds to human CD3 on the surface of a T cell) particularly have the following format: the pairs of VH and VL regions are in the format of a single chain antibody (scFv). The VH and VL regions are arranged in the order VH-VL or VL-VH. It is preferred that the VH region is positioned at the N-terminus of a binding sequence and that the VL region is positioned at the C-terminus of the binding sequence.
[0074] O segundo domínio de ligação do construto de anticorpo compreendido na composição farmacêutica da invenção capaz de se ligar ao CD3 do antígeno da superfície de células T. As células T ou os linfócitos T são um tipo de linfócito (ele mesmo um tipo de glóbulo branco) que desempenham um papel central na imunidade mediada por células. Existem vários subconjuntos de células T, cada um com uma função distinta. As células T podem ser distinguidas de outros linfócitos, tais como células B e células NK, pela presença de um receptor de células T (TCR) na superfície de célula. O TCR é responsável pelo reconhecimento de antígenos ligados às principais moléculas do complexo de histocompatibilidade (MHC) e é composto por duas cadeias proteicas diferentes. Em 95% das células T, o TCR consiste em uma cadeia alfa (α) e beta (β). Quando o TCR se envolve com péptido antigênico e MHC (complexo peptídeo/MHC), o linfócito T é ativado através de uma série de eventos bioquímicos mediados por enzimas associadas, co-receptores, moléculas adaptadoras especializadas e fatores de transcrição ativados ou liberados.[0074] The second binding domain of the antibody construct comprised in the pharmaceutical composition of the invention capable of binding to the CD3 of the surface antigen of T cells. T cells or T lymphocytes are a type of lymphocyte (itself a type of white blood cell) that play a central role in cell-mediated immunity. There are several subsets of T cells, each with a distinct function. T cells can be distinguished from other lymphocytes, such as B cells and NK cells, by the presence of a T cell receptor (TCR) on the cell surface. The TCR is responsible for recognizing antigens bound to the major histocompatibility complex (MHC) molecules and is composed of two different protein chains. In 95% of T cells, the TCR consists of an alpha (α) and a beta (β) chain. When the TCR engages with antigenic peptide and MHC (peptide/MHC complex), the T lymphocyte is activated through a series of biochemical events mediated by associated enzymes, co-receptors, specialized adaptor molecules, and activated or released transcription factors.
[0075] O complexo do receptor CD3 é um complexo protéico e é composto por quatro cadeias. Nos mamíferos, o complexo contém uma cadeia CD3Y (gama), uma cadeia CD3δ (delta) e duas cadeias CD3ε (epsilon). Essas cadeias se associam ao receptor de células T (TCR) e à chamada cadeia Z (zeta) para formar o complexo CD3 do receptor de células T e para gerar um sinal de ativação em linfócitos T. As cadeias CD3Y (gama), CD3δ (delta) e CD3ε (epsilon) são proteínas de superfície de célula altamente relacionadas da superfamília de imunoglobulina contendo um único domínio de imunoglobulina extracelular. As caudas intracelulares das moléculas de CD3 contêm um único motivo conservado conhecido como motivo de ativação baseado na tirosina imunorreceptora ou, de forma abreviada, ITAM, que é essencial para a capacidade de sinalização do TCR. A molécula de CD3 ípsilon é um polipeptídeo que em humanos é codificado pelo gene CD3E, que reside no cromossomo 11.[0075] The CD3 receptor complex is a protein complex and is composed of four chains. In mammals, the complex contains a CD3Y (gamma) chain, a CD3δ (delta) chain and two CD3ε (epsilon) chains. These chains associate with the T cell receptor (TCR) and the so-called Z (zeta) chain to form the T cell receptor CD3 complex and to generate an activation signal in T lymphocytes. The CD3Y (gamma), CD3δ (delta) and CD3ε (epsilon) chains are highly related cell surface proteins of the immunoglobulin superfamily containing a single extracellular immunoglobulin domain. The intracellular tails of the CD3 molecules contain a single conserved motif known as the immunoreceptor tyrosine-based activation motif or ITAM for short, which is essential for the signaling capacity of the TCR. The CD3 epsilon molecule is a polypeptide that in humans is encoded by the CD3E gene, which resides on chromosome 11.
[0076] O segundo domínio de ligação da construção de anticorpo de cadeia simples biespecífica compreendido na composição farmacêutica da invenção é capaz de se ligar a um antígeno da superfície da célula-alvo. O referido antígeno da superfície da célula- alvo pode, em geral, ser qualquer antígeno que possa ser reconhecido e ligado ao segundo domínio de ligação. A construção de anticorpo de cadeia simples biespecífica é concebida para formar uma ligação entre células T e células-alvo, ligando-se tanto ao CD3 como ao antígeno da superfície da célula-alvo. Considera-se, assim, que a construção de anticorpo de cadeia simples biespecífica recruta células T para as células-alvo e, de preferência, faz com que as células T exerçam uma atividade citotóxica nas células-alvo, produzindo proteínas pró- apoptóticas, como perforinas e granzimas, causando assim a célula- alvo. A célula-alvo geralmente será, portanto, uma célula destinada como alvo para a citotoxicidade mediada por células T e, portanto, citólise. Por exemplo, a célula-alvo pode ser uma célula tumoral, tal como uma célula blástica maligna. O antígeno da superfície da célula- alvo pode, assim, ser selecionado dentre CD33, CD19, FAPalpha, MSLN, FLT3 ou BCMA. O CD33 particularmente visado como alvo do primeiro domínio de ligação da construção de anticorpo de cadeia simples biespecífica da invenção.[0076] The second binding domain of the bispecific single chain antibody construct comprised in the pharmaceutical composition of the invention is capable of binding to a target cell surface antigen. Said target cell surface antigen may generally be any antigen that can be recognized and bound by the second binding domain. The bispecific single chain antibody construct is designed to form a link between T cells and target cells by binding to both CD3 and target cell surface antigen. The bispecific single chain antibody construct is thus envisaged to recruit T cells to the target cells and preferably cause the T cells to exert a cytotoxic activity on the target cells by producing pro-apoptotic proteins such as perforins and granzymes, thereby causing the target cell to undergo cytotoxicity. The target cell will therefore generally be a cell intended as a target for T cell-mediated cytotoxicity and therefore cytolysis. For example, the target cell may be a tumor cell, such as a malignant blast cell. The surface antigen of the target cell may thus be selected from CD33, CD19, FAPalpha, MSLN, FLT3 or BCMA. CD33 is particularly targeted by the first binding domain of the bispecific single chain antibody construct of the invention.
[0077] As construções de anticorpo de cadeia simples biespecífica preferidas da presente invenção incluem AMG 103 (compreendendo um primeiro domínio de ligação que reconhece CD19), AMG 330 (compreendendo um primeiro domínio de ligação que reconhece CD33) um HLE BiTE específico do CD33, um HLE BiTE específico de FLT3 e um HLE específico de BCMA BiTE, conforme avaliado nos Exemplos em anexo.[0077] Preferred bispecific single chain antibody constructs of the present invention include AMG 103 (comprising a first binding domain that recognizes CD19), AMG 330 (comprising a first binding domain that recognizes CD33), a CD33-specific HLE BiTE, a FLT3-specific HLE BiTE, and a BCMA-specific HLE BiTE, as assessed in the attached Examples.
[0078] Especificamente, a sequência de aminoácidos do primeiro domínio de ligação da construção de cadeia simples biespecífica é selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID 99, 109, 119, 128, 137, 146, 155, 164, 173, 183, 185 e 187 e a sequência de aminoácidos do segundo domínio de ligação da construção de cadeia simples biespecífica pode ser selecionada do grupo constituído por SEQ ID NO: 9, 18, 27, 36, 45, 54, 63, 72, 81, 179 e 90.[0078] Specifically, the amino acid sequence of the first binding domain of the bispecific single-chain construct is selected from the group consisting of SEQ ID 99, 109, 119, 128, 137, 146, 155, 164, 173, 183, 185, and 187, and the amino acid sequence of the second binding domain of the bispecific single-chain construct can be selected from the group consisting of SEQ ID NO: 9, 18, 27, 36, 45, 54, 63, 72, 81, 179, and 90.
[0079] As construções de anticorpo de cadeia simples biespecíficas preferidas da invenção incluem construções compreendendo ou consistindo em um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos tal como representada em uma SEQ ID NO selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186 e SEQ ID NO: 188.[0079] Preferred bispecific single chain antibody constructs of the invention include constructs comprising or consisting of a polypeptide having an amino acid sequence as represented in a SEQ ID NO selected from the group consisting of SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, and SEQ ID NO: 188.
[0080] Pelo menos dois dos domínios de ligação e os domínios variáveis da construção do anticorpo da presente invenção podem ou não compreender os ligantes peptídicos (peptídeos espaçadores). O termo "ligante peptídico" é definido, de acordo com a presente invenção, como uma sequência de aminoácidos através da qual as sequências de aminoácidos de um domínio (variável e/ou de ligação) e outro domínio (variável e/ou de ligação) da construção de anticorpo da invenção estão ligados entre si. Uma característica técnica essencial desse ligante peptídico é que o referido ligante peptídico não compreende nenhuma atividade de polimerização. Entre os ligantes peptídicos adequados estão os descritos nas Patentes U.S. 4.751.180 e 4.935.233 ou WO 88/09344.[0080] At least two of the binding domains and the variable domains of the antibody construct of the present invention may or may not comprise peptide linkers (spacer peptides). The term "peptide linker" is defined, according to the present invention, as an amino acid sequence through which the amino acid sequences of one domain (variable and/or binding) and another domain (variable and/or binding) of the antibody construct of the invention are linked together. An essential technical feature of such a peptide linker is that said peptide linker does not comprise any polymerization activity. Suitable peptide linkers include those described in U.S. Patents 4,751,180 and 4,935,233 or WO 88/09344.
[0081] No caso em que um ligante é usado, esse ligante é preferencialmente de um comprimento e sequência suficiente para garantir que cada um dos primeiro e segundo domínios possam, independentemente um do outro, reter suas especificidades de ligação diferencial. Para os ligantes peptídicos que se ligam a pelo menos dois dos domínios de ligação na construção de anticorpo (ou dois domínios varieis), esses ligantes peptídicos podem compreender apenas um pequeno número de resíduos de aminoácidos, por exemplo, 12 resíduos de aminoácidos ou menos, tal como 11, 10, 9, 8, 7, 6 ou 5 resíduos de aminoácidos. Um ligante peptídico previsto com menos de 5 aminoácidos compreende 4, 3, 2 ou um aminoácido(s) e pode ser rico em Gly, isto é, pode consistir no único aminoácido Gly. Outros ligantes peptídicos úteis são caracterizados pela sequência de aminoácidos Gly- Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 178), ou seja, Gly4Ser, ou seus polímeros, ou seja: (Gly4Ser)x, onde x é um número inteiro igual a 1 ou mais. De preferência, os ligantes peptídicos não promovem nenhuma estrutura secundária são preferidos. Os métodos para preparar construções de cadeia simples biespecíficas fundidas e operacionalmente ligados e expressados em células de mamíferos ou bactérias são bem conhecidos na técnica (por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York, 2012).[0081] In the case where a linker is used, such linker is preferably of a length and sequence sufficient to ensure that each of the first and second domains can, independently of one another, retain their differential binding specificities. For peptide linkers that bind to at least two of the binding domains in the antibody construct (or two variable domains), such peptide linkers may comprise only a small number of amino acid residues, e.g., 12 amino acid residues or less, such as 11, 10, 9, 8, 7, 6 or 5 amino acid residues. A predicted peptide linker with less than 5 amino acids comprises 4, 3, 2 or one amino acid(s) and may be Gly-rich, i.e., may consist of the single amino acid Gly. Other useful peptide linkers are characterized by the amino acid sequence Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 178), i.e., Gly4Ser, or polymers thereof, i.e.: (Gly4Ser)x, where x is an integer equal to 1 or more. Preferably, peptide linkers that do not promote any secondary structure are preferred. Methods for preparing fused and operably linked bispecific single-chain constructs expressed in mammalian or bacterial cells are well known in the art (e.g., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2012).
[0082] O termo "construto de anticorpo" também abrange derivados. O termo "derivado" geralmente se refere a um construto de anticorpo que foi modificado covalentemente para introduzir uma funcionalidade adicional. As modificações covalentes das construções de anticorpo podem ser introduzidas pós-tradução por meio da reação de resíduos de aminoácidos específicos da molécula com um agente de derivação orgânico capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou com os resíduos de terminal N ou C. A derivação de construções de anticorpo pode ser utilizada para ligar agentes terapêuticos ou de diagnóstico, etiquetas, grupos que prolongam a meia-vida no soro da molécula ou para inserção de aminoácidos não naturais. As modificações químicas geralmente aplicadas incluem:[0082] The term "antibody construct" also encompasses derivatives. The term "derivative" generally refers to an antibody construct that has been covalently modified to introduce additional functionality. Covalent modifications of antibody constructs may be introduced post-translationally by reacting specific amino acid residues of the molecule with an organic derivatizing agent capable of reacting with selected side chains or the N- or C-terminal residues. Derivatization of antibody constructs may be used to attach therapeutic or diagnostic agents, labels, groups that extend the serum half-life of the molecule, or for insertion of unnatural amino acids. Commonly applied chemical modifications include:
[0083] Os resíduos de cisteinila são mais habitualmente colocados em reação com α-haloacetatos (e aminas correspondentes), tais como ácido cloroacético ou cloroacetamida, para resultar em derivados de carboximetil ou carboxiamidometil. Os resíduos de cisteinil também são derivados pela reação com bromotrifluoroacetona, ácido α-bromo-β-(5- imidozoil)propiônico, fosfato de cloroacetila, N-alquilmaleimidas, dissulfeto de 3-nitro-2-piridila, dissulfeto de metil 2-piridila, p- cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol ou cloro-7- nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.[0083] Cysteinyl residues are most commonly reacted with α-haloacetates (and corresponding amines), such as chloroacetic acid or chloroacetamide, to afford carboxymethyl or carboxyamidomethyl derivatives. Cysteinyl residues are also derived by reaction with bromotrifluoroacetone, α-bromo-β-(5-imidozoyl)propionic acid, chloroacetyl phosphate, N-alkylmaleimides, 3-nitro-2-pyridyl disulfide, 2-pyridyl methyl disulfide, p-chloromercuribenzoate, 2-chloromercuri-4-nitrophenol, or chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole.
[0084] Os resíduos de histidil são derivados através da reação com dietilpirocarbonato em pH 5,5-7,0 porque esse agente é relativamente específico para a cadeia lateral de histidil. O brometo de para- bromofenacil é também útila; a reacção é de preferência realizada em cacodilato de sódio 0,1 M a pH 6,0. Resíduos de lisinil e amino terminais são reagidos com anidrido succínico ou outros anidridos de ácidos carboxílicos. A derivação com esses agentes tem o efeito de reverter a carga dos resíduos de lisinil. Outros reagentes adequados para a derivação de resíduos contendo alfa-amino incluem imidoésteres, tais como picolinimidato de metila; fosfato de piridoxal; piridoxal; borohidreto de cloro; ácido trinitrobenzenossulfônico; O-metilisoureia; 2,4- pentanodiona; e reação com glioxilato catalisada por transaminase.[0084] Histidyl residues are derivatized by reaction with diethylpyrocarbonate at pH 5.5-7.0 because this agent is relatively specific for the histidyl side chain. Para-bromophenacyl bromide is also useful; the reaction is preferably carried out in 0.1 M sodium cacodylate at pH 6.0. Amino-terminal lysinyl residues are reacted with succinic anhydride or other carboxylic acid anhydrides. Derivatization with these agents has the effect of reversing the charge of the lysinyl residues. Other suitable reagents for the derivatization of alpha-amino-containing residues include imidoesters such as methyl picolinimidate; pyridoxal phosphate; pyridoxal; chloroborohydride; trinitrobenzenesulfonic acid; O-methylisourea; 2,4-pentanedione; and reaction with glyoxylate catalyzed by transaminase.
[0085] Resíduos de arginil são modificados através da reação com um ou vários reagentes convencionais, entre eles fenilglioxal, 2,3- butanodiona, 1,2-ciclo-hexanodiona e ninhidrina. derivação de resíduos de arginina requer que a reação seja realizada em condições alcalinas devido ao pKa elevado do grupo funcional de guanidina. Além disso, esses reagentes podem reagir com os grupos de lisina, bem como com o grupo epsilon-amino de arginina.[0085] Arginyl residues are modified by reaction with one or more conventional reagents, including phenylglyoxal, 2,3-butanedione, 1,2-cyclohexanedione, and ninhydrin. Derivatization of arginine residues requires that the reaction be carried out under alkaline conditions due to the high pKa of the guanidine functional group. In addition, these reagents can react with lysine groups as well as the epsilon-amino group of arginine.
[0086] A modificação específica de resíduos de tirosil pode ser feita, com particular interesse na introdução de marcadores espectrais em resíduos de tirosil por reação com compostos de diazônio aromáticos ou tetranitrometano. Mais comumemnte, N-acetilimidizol e tetranitrometano são usados para formar espécies de O-acetil tirosil e derivados de 3-nitro, respectivamente. Os resíduos de tirosil são iodados usando 125I ou 131I para preparar proteínas marcadas para uso em radioimunoensaio, o método da cloramina T descrito acima sendo adequado.[0086] Specific modification of tyrosyl residues can be made, with particular interest in introducing spectral labels into tyrosyl residues by reaction with aromatic diazonium compounds or tetranitromethane. Most commonly, N-acetylimidazole and tetranitromethane are used to form O-acetyl tyrosyl species and 3-nitro derivatives, respectively. Tyrosyl residues are iodinated using 125I or 131I to prepare labeled proteins for use in radioimmunoassay, the chloramine T method described above being suitable.
[0087] Os grupos laterais de carboxil (aspartil ou glutamil) são seletivamente modificados através da reação com carbodiimidas ((R’— N=C=N--R’), onde R e R' são grupos alquil opcionalmente diferentes, tais como 1-ciclo-hexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida ou 1-etil-3-(4- azônia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Além disso, os resíduos de aspartil e glutamil são convertidos em resíduos asparaginil e glutaminil através da reação com íons de amônio.[0087] The carboxyl (aspartyl or glutamyl) side groups are selectively modified by reaction with carbodiimides ((R’—N=C=N--R’), where R and R' are optionally different alkyl groups, such as 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimide or 1-ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimide. Furthermore, aspartyl and glutamyl residues are converted to asparaginyl and glutaminyl residues by reaction with ammonium ions.
[0088] A derivação com agentes bifuncionais é útil para reticular as construções de anticorpo da presente invenção a uma matriz ou superfície de suporte insolúvel em água para utilização em uma variedade de métodos. Os agentes de reticulação comumente utilizados incluem, por exemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxissuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4- azidossalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo dissuccinimidil ésteres tais como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), e maleimidas bifuncionais, tais como bis-N-maleimido-1,8-octano. Os agentes de derivação, tais como metil-3-[(p- azidofenil)ditio]propioimidato, rendem intermediários fotoativáveis que são capazes de formar reticulações na presença de luz. Alternativamente, as matrizes reativas insolúveis em água, tais como hidratos de carbono ativados por brometo de cianogênio e os substratos reativos descritos nas Pat. U.S. Nos. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; e 4.330.440, são empregadas para a imobilização de proteínas.[0088] Derivatization with bifunctional agents is useful for crosslinking the antibody constructs of the present invention to a water-insoluble support matrix or surface for use in a variety of methods. Commonly used crosslinking agents include, for example, 1,1-bis(diazoacetyl)-2-phenylethane, glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide esters, for example, esters with 4-azidosalicylic acid, homobifunctional imidoesters, including disuccinimidyl esters such as 3,3'-dithiobis(succinimidylpropionate), and bifunctional maleimides, such as bis-N-maleimido-1,8-octane. Derivatization agents, such as methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidate, yield photoactivatable intermediates that are capable of forming crosslinks in the presence of light. Alternatively, water-insoluble reactive matrices, such as cyanogen bromide-activated carbohydrates and the reactive substrates described in U.S. Pat. Nos. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; and 4,330,440, are employed for protein immobilization.
[0089] Resíduos de glutaminil e asparaginil são frequentemente desamidados para os resíduos glutamil e aspartil correspondentes, respectivamente. Alternativamente, esses resíduos são desamidados sob condições ligeiramente ácidas. Qualquer das formas destes resíduos cai dentro do escopo da presente invenção.[0089] Glutaminyl and asparaginyl residues are often deamidated to the corresponding glutamyl and aspartyl residues, respectively. Alternatively, these residues are deamidated under slightly acidic conditions. Either form of these residues falls within the scope of the present invention.
[0090] Outras modificações incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxil de resíduos de seril ou treonila, metilação dos grupos a-amino de cadeias laterais de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp. 79-86), acetilação da amina de N-terminal e amidação de qualquer grupo carboxil de C-terminal.[0090] Other modifications include hydroxylation of proline and lysine, phosphorylation of hydroxyl groups of seryl or threonyl residues, methylation of the α-amino groups of lysine, arginine, and histidine side chains (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp. 79-86), acetylation of the N-terminal amine, and amidation of any C-terminal carboxyl group.
[0091] Outro tipo de modificação covalente das construções de anticorpos incluídos no âmbito desta invenção compreende a alteração do padrão de glicosilação da proteína. Como é conhecido na técnica, os padrões de glicosilação podem depender tanto da sequência da proteína (por exemplo, a presença ou ausência de resíduos de aminoácidos de glicosilação em particular, discutido abaixo), ou da célula ou organismo hospedeiro no qual a proteína é produzida. Sistemas de expressão particulares são discutidos abaixo.[0091] Another type of covalent modification of antibody constructs included within the scope of this invention comprises altering the glycosylation pattern of the protein. As is known in the art, glycosylation patterns can depend either on the sequence of the protein (e.g., the presence or absence of particular glycosylation amino acid residues, discussed below), or on the host cell or organism in which the protein is produced. Particular expression systems are discussed below.
[0092] A glicosilação de polipeptídeos é tipicamente ligada a N ou ligada a O. Ligada a N se refere à ligação da porção carboidrato a uma cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências tripeptídicas asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para ligação enzimática da porção carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de qualquer uma dessas sequências tripeptídicas em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação em potencial. A glicosilação ligada a O se refere à ligação de um dos açúcares N- acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5- hidroxilisina também possam ser usadas.[0092] Glycosylation of polypeptides is typically either N-linked or O-linked. N-linked refers to the attachment of the carbohydrate moiety to a side chain of an asparagine residue. The tripeptide sequences asparagine-X-serine and asparagine-X-threonine, where X is any amino acid except proline, are the recognition sequences for enzymatic attachment of the carbohydrate moiety to the asparagine side chain. Thus, the presence of either of these tripeptide sequences in a polypeptide creates a potential glycosylation site. O-linked glycosylation refers to the attachment of one of the sugars N-acetylgalactosamine, galactose, or xylose to a hydroxyamino acid, most commonly serine or threonine, although 5-hydroxyproline or 5-hydroxylysine may also be used.
[0093] A adição de sítios de glicosilação à construção de anticorpo é realizada convenientemente através da alteração da sequência de aminoácidos de forma tal que contenha uma ou mais das sequências tripeptídicas descritas acima (para sítios de glicosilação ligados a N). A alteração também pode ser pela adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência inicial (para sítios de glicosilação ligados a O). Para facilidade, a sequência de aminoácidos da construção de anticorpo é preferencialmente alterada através de mudanças ao nível do DNA, particularmente por mutação do DNA que codifica o polipeptídeo-alvo em bases pré-selecionadas de modo tal que sejam gerados códons que traduzir-se-ão nos aminoácidos desejados.[0093] Addition of glycosylation sites to the antibody construct is conveniently accomplished by altering the amino acid sequence such that it contains one or more of the tripeptide sequences described above (for N-linked glycosylation sites). The alteration may also be by the addition of, or substitution by, one or more serine or threonine residues to the starting sequence (for O-linked glycosylation sites). For ease, the amino acid sequence of the antibody construct is preferably altered through changes at the DNA level, particularly by mutating the DNA encoding the target polypeptide at preselected bases such that codons are generated that will translate to the desired amino acids.
[0094] Outro meio de aumentar o número de porções carboidrato na construção de anticorpo é por acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos à proteína. Esses procedimentos são vantajosos em que não requerem a produção da proteína em uma célula hospedeira que tem capacidades de glicosilação para glicosilação ligada a N e a O. Dependendo do modo de acoplamento usado, o(s) açúcar(es) podem ser ligados a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxila livres, (c) grupos sulfidrila livres, tais como aqueles de cisteína, (d) grupos hidroxila livres, tais como aqueles de serina, treonina, ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos, tais como aqueles de fenilalanina, tirosina, ou triptofano, ou (f) o grupo amida da glutamina. Esses métodos são descritos em WO 87/05330 e em Aplin e Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306.[0094] Another means of increasing the number of carbohydrate moieties in the antibody construct is by chemical or enzymatic coupling of glycosides to the protein. These procedures are advantageous in that they do not require production of the protein in a host cell that has glycosylation capabilities for both N- and O-linked glycosylation. Depending on the mode of coupling used, the sugar(s) may be attached to (a) arginine and histidine, (b) free carboxyl groups, (c) free sulfhydryl groups, such as those of cysteine, (d) free hydroxyl groups, such as those of serine, threonine, or hydroxyproline, (e) aromatic residues, such as those of phenylalanine, tyrosine, or tryptophan, or (f) the amide group of glutamine. These methods are described in WO 87/05330 and in Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306.
[0095] A remoção de porções carboidrato presentes na construção de anticorpo inicial pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente. A desglicosilação química requer a exposição da proteína ao composto ácido trifluorometanossulfônico ou um composto equivalente. Esse tratamento resulta na clivagem da maioria ou de todos os açúcares, exceto do açúcar de ligação (N-acetilglicosamina ou N- acetilgalactosamina), deixando o polipeptídeo intacto. A desglicosilação química é descrita por Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys.259:52 e por Edge et al., 1981, Anal.Biochem.118: 131. A clivagem enzimática de porções de carboidrato nos polipeptídeos pode ser alcançada pela utilização de uma variedade de endo- e exo- glicosidases como descrito por Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol.138: 350. A glicosilação em sítios de glicosilação em potencial pode ser prevenida pelo uso do composto tunicamicina como descrito por Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem.257: 3105. A tunicamicina bloqueia a formação de ligações proteína-N-glicosídeo.[0095] Removal of carbohydrate moieties present in the initial antibody construct can be accomplished chemically or enzymatically. Chemical deglycosylation requires exposure of the protein to the compound trifluoromethanesulfonic acid or an equivalent compound. This treatment results in cleavage of most or all of the sugars except the linker sugar (N-acetylglucosamine or N-acetylgalactosamine), leaving the polypeptide intact. Chemical deglycosylation is described by Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys.259:52 and by Edge et al., 1981, Anal.Biochem.118:131. Enzymatic cleavage of carbohydrate moieties in polypeptides can be accomplished by utilizing a variety of endo- and exo-glycosidases as described by Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol.138: 350. Glycosylation at potential glycosylation sites can be prevented by the use of the compound tunicamycin as described by Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem.257: 3105. Tunicamycin blocks the formation of protein-N-glycoside bonds.
[0096] Outras modificações da construção de anticorpo também são contempladas aqui. Por exemplo, outro tipo de modificação covalente do construto de anticorpo compreende a ligação da construção de anticorpo a vários polímeros não proteináceos, incluindo, mas não limitados a, vários polióis, tais como polietilenoglicol (PEGuilao), polipropilenoglicol, polioxialquilenos ou copolímeros de polietilenoglicol e polipropilenoglicol ou de carboidratos, tais como hidroxietilamido (por exemplo, HESylation®) ou ácido polissiálico (por exemplo, tecnologia PolyXen®). Ademais, tal como é conhecido na técnica, substituições de aminoácidos podem ser feitas em várias posições dentro da construção de anticorpo, por exemplo para facilitar a adição de polímeros, tais como PEG.[0096] Other modifications of the antibody construct are also contemplated herein. For example, another type of covalent modification of the antibody construct comprises linking the antibody construct to various non-proteinaceous polymers, including, but not limited to, various polyols, such as polyethylene glycol (PEGylation), polypropylene glycol, polyoxyalkylenes or copolymers of polyethylene glycol and polypropylene glycol, or carbohydrates, such as hydroxyethyl starch (e.g., HESylation®) or polysialic acid (e.g., PolyXen® technology). Furthermore, as is known in the art, amino acid substitutions can be made at various positions within the antibody construct, for example to facilitate the addition of polymers, such as PEG.
[0097] Em algumas modalidades, a modificação covalente das construções de anticorpo da invenção compreende a adição de uma ou mais etiquetas. O grupo de marcação pode ser acoplado à contrução de anticorpo através de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o obstáculo estérico potencial. Vários métodos para a etiquetagem de proteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados na realização da presente invenção. O termo "marcação" ou "grupo de marcação" refere-se a qualquer marcação detectável. Em geral, as marcações se enquadram em uma variedade de classes, dependendo do ensaio em que devem ser detectadas - os seguintes exemplos incluem, mas não estão limitados a: a) marcações isotópicas, que podem ser isótopos radioativos ou pesados, como radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 89Zr, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I)b) marcações magnéticas (por exemplo,partículasmagnéticas)c) Porções redox ativasd) Corantes ópticos (incluindo, mas não limitado a cromóforos, fósforos e fluoróforos), tais como grupos fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantanídeos), grupos quimioluminescentes e fluoróforos que podem ser fluorescentes de "molécula pequena" ou fluorescentes proteináceose) grupos enzimáticos (por exemplo, peroxidase derábano, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina)f) grupos biotiniladosg) epítopos de polipeptídeo predeterminadosreconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de pares de zíper de leucina, locais de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, marcações de epítopo, etc.)[0097] In some embodiments, covalent modification of the antibody constructs of the invention comprises the addition of one or more tags. The tagging group may be coupled to the antibody construct via spacer arms of various lengths to reduce potential steric hindrance. Various methods for tagging proteins are known in the art and may be used in carrying out the present invention. The term "tag" or "tag group" refers to any detectable tag. In general, labels fall into a variety of classes depending on the assay in which they are to be detected - the following examples include, but are not limited to: a) isotopic labels, which may be radioactive or heavy isotopes such as radioisotopes or radionuclides (e.g., 3H, 14C, 15N, 35S, 89Zr, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I) b) magnetic labels (e.g., magnetic particles) c) redox-active moieties d) optical dyes (including but not limited to chromophores, phosphors, and fluorophores) such as fluorescent groups (e.g., FITC, rhodamine, lanthanide phosphors), chemiluminescent groups, and fluorophores which may be "small molecule" fluorescent or proteinaceous fluorescent e) enzymatic groups (e.g., horseradish peroxidase, β-galactosidase, luciferase, alkaline phosphatase)f) biotinylated groupsg) predetermined polypeptide epitopes recognized by a secondary reporter (e.g., leucine zipper pair sequences, binding sites for secondary antibodies, metal binding domains, epitope tags, etc.)
[0098] Por "marcador fluorescente" entende-se qualquer molécula que possa ser detectada através de suas propriedades fluorescentes inerentes. As etiquetas fluorescentes adequadas incluem, mas não estão limitadas a, fluoresceina, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarinas, pireno, verde Malacita, estilbeno, Amarelo Lucifer, Azul Cascata J, Vermelho do Texas, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Vermelho 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Vermelho 705, Verde Oregon, os corantes Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Azul Cascata, Amarelo Cascata e R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, rodamina, e Vermelho do Texas (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Corantes óticos adequados, incluindo fluoróforos, são descritos em Molecular Probes Handbook por Richard P. Haugland.[0098] By "fluorescent marker" is meant any molecule that can be detected through its inherent fluorescent properties. Suitable fluorescent labels include, but are not limited to, fluorescein, rhodamine, tetramethylrhodamine, eosin, erythrosine, coumarin, methyl coumarins, pyrene, Malacite green, stilbene, Lucifer Yellow, Cascade Blue J, Texas Red, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, Oregon Green, the Alexa-Fluor dyes (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade Blue, Cascade Yellow, and R-phycoerythrin (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, rhodamine, and Texas Red (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Suitable optical dyes, including fluorophores, are described in Molecular Probes Handbook by Richard P. Haugland.
[0099] As marcações fluorescentes proteináceas adequadas também incluem, mas não estão limitadas a proteína fluorescente verde, incluindo uma espécie Renilla, Ptilosarcus ou Aequorea de GFP (Chalfie et al.1994, Science 263: 802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., Número de Acesso Genanium U55762), proteína azul fluorescente (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6: 178-182), proteína fluorescente amarela potencializada (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferase (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:54085417), β galactosidase (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA. 85: 2603-2607) e Renilla (WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, Patentes U.S. Nos. 5292658, 5418155, 5683888, 5741668, 5777079, 5804387, 5874304, 5876995, 5925558).[0099] Suitable proteinaceous fluorescent tags also include, but are not limited to, green fluorescent protein, including a Renilla, Ptilosarcus, or Aequorea species of GFP (Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., Genanium Accession Number U55762), blue fluorescent protein (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182), enhanced yellow fluorescent protein (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferase (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:54085417), β galactosidase (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 2603-2607) and Renilla (WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, U.S. Patent Nos. 5,292,658, 5,418,155, 5,683,888, 5,741,668, 5,777,079, 5,804,387, 5,874,304, 5,876,995, 5,925,558).
[0100] Domínios de zíper de leucina são peptídeos que promovem a oligomerização das proteínas nas quais eles se encontram. Zíperes de leucina foram originalmente identificados em várias proteínas de ligação ao DNA (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), e têm sido desde então encontrados em uma variedade de proteínas diferentes. Entre os zíperes de leucina conhecidos estão peptídeos de ocorrência natural e derivados dos mesmos que dimerizam ou trimerizam. Exemplos de domínios de zíper de leucina adequados para produzir proteínas oligoméricas solúveis estão descritos no pedido PCT WO 94/10308, e o zíper de leucina derivado da proteína D de tensoativo pulmonar (SPD) descrito em Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191. O uso de um zíper de leucina modificado que permite a trimerização estável de uma proteína heteróloga fundida ao mesmo é descrito em Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6: 267-78. Em uma abordagem, as proteínas de fusão recombinantes compreendendo um fragmento ou derivado de anticorpo CDH19 fundido com um péptido de zíper de leucina são expressas em células hospedeiras adequadas e os fragmentos ou derivados de anticorpos CDH19 oligoméricos solúveis que se formam são recuperados do sobrenadante da cultura.[0100] Leucine zipper domains are peptides that promote the oligomerization of the proteins in which they are found. Leucine zippers were originally identified in several DNA-binding proteins (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), and have since been found in a variety of different proteins. Known leucine zippers include naturally occurring peptides and derivatives thereof that dimerize or trimerize. Examples of leucine zipper domains suitable for producing soluble oligomeric proteins are described in PCT application WO 94/10308, and the leucine zipper derived from lung surfactant protein D (SPD) described in Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191. The use of a modified leucine zipper that allows stable trimerization of a heterologous protein fused thereto is described in Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6: 267-78. In one approach, recombinant fusion proteins comprising a CDH19 antibody fragment or derivative fused to a leucine zipper peptide are expressed in suitable host cells and the soluble oligomeric CDH19 antibody fragments or derivatives that form are recovered from the culture supernatant.
[0101] A construção de anticorpo também pode compreender domínios ou peptídeos adicionais, que são úteis, por exemplo, no isolamento da molécula ou se relacionam com um perfil farmacocinético adaptado da molécula. Os domínios úteis para o isolamento de uma construção de anticorpos podem ser selecionados a partir de motivos peptídicos ou porções secundariamente introduzidas, que podem ser capturadas em um método de isolamento, por exemplo, uma coluna de isolamento. As modalidades não limitativas desses domínios adicionais compreendem motivos peptídicos conhecidos como Myc-tag, HAT-tag, HA-tag, TAP-tag, GST-tag, domínio de ligação à quitina (CBD-tag), proteína de ligação a maltose (MBP-tag), Flag-tag, Strep-tag e suas variantes (por exemplo, StrepII-tag) e His-tag. Os domínios de marcação His geralmente são conhecidos como uma repetição de resíduos His consecutivos na sequência de aminoácidos de uma molécula, preferivelmente de seis resíduos His. Domínios ou peptídeos úteis para estender a meia-vida sérica (isto é, o tempo em que 50% de uma droga administrada são eliminados através de processos biológicos, por exemplo, metabolismo, excreção, etc.) dos construtos de anticorpos incluem aqueles capazes de se ligar a outras proteínas com um perfil farmacocinético preferido no corpo humano, tal como albumina sérica (por exemplo, o peptídeo AB156) ou a região constante de imunoglobulinas (domínios Fc ou suas variantes).[0101] The antibody construct may also comprise additional domains or peptides, which are useful, for example, in isolating the molecule or relate to a tailored pharmacokinetic profile of the molecule. Domains useful for isolating an antibody construct may be selected from peptide motifs or secondarily introduced moieties, which may be captured in an isolation method, for example, an isolation column. Non-limiting embodiments of such additional domains comprise peptide motifs known as Myc-tag, HAT-tag, HA-tag, TAP-tag, GST-tag, chitin-binding domain (CBD-tag), maltose-binding protein (MBP-tag), Flag-tag, Strep-tag and its variants (e.g., StrepII-tag), and His-tag. His-tag domains are generally known as a repeat of consecutive His residues in the amino acid sequence of a molecule, preferably of six His residues. Useful domains or peptides for extending the serum half-life (i.e., the time at which 50% of an administered drug is eliminated through biological processes, e.g., metabolism, excretion, etc.) of antibody constructs include those capable of binding to other proteins with a preferred pharmacokinetic profile in the human body, such as serum albumin (e.g., the AB156 peptide) or the constant region of immunoglobulins (Fc domains or their variants).
[0102] A construção de anticorpo de cadeia simples biespecífica está prevista para estar presente na composição farmacêutica da invenção a uma concentração até cerca de 5 mg/mL, isto é: cerca de 4,0 mg/mL, 3,0 mg/mL, 2,0 mg/mL, 1,0 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,25 mg/mL ou 0,1 mg/mL. De preferência, a construção de anticorpo de cadeia simples biespecífica está presente na composição farmacêutica a uma concentração entre 0,1 a 5 mg/mL, de preferência 0,2-2,5 mg/mL, de um modo mais preferido de 0,25-1,0 mg/mL.[0102] The bispecific single chain antibody construct is envisaged to be present in the pharmaceutical composition of the invention at a concentration of up to about 5 mg/mL, i.e.: about 4.0 mg/mL, 3.0 mg/mL, 2.0 mg/mL, 1.0 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.25 mg/mL or 0.1 mg/mL. Preferably, the bispecific single chain antibody construct is present in the pharmaceutical composition at a concentration between 0.1 to 5 mg/mL, preferably 0.2-2.5 mg/mL, more preferably 0.25-1.0 mg/mL.
[0103] Além da construção de anticorpo de cadeia simples biespecífica e do tampão, a composição farmacêutica da presente invenção compreende ainda uma β-ciclodextrina. Em geral, o termo "ciclodextrina" ou "CD" refere-se a oligossacarídeos cíclicos compostos por pelo menos 6 ou mais unidades de a-D-glicopiranosídeo ligado a 1^4. A estrutura unitária das ciclodextrinas é caracterizada por uma cavidade hidrofóbica com grupos éter no interior e um exterior polar que é caracterizado por grupos hidroxil primários. Muitas ciclodextrinas são conhecidas na técnica, incluindo 6-membros (α-ciclodextrinas), 7- membros (β-ciclodextrinas) e ciclodextrinas de 8-membros (Y- cododextrinas). As β-ciclodextrinas compreendendo 7 unidades de α-D- glucopiranosídeo são componentes particularmente preferidos da composição farmacêutica da invenção, na medida em que se demonstraram capazes de estabilizar com eficácia as construções de anticorpo de cadeia simples biespecíficas sob várias condições de tensão.[0103] In addition to the bispecific single chain antibody construct and the buffer, the pharmaceutical composition of the present invention further comprises a β-cyclodextrin. In general, the term "cyclodextrin" or "CD" refers to cyclic oligosaccharides composed of at least 6 or more 1^4-linked α-D-glucopyranoside units. The unitary structure of cyclodextrins is characterized by a hydrophobic cavity with ether groups on the interior and a polar exterior that is characterized by primary hydroxyl groups. Many cyclodextrins are known in the art, including 6-membered (α-cyclodextrins), 7-membered (β-cyclodextrins), and 8-membered cyclodextrins (Y-cododextrins). β-Cyclodextrins comprising 7 α-D-glucopyranoside units are particularly preferred components of the pharmaceutical composition of the invention, as they have been shown to effectively stabilize bispecific single chain antibody constructs under various stress conditions.
[0104] O termo "ciclodextrina" (e em particular "β-ciclodextrina") também engloba derivados de (β-)ciclodextrina quimicamente modificadas. Em geral, qualquer modificação química é concebível desde que não reduza ou elimine as propriedades vantajosas da composição farmacêutica, como demonstrado nos exemplos em anexo, e em particular, desde que as composições farmacêuticas mantenham a sua estabilidade. Derivados de ciclodextrina quimicamente modificadas resultam tipicamente da eterificação ou da introdução de outros grupos funcionais nos grupos 2-, 3- e 6-hidroxil dos resíduos de glicose. Assim, o termo inclui ciclodextrinas compreendendo uma ou mais substituições dos grupos hidroxila, por exemplo: ciclodextrinas hidroxialquiladas e alquiladas.[0104] The term "cyclodextrin" (and in particular "β-cyclodextrin") also encompasses chemically modified (β-)cyclodextrin derivatives. In general, any chemical modification is conceivable as long as it does not reduce or eliminate the advantageous properties of the pharmaceutical composition, as demonstrated in the attached examples, and in particular, as long as the pharmaceutical compositions maintain their stability. Chemically modified cyclodextrin derivatives typically result from etherification or the introduction of other functional groups into the 2-, 3- and 6-hydroxyl groups of glucose residues. Thus, the term includes cyclodextrins comprising one or more substitutions of the hydroxyl groups, for example: hydroxyalkylated and alkylated cyclodextrins.
[0105] Para o propósito da invenção, o termo "ciclodextrina" inclui ainda sal(is) farmaceuticamente aceitável(is) seu(s). O termo "sal(is) farmaceuticamente aceitável(is)", como aqui utilizado, denota aqueles sais de ciclodextrinas que são seguros e eficazes para administração. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles formados com ânions, tais como aqueles derivados de clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, ácidos tartárico, etc. e os formados com cátions tais como aqueles derivados de sódio, potássio, amônio, cálcio, isopropilamina hidróxido férrico, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc. Evidentemente, qualquer contra-ataque usado em produtos farmacêuticos deve ser considerado seguro e existem várias listas de contra-indicações farmacêuticas aprovadas, que variam dependendo da fonte. Os formadores de sal aprovados podem, por exemplo, ser encontrados no Manual de Sais Farmacêuticos (Stahl PH, Wermuth CG, editores. 2002. Handbook of pharmaceutical salts: Properties, selection and use. Weinheim/Zurique: Wiley-VCH/VHCA.).[0105] For the purpose of the invention, the term "cyclodextrin" further includes pharmaceutically acceptable salt(s) thereof. The term "pharmaceutically acceptable salt(s)" as used herein denotes those salts of cyclodextrins that are safe and effective for administration. Pharmaceutically acceptable salts include those formed with anions, such as those derived from hydrochloric, phosphoric, acetic, oxalic, tartaric acids, etc. and those formed with cations such as those derived from sodium, potassium, ammonium, calcium, isopropylamine, ferric hydroxide, triethylamine, 2-ethylaminoethanol, histidine, procaine, etc. Of course, any contraindication used in pharmaceutical products must be considered safe and there are several lists of approved pharmaceutical contraindications, which vary depending on the source. Approved salt formers can, for example, be found in the Handbook of Pharmaceutical Salts (Stahl PH, Wermuth CG, eds. 2002. Handbook of pharmaceutical salts: Properties, selection and use. Weinheim/Zurich: Wiley-VCH/VHCA.).
[0106] Desse modo, pretende-se que a composição farmacêutica da invenção compreenda uma β-ciclodextrina, particular uma selecionada do grupo que consiste em β-ciclodextrina, metil-β- ciclodextrina, hidroxietil-β-ciclodextrina, hidroxipropil-β-ciclodextrina, etil-β-ciclodextrina, butil-β-ciclodextrina Succinil-(2-hidroxipropil)-β- ciclodextrina, heptaquis(2,3,6-tri-O-metil)-β-ciclodextrina,heptaquis(2,3,6-tri-O-benzoil)-β-ciclodextrina, sal sódico de fosfato β- ciclodextrina, sal sódico de sulfato β-ciclodextrina, triacetil-β- ciclodextrina, sal heptassódico de heptaquis(6-O-sulfo)-β-ciclodextrina, sal sódico de carboximetil-β-ciclodextrina, sal sódico de sulfobutiléter—e— ciclodextrina e 6-O-p-toluenossulfonil-β-ciclodextrina. Em particular, a p- ciclodextrina pode ser o éster de sódio de éter sulfobutilico—β— ciclodextrina ("SBE—β—CD") e da hidroxipropil—β—ciclodextrina ("HP—β— CD").[0106] Thus, it is intended that the pharmaceutical composition of the invention comprises a β-cyclodextrin, in particular one selected from the group consisting of β-cyclodextrin, methyl-β-cyclodextrin, hydroxyethyl-β-cyclodextrin, hydroxypropyl-β-cyclodextrin, ethyl-β-cyclodextrin, butyl-β-cyclodextrin, succinyl-(2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin, heptakis(2,3,6-tri-O-methyl)-β-cyclodextrin, heptakis(2,3,6-tri-O-benzoyl)-β-cyclodextrin, β-cyclodextrin phosphate sodium salt, β-cyclodextrin sulfate sodium salt, triacetyl-β-cyclodextrin, heptasodium salt of heptakis(6-O-sulfo)-β-cyclodextrin, carboxymethyl-β-cyclodextrin sodium salt, sulfobutyl ether-β-cyclodextrin sodium salt and 6-O-p-toluenesulfonyl-β-cyclodextrin. In particular, the p-cyclodextrin may be the sodium ester of sulfobutyl ether-β-cyclodextrin ("SBE-β-CD") and hydroxypropyl-β-cyclodextrin ("HP-β-CD").
[0107] Ela pode estar presente na composição farmacêutica em uma concentração na gama de 0,1% a 20% (p/v), preferencialmente de 0,5% a 2% (p/v) e mais preferencialmente de 0,8% a 1,5% (p/v).Considera—se em particular que a concentração de β—ciclodextrina quimicamente não modificada é de cerca de 1,8% (p/v) ou inferior, tal como cerca de 1,6% (p/v), cerca de 1,5% (p/v), cerca de 1,4% (p/v), cerca de 1,3% (p/v), cerca de 1,2% (p/v), cerca de 1,1% (p/v), cerca de 1,0% (p/v), cerca de 0,9% (p/v), cerca de 0,8% (p/v) ou inferior até uma concentração de cerca de 0,1% (p/v).[0107] It may be present in the pharmaceutical composition in a concentration in the range of 0.1% to 20% (w/v), preferably 0.5% to 2% (w/v) and more preferably 0.8% to 1.5% (w/v). It is in particular contemplated that the concentration of chemically unmodified β-cyclodextrin is about 1.8% (w/v) or lower, such as about 1.6% (w/v), about 1.5% (w/v), about 1.4% (w/v), about 1.3% (w/v), about 1.2% (w/v), about 1.1% (w/v), about 1.0% (w/v), about 0.9% (w/v), about 0.8% (w/v) or lower to a concentration of about 0.1% (w/v).
[0108] A composição farmacêutica da invenção compreende também um tampão, que pode ser selecionado do grupo que consiste em fosfato de potássio, ácido acético/acetato de sódio, ácido cítrico/citrato de sódio, ácido sucínico/sucinato de sódio, ácido tartárico/tartarato de sódio, histidina/HCl de histidina, glicina, Tris, glutamato, acetato e misturas destes, e em particular de fosfato de potássio, ácido cítrico/citrato de sódio, ácido sucínico, histidina, glutamato, acetato e suas combinações.[0108] The pharmaceutical composition of the invention also comprises a buffer, which may be selected from the group consisting of potassium phosphate, acetic acid/sodium acetate, citric acid/sodium citrate, succinic acid/sodium succinate, tartaric acid/sodium tartrate, histidine/histidine HCl, glycine, Tris, glutamate, acetate and mixtures thereof, and in particular potassium phosphate, citric acid/sodium citrate, succinic acid, histidine, glutamate, acetate and combinations thereof.
[0109] As concentrações de tampão adequadas englobam concentrações de cerca de 200 mM ou menos, tal como cerca de 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 ou 5 mM. Aqueles versados na técnica serão prontamente capazes de ajustar as concentrações de tampão de modo a proporcionar estabilidade à composição farmacêutica, como descrito aqui. As concentrações de tampão previstas na composição farmacêutica da invenção variam especificamente de cerca de 5 a cerca de 200 mM, preferencialmente de cerca de 5 a cerca de 100 mM e mais preferencialmente de cerca de 10 a cerca de 50 mM.[0109] Suitable buffer concentrations encompass concentrations of about 200 mM or less, such as about 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 or 5 mM. Those skilled in the art will be readily able to adjust buffer concentrations so as to provide stability to the pharmaceutical composition as described herein. Buffer concentrations envisaged in the pharmaceutical composition of the invention specifically range from about 5 to about 200 mM, preferably from about 5 to about 100 mM and more preferably from about 10 to about 50 mM.
[0110] A composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ter um pH na gama de cerca de 4 a cerca de 7,5, isto é, um pH de 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7 ou 7,5. De preferência, o pH está na gama de cerca de 5 a cerca de 7,5, de preferência de cerca de 5,5 a cerca de 7,5.[0110] The pharmaceutical composition according to the invention may have a pH in the range of about 4 to about 7.5, i.e. a pH of 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7 or 7.5. Preferably, the pH is in the range of about 5 to about 7.5, preferably from about 5.5 to about 7.5.
[0111] Como utilizado aqui, o termo "composição farmacêutica" refere-se a uma composição que é adequada para administração a um indivíduo que dela necessite. Os termos "sujeito", "indivíduo" ou "animal" ou "paciente" são usados aqui intercambiavelmente para se referir a qualquer sujeito, particularmente um sujeito mamífero, a quem a administração da composição farmacêutica da invenção é desejada. Os sujeitos mamíferos incluem seres humanos, primatas não humanos, cães, gatos, porquinhos-da-índia, coelhos, camundongos, ratos, cavalos, vacas, gado e afins, sendo os humanos preferidos. A composição farmacêutica da presente invenção é estável e farmaceuticamente aceitável, isto é, capaz de desencadear o efeito terapêutico desejado sem causar nenhum efeito local ou sistêmico indesejáveis no indivíduo ao qual a composição farmacêutica é administrada. As composições farmaceuticamente aceitáveis da invenção podem, em particular, ser estéreis e/ou farmaceuticamente inertes. Especificamente, o termo "farmaceuticamente aceitável" pode significar aprovado por uma agência reguladora ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para utilização em animais, mais particularmente em humanos.[0111] As used herein, the term "pharmaceutical composition" refers to a composition that is suitable for administration to a subject in need thereof. The terms "subject", "individual" or "animal" or "patient" are used interchangeably herein to refer to any subject, particularly a mammalian subject, to whom administration of the pharmaceutical composition of the invention is desired. Mammalian subjects include humans, non-human primates, dogs, cats, guinea pigs, rabbits, mice, rats, horses, cows, cattle and the like, with humans being preferred. The pharmaceutical composition of the present invention is stable and pharmaceutically acceptable, that is, capable of eliciting the desired therapeutic effect without causing any undesirable local or systemic effects in the subject to which the pharmaceutical composition is administered. The pharmaceutically acceptable compositions of the invention may, in particular, be sterile and/or pharmaceutically inert. Specifically, the term "pharmaceutically acceptable" may mean approved by a regulatory agency or other generally recognized pharmacopoeia for use in animals, more particularly in humans.
[0112] A composição farmacêutica da invenção compreende uma ou várias construções de anticorpo de cadeia simples biespecíficas aqui descritas, de preferência a uma quantidade terapeuticamente eficaz, uma p-ciclodextrina e um tampão. Por "quantidade terapeuticamente eficaz" entende-se uma quantidade da referida construção que induz o efeito terapêutico desejado. A eficácia terapêutica e toxicidade de tais compostos por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou com animais experimentais, como, por exemplo, ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população) e LD50 (a dose letal para 50% da população). A relação de dose entre efeitos terapêuticos e tóxicos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a razão ED50/LD50. São preferidas, em geral, as composições farmacêuticas que exibem grandes índices terapêuticos.[0112] The pharmaceutical composition of the invention comprises one or more bispecific single chain antibody constructs described herein, preferably in a therapeutically effective amount, a β-cyclodextrin and a buffer. By "therapeutically effective amount" is meant an amount of said construct that induces the desired therapeutic effect. The therapeutic efficacy and toxicity of such compounds by standard pharmaceutical procedures in cell cultures or with experimental animals, such as, for example, ED50 (the therapeutically effective dose in 50% of the population) and LD50 (the lethal dose for 50% of the population). The dose relationship between therapeutic and toxic effects is the therapeutic index and can be expressed as the ratio ED50/LD50. Pharmaceutical compositions that exhibit large therapeutic indices are generally preferred.
[0113] Além da β-ciclodextrina e do tampão descrito anteriormente, a composição farmacêutica pode compreender opcionalmente um ou mais excipientes, desde que eles não reduzam ou excluam as suas propriedades vantajosas, conforme descritas aqui, e em particular a sua estabilidade.[0113] In addition to the β-cyclodextrin and the buffer described above, the pharmaceutical composition may optionally comprise one or more excipients, provided that they do not reduce or exclude its advantageous properties, as described herein, and in particular its stability.
[0114] Os excipientes podem ser usados na invenção para uma vasta variedade de fins, tais como o ajuste de propriedades físicas, químicas, ou biológicas das formulações, tais como o ajuste de viscosidade, e os processos da invenção para melhorar a eficácia e ou para estabilizar adicionalmente essas formulações e processos contra a degradação e deterioração devida, por exemplo, a estresses que ocorrem durante a fabricação, transporte, armazenamento, preparação pré-uso, administração, e daí em diante. O termo "excipiente" geralmente inclui enchimentos, aglutinantes, desintegrantes, revestimentos, sorventes, antiaderentes, deslizantes, conservantes, antioxidantes, aromatizantes, corantes, agentes aditivos, solventes, co- solventes, agentes de tamponamento, agentes quelantes, agentes transmissores de viscosidade, agentes ativos de superfície, diluentes, umectantes, transportadores, diluentes, conservantes, emulsionantes, estabilizadores e modificadores de tonicidade.[0114] Excipients may be used in the invention for a wide variety of purposes, such as adjusting the physical, chemical, or biological properties of the formulations, such as adjusting viscosity, and processes of the invention to improve efficacy and/or to further stabilize such formulations and processes against degradation and deterioration due, for example, to stresses occurring during manufacturing, transportation, storage, pre-use preparation, administration, and the like. The term "excipient" generally includes fillers, binders, disintegrants, coatings, sorbents, anti-adherents, glidants, preservatives, antioxidants, flavorings, coloring agents, additives, solvents, co-solvents, buffering agents, chelating agents, viscosity-transferring agents, surface-active agents, diluents, humectants, carriers, diluents, preservatives, emulsifiers, stabilizers, and tonicity modifiers.
[0115] Os excipientes aceitáveis são, de preferência, farmaceuticamente aceitáveis, isto é, não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações usadas.[0115] Acceptable excipients are preferably pharmaceutically acceptable, i.e. non-toxic to recipients at the dosages and concentrations used.
[0116] Os excipientes exemplificativos incluem, sem limitação:• aminoácidos tais como glicina, alanina, glutamina, asparagina, treonina, prolina, 2-fenilalanina, incluindo aminoácidos carregados, preferencialmente, lisina, acetato de lisina, arginina, glutamato e/ou histidina.• conservantes, incluindo antimicrobianos, tais como agentes antibacterianos e antifúngicos• antioxidantes, tais como ido ascórbico, metionina, sulfito de sódio ou hidrogenossulfito de sódio;• tampões, sistemas de tampão e agentes tampão que são utilizados para manter a composição a pH fisiológico ou a um pH ligeiramente inferior, tipicamente dentro de um intervalo de pH de cerca de 5 a cerca de 8 ou 9; exemplos de tampões são borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos, succinato, fosfato, histidina e acetato; por exemplo, tampão Tris de cerca de pH 7,0-8,5, ou tampão de acetato de cerca de pH 4,0-5,5.• solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais, tais como azeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila;• veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, suspensões ou emulsões incluindo solução salina e meios tamponados;• polímeros biodegradáveis, tais como poliésteres;• agentes de volume tais como manitol ou glicina;• agentes quelantes tais como ácido etilenodiaminotetracético (EDTA);• agentes isotônicos e retardadores de absorção;• agentes complexantes tais como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipropil-beta- ciclodextrina)• agentes de enchimento;• monossacarídeos; dissacarídeos; e outros carboidratos (como glicose, manose ou dextrina); os carboidratos podem ser açúcares não redutores, preferencilamente, trealose, sacarose, octasulfato, sorbitol ou xilitol;• proteínas (de baixo peso molecular), polipeptídeos ou veículos proteináceos tais como albumina de soro humano ou bovino, gelatina ou imunoglobulinas, preferencialmente, de origem humana;• agentes corantes e flavorizantes;• agentes redutores contendo enxofre, tais como glutationa, ácido tioctico, tioglicolato de sódio, tioglicerol, alfa-monotioglicerol e tio- sulfato de sódio• agentes de diluição;• agentes emulsionantes;• polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona)• contra-ions formadores de sal, como o sódio;• conservantes tais como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes e semelhantes; exemplos são: cloreto de benzalcônio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetilico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogênio);• complexos metálicos tais como complexos de Zn-proteína;• solventes e cossolventes (tais como glicerina, propilenoglicol ou polietilenoglicol);• açúcares e álcoois de açúcar, incluindo polióis, trealose, sacarose, octassulfato, manitol, sorbitol ou xilitol estaquiose, manose, sorbose, xilose, ribose, mioinisitose, galactose, lactitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol, ciclitos (por exemplo, inositol), polietilenoglicol; e álcoois de açúcar poli-hídricos;• agentes de suspensão;• tensoativos ou agentes molhantes tais como plurônicos, PEG, ésteres de sorbitano, polissorbatos tais como polissorbato 20, polissorbato, tritão, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapa; os tensoativos podem ser detergentes, preferencialmente, com um peso molecular de> 1,2 KD e/ou um poliéter, preferencialmente, com um peso molecular de> 3 KD; exemplos não limitativos para detergentes preferenciais são Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 e Tween 85; exemplos não limitativos para poliéteres preferenciais são PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 e PEG 5000;• agentes que melhoram a estabilidade tais como sacarose ou sorbitol;• agentes intensificadores de tonicidade tais como halogenetos de metais alcalinos, preferencialmente, cloreto de sódio ou potássio, manitol sorbitol;• veículos de administração parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, solução lática de Ringer ou óleos fixos;• os veículos de administração intravenosa incluem repositores de fluido e nutrientes, repositores de eletrólitos (tais como aqueles baseados na dextrose de Ringer).[0116] Exemplary excipients include, without limitation: amino acids such as glycine, alanine, glutamine, asparagine, threonine, proline, 2-phenylalanine, including charged amino acids, preferably lysine, lysine acetate, arginine, glutamate, and/or histidine; preservatives, including antimicrobials, such as antibacterial and antifungal agents; antioxidants, such as ascorbic acid, methionine, sodium sulfite, or sodium hydrogen sulfite; buffers, buffer systems, and buffering agents that are used to maintain the composition at physiological pH or a slightly lower pH, typically within a pH range of about 5 to about 8 or 9; examples of buffers are borate, bicarbonate, Tris-HCl, citrates, phosphates or other organic acids, succinate, phosphate, histidine, and acetate; for example, Tris buffer of about pH 7.0-8.5, or acetate buffer of about pH 4.0-5.5.• Nonaqueous solvents are propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable organic esters such as ethyl oleate;• Aqueous vehicles include water, alcoholic/aqueous solutions, suspensions or emulsions including saline, and buffered media;• Biodegradable polymers such as polyesters;• Bulking agents such as mannitol or glycine;• Chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA);• Isotonic and absorption-delaying agents;• Complexing agents such as caffeine, polyvinylpyrrolidone, beta-cyclodextrin, or hydroxypropyl-beta-cyclodextrin)• Fillers;• Monosaccharides; disaccharides; and other carbohydrates (such as glucose, mannose, or dextrin); carbohydrates may be non-reducing sugars, preferably trehalose, sucrose, octasulfate, sorbitol or xylitol;• proteins (of low molecular weight), polypeptides or proteinaceous carriers such as human or bovine serum albumin, gelatin or immunoglobulins, preferably of human origin;• coloring and flavoring agents;• sulfur-containing reducing agents such as glutathione, thioctic acid, sodium thioglycolate, thioglycerol, alpha-monothioglycerol and sodium thiosulfate;• diluting agents;• emulsifying agents;• hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone)• salt-forming counterions such as sodium;• preservatives such as antimicrobials, antioxidants, chelating agents, inert gases and the like; examples are: benzalkonium chloride, benzoic acid, salicylic acid, thimerosal, phenethyl alcohol, methylparaben, propylparaben, chlorhexidine, sorbic acid or hydrogen peroxide);• metal complexes such as Zn-protein complexes;• solvents and co-solvents (such as glycerol, propylene glycol or polyethylene glycol);• sugars and sugar alcohols including polyols, trehalose, sucrose, octasulfate, mannitol, sorbitol or xylitol stachyose, mannose, sorbose, xylose, ribose, myoinisitose, galactose, lactitol, ribitol, myoinisitol, galactitol, glycerol, cyclites (e.g. inositol), polyethylene glycol; and polyhydric sugar alcohols;• suspending agents;• surfactants or wetting agents such as pluronics, PEG, sorbitan esters, polysorbates such as polysorbate 20, polysorbate, triton, tromethamine, lecithin, cholesterol, tyloxapa; the surfactants may be detergents, preferably with a molecular weight of >1.2 KD and/or a polyether, preferably with a molecular weight of >3 KD; non-limiting examples for preferred detergents are Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 and Tween 85; non-limiting examples of preferred polyethers are PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 and PEG 5000; • stability enhancing agents such as sucrose or sorbitol; • tonicity enhancing agents such as alkali metal halides, preferably sodium or potassium chloride, mannitol or sorbitol; • parenteral administration vehicles include sodium chloride solution, Ringer's dextrose, dextrose and sodium chloride, Ringer's lactic acid solution or fixed oils; • intravenous administration vehicles include fluid and nutrient replenishers, electrolyte replenishers (such as those based on Ringer's dextrose).
[0117] É evidente para os versados na técnica que os diferentes excipientes da composição farmacêutica (por exemplo, os listados acima) podem ter efeitos diferentes, por exemplo, e o aminoácido pode atuar como um tampão, um estabilizador e/ou um antioxidante; o manitol pode agir como um agente de volume e/ou um agente que melhora a tonicidade; o cloreto de sódio pode atuar como veículo de entrega e/ou agente intensificador de tonicidade; etc.[0117] It is apparent to those skilled in the art that different excipients of the pharmaceutical composition (e.g., those listed above) may have different effects, for example, the amino acid may act as a buffer, a stabilizer, and/or an antioxidant; mannitol may act as a bulking agent and/or a tonicity-enhancing agent; sodium chloride may act as a delivery vehicle and/or a tonicity-enhancing agent; etc.
[0118] Os polióis são agentes estabilizantes úteis em formulações líquidas e liofilizadas para proteger proteínas de processos de degradação física e química e também são úteis para ajustar a tonicidade das formulações. Os polióis incluem açúcares, por exemplo, manitol, sacarose e sorbitol e álcoois poli-hídricos, tais como, por exemplo, glicerol e propileno glicol, e, para fins da discussão neste documento, polietileno glicol (PEG) e substâncias relacionadas. O manitol é usado comumente para garantir a estabilidade estrutural do bolo em formulações liofilizadas. Ele garante a estabilidade estrutural na torta. Ele é geralmente usado com um lioprotetor, por exemplo, sacarose. Sorbitol e sacarose geralmente são os agentes usados para ajustar a tonicidade e como estabilizantes para proteger contra estresses de congelamento e descongelamento durante o transporte ou a preparação dos volumes durante o processo de fabricação. O PEG é útil para estabilizar proteínas e como crioprotetor.[0118] Polyols are useful stabilizing agents in liquid and freeze-dried formulations to protect proteins from physical and chemical degradation processes and are also useful for adjusting the tonicity of the formulations. Polyols include sugars, e.g., mannitol, sucrose, and sorbitol, and polyhydric alcohols, e.g., glycerol and propylene glycol, and, for the purposes of the discussion herein, polyethylene glycol (PEG) and related substances. Mannitol is commonly used to ensure the structural stability of the cake in freeze-dried formulations. It ensures structural stability in the cake. It is generally used with a lyoprotectant, e.g., sucrose. Sorbitol and sucrose are commonly used as tonicity adjusting agents and as stabilizers to protect against freeze-thaw stresses during transportation or bulk preparation during the manufacturing process. PEG is useful for stabilizing proteins and as a cryoprotectant.
[0119] Tensoativos são usados rotineiramente para prevenir, minimizar ou reduzir a adsorção superficial. As moléculas de proteína podem ser susceptíveis à adsorção em as superfícies e à desnaturação e consequente agregação em interfaces ar-líquido, líquido-sólido e líquido-líquido. Esses efeitos são geralmente inversamente proporcionais à concentração de proteína. Essas interações prejudiciais são geralmente inversamente proporcionais à concentração de proteína e, normalmente, são exacerbadas por agitação física, tal como aquela gerada durante o transporte e manuseio de um produto. Os tensoativos geralmente usados incluem polissorbato 20, polissorbato 80, outros ésteres de ácidos graxos de polietoxilatos de sorbitano, e poloxâmero 188. Os tensoativos também são usados rotineiramente para controlar a estabilidade conformacional da proteína. O uso de surfatantes a este respeito é específico da proteína, pois qualquer tensoativo tipicamente estabilizará algumas proteínas e desestabilizará outras.[0119] Surfactants are routinely used to prevent, minimize, or reduce surface adsorption. Protein molecules can be susceptible to adsorption on surfaces and to denaturation and subsequent aggregation at air-liquid, liquid-solid, and liquid-liquid interfaces. These effects are generally inversely proportional to protein concentration. These detrimental interactions are generally inversely proportional to protein concentration and are typically exacerbated by physical agitation, such as that generated during transport and handling of a product. Commonly used surfactants include polysorbate 20, polysorbate 80, other fatty acid esters of sorbitan polyethoxylates, and poloxamer 188. Surfactants are also routinely used to control protein conformational stability. The use of surfactants in this regard is protein-specific, as any given surfactant will typically stabilize some proteins and destabilize others.
[0120] Os polissorbatos são suscetíveis à degradação oxidativa e, muitas vezes, conforme fornecido, contêm quantidades suficientes de peróxidos para causar a oxidação de cadeias laterais de resíduos proteicos, especialmente metionina. Consequentemente, os polissorbatos devem ser utilizados com cuidado e, quando utilizados, devem ser utilizados na sua menor concentração efetiva.[0120] Polysorbates are susceptible to oxidative degradation and often, as supplied, contain sufficient amounts of peroxides to cause oxidation of side chains of protein residues, especially methionine. Consequently, polysorbates should be used with caution and, when used, should be used at their lowest effective concentration.
[0121] Até certo ponto, os antioxidantes podem evitar a oxidação deletéria das proteínas em formulações farmacêuticas, mantendo níveis adequados de oxigênio e temperatura ambiente e evitando a exposição à luz. Excipientes antioxidantes podem ser usados bem como para prevenir a degradação oxidativa de proteínas. Entre os antioxidantes úteis quanto a esse aspecto estão os agentes redutores, eliminadores de oxigênio/radicais livres e agentes quelantes. Os antioxidantes para utilização em formulações de proteínas terapêuticas preferencialmente são solúveis em água e mantêm a sua atividade ao longo da vida útil de um produto. O EDTA é um exemplo útil.[0121] To some extent, antioxidants can prevent deleterious oxidation of proteins in pharmaceutical formulations by maintaining adequate oxygen levels and ambient temperature and avoiding exposure to light. Antioxidant excipients can also be used to prevent oxidative degradation of proteins. Antioxidants useful in this regard include reducing agents, oxygen/free radical scavengers and chelating agents. Antioxidants for use in therapeutic protein formulations are preferably water-soluble and maintain their activity throughout the shelf life of a product. EDTA is a useful example.
[0122] Os íons metálicos podem atuar como co-fatores proteicos e permitir a formação de complexos de coordenação de proteínas. Os íons metálicos também podem inibir alguns processos que degradam proteínas. No entanto, os íons metálicos também catalisam os processos físicos e químicos que degradam as proteínas. Íons magnésio (10-120 mM) podem ser usados para inibir a isomerização de ácido aspártico em ácido isoaspártico. Os íons de Ca+2 (até 100 mM) podem aumentar a estabilidade da desoxirribonuclease humana. Mg+2, Mn+2e Zn+2, no entanto, pode desestabilizar a rhDNase. Da mesma forma, Ca+2 e Sr+2 pode estabilizar o Fator VIII, pode ser desestabilizado por Mg+2, Mn+2 e Zn+2, Cu+2 e Fe+2 e sua agregação pode ser aumentada por íons de Al+3.[0122] Metal ions can act as protein cofactors and allow the formation of protein coordination complexes. Metal ions can also inhibit some processes that degrade proteins. However, metal ions also catalyze the physical and chemical processes that degrade proteins. Magnesium ions (10-120 mM) can be used to inhibit the isomerization of aspartic acid to isoaspartic acid. Ca+2 ions (up to 100 mM) can increase the stability of human deoxyribonuclease. Mg+2, Mn+2, and Zn+2, however, can destabilize rhDNase. Similarly, Ca+2 and Sr+2 can stabilize Factor VIII, it can be destabilized by Mg+2, Mn+2 and Zn+2, Cu+2 and Fe+2 and its aggregation can be increased by Al+3 ions.
[0123] Os conservantes têm a função principal de inibir o crescimento microbiano e assegurar a esterilidade do produto durante todo o prazo de validade ou termo de uso do medicamento, e são particularmente necessários para formulações de várias doses. Os conservantes geralmente usados incluem álcool benzílico, fenol e m- cresol. Embora os conservantes tenham um longo histórico de uso com parenterais de moléculas pequenas, o desenvolvimento de formulações de proteína que inclui conservantes pode ser um desafio. Os conservantes quase sempre têm um efeito desestabilizador (agregação) em proteínas, e isso se tornou um fator importante na limitação do seu uso em formulações de proteínas. Até o momento, a maioria das drogas proteicas foi formulada para uso exclusivo. No entanto, quando as formulações de doses múltiplas são possíveis, elas têm a vantagem adicional de permitir a conveniência do paciente e maior comercialização. Um bom exemplo é o hormônio do crescimento humano (hGH), onde o desenvolvimento de formulações preservadas levou à comercialização de apresentações de canetas de injeção multiuso mais convenientes.[0123] Preservatives have the primary function of inhibiting microbial growth and ensuring product sterility throughout the shelf life or term of use of the drug, and are particularly necessary for multi-dose formulations. Commonly used preservatives include benzyl alcohol, phenol, and m-cresol. Although preservatives have a long history of use with small molecule parenterals, developing protein formulations that include preservatives can be challenging. Preservatives almost always have a destabilizing (aggregating) effect on proteins, and this has become a major factor in limiting their use in protein formulations. To date, most protein drugs have been formulated for single-use use. However, when multi-dose formulations are possible, they have the added advantage of allowing for patient convenience and increased marketability. A good example is human growth hormone (hGH), where the development of preserved formulations has led to the commercialization of more convenient multi-use injection pen presentations.
[0124] Como seria de se esperar, o desenvolvimento de formulações líquidas contendo conservantes são mais desafiantes do que as formulações liofilizadas. Os produtos liofilizados podem ser liofilizados sem o conservante e reconstituídos com um conservante contendo diluente no momento da utilização. Isso reduz o tempo durante o qual um conservante está em contato com a proteína, minimizando significativamente os riscos de estabilidade associados. Com formulações líquidas, a eficácia e a estabilidade do conservante devem ser mantidas ao longo da vida útil do produto (cerca de 18 a 24 meses). Um ponto importante a se observar é que a eficácia conservadora deve ser demonstrada na formulação final contendo a droga ativa e todos os componentes do excipiente.[0124] As might be expected, the development of liquid formulations containing preservatives is more challenging than lyophilized formulations. Lyophilized products can be lyophilized without the preservative and reconstituted with a preservative containing diluent at the time of use. This reduces the time during which a preservative is in contact with the protein, significantly minimizing the associated stability risks. With liquid formulations, the efficacy and stability of the preservative must be maintained throughout the shelf life of the product (approximately 18 to 24 months). An important point to note is that preservative efficacy must be demonstrated in the final formulation containing the active drug and all excipient components.
[0125] Os sais podem ser utilizados de acordo com a invenção para, por exemplo, ajustar a intensidade iônica e/ou a isotonicidade da formulação farmacêutica e/ou para melhorar ainda mais a solubilidade e/ou a estabilidade física da construção de anticorpo ou outro ingrediente. Como bem se sabe, os íons podem estabilizar o estado nativo das proteínas, ligando-se a resíduos carregados na superfície da proteína e protegendo grupos carregados e polares na proteína e reduzindo a força de suas interações eletrostáticas, interações atraentes e repulsivas. Os íons também podem estabilizar o estado desnaturado de uma proteína, unindo, em particular, as ligações peptídicas desnaturadas (- CONH) da proteína. Além disso, a interação iônica com grupos carregados e polares em uma proteína também pode reduzir as interações eletrostáticas intermoleculares e, assim, prevenir ou reduzir a agregação de proteínas e a insolubilidade. As espécies iônicas diferem quanto aos efeitos sobre as proteínas. Foram desenvolvidos vários rankings categóricos de íons e seus efeitos sobre proteínas que podem ser utilizados na formulação de composições farmacêuticas de acordo com a invenção. Um exemplo é a série Hofmeister, que classifica os solutos iônicos e não iônicos polares por seu efeito sobre a estabilidade conformacional das proteínas em solução. Os solutos de estabilização são mencionados como "cosmotrópicos". Os solutos de desestabilização são mencionados como "caotrópicos". Os cosmotrópicos são comumente usados em altas concentrações (por exemplo, sulfato de amônio de >1 molar) para precipitar as proteínas da solução ("salting-out"). Os caotrópicos geralmente são usados para prótese e/ou para solubilizar proteínas ("salting-in"). A eficácia relativa dos íons para "salt-in" e "salt-out" define sua posição na série Hofmeister.[0125] Salts can be used according to the invention to, for example, adjust the ionic strength and/or isotonicity of the pharmaceutical formulation and/or to further improve the solubility and/or physical stability of the antibody construct or other ingredient. As is well known, ions can stabilize the native state of proteins by binding to charged residues on the protein surface and shielding charged and polar groups on the protein and reducing the strength of their electrostatic interactions, attractive and repulsive interactions. Ions can also stabilize the denatured state of a protein by bridging in particular the denatured peptide bonds (-CONH) of the protein. Furthermore, ionic interaction with charged and polar groups on a protein can also reduce intermolecular electrostatic interactions and thus prevent or reduce protein aggregation and insolubility. Ionic species differ in their effects on proteins. Several categorical rankings of ions and their effects on proteins have been developed that can be used in the formulation of pharmaceutical compositions according to the invention. One example is the Hofmeister series, which classifies polar ionic and non-ionic solutes by their effect on the conformational stability of proteins in solution. Stabilizing solutes are referred to as "kosmotropes." Destabilizing solutes are referred to as "chaotropes." Kosmotropes are commonly used in high concentrations (e.g., >1 molar ammonium sulfate) to precipitate proteins from solution ("salting-out"). Chaotropes are generally used for prosthetics and/or for solubilizing proteins ("salting-in"). The relative effectiveness of the ions for "salting-in" and "salting-out" defines their position in the Hofmeister series.
[0126] Os aminoácidos livres podem ser utilizados na composição farmacêutica como agentes de volume, estabilizadores e antioxidantes, bem como outros usos convencionais. Lisina, prolina, serina e alanina podem ser usadas para estabilizar proteínas em uma formulação. Glicina é útil na liofilização para garantir a estrutura e propriedades corretas da torta. Arginina pode ser útil para inibir a agregação de proteínas, tanto em formulações líquidas quanto liofilizadas. A metionina é útil como antioxidante.[0126] Free amino acids can be used in pharmaceutical compounding as bulking agents, stabilizers and antioxidants, as well as other conventional uses. Lysine, proline, serine and alanine can be used to stabilize proteins in a formulation. Glycine is useful in freeze-drying to ensure the correct cake structure and properties. Arginine can be useful to inhibit protein aggregation, both in liquid and freeze-dried formulations. Methionine is useful as an antioxidant.
[0127] Os excipientes particularmente úteis para a formulação da composição farmacêutica incluem sacarose, trealose, manitol, sorbitol, arginina, lisina, polissorbato 20, polissorbato 80, poloxâmero 188, plurônico e suas combinações. Os excipientes referidos podem estar presentes na composição farmacêutica a diferentes concentrações, desde que a composição exiba as propriedades desejáveis, conforme exemplificativo aqui, e, em particular, promova a estabilização das construções de anticorpo de cadeia simples biespecíficas contidas. Por exemplo, a sacarose pode estar presente na composição farmacêutica a uma concentração entre 2% (p/v) e 12% (p/v), isto é, a uma concentração de 12% (p/v), 11% (p/v), 10% (p/v), 9% (p/v), 8% (p/v), 7% (p/v), 6% (p/v), 5% (p/v), 4% (p/v), 3% (p/v) ou 2% (p/v). As concentrações preferidas de sacarose variam entre 4% (p/v) e 10% (p/v) e mais preferencialmente entre 6% (p/v) e 10% (p/v). O polissorbato 80 pode estar presente na composição farmacêutica a uma concentração entre 0,001% (p/v) e 0,5% (p/v), isto é, a uma concentração de 0,5% (p/v), 0,2% (p/v), 0,1% (p/v), 0,08% (p/v), 0,05% (p/v), 0,02% (p/v), 0,01% (p/v), 0,008% (p/v), 0,005% (p/v), 0,002% (p/v) ou 0,001% (p/v). As concentrações preferidas de polissorbato 80 variam entre 0,002% (p/v) e 0,5% (p/v) e, de preferência, entre 0,005% (p/v) e 0,02% (p/v).[0127] Excipients particularly useful for the formulation of the pharmaceutical composition include sucrose, trehalose, mannitol, sorbitol, arginine, lysine, polysorbate 20, polysorbate 80, poloxamer 188, pluronic and combinations thereof. Said excipients may be present in the pharmaceutical composition at different concentrations, provided that the composition exhibits the desirable properties, as exemplified herein, and, in particular, promotes the stabilization of the bispecific single chain antibody constructs contained therein. For example, sucrose may be present in the pharmaceutical composition at a concentration between 2% (w/v) and 12% (w/v), that is, at a concentration of 12% (w/v), 11% (w/v), 10% (w/v), 9% (w/v), 8% (w/v), 7% (w/v), 6% (w/v), 5% (w/v), 4% (w/v), 3% (w/v) or 2% (w/v). Preferred concentrations of sucrose range from 4% (w/v) to 10% (w/v) and more preferably from 6% (w/v) to 10% (w/v). Polysorbate 80 may be present in the pharmaceutical composition at a concentration between 0.001% (w/v) and 0.5% (w/v), that is to say at a concentration of 0.5% (w/v), 0.2% (w/v), 0.1% (w/v), 0.08% (w/v), 0.05% (w/v), 0.02% (w/v), 0.01% (w/v), 0.008% (w/v), 0.005% (w/v), 0.002% (w/v) or 0.001% (w/v). Preferred concentrations of polysorbate 80 range from 0.002% (w/v) to 0.5% (w/v) and preferably from 0.005% (w/v) to 0.02% (w/v).
[0128] A composição farmacêutica fornecida aqui pode compreendem, particularmente, um ou mais conservantes.[0128] The pharmaceutical composition provided herein may particularly comprise one or more preservatives.
[0129] Os conservantes úteis para a formulação de composições farmacêuticas incluem geralmente antimicrobianos (por exemplo, agentes antibacterianos ou antifúngicos), antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes e similares; os exemplos incluem: cloreto de benzalcônio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerossal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogênio). Os conservantes antimicrobianos são substâncias utilizadas para prolongar o prazo de validade dos medicamentos, reduzindo a proliferação microbiana. Os conservantes particularmente úteis para formular a composição farmacêutica da invenção incluem álcool benzílico, clorobutanol, fenol, meta-cresol, metilparabeno, fenoxietanol e tiomerossal propilparabeno. A estrutura e a concentração típica para o uso desses conservantes estão descritas na Tabela 1 de Meyer et al. J Pharm Sci. 96(12), 3155.[0129] Preservatives useful for formulating pharmaceutical compositions generally include antimicrobials (e.g., antibacterial or antifungal agents), antioxidants, chelating agents, inert gases, and the like; examples include: benzalkonium chloride, benzoic acid, salicylic acid, thimerosal, phenethyl alcohol, methylparaben, propylparaben, chlorhexidine, sorbic acid, or hydrogen peroxide). Antimicrobial preservatives are substances used to extend the shelf life of drugs by reducing microbial growth. Preservatives particularly useful for formulating the pharmaceutical composition of the invention include benzyl alcohol, chlorobutanol, phenol, meta-cresol, methylparaben, phenoxyethanol, and thimerosal propylparaben. The structure and typical concentration for use of these preservatives are described in Table 1 of Meyer et al. J Pharm Sci. 96(12), 3155.
[0130] Os conservantes supramencionados podem estar presentes na composição farmacêutica a diferentes concentrações. Por exemplo, o álcool benzílico pode estar presente a uma concentração que varia entre 0,2 e 1,1% (v/v), clorobutanol a uma concentração que varia entre 0,3-0,5% (v/v), fenol a uma concentração que varia entre 0,07 e 0,5% (v/v), meta-cresol a uma concentração que varia entre 0,17 e 0-32% (v/v) ou tiomerossal a uma concentração que varia entre 0,003 e 0,01% (v/v). As concentrações preferidas do metilparabeno encontram-se na gama de 0,05 e 0,5% (v/v); para o fenoxietanol, na gama de 0,1 e 3% (v/v); e para o propilparabeno, na gama de 0,05 e 0,5% (v/v).[0130] The aforementioned preservatives may be present in the pharmaceutical composition at different concentrations. For example, benzyl alcohol may be present at a concentration ranging from 0.2 to 1.1% (v/v), chlorobutanol at a concentration ranging from 0.3-0.5% (v/v), phenol at a concentration ranging from 0.07 to 0.5% (v/v), meta-cresol at a concentration ranging from 0.17 to 0-32% (v/v) or thiomerosal at a concentration ranging from 0.003 to 0.01% (v/v). Preferred concentrations of methylparaben are in the range of 0.05 to 0.5% (v/v); for phenoxyethanol, in the range of 0.1 to 3% (v/v); and for propylparaben, in the range of 0.05 and 0.5% (v/v).
[0131] Contudo, também é concebível que a composiçãofarmacêutica não compreenda nenhum conservante. Em particular, a presente invenção proporciona, inter alia, uma composição farmacêutica sem conservantes, compreendendo uma construção de anticorpo de cadeia simples biespecífica com uma sequência de aminoácidos, conforme representada nas SEQ ID NOs 100 e 110 a uma concentração de cerca de 0,5 mg/ml, sal de sódio de sulfobutiléter-e- ciclodextrina a uma concentração de cerca de 1% (p/v) e fosfato de potássio na concentração de cerca de 10 mM e ainda sacarose a uma concentração de cerca de 8% (p/v) de polissorbato 80 na concentração de cerca de 0,01% (p/v) a um pH de cerca de 6,0.[0131] However, it is also conceivable that the pharmaceutical composition does not comprise any preservative. In particular, the present invention provides, inter alia, a preservative-free pharmaceutical composition comprising a bispecific single chain antibody construct having an amino acid sequence as represented in SEQ ID NOs 100 and 110 at a concentration of about 0.5 mg/ml, sulfobutyl ether-cyclodextrin sodium salt at a concentration of about 1% (w/v) and potassium phosphate at a concentration of about 10 mM and further sucrose at a concentration of about 8% (w/v) polysorbate 80 at a concentration of about 0.01% (w/v) at a pH of about 6.0.
[0132] As composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas em várias formas, por exemplo, na forma sólida, líquida, congelada, gasosa ou liofilizada, e podem ser, inter alia, sob a forma de um unguento, um creme, adesivos transdérmicos, gel, pó, comprimido, solução, aerossol, grânulos, pílulas, suspensões, emulsões, cápsulas, xaropes, fluidos, elixires, extratos, tintura ou extratos fluidos.[0132] The pharmaceutical compositions of the invention may be formulated in various forms, for example in solid, liquid, frozen, gaseous or lyophilized form, and may be, inter alia, in the form of an ointment, a cream, transdermal patches, gel, powder, tablet, solution, aerosol, granules, pills, suspensions, emulsions, capsules, syrups, fluids, elixirs, extracts, tincture or fluid extracts.
[0133] Geralmente, várias formas de armazenamento e/ou dosagem são concebíveis para a composição farmacêutica da invenção, dependendo, inter alia, da via de administração pretendida, do formato de administração e da dosagem desejada (ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 22a edição, Oslo, A., Ed., (2012)). Aqueles versados na técnica saberão que a escolha de uma determinada forma de dosagem pode, por exemplo, influenciar o estado físico, a estabilidade, a taxa de liberação in vivo e a taxa de depuração in vivo da construção de anticorpo da invenção.[0133] Generally, various storage and/or dosage forms are conceivable for the pharmaceutical composition of the invention, depending, inter alia, on the intended route of administration, the administration format and the desired dosage (see, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences, 22nd edition, Oslo, A., Ed., (2012)). Those skilled in the art will know that the choice of a particular dosage form can, for example, influence the physical state, stability, in vivo release rate and in vivo clearance rate of the antibody construct of the invention.
[0134] Por exemplo, o veículo ou transportador primário em uma composição farmacêutica pode ser aquosa ou não aquosa na natureza. Um veículo ou transportador adequado pode ser água para injeção, solução salina fisiológica ou fluido cerebroespinal artificial, possivelmente suplementado com outros materiais comuns em composições para administração parentérica. Uma solução salina tamponada neutra ou uma solução salina misturada com albumina sérica são outros veículos exemplificativos.[0134] For example, the primary vehicle or carrier in a pharmaceutical composition may be aqueous or non-aqueous in nature. A suitable vehicle or carrier may be water for injection, physiological saline, or artificial cerebrospinal fluid, possibly supplemented with other materials common in compositions for parenteral administration. A neutral buffered saline solution or a saline solution mixed with serum albumin are other exemplary vehicles.
[0135] Quando a administração parentérica for contemplada, as composições terapêuticas da invenção podem ser proporcionadas sob a forma de uma solução aquosa aceitável parenteralmente pirogênios que compreende a construção de anticorpo desejado em um veículo farmaceuticamente aceitável. Um veículo particularmente adequado para injeção parenteral é água destilada estéril na qual a construção de anticorpo é formulada como uma solução isotônica estéril, devidamente preservada. A preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, tal como microesferas injetáveis, partículas bio-erodíveis, compostos poliméricos (tais como ácido polilático ou ácido poliglicólico), contas ou lipossomas, que podem prover liberação controlada ou prolongada do produto, o qual pode ser entregue através de injeção depot. O ácido hialurônico também pode ser usado, tendo o efeito de promover a duração prolongada na circulação. Os dispositivos de administração de drogas implantáveis podem ser usados para introduzir o anticorpo desejado.[0135] Where parenteral administration is contemplated, the therapeutic compositions of the invention may be provided in the form of a pyrogen-free, parenterally acceptable aqueous solution comprising the desired antibody construct in a pharmaceutically acceptable carrier. A particularly suitable carrier for parenteral injection is sterile distilled water in which the antibody construct is formulated as a sterile, suitably preserved, isotonic solution. Preparation may involve formulating the desired molecule with an agent, such as injectable microspheres, bio-erodible particles, polymeric compounds (such as polylactic acid or polyglycolic acid), beads or liposomes, which may provide controlled or sustained release of the product, which may be delivered by depot injection. Hyaluronic acid may also be used, having the effect of promoting prolonged duration in the circulation. Implantable drug delivery devices may be used to introduce the desired antibody.
[0136] As formulações de liberação/administração sustentada ou controlada também são contempladas aqui. As técnicas para formulação de uma variedade de outros meios de entrega prolongada ou controlada, tais como carreadores lipossômicos, micropartículas bio- erodíveis ou contas porosas e injeções depot, também são conhecidas por aqueles versados na técnica. Veja, por exemplo, o pedido de patente internacional n° PCT/US93/00829, que descreve a liberação controlada de micropartículas poliméricas porosas para a entrega de composições farmacêuticas. Preparações de liberação prolongada podem incluir matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de artigos conformados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Matrizes de liberação prolongada podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactídeos (como descrito na Pat. No. 3.773.919 e Publicação de Pedido de Patente Europeia No. EP 058481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2: 547-556), poli(2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 e Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), acetato de etileno-vinila (Langer et al., 1981, supra) ou ácido poli-D(-)-3-hidroxi- butírico (Publicação de Pedido de Patente Europeia No. EP 133.988). As composições de liberação prolongada também podem incluir lipossomas que podem ser preparados por qualquer um dos vários métodos conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 82:3688-3692; Publicações de Pedido de Patente Europeia Nos. EP 036.676, EP 088.046 e EP 143.949. A construção de anticorpo também pode ser aprisionada em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de distribuição de drogas coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Essas técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 22a edição, Oslo, A., Ed., (2012).[0136] Sustained or controlled release/delivery formulations are also contemplated herein. Techniques for formulating a variety of other sustained or controlled delivery means, such as liposomal carriers, bio-erodible microparticles or porous beads, and depot injections, are also known to those skilled in the art. See, for example, International Patent Application No. PCT/US93/00829, which describes the controlled release of porous polymeric microparticles for the delivery of pharmaceutical compositions. Sustained release preparations may include semipermeable polymeric matrices in the form of shaped articles, e.g., films or microcapsules. Sustained-release matrices may include polyesters, hydrogels, polylactides (as described in U.S. Pat. No. 3,773,919 and European Patent Application Publication No. EP 058481), copolymers of L-glutamic acid and gamma ethyl-L-glutamate (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2:547-556), poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 and Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), ethylene vinyl acetate (Langer et al., 1981, supra ) or poly-D(-)-3-hydroxybutyric acid (European Patent Application Publication No. EP 133,988). Sustained-release compositions can also include liposomes that can be prepared by any of several methods known in the art. See, e.g., Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; European Patent Application Publication Nos. EP 036,676, EP 088,046, and EP 143,949. The antibody construct can also be entrapped in microcapsules prepared, e.g., by coacervation techniques or by interfacial polymerization, e.g., hydroxymethylcellulose or gelatin microcapsules and poly(methylmethacylate) microcapsules, respectively, in colloidal drug delivery systems (e.g., liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles, and nanocapsules), or in macroemulsions. These techniques are disclosed in Remington's Pharmaceutical Sciences, 22nd edition, Oslo, A., Ed., (2012).
[0137] As composições farmacêuticas usadas para administração in vivo são tipicamente providas na forma de preparações estéreis. A esterilização pode ser realizada por filtração através de membranas de filtração estéreis. Quando a composição é liofilizada, a esterilização usando esse método pode ser conduzida antes ou após a liofilização e reconstituição. As composições para administração parentérica podem ser armazenadas na forma liofilizada ou em uma solução. As composições parentéricas geralmente são colocadas em um recipiente com uma porta de acesso estéril, por exemplo, um saco ou frasco de solução intravenosa com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.[0137] Pharmaceutical compositions used for in vivo administration are typically provided in the form of sterile preparations. Sterilization may be accomplished by filtration through sterile filtration membranes. When the composition is lyophilized, sterilization using this method may be conducted before or after lyophilization and reconstitution. Compositions for parenteral administration may be stored in lyophilized form or in a solution. Parenteral compositions are generally placed in a container with a sterile access port, for example, an intravenous solution bag or vial with a stopper pierceable by a hypodermic injection needle.
[0138] As construções de anticorpo descritas neste documento também podem ser formulados como imunolipossomos. Um "lipossomo" é uma vesícula pequena composta de vários tipos de lipídios, fosfolipídios e/ou tensoativos que sejam úteis para administrar uma droga a um mamífero. Os componentes do lipossomo geralmente são dispostos em uma formação bicamada, semelhante à disposição lipídica das membranas biológicas. Os lipossomas contendo a construção de anticorpo são preparados por métodos conhecidos na técnica, tal como descrito em Epstein et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al. , Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); US Pat. Números 4.485.045 e 4.544.545; e W0 97/38731. Os lipossomas com tempo de circulação aumentado são divulgados na Patente U.S. No. 5.013.556. Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados pelo método de evaporação de fase inversa com uma composição lipídica compreendendo fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada com PEG (PEG-PE). Os lipossomos são extrudidos através de filtros de tamanho de poro definido para obter lipossomos com o diâmetro desejado. Os fragmentos Fab' de construção de anticorpo da presente invenção podem ser conjugados aos lipossomas como descrito em Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286288 (1982) através de uma reação de permuta de dissulfureto. Um agente quimioterapêutico está opcionalmente contido dentro do lipossomo. Veja Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989).[0138] The antibody constructs described herein may also be formulated as immunoliposomes. A "liposome" is a small vesicle composed of various types of lipids, phospholipids, and/or surfactants that are useful for delivering a drug to a mammal. The components of the liposome are generally arranged in a bilayer formation, similar to the lipid arrangement of biological membranes. Liposomes containing the antibody construct are prepared by methods known in the art, such as described in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); U.S. Pat. Nos. 4,485,045 and 4,544,545; and WO 97/38731. Liposomes with increased circulation time are disclosed in U.S. Patent No. 5,013,556. Particularly useful liposomes can be generated by the reverse phase evaporation method with a lipid composition comprising phosphatidylcholine, cholesterol, and PEG-derivatized phosphatidylethanolamine (PEG-PE). The liposomes are extruded through filters of defined pore size to obtain liposomes of the desired diameter. The antibody construct Fab' fragments of the present invention can be conjugated to the liposomes as described in Martin et al. J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) via a disulfide exchange reaction. A chemotherapeutic agent is optionally contained within the liposome. See Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989).
[0139] Está previsto que a composição da invenção possa compreender, além da construção de anticorpo de cadeia simples biespecífica definida neste documento, outros agentes biologicamente ativos, dependendo da utilização pretendida da composição. Tais agentes podem ser, em particular, drogas que atuam em tumores e/ou células malignas, mas também são concebíveis outros agentes ativos, dependendo da utilização pretendida da composição farmacêutica, incluindo agentes que atuam no sistema gastrointestinal, drogas inibidoras de imunorreações (por exemplo, corticosteroides), drogas moduladoras da resposta inflamatória, drogas que atuam no sistema circulatório e/ou agentes, como citocinas, conhecidos na técnica. Também está previsto que a composição farmacêutica da presente invenção seja aplicada em uma co-terapia, isto é, em combinação com outro medicamento anti-cancerígeno.[0139] It is envisaged that the composition of the invention may comprise, in addition to the bispecific single-chain antibody construct defined herein, other biologically active agents, depending on the intended use of the composition. Such agents may be, in particular, drugs that act on tumors and/or malignant cells, but other active agents are also conceivable, depending on the intended use of the pharmaceutical composition, including agents that act on the gastrointestinal system, drugs that inhibit immunoreactions (e.g. corticosteroids), drugs that modulate the inflammatory response, drugs that act on the circulatory system and/or agents, such as cytokines, known in the art. It is also envisaged that the pharmaceutical composition of the present invention will be applied in a co-therapy, i.e. in combination with another anti-cancer drug.
[0140] Uma vez que a composição farmacêutica tiver sido formulada, ela pode ser armazenada em frascos estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido, cristal ou como um pó desidratado ou liofilizado. Tais formulações podem ser armazenadas em uma forma pronta para uso ou em uma forma (por exemplo, liofilizada) que é reconstituída antes da administração. Por exemplo, as composições liofilizadas podem ser reconstituídas, por exemplo, água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina fisiológica, solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou a mesma formulação que a proteína tinha estado antes da liofilização.[0140] Once the pharmaceutical composition has been formulated, it can be stored in sterile vials as a solution, suspension, gel, emulsion, solid, crystal or as a dehydrated or lyophilized powder. Such formulations can be stored in a ready-to-use form or in a form (e.g. lyophilized) that is reconstituted prior to administration. For example, lyophilized compositions can be reconstituted in, for example, bacteriostatic water for injection (BWFI), physiological saline, phosphate buffered saline (PBS) or the same formulation as the protein had been in prior to lyophilization.
[0141] A composição farmacêutica da invenção pode ser formulada, em geral, para administração por qualquer via de administração adequada. No contexto da presente invenção, as vias de administração incluem, mas não se limitam a, vias tópicas (como epicutânea, inalatvia, nasal, ofáltmica, auricular, vaginal, mucosa); vias entéricas (como oral, gastrointestinal, sublingual, sublabial, bucal, retal); e vias parentéricas (como intravenosa, intra-arterial, intra-óssea, intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular, epidural, intratecal, subcutânea, intraperitoneal, extra-amniótica, intra-articular, intracardíaca, intradérmica, intralesional, intra-uterina, intravesical, intravítrea, transdérmica, intranasal, transmucosa, intrasinovial, intraluminal).[0141] The pharmaceutical composition of the invention may be formulated, in general, for administration by any suitable route of administration. In the context of the present invention, routes of administration include, but are not limited to, topical routes (such as epicutaneous, inhalation, nasal, ophthalmic, auricular, vaginal, mucosal); enteral routes (such as oral, gastrointestinal, sublingual, sublabial, buccal, rectal); and parenteral routes (such as intravenous, intra-arterial, intraosseous, intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular, epidural, intrathecal, subcutaneous, intraperitoneal, extra-amniotic, intra-articular, intracardiac, intradermal, intralesional, intrauterine, intravesical, intravitreal, transdermal, intranasal, transmucosal, intrasynovial, intraluminal).
[0142] As composições farmacêuticas descritas aqui são particularmente úteis para administração parentérica, por exemplo, administração subcutânea ou intravenosa, por exemplo, por injeção, tal como injeção de bolus ou por infusão, por exemplo: por infusão contínua. As composições farmacêuticas podem ser administradas utilizando um dispositivo médico. Exemplos de dispositivos médicos para administrar composições farmacêuticas estão descritos nas Patentes dos EUA Nos. 4.475.196; 4.439.196; 4.447.224; 4.447.233; 4.486.194; 4.487.603; 4.596.556; 4.790.824; 4.941.880; 5.064.413; 5.312.335; 5.312.335; 5.383.851; e 5.399.163.[0142] The pharmaceutical compositions described herein are particularly useful for parenteral administration, e.g., subcutaneous or intravenous administration, e.g., by injection, such as a bolus injection, or by infusion, e.g., by continuous infusion. The pharmaceutical compositions can be administered using a medical device. Examples of medical devices for administering pharmaceutical compositions are described in U.S. Patent Nos. 4,475,196; 4,439,196; 4,447,224; 4,447,233; 4,486,194; 4,487,603; 4,596,556; 4,790,824; 4,941,880; 5,064,413; 5,312,335; 5,383,851; and 5,399,163.
[0143] A composição farmacêutica da invenção também pode ser administrada ininterruptamente. A título de exemplo não limitativo, a administração ininterrupta ou substancialmente ininterrupta, isto é: a administração contínua, pode ser realizada por um sistema de bomba pequeno usado pelo paciente para medir o influxo da construção de anticorpo para o corpo do paciente. A composição farmacêutica pode ser administrada usando os referidos sistemas de bomba. Esses sistemas de bombeamento geralmente são conhecidos na técnica e geralmente dependem da troca periódica de cartuchos contendo o agente terapêutico a ser infundido. Ao trocar o cartucho em um sistema de bomba desse tipo, pode ocorrer uma interrupção temporária do fluxo ininterrupto do agente terapêutico no corpo do paciente de forma ininterrupta. Nesse caso, a fase de administração antes da substituição do cartucho e a fase de administração após a substituição do cartucho ainda serão consideradas dentro da acepção dos meios e métodos farmacêuticos da invenção que juntos constituem uma "administração ininterrupta" desse agente terapêutico.[0143] The pharmaceutical composition of the invention may also be administered uninterruptedly. By way of non-limiting example, uninterrupted or substantially uninterrupted administration, i.e.: continuous administration, may be carried out by a small pump system worn by the patient to meter the influx of the antibody construct into the patient's body. The pharmaceutical composition may be administered using such pump systems. Such pumping systems are generally known in the art and generally rely on the periodic exchange of cartridges containing the therapeutic agent to be infused. By exchanging the cartridge in such a pump system, a temporary interruption of the uninterrupted flow of the therapeutic agent into the patient's body in an uninterrupted manner may occur. In this case, the administration phase before the replacement of the cartridge and the administration phase after the replacement of the cartridge will still be considered within the meaning of the pharmaceutical means and methods of the invention which together constitute an "uninterrupted administration" of such a therapeutic agent.
[0144] A administração contínua ou ininterrupta da composição farmacêutica da invenção pode ser intravenosa ou subcutânea por meio de um dispositivo de administração de fluido ou sistema de bomba pequeno, incluindo um mecanismo de acionamento de fluido para expulsar o fluido de um reservatório e um mecanismo de ativação para ativar o mecanismo de acionamento. Os sistemas de bomba para administração subcutânea podem incluir uma agulha ou uma cânula para penetrar a pele de um paciente e administrar a composição adequada no corpo do paciente. Os referidos sistemas de bomba podem ser fixados ou fixados diretamente na pele do paciente independentemente de uma veia, artéria ou vaso sanguíneo, permitindo assim um contato direto entre o sistema de bomba e a pele do paciente. O sistema de bomba pode ser ligado à pele do paciente por 24 horas até vários dias. O sistema de bomba pode ser de tamanho pequeno com um reservatório para pequenos volumes. A título de exemplo não limitativo, o volume do reservatório para a composição farmacêutica adequada a ser administrada pode estar entre 0,1 e 50 ml.[0144] Continuous or uninterrupted administration of the pharmaceutical composition of the invention may be intravenous or subcutaneous by means of a fluid administration device or small pump system including a fluid drive mechanism for expelling fluid from a reservoir and an activation mechanism for activating the drive mechanism. Pump systems for subcutaneous administration may include a needle or cannula for penetrating the skin of a patient and administering the appropriate composition into the patient's body. Said pump systems may be attached or fixed directly to the patient's skin independently of a vein, artery or blood vessel, thus allowing direct contact between the pump system and the patient's skin. The pump system may be attached to the patient's skin for 24 hours to several days. The pump system may be small in size with a reservoir for small volumes. By way of non-limiting example, the volume of the reservoir for the appropriate pharmaceutical composition to be administered may be between 0.1 and 50 ml.
[0145] A administração contínua também pode ser obtida transdermicamente por meio de um adesivo usado sobre a pele e substituído em intervalos. Uma pessoa versada na técnica estará ciente quanto aos sistemas de emplastro para administração de fármacos adequados para este fim. É de notar que a administração transdérmica é especialmente passível de administração ininterrupta, uma vez que a troca de um primeiro emplastro esgotado pode ser realizada de forma vantajosa simultaneamente com a colocação de um novo e segundo emplastro, por exemplo, na superfície da pele imediatamente adjacente ao primeiro emplastro esgotado e imediatamente antes da remoção do primeiro emplastro esgotado. Problemas de interrupção de fluxo ou falha de célula de energia não surgem.[0145] Continuous administration may also be achieved transdermally by means of a patch worn on the skin and replaced at intervals. A person skilled in the art will be aware of drug delivery patch systems suitable for this purpose. It is to be noted that transdermal administration is especially amenable to uninterrupted administration, since the exchange of a first, exhausted patch may advantageously be carried out simultaneously with the placement of a new, second patch, for example, on the skin surface immediately adjacent to the first, exhausted patch and immediately before removal of the first, exhausted patch. Problems of flow interruption or power cell failure do not arise.
[0146] Aqueles versados na técnica entenderão prontamente que a composição farmacêutica da invenção pode, geralmente, compreender qualquer um dos excipientes supramencionados, ou agentes ativos adicionais, ou podem ser fornecidos em qualquer forma adequada, contanto que seja estável e preferencialmente apresente as mesmas propriedades vantajosas que as composições farmacêuticas que compreendem as β-ciclodextrinas que foram avaliadas nos exemplos em anexo. Aqueles versados na técnica estarão prontamente aptos a ajustar os vários componentes, de forma a fornecer uma composição farmacêutica estável, isto é, está substancialmente, preferencialmente, sem agregados e/ou conformadores dos fragmentos de anticorpo de cadeia simples biespecífica neles compreendidos.[0146] Those skilled in the art will readily understand that the pharmaceutical composition of the invention may generally comprise any of the aforementioned excipients, or additional active agents, or may be provided in any suitable form, provided that it is stable and preferably exhibits the same advantageous properties as the pharmaceutical compositions comprising the β-cyclodextrins that have been evaluated in the appended examples. Those skilled in the art will readily be able to adjust the various components so as to provide a stable pharmaceutical composition, i.e., one that is substantially, preferably, free of aggregates and/or conformers of the bispecific single chain antibody fragments comprised therein.
[0147] Deve-se notar que, conforme usado neste documento, as formas singulares "um", "uma e "o(a)" incluem as referências plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um reagente" inclui um ou mais desses reagentes diferentes e a referência ao "método" inclui uma referência a passos e métodos equivalentes conhecidos por aqueles versados na técnica que poderiam ser modificados ou substituídos pelos métodos aqui descritos.[0147] It should be noted that, as used herein, the singular forms "a," "an," and "the" include the plural references unless the context clearly indicates otherwise. Thus, for example, reference to "a reagent" includes one or more such different reagents, and reference to "method" includes a reference to equivalent steps and methods known to those skilled in the art that could be modified or substituted for the methods described herein.
[0148] A menos que indicado de outra forma, o termo "pelo menos" precedendo uma série de elementos deve ser entendido como se referindo a cada elemento da série. Aqueles versados na técnica reconhecerão ou serão capazes de verificar o uso de não mais do que a experimentação de rotina e de muitos equivalentes para as modalidades específicas da invenção descritas neste documento. Pretende-se que tais equivalentes sejam abarcados pela presente invenção.[0148] Unless otherwise indicated, the term "at least" preceding a series of elements should be understood to refer to each element of the series. Those skilled in the art will recognize or be able to verify the use of no more than routine experimentation and many equivalents for the specific embodiments of the invention described herein. It is intended that such equivalents be encompassed by the present invention.
[0149] O termo "e/ou", quando usados aqui, incluem o significado de "e", "ou" e "toda ou qualquer outra combinação dos elementos ligados ao referido termo".[0149] The term "and/or", when used herein, includes the meaning of "and", "or" and "any or any other combination of the elements attached to said term".
[0150] O termo "cerca de" ou "aproximadamente", como usado aqui, significa dentro de 20%, preferencialmente dentro de 10% e mais preferencialmente dentro de 5% de um determinado valor ou intervalo. Ele inclui ainda, no entanto, o número concreto, por exemplo: "cerca de 20" inclui 20.[0150] The term "about" or "approximately" as used herein means within 20%, preferably within 10%, and most preferably within 5% of a given value or range. It further includes, however, the concrete number, e.g., "about 20" includes 20.
[0151] O termo "menor do que" ou "maior do que" inclui o número concreto. Por exemplo, menos de 20 significa menor do que ou igual a. Da mesma forma, mais do que ou maior do que significa mais do que ou igual a ou maior do que ou igual a, respectivamente.[0151] The term "less than" or "greater than" includes the concrete number. For example, less than 20 means less than or equal to. Similarly, more than or greater than means more than or equal to or greater than or equal to, respectively.
[0152] Ao longo deste relatório descritivo e das reivindicações que o seguem, a menos que o contexto requeira de outra forma, a palavra "compreender" ou variações tais como "compreende" ou "compreendendo" será entendida como implicando na inclusão de um número inteiro relatado ou etapas ou grupos de números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas. Quando usado aqui, o termo "compreendendo" pode ser substituído pelo termo "contendo" ou "incluindo" ou às vezes quando usado aqui com o termo "tendo".[0152] Throughout this specification and the claims that follow it, unless the context otherwise requires, the word "comprise" or variations such as "comprises" or "comprising" will be understood to imply the inclusion of a reported integer or steps or groups of integers or steps, but not the exclusion of any other integer or step or group of integers or steps. When used herein, the term "comprising" may be replaced by the term "containing" or "including" or sometimes when used herein with the term "having".
[0153] Quando usado neste documento, "consistindo em" exclui qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especificado no elemento da reivindicação. Quando usado neste documento, "consistindo essencialmente em" não exclui materiais ou etapas que não afetam materialmente as características novas e básicas da reivindicação.[0153] When used herein, "consisting of" excludes any element, step, or ingredient not specified in the claim element. When used herein, "consisting essentially of" does not exclude materials or steps that do not materially affect the novel and basic features of the claim.
[0154] Em cada caso, neste documento, qualquer um dos termos "compreendendo", "consistindo essencialmente em" e "consistindo em" pode ser substituído por qualquer um dos outros dois termos.[0154] In each case in this document, any of the terms "comprising", "consisting essentially of" and "consisting of" may be replaced by either of the other two terms.
[0155] Deve-se entender que esta invenção não está limitada à metodologia, protocolos, materiais, reagentes e substâncias, etc. descritos aqui e, assim, podem variar. A terminologia usada neste documento é para o fim de descrever modalidades particulares somente e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, o qual é definido somente pelas reivindicações.[0155] It should be understood that this invention is not limited to the methodology, protocols, materials, reagents and substances, etc. described herein and thus may vary. The terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only and is not intended to limit the scope of the present invention, which is defined only by the claims.
[0156] Todas as publicações e patentes citadas ao longo do texto deste relatório descritivo (incluindo todas as patentes, pedidos de patentes, publicações científicas, especificações do fabricante, instruções, etc.), sejam supra ou infra, são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade. Nada neste documento deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não é intitulada para antecipar tal divulgação em virtude da invenção prévia. Na medida em que o material incorporado por referência contradiz ou é inconsistente com este relatório descritivo, o relatório descritivo substituirá qualquer material desse tipo.[0156] All publications and patents cited throughout the text of this specification (including all patents, patent applications, scientific publications, manufacturer's specifications, instructions, etc.), whether supra or infra, are incorporated herein by reference in their entirety. Nothing herein should be construed as an admission that the invention is not entitled to anticipate such disclosure by virtue of prior invention. To the extent that material incorporated by reference contradicts or is inconsistent with this specification, the specification shall supersede any such material.
[0157] Uma melhor compreensão da presente invenção e das suas vantagens será obtida a partir dos exemplos que seguem, oferecidos apenas para fins ilustrativos. Os exemplos não se destinam a limitar o âmbito da presente invenção de forma alguma.[0157] A better understanding of the present invention and its advantages will be obtained from the following examples, which are offered for illustrative purposes only. The examples are not intended to limit the scope of the present invention in any way.
[0158] O conjunto de proteínas AMG 330 (SEQ ID NO: 100) derivado de cromatografia de hidroxiapatite foi dialisado para um tampão de base de formulação composto por 100 mM de base tris, 50 mM de hidrogenofosfato dissódico, 4% (p/v) de trealose di-hidratada a pH 5,2. O ponto final da diálise foi verificado por medidas de osmolalidade. O volume dialisado foi concentrado por ultrafiltração e centrifugação a uma concentração de 0,96 mg/mL e esterilizado por filtração através de um filtro de PVDF de 0,2 μm. O volume pré- formulado foi dividido em três porções volumétricas de tamanhos iguais. Elas foram ajustadas a pH 5,2, 5,6 e 6,0, respectivamente, utilizando hidróxido de sódio de 5M e novamente filtrados com um filtro de PVDF de 0,2 μm. Após o ajuste do pH, os volumes pré-formulados foram misturados com os volumes requeridos de soluções de reserva contendo 1% (p/v) de polissorbato a 20,1% (p/v) de polissorbato a 80 ou 4% (p/v) de HP-β-CD. As concentrações de polissorbato 20, polissorbato 80 e HP-β-CD nas formulações finais são mostradas na Figura 1. A concentração de cada formulação foi ajustada a 0,4 mg/mL utilizando um tampão de base composto conforme descrito acima. Todos os excipientes foram aplicados em grau compendial. As formulações finais foram preenchidas a 150 μL em tubos de reação de polipropileno e incubadas em um armário controlado a 30°C por 72 horas. O teor do conformador e das espécies de alto peso molecular (HMWS) foi determinado por cromatografia líquida de desempenho ultraelevado (SE-UPLC). O SE-UPLC foi realizado em um sistema Aquity H-Class UPLC (Waters) utilizando uma coluna Acquity UPLC BEH200 SEC de 150 mm (Waters). A temperatura da coluna foi ajustada a 25°C. A separação das variantes de tamanho foi obtida pela aplicação de um método isocrático com vazão de 0,4 mL/min. A fase móvel foi composta por fosfato de sódio de 100 mM, NaCl de 250 mM, pH 6,8. O tempo de execução totaliza 6,0 minutos. As amostras foram mantidas a 8°C dentro do amostrador automático até a análise. O volume de injeção foi de 7,5 μL. Para evitar a transferência, uma injeção intermediária com 40% de ACN foi realizada após cada amostra. A detecção foi baseada na fluorescência (Ex 280 nm, Em 325 nm). Integração de pico foi realizada utilizando o software Empower®. A AUC relativa do monômero e variantes de tamanho foram relatadas. Pode-se demonstrar que a formação de espécies proteicas não monoméricas (incluindo conformadores e espécies de alto peso molecular) sob tensão térmica (30°C) podem ser inibidas na presença de HP-β-CD (Figura 1). Em contraste, as formulações contendo polissorbato 20 ou 80 apresentaram formação de espécies nãomonoméricas ao longo do tempo.[0158] The AMG 330 (SEQ ID NO: 100) protein pool derived from hydroxyapatite chromatography was dialyzed into a formulation base buffer composed of 100 mM tris base, 50 mM disodium hydrogen phosphate, 4% (w/v) trehalose dihydrate at pH 5.2. The dialysis endpoint was verified by osmolality measurements. The dialyzed volume was concentrated by ultrafiltration and centrifugation to a concentration of 0.96 mg/mL and sterilized by filtration through a 0.2 μm PVDF filter. The pre-formulated volume was divided into three equal sized volumetric portions. They were adjusted to pH 5.2, 5.6, and 6.0, respectively, using 5 M sodium hydroxide and re-filtered with a 0.2 μm PVDF filter. After pH adjustment, the preformulated volumes were mixed with the required volumes of stock solutions containing 1% (w/v) polysorbate 20, 1% (w/v) polysorbate 80, or 4% (w/v) HP-β-CD. The concentrations of polysorbate 20, polysorbate 80, and HP-β-CD in the final formulations are shown in Figure 1. The concentration of each formulation was adjusted to 0.4 mg/mL using a base buffer compounded as described above. All excipients were applied compendial grade. The final formulations were filled to 150 μL in polypropylene reaction tubes and incubated in a controlled cabinet at 30°C for 72 h. The conformer and high molecular weight species (HMWS) content was determined by ultrahigh performance liquid chromatography (SE-UPLC). SE-UPLC was performed on an Aquity H-Class UPLC system (Waters) using a 150 mm Acquity UPLC BEH200 SEC column (Waters). The column temperature was set at 25°C. Separation of size variants was achieved by applying an isocratic method with a flow rate of 0.4 mL/min. The mobile phase was composed of 100 mM sodium phosphate, 250 mM NaCl, pH 6.8. The total run time was 6.0 min. Samples were kept at 8°C inside the autosampler until analysis. The injection volume was 7.5 μL. To avoid carryover, an intermediate injection with 40% ACN was performed after each sample. Detection was based on fluorescence (Ex 280 nm, Em 325 nm). Peak integration was performed using Empower® software. The relative AUC of the monomer and size variants were reported. It could be demonstrated that the formation of non-monomeric protein species (including conformers and high molecular weight species) under thermal stress (30°C) could be inhibited in the presence of HP-β-CD (Figure 1). In contrast, formulations containing polysorbate 20 or 80 showed formation of non-monomeric species over time.
[0159] Uma outra experiência foi realizada para avaliar se o HP-β- CD estabiliza o AMG 330 em condições de tensão induzida por superfície. A substância medicinal AMG 330 formulada em tris cloridrato de 35 mM, hidrogenofosfato de fosfato de sódio de 17,5 mM, cloridrato de L-arginina de 100 mM e 1,4% (p/v) de trealose di-hidratada, pH 6,0, foi suplementada com polissorbato 20, 80 ou HP-β-CD a diferentes concentrações representadas na Figura 2 (eixo x). Todos os excipientes foram aplicados em grau compendial. As formulações foram preenchidas até 1,0 mL em frascos de vidro de tipo I pré-lavados e pré- esterilizados. Os frascos foram vedados com rolhas de borracha butílica esterilizada e foram vedados com tampas de alumínio. As formulações foram acentuadas por (1) dez ciclos consecutivos de congelamento/degelo e (2) formação de espuma. O congelamento e o degelo foram realizados em um liofilizador de escala piloto Epsilon 2-6D (Christ, Alemanha). As temperaturas-alvo para congelamento e degelo foram ajustadas a -50°C e 20°C, respectivamente. Taxas de congelamento e degelo de 0,3 K/min. foram usadas. Cada temperatura foi seguida por um platô isotérmico de 1 hora. A formação de espuma foi atingida através de uma injeção de nitrogênio na respectiva solução durante 1 hora a 80 mL por minuto usando uma agulha de injeção de 21G. O frasco foi ventilado utilizando uma segunda agulha de injeção equipada com filtro estéril. Amostras armazenadas a -70°C foram utilizadas como controles não acentuados. As amostras foram analisadas por SE-UPLC e inspeção visível de acordo com o teste 5 do Deutscher Arzneimittel Codex (DAC). Foi realizada uma SE-UPLC, tal como descrito no Exemplo 1. Para a avaliação da concentração da proteína, a detecção foi adicionalmente realizada por absorção a 280 nm.[0159] A further experiment was performed to evaluate whether HP-β-CD stabilizes AMG 330 under surface-induced tension conditions. The drug substance AMG 330 formulated in 35 mM tris hydrochloride, 17.5 mM sodium hydrogen phosphate, 100 mM L-arginine hydrochloride and 1.4% (w/v) trehalose dihydrate, pH 6.0, was supplemented with polysorbate 20, 80 or HP-β-CD at different concentrations represented in Figure 2 (x-axis). All excipients were applied in compendial grade. The formulations were filled to 1.0 mL in pre-washed and pre-sterilized type I glass vials. The vials were sealed with sterilized butyl rubber stoppers and capped with aluminum caps. The formulations were accentuated by (1) ten consecutive freeze/thaw cycles and (2) foaming. Freezing and thawing were performed in an Epsilon 2-6D pilot-scale freeze dryer (Christ, Germany). Target temperatures for freezing and thawing were set at −50°C and 20°C, respectively. Freezing and thawing rates of 0.3 K/min were used. Each temperature was followed by a 1-h isothermal plateau. Foaming was achieved by flushing the respective solution with nitrogen for 1 h at 80 mL per minute using a 21G injection needle. The vial was vented using a second injection needle equipped with a sterile filter. Samples stored at −70°C were used as unaccentuated controls. Samples were analyzed by SE-UPLC and visible inspection according to Deutscher Arzneimittel Codex (DAC) test 5. A SE-UPLC was performed as described in Example 1. For the evaluation of the protein concentration, detection was additionally performed by absorption at 280 nm.
[0160] Nas amostras de controle não acentuadas, tornou-se evidente que as espécies não monoméricas, incluindo o conformador, os dímeros e os agregados, são mais abundantes em formulações contendo polissorbato 20 ou 80 em comparação com as formulações com HP-β-CD. Quando acentuadas por formação de espuma e congelamento/degelo, as espécies não monoméricas aumentaram em formulações que contêm polissorbatos (Figura 2). O uso de HP-β-CD reduziu a formação de espécies não monoméricas. Na ausência de tensoativos, perdas de proteína superiores a 80% foram observadas enquanto que o uso de polissorbato e HP-β-CD resultou na recuperação quantitativa de proteínas. Em contraste com formulações sem tensoativos, as formulações contendo HP-β-CD estavam praticamente sem agregados proteicos na gama de tamanhos visíveis (Tabela 1).Tabela 1: Avaliação de partículas visíveis de acordo com PhEur 2.9.20. Classificações dos resultados de inspeção atribuídas de acordo com o teste 5 do Deutscher Arzneimittel Codex (DAC).Requisito compendial de acordo com o teste 5 do Deutscher ArzneimittelCodex (DAC): resultado de inspeção <4,5[0160] In the unstressed control samples, it became evident that non-monomeric species, including conformer, dimers and aggregates, are more abundant in formulations containing polysorbate 20 or 80 compared to formulations with HP-β-CD. When stressed by foaming and freeze/thaw, non-monomeric species increased in formulations containing polysorbates (Figure 2). The use of HP-β-CD reduced the formation of non-monomeric species. In the absence of surfactants, protein losses of greater than 80% were observed whereas the use of polysorbate and HP-β-CD resulted in quantitative protein recovery. In contrast to formulations without surfactants, formulations containing HP-β-CD were virtually free of protein aggregates in the visible size range (Table 1).Table 1: Assessment of visible particles according to PhEur 2.9.20. Inspection result ratings assigned according to test 5 of the Deutscher Arzneimittel Codex (DAC). Compendial requirement according to test 5 of the Deutscher ArzneimittelCodex (DAC): inspection result <4.5
[0161] O impacto do HP-β-CD e SBE-β-CD na estabilidade dos construtos de anticorpo BiTE® na presença de álcool benzílico foi investigado em formulações contendo 0,6 mg/mL de AMG 103 (blinatumomab). Portanto, o AMG 103 foi formulado em Histidina de 20 mM, di-hidrato de trealose a 2% (p/v), cloreto de sódio a 0,9% (p/v) a pH 7,0. Essa formulação foi suplementada com diferentes concentrações de HP-β-CD (0,5 e 1,0% em p/v) ou SBE-β-CD (0,5, 1,0 e 2,0% em p/v). Uma formulação isenta de ciclodextrina serviu como controle. A concentração de AMG 103 em todas as formulações foi ajustada a 0,6 mg/mL. Todos os excipientes foram aplicados em grau compendial. Todas as formulações foram misturadas com 0,9% (V/V) de álcool benzílico e preenchidas até 0,5 mL em tubos de reação de polipropileno. A incubação foi realizada a 37°C durante 24 horas. As amostras foram analisadas por absorção UV para determinar a densidade ótica a 350 nm como uma medida para agregação de proteínas e pela medição de intensidade de emissão de fluorescência intrínseca, a fim de detectar potenciais mudanças conformacionais. A absorção UV foi realizada em um leitor de placas Infinite M1000 (Tecan) utilizando placas de 96 poços de meia área transparentes (Corning). Cada poço foi preenchido com 100 μL de solução da amostra. As medições da amostra foram realizadas em triplicatas. A absorção UV foi registada a 350 nm. As intensidades intrínsecas de emissão de fluorescência foram analisadas na mesma placa desde o fundo. A excitação foi realizada a 278 nm. A intensidade de emissão foi registrada de 300 a 500 nm usando incrementos de 1 nm. As fendas de excitação e emissão foram ajustadas a 10 e 5 nm respectivamente. Durante as medições UV e fluorescência, a placa foi controlada por temperatura (25°C).[0161] The impact of HP-β-CD and SBE-β-CD on the stability of BiTE® antibody constructs in the presence of benzyl alcohol was investigated in formulations containing 0.6 mg/mL AMG 103 (blinatumomab). Therefore, AMG 103 was formulated in 20 mM Histidine, 2% (w/v) trehalose dihydrate, 0.9% (w/v) sodium chloride at pH 7.0. This formulation was supplemented with different concentrations of HP-β-CD (0.5 and 1.0% w/v) or SBE-β-CD (0.5, 1.0, and 2.0% w/v). A cyclodextrin-free formulation served as a control. The concentration of AMG 103 in all formulations was adjusted to 0.6 mg/mL. All excipients were applied at compendial grade. All formulations were mixed with 0.9% (V/V) benzyl alcohol and filled to 0.5 mL in polypropylene reaction tubes. Incubation was performed at 37°C for 24 h. Samples were analyzed by UV absorption to determine optical density at 350 nm as a measure of protein aggregation and by intrinsic fluorescence emission intensity measurement to detect potential conformational changes. UV absorption was performed on an Infinite M1000 plate reader (Tecan) using clear half-area 96-well plates (Corning). Each well was filled with 100 μL of sample solution. Sample measurements were performed in triplicate. UV absorption was recorded at 350 nm. Intrinsic fluorescence emission intensities were analyzed on the same plate from the bottom. Excitation was performed at 278 nm. Emission intensity was recorded from 300 to 500 nm using 1 nm increments. The excitation and emission slits were set at 10 and 5 nm respectively. During UV and fluorescence measurements, the plate was temperature controlled (25°C).
[0162] As densidades óticas (DO) a 350 nm indicaram uma propensão de agregação reduzida de AMG 103 na presença de HP-β- CD ou SBE-β-CD. O efeito foi mais pronunciado com o aumento das concentrações de ciclodextrina (Figura 3). A agregação de AMG 103 na presença de álcool benzílico traduz-se em uma alteração dos resíduos de triptofano do ambiente local demonstrados por fluorescência intrínseca. Essas alterações foram minimizadas com concentrações crescentes dos diferentes β-CDs (Figura 4).[0162] Optical densities (OD) at 350 nm indicated a reduced aggregation propensity of AMG 103 in the presence of HP-β-CD or SBE-β-CD. The effect was more pronounced with increasing cyclodextrin concentrations (Figure 3). Aggregation of AMG 103 in the presence of benzyl alcohol translates into an alteration of the tryptophan residues of the local environment demonstrated by intrinsic fluorescence. These alterations were minimized with increasing concentrations of the different β-CDs (Figure 4).
[0163] O efeito do aumento das concentrações de HP-β-CD e SBE-β-CD na propensão de agregação de AMG 103 (blinatumomab) foi abordado por um delineamento experimental fatorial de 2 níveis e 4 fatores. O AMG 103 foi formulado tal como descrito no Exemplo 2. No entanto, sua concentração foi variada entre 0,2 e 0,6 mg/mL (Tabela 2).Tabela 2: Delineamento experimental fatorial de dois níveis e quatro fatores para avaliar o efeito de SBE-β-CD e HP-β-CD na propensão da agregação de AMG 103 na presença de álcool benzílico[0163] The effect of increasing concentrations of HP-β-CD and SBE-β-CD on the aggregation propensity of AMG 103 (blinatumomab) was addressed by a 2-level, 4-factor factorial experimental design. AMG 103 was formulated as described in Example 2. However, its concentration was varied between 0.2 and 0.6 mg/mL (Table 2).Table 2: Two-level, four-factor factorial experimental design to evaluate the effect of SBE-β-CD and HP-β-CD on the aggregation propensity of AMG 103 in the presence of benzyl alcohol
[0164] Todas as amostras foram incubadas diretamente em placas de 96 poços de meia área transparente (Corning) a 37°C por 96 horas. A placa foi coberta com uma folha adesiva para evitar perdas por evaporação. Mais uma vez, as densidades óticas a 350 nm foram tomadas como uma medida para a agregação de AMG 103 (ver Exemplo 3). Os dados analíticos foram avaliados através de análise de variância (ANOVA) usando um software Statistica®. A distribuição normal dos valores medidos foi verificada graficamente, traçando os valores normais esperados em relação aos resíduos brutos. Modelos preditivos (Figura 5) foram gerados por Statistica®, com base na regressão de dados analíticos. Assim, os efeitos de fator puro, bem como interações lineares entre fatores, foram levados em conta. Em determinadas concentrações de AMG 103 e álcool benzílico, a agregação de AMG 103 poderia ser reduzida com o aumento do teor de HP-β-CD ou SBE-β-CD (Figura 5).[0164] All samples were incubated directly in clear half-area 96-well plates (Corning) at 37°C for 96 hours. The plate was covered with an adhesive foil to avoid evaporation losses. Again, the optical densities at 350 nm were taken as a measure for the aggregation of AMG 103 (see Example 3). Analytical data were evaluated by analysis of variance (ANOVA) using Statistica® software. The normal distribution of the measured values was verified graphically by plotting the expected normal values against the raw residuals. Predictive models (Figure 5) were generated by Statistica®, based on the regression of analytical data. Thus, pure factor effects as well as linear interactions between factors were taken into account. At certain concentrations of AMG 103 and benzyl alcohol, the aggregation of AMG 103 could be reduced by increasing the content of HP-β-CD or SBE-β-CD (Figure 5).
[0165] A substância da droga pré-formulada contendo aproximadamente 1 mg/mL de CD33_2-hALB em fosfato de potássio de 20 mM, cloridrato de L-arginina de 150 mM e di-hidrato de trealose a 6% (p/v) a pH 6,0 foi dialisada em ácido cítrico de 20 mM, 6% (p/V) de sacarose a pH 5,0 e em fosfato de potássio de 20 mM, 6% (p/v) de sacarose a pH 6,0, respectivamente. O ponto final da diálise foi determinado através de medições de osmolalidade. A diálise foi realizada usando dispositivos Slide A Lyzer®. Depois da diálise, o material tamponado com citrato foi diretamente concentrado acima de 7 mg/mL com unidades VivaSpin®. A centrifugação foi realizada a aproximadamente 2000 g por 5 min. entre 2 e 8°C. O material tamponado com fosfato de potássio foi tratado da mesma forma. No entanto, o material foi dividido em duas fracções de volume de tamanho igual antes da etapa de centrifugação. Uma porção foi ajustada a um pH de 7,0. O pH da segunda porção foi mantido a pH 6,0. Após filtração estéril através de um filtro PVDF de 0,2 μm, os concentrados foram finalmente formulados adicionando-se soluções de reserva de polissorbato 80 e SBE-β-CD, quando aplicável. A concentração-alvo de CD33_2- hALB foi de 5,0 mg/mL. Os granulados finalmente formulados foram colocados em frascos de vidro de tipo I pré-lavados e pré- esterilizados. Os frascos foram vedados com rolhas de borracha butílica esterilizada e foram vedados com tampas de alumínio. O volume de enchimento totalizou 1,0 mL. Uma visão geral das formulações é fornecida pela Tabela 3. Os frascos foram armazenados durante seis dias em um armário com temperatura controlada a 37°C. As espécies de alto peso molecular foram quantificadas por SE-UPLC usando o método descrito no Exemplo 1. A quantidade injetada de proteína totalizou 3 μg.Tabela 3: Visão geral sobre as formulações de CD33_2-hALB[0165] Preformulated drug substance containing approximately 1 mg/mL CD33_2-hALB in 20 mM potassium phosphate, 150 mM L-arginine hydrochloride and 6% (w/v) trehalose dihydrate at pH 6.0 was dialyzed into 20 mM citric acid, 6% (w/v) sucrose at pH 5.0 and into 20 mM potassium phosphate, 6% (w/v) sucrose at pH 6.0, respectively. The dialysis endpoint was determined by osmolality measurements. Dialysis was performed using Slide A Lyzer® devices. After dialysis, the citrate-buffered material was directly concentrated to above 7 mg/mL with VivaSpin® units. Centrifugation was performed at approximately 2000 g for 5 min. between 2 and 8°C. The potassium phosphate buffered material was treated in the same way. However, the material was divided into two equally sized volume fractions prior to the centrifugation step. One portion was adjusted to a pH of 7.0. The pH of the second portion was maintained at pH 6.0. After sterile filtration through a 0.2 μm PVDF filter, the concentrates were finally formulated by adding polysorbate 80 and SBE-β-CD stock solutions, where applicable. The target concentration of CD33_2-hALB was 5.0 mg/mL. The finally formulated pellets were filled into pre-washed and pre-sterilized type I glass vials. The vials were sealed with sterile butyl rubber stoppers and capped with aluminum caps. The total filling volume was 1.0 mL. An overview of the formulations is provided in Table 3. The vials were stored for six days in a temperature-controlled cabinet at 37°C. High molecular weight species were quantified by SE-UPLC using the method described in Example 1. The injected amount of protein totaled 3 μg. Table 3: Overview of CD33_2-hALB formulations
[0166] As formulações contendo SBE-β-CD (F2, F4, F6) apresentaram menores quantidades de espécies de alto peso molecular (HMWS) após a incubação em comparação às preparações sem ciclodextrina. O efeito foi mais pronunciado em pH 6 e 7 do que em pH 5 (Figura 6).Exemplo 6: Efeito da ultrafiltração e diafiltração em formulações compreendendo construções de anticorpo biespecíficas e β-CD[0166] Formulations containing SBE-β-CD (F2, F4, F6) showed lower amounts of high molecular weight species (HMWS) after incubation compared to preparations without cyclodextrin. The effect was more pronounced at pH 6 and 7 than at pH 5 (Figure 6).Example 6: Effect of ultrafiltration and diafiltration on formulations comprising bispecific antibody constructs and β-CD
[0167] A MSLN-hALB purificada (isto é, a SEQ ID NO: 176) foi concentrada por ultrafiltração (UF). Em primeiro lugar, realizou-se uma concentração de sete vezes utilizando uma cassete equipada com uma membrana de celulose regenerada e uma superfície de 0,11 m2. Uma outra concentração de sete vezes foi realizada com uma membrana menor com uma superfície de 50 cm2. Ambas as membranas tiveram um peso molecular de corte (MWCO) de 10 kDa. Para as etapas de ultrafiltração e diafiltração, a pressão transmembranar foi limitada a 1,4 bar. O conjunto concentrado foi dividido em duas partes. A primeira parte foi filtrada em um tampão composto por fosfato de potássio a 20 mM, cloridrato de L-arginina a 150 mM e di-hidrato de trealose a 6% (p/V) a pH 6,0. A segunda parte foi diafiltrada em um tampão composto por fosfato de potsio 20 de mM e 2% (p/V) de sacarose a pH 6,0. As formulações finais listadas na Tabela 4 foram ajustadas adicionando-se soluções concentradas aos materiais diafiltrados. Todos os excipientes foram aplicados em grau compendial. A concentração-alvo de MSLN- hALB foi de 1,0 mg/mL.Tabela 4: Visão geral sobre as formulações de MSLN-hALB[0167] Purified MSLN-hALB (i.e., SEQ ID NO: 176) was concentrated by ultrafiltration (UF). First, a seven-fold concentration was performed using a cassette equipped with a regenerated cellulose membrane and a surface area of 0.11 m2. A further seven-fold concentration was performed with a smaller membrane with a surface area of 50 cm2. Both membranes had a molecular weight cut-off (MWCO) of 10 kDa. For the ultrafiltration and diafiltration steps, the transmembrane pressure was limited to 1.4 bar. The concentrated pool was divided into two portions. The first portion was filtered into a buffer composed of 20 mM potassium phosphate, 150 mM L-arginine hydrochloride, and 6% (w/v) trehalose dihydrate at pH 6.0. The second part was diafiltered into a buffer composed of 20 mM potassium phosphate and 2% (w/v) sucrose at pH 6.0. The final formulations listed in Table 4 were adjusted by adding concentrated solutions to the diafiltered materials. All excipients were applied in compendial grade. The target concentration of MSLN-hALB was 1.0 mg/mL. Table 4: Overview of MSLN-hALB formulations
[0168] Por fim, a substância da droga de MSLN-hALB foi esterilizada por filtração através de um filtro PVDF de 0,2 μm e introduzida em frascos de vidro de tipo I pré-lavados e pré- esterilizados. Os frascos foram vedados com rolhas de borracha butílica esterilizada e foram vedados com tampas de alumínio. O volume de enchimento totalizou 1,0 mL. Os frascos foram armazenados por até duas semanas em armários com temperatura controlada a 25°C e 37°C, respectivamente. Espécies de alto peso molecular foram quantificadas por SE-UPLC usando o método descrito no Exemplo 1. A quantidade injetada de proteína totalizou 3 μg. As variantes de carga ácida foram determinadas usando cromatografia líquida de desempenho ultraelevado de permuta catiônica fraca (WCX- UPLC). A WCX-UPLC foi realizado em um Aquity de UPLC de classe H (Waters) usando uma coluna Protein-Pak Hi Res CM de 7μm de 4,6 x 100 mm. A temperatura da coluna foi ajustada a 30°C. A fim de obter a separação cromatográfica, o seguinte gradiente (Tabela 5) foi aplicado:Tabela 5: Visão geral sobre o gradiente de WCX-UPLC[0168] Finally, the MSLN-hALB drug substance was sterilized by filtration through a 0.2 μm PVDF filter and filled into pre-cleaned and pre-sterilized Type I glass vials. The vials were sealed with sterilized butyl rubber stoppers and capped with aluminum caps. The total fill volume was 1.0 mL. The vials were stored for up to two weeks in temperature-controlled cabinets at 25°C and 37°C, respectively. High molecular weight species were quantified by SE-UPLC using the method described in Example 1. The injected amount of protein totaled 3 μg. Acidic charge variants were determined using weak cation exchange ultrahigh performance liquid chromatography (WCX-UPLC). WCX-UPLC was performed on an Aquity H-class UPLC (Waters) using a 4.6 x 100 mm Protein-Pak Hi Res CM 7μm column. The column temperature was set at 30°C. In order to achieve chromatographic separation, the following gradient (Table 5) was applied:Table 5: Overview of the WCX-UPLC gradient
[0169] O eluente A foi composto por fosfato de sódio de 20 mM a pH 6,5. O eluente B era composto de fosfato de sódio de 20 mM, cloreto de sódio de 250 mM, pH 6,5. A quantidade injetada de proteína totalizou 3 μg. A taxa de fluxo foi de 0,65 mL/min. Antes da injeção, as amostras foram mantidas no amostrador automático a 8°C. A detecção de proteínas contou com a medição da intensidade de fluorescência intrínseca. A excitação foi realizada a 280 nm e a emissão foi realizada a 330 nm. As variantes de cargas ácidas foram quantificadas com base na área relativa sob a curva (AUC). A integração foi realizada usando o software Empower®.[0169] Eluent A was composed of 20 mM sodium phosphate at pH 6.5. Eluent B was composed of 20 mM sodium phosphate, 250 mM sodium chloride, pH 6.5. The injected amount of protein totaled 3 μg. The flow rate was 0.65 mL/min. Prior to injection, samples were kept in the autosampler at 8°C. Protein detection relied on measurement of intrinsic fluorescence intensity. Excitation was performed at 280 nm and emission was performed at 330 nm. Acidic charge variants were quantified based on the relative area under the curve (AUC). Integration was performed using Empower® software.
[0170] As menores taxas de formação de espécies de alto peso molecular (HMWS) foram observadas para a formulação com SBE-β- CD (Figura 7B). A estabilidade química também foi mais pronunciada para a formulação contendo SBE-β-CD indicada pela menor porção de variantes de carga ácida (Figura 8).[0170] The lowest rates of high molecular weight species (HMWS) formation were observed for the formulation with SBE-β-CD (Figure 7B). Chemical stability was also more pronounced for the formulation containing SBE-β-CD indicated by the lower portion of acidic charge variants (Figure 8).
[0171] LLPS: A separação líquido-fase líquida (LLPS) é causada pela atração líquida entre as partículas coloidais (por exemplo, proteínas) e, portanto, é a medida da força dessa atração. Quando há atração entre as proteínas, uma LLPS ocorre em fases coexistentes ricas em proteínas e escassas em proteínas, desde que a temperatura seja suficientemente baixa. Na LLPS, as fases coexistentes estão em equilíbrio termodinâmico real e são totalmente reversíveis, e as concentrações das fases coexistentes dependem apenas da temperatura e não da concentração inicial da proteína. A LLPS pode ser induzida pela adição de PEG. Se houver uma atração mais forte entre as proteínas, menor será a concentração de PEG necessária para a LLPS, o que, por sua vez, indica que essas proteínas serão facilmente agregadas. A uma determinada temperatura e concentração de PEG, os excipientes que aumentam a estabilidade coloidal de uma proteína resultam em uma maior concentração de proteína na fase escassa em proteína. Esse aumento na concentração de proteína pode ser medido cromatograficamente em relação a um controle sem um excipiente. No desenvolvimento de formulações, é desejável observar a LLPS e avaliar a atração entre as moléculas de proteína.[0171] LLPS: Liquid-liquid phase separation (LLPS) is caused by the net attraction between colloidal particles (e.g. proteins) and is therefore a measure of the strength of this attraction. When there is attraction between proteins, an LLPS occurs in coexisting protein-rich and protein-poor phases, provided the temperature is sufficiently low. In LLPS, the coexisting phases are in true thermodynamic equilibrium and are fully reversible, and the concentrations of the coexisting phases depend only on the temperature and not on the initial protein concentration. LLPS can be induced by the addition of PEG. If there is a stronger attraction between proteins, the lower the concentration of PEG required for LLPS, which in turn indicates that these proteins will be easily aggregated. At a given temperature and PEG concentration, excipients that increase the colloidal stability of a protein result in a higher concentration of protein in the protein-poor phase. This increase in protein concentration can be measured chromatographically relative to a control without an excipient. In formulation development, it is desirable to observe the LLPS and evaluate the attraction between protein molecules.
[0172] O objetivo deste experimento é usar a LLPS para avaliar o efeito do SBE-β-CD e do alginato sobre a estabilidade coloidal do AMG 330. Tabela 6. Composição e preparação da solução:Tabela 7. Composição e preparação da amostra:[0172] The objective of this experiment is to use LLPS to evaluate the effect of SBE-β-CD and alginate on the colloidal stability of AMG 330. Table 6. Composition and solution preparation: Table 7. Sample composition and preparation:
[0173] A solução/composição de diferentes amostras e preparações foi preparada conforme mencionado acima, nas tabelas 6 e 7. As amostras foram preparadas (concentração final de AMG 330 de 0,12 mg/ml) e incubadas a 40°C durante três dias. As amostras foram então micro-centrifugadas (Eppendorf Centrifuge 5418, St. Louis, MO, EUA) por 20 s e o sobrenadante de 80 uL foi removido e analisado por CEX analítica (coluna ProPac WCX-10, 2mm de ID) no sistema de cromatografia Agilent (Agilent 1200, Santa Clara, CA, EUA).[0173] The solution/composition of different samples and preparations was prepared as mentioned above in Tables 6 and 7. The samples were prepared (final concentration of AMG 330 of 0.12 mg/ml) and incubated at 40°C for three days. The samples were then micro-centrifuged (Eppendorf Centrifuge 5418, St. Louis, MO, USA) for 20 s and 80 uL supernatant was removed and analyzed by analytical CEX (ProPac WCX-10 column, 2 mm ID) on Agilent chromatography system (Agilent 1200, Santa Clara, CA, USA).
[0174] CEX analítica: 70 μL da amostra foram injetados na coluna CEX que foi equilibrada com ácido cítrico de 20 mM, azida sódica a 0,005%, pH 6,0, e eluída com ácido cítrico de 20 mM, cloreto de sódio de 1M, azida sódica a 0,005%, pH 6,0, com um tempo de gradiente de 30 min (tempo total de execução: 45 min/injeção) com uma concentração mínima de 500 mM de cloreto de sódio a uma taxa de fluxo de 0,2 mL/min. A temperatura do amostrador automático foi mantida a 40°C durante a execução. A partir dos cromatogramas, as áreas dos picos das amostras foram calculadas (Figura 9 e 10).Exemplo 8: Permuta de tampão e concentração de proteína de AMG 330 por centrifugação por ultrafiltração na presença de 4 formulações diferentes (incluindo SBE-β-CD)Tabela 8 Composição e preparação da solução (Volume em mL):Tabela 9: Composição da amostra e da preparação:[0174] Analytical CEX: 70 μL of sample was injected onto the CEX column which was equilibrated with 20 mM citric acid, 0.005% sodium azide, pH 6.0, and eluted with 20 mM citric acid, 1 M sodium chloride, 0.005% sodium azide, pH 6.0, with a gradient time of 30 min (total run time: 45 min/injection) with a minimum concentration of 500 mM sodium chloride at a flow rate of 0.2 mL/min. The autosampler temperature was maintained at 40°C during the run. From the chromatograms, the peak areas of the samples were calculated (Figure 9 and 10).Example 8: Buffer exchange and protein concentration of AMG 330 by ultrafiltration centrifugation in the presence of 4 different formulations (including SBE-β-CD)Table 8 Solution composition and preparation (Volume in mL): Table 9: Sample and preparation composition:
[0175] A concentração inicial de proteína foi de 0,4 mg/ml. 2 mL de 0,4 mg/mL de AMG 330 foram colocados em um filtro centrífugo Amicon ultra de 15 ml, MWCO 10.000. 10 mL do tampão apropriado foram adicionados a cada tubo e suavemente misturados com a proteína e centrifugados (centrífuga Allegra 6R, Beckman Coulter, Brea, CA, EUA) por 3 horas a 2000 rpm a 4oC. O retentado foi então misturado suavemente e os tubos foram centrifugados durante 1,5 h a 2500 rpm a 25oC. Após um volume de retentado de 200-250 μL, 10 mL do tampão apropriado foram adicionados e suavemente misturados com o retentado, e depois centrifugados durante 30 min a 2500 rpm a 25oC até um volume final de 200-250μL. A concentração final de proteína em 4 formulações diferentes variou de 2,9 a 3,7 mg/ml.[0175] The initial protein concentration was 0.4 mg/mL. 2 mL of 0.4 mg/mL AMG 330 was loaded onto a 15 mL Amicon ultra centrifugal filter, MWCO 10,000. 10 mL of the appropriate buffer was added to each tube and gently mixed with the protein and centrifuged (Allegra 6R centrifuge, Beckman Coulter, Brea, CA, USA) for 3 h at 2000 rpm at 4°C. The retentate was then gently mixed and the tubes were centrifuged for 1.5 h at 2500 rpm at 25°C. After a retentate volume of 200-250 μL, 10 mL of the appropriate buffer was added and gently mixed with the retentate, and then centrifuged for 30 min at 2500 rpm at 25oC to a final volume of 200-250μL. The final protein concentration in 4 different formulations ranged from 2.9 to 3.7 mg/mL.
[0176] Analítica SEC: As amostras foram analisadas por SEC analítica (TSKgel G3000SWXL, 7,8 mm ID, PA, EUA) em um sistema de cromatografia Agilent (Agilent 1200, Santa Clara, CA, EUA) com tampão de 100 mM de fosfato de sódio de 250 mM de cloreto de sódio, pH 6,8 com uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min (tempo total de execução: 35 min/injeção). A temperatura do amostrador automático foi mantida em 4oC durante a execução.[0176] Analytical SEC: Samples were analyzed by analytical SEC (TSKgel G3000SWXL, 7.8 mm ID, PA, USA) on an Agilent chromatography system (Agilent 1200, Santa Clara, CA, USA) with 100 mM sodium phosphate 250 mM sodium chloride buffer, pH 6.8 at a flow rate of 0.5 mL/min (total run time: 35 min/injection). The autosampler temperature was maintained at 4oC during the run.
[0177] A presença de SBE-β-CD parece fornecer proteção significativa a AMG 330 contra a formação de HMW durante a concentração de proteína por ultrafiltração com a menor quantidade relativa de agregados em formulação contendo SBE-β-CD. A formulação contendo Arginina, Glutamato, Sacarose, Manitol e PS-80 apresentou a maior quantidade de HMW, seguida pela formulação contendo Tris, fosfato, Arginina, Trehalose e PEG 4000 (Figura 11). A análise CEX apresentou efeito similar (dados não mostrados).[0177] The presence of SBE-β-CD appears to provide significant protection to AMG 330 against HMW formation during protein concentration by ultrafiltration with the lowest relative amount of aggregates in formulation containing SBE-β-CD. The formulation containing Arginine, Glutamate, Sucrose, Mannitol and PS-80 showed the highest amount of HMW, followed by the formulation containing Tris, phosphate, Arginine, Trehalose and PEG 4000 (Figure 11). CEX analysis showed a similar effect (data not shown).
[0178] O objetivo deste experimento é avaliar a estabilidade do AMG 330 após várias tensões em 14 formulações diferentes. Especificamente, o AMG 330 foi avaliado após o LLPS, 20 ciclos de congelamento/degelo (F/T) e concentração por ultrafiltração/centrifugação (UFC). Como mostrado no Exemplo 8, o SBE-β-CD fornece proteção contra a agregação de AMG 330 e é avaliado em mais detalhes neste experimento. Para a UFC (Figura 12 A, B), apenas 5 formulações foram investigadas. Para os estudos de LLPS e F/T (Figura 12 C, D), 14 formulações foram investigadas. As amostras de LLPS foram analisadas por CEX analítica, enquanto que as amostras de UFC e F/T foram analisadas tanto pela SEC quanto pela CEX analíticas.Materiais e métodos:Tabela 10. Preparação da solução de estoque:Ultrafiltração/centrifugação (UFC):Tabela 11. Preparação da composição da amostra para UFC (Volume em μL).[0178] The objective of this experiment is to evaluate the stability of AMG 330 following various stresses in 14 different formulations. Specifically, AMG 330 was evaluated following LLPS, 20 freeze/thaw (F/T) cycles, and concentration by ultrafiltration/centrifugation (UFC). As shown in Example 8, SBE-β-CD provides protection against AMG 330 aggregation and is evaluated in further detail in this experiment. For UFC (Figure 12 A, B), only 5 formulations were investigated. For the LLPS and F/T studies (Figure 12 C, D), 14 formulations were investigated. The LLPS samples were analyzed by analytical CEX, while the UFC and F/T samples were analyzed by both analytical SEC and CEX. Materials and methods: Table 10. Preparation of stock solution: Ultrafiltration/centrifugation (UFC):Table 11. Preparation of sample composition for UFC (Volume in μL).
[0179] Para cada amostra, 4 mL de 0,4 mg/mL de AMG 330 foram colocados em um tubo de filtro centrífugo Amicon Ultra de 15 ml de MWCO 10.000. Foram adicionados 8 mL do tampão apropriado a cada tubo e misturados suavemente com proteína e centrifugados (centrífuga Allegra 6R, Beckman Coulter, Brea, CA, EUA) a 2000 rpm (4000 rcf) a 20oC até o volume de retentado ser de 200-250uL. Esse processo foi repetido mais duas vezes por um total de 3 etapas de concentração. O retentado foi então misturado suavemente com um pipetador removido do tubo de filtro, colocado em um tubo Eppendorf e micro-centrifugado (Eppendorf Centrifuge 5418, St. Louis, MO, EUA) na velocidade máxima por 2 min. A seguir, mediu-se a concentração de proteína para o sobrenadante e analisou-se por SEC analítica (os mesmos detalhes que no Exemplo 8) injetando-se 20 μL. Cada amostra foi preparada em duplicado.[0179] For each sample, 4 mL of 0.4 mg/mL AMG 330 was placed into a 15 mL MWCO 10,000 Amicon Ultra centrifugal filter tube. 8 mL of the appropriate buffer was added to each tube and gently mixed with protein and centrifuged (Allegra 6R centrifuge, Beckman Coulter, Brea, CA, USA) at 2000 rpm (4000 rcf) at 20oC until the retentate volume was 200-250uL. This process was repeated two more times for a total of 3 concentration steps. The retentate was then gently mixed with a pipettor removed from the filter tube, placed into an Eppendorf tube, and microcentrifuged (Eppendorf Centrifuge 5418, St. Louis, MO, USA) at maximum speed for 2 min. The protein concentration was then measured for the supernatant and analyzed by analytical SEC (same details as in Example 8) by injecting 20 μL. Each sample was prepared in duplicate.
[0180] As amostras foram preparadas conforme descrito na tabela abaixo e incubadas por 5 dias a 4oC. O volume final de todas as amostras foi de 240 μL. Após a incubação, as amostras foram micro- centrifugadas (Eppendorf Centrifuge 5418, St. Louis, MO, EUA) durante 20 s e, em seguida, 200 μL de sobrenadante foram removidos para a CEX analítica (os mesmos detalhes que no Exemplo 7), exceto pelo fato de que a temperatura do amostrador automático foi mantida a 25oC.Tabela 12: Preparação da composição da amostra para a LLPS:[0180] Samples were prepared as described in the table below and incubated for 5 days at 4oC. The final volume of all samples was 240 μL. After incubation, samples were microcentrifuged (Eppendorf Centrifuge 5418, St. Louis, MO, USA) for 20 s and then 200 μL of supernatant was removed to the analytical CEX (same details as in Example 7), except that the temperature of the autosampler was maintained at 25oC.Table 12: Preparation of sample composition for LLPS:
[0181] Concentrações crescentes de SBE-β-CD resultaram em uma maior recuperação de monômero, mantendo um nível relativamente baixo de agregados. O SBE-β-CD apresentou um desempenho ainda melhor quando combinado com sacarose, manitol e sacarose e, especialmente, com glicina e sacarose. Isso é especialmente notável na medida em que a glicina, isoladamente, apresentou um desempenho muito ruim e não foi muito melhor em combinação com a sacarose.Congelamento/degelo (F/T):Tabela 13. Preparação da composição da amostra para F/T:[0181] Increasing concentrations of SBE-β-CD resulted in higher monomer recovery while maintaining a relatively low level of aggregates. SBE-β-CD performed even better when combined with sucrose, mannitol, and sucrose, and especially with glycine and sucrose. This is especially notable as glycine alone performed very poorly and was not much better in combination with sucrose. Freeze/thaw (F/T):Table 13. Sample composition preparation for F/T:
[0182] As amostras foram preparadas conforme tabeladas acima. Foram efetuados 20 ciclos de F/T, com amostras armazenadas por pelo menos uma hora a -70°C ou -30°C durante cada congelamento e à temperatura ambiente por não mais do que uma hora durante o degelo. O volume final de cada amostra foi de 240 μL. Alíquotas foram removidas para análise por SEC analítica (o mesmo que no exemplo 8) após 0 e 20 ciclos.[0182] Samples were prepared as tabulated above. 20 F/T cycles were performed, with samples stored for at least one hour at -70°C or -30°C during each freeze and at room temperature for no more than one hour during thaw. The final volume of each sample was 240 μL. Aliquots were removed for analysis by analytical SEC (same as in Example 8) after 0 and 20 cycles.
[0183] A presença de SBE-β-CD parece fornecer benefícios para reduzir a agregação e aumentar os níveis relativos de monômero durante o F/T em comparação com outras formulações. As formulações nas quais o SBE-β-CD foi utilizado em combinação com outros excipientes também tiveram um bom desempenho, particularmente com Glicina e Sacarose.[0183] The presence of SBE-β-CD appears to provide benefits in reducing aggregation and increasing relative monomer levels during F/T compared to other formulations. Formulations in which SBE-β-CD was used in combination with other excipients also performed well, particularly with Glycine and Sucrose.
[0184] O SBE-β-CD mostrou, em experimentos anteriores com UFC, fornecer proteção significativa ao AMG 330 contra a agregação durante a concentração de proteína. No presente experimento, os efeitos sobre o AMG 330 durante a concentração de proteína pela UFC são comparados na presença de SBE-β-CD ou de outra ciclodextrina, 2-hidroxipropil beta-ciclodextrina (2-HP-β-CD).[0184] SBE-β-CD has been shown in previous experiments with UFC to provide significant protection to AMG 330 against aggregation during protein concentration. In the present experiment, the effects on AMG 330 during protein concentration by UFC are compared in the presence of SBE-β-CD or another cyclodextrin, 2-hydroxypropyl beta-cyclodextrin (2-HP-β-CD).
[0185] 20 mL de 0,4 mg/mL de AMG 330 foram concentrados a ~10mL em tubos de filtro centrífugo Amicon Ultra de 15 mL de MWCO 10.000. O retentado dos tubos foi combinado e a concentração de proteína foi então medida por SoloVPE (utilizando o coeficiente de extinção de 2,319 mL/(mg*cm)) e verificou-se ser 0,83 mg/mL. Utilizou- se então essa proteína para preparar as amostras de UFC.[0185] 20 mL of 0.4 mg/mL AMG 330 was concentrated to ~10 mL in 15 mL MWCO 10,000 Amicon Ultra centrifugal filter tubes. The retentate from the tubes was combined and the protein concentration was then measured by SoloVPE (using extinction coefficient of 2.319 mL/(mg*cm)) and found to be 0.83 mg/mL. This protein was then used to prepare CFU samples.
[0186] Todas as amostras continham 10 mM de fosfato de potássio, 8% de sacarose, 0,01% de polissorbato-80, pH 6,0.[0186] All samples contained 10 mM potassium phosphate, 8% sucrose, 0.01% polysorbate-80, pH 6.0.
[0187] Foram testadas cinco condições de formulação: 1) controle apenas com tampão, 2) SBE-β-CD a 1%, 3) adicionados 2% de SBE-β- CD, 4) adicionados 1% de 2-HP-β-CD e 5) adicionados 2% de 2-HP-β- CD. Foram preparados 50 mL de cada uma das 5 soluções de tamponamento. Duas amostras replicadas de cada formulação foram testadas.[0187] Five formulation conditions were tested: 1) buffer only control, 2) 1% SBE-β-CD, 3) 2% SBE-β-CD added, 4) 1% 2-HP-β-CD added, and 5) 2% 2-HP-β-CD added. 50 mL of each of the 5 buffer solutions were prepared. Two replicate samples of each formulation were tested.
[0188] Para cada amostra, 0,875 mL de AMG 330 foram colocados em um tubo de filtro centrífugo Amicon Ultra de 4 mL de MWCO 10.000. 3,125 mL do tampão apropriado foram adicionados a cada tubo e misturados suavemente com a proteína e os tubos foram centrifugados (Allegra 6R Centrifuge, Beckman Coulter, Brea, CA, EUA) a 4000 rcf a 25C até o volume de retentado ser de ~100 uL. Foram adicionados mais 4 mL de tampão e as amostras foram novamente concentradas a ~100 uL. O retentado foi então misturado suavemente com um pipetador e 45 μL foram removidos do tubo de filtro, colocados em um tubo Eppendorf e micro-centrifugados (Eppendorf Centrifuge 5418, St. Louis, MO, EUA) na velocidade máxima por 2 min. O sobrenadante foi analisado por SEC analítica (o mesmo que no Exemplo 8). O AMG 330 não concentrado (0,4 mg/mL) também foi analisado para fins de comparação.[0188] For each sample, 0.875 mL of AMG 330 was placed into a 4 mL Amicon Ultra centrifugal filter tube of 10,000 MWCO. 3.125 mL of the appropriate buffer was added to each tube and gently mixed with the protein and the tubes were centrifuged (Allegra 6R Centrifuge, Beckman Coulter, Brea, CA, USA) at 4000 rcf at 25C until the retentate volume was ~100 uL. An additional 4 mL of buffer was added and the samples were again concentrated to ~100 uL. The retentate was then gently mixed with a pipettor and 45 μL was removed from the filter tube, placed into an Eppendorf tube and microcentrifuged (Eppendorf Centrifuge 5418, St. Louis, MO, USA) at maximum speed for 2 min. The supernatant was analyzed by analytical SEC (same as in Example 8). Unconcentrated AMG 330 (0.4 mg/mL) was also analyzed for comparison purposes.
[0189] Neste experimento, o AMG 330 foi concentrado a ~10 mg/mL na presença de 1 e 2% de SBE-β-CD ou de 2-HP-β-CD. As formulações contendo SBE-β-CD são indicadas por asteriscos. O controle à esquerda (etiquetado como 0,4 mg/mL) não foi concentrado para além da concentração inicial de 0,4 mg/mL. Segundo a partir da esquerda (etiquetado como Controle nas Figs. 4a e 4b) é uma amostra que foi concentrada sem ciclodextrina. A comparação entre as formulações SBE-β-CD e 2-HP-β-CD demonstrou a vantagem de usar o SBE-β-CD. A figura 13 mostra a maior concentração atingida; a Figura 14 revela a composição dessas soluções concentradas em termos de % de agregado e % de monômero.[0189] In this experiment, AMG 330 was concentrated to ~10 mg/mL in the presence of 1 and 2% SBE-β-CD or 2-HP-β-CD. Formulations containing SBE-β-CD are indicated by asterisks. The control on the left (labeled 0.4 mg/mL) was not concentrated beyond the initial concentration of 0.4 mg/mL. Second from the left (labeled Control in Figs. 4a and 4b) is a sample that was concentrated without cyclodextrin. Comparison between the SBE-β-CD and 2-HP-β-CD formulations demonstrated the advantage of using SBE-β-CD. Figure 13 shows the highest concentration achieved; Figure 14 reveals the composition of these concentrated solutions in terms of % aggregate and % monomer.
[0190] O SBE-β-CD demonstrou reduzir a agregação no AMG 330 em experimentos anteriores. O objetivo deste experimento é avaliar outras ciclodextrinas em comparação com o SBE-β-CD. Os níveis de agregação em AMG 330 foram medidos após 1-4 dias de incubação a 4°C e 25°C com 4 ciclodextrinas diferentes.[0190] SBE-β-CD has been shown to reduce aggregation on AMG 330 in previous experiments. The purpose of this experiment is to evaluate other cyclodextrins in comparison to SBE-β-CD. Aggregation levels on AMG 330 were measured after 1-4 days of incubation at 4°C and 25°C with 4 different cyclodextrins.
[0191] Todas as amostras também continham ~2 mg/mL de AMG 330, citrato de 20 mM e 0,01% de polissorbato 80, pH 6,0. As amostras foram preparadas e armazenadas em tubos Eppendorf (tabela 14). Os tubos foram embrulhados em plástico e protegidos da luz durante a incubação. Alíquotas foram tomadas após 1 e 4 dias de incubação a 4°C e 25°C (Thermofisher Scientific, (Newington, NH) Haake A28). As alíquotas foram brevemente centrifugadas em mciro (Eppendorf Centrifuge 5418, St. Louis, MO, EUA) e os sobrenadantes foram analisados por SEC analítica.Tabela 14. Composição e preparação da solução:Tabela 15. Composição e preparação da amostra:[0191] All samples also contained ~2 mg/mL AMG 330, 20 mM citrate, and 0.01% polysorbate 80, pH 6.0. Samples were prepared and stored in Eppendorf tubes (Table 14). Tubes were wrapped in plastic and protected from light during incubation. Aliquots were taken after 1 and 4 days of incubation at 4°C and 25°C (Thermofisher Scientific, (Newington, NH) Haake A28). Aliquots were briefly centrifuged in a micro (Eppendorf Centrifuge 5418, St. Louis, MO, USA) and supernatants were analyzed by analytical SEC.Table 14. Solution composition and preparation: Table 15. Sample composition and preparation:
[0192] Quatro ciclodextrinas diferentes, incluindo SBE-β-CD, foram testadas quanto à capacidade de manter AMG 330 em uma forma solúvel não agregada. A proteína a ~ 2 mg/ml foi incubada por 4 dias a 4oe 25oC, sem mais concentração. Todas as amostras continham também citrato de 20 mM e 0,01% de polissorbato 80, pH 6,0.[0192] Four different cyclodextrins, including SBE-β-CD, were tested for the ability to maintain AMG 330 in a non-aggregated, soluble form. Protein at ~2 mg/ml was incubated for 4 days at 4°C and 25°C without further concentration. All samples also contained 20 mM citrate and 0.01% polysorbate 80, pH 6.0.
[0193] No final de 4 dias a 4oC, 0,5% da formulação de SBE-β-CD teve uma maior área de pico total por SEC, indicando concentrações de proteínas solúveis mais altas. Outras formulações precipitaram e agregaram em vários graus. Esse resultado demonstra que o SBE-β- CD foi um estabilizador e p solubilizante mais efetivo de AMG 330 em ambas as temperaturas (4oe 25oC) em comparação com a α- ciclodextrina, a Y-ciclodextrina ou as hidroxipropil β-ciclodextrinas pareciam se dar melhor apenas a 25oC (Figura 15).[0193] At the end of 4 days at 4°C, the 0.5% SBE-β-CD formulation had a larger total peak area by SEC, indicating higher soluble protein concentrations. Other formulations precipitated and aggregated to varying degrees. This result demonstrates that SBE-β-CD was a more effective stabilizer and solubilizer of AMG 330 at both temperatures (4°C and 25°C) compared to α-cyclodextrin, γ-cyclodextrin, or hydroxypropyl β-cyclodextrins that appeared to perform best only at 25°C (Figure 15).
[0194] O objetivo deste experimento é desenvolver uma formulação congelada e liofilizada estável para o AMG 330 SBE-β-CD e o Triton X100 foi avaliado como excipiente da formulação. Garrafões de policarbonato serão usados para simular o armazenamento congelado da substância da droga (DS).[0194] The objective of this experiment is to develop a stable frozen and lyophilized formulation for AMG 330 SBE-β-CD and Triton X100 was evaluated as an excipient of the formulation. Polycarbonate carboys will be used to simulate frozen storage of the drug substance (DS).
[0195] Com uma concentração inicial de 0,4 mg/mL para o AMG 330, a permuta de tampão de UF/DF (tampões listados na tabela 16) foi realizada usando-se dois sistemas TFF μscale cogentes com uma pressão delta ajustada em ~ 23 psi. Quatro cassetes Millipore Pellicon 3 Ultracel de 10 kD 0,11 m2 e dois conjuntos de tubos de coagentes foram utilizados. Após a troca, o material foi superconcentrado a 1,2 mg/mL e coletado em recipientes Nalgene estéreis.Tabela 16. Composição da formulação:[0195] With an initial concentration of 0.4 mg/mL for AMG 330, UF/DF buffer exchange (buffers listed in Table 16) was performed using two coagent μscale TFF systems with a delta pressure set at ~23 psi. Four 10 kD 0.11 m2 Millipore Pellicon 3 Ultracel cassettes and two sets of coagent tubing were used. After exchange, the material was superconcentrated to 1.2 mg/mL and collected in sterile Nalgene containers.Table 16. Formulation composition:
[0196] Estoques de tampão de formulação, PEG e tensoativo foramrecém preparados e adicionados para produzir o material formulado final. As amostras foram preenchidas a um volume de 15 mL em frascos de 30 mL de PC (Nalgene) para este experimento. Todas as amostras foram filtradas em um exaustor estéril usando unidades de filtro sterivex (0,22 μm) antes do preenchimento. A concentração final de proteína nos garrafões de PC é de 1 mg/mL.[0196] Stocks of formulation buffer, PEG, and surfactant were freshly prepared and added to produce the final formulated material. Samples were filled to a volume of 15 mL into 30 mL PC bottles (Nalgene) for this experiment. All samples were filtered in a sterile fume hood using sterivex filter units (0.22 μm) prior to filling. The final protein concentration in the PC carboys is 1 mg/mL.
[0197] Para experimentos estáticos, as amostras foram medidas por SEC analítica (igual ao Exemplo 8) em t = 0 e t = 6 semanas.[0197] For static experiments, samples were measured by analytical SEC (same as Example 8) at t = 0 and t = 6 weeks.
[0198] O SBE-β-CD foi incluído nas formulações do AMG 330 que foram incubadas a várias temperaturas. Os resultados depois de 6 semanas de armazenamento mostraram que todas as formulações contendo SBE-β-CD estavam estáveis, em contraste com uma formulação baseada na utilização de PEG-4000 e sem SBE-β-CD.[0198] SBE-β-CD was included in AMG 330 formulations that were incubated at various temperatures. Results after 6 weeks of storage showed that all formulations containing SBE-β-CD were stable, in contrast to a formulation based on the use of PEG-4000 and without SBE-β-CD.
[0199] A comparação entre SBE-β-CD e a formulação à base de PEG demonstra a vantagem do uso de SBE-β-CD. A formulação à base de PEG agregada e particulada amplamente depois da armazenagem a -20oC (Figura 16).[0199] Comparison between SBE-β-CD and PEG-based formulation demonstrates the advantage of using SBE-β-CD. The PEG-based formulation aggregated and particulate extensively after storage at -20oC (Figure 16).
[0200] Este experimento foi conduzido para determinar que uma formulação liofilizada de plataforma pode ser desenvolvida para as moléculas BiTE®. AMG 330 BiTE® foi usado como proteína modelo. Duas ciclodextrinas (SBE-β-CD e α-ciclodextrano) foram avaliadas como excipientes de formulação.[0200] This experiment was conducted to determine that a platform lyophilized formulation can be developed for BiTE® molecules. AMG 330 BiTE® was used as a model protein. Two cyclodextrins (SBE-β-CD and α-cyclodextran) were evaluated as formulation excipients.
[0201] A concentração da substância da droga de AMG 330 é de 0,4 mg/mL. O AMG 330 foi permutado com tampão para os respectivos tampões (listados na tabela 17) usando Millipore Centripreps (30K NMWL, 15 mL):1. Aliquotaram-se 30 mL de AMG 330 DS em dois recipientes de amostra Centriprep (2 x 15 mL) por formulação2. Adição de 4,4 mL do tampão de formulação correspondente a cada coletor de filtrado Centriprep (para evitar a superconcentração da DS) 3. Centrifugou-se (centrífuga Allegra 6R, Beckman Coulter, Brea, CA, EUA) a 1500 xg durante 20 min a 25°C (centrifugada para equilíbrio); ~ 5 mL restantes de proteína em cada recipiente da amostra, concentração de 3 vezes a 1,2 mg/mL-alvo4. Filtrou-se em decantado em cada colector de filtrado e substituiu-se por 4,4 mL de tampão da formulação fresco; adicionaram-se 10 mL de tampão da formulação fresco a cada recipiente da amostra5. Centrifugou-se por etapa 36. Repetiram-se as etapas 4-5 por mais quatro vezes (cinco permutas de tampão ao total; ~ 243 vezes a diluição total)7. Material armazenado em tampão armazenado O/N a 4°CTabela 17: Componentes da formulação para liofilização:[0201] The drug substance concentration of AMG 330 is 0.4 mg/mL. AMG 330 was buffer exchanged to the respective buffers (listed in Table 17) using Millipore Centripreps (30K NMWL, 15 mL): 1. Aliquot 30 mL of AMG 330 DS into two Centriprep sample wells (2 x 15 mL) per formulation 2. Add 4.4 mL of the corresponding formulation buffer to each Centriprep filtrate collector (to avoid overconcentration of DS) 3. Centrifuged (Allegra 6R centrifuge, Beckman Coulter, Brea, CA, USA) at 1500 xg for 20 min at 25°C (centrifuged to equilibration); ~5 mL remaining protein in each sample well, 3-fold concentration at 1.2 mg/mL target4. Decanted filter into each filtrate collector and replaced with 4.4 mL fresh formulation buffer; 10 mL fresh formulation buffer was added to each sample well5. Centrifuged per step 36. Steps 4-5 were repeated four more times (five buffer exchanges total; ~243-fold total dilution)7. Material stored in buffer stored O/N at 4°CTable 17: Formulation components for lyophilization:
[0202] Estoques de tampão da formulação e de tensoativo foram adicionados para produzir o material formulado final. As amostras foram preenchidas a um volume de 2 mL em frascos de vidro de 5 cc (Schott Tipo 1A) com um total de 4 frascos por formulação. Todas as amostras foram filtradas em um exaustor estéril usando unidades de filtro Sterivex (0,22 μm) antes do preenchimento. Após o preenchimento, os frascos foram tampados com tampas de borracha para liofilização (Figura 17A).[0202] Formulation buffer and surfactant stocks were added to produce the final formulated material. Samples were filled to a volume of 2 mL into 5 cc glass vials (Schott Type 1A) with a total of 4 vials per formulation. All samples were filtered in a sterile fume hood using Sterivex filter units (0.22 μm) prior to filling. After filling, the vials were capped with rubber stoppers for lyophilization (Figure 17A).
[0203] Três frascos por formulação foram liofilizados usando um ciclo de liofilização conservador modificado (-17C de temperatura de recozimento, tempo de ciclo total de 66 horas). O frasco remanescente por formulação foi reservado para a análise a t = 0 (pré-liofilização). Antes da reconstituição, os bolos liofilizados foram visualmente inspecionados quanto à integridade estrutural e à elegância. As amostras liofilizadas foram reconstituídas com 1,96 mL de água Milli-Q e rodadas suavemente até estarem completamente dissolvidas para análise posterior. As amostras de pré-liofilização e pós-constituição foram analisadas por SEC analítica e imageamento a microfluxo (MFI).[0203] Three vials per formulation were lyophilized using a modified conservative lyophilization cycle (-17°C annealing temperature, 66 hours total cycle time). The remaining vial per formulation was reserved for analysis at t = 0 (pre-lyophilization). Prior to reconstitution, lyophilized cakes were visually inspected for structural integrity and elegance. Lyophilized samples were reconstituted with 1.96 mL of Milli-Q water and gently swirled until completely dissolved for further analysis. Pre-lyophilization and post-constitution samples were analyzed by analytical SEC and microflow imaging (MFI).
[0204] Os resultados da SEC revelaram que as formulações contendo SBE-β-CD geraram níveis mais baixos de espécies HMW antes e depois da liofilização em comparação com formulações com α- ciclodextrano ou sem ciclodextrano. Outros excipientes da formulação (sacarose, glicina, manitol) não pareciam impactar significativamente os níveis de espécies HMW (Figuras 17B, C).[0204] SEC results revealed that formulations containing SBE-β-CD generated lower levels of HMW species before and after lyophilization compared to formulations with α-cyclodextran or without cyclodextran. Other formulation excipients (sucrose, glycine, mannitol) did not appear to significantly impact HMW species levels (Figures 17B, C).
[0205] O MFI revelou um aumento moderado nas partículas subvisiveis (a maioria na gama de 1-2 μm) para a maioria das formulações depois da liofilização. Um aumento drástico foi observado quanto a uma das formulações de α-ciclodextrano, C60AcL. Duas formulações contendo SBE-β-CD (captisol), C60CpT e C60CpMSuT, continham o menor número de partículas subvisiveis após a liofilização (Figura 17D).[0205] The MFI revealed a moderate increase in subvisible particles (most in the 1-2 μm range) for most formulations after lyophilization. A dramatic increase was observed for one of the α-cyclodextran formulations, C60AcL. Two formulations containing SBE-β-CD (captisol), C60CpT and C60CpMSuT, contained the fewest subvisible particles after lyophilization (Figure 17D).
[0206] O objetivo deste experimento é avaliar a estabilidade de Fap alfa BiTE® depois de várias tensões em várias formulações. Especificamente, a FAP alfa BiTE® (SEQ ID NO: 177) foi avaliada depois da LLPS, de 20 ciclos de congelamento/degelo (F/T) e da concentração por ultrafiltração/centrifugação (UFC). Os resultados de estudos anteriores com formulações similares mostraram que o SBE-β- CD tem um efeito positivo sobre a estabilidade de AMG 330 BiTE® e, neste estudo, um efeito sobre o SBE-β-CD em FAP BiTE® foi investigado.[0206] The objective of this experiment is to evaluate the stability of Fap alpha BiTE® after various stresses in various formulations. Specifically, FAP alpha BiTE® (SEQ ID NO: 177) was evaluated after LLPS, 20 freeze/thaw (F/T) cycles, and ultrafiltration/centrifugation (UFC) concentration. Results from previous studies with similar formulations have shown that SBE-β-CD has a positive effect on the stability of AMG 330 BiTE®, and in this study, an effect of SBE-β-CD on FAP BiTE® was investigated.
[0207] 30 mL de tampão foram preparados para cada formulaçãotestada.Tabela 18: Composição da amostra e da preparação. O controle (FRM1) é formulado em 10 mM de fosfato de potássio, 161 mM de arginina, pH 7,6 + 4% de trealose a 2,65 mg/mL.[0207] 30 mL of buffer were prepared for each formulation tested. Table 18: Sample and preparation composition. The control (FRM1) is formulated in 10 mM potassium phosphate, 161 mM arginine, pH 7.6 + 4% trehalose at 2.65 mg/mL.
[0208] Para cada amostra, 375 μL de 2,65 mg/mL de FAP alfa BiTE® (formulados em 10 mM de fosfato de potássio, 161 mM de arginina, pH 7,6 + 4% de trealose) foram colocados em um tubo de filtração centrífugo Amicon Ultra 4 mL de MWCO 10.000. 3,5 mL do tampão apropriado foram adicionados a cada tubo e misturados suavemente com a proteína e os tubos foram centrifugados (Allegra 6R Centrifuge, Beckman Coulter, Brea, CA, EUA) a 4000 rcf a 25C até o volume de retentado ser de ~50 uL. As etapas de adição de tampão e centrifugação foram repetidos mais duas vezes por um total de 3 etapas de concentração. O retentado foi então misturado suavemente com um pipetador removido do tubo de filtro, colocado em um tubo Eppendorf e micro-centrifugado (Eppendorf Centrifuge 5418, St. Louis, MO, EUA) na velocidade máxima por 2 min. O sobrenadante foi então analisado por SEC. Cada amostra foi preparada em duplicado. A FAP alfa BiTE® (2,65 mg/mL) não concentrada também foi analisada para fins de comparação.[0208] For each sample, 375 μL of 2.65 mg/mL FAP alfa BiTE® (formulated in 10 mM potassium phosphate, 161 mM arginine, pH 7.6 + 4% trehalose) was placed in a 4 mL MWCO 10,000 Amicon Ultra centrifugal filter tube. 3.5 mL of the appropriate buffer was added to each tube and gently mixed with the protein and the tubes were centrifuged (Allegra 6R Centrifuge, Beckman Coulter, Brea, CA, USA) at 4000 rcf at 25C until the retentate volume was ~50 uL. The buffer addition and centrifugation steps were repeated two more times for a total of 3 concentration steps. The retentate was then gently mixed with a pipettor removed from the filter tube, placed in an Eppendorf tube and microcentrifuged (Eppendorf Centrifuge 5418, St. Louis, MO, USA) at maximum speed for 2 min. The supernatant was then analyzed by SEC. Each sample was prepared in duplicate. Unconcentrated FAP alfa BiTE® (2.65 mg/mL) was also analyzed for comparison purposes.
[0209] A presença de SBE-β-CD pareceu aumentar o par de SEC relativo, suprimindo a formação de espécies HMW durante a concentração de proteínas. A presença de α-ciclodextrano resultou em uma recuperação muito baixa de proteínas e em altos níveis relativos de espécies HMW.[0209] The presence of SBE-β-CD appeared to increase the relative SEC couple, suppressing the formation of HMW species during protein concentration. The presence of α-cyclodextran resulted in very low protein recovery and high relative levels of HMW species.
[0210] Resultados da LLPS da Fap alfa: os resultados da LLPS com Fap α BiTE® e SBE-β-CD são comparáveis aos resultados da LLPS com AMG 330. O α-ciclodextrano não mostrou nenhum efeito positivo ou negativo na estabilidade coloidal desta molécula (Figura 18).[0210] LLPS results of Fap alpha: LLPS results with Fap α BiTE® and SBE-β-CD are comparable to LLPS results with AMG 330. α-cyclodextran did not show any positive or negative effect on the colloidal stability of this molecule (Figure 18).
[0211] A construção do anticorpo CD33-scFc BiTE foi purificada utilizando a Proteína A e cromatografia de permuta catiônica (CEX). O eluato da CEX foi dialisado em um tampão de ácido L-glutâmico de 10 mM, pH 4,2, utilizando cassetes de diálise contendo membranas com um corte de peso molecular (MWCO) igual a 10 kDa. A diálise foi realizada a 2-8°C. A concentração do material do conjunto dialisado totalizou 2,3 mg/mL. O material foi concentrado posteriormente através de centrifugação por ultrafiltração (UFC) utilizando tubos concentradores contendo membranas com MWCO de 10 kDa. O material concentrado foi filtrado através de um filtro com um tamanho de poro de 0,22 μm. A concentração pós-filtração totalizou 2,7 mg/mL. O material foi totalmente formulado nas formulações listadas na Tabela 19 pelo aumento com solução de estoque concentrada. A concentração final de proteína totaliza 1,0 mg/mL.[0211] The CD33-scFc BiTE antibody construct was purified using Protein A and cation exchange chromatography (CEX). The CEX eluate was dialyzed into 10 mM L-glutamic acid buffer, pH 4.2, using dialysis cassettes containing membranes with a molecular weight cut-off (MWCO) equal to 10 kDa. Dialysis was performed at 2-8°C. The concentration of the dialyzed pool material totaled 2.3 mg/mL. The material was further concentrated by ultrafiltration centrifugation (UFC) using concentrator tubes containing membranes with a MWCO of 10 kDa. The concentrated material was filtered through a filter with a pore size of 0.22 μm. The post-filtration concentration totaled 2.7 mg/mL. The material was fully formulated into the formulations listed in Table 19 by augmentation with concentrated stock solution. The final protein concentration totals 1.0 mg/mL.
[0212] Tabela 19: Visão geral das formulações testadas; HPBCD: hidroxipropil-beta-ciclodextrina; PS 80: polissorbato 80.[0212] Table 19: Overview of the tested formulations; HPBCD: hydroxypropyl-beta-cyclodextrin; PS 80: polysorbate 80.
[0213] As formulações foram preenchidas até 1,0 mL em frascos de vidro 2R de tipo I, que foram vedados com rolhas de borracha butílica e vedações flip-off de alumínio. Os frascos foram armazenados a -20°C e -70°C. As amostras foram extraídas em pontos de tempo designados. Após a amostragem, os frascos foram descongelados à temperatura ambiente e analisados por meio de cromatografia de desempenho ultraelevado de exclusão de tamanho (SE-UPLC), a fim de quantificar o teor percentual de espécies de alto peso molecular. O SE-UPLC foi realizado em um sistema Aquity H-Class UPLC (Waters) utilizando uma coluna Acquity UPLC BEH200 SEC de 150 mm (Waters). A temperatura da coluna foi ajustada a 25°C. A separação das variantes de tamanho foi obtida pela aplicação de um método isocrático com vazão de 0,4 mL/min. A fase móvel foi composta por fosfato de sódio de 100 mM, NaCl de 250 mM, pH 6,8. O tempo de execução totaliza 6,0 minutos. As amostras foram mantidas a 8°C dentro do amostrador automático até a análise. Um total de 3 μg de proteína foi injetado. Para evitar a transferência, uma injeção intermediária com 40% de ACN foi realizada após cada amostra. A detecção foi baseada na fluorescência (excitação a 280 nm, emissão a 325 nm). Integração de pico foi realizada utilizando o software Empower®. A área relativa sob a curva de HMWS foi relatada (Figura 18).[0213] Formulations were filled to 1.0 mL in 2R Type I glass vials, which were sealed with butyl rubber stoppers and aluminum flip-off seals. Vials were stored at -20°C and -70°C. Samples were extracted at designated time points. After sampling, vials were thawed at room temperature and analyzed by size exclusion ultrahigh performance chromatography (SE-UPLC) in order to quantify the percentage content of high molecular weight species. SE-UPLC was performed on an Aquity H-Class UPLC system (Waters) using a 150 mm Acquity UPLC BEH200 SEC column (Waters). The column temperature was set at 25°C. Separation of size variants was achieved by applying an isocratic method at a flow rate of 0.4 mL/min. The mobile phase was composed of 100 mM sodium phosphate, 250 mM NaCl, pH 6.8. The total run time was 6.0 min. Samples were kept at 8°C inside the autosampler until analysis. A total of 3 μg of protein was injected. To avoid carryover, an intermediate injection with 40% ACN was performed after each sample. Detection was based on fluorescence (excitation at 280 nm, emission at 325 nm). Peak integration was performed using Empower® software. The relative area under the HMWS curve was reported (Figure 18).
[0214] O armazenamento da construção formulada de anticorpo CD33-scFc BiTE a -70°C ou menos inibiu a formação de HMWS. No entanto, a HMWS aumentou significativamente durante o armazenamento a -20°C quanto às formulações que não continham HPBCD. Em contraste, a proteína foi impedida de formar HMWS a -20°C na presença de HPBCD, independentemente da sua concentração (6 ou 12%). A presença de manitol prejudicou a estabilidade a -20°C, indicada por um aumento na HMWS.[0214] Storage of the formulated CD33-scFc BiTE antibody construct at -70°C or lower inhibited the formation of HMWS. However, HMWS increased significantly during storage at -20°C relative to formulations not containing HPBCD. In contrast, the protein was prevented from forming HMWS at -20°C in the presence of HPBCD, regardless of its concentration (6 or 12%). The presence of mannitol impaired stability at -20°C, indicated by an increase in HMWS.
[0215] Duas construções diferentes de anticorpo FLT3-scFc BiTE (FL1-scFc e FL2-scFc) foram purificadas utilizando cromatografia de proteína A e CEX. Após a CEX, todas as construções foram diafiltradas em um tampão composto por 10 mM de ácido L-glutâmico, 4% (p/V) de sacarose a pH 4,2. O MWCO da membrana utilizada foi de 10 kDa. O conjunto diafiltrado (concentração de proteína de 1,7 mg/mL) foi concentrado via ultrafiltração (MWCO de 10 kDa) até ser alcançada uma concentração de 7,6 mg/mL. O material foi então filtrado através de um filtro de 0,2 μm e totalmente formulado através do aumento com soluções de estoque do excipiente. Uma visão geral das formulações é fornecida na Tabela 20.[0215] Two different FLT3-scFc BiTE antibody constructs (FL1-scFc and FL2-scFc) were purified using protein A chromatography and CEX. After CEX, all constructs were diafiltered into a buffer composed of 10 mM L-glutamic acid, 4% (w/v) sucrose at pH 4.2. The MWCO of the membrane used was 10 kDa. The diafiltered pool (protein concentration of 1.7 mg/mL) was concentrated via ultrafiltration (MWCO of 10 kDa) until a concentration of 7.6 mg/mL was reached. The material was then filtered through a 0.2 μm filter and fully formulated by spiking with excipient stock solutions. An overview of the formulations is provided in Table 20.
[0216] Tabela 20: Visão geral sobre formulações testadas; o pH foi ajustado a 4,2 para todas as formulações; HPBCD: hidroxipropil-beta- ciclodextrina; PS 80: polissorbato 80.[0216] Table 20: Overview of tested formulations; pH was adjusted to 4.2 for all formulations; HPBCD: hydroxypropyl-beta-cyclodextrin; PS 80: polysorbate 80.
[0217] Ambas as formulações foram preenchidas até 1,3 mL em frascos de vidro 2R de tipo I, que foram vedados com rolhas de borracha butílica e vedações flip-off de alumínio. Os frascos foram armazenados a -20°C. As amostras foram extraídas em pontos de tempo designados. Após a amostragem, os frascos foram descongelados à temperatura ambiente e analisados por meio de cromatografia de desempenho ultraelevado de exclusão de tamanho (SE-UPLC), a fim de quantificar o teor percentual de espécies de alto peso molecular. O SE-UPLC foi realizado em um sistema Aquity H-Class UPLC (Waters) utilizando uma coluna Acquity UPLC BEH200 SEC de 150 mm (Waters). A temperatura da coluna foi ajustada a 25°C. A separação das variantes de tamanho foi obtida pela aplicação de um método isocrático com vazão de 0,4 mL/min. A fase móvel foi composta por fosfato de sódio de 100 mM, NaCl de 250 mM, pH 6,8. O tempo de execução totaliza 6,0 minutos. As amostras foram mantidas a 8°C dentro do amostrador automático até a análise. Um total de 3 μg de proteína foi injetado. Para evitar a transferência, uma injeção intermediária com 40% de ACN foi realizada após cada amostra. A detecção foi baseada na fluorescência (excitação a 280 nm, emissão a 325 nm). Integração de pico foi realizada utilizando o software Empower®. A área relativa sob a curva de HMWS foi relatada (Figura 19).[0217] Both formulations were filled to 1.3 mL in 2R type I glass vials, which were sealed with butyl rubber stoppers and aluminum flip-off seals. The vials were stored at -20°C. Samples were extracted at designated time points. After sampling, the vials were thawed at room temperature and analyzed by size exclusion ultrahigh performance chromatography (SE-UPLC) in order to quantify the percentage content of high molecular weight species. SE-UPLC was performed on an Aquity H-Class UPLC system (Waters) using a 150 mm Acquity UPLC BEH200 SEC column (Waters). The column temperature was set at 25°C. Separation of size variants was achieved by applying an isocratic method at a flow rate of 0.4 mL/min. The mobile phase was composed of 100 mM sodium phosphate, 250 mM NaCl, pH 6.8. The total run time was 6.0 min. Samples were kept at 8°C inside the autosampler until analysis. A total of 3 μg of protein was injected. To avoid carryover, an intermediate injection with 40% ACN was performed after each sample. Detection was based on fluorescence (excitation at 280 nm, emission at 325 nm). Peak integration was performed using Empower® software. The relative area under the HMWS curve was reported (Figure 19).
[0218] Duas construções de anticorpo BiTE BCMA-scFc (BC1-scFc e BC2-scFc) foram purificadas, formuladas, armazenadas e analisadas como descrito no Exemplo 16. Uma visão geral das formulações é fornecida na Tabela 21.[0218] Two BiTE BCMA-scFc antibody constructs (BC1-scFc and BC2-scFc) were purified, formulated, stored and analyzed as described in Example 16. An overview of the formulations is provided in Table 21.
[0219] Tabela 21: Visão geral sobre formulações testadas; o pH foi ajustado a 4,2 para todas as formulações; HPBCD: hidroxipropil-beta- ciclodextrina; PS 80: polissorbato 80.[0219] Table 21: Overview of tested formulations; pH was adjusted to 4.2 for all formulations; HPBCD: hydroxypropyl-beta-cyclodextrin; PS 80: polysorbate 80.
[0220] A Figura 20 mostra o teor percentual de HMWS em função da formulação para ambas as construções de anticorpo. O teor percentual de HMWS aumentou em 1,6% (BC1-scFc) e 1,9% (BC-scFc), respectivamente, nas formulações sem HPBCD após quatro semanas. Em contraste, a formação de HMWS foi inibida nas formulações contendo 6% de HPBCD.[0220] Figure 20 shows the percent HMWS content as a function of formulation for both antibody constructs. The percent HMWS content increased by 1.6% (BC1-scFc) and 1.9% (BC-scFc), respectively, in the formulations without HPBCD after four weeks. In contrast, HMWS formation was inhibited in the formulations containing 6% HPBCD.
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