Giorgio Vasari startet byggingen av palasset i1560 på oppdrag fraCosimo I de' Medici som administrasjonskontorer. NavnetUffizi betyr kontor. Bygget stod ferdig i1581. Ettersom årene gikk ble deler av palasset brukt som lagerplass for noen av de mange kunstgjenstander somMediciene samlet seg. Etter Medicienes styre var over, forble kunstskattene i Firenze, og et av verdens første museer ble skapt. Galleriet hadde vært åpent for besøkende på forespørsel siden det16. århundre og i1765 ble det offisielt åpnet for publikum.
Ettersom samlingen er så enorm, er deler av den flyttet til andre museer i Firenze. Dette gjelder f.eks. noen berømtestatuer som befinner seg iBargello. For tiden pågår et prosjekt for å utvide utstillingslokalene fra ca. 6 000 m² til nesten 13 000 m². Dette vil gjøre det mulig for publikum å se mange kunstverk som hittil normalt har vært i magasinene.
I1993 eksploderte en bilbombe som drepte fem mennesker og skadet palasset. Det er fortsatt ikke klart hva som var bakgrunn for bomben, men mafiaen mistenkes. Bombens skader er reparert, med unntak av noen fresker som det ikke var mulig å reparere.
I dag er Uffizi en av de mest populære turistattraksjonene i Firenze. I høysesongen (verst erjuli) kan ventetiden for å komme inn være opp til fem timer, men noe kortere for de som har forhåndsbestilt billetter.