Etter enkelte opptredener i TV-reklame og radio, blant annet i CBS Radio Mystery Theater i 1974, hadde Patinkin sin første suksess påBroadway i 1979 som han vant enTony Award for «Beste ytelse av en hovedrolle i en musikal» for. Patinkin begynte deretter med film før han i 1984 vendte tilbake til Broadway med denPulitzer Prize-vinnende musikalenSunday in the Park with George, som han fikk en Tony Award-nominasjon for «Beste mannlige skuespiller i en musikal» for. På Broadway, over det neste tiåret, dukket han opp i musikalenThe Secret Garden. Han ga også ut to solo-album, med tittelenMandy Patinkin (1989) ogDress Casual (1990).
I 1994 tok Patinkin rollen som Dr. Jeffrey Geiger i dramaserienChicago Hope som han ble tildelt enEmmy Award for. Han forlot denne serien i løpet av den andre sesongen fordi han ikke ville tilbringe så mye tid borte fra sin kone. I 1995 var han gjeste-skuespiller iThe Simpsons i episoden «Lisas Wedding» som Lisa Simpsons fremtidige brudgom. I 1999 vendte han tilbake til serien i begynnelsen av den sjette sesongen, men denne ble kansellert i 2000. EtterChicago Hope, har Patinkin dukket opp i en rekke filmer. For det meste har han opptrådt som sanger og gitt ut tre album. Patinkin returnerte til Broadway i 2000.
I september 2005 debuterte Patinkin i rollen som Jason Gideon, en erfaren profiler i TV-serienCriminal Minds. I løpet av 2007-2008 sesongen, ble hans rollefigur, Jason Gideon, skrevet ut av serien, og erstattet med spesialagent David Rossi (spilt avJoe Mantegna). 14. oktober 2009 ble det annonsert at Patinkin skulle være gjesteskuespiller i en episode avThree Rivers, som ble sendt 15. november 2009, der han spilte en pasient medLou Gehrigs sykdom som var skadet i en bilulykke og som ber legene på sykehuset om å ikke la ham leve. Patinkin giftet seg med skuespiller og forfatterKathryn Grody i 1980, og paret har to sønner sammen. Patinkin led av en degenerativ øyesykdom på midten av 1990-tallet. Han ble diagnostisert med og behandlet forprostatakreft i 2004. For tiden[når?] spiller han rollen Saul Berenson i TV-serienHomeland.